CN107488230B - 一种抗人CD79a胞外端蛋白的抗体、编码基因及应用 - Google Patents

一种抗人CD79a胞外端蛋白的抗体、编码基因及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗人CD79a胞外端蛋白的抗体、编码基因及应用。本发明以人B细胞淋巴瘤Raji细胞株作为免疫原免疫小鼠，获取脾细胞后与小鼠骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤细胞，再经筛选获得特异性针对人CD79a胞外端蛋白的单克隆抗体，经序列分析获得了所得单克隆抗体的氨基酸序列，并分析获得了重链和轻链的可变区序列及CDR序列，通过克隆表达的嵌合抗体也能够有效且特异性识别人CD79a胞外端蛋白，且抗体作用于人B淋巴细胞时内化率高，具有良好的用于制备靶向B淋巴细胞的靶向药物的前景，可以用于治疗B淋巴细胞相关的疾病。

Description

一种抗人CD79a胞外端蛋白的抗体、编码基因及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种抗人CD79a胞外端蛋白的抗体、编码基因及应用。
背景技术
B细胞抗原识别受体(BCR)是B细胞表面最主要的分子，它由一个识别和结合抗原的mIg和两个传递抗原刺激信号的CD79a/CD79b(又称Igα/Igβ)异源二聚体构成。B细胞分子CD79a/CD79b，是免疫球蛋白超家族成员，分子量分别为45kDa、33kDa和37kDa，其分别有胞膜外区、跨膜区和胞质区。胞膜外区结构属IgSF，分别有1个C2样区和V样结构域，跨膜区都有一个谷氨酸。CD79a和CD79b跨膜区带负电的谷氨酸或谷氨酰胺与mIgM重链跨膜区带正电的氨基酸可形成盐桥，稳定BCR复合物。两种CD79分子的胞质区均有一个免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)，抗原结合mIg诱导CD79-ITAM的酪氨酸残基磷酸化，通过募集并活化下游信号分子Syk及Lyn等，沿着Btk、PLC-γ2和PI3K这3条主要途径活化，从而介导由BCR途径的信号转导。因此，CD79在B细胞的免疫应答过程中起重要作用，近年来已越来越引起医学研究人员的注意。
淋巴瘤是起源于淋巴造血系统的恶性肿瘤，严重危害人类健康的疾病，早在20世纪70年代前，淋巴瘤被认为是不治之症，其病死率几乎是100％。随着世界各国对淋巴瘤诊疗的深入研究，新的抗肿瘤药物的不断问世和造血干细胞移植的实施，淋巴瘤的预后已经有了明显的改善。但严重的毒副作用仍然是临床成功治疗淋巴瘤的主要障碍，且复发耐药的病例缺乏药物选择，给治疗带来了极大的困难。近年来随着分子生物学及抗体工程技术的进步，只杀伤肿瘤细胞而不损伤正常细胞的淋巴瘤靶向治疗得到了广泛的关注和发展，其中单克隆抗体(单抗)导向的靶向治疗是该领域的主要方向。与化疗比较，单克隆抗体靶向治疗具有良好的选择性和特异性，它们只杀伤表达靶分子的细胞，而不损伤无靶分子表达的血细胞成分和组织器官细胞，从而可大大提高靶向治疗的特异性，降低药物的全身毒副作用。有效的靶向治疗取决于良好的先导分子，系列特异性表面分化抗原单抗作为先导分子，抗体偶联药物(antibody-drug conjugate，ADC)将药物或毒素特异地带到肿瘤细胞膜上或细胞内，或通过完整抗体激活补体(CDC)或通过抗体介导细胞毒(ADCC)作用以达到杀灭肿瘤细胞的目的，有着无可替代的优势，有理由相信抗体偶联药物拥有美好未来，下一代连接子、偶联技术以及新的靶点都是创新的机遇。Rituximab(商品名：美罗华)是美国FDA批准用于肿瘤治疗的第一个单抗药物，是一种非结合型人鼠嵌合型CD20单抗，其作用靶点是CD20抗原，主要在前B细胞和成熟B细胞上表达，95％以上B系非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)病例淋巴瘤细胞上呈高表达，在成人B系NHL治疗中取得令人满意的疗效。除了CD20和CD19外，在对B细胞系肿瘤如慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)及非何杰金淋巴瘤(NHL)的治疗中，针对B细胞受体(BCR)的研究成为热点，抗CD79b抗体-药物偶联物(polatuzumab vedotin)靶向CD79b+的B细胞已证明亦是一个有效的治疗靶点，尤其对针对复发及难治的B细胞淋巴瘤。因此，探索抗体靶向治疗恶性血液病是当前研究热点。在靶向药物的研究中，为了提高靶向药物对靶细胞的选择性杀伤，减少对非靶向组织的毒副作用，确定一个特异性强的单抗是首要问题。
自身免疫性疾病如风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化症及I型糖尿病等的发病机制中B淋巴细胞起着重要作用，其中涉及到B细胞多种功能，包括自身抗体、细胞因子的分泌、自身抗原呈现以及随之而来的与T细胞的相互作用，导致炎性细胞因子的分泌。因此抗体介导及T细胞介导的自身免疫性疾病均涉及到B细胞的作用机制，目前对B细胞作用的新认识开辟了新的治疗自身免疫性疾病的治疗方案。将B淋巴细胞作为身免疫性疾病治疗靶点是一项非常有前景的治疗策略。B细胞的单抗CD20通过通过ADCC杀伤B细胞的机制应用于自身免疫性疾病(如类风湿性关节炎等)的靶向治疗并取得了较好的疗效。自身免疫性脑脊髓炎(EAE)及多发性硬化症(MS)主要与IL-6+B细胞有关，应用单抗CD20进行B细胞缺失疗法(BCDT)治疗复发-缓解型MS及EAE有很好疗效。另外，利用针对B淋巴细胞的CD79b抗体可显著改善自身免疫性疾病，自身免疫性疾病的CD79b+细胞亦可作为一个有效的治疗靶点。靶向CD79b的抗体治疗自身免疫性疾病中，并不像CD20抗体那样通过杀伤导致B细胞消耗而发挥治疗作用，而是通过阻断BCR途径的信号转导(SYK，PI3Kδ，BTK)，导致B细胞无变应性(免疫失能)的机制而抑制免疫反应，CD79单抗比CD20在单抗靶向治疗自身免疫性疾病中具有明显的优势。因此，CD79等抗B淋巴细胞单克隆抗体的开发研制为细胞分化发育机制研究、自身免疫性疾病及白血病淋巴瘤诊断和治疗开辟了新的天地。
目前抗体靶向治疗B淋巴细胞相关性疾病存在的问题：综上所述，现今临床上通过CD20嵌合抗体美罗华(rituximab)的联合化疗，许多B-NHL和B淋巴细胞白血病成功得到了治疗，但是某些B细胞肿瘤不表达CD20，而有些则在美罗华的治疗过程中会丢失CD20表面标记，这就出现了耐药以及复发的问题，在这些肿瘤病人的免疫治疗中就需要找到其它的有效靶位。尽管CD79b可作为靶向治疗B细胞淋巴瘤的补充，但B细胞淋巴瘤CD79b分子基因较多发生突变(20％)可能导致抗原表达异常导致靶向作用减弱，而CD79a分子较少发生变异(3％)，另外，抗体偶联药物对靶细胞的作用主要取决于抗体抗原分子结合时的内化效应，文献表明BCR的内化主要取决于CD79a分子而不是CD79b(Jang C,Machtaler S,MatsuuchiL.The role of Ig-α/βin B cell antigen receptor internalization.ImmunologyLetters.2010,134:75-82.)。另外，在B淋巴细胞发育过程中，CD79a分子比CD19、CD20及CD79b在B细胞上表达更早更全面至浆细胞，可避免CD19、CD20药物的脱靶效应。在自身免疫性疾病治疗方面，CD79a分子更是在分泌自身抗体的浆细胞上表达，而CD20及CD19不表达。尽管CD79b+细胞的治疗中可作为一个有效的治疗靶点，但有文献报道类风湿性关节炎滑液CD79a+的B细胞渗透与联合损伤有关，而不是其他B细胞标志(Mo YQ,Dai L,Zheng DH,ZhuLJ,Wei XN,Pessler F,et al.Synovial Infiltration with CD79a-positive B Cells,But Not Other B Cell Lineage Markers,Correlates with Joint Destruction inRheumatoid Arthritis.The Journal of Rheumatology.2011,38:2301-2308.及Teng YK,Levarht EW,Toes RE,Huizinga TW,van Laar JM.Residual inflammation afterrituximab treatment is associated with sustained synovial plasma cellinfiltration and enhanced B cell repopulation.Ann Rheum Dis 2009,68:1011-1016.)。因此，可能CD79a分子比CD79b分子更适合用于淋巴瘤及自身免疫性疾病的治疗靶点，然而迄今为止，未见有关淋巴瘤及自身免疫性疾病的CD79a分子的靶向研究的文献，这可能是由于目前未获得有效的对活体细胞CD79a分子反应的单克隆抗体，迄今没有文献报道用活体细胞去免疫获得针对CD79a分子胞外端部分的单抗。尽管有文献报道(Mason DY,Cordell JL,Brown MH,Borst J,Jones M,Pulford K,Jaffe E,Ralfkiaer E,DallenbachF,Stein H.CD79a:a novel marker for B-cell neoplasms in routinely processedtissue samples.Blood.1995；15；86(4):1453-9.)使用免疫原为计算机模拟的CD79a分子胞外端蛋白质一级结构的15个氨基酸合成肽偶联甲状腺球蛋白获得一株抗体(克隆号JCB117)，但经流式细胞仪检测其仍不与活体B细胞反应(可能原因是合成肽免疫原失去了肽链折叠机糖基化结构)，无法进行对CD79a分子的免疫信号转导功能及疾病靶向治疗的研究，从而未有有关这方面的文献报道。文献报道(Tribolet L,Cantacessi C,PickeringDA,Navarro S,Doolan DL,Trieu A,Fei H,Chao Y,Hofmann A,Gasser RB,GiacominPR.Loukas A.Probing of a human proteome microarray with a recombinantpathogen protein reveals a novel mechanism by which hookworms suppress B-cellreceptor signaling.J Infect Dis.2015；211(3):416-25.)用钩虫的重组疫苗Na-ASP-2蛋白通过结合CD79a，导致BCR信号通路的lyn及pi3k的转录下调从而控制BCR信号进程，使得B细胞免疫失能。可见对CD79a的功能改变影响BCR信号通路的研究极为重要，对CD79a分子的检测及免疫信号转导功能的研究对于疾病的诊断和靶向治疗的研究具有重要意义。CD79a分子是一个含226个人氨基酸的跨膜蛋白，包含一个引导序列(32个氨基酸)、一个胞外端序列(111个氨基酸)及一个跨膜区序列(22个氨基酸)及一个胞浆端序列(61个氨基酸)。
鼠源性单抗用于人体治疗的主要障碍是异体蛋白与病人间产生免疫反应，从而产生病人难以耐受的毒副作用，其根本原因是鼠源性免疫球蛋白(抗体)的Fc段对人体具有免疫原性，因此，有必要对鼠源性抗体进行人鼠嵌合抗体及人源化改造，通常在CHO等细胞上进行这类抗体蛋白表达，而抗体的重链和轻链可变区氨基酸及其CHO细胞表达抗体的密码子优化编码基因序列是研制嵌合抗体及人源化抗体的关键，其中每种抗体的重链和轻链可变区氨基酸序列的唯一性是其关键特征。
发明内容
本发明提供了一种抗人CD79a胞外端蛋白的抗体，利用该抗体制备B淋巴细胞靶向药物，能够用于治疗B淋巴细胞相关的疾病。
一种抗人CD79a胞外端蛋白的抗体，重链的CDR(complementarity-determiningregions，互补决定区)氨基酸序列分别为GYTFTNYG、IYPGSGST、ARYAMDY，轻链的CDR氨基酸序列分别为QSIVHSNGNTY、KVS、FQGSHVPWT。
本发明以人B细胞淋巴瘤Raji细胞株作为免疫原免疫小鼠，获取脾细胞后与小鼠骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤细胞，再经筛选获得特异性针对人CD79a胞外端蛋白的单克隆抗体，经序列分析获得了所得单克隆抗体的氨基酸序列，并分析获得了重链和轻链的可变区序列及CDR序列。
优选的，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。
更优选的，恒定区氨基酸序列为小鼠IgG恒定区序列或人IgG恒定区序列。
进一步优选的，重链的氨基酸序列如SEQ ID No.11所示，轻链的氨基酸序列如SEQID No.12所示。
本发明又提供了编码所述抗体的基因，包括分别用于编码重链和轻链的核苷酸序列。
优选的，编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示。
更优选的，编码重链的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示，编码轻链的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示。
本发明还提供了一种包含所述基因的重组基因工程表达系统。
优选的，所述的重组基因工程表达系统，宿主为CHO细胞。
本发明还提供了所述抗体在制备靶向B淋巴细胞的药物中的应用。
优选的，所述药物用于治疗B淋巴细胞相关的自身免疫系统疾病或血液系统癌症。
优选的，所述药物为所述抗体偶联用于杀伤B淋巴细胞的免疫毒素。
更优选的，所述免疫毒素为微管抑制剂MMAE(monomethyl auristatin E)或细胞毒性药物美登素DM1(maytansine)。
本发明还提供了一种靶向B淋巴细胞的药物，包括所述的抗体及用于杀伤B淋巴细胞的免疫毒素。
优选的，所述免疫毒素为微管抑制剂MMAE(monomethyl auristatin E)或细胞毒性药物美登素DM1(maytansine)。
本发明以人B细胞淋巴瘤Raji细胞株作为免疫原免疫小鼠，获取脾细胞后与小鼠骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤细胞，再经筛选获得特异性针对人CD79a胞外端蛋白的单克隆抗体，经序列分析获得了所得单克隆抗体的氨基酸序列，并分析获得了重链和轻链的可变区序列及CDR序列，通过克隆表达的嵌合抗体也能够有效且特异性识别人CD79a胞外端蛋白，且抗体作用于人B淋巴细胞时内化率高，具有良好的用于制备靶向B淋巴细胞的靶向药物的前景，可以用于治疗B淋巴细胞相关的疾病。
附图说明
图1为SDS-PAGE电泳鉴定S3单抗结果图，其中M为标准蛋白分子量Marker；泳道1为S3单抗。
图2为S3单抗与Raji细胞及Nalm-6细胞株反应流式细胞仪检测结果图，其中图A、B、C为Raji细胞，图A为根据Raji细胞的前向角散射FSC和侧向角散射SSC设门分析圈内细胞、图B为S3单抗培养上清(shangqing)、图C为腹水纯化抗体(ascites)；图D、E、F为Nalm-6细胞株，图D为根据Nalm-6细胞FSC和SSC的设定细胞群、图E为S3单抗培养上清(shangqing)、图F为腹水纯化抗体(ascites)。
图3为S3单抗与正常外周血细胞反应流式细胞仪检测结果图，其中图A为根据细胞的FSC和SSC设门单个核细胞群；图B为S3单抗不与CD3阳性的T细胞反应；图C为S3单抗与CD19阳性的B细胞反应；图D为S3单抗与CD20阳性的B细胞反应。
图4为S3单抗与B细胞淋巴瘤(Burkitt)细胞反应图，其中图A为根据细胞FSC和SSC设门细胞群；图B为S3单抗与CD19阳性的淋巴瘤细胞反应；图C为S3单抗与CD20阳性的淋巴瘤细胞反应；图D为S3单抗与淋巴瘤细胞反应，而不与成熟的CD3阳性的T细胞反应；图E、F、G分别为CD19阳性、CD20阳性和CD3阳性细胞的FITC荧光通道的阴性对照。
图5为S3单抗与急性B淋巴细胞性白血病(B-ALL)细胞的反应图，其中图A为根据细胞的FSC和SSC设门单个核细胞群；图B为CD45-CD34+的白血病细胞；图C为CD45-CD19+白血病细胞及CD45+CD19+正常成熟B细胞；图D为患者经泼尼松诱导一周后CD45-CD19+白血病细胞及CD45+CD19+正常成熟B细胞；图E为S3单抗与CD45+的细胞成熟B细胞反应，而不与CD45-的白血病细胞反应；图F为S3单抗不与CD45-CD19+的白血病细胞反应，而与CD45+CD19+正常成熟B细胞反应。图中上方箭头指示白血病细胞，下方箭头指示正常成熟B细胞。
图6为S3单抗与B细胞淋巴瘤(Burkitt)细胞反应的荧光显微镜观察结果图，其中图A为自然光镜；图B为荧光镜。
图7为S3单抗流式细胞仪检测S3单抗对克隆名HM47的抗CD79a单抗的阻滞作用结果图，其中图A为据细胞FSC和SSC设门细胞群；图B为抗CD79a单抗(HM47)与细胞反应结果的散点图；图C为经S3单抗阻滞后，抗CD79a单抗(HM47)与细胞反应结果的散点图；图D为抗CD79a单抗(HM47)与细胞反应结果的直方图；图E为经S3单抗阻滞后，抗CD79a单抗(HM47)与细胞反应结果的直方图；图F为图D和图E两个直方图的重叠。
图8为S3单抗与抗原复合物的电泳结果图，其中泳道M为标准蛋白分子量Marker；泳道1为S3单抗与抗原复合物样品。
图9为S3单抗氨基酸序列测序结果图，其中图A为重链可变区；图B为轻链可变区。
图10为CHO细胞重组S3单抗表达结果Western blot检测图，其中泳道M为标准蛋白分子量Marker；泳道P为小鼠IgG1，κ(Sigma，货号M9269)阳性对照；泳道1～3分别为转染2、4和6天的样品经DTT还原后的检测结果；泳道4～6分别为转染2、4和6天的样品不经DTT还原的检测结果。
图11为重组S3单抗活性检测Western blot结果图，其中泳道M为标准蛋白分子量Marker；泳道1～3分别为重组S3单抗加入量分别为10μg、20μg和30μg。
图12为重组S3单抗特异性识别CD79a胞外端蛋白检测Western blot结果图，其中泳道M为标准蛋白分子量Marker；泳道1为人CD79a胞外端蛋白。
图13为流式细胞仪检测重组S3单抗与人外周血细胞的反应结果图，其中图A为据细胞FSC和CD45设门单个核细胞群；图B为S3单抗与CD45+细胞群反应；图C为CD19单抗与CD45+细胞群反应。
图14为重组S3单抗内化荧光强度随孵育时间变化图。
图15为重组S3单抗内化结果检测图。
具体实施方式
样品来源：
正常外周血细胞、B细胞淋巴瘤患者细胞及B细胞急性白血病细胞(B-ALL)等健康及病人样品均来自浙江大学医学院附属儿童医院，并经浙江大学医学院附属儿童医院伦理委员会批准，伦理编号2016-IRBAL-009。
实施例1
ZUCH-S3单克隆抗体的研制。
按Koller和Milstein报告(林学颜，张玲主编.现代细胞与分子免疫学.第一版.北京：科学技术出版社.2000,p489-521.)的鼠-鼠杂交瘤经典方法进行，以B细胞淋巴瘤细胞株Raji细胞作为免疫原，将107个Raji细胞给8周龄雌性Balb/C小鼠作腹腔注射，每周一次，共4次，于第4次注射后第3天，脱臼杀死小鼠，无菌取脾细胞与处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株NS-1细胞(美国ATCC产品)按6∶1混合，以50％聚乙二醇(PEG，美国Sigma公司，分子量3350道尔顿)溶液作为融合媒介进行细胞融合，于96孔板(美国Falcon公司)中进行选择性培养。于融合后第9～20天，隔日用免疫原细胞对培养上清进行间接免疫荧光法(IIF)筛选。阳性孔细胞经3次克隆化并连续2次100％孔达到阳性，即建立了一株能持续分泌单抗的杂交瘤细胞系，命名为杂交瘤细胞株ZUCH-S3，分泌的单抗命名为S3单抗。经8个多月的连续传代培养和反复冻融，其分泌S3单抗的能力稳定。以其腹水(荧光法效价1∶3200)或培养上清(荧光法效价1∶16)作为S3单抗的来源。
实施例2
单克隆抗体的纯化与亚型鉴定。
1.单克隆抗体的纯化：为诱生腹水，在接种杂交瘤细胞(实施例1获得的杂交瘤细胞株ZUCH-S3)前1周，给BALB/C小鼠腹腔注射降植烷每只0.5ml，然后每只接种5.0×106个阳性杂交瘤细胞，10天后收集腹水离心，测定抗体效价。采用亲和纯化法(Protein G交联的Sepharose)纯化腹水中单克隆抗体。①腹水用冷Binding Buffer(结合缓冲液)稀释3倍后，于4℃10000rpm离心15分钟去除沉淀物。②将预装有Sepharose-Protein G的亲和纯化柱用10倍柱床体积的Binding Buffer充分流洗。③将稀释的腹水上柱，控制流速8～10滴/分钟。④将流穿的腹水重复上柱一次。⑤用20倍柱床体积的Binding Buffer充分洗涤，直至流穿液A280吸光值小于0.01。⑥用Elution Buffer(洗脱缓冲液)洗脱结合的单克隆抗体，控制流速8～1滴/分钟，收集洗脱液于预加0.1ml的磷酸钾缓冲液(pH7.9，0.5M)的收集管中，每管收集0.5ml含抗体的洗脱液，共收集20管以上。⑦于A280nm检测每管洗脱液的吸光度，并收集吸光值大于0.2的洗脱液。⑧将收集的洗脱液置于透析卡中，并于0.1M，pH7.0的PBS中透析。每隔6小时换液一次，共透析24小时。⑨将透析后的抗体溶液稀释(1∶100)后，于280nm测蛋白含量。⑩将纯化的抗体分装于小管中，置于低温冰箱备用。
2.单克隆抗体的亚型鉴定：采用Serotec公司的小鼠单克隆抗体免疫球蛋白分型试剂盒分析。将纯化的单抗作适当稀释后进行检测，操作严格按试剂盒说明书进行。杂交瘤细胞株ZUCH-S3分泌的单克隆抗体(S3单抗)为IgG1、κ型。纯化的单抗加1M浓度的DTT及沸水中煮5～10min使蛋白变性，SDS-PAGE电泳后考马斯亮蓝染色可见约55kDa的IgG重链和26kDa的IgG轻链(图1)。
实施例3
流式细胞仪及荧光显微镜检测S3单抗识别抗原能力。
步骤如下：①计数Raji细胞、Nmlm-6细胞、正常外周血细胞、B细胞淋巴瘤患者细胞及B细胞急性白血病细胞(B-ALL)，经牛血清白蛋白封闭Fc受体，PBS洗涤，分别调整浓度至1×107/ml，每管取100μl细胞悬液；②每管加入S3单抗培养上清50μl或纯化抗体10μl，4℃孵育30min；③分别加PBS后于1000g离心10分钟，洗去未结合的S3；④分别加入5μl FITC标记的羊抗鼠单抗(GAM-FITC)，4℃孵育30min；⑤分别加PBS后于1000g离心10分钟，去上清；⑥流式细胞仪或荧光显微镜检测、分析。⑦结果分别见图2～图6：
如图2所示，S3单抗与Raji及Nalm-6细胞株反应流式检测结果图，杂交瘤细胞株ZUCH-S3上清(shangqing)及腹水纯化抗体(ascites)与Raji细胞反应，不与Nalm-6细胞反应。如图3所示，S3单抗不与正常外周血CD3+T细胞反应，而仅与CD19+CD20+B细胞反应。如图4所示，S3单抗与CD19+CD20+淋巴瘤细胞反应，不与CD3+的T细胞反应。如图5所示，患者(B细胞急性白血病患者)经B-ALL泼尼松诱导一周后取血样分离细胞检测，结果S3单抗与残留的白血病细胞不反应，而与成熟的B细胞反应。如图6所示，S3单抗与B细胞淋巴瘤(Burkitt)细胞反应的荧光显微镜观察结果，可见细胞胞膜荧光阳性。
实施例4
流式细胞仪检测S3单抗对BD公司的抗CD79a单抗(克隆名HM47)的阻滞作用。
根据S3单抗与血细胞的反应特性及识别抗原的分子量，初步确定为CD79a抗体，因此选定BD公司的B细胞抗体CD10、CD19、CD20、CD22、CD79b、HLA-DR及CD79a单抗(克隆名HM47)的阻滞实验验证，操作步骤如下：①计数B细胞淋巴瘤患者细胞，调整浓度至1×107/ml，每个流式管取100μl细胞悬液；②每管加S3纯化抗体10μl，4℃孵育30min；③加PBS后于1000g离心10分钟，洗去未结合的S3；④分别加入上述各检测抗体(购自BD公司，分别为抗CD10、CD19、CD20、CD22、CD79b、HLA-DR及CD79a的单抗)，抗体使用量为10μl，4℃避光孵育30min；⑤加PBS后于1000g离心10分钟，洗去未结合的抗体；⑥流式细胞仪检测、分析。⑦分析结果表明，经S3单抗阻滞后，使用BD公司的抗CD79a单抗(HM47)能够检测到CD79a的细胞比例从45.14％下降到25.72％，表明有抗原分子部分位阻效应，但不能完全阻滞(图7)。而对其它B细胞抗体CD10、CD19、CD20、CD22、CD79b、HLA-DR等完全不能阻滞。故考虑S3单抗识别的是CD79a分子中的某一段氨基酸。
实施例5
S3单抗识别抗原的分子量鉴定。
利用免疫沉淀方法(immunoprecipitation，IP)纯化S3单抗识别的抗原，步骤如下：
1、抗体偶联：取10μg S3单抗和200μl结合缓冲液，加入到上一步已备好DynabeadsProtein G的Eppendorf管中。轻轻吹打混匀后，于室温在摇床上温和摇20min。孵育结束后，将Eppendorf管放在磁力架上。待Dynabeads Protein G-S3单抗复合物从溶液中分离出来，吸净上清。将Eppendorf管从磁力架上取下来。加入200μl结合缓冲液，轻轻重悬浮Dynabeads Protein G-S3单抗复合物。
2、免疫复合物沉淀：按每107个Raji细胞中加入1ml细胞NP-40裂解液，然后再加入相应量的蛋白酶抑制剂，冰里放置30min。将蛋白样品转移至1.5ml离心管，4℃、12000g离心10min。将上清小心转移至干净无菌离心管。将制备的1ml蛋白样品和50μl DynabeadsProtein G加入新的Eppendorf管中，于4℃在摇床上温和摇1h(去除非特异性蛋白)。将Eppendorf管放在磁力架上，收集上清。将上清加入已备好Dynabeads Protein G-S3单抗复合物的Eppendorf管中，轻轻重悬后，于室温在摇床上温和摇10min。将Eppendorf管放在磁力架上，吸净上清。用200μl PBS清洗Dynabeads Protein G-S3单抗-抗原复合物3次，清洗后均放在磁力架上并吸净上清。将Eppendorf管从磁力架上取下来。以100μl PBS重悬浮Dynabeads Protein G-S3单抗-抗原复合物，然后转移至一支新的Eppendorf管中。
3、洗脱目标蛋白：将Eppendorf管放在磁力架上，吸净上清。将Eppendorf管从磁力架上取下来。加入20μl洗脱液于Eppendorf管中，轻吹打混匀后，于室温在摇床上温和摇2min。Eppendorf管放在磁力架上，吸取上清并小心转移至干净无菌离心管，-20或-80℃保存。
4、SDS-PAGE电泳：洗脱的目标蛋白加1M DTT及沸水中煮5～10min使蛋白变性，SDS-PAGE电泳后考马斯亮蓝染色，分析结果表明，SDS-PAGE电泳后考马斯亮蓝染色可见主要为约33kDa左右的抗原蛋白条带(图8)。
实施例6
运用DASS技术对S3单抗的重链和轻链可变区氨基酸进行测序。
1、由于每一种抗体重链和轻链可变区氨基酸序列是唯一的，采用DASS(DatabaseAssisted Shotgun Sequencing，鸟枪法与抗体数据库相结合的技术)技术，通过使用先进的质谱仪和强大的数据处理算法，生成大量序列信息，进而运用计算程序对MS/MS光谱从头测序，利用其独特的内部数据挖掘工具能保证从上万条MS/MS光谱数据中提取目标抗体序列信息。保证每条肽段都会被检测到，而且每一个氨基酸位点都会生成20-27条MS/MS光谱，因此，对于最难测序的高脯氨酸(proline)和精氨酸(arginine)肽段也可实现测量，而且不需要再进行额外的Edman测序来辅助测序，而DASS平台可以保证100％全序列覆盖，对于抗体的可变区更是每个位点至少覆盖4次。通过这样高频度的覆盖，可以充分保证测序结果的精度。DASS采用专业的质谱软件PEAKS Mass Spectrometry Software。
2、美国Creative Biolabs实验室拥有高精度的Orbitrap Elite测序仪及DASS技术，因此，将500μg纯化的S3单抗送至美国Creative Biolabs实验室进行氨基酸序列测序，测序结果见图9。
3、S3单抗的重链可变区(VHS3)、轻链可变区(VLS3)氨基酸测序结果表明，VHS3和VLS3均符合小鼠Ig可变区框架结构。VHS3全长114个氨基酸(见序列SEQ ID No.7)，在美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中进行检索，氨基酸序列分析结果显示，此重链可变区含有明确的4个框架区(FR)和3个抗原决定簇互补区(CDR)，此重链可变区氨基酸序列与小鼠Ig重链的同源性达90％，归属于小鼠Ig的VH，在第22位和第96位为特征性Cys(半胱氨酸)。VHS3氨基酸序列结构框架如下：1～25：FR1；26～33：CDR1；34～50：FR2；51～58：CDR2；59～96：FR3；97～103：CDR3；104～114：FR4。
VLS3全长112个氨基酸(见序列SEQ ID No.8)，在NCBI上进行检索氨基酸序列分析结果显示，此轻链可变区含有明确的4个框架区(FR)和3个抗原决定簇互补区(CDR)，此轻链可变区氨基酸序列与小鼠Igκ链的同源性达89％，归属于小鼠Ig的Vκ，在第23位和第93位为特征性半胱氨酸(Cys)。VLS3氨基酸序列框架如下：1～26：FR1；27～37：CDR1；38～54：FR2；55～57：CDR2；58～93：FR3；94～102：CDR3；103～112：FR4。
实施例7
CHO细胞重组表达重组S3单抗。
由于抗体的重链和轻链可变区氨基酸序列是研制嵌合抗体及人源化抗体的关键，且目前多在CHO细胞上进行这类抗体的表达，同时为了验证所测的氨基酸序列的正确性，根据所测的氨基酸序列，转化为CHO细胞编码重链可变区偏爱的密码子核苷酸序列(SEQ IDNo.9)及编码轻链可变区偏爱的密码子核苷酸序列(SEQ ID No.10)，运用基因工程技术使CHO细胞表达完整的有活性的S3单抗蛋白。本实施例中的CHO细胞抗体表达由南京金斯瑞生物科技公司实行，步骤如下：
1、基因合成步骤：①合成S3单抗重链目的基因序列：设计目的序列两端带有EcoRI和HindIII酶切序列，即EcoRI序列-Kozak序列-信号肽-S3单抗重链可变区序列(小鼠)-通用小鼠IgG1恒定区序列-终止密码子-HindIII序列共1398bp(简称S3Ab-HC)，其中EcoRI序列-Kozak序列-信号肽的序列如SEQ ID No.15所示，S3单抗重链可变区序列(小鼠)-通用小鼠IgG1恒定区序列-终止密码子的序列如SEQ ID No.13所示。②EcoRV单酶切pUC57载体；③通过T4连接酶将目的序列与线性化载体连接；④将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞；⑤培养并抽提质粒，最终获得含S3单抗重链序列的pUC57的质粒，经过酶切和测序鉴定正确。
2、亚克隆步骤：①将含S3单抗重链序列的pUC57质粒用EcoRI和HindIII酶切，回收目的片段；②将载体pTT5用EcoRI和HindIII酶切；③回收的目的片段和酶切后的载体通过T4连接酶连接；④连接液转化大肠杆菌感受态细胞；⑤培养并抽提质粒，最终获得含S3单抗重链序列的的pTT5质粒。
3、合成S3单抗轻链目的基因序列：设计目的序列两端带有EcoRI和HindIII，即EcoRI序列-Kozak序列-信号肽-S3单抗轻链可变区序列(小鼠)-通用小鼠IgG1恒定区序列-终止密码子-HindIII序列共741bp，其中S3单抗轻链可变区序列(小鼠)-通用小鼠IgG1恒定区序列-终止密码子的序列如SEQ ID No.14所示。
4、获取含S3单抗轻链序列的pTT5质粒，方法同以上1和2步骤。
5、将编码S3单抗轻、重链的重组pTT5质粒瞬时共转染到CHO-3E7细胞。
6、分别在转染后第2、第4和第6天收集培养上清，SDS-PAGE和Western blot(羊抗鼠IgG–HRP)检测表达，，DTT降解后可见有分子量为55kDa的重链和26kDa的轻链表达，未降解可见有150kDa的全抗体蛋白表达(图10)。
7、取10ml培养上清经超滤浓缩至200μl，加PBS稀释到1ml溶液，置4℃保存待活性鉴定。
实施例8
重组S3单抗(实施例7制备所得)活性鉴定。
1、Western blot鉴定：按107个Raji细胞中加入1ml细胞NP-40裂解液，再加入相应量的蛋白酶抑制剂，加1M DTT及沸水中煮5～10min使蛋白变性，SDS-PAGE电泳后转PVDF膜，把PVDF膜放入塑料袋中，根据滤膜面积以0.1ml/cm2的量加入封闭液，按10μg/ml的量加实施例六获得的CHO重组S3单抗到封闭液中，放在平缓摇动的平台上，于室温下温育2h。将PVDF膜取出后放入含250ml TBST液的托盘中，置于平缓摇动的平台上，漂洗3次，每次15～30min。将经TBST洗涤后的PVDF膜转移到另一塑料袋中，按滤膜面积以0.1ml/cm2的量加入新鲜封闭液(可以适当多加，以保证滤膜充分浸没)，将接有辣根过氧化物酶的羊抗鼠二抗以1∶5000比例加入，于室温温育1～2h。将PVDF膜取出后放入含250ml TBST液的托盘中，于摇床上洗涤3次，每次10min。将PVDF膜置于保鲜膜上，取适量ECL试剂盒中等体积的A液和B液混合，混匀后加在膜的表面，移入凝胶成像分析仪中，化学光敏模式曝光显影。照片以TIF格式导出后在Image J软件下分析，确认目的条带位置，可见约33kDa的反应条带这与图8所示的原腹水S3单抗反应条带一致(图11)。
2、CHO重组S3单抗与CD79a胞外端蛋白的反应：为进一步确定S3单抗识别的抗原，特购买了美国ABCAM公司重组的人CD79a胞外端蛋白(货号：ab112267)，其构成的氨基酸序列如SEQ ID No.16所示。
CD79a胞外端蛋白直接SDS-PAGE电泳后转PVDF膜，加CHO重组S3单抗经Westernblot检测(操作步骤同上Western blot鉴定)，结果可见特异性的反应条带，表明S3单抗特异性地识别CD79a胞外端蛋白(图12)。
3、流式细胞检测CHO重组S3单抗与人外周血细胞的反应：操作步骤同实施例3。结果S3单抗与CD45+细胞群反应，S3单抗反应阳性细胞比例为63.4％；CD19单抗(美国贝克曼公司，克隆号J4.119)与CD45+细胞群反应，CD19单抗反应阳性细胞比例为63.5％，可见CHO重组S3单抗特异性地与CD19阳性的B细胞反应(图13)。
以上验证实验表明，获得的重组S3单抗的重链和轻链可变区氨基酸序列及其编码基因序列正确。
实施例9
木瓜酶(Papain)酶切结合流式细胞仪检测CHO重组S3单抗内化程度。
木瓜酶是木瓜中提取的酶类，它能够将免疫球蛋白的Fc段从Fab段切除，抗体经木瓜酶作用后，分解为2个Fab段和1个Fc段共三个片段。抗体的Fab段与抗原结合，而FITC则连于抗体的Fc段。在抗体内化检测中，木瓜酶能够切除结合在细胞表面的抗体的Fc段，与Fc段连接的FITC随之被切除，但不能切除内化至胞浆的抗体Fc段。
实验步骤如下：1、CHO重组S3单抗FITC荧光标记：使用ABCAM公司FITC连接试剂盒(货号ab102884)，具体步骤如下：调节重组S3单抗浓度为1mg/ml，在100μl重组S3单抗中加标记调节试剂10μl，混匀；再用移液枪移至FITC混合物瓶，反复混匀，置室温(20-25℃)3小时；再加标记终止试剂10μl；再用移液枪将混合液移至透析袋，放置pH8.0缓冲盐水4℃透析24小时，S3单抗-FITC荧光试剂(Rc-S3-FITC)即可使用。2、计数Raji细胞，调整浓度至5×106/ml，每个反应管取100μl。3、每管加CHO重组S3单抗-FITC(Rc-S3-FITC)5μl，在37℃分别孵育0.25h、0.5h、1h、2h、3h、4h、5h。4、加PBS后于1000g离心10分钟终止孵育。5、实验组加木瓜酶(终浓度2mg/ml)酶切15分钟。6、加PBS后于1000g离心10分钟终止酶切。7、流式细胞仪检测。
结果：在37℃孵育时，细胞跨膜蛋白质转运接近生理状态，S3快速内化至细胞内，内化荧光强度随孵育时间延长而增加(图14)，孵育3小时，抗体内化量接近最大值，其内化率为74％(图15)。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种抗人CD79a胞外端蛋白的抗体、编码基因及应用
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 1
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 2
Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Thr
1 5
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 3
Ala Arg Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 4
Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 5
<211> 3
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 5
Lys Val Ser
1
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 6
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Trp Thr
1 5
<210> 7
<211> 114
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 7
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 8
<211> 112
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 8
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 9
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
caggttcagt tgcagcagtc tggccccgag cttgtgaaac ctggcgcctc cgtgaagatc 60
tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc aactacggca tgaactgggt caagcagagg 120
cctggacagg gcctcgagtg gatcggcaga atctatcctg gctccggctc taccaactac 180
aacgagaagt tcaagggcaa agctaccctg accgtggaca agtcctcctc caccgcctac 240
atggaactgc ggtccctgac ctctgaggac tccgccgtgt actactgtgc cagatacgcc 300
atggactact ggggccaggg cacctctgtg acagtgtcct ct 342
<210> 10
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gatgttctga tgacccagac acctctgagc ctgcctgtgt ctctgggcga tcaggcctcc 60
atctcctgca gatcctctca gtccatcgtg cactccaacg gcaacaccta cctggaatgg 120
tatctgcaga agcccggcca gtctcctaag ctgctgatct acaaggtgtc caaccggttc 180
tctggcgtgc ccgacagatt ttccggctct ggctctggca ccgacttcac cctgaagatc 240
tccagagtgg aagccgagga cctgggcgtg tactactgct tccaaggctc tcacgtgccc 300
tggacatttg gcggcggaac aaagctggaa atcaag 336
<210> 11
<211> 438
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly
115 120 125
Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys
130 135 140
Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu
145 150 155 160
Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr
165 170 175
Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu
180 185 190
Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp
195 200 205
Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr
210 215 220
Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
225 230 235 240
Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp
245 250 255
Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp
260 265 270
Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
275 280 285
Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp
290 295 300
Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro
305 310 315 320
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala
325 330 335
Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp
340 345 350
Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile
355 360 365
Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn
370 375 380
Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys
385 390 395 400
Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys
405 410 415
Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu
420 425 430
Ser His Ser Pro Gly Lys
435
<210> 12
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
115 120 125
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
145 150 155 160
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
180 185 190
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
195 200 205
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215
<210> 13
<211> 1317
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
caggttcagt tgcagcagtc tggccccgag cttgtgaaac ctggcgcctc cgtgaagatc 60
tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc aactacggca tgaactgggt caagcagagg 120
cctggacagg gcctcgagtg gatcggcaga atctatcctg gctccggctc taccaactac 180
aacgagaagt tcaagggcaa agctaccctg accgtggaca agtcctcctc caccgcctac 240
atggaactgc ggtccctgac ctctgaggac tccgccgtgt actactgtgc cagatacgcc 300
atggactact ggggccaggg cacctctgtg acagtgtcct ctgctaagac cacacctcct 360
agcgtgtacc ctctggctcc tggatctgcc gctcagacca actctatggt caccctgggc 420
tgtctggtca agggctactt tcctgagcct gtgaccgtga cctggaacag cggatctctg 480
tctagcggag tgcacacctt tccagccgtg ctgcagtccg acctgtacac cctgtctagc 540
tccgtgaccg tgccttcctc tacctggcct tctgagacag tgacctgcaa cgtggcccat 600
cctgcctctt ctaccaaggt ggacaagaaa atcgtgccca gagactgcgg ctgcaagccc 660
tgcatctgta cagtgcctga agtgtcctcc gtgttcatct tcccacctaa gcctaaggac 720
gtgctgacca tcacactgac ccctaaagtg acctgtgtgg tggtggacat ctccaaggac 780
gaccccgagg tgcagttcag ttggttcgtg gacgacgtgg aagtgcacac agctcagacc 840
cagcctagag aggaacagtt caactccacc ttcagatccg tgtccgagct gcccatcatg 900
caccaggatt ggctgaacgg caaagagttc aagtgcagag tgaactccgc cgcctttcct 960
gctcctatcg aaaagaccat cagcaagacc aagggcagac ccaaggctcc ccaggtgtac 1020
acaatccctc cacctaaaga acagatggcc aaggacaagg tgtccctcac ctgtatgatc 1080
accgatttct tcccagagga catcaccgtg gaatggcagt ggaatggaca gcccgccgag 1140
aactacaaga acacccagcc aatcatggac accgacggct cctacttcgt gtactccaag 1200
ctgaacgtgc agaagtccaa ctgggaggcc ggcaacacct ttacctgctc tgtgctgcat 1260
gagggcctgc acaatcacca caccgagaag tccctgtctc actcccctgg aaagtga 1317
<210> 14
<211> 660
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gatgttctga tgacccagac acctctgagc ctgcctgtgt ctctgggcga tcaggcctcc 60
atctcctgca gatcctctca gtccatcgtg cactccaacg gcaacaccta cctggaatgg 120
tatctgcaga agcccggcca gtctcctaag ctgctgatct acaaggtgtc caaccggttc 180
tctggcgtgc ccgacagatt ttccggctct ggctctggca ccgacttcac cctgaagatc 240
tccagagtgg aagccgagga cctgggcgtg tactactgct tccaaggctc tcacgtgccc 300
tggacatttg gcggcggaac aaagctggaa atcaagcggg ctgatgccgc tcctaccgtg 360
tctatcttcc cacctagctc cgagcagctg acctctggcg gagcttctgt cgtgtgcttc 420
ctgaacaact tctaccccaa ggacatcaac gtgaagtgga agatcgacgg ctccgagaga 480
cagaacggcg tgctgaactc ttggaccgac caggactcca aggacagcac ctactccatg 540
tcctccacac tgaccctgac caaggacgag tacgagcggc acaactccta tacctgcgag 600
gctacccaca agacctccac ctctccaatc gtgaagtcct tcaaccggaa cgagtgctga 660
<210> 15
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gaattcccgc cgccaccatg ggctggtcct gcatcattct gtttctggtg gctaccgcca 60
ccggcgtgca ctct 74
<210> 16
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 16
Leu Trp Met His Lys Val Pro Ala Ser Leu Met Val Ser Leu Gly Glu
1 5 10 15
Asp Ala His Phe Gln Cys Pro His Asn Ser Ser Asn Asn Ala Asn Val
20 25 30
Thr Trp Trp Arg Val Leu His Gly Asn Tyr Thr Trp Pro Pro Glu Phe
35 40 45
Leu Gly Pro Gly Glu Asp Pro Asn Gly Thr Leu Ile Ile Gln Asn Val
50 55 60
Asn Lys Ser His Gly Gly Ile Tyr Val Cys Arg Val Gln Glu Gly Asn
65 70 75 80
Glu Ser Tyr Gln Gln Ser Cys Gly Thr Tyr Leu Arg Val Arg Gln Pro
85 90 95
Pro Pro Arg Pro Phe Leu Asp Met Gly Glu Gly Thr
100 105

Claims (10)

1.一种抗人CD79a胞外端蛋白的抗体，其特征在于，重链的CDR氨基酸序列分别为GYTFTNYG、IYPGSGST、ARYAMDY，轻链的CDR氨基酸序列分别为QSIVHSNGNTY、KVS、FQGSHVPWT。
2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。
3.如权利要求2所述的抗体，其特征在于，重链的氨基酸序列如SEQ ID No.11所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.12所示。
4.编码如权利要求1～3任一所述抗体的基因，其特征在于，包括分别用于编码重链和轻链的核苷酸序列。
5.如权利要求4所述的基因，其特征在于，编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ IDNo.9所示，编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示。
6.如权利要求5所述的基因，其特征在于，编码重链的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示，编码轻链的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示。
7.如权利要求1～3任一所述抗体在制备靶向B淋巴细胞的药物中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物为所述抗体偶联用于杀伤B淋巴细胞的免疫毒素，所述免疫毒素为微管抑制剂MMAE或细胞毒性药物美登素DM1。
9.一种靶向B淋巴细胞的药物，其特征在于，包括如权利要求1～3任一所述的抗体及用于杀伤B淋巴细胞的免疫毒素。
10.如权利要求9所述的药物，其特征在于，所述免疫毒素为微管抑制剂MMAE或细胞毒性药物美登素DM1。
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