TWI746491B - 異質雙聚體型血管內皮生長因子及其應用 - Google Patents

異質雙聚體型血管內皮生長因子及其應用 Download PDF

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Abstract

本發明係關於一種融合蛋白，包含：(i)第一血管內皮生長因子同功異形體，與(ii)第二血管內皮生長因子同功異形體，及(iii)介於該第一同功異形體與該第二同功異形體間的雙聚化功能域，其中該第一同功異形體及該第二同功異形體係選自VEGF121及VEGF165。

Description

異質雙聚體型血管內皮生長因子及其應用
本發明係關於一種融合蛋白。更特別地，本發明係關於一種異質雙聚體型血管內皮生長因子，包含第一血管內皮生長因子同功異形體與第二血管內皮生長因子同功異形體，及一介於該第一同功異形體與該第二同功異形體間的雙聚化功能域。
本發明係主張美國臨時案第62/262,630號(申請日為2015年12月3日)之優先權，其完整內文以引用方式納入本說明書為參考文獻。
血管生成是腫瘤發展過程中一個重要的限速過程(rate-limiting process)，其係透過將平衡傾向於促血管新生因子(proangiogenic factors)，而驅動血管生長而被誘導發生。處在微環境中之癌細胞需倚賴血管生成來供給氧及營養物。因此，靶定血管生成途徑之藥劑已被研發作為具潛力的癌症藥物。最初的努力主要集中於靶定內皮與腫瘤衍生的血管內皮生長因子A(VEGF-A)/VEGFR信號傳導。已設計出數種不同的策略，用以抑制此種信號傳導，作為單一療法或輔助療法，例如VEGFR信號傳導之小分子抑制劑、VEGF-陷阱、抗-VEGFR抗體及抗-VEGF-A單株抗體貝伐單抗(Bevacizumab)(癌思停，Avastin)，為第一種在2004年被美國FDA批准的VEGF-A標靶抗體。
但是，有許多患者對抗血管生成藥物沒有反應，或很快地對其產生抗性。腫瘤可通過適應性反應(adaptive response)，例如增量調節替代的促血管新生信號傳導、選擇正常的腫瘤周圍血管、透過招集免疫細胞與骨髓衍生的促血管新生細胞抑制免疫 監控及活化侵襲性表現型，而對抗血管生成藥物產生抗性。此等適應性反應是透過，因腫瘤血管修剪及廣泛抑制血管生成所引起之腫瘤內缺氧而被誘導發生。
有效抑制VEGF-A/VEGFR信號傳導，並同時減輕對抗血管生成治療的抗性，仍然是一項主要的挑戰。
於是，本發明之一方面係關於一種融合蛋白，含有(i)第一血管內皮生長因子(VEGF)同功異形體，(ii)第二VEGF同功異形體，及(iii)介於該第一同功異形體與該第二同功異形體間的雙聚化功能域。所述第一同功異形體及第二同功異形體係選自VEGF121及VEGF165。VEGF121可具有與SEQ ID NO：2達至少80%(例如，至少99%、98%、97%、96%、95%、90%或85%)序列同一性的胺基酸序列。VEGF165可具有與SEQ ID NO：4達至少80%(例如，至少99%、98%、97%、96%、95%、90%或85%)序列同一性的胺基酸序列。
於一項具體實施態樣，所述之雙聚化功能域含有兩個Fc區域，及一介於該二Fc區域間的連結肽。所述之連結肽可為一由15至30個胺基酸組成之可撓性連結肽。例如，所述之連結肽可為(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n，n係3、4、5或6。
於一項具體實施態樣，所述之融合蛋白包括(從N-端至C-端的方向)VEGF121、所述二Fc區域其中之一、所述之連結肽、所述二Fc區域其中另一個及VEGF165。
於一項具體實施態樣，所述之融合蛋白包括(從N-端至C-端的方向)VEGF165、所述二Fc區域其中之一、所述之連結肽、所述二Fc區域其中另一個及VEGF121。
所述之融合蛋白可具有與SEQ ID NO：11達至少80%序列同一性的胺基酸序列。
於另一方面，本發明係關於一種核酸分子，包含一 編碼本發明所述融合蛋白之核酸序列。於一項具體實施態樣，所述之核酸序列係編碼一與SEQ ID NO：11達至少80%(例如，至少99%、98%、97%、96%、95%、90%或85%)序列同一性的胺基酸序列。
於又另一方面，本發明係關於一種醫藥組成物，包含所述之融合蛋白及醫藥上可接受的載體。所述之醫藥組成物可用於治療癌症，或抑制有需要個體中的血管生成。
於以下之實施方式及參照的圖式，將詳細描述本發明之一或多項具體實施態樣。該等具體實施態樣之其他特色、標的及優點，將由下列敘述說明及圖式，以及申請專利範圍彰顯出來。
圖1為所述血管內皮生長因子(VEGF)同功異形體之示意圖。
圖2係一種VEGF121-VEGF165融合蛋白之示意圖。
圖3為一組圖顯示所述VEGF121-VEGF165蛋白對於細胞增生之影響。總共1×104個3B-11細胞(A)及HCT-15細胞(B)，於VEGF165(222pM)存在下以該融合蛋白(42、83、125pM)處理。細胞增生係以CCK-8套組進行測定(t-test,*P<0.05,**P<0.01,n=3)。 1：對照組；2：VEGF165；3：VEGF165+VEGF121-VEGF165(42pM)；4：VEGF165+VEGF121-VEGF165(83pM)；5：VEGF165+VEGF121-VEGF165(125pM)。
圖4係一組圖顯示所述VEGF121-VEGF165蛋白對於血管形成之影響。(A)3B-11(8×105)細胞接種於Matrigel，並於VEGF165(222pM)存在下以VEGF121-VEGF165(42、83、125pM)處理。管形成是經由在100×放大倍數下隨機選擇的視野中計數連接的細胞來定量。1：對照組；2：VEGF165；3：VEGF165+VEGF121-VEGF165(42pM)；4：VEGF165+VEGF121-VEGF165(83pM)；5：VEGF165+ VEGF121-VEGF165(125pM)。(B)將VEGF121-VEGF165質體轉感染至3B-11細胞中。使用3B-11細胞完成管形成分析。數據以平均值表示，基於三次獨立實驗。1：對照組；2：VEGF165(222pM)；3：VEGF121-VEGF165質體。* P<0.05，** P<0.01，***p<0.001。
圖5係顯示VEGF121-VEGF165蛋白對於3B-11細胞移行之影響。將VEGF121-VEGF165質體轉感染至3B-11細胞中。使用經轉染之3B-11細胞測定細胞移行。3B-11細胞之細胞移行能力在VEGF165(222pM)存在時增強，但受到VEGF121-VEGF165質體的存在抑制。
圖6為一組圖顯示所述VEGF121-VEGF165蛋白對於HCT-15細胞移行之影響。(A)HCT-15細胞接種於TranswellTM可通透嵌件中，並以VEGF121-VEGF165蛋白(42、83、125pM)或於VEGF165(222pM)存在下進行處理。於TranswellTM可通透嵌件中分析間隙之間的距離。以未經處理之HCT-15細胞為對照組。1：對照組；2：VEGF165；3：VEGF165+VEGF121-VEGF165(42pM)；4：VEGF165+VEGF121-VEGF165(83pM)；5：VEGF165+VEGF121-VEGF165(125pM)。(B)將VEGF121-VEGF165質體轉感染至HCT-15細胞中。使用經轉染之HCT-15細胞測定細胞移行。HCT-15細胞之細胞移行能力在VEGF165(222pM)存在時增強，但受到VEGF121-VEGF165質體的存在抑制。t-檢定，* P<0.05，** P<0.01，***p<0.001,n=3。
圖7係顯示VEGF121-VEGF165蛋白對於細胞侵襲性之影響。將HCT-15細胞於VEGF165(222pM)存在下以不同濃度之VEGF121-VEGF165(42、83、125pM)處理。透過小室分析(transwell chamber assay)測定細胞侵襲性。於進行細胞移行後48小時，經結晶紫染色後計數通過濾膜的細胞數目(原始放大倍率：400×)。1：對照組；2：VEGF165；3：VEGF165+VEGF121-VEGF165(42pM)；4：VEGF165+VEGF121-VEGF165(83pM)；5：VEGF165+VEGF121-VEGF165(125pM)。t-檢定，* P<0.05，** P<0.01，***p<0.001。
圖8為一組圖顯示以異種移植腫瘤發生分析VEGF121-VEGF165 蛋白之功效。將HCT-15細胞經皮下注射入裸數的背側(每隻小鼠1部位)。受注射之小鼠每兩天檢查其腫瘤形成。將不同濃度之VEGF121-VEGF165蛋白(10、50或250ng/ml)，或PBS對照組直接注射入小鼠體內的腫瘤中。(A)所偵測得之受注射小鼠的體重。(B)從腫瘤長度與寬度(以6-吋帶表卡尺測量)估算之腫瘤體積，使用方程式：腫瘤體積=1 x w2 x 0.52。
本發明意外發現，由兩種不同的血管內皮生長因子(VEGF)同功異形體所組成之異質雙聚體型VEGF，可透過以旁分泌及自體分泌的形式與VEGF165同質雙聚體進行競爭，而減少細胞增生、移行、侵襲與管形成。
因此，本發明係描述一種融合型VEGF蛋白，含有藉由一雙聚化功能域連結之同功異形體VEGF121與同功異形體VEGF165。
VEGF-A基因包括八個外顯子，可產生不同替換剪接的變異型，即VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF183、VEGF189及VEGF206(參見圖1)。
VEGF121為一種易溶且具弱酸性的多肽，缺乏肝素-結合功能域。於本文提供VEGF121之核酸序列(SEQ ID NO：1)及其所編碼之胺基酸序列(SEQ ID NO：2)。SEQ ID NO：2之序列包括一N-端信號肽，此肽序列並不存在成熟型VEGF121中。
VEGF165含有鹼性胺基酸及一與VEGF受體結合之缺乏肝素-結合功能域，可誘導信息傳遞及刺激內皮細胞增生。於本文提供VEGF165之核酸序列(SEQ ID NO：3)及其所編碼之胺基酸序列(SEQ ID NO：4)。SEQ ID NO：4之序列包括一N-端信號肽，此肽序列並不存在成熟型VEGF165中。
本發明之融合型VEGF蛋白進一步包括一位於介於該二VEGF同功異形體之間，而使該融合型VEGF能形成一種異質 雙聚體的雙聚化功能域。於一項具體實施態樣，所述之雙聚化功能域係由兩個經由一連結肽連接的Fc區域所組成。所述之Fc區域可為一人類IgG Fc區域。例如，所述之Fc區域可具有SEQ ID NO：6之胺基酸序列，其係由SEQ ID NO：5之核酸序列所編碼。
介於該二Fc區域間的連結肽可為任一該項技術已知之具撓性的連結肽。所述之連結肽可具有15至30個胺基酸。具撓性的連結肽可為富含Gly及Ser之連結肽。例如，所述之連結肽可為(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n(SEQ ID NO：7)，n係一整數(例如，1、2、3、4、5、6、7或8)。
本發明之融合蛋白可進一步包括一位於N-端的信號肽。所述之信號肽可為對該等VEGF同功異形體係內源性的信號肽。例如，所述之信號肽可具有SEQ ID NO：9之序列(其係由SEQ ID NO：8之核酸序列所編碼)。位於融合蛋白之C-端VEGF同功異形體可獲可不包括一信號肽。
此外，本發明之融合蛋白可包括一有助於分離或鑑定該融合蛋白的C-端標記物。此類標記物可為一聚(His)標記、HA標記、Myc標記、V5或FLAG標記。
本發明之融合蛋白可含有(從N-端至C-端的方向)VEGF165、一Fc區域、一連結肽、一Fc區域及VEGF121。或者，本發明之融合蛋白可含有(從N-端至C-端的方向)VEGF121、一Fc區域、一連結肽、一Fc區域及VEGF165。各同功異形體可直接或經由一連結肽與一Fc區域連接，其中該連結肽可與介於該二Fc區域間的連結肽相同或不同。於一項具體實施態樣，所述之融合蛋白可具有一與SEQ ID NO：11(其係由SEQ ID NO：10之核酸序列所編碼)達至少80%(例如，至少99%、98%、97%、96%、95%、90%或85%)序列同一性的胺基酸序列。
習知方法(例如重組技術)可使用於製造本發明之融合蛋白。例如，可製得一編碼所述蛋白質之表現構體，並將其導入適合的宿主細胞(例如哺乳動物細胞)中。之後可將該於所述宿主細胞中表現的融合蛋白分離出。
本發明之融合蛋白可與一醫藥上可接受之載體混合，而形成一種醫藥組成物。所述之組成物可投藥予有其需要的個體用於治療癌症或抑制血管生成。本發明之融合蛋白亦可用於與其他癌症治療併用之組合療法。
本發明之融合蛋白亦可與經設計用於將該融合蛋白靶定至腫瘤及/或其締結血管之成分(例如，脂質、碳水化合物、聚合物或奈米粒子)結合或封裝於其中。
所述之組成物可與一醫藥上可接受之載體，例如。磷酸鹽緩衝食鹽水、碳酸氫鹽溶液及/或一佐劑調和。適宜之醫藥載體與稀釋劑(以及其藥用必需品)為該項技藝所已知。此類組成物可製備成一種可注射、液體溶液、乳劑或其他適合的配方。
佐劑之實例包括(但不限定於)明礬-沉澱物、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、單磷酰脂質A/海藻糖雙黴菌酸酯佐劑、含有短小棒桿菌和tRNA的油包水乳劑，及其他藉由模擬進化上保守分子之特定集合來完成增加免疫反應任務的物質，包括微脂體、脂多醣(LPS)、抗原的分子籠、細菌細胞壁的組分及內吞的核酸，如雙股RNA、單股DNA與未甲基化之含有CpG二核苷酸的DNA。其他實例包括霍亂毒素，大腸桿菌熱-不穩定腸毒素，脂質體，免疫刺激性複合物(ISCOM)，免疫刺激序列寡去氧核苷酸及氫氧化鋁。所述之組成物亦可包括一有助於活體內遞送之聚合物。
可將有效量之前述組成物以非經腸道方式，例如皮下注射，靜脈內注射或肌內注射進行投藥。亦可使用其他投藥途徑。熟練的從業者將能夠確定合適的劑量和投藥途徑。
可使用本發明之融合蛋進行治療的癌症包括固體腫瘤，如膠質母細胞瘤、結腸直腸癌、肺癌、腎癌、肝癌，腎臟癌、神經內分泌腫瘤、乳腺癌、食道癌、胃腸道間質瘤、黑素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、胰腺癌、前列腺癌，胃癌及頭頸癌。
本發明以下所敘述之實施例僅作為輔助說明，並非用於以任何方式限制本發明所揭露的其他部分。無需進一步詳細描述，相信習於本領域技術人員可基於本文的描述，最大程度地 利用本發明所揭露之內容。所有於本文引用的公開文獻皆以其完整內容通過引用方式併入本文。
實施例
本發明係製造一種與兩個人類IgG1之Fc區域融合的新穎嵌合型VEGF121-VEGF165雙聚體，作為有效的抗血管新生調制劑。經發現，本發明之嵌合型VEGF121-VEGF165雙聚體可減低3B-11內皮細胞的管形成，並抑制HCT-15癌細胞之侵襲性。而且，本發明發現VEGF121-VEGF165蛋白可減弱癌細胞中透過PI3K-AKT-mTOR途徑之VEGFR2-HIF-1 α信號傳遞作用。數據證明，本發明之嵌合型VEGF121-VEGF165蛋白可拮抗血管生成及HIF-1 α信號傳遞，顯示該蛋白能對抗對於抗血管生成治療產生的抗藥性。
VEGF 121 -VEGF 165 融合蛋白之構築及性質分析
經由將人類IgG1之Fc核酸序列分別與VEGF121序列之3’端及VEGF165序列之5’端融合，而產生一VEGF121-VEGF165融合體，其中該二Fc序列是藉由一連結肽序列連接。將該VEGF121-VEGF165融合核酸序列選殖入pcDNA3.1載體，產生用以表現VEGF121-VEGF165的表現載體。使用DNA定序確認最終構築體之完整性。所推導的蛋白質包括一段推定的26-aa信號肽(參見圖2)。將含有VEGF121-VEGF165融合基因之質體轉染至293T細胞株中。以西方轉漬法確認VEGF121-VEGF165融合蛋白之表現及分泌。於本實例發現，在得自經轉染之293T細胞的培養基及細胞溶解產物的樣品中，存在對應於VEGF121-VEGF165融合蛋白之~120kDa的單一條帶(數據未示)。重組蛋白於細胞係表現呈一種His-標記融合蛋白，並使用鎳親和性層析術進行純化。藉由西方轉漬法測定所純化得融合蛋白之純度及分子量(數據未示)。此等結果表示，VEGF121-VEGF165經由片段與一多肽連結肽共價連接而形成雙聚體。
VEGF 121 -VEGF 165 融合蛋白抑制由VEGF 165 所誘導之細胞增生
由於內皮細胞增生為早期血管生成反應所必需，本實例遂檢測VEGF121-VEGF165蛋白是否會影響受VEGF165刺激的3B-11細胞增生，此為一種方便用於管形成分析的內皮細胞模式(參見Zhou等人，Methods 2008,44(2)：190-195)。由圖3A顯示，VEGF165所誘導的3B-11細胞生長，係以濃度-依賴方式受到VEGF121-VEGF165阻斷。濃度222pM之VEGF165對於3B-11細胞增生的作用，容易地被濃度為42pM之重組VEGF121-VEGF165抑制，表示VEGF121-VEGF165蛋白能有效阻斷VEGF165所誘導的細胞增生。而且，VEGF121-VEGF165蛋白對於VEGF165所誘導之HCT-15癌細胞生長，呈現相似的抑制功效(參見圖3B)。吾等亦發現，當融合基因之質體轉染至3B-11及HCT-15細胞時，VEGF121-VEGF165蛋白會以自分泌方式，對於此等細胞之細胞增生呈現相似的抑制活性，雖然該抑制作用在統計學上不具顯著性(數據未示)。此等結果表示，VEGF121-VEGF165係經由壓制細胞增生(而非產生細胞毒性)來抑制細胞數量增加。再者，VEGF121-VEGF165可以自分泌方式抑制HCT-15之細胞轉變(數據未示)。本發明之結果指出，VEGF121-VEGF165重組蛋白能以自分泌及旁分泌方式，阻斷3B-11之細胞增生，及結腸癌細胞HCT-15之細胞增生與轉變。
VEGF 121 -VEGF 165 融合蛋白抑制由VEGF 165 所誘導之管形成
血管生成後期階段需要內皮細胞進行形態改變，而導致管腔形成。本實例檢測在有VEGF121-VEGF165蛋白存在下的活體外管形成。使用被誘導侵入三維膠原凝膠，並在其中形成毛細管狀管網絡的3B-11內皮細胞，進行活體外管形成分析。參見Zhou等人，Methods 2008,44(2)：190-195。
結果顯示，3B-11細胞能在正常條件下形成血管網絡，而VEGF165會增加血管形成的數量(參見圖4A)。然而，3B-11細胞之管狀構造形成數，因添加VEGF121-VEGF165蛋白而以濃度-依賴方式受到抑制(參見圖4A)。而且，VEGF121-VEGF165蛋白以旁分泌方式(圖4A)，及以自分泌方式(圖4B)，顯著抑制VEGF165所誘導的管 形成。此等結果證明，VEGF121-VEGF165嵌合型蛋白能於活體外抑制由VEGF165誘導的血管生成。
VEGF 121 -VEGF 165 融合蛋白抑制細胞移行
細胞移行為血管生成及腫瘤轉移的一項關鍵過程。本實例研究細胞移行是否會受VEGF121-VEGF165嵌合型蛋白影響。使用間隙-閉合移行分析來檢測細胞移行。結果與前述一致，VEGF121-VEGF165蛋白以自分泌方式，顯著抑制3B-11細胞的移行作用(參見圖5)。此外，結果亦顯示，HCT-15細胞由VEGF165誘導的移行作用，因添加VEGF121-VEGF165蛋白而以濃度-依賴方式受到抑制(參見圖6A)。VEGF121-VEGF165蛋白以旁泌方式(圖6A)，及以自分泌方式(圖6B)，顯著抑制細胞移行。由此等結果表示，VEGF121-VEGF165嵌合型蛋白能於抑制內皮細胞及腫瘤細胞的移行作用。
VEGF 121 -VEGF 165 融合蛋白妨害腫瘤侵襲
為驗證VEGF121-VEGF165嵌合型蛋白對於腫瘤細胞轉移之效用，本實例遂使用Transwell分析來檢測該蛋白對於細胞侵襲的影響。於無VEGF121-VEGF165存在下，VEGF165會誘導如密集穿透所呈現的侵襲能力(參見圖7)。但是，由VEGF165誘導之細胞侵襲會因添加VEGF121-VEGF165蛋白，而以濃度-依賴方式受到抑制。以增加濃度之VEGF121-VEGF165蛋白處理時，穿透的細胞數目明顯較單獨以VEGF165處理時減少(參見圖7)。此等結果表示，癌細胞之侵襲作用顯著受到添加VEGF121-VEGF165蛋白抑制，暗示該蛋白在壓制癌細胞轉移上扮演重要功能。
VEGF 121 -VEGF 165 嵌合型蛋白減弱透過PI3K-AKT-mTOR途徑之VEGFR2-HIF-1 α信號傳遞作用
為審核VEGF121-VEGF165嵌合型蛋白是否會減弱HIF-1 α信號傳遞作用，以減低對抗血管生成治療的抗性，本實例首先檢測VEGF121-VEGF165對於腫瘤細胞中VEGFR2-HIF-1 α-VEGF165軸之影響。Lon係受缺氧誘導因子-1 α(HIF-1 α)增量調節，且參與對於低氧可利用性之反應，使癌細胞 能適應缺氧環境。本實例係檢測該融合蛋白是否影響Lon蛋白酶之表現。使用西方轉漬分析測定HIF-1 α、VEGF165及Lon之表現。結果顯示，HCT-15癌細胞中之VEGFR2-HIF-1 α-VEGF165/Lon信號傳遞，係受到VEGF165處理及氯化鈷(CoCl2)刺激之缺氧而活化(數據未示)。然而，該信號傳遞之活化因添加VEGF121-VEGF165蛋白，而以濃度-依賴方式，在常氧及缺氧條件下受到抑制。重組VEGF121-VEGF165蛋白會減低由VEGF165及/或缺氧誘導之HIF-1 α、VEGF165、Lon與二氧磷基-VEGFR2的表現量(數據未示)。就機制上來說，VEGF121-VEGF165蛋白係透過阻制PI3K-AKT-mTOR途徑，而抑制VEGFR2-HIF-1 α-VEGF165/Lon信號傳遞的活化(數據未示)，表示VEGF121-VEGF165蛋白會克服，在缺氧條件下由PI3K-AKT-mTOR觸發至VEGFR2-HIF-1 α-VEGF165/Lon軸的存活機制。此等數據暗示，VEGF121-VEGF165能抑制癌細胞中透過PI3K-AKT-mTOR途徑的自分泌VEGFR2-HIF-1 α-VEGF165/Lon信號傳遞作用。
VEGF 121 -VEGF 165 融合蛋白於活體內阻礙腫瘤生長
前述之數據證明，嵌合型VEGF121-VEGF165蛋白能於活體外抑制內皮細胞之管形成，及干擾腫瘤細胞生長、移行與侵襲。於本實例進行異種移植腫瘤發生分析，以證明VEGF121-VEGF165蛋白於活體內對腫瘤的抑制功效。於該項分析是使用BALB/c裸鼠(6-8週齡)。將1×106個HCT-15細胞懸浮於0.2ml之Matrigel中，以皮下注射入裸鼠的背側(每隻小鼠1個部位)。每兩天檢查小鼠體中的腫瘤形成。將不同濃度之VEGF121-VEGF165蛋白(10、50或250ng/ml)，或PBS對照組溶液直接注射到小鼠體內的腫瘤中(參見圖8B)。偵測小鼠體重(參見圖8A)。然後將小鼠以CO2安樂死犧牲。
經VEGF121-VEGF165嵌合蛋白處理之小鼠體重並無明顯變化，表示本發明蛋白質對該等動物不具毒性(參見圖8A)。本發明之嵌合蛋白以劑量-依賴方式減低腫瘤生長(參見圖8B)。因此，本實例之研究證明VEGF121-VEGF165嵌合蛋白能於活體內抑制腫瘤生長。
材料與方法
細胞株及細胞培養：3B-11細胞購自ATCC(#CRL-2160，馬納薩斯，VA,USA)。3B-11細胞維持於DMEM培養基中，HCT-15細胞維持於補充10%(v/v)熱-不活化胎牛血清(FBS合格的；Invitrogen)、1% PSA(青黴素-鏈黴素-兩性黴素B；Biological industries,NY,USA)之培養基，培養於具備5% CO2之37℃濕潤化培養箱中。
VEGF121-VEGF165重組蛋白之純化：使用Biomics轉染試劑依pcDNA3.1載體無輔助劑(helper-free)系統(Biomics)之操作手冊，將質體轉染至293T細胞中。待培養36小時後，收集293T細胞培養物之上清液，並置於Ni-NTA樹脂上，以250mmol/L咪唑溶析，依據操作手冊進行純化。將重組蛋白通過Microcon離心過濾單元(Millipore,Bedford,MA,USA)濃縮。最後，以10% SDS-PAGE與西方轉漬法確認已純化之蛋白。
細胞增殖分析：使用CCK-8染料減少分析(Enzo,USA)檢測3B-11細胞及HCT-15細胞之增殖。將3B-11細胞或HCT-15細胞以不同濃度之VEGF121-VEGF165(42、83、125pM)進行前-處理30分鐘，加入市售之VEGF165(222pM,Abcam,Cambridge,MA,USA)，然後將細胞靜置24小時。於處理結束，將10μl之CCK-8溶液加入平盤的每孔中，並將平盤至於培養箱中靜置2~4小時。將平盤搖晃10秒後，經由使用微量平盤計讀機測量於450nm下之吸光值分析細胞存活度。所有測量皆進行三次。使用T-測試比較各組之差異。數據以平均值±SD表示。
集落形成分析：集落生成分析是一項基於單細胞生長成為集落之能力的活體外轉型分析。為檢測此能力，將VEGF121-VEGF165之質體轉染至HCT-15細胞(於10cm培養盤中處理過夜)，並以VEGF165重組蛋白222pM處理做為陽性對照組。次日，將經處理之HCT-15細胞(每孔~1×103個)平鋪於6-孔平盤中，並靜置於37℃培養箱中。每48小時添加含有10% FBS之新鮮RPMI培養基。於第14天結束後，將細胞以冰凍PBS清洗兩次，使用甲 醇固定10分鐘，之後以1%結晶紫甲醇溶液染色15分鐘，隨後以去離子水清洗。選出含有超過50個細胞之集落，並於顯微鏡下以200x倍率計量。
細胞移行分析：透過間隙-閉合移行分析，來測定細胞移行分析。將3B-11細胞或HCT-15細胞以不同濃度(42、83、125pM)之重組蛋白質處理16小時(37℃,5% CO2)。將此等細胞胰蛋白酶化，並懸浮於不含血清之DMEM或RPMI-1640培養基中。將總數8×105個懸浮於70μl不含血清之DMEM或RPMI-1640培養基中之細胞接種於各孔中(8x105個細胞/孔)，並靜置於37℃,5% CO2下培養。次日，使用滅菌的鑷子，溫和地將同上培養物-嵌件(Applied Biophysics,USA)取出，然後將每孔以2ml 0.1% FBS培養基填滿。使用顯微鏡監測細胞移行達48小時。
血管形成分析：將Corning Matrigel® Matrix(BD Biosciences,San Jose,CA,USA)溶液置於冰上解凍過夜，取50μl等量覆蓋於96-孔平盤並於37℃下靜置1小時使其固化。將50μl含有約8x105 3B-11細胞之補充10% FBS的DMEM培養基接種於鍍金屬的Matrigel Matrix上，並靜置於37℃下。將此等細胞以前述方法處理。該項分析進行三重複，並靜置於37℃,5% CO2下。於2小時後，以結合電腦之顯微鏡(Olympus，東京，日本)，於200x放大倍率下獲取類毛細管構造之形成影像。經由手動計算於200x放大倍率下，隨機選擇視野中相連細胞的數目來定量管狀構造。計數網絡形成之總管數。
細胞侵襲分析：細胞侵襲係使用配備Matrigel-塗覆濾膜(孔徑8μm)之小室(Corning Costar；Cambridge,MA,USA)進行評估。簡言之，將濾膜預先塗覆以基底膜蛋白(Matrigel；BD Biosciences,San Jose,CA,USA)，並靜置於37℃,5% CO2下過夜令其乾燥。將培養於不含FBS之培養基中的HCT-15細胞(8x105)接種於上層小室，並將下層小室充滿10% FBS培養基。待於37℃下靜置48小時後，將位於嵌件上面未移行的細胞以棉花棒去除。將已通過濾膜之細胞於甲醇中進行固定，並使用結晶紫染色。在顯微 鏡下計數於隨機選擇視野中的細胞數量。
免疫轉漬分析：將HCT-15細胞以10ml培養基含1.5×106個細胞之密度接種於10mm培養盤，並依如前述之方法於常氧及缺氧(CoCl2，氯化鈷；150μM)條件下處理24小時。使用BCA蛋白分析法測定總體蛋白質濃度。將等量之總體蛋白質使用10% SDS-PAGE溶解，並經電轉漬至聚偏二氟乙烯膜上。將膜以脫脂牛奶進行封阻，並於4℃下與第一級抗體進行探測反應過夜。然後將膜與適當的HRP-結合第二級抗體(GeneTex，新竹，台灣)進行反應，並使用增強化學發光方法(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)將具有免疫反應之條帶顯色。用於本發明之抗體係如說明書所述購得或製備得。對抗人類Lon之抗體製備方法如前所述。參見Wang等人，Cancer Sci 2010,101(12)：2612-2620；及Cheng等人，Cell death & disease 2013,4,e681。Phospho-PI3K(Tyr458/Tyr199,#4228)、phospho-AKT(Ser473,#4060)及phoshpo-mTOR(Ser2448,#2971)抗體係購自Cell Signaling Technology(Beverly,MA,USA)；HIF-1 α(#610958)抗體係購自BD Biosciences(Franklin Lakes,NJ)；phospho-VEGFR2(Tyr1054/Tyr1059,ab5473)、VEGF-165A(ab69479)抗體係購自Abcam(Cambridge,MA,USA)；beta-肌動蛋白抗體係購自GeneTex(GTX109639，新竹，台灣)。
統計方法：於本發明使用參數Student氏t檢定法判斷所設定條件組之間的差異顯著性。一般而言，P值<0.05係認為在統計學上具有顯著性(Student氏t檢定，*p<0.05、**p<0.01及***p<0.001)。
其他具體實施態樣
本說明書中所揭示之全部特徵可以任何組合方式組合。於是，本說明書中所揭示之各別特徵可由依相同、相等或類似目的之替代特徵取代。因此，除非另行清楚地指示，所揭示之各特徵僅為一系列同等物或類似特徵之實例。
從前述之說明，習於該項技藝人士可容易地確定本發明之基本特徵，且在未偏離其範圍的情況下，可進行本發明之 各種改變與修飾，以使其適於各種不同用途與狀況。因此，於申請專利範圍內亦包含其他具體態樣。
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<160> 11
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<210> 1
<211> 444
<212> DNA
<213> 人類
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(444)
<223> VEGF121
<400> 1
Figure 105139819-A0202-12-0016-1
Figure 105139819-A0202-12-0017-2
<210> 2
<211> 147
<212> PRT
<213> 人類
<400> 2
Figure 105139819-A0202-12-0017-3
Figure 105139819-A0202-12-0018-4
<210> 3
<211> 576
<212> DNA
<213> 人類
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(576)
<223> VEGF165
<400> 3
Figure 105139819-A0202-12-0018-5
Figure 105139819-A0202-12-0019-6
<210> 4
<211> 191
<212> PRT
<213> 人類
<400> 4
Figure 105139819-A0202-12-0020-7
<210> 5
<211> 711
<212> DNA
<213> 人類
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(711)
<223> Fc
<400> 5
Figure 105139819-A0202-12-0021-8
Figure 105139819-A0202-12-0022-9
<210> 6
<211> 237
<212> PRT
<213> 人類
<400> 6
Figure 105139819-A0202-12-0022-10
Figure 105139819-A0202-12-0023-11
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成連結肽
<400> 7
Figure 105139819-A0202-12-0023-12
<210> 8
<211> 78
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(78)
<223> 信號肽
<400> 8
Figure 105139819-A0202-12-0024-13
<210> 9
<211> 26
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成構體
<400> 9
Figure 105139819-A0202-12-0024-14
<210> 10
<211> 2388
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2388)
<223> VEGF121-Fc-連結肽-Fc-VEGF165-6xHis標記
<400> 10
Figure 105139819-A0202-12-0025-15
Figure 105139819-A0202-12-0026-16
Figure 105139819-A0202-12-0027-17
Figure 105139819-A0202-12-0028-18
Figure 105139819-A0202-12-0029-19
<210> 11
<211> 795
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成構體
<400> 11
Figure 105139819-A0202-12-0030-20
Figure 105139819-A0202-12-0031-21
Figure 105139819-A0202-12-0032-22
Figure 105139819-A0202-12-0033-23

Claims (15)

  1. 一種融合蛋白質，包含：第一血管內皮生長因子(VEGF)同功異形體，第二血管內皮生長因子同功異形體，及介於該第一同功異形體與該第二同功異形體間的一雙聚化功能域；其中該雙聚化功能域含有兩個Fc區域；其中，第一血管內皮生長因子同功異形體為VEGF121，第二血管內皮生長因子同功異形體為VEGF165。
  2. 如請求項1所述之融合蛋白質，其中，該雙聚化功能域進一步包含一介於該二Fc區域間的連結肽。
  3. 如請求項2所述之融合蛋白質，其中該融合蛋白質包含(從N-端至C-端的方向)VEGF121、該二Fc區域其中之一、該連結肽、該二Fc區域其中另一個及VEGF165。
  4. 如請求項2所述之融合蛋白質，其中該融合蛋白質包含(從N-端至C-端的方向)VEGF165、該二Fc區域其中之一、該連結肽、該二Fc區域其中另一個及VEGF121。
  5. 如請求項2-4中任一項所述之融合蛋白質，其中該連結肽為一由15至30個胺基酸組成之可撓性連結肽。
  6. 如請求項5所述之融合蛋白質，其中該連結肽係(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n，其中n為3。
  7. 如請求項6所述之融合蛋白質，其中該各別之Fc區域為一人類IgG1 Fc區域。
  8. 如請求項7所述之融合蛋白質，其進一步包含一肽類標記物。
  9. 如請求項7所述之融合蛋白質，其中該標記物為C-端6X-His標記。
  10. 如請求項7所述之融合蛋白質，其進一步包含一N-端信號肽。
  11. 如請求項10所述之融合蛋白質，其中該融合蛋白質具有SEQ ID NO：11所示之序列。
  12. 一種核酸分子，包含一編碼如請求項1-11中任一項所述之融合蛋白質的核酸序列。
  13. 一種宿主細胞，包含如請求項12所述之核酸分子。
  14. 一種醫藥組成物，包含如請求項1-11中任一項所述之融合蛋白質及一醫藥上可接受的載劑。
  15. 一種使用請求項14之醫藥組成物於製造供治療癌症藥物之用途；其中，該癌症與血管生成有關。
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