TW202122117A - 用於治療病毒感染之組合物及方法 - Google Patents

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詹姆士 Ｍ 巴爾科維克
丹尼爾 Ｃ 班森
艾倫 柏查德特
湯姆士 Ｐ 布雷迪
志勇 陳
傑森 科爾
娟娟 水 杜
西蒙 達爾曼
萬龍 江
成 林
艾蘭 納卡菲克
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Abstract

用於治療病毒感染之組合物及方法包括含有連接於Fc單體、Fc域及Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽之病毒神經胺糖酸酶抑制劑(例如，紮那米韋(zanamivir)、帕拉米韋(peramivir)或其類似物)之結合物。詳言之，結合物可用於治療病毒感染(例如，流感病毒感染)。

Description

用於治療病毒感染之組合物及方法
對於用於流感之新穎抗病毒治療之需求很顯著且在醫學領域中尤其至關重要。流感病毒(流感(influenza或flu)之病原體)每年造成三百萬至五百萬例嚴重疾病，且在全世界造成大約500,000例死亡。雖然大多數人在約一週至兩週內完全地自流感恢復，但其他人會發展危及生命之併發症，諸如肺炎。因此，流感可為致命的，尤其對於年輕人、老人或慢性病患。具有微弱或受損免疫系統之人，諸如具有晚期HIV感染之人或移植患者(其免疫系統在醫學上受到抑制以預防移植器官排斥)處於與流感有關之併發症的較大風險中。懷孕婦女及幼兒亦處於併發症之高風險中。
用於流感之抗病毒治療之開發已成為一項持續挑戰。數種流感抗病毒劑已獲得批准用於臨床，且當製備疫苗時，此等劑在調節疾病嚴重程度及控制泛流行病方面發揮重要作用。然而，已出現針對最常用之抑制劑的耐藥性病毒株。
流感抗病毒劑主要靶向在流感病毒粒子之表面上呈現之蛋白質。流感病毒之包膜含有兩種免疫顯性醣蛋白，即血球凝集素及神經胺糖酸酶，其在病毒感染及擴散中發揮關鍵作用。血球凝集素經由其與表面唾液酸之相互作用實現該病毒與宿主細胞之附接，尤其起始進入。神經胺糖酸酶為外切糖苷酶，其在受感染宿主細胞之表面上裂解來自聚醣結構之唾液酸(末端神經胺糖酸殘基)，從而釋放後代病毒且允許該病毒自該宿主細胞擴散至未受感染周圍細胞。神經胺糖酸酶之抑制因此充當抗病毒藥物之藥理學標靶。用於減少病毒擴散之病毒神經胺糖酸酶抑制劑已經鑑別，包括奧司他韋(oseltamivir)(TamifluTM )、紮那米韋(zanamivir)(RelenzaTM )及帕拉米韋(peramivir)(RapivabTM )。
然而，移植接受者之流感的特徵仍在於延長之病毒遮蔽，從而增加發展耐藥性病毒株之可能性。需要用於治療流感之新的更有效療法。
本發明係關於用於抑制病毒生長之結合物、組合物及方法，及用於治療病毒感染之方法。詳言之，該等結合物含有抑制流感病毒神經胺糖酸酶之部分(例如，紮那米韋、帕拉米韋或其類似物)之單體或二聚體，其結合於Fc單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽。該等結合物中之神經胺糖酸酶抑制劑(例如，紮那米韋、帕拉米韋或其類似物)靶向在病毒粒子之表面上的神經胺糖酸酶。該等結合物中之Fc單體或Fc域結合於免疫細胞(例如，嗜中性粒細胞)上之FcγR (例如，FcRn、FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIc、FcγRIIIa及FcγRIIIb)以活化吞噬作用及效應子功能，諸如抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)，因此由免疫細胞吞沒及破壞病毒粒子且進一步增強該等結合物之抗病毒活性。該白蛋白或白蛋白結合肽可例如藉由使白蛋白結合於再循環之新生兒Fc受體而延長該結合物之半衰期。該等組合物適用於抑制病毒生長之方法及治療病毒感染(諸如藉由A型流感病毒、B型流感病毒及C型流感病毒引起之彼等)之方法。
在第一態樣，本發明提供由式(D-I)、(M-I)、(1)或(2)中任一者所述之結合物：
Figure 02_image001
、
Figure 02_image003
、
Figure 02_image005
或
Figure 02_image007
； (D-I)                   (M-I)                  (1)                      (2) 其中各A1 及各A2 係獨立地選自式(A-I)-(A-XII)中任一者：
Figure 02_image009
、
Figure 02_image011
、
Figure 02_image013
、
Figure 02_image015
、
Figure 02_image017
、 (A-I)                     (A-II)                 (A-III)             (A-IV)                (A-V)
Figure 02_image019
、
Figure 02_image021
、
Figure 02_image023
、
Figure 02_image025
、 (A-VI)                (A-VII)                 (A-VIII)                (A-IX)
Figure 02_image027
、
Figure 02_image029
、
Figure 02_image031
； (A-X)                 (A-XI)                      (A-XII) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ；R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br；R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H；R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ；X係選自-O-及-S-；Y係選自
Figure 02_image033
R6 係選自
Figure 02_image035
、
Figure 02_image037
、
Figure 02_image039
、
Figure 02_image041
、
Figure 02_image043
、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
Figure 02_image091
、
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、
Figure 02_image095
及
Figure 02_image097
； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； n為1或2； 各E包含Fc域單體、白蛋白、白蛋白結合肽或Fc結合肽； L係共價附接至E且附接至各A1 或各A1 及A2 之各Y的連接體； T係1至20之整數，並且 式(D-I)、(M-I)、(1)或(2)中之每條波浪線表示L與各E共價附接。 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，n為1，並且各E包括Fc域單體(例如，具有SEQ ID NO：1-138中任一者之序列之Fc域單體)、白蛋白(例如，具有SEQ ID NO：139-141中任一者之序列之白蛋白)、白蛋白結合肽或Fc結合肽；  在一些實施例中，n為2，並且各E包括Fc域單體(例如，具有SEQ ID NO：1-138中任一者之序列之Fc域單體)，其中Fc域單體二聚化以形成Fc域； L係共價附接至E且附接至各A1 及/或A2 之各Y的連接體； T係1至20之整數(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，並且式(D-I)、(M-I)、(1)或(2)中之每條波浪線表示L與各E共價附接(例如，藉助於共價鍵或連接體)；或其醫藥學上可接受之鹽。當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各A1 -L或各A1 -L-A2 可獨立地選擇(例如，獨立地選自本文描述之A1 -L或A1 -L-A2 結構中之任一者)。
在本文所述之任何態樣之較佳實施例中，n為2，並且各E包括Fc域單體(例如，具有SEQ ID NO：1-138中任一者之序列之Fc域單體)。在具有兩個Fc域單體之結合物(例如，式(1)、式(2)、其中n等於2之式(D-I)或其中n等於2之(M-I)之結合物)中，Fc域單體二聚化以形成Fc域。
在另一態樣中，本發明提供由式(D-I)描述之結合物：
Figure 02_image001
(D-I) 其中各E包括Fc域單體(例如，具有SEQ ID NO：1-138中任一者之序列之Fc域單體)；各A1 -L-A2 中之L係共價附接至E中之鉸鏈半胱胺酸之硫原子且附接至A1 及A2 中之每一者的連接體； n為1或2(例如，當n為2時，兩個Fc域單體二聚化以形成Fc域)；T係1至20之整數(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，且連接至E之波浪線表示各A1 -L-A2 共價附接(例如，藉助於共價鍵或連接體)至E中鉸鏈半胱胺酸之硫原子，或其醫藥學上可接受之鹽。當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各A1 -L-A2 可獨立地選擇(例如，獨立地選自本文描述之A1 -L-A2 結構中之任一者)。
在另一態樣中，本發明提供由式(D-I)描述之結合物：
Figure 02_image001
(D-I) 其中各E包括Fc域單體(例如，具有SEQ ID NO：1-138中任一者之序列之Fc域單體)；A1 -L-A2 中之L係共價附接至E中之表面暴露離胺酸之氮原子並且附接至A1 及A2 中之每一者的連接體；n為1或2(例如，當n為2時，兩個Fc域單體二聚化以形成Fc域)；T係1至20之整數(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，並且連接至E之波浪線表示各A1 -L-A2 共價附接(例如，藉助於共價鍵或連接體)至E中表面暴露離胺酸之氮原子，或其醫藥學上可接受之鹽。當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各A1 -L-A2 可獨立地選擇(例如，獨立地選自本文描述之A1 -L-A2 結構中之任一者)。在一些實施例中，A1 及A2 中之每一者可獨立地選自式(A-I)、(A-II)、(A-VI)或(A-VII)中之任一者。在其他實施例中，A1 及A2 中之每一者可獨立地選自式(A-I)。
在另一態樣中，本發明提供由式(M-I)描述之結合物：
Figure 02_image003
(M-I) 其中各E包括Fc域單體(例如，具有SEQ ID NO：1-138中任一者之序列之Fc域單體)；各L-A1 中之L係共價附接至E中之鉸鏈半胱胺酸之硫原子且附接至A1 之連接體；n為1或2(例如，當n為2時，兩個Fc域單體二聚化以形成Fc域)；T係1至20之整數(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)；並且與E連接之波浪線表示各L-A1 共價附接(例如，藉助於共價鍵或連接體)至E中鉸鏈半胱胺酸之硫原子，或其醫藥學上可接受之鹽。當T大於1時(例如T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，各A1 可以獨立地選自由式(A-I)-(A-XII)描述之任何結構。在一些實施例中，各A1 可獨立地選自式(A-I)、(A-II)、(A-VI)或(A-VII)中之任一者。在其他實施例中，各A1 可獨立地選自式(A-I)。
在另一態樣中，本發明提供由式(M-I)描述之結合物：
Figure 02_image003
(M-I) 其中各E包括Fc域單體(例如，具有SEQ ID NO：1-138中任一者之序列之Fc域單體)；各L-A1 中之L係共價附接至E中表面暴露離胺酸之氮原子且附接至A1 之連接體；n為1或2(例如，當n為2時，兩個Fc域單體二聚化以形成Fc域)；T係1至20之整數(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，連接至E之波浪線表示各L-A1 共價附接(例如，藉助於共價鍵或連接子)至E中表面暴露離胺酸之氮原子，或其醫藥學上可接受之鹽。當T大於1時(例如T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，各A1 可以獨立地選自由式(A-I)-(A-XII)描述之任何結構。在一些實施例中，各A1 可獨立地選自式(A-I)、(A-II)、(A-VI)或(A-VII)中之任一者。在其他實施例中，各A1 可獨立地選自式(A-I)。
在一態樣中，本發明提供一種由式(1)描述之結合物：
Figure 02_image005
(1) 其中各A1 及各A2 係獨立地選自式(A-I)-(A-XII)中任一者； 各E包含Fc域單體(例如，具有SEQ ID NO: 1-138中任一者之序列的Fc域單體)；各A1 -L-A2 中之L係共價附接至各E中之鉸鏈半胱胺酸的硫原子且附接至A1 及A2 中每一者之連接體；T為1至20之整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，且連接至兩個E之兩條波浪線指示各A1 -L-A2 共價附接(例如，藉助於共價鍵或連接體)至兩個E中之兩個鉸鏈半胱胺酸的一對硫原子，或其醫藥學上可接受之鹽。當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各A1 -L-A2 可獨立地經選擇(例如，獨立地選自本文所述之A1 -L-A2 結構中任一者)。在一些實施例中，A1 及A2 中之每一者可獨立地選自式(A-I)、(A-II)、(A-VI)或(A-VII)中之任一者。在其他實施例中， A1 A2 中之每一者可獨立地選自式(A-I)。
在另一態樣中，本發明提供一種由式(1)描述之結合物：
Figure 02_image102
(1) 其中各A1 及各A2 係獨立地選自式(A-I)-(A-V)中任一者； 各E包含Fc域單體(例如，具有SEQ ID NO: 1-138中任一者之序列的Fc域單體)；各A1 -L-A2 中之L係共價附接至各E中之鉸鏈半胱胺酸的硫原子且附接至A1 及A2 中每一者之連接體；T為1至20之整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，且連接至兩個E之兩條波浪線指示各A1 -L-A2 共價附接(例如，藉助於共價鍵或連接體)至兩個E中之兩個鉸鏈半胱胺酸的一對硫原子，或其醫藥學上可接受之鹽。當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各A1 -L-A2 可獨立地經選擇(例如，獨立地選自本文所述之A1 -L-A2 結構中任一者)。
在另一態樣中，本發明提供一種由式(1)描述之結合物：
Figure 02_image005
(1) 其中各A1 及各A2 係獨立地選自式(A-VI)-(A-IX)中任一者； 各E包含Fc域單體(例如，具有SEQ ID NO: 1-138中任一者之序列的Fc域單體)；各A1 -L-A2 中之L係共價附接至各E中之鉸鏈半胱胺酸的硫原子且附接至A1 及A2 中每一者之連接體；T為1至20之整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，且連接至兩個E之兩條波浪線指示各A1 -L-A2 共價附接(例如，藉助於共價鍵或連接體)至兩個E中之兩個鉸鏈半胱胺酸的一對硫原子，或其醫藥學上可接受之鹽。當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各A1 -L-A2 可獨立地經選擇(例如，獨立地選自本文所述之A1 -L-A2 結構中任一者)。
在另一態樣中，本發明提供一種由式(2)描述之結合物：
Figure 02_image007
(2) 其中各A1 係獨立地選自式(A-I)-(A-XII)中任一者；各E包含Fc域單體(例如，具有SEQ ID NO: 1-138中任一者之序列的Fc域單體)；各L-A1 中之L係共價附接至E中之鉸鏈半胱胺酸的硫原子且附接至A1 之連接體；T為1至20之整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，且連接至兩個硫原子之兩條波浪線指示各L-A1 共價(例如，藉助於共價鍵或連接體)附接至兩個E中之兩個鉸鏈半胱胺酸的一對硫原子，或其醫藥學上可接受之鹽。當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各A1 可獨立地選自式(A-I)-(A-XII)中任一者。在一些實施例中，A1 及A2 中之每一者可獨立地選自式(A-I)、(A-II)、(A-VI)或(A-VII)中之任一者。在其他實施例中， A1 A2 中之每一者可獨立地選自式(A-I)。
在另一態樣中，本發明提供一種由式(2)描述之結合物：
Figure 02_image007
(2) 其中各A1 係獨立地選自式(A-I)-(A-V)中任一者；各E包含Fc域單體(例如，具有SEQ ID NO: 1-138中任一者之序列的Fc域單體)；各L-A1 中之L係共價附接至E中之鉸鏈半胱胺酸的硫原子且附接至A1 之連接體；T為1至20之整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，且連接至兩個硫原子之兩條波浪線指示各L-A1 共價附接(例如，藉助於共價鍵或連接體)至兩個E中之兩個鉸鏈半胱胺酸的一對硫原子，或其醫藥學上可接受之鹽。當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各A1 可獨立地選自式(A-I)-(A-V)中任一者。
在另一態樣中，本發明提供一種由式(2)描述之結合物：
Figure 02_image007
(2) 其中各A1 係獨立地選自式(A-VI)-(A-IX)中任一者；各E包含Fc域單體(例如，具有SEQ ID NO: 1-138中任一者之序列的Fc域單體)；各L-A1 中之L係共價附接至E中之鉸鏈半胱胺酸的硫原子且附接至A1 之連接體；T為1至20之整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，且連接至兩個硫原子之兩條波浪線指示各L-A1 共價附接(例如，藉助於共價鍵或連接體)至兩個E中之兩個鉸鏈半胱胺酸的一對硫原子，或其醫藥學上可接受之鹽。當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各A1 可獨立地選自式(A-VI)-(A-IX)中任一者。
在前述實施例中任一者之一些實施例中，各E包括具有SEQ ID NO: 1-138中任一者之序列的Fc域單體。
在一些實施例中，該硫原子對中之至少一者係對應於SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之鉸鏈半胱胺酸，亦即SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys10、Cys13、Cys16或Cys18 (例如，其硫原子)的硫原子。在一些實施例中，該硫原子對係對應於SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11中之Cys10及Cys13、SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11中之Cys10及Cys16、SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11中之Cys 30及Cys18、SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11中之Cys13及Cys 36、SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11中之Cys13及Cys 38及/或SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11中之Cys 36及Cys 38 (例如，其硫原子)的硫原子。
在一些實施例中，當T為2時，該硫原子對係SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11中之Cys10及Cys13或SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11中之Cys 36及Cys 38 (例如，對應於其之硫原子)。
在一些實施例中，該硫原子對包括來自各E之半胱胺酸之一硫原子，亦即，L-A連同其所附接之硫原子形成兩個Fc域(例如，包含SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之序列的兩個Fc域)之間的橋。在一些實施例中，該硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys10(例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys10(例如，其硫原子)的硫原子。在一些實施例中，該硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子。在一些實施例中，該硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys16 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys16 (例如，其硫原子)的硫原子。在一些實施例中，該硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys18 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys18 (例如，其硫原子)的硫原子。
在一些實施例中，當T為2時，硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子，及對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子。在一些實施例中，當T為2時，硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子，及對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys16 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys16 (例如，其硫原子)的硫原子。在一些實施例中，當T為2時，硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子，及對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys18 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys18 (例如，其硫原子)的硫原子。
在一些實施例中，當T為2時，硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子，及對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys16 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys16 (例如，其硫原子)的硫原子。在一些實施例中，當T為2時，硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子，及對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys18 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys18 (例如，其硫原子)的硫原子。
在一些實施例中，當T為2時，硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys16 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys16 (例如，其硫原子)的硫原子，及對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys18 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys18 (例如，其硫原子)的硫原子。
在一些實施例中，當T為3時，硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子；對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子；及對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys16 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys16 (例如，其硫原子)的硫原子。在一些實施例中，當T為3時，硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子；對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子；及對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys18 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys18 (例如，其硫原子)的硫原子。在一些實施例中，當T為3時，硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子；對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys18 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys18 (例如，其硫原子)的硫原子；及對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys16 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys16 (例如，其硫原子)的硫原子。在一些實施例中，當T為3時，硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子；對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys18 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys18 (例如，其硫原子)的硫原子；及對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys16 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys16 (例如，其硫原子)的硫原子。
在一些實施例中，當T為3時，硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子；對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子；對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys16 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys16 (例如，其硫原子)的硫原子；及對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys18 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys18 (例如，其硫原子)的硫原子。
在一些實施例中，該結合物具有結構：
Figure 02_image106
其中a、b、c及d各自獨立地為0或1且其中當a、b、c或d為0時，兩個硫原子形成二硫鍵。
在一些實施例中，a為1且b、c及d為0。在一些實施例中，a及b為1且c及d為0。在一些實施例中，a及c為1且b及d為0。在一些實施例中，a及d為1且b及c為0。在一些實施例中，a、b及c為1且d為0。在一些實施例中，a、b及d為1且c為0。在一些實施例中，a、c及d為1且b為0。在一些實施例中，b及c為1且a及d為0。在一些實施例中，b及d為1且a及c為0。在一些實施例中，b、c及d為1且a為0。在一些實施例中，c及d為1且a及b為0。在一些實施例中，a、b、c及d為1。
在一些實施例中，各E包含序列 MVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 4)。
在一些實施例中，各E包含序列 MVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 33)。
在一些實施例中，該硫原子對中之至少一者係對應於SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 33之鉸鏈半胱胺酸，亦即Cys10及/或Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子。在一些實施例中，該硫原子對係對應於SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 33中之Cys10及Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子。
在一些實施例中，該硫原子對包括來自各E之半胱胺酸之一硫原子，亦即，L-A連同其所附接之硫原子形成兩個Fc域(例如，包含SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 33之序列的兩個Fc域)之間的橋。在一些實施例中，該硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 33之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 33之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子。在一些實施例中，該硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 33之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 33之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子。在一些實施例中，當T為2時，硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 33之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 33之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子，及對應於來自一個E之SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 33之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 33之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子。
在一些實施例中，該結合物具有結構：
Figure 02_image108
其中a及b各自獨立地為0或1且其中當a或b為0時，兩個硫原子形成二硫鍵。在一些實施例中，a為1且b為0。在一些實施例中，a為0且b為1。在一些實施例中，a及b為1。
在一些實施例中，該硫原子對中之至少一者係對應於SEQ ID NO: 8之鉸鏈半胱胺酸，亦即Cys10及/或Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子。在一些實施例中，該硫原子對係對應於SEQ ID NO: 8中之Cys10及Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子。
在一些實施例中，該硫原子對包括來自各E之半胱胺酸之一硫原子，亦即，L-A連同其所附接之硫原子形成兩個Fc域(例如，包含SEQ ID NO: 8之序列的兩個Fc域)之間的橋。在一些實施例中，該硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 8之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 8之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子。在一些實施例中，該硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 8之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 8之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子。在一些實施例中，當T為2時，硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 8之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 8之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子，及對應於來自一個E之SEQ ID NO: 8之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 8之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子。
在一些實施例中，該結合物具有結構：
Figure 02_image110
其中a及b各自獨立地為0或1且其中當a或b為0時，兩個硫原子形成二硫鍵。在一些實施例中，a為1且b為0。在一些實施例中，a為0且b為1。在一些實施例中，a及b為1。
在一些實施例中，該結合物具有結構：
Figure 02_image112
其中a及b各自獨立地為0或1且其中當a或b為0時，兩個硫原子形成二硫鍵。在一些實施例中，a為1並且b為0。在一些實施例中，a為0並且b為1。在一些實施例中，a及b為1。
在一些實施例中，該結合物具有結構：
Figure 02_image114
其中a及b各自獨立地為0或1且其中當a或b為0時，兩個硫原子形成二硫鍵。在一些實施例中，a為1且b為0。在一些實施例中，a為0且b為1。在一些實施例中，a及b為1。
在一些實施例中，該結合物具有結構：
Figure 02_image116
其中a及b各自獨立地為0或1且其中當a或b為0時，該等硫原子為硫醇。在一些實施例中，a為1且b為0。在一些實施例中，a為0且b為1。在一些實施例中，a及b為1。
在前述三個態樣之一些實施例中，該氮原子為表面暴露離胺酸之氮，例如對應於SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Lys35、Lys63、Lys77、Lys79、Lys106、Lys123、Lys129、Lys181、Lys203、Lys228或Lys236 (例如，其氮原子)的氮原子。在一些實施例中，該氮原子係對應於SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Lys65、Lys79、Lys108、Lys230及/或Lys238 (例如，其氮原子)的氮原子。
在一些實施例中，該結合物具有結構：
Figure 02_image118
其中a、b、c、d及e各自獨立地為0或1且其中當a、b、c、d或e為0時，兩個氮原子為NH2 。在一些實施例中，a為1且b、c、d及e為0。在一些實施例中，b為1且a、c、d及e為0。在一些實施例中，c為1且a、b、d及e為0。在一些實施例中，d為1且a、b、c及e為0。在一些實施例中，e為1且a、b、c及d為0。在一些實施例中，a及b為1且c、d及e為0。在一些實施例中，a及c為1且b、d及e為0。在一些實施例中，a及d為1且b、c及e為0。在一些實施例中，a及e為1且b、c及d為0。在一些實施例中，b及c為1且a、d及e為0。在一些實施例中，b及d為1且a、c及e為0。在一些實施例中，b及e為1且a、c及d為0。在一些實施例中，c及d為1且a、b及e為0。在一些實施例中，c及e為1且a、b及d為0。在一些實施例中，d及e為1且a、b及c為0。在一些實施例中，a、b及c為1且d及e為0。在一些實施例中，a、b及d為1且c及e為0。在一些實施例中，a、b及e為1且c及d為0。在一些實施例中，a、c及d為1且b及e為0。在一些實施例中，a、c及e為1且b及d為0。在一些實施例中，a、d及e為1且b及c為0。在一些實施例中，b、c及d為1且a及e為0。在一些實施例中，b、d及e為1且a及c為0。在一些實施例中，c、d及e為1且a及b為0。
在本文所述之任何結合物的一些實施例中，該結合物形成包括Fc域之均二聚體。在本文所述之結合物的一些實施例中，E與另一E均二聚以形成Fc域。
在另一態樣中，本發明提供一種由式(D-I)描述之結合物：
Figure 02_image001
(D-I) 其中E包括白蛋白(例如，具有SEQ ID NO: 139-141中任一者之序列的白蛋白)、白蛋白結合肽或Fc結合肽；各A1 -L-A2 中之L係獨立地共價附接至E中之表面暴露半胱胺酸的硫原子或表面暴露離胺酸的氮原子且附接至A1 及A2 中每一者之連接體；n為1；T為1至20之整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，且連接至E之波浪線指示各A1 -L-A2 獨立地共價附接至E中之溶劑暴露半胱胺酸的硫原子或溶劑暴露離胺酸的氮原子，或其醫藥學上可接受之鹽。當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各A1 -L-A2 可獨立地經選擇(例如，獨立地選自本文所述之A1 -L-A2 結構中任一者)。在一些實施例中，A1 A2 中之每一者可獨立地選自式(A-I)、(A-II)、(A-VI)或(A-VII)中之任一者。在其他實施例中，A1 A2 中之每一者可獨立地選自式(A-I)。
在上述之較佳實施例中，x為2。
在另一態樣中，本發明提供由式(M-I)描述之結合物：
Figure 02_image003
(M-I) 其中E包括白蛋白(例如，具有SEQ ID NO: 139-141中任一者之序列的白蛋白)、白蛋白結合肽或Fc結合肽；各L-A1 中之L係獨立地共價附接至E中之表面暴露半胱胺酸的硫原子或表面暴露離胺酸的氮原子且附接至A1 之連接體；n為1；T為1至20之整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)；且連接至E之波浪線指示各L-A1 獨立地共價附接至E中之溶劑暴露半胱胺酸的硫原子或溶劑暴露離胺酸的氮原子，或其醫藥學上可接受之鹽。當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各A1 可獨立地選自由式(A-I)-(A-XII)描述之任何結構。在一些實施例中，各A1 可獨立地選自式(A-I)、(A-II)、(A-VI)或(A-VII)中之任一者。在其他實施例中，各A1 可獨立地選自式(A-I)。在上述之較佳實施例中，x為2。
在一些實施例中，各E包括具有SEQ ID NO: 139-141中任一者之序列的白蛋白。
在一些實施例中，T為1並且L-A1 共價附接至對應於SEQ ID NO：139之Cys34之硫原子。
表1a之中間物可藉由熟習此項技術者已知之任何合適方法，包括本文所述或例示之任何方法結合於Fc域或Fc域單體(例如，藉助於連接體)。在一些實施例中，該結合物(例如，由(1)、(2)、(D-I)-(D-XI)或(M-I)-(M-XI)中之任一者描述之結合物)包括E，其中E為Fc域單體或Fc域(例如，Fc域單體或Fc域，各Fc域單體獨立地具有SEQ ID NO: 1-138中之任一者之序列)。在較佳實施例中，E之一或多個表面暴露離胺酸殘基的一或多個氮原子或E中之一或多個表面暴露半胱胺酸的一或多個硫原子共價結合於連接體(例如，PEG2 -PEG20 連接體)。結合於E之連接體可經官能化，以致其可反應以與本文所述之任何Int (例如，表1a之Int)形成共價鍵。在較佳實施例中，E結合於經疊氮基官能化之連接體且Int (例如，表1a之Int)經炔基官能化。E之連接體-疊氮基及Int之連接體-炔結合(例如，藉由點擊化學)形成本發明結合物，例如由式(5)描述之結合物。在其他實施例中，E結合於經炔基官能化之連接體且Int (例如，表1a之Int)經疊氮基官能化。E之連接體-炔及Int之連接體-疊氮基結合(例如，藉由點擊化學；參見例如圖103)形成本發明結合物，例如由式(1)、(2)、(D-I)-(D-XI)或(M-I)-(M-XI)中之任一者描述之結合物。 表1a：中間物
Figure 02_image122
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Figure 02_image150
Figure 02_image152
Figure 02_image154
Figure 02_image156
另一態樣中，本發明提供表1b之結合物。如表所示，表1b之各結合物對應於式(M-I)或式(D-I)之結合物。表1b之結合物包括藉由表1a之Int與連接體共價反應形成之結合物，該連接體轉而與E(例如，Fc域單體、白蛋白、白蛋白結合肽或Fc結合肽)結合。在一些實施例中，Int之反應性部分(例如，炔或疊氮基)與共價附接至E之連接體(由L'代表)之相應反應性基團(例如，炔或疊氮基)反應，使得表1a之Int共價附接至E。如表1b所示，L'對應於(M-1)或(D-I)定義之L之剩餘部分(例如L'係共價連接Int及E之連接體)。例如，L'可以包括三唑(藉由Int與結合至E之連接體之間之點擊化學反應形成)及連接體(例如，PEG2 -PEG20 連接體)，其轉而結合至E之胺基酸側鏈(例如，參見圖103)。
在表1b之結合物之一些實施例中，n為1或2。當n為1時，各E包括Fc域單體(例如，具有SEQ ID NOs：1-138中任一者之序列之Fc域單體)、白蛋白(例如，具有SEQ ID NO：139-141中任一者之序列之白蛋白)、白蛋白結合肽或Fc結合肽。當n為2時，各E包括Fc域單體(例如，具有SEQ ID NO：1-138中任一者之序列之Fc域單體)，並且Fc域單體二聚化以形成Fc域。
在表1b之任何結合物之一些實施例中，T係1至20之整數(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13， 14、15、16、17、18、19或20)。本揭示案亦提供表2之任何結合物之群體，其中T之平均值為1至20 (例如，T之平均值為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5)。在一些實施例中，T之平均值為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在某些實施例中，平均數T為1至10 (例如，1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10)。在某些實施例中，平均數T為1至5 (例如1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5)。在一些實施例中，平均數T為5至10 (例如5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10)。在一些實施例中，平均數T為2.5至7.5 (例如2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5)。
表1b之結合物中之波浪線表示各L'-Int共價附接至E中之胺基酸側鏈(例如，E中之表面暴露之離胺酸之氮原子或表面暴露之半胱胺酸之硫原子)，或其醫藥學上可接受之鹽。 表1b：對應於表1a之中間物之結合物
表 1a 之相应中间物 由下式描述 结合物结构
Int-1 (D-I)
Figure 02_image158
Int-2 (D-I)
Figure 02_image160
Int-3 (D-I)
Figure 02_image162
Int-4 (M-I)
Figure 02_image164
Int-5 (M-I)
Figure 02_image166
  
Figure 02_image168
Figure 02_image170
Figure 02_image172
Figure 02_image174
Figure 02_image176
Figure 02_image178
Figure 02_image180
Figure 02_image182
Figure 02_image184
Figure 02_image186
Figure 02_image188
Figure 02_image190
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Figure 02_image194
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Figure 02_image198
Figure 02_image200
Figure 02_image202
Figure 02_image204
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Figure 02_image210
Figure 02_image212
Figure 02_image214
Figure 02_image216
Figure 02_image218
Figure 02_image220
在一些實施例中，各E包括具有SEQ ID NO: 1-138中任一者之序列的Fc域單體。在其他實施例中，各E包括Fc域單體，該Fc域單體具有與SEQ ID NO: 63或SEQ ID NO: 64之胺基酸序列至少95%一致的序列。在其他實施例中，各E包括Fc域單體，該Fc域單體具有SEQ ID NO: 63或SEQ ID NO: 64之胺基酸序列。在其他實施例中，各E包括Fc域單體，該Fc域單體具有與SEQ ID NO: 67或SEQ ID NO: 68之胺基酸序列至少95%一致的序列。在其他實施例中，各E包括Fc域單體，該Fc域單體具有SEQ ID NO: 67或SEQ ID NO: 68之胺基酸序列。在其他實施例中，各E包括Fc域單體，該Fc域單體具有與SEQ ID NO: 72或SEQ ID NO: 73之胺基酸序列至少95%一致的序列。在其他實施例中，各E包括Fc域單體，該Fc域單體具有SEQ ID NO: 72或SEQ ID NO: 73之胺基酸序列。在其他實施例中，各E包括Fc域單體，該Fc域單體具有與SEQ ID NO: 76或SEQ ID NO: 77之胺基酸序列至少95%一致的序列。在其他實施例中，各E包括Fc域單體，該Fc域單體具有SEQ ID NO: 76或SEQ ID NO: 77之胺基酸序列。在其他實施例中，各E包括Fc域單體，該Fc域單體具有與SEQ ID NO: 81或SEQ ID NO: 82之胺基酸序列至少95%一致的序列。在其他實施例中，各E包括Fc域單體，該Fc域單體具有SEQ ID NO: 81或SEQ ID NO: 82之胺基酸序列。在其他實施例中，各E包括Fc域單體，該Fc域單體具有與SEQ ID NO: 85或SEQ ID NO: 86之胺基酸序列至少95%一致的序列。在其他實施例中，各E包括Fc域單體，該Fc域單體具有SEQ ID NO: 85或SEQ ID NO: 86之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供一種結合物，其包括(i)第一部分A1 ；(ii)第二部分A2 ；(iii) Fc域單體或Fc域；及(iv)共價附接至A1 及A2 且附接至該Fc域單體或該Fc域之連接體；其中各A1 及各A2 係獨立地選自式(A-I)-(A-XII)中任一者。在一些實施例中，A1 及A2 中之每一者可獨立地選自式(A-I)、(A-II)、(A-VI)或(A-VII)中之任一者。在其他實施例中，A1 及A2 中之每一者可獨立地選自式(A-I)。在上述之較佳實施例中，x為2。
在另一態樣中，本發明提供一種結合物，其包括(i)第一部分Int；(ii) Fc域單體或Fc域；及(iv)共價附接至Int且附接至該Fc域單體或該Fc域之連接體；其中各Int係獨立地選自表1a之任一中間物。
在另一態樣中，本發明提供一種結合物，其包括(i)第一部分A1 ；(ii)第二部分A2 ；(iii)白蛋白、白蛋白結合肽或Fc結合肽；及(iv)共價附接至A1 及A2 且附接至該白蛋白、該白蛋白結合肽或該Fc結合肽之連接體；其中各A1 及各A2 係獨立地選自式(A-I)-(A-XII)中任一者。在一些實施例中，A1 及A2 中之每一者可獨立地選自式(A-I)、(A-II)、(A-VI)或(A-VII)中之任一者。在其他實施例中，A1 及A2 中之每一者可獨立地選自式(A-I)。在上述之較佳實施例中，x為2。
在另一態樣中，本發明提供一種由式(D-I)描述之結合物：
Figure 02_image001
(D-I) 其中各A1 及各A2 係獨立地選自式(A-I)-(A-XII)中任一者；各E包含Fc域單體(例如，具有SEQ ID NO：1-138中任一者之序列之Fc域單體)、白蛋白(例如，具有SEQ ID NO：139-141中任一者之序列之白蛋白)、白蛋白結合肽或Fc結合肽；n為1或2；T係1至20之整數(例如T係1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)；且L為與E、A1 及A2 中之每一者共價附接之連接體，或其醫藥學上可接受之鹽。當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各A1 -L-A2 可獨立地選擇(例如，獨立地選自本文描述之A1 -L-A2 結構中之任一者)。在一些實施例中，A1 及A2 中之每一者可獨立地選自式(A-I)、(A-II)、(A-VI)或(A-VII)中之任一者。在其他實施例中，A1 及A2 中之每一者可獨立地選自式(A-I)。
在另一態樣中，本發明提供由式(D-I)描述之結合物：
Figure 02_image001
(D-I) 其中各A1 及各A2 獨立地選自式(A-I)-(A-V)中之任一者；各E包含Fc域單體(例如，具有SEQ ID NO: 1-138中任一者之序列的Fc域單體)、白蛋白(例如，具有SEQ ID NO: 139-141中任一者之序列的白蛋白)、白蛋白結合肽或Fc結合肽；n為1或2；T為1至20之整數(例如，T為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)；且L係共價附接至E、A1 及A2 中每一者之連接體，或其醫藥學上可接受之鹽。當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各A1 -L-A2 可獨立地經選擇(例如，獨立地選自本文所述之A1 -L-A2 結構中任一者)。
在另一態樣中，本發明提供由式(D-I)描述之結合物：
Figure 02_image001
(D-I) 其中各A1 及各A2 獨立地選自式(A-VI)-(A-IX)中之任一者；各E包含Fc域單體(例如，具有SEQ ID NO: 1-138中任一者之序列的Fc域單體)、白蛋白(例如，具有SEQ ID NO: 139-141中任一者之序列的白蛋白)、白蛋白結合肽或Fc結合肽；n為1或2；T為1至20之整數(例如，T為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)；且L係共價附接至E、A1 及A2 中每一者之連接體，或其醫藥學上可接受之鹽。當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各A1 -L-A2 可獨立地經選擇(例如，獨立地選自本文所述之A1 -L-A2 結構中任一者)。
在一些實施例中，該結合物由式(D-II)描述：
Figure 02_image225
(D-II) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-II-1)描述：
Figure 02_image227
(D-II-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-II-2)描述：
Figure 02_image229
(D-II-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-II-3)描述：
Figure 02_image231
(D-II-3) 其中L’係L之剩餘部分，且y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數(例如，y1 及y2 各自獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，L’為氮原子。
在一些實施例中，該結合物具有選自以下之結構：
Figure 02_image233
、
Figure 02_image235
或
Figure 02_image237
。
在一些實施例中，該結合物由式(D-II-4)描述：
Figure 02_image239
(D-II-4) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-II-5)描述：
Figure 02_image241
(D-II-5) 其中L’係L之剩餘部分，且y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數(例如，y1 及y2 各自獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，L’為氮原子。
在一些實施例中，該結合物具有選自以下之結構：
Figure 02_image243
、
Figure 02_image245
或
Figure 02_image247
， 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物具有選自以下之結構：
Figure 02_image249
、
Figure 02_image251
、
Figure 02_image253
或
Figure 02_image255
， 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-II-6)描述：
Figure 02_image257
， (D-II-6) 其中R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；或其醫藥學上可接受之鹽。在一些实施例中，R7 选自C1-C20烷基、C3-C20环烷基、C3-C20杂环烷基；C5-C15芳基及C2-C15杂芳基。在一些实施例中，R7 选自C1-C20烷基(例如，甲基、乙基、丙基或丁基)。
在一些實施例中，該結合物由式(D-II-7)描述：
Figure 02_image259
(D-II-7) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-II-8)描述：
Figure 02_image261
； (D-II-8) 其中L’係L之剩餘部分，且y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數(例如，y1 及y2 各自獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，L’為氮原子。
在一些實施例中，該結合物具有結構
Figure 02_image263
或
Figure 02_image265
， 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物具有結構
Figure 02_image267
或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物具有結構
Figure 02_image269
、
Figure 02_image271
、
Figure 02_image273
或
Figure 02_image275
， 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物具有結構
Figure 02_image277
、
Figure 02_image279
、
Figure 02_image281
或
Figure 02_image283
或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-II-9)描述：
Figure 02_image285
； (D-II-9) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-II-10)描述：
Figure 02_image287
； (D-II-10) 其中L’係L之剩餘部分，且y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數(例如，y1 及y2 各自獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，L’為氮原子。
在一些實施例中，該結合物具有結構：
Figure 02_image289
， 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物具有結構：
Figure 02_image291
， 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-III)描述：
Figure 02_image293
(D-III) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-III-1)描述：
Figure 02_image295
(D-III-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-III-2)描述：
Figure 02_image297
(D-III-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-III-3)描述：
Figure 02_image299
(D-III-3) 其中L’係L之剩餘部分，且y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數(例如，y1 及y2 各自獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，L’為氮原子。
在一些實施例中，該結合物由式(D-III-4)描述：
Figure 02_image301
(D-III-4) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-III-5)描述：
Figure 02_image303
(D-III-5) 其中L’係L之剩餘部分，且y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數(例如，y1 及y2 各自獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，L’為氮原子。
在一些實施例中，該結合物由式(D-III-6)描述：
Figure 02_image305
(D-III-6) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-III-7)描述：
Figure 02_image307
(D-III-7) 其中L’係L之剩餘部分，且y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數(例如，y1 及y2 各自獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，L’為氮原子。
在一些實施例中，該結合物由式(D-III-8)描述：
Figure 02_image309
(D-III-8) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-III-9)描述：
Figure 02_image311
(D-III-9) 其中L’係L之剩餘部分，且y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數(例如，y1 及y2 各自獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，L’為氮原子。
在一些實施例中，該結合物由式(D-IV)描述：
Figure 02_image313
(D-IV) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-IV-1)描述：
Figure 02_image315
(D-IV-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-IV-2)描述：
Figure 02_image317
(D-IV-2)
其中L’係L之剩餘部分，且y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數(例如，y1 及y2 各自獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，L’為氮原子。
在一些實施例中，該結合物由式(D-V)描述：
Figure 02_image319
(D-V) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-V-1)描述：
Figure 02_image321
(D-V-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-V-2)描述：
Figure 02_image323
(D-V-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-V-3)描述：
Figure 02_image325
(D-V-3) 其中L’係L之剩餘部分，且y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數(例如，y1 及y2 各自獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，L’為氮原子。在一些實施例中，y1 及y2 各自為1，y1 及y2 各自為2，或y1 及y2 各自為3。
在一些實施例中，該結合物由式(D-V-4)描述：
Figure 02_image327
(D-V-4) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-V-5)描述：
Figure 02_image329
(D-V-5) 其中L’係L之剩餘部分，且y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數(例如，y1 及y2 各自獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，L’為氮原子。在一些實施例中，y1 及y2 各自為1，y1 及y2 各自為2，或y1 及y2 各自為3。
在一些實施例中，該結合物由式(D-V-6)描述：
Figure 02_image331
(D-V-6) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-V-7)描述：
Figure 02_image333
(D-V-7) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-V-8)描述：
Figure 02_image335
(D-V-8) 其中L’係L之剩餘部分，且y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數(例如，y1 及y2 各自獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，L’為氮原子。在一些實施例中，y1 及y2 各自為1，y1 及y2 各自為2，或y1 及y2 各自為3。
在一些實施例中，該結合物由式(D-V-9)描述：
Figure 02_image337
(D-V-9) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-V-10)描述：
Figure 02_image339
(D-V-10) 其中L’係L之剩餘部分，且y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數(例如，y1 及y2 各自獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，L’為氮原子。在一些實施例中，y1 及y2 各自為1，y1 及y2 各自為2，或y1 及y2 各自為3。
在一些實施例中，該結合物由式(D-VI)描述：
Figure 02_image341
(D-VI) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-VI-1)描述：
Figure 02_image343
(D-VI-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-VI-2)描述：
Figure 02_image345
(D-VI-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-VI-3)描述：
Figure 02_image347
(D-VI-3) 其中L’係L之剩餘部分，且y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數(例如，y1 及y2 各自獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，L’為氮原子。在一些實施例中，y1 及y2 各自為1，y1 及y2 各自為2，或y1 及y2 各自為3。
在一些實施例中，該結合物由式(D-VI-4)描述：
Figure 02_image349
(D-VI-4) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-VI-5)描述：
Figure 02_image351
(D-VI-5) 其中L’係L之剩餘部分，且y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數(例如，y1 及y2 各自獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，L’為氮原子。在一些實施例中，y1 及y2 各自為1，y1 及y2 各自為2，或y1 及y2 各自為3。
在一些實施例中，該結合物由式(D-VI-6)描述：
Figure 02_image353
(D-VI-6) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-VI-7)描述：
Figure 02_image355
(D-VI-7) 其中L’係L之剩餘部分，且y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數(例如，y1 及y2 各自獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，L’為氮原子。在一些實施例中，y1 及y2 各自為1，y1 及y2 各自為2，或y1 及y2 各自為3。
在一些實施例中，該結合物由式(D-VI-8)描述：
Figure 02_image357
(D-VI-8) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-VI-9)描述：
Figure 02_image359
(D-VI-9) 其中L’係L之剩餘部分，且y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數(例如，y1 及y2 各自獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，L’為氮原子。在一些實施例中，y1 及y2 各自為1，y1 及y2 各自為2，或y1 及y2 各自為3。
在一些實施例中，該結合物由式(D-VII)描述：
Figure 02_image361
(D-VII) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，R1 為OH。在本文所述之任何態樣之一些實施例中，R1 為NH2 。在本文所述之任何態樣之一些實施例中，R1 為-NHC(=NH)NH2 。
在一些實施例中，該結合物由式(D-VIII)描述：
Figure 02_image363
(D-VIII) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-VIII-1)描述：
Figure 02_image365
(D-VIII-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-VIII-2)描述：
Figure 02_image367
(D-VIII-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-VIII-3)描述：
Figure 02_image369
(D-VIII-3) 其中L’係L之剩餘部分，且y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數(例如，y1 及y2 各自獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，L’為氮原子。
在一些實施例中，該結合物具有選自以下之結構：
Figure 02_image371
、
Figure 02_image373
或
Figure 02_image375
， 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-VIII-4)描述：
Figure 02_image377
(D-VIII-4) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-VIII-5)描述：
Figure 02_image379
(D-VIII-5) 其中L’係L之剩餘部分，且y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數(例如，y1 及y2 各自獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，L’為氮原子。
在一些實施例中，該結合物具有選自以下之結構：
Figure 02_image381
、
Figure 02_image383
或
Figure 02_image385
或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由以下結構描述：
Figure 02_image387
或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-VIII-6)描述：
Figure 02_image389
(D-VIII-6) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-VIII-7)描述：
Figure 02_image391
(D-VIII-7) 其中L’係L之剩餘部分，且y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數(例如，y1 及y2 各自獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，L’為氮原子。
在一些實施例中，該結合物由式(D-VIII-8)描述：
Figure 02_image393
(D-VIII-8) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-VIII-9)描述：
Figure 02_image395
(D-VIII-9) 其中L'係L之剩餘部分，且y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數(例如，y1 及y2 各自獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，L'為氮原子。
在一些實施例中，該結合物由式(D-VIII-10)描述：
Figure 02_image397
(D-VIII-10) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-VIII-11)描述：
Figure 02_image399
(D-VIII-11) 其中L'係L之剩餘部分，且y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數(例如，y1 及y2 各自獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，L'為氮原子。
在一些實施例中，該結合物由式(D-IX)描述：
Figure 02_image401
(D-IX) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-IX-1)描述：
Figure 02_image403
(D-IX-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-IX-2)描述：
Figure 02_image405
(D-IX-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-IX-3)描述：
Figure 02_image407
(D-IX-3) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-IX-4)描述：
Figure 02_image409
(D-IX-4) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-IX-5)描述：
Figure 02_image411
(D-IX-5) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-IX-6)描述：
Figure 02_image413
(D-IX-6) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-X)描述：
Figure 02_image415
(D-X) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-X-1)描述：
Figure 02_image417
(D-X-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-X-2)描述：
Figure 02_image419
(D-X-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-X-3)描述：
Figure 02_image421
(D-X-3) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，L或L'包括一或多個視情況經取代C1-C20伸烷基、視情況經取代C1-C20伸雜烷基、視情況經取代C2-C20伸烯基、視情況經取代C2-C20伸雜烯基、視情況經取代C2-C20伸炔基、視情況經取代C2-C20伸雜炔基、視情況經取代C3-C20伸環烷基、視情況經取代C3-C20伸雜環烷基、視情況經取代C4-C20伸環烯基、視情況經取代C4-C20伸雜環烯基、視情況經取代C8-C20伸環炔基、視情況經取代C8-C20伸雜環炔基、視情況經取代C5-C15伸芳基、視情況經取代C2-C15伸雜芳基、O、S、NRi 、P、羰基、硫羰基、磺醯基、磷酸酯基、磷醯基或亞胺基，其中Ri 為H、視情況經取代C1-C20烷基、視情況經取代C1-C20雜烷基、視情況經取代C2-C20烯基、視情況經取代C2-C20雜烯基、視情況經取代C2-C20炔基、視情況經取代C2-C20雜炔基、視情況經取代C3-C20環烷基、視情況經取代C3-C20雜環烷基、視情況經取代C4-C20環烯基、視情況經取代C4-C20雜環烯基、視情況經取代C8-C20環炔基、視情況經取代C8-C20雜環炔基、視情況經取代C5-C15芳基或視情況經取代C2-C15雜芳基。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，L或L'之骨架由一或多個視情況經取代C1-C20伸烷基、視情況經取代C1-C20伸雜烷基、視情況經取代C2-C20伸烯基、視情況經取代C2-C20伸雜烯基、視情況經取代C2-C20伸炔基、視情況經取代C2-C20伸雜炔基、視情況經取代C3-C20伸環烷基、視情況經取代C3-C20伸雜環烷基、視情況經取代C4-C20伸環烯基、視情況經取代C4-C20伸雜環烯基、視情況經取代C8-C20伸環炔基、視情況經取代C8-C20伸雜環炔基、視情況經取代C5-C15伸芳基、視情況經取代C2-C15伸雜芳基、O、S、NRi 、P、羰基、硫羰基、磺醯基、磷酸酯基、磷醯基或亞胺基組成，其中Ri 為H、視情況經取代C1-C20烷基、視情況經取代C1-C20雜烷基、視情況經取代C2-C20烯基、視情況經取代C2-C20雜烯基、視情況經取代C2-C20炔基、視情況經取代C2-C20雜炔基、視情況經取代C3-C20環烷基、視情況經取代C3-C20雜環烷基、視情況經取代C4-C20環烯基、視情況經取代C4-C20雜環烯基、視情況經取代C8-C20環炔基、視情況經取代C8-C20雜環炔基、視情況經取代C5-C15芳基或視情況經取代C2-C15雜芳基。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，L或L'係經側氧基取代。在一些實施例中，L或L'之骨架包含不超過250個原子。在一些實施例中，L或L'能夠形成醯胺、胺基甲酸酯、磺醯基或脲鍵聯。在一些實施例中，L或L'為鍵。在一些實施例中，L或L'為原子。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，各L由式(D-L-I)描述：
Figure 02_image423
(D-L-I) 其中LA 由式GA1 -(ZA1 )g1 -(YA1 )h1 -(ZA2 )i1 -(YA2 )j1 -(ZA3 )k1 -(YA3 )l1 -(ZA4 )m1 -(YA4 )n1 -(ZA5 )o1 -GA2 描述；LB 由式GB1 -(ZB1 )g2 -(YB1 )h2 -(ZB2 )i2 -(YB2 )j2 -(ZB3 )k2 -(YB3 )l2 -(ZB4 )m2 -(YB4 )n2 -(ZB5 )o2 -GB2 描述；LC 由式GC1 -(ZC1 )g3 -(YC1 )h3 -(ZC2 )i3 -(YC2 )j3 -(ZC3 )k3 -(YC3 )l3 -(ZC4 )m3 -(YC4 )n3 -(ZC5 )o3 -GC2 描述；GA1 係附接至Q之鍵；GA2 係附接至A1之鍵；GB1 係附接至Q)之鍵；GB2 係附接至A2之鍵；GC1 係附接至Q之鍵；GC2 係附接至E之鍵或能夠與結合於E之官能基反應的官能基(例如，順丁烯二醯亞胺及半胱胺酸、胺及經活化羧酸、硫醇及順丁烯二醯亞胺、經活化磺酸及胺、異氰酸酯及胺、疊氮化物及炔以及烯烴及四嗪)；ZA1 、ZA2 、ZA3 、ZA4 、ZA5 、ZB1 、ZB2 、ZB3 、ZB4 、ZB5 、ZC1 、ZC2 、ZC3 、ZC4 及ZC5 各自獨立地為視情況經取代C1-C20伸烷基、視情況經取代C1-C20伸雜烷基、視情況經取代C2-C20伸烯基、視情況經取代C2-C20伸雜烯基、視情況經取代C2-C20伸炔基、視情況經取代C2-C20伸雜炔基、視情況經取代C3-C20伸環烷基、視情況經取代C3-C20伸雜環烷基、視情況經取代C4-C20伸環烯基、視情況經取代C4-C20伸雜環烯基、視情況經取代C8-C20伸環炔基、視情況經取代C8-C20伸雜環炔基、視情況經取代C5-C15伸芳基或視情況經取代C2-C15伸雜芳基；YA1 、YA2 、YA3 、YA4 、YB1 、YB2 、YB3 、YB4 、YC1 、YC2 、YC3 及YC4 各自獨立地為O、S、NRi 、P、羰基、硫羰基、磺醯基、磷酸酯基、磷醯基或亞胺基；Ri 為H、視情況經取代C1-C20烷基、視情況經取代C1-C20雜烷基、視情況經取代C2-C20烯基、視情況經取代C2-C20雜烯基、視情況經取代C2-C20炔基、視情況經取代C2-C20雜炔基、視情況經取代C3-C20環烷基、視情況經取代C3-C20雜環烷基、視情況經取代C4-C20環烯基、視情況經取代C4-C20雜環烯基、視情況經取代C8-C20環炔基、視情況經取代C8-C20雜環炔基、視情況經取代C5-C15芳基或視情況經取代C2-C15雜芳基；g1、h1、i1、j1、k1、l1、m1、n1、o1、g2、h2、i2、j2、k2、l2、m2、n2、o2、g3、h3、i3、j3、k3、l3、m3、n3及o3各自獨立地為0或1；Q為氮原子、視情況經取代C1-C20伸烷基、視情況經取代C1-C20伸雜烷基、視情況經取代C2-C20伸烯基、視情況經取代C2-C20伸雜烯基、視情況經取代C2-C20伸炔基、視情況經取代C2-C20伸雜炔基、視情況經取代C3-C20伸環烷基、視情況經取代C3-C20伸雜環烷基、視情況經取代C4-C20伸環烯基、視情況經取代C4-C20伸雜環烯基、視情況經取代C8-C20伸環炔基、視情況經取代C8-C20伸雜環炔基、視情況經取代C5-C15伸芳基或視情況經取代C2-C15伸雜芳基。
在一些實施例中，LC 可具有兩個附接至Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽之點(例如，兩個GC2 )。在本文所述之任何態樣之一些實施例中，L包括聚乙二醇(PEG)連接體。PEG連接體包括具有重複單元結構(-CH2 CH2 O-)n 之連接體，其中n為2至100之整數。聚乙二醇連接體可共價接合神經胺糖酸酶抑制劑及E (例如，在式(M-I)-(M-XI)中任一者之結合物中)。聚乙二醇連接體可共價接合第一神經胺糖酸酶抑制劑及第二神經胺糖酸酶抑制劑(例如，在式(D-I)-(D-XI)中任一者之結合物中)。聚乙二醇連接體可共價接合神經胺糖酸酶抑制劑二聚體及E (例如，在式(D-I)-(D-XI)中任一者之結合物中)。聚乙二醇連接體可選自PEG2 至PEG100 中任一者(例如，PEG2 、PEG3 、PEG4 、PEG5 、PEG5 -PEG10 、PEG10 -PEG20 、PEG20 -PEG30 、PEG30 -PEG40 、PEG50 -PEG60 、PEG60 -PEG70 、PEG70 -PEG80 、PEG80 -PEG90 、PEG90 -PEG100 )。在一些實施例中，Lc 包括PEG連接體，其中LC 共價附接至Q及E中每一者。
在一些實施例中，L為
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Figure 02_image571
、
Figure 02_image573
、
Figure 02_image575
、
Figure 02_image577
、
Figure 02_image579
、
Figure 02_image581
、
Figure 02_image583
、
Figure 02_image585
、
Figure 02_image587
、
Figure 02_image589
、
Figure 02_image591
、
Figure 02_image593
、
Figure 02_image595
、
Figure 02_image597
、
Figure 02_image599
、
Figure 02_image601
、
Figure 02_image603
、
Figure 02_image605
、
Figure 02_image607
、
Figure 02_image609
、
Figure 02_image611
、
Figure 02_image613
、
Figure 02_image615
、
Figure 02_image617
或
Figure 02_image619
； 其中z1 及z2 各自獨立地為1至20之整數；且R9 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基。
在一些實施例中，L為
Figure 02_image621
、
Figure 02_image623
、
Figure 02_image625
、
Figure 02_image627
、
Figure 02_image629
、
Figure 02_image631
、
Figure 02_image633
、
Figure 02_image635
、
Figure 02_image637
、
Figure 02_image639
、
Figure 02_image641
、
Figure 02_image643
、
Figure 02_image645
、
Figure 02_image647
、
Figure 02_image649
、
Figure 02_image651
、
Figure 02_image653
、
Figure 02_image655
、
Figure 02_image657
、
Figure 02_image659
、
Figure 02_image661
、
Figure 02_image663
、
Figure 02_image665
、、
Figure 02_image667
、
Figure 02_image669
、
Figure 02_image671
、
Figure 02_image673
、
Figure 02_image675
、
Figure 02_image677
、
Figure 02_image679
、
Figure 02_image681
、
Figure 02_image683
、
Figure 02_image685
、
Figure 02_image687
、
Figure 02_image689
、
Figure 02_image691
、
Figure 02_image693
、
Figure 02_image695
、
Figure 02_image697
、
Figure 02_image699
、
Figure 02_image701
；
Figure 02_image703
、
Figure 02_image705
；
Figure 02_image707
、
Figure 02_image709
；
Figure 02_image711
、
Figure 02_image713
；
Figure 02_image715
、
Figure 02_image717
或
Figure 02_image719
其中R*為鍵或包括視情況經取代C1-C20伸烷基、視情況經取代C1-C20伸雜烷基、視情況經取代C2-C20伸烯基、視情況經取代C2-C20伸雜烯基、視情況經取代C2-C20伸炔基、視情況經取代C2-C20伸雜炔基、視情況經取代C3-C20伸環烷基、視情況經取代C3-C20伸雜環烷基、視情況經取代C4-C20伸環烯基、視情況經取代C4-C20伸雜環烯基、視情況經取代C8-C20伸環炔基、視情況經取代C8-C20伸雜環炔基、視情況經取代C5-C15伸芳基、視情況經取代C2-C15伸雜芳基、O、S、NRi 、P、羰基、硫羰基、磺醯基、磷酸酯基及亞胺基中之一或多者，且其中Ri 為H、視情況經取代C1-C20烷基、視情況經取代C1-C20雜烷基、視情況經取代C2-C20烯基、視情況經取代C2-C20雜烯基、視情況經取代C2-C20炔基、視情況經取代C2-C20雜炔基、視情況經取代C3-C20環烷基、視情況經取代C3-C20雜環烷基、視情況經取代C4-C20環烯基、視情況經取代C4-C20雜環烯基、視情況經取代C8-C20環炔基、視情況經取代C8-C20雜環炔基、視情況經取代C5-C15芳基或視情況經取代C2-C15雜芳基。
在一些實施例中，Y為：
Figure 02_image721
(-NH(C=O)O-)且L為：
Figure 02_image579
。
在一些實施例中，Y為：
Figure 02_image721
(-NH(C=O)O-)且L為：
Figure 02_image583
。
在一些實施例中，Y為：
Figure 02_image721
(-NH(C=O)O-)且L為：
Figure 02_image587
。
在一些實施例中，Y為：
Figure 02_image728
(-O-)且L為：
Figure 02_image593
。
在另一態樣中，本發明提供一種由式(M-I)描述之結合物：
Figure 02_image003
(M-I) 其中各A1 係獨立地選自式(A-I)-(A-XII)中任一者； 各E包含Fc域單體(例如，具有SEQ ID NO: 1-138中任一者之序列的Fc域單體)、白蛋白(例如，具有SEQ ID NO: 139-141中任一者之序列的白蛋白)、白蛋白結合肽或Fc結合肽；n為1或2；T為1至20之整數(例如，T為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)；且L係共價附接至E及A1 中每一者之連接體，或其醫藥學上可接受之鹽。當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各A1 可獨立地選自式(A-I)-(A-XII)中任一者。在一些實施例中，各A1 可獨立地選自式(A-I)、(A-II)、(A-VI)或(A-VII)中之任一者。在其他實施例中，各A1 可獨立地選自式(A-I)。
在另一態樣中，本發明提供一種由式(M-I)描述之結合物：
Figure 02_image003
(M-I) 其中各A1 係獨立地選自式(A-I)-(A-V)中任一者；各E包含Fc域單體(例如，具有SEQ ID NO: 1-138中任一者之序列的Fc域單體)、白蛋白(例如，具有SEQ ID NO: 139-141中任一者之序列的白蛋白)、白蛋白結合肽或Fc結合肽；n為1或2；T為1至20之整數(例如，T為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)；且L係共價附接至E及A1 中每一者之連接體，或其醫藥學上可接受之鹽。當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各A1 可獨立地選自式(A-I)-(A-V)中任一者。
在另一態樣中，本發明提供一種由式(M-I)描述之結合物：
Figure 02_image003
(M-I) 其中各A1 係獨立地選自式(A-VI)-(A-IX)中任一者；各E包含Fc域單體(例如，具有SEQ ID NO: 1-138中任一者之序列的Fc域單體)、白蛋白(例如，具有SEQ ID NO: 139-141中任一者之序列的白蛋白)、白蛋白結合肽或Fc結合肽；n為1或2；T為1至20之整數(例如，T為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)；且L係共價附接至E及A1 中每一者之連接體，或其醫藥學上可接受之鹽。當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各A1 可獨立地選自式(A-VI)-(A-IX)中任一者。
在一些實施例中，該結合物由式(M-II)描述：
Figure 02_image734
(M-II) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-II-1)描述：
Figure 02_image736
(M-II-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-II-2)描述：
Figure 02_image738
(M-II-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-II-3)描述：
Figure 02_image740
(M-II-3) 其中L'係L之剩餘部分，且y1 為1-20之整數(例如，y1 為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-II-4)描述：
Figure 02_image742
(M-II-4) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-II-5)描述：
Figure 02_image744
(M-II-5) 其中L'係L之剩餘部分，且y1 為1-20之整數(例如，y1 為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物具有結構
Figure 02_image746
， 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-II-6)描述：
Figure 02_image748
； (M-II-6) 其中R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；或其醫藥學上可接受之鹽。在一些实施例中，R7 选自C1-C20烷基、C3-C20环烷基、C3-C20杂环烷基；C5-C15芳基及C2-C15杂芳基。在一些实施例中，R7 选自C1-C20烷基(例如，甲基、乙基、丙基或丁基)。
在一些實施例中，該結合物由式(M-II-7)描述：
Figure 02_image750
(M-II-7) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-II-8)描述：
Figure 02_image752
； (M-II-8) 其中L'係L之剩餘部分，且y1 為1-20之整數(例如，y1 為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物具有結構
Figure 02_image754
。
在一些實施例中，該結合物由式(M-II-9)描述：
Figure 02_image756
； (M-II-9) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-II-10)描述：
Figure 02_image758
； (M-II-10) 其中L'係L之剩餘部分，且y1為1-20之整數(例如，y1為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物具有結構
Figure 02_image760
或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-III)描述：
Figure 02_image762
(M-III) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-III-1)描述：
Figure 02_image764
(M-III-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-III-2)描述：
Figure 02_image766
(M-III-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-III-3)描述：
Figure 02_image768
(M-III-3) 其中L'係L之剩餘部分，且y1 為1-20之整數(例如，y1 為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-III-4)描述：
Figure 02_image770
(M-III-4) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-III-5)描述：
Figure 02_image772
(M-III-5) 其中L'係L之剩餘部分，且y1 為1-20之整數(例如，y1 為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-III-6)描述：
Figure 02_image774
(M-III-6) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-III-7)描述：
Figure 02_image776
(M-III-7) 其中L'係L之剩餘部分，且y1 為1-20之整數(例如，y1 為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-III-8)描述：
Figure 02_image778
(M-III-8) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-III-9)描述：
Figure 02_image780
(M-III-9) 其中L'係L之剩餘部分，且y1 為1-20之整數(例如，y1 為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-IV)描述：
Figure 02_image782
(M-IV) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-IV-1)描述：
Figure 02_image784
(M-IV-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-IV-2)描述：
Figure 02_image786
(M-IV-2) 其中L'係L之剩餘部分，且y1 為1-20之整數(例如，y1 為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-V)描述：
Figure 02_image788
(M-V) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-V-1)描述：
Figure 02_image790
(M-V-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-V-2)描述：
Figure 02_image792
(M-V-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-V-3)描述：
Figure 02_image794
(M-V-3) 其中L'係L之剩餘部分，且y1 為1-20之整數(例如，y1 為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-V-4)描述：
Figure 02_image796
(M-V-4) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-V-5)描述：
Figure 02_image798
(M-V-5) 其中L'係L之剩餘部分，且y1 為1-20之整數(例如，y1 為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-V-6)描述：
Figure 02_image800
(M-V-6) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-V-7)描述：
Figure 02_image802
(M-V-7) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-V-8)描述：
Figure 02_image804
(M-V-8) 其中L'係L之剩餘部分，且y1 為1-20之整數(例如，y1 為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-V-9)描述：
Figure 02_image806
(M-V-9) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-V-10)描述：
Figure 02_image808
(M-V-10) 其中L'係L之剩餘部分，且y1 為1-20之整數(例如，y1 為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-VI)描述：
Figure 02_image810
(M-VI) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-VI-1)描述：
Figure 02_image812
(M-VI-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-VI-2)描述：
Figure 02_image814
(M-VI-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-VI-3)描述：
Figure 02_image816
(M-VI-3) 其中L'係L之剩餘部分，且y1 為1-20之整數(例如，y1 為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-VI-4)描述：
Figure 02_image818
(M-VI-4) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-VI-5)描述：
Figure 02_image820
(M-VI-5) 其中L'係L之剩餘部分，且y1 為1-20之整數(例如，y1 為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-VI-6)描述：
Figure 02_image822
(M-VI-6) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-VI-7)描述：
Figure 02_image824
(M-VI-7) 其中L'係L之剩餘部分，且y1 為1-20之整數(例如，y1 為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-VI-8)描述：
Figure 02_image826
(M-VI-8) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-VI-9)描述：
Figure 02_image828
(M-VI-9) 其中L'係L之剩餘部分，且y1 為1-20之整數(例如，y1 為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-VII)描述：
Figure 02_image830
(M-VII) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，R1 為OH。在本文所述之任何態樣之一些實施例中，R1 為NH2 。在本文所述之任何態樣之一些實施例中，R1 為-NHC(=NH)NH2 。
在一些實施例中，該結合物由式(M-VIII)描述：
Figure 02_image832
(M-VIII) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-VIII-1)描述：
Figure 02_image834
(M-VIII-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-VIII-2)描述：
Figure 02_image836
(M-VIII-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-VIII-3)描述：
Figure 02_image838
(M-VIII-3) 其中L'係L之剩餘部分，且y1 為1-20之整數(例如，y1 為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-VIII-4)描述：
Figure 02_image840
(M-VIII-4) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-VIII-5)描述：
Figure 02_image842
(M-VIII-5) 其中L'係L之剩餘部分，且y1 為1-20之整數，或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物具有結構
Figure 02_image844
或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-VIII-6)描述：
Figure 02_image846
(M-VIII-6) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-VIII-7)描述：
Figure 02_image848
(M-VIII-7) 其中L'係L之剩餘部分，且y1 為1-20之整數(例如，y1 為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-VIII-8)描述：
Figure 02_image850
(M-VIII-8) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-VIII-9)描述：
Figure 02_image852
(M-VIII-9) 其中L'係L之剩餘部分，且y1 為1-20之整數(例如，y1 為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-VIII-10)描述：
Figure 02_image854
(M-VIII-10) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-VIII-11)描述：
Figure 02_image856
(M-VIII-11) 其中L'係L之剩餘部分，且y1 為1-20之整數(例如，y1 為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-IX)描述：
Figure 02_image858
(M-IX) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-IX-1)描述：
Figure 02_image860
(M-IX-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-IX-2)描述：
Figure 02_image862
(M-IX-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-IX-3)描述：
Figure 02_image864
(M-IX-3) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-IX-4)描述：
Figure 02_image866
(M-IX-4) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-IX-5)描述：
Figure 02_image868
(M-IX-5) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-IX-6)描述：
Figure 02_image870
(M-IX-6) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-X)描述：
Figure 02_image872
(M-X) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-X-1)描述：
Figure 02_image874
(M-X-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-X-2)描述：
Figure 02_image876
(M-X-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-X-3)描述：
Figure 02_image878
(M-X-3) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，L或L'包含一或多個視情況經取代C1-C20伸烷基、視情況經取代C1-C20伸雜烷基、視情況經取代C2-C20伸烯基、視情況經取代C2-C20伸雜烯基、視情況經取代C2-C20伸炔基、視情況經取代C2-C20伸雜炔基、視情況經取代C3-C20伸環烷基、視情況經取代C3-C20伸雜環烷基、視情況經取代C4-C20伸環烯基、視情況經取代C4-C20伸雜環烯基、視情況經取代C8-C20伸環炔基、視情況經取代C8-C20伸雜環炔基、視情況經取代C5-C15伸芳基、視情況經取代C2-C15伸雜芳基、O、S、NRi 、P、羰基、硫羰基、磺醯基、磷酸酯基、磷醯基或亞胺基，其中Ri 為H、視情況經取代C1-C20烷基、視情況經取代C1-C20雜烷基、視情況經取代C2-C20烯基、視情況經取代C2-C20雜烯基、視情況經取代C2-C20炔基、視情況經取代C2-C20雜炔基、視情況經取代C3-C20環烷基、視情況經取代C3-C20雜環烷基、視情況經取代C4-C20環烯基、視情況經取代C4-C20雜環烯基、視情況經取代C8-C20環炔基、視情況經取代C8-C20雜環炔基、視情況經取代C5-C15芳基或視情況經取代C2-C15雜芳基。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，L或L'之骨架由一或多個視情況經取代C1-C20伸烷基、視情況經取代C1-C20伸雜烷基、視情況經取代C2-C20伸烯基、視情況經取代C2-C20伸雜烯基、視情況經取代C2-C20伸炔基、視情況經取代C2-C20伸雜炔基、視情況經取代C3-C20伸環烷基、視情況經取代C3-C20伸雜環烷基、視情況經取代C4-C20伸環烯基、視情況經取代C4-C20伸雜環烯基、視情況經取代C8-C20伸環炔基、視情況經取代C8-C20伸雜環炔基、視情況經取代C5-C15伸芳基、視情況經取代C2-C15伸雜芳基、O、S、NRi 、P、羰基、硫羰基、磺醯基、磷酸酯基、磷醯基或亞胺基組成，其中Ri 為H、視情況經取代C1-C20烷基、視情況經取代C1-C20雜烷基、視情況經取代C2-C20烯基、視情況經取代C2-C20雜烯基、視情況經取代C2-C20炔基、視情況經取代C2-C20雜炔基、視情況經取代C3-C20環烷基、視情況經取代C3-C20雜環烷基、視情況經取代C4-C20環烯基、視情況經取代C4-C20雜環烯基、視情況經取代C8-C20環炔基、視情況經取代C8-C20雜環炔基、視情況經取代C5-C15芳基或視情況經取代C2-C15雜芳基。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，L或L'係經側氧基取代。在一些實施例中，L或L'之骨架包含不超過250個原子。在一些實施例中，L或L'能夠形成醯胺、胺基甲酸酯、磺醯基或脲鍵聯。在一些實施例中，L或L'為鍵。在一些實施例中，L或L'為原子。在一些實施例中，L'為氮原子。
在一些實施例中，各L由式(M-L-1)描述：
Figure 02_image880
其中：J1 係附接至A1之鍵；J2 係附接至E之鍵或能夠與結合於E之官能基反應的官能基(例如，順丁烯二醯亞胺及半胱胺酸、胺及經活化羧酸、硫醇及順丁烯二醯亞胺、經活化磺酸及胺、異氰酸酯及胺、疊氮化物及炔以及烯烴及四嗪)；Q1 、Q2 、Q3 、Q4 及Q5 各自獨立地為視情況經取代C1-C20伸烷基、視情況經取代C1-C20伸雜烷基、視情況經取代C2-C20伸烯基、視情況經取代C2-C20伸雜烯基、視情況經取代C2-C20伸炔基、視情況經取代C2-C20伸雜炔基、視情況經取代C3-C20伸環烷基、視情況經取代C3-C20伸雜環烷基、視情況經取代C4-C20伸環烯基、視情況經取代C4-C20伸雜環烯基、視情況經取代C8-C20伸環炔基、視情況經取代C8-C20伸雜環炔基、視情況經取代C5-C15伸芳基或視情況經取代C2-C15伸雜芳基；T1 、T2 、T3 、T4 各自獨立地為O、S、NRi 、P、羰基、硫羰基、磺醯基、磷酸酯基、磷醯基或亞胺基；Ri 為H、視情況經取代C1-C20烷基、視情況經取代C1-C20雜烷基、視情況經取代C2-C20烯基、視情況經取代C2-C20雜烯基、視情況經取代C2-C20炔基、視情況經取代C2-C20雜炔基、視情況經取代C3-C20環烷基、視情況經取代C3-C20雜環烷基、視情況經取代C4-C20環烯基、視情況經取代C4-C20雜環烯基、視情況經取代C8-C20環炔基、視情況經取代C8-C20雜環炔基、視情況經取代C5-C15芳基或視情況經取代C2-C15雜芳基；且g、h、i、j、k、l、m、n及o各自獨立地為0或1；或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，J2 可具有兩個附接至Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽之點(例如，兩個J2 )。
在一些實施例中，L為
Figure 02_image882
、
Figure 02_image884
、
Figure 02_image886
、
Figure 02_image888
或
Figure 02_image890
， 其中d為1至20之整數(例如，d為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)。
在一些實施例中，L為
Figure 02_image892
、
Figure 02_image894
、
Figure 02_image896
、
Figure 02_image898
、
Figure 02_image900
、
Figure 02_image902
、
Figure 02_image904
、
Figure 02_image906
、
Figure 02_image908
、
Figure 02_image910
、
Figure 02_image912
、
Figure 02_image914
、
Figure 02_image916
、
Figure 02_image918
、
Figure 02_image920
或
Figure 02_image922
， 其中d及e各自獨立地為1至26之整數；或其醫藥學上可接受之鹽。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，L包括聚乙二醇(PEG)連接體。PEG連接體包括具有重複單元結構(-CH2 CH2 O-)n 之連接體，其中n為2至100之整數。聚乙二醇連接體可共價接合神經胺糖酸酶抑制劑及E (例如，在式(M-I)-(M-XI)中任一者之結合物中)。聚乙二醇連接體可共價接合第一神經胺糖酸酶抑制劑及第二神經胺糖酸酶抑制劑(例如，在式(D-I)-(D-XI)中任一者之結合物中)。聚乙二醇連接體可共價接合神經胺糖酸酶抑制劑二聚體及E (例如，在式(D-I)-(D-XI)中任一者之結合物中)。聚乙二醇連接體可選自PEG2 至PEG100 中任一者(例如，PEG2 、PEG3 、PEG4 、PEG5 、PEG5 -PEG10 、PEG10 -PEG20 、PEG20 -PEG30 、PEG30 -PEG40 、PEG50 -PEG60 、PEG60 -PEG70 、PEG70 -PEG80 、PEG80 -PEG90 、PEG90 -PEG100 )。在一些實施例中，Lc 包括PEG連接體，其中LC 共價附接至Q及E中每一者。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，R1 為-NHC(=NH)NH2 。在本文所述之任何態樣之一些實施例中，R2 為-F。在本文所述之任何態樣之一些實施例中，R3 為-F。在本文所述之任何態樣之一些實施例中，R4 為–CO2 H。在本文所述之任何態樣之一些實施例中，R5 為–COCH3 。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，L共價附接至E之表面暴露離胺酸的氮原子或L共價附接至E之表面暴露半胱胺酸的硫原子。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E為Fc域單體。在一些實施例中，n為2且各E二聚以形成Fc域。
在一些實施例中，n為2，各E為Fc域單體，各E二聚以形成Fc域，且該結合物由式(D-I-1)描述：
Figure 02_image924
(D-I-1) 其中J為Fc域；且T為1至20之整數(例如，T為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，結合物具有結構
Figure 02_image926
， 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，n為2，各E為Fc域單體，各E二聚以形成Fc域，且該結合物由式(M-I-1)描述：
Figure 02_image928
(M-I-1) 其中J為Fc域；且T為1至20之整數(例如，T為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E具有SEQ ID NO: 1-138中任一者之序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E為白蛋白、白蛋白結合肽或Fc結合肽。在其中E為白蛋白、白蛋白結合肽或Fc結合肽之一些實施例中，n為1。
在一些實施例中，n為1，E為白蛋白、白蛋白結合肽或Fc結合肽且該結合物由式(D-I-2)描述：
Figure 02_image930
(D-I-2) 其中E為白蛋白、白蛋白結合肽或Fc結合肽；且T為1至20之整數，或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，n為1，E為白蛋白、白蛋白結合肽或Fc結合肽且該結合物由式(M-I-2)描述：
Figure 02_image932
(M-I-2) 其中E為白蛋白、白蛋白結合肽或Fc結合肽；且T為1至20之整數，或其醫藥學上可接受之鹽。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E為具有SEQ ID NO: 139-141中任一者之序列的白蛋白。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，T為1、2、3、4或5。
在另一態樣中，本發明提供具有本文所述之任何結合物之結構的結合物之群體(例如，具有式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一式之結合物之群體)，其中T之平均值為1至20 (例如，T之平均值為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5)。在一些實施例中，T之平均值為約1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5或20。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各A1 -L-A2 可獨立地經選擇(例如，獨立地選自本文所述之A1 -L-A2 結構中任一者)。在一些實施例中，E可結合於2、3、4、5、6、7、8、9、10個或10個以上不同A1 -L-A2 部分。在一些實施例中，E結合於第一A1 -L-A2 部分及第二A1 -L-A2 部分。在一些實施例中，第一A1 -L-A2 部分之A1 及A2 係獨立地選自式(A-III)-(A-V)中任一者且第二A1 -L-A2 部分之A1 及A2 係獨立地選自式(A-I)、(A-II)、(A-VI)、(A-VII)、(A-VIII)及(A-IX)中任一者。
在一些實施例中，第一A1 -L-A2 部分各自特異性地結合於E之離胺酸殘基(例如，E之表面暴露離胺酸殘基的氮原子)，且第二A1 -L-A2 部分各自特異性地結合於E之半胱胺酸殘基(例如，E之表面暴露半胱胺酸殘基的硫原子)。在一些實施例中，第一A1 -L-A2 部分各自特異性地結合於E之半胱胺酸殘基(例如，E之表面暴露半胱胺酸殘基的硫原子)，且第二A1 -L-A2 部分各自特異性地結合於E之離胺酸殘基(例如，E之表面暴露離胺酸殘基的氮原子)。
在一些實施例中，結合於E之第一A1 -L-A2 部分的數目為1至10之整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。在一些實施例中，結合於E之第二A1 -L-A2 部分的數目為1至10之整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各A1 -L可獨立地經選擇(例如，獨立地選自本文所述之A1 -L結構中任一者)。在一些實施例中，E可結合於2、3、4、5、6、7、8、9、10個或10個以上不同A1 -L部分。在一些實施例中，E結合於第一A1 -L部分及第二A1 -L部分。在一些實施例中，第一A1 -L部分之A1 係選自式(A-III)-(A-V)中任一者且第二A1 -L部分之A1 係選自式(A-I)、(A-II)、(A-VI)、(A-VII)、(A-VIII)或(A-IX)中任一者。
在一些實施例中，第一A1 -L部分各自特異性地結合於E之離胺酸殘基(例如，E之表面暴露離胺酸殘基的氮原子)，且第二A1 -L部分各自特異性地結合於E之半胱胺酸殘基(例如，E之表面暴露半胱胺酸殘基的硫原子)。在一些實施例中，第一A1 -L部分各自特異性地結合於E之半胱胺酸殘基(例如，E之表面暴露半胱胺酸殘基的硫原子)，且第二A1 -L部分各自特異性地結合於E之離胺酸殘基(例如，E之表面暴露離胺酸殘基的氮原子)。
在一些實施例中，結合於E之第一A1 -L部分的數目為1至10之整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。在一些實施例中，結合於E之第二A1 -L部分的數目為1至10之整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)。
在另一態樣中，本發明提供一種由式(D’-I)描述之結合物：
Figure 02_image934
(D’-I) 其中各A1 係獨立地選自式(A-III)-(A-V)中任一者；其中各A2 係獨立地選自式(A-I)、(A-II)、(A-VI)、(A-VII)、(A-VIII)及(A-IX)中任一者；各E包含Fc域單體(例如，具有SEQ ID NO: 1-138中任一者之序列的Fc域單體)、白蛋白(例如，具有SEQ ID NO: 139-141中任一者之序列的白蛋白)、白蛋白結合肽或Fc結合肽；n為1或2；T1 為1至10之整數(例如，T1 為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)；L1 係共價附接至E及各A1 之連接體；T1 為1至10之整數(例如，T1 為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)；L2 係共價附接至E及各A2 之連接體；T2 為1至10之整數(例如，T2 為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)，或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，各A1 -L-A1 特異性地結合於E之離胺酸殘基(例如，E之表面暴露離胺酸殘基的氮原子)，且各A2 -L-A2 特異性地結合於E之半胱胺酸殘基(例如，E之表面暴露半胱胺酸殘基的硫原子)。在一些實施例中，各A1 -L-A1 部分特異性地結合於E之半胱胺酸殘基(例如，E之表面暴露半胱胺酸殘基的硫原子)，且各A2 -L-A2 部分特異性地結合於E之離胺酸殘基(例如，E之表面暴露離胺酸殘基的氮原子)。
在另一態樣中，本發明提供一種由式(M’-I)描述之結合物：
Figure 02_image936
(M’-I) 其中各A1 係獨立地選自式(A-III)-(A-V)中任一(M-IX)；其中各A2 係獨立地選自式(A-I)、(A-II)、(A-VI)、(A-VII)、(A-VIII)及(A-IX)中任一者：各E包含Fc域單體(例如，具有SEQ ID NO: 1-138中任一者之序列的Fc域單體)、白蛋白(例如，具有SEQ ID NO: 139-141中任一者之序列的白蛋白)、白蛋白結合肽或Fc結合肽；n為1或2；T1 為1至10之整數(例如，T1 為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)；L1 係共價附接至E及A1 之連接體；T1 為1至10之整數(例如，T1 為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)；L2 係共價附接至E及A2 之連接體；T2 為1至10之整數(例如，T2 為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)，或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，各A1 -L特異性地結合於E之離胺酸殘基(例如，E之表面暴露離胺酸殘基的氮原子)，且各A2 -L特異性地結合於E之半胱胺酸殘基(例如，E之表面暴露半胱胺酸殘基的硫原子)。在一些實施例中，各A1 -L部分特異性地結合於E之半胱胺酸殘基(例如，E之表面暴露半胱胺酸殘基的硫原子)，且各A2 -L部分特異性地結合於E之離胺酸殘基(例如，E之表面暴露離胺酸殘基的氮原子)。
在另一態樣中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含本文所述之任何結合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者之結合物)或其醫藥學上可接受之鹽，及醫藥學上可接受之賦形劑。
在另一態樣中，本發明提供一種用於治療具有病毒感染或據推測具有病毒感染之個體之方法，該方法包括向該個體投與有效量的本文所述之結合物或組合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者之結合物)中任一者。
在另一態樣中，本發明提供一種用於預防性治療有需要之個體的病毒感染之方法，該方法包括向該個體投與有效量的本文所述之結合物或組合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者之結合物)中任一者。
在一些實施例中，該病毒感染係由流感病毒或副流感病毒引起。在一些實施例中，該病毒感染為A型、B型或C型流感病毒或副流感病毒。
在一些實施例中，該個體係免疫受損的。
在一些實施例中，該個體已經診斷患有體液免疫缺乏、T細胞缺乏、嗜中性白血球減少症、無脾或補體缺乏。
在一些實施例中，該個體正在經免疫抑制性療法治療或即將經免疫抑制性療法治療。
在一些實施例中，該個體已經診斷患有引起免疫抑制之疾病。在一些實施例中，該疾病為癌症或獲得性免疫缺乏症候群。在一些實施例中，該癌症為白血病、淋巴瘤或多發性骨髓瘤。
在一些實施例中，該個體已經受或即將經受造血幹細胞移植。
在一些實施例中，該個體已經受或即將經受器官移植。
在一些實施例中，個體患有繼發性感染或處於繼發性感染之風險中。在一些實施例中，繼發性感染係細菌感染(例如耐甲氧西林之金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus；MRSA)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)及/或流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae))、病毒感染或真菌感染。在具體實施例中，繼發性感染係MRSA。在某些實施例中，繼發性感染係肺炎鏈球菌。在一些實施例中，繼發性感染係呼吸道感染(例如，呼吸道之感染)。在一些實施例中，繼發性感染與(例如，引起)肺炎(例如，細菌性或病毒性肺炎)相關。在一些實施例中，個體患有肺炎或有發展成肺炎之風險。
在另一態樣，本發明提供一種在經診斷患有流感感染之個體中預防繼發性感染之方法，其中該方法包括向個體投與本文所述之結合物或組合物。在一些實施例中，該方法包括向個體投與結合物45或包含結合物45之醫藥組合物。
在一些實施例中，將本發明之結合物或組合物投與診斷患有流感感染之個體降低了發展繼發性感染之可能性，例如降低了10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%或更多(例如，與未用結合物或組合物治療之患有流感之個體相比)。例如，將本發明之結合物或組合物投與診斷患有流感感染之個體降低了發展繼發性細菌感染(例如，MRSA、肺炎鏈球菌、銅綠假單胞菌及/或流感嗜血桿菌)之可能性，例如降低了10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%或更多。在一些實施例中，該結合物或組合物肌內、靜脈內、皮內、動脈內、腹膜內、病變內、顱內、關節內、前列腺內、胸膜內、氣管內、鼻內、玻璃體內、陰道內、直腸內、經表面、腫瘤內、經腹膜、皮下、結膜下、囊內、經黏膜、心包內、臍內、眼內、經口、經局部、藉由吸入、藉由注射或藉由輸注經投與。
在一些實施例中，該個體經第二治療劑治療。在一些實施例中，該第二治療劑為抗病毒劑。在一些實施例中，該抗病毒劑係選自匹莫維地爾(pimovidir)、奧司他韋、紮那米韋、帕拉米韋、拉尼米韋(laninamivir)、金剛烷胺或金剛乙胺。在特定實施例中，第二治療劑為匹莫維地爾。在一些實施例中，該第二治療劑為病毒疫苗。在一些實施例中，該病毒疫苗在該個體中引起針對A型、B型或C型流感病毒或副流感病毒之免疫反應。
在一些實施例中，結合物與抗病毒劑組合投與，其中抗病毒劑係巴洛沙韋(baloxavir)。在某些實施例中，結合物由式(D-II-6)描述。在其他實施例中，結合物由式(D-II-7)描述。在某些實施例中，各E包括具有與SEQ ID NO：63-138中任一者之序列至少95%一致之胺基酸序列之Fc域。在具體實施例中，各E包括具有與SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：85或SEQ ID NO：86中任一者之序列至少95%一致之胺基酸序列之Fc域。在具體實施例中，各E包括Fc域，該域具有SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：85或SEQ ID NO：86中任一者之胺基酸序列。在較佳實施例中，結合物係結合物45(例如，結合物45a或45b)或結合物46。
在某些實施例中，結合物及巴洛沙韋依次投與。在其他實施例中，結合物及巴洛沙韋同時投與。
在一個態樣，本發明提供了一種藉由向個體投與以下來治療或預防個體之病毒感染之方法：a)有效量之如技術方案1-215中任一項之結合物或組合物；及b)第二治療劑。在某些實施例中，在個體患有病毒感染、假定患有病毒感染或已經暴露於病毒之後，將結合物投與個體。在一些實施例中，將結合物預防性地投與個體。在某些實施例中，在個體患有病毒感染、假定患有病毒感染或已經暴露於病毒之後，向個體投與第二治療劑。在一些實施例中，將第二治療劑預防性地投與個體。在一些實施例中，第二治療劑在結合物之30天內、14天內、7天內、2天內或24小時之內投與。在具體實施例中，第二治療劑在結合物之2天內投與。在某些實施例中，第二治療劑係抗病毒劑(例如匹莫維地爾、奧司他韋、紮那米韋、帕拉米韋、拉尼米韋、金剛烷胺、巴洛沙韋瑪波地爾(baloxavirmarboxil)、巴洛沙韋酸、金剛乙胺或其醫藥學上可接受之鹽)。在具體實施例中，抗病毒劑係巴洛沙韋瑪波地爾、巴洛沙韋酸或其醫藥學上可接受之鹽。在某些實施例中，以20 mg至90 mg(例如25 mg至50 mg、45 mg至70 mg或65至90 mg)之間之量投與巴洛沙韋瑪波地爾。在一些實施例中，經口投與巴洛沙韋瑪波地爾。在某些實施例中，巴洛沙韋瑪波地爾以單劑量投與。在其他實施例中，以超過一劑之劑量投與巴洛沙韋瑪波地爾。在具體實施例中，以20 mg至40 mg之間之量投與巴洛沙韋瑪波地爾。在其他實施例中，以30至80 mg之量投與巴洛沙韋瑪波地爾。在某些實施例中，結合物由式(D-II-6)描述。在其他實施例中，結合物由式(D-II-7)描述。在某些實施例中，各E具有與SEQ ID NO：63-138中任一者之序列至少95%一致之序列。在具體實施例中，各E包括具有與SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：85或SEQ ID NO：86中任一者之序列至少95%一致之胺基酸序列之Fc域。在具體實施例中，各E包括Fc域，該域具有SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：85或SEQ ID NO：86中任一者之胺基酸序列。在某些實施例中，結合物係結合物45(例如，結合物45a或結合物45b)或結合物46。在具體實施例中，結合物肌內、靜脈內、皮內、動脈內、腹膜內、病變內、顱內、關節內、前列腺內、胸膜內、氣管內、鼻內、玻璃體內、陰道內、直腸內、經表面、腫瘤內、經腹膜、皮下、結膜下、囊內、經黏膜、心包內、臍內、眼內、經口、經局部、藉由吸入、藉由注射或藉由輸注來投與。在一些實施例中，結合物靜脈內投與。在一些實施例中，結合物肌內投與。在一些實施例中，病毒感染係由流感病毒或副流感病毒引起。在某些實施例中，該病毒係流感病毒A、B或C，或副流感病毒。
在一些實施例中，在式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者(例如，式(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(D-I)、(D-II)、(D-II-1)、(D-II-2)、(D-II-3)、(D-II-4)、(D-II-5)、(D-II-6)、(D-II-7)、(D-II-8)、(D-II-9)、(D-II-10)、(D-III)、(D-III-1)、(D-III-2)、(D-III-3)、(D-III-4)、(D-III-5)、(D-III-6)、(D-III-7)、(D-III-8)、(D-III-9)、(D-IV)、(D-IV-1)、(D-IV-2)、(D-V)、(D-V-1)、(D-V-2)、(D-V-3)、(D-V-4)、(D-V-5)、(D-V-6)、(D-V-7)、(D-V-8)、(D-V-9)、(D-V-10)、(D-VI)、(D-VI-1)、(D-VI-2)、(D-VI-3)、(D-VI-4)、(D-VI-5)、(D-VI-6)、(D-VI-7)、(D-VI-8)、(D-VI-9)、(D-VII)、(D-VIII)、(D-VIII-1)、(D-VIII-2)、(D-VIII-3)、(D-VIII-4)、(D-VIII-5)、(D-VIII-6)、(D-VIII-7)、(D-VIII-8)、(D-VIII-9)、(D-VIII-10)、(D-VIII-11)、(D-IX)、(D-IX-1)、(D-IX-2)、(D-IX-3)、(D-IX-4)、(D-IX-5)、(D-IX-6)、(D-X)、(D-X-1)、(D-X-2)、(D-X-3)、(D-XI)、(D-XI-1)、(D’-I)、(M-I)、(M-II)、(M-II-1)、(M-II-2)、(M-II-3)、(M-II-4)、(M-II-5)、(M-II-6)、(M-II-7)、(M-II-8)、(M-II-9)、(M-II-10)、(M-III)、(M-III-1)、(M-III-2)、(M-III-3)、(M-III-4)、(M-III-5)、(M-III-6)、(M-III-7)、(M-III-8)、(M-III-9)、(M-IV)、(M-IV-1)、(M-IV-2)、(M-V)、(M-V-1)、(M-V-2)、(M-V-3)、(M-V-4)、(M-V-5)、(M-V-6)、(M-V-7)、(M-V-8)、(M-V-9)、(M-V-10)、(M-VI)、(M-VI-1)、(M-VI-2)、(M-VI-3)、(M-VI-4)、(M-VI-5)、(M-VI-6)、(M-VI-7)、(M-VI-8)、(M-VI-9)、(M-VII)、(M-VIII)、(M-VIII-1)、(M-VIII-2)、(M-VIII-3)、(M-VIII-4)、(M-VIII-5)、(M-VIII-6)、(M-VIII-7)、(M-VIII-8)、(M-VIII-9)、(M-VIII-10)、(M-VIII-11)、(M-IX)、(M-IX-1)、(M-IX-2)、(M-IX-3)、(M-IX-4)、(M-IX-5)、(M-IX-6)、(M-X)、(M-X-1)、(M-X-2)、(M-X-3)、(M-XI)、(M-XI-1)或(M’-I)中任一者)中，含Fc域組合物可取代Fc域且含Fc域-單體組合物可取代Fc域單體。在本文所述之式中任一者(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者)中，當n為1時，E為含Fc域-單體組合物。在本文所述之式中任一者(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者)中，當n為2時，E為含Fc域組合物。
在某些實施例中，該含Fc域組合物為抗體或抗體片段。抗體可包括免疫球蛋白之任何形式、重鏈抗體、輕鏈抗體、基於LRR之抗體或具有抗體樣特性之其他蛋白骨架，以及此項技術中已知之任何其他免疫結合部分，包括抗體片段(例如，Fab、Fab'、Fab’2、F(ab')2、Fd、Fv、Feb、scFv或SMIP)。不同類別之抗體的次單元結構及三維組態為此項技術中已知的。抗體片段可包括如下結合部分，其包括源於抗體或與抗體具有顯著同源性之部分，諸如抗體之抗原決定區。例示性抗體片段包括Fab、Fab'、Fab’2、F(ab')2、Fd、Fv、Feb、scFv及SMIP。
在特定實施例中，該抗體或抗體片段為人類、小鼠、駱駝科動物(例如，美洲駝、羊駝或駱駝)、山羊、綿羊、兔、雞、豚鼠、倉鼠、馬或大鼠抗體或抗體片段。在特定實施例中，該抗體為IgG、IgA、IgD、IgE、IgM或內體。在某些實施例中，該抗體片段包括scFv、sdAb、dAb、Fab、Fab'、Fab'2、F(ab')2、Fd、Fv、Feb或SMIP。
在一些實施例中，該含Fc域組合物(例如，抗體或抗體片段)對一或多種標靶(例如，抗原)賦予結合特異性。
在一些實施例中，由該含Fc域組合物(例如，抗體或抗體片段)結合之該一或多種標靶(例如，抗原)為病毒(例如，流感)蛋白，諸如神經胺糖酸酶或血球凝集素。在一些實施例中，該抗體或抗體片段識別病毒表面抗原。在一些實施例中，該抗體或抗體片段靶向血球凝集素。血球凝集素靶向抗體包括單株抗體，諸如CR6261、CR8020、MEDI8852、MHAA4549A及VIS410。在一些實施例中，該抗體或抗體片段係靶向流感血球凝集素之廣泛中和抗體或抗體片段(例如，描述於Wu等人, J. Mol. Biol. 429:2694–2709 (2017)中之抗體或抗體片段)。在一些實施例中，該抗體或抗體片段靶向病毒基質蛋白(例如，基質2蛋白)。TCN032為基質2蛋白靶向性單株抗體。
在一些實施例中，該含Fc域組合物(例如，抗體或抗體片段)包括一或多種單域抗體(sdAb)。在一些實施例中，該含Fc域組合物為如下抗體或抗體片段，其包括具有流感A反應性之sdAb，諸如結合於流感A之血球凝集素之sdAb (例如SD36或SD38，描述於Laursen等人 Science. 362:598-602 (2018)中)。在一些實施例中，該含Fc域組合物為如下抗體或抗體片段，其包括具有流感B反應性之sdAb，諸如結合於流感B之血球凝集素之sdAb (例如SD83或SD84，描述於Laursen等人 Science. 362:598-602 (2018)中)。
在一些實施例中，該含Fc域組合物係包括2種或2種以上(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10種或10種以上) sdAb之多域抗體(MDAb)或多域抗體片段。在一些實施例中，該MDAb或其片段包括結合於流感A之血球凝集素之一或多種sdAB，及結合於流感B之血球凝集素之一或多種sdAb。在一些實施例中，該MDAb為JNJ-7445 (亦稱作MD3606)，其描述於Laursen等人 Science. 362:598-602 (2018)中。簡言之，JNJ-7445係包括結合於流感A之血球凝集素之兩種sdAb (SD36及SD38)及結合於流感B之血球凝集素之兩種sdAb (SD83及SD84)的MDAb，該等sdAb連接至Fc域(IgG1)。該等sdAb藉由用流感疫苗及H7及H2重組血球凝集素使美洲駝免疫而產生。
在另一態樣中，本發明包括由式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者(例如，式(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(D-I)、(D-II)、(D-II-1)、(D-II-2)、(D-II-3)、(D-II-4)、(D-II-5)、(D-II-6)、(D-II-7)、(D-II-8)、(D-II-9)、(D-II-10)、(D-III)、(D-III-1)、(D-III-2)、(D-III-3)、(D-III-4)、(D-III-5)、(D-III-6)、(D-III-7)、(D-III-8)、(D-III-9)、(D-IV)、(D-IV-1)、(D-IV-2)、(D-V)、(D-V-1)、(D-V-2)、(D-V-3)、(D-V-4)、(D-V-5)、(D-V-6)、(D-V-7)、(D-V-8)、(D-V-9)、(D-V-10)、(D-VI)、(D-VI-1)、(D-VI-2)、(D-VI-3)、(D-VI-4)、(D-VI-5)、(D-VI-6)、(D-VI-7)、(D-VI-8)、(D-VI-9)、(D-VII)、(D-VIII)、(D-VIII-1)、(D-VIII-2)、(D-VIII-3)、(D-VIII-4)、(D-VIII-5)、(D-VIII-6)、(D-VIII-7)、(D-VIII-8)、(D-VIII-9)、(D-VIII-10)、(D-VIII-11)、(D-IX)、(D-IX-1)、(D-IX-2)、(D-IX-3)、(D-IX-4)、(D-IX-5)、(D-IX-6)、(D-X)、(D-X-1)、(D-X-2)、(D-X-3)、(D-XI)、(D-XI-1)、(D’-I)、(M-I)、(M-II)、(M-II-1)、(M-II-2)、(M-II-3)、(M-II-4)、(M-II-5)、(M-II-6)、(M-II-7)、(M-II-8)、(M-II-9)、(M-II-10)、(M-III)、(M-III-1)、(M-III-2)、(M-III-3)、(M-III-4)、(M-III-5)、(M-III-6)、(M-III-7)、(M-III-8)、(M-III-9)、(M-IV)、(M-IV-1)、(M-IV-2)、(M-V)、(M-V-1)、(M-V-2)、(M-V-3)、(M-V-4)、(M-V-5)、(M-V-6)、(M-V-7)、(M-V-8)、(M-V-9)、(M-V-10)、(M-VI)、(M-VI-1)、(M-VI-2)、(M-VI-3)、(M-VI-4)、(M-VI-5)、(M-VI-6)、(M-VI-7)、(M-VI-8)、(M-VI-9)、(M-VII)、(M-VIII)、(M-VIII-1)、(M-VIII-2)、(M-VIII-3)、(M-VIII-4)、(M-VIII-5)、(M-VIII-6)、(M-VIII-7)、(M-VIII-8)、(M-VIII-9)、(M-VIII-10)、(M-VIII-11)、(M-IX)、(M-IX-1)、(M-IX-2)、(M-IX-3)、(M-IX-4)、(M-IX-5)、(M-IX-6)、(M-X)、(M-X-1)、(M-X-2)、(M-X-3)或(M’-I)中任一者)描述之結合物，其中E為抗體或抗體片段。在其中E為抗體或抗體片段之較佳實施例中，n為1。在一些實施例中，該抗體或抗體片段包括本文所述之任何抗體或抗體片段，諸如結合於病毒血球凝集素之單株抗體(例如，CR6261、CR8020、MEDI8852、MHAA4549A或VIS410)；靶向病毒血球凝集素之廣泛中和抗體或抗體片段(例如，描述於Wu等人, J. Mol. Biol. 429:2694–2709 (2017)中之抗體或抗體片段)；靶向病毒血球凝集素之sdAb (例如，SD36、SD38、SD83或SD84)；或靶向病毒血球凝集素之MDAb或其片段(例如，JNJ-7445)。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 1之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 1之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 2之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 2之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 3之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 3之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 4之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 4之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 5之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 5之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 6之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 6之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 7之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 7之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 8之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 8之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 9之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 9之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 10之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 10之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 11之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 12之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 12之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 13之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 13之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 14之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 14之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 15之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 15之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 16之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 16之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 17之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 17之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 18之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 18之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 19之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 19之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 20之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 20之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 21之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 21之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 22之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 22之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 23之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 23之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 24之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 24之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 25之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 25之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 26之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 26之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 27之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 27之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 28之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 28之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 29之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 29之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 30之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 30之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 31之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 31之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 32之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 32之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 33之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 33之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 34之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 34之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 35之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 35之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 36之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 36之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 37之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 37之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 38之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 38之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 39之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 39之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 40之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 40之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 41之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 41之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 42之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 42之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 43之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 43之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 44之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 45之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 46之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 46之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 47之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 47之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 48之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 48之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 49之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 49之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 50之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 50之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 51之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 51之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 52之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 52之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 53之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 53之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 54之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 54之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 55之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 55之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 56之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 56之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 57之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 57之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 58之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 58之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 59之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 59之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 60之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 60之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 61之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 61之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 62之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 62之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 63之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 63之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 64之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 64之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 65之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 65之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 66之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 66之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 67之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 67之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 68之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 68之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 69之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 69之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 70之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 70之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 71之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 71之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 72之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 72之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 73之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 73之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 74之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 74之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 75之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 75之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 76之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 76之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 77之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 77之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 78之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 78之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 79之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 79之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 80之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 80之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 81之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 81之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 82之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 82之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 83之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 83之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 84之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 84之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 85之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 85之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 86之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 86之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 87之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 87之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 88之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 88之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 89之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 89之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 90之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 90之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 91之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 91之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 92之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 92之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 93之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 93之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 94之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 94之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 95之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 95之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 96之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 96之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 97之胺基酸序列。在一些實施例中，E包含與SEQ ID NO: 97之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 98之胺基酸序列。在一些實施例中，E包含與SEQ ID NO: 98之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 99之胺基酸序列。在一些實施例中，E包含與SEQ ID NO: 99之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 100之胺基酸序列。在一些實施例中，E包含與SEQ ID NO: 100之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 101之胺基酸序列。在一些實施例中，E包含與SEQ ID NO: 101之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 102之胺基酸序列。在一些實施例中，E包含與SEQ ID NO: 102之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 103之胺基酸序列。在一些實施例中，E包含與SEQ ID NO: 103之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 104之胺基酸序列。在一些實施例中，E包含與SEQ ID NO: 104之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 105之胺基酸序列。在一些實施例中，E包含與SEQ ID NO: 105之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 106之胺基酸序列。在一些實施例中，E包含與SEQ ID NO: 106之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 107之胺基酸序列。在一些實施例中，E包含與SEQ ID NO: 107之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 108之胺基酸序列。在一些實施例中，E包含與SEQ ID NO: 108之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 109之胺基酸序列。在一些實施例中，E包含與SEQ ID NO: 109之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 110之胺基酸序列。在一些實施例中，E包含與SEQ ID NO: 110之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 111之胺基酸序列。在一些實施例中，E包含與SEQ ID NO: 111之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 112之胺基酸序列。在一些實施例中，E包含與SEQ ID NO: 112之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 113之胺基酸序列。在一些實施例中，E包含與SEQ ID NO: 113之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 114之胺基酸序列。在一些實施例中，E包含與SEQ ID NO: 114之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 115之胺基酸序列。在一些實施例中，E包含與SEQ ID NO: 115之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 116之胺基酸序列。在一些實施例中，E包含與SEQ ID NO: 116之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 117之胺基酸序列。在一些實施例中，E包含與SEQ ID NO: 117之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 118之胺基酸序列。在一些實施例中，E包含與SEQ ID NO: 118之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 119之胺基酸序列。在一些實施例中，E包含與SEQ ID NO: 119之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 120之胺基酸序列。在一些實施例中，E包含與SEQ ID NO: 120之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 121之胺基酸序列。在一些實施例中，E包含與SEQ ID NO: 121之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 122之胺基酸序列。在一些實施例中，E包含與SEQ ID NO: 122之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 123之胺基酸序列。在一些實施例中，E包含與SEQ ID NO: 123之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 124之胺基酸序列。在一些實施例中，E包含與SEQ ID NO: 124之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 125之胺基酸序列。在一些實施例中，E包含與SEQ ID NO: 125之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 126之胺基酸序列。在一些實施例中，E包含與SEQ ID NO: 126之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 127之胺基酸序列。在一些實施例中，E包含與SEQ ID NO: 127之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 128之胺基酸序列。在一些實施例中，E包含與SEQ ID NO: 128之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 129之胺基酸序列。在一些實施例中，E包含與SEQ ID NO: 129之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 130之胺基酸序列。在一些實施例中，E包含與SEQ ID NO: 130之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 131之胺基酸序列。在一些實施例中，E包含與SEQ ID NO: 131之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 132之胺基酸序列。在一些實施例中，E包含與SEQ ID NO: 132之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 133之胺基酸序列。在一些實施例中，E包含與SEQ ID NO: 133之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 134之胺基酸序列。在一些實施例中，E包含與SEQ ID NO: 134之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 135之胺基酸序列。在一些實施例中，E包含與SEQ ID NO: 135之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 136之胺基酸序列。在一些實施例中，E包含與SEQ ID NO: 136之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 137之胺基酸序列。在一些實施例中，E包含與SEQ ID NO: 137之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 138之胺基酸序列。在一些實施例中，E包含與SEQ ID NO: 138之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 139之胺基酸序列。在一些實施例中，E包含與SEQ ID NO: 139之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 140之胺基酸序列。在一些實施例中，E包含與SEQ ID NO: 140之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E(例如，各E)包括SEQ ID NO: 145之胺基酸序列。在一些實施例中，E包含與SEQ ID NO: 141之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，其中E包括Fc域單體，Fc域單體(例如，具有SEQ ID NO：1-138中任一者之序列之Fc域單體)包括對應於M252Y/S254T/T256E(YTE)之三重突變。如本文所用，應理解「對應於」(例如，特定SEQ ID NO.之)特定胺基酸殘基之胺基酸包括熟習此項技術者將理解與(例如，該特定序列之)該特定殘基比對的任何胺基酸殘基。例如，SEQ ID NO: 1-138中任一者可發生突變以包括YTE突變。
在其中E包括Fc域單體的本文所述之任何態樣之一些實施例中，該Fc域單體(例如，具有SEQ ID NO: 1-138中任一者之序列的Fc域單體)包括對應於M428L/N434S (LS)之雙重突變型。如本文所用，應理解「對應於」(例如，特定SEQ ID NO.之)特定胺基酸殘基之胺基酸包括熟習此項技術者將理解與(例如，該特定序列之)該特定殘基比對的任何胺基酸殘基。例如，SEQ ID NO: 1-138中任一者可發生突變以包括LS突變。
在其中E包括Fc域單體的本文所述之任何態樣之一些實施例中，該Fc域單體(例如，具有SEQ ID NO: 1-138中任一者之序列的Fc域單體)包括對應於N434H之突變型。如本文所用，應理解「對應於」(例如，特定SEQ ID NO.之)特定胺基酸殘基之胺基酸包括熟習此項技術者將理解與(例如，該特定序列之)該特定殘基比對的任何胺基酸殘基。例如，SEQ ID NO: 1-138中任一者可發生突變以包括N434H突變。
在其中E包括Fc域單體的本文所述之任何態樣之一些實施例中，該Fc域單體(例如，具有SEQ ID NO: 1-138中任一者之序列的Fc域單體)包括對應於C220S之突變型。如本文所用，應理解「對應於」(例如，特定SEQ ID NO.之)特定胺基酸殘基之胺基酸包括熟習此項技術者將理解與(例如，該特定序列之)該特定殘基比對的任何胺基酸殘基。例如，SEQ ID NO: 1-138中任一者可發生突變以包括C220S突變。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，Fc域單體(例如，具有SEQ ID NO：1-95中任一者序列之Fc域單體)包括對應於V309D/Q311H/N434S(DHS)之三重突變。如本文所用，應理解「對應於」(例如，特定SEQ ID NO.之)特定胺基酸殘基之胺基酸包括熟習此項技術者將理解與(例如，該特定序列之)該特定殘基比對的任何胺基酸殘基。例如，可以將SEQ ID NO：1-95中任一者突變為包括DHS突變。
在其中E包括Fc域單體的本文所述之任何態樣之一些實施例中，該Fc域單體(例如，具有SEQ ID NO: 1-138中任一者之序列的Fc域單體)係該Fc域單體之片段(例如，來自SEQ ID NO: 1-138之至少25個(例如，20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50個或更多)、至少50個(例如，51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75個或更多)、至少75個(例如，75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100個或更多)連續胺基酸長的片段。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者之結合物)，E之一或多個表面暴露離胺酸殘基的一或多個氮原子或E中之一或多個表面暴露半胱胺酸的一或多個硫原子共價結合於連接體(例如，PEG2 -PEG20 連接體)。結合於E之連接體可經官能化，以致其可反應以與本文所述之任何A1 -L或任何A2 -L-A1 之L形成共價鍵。在較佳實施例中，E結合於經疊氮基官能化之連接體且A1 -L或任何A2 -L-A1 之L經炔基官能化。E之連接體-疊氮基及A1 -L或A2 -L-A1 之連接體-炔結合(例如，藉由點擊化學)形成本發明結合物，例如由式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者描述之結合物。在其他實施例中，E結合於經炔基官能化之連接體且任何A1 -L或任何A2 -L-A1 之L經疊氮基官能化。E之連接體-炔及A1 -L或A2 -L-A1 之連接體-疊氮基結合(例如，藉由點擊化學，參見例如圖103)形成本發明結合物，例如由式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)描述之結合物。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者之波浪線可表示E與A1 -L或A2 -L-A1 之L之間的共價鍵。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者之波浪線可表示E之一或多個胺基酸側鏈(例如，E之一或多個表面暴露離胺酸殘基的一或多個氮原子或E中之一或多個表面暴露半胱胺酸的一或多個硫原子)已結合於連接體(例如，PEG2 -PEG20 連接體)，其中該連接體已經反應性部分官能化，以致該反應性部分與本文所述之任何A1 -L或任何A2 -L-A1 之L形成共價鍵(例如，藉由經疊氮基官能化之連接體與經炔官能化之連接體之間的點擊化學，如上文所述；參見例如圖103)。在本文所述之任何態樣之一些實施例中，A1 及/或A2 具有由(A-I)描述之結構：
Figure 02_image009
(A-I)。
在較佳實施例中，其中A1 及/或A2 具有由(A-I)描述之結構：R1 為-NHC(=NH)NH2 ，R4 為-CO2 H，R5 為-COCH3 ，及/或X為-O-。在較佳實施例中，A1 及/或A2 具有由下式描述之紮那米韋結構：
Figure 02_image939
。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，A1 及/或A2 具有由(A-II)描述之結構：
Figure 02_image011
(A-II)。
在較佳實施例中，其中A1 及/或A2 具有由(A-II)描述之結構：R1 為-NHC(=NH)NH2 ，R2 為H或F，R3 為H或F，R4 為-CO2 H，R5 為-COCH3 ，及/或X為-O-。在較佳實施例中，A1 及/或A2 具有由下式描述之結構：
Figure 02_image942
或
Figure 02_image944
。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，A1 及/或A2 具有由(A-III)描述之結構：
Figure 02_image013
(A-III)。
在較佳實施例中，其中A1 及/或A2 具有由(A-III)描述之結構：R1 為-NHC(=NH)NH2 ，R4 為-CO2 H，及/或R5 為-COCH3 。在較佳實施例中，A1 及/或A2 具有由下式描述之帕拉米韋結構：
Figure 02_image947
。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，A1 及/或A2 具有由(A-IV)描述之結構：
Figure 02_image015
(A-IV)。
在較佳實施例中，其中A1 及/或A2 具有由(A-IV)描述之結構：R1 為-NHC(=NH)NH2 ，R4 為-CO2 H，及/或R5 為-COCH3 。在較佳實施例中，A1 及/或A2 具有由下式描述之結構：
Figure 02_image950
。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，A1 及/或A2 具有由(A-V)描述之結構：
Figure 02_image017
(A-V)。
在較佳實施例中，其中A1 及/或A2 具有由(A-V)描述之結構：R1 為-NHC(=NH)NH2 ，R4 為-CO2 H，及/或R5 為-COCH3 。在較佳實施例中，A1 及/或A2 具有由下式描述之結構：
Figure 02_image953
。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，A1 及/或A2 具有由(A-VI)描述之結構：
Figure 02_image019
(A-VI)。
在較佳實施例中，其中A1 及/或A2 具有由(A-VI)描述之結構：R1 為-NHC(=NH)NH2 ，R4 為-CO2 H，R5 為-COCH3 ，及/或X為-O-。在較佳實施例中，A1 及/或A2 具有由下式描述之紮那米韋結構：
Figure 02_image956
。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，A1 及/或A2 具有由(A-VII)描述之結構：
Figure 02_image021
(A-VII)。
在較佳實施例中，其中A1 及/或A2 具有由(A-VII)描述之結構：R1 為-NHC(=NH)NH2 ，R2 為H或F，R3 為H或F，R4 為-CO2 H，R5 為-COCH3 ，及/或X為-O-。在較佳實施例中，A1 及/或A2 具有由下式描述之結構：
Figure 02_image959
或
Figure 02_image961
。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，A1 及/或A2 具有由(A-VIII)描述之結構：
Figure 02_image023
(A-VIII)。
在較佳實施例中，其中A1 及/或A2 具有由(A-VIII)描述之結構：R1 為-NHC(=NH)NH2 ，R5 為-COCH3 ，及/或X為-O-。在較佳實施例中，A1 及/或A2 具有由下式描述之結構：
Figure 02_image964
。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，A1 及/或A2 具有由(A-IX)描述之結構：
Figure 02_image025
(A-IX)。
在較佳實施例中，其中A1 及/或A2 具有由(A-IX)描述之結構：R1 為-NHC(=NH)NH2 ，R2 為H或F，R3 為H或F，R5 為-COCH3 ，及/或X為-O-。在較佳實施例中，A1 及/或A2 具有由下式描述之結構：
Figure 02_image967
或
Figure 02_image969
。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，A1 及/或A2 具有由(A-X)描述之結構：
Figure 02_image027
(A-X)。
在較佳實施例中，其中A1 及/或A2 具有由(A-X)描述之結構：R1 為-NHC(=NH)NH2 ，R3 為H，R5 為-COCH3 ，及/或X為-O-。在較佳實施例中，A1 及/或A2 具有由下式描述之磺基紮那米韋結構：
Figure 02_image972
。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，A1 及/或A2 具有由(A-XI)描述之結構：
Figure 02_image029
(A-XI)。
在較佳實施例中，其中A1 及/或A2 具有由(A-XI)描述之結構：R4 為-CO2 H，及/或R5 為-COCH3 。在較佳實施例中，該烯烴為(E)、(Z)或(E)/(Z)之外消旋混合物。在較佳實施例中，A1 及/或A2 具有由下式描述之A-315675 (Abbott)結構：
Figure 02_image975
。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，A1 及/或A2 具有由(A-XII)描述之結構：
Figure 02_image031
(A-XII)。
在較佳實施例中，其中A1 及/或A2 具有由(A-XII)描述之結構：R4 為-CO2 H。在較佳實施例中，A1 及/或A2 具有由下式描述之A-315675 (Abbott)結構：
Figure 02_image978
。
在一些實施例中，該結合物為結合物1或其任何區域異構體，且藥物:抗體比率(DAR) (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。在另一態樣中，本發明提供結合物之群體，各結合物具有結合物1之結構，其中結合物之群體之平均DAR(例如，T)為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些實施例中，該結合物為結合物2或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。在另一態樣中，本發明提供結合物之群體，各結合物具有結合物2之結構，其中結合物之群體之平均DAR(例如，T)為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些實施例中，該結合物為結合物3或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。在另一態樣中，本發明提供結合物之群體，各結合物具有結合物3之結構，其中結合物之群體之平均DAR(例如，T)為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些實施例中，該結合物為結合物4或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。在另一態樣中，本發明提供結合物之群體，各結合物具有結合物4之結構，其中結合物之群體之平均DAR(例如，T)為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些實施例中，該結合物為結合物5或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。在另一態樣中，本發明提供結合物之群體，各結合物具有結合物5之結構，其中結合物之群體之平均DAR(例如，T)為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些實施例中，該結合物為結合物6或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。在另一態樣中，本發明提供結合物之群體，各結合物具有結合物6之結構，其中結合物之群體之平均DAR(例如，T)為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些實施例中，該結合物為結合物7或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。在另一態樣中，本發明提供結合物之群體，各結合物具有結合物7之結構，其中結合物之群體之平均DAR(例如，T)為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些實施例中，該結合物為結合物8或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。在另一態樣中，本發明提供結合物之群體，各結合物具有結合物8之結構，其中結合物之群體之平均DAR(例如，T)為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些實施例中，該結合物為結合物9或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。在另一態樣中，本發明提供結合物之群體，各結合物具有結合物9之結構，其中結合物之群體之平均DAR(例如，T)為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些實施例中，該結合物為結合物10或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。在另一態樣中，本發明提供結合物之群體，各結合物具有結合物10之結構，其中結合物之群體之平均DAR(例如，T)為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些實施例中，該結合物為結合物11或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。在另一態樣中，本發明提供結合物之群體，各結合物具有結合物11之結構，其中結合物之群體之平均DAR(例如，T)為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些實施例中，該結合物為結合物12或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。在另一態樣中，本發明提供結合物之群體，各結合物具有結合物12之結構，其中結合物之群體之平均DAR(例如，T)為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些實施例中，該結合物為結合物13或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。在另一態樣中，本發明提供結合物之群體，各結合物具有結合物13之結構，其中結合物之群體之平均DAR(例如，T)為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些實施例中，該結合物為結合物14或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。在另一態樣中，本發明提供結合物之群體，各結合物具有結合物14之結構，其中結合物之群體之平均DAR(例如，T)為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些實施例中，該結合物為結合物15或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。在另一態樣中，本發明提供結合物之群體，各結合物具有結合物15之結構，其中結合物之群體之平均DAR(例如，T)為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些實施例中，該結合物為結合物16或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。在另一態樣中，本發明提供結合物之群體，各結合物具有結合物16之結構，其中結合物之群體之平均DAR(例如，T)為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些實施例中，該結合物為結合物17或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。在另一態樣中，本發明提供結合物之群體，各結合物具有結合物17之結構，其中結合物之群體之平均DAR(例如，T)為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些實施例中，該結合物為結合物18或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。在另一態樣中，本發明提供結合物之群體，各結合物具有結合物18之結構，其中結合物之群體之平均DAR(例如，T)為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些實施例中，該結合物為結合物19或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。在另一態樣中，本發明提供結合物之群體，各結合物具有結合物19之結構，其中結合物之群體之平均DAR(例如，T)為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些實施例中，該結合物為結合物20或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。在另一態樣中，本發明提供結合物之群體，各結合物具有結合物20之結構，其中結合物之群體之平均DAR(例如，T)為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些實施例中，該結合物為結合物21或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。在另一態樣中，本發明提供結合物之群體，各結合物具有結合物21之結構，其中結合物之群體之平均DAR(例如，T)為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些實施例中，該結合物為結合物22或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。在另一態樣中，本發明提供結合物之群體，各結合物具有結合物22之結構，其中結合物之群體之平均DAR(例如，T)為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些實施例中，該結合物為結合物23或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。在另一態樣中，本發明提供結合物之群體，各結合物具有結合物23之結構，其中結合物之群體之平均DAR(例如，T)為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些實施例中，該結合物為結合物24或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。在另一態樣中，本發明提供結合物之群體，各結合物具有結合物24之結構，其中結合物之群體之平均DAR(例如，T)為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些實施例中，該結合物為結合物25或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。在另一態樣中，本發明提供結合物之群體，各結合物具有結合物25之結構，其中結合物之群體之平均DAR(例如，T)為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些實施例中，該結合物為結合物26或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。在另一態樣中，本發明提供結合物之群體，各結合物具有結合物26之結構，其中結合物之群體之平均DAR(例如，T)為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些實施例中，該結合物為結合物27或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。在另一態樣中，本發明提供結合物之群體，各結合物具有結合物27之結構，其中結合物之群體之平均DAR(例如，T)為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些實施例中，該結合物為結合物28或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。在另一態樣中，本發明提供結合物之群體，各結合物具有結合物28之結構，其中結合物之群體之平均DAR(例如，T)為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些實施例中，該結合物為結合物29或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。在另一態樣中，本發明提供結合物之群體，各結合物具有結合物29之結構，其中結合物之群體之平均DAR(例如，T)為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些實施例中，該結合物為結合物30或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。在另一態樣中，本發明提供結合物之群體，各結合物具有結合物30之結構，其中結合物之群體之平均DAR(例如，T)為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些實施例中，該結合物為結合物31或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。在另一態樣中，本發明提供結合物之群體，各結合物具有結合物31之結構，其中結合物之群體之平均DAR(例如，T)為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些實施例中，該結合物為結合物32或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。在另一態樣中，本發明提供結合物之群體，各結合物具有結合物32之結構，其中結合物之群體之平均DAR(例如，T)為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些實施例中，該結合物為結合物33或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。在另一態樣中，本發明提供結合物之群體，各結合物具有結合物33之結構，其中結合物之群體之平均DAR(例如，T)為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些實施例中，該結合物為結合物34或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。在另一態樣中，本發明提供結合物之群體，各結合物具有結合物34之結構，其中結合物之群體之平均DAR(例如，T)為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些實施例中，該結合物為結合物35或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。在另一態樣中，本發明提供結合物之群體，各結合物具有結合物35之結構，其中結合物之群體之平均DAR(例如，T)為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些實施例中，該結合物為結合物36或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。在另一態樣中，本發明提供結合物之群體，各結合物具有結合物36之結構，其中結合物之群體之平均DAR(例如，T)為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些實施例中，該結合物為結合物37或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。在另一態樣中，本發明提供結合物之群體，各結合物具有結合物37之結構，其中結合物之群體之平均DAR(例如，T)為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些實施例中，該結合物為結合物38或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。在另一態樣中，本發明提供結合物之群體，各結合物具有結合物38之結構，其中結合物之群體之平均DAR(例如，T)為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些實施例中，該結合物為結合物39或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。在另一態樣中，本發明提供結合物之群體，各結合物具有結合物39之結構，其中結合物之群體之平均DAR(例如，T)為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些實施例中，該結合物為結合物40或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。在另一態樣中，本發明提供結合物之群體，各結合物具有結合物40之結構，其中結合物之群體之平均DAR(例如，T)為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些實施例中，該結合物為結合物41或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。在另一態樣中，本發明提供結合物之群體，各結合物具有結合物41之結構，其中結合物之群體之平均DAR(例如，T)為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些實施例中，該結合物為結合物42或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。在另一態樣中，本發明提供結合物之群體，各結合物具有結合物42之結構，其中結合物之群體之平均DAR(例如，T)為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些實施例中，該結合物為結合物43或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。在另一態樣中，本發明提供結合物之群體，各結合物具有結合物43之結構，其中結合物之群體之平均DAR(例如，T)為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些實施例中，結合物為結合物44或其任何區域異構體，並且DAR (例如，T)在0.5與10.0之間，例如，約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR為0.5至2.0，2.0至4.0，4.0至6.0，6.0至8.0，或8.0至10.0。在另一態樣中，本發明提供結合物之群體，各結合物具有結合物44之結構，其中結合物之群體之平均DAR(例如，T)為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些實施例中，結合物為結合物45(例如，结合物45a或结合物45b)或其任何區域異構體，並且DAR (例如，T)在0.5與10.0之間，例如，約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR為0.5至2.0，2.0至4.0，4.0至6.0，6.0至8.0，或8.0至10.0。在另一態樣中，本發明提供結合物之群體，各結合物具有結合物45(例如，结合物45a或结合物45b)之結構，其中結合物之群體之平均DAR(例如，T)為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些實施例中，結合物為結合物46或其任何區域異構體，並且DAR (例如，T)在0.5與10.0之間，例如，約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR為0.5至2.0，2.0至4.0，4.0至6.0，6.0至8.0，或8.0至10.0。在另一態樣中，本發明提供結合物之群體，各結合物具有結合物46之結構，其中結合物之群體之平均DAR(例如，T)為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些實施例中，結合物為結合物47或其任何區域異構體，並且DAR (例如，T)在0.5與10.0之間，例如，約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR為0.5至2.0，2.0至4.0，4.0至6.0，6.0至8.0，或8.0至10.0。在另一態樣中，本發明提供結合物之群體，各結合物具有結合物47之結構，其中結合物之群體之平均DAR(例如，T)為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些實施例中，結合物為結合物48或其任何區域異構體，並且DAR (例如，T)在0.5與10.0之間，例如，約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR為0.5至2.0，2.0至4.0，4.0至6.0，6.0至8.0，或8.0至10.0。在另一態樣中，本發明提供結合物之群體，各結合物具有結合物48之結構，其中結合物之群體之平均DAR(例如，T)為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，本發明提供由式(D-I)、(M-I)、(1)或(2)中之任一者描述之結合物：其中各A1 及各A2 獨立地選自式(A-XIII)中任一者：
Figure 02_image980
(A-XIII) 其中R1 選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ；R4 選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H；R5 選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ；X選自-O-及-S-；Y選自
Figure 02_image982
R6 選自
Figure 02_image984
Figure 02_image986
R7 選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； R8 選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； R9 選自-H、鹵素(例如Cl或F)、-OR10 、-NHC(=O)R7 、視情況經取代C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； R10 選自C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； n為1或2； 各E包含Fc域單體、白蛋白、白蛋白結合肽或Fc結合肽； L係共價附接至E且附接至各A1 或各A1 及A2 之各Y的連接體； T係1至20之整數，並且 式(D-I)、(M-I)、(1)或(2)中之每條波浪線表示L與各E共價附接。 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，各A1 及各A2 由式(A-XIII-1)描述：
Figure 02_image988
(A-XIII-1)
在一些實施例中，各A1 及各A2 獨立地選自式(A-XIII-1a)-(A-XIII-1d)中任一者：
Figure 02_image990
、
Figure 02_image992
、
Figure 02_image994
、
Figure 02_image996
(A-XIII-1a)           (A-XIII-1b)                (A-XIII-1c)           (A-XIII-1d)
在一些實施例中，結合物由式(D-XI)描述：
Figure 02_image998
(D-XI) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，結合物由式(D-XI-1)描述：
Figure 02_image1000
(D-XI-1) 其中R7 選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，結合物由式(M-XI)描述：
Figure 02_image1002
(M-XI) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，結合物由式(M-XI-1)描述：
Figure 02_image1004
(M-XI-1) 其中R7 選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；或其醫藥學上可接受之鹽。定義
為了促進理解本發明，下文定義多個術語。本文所定義之術語具有如本發明相關領域中之一般技術者通常所理解的含義。諸如「一(a)」、「一(an)」及「該(the)」之術語不意欲僅指單一實體，而包括可用於說明之特定實例所屬的一般類別。該術語在本文中用於描述本發明之特定實施例，但其使用不會限定本發明，除非如申請專利範圍中所概述。
如本文所用，術語「神經胺糖酸酶抑制劑」或「病毒神經胺糖酸酶抑制劑」係指減少酶流感病毒神經胺糖酸酶(例如，來自A型、B型或C型流感病毒)之活性之化合物。神經胺糖酸酶抑制劑可藉由熟習此項技術者已知之方法，例如藉由流感病毒斑塊減少分析中病毒複製之減少，例如低於20 μM (例如，低於10 μM、5 μM、2 μM、1 μM、500 nM或100 nM)之濃度來鑑別。熟習此項技術者已知之病毒神經胺糖酸酶抑制劑包括紮那米韋、磺基紮那米韋、帕拉米韋及A-315675 (Abbott) (參見例如Hadházi等人 A sulfozanamivir analogue has potent anti-influenza virus activity.ChemMedChem Comm. 13:785-789 (2018)及In vitro characterization of A-315675, a highly potent inhibitor of A and B strain of influenze virus neuraminidases and influenza virus replication.Antimicrobial Agents and Chemotherapy 46(4):1014-1021 (2002))。本發明之病毒神經胺糖酸酶抑制劑包括紮那米韋、磺基紮那米韋、帕拉米韋、A-315675及其類似物，諸如式(A-I)-(A-XIII)之病毒神經胺糖酸酶抑制劑：
Figure 02_image009
、
Figure 02_image011
、
Figure 02_image013
、
Figure 02_image015
、
Figure 02_image017
、 (A-I)                       (A-II)                    (A-III)                (A-IV)               (A-V)
Figure 02_image019
、
Figure 02_image021
、
Figure 02_image023
、
Figure 02_image025
、 (A-VI)                (A-VII)             (A-VIII)                     (A-IX)
Figure 02_image027
、
Figure 02_image029
、
Figure 02_image031
；
Figure 02_image980
(A-X)                 (A-XI)                      (A-XII)                            (A-XIII) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ；R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br；R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H；R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ；X係選自-O-及-S-；Y係選自
Figure 02_image1019
Figure 02_image1021
R6 係選自
Figure 02_image035
、
Figure 02_image037
、
Figure 02_image039
、
Figure 02_image041
、
Figure 02_image043
、
Figure 02_image045
、
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、
Figure 02_image049
、
Figure 02_image051
、
Figure 02_image053
、
Figure 02_image055
、
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、
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、
Figure 02_image061
、
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、
Figure 02_image065
、
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、
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、
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、
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、
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、
Figure 02_image077
、
Figure 02_image079
、
Figure 02_image081
、
Figure 02_image083
、
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、
Figure 02_image087
、
Figure 02_image089
、
Figure 02_image091
、
Figure 02_image093
、
Figure 02_image095
及
Figure 02_image097
； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；且R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；R9 選自-H、鹵素(例如Cl、F或Br)、-OR10 、-NHC(=O)R7 、視情況經取代C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；且R10 選自C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基。
如本文所用，術語「抑制神經胺糖酸酶活性」係指小於或等於1,000 nM之IC50 ，例如，如根據本文實例2中之神經胺糖酸酶抑制分析所量測。特定言之，IC50 表示活體外50%抑制所需之流感病毒神經胺糖酸酶抑制劑濃度。在一些態樣中，根據神經胺糖酸酶抑制分析小於或等於100 nM或小於或等於10 nM之IC50 指示抑制神經胺糖酸酶活性之化合物。
「病毒感染」意指病毒(例如，流感病毒)在宿主生物體(例如，人類個體)中之致病性生長。病毒感染可為其中病毒群體之存在正在損害宿主身體之任何情形。因此，當個體之身體中或身體上存在過量病毒群體時，或當病毒群體之存在正在損害該個體之細胞或其他組織時，該個體「正在經受」病毒感染。
如本文所用，術語「Fc域單體」係指如下多肽鏈，其包括至少一個鉸鏈域及第二及第三抗體恆定域(CH 2及CH 3)或其功能片段(例如，能夠(i)與另一Fc域單體二聚以形成Fc域，及(ii)結合於Fc受體之片段。該Fc域單體可為任何免疫球蛋白抗體同型，包括IgG、IgE、IgM、IgA或IgD (例如，IgG)。另外，該Fc域單體可為IgG亞型(例如，IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgG4) (例如，IgG1)。Fc域單體不包括免疫球蛋白中能夠充當抗原-識別區之任何部分，例如可變域或互補決定區(CDR)。如本文所述之結合物中的Fc域單體可含有相對於野生型Fc域單體序列之一或多種改變(例如，1-10、1-8、1-6、1-4種胺基酸取代、添加或缺失)，其改變Fc域與Fc受體之間的相互作用。合適改變之實例為此項技術中已知的。在某些實施例中，人類Fc域單體(例如IgG重鏈，諸如IgG1)包含自Asn208、Glu216、Asp221、Lys222或Cys226中任一者延伸至Lys447處之重鏈羧基端的區。該Fc區之C端Lys447可或可不存在，不影響該Fc區之結構或穩定性。多肽表現後，C端Lys 447可被蛋白水解裂解。在本文描述之任何Fc域單體之一些實施例中，C端Lys 447視情況地存在或不存在。本發明具體地考慮了SEQ ID NO：1-4、11、16、19、20、32-37、48-53及60-68中任一者，其不包括對應於Lys447之C端Lys。Fc區(例如，SEQ ID NO：60-77中任一者)之N端N(Asn)可以存在或可以不存在，而不影響Fc區之穩定性結構。N端Asn可在多肽表現時去醯胺。在本文描述之任何Fc域單體之一些實施例中，N端Asn視情況地存在或不存在。本發明具體地考慮了不包括N端Asn之SEQ ID NO：60-77中任一者。除非本文中另外規定，否則該IgG或Fc域單體中胺基酸殘基之編號係根據針對抗體之EU編號系統，該系統亦稱為Kabat EU指數，如例如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest , 第5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991中所述。
如本文所用，術語「Fc域」係指兩種Fc域單體之二聚體，其能夠結合Fc受體。在野生型Fc域中，兩種Fc域單體藉由兩個CH 3抗體恆定域之間的相互作用二聚化，在一些實施例中，兩種二聚化Fc域單體之鉸鏈域之間形成一或多個二硫鍵。
術語「共價附接」係指結合物中藉由共價鍵彼此連接之兩個部分，該共價鍵形成於該結合物之該兩個部分中的兩個原子之間。
如本文所用，術語「Fc結合肽」係指係指具有5至50個(例如，5至40個、5至30個、5至20個、5至15個、5至10個、10至50個、10至30個或10至20個)胺基酸殘基之胺基酸序列之多肽，其對Fc域(諸如本文所述之任何Fc域)具有親和力且具有結合該Fc域之功能。Fc結合肽肽可具有不同起源，例如合成、人類、小鼠或大鼠。本發明之Fc結合肽包括已經工程改造以包括一或多個(例如，兩個、三個、四個或五個)溶劑暴露半胱胺酸或離胺酸殘基之Fc結合肽，其可提供用於結合於本發明化合物(例如，結合於神經胺糖酸酶抑制劑單體或二聚體，包括藉助於連接體)之位點。最佳地，該Fc結合肽將含有單一溶劑暴露半胱胺酸或離胺酸，因此使得本發明化合物能夠位點特異性結合。Fc結合肽可僅包括天然存在之胺基酸殘基，或可包括一或多個非天然存在之胺基酸殘基。在包括時，非天然存在之胺基酸殘基(例如，非天然存在之胺基酸殘基的側鏈)可用作用於本發明化合物(例如，神經胺糖酸酶抑制劑單體或二聚體，包括藉助於連接體)之附接點。本發明之Fc結合肽可為直鏈或環狀的。本發明之Fc結合肽包括熟習此項技術者已知之任何Fc結合肽。
如此處所用，術語「白蛋白」係指包含對應於天然存在之白蛋白(例如，人類血清白蛋白)或其變異體(諸如天然存在之白蛋白的經工程改造變異體)之胺基酸徐麗麗餓之多肽。白蛋白之變異體包括多態性、諸如域及子域之片段及融合蛋白(例如，具有諸如多肽連接體之C端或N端融合之白蛋白)。較佳地，白蛋白具有人類血清白蛋白(HSA)或其變異體或片段之胺基酸序列，最佳地具有其功能變異體或片段之胺基酸序列。本發明之白蛋白包括與SEQ ID NO: 139-141中任一者具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之蛋白。本發明之白蛋白包括已經工程改造以包括一或多個(例如，兩個、三個、四個或五個)溶劑暴露半胱胺酸或離胺酸殘基之白蛋白，其可提供用於結合於本發明化合物(例如，結合於神經胺糖酸酶抑制劑單體或二聚體，包括藉助於連接體)之位點。最佳地，該白蛋白將含有單一溶劑暴露半胱胺酸或離胺酸，因此使得本發明化合物能夠位點特異性結合。白蛋白可僅包括天然存在之胺基酸殘基，或可包括一或多個非天然存在之胺基酸殘基。在包括時，非天然存在之胺基酸殘基(例如，非天然存在之胺基酸殘基的側鏈)可用作用於本發明化合物(例如，神經胺糖酸酶抑制劑單體或二聚體，包括藉助於連接體)之附接點。
如本文所用，術語「白蛋白結合肽」係指具有5至50個(例如，5至40個、5至30個、5至20個、5至15個、5至10個、10至50個、10至30個或10至20個)胺基酸殘基之胺基酸序列之多肽，其對白蛋白(諸如本文所述之任何白蛋白)具有親和力且具有結合該白蛋白之功能。較佳地，白蛋白結合肽結合於天然存在之血清白蛋白，最佳地人類血清白蛋白。白蛋白結合肽可具有不同起源，例如合成、人類、小鼠或大鼠。本發明之白蛋白結合肽包括已經工程改造以包括一或多個(例如，兩個、三個、四個或五個)溶劑暴露半胱胺酸或離胺酸殘基之白蛋白結合肽，其可提供用於結合於本發明化合物(例如，結合於神經胺糖酸酶抑制劑單體或二聚體，包括藉助於連接體)之位點。最佳地，該白蛋白結合肽將含有單一溶劑暴露半胱胺酸或離胺酸，因此使得本發明化合物能夠位點特異性結合。白蛋白結合肽可僅包括天然存在之胺基酸殘基，或可包括一或多個非天然存在之胺基酸殘基。在包括時，非天然存在之胺基酸殘基(例如，非天然存在之胺基酸殘基的側鏈)可用作用於本發明化合物(例如，神經胺糖酸酶抑制劑單體或二聚體，包括藉助於連接體)之附接點。本發明之白蛋白結合肽可為直鏈或環狀的。本發明之白蛋白結合肽包括熟習此項技術者已知之任何白蛋白結合肽，其實例提供於本文中。進一步例示性白蛋白結合肽提供於美國專利申請案第2005/0287153號中，該美國專利申請案以引用之方式整體併入本文中。
如本文所用，諸如表面暴露半胱胺酸或表面暴露離胺酸之「表面暴露胺基酸」或「溶劑暴露胺基酸」係指如下胺基酸，其易接近圍繞該蛋白質之溶劑。表面暴露胺基酸可為天然存在的，或該蛋白質之經工程改造變異體(例如，取代或插入)。在一些實施例中，表面暴露胺基酸係如下胺基酸，其在經取代時未實質上改變該蛋白質之三維結構。
如本文所用，術語「連接體」、「L」及「L'」係指結合物中之兩種或兩種以上組分之間(例如，本文所述之結合物中的兩種神經胺糖酸酶抑制劑之間、本文所述之結合物中的神經胺糖酸酶抑制劑與Fc域或白蛋白之間及本文所述之結合物中的兩種神經胺糖酸酶抑制劑之二聚體與Fc域或白蛋白之間)的共價連接。在一些實施例中，本文所述之結合物可含有具有三價結構之連接體(例如，三價連接體)。三價連接體具有三個臂，其中各臂共價連接至該結合物之組分(例如，結合於第一神經胺糖酸酶抑制劑之第一臂、結合於第二神經胺糖酸酶抑制劑之第二臂及結合於Fc域或白蛋白之第三臂)。
可用作連接體之分子包括至少兩個官能基，該等官能基可為相同或不同的，例如兩個羧酸基、兩個胺基、兩個磺酸基、羧酸基及順丁烯二醯亞胺基、羧酸基及炔基、羧酸基及胺基、羧酸基及磺酸基、胺基及順丁烯二醯亞胺基、胺基及炔基或胺基及磺酸基。第一官能基可與該結合物中之第一組分形成共價連接且第二官能基可與該結合物中之第二組分形成共價連接。在三價連接體之一些實施例中，連接體之兩個臂可含有兩種二羧酸，其中第一羧酸可與該結合物中之第一神經胺糖酸酶抑制劑形成共價連接且第二羧酸可與該結合物中之第二神經胺糖酸酶抑制劑形成共價連接且該連接體之第三臂可與該結合物中之Fc域或白蛋白形成共價連接。二羧酸之實例進一步描述於本文中。在一些實施例中，含有一或多個順丁烯二醯亞胺基之分子可用作連接體，其中該順丁烯二醯亞胺基可與該結合物中之組分(例如，Fc域或白蛋白)的半胱胺酸形成碳-硫連接。在一些實施例中，含有一或多個炔基之分子可用作連接體，其中該炔基可與該結合物中之組分(例如，Fc域或白蛋白)的疊氮化物形成1,2,3-三唑連接。在一些實施例中，含有一或多個疊氮基之分子可用作連接體，其中該疊氮基可與該結合物中之組分(例如，Fc域或白蛋白)的炔形成1,2,3-三唑連接。在一些實施例中，含有一或多個雙碸基之分子可用作連接體，其中該雙碸基可與該結合物中之組分(例如，Fc域或白蛋白)的胺基形成連接。在一些實施例中，含有一或多個磺酸基之分子可用作連接體，其中該磺酸基可與該結合物中之組分形成磺醯胺連接。在一些實施例中，含有一或多個異氰酸酯基之分子可用作連接體，其中該異氰酸酯基可與該結合物中之組分形成脲鍵聯。在一些實施例中，含有一或多個鹵烷基之分子可用作連接體，其中該鹵烷基可與該結合物中之組分形成共價連接，例如C-N及C-O連接。
在一些實施例中，連接體提供兩種或兩種以上組分之間的空間、剛性及/或柔性。在一些實施例中，連接體可為鍵，例如共價鍵。術語「鍵」係指化學鍵，例如醯胺鍵、二硫鍵、C-O鍵、C-N鍵、N-N鍵、C-S鍵或由化學反應(例如，化學結合)產生之任何種類的鍵。在一些實施例中，連接體包括不超過250個原子。在一些實施例中，連接體包括不超過250個非氫原子。在一些實施例中，連接體之骨架包括不超過250個原子。連接體之「骨架」係指連接體中之原子，其合起來形成自結合物之一部分至該結合物之另一部分之最短路徑(例如，連接第一神經胺糖酸酶抑制劑及第二神經胺糖酸酶抑制劑的最短路徑)。連接體之骨架中的原子直接地參與連接結合物之一部分至該結合物之另一部分(例如，連接第一神經胺糖酸酶抑制劑及第二神經胺糖酸酶抑制劑)。例如，附接於連接體之骨架中的碳之氫原子未被視為直接地參與連接該結合物之一部分至該結合物之另一部分。
在一些實施例中，連接體可包含源於例如合成聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)聚合物)之合成基團。在一些實施例中，連接體可包含一或多個胺基酸殘基，諸如D-或L-胺基酸殘基。在一些實施例中，連接體可為胺基酸序列(例如，1-25個胺基酸、1-10個胺基酸、1-9個胺基酸、1-8個胺基酸、1-7個胺基酸、1-6個胺基酸、1-5個胺基酸、1-4個胺基酸、1-3個胺基酸、1-2個胺基酸或1個胺基酸之序列)之殘基。在一些實施例中，連接體可包含一或多個(例如，1-100個、1-50個、1-25個、1-10個、1-5個或1-3個)視情況經取代伸烷基、視情況經取代伸雜烷基(例如，PEG單元)、視情況經取代伸烯基、視情況經取代伸雜烯基、視情況經取代伸炔基、視情況經取代伸雜炔基、視情況經取代伸環烷基、視情況經取代伸雜環烷基、視情況經取代伸環烯基、視情況經取代伸雜環烯基、視情況經取代伸環炔基、視情況經取代伸雜環炔基、視情況經取代伸芳基、視情況經取代伸雜芳基(例如，吡啶)、O、S、NRi (Ri 為H、視情況經取代烷基、視情況經取代雜烷基、視情況經取代烯基、視情況經取代雜烯基、視情況經取代炔基、視情況經取代雜炔基、視情況經取代環烷基、視情況經取代雜環烷基、視情況經取代環烯基、視情況經取代雜環烯基、視情況經取代環炔基、視情況經取代雜環炔基、視情況經取代芳基或視情況經取代雜芳基)、P、羰基、硫羰基、磺醯基、磷酸酯基、磷醯基或亞胺基。例如，連接體可包含一或多個視情況經取代C1-C20伸烷基、視情況經取代C1-C20伸雜烷基(例如，PEG單元)、視情況經取代C2-C20伸烯基(例如，C2伸烯基)、視情況經取代C2-C20伸雜烯基、視情況經取代C2-C20伸炔基、視情況經取代C2-C20伸雜炔基、視情況經取代C3-C20伸環烷基(例如，伸環丙基、伸環丁基)、視情況經取代C3-C20伸雜環烷基、視情況經取代C4-C20伸環烯基、視情況經取代C4-C20伸雜環烯基、視情況經取代C8-C20伸環炔基、視情況經取代C8-C20伸雜環炔基、視情況經取代C5-C15伸芳基(例如，C6伸芳基)、視情況經取代C2-C15伸雜芳基(例如，咪唑、吡啶)、O、S、NRi (Ri 為H、視情況經取代C1-C20烷基、視情況經取代C1-C20雜烷基、視情況經取代C2-C20烯基、視情況經取代C2-C20雜烯基、視情況經取代C2-C20炔基、視情況經取代C2-C20雜炔基、視情況經取代C3-C20環烷基、視情況經取代C3-C20雜環烷基、視情況經取代C4-C20環烯基、視情況經取代C4-C20雜環烯基、視情況經取代C8-C20環炔基、視情況經取代C8-C20雜環炔基、視情況經取代C5-C15芳基或視情況經取代C2-C15雜芳基)、P、羰基、硫羰基、磺醯基、磷酸酯基、磷醯基或亞胺基。
如本文所用，術語「烷基」、「烯基」及「炔基」包括直鏈及分支鏈單價取代基，以及其組合，當未經取代時僅含有C及H。當烷基包括至少一個碳-碳雙鍵或碳-碳三鍵時，該烷基可分別稱作「烯基」或「炔基」。烷基、烯基或炔基之單價不包括該烷基、烯基或炔基上視情況存在之取代基。例如，若烷基、烯基或炔基附接於化合物，則該烷基、烯基或炔基之單價係指其附接於該化合物且不包括可存在於該烷基、烯基或炔基上之任何額外取代基。在一些實施例中，烷基或雜烷基可含有例如1-20、1-18、1-16、1-14、1-12、1-10、1-8、1-6、1-4或1-2個碳原子(例如，C1-C20、C1-C18、C1-C16、C1-C14、C1-C12、C1-C10、C1-C8、C1-C6、C1-C4或C1-C2)。在一些實施例中，烯基、雜烯基、炔基或雜炔基可含有例如2-20、2-18、2-16、2-14、2-12、2-10、2-8、2-6或2-4個碳原子(例如，C2-C20、C2-C18、C2-C16、C2-C14、C2-C12、C2-C10、C2-C8、C2-C6或C2-C4)。實例包括但不限於甲基、乙基、異丁基、第二丁基、第三丁基、2-丙烯基及3-丁炔基。
如本文所用，術語「環烷基」表示單價飽和或不飽和非芳族環烷基。環烷基可具有例如三個至二十個碳(例如，C3-C7、C3-C8、C3-C9、C3-C10、C3-C11、C3-C12、C3-C14、C3-C16、C3-C18或C3-C20環烷基)。環烷基之實例包括但不限於環丙基、環丁基、環戊基、環己基及環庚基。當環烷基包括至少一個碳-碳雙鍵時，該環烷基可稱作「環烯基」。環烯基可具有例如四個至二十個碳(例如，C4-C7、C4-C8、C4-C9、C4-C10、C4-C11、C4-C12、C4-C14、C4-C16、C4-C18或C4-C20環烯基)。例示性環烯基包括但不限於環戊烯基、環己烯基及環庚烯基。當環烷基包括至少一個碳-碳三鍵時，該環烷基可稱作「環炔基」。環炔基可具有例如八個至二十個碳(例如，C8-C9、C8-C10、C8-C11、C8-C12、C8-C14、C8-C16、C8-C18或C8-C20環炔基)。術語「環烷基」亦包括具有橋接多環結構之環狀化合物，其中一或多個碳橋接單環之兩個不相鄰成員，例如雙環[2.2.1.]庚基及金剛烷。術語「環烷基」亦包括二環、三環及四環稠環結構，例如十氫化萘及螺環化合物。如本文所用，術語「芳基」係指就電子分佈而言在環系統中具有芳香性特徵之任何單環或稠環二環或三環系統，例如苯基、萘基或菲。在一些實施例中，環系統含有5-15個環成員原子或5-10個環成員原子。芳基可具有例如五個至十五個碳(例如，C5-C6、C5-C7、C5-C8、C5-C9、C5-C10、C5-C11、C5-C12、C5-C13、C5-C14或C5-C15芳基)。術語「雜芳基」亦指含有一或多個(例如，1-4、1-3、1、2、3或4個)選自O、S及N之雜原子之該等單環或稠合二環系統。雜芳基可具有例如兩個至十五個碳(例如，C2-C3、C2-C4、C2-C5、C2-C6、C2-C7、C2-C8、C2-C9、C2-C10、C2-C11、C2-C12、C2-C13、C2-C14或C2-C15雜芳基)。雜原子之包括允許包括欲被視為芳族之5-員環以及6-員環。因此，典型雜芳基系統包括例如吡啶基、嘧啶基、吲哚基、苯并咪唑基、苯并三唑基、異喹啉基、喹啉基、苯并噻唑基、苯并呋喃基、噻吩基、呋喃基、噻唑基、噁唑基、異噁唑基、苯并惡唑基、苯并異噁唑基及咪唑基。因為互變異構體為可能的，故諸如鄰苯二甲醯亞胺基之基團亦被視為雜芳基。在一些實施例中，芳基或雜芳基為視情況含有1-2個氮原子之5或6員芳環系統。在一些實施例中，芳基或雜芳基為視情況經取代苯基、吡啶基、吲哚基、嘧啶基、噠嗪基、苯并噻唑基、苯并咪唑基、吡唑基、咪唑基、異噁唑基、噻唑基或咪唑并吡啶基。在一些實施例中，芳基為苯基。在一些實施例中，芳基可視情況經諸如芳基取代基(例如，聯苯基)之取代基取代。
術語「烷芳基」係指連接至伸烷基、伸烯基或伸炔基之芳基。一般而言，若化合物附接於烷芳基，則該烷芳基之伸烷基、伸烯基或伸炔基部分附接於該化合物。在一些實施例中，烷芳基為C6-C35烷芳基(例如，C6-C16、C6-C14、C6-C12、C6-C10、C6-C9、C6-C8、C7或C6烷芳基)，其中碳數目指示該烷芳基之芳基部分及伸烷基、伸烯基或伸炔基部分中的碳之總數。烷芳基之實例包括但不限於(C1-C8)伸烷基(C6-C12)芳基、(C2-C8)伸烯基(C6-C12)芳基或(C2-C8)伸炔基(C6-C12)芳基。在一些實施例中，烷芳基為苯甲基或苯乙基。在雜烷芳基中，一或多個選自N、O及S之雜原子可存在於該烷芳基之伸烷基、伸烯基或伸炔基部分中及/或可存在於該烷芳基之芳基部分中。在視情況經取代烷芳基中，取代基可存在於該烷芳基之伸烷基、伸烯基或伸炔基部分上及/或可存在於該烷芳基之芳基部分上。
如本文所用，術語「胺基」表示–N(Rx )2 或–N+ (Rx )3 ，其中Rx 各自獨立地為H、烷基、烯基、炔基、芳基、烷芳基、環烷基，或兩個Rx 組合形成雜環烷基。在一些實施例中，胺基為-NH2 。
如本文所用，術語「烷胺基」係指本文所述之胺基，其附接於伸烷基(例如，C1-C5伸烷基)、伸烯基(例如，C2-C5伸烯基)或伸炔基(例如，C2-C5伸烯基)。一般而言，若化合物附接於烷胺基，則該烷胺基之伸烷基、伸烯基或伸炔基部分附接於該化合物。烷胺基之胺基部分係指–N(Rx )2 或–N+ (Rx )3 ，其中Rx 各自獨立地為H、烷基、烯基、炔基、芳基、烷芳基、環烷基，或兩個Rx 組合形成雜環烷基。在一些實施例中，烷胺基之胺基部分為-NH2 。烷胺基之實例為C1-C5烷胺基，例如C2烷胺基(例如，CH2 CH2 NH2 或CH2 CH2 N(CH3 )2 )。在雜烷胺基中，一或多個(例如，1-4、1-3、1、2、3或4個)選自N、O及S之雜原子可存在於該雜烷胺基之伸烷基、伸烯基或伸炔基部分中。在一些實施例中，烷胺基可視情況經取代。在經取代烷胺基中，取代基可存在於該烷胺基之伸烷基、伸烯基或伸炔基部分上及/或可存在於該烷胺基之胺基部分上。
如本文所用，術語「烷醯胺」係指如下醯胺基，其附接於伸烷基(例如，C1-C5伸烷基)、伸烯基(例如，C2-C5伸烯基)或伸炔基(例如，C2-C5伸烯基)。一般而言，若化合物附接於烷醯胺基，則該烷醯胺之伸烷基、伸烯基或伸炔基部分附接於該化合物。烷醯胺之醯胺部分係指–C(O)-N(Rx )2 ，其中Rx 各自獨立地為H、烷基、烯基、炔基、芳基、烷芳基、環烷基，或兩個Rx 組合形成雜環烷基。在一些實施例中，烷醯胺之醯胺部分為-C(O)NH2 。烷醯胺基可為-(CH2 )2 -C(O)NH2 或-CH2 -C(O)NH2 。在雜烷醯胺基中，一或多個(例如，1-4、1-3、1、2、3或4個)選自N、O及S之雜原子可存在於該雜烷醯胺基之伸烷基、伸烯基或伸炔基部分中。在一些實施例中，烷醯胺基可視情況經取代。在經取代烷醯胺基中，取代基可存在於該烷醯胺基之伸烷基、伸烯基或伸炔基部分上及/或可存在於該烷醯胺基之醯胺部分上。
如本文所用，術語「伸烷基」、「伸烯基」及「伸炔基」係指具有規定大小之二價基團。在一些實施例中，伸烷基可含有例如1-20、1-18、1-16、1-14、1-12、1-10、1-8、1-6、1-4或1-2個碳原子(例如，C1-C20、C1-C18、C1-C16、C1-C14、C1-C12、C1-C10、C1-C8、C1-C6、C1-C4或C1-C2)。在一些實施例中，伸烯基或伸炔基可含有例如2-20、2-18、2-16、2-14、2-12、2-10、2-8、2-6或2-4個碳原子(例如，C2-C20、C2-C18、C2-C16、C2-C14、C2-C12、C2-C10、C2-C8、C2-C6或C2-C4)。伸烷基、伸烯基及/或伸炔基包括直鏈及分支鏈形式，以及其組合。伸烷基、伸烯基或伸炔基之二價不包括該伸烷基、伸烯基或伸炔基上視情況存在之取代基。例如，兩種神經胺糖酸酶抑制劑可藉助於包括伸烷基、伸烯基及/或伸炔基或其組合之連接體彼此附接。該連接體中之伸烷基、伸烯基及/或伸炔基中每一者關於伸烷基、伸烯基及/或伸炔基之任一末端上的兩個附接被視為二價。例如，若連接體包括-(視情況經取代伸烷基)-(視情況經取代伸烯基)-(視情況經取代伸烷基)-，則該伸烯基關於其與該連接體之末端處的兩個伸烷基之附接被視為二價。伸烯基上之視情況存在之取代基未包括於該伸烯基之二價中。伸烷基、伸烯基或伸炔基(例如，連接體中之伸烷基、伸烯基或伸炔基)之二價性質係指該基團的兩個末端且不包括可存在於伸烷基、伸烯基或伸炔基中之視情況存在之取代基。因為其為二價，故其可使結合物之多個(例如，兩個)部分(例如，第一神經胺糖酸酶抑制劑及第二神經胺糖酸酶抑制劑)連接在一起。伸烷基、伸烯基及/或伸炔基可由典型地適用作如本文所陳述之烷基、烯基及炔基之取代基的基團取代。例如，C=O係由側氧基(=O)取代之C1伸烷基。例如，-HCR-C≡C-可被視為視情況經取代伸炔基且被視為二價基團，即使其具有視情況存在之取代基R。伸雜烷基、伸雜烯基及/或伸雜炔基係指包括一或多個(例如，1-4、1-3、1、2、3或4個)雜原子(例如，N、O及S)之伸烷基、伸烯基及/或伸炔基。例如，聚乙二醇(PEG)聚合物或PEG聚合物中之PEG單元-(CH2 )2 -O-被視為含有一或多個氧原子之伸雜烷基。
如本文所用，「組合療法」或「組合投與」意指本文所述之結合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D'-I)、(M-I)-(M-XI)或(M'-I)中任一者之結合物)及一種(或多種)不同劑或治療作為病毒感染之既定治療方案之一部分投與個體。治療方案規定了每種劑之劑量及投與週期，以使單獨劑對個體之作用疊加。在一些實施例中，結合物及一或多種劑之遞送係同時或同步的，並且結合物及一或多種劑可共同調配。在一些實施例中，結合物及一或多種劑並非共同調配，並且作為規定方案之一部分以順序方式投與。在一些實施例中，結合物及一或多種劑或治療之組合投與使得症狀或與病毒感染有關之其他參數之減少大於一種劑或治療在單獨或在沒有另一種劑或治療的情況下遞送時所觀察到之減少。結合物及一或多種劑之作用可以係部分累加的、完全累加的或大於累加的(例如，協同作用)。可以藉由任何適當之途徑(包括但不限於經口途徑、靜脈內途徑、肌內途徑以及藉由黏膜組織之直接吸收)依次或基本上同時投與每種治療劑。可以藉由相同途徑或不同途徑來投與治療劑。例如，本文所述之結合物可以藉由靜脈內注射投與，而該組合之第二治療劑可以經口投與。
如本文所用，術語「伸環烷基」係指使化合物之兩個部分連接在一起之二價環狀基團。例如，伸環烷基內之一個碳可連接至該化合物之一部分，而該伸環烷基內之另一碳可連接至該化合物之另一部分。伸環烷基可包括飽和或不飽和非芳族環狀基團。伸環烷基可在該伸環烷基之環狀部分中具有例如三個至二十個碳(例如，C3-C7、C3-C8、C3-C9、C3-C10、C3-C11、C3-C12、C3-C14、C3-C16、C3-C18或C3-C20伸環烷基)。當伸環烷基包括至少一個碳-碳雙鍵時，該伸環烷基可稱作「伸環烯基」。伸環烯基可在該伸環烯基之環狀部分中具有例如四個至二十個碳(例如，C4-C7、C4-C8、C4-C9、C4-C10、C4-C11、C4-C12、C4-C14、C4-C16、C4-C18或C4-C20伸環烯基)。當伸環烷基包括至少一個碳-碳三鍵時，該伸環烷基可稱作「伸環炔基」。伸環炔基可在該伸環炔基之環狀部分中具有例如四個至二十個碳(例如，C4-C7、C4-C8、C4-C9、C4-C10、C4-C11、C4-C12、C4-C14、C4-C16、C4-C18或C8-C20伸環炔基)。伸環烷基可由典型地適用作如本文所陳述之烷基、烯基及炔基之取代基的基團取代。伸雜環烷基係指包括一或多個(例如，1-4、1-3、1、2、3或4個)雜原子(例如，N、O及S)之伸環烷基。伸環烷基之實例包括但不限於伸環丙基及伸環丁基。四氫呋喃可被視為伸雜環烷基。
如本文所用，術語「伸芳基」係指使化合物之多個(例如，兩個或三個)部分連接在一起之多價(例如，二價或三價)芳基。例如，伸芳基內之一個碳可連接至該化合物之一部分，而該伸芳基內之另一碳可連接至該化合物之另一部分。伸芳基可在該伸芳基之芳基部分中具有例如五個至十五個碳(例如，C5-C6、C5-C7、C5-C8、C5-C9、C5-C10、C5-C11、C5-C12、C5-C13、C5-C14或C5-C15伸芳基)。伸芳基可由典型地適用作如本文所陳述之烷基、烯基及炔基之取代基的基團取代。伸雜芳基係指包括一或多個(例如，1-4、1-3、1、2、3或4個)雜原子(例如，N、O及S)之芳族基團。伸雜芳基可具有例如兩個至十五個碳(例如，C2-C3、C2-C4、C2-C5、C2-C6、C2-C7、C2-C8、C2-C9、C2-C10、C2-C11、C2-C12、C2-C13、C2-C14或C2-C15伸雜芳基)。
如本文所用，術語「視情況經取代」係指具有0、1或多個取代基，諸如0-25、0-20、0-10或0-5個取代基。取代基包括但不限於烷基、烯基、炔基、芳基、烷芳基、醯基、雜芳基、雜烷基、雜烯基、雜炔基、雜烷芳基、鹵素、側氧基、氰基、硝基、胺基、烷胺基、羥基、烷氧基、烷醯基、羰基、胺甲醯基、胍基、脲基、脒基、上述基團或部分中任一者及上述基團或部分中任一者之雜形式。取代基包括但不限於F、Cl、甲基、苯基、苯甲基、OR、NR2 、SR、SOR、SO2 R、OCOR、NRCOR、NRCONR2 、NRCOOR、OCONR2 、RCO、COOR、烷基-OOCR、SO3 R、CONR2 、SO2 NR2 、NRSO2 NR2 、CN、CF3 、OCF3 、SiR3 及NO2 ，其中R各自獨立地為H、烷基、烯基、芳基、雜烷基、雜烯基或雜芳基，且其中同一或相鄰原子上之兩個視情況存在之取代基可接合以形成含有3–8個成員的稠合、視情況經取代芳族或非芳族、飽和或不飽和環，或同一原子上之兩個視情況存在之取代基可接合以形成含有3–8個成員的視情況經取代芳族或非芳族、飽和或不飽和環。
視情況經取代基團或部分係指其中一個原子(例如，氫原子)視情況經另一取代基置換之基團或部分(例如，上述基團或部分中任一者)。例如，視情況經取代烷基可為視情況經取代甲基，其中該甲基之氫原子由例如OH置換。作為另一實例，雜烷基或其二價配對物伸雜烷基上之取代基可置換碳上之氫或諸如N之雜原子上的氫。例如，基團-R-NH-R-中之氫原子可經烷醯胺取代基取代，例如-R-N[(CH2 C(O)N(CH3 )2 ]-R。
一般而言，視情況存在之取代基為非干擾取代基。「非干擾取代基」係指如下取代基，其保留本文所述之結合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者之結合物)結合於病毒神經胺糖酸酶或抑制流感病毒的增殖之能力。因此，在一些實施例中，該取代基可改變該活性之程度。然而，只要該結合物保留結合於病毒神經胺糖酸酶或抑制病毒增殖之能力，該取代基就將歸類為「非干擾」。例如，非干擾取代基將保留該化合物基於病毒斑塊減少分析中10 μM或更低之IC50值(諸如在實例2中基於小於500 nM之針對流感病毒神經胺糖酸酶的IC50值)提供抗病毒功效之能力。因此，基於斑塊減少或流感病毒神經胺糖酸酶抑制，該取代基可改變抑制之程度。然而，只要本文中之該等化合物(諸如式(A-I)、(A-II)、(A-III)、(A-IV)、(A-V)、(A-VI)、(A-VII)、(A-VIII)、(A-IX)、(A-X)、(A-XI)、(A-XII)及(A-XIII)化合物)保留抑制流感病毒神經胺糖酸酶活性之能力，該取代基就將歸類為「非干擾」。用於測定病毒斑塊減少或任何化合物抑制流感病毒神經胺糖酸酶之能力之多種分析在此項技術中可獲得且一些例示於下文實例中。
術語「雜」在用於描述化學基團或部分時係指具有至少一個非碳或氫之雜原子，例如N、O及S。若上述基團或部分中任一者均含有至少一個雜原子，則其可稱為雜。例如，雜環烷基、雜環烯基或雜環炔基係指具有一或多個獨立地選自例如N、O及S之雜原子之環烷基、環烯基或環炔基。雜環烯基之實例為順丁烯二醯亞胺基。例如，雜芳基係指具有一或多個獨立地選自例如N、O及S之雜原子之芳族基團。一或多個雜原子亦可包括於置換如本文所述之基團或部分中的氫原子之取代基中。例如，在視情況經取代雜芳基中，若該雜芳基中之一個氫原子經取代基(例如，甲基)置換，則該取代基亦可含有一或多個雜原子(例如，甲醇)。
如本文所用，術語「醯基」係指具有如下結構之基團：
Figure 02_image1055
，其中Rz 為視情況經取代烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、烷芳基、烷胺基、雜烷基、雜烯基、雜炔基、雜環烷基、雜環烯基、雜環炔基、雜芳基、雜烷芳基或雜烷胺基。
如本文所用，術語「鹵基」或「鹵素」係指任何鹵素原子，例如F、Cl、Br或I。若本文所述之基團或部分中任一者均含有至少一個鹵素原子，則其可稱為「鹵基部分」，諸如鹵烷基。
如本文所用，術語「羥基」表示-OH基團。
如本文所用，術語「側氧基」係指具有結構=O之取代基，其中在原子與氧原子之間存在雙鍵。
如本文所用，術語「羰基」係指具有如下結構之基團：
Figure 02_image1057
。
如本文所用，術語「硫羰基」係指具有如下結構之基團：
Figure 02_image1059
如本文所用，術語「磷酸酯基」表示具有如下結構之基團：
Figure 02_image1061
。
如本文所用，術語「磷醯基」表示具有如下結構之基團：
Figure 02_image1063
或
Figure 02_image1065
。
如本文所用，術語「磺醯基」表示具有如下結構之基團：
Figure 02_image1067
。
如本文所用，術語「亞胺基」表示具有如下結構之基團：
Figure 02_image1069
，其中R為視情況存在之取代基。
如本文所用，術語「N -保護基」表示在合成程序期間意欲保護胺基以抵禦非所需反應之彼等基團。通常使用之N -保護基揭示於Greene, 「Protective Groups in Organic Synthesis,」第5版(John Wiley & Sons, New York, 2014)中，其以引用之方式併入本文中。N -保護基包括例如醯基、芳醯基及胺甲醯基，諸如甲醯基、乙醯基、丙醯基、特戊醯基、第三丁基乙醯基、2-氯乙醯基、2-溴乙醯基、三氟乙醯基、三氯乙醯基、鄰苯二甲醯基、鄰硝基苯氧基乙醯氯、α-氯丁醯基、苯甲醯基、羧基苯甲基(CBz)、4-氯苯甲醯基、4-溴苯甲醯基、4-硝基苯甲醯基，及對掌性助劑，諸如經保護或未經保護D、L或D, L-胺基酸殘基，諸如丙胺酸、白胺酸、苯丙胺酸；含磺醯基之基團，諸如苯磺醯基及對甲苯磺醯基；胺基甲酸酯形成基團，諸如苯甲氧基羰基、對-氯苯甲氧基羰基、對-甲氧基苯甲氧基羰基、對硝基苯甲氧基羰基、2-硝基苯甲氧基羰基、對-溴苯甲氧基羰基、3,4-二甲氧基苯甲氧基羰基、3,5-二甲氧基苯甲氧基羰基、2,4-二甲氧基苯甲氧基羰基、4-甲氧基苯甲氧基羰基、2-硝基-4,5-二甲氧基苯甲氧基羰基、3,4,5-三甲氧基苯甲氧基羰基、1-(對-聯苯基)-1-甲基乙氧基羰基、α,α-二甲基-3,5-二甲氧基苯甲氧基羰基、二苯甲基氧基羰基、第三丁基氧基羰基(BOC)、二異丙基甲氧基羰基、異丙氧基羰基、乙氧基羰基、甲氧基羰基、烯丙氧基羰基、2,2,2,-三氯乙氧基羰基、苯氧基羰基、4-硝基苯氧基羰基、茀基-9-甲氧基羰基(Fmoc)、環戊基氧基羰基、金剛烷基氧基羰基、環己基氧基羰基及苯基硫羰基；烷芳基，諸如苯甲基、三苯基甲基及苯甲氧基甲基；及矽烷基，諸如三甲基矽烷基。
如本文所用，術語「胺基酸」意謂天然存在之胺基酸及非天然存在之胺基酸。
如本文所用，術語「天然存在之胺基酸」意謂包括Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr及Val之胺基酸。
如本文所用，術語「非天然存在之胺基酸」意謂未天然產生或發現於哺乳動物中之α胺基酸。非天然存在之胺基酸之實例包括D-胺基酸；具有附接於半胱胺酸之硫原子的乙醯基胺基甲基之胺基酸；聚乙二醇化胺基酸；式NH2 (CH2 )n COOH之ω胺基酸，其中n為2-6，中性非極性胺基酸，諸如肌胺酸、第三丁基丙胺酸、第三丁基甘胺酸、N-甲基異白胺酸及正白胺酸；氧基甲硫胺酸；苯基甘胺酸；瓜胺酸；甲硫胺酸亞碸；磺基丙胺酸；鳥胺酸；二胺基丁酸；3-胺基丙胺酸；3-羥基-D-脯胺酸；2,4-二胺基丁酸；2-胺基戊酸；2-胺基辛酸、2-羧基哌嗪；哌嗪-2-甲酸、2-胺基-4苯基丁酸；3-(2-萘基)丙胺酸，及羥基脯胺酸。其他胺基酸為α-胺基丁酸、α-胺基-α-甲基丁酸酯、胺基環丙烷-羧酸酯、胺基異丁酸、胺基降冰片基-羧酸酯、L-環己基丙胺酸、環戊基丙胺酸、L-N-甲基白胺酸、L-N-甲基甲硫胺酸、L-N-甲基正纈胺酸、L-N-甲基苯基丙胺酸、L-N-甲基脯胺酸、L-N-甲基絲胺酸、L-N-甲基色胺酸、D-鳥胺酸、L-N-甲基乙基甘胺酸、L-正白胺酸、α-甲基-胺基異丁酸酯、α-甲基環己基丙胺酸、D-α-甲基丙胺酸、D-α-甲基精胺酸、D-α-甲基天冬醯胺、D-α-甲基天冬胺酸、D-α-甲基半胱胺酸、D-α-甲基麩醯胺、D-α-甲基組胺酸、D-α-甲基異白胺酸、D-α-甲基白胺酸、D-α-甲基離胺酸、D-α-甲基甲硫胺酸、D-α-甲基鳥胺酸、D-α-甲基苯丙胺酸、D-α-甲基脯胺酸、D-α-甲基絲胺酸、D-N-甲基絲胺酸、D-α-甲基酥胺酸、D-α-甲基色胺酸、D-α-甲基酪胺酸、D-α-甲基纈胺酸、D-N-甲基丙胺酸、D-N-甲基精胺酸、D-N-甲基天冬醯胺、D-N-甲基天冬胺酸、D-N-甲基半胱胺酸、D-N-甲基麩醯胺、D-N-甲基麩胺酸鹽、D-N-甲基組胺酸、D-N-甲基異白胺酸、D-N-甲基白胺酸、D-N-甲基離胺酸、N-甲基環己基丙胺酸、D-N-甲基鳥胺酸、N-甲基甘胺酸、N-甲基胺基異丁酸鹽、N-(1-甲基丙基)甘胺酸、N-(2-甲基丙基)甘胺酸、D-N-甲基色胺酸、D-N-甲基酪胺酸、D-N-甲基纈胺酸、γ-胺基丁酸、L-第三丁基甘胺酸、L-乙基甘胺酸、L-高苯丙胺酸、L-α-甲基精胺酸、L-α-甲基天冬胺酸、L-α-甲基半胱胺酸、L-α-甲基麩醯胺、L-α-甲基組胺酸、L-α-甲基異白胺酸、L-α-甲基白胺酸、L-α-甲基甲硫胺酸、L-α-甲基正纈胺酸、L-α-甲基苯丙胺酸、L-α-甲基絲胺酸、L-α-甲基色胺酸、L-α-甲基纈胺酸、N-(N-(2,2-二苯基乙基)胺甲醯基甲基甘胺酸、1-羧基-1-(2,2-二苯基-乙基胺基)環丙烷、4-羥基脯胺酸、鳥胺酸、2-胺基苯甲醯基(鄰胺基苯甲醯基)、D-環己基丙胺酸、4-苯基-苯丙胺酸、L-瓜胺酸、α-環己基甘胺酸、L-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲酸、L-噻唑啶-4-甲酸、L-高酪胺酸、L-2-呋喃基丙胺酸、L-組胺酸(3-甲基)、N-(3-胍基丙基)甘胺酸、O-甲基-L-酪胺酸、O-聚醣-絲胺酸、間-酪胺酸、正-酪胺酸、L-N,N′,N″-三甲基離胺酸、高離胺酸、正離胺酸、N-聚醣天冬醯胺、7-羥基-1,2,3,4-四氫-4-氟苯丙胺酸、4-甲基苯丙胺酸、雙-(2-吡啶甲基)胺、五氟苯丙胺酸、吲哚啉-2-甲酸、2-胺基苯甲酸、3-胺基-2-萘甲酸、不對稱二甲基精胺酸、L-四氫異喹啉-1-甲酸、D-四氫異喹啉-1-甲酸、1-胺基-環己烷乙酸、D/L-烯丙基甘胺酸、4-胺基苯甲酸、1-胺基-環丁烷甲酸、2或3或4-胺基環己烷甲酸、1-胺基-1-環戊烷甲酸、1-胺基茚滿-1-甲酸、4-胺基-吡咯啶-2-甲酸、2-胺基萘滿-2-甲酸、氮雜環丁烷-3-甲酸、4-苯甲基-吡咯啶-2-甲酸、第三丁基甘胺酸、b-(苯并噻唑基-2-基)-丙胺酸、b-環丙基丙胺酸、5,5-二甲基-1,3-噻唑啶-4-甲酸、(2R,4S)4-羥基哌啶-2-甲酸、(2S,4S)及(2S,4R)-4-(2-萘基甲氧基)-吡咯啶-2-甲酸、(2S,4S)及(2S,4R)4-苯氧基-吡咯啶-2-甲酸、(2R,5S)及(2S,5R)-5-苯基-吡咯啶-2-甲酸、(2S,4S)-4-胺基-1-苯甲醯基-吡咯啶-2-甲酸、第三丁基丙胺酸、(2S,5R)-5-苯基-吡咯啶-2-甲酸、1-胺基甲基-環己烷-乙酸、3,5-雙-(2-胺基)乙氧基-苯甲酸、3,5-二胺基-苯甲酸、2-甲基胺基-苯甲酸、N-甲基鄰胺基苯甲酸、L-N-甲基丙胺酸、L-N-甲基精胺酸、L-N-甲基天冬醯胺、L-N-甲基天冬胺酸、L-N-甲基半胱胺酸、L-N-甲基麩醯胺、L-N-甲基麩胺酸、L-N-甲基組胺酸、L-N-甲基異白胺酸、L-N-甲基離胺酸、L-N-甲基正白胺酸、L-N-甲基鳥胺酸、L-N-甲基酥胺酸、L-N-甲基酪胺酸、L-N-甲基纈胺酸、L-N-甲基-第三丁基甘胺酸、L-正纈胺酸、α-甲基-γ-胺基丁酸鹽、4,4′-二苯基丙胺酸、α-甲基環戊基丙胺酸、α-甲基-α-萘基丙胺酸、α-甲基青黴胺、N-(4-胺基丁基)甘胺酸、N-(2-胺基乙基)甘胺酸、N-(3-胺基丙基)甘胺酸、N-胺基-α-甲基丁酸鹽、α-萘基丙胺酸、N-苯甲基甘胺酸、N-(2-胺甲醯基乙基)甘胺酸、N-(胺甲醯基甲基)甘胺酸、N-(2-羧基乙基)甘胺酸、N-(羧基甲基)甘胺酸、N-環丁基甘胺酸、N-環癸基甘胺酸、N-環庚基甘胺酸、N-環己基甘胺酸、N-環癸基甘胺酸、N-環十二烷基甘胺酸、N-環辛基甘胺酸、N-環丙基甘胺酸、N-環十一烷基甘胺酸、N-(2,2-二苯基乙基)甘胺酸、N-(3,3-二苯基丙基)甘胺酸、N-(3-胍基丙基)甘胺酸、N-(1-羥基乙基)甘胺酸、N-(羥基乙基))甘胺酸、N-(咪唑基乙基))甘胺酸、N-(3-吲哚基乙基)甘胺酸、N-甲基-γ-胺基丁酸鹽、D-N-甲基甲硫胺酸、N-甲基環戊基丙胺酸、D-N-甲基苯丙胺酸、D-N-甲基脯胺酸、D-N-甲基酥胺酸、N-(1-甲基乙基)甘胺酸、N-甲基-萘基丙胺酸、N-甲基青黴胺、N-(p-羥基苯基)甘胺酸、N-(硫甲基)甘胺酸、青黴胺、L-α-甲基丙胺酸、L-α-甲基天冬醯胺、L-α-甲基-第三丁基甘胺酸、L-甲基乙基甘胺酸、L-α-甲基麩胺酸鹽、L-α-甲基高苯丙胺酸、N-(2-甲基硫乙基)甘胺酸、L-α-甲基離胺酸、L-α-甲基正白胺酸、L-α-甲基鳥胺酸、L-α-甲基脯胺酸、L-α-甲基酥胺酸、L-α-甲基酪胺酸、L-N-甲基-高苯丙胺酸、N-(N-(3,3-二苯基丙基)胺甲醯基甲基甘胺酸、L-焦麩胺酸、D-焦麩胺酸、O-甲基-L-絲胺酸、O-甲基-L-高絲胺酸、5-羥基離胺酸、α-羧基麩胺酸鹽、苯基甘胺酸、L-哌可酸(高脯胺酸)、L-高白胺酸、L-離胺酸(二甲基)、L-2-萘基丙胺酸、L-二甲基多巴或L-二甲氧基-苯丙胺酸、L-3-吡啶基丙胺酸、L-組胺酸(苯甲醯基氧基甲基)、N-環庚基甘胺酸、L-二苯丙胺酸、O-甲基-L-高酪胺酸、L-β-高離胺酸、O-聚醣-酥胺酸、鄰-酪胺酸、L-N,N′-二甲基離胺酸、L-高精胺酸、新色胺酸、3-苯并噻吩基丙胺酸、異喹啉-3-甲酸、二胺基丙酸、高半胱胺酸、3,4-二甲氧基苯丙胺酸、4-氯苯丙胺酸、L-1,2,3,4-四氫去甲哈爾滿-3-甲酸、金剛烷基丙胺酸、對稱二甲基精胺酸、3-羧基硫代嗎啉、D-1,2,3,4-四氫去甲哈爾滿-3-甲酸、3-胺基苯甲酸、3-胺基-1-羧基甲基-吡啶-2-酮、1-胺基-1-環己烷甲酸、2-胺基環戊烷甲酸、1-胺基-1-環丙烷甲酸、2-胺基茚滿-2-甲酸、4-胺基-四氫噻喃-4-甲酸、氮雜環丁烷-2-甲酸、b-(苯并噻唑-2-基)-丙胺酸、新戊基甘胺酸、2-羧基甲基哌啶、b-環丁基丙胺酸、烯丙基甘胺酸、二胺基丙酸、高-環己基丙胺酸、(2S,4R)- 4-羥基哌啶-2-甲酸、八氫吲哚-2-甲酸、(2S,4R)及(2S,4R)-4-(2-萘基)、吡咯啶-2-甲酸、哌啶甲酸、(2S,4R)及(2S,4S)-4-(4-苯基苯甲基)吡咯啶-2-甲酸、(3S)-1-吡咯啶-3-甲酸、(2S,4S)-4-三苯甲基巰基-吡咯啶-2-甲酸、(2S,4S)-4-巰基脯胺酸、第三丁基甘胺酸、N,N-雙(3-胺基丙基)甘胺酸、1-胺基-環己烷-1-甲酸、N-巰基乙基甘胺酸及硒並半胱胺酸。在一些實施例中，胺基酸殘基可為帶電的或極性。帶電胺基酸包括丙胺酸、離胺酸、天冬胺酸或麩胺酸，或其非天然存在之類似物。極性胺基酸包括麩醯胺、天冬醯胺、組胺酸、絲胺酸、酥胺酸、酪胺酸、甲硫胺酸或色胺酸，或其非天然存在之類似物。特定言之，預期在一些實施例中，胺基酸中之末端胺基可為醯胺基或胺基甲酸酯基。
如本文所用，術語「百分比(%)一致性」係指候選序列(例如，Fc-IgG或其片段)中之胺基酸殘基的百分率，該等胺基酸殘基在比對該等序列且必要時引入間隙以實現最大百分比一致性之後與參考序列之胺基酸殘基一致(亦即，可在該等候選及參考序列中之一或兩者中引入間隙以進行最佳比對且出於比較目的可忽略非同源序列)。用於達成測定百分比一致性之目的的比對可以在此項技術之技能內的多種方式實現，例如使用公開可得之電腦軟體，諸如BLAST、ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可確定用於量測比對之適當參數，包括在所比較之序列的全長內實現最大比對所需之任何算法。在一些實施例中，既定候選序列相對、與或針對既定參考序列之百分比胺基酸序列一致性(其或者可表述為具有或包括相對、與或針對既定參考序列之某一百分比胺基酸序列一致性的既定候選序列)計算如下： 100 × (A/B之分數) 其中A係在候選序列與參考序列之比對中經評分為一致之胺基酸殘基的數目，且其中B係參考序列中之胺基酸殘基的總數。在其中候選序列之長度不等於參考序列之長度的一些實施例中，候選序列與參考序列之百分比胺基酸序列一致性將不等於參考序列與候選序列之百分比胺基酸序列一致性。
當如上文所述針對最大對應進行比對時，若兩個聚核苷酸或多肽序列中之核苷酸或胺基酸的序列相同，則該兩個序列被稱為「一致」。兩個序列之間的比較典型地藉由在比較窗中比較該等序列來執行以鑑別且比較具有序列相似性之局部區。如本文所用，「比較窗」係指至少約15個鄰近位置、約20個鄰近位置、約25個鄰近位置或更多(例如，約30個至約75個鄰近位置或約40個至約50個鄰近位置)之區段，其中在序列及相同數目之鄰近位置的參考序列經最佳比對之後，該兩個序列可進行比較。
如本文所用，術語「治療(treating)」或「以治療(to treat)」係指個體之病毒感染(例如病毒感染，諸如流感感染)之治療性治療。在一些實施例中，治療性治療可減慢病毒感染之進展、改良個體之結果及/或消除該感染。在一些實施例中，個體之病毒感染之治療性治療可緩解或改善與該病毒感染相關的一或多種症狀或病狀，削弱病毒程度，穩定化病毒感染之狀態，預防病毒感染之擴散，及/或延遲或減慢病毒感染之進展，如與該治療性治療不存在下該病毒感染之狀態及/或病狀相比。
如本文所用，術語「T之平均值」係指結合於結合物群體內之Fc域或白蛋白的神經胺糖酸酶抑制劑單體或神經胺糖酸酶抑制劑二聚體之平均數。在一些實施例中，在結合物群體內，結合於Fc域單體之神經胺糖酸酶抑制劑單體或神經胺糖酸酶抑制劑二聚體之平均數可為1至20 (例如，T之平均值為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5)。在一些實施例中，T之平均值為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。
如本文所用，術語「個體」可為人類、非人類靈長類動物或其他哺乳動物，諸如但不限於犬、貓、馬、牛、豬、火雞、山羊、魚、猴、雞、大鼠、小鼠及綿羊。
如本文所用，術語「治療有效量」係指有效誘導個體之所需效應或治療具有本文所述之病狀或病症(例如病毒感染，諸如流感感染)的個體之量，例如醫藥劑量。本文中亦應瞭解，「治療有效量」可解釋為給出所需治療及/或預防效應之量，以一或多個劑量或以任何劑量或途徑服用，及/或單獨或與其他治療劑(例如，本文素數之抗病毒劑)組合服用。例如，在投與用於治療病毒感染之本文所述之結合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者之結合物)的情況下，結合物之治療有效量為例如以下量，如與不投與該結合物時獲得的反應相比，該量足以預防、減慢或逆轉病毒感染之進展。
如本文所用，術語「醫藥組合物」係指含有至少一種活性成分(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者之結合物)以及一或多種賦形劑及稀釋劑以使該活性成分能夠適用於投與方法之藥用或醫藥調配物。本發明之醫藥組合物包括可與本文所述之結合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者之結合物)相容的醫藥學上可接受之組分。
如本文所用，術語「醫藥學上可接受之載劑」係指醫藥組合物中之賦形劑或稀釋劑。例如，醫藥學上可接受之載劑可為能夠懸浮或溶解活性結合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)或(M-I)-(M-VI)中任一者之結合物)的媒劑。醫藥學上可接受之載劑必須可與該調配物之其他成分相容且對接受者無害。在本發明中，醫藥學上可接受之載劑必須向本文所述之結合物提供適當醫藥穩定性。載劑之性質隨投與模式變化。例如，關於經口投與，固體載劑為較佳的；關於靜脈內投與，一般使用水溶液載劑(例如，WFI及/或緩衝溶液)。
如本文所用，術語「醫藥學上可接受之鹽」表示本文所述之結合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者之結合物)的鹽，其在合理醫學判斷之範圍內適用於本文所述之方法而無不當毒性、刺激及/或過敏性反應。醫藥學上可接受之鹽為此項技術中熟知的。例如，醫藥學上可接受之鹽描述於：Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use (P.H. Stahl及C.G. Wermuth編), Wiley-VCH, 2008中。該等鹽可在本文所述之結合物的最終分離及純化期間當場製備，或藉由使遊離鹼基與合適有機酸反應而單獨製備。
術語「藥物:抗體比率」或「DAR」係指結合於本文所述之抗體、Fc域或白蛋白之小分子藥物部分的平均數(例如，小分子藥物單體或二聚體之平均數)。在本文所述之一些實施例中，DAR係由「T」表示(例如，在式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中)。如本文所用，結合於Fc域、抗體或白蛋白之各單體部分(例如，各紮那米韋或帕拉米韋單體)或各二聚體部分(例如，各紮那米韋或帕拉米韋二聚體)對應於DAR值1.0 (例如，「T」值為1.0)。例如，結合於4個紮那米韋單體之Fc域將具有DAR 4.0 (例如，「T」為4.0)。結合於4個紮那米韋二聚體(例如，總計8個紮那米韋分子)之Fc域亦將具有DAR 4.0 (例如，「T」為4.0)。DAR亦可經計算為分子群體(諸如Fc域、抗體或白蛋白之群體)之平均DAR。DAR值可影響藥物之功效、效能、藥物動力學或毒性。
如本文所用，術語「繼發性感染」係指在個體中在該個體中之另一種(稱為原發性)感染期間或之後(例如，在原發性流感感染期間或之後)發生之感染。繼發性感染可能係由原發性感染引起的，亦可能係由原發性感染之治療引起的。在一些情況下，原發性感染會改變免疫系統，使個體更容易受到繼發性感染。在一些情況下，對原發性感染之治療使個體更易於受到繼發性感染。例如，流感病毒已經與繼發性感染有關(例如，發生繼發性感染之風險增加)，例如細菌繼發性感染，例如呼吸道之細菌繼發性感染。與流感病毒感染相關之繼發性感染會增加流感之發病率及死亡率。繼發性感染包括合併感染。術語「繼發性感染」及「合併感染」在本文可互換使用。
如本文所用，術語「約」指示多達±5%之偏差。例如，約10%係指9.5%至10.5%。
以值之範圍提供之任何值均包括上限及下限，及含於該等上限及下限內之任何值。
如本文所用，術語「(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)」表示式(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(D-I)、(D-II)、(D-II-1)、(D-II-2)、(D-II-3)、(D-II-4)、(D-II-5)、(D-II-6)、(D-II-7)、(D-II-8)、(D-II-9)、(D-II-10)、(D-III)、(D-III-1)、(D-III-2)、(D-III-3)、(D-III-4)、(D-III-5)、(D-III-6)、(D-III-7)、(D-III-8)、(D-III-9)、(D-IV)、(D-IV-1)、(D-IV-2)、(D-V)、(D-V-1)、(D-V-2)、(D-V-3)、(D-V-4)、(D-V-5)、(D-V-6)、(D-V-7)、(D-V-8)、(D-V-9)、(D-V-10)、(D-VI)、(D-VI-1)、(D-VI-2)、(D-VI-3)、(D-VI-4)、(D-VI-5)、(D-VI-6)、(D-VI-7)、(D-VI-8)、(D-VI-9)、(D-VII)、(D-VIII)、(D-VIII-1)、(D-VIII-2)、(D-VIII-3)、(D-VIII-4)、(D-VIII-5)、(D-VIII-6)、(D-VIII-7)、(D-VIII-8)、(D-VIII-9)、(D-VIII-10)、(D-VIII-11)、(D-IX)、(D-IX-1)、(D-IX-2)、(D-IX-3)、(D-IX-4)、(D-IX-5)、(D-IX-6)、(D-X)、(D-X-1)、(D-X-2)、(D-X-3)、(D-XI)、(D-XI-1)、(D’-I)、(M-I)、(M-II)、(M-II-1)、(M-II-2)、(M-II-3)、(M-II-4)、(M-II-5)、(M-II-6)、(M-II-7)、(M-II-8)、(M-II-9)、(M-II-10)、(M-III)、(M-III-1)、(M-III-2)、(M-III-3)、(M-III-4)、(M-III-5)、(M-III-6)、(M-III-7)、(M-III-8)、(M-III-9)、(M-IV)、(M-IV-1)、(M-IV-2)、(M-V)、(M-V-1)、(M-V-2)、(M-V-3)、(M-V-4)、(M-V-5)、(M-V-6)、(M-V-7)、(M-V-8)、(M-V-9)、(M-V-10)、(M-VI)、(M-VI-1)、(M-VI-2)、(M-VI-3)、(M-VI-4)、(M-VI-5)、(M-VI-6)、(M-VI-7)、(M-VI-8)、(M-VI-9)、(M-VII)、(M-VIII)、(M-VIII-1)、(M-VIII-2)、(M-VIII-3)、(M-VIII-4)、(M-VIII-5)、(M-VIII-6)、(M-VIII-7)、(M-VIII-8)、(M-VIII-9)、(M-VIII-10)、(M-VIII-11)、(M-IX)、(M-IX-1)、(M-IX-2)、(M-IX-3)、(M-IX-4)、(M-IX-5)、(M-IX-6)、(M-X)、(M-X-1)、(M-X-2)、(M-X-3)、(M-XI)、(M-XI-1)或(M’-I)中任一者)。
本文所述之結合物之其他特徵及優勢將由實施方式及申請專利範圍顯而易知。
本發明提供用於治療病毒感染(例如，流感病毒感染)之結合物、組合物及方法。本文所揭示之結合物包括病毒神經胺糖酸酶抑制劑(例如，紮那米韋、帕拉米韋或其類似物)之單體或二聚體，其結合於Fc單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽。該等結合物中之神經胺糖酸酶抑制劑(例如，紮那米韋、帕拉米韋或其類似物)靶向在病毒粒子之表面上的神經胺糖酸酶。該等結合物中之Fc單體或Fc域結合於免疫細胞(例如，嗜中性粒細胞)上之FcγR (例如，FcRn、FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIc、FcγRIIIa及FcγRIIIb)以活化吞噬作用及效應子功能，諸如抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)，因此由免疫細胞吞沒及破壞病毒粒子且進一步增強該等結合物之抗病毒活性。該白蛋白或白蛋白結合肽可例如藉由使白蛋白結合於再循環之新生兒Fc受體而延長該結合物之半衰期。該等組合物適用於抑制病毒生長之方法及治療病毒感染(諸如藉由A型流感病毒、B型流感病毒及C型流感病毒引起之彼等)之方法。I. 病毒感染
本文所述之化合物及醫藥組合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者之結合物)可用於治療病毒感染(例如流感病毒感染，諸如流感A、B、C或副流感)。
病毒感染係指病毒(例如，流感病毒)在宿主生物體(例如，人類個體)中之致病性生長。病毒感染可為其中病毒群體之存在正在損害宿主身體之任何情形。因此，當個體之身體中或身體上存在過量病毒群體時，或當病毒群體之存在正在損害該個體之細胞或其他組織時，該個體正在經受病毒感染。
流感(通常稱作「流感(flu)」)係由流感病毒引起之傳染病。症狀可為輕微至嚴重。最常見症狀包括：高燒、流鼻涕、喉嚨痛、肌肉疼痛、頭痛、咳嗽及感覺疲倦。此等症狀典型地在暴露於病毒之後兩天開始且大多數情況下持續不足一週。然而，咳嗽可持續超過兩週。關於兒童，可存在噁心及嘔吐，但其在成人中不常見。流感併發症可包括病毒性肺炎、繼發性細菌性肺炎、鼻竇感染及諸如哮喘或心臟衰竭之先前健康問題惡化。嚴重併發症可出現於具有經削弱免疫系統之個體中，諸如年輕人、老年人、具有削弱免疫系統之疾病的彼等個體及經歷導致免疫系統削弱之療法治療的彼等個體。
感染了流感之個體發生繼發性感染(例如繼發性細菌、病毒或真菌感染)之風險亦增加，尤其係細菌感染，例如耐甲氧西林之金黃色葡萄球菌(MRSA)、肺炎鏈球菌、銅綠假單胞菌及/或流感嗜血桿菌。細菌繼發性感染進一步增加了流感感染之發病率及死亡率。
三種類型之流感病毒影響人類個體，即A型、B型及C型。通常，該病毒藉由咳嗽或噴嚏在空氣中擴散。咸信此主要在相對較短距離內出現。其亦可藉由接觸由該病毒污染之表面且接著接觸嘴或眼睛來擴散。人在其顯示症狀之前及期間可傳染其他人。感染可藉由針對該病毒測試喉嚨、唾液或鼻子經確認。可獲得多種快速測試；然而，即使結果為陰性，人們仍可具有感染。偵測病毒之RNA的一種類型之聚合酶鏈反應可用於診斷流感感染。II. 本發明結合物
本文提供適用於治療病毒感染(例如，流感感染)之合成結合物。本文所揭示之結合物包括結合於一或多種神經胺糖酸酶抑制劑單體或兩種神經胺糖酸酶抑制劑(例如，選自紮那米韋、磺基紮那米韋、帕拉米韋、A-315675或其類似物)之一或多種二聚體的Fc域或白蛋白。兩種神經胺糖酸酶抑制劑之二聚體包括一種神經胺糖酸酶抑制劑(例如，式(A-I)、(A-II)、(A-III)、(A-IV)、(A-V)、(A-VI)、(A-VII)、(A-VIII)、(A-IX)、(A-X)、(A-XI)、(A-XII)或(A-XIII)之第一神經胺糖酸酶抑制劑)及第二神經胺糖酸酶抑制劑(例如，式(A-I)、(A-II)、(A-III)、(A-IV)、(A-V)、(A-VI)、(A-VII)、(A-VIII)、(A-IX)、(A-X)、(A-XI)、(A-XII)或(A-XIII)之第二神經胺糖酸酶抑制劑)。該等第一及第二神經胺糖酸酶抑制劑藉助於連接體彼此連接。
不受理論束縛，在一些態樣中，本文所述之結合物經由該等結合物中之神經胺糖酸酶抑制劑部分與病毒粒子之表面上的蛋白質之間之相互作用結合於該病毒粒子之表面(例如，在流感病毒粒子之表面上結合於病毒神經胺糖酸酶)。神經胺糖酸酶抑制劑破壞神經胺糖酸酶，神經胺糖酸酶為包膜醣蛋白，其在受感染宿主細胞之表面上裂解來自聚醣結構之唾液酸(亦即，末端神經胺糖酸殘基)，從而釋放後代病毒且允許該病毒自該宿主細胞擴散至未受感染周圍細胞。
本發明結合物包括結合於Fc域、Fc單體或Fc結合肽之神經胺糖酸酶抑制劑單體及二聚體。本文所述之結合物中的Fc域結合於免疫細胞上之FcγR (例如，FcRn、FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIc、FcγRIIIa及FcγRIIIb)。本文所述之結合物中的Fc域結合於免疫細胞上之FcγR會活化吞噬作用及效應子功能，諸如抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)，因此由免疫細胞吞沒及破壞病毒粒子且進一步增強該等結合物之抗病毒活性。
本發明結合物包括結合於白蛋白或白蛋白結合肽之神經胺糖酸酶抑制劑單體及二聚體。該白蛋白或白蛋白結合肽可例如藉由使白蛋白結合於再循環之新生兒Fc受體而延長該結合物之半衰期。
本文所提供之結合物係由式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者描述。在一些實施例中，本文所述之結合物包括結合於Fc域或白蛋白之神經胺糖酸酶抑制劑的一或多種單體。在一些實施例中，本文所述之結合物包括結合於Fc域或白蛋白之神經胺糖酸酶抑制劑的一或多種二聚體。在一些實施例中，當n為2時，E (Fc域單體)二聚以形成Fc域。
本文所述之結合物可使用此項技術中可獲得之化學合成技術來合成。在無法獲得用於結合之官能基的情況下，分子可使用此項技術中熟知之習知化學合成技術衍生化。在一些實施例中，本文所述之結合物含有一或多個對掌性中心。該等結合物包括經分離立體異構體形式中任一者，以及具有變化之對掌性純度程度之立體異構體的混合物，包括外消旋混合物。其亦涵蓋可形成之多種非對映異構體、對映異構體及互變異構體。神經胺糖酸酶抑制劑
本文所述之結合物之組分為流感病毒神經胺糖酸酶抑制劑部分。流感病毒神經胺糖酸酶抑制劑破壞神經胺糖酸酶，神經胺糖酸酶為包膜醣蛋白，其在受感染宿主細胞之表面上裂解來自聚醣結構之唾液酸(亦即，末端神經胺糖酸殘基)，從而釋放後代病毒且允許該病毒自該宿主細胞擴散至未受感染周圍細胞。流感病毒神經胺糖酸酶抑制劑之實例包括紮那米韋(Relenza)、磺基紮那米韋、A-315675及帕拉米韋。另外，紮那米韋、磺基紮那米韋、A-315675及帕拉米韋之衍生物(諸如文獻中發現之彼等)具有神經胺糖酸酶抑制劑活性且適用作本文中該等化合物之神經胺糖酸酶抑制劑部分(參見例如Hadházi等人 A sulfozanamivir analogue has potent anti-influenza virus activity.ChemMedChem Comm. 13:785-789 (2018)及In vitro characterization of A-315675, a highly potent inhibitor of A and B strain of influenze virus neuraminidases and influenza virus replication.Antimicrobial Agents and Chemotherapy 46(4):1014-1021 (2002))。
本文所述之結合物分成兩種類型：(1)結合於Fc域或白蛋白之神經胺糖酸酶抑制劑的一或多種二聚體，及(2)結合於Fc域或白蛋白之神經胺糖酸酶抑制劑的一或多種單體。神經胺糖酸酶抑制劑之二聚體藉助於連接體(諸如本文所述之連接體)彼此連接。
本發明之病毒神經胺糖酸酶抑制劑包括紮那米韋、磺基紮那米韋、A-315675、帕拉米韋及其類似物，諸如式(A-I)-(A-XIII)之病毒神經胺糖酸酶抑制劑：
Figure 02_image009
、
Figure 02_image011
、
Figure 02_image013
、
Figure 02_image015
、
Figure 02_image017
、 (A-I)                      (A-II)                 (A-III)                  (A-IV)                 (A-V)
Figure 02_image019
、
Figure 02_image021
、
Figure 02_image023
、
Figure 02_image025
、 (A-VI)                (A-VII)                    (A-VIII)                    (A-IX)
Figure 02_image027
、
Figure 02_image029
、
Figure 02_image031
；
Figure 02_image980
(A-X)                        (A-XI)                             (A-XII)                     (A-XIII) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ；R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br；R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H；R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ；X係選自-O-及-S-；Y係選自
Figure 02_image1084
Figure 02_image1086
R6 係選自
Figure 02_image035
、
Figure 02_image037
、
Figure 02_image039
、
Figure 02_image041
、
Figure 02_image043
、
Figure 02_image045
、
Figure 02_image047
、
Figure 02_image049
、
Figure 02_image051
、
Figure 02_image053
、
Figure 02_image055
、
Figure 02_image057
、
Figure 02_image059
、
Figure 02_image061
、
Figure 02_image063
、
Figure 02_image065
、
Figure 02_image067
、
Figure 02_image069
、
Figure 02_image071
、
Figure 02_image073
、
Figure 02_image075
、
Figure 02_image077
、
Figure 02_image079
、
Figure 02_image081
、
Figure 02_image083
、
Figure 02_image085
、
Figure 02_image087
、
Figure 02_image089
、
Figure 02_image091
、
Figure 02_image093
、
Figure 02_image095
及
Figure 02_image097
； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；R9 選自-H、鹵素(例如，Cl、F或Br)、-OR10 、-NHC(=O)R7 、視情況經取代之C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；並且R10 選自C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基。最佳地，式(A-I)、(A-II)、(A-III)、(A-IV)、(A-V)、(A-VI)、(A-VII)、(A-VIII)、(A-IX)、(A-X)、(A-XI)、(A-XII)或(A-XIII)之病毒神經胺糖酸酶抑制劑經由Y附接於該結合物。
較佳地，該病毒神經胺糖酸酶抑制劑係選自紮那米韋、磺基紮那米韋、帕拉米韋或A-315675：
Figure 02_image1120
、
Figure 02_image972
、
Figure 02_image1123
、
Figure 02_image1125
。 紮那米韋                  磺基紮那米韋、             帕拉米韋                  A-315675連接於 Fc 域或白蛋白之神經胺糖酸酶抑制劑之二聚體的結合物
本文所述之結合物包括共價連接於神經胺糖酸酶抑制劑之一或多種二聚體的Fc域及Fc單體、Fc結合肽及白蛋白或白蛋白結合肽。兩種神經胺糖酸酶抑制劑之二聚體包括第一神經胺糖酸酶抑制劑(例如，式(A-I)-(A-XIII)之第一病毒神經胺糖酸酶抑制劑)及第二神經胺糖酸酶抑制劑(例如，式(A-I)-(A-XIII)之第二病毒神經胺糖酸酶抑制劑)。該等第一及第二神經胺糖酸酶抑制劑藉助於連接體(諸如本文所述之連接體)彼此連接。在神經胺糖酸酶抑制劑之二聚體的一些實施例中，該等第一及第二神經胺糖酸酶抑制劑為相同的。在一些實施例中，該等第一及第二神經胺糖酸酶抑制劑為不同的。
神經胺糖酸酶抑制劑之二聚體包括紮那米韋或其類似物(例如，(A-I)、(A-II)、(A-VI)、(A-VII)、(A-VIII)、(A-IX)、(A-X)或(A-XIII))之均二聚體。例如，本發明之神經胺糖酸酶抑制劑二聚體包括具有結構A1 -L-A2 之二聚體，其中各A1 及各A2 係選自(A-I)、(A-II)、(A-VI)、(A-VII)、(A-VIII)、(A-IX)、(A-X)及(A-XIII)。
神經胺糖酸酶抑制劑之二聚體包括帕拉米韋或其類似物(例如，(A-III)、(A-IV)或(A-V))之均二聚體。例如，本發明之神經胺糖酸酶抑制劑二聚體包括具有結構A1 -L-A2 之二聚體，其中各A1 及各A2 係選自(A-III)、(A-IV)及(A-V)。
神經胺糖酸酶抑制劑之二聚體包括包含紮那米韋或其類似物及帕拉米韋或其類似物之雜二聚體(例如，(A-I)-(A-XIII))。例如，本發明之神經胺糖酸酶抑制劑二聚體包括具有結構A1 -L-A2 之二聚體，其中各A1 係選自(A-I)、(A-II)、(A-VI)、(A-VII)、(A-VIII)、(A-IX)、(A-X)及(A-XIII)，且各A2 係選自(A-III)、(A-IV)及(A-V)。
在一些實施例中，當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各A1 -L-A2 可獨立地經選擇(例如，獨立地選自本文所述之A1 -L-A2 結構中任一者)。在一些實施例中，E可結合於2、3、4、5、6、7、8、9、10個或10個以上不同A1 -L-A2 部分。在一些實施例中，E結合於第一A1 -L-A2 部分及第二A1 -L-A2 部分。在一些實施例中，第一A1 -L-A2 部分之A1 及A2 係獨立地選自式(A-III)-(A-V)中任一者：
Figure 02_image013
、
Figure 02_image015
、
Figure 02_image017
； (A-III)                   (A-IV)                      (A-V) 且第二A1 -L-A2 部分之A1 及A2 係獨立地選自式(A-I)、(A-II)、(A-VI)、(A-VII)、(A-VIII)、(A-IX)、(A-X)或(A-XIII)中任一者：
Figure 02_image009
、
Figure 02_image011
、
Figure 02_image019
、
Figure 02_image021
、
Figure 02_image023
、 (A-I)                       (A-II)                  (A-VI)                  (A-VII)             (A-VIII)
Figure 02_image025
；
Figure 02_image027
；
Figure 02_image980
。 (A-IX)                (A-X)                        (A-XIII)
在一些實施例中，第一A1 -L-A2 部分特異性地結合於E之離胺酸殘基(例如，E之表面暴露離胺酸殘基的氮原子)，且第二A1 -L-A2 部分特異性地結合於E之半胱胺酸殘基(例如，E之表面暴露半胱胺酸殘基的硫原子)。在一些實施例中，第一A1 -L-A2 部分特異性地結合於E之半胱胺酸殘基(例如，E之表面暴露半胱胺酸殘基的硫原子)，且第二A1 -L-A2 部分特異性地結合於E之離胺酸殘基(例如，E之表面暴露離胺酸殘基的氮原子)。
在一些實施例中，本發明提供由以下各式描述之結合物或其醫藥學上可接受之鹽;
Figure 02_image005
； (1)
Figure 02_image001
； (D-I)
Figure 02_image225
； (D-II)
Figure 02_image227
； (D-II-1)
Figure 02_image229
； (D-II-2)
Figure 02_image231
； (D-II-3)
Figure 02_image239
； (D-II-4)
Figure 02_image241
； (D-II-5)
Figure 02_image257
； (D-II-6)
Figure 02_image259
； (D-II-7)
Figure 02_image261
； (D-II-8)
Figure 02_image1149
； (D-II-9)
Figure 02_image287
； (D-II-10)
Figure 02_image293
； (D-III)
Figure 02_image295
； (D-III-1)
Figure 02_image297
； (D-III-2)
Figure 02_image299
； (D-III-3)
Figure 02_image301
； (D-III-4)
Figure 02_image303
； (D-III-5)
Figure 02_image305
； (D-III-6)
Figure 02_image307
； (D-III-7)
Figure 02_image309
； (D-III-8)
Figure 02_image311
； (D-III-9)
Figure 02_image313
； (D-IV)
Figure 02_image315
； (D-IV-1)
Figure 02_image317
； (D-IV-2)
Figure 02_image319
； (D-V)
Figure 02_image321
； (D-V-1)
Figure 02_image323
； (D-V-2)
Figure 02_image325
； (D-V-3)
Figure 02_image327
； (D-V-4)
Figure 02_image329
； (D-V-5)
Figure 02_image331
； (D-V-6)
Figure 02_image333
； (D-V-7)
Figure 02_image335
； (D-V-8)
Figure 02_image337
； (D-V-9)
Figure 02_image339
； (D-V-10)
Figure 02_image341
； (D-VI)
Figure 02_image343
； (D-VI-1)
Figure 02_image345
； (D-VI-2)
Figure 02_image347
； (D-VI-3)
Figure 02_image349
； (D-VI-4)
Figure 02_image351
； (D-VI-5)
Figure 02_image353
； (D-VI-6)
Figure 02_image355
； (D-VI-7)
Figure 02_image357
； (D-VI-8)
Figure 02_image359
； (D-VI-9)
Figure 02_image361
； (D-VII)
Figure 02_image363
； (D-VIII)
Figure 02_image365
； (D-VIII-1)
Figure 02_image367
； (D-VIII-2)
Figure 02_image369
； (D-VIII-3)
Figure 02_image377
； (D-VIII-4)
Figure 02_image379
； (D-VIII-5)
Figure 02_image389
； (D-VIII-6)
Figure 02_image391
； (D-VIII-7)
Figure 02_image393
； (D-VIII-8)
Figure 02_image395
； (D-VIII-9)
Figure 02_image397
； (D-VIII-10)
Figure 02_image399
； (D-VIII-11)
Figure 02_image401
； (D-IX)
Figure 02_image403
； (D-IX-1)
Figure 02_image405
； (D-IX-2)
Figure 02_image407
； (D-IX-3)
Figure 02_image409
； (D-IX-4)
Figure 02_image411
； (D-IX-5)
Figure 02_image413
； (D-IX-6)
Figure 02_image1206
； (D-X)
Figure 02_image1208
； (D-X-1)
Figure 02_image1210
； (D-X-2)
Figure 02_image1212
； (D-X-3)
Figure 02_image998
； (D-XI)
Figure 02_image1000
；或 (D-XI-1)
Figure 02_image934
； (D’-I) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在本文所述之結合物中，連接至E之波浪線指示神經胺糖酸酶抑制劑之一或多種(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20種)二聚體可附接於Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽。在一些實施例中，當n為1時，神經胺糖酸酶抑制劑之一或多種(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10種)二聚體可附接於Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽。在一些實施例中，當n為2時，神經胺糖酸酶抑制劑之一或多種(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20種)二聚體可附接於Fc域。本文所述之結合物中的波浪線不應解釋為神經胺糖酸酶抑制劑之一或多種二聚體與Fc域或白蛋白中之原子之間的單鍵。在一些實施例中，當T為1時，神經胺糖酸酶抑制劑之一種二聚體可附接於Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽中之原子。在一些實施例中，當T為2時，神經胺糖酸酶抑制劑之兩種二聚體可附接於Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽中之原子。
如本文進一步描述，本文所述之結合物中的連接體(例如，L或L')可為分支鏈結構。如本文進一步描述，本文所述之結合物中的連接體(例如，L或L')可為多價結構，例如分別具有兩個或三個臂之二價或三價結構。在一些實施例中，當該連接體具有三個臂時，該等臂中之兩者可附接於第一及第二神經胺糖酸酶抑制劑且第三個臂可附接於Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽。
在如由以上各式表示之具有共價連接於神經胺糖酸酶抑制劑之一或多種二聚體之Fc域的結合物中，當n為2時，兩種Fc域單體(各Fc域單體由E表示)二聚以形成Fc域。連接於 Fc 域或白蛋白之神經胺糖酸酶抑制劑之單體的結合物
在一些實施例中，本文所述之結合物包括共價連接於神經胺糖酸酶抑制劑之一或多種單體的Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽。Fc域單體或白蛋白及神經胺糖酸酶抑制劑之一或多種單體的結合物可藉由經由連接體(諸如本文所述之任何連接體)使該Fc域或白蛋白連接於神經胺糖酸酶抑制劑之各單體來形成。
在本文所述之具有共價連接於神經胺糖酸酶抑制劑之一或多種單體之Fc域或白蛋白的結合物中，連接至E之波浪線指示神經胺糖酸酶抑制劑之一或多種(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20種)單體可附接於Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽。在一些實施例中，當n為1時，神經胺糖酸酶抑制劑之一或多種(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10種)單體可附接於Fc域單體或白蛋白。在一些實施例中，當n為2時，神經胺糖酸酶抑制劑之一或多種(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20種)單體可附接於Fc域。本文所述之結合物中的波浪線不應解釋為神經胺糖酸酶抑制劑之一或多種單體與Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽中之原子之間的單鍵。在一些實施例中，當T為1時，神經胺糖酸酶抑制劑之一種單體可附接於Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽中之原子。在一些實施例中，當T為2時，神經胺糖酸酶抑制劑之兩種單體可附接於Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽中之原子。
在一些實施例中，當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各A1 -L可獨立地經選擇(例如，獨立地選自本文所述之A1 -L結構中任一者)。在一些實施例中，E可結合於2、3、4、5、6、7、8、9、10個或10個以上不同A1 -L部分。在一些實施例中，E結合於第一A1 -L部分及第二A1 -L部分。在一些實施例中，第一A1 -L部分之A1 係選自式(A-III)-(A-V)中任一者：
Figure 02_image013
、
Figure 02_image015
、
Figure 02_image017
； (A-III)                     (A-IV)                      (A-V) 且第二A1 -L部分之A1 係選自式(A-I)、(A-II)、(A-VI)、(A-VII)、(A-VIII)、(A-IX)、(A-X)或(A-XIII)中任一者：
Figure 02_image009
、
Figure 02_image011
、
Figure 02_image019
、
Figure 02_image021
、
Figure 02_image023
、 (A-I)                 (A-II)                  (A-VI)                  (A-VII)             (A-VIII)
Figure 02_image025
；
Figure 02_image027
；
Figure 02_image980
。 (A-IX)               (A-X)                 (A-XIII)
在一些實施例中，第一A1 -L部分特異性地結合於E之離胺酸殘基(例如，E之表面暴露離胺酸殘基的氮原子)，且第二A1 -L部分特異性地結合於E之半胱胺酸殘基(例如，E之表面暴露半胱胺酸殘基的硫原子)。在一些實施例中，第一A1 -L部分特異性地結合於E之半胱胺酸殘基(例如，E之表面暴露半胱胺酸殘基的硫原子)，且第二A1 -L部分特異性地結合於E之離胺酸殘基(例如，E之表面暴露離胺酸殘基的氮原子)。
如本文進一步描述，本文所述之具有共價連接於神經胺糖酸酶抑制劑之一或多種單體的Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽之結合物中的連接體(例如，L或L')可為具有兩個臂之二價結構。二價連接體中之一個臂可附接於神經胺糖酸酶抑制劑之單體且另一臂可附接於Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽。
在一些實施例中，本文所提供之含有共價連接於神經胺糖酸酶抑制劑之一或多種單體的Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽之結合物係由以下各式中任一者描述：
Figure 02_image1228
； (2)
Figure 02_image1230
(5)
Figure 02_image003
； (M-I)
Figure 02_image734
； (M-II)
Figure 02_image736
； (M-II-1)
Figure 02_image738
； (M-II-2)
Figure 02_image740
； (M-II-3)
Figure 02_image742
； (M-II-4)
Figure 02_image744
； (M-II-5)
Figure 02_image748
； (M-II-6)
Figure 02_image750
； (M-II-7)
Figure 02_image752
； (M-II-8)
Figure 02_image756
； (M-II-9)
Figure 02_image758
； (M-II-10)
Figure 02_image762
； (M-III)
Figure 02_image764
； (M-III-1)
Figure 02_image766
； (M-III-2)
Figure 02_image768
； (M-III-3)
Figure 02_image770
； (M-III-4)
Figure 02_image772
； (M-III-5)
Figure 02_image774
； (M-III-6)
Figure 02_image776
； (M-III-7)
Figure 02_image778
； (M-III-8)
Figure 02_image780
； (M-III-9)
Figure 02_image782
； (M-IV)
Figure 02_image784
； (M-IV-1)
Figure 02_image786
； (M-IV-2)
Figure 02_image788
； (M-V)
Figure 02_image790
； (M-V-1)
Figure 02_image792
； (M-V-2)
Figure 02_image794
； (M-V-3)
Figure 02_image796
； (M-V-4)
Figure 02_image798
； (M-V-5)
Figure 02_image800
； (M-V-6)
Figure 02_image802
； (M-V-7)
Figure 02_image804
； (M-V-8)
Figure 02_image806
； (M-V-9)
Figure 02_image808
； (M-V-10)
Figure 02_image810
； (M-VI)
Figure 02_image812
； (M-VI-1)
Figure 02_image814
； (M-VI-2)
Figure 02_image816
； (M-VI-3)
Figure 02_image818
； (M-VI-4)
Figure 02_image820
； (M-VI-5)
Figure 02_image822
； (M-VI-6)
Figure 02_image824
； (M-VI-7)
Figure 02_image826
； (M-VI-8)
Figure 02_image828
； (M-VI-9)
Figure 02_image830
； (M-VII)
Figure 02_image832
； (M-VIII)
Figure 02_image834
； (M-VIII-1)
Figure 02_image836
； (M-VIII-2)
Figure 02_image838
； (M-VIII-3)
Figure 02_image840
； (M-VIII-4)
Figure 02_image842
； (M-VIII-5)
Figure 02_image846
； (M-VIII-6)
Figure 02_image848
； (M-VIII-7)
Figure 02_image850
； (M-VIII-8)
Figure 02_image852
； (M-VIII-9)
Figure 02_image854
； (M-VIII-10)
Figure 02_image856
； (M-VIII-11)
Figure 02_image858
； (M-IX)
Figure 02_image860
； (M-IX-1)
Figure 02_image862
； (M-IX-2)
Figure 02_image864
； (M-IX-3)
Figure 02_image866
； (M-IX-4)
Figure 02_image868
； (M-IX-5)
Figure 02_image870
； (M-IX-6)
Figure 02_image1298
； (M-X)
Figure 02_image1300
； (M-X-1)
Figure 02_image1302
； (M-X-2)
Figure 02_image1304
； (M-X-3)
Figure 02_image1002
； (M-XI)
Figure 02_image1004
；或 (M-XI-1)
Figure 02_image936
； (M’-I) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在如由以上各式表示之具有共價連接於神經胺糖酸酶抑制劑之一或多種單體之Fc域的結合物中，當n為2時，兩種Fc域單體(各Fc域單體由E表示)二聚以形成Fc域。包括紮那米韋或其類似物之結合物之區域異構體
結合物(例如，如本文中詳細描述之單體或二聚體結合物)可以混合物或區域異構體形式產生。出於諸如容易合成、熱穩定性、氧化穩定性、藥物動力學(例如，代謝穩定性或生物可用性)、效應子結合或治療功效之原因，特定區域異構體或區域異構體之混合物可為較佳的。
在一些實施例中，本發明結合物包括紮那米韋或其類似物(例如，(A-I)、(A-II)、(A-VI)、(A-VII)、(A-VIII)、(A-IX)、(A-X)或(A-XIII)中任一者)。紮那米韋或其類似物可經由例如C7位置(參見例如(A-I)、(A-II)、(A-X)或(A-XIII))或經由C9位置(參見例如(A-VI)或(A-VII))結合於Fc域或白蛋白(例如，藉助於連接體)：
Figure 02_image009
(A-I)，C7結合，
Figure 02_image011
(A-II)，C7結合，
Figure 02_image027
(A-X)，C7結合，
Figure 02_image980
(A-XIII)，C7結合
Figure 02_image019
(A-VI)，C9結合，
Figure 02_image021
(A-VII)，C9結合。
本發明包括單體結合物群體(例如，式(M-I)結合物群體)，其中該結合物群體包括本文所述之單體結合物中任一者及一或多種其相應區域異構體。例如，結合物群體可包括(1)在C7位置結合(例如，藉助於連接體)於Fc域或白蛋白之紮那米韋或其類似物，及(2)在C9位置結合(例如，藉助於連接體)於Fc域或白蛋白之紮那米韋或其類似物。
單體結合物群體可具有規定之C7連接結合物:C9連接結合物比率。例如，結合物群體可具有實質上100% C-7連接結合物及實質上0% C-9連接結合物。結合物群體可具有約95% C-7連接結合物及約5% C-9連接結合物。結合物群體可具有約90% C-7連接結合物及約10% C-9連接結合物。結合物群體可具有約85% C-7連接結合物及約15% C-9連接結合物。結合物群體可具有約80% C-7連接結合物及約20% C-9連接結合物。結合物群體可具有約75% C-7連接結合物及約25% C-9連接結合物。結合物群體可具有約70% C-7連接結合物及約30% C-9連接結合物。結合物群體可具有約65% C-7連接結合物及約35% C-9連接結合物。結合物群體可具有約60% C-7連接結合物及約40% C-9連接結合物。結合物群體可具有約55% C-7連接結合物及約45% C-9連接結合物。結合物群體可具有約50% C-7連接結合物及約50% C-9連接結合物。結合物群體可具有約45% C-7連接結合物及約55% C-9連接結合物。結合物群體可具有約40% C-7連接結合物及約60% C-9連接結合物。結合物群體可具有約35% C-7連接結合物及約65% C-9連接結合物。結合物群體可具有約30% C-7連接結合物及約70% C-9連接結合物。結合物群體可具有約25% C-7連接結合物及約75% C-9連接結合物。結合物群體可具有約20% C-7連接結合物及約80% C-9連接結合物。結合物群體可具有約15% C-7連接結合物及約85% C-9連接結合物。結合物群體可具有約10% C-7連接結合物及約90% C-9連接結合物。結合物群體可具有實質上0% C-7連接結合物及實質上100% C-9連接結合物。
結合物群體可具有大於99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%、80%、75%、70%、60%、65%、60%、55%或50% C7連接結合物。
結合物群體可具有少於50%、40%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%或1% C9連接結合物。
本發明亦包括二聚體結合物群體(例如，式(D-I)結合物群體)，其中該結合物群體包括本文所述之二聚體結合物中任一者及一或多種其相應區域異構體。例如，結合物群體可包括(1) C7-C7二聚體(例如，該二聚體之紮那米韋或其類似物部分在其各別C7位置結合(例如，藉助於連接體)於Fc域或白蛋白)，(2) C9-C9二聚體(例如，該二聚體之紮那米韋或其類似物部分在其各別C9位置結合(例如，藉助於連接體)於Fc域或白蛋白)，及/或(3) C7-C7二聚體(例如，一個紮那米韋或其類似物部分經由其C7位置結合(例如，藉助於連接體)於Fc域或白蛋白且另一紮那米韋或其類似物部分經由其C9位置結合(例如，藉助於連接體)於Fc域或白蛋白)。
二聚體結合物群體可具有規定之C7-C7連接結合物:C7-C9連接結合物:C9-C9連接結合物比率。例如，結合物群體可具有實質上100% C7-C7連接結合物及實質上0% C7-C9或C9-C9連接結合物。結合物群體可具有實質上100% C9-C9連接結合物及實質上0% C7-C7或C7-C9連接結合物。結合物群體可具有實質上100% C7-C9連接結合物及實質上0% C7-C7或C9-C9連接結合物。
結合物群體可具有大於99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%、80%、75%、70%、60%、65%、60%、55%或50% C7-C7連接結合物。
結合物群體可具有少於50%、40%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%或1% C9-C9連接結合物。
結合物群體可具有少於50%、40%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%或1% C7-C9連接結合物。
關於上述區域異構體群體中任一者，A1 及/或A2 (例如，(M-I)或(D-I)中)可選自紮那米韋或本文所述之紮那米韋類似物中任一者(例如，(A-I)、(A-II)、(A-VI)、(A-VII)、(A-VIII)、(A-IX)、(A-X)或(A-XIII)中任一者)。詳言之，C7連接紮那米韋或其類似物係由(A-I)、(A-II)、(A-X)及(A-XIII)描述，且C9連接紮那米韋或其類似物係由(A-VI)或(A-VII)描述。用於製備區域異構體(例如，C7、C9、C7-C7、C7-C9及C9-C9連接區域異構體)之例示性方法描述於實例100-103、123及124中。在一些情況下，具有95%或更多、96%或更多、97%或更多、98%或更多、99%或更多或實質上100% C7連接單體結合物或C7-C7連接二聚體結合物可為較佳的。在此等情況下，用實質上形成C7連接單體或C7-C7連接二聚體中間物之方法(諸如描述於例如實例103及123中之方法)製備該中間物可為較佳的。實例103之方法係主要用於獲得C7或C7-C7連接中間物且可用於製備本文所述之任何中間物之例示性方法。
在C9位具有修飾基團(例如，除OH之外之取代基)之紮那米韋類似物(例如，(A-XIII)描述之紮那米韋類似物)可以藉由防止C7連接之紮那米韋遷移至C9連接之紮那米韋而增加C7連接之紮那米韋與C9連接之紮那米韋之比率。本文描述了示例性之C9-修飾之紮那米韋類似物(參見例如D-XI或M-XI描述之結合物，例如結合物47(Int-91)或結合物48(Int-92)。
在較佳實施例中，該結合物為式(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者之結合物，其中A1 及/或A2 係由式(A-I)、(A-II)、(A-X)或(A-XIII)描述且Y為
Figure 02_image1315
，其中R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基。在較佳實施例中，A1 及/或A2 係由式(A-I)描述(例如，紮那米韋)。在較佳實施例中，R7 為C1-C20烷基(例如，-CH3 、-CH2 CH3 、-CH2 CH2 CH3 )。該等結合物已顯示出展現增加之C7連接穩定性，導致較少C7至C9遷移(例如參見D-II-6或D-II-7描述之結合物，例如結合物45(Int-83)或結合物46(Int-83))。因此，預期所得產物更加均質且展現增加之功效。較佳之結合物係更均一的、具有增加之比例(例如，基本上純，例如大於95%、96%、97%、98%或99%純)之C7連接之紮那米韋，並保持抗流感之功效。III. Fc 域單體及 Fc 域
Fc域單體包括鉸鏈域、CH 2抗體恆定域及CH 3抗體恆定域。該Fc域單體可具有免疫球蛋白抗體同型IgG、IgE、IgM、IgA或IgD。該Fc域單體亦可具有任何免疫球蛋白抗體同型(例如，IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgG4)。該Fc域單體可具有任何免疫球蛋白抗體同種異型(例如，IGHG1*01 (亦即，G1m(za))、IGHG1*07 (亦即，G1m(zax))、IGHG1*04 (亦即，G1m(zav))、IGHG1*03 (G1m(f))、IGHG1*08 (亦即，G1m(fa))、IGHG2*01、IGHG2*06、IGHG2*02、IGHG3*01、IGHG3*05、IGHG3*10、IGHG3*04、IGHG3*09、IGHG3*11、IGHG3*12、IGHG3*06、IGHG3*07、IGHG3*08、IGHG3*13、IGHG3*03、IGHG3*14、IGHG3*15、IGHG3*16、IGHG3*17、IGHG3*18、IGHG3*19、IGHG2*04、IGHG4*01、IGHG4*03或IGHG4*02) (如描述於例如Vidarsson等人IgG subclasses and allotypes: from structure to effector function.Frontiers in Immunology . 5(520):1-17 (2014)中)。該Fc域單體亦可屬任何物種，例如人類、鼠類或小鼠。Fc域單體之二聚體係可結合於Fc受體之Fc域，該Fc受體係位於白細胞表面上之受體。
在一些實施例中，本文所述之結合物中的Fc域單體可相對於具有SEQ ID NO: 1-138中任一者之序列的Fc域單體含有一或多種胺基酸取代、添加及/或缺失。在一些實施例中，如本文所述之結合物中的Fc域單體中之Asn可由Ala置換以便預防N連接之糖基化(參見例如SEQ ID NO: 12-15，其中Asn至Ala取代用*標記)。在一些實施例中，本文所述之結合物中的Fc域單體亦可含有額外Cys添加(參見例如SEQ ID NO: 9、10及11，其中Cys添加用*標記)。
在一些實施例中，如本文所述之結合物中的Fc域單體包括額外部分，例如附接於該Fc域單體之N或C端之白蛋白結合肽、純化肽(例如，六組胺酸肽(HHHHHH (SEQ ID NO: 146))或信號序列(例如，IL2信號序列MYRMQLLSCIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 147))。在一些實施例中，該結合物中之Fc域單體不含任何類型之抗體可變區，例如VH 、VL 、互補決定區(CDR)或高變區(HVR)。
在一些實施例中，如本文所述之結合物中的Fc域單體可具有與下文所示之SEQ ID NO: 1-138中任一者之序列至少95%一致(例如，97%、99%或99.5%一致)的序列。在一些實施例中，如本文所述之結合物中的Fc域單體可具有下文所示之SEQ ID NO: 1-138中任一者之序列。 SEQ ID NO: 1：N端(粗體)具有IL2信號序列之鼠類Fc-IgG2aMYRMQLLSCIALSLALVTNS PRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK SEQ ID NO: 2：成熟鼠類Fc-IgG2a PRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK SEQ ID NO: 3：N端(粗體)具有IL2信號序列且添加有N端MVRS胺基酸殘基(加下劃線)之人類Fc-IgG1MYRMQLLSCIALSLALVTNS MVRS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 4：添加有N端MVRS胺基酸殘基(加下劃線)之成熟人類Fc-IgG1MVRS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 5：N端具有IL2信號序列(粗體)且C端具有六組胺酸肽(斜體)之鼠類Fc-IgG2aMYRMQLLSCIALSLALVTNS PRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGKHHHHHH SEQ ID NO: 6：C端具有六組胺酸肽(斜體)之成熟鼠類Fc-IgG2a PRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGKHHHHHH SEQ ID NO: 7：N端具有IL2信號序列(粗體)、添加有N端MVRS胺基酸殘基(加下劃線)且C端具有六組胺酸肽(斜體)之人類Fc-IgG1MYRMQLLSCIALSLALVTNS MVRS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKHHHHHH SEQ ID NO: 8：C端具有六組胺酸肽(斜體)且添加有N端MVRS胺基酸殘基(加下劃線)之成熟人類Fc-IgG1MVRS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKHHHHHH SEQ ID NO: 9：N端具有IL2信號序列(粗體)、添加有N端MVRS胺基酸殘基(加下劃線)、鉸鏈區中具有兩個額外半胱胺酸(*)且C端具有六組胺酸肽(斜體)之人類Fc-IgG1MYRMQLLSCIALSLALVTNS MVRS DKTHTCPPCPPC*KC*PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKHHHHHH SEQ ID NO: 10：添加有N端MVRS胺基酸殘基(加下劃線)、鉸鏈區中具有兩個額外半胱胺酸(*)且C端具有六組胺酸肽(斜體)之成熟人類Fc-IgG1MVRS DKTHTCPPCPPC*KC*PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKHHHHHH SEQ ID NO: 11：添加有N端MVRS胺基酸殘基(加下劃線)且鉸鏈區中具有兩個額外半胱胺酸(*)之成熟人類Fc-IgG1MVRS DKTHTCPPCPPC*KC*PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 12：N端具有IL2信號序列(粗體)、具有Asn至Ala取代(*)且C端具有六組胺酸肽(斜體)之鼠類Fc-IgG2aMYRMQLLSCIALSLALVTNS PRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYA* STLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGKHHHHHH SEQ ID NO: 13：具有Asn至Ala取代(*)且C端具有六組胺酸肽(斜體)之成熟鼠類Fc-IgG2a PRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYA*STLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGKHHHHHH SEQ ID NO: 14：N端具有IL2信號序列(粗體)、添加有N端MVRS胺基酸殘基(加下劃線)、具有Asn至Ala取代(*)且C端具有六組胺酸肽(斜體)之人類Fc-IgG1MYRMQLLSCIALSLALVTNS MVRS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYA*STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKHHHHHH SEQ ID NO: 15：具有Asn至Ala取代(*)、添加有N端MVRS胺基酸殘基(加下劃線)且C端具有六組胺酸肽(斜體)之成熟人類Fc-IgG1MVRS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYA*STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKHHHHHH SEQ ID NO: 16：N端具有人類血清白蛋白信號序列(粗體)且添加有N端ISAMVRS胺基酸殘基(加下劃線)之人類IgG1 FcMKWVTFISLLFLFSSAYS ISAMVRS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 17：N端具有人類血清白蛋白信號序列(粗體)、添加有N端ISAMVRS胺基酸殘基(加下劃線)、具有C端G4S連接體(斜體)且具有C端c-Myc標籤(加下劃線、斜體)之人類IgG1 FcMKWVTFISLLFLFSSAYS ISAMVRS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGG GSEQKLISEEDL SEQ ID NO: 18：添加有N端ISAMVRS胺基酸殘基(加下劃線)、具有C端G4S連接體(斜體)且具有C端c-Myc標籤(加下劃線、斜體)之成熟人類IgG1 FcISAMVRS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGG GSEQKLISEEDL SEQ ID NO: 19：具有人類血清白蛋白信號序列(粗體)、添加有N端ISAMVRS胺基酸殘基(加下劃線)且具有離胺酸至絲胺酸修飾(*)以預防此位點處之離胺酸結合之人類IgG1 FcMKWVTFISLLFLFSSAYS ISAMVRS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPS*DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 20：添加有N端ISAMVRS胺基酸殘基(加下劃線)且具有離胺酸至絲胺酸修飾(*)以預防此位點處之離胺酸結合之成熟人類IgG1 FcISAMVRS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPS*DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 21：N端具有人類血清白蛋白信號序列(粗體)、添加有N端ISAMVRS胺基酸殘基(加下劃線)、具有離胺酸至絲胺酸修飾(*)以預防此位點處之離胺酸結合、具有C端G4S連接體(斜體)且具有C端C-Myc標籤(加下劃線、斜體)之人類IgG1 FcMKWVTFISLLFLFSSAYS ISAMVRS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPS(*)DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSEQKLISEEDL SEQ ID NO: 22：添加有N端ISAMVRS胺基酸殘基(加下劃線)、具有離胺酸至絲胺酸修飾(*)以預防此位點處之離胺酸結合、具有C端G4S連接體(斜體)且具有C端C-Myc標籤(加下劃線、斜體)之成熟人類IgG1 FcISAMVRS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPS(*)DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSEQKLISEEDL SEQ ID NO: 23：N端具有人類血清白蛋白信號序列(粗體)、添加有N端ISAMVRS胺基酸殘基(加下劃線)、具有Asn至Ala取代(*)、具有C端G4S連接體(斜體)且具有C端C-myc標籤(加下劃線、斜體)之人類IgG1 FcMKWVTFISLLFLFSSAYS ISAMVRS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYA(*)STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSEQKLISEEDL SEQ ID NO: 24：添加有N端ISAMVRS胺基酸殘基(加下劃線)、具有Asn至Ala取代(*)、具有C端G4S連接體(斜體)且具有C端C-myc標籤(加下劃線、斜體)之成熟人類IgG1 FcISAMVRS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYA(*)STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSEQKLISEEDL SEQ ID NO: 25：N端具有人類血清白蛋白信號序列(粗體)、添加有N端ISAMVRS胺基酸殘基(加下劃線)、具有H310A (*)及H435A (*)突變以妨礙FcRn結合、具有C端G4S (斜體)且具有C端C-myc標籤(加下劃線、斜體)之人類IgG1 FcMKWVTFISLLFLFSSAYS ISAMVRS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLA(*)QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA(*)KGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNAYTQKSLSLSPGGGGGSEQKLISEEDL SEQ ID NO: 26：N端具有人類血清白蛋白信號序列(粗體)、添加有N端ISAMVRS胺基酸殘基(加下劃線)、具有H310A (*)及H435A (*)突變以妨礙FcRn結合、具有C端G4S (斜體)且具有C端C-myc標籤(加下劃線、斜體)之成熟人類IgG1 FcISAMVRS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLA(*)QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA(*)KGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNAYTQKSLSLSPGGGGGSEQKLISEEDL SEQ ID NO: 27：N端具有人類血清白蛋白信號序列(粗體)、添加有N端ISAMVRS胺基酸殘基(加下劃線)、具有C端G4S連接體(斜體)且具有C端突變型(離胺酸至苯丙胺酸，粗體) C-myc標籤(加下劃線、斜體)之人類IgG1 FcMKWVTFISLLFLFSSAYS ISAMVRS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSEQF LISEEDL SEQ ID NO: 28：添加有N端ISAMVRS胺基酸殘基(加下劃線)、具有C端G4S連接體(斜體)且具有C端突變型(離胺酸至苯丙胺酸，粗體) C-myc標籤(加下劃線、斜體)之成熟人類IgG1 FcISAMVRS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGG GSEQF LISEEDL SEQ ID NO: 29：N端具有人類血清白蛋白信號序列(粗體)、添加有N端ISAMVRS胺基酸殘基(加下劃線)、具有Asn至Ala取代(*)、具有C端G4S連接體(斜體)且具有C端突變型(離胺酸至苯丙胺酸，粗體) C-myc標籤(加下劃線、斜體)之人類IgG1 FcMKWVTFISLLFLFSSAYS ISAMVRS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYA(*)STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGG GS EQF LISEEDL SEQ ID NO: 30：添加有N端MVRS胺基酸殘基(加下劃線)、具有Asn至Ala取代(*)、具有C端G4S連接體(斜體)且具有C端突變型(離胺酸至苯丙胺酸，粗體) C-myc標籤(加下劃線、斜體)之成熟人類IgG1 FcISAMVRS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYA(*)STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGG GSEQF LISEEDL SEQ ID NO: 31：N端具有人類血清白蛋白信號序列(粗體)、具有同種異型G1m(fa) (粗斜體)、具有C端G4S連接體(斜體)且具有C端突變型(離胺酸至苯丙胺酸，粗體) C-myc標籤(加下劃線)之人類IgG1 Fc MKWVTFISLLFLFSSAYS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGS EQFLISEEDL SEQ ID NO: 32：N端具有人類血清白蛋白信號序列(粗體)、具有同種異型G1m(fa) (粗斜體)之人類IgG1 FcMKWVTFISLLFLFSSAYS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 33：具有YTE三重突變(粗體且加下劃線)且添加有N端MVRS胺基酸殘基(加下劃線)之成熟人類IgG1 FcMVRS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL Y I T R E PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 34：N端具有人類血清白蛋白信號序列(粗體)、含有在成熟人類IgG1 Fc之N端構成全鉸鏈區之殘基EPKSS(加下劃線)、具有Cys至Ser取代(#)、具有同種異型G1m(fa) (粗斜體)之人類IgG1 FcMKWVTFISLLFLFSSAYS EPKSS (#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:35：N端具有鼠類IgG信號序列(粗體)、自成熟人類IgG1 Fc之N端移除EPKSSD鉸鏈殘基、具有同種異型G1m(fa) (粗斜體)之人類IgG1 FcMGWSCIILFLVATATGVHS KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:36：具有YTE三重突變(粗體且加下劃線)、自成熟人類IgG1 Fc之N端移除EPKSSD鉸鏈殘基、具有同種異型G1m(fa) (粗斜體)之成熟人類IgG1 Fc KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL Y I T R E PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:37：具有LS雙重突變(粗體且加下劃線)、自成熟人類IgG1 Fc之N端移除EPKSSD鉸鏈殘基、具有同種異型G1m(fa) (粗斜體)之成熟人類IgG1 Fc KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV L HEALH S HYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:38：N端具有人類血清白蛋白信號序列(粗體)、具有YTE三重突變(粗體且加下劃線)、具有同種異型G1m(fa) (粗斜體)、具有C端G4S連接體(斜體)且具有C端C-myc標籤(加下劃線)之成熟人類IgG1 FcMKWVTFISLLFLFSSAYS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL Y I T R E PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGS EQKLISEEDL SEQ ID NO:39：成熟人類Fc IgG1，其中X1 為Met或Tyr，X2 為Ser或Thr，X3 為Thr或Glu，X4 為Asp或Glu，且X5 為Leu或Met，X6 為Met或Leu，且X7 為Asn或Ser DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLX1 IX2 RX3 PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRX4 EX5 TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVX6 HEALHX7 HYTQKSLSLSPG SEQ ID NO:40：成熟人類Fc IgG1，其中X4 為Asp或Glu，且X5 為Leu或Met DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRX4 EX5 TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG SEQ ID NO:41：具有YTE三重突變(粗體且加下劃線)之成熟人類Fc IgG1，且其中X4 為Asp或Glu，且X5 為Leu或Met DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL Y I T R E PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRX4 EX5 TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG SEQ ID NO:42：具有YTE三重突變(粗體且加下劃線)、具有同種異型G1m(fa) (粗斜體)之成熟人類Fc IgG1 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL Y I T R E PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG SEQ ID NO:43：具有YTE三重突變(粗體且加下劃線)、具有同種異型G1m(f) (粗斜體)之成熟人類Fc IgG1 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL Y I T R E PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR E E M TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG SEQ ID NO:44：具有LS雙重突變(粗體且加下劃線)之成熟人類Fc IgG1，且其中X4 為Asp或Glu，且X5 為Leu或Met DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRX4 EX5 TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV L HEALH S HYTQKSLSLSPG SEQ ID NO:45：具有LS雙重突變(粗體且加下劃線)、具有同種異型G1m(fa) (粗斜體)之成熟人類Fc IgG1 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV L HEALH S HYTQKSLSLSPG SEQ ID NO:46：具有LS雙重突變(粗體且加下劃線)、具有同種異型G1m(f) (粗斜體)之成熟人類Fc IgG1 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR E E M TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV L HEALH S HYTQKSLSLSPG SEQ ID NO:47：具有小鼠重鏈MIgGVh信號序列(粗體)、具有Cys至Ser取代(#)之成熟人類Fc IgG1，且其中X1 為Met或Tyr，X2 為Ser或Thr，X3 為Thr或Glu，X4 為Asp或Glu，且X5 為Leu或Met，X6 為Met或Leu，且X7 為Asn或SerMGWSCIILFLVATATGVHS NVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLX1 IX2 RX3 PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRX4 EX5 TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVX6 HEALHX7 HYTQKSLSLSPG SEQ ID NO:48：具有小鼠重鏈MIgGVh信號序列(粗體)、具有Cys至Ser取代(#)、具有同種異型G1m(fa) (粗斜體)之成熟人類IgG1 FcMGWSCIILFLVATATGVHS NVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:49：具有小鼠重鏈MIgGVh信號序列(粗體)、具有Cys至Ser取代(#)、具有同種異型G1m(f) (粗斜體)之成熟人類IgG1 FcMGWSCIILFLVATATGVHS NVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR E E M TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:50：具有小鼠重鏈MIgGVh信號序列(粗體)、具有Cys至Ser取代(#)、具有M428L、N434S突變(粗體/加下劃線)、具有同種異型G1m(fa) (粗斜體)之成熟人類IgG1 FcMGWSCIILFLVATATGVHS NVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV L HEALH S HYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 51：具有小鼠重鏈MIgGVh信號序列(粗體)、具有Cys至Ser取代(#)、具有M428L、N434S突變(粗體/加下劃線)、具有同種異型G1m(f) (粗斜體)之成熟人類IgG1 FcMGWSCIILFLVATATGVHS NVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR E E M TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV L HEALH S HYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:52：具有小鼠重鏈MIgGVh信號序列(粗體)、具有Cys至Ser取代(#)、具有YTE三重突變(粗體且加下劃線)、具有同種異型G1m(fa) (粗斜體)之成熟人類IgG1 FcMGWSCIILFLVATATGVHS NVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL Y I T R E PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:53：具有小鼠重鏈MIgGVh信號序列(粗體)、具有Cys至Ser取代(#)、具有YTE三重突變(粗體且加下劃線)、具有同種異型G1m(f) (粗斜體)之成熟人類IgG1 FcMGWSCIILFLVATATGVHS NVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL Y I T R E PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR E E M TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:54：具有小鼠重鏈MIgGVh信號序列(粗體)、添加有N端ISAMVRS胺基酸殘基(斜體)、具有M428L、N434S突變(粗體/加下劃線)、具有G4S連接體(斜體)且具有C端C-myc-標籤(加下劃線)、具有同種異型G1m(f) (粗斜體)之成熟人類IgG1 FcMGWSCIILFLVATATGVHS ISAMVRS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR E E M TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV L HEALH S HYTQKSLSLSPGGGGGS EQKLISEEDL SEQ ID NO:55：具有小鼠重鏈MIgGVh信號序列(粗體)、添加有N端ISAMVRS胺基酸殘基(斜體)、具有M428L、N434S突變(粗體/加下劃線)、具有G4S連接體(斜體)、具有C端C-myc-標籤(加下劃線)、具有同種異型G1m(fa) (粗斜體)之成熟人類IgG1 FcMGWSCIILFLVATATGVHS ISAMVRS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV L HEALH S HYTQKSLSLSPGGGGGS EQKLISEEDL SEQ ID NO:56：具有小鼠重鏈MIgGVh信號序列(粗體)、添加有N端ISAMVRS胺基酸殘基(斜體)、具有YTE三重突變(粗體/加下劃線)、具有G4S連接體(斜體)且具有C端C-myc-標籤(加下劃線)、具有同種異型G1m(f) (粗斜體)之成熟人類IgG1 FcMGWSCIILFLVATATGVHS ISAMVRS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL Y I T R E PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR E E M TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGS EQKLISEEDL SEQ ID NO:57：具有小鼠重鏈MIgGVh信號序列(粗體)、添加有N端ISAMVRS胺基酸殘基(斜體)、具有YTE三重突變體(粗體/加下劃線)、具有G4S連接體(斜體)、具有C端C-myc-標籤(加下劃線)、具有同種異型G1m(fa) (粗斜體)之成熟人類IgG1 FcMGWSCIILFLVATATGVHS ISAMVRS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL Y I T R E PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGS EQKLISEEDL SEQ ID NO:58：具有小鼠重鏈MIgG1信號序列(粗體)、具有Cys至Ser取代(#)、具有C端G4S (斜體)且具有C端IgA肽(加下劃線)、具有同種異型G1m(fa) (粗斜體)之成熟人類IgG1MGWSCIILFLVATATGVHS EPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGS QRNPRLRLIRRHPTLRIPPI SEQ ID NO:59：具有小鼠重鏈MIgG1信號序列(粗體)、具有Cys至Ser取代(#)、具有M428L、N434S突變(粗體/加下劃線)、具有C端G4S (斜體)且具有C端IgA肽(加下劃線)、具有同種異型G1m(fa) (粗斜體)之成熟人類IgG1MGWSCIILFLVATATGVHS EPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV L HEALH S HYTQKSLSLSPGGGGGS QRNPRLRLIRRHPTLRIPPI SEQ ID NO:60：成熟人類Fc IgG1，Z1 為Cys或Ser，且其中X1 為Met或Tyr，X2 為Ser或Thr，X3 為Thr或Glu，X4 為Asp或Glu，且X5 為Leu或Met，X6 為Met或Leu，且X7 為Asn或Ser NVNHKPSNTKVDKKVEPKSZ1 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLX1 IX2 RX3 PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRX4 EX5 TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVX6 HEALHX7 HYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:61：成熟人類Fc IgG1，Cys至Ser取代(#)，且其中X1 為Met或Tyr，X2 為Ser或Thr，X3 為Thr或Glu，X4 為Asp或Glu，且X5 為Leu或Met，X6 為Met或Leu，且X7 為Asn或Ser NVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLX1 IX2 RX3 PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRX4 EX5 TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVX6 HEALHX7 HYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:62：成熟人類IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)，X4 為Asp或Glu，且X5 為Leu或Met NVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRX4 EX5 TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:63：成熟人類IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)、同種異型G1m(f) (粗斜體) NVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR E E M TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:64：成熟人類IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)、同種異型G1m(fa) (粗斜體) NVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:65：成熟人類IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)、M428L、N434S突變(粗體/加下劃線)、同種異型G1m(fa) (粗斜體) NVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV L HEALH S HYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 66：成熟人類IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)、M428L、N434S突變(粗體/加下劃線)、同種異型G1m(f) (粗斜體) NVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR E E M TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV L HEALH S HYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:67：成熟人類IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)、YTE三重突變(粗體且加下劃線)、同種異型G1m(fa) (粗斜體) NVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL Y I T R E PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:68：成熟人類IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)、YTE三重突變(粗體且加下劃線)、同種異型G1m(f) (粗斜體) NVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL Y I T R E PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR E E M TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:69：成熟人類Fc IgG1，Z1 為Cys或Ser，且其中X1 為Met或Tyr，X2 為Ser或Thr，X3 為Thr或Glu，X4 為Asp或Glu，且X5 為Leu或Met，X6 為Met或Leu，且X7 為Asn或Ser NVNHKPSNTKVDKKVEPKSZ1 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLX1 IX2 RX3 PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRX4 EX5 TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVX6 HEALHX7 HYTQKSLSLSPG SEQ ID NO:70：成熟人類Fc IgG1，Cys至Ser取代(#)，且其中X1 為Met或Tyr，X2 為Ser或Thr，X3 為Thr或Glu，X4 為Asp或Glu，且X5 為Leu或Met，X6 為Met或Leu，且X7 為Asn或Ser NVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLX1 IX2 RX3 PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRX4 EX5 TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVX6 HEALHX7 HYTQKSLSLSPG SEQ ID NO:71：成熟人類IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)，X4 為Asp或Glu，且X5 為Leu或Met NVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRX4 EX5 TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG SEQ ID NO:72：成熟人類IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)、同種異型G1m(f) (粗斜體) NVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR E E M TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG SEQ ID NO:73：成熟人類IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)、同種異型G1m(fa) (粗斜體) NVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG SEQ ID NO:74：成熟人類IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)、M428L、N434S突變(粗體/加下劃線)、同種異型G1m(fa) (粗斜體) NVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV L HEALH S HYTQKSLSLSPG SEQ ID NO: 75：成熟人類IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)、M428L、N434S突變(粗體/加下劃線)、同種異型G1m(f) (粗斜體) NVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR E E M TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV L HEALH S HYTQKSLSLSPG SEQ ID NO:76：成熟人類IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)、YTE三重突變(粗體且加下劃線)、同種異型G1m(fa) (粗斜體) NVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL Y I T R E PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG SEQ ID NO:77：成熟人類IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)、YTE三重突變(粗體且加下劃線)、同種異型G1m(f) (粗斜體) NVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL Y I T R E PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR E E M TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG SEQ ID NO:78：成熟人類Fc IgG1，Z1 為Cys或Ser，且其中X1 為Met或Tyr，X2 為Ser或Thr，X3 為Thr或Glu，X4 為Asp或Glu，且X5 為Leu或Met，X6 為Met或Leu，且X7 為Asn或Ser VNHKPSNTKVDKKVEPKSZ1 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLX1 IX2 RX3 PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRX4 EX5 TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVX6 HEALHX7 HYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:79：成熟人類Fc IgG1，Cys至Ser取代(#)，且其中X1 為Met或Tyr，X2 為Ser或Thr，X3 為Thr或Glu，X4 為Asp或Glu，且X5 為Leu或Met，X6 為Met或Leu，且X7 為Asn或Ser VNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLX1 IX2 RX3 PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRX4 EX5 TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVX6 HEALHX7 HYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:80：成熟人類IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)，X4 為Asp或Glu，且X5 為Leu或Met VNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRX4 EX5 TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:81：成熟人類IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)、同種異型G1m(f) (粗斜體) VNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR E E M TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:82：成熟人類IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)、同種異型G1m(fa) (粗斜體) VNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:83：成熟人類IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)、M428L、N434S突變(粗體/加下劃線)、同種異型G1m(fa) (粗斜體) VNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV L HEALH S HYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 84：成熟人類IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)、M428L、N434S突變(粗體/加下劃線)、同種異型G1m(f) (粗斜體) VNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR E E M TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV L HEALH S HYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:85：成熟人類IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)、YTE三重突變(粗體且加下劃線)、同種異型G1m(fa) (粗斜體) VNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL Y I T R E PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:86：成熟人類IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)、YTE三重突變(粗體且加下劃線)、同種異型G1m(f) (粗斜體) VNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL Y I T R E PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR E E M TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:87：成熟人類Fc IgG1，Z1 為Cys或Ser，且其中X1 為Met或Tyr，X2 為Ser或Thr，X3 為Thr或Glu，X4 為Asp或Glu，且X5 為Leu或Met，X6 為Met或Leu，且X7 為Asn或Ser VNHKPSNTKVDKKVEPKSZ1 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLX1 IX2 RX3 PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRX4 EX5 TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVX6 HEALHX7 HYTQKSLSLSPG SEQ ID NO:88：成熟人類Fc 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NO:91：成熟人類IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)、同種異型G1m(fa) (粗斜體) VNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG SEQ ID NO:92：成熟人類IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)、M428L、N434S突變(粗體/加下劃線)、同種異型G1m(fa) (粗斜體) VNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV L HEALH S HYTQKSLSLSPG SEQ ID NO: 93：成熟人類IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)、M428L、N434S突變(粗體/加下劃線)、同種異型G1m(f) (粗斜體) VNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR E E M TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV L HEALH S HYTQKSLSLSPG SEQ ID NO:94：成熟人類IgG1 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NO:108：成熟人類Fc IgG1，Cys至Ser取代(#)、DHS三重突變(粗體且加下劃線)、同種異型G1m(f) (粗斜體) VNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTV D H H DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR E E M TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH S HYTQKSLSLSPG SEQ ID NO: 109：成熟人類Fc IgG1，Cys至Ser取代(#)，Asn至Ala取代(*)，DHS三重突變(粗體且加下劃線)，其中X7 為Asp或Glu且X8 為Leu或Met NVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYA(*)STYRVVSVLTV D H H DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRX7 EX8 TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH S HYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:110：成熟人類Fc IgG1，Cys至Ser取代(#)、Asn至Ala取代(*)、DHS三重突變(粗體且加下劃線)、同種異型G1m(fa) (粗斜體) NVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYA(*)STYRVVSVLTV D H H DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH S HYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:111：成熟人類Fc IgG1，Cys至Ser取代(#)、Asn至Ala取代(*)、DHS三重突變(粗體且加下劃線)、同種異型G1m(f) (粗斜體) NVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYA(*)STYRVVSVLTV D H H DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR E E M TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH S HYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:112：成熟人類Fc IgG1，Cys至Ser取代(#)、Asn至Ala取代(*)、DHS三重突變(粗體且加下劃線)、同種異型G1m(fa) (粗斜體) VNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYA(*)STYRVVSVLTV D H H DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH S HYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:113：成熟人類Fc IgG1，Cys至Ser取代(#)、Asn至Ala取代(*)、DHS三重突變(粗體且加下劃線)、同種異型G1m(f) (粗斜體) VNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYA(*)STYRVVSVLTV D H H DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR E E M TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH S HYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:114：成熟人類Fc IgG1，Cys至Ser取代(#)、Asn至Ala取代(*)、DHS三重突變(粗體且加下劃線)、同種異型G1m(fa) (粗斜體) NVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYA(*)STYRVVSVLTV D H H DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH S HYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:115：成熟人類Fc IgG1，Cys至Ser取代(#)、Asn至Ala取代(*)、DHS三重突變(粗體且加下劃線)、同種異型G1m(f) (粗斜體) NVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYA(*)STYRVVSVLTV D H H DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR E E M TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH S HYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:116：成熟人類Fc IgG1，Cys至Ser取代(#)、Asn至Ala取代(*)、DHS三重突變(粗體且加下劃線)、同種異型G1m(fa) (粗斜體) VNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYA(*)STYRVVSVLTV D H H DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH S HYTQKSLSLSPG SEQ ID NO:117：成熟人類Fc IgG1，Cys至Ser取代(#)、Asn至Ala取代(*)、DHS三重突變(粗體且加下劃線)、同種異型G1m(f) (粗斜體) VNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYA(*)STYRVVSVLTV D H H DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR E E M TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH S HYTQKSLSLSPG SEQ ID NO: 118：成熟人類Fc IgG1，J1 為Asn或不存在，J2 為Lys或不存在，且其中X4 為Asn或Ala，X5 為Leu或Asp，X6 為Gln或His，X7 為Asp或Glu，且X8 為Leu或Met，且X10 為Asn或SerJ1 VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYX4 STYRVVSVLTVX5 HX6 DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRX7 EX8 TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHX10 HYTQKSLSLSPGJ2 SEQ ID NO: 119：成熟人類Fc IgG1，DHS三重突變(粗體且加下劃線)，J1 為Asn或不存在，J2 為Lys或不存在，且其中X4 為Asn或Ala，X7 為Asp或Glu，且X8 為Leu或MetJ1 VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYX4 STYRVVSVLTV D H H DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRX7 EX8 TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH S HYTQKSLSLSPGJ2 SEQ ID NO: 120：成熟人類Fc IgG1，DHS三重突變(粗體且加下劃線)，其中X4 為Asn或Ala，且X7 為Asp或Glu，且X8 為Leu或Met NVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYX4 STYRVVSVLTV D H H DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRX7 EX8 TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH S HYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 121：成熟人類Fc IgG1，DHS三重突變(粗體且加下劃線)，其中X7 為Asp或Glu且X8 為Leu或Met NVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTV D H H DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRX7 EX8 TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH S HYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:122：成熟人類Fc IgG1，DHS三重突變(粗體且加下劃線)、同種異型G1m(fa) (粗斜體) NVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTV D H H DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH S HYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:123：成熟人類Fc IgG1，DHS三重突變(粗體且加下劃線)、同種異型G1m(f) (粗斜體) NVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTV D H H DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR E E M TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH S HYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:124：成熟人類Fc IgG1，DHS三重突變(粗體且加下劃線)、同種異型G1m(fa) (粗斜體) VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTV D H H DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH S HYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:125：成熟人類Fc IgG1，DHS三重突變(粗體且加下劃線)、同種異型G1m(f) (粗斜體) VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTV D H H DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR E E M TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH S HYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:126：成熟人類Fc IgG1，DHS三重突變(粗體且加下劃線)、同種異型G1m(fa) (粗斜體) NVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTV D H H DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH S HYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:127：成熟人類Fc IgG1，DHS三重突變(粗體且加下劃線)、同種異型G1m(f) (粗斜體) NVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTV D H H DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR E E M TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH S HYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:128：成熟人類Fc IgG1，DHS三重突變(粗體且加下劃線)、同種異型G1m(fa) (粗斜體) VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTV D H H DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH S HYTQKSLSLSPG SEQ ID NO:129：成熟人類Fc IgG1，DHS三重突變(粗體且加下劃線)、同種異型G1m(f) (粗斜體) VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTV D H H DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR E E M TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH S HYTQKSLSLSPG SEQ ID NO: 130：成熟人類Fc IgG1，Asn至Ala取代(*)，DHS三重突變(粗體且加下劃線)，其中X7 為Asp或Glu且X8 為Leu或Met NVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYA(*)STYRVVSVLTV D H H DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRX7 EX8 TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH S HYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:131：成熟人類Fc IgG1，Asn至Ala取代(*)、DHS三重突變(粗體且加下劃線)、同種異型G1m(fa) (粗斜體) NVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYA(*)STYRVVSVLTV D H H DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH S HYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:132：成熟人類Fc IgG1，Asn至Ala取代(*)、DHS三重突變(粗體且加下劃線)、同種異型G1m(f) (粗斜體) NVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYA(*)STYRVVSVLTV D H H DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR E E M TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH S HYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:133：成熟人類Fc IgG1，Asn至Ala取代(*)、DHS三重突變(粗體且加下劃線)、同種異型G1m(fa) (粗斜體) VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYA(*)STYRVVSVLTV D H H DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH S HYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:134：成熟人類Fc IgG1，Asn至Ala取代(*)、DHS三重突變(粗體且加下劃線)、同種異型G1m(f) (粗斜體) VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYA(*)STYRVVSVLTV D H H DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR E E M TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH S HYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:135：成熟人類Fc IgG1，Asn至Ala取代(*)、DHS三重突變(粗體且加下劃線)、同種異型G1m(fa) (粗斜體) NVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYA(*)STYRVVSVLTV D H H DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH S HYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:136：成熟人類Fc IgG1，Asn至Ala取代(*)、DHS三重突變(粗體且加下劃線)、同種異型G1m(f) (粗斜體) NVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYA(*)STYRVVSVLTV D H H DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR E E M TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH S HYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:137：成熟人類Fc IgG1，Asn至Ala取代(*)、DHS三重突變(粗體且加下劃線)、同種異型G1m(fa) (粗斜體) VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYA(*)STYRVVSVLTV D H H DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH S HYTQKSLSLSPG SEQ ID NO:138：成熟人類Fc IgG1，Asn至Ala取代(*)、DHS三重突變(粗體且加下劃線)、同種異型G1m(f) (粗斜體) VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYA(*)STYRVVSVLTV D H H DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR E E M TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH S HYTQKSLSLSPG
如本文所定義，Fc域包括藉由CH 3抗體恆定域之間的相互作用二聚化之兩種Fc域單體，以及在兩種二聚化Fc域單體之鉸鏈域之間形成的一或多個二硫鍵。Fc域形成結合於Fc受體，例如Fc-γ受體(亦即，Fcγ受體(FcγR))、Fc-α受體(亦即，Fcα受體(FcαR))、Fc-ε受體(亦即，Fcε受體(FcεR))及/或新生兒Fc受體(FcRn)之最小結構。在一些實施例中，本發明之Fc域結合於Fcγ受體(例如，FcRn、FcγRI (CD64)、FcγRIIa (CD32)、FcγRIIb (CD32)、FcγRIIIa (CD16a)、FcγRIIIb (CD16b))及/或FcγRIV及/或新生兒Fc受體(FcRn)。
在一些實施例中，本發明之Fc域單體或Fc域為無糖基化Fc域單體或Fc域(例如，維持銜接於Fc受體(例如，FcRn)之Fc域單體或及Fc域。例如，該Fc域係維持銜接於Fc受體之無糖基化IgG1變異體(例如，在糖基化基序之N297及/或T299處具有胺基酸取代之IgG1)。例示性無糖基化Fc域及用於製備無糖基化Fc域之方法為此項技術中已知的，例如，如描述於Sazinsky S.L.等人, Aglycosylated immunoglobulin G1 variants productively engage activating Fc receptors, PNAS, 2008, 105(51):20167-20172中，該文獻整體併入本文中。
在一些實施例中，本發明之Fc域或Fc域單體經工程改造以增強與新生兒Fc受體(FcRn)之結合。例如，該Fc域可包括對應於M252Y/S254T/T256E (YTE)之三重突變(例如IgG1，諸如具有YTE突變之人類或人類化IgG1，例如SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:56或SEQ ID NO:57)。該Fc域可包括對應於M428L/N434S (LS)之雙重突變體(例如IgG1，諸如具有LS突變之人類或人類化IgG1，諸如SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:59)。該Fc域可包括對應於N434H之單一突變體(例如IgG1，諸如具有N434H突變之人類或人類化IgG1)。該Fc域可包括對應於C220S之單一突變體(例如IgG1，諸如具有C220S突變之人類或人類化IgG1，諸如SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 92、SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 94及SEQ ID NO: 95)。Fc域可包括對應於C220S/L309D/Q311H/N434S(CDHS)之四重突變體(例如IgG1，例如具有DHS突變之人類或人類化IgG1，例如SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：116及SEQ ID NO：117)。Fc域可包括對應於L309D/Q311H/N434S(DHS)之三重突變體(例如IgG1，例如具有DHS突變之人類或人類化IgG1，例如SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO： 136、SEQ ID NO：137及SEQ ID NO：138)。該Fc域可包括增強與FcRn之結合之上述突變中的一或多者之組合。增強之與FcRn之結合可增加含Fc域之結合物的半衰期。例如，相對於具有不含增強FcRn結合之突變之相應Fc域的結合物，增加結合於FcRn之一或多種胺基酸突變(例如，YTE突變、LS突變或N434H突變)之併入可增加該結合物的半衰期達5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%或更高。具有增強之與FcRN之結合的例示性Fc域及用於製備具有增強之與FcRN之結合的Fc域之方法為此項技術中已知的，例如，如描述於Maeda, A.等人, Identification of human IgG1 variant with enhanced FcRn binding and without increased binding to rheumatoid factor autoantibody, MABS, 2017, 9(5):844-853中，該文獻整體併入本文中。如本文所用，應理解「對應於」(例如，特定SEQ ID NO.之)特定胺基酸殘基之胺基酸包括熟習此項技術者將理解與(例如，該特定序列之)該特定殘基比對的任何胺基酸殘基。例如，SEQ ID NO: 1-138中任一者可藉由使該胺基酸序列之「相應殘基」突變而發生突變以包括YTE突變、LS突變及/或N434H突變。
如本文所用，應理解「對應於」特定SEQ ID NO.之特定半胱胺酸殘基之硫原子包括熟習此項技術者將理解與該特定序列之特定半胱胺酸比對的任何半胱胺酸殘基之硫原子。下文提供人類IgG1 (UniProtKB: P01857；SEQ ID NO: 142)、人類IgG2 (UniProtKB: P01859；SEQ ID NO: 143)、人類IgG3 (UniProtKB: P01860；SEQ ID NO: 144)及人類IgG4 (UniProtKB: P01861；SEQ ID NO: 145)之蛋白質序列比對(用Clustal Omega Multiple Pairwise Alignment比對)。該比對指示彼此「對應」之半胱胺酸殘基(例如，半胱胺酸殘基之硫原子) (在盒中且由•符號指示)。熟習此項技術者將能夠容易地執行與本發明之任何IgG變異體的該種比對以確定半胱胺酸中對應於本文所述之特定SEQ ID NO. (例如，SEQ ID NO: 1-138中任一者)之特定半胱胺酸的任何硫原子之硫原子。例如，熟習此項技術者將能夠容易地確定SEQ ID NO: 10之Cys10 (該Fc域之鉸鏈區之保守CPPC基序的第一個半胱胺酸)對應於例如IgG1之Cys109、IgG2之Cys106、IgG3之Cys156、SEQ ID NO: 1之Cys29、SEQ ID NO: 2之Cys9、SEQ ID NO: 3之Cys30或SEQ ID NO: 10之Cys10。
在一些實施例中，本發明之Fc域或Fc域單體具有SEQ ID NO: 39-138中任一者之序列，可進一步包括N端處之額外胺基酸(Xaa)x及/或C端處之額外胺基酸(Xaa)z，其中Xaa為任何胺基酸且x及z為大於或等於零之整數，一般地小於100，較佳地小於10且更佳地為0、1、2、3、4或5。在一些實施例中，該等額外胺基酸與SEQ ID NO: 81之一或多個連續胺基酸至少70% (例如，70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致。例如，該等額外胺基酸可為C端處對應於IgG1 (SEQ ID NO: 119)之Lys330之單一胺基酸。
如本文所用，應理解「對應於」特定SEQ ID NO.之特定離胺酸殘基之氮原子包括熟習此項技術者將理解與該特定序列之特定離胺酸比對的任何離胺酸殘基之氮原子。下文提供人類IgG1 (UniProtKB: P01857；SEQ ID NO: 142)、人類IgG2 (UniProtKB: P01859；SEQ ID NO: 143)、人類IgG3 (UniProtKB: P01860；SEQ ID NO: 144)及人類IgG4 (UniProtKB: P01861；SEQ ID NO: 145)之蛋白質序列比對(用Clustal Omega Multiple Pairwise Alignment比對)。該比對指示彼此「對應」之離胺酸殘基(例如，離胺酸殘基之氮原子) (在盒中且由*符號指示)。熟習此項技術者將能夠容易地執行與本發明之任何IgG變異體的該種比對以確定離胺酸中對應於本文所述之特定SEQ ID NO. (例如，SEQ ID NO: 1-138中任一者)之特定離胺酸的任何氮原子之氮原子。例如，熟習此項技術者將能夠容易地確定SEQ ID NO: 10之Lys35對應於例如IgG1之Lys129、IgG2之Lys126、IgG3之Lys176、SEQ ID NO: 1之Lys51、SEQ ID NO: 2之Lys31、SEQ ID NO: 3之Lys50或SEQ ID NO: 10之Lys30。IgG1 (SEQ ID NO: 142) 、 IgG2 (SEQ ID NO: 143) 、 IgG3 (SEQ ID NO: 144) 及 IgG4 (SEQ ID NO: 145) 之蛋白質序列比對
Figure 02_image1317
免疫細胞活化
Fc-γ受體(FcγR)結合免疫球蛋白G (IgG)之Fc部分且在免疫活化及調節中發揮重要作用。例如，免疫複合物(IC)中之IgG Fc域以高親合力銜接FcγR，因此觸發調節免疫細胞活化之信號傳導級聯。人類FcγR家族含有數種活化受體(FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIc、FcγRIIIa及FcγRIIIb)及一種抑制受體(FcγRIIb)。FcγR信號傳導藉由細胞內域介導，該等細胞內域含有用於活化FcγR之免疫酪胺酸活化基序(ITAM)及用於抑制受體FcγRIIb之免疫酪胺酸抑制基序(ITIM)。在一些實施例中，Fc域與FcγR之結合使Src家族激酶進行ITAM磷酸化；此活化Syk家族激酶且誘導包括PI3K及Ras路徑之下游信號傳導網路。
在本文所述之結合物中，結合物中包括神經胺糖酸酶抑制劑之單體或二聚體的部分結合於且抑制病毒神經胺糖酸酶，導致抑制病毒複製，而該等結合物之Fc域部分結合於免疫細胞上之FcγR (例如，FcRn、FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIc、FcγRIIIa及FcγRIIIb)且活化吞噬作用及效應子功能，諸如抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)，因此由免疫細胞吞沒及破壞病毒粒子且進一步增強該等結合物之抗病毒活性。可藉由本文所述之結合物活化的免疫細胞之實例包括但不限於巨噬細胞、嗜中性粒細胞、嗜曙紅細胞、嗜鹼細胞、淋巴細胞、濾泡性樹突狀細胞、天然殺手細胞及肥大細胞。組織分佈
治療劑進全身循環後，就會分佈至人體之組織中。由於血液灌注、組織結合、局部pH及細胞膜通透性之不同，分佈通常不均勻。藥物進入組織之速率取決於流向組織之血流速率、組織質量以及血液與組織之間之分配特性。在血管豐富之區域，血液及組織之間之分佈平衡(當進入及離開之速率相同時)會更快地達到，除非跨細胞膜之擴散係速率限制步驟。大小、形狀、電荷、靶標結合、FcRn及靶標結合機制、投與途徑及製劑影響組織分佈。
在一些情況下，本文所述之結合物可以經最佳化以分佈至肺組織。在一些情況下，結合物在投與後2小時內在上皮襯裡液中之分佈濃度比係結合物在血漿中之濃度之至少30%。在某些實施例中，投與後2小時內濃度比為至少45%。在一些實施例中，投與後2小時內濃度比為至少55%。特別地，投與後2小時內濃度比為至少60%。如實例190及圖98所示，截至注射後2小時，具有Fc域(SEQ ID NO：73)之結合物ELF水準驚奇地係在剩下時間過程中藉由AUC量測之血漿暴露水準之約60%，表明結合物幾乎立即自血漿分配至肺部ELF。此表明含Fc之結合物快速分佈至肺，並且相對於血漿中之水準維持肺中之高濃度。IV. 白蛋白及白蛋白結合肽 白蛋白
本發明之白蛋白可為天然存在之白蛋白或其變異體，諸如天然存在之白蛋白的經工程改造變異體。變異體包括多態性、諸如域及子域之片段及融合蛋白。白蛋白可包括自任何來源獲得之白蛋白之序列。較佳地，該來源為哺乳動物，諸如人類或牛。最佳地，該白蛋白為人類血清白蛋白(HSA)或其變異體。人類血清白蛋白包括具有天然存在於人類中之胺基酸序列之任何白蛋白及其變異體。白蛋白編碼序列可藉由熟習此項技術者已知用於分離對應於人類基因之cDNA且對該cDNA進行測序之方法獲得。本發明之白蛋白可包括以SEQ ID NO: 139或SEQ ID NO: 140提供的人類血清白蛋白(HSA)之胺基酸序列，或以SEQ ID NO: 141提供的小鼠血清白蛋白(MSA)之胺基酸序列，或其變異體或片段，較佳地其功能變異體或片段。片段或變異體可或可不為功能性的，或可在某種程度上保持白蛋白之功能。例如，片段或變異體可保持與白蛋白受體(諸如HSA或MSA)結合之能力，達親本白蛋白(例如，產生該片段或變異體之親本白蛋白)之該能力的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或105%。相對結合能力可藉由此項技術中已知之方法，諸如藉由表面電漿共振來測定。
該白蛋白可為白蛋白之天然存在之多態變異體，諸如人類血清白蛋白。一般而言，人類血清白蛋白之變異體或片段將具有人類血清白蛋白或小鼠血清白蛋白之配位體結合活性的至少5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%或70%，且較佳地80%、90%、95%、100%或105%或更高。
該白蛋白可包括牛血清白蛋白之胺基酸序列。牛血清白蛋白包括具有天然存在於牛中之胺基酸序列之任何白蛋白，例如，如藉由Swissprot寄存編號P02769所述，及如本文所定義的其變異體。牛血清白蛋白亦包括如本文所定義之全長牛血清白蛋白或其變異體之片段。
該白蛋白可包含源於犬(例如，Swissprot寄存編號P49822-1)、豬(例如，Swissprot寄存編號P08835-1)、山羊(例如，Sigma產品編號A2514或A4164)、貓(例如，Swissprot寄存編號P49064-1)、雞(例如，Swissprot寄存編號P19121-1)、卵白蛋白(例如，雞卵白蛋白) (例如，Swissprot寄存編號P01012-1)、火雞卵白蛋白(例如，Swissprot寄存編號O73860-1)、驢(例如，Swissprot寄存編號Q5XLE4-1)、豚鼠(例如，Swissprot寄存編號Q6WDN9-1)、倉鼠(例如，如描述於DeMarco等人 International Journal for Parasitology 37(11): 1201-1208 (2007)中)、馬(例如，Swissprot寄存編號P35747-1)、恆河猴(例如，Swissprot寄存編號Q28522-1)、小鼠(例如，Swissprot寄存編號P07724-1)、鴿子(例如，如由Khan等人 Int. J. Biol. Macromol. 30(3-4),171-8 (2002)所定義)、兔(例如，Swissprot寄存編號P49065-1)、大鼠(例如，Swissprot寄存編號P02770-1)或綿羊(例如，Swissprot寄存編號P14639-1)之血清白蛋白之一的白蛋白之序列，且包括如本文所定義之其變異體及片段。
熟習此項技術者已知白蛋白之多種天然存在之突變體形式。白蛋白之天然存在之突變體形式描述於例如Peters等人All About Albumin: Biochemistry, Genetics and Medical Applications , Academic Press, Inc., San Diego, Calif., 第170-181頁(1996)中。本發明之白蛋白包括天然存在之白蛋白的變異體。變異型白蛋白係指具有至少一種胺基酸突變，諸如藉由插入、缺失或取代產生之胺基酸突變(保守或非保守)的白蛋白，其限制條件在於該等改變產生尚未顯著改變至少一種基礎特性(例如，尚未改變超過5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%或40%)之白蛋白。可定義白蛋白之活性的例示性特性包括結合活性(例如，包括對膽紅素或諸如長鏈脂肪酸之脂肪酸的結合特異性或親和力)、容積滲透濃度或在特定pH範圍內之行為。
典型地，白蛋白變異體將與天然存在之白蛋白(諸如SEQ ID NO: 139-141中任一者之白蛋白)具有至少40%、至少50%、至少60%且較佳地至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%胺基酸序列一致性。
用於產生及純化重組人類白蛋白之方法為充分確立的(Sleep等人. Biotechnology, 8(1):42-6 (1990))，且包括用於醫藥應用之重組人類白蛋白的產生(Bosse等人 J Clin Pharmacol 45(1):57-67 (2005))。HSA之三維結構已藉由X射線結晶學(Carter等人 Science. 244(4909): 1195-8(1998))；Sugio等人 Protein Eng. 12(6):439-46 (1999))闡明。HSA多肽鏈具有35個半胱胺酸殘基，該等殘基形成17個二硫鍵；及在成熟蛋白質之位置34處的一個未配對(例如，遊離)半胱胺酸。HSA之Cys-34已用於使分子結合於白蛋白(Leger等人Bioorg Med Chem Lett 14(17):4395-8 (2004)；Thibaudeau等人Bioconjug Chem 16(4):1000-8 (2005))，且提供用於位點特異性結合之位點。 SEQ ID NO:139 (人類血清白蛋白(HSA)，變異體1) DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL SEQ ID NO:140 (人類血清白蛋白(HSA)，變異體2) RGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL SEQ ID NO:141 (小鼠血清白蛋白(MSA)) RGVFRREAHKSEIAHRYNDLGEQHFKGLVLIAFSQYLQKCSYDEHAKLVQEVTDFAKTCVADESAANCDKSLHTLFGDKLCAIPNLRENYGELADCCTKQEPERNECFLQHKDDNPSLPPFERPEAEAMCTSFKENPTTFMGHYLHEVARRHPYFYAPELLYYAEQYNEILTQCCAEADKESCLTPKLDGVKEKALVSSVRQRMKCSSMQKFGERAFKAWAVARLSQTFPNADFAEITKLATDLTKVNKECCHGDLLECADDRAELAKYMCENQATISSKLQTCCDKPLLKKAHCLSEVEHDTMPADLPAIAADFVEDQEVCKNYAEAKDVFLGTFLYEYSRRHPDYSVSLLLRLAKKYEATLEKCCAEANPPACYGTVLAEFQPLVEEPKNLVKTNCDLYEKLGEYGFQNAILVRYTQKAPQVSTPTLVEAARNLGRVGTKCCTLPEDQRLPCVEDYLSAILNRVCLLHEKTPVSEHVTKCCSGSLVERRPCFSALTVDETYVPKEFKAETFTFHSDICTLPEKEKQIKKQTALAELVKHKPKATAEQLKTVMDDFAQFLDTCCKAADKDTCFSTEGPNLVTRCKDALA白蛋白之結合
本發明之白蛋白可結合於(例如，藉助於共價鍵)任何本發明化合物(例如，藉助於神經胺糖酸酶抑制劑單體或二聚體之連接體部分)。該白蛋白可藉由熟習此項技術者熟知用於產生小分子-蛋白結合物之任何方法結合於任何本發明化合物。此可包括共價結合於溶劑暴露胺基酸，諸如溶劑暴露半胱胺酸或離胺酸。例如，人類血清白蛋白可藉由共價連接於對應於SEQ ID NO: 139之Cys34或SEQ ID NO: 140之Cys40的硫原子而結合於本發明化合物。
本發明之白蛋白可藉助於位於該白蛋白之C末端或N末端的10個胺基酸殘基內之胺基酸結合於任何本發明化合物。白蛋白可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20個或20個以上胺基酸之C端或N端多肽融合。該C端或N端多肽融合可包括一或多個溶劑暴露半胱胺酸或離胺酸殘基，該等殘基可用於共價結合本發明化合物(例如，結合於神經胺糖酸酶抑制劑單體或二聚體，包括藉助於連接體)。
本發明之白蛋白包括已經工程改造以包括一或多個溶劑暴露半胱胺酸或離胺酸殘基之任何白蛋白，其可提供用於結合於本發明化合物(例如，結合於神經胺糖酸酶抑制劑單體或二聚體，包括藉助於連接體)之位點。最佳地，該白蛋白將含有單一溶劑暴露半胱胺酸或離胺酸，因此使得本發明化合物能夠位點特異性結合。
用於產生包括一或多個結合勝任半胱胺酸殘基之經工程改造白蛋白變異體之例示性方法提供於美國專利申請案第2017/0081389號中，該案以引用之方式整體併入本文中。簡言之，較佳白蛋白變異體係包含單一、溶劑暴露、未配對(例如，遊離)半胱胺酸殘基，因此使得連接體能夠位點特異性結合於該半胱胺酸殘基之彼等變異體。
已經工程改造以使得能夠化學結合於溶劑暴露、未配對半胱胺酸殘基之白蛋白包括以下白蛋白變異體： (a) 在對應於SEQ ID NO: 139之L585、D1、A2、D562、A364、A504、E505、T79、E86、D129、D549、A581、D121、E82、S270、Q397及A578中任一者的胺基酸殘基處由半胱胺酸取代非半胱胺酸胺基酸殘基之白蛋白； (b) 在鄰近對應於SEQ ID NO: 139之L585、D1、A2、D562、A364、A504、E505、T79、E86、D129、D549、A581、D121、E82、S270、Q397及A578中任一者的胺基酸殘基之N端或C端側的位置處具有半胱胺酸插入之白蛋白； (c) 如下白蛋白，其經工程改造以在對應於SEQ ID NO: 96之C369、C361、C91、C177、C567、C316、C75、C169、C124或C558中任一者的殘基處具有含遊離硫醇基之未配對半胱胺酸，且其可或可不藉由對應於SEQ ID NO: 139之C360、C316、C75、C168、C558、C361、C91、C124、C169或C567的殘基之缺失或取代產生；及/或 (d) 添加半胱胺酸至白蛋白之N端或C端。
在本發明之一些實施例中，(a)、(b)、(c)及/或(d)之取代、缺失、添加或插入事件的淨結果係該多肽序列之結合勝任半胱胺酸殘基之數目相對於親本白蛋白序列有所增加。在本發明之一些實施例中，(a)、(b)、(c)及/或(d)之取代、缺失、添加或插入事件的淨結果係該多肽序列之結合勝任半胱胺酸殘基之數目為1，因此使得能夠位點特異性結合。
較佳白蛋白變異體亦包括具有單一溶劑暴露離胺酸殘基，因此使得連接體能夠位點特異性結合於該離胺酸殘基之白蛋白。該等變異體可藉由工程改造白蛋白，包括任何前述方法(例如，插入、缺失、取代或C端或N端融合)來產生。白蛋白結合肽
生物活性化合物與白蛋白結合肽之結合可改變該生物活性化合物之藥效，包括組織攝取、滲透及擴散的改變。在一較佳實施例中，如與單獨本發明化合物(例如，神經胺糖酸酶抑制劑單體或二聚體，藉助於連接體)相比，白蛋白結合肽與該化合物之結合會增加該化合物之功效或減少毒性。
本發明之白蛋白結合肽包括具有5至50個(例如，5至40個、5至30個、5至20個、5至15個、5至10個、10至50個、10至30個或10至20個)胺基酸殘基之胺基酸序列之任何多肽，其對白蛋白(諸如本文所述之任何白蛋白)具有親和力且具有結合該白蛋白之功能。較佳地，白蛋白結合肽結合於天然存在之血清白蛋白，最佳地人類血清白蛋白。白蛋白結合肽可具有不同起源，例如合成、人類、小鼠或大鼠。本發明之白蛋白結合肽包括已經工程改造以包括一或多個(例如，兩個、三個、四個或五個)溶劑暴露半胱胺酸或離胺酸殘基之白蛋白結合肽，其可提供用於結合於本發明化合物(例如，結合於神經胺糖酸酶抑制劑單體或二聚體，包括藉助於連接體)之位點。最佳地，該白蛋白結合肽將含有單一溶劑暴露半胱胺酸或離胺酸，因此使得本發明化合物能夠位點特異性結合。白蛋白結合肽可僅包括天然存在之胺基酸殘基，或可包括一或多個非天然存在之胺基酸殘基。在包括時，非天然存在之胺基酸殘基(例如，非天然存在之胺基酸殘基的側鏈)可用作用於本發明化合物(例如，神經胺糖酸酶抑制劑單體或二聚體，包括藉助於連接體)之附接點。本發明之白蛋白結合肽可為直鏈或環狀的。本發明之白蛋白結合肽包括熟習此項技術者已知之任何白蛋白結合肽，其實例提供於本文中。
白蛋白結合肽及包括白蛋白結合肽之結合物較佳地以如下親和力結合白蛋白(例如，人類血清白蛋白)，該親和力之特徵在於小於約100 μM，較佳地小於約100 nM，且最佳地不會實質上結合其他血漿蛋白質之解離常數Kd。該等化合物之特定實例為直鏈或環狀肽，其長度較佳地在約10個與20個胺基酸殘基之間，視情況在N端或C端或該兩處經修飾。
白蛋白結合肽包括包含以下通式之直鏈及環狀肽，其中Xaa為任何胺基酸： SEQ ID NO:148 Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Phe-Cys-Xaa-Asp-Trp-Pro-Xaa-Xaa-Xaa-Ser-Cys SEQ ID NO:149 Val-Cys-Tyr-Xaa-Xaa-Xaa-Ile-Cys-Phe SEQ ID NO:150 Cys-Tyr-Xaa-Pro-Gly-Xaa-Cys SEQ ID NO:151 Asp-Xaa-Cys-Leu-Pro-Xaa-Trp-Gly-Cys-Leu-Trp SEQ ID NO:152 Trp-Cys-Asp-Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Ala-Xaa-Asp-Leu-Cys SEQ ID NO:153 Asp-Leu-Val-Xaa-Leu-Gly-Leu-Glu-Cys-Trp
本發明之白蛋白結合肽進一步包括以下肽序列中任一者，其可為直鏈或環狀：
SEQ ID NO:154 DLCLRDWGCLW
SEQ ID NO:155 DICLPRWGCLW
SEQ ID NO:156 MEDICLPRWGCLWGD
SEQ ID NO:157 QRLMEDICLPRWGCLWEDDE
SEQ ID NO:158 QGLIGDICLPRWGCLWGRSV
SEQ ID NO:159 QGLIGDICLPRWGCLWGRSVK
SEQ ID NO:160 EDICLPRWGCLWEDD
SEQ ID NO:161 RLMEDICLPRWGCLWEDD
SEQ ID NO:162 MEDICLPRWGCLWEDD
SEQ ID NO:163 MEDICLPRWGCLWED
SEQ ID NO:164 RLMEDICLARWGCLWEDD
SEQ ID NO:165 EVRSFCTRWPAEKSCKPLRG
SEQ ID NO:166 RAPESFVCYWETICFERSEQ
SEQ ID NO:167 EMCYFPGICWM
SEQ ID NO: 154-167之白蛋白結合肽可進一步包括N端處之額外胺基酸(Xaa)x及/或C端處之額外胺基酸(Xaa)z，其中Xaa為任何胺基酸且x及z為大於或等於零之整數，一般地小於100，較佳地小於10且更佳地為0、1、2、3、4或5。
進一步例示性白蛋白結合肽提供於美國專利申請案第2005/0287153號中，該美國專利申請案以引用之方式整體併入本文中。白蛋白結合肽之結合
本發明之白蛋白結合肽可結合於(例如，藉助於共價鍵)任何本發明化合物(例如，藉助於神經胺糖酸酶抑制劑單體或二聚體之連接體部分)。該白蛋白結合肽可藉由熟習此項技術者已知用於產生肽-小分子結合物之任何方法結合於任何本發明化合物。此可包括共價結合於胺基酸殘基(諸如半胱胺酸、離胺酸或非天然胺基酸)之側鏈基團。或者，共價結合可出現於C端(例如，結合於C端羧酸，或結合於C端殘基之側鏈基團)或N端(例如，結合於N端胺基，或結合於N端胺基酸之側鏈基團)。V. 連接體
連接體係指本文所述之結合物中的兩種或兩種以上組分之間(例如，本文所述之結合物中的兩種神經胺糖酸酶抑制劑之間、本文所述之結合物中的神經胺糖酸酶抑制劑與Fc域或白蛋白之間及本文所述之結合物中的兩種神經胺糖酸酶抑制劑之二聚體與Fc域或白蛋白之間)的連接。具有共價連接於神經胺糖酸酶抑制劑之二聚體之 Fc 域或白蛋白的結合物中之連接體
在如本文所述之含有共價連接於神經胺糖酸酶抑制劑之一或多種二聚體的Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽之結合物中，該結合物中之連接體(例如，L或L’)可為分支鏈結構。如本文進一步描述，本文所述之結合物中的連接體(例如，L或L’)可為多價結構，例如分別具有兩個或三個臂之二價或三價結構。在一些實施例中，當該連接體具有三個臂時，該等臂中之兩者可附接於第一及第二神經胺糖酸酶抑制劑且第三個臂可附接於Fc域單體及Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽。在一些實施例中，當該連接體具有兩個臂時，一個臂可附接於Fc域或白蛋白且另一臂可附接於兩種神經胺糖酸酶抑制劑之一。在其他實施例中，具有兩個臂之連接體可用於附接含有共價連接於神經胺糖酸酶抑制劑之一或多種二聚體的Fc域或白蛋白之結合物上的兩種神經胺糖酸酶抑制劑。
在一些實施例中，具有共價連接於神經胺糖酸酶抑制劑之一或多種二聚體的Fc域或白蛋白之結合物中之連接體係由式(D-L-I)描述：
Figure 02_image423
(L-I) 其中LA 由式GA1 -(ZA1 )g1 -(YA1 )h1 -(ZA2 )i1 -(YA2 )j1 -(ZA3 )k1 -(YA3 )l1 -(ZA4 )m1 -(YA4 )n1 -(ZA5 )o1 -GA2 描述；LB 由式GB1 -(ZB1 )g2 -(YB1 )h2 -(ZB2 )i2 -(YB2 )j2 -(ZB3 )k2 -(YB3 )l2 -(ZB4 )m2 -(YB4 )n2 -(ZB5 )o2 -GB2 描述；LC 由式GC1 -(ZC1 )g3 -(YC1 )h3 -(ZC2 )i3 -(YC2 )j3 -(ZC3 )k3 -(YC3 )l3 -(ZC4 )m3 -(YC4 )n3 -(ZC5 )o3 -GC2 描述；GA1 係附接至式(D-L-I)中的Q之鍵；GA2 係附接至第一神經胺糖酸酶抑制劑(例如，A1 )之鍵；GB1 係附接至式(D-L-I)中的Q之鍵；GB2 係附接至第二神經胺糖酸酶抑制劑(例如，A2 )之鍵；GC1 係附接至式(D-L-I)中的Q之鍵；GC2 係附接至Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽之鍵或能夠與結合於Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽之官能基反應的官能基(例如，順丁烯二醯亞胺及半胱胺酸、胺及經活化羧酸、硫醇及順丁烯二醯亞胺、經活化磺酸及胺、異氰酸酯及胺、疊氮化物及炔以及烯烴及四嗪)；ZA1 、ZA2 、ZA3 、ZA4 、ZA5 、ZB1 、ZB2 、ZB3 、ZB4 、ZB5 、ZC1 、ZC2 、ZC3 、ZC4 及ZC5 各自獨立地為視情況經取代C1-C20伸烷基、視情況經取代C1-C20伸雜烷基、視情況經取代C2-C20伸烯基、視情況經取代C2-C20伸雜烯基、視情況經取代C2-C20伸炔基、視情況經取代C2-C20伸雜炔基、視情況經取代C3-C20伸環烷基、視情況經取代C3-C20伸雜環烷基、視情況經取代C4-C20伸環烯基、視情況經取代C4-C20伸雜環烯基、視情況經取代C8-C20伸環炔基、視情況經取代C8-C20伸雜環炔基、視情況經取代C5-C15伸芳基或視情況經取代C2-C15伸雜芳基；YA1 、YA2 、YA3 、YA4 、YB1 、YB2 、YB3 、YB4 、YC1 、YC2 、YC3 及YC4 各自獨立地為O、S、NRi 、P、羰基、硫羰基、磺醯基、磷酸酯基、磷醯基或亞胺基；Ri 為H、視情況經取代C1-C20烷基、視情況經取代C1-C20雜烷基、視情況經取代C2-C20烯基、視情況經取代C2-C20雜烯基、視情況經取代C2-C20炔基、視情況經取代C2-C20雜炔基、視情況經取代C3-C20環烷基、視情況經取代C3-C20雜環烷基、視情況經取代C4-C20環烯基、視情況經取代C4-C20雜環烯基、視情況經取代C8-C20環炔基、視情況經取代C8-C20雜環炔基、視情況經取代C5-C15芳基或視情況經取代C2-C15雜芳基；g1、h1、i1、j1、k1、l1、m1、n1、o1、g2、h2、i2、j2、k2、l2、m2、n2、o2、g3、h3、i3、j3、k3、l3、m3、n3及o3各自獨立地為0或1；Q為氮原子、視情況經取代C1-C20伸烷基、視情況經取代C1-C20伸雜烷基、視情況經取代C2-C20伸烯基、視情況經取代C2-C20伸雜烯基、視情況經取代C2-C20伸炔基、視情況經取代C2-C20伸雜炔基、視情況經取代C3-C20伸環烷基、視情況經取代C3-C20伸雜環烷基、視情況經取代C4-C20伸環烯基、視情況經取代C4-C20伸雜環烯基、視情況經取代C8-C20伸環炔基、視情況經取代C8-C20伸雜環炔基、視情況經取代C5-C15伸芳基或視情況經取代C2-C15伸雜芳基。
在一些實施例中，LC 可具有兩個附接至Fc域之點(例如，兩個GC2 )。在一些實施例中，L包括聚乙二醇(PEG)連接體。PEG連接體包括具有重複單元結構(-CH2 CH2 O-)n 之連接體，其中n為2至100之整數。聚乙二醇連接體可共價接合神經胺糖酸酶抑制劑及E (例如，在式(M-I)-(M-XI)中任一者之結合物中)。聚乙二醇連接體可共價接合第一神經胺糖酸酶抑制劑及第二神經胺糖酸酶抑制劑(例如，在式(D-I)-(D-XI)中任一者之結合物中)。聚乙二醇連接體可共價接合神經胺糖酸酶抑制劑二聚體及E (例如，在式(D-I)-(D-XI)中任一者之結合物中)。聚乙二醇連接體可選自PEG2 至PEG100 中任一者(例如，PEG2 、PEG3 、PEG4 、PEG5 、PEG5 -PEG10 、PEG10 -PEG20 、PEG20 -PEG30 、PEG30 -PEG40 、PEG50 -PEG60 、PEG60 -PEG70 、PEG70 -PEG80 、PEG80 -PEG90 、PEG90 -PEG100 )。在一些實施例中，Lc 包括PEG連接體，其中LC 共價附接至Q及E中每一者。
可用於本文所述之結合物中的式(D-L-I)之連接體包括但不限於
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；或
Figure 02_image613
， 其中z1 及z2 各自獨立地為1至20之整數；且R9 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基。
式(D-L-I)之連接體亦可包括以下任一者：
Figure 02_image1410
Figure 02_image1412
Figure 02_image1414
Figure 02_image1416
具有共價連接於神經胺糖酸酶抑制劑之單體之 Fc 域或白蛋白的結合物中之連接體
在如本文所述之含有共價連接於神經胺糖酸酶抑制劑之一或多種單體的Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽之結合物中，該結合物中之連接體(例如，L或L’)可為具有兩個臂之二價結構。二價連接體中之一個臂可附接於神經胺糖酸酶抑制劑之單體且另一臂可附接於Fc域單體及Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽。在一些實施例中，本文所述之結合物中的神經胺糖酸酶抑制劑之一或多種單體可各自獨立地連接於Fc域單體及Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽中之原子。
在一些實施例中，連接體係由式(M-L-I)描述： J1 -(Q1 )g -(T1 )h -(Q2 )i -(T2 )j -(Q3 )k -(T3 )l -(Q4 )m -(T4 )n -(Q5 )o -J2 其中J1 係附接至神經胺糖酸酶抑制劑之鍵；J2 係附接至Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽之鍵或能夠與結合於Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽之官能基反應的官能基(例如，順丁烯二醯亞胺及半胱胺酸、胺及經活化羧酸、硫醇及順丁烯二醯亞胺、經活化磺酸及胺、異氰酸酯及胺、疊氮化物及炔以及烯烴及四嗪)；Q1 、Q2 、Q3 、Q4 及Q5 各自獨立地為視情況經取代C1-C20伸烷基、視情況經取代C1-C20伸雜烷基、視情況經取代C2-C20伸烯基、視情況經取代C2-C20伸雜烯基、視情況經取代C2-C20伸炔基、視情況經取代C2-C20伸雜炔基、視情況經取代C3-C20伸環烷基、視情況經取代C3-C20伸雜環烷基、視情況經取代C4-C20伸環烯基、視情況經取代C4-C20伸雜環烯基、視情況經取代C8-C20伸環炔基、視情況經取代C8-C20伸雜環炔基、視情況經取代C5-C15伸芳基或視情況經取代C2-C15伸雜芳基；T1 、T2 、T3 、T4 各自獨立地為O、S、NRi 、P、羰基、硫羰基、磺醯基、磷酸酯基、磷醯基或亞胺基；Ri 為H、視情況經取代C1-C20烷基、視情況經取代C1-C20雜烷基、視情況經取代C2-C20烯基、視情況經取代C2-C20雜烯基、視情況經取代C2-C20炔基、視情況經取代C2-C20雜炔基、視情況經取代C3-C20環烷基、視情況經取代C3-C20雜環烷基、視情況經取代C4-C20環烯基、視情況經取代C4-C20雜環烯基、視情況經取代C8-C20環炔基、視情況經取代C8-C20雜環炔基、視情況經取代C5-C15芳基或視情況經取代C2-C15雜芳基；且g、h、i、j、k、l、m、n及o各自獨立地為0或1。
在一些實施例中，J2 可具有兩個附接至Fc域單體及Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽之點(例如，兩個J2 )。
可用於本文所述之結合物中的式(M-L-I)之連接體包括但不限於
Figure 02_image1418
Figure 02_image1420
或
Figure 02_image1422
， 其中d為1至20之整數(例如，d為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)。
可用於本文所述之結合物中的式(M-L-I)之連接體包括但不限於
Figure 02_image1424
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Figure 02_image918
、
Figure 02_image920
及
Figure 02_image1437
，其中d及e各自獨立地為1至26之整數。連接基團
在一些實施例中，連接體提供此處所述之結合物中的神經胺糖酸酶抑制劑與Fc域單體及Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽之間或本文所述之結合物中之兩種神經胺糖酸酶抑制劑的空間、剛性及/或柔性。在一些實施例中，連接體可為鍵，例如共價鍵，例如醯胺鍵、二硫鍵、C-O鍵、C-N鍵、N-N鍵、C-S鍵或由化學反應(例如，化學結合)產生之任何種類的鍵。在一些實施例中，連接體(如式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者所示之L或L’)包括不超過250個原子(例如，1-2、1-4、1-6、1-8、1-10、1-12、1-14、1-16、1-18、1-20、1-25、1-30、1-35、1-40、1-45、1-50、1-55、1-60、1-65、1-70、1-75、1-80、1-85、1-90、1-95、1-100、1-110、1-120、1-130、1-140、1-150、1-160、1-170、1-180、1-190、1-200、1-210、1-220、1-230、1-240或1-250個原子；250、240、230、220、210、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、28、26、24、22、20、18、16、14、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個原子)。在一些實施例中，連接體(L或L)包括不超過250個非氫原子(例如，1-2、1-4、1-6、1-8、1-10、1-12、1-14、1-16、1-18、1-20、1-25、1-30、1-35、1-40、1-45、1-50、1-55、1-60、1-65、1-70、1-75、1-80、1-85、1-90、1-95、1-100、1-110、1-120、1-130、1-140、1-150、1-160、1-170、1-180、1-190、1-200、1-210、1-220、1-230、1-240或1-250個非氫原子；250、240、230、220、210、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、28、26、24、22、20、18、16、14、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個非氫原子)。在一些實施例中，連接體(L或L)之骨架包括不超過250個原子(例如，1-2、1-4、1-6、1-8、1-10、1-12、1-14、1-16、1-18、1-20、1-25、1-30、1-35、1-40、1-45、1-50、1-55、1-60、1-65、1-70、1-75、1-80、1-85、1-90、1-95、1-100、1-110、1-120、1-130、1-140、1-150、1-160、1-170、1-180、1-190、1-200、1-210、1-220、1-230、1-240或1-250個原子；250、240、230、220、210、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、28、26、24、22、20、18、16、14、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個原子)。連接體之「骨架」係指連接體中之原子，其合起來形成自結合物之一部分至該結合物之另一部分之最短路徑。連接體之骨架中之原子直接地參與連接該結合物之一部分至該結合物之另一部分。例如，附接於連接體之骨架中的碳之氫原子未被視為直接地參與連接該結合物之一部分至該結合物之另一部分。
可用於製備連接體(L或L’)之分子包括至少兩個官能基，例如兩個羧酸基。在三價連接體之一些實施例中，連接體之兩個臂可含有兩種二羧酸，其中第一羧酸可與該結合物中之第一神經胺糖酸酶抑制劑形成共價連接且第二羧酸可與該結合物中之第二神經胺糖酸酶抑制劑形成共價連接且該連接體之第三臂可與該結合物中之Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽形成共價連接(例如，C-O鍵)。在二價連接體之一些實施例中，該二價連接體可含有兩種羧酸，其中第一羧酸可與該結合物中之一種組分(例如，神經胺糖酸酶抑制劑)形成共價連接且第二羧酸可與該結合物中之另一組分(例如，Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽)形成共價連接(例如，C-S鍵或C-N鍵)。
在一些實施例中，二羧酸分子可用作連接體(例如，二羧酸連接體)。例如，在含有共價連接於神經胺糖酸酶抑制劑之一或多種二聚體的Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽之結合物中，二羧酸分子中之第一羧酸可與第一神經胺糖酸酶抑制劑之羥基或胺基形成共價連接且第二羧酸可與第二神經胺糖酸酶抑制劑之羥基或胺基形成共價連接。
可用於形成連接體之二羧酸分子之實例包括但不限於：
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Figure 02_image1489
、
Figure 02_image1491
其中n為1至20之整數(例如，n為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)。
可用於形成連接體之二羧酸分子之其他實例包括但不限於：
Figure 02_image1493
Figure 02_image1495
在一些實施例中，二羧酸分子(諸如本文所述者)可進一步官能化以含有一或多個額外官能基。二羧酸可進一步官能化，例如以提供與Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽之附接點(例如，藉助於連接體，諸如PEG連接體)。
在一些實施例中，當該神經胺糖酸酶抑制劑附接於Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽時，連接基團可包含包括由1至25個原子間隔之羧酸部分及胺基部分的部分。該等連接基團之實例包括但不限於：
Figure 02_image1497
其中n為1至20之整數(例如，n為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)。
在一些實施例中，可包含包括羧酸部分及胺基部分之部分之連接基團(諸如本文所述者)可進一步官能化以含有一或多個額外官能基。該等連接基團可進一步官能化，例如以提供與Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽之附接點(例如，藉助於連接體，諸如PEG連接體)。
在一些實施例中，當該神經胺糖酸酶抑制劑附接於Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽時，連接基團可包含包括由1至25個原子間隔之兩個或胺基部分(例如，二胺基部分)之部分。該等連接基團之實例包括但不限於：
Figure 02_image1499
其中n為1至20之整數(例如，n為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)。
在一些實施例中，可包括二胺基部分之連接基團(諸如本文所述者)可進一步官能化以含有一或多個額外官能基。該等二胺基連接基團可進一步官能化，例如以提供與Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽之附接點(例如，藉助於連接體，諸如PEG連接體)。
在一些實施例中，含有疊氮基之分子可用於形成連接體，其中該疊氮基可與炔進行環加成以形成1,2,3-三唑連接。在一些實施例中，含有炔基之分子可用於形成連接體，其中該炔基可與疊氮化物進行環加成以形成1,2,3-三唑連接。在一些實施例中，含有順丁烯二醯亞胺基之分子可用於形成連接體，其中該順丁烯二醯亞胺基可與半胱胺酸反應以形成C-S連接。在一些實施例中，含有一或多個磺酸基之分子可用於形成連接體，其中該磺酸基可與神經胺糖酸酶抑制劑中之連接氮形成磺醯胺連接。在一些實施例中，含有一或多個異氰酸酯基之分子可用於形成連接體，其中該異氰酸酯基可與神經胺糖酸酶抑制劑中之連接氮形成脲鍵聯。在一些實施例中，含有一或多個鹵烷基之分子可用於形成連接體，其中該鹵烷基可與神經胺糖酸酶抑制劑形成共價連接，例如C-N及C-O連接。
在一些實施例中，連接體(L或L’)可包含源於例如合成聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)聚合物)之合成基團。在一些實施例中，連接體可包含一或多個胺基酸殘基。在一些實施例中，連接體可為胺基酸序列(例如，1-25個胺基酸、1-10個胺基酸、1-9個胺基酸、1-8個胺基酸、1-7個胺基酸、1-6個胺基酸、1-5個胺基酸、1-4個胺基酸、1-3個胺基酸、1-2個胺基酸或1個胺基酸之序列)。在一些實施例中，連接體(L或L’)可包括一或多個視情況經取代C1-C20伸烷基、視情況經取代C1-C20伸雜烷基(例如，PEG單元)、視情況經取代C2-C20伸烯基(例如，C2伸烯基)、視情況經取代C2-C20伸雜烯基、視情況經取代C2-C20伸炔基、視情況經取代C2-C20伸雜炔基、視情況經取代C3-C20伸環烷基(例如，伸環丙基、伸環丁基)、視情況經取代C3-C20伸雜環烷基、視情況經取代C4-C20伸環烯基、視情況經取代C4-C20伸雜環烯基、視情況經取代C8-C20伸環炔基、視情況經取代C8-C20伸雜環炔基、視情況經取代C5-C15伸芳基(例如，C6伸芳基)、視情況經取代C2-C15伸雜芳基(例如，咪唑、吡啶)、O、S、NRi (Ri 為H、視情況經取代C1-C20烷基、視情況經取代C1-C20雜烷基、視情況經取代C2-C20烯基、視情況經取代C2-C20雜烯基、視情況經取代C2-C20炔基、視情況經取代C2-C20雜炔基、視情況經取代C3-C20環烷基、視情況經取代C3-C20雜環烷基、視情況經取代C4-C20環烯基、視情況經取代C4-C20雜環烯基、視情況經取代C8-C20環炔基、視情況經取代C8-C20雜環炔基、視情況經取代C5-C15芳基或視情況經取代C2-C15雜芳基)、P、羰基、硫羰基、磺醯基、磷酸酯基、磷醯基或亞胺基。結合化學
神經胺糖酸酶抑制劑單體或二聚體(例如，在式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者之結合物中)可例如藉助於連接體，藉由熟習此項技術者已知之任何標準結合化學結合於Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽。特定地涵蓋以下結合化學，例如關於使PEG連接體(例如，官能化PEG連接體)結合於Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽。
使用連接體使結合物中之兩種或兩種以上組分共價結合可使用熟知有機化學合成技術及方法來實現。兩種組分上之互補官能基可彼此反應以形成共價鍵。互補反應性官能基之實例包括但不限於例如順丁烯二醯亞胺及半胱胺酸、胺及經活化羧酸、硫醇及順丁烯二醯亞胺、經活化磺酸及胺、異氰酸酯及胺、疊氮化物及炔以及烯烴及四嗪。與多肽(例如，Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽)之位點特異性結合可使用此項技術中已知之技術來實現。用於使小分子位點特異性結合於Fc域之例示性技術提供於Agarwall. P.等人 Bioconjugate Chem. 26:176-192 (2015)中。
能夠與胺基反應之官能基之其他實例包括例如烷基化劑及醯化劑。代表性烷基化劑包括：(i) α-鹵基乙醯基，例如XCH2 CO- (其中X=Br、Cl或I)；(ii) N-順丁烯二醯亞胺基，其可經由Michael類型反應或經由藉由增加環羰基進行醯化而與胺基反應；(iii)芳基鹵化物，例如硝基鹵基芳族基團；(iv)烷基鹵化物；(v)能夠與胺基形成席夫氏鹼之醛或酮；(vi)可與胺基、巰基或酚式羥基反應之環氧化物，例如表氯醇及雙環氧乙烷；(vii)含氯s-三嗪，其可對諸如胺基、巰基及羥基之親核試劑具反應性；(viii)氮丙啶，其可藉由開環對諸如胺基之親核試劑具反應性；(ix)方酸二乙酯；及(x) α-鹵基烷基醚。
胺基反應性醯化劑之實例包括例如(i)異氰酸酯及異硫氰酸酯；(ii)磺醯氯；(iii)醯基鹵；(iv)活性酯，例如硝基苯酯或N-羥基丁二醯亞胺酯或其衍生物(例如，疊氮基-PEG2 -PEG40 -NHS酯)；(v)酸酐，例如混合、對稱或N-羧基酐；(vi)醯基疊氮化物；及(vii)醯亞胺酯。醛及酮可與胺反應以形成席夫氏鹼，席夫氏鹼可經由還原胺化穩定化。
應理解，某些官能基可在反應之前轉化為其他官能基，例如以賦予額外反應性或選擇性。適用於此目的之實例包括使用諸如二羧酸酐之試劑使胺轉化為羧基；使用諸如N-乙醯基高半胱胺酸硫內酯、S-乙醯基巰基丁二酸酐、2-亞胺基硫雜環戊烷或含硫醇之丁二醯亞胺基衍生物之試劑使胺轉化為硫醇；使用諸如α -鹵基乙酸酯之試劑使硫醇轉化為羧基；使用諸如乙烯亞胺或2-溴乙胺之試劑使硫醇轉化為胺；使用諸如碳化二亞胺之試劑、隨後二胺使羧基轉化為胺；及使用諸如甲苯磺醯氯之試劑、隨後用硫代乙酸酯進行酯基轉移且用乙酸鈉水解為硫醇而使醇轉化為硫醇。
在一些實施例中，本發明之連接體(例如L或L’，諸如D-L-I之LC )結合(例如，藉由本文所述之任何方法)於E (例如，Fc域或白蛋白)。在本發明之較佳實施例中，該連接體藉助於以下進行結合：(a)硫脲鍵聯(亦即，-NH(C=S)NH-)於E之離胺酸；(b)胺基甲酸酯連接(亦即，-NH(C=O)-O)於E之離胺酸；(c)在離胺酸與E之間藉由還原胺化實現之胺連接(亦即，-NHCH2 )；(d)醯胺(亦即，-NH-(C=O)CH2 )於E之離胺酸；(e)連接體之順丁烯二醯亞胺至E之半胱胺酸之間的半胱胺酸-順丁烯二醯亞胺結合；(f)在連接體與E之碳水化合物(例如，Fc域單體或Fc域之糖基)之間藉由還原胺化實現之胺連接(亦即，-NHCH2 )；(g)再橋接半胱胺酸結合，其中該連接體結合於E之兩個半胱胺酸；(h)在連接體與E之碳水化合物(例如，Fc域單體或Fc域之糖基)之間的肟連接；(i)在連接體與E之胺基酸殘基之間的肟連接；(j)在連接體與E之間的疊氮基連接；(k)連接體直接醯化為E；或(l)在連接體與E之間的硫醚連接。
在一些實施例中，連接體結合於E，其中該連接包括結構-NH(C=NH)X-，其中X為O、HN或鍵。在一些實施例中，連接體結合於E，其中在連接體之剩餘部分與E之間的連接包括結構-NH(C=O)NH-。
在一些實施例中，連接體(例如活性酯，例如硝基苯酯或N-羥基丁二醯亞胺酯或其衍生物(例如，官能化PEG連接體(例如，疊氮基-PEG2 -PEG40 -NHS酯)結合於E，其中T (例如，DAR)在0.5與10.0之間，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在此等情況下，E-(PEG2 -PEG40 )-疊氮化物可經由點擊結合與具有末端炔連接體(例如L或L’，諸如D-L-I之LC )之Int反應。在點擊結合期間，銅催化之疊氮化物(例如，Fc-(PEG2 -PEG40 )-疊氮化物)與炔(例如，具有末端炔連接體(例如L或L’，諸如D-L-I之LC 之Int)之反應形成5員雜原子環。在一些實施例中，結合於E之連接體為末端炔且結合於具有末端疊氮化物之Int。E-(PEG2 -PEG40 )-疊氮化物之製備之例示性製備描述於實例7、8、61、84、88及124中。經由點擊結合製備之例示性結合物描繪於圖43、圖61及圖102中。點擊化學結合程序在圖103中示出。熟習此項技術者應容易瞭解來自點擊化學結合之最終產物。
例示性連接策略(例如，用於使神經胺糖酸酶抑制劑之單體或二聚體連接於E之方法，諸如藉助於連接體)進一步描繪於圖1、28、29、30、43及61中。VI. 組合療法 抗病毒劑
在一些實施例中，一或多種抗病毒劑可與本文所述之結合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D'-I)、(M-I)-(M-XI)或(M'-I)中任一者之結合物)組合投與(例如，實質上同時投與(例如，在同一醫藥組合物中或在獨立醫藥組合物中)或在不同時間獨立地投與)。
抗病毒劑可以與結合物基本同時投與(例如，在相同之醫藥組合物中或在單獨之醫藥組合物中)，或者可以在結合物之前或之後投與(例如，在1天、2天、5天、1週、2週、3週、1個月、2個月、6個月或12個月或更長時間內)。在一些實施例中，結合物藉由注射(例如，肌內、皮內、鼻內或皮下)投與，並且抗病毒劑經口投與。最佳地，結合物經靜脈內投與，並且抗病毒劑經口投與。
在一些實施例中，預防性地(例如，在個體接觸病毒之前)投與結合物，並且在個體患有病毒感染、推定患有病毒感染或已經暴露於病毒之後，投與抗病毒劑。在一些實施例中，結合物及抗病毒劑都在個體患有病毒感染、假定患有病毒感染或已經暴露於病毒之後投與。在一些實施例中，結合物及抗病毒劑都預防性地投與。
結合物及抗病毒劑可以調配在相同之醫藥組合物或單獨之醫藥組合物中。在較佳實施例中，將結合物及抗病毒劑調配在單獨之醫藥組合物中(例如，調配用於不同之投與途徑)。在一些實施例中，結合物及抗病毒劑同時(例如，在基本上相同之時間，例如5分鐘、30分鐘、1-6小時、1-12小時或1天之內)或順序(例如，在不同之時間，例如相隔1天以上)投與。如果抗病毒劑及結合物相繼投與，則抗病毒劑在結合物投與後1-50次(例如1-15、10-25、20-35、30-45或35-50)投與(例如，在結合物後1天、2天、5天、1週、2週、3週、1個月、2個月、6個月或12個月或更長時間投與)。
在一些情況下，在投與本文所述之結合物(例如式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D'-I)、(M-I)-(M-XI)或(M'-I)中任一者之結合物)後每天、每週、每月、每半年、每年或視醫學需要將抗病毒劑一次或多次(例如1-10次或更多次；1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次)投與有需要之個體。
在一些實施例中，該抗病毒劑係用於治療流感病毒之抗病毒劑。例如，該抗病毒劑可為M2離子通道阻斷劑、神經胺糖酸酶抑制劑(例如，長效神經胺糖酸酶抑制劑)、聚合酶抑制劑、血球凝集素抑制劑、融合蛋白抑制劑、COX-2抑制劑或PPAR促效劑。該抗病毒劑可靶向病毒或宿主個體。與本文所述之結合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者之結合物)組合使用的用於治療流感病毒之抗病毒劑可選自匹莫維地爾、奧司他韋、紮那米韋、帕拉米韋、拉尼米韋、CS-8958、金剛烷胺、金剛乙胺、藍藻抗病毒蛋白-N、cap依賴性核酸內切酶抑制劑(例如，巴洛沙韋瑪波地爾)、聚合酶抑制劑(例如，T-705)、PB2抑制劑(例如，JNJ-63623872)、結合之唾液酸酶(例如，DAS181)、噻唑啶(例如，硝唑尼特)、COX抑制劑、PPAR促效劑、靶向血球凝集素之抗體(例如單株抗體，諸如CR6261、CR8020、MEDI8852、MHAA4549A或VIS410)或靶向宿主或病毒基因之siRNA或其前藥，或其醫藥學上可接受之鹽。
較佳地，抗病毒劑針對與結合物不同之治療靶標，例如M2離子通道阻滯劑、聚合酶抑制劑、血凝素抑制劑、病毒複製抑制劑(例如帽依賴性核酸內切酶抑制劑)、融合蛋白抑制劑、COX-2抑制劑或PPAR促效劑。最佳地，抗病毒劑係帽依賴性核酸內切酶抑制劑(例如，巴洛沙韋瑪波地爾)。在一些實施例中，抗病毒劑與式(D-II-6)所述之結合物組合投與。在一些實施例中，抗病毒劑與式(D-II-7)所述之結合物組合投與。在較佳實施例中，抗病毒劑(例如巴洛沙韋瑪波地爾)與式(D-II-6)所述之結合物組合投與。最佳地，將抗病毒劑(例如巴洛沙韋瑪波地爾)與式(D-II-7)所述之結合物組合投與。更佳地，結合物係結合物45或結合物46。巴洛沙韋
在一些實施例中，巴洛沙韋瑪波地爾(BXM，前藥形式)或巴洛沙韋酸(BXA，活性形式)或其任何鹽(Omoto等人Scientific Reports. 8:9633, 2018; Japic CTI-153090; Japic CTI-163417；其每一者以引用之方式整體併入本文中)可與本文描述之結合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D'-I)、(M-I)-(M-XI)或(M'-I)中任一者之結合物)組合投與(例如，基本上同時(例如，在同一醫藥組合物中或在分開之醫藥組合物中)投與或在不同之時間分開投與)。
Figure 02_image1501
；
Figure 02_image1503
。 (巴洛沙韋瑪波地爾)       (巴洛沙韋酸)
在一些實施例中，以每天每位成人約0.1 mg至約3000 mg，較佳約0.1 mg至約1000 mg，最佳約10 mg至約100 mg(例如，約10 mg、約20 mg、約30 mg、約40 mg、約50 mg、約60 mg、約70 mg、約80 mg、約90 mg或約100 mg)之劑量投與巴洛沙韋瑪波地爾、巴洛沙韋酸或其鹽，若需要，可分次投與。在一些實施例中，當與結合物組合投與時，與護理標準相比，以減少之劑量或頻率投與巴洛沙韋瑪波地爾、巴洛沙韋酸或其鹽。結合物可以本文所述之劑量投與。
在一些實施例中，比結合物更頻繁地投與巴洛沙韋瑪波地爾、巴洛沙韋酸或其鹽。例如，結合物可以每12個月、6個月、3個月、2個月、1個月、每3週、每2週或每週投與一次。可以每天3次、每天兩次、每天一次、每2-6天一次、每週一次或每兩週一次投與巴洛沙韋瑪波地爾、巴洛沙韋酸或其鹽。在一些實施例中，在投與本文所述之結合物之後(例如，在6個月、3個月、2個月、1個月、3週、2週或1週內)，將巴洛沙韋瑪波地爾、巴洛沙韋酸或其鹽投與一次或多次(例如1-10次或更多次；1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次)。
在一些實施例中，經口投與巴洛沙韋瑪波地爾、巴洛沙韋酸或其鹽。在一些實施例中，例如每天以約0.01 mg至約1000 mg，較佳約0.05 mg至約500 mg範圍內之劑量經口投與巴洛沙韋瑪波地爾、巴洛沙韋酸或其鹽。巴洛沙韋瑪波地爾(XOFLUZATM )之劑型及強度係眾所周知的，40至＜80 kg之成人之單次經口劑量為40 mg，並且≥80 kg之成人之單次經口劑量為80 mg。巴洛沙韋瑪波地爾(XOFLUZATM ))用於兒科個體(例如，≥12歲且≥40 kg之個體)之劑型及強度係眾所周知的，對於40至＜80 kg之兒科個體，單次經口劑量為40 mg，並且≥80 kg之兒科個體之單次經口劑量為80 mg。
當與本發明之結合物組合投與時，可以例如藉由巴洛沙韋及結合物之協同相互作用來增強巴洛沙韋(例如，巴洛沙韋瑪波地爾、巴洛沙韋酸或其鹽)之功效。此可以允許以減少之劑量(例如，相對於當前之臨床護理標準)投與巴洛沙韋，而沒有任何功效之損失。此具有減少與巴洛沙韋投與有關之不良事件之優點。在一些實施例中，以減少或亞臨床劑量(例如，以低於沒有本文所述之結合物及/或低於當前之臨床護理標準之劑量(例如低於40 mg經口劑量之劑量(例如0.01 mg至40 mg範圍內(例如0.5 mg、1.0 mg、1.5 mg、2.0 mg、2.5 mg、5.0 mg、7.5 mg、10 mg、15 mg、18 mg、20 mg、23 mg、25 mg、30 mg，35 mg或38 mg經口劑量)之劑量))，投與巴洛沙韋瑪波地爾、巴洛沙韋酸或其鹽。巴洛沙韋瑪波地爾(XOFLUZATM )可以任何足以在先前已投與本文所述任何結合物之個體中治療流感病毒感染之量提供。抗病毒疫苗
在一些實施例中，本文所述之結合物中任一者(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者之結合物)與抗病毒疫苗(例如，在針對病毒之個體中引起免疫反應之組合物)組合投與。該抗病毒疫苗可與該等結合物實質上同時投與(例如，在同一醫藥組合物中或在獨立醫藥組合物中)，或可在該等結合物之前或之後(例如，在1天、2天、5天、1週、2週、3週、1個月、2個月、6個月或12個月或更久時期內)經投與。
在一些實施例中，該病毒疫苗包含在該個體中引起針對A型、B型、C型流感病毒或副流感病毒之免疫反應之免疫原。在一些實施例中，該免疫原為不活化病毒(例如，該疫苗係含有經純化且不活化材料A型、B型、C型流感病毒或副流感病毒或其任何組合之三價流感疫苗)。在一些實施例中，該疫苗呈肌內注射液形式給予。在一些實施例中，該疫苗係含有已經減弱(削弱)之活病毒之活病毒疫苗。在一些實施例中，該疫苗呈鼻內噴霧劑形式經投與。VII. 方法
本文所述之方法包括例如進行保護以抵禦或治療個體之病毒感染(例如，流感病毒感染)之方法及預防、穩定化或抑制病毒粒子之生長之方法。治療個體之病毒感染(例如，流感病毒感染)之方法包括向該個體投與本文所述之結合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者之結合物)或其醫藥組合物。在一些實施例中，該病毒感染係由流感病毒(例如，A型、B型、C型流感病毒或副流感病毒)引起。在一些實施例中，該病毒感染係由抗性病毒株引起。預防、穩定化或抑制病毒粒子之生長或預防病毒之複製及擴散的方法包括使該病毒或易經受病毒生長之位點與本文所述之結合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者之結合物)或其醫藥組合物接觸。
本發明亦提供在患有繼發性感染(例如繼發性細菌感染、繼發性病毒感染或繼發性真菌感染)或有發展其風險之個體中預防或治療病毒感染(例如流感病毒感染)之方法，其中該方法包括向個體投與本文所述之結合物或組合物。本發明進一步提供了一種在經診斷患有流感感染之個體中預防繼發性感染之方法，其中該方法包括向個體投與本文所述之結合物或組合物。在一些實施例中，繼發性感染係細菌感染(例如耐甲氧西林之金黃色葡萄球菌(MRSA)、肺炎鏈球菌、銅綠假單胞菌及/或流感嗜血桿菌)、病毒感染或真菌感染。在具體實施例中，繼發性感染係MRSA。在某些實施例中，繼發性感染係肺炎鏈球菌。在一些實施例中，繼發性感染係呼吸道感染(例如，呼吸道之感染)。在一些實施例中，繼發性感染與(例如，引起)肺炎(例如，細菌性或病毒性肺炎)相關。在一些實施例中，個體患有肺炎或有發展成肺炎之風險。
此外，本文所述之方法亦包括藉由向個體投與本文所述之結合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者之結合物)來進行保護以抵禦或治療個體之病毒感染之方法。在一些實施例中，該方法進一步包括向該個體投與抗病毒劑或抗病毒疫苗。
本文所述之方法亦包括藉由向個體投與(1)本文所述之結合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者之結合物)及(2)抗病毒劑或抗病毒疫苗來進行保護以抵禦或治療該個體之病毒感染的方法。本文所述之方法亦包括藉由使病毒或易經受病毒生長之位點與(1)本文所述之結合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者之結合物)及(2)抗病毒劑或抗病毒疫苗接觸來預防、穩定化或抑制病毒粒子之生長或預防病毒之複製或擴散的方法。
在一些實施例中，首先投與本文所述之結合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者之結合物)，隨後單獨投與抗病毒劑或抗病毒疫苗。在一些實施例中，首先投與抗病毒劑或抗病毒疫苗，隨後單獨投與本文所述之結合物。在一些實施例中，實質上同時投與本文所述之結合物及抗病毒劑或抗病毒疫苗(例如，在同一醫藥組合物中或在獨立醫藥組合物中)。在一些實施例中，首先投與本文所述之結合物或抗病毒劑或抗病毒疫苗，隨後實質上同時投與本文所述之結合物及抗病毒劑或抗病毒疫苗(例如，在同一醫藥組合物中或在獨立醫藥組合物中)。在一些實施例中，首先實質上同時投與本文所述之結合物及抗病毒劑或抗病毒疫苗(例如，在同一醫藥組合物中或在獨立醫藥組合物中)，隨後單獨投與本文所述之結合物或抗病毒劑或抗病毒疫苗。在一些實施例中，當本文所述之結合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者之結合物)及抗病毒劑或抗病毒疫苗合起來(例如，在同一或獨立醫藥組合物中實質上同時，或在同一治療方案中獨立地)經投與時，該結合物及該抗病毒劑或抗病毒疫苗中每一者對病毒複製之抑制可大於(例如，在較低濃度下出現)當在治療方案中單獨使用每一者時該結合物及該抗病毒劑或抗病毒疫苗中每一者對病毒複製之抑制。VIII. 醫藥組合物及製劑
本文所述之結合物可經調配於用於本文所述之方法的醫藥組合物中。在一些實施例中，本文所述之結合物可單獨經調配於醫藥組合物中。在一些實施例中，本文所述之結合物可與抗病毒劑或抗病毒疫苗組合經調配於醫藥組合物中。在一些實施例中，該醫藥組合物包括本文所述之結合物(例如，由式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者描述之結合物)及醫藥學上可接受之載劑及賦形劑。
該等醫藥組合物中可接受之載劑及賦形劑在所用之劑量及濃度下對接受者無毒。可接受之載劑及賦形劑可包括緩衝液，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽、HEPES及TAE；抗氧化劑，諸如抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑，諸如氯化六烴季銨、十八烷基二甲基苯甲基氯化銨、間苯二酚及苯紮氯銨；蛋白質，諸如人類血清白蛋白、明膠、右旋糖苷及免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸殘基，諸如甘胺酸、麩醯胺、組胺酸及離胺酸；及碳水化合物，諸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖及山梨糖醇。
其他賦形劑之實例包括但不限於抗黏劑、黏合劑、包衣、壓縮助劑、崩解劑、染料、潤膚劑、乳化劑、填充劑(稀釋劑)、成膜劑或包衣、調味劑、芳香劑、助流劑(流動增強劑)、潤滑劑、吸附劑、懸浮或分散劑或甜味劑。例示性賦形劑包括但不限於：丁基化羥基甲苯(BHT)、碳酸鈣、磷酸鈣(一氫)、硬脂酸鈣、交聯羧甲纖維素、交聯聚乙烯吡咯啶酮、檸檬酸、交聯聚維酮、半胱胺酸、乙基纖維素、明膠、羥基丙基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、乳糖、硬脂酸鎂、麥芽糖醇、甘露糖醇、甲硫胺酸、甲基纖維素、對羥基苯甲酸甲酯、微晶纖維素、聚乙二醇、聚維酮、預膠凝澱粉、對羥基苯甲酸丙酯、視黃醇棕櫚酸酯、蟲膠、二氧化矽、羧基甲基纖維素鈉、檸檬酸鈉、乙醇酸澱粉鈉、山梨糖醇、澱粉(玉米)、硬脂酸、硬脂酸、蔗糖、滑石、二氧化鈦、維他命A、維他命E、維他命C及木糖醇。
本文中之結合物可具有可離子化基團以便能夠呈醫藥學上可接受之鹽形式製備。此等鹽可為涉及無機或有機酸之酸加成鹽，或該等鹽在本文中之結合物的酸性形式之情況下可由無機或有機鹼製備。該等結合物經常地呈醫藥學上可接受之鹽形式經製備或使用，該等醫藥學上可接受之鹽呈醫藥學上可接受之酸或鹼的加成產物形式經製備。合適的醫藥學上可接受之酸及鹼為此項技術中熟知的，諸如用於形成酸加成鹽之鹽酸、硫酸、氫溴酸、乙酸、乳酸、檸檬酸或酒石酸，及用於形成鹼式鹽之氫氧化鉀、氫氧化鈉、氫氧化銨、咖啡因、多種胺及其類似物。用於製備適當鹽之方法為此項技術中充分確立的。
代表性酸加成鹽包括但不限於乙酸鹽、己二酸鹽、褐藻酸鹽、抗壞血酸鹽、天冬胺酸鹽、苯磺酸鹽、本甲酸鹽、硫酸氫鹽、硼酸鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、檸檬酸鹽、環戊烷丙酸鹽、二葡糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙烷磺酸鹽、反丁烯二酸鹽、葡庚糖酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、氫溴酸鹽、鹽酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基-乙烷磺酸鹽、乳糖酸鹽、乳酸鹽、月桂酸鹽、月桂基硫酸鹽、蘋果酸鹽、順丁烯二酸鹽、丙二酸鹽、己烷磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、菸鹼酸鹽、硝酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、雙羥萘酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、磷酸鹽、苦味酸鹽、特戊酸鹽、丙酸鹽、硬脂酸鹽、丁二酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽、十一烷酸鹽及戊酸鹽。代表性鹼金屬或鹼土金屬鹽包括但不限於鈉、鋰、鉀、鈣及鎂；以及無毒銨、四級銨及胺陽離子，包括但不限於銨、四甲基銨、四乙基銨、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺及乙胺。
視投與途徑及劑量而定，用於本文所述之方法中的本文中之結合物或其醫藥組合物將經調配成合適醫藥組合物以允許容易遞送。結合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者之結合物)或其醫藥組合物可經調配以肌內、靜脈內(例如，呈無菌溶液形式且在適用於靜脈內使用之溶劑系統中)、皮內、動脈內、腹膜內、病變內、顱內、關節內、前列腺內、胸膜內、氣管內、鼻內、玻璃體內、陰道內、直腸內、經表面、腫瘤內、經腹膜、皮下、結膜下、囊內、經黏膜、心包內、臍內、眼內、經口(例如，錠劑、膠囊、囊片、囊形片或糖漿)、經表面(例如，呈乳膏、凝膠、洗劑或軟膏形式)、經局部、藉由吸入、藉由注射或藉由輸注(例如，連續輸注、直接地浸泡標靶細胞之局部灌注、導管、灌洗、呈乳膏或脂質組合物形式)經投與。視投與途徑而定，本文中之結合物或其醫藥組合物可呈例如錠劑、膠囊、丸劑、散劑、顆粒劑、懸浮液、乳液、溶液、凝膠(包括水凝膠)、糊劑、軟膏、乳膏、膏藥、灌藥、滲透遞送器件、栓劑、灌腸劑、可注射劑、植入物、噴霧劑、適用於離子導入遞送之製劑或氣霧劑之形式。該等組合物可根據習知醫藥規範經調配。
本文所述之結合物可以此項技術中已知之多種方式經調配。關於用作人類及動物個體之治療，本文所述之結合物可經調配為醫藥或獸醫學組合物。視欲治療之個體(例如，人類)、投與模式及所需治療類型(例如，預防或療法)而定，本文所述之結合物係以與此等參數一致之方式經調配。該等技術之概述發現於Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第22版, Lippincott Williams & Wilkins (2012)；及Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, 第4版, J. Swarbrick及J. C. Boylan, Marcel Dekker, New York (2013)中，該等文獻各自以引用之方式併入本文中。
調配物可以適用於全身性投與或表面或局部投與之方式經製備。全身性調配物包括經設計用於注射(例如，肌內、靜脈內或皮下注射)之彼等調配物，或可經製備用於經皮、經黏膜或經口投與。該調配物一般將包括稀釋劑以及在一些情況下佐劑、緩衝液及防腐劑。該等結合物亦可呈脂質體組合物形式或呈微乳液形式經投與。全身性投與亦可包括相對非侵襲性方法，諸如使用栓劑、經皮貼片、經黏膜遞送及鼻內投與。經口投與亦適用於本文中之結合物。合適形式包括糖漿、膠囊及錠劑，如此項技術中應理解。該等醫藥組合物可呈可注射調配物形式非經腸投與。用於注射之醫藥組合物可使用無菌溶液或任何醫藥學上可接受之液體作為媒劑經調配。調配物可經製備為適用於在注射之前溶解或懸浮於液體中之固體形式或經製備為乳液。醫藥學上可接受之媒劑包括但不限於無菌水、生理食鹽水及細胞培養基(例如，杜氏改良伊格爾培養基(DMEM)、α改良伊格爾培養基(α-MEM)、F-12培養基)。該等可注射組合物亦可含有一定量之無毒輔助物質，諸如濕潤或乳化劑、pH緩衝劑，諸如乙酸鈉及山梨醇酐單月桂酸酯。調配方法為此項技術中已知的，參見例如Pharmaceutical Preformulation and Formulation, 第2版, M. Gibson, Taylor & Francis Group, CRC Press (2009)。
該等醫藥組合物可呈經口調配物形式經製備。用於經口使用之調配物包括含有活性成分與無毒醫藥學上可接受之賦形劑的混合物之錠劑。此等賦形劑可為例如惰性稀釋劑或填充劑(例如，蔗糖、山梨糖醇、糖、甘露糖醇、微晶纖維素、包括馬鈴薯澱粉在內之澱粉、碳酸鈣、氯化鈉、乳糖、磷酸鈣、硫酸鈣或磷酸鈉)；造粒及崩解劑(例如，包括微晶纖維素在內之纖維素衍生物、包括馬鈴薯澱粉在內之澱粉、交聯羧甲纖維素鈉、褐藻酸鹽或褐藻酸)；黏合劑(例如，蔗糖、葡萄糖、山梨糖醇、阿拉伯膠、褐藻酸、褐藻酸鈉、明膠、澱粉、預膠凝澱粉、微晶纖維素、矽酸鎂鋁、羧基甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、乙基纖維素、聚乙烯吡咯啶酮或聚乙二醇)；及潤滑劑、助流劑及抗黏劑(例如，硬脂酸鎂、硬脂酸鋅、硬脂酸、矽石、氫化植物油或滑石)。用於經口使用之調配物亦可呈可咀嚼錠劑形式，或呈硬明膠膠囊形式，其中活性成分與惰性固體稀釋劑(例如，馬鈴薯澱粉、乳糖、微晶纖維素、碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土)混合，或呈軟明膠膠囊形式，其中活性成分與水或油介質(例如，花生油、液體石蠟或橄欖油)混合。散劑、顆粒劑及集結粒可使用上文關於錠劑及膠囊所提及之成分以習知方式使用例如混合器、流體床裝置或噴霧乾燥設備經製備。用於經口調配物之其他醫藥學上可接受之賦形劑包括但不限於著色劑、調味劑、增塑劑、保濕劑及緩衝劑。用於經口使用之調配物亦可呈可咀嚼錠劑形式，或呈硬明膠膠囊形式，其中活性成分與惰性固體稀釋劑(例如，馬鈴薯澱粉、乳糖、微晶纖維素、碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土)混合，或呈軟明膠膠囊形式，其中活性成分與水或油介質(例如，花生油、液體石蠟或橄欖油)混合。散劑、顆粒劑及集結粒可使用上文關於錠劑及膠囊所提及之成分以習知方式使用例如混合器、流體床裝置或噴霧乾燥設備經製備。
本文所述之結合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者之結合物)或其醫藥組合物的溶解或擴散控制釋放可藉由該結合物之錠劑、膠囊、集結粒或顆粒劑調配物之適當塗佈，或藉由將該結合物併入至適當基質中來實現。控制釋放包衣可包括上文所提及之塗佈物質及/或例如蟲膠、蜂蠟、葡萄糖蠟、蓖麻蠟、巴西棕櫚蠟、硬脂醇、單硬脂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、硬脂酸棕櫚酸甘油酯、乙基纖維素、丙烯酸系樹脂、dl-聚乳酸、乙酸丁酸纖維素、聚氯乙烯、聚乙酸乙烯酯、乙烯基吡咯啶酮、聚乙烯、聚甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸甲酯、2-羥基甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯水凝膠、1,3丁二醇、乙二醇甲基丙烯酸酯及/或聚乙二醇中之一或多者。在控制釋放基質調配物中，基質材料亦可包括例如氫化甲基纖維素、巴西棕櫚蠟及硬脂醇、卡伯波934、矽酮、三硬脂酸甘油酯、丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯、聚乙烯及/或鹵代碳氟化合物。
該醫藥組合物可如所需呈單位劑型形成。包括於該等醫藥組合物中之活性組分(例如，本文所述之結合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I))的量使得提供在指定範圍內之合適劑量(例如，在0.01-100 mg/kg體重範圍內之劑量)。IX. 投與途徑及劑量
在本文所述之任何方法中，本文中之結合物可藉由用於治療或提供保護以抵禦病毒感染(例如，流感感染)，或用於預防、穩定化或抑制病毒(例如，流感病毒)之增殖或擴散的任何適當途徑經投與。本文所述之結合物可用醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑或賦形劑投與至人類、家養寵物、家畜或其他動物。在一些實施例中，投與包括經肌內、靜脈內(例如，呈無菌溶液形式且在適用於靜脈內使用之溶劑系統中)、皮內、動脈內、腹膜內、病變內、顱內、關節內、前列腺內、胸膜內、氣管內、鼻內、玻璃體內、陰道內、直腸內、經表面、腫瘤內、經腹膜、皮下、結膜下、囊內、經黏膜、心包內、臍內、眼內、經口(例如，錠劑、膠囊、囊片、囊形片或糖漿)、經表面(例如，呈乳膏、凝膠、洗劑或軟膏形式)、經局部、藉由吸入、藉由注射或藉由輸注(例如，連續輸注、直接地浸泡標靶細胞之局部灌注、導管、灌洗、呈乳膏或脂質組合物形式)投與本文所述之結合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者之結合物)或組合物中任一者。在一些實施例中，若除了本文所述之結合物以外亦投與抗病毒劑，則該抗病毒劑或其醫藥組合物亦可以本文所述之投與途徑中任一者經投與。
本文所述之結合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)或其醫藥組合物之劑量取決於如下因素，包括投與途徑、欲治療之疾病(例如，病毒感染的程度及/或病狀)及物理特徵，例如個體之年齡、重量、一般健康狀況。典型地，含於單一劑量內之該結合物或其醫藥組合物之量可係有效地預防、延遲或治療病毒感染而不誘導顯著毒性之量。醫藥組合物可包括介於0.01至500 mg/kg範圍內(例如，0.01、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、150、200、250、300、350、400、450或500 mg/kg)且在一更特定實施例中介於約0.1至約30 mg/kg範圍內且在一更特定實施例中介於約1至約30 mg/kg範圍內之劑量的本文所述之結合物。在一些實施例中，當本文所述之結合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者之結合物)及抗病毒劑或抗病毒疫苗組合(例如，在同一或獨立醫藥組合物中實質上同時，或在同一治療方案中獨立地)經投與時，本文所述之結合物的所需劑量可低於若該結合物單獨用於治療方案中時該結合物之所需劑量。
本文所述之結合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者之結合物)或其醫藥組合物可例如每天、每週、每個月、每半年、每年一或多次(例如，1-10次或更多次；1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次)，或如醫學上必要時經投與至有需要之個體。劑量可以單一或多劑量方案經提供。投與之間的時間安排可在醫學病狀改良時減少，或在患者之健康狀況下降時增加。投與之劑量及頻率可由醫師根據諸如感染程度及個體之不同參數之習知因素經調適。實例
提出以下實例以便向一般技術者提供可如何使用、製備及評估本文所述之組合物及方法之描述，且不意欲僅例示本發明且不意欲限制被本發明者視為其發明之發明的範圍。實例 1 ：製備 Fc 構築體
藉由固相合成來合成構成蛋白構築體(SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、12及14)之胺基酸的逆轉譯。寡核苷酸模板經選殖至pcDNA3.1 (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)中之選殖位點BamHI及XhoI (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)處且包括源於人類介白素-2或人類白蛋白之信號序列。該等pcDNA3.1質體經轉型至Top10大腸桿菌細胞(LifeTech)中。使用PURELINK® HiPure Plasmid Filter Maxiprep套組(LifeTech)對DNA進行擴增，萃取，且純化。該質體DNA使用ExpiFectamine™ 293轉染套組(LifeTech)根據製造商之方案經遞送至HEK-293細胞中。細胞經離心，過濾，且使用MabSelect Sure Resin (GE Healthcare, Chicago, IL, USA)純化上清液。經純化分子使用4-12% Bis Tris SDS PAGE凝膠藉由將1-2 µg每種分子裝載至該凝膠中且使用instant Blue染色進行染色而經分析。各凝膠包括具有經指示分子量標準之分子量梯(圖2-8)。經還原及非還原泳道由「R」及「NR」表示。圖2-8分別顯示由具有SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、12及14之序列的Fc域單體形成之Fc域之非還原及還原SDS-PAGE。實例 2. 合成紮那米韋中間物
Figure 02_image1505
步驟 a.
Figure 02_image1507
5-乙醯胺基-7,8,9-O-三乙醯基-2,6-無水-4-疊氮基-3,4,5-三去氧-D-甘油-D-半乳-壬-2-烯酸甲酯(4.56 g，10.0 mmol)溶解於無水THF (15 mL)中，且該溶液經冷卻至大約13℃。經20分鐘分成數份添加三苯膦(2.89 g，11 mmol)。所得混合物在大約13℃至室溫下經攪拌持續2小時，接著逐滴添加LiOH (24 mg，1 mmol)於水(1.5 mL)中之溶液。在攪拌持續28小時之後，向反應混合物中添加N,N'-雙-boc-1-脒基吡唑(3.26 g，10.5 mmol)及4-二甲基胺基吡啶(244.4 mg，2 mmol)。該反應攪拌持續1.5天。其接著用乙酸乙酯:己烷之1:1混合物(100 mL)稀釋且用水(30 mL)萃取。水層用乙酸乙酯(30 mL)反萃取。經組合之有機層藉由旋轉蒸發經濃縮。殘餘物經由C18逆相管柱層析法(150 g，25至70%乙腈及水)經純化。所收集之溶離份在室溫下藉由旋轉蒸發經濃縮。產生渾濁水溶液且大部分產物呈凝膠形式沉積於燒瓶上。該溶液接著用乙酸乙酯(150 mL)萃取。有機層用於再溶解凝膠材料。其接著經Na2 SO4 乾燥，藉由旋轉蒸發經濃縮，且進一步在高真空下乾燥以提供呈白色泡沫狀之標題化合物。產量6.24 g，92.8%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 673.2。步驟 b.
Figure 02_image1509
來自步驟-a之產物(6.24 g，9.28 mmol)於無水MeOH (20 mL)中之溶液在冰水浴中冷卻且緩慢地添加甲醇鈉於MeOH中之0.5 M溶液(26 mL，13 mmol)。該反應攪拌持續1小時，接著藉由逐滴添加HCl於二噁烷(3 mL)中之4 N溶液小心地將其pH調節至7至7.5。在不高於室溫之溫度下藉由旋轉蒸發移除溶劑。殘餘物用乙酸乙酯及己烷之2:1混合物(150 mL)稀釋，且所得溶液用水(20 mL)萃取。水層用乙酸乙酯(30 mL)反萃取。經組合之有機層經Na2 SO4 乾燥，藉由旋轉蒸發經濃縮，且進一步在高真空下乾燥。產物無需進一步純化繼續用於後續步驟。產量5.03 g，99.2%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 547.2。步驟 c.
Figure 02_image1511
無水DCM (6 mL)中之步驟-b產物(713 mg，1.3 mmol)在冰水浴中冷卻且添加4-二甲基胺基吡啶(159.8 mg，1.3 mmol)及DIPEA (520 mg，4 mmol)。接著向該混合物中逐滴添加氯甲酸4-硝基苯酯(356.6 mg，2.2 mmol)於無水DCM (2 mL)中之溶液。接著移除冰水浴，且該反應混合物攪拌持續3小時且藉由LCMS進行監測(需要時可添加額外氯甲酸4-硝基苯酯)。在該反應完成之後，其用水(10 mL)淬滅，且有機層經萃取且藉由旋轉蒸發經濃縮。殘餘物藉由C18逆相管柱層析法(100 g，20至70%乙腈及水)經純化。所收集之溶離份中的乙腈在室溫下藉由旋轉蒸發經移除。水層接著用乙酸乙酯及己烷之1:1混合物(120 mL)萃取。水層用乙酸乙酯(30 mL)反萃取。經組合之有機層經Na2 SO4 乾燥，藉由旋轉蒸發經濃縮，且進一步在高真空下乾燥以提供呈白色固體狀之標題化合物。產量520 mg，70%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 573.2。實例 3. 合成連接體 -1
Figure 02_image1513
步驟 a.
Figure 02_image1515
經25分鐘分成數份向Z-D-麩胺酸γ-甲酯(2.0 g，6.77 mmol)及甘胺酸甲酯HCl (1.282 g，10.2 mmol)於無水DMF (7 mL)中之混合物中相繼添加DIPEA (2.02 g，15.57 mmol)、HATU (2.66 g，7.0 mmol)。在HATU溶解之後，添加額外量之DIPEA (1.15 g，8.8 mmol)。該反應混合物攪拌持續1.5小時，接著用5% HCl水溶液(100 mL)及EtOAc (100 mL × 2)萃取。有機層藉由旋轉蒸發經濃縮。殘餘物用水(100 mL)及EtOAc/己烷(2:1，150 mL)再萃取。有機層經Na2 SO4 乾燥，藉由旋轉蒸發經濃縮且進一步在高真空下乾燥為白色固體。粗產物無需進一步純化繼續用於後續步驟。產量2.3 g，93%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 367。步驟 b.
Figure 02_image1517
步驟-a產物(2.3 g，6.29 mmol)溶解於MeOH及THF之1:1混合物(10 mL)中。在該溶液在冰水浴中冷卻之後，經1.5小時分成數份添加水(9 mL)中之LiOH單水合物(630 mg，15 mmol)溶液。再攪拌持續2小時之後，該反應混合物用二噁烷(3.7 mL)中之4N HCl中和。有機溶劑在室溫下藉由旋轉蒸發部分地經移除。剩餘材料直接地藉由RPLC (150 g，0至39%乙腈及水)經純化。經兩個步驟，產量2.03 g，88.7%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 339.2。步驟 c.
Figure 02_image1519
藉助於注射幫浦以11 mL/h之速率向步驟-b產物(1.41 g，4.17 mmol)及N-Boc-1,6-二胺基己烷(1.99 g，9.2 mmol)於無水DMF (6 mL)及DIPEA (1.3 g，10 mmol)中之混合物中添加HATU (3.5 g，9.2 mmol)於DMF (10 mL)中之溶液。在HATU完成添加時，該反應再攪拌持續30分鐘且直接地藉由RPLC (150 g，10至50%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量1.3 g，42.4%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 735, [M – Boc + H]+ = 635.4。步驟 d.
Figure 02_image1521
步驟-c產物(1.3 g，1.77 mmol)溶解於MeOH (20 mL)中，且Pd/C添加至該溶液中。該混合物在氫氣下攪拌持續4小時。濾出Pd/C，且濾液藉由旋轉蒸發經濃縮且進一步在高真空下乾燥。產量1.03 g，96.9%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 601。步驟 e.
Figure 02_image1523
經火焰乾燥之反應燒瓶用氮氣沖洗且饋入4-疊氮基丁酸(77 mg，0.6 mmol)、N-羥基丁二醯亞胺(92 mg，0.8 mmol)及無水DMF (0.5 mL)。該混合物經攪拌以溶解固體，且接著添加DCC (125.5 mg，0.608 mmol)。在攪拌持續一小時之後，步驟-d產物(300 mg，0.5 mmol)添加至該反應混合物中。該反應經攪拌持續6小時且直接地使用RPLC (150 g，10至70%乙腈及水，使用01.% TFA作為修飾劑)經純化。所收集之溶離份經凍乾為白色固體(LCMS：[M + H]+ = 712, [M – Boc + H]+ = 612)。該材料再溶解於DCM (約2 mL)及TFA (約1 mL)中且攪拌持續15分鐘。其接著藉由旋轉蒸發經濃縮，且殘餘物藉由RPLC (50 g，0至40%乙腈及水)經純化。產量255 mg，68. 9%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 512, [(M + 2H)/2]+ = 256。實例 4. 合成 Int-1
Figure 02_image1525
步驟 a.
Figure 02_image1527
向紮那米韋中間物(實例2) (532.5 mg，0.93 mmol)於無水THF (2 mL)中之溶液中相繼添加DMAP (490 mg，4 mmol)、碳酸雙(五氟苯基)酯(385 mg，0.911 mmol)。在攪拌隔夜之後，連接體-1 (實例3) (245.6 mg，0.332 mmol)於無水DMF (1 mL)及DIPEA (91 mg，0.3 mmol)中之溶液添加至該反應混合物中。該反應繼續進行2小時，接著藉由RPLC (100 g，5至67%乙腈及水)經純化。產量135 mg，23.8%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 845.9。步驟 b.
Figure 02_image1529
步驟-a產物(135 mg，0.079 mmol)溶解於TFA (0.5 mL)中，且該溶液在室溫下攪拌持續20分鐘。其接著直接地藉由RPLC (50 g，5至32%乙腈及水)經純化。產量88 mg，85.1%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 654.8。步驟 c.
Figure 02_image1531
步驟-b產物(88 mg，0.0673 mmol)於MeOH (1.5 mL)中之溶液在冰水浴中冷卻且添加水(0.5 mL)中之LiOH (5 mg，0.2 mmol)。在該混合物攪拌持續5小時之後，其用二噁烷(0.1 mL)中之4N HCl溶液酸化且藉由HPLC (5至20%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量76.4 mg，78%。藉由LCM發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 614.8。實例 5. 合成連接體 -2
Figure 02_image1533
步驟 a.
Figure 02_image1535
向炔丙基-PEG4-酸(364.4 mg，1.4 mmol)於無水DMF (2 mL)中之溶液中添加HATU (558.9 mg，1.47 mmol)。在攪拌以溶解所有偶合試劑之後，添加DIPEA (390 mg，3 mmol)且攪拌持續10分鐘。添加連接體-1步驟-d產物(實例3，步驟d) (701.1 mg，1.167 mmol)於無水DMF (1 mL)中之溶液。所得混合物經攪拌持續30小時且直接地藉由RPLC (100 g，5至60%乙腈及水)經純化。產量830 mg，84.4%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 843。步驟 b.
Figure 02_image1537
步驟-a產物溶解於THF (5 mL)中且用二噁烷(2.5 mL)中之4N HCl溶液處理。在室溫下攪拌隔夜之後，該反應混合物藉由旋轉蒸發經濃縮。殘餘物再溶解於乙腈/水(1:1，16 mL)中，且該溶液經凍乾。粗產物無需進一步純化繼續用於後續步驟。產量761.8 mg，100%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 643.8。實例 6. 合成 Int-2
Figure 02_image1539
步驟 a.
Figure 02_image1541
經火焰乾燥之反應燒瓶用氮氣沖洗且饋入紮那米韋中間物(實例2) (533.6 mg，0.812 mmol)、DMAP (99.8 mg，0.81 mmol)及無水DCM (1 mL)。在攪拌以溶解起始材料之後，該溶液在冰水浴中冷卻且添加氯甲酸4-硝基苯酯(242 mg，1.2 mmol)。所得混合物經攪拌持續5小時，接著添加至連接體-2 (實例5) (228.4 mg，0.319 mmol)於無水DMF (1 mL)及DIPEA (130 mg，1 mmol)中之溶液中。該反應經攪拌隔夜且藉由RPLC (150 g，20至65%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。所收集之溶離份經凍乾。產量178.3 mg，30.4%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 920.5, [(M + 3H)/3]+ = 614.2。步驟 b.
Figure 02_image1543
步驟-a產物(178.3 mg，0.0969 mmol)溶解於TFA (0.5 mL)中。該反應經攪拌持續20分鐘，接著直接地藉由HPLC (0至25%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量91.8 mg，56.8%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 720.4, [(M + 3H)/3]+ = 480.6。步驟 c.
Figure 02_image1545
步驟-b產物(91.8 mg，0.055 mmol)溶解於MeOH (1 mL)中，且該溶液在冰水浴中冷卻。經1小時分成數份添加水(1 mL)中之LiOH單水合物(21 mg，0.5 mmol)。再攪拌持續2小時之後，該反應混合物用二噁烷(0.3 mL)中之4N HCl溶液酸化且藉由HPLC (0至20%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量36.2 mg，59.4%.%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 680.3, [(M + 3H)/3]+ = 454.0。實例 7. 合成 h-IgG1 Fc-PEG4- 疊氮化物
PEG4-疊氮基NHS酯(98%，180 μmol，9.5當量，71.4 mg於0.5 mL DMF中且用pH 7.4 PBS 1x緩衝溶液稀釋至3.60 mL)添加至h-IgG1 Fc (SEQ ID NO: 4)之溶液(1103 mg於70.0 mL pH 7.4 PBS中，MW~58,000 Da，19.0 μmol)中且該混合物在環境溫度下輕柔地震盪持續12小時。該溶液使用離心濃縮機(30,000 MWCO)經濃縮至約1.5 mL之體積。粗混合物1:10稀釋於PBS pH 7.4中，且再次經濃縮。重複此洗滌程序，共計三次。用此洗滌程序移除小分子試劑。經濃縮Fc-PEG4-疊氮化物用pH 7.4 PBS 1x緩衝液稀釋至70.0 mL且準備用於點擊結合。經純化材料使用Nanodrop™ UV可見光光譜儀(使用基於h-IgG1之胺基酸序列計算的消光係數)經定量。產率係在純化之後定量的。藉由MALDI測定，DAR = 4.3。DAR值可藉由以接近線性關係改變PEG4-疊氮基NHS酯之當量數經調節。例如，當使用7.0當量之PEG4-疊氮化物NHS酯時，DAR值將為3.0。
編碼本文所述任何結合物之Fc之核酸構築體可包括編碼包括胺基酸Lys447 (例如，C末端離胺酸殘基)之Fc的核酸序列。表現後，Fc之C末端離胺酸經蛋白水解裂解，由此產生具有缺少Lys447 (例如，缺少C末端離胺酸殘基)之序列的Fc。C末端離胺酸之存在或不存在不改變Fc或相應結合物之性質。實例 8. 合成重組小鼠血清白蛋白 (MSA)-PEG4- 疊氮化物
PEG4-疊氮基NHS酯(98%，81.7 μmol，4.5當量，32.4 mg於0.3 mL DMF中且用pH 7.4 PBS 1x緩衝溶液稀釋至1.63 mL)添加至重組小鼠血清白蛋白(SEQ ID NO: 80)之溶液(1200 mg於75.0 mL pH 7.4 PBS中，MW~66,000 Da，18.2 μmol)中且該混合物在環境溫度下輕柔地震盪持續12小時。該溶液使用離心濃縮機(30,000 MWCO)經濃縮至約1.5 mL之體積。粗混合物1:10稀釋於PBS pH 7.4中，且再次經濃縮。重複此洗滌程序，共計三次。用此洗滌程序移除小分子試劑。經濃縮MSA-PEG4-疊氮化物用pH 7.4 PBS 1x緩衝液稀釋至75.0 mL且準備用於點擊結合。經純化材料使用Nanodrop™ UV可見光光譜儀(使用基於h-IgG1之胺基酸序列計算的消光係數)經定量。產率係在純化之後定量的。藉由MALDI測定，DAR = 3.5。DAR值可藉由類似於h-IgG1 Fc (實例7)改變PEG4-疊氮基NHS酯之當量數經調節。實例 9. 合成結合物 1
h-IgG1 Fc-PEG4-疊氮化物(實例7) (50 mg，2.815 mL，0.8591 µmol)之PBS溶液添加至含有Int-2 (實例6) (35.2 mg，0.02217 mmol)之15 mL離心管中。在輕柔地震盪該混合物以溶解所有Int-2之後，添加344 µl L-抗壞血酸鈉(59.4 mg，0.3 mmol)、硫酸銅(II) (10 mg，0.05 mmol)及THPTA (23 mg，0.05 mmol)於PBS 7.4緩衝液(1 mL)中之溶液。所得混合物輕柔地震盪隔夜。其相繼藉由在蛋白A管柱上之親和層析法、如實例8所述之尺寸排阻層析法經純化。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出63797 Da之平均質量(DAR = 3.4)。產量27.39 mg，55%產率。圖9顯示結合物1之非還原SDS-PAGE。實例 10. 純化結合物
粗混合物1:10稀釋於PBS pH 7.4中，且相繼使用MabSelect Sure Resin (GE Healthcare, Chicago, IL, USA)、尺寸排阻層析法(HiLoad 26/600 Superdex200 pg, GE Healthcare, Chicago, IL, USA)經純化。彙集含有經純化結合物之溶離份且使用離心濃縮機(30,000 MWCO)經濃縮至大約20 mg/mL。經純化材料使用Nanodrop™ UV可見光光譜儀使用基於hIgG1 Fc(myc)之胺基酸序列計算的消光係數經定量。經純化分子使用4-12% Bis Tris SDS PAGE凝膠藉由將1 µg每種分子裝載至該凝膠中且使用Instant Blue (Expedeon, San Diego, CA, USA)進行染色而經分析。各凝膠包括具有經指示分子量標準之分子量梯。藉由Agilent Analytical HPLC計算產量且測定純度。藉由Maldi MS發現產物峰及MW且計算最終DAR。實例 11. 合成 Int-3
Figure 02_image1547
步驟 a.
Figure 02_image1549
向炔丙基-PEG4-酸(260 mg，1 mmol)及HATU (380.2 mg，1 mmol)於無水DMF (1 mL)中之溶液中添加DIPEA (130 mg)。在攪拌5分鐘之後，添加NH-雙(PEG3-Boc) (500 mg，0.881 mmol)且在室溫下繼續攪拌隔夜。其接著直接地藉由RPLC 9100 g，5至50%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量683 mg，95.8%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 810.4, [M - Boc + H]+ = 710.4, [(M - 2Boc + 2H)/2]+ = 305.8。步驟 b.
Figure 02_image1551
步驟-a產物溶解於TFA (1 mL)中。該溶液經攪拌持續2小時且接著直接地經由RPLC (100 g，0至30%乙腈及水)經純化。產量589 mg，98.7%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 305.8。步驟 c.
Figure 02_image1553
經火焰乾燥之反應燒瓶用氮氣沖洗且饋入紮那米韋中間物(實例2) (572 mg，1 mmol)及無水DCM (1 mL)。在攪拌以溶解起始材料之後，該溶液在冰水浴中冷卻且相繼添加氯甲酸4-硝基苯酯(302.4 mg，1.5 mmol)、DMAP (22.4 mg，0.2 mmol)。所得混合物經攪拌持續5小時，接著添加淬滅水(0.2 mL)。在攪拌持續10分鐘之後，添加無水DMF (1 mL)及DIPEA (163.8 mg，1.26 mmol)中之步驟-b產物(256.7 mg，0.355 mmol)。繼續攪拌持續2小時且接著該反應直接地藉由RPLC (150 g，20至65%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。所收集之溶離份經凍乾。所需產物之產量422.8 mg，其受到一些雜質污染，＜69%產率。該材料無需進一步純化繼續用於後續步驟。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 903.9, [(M + 3H)/3]+ = 603.2。步驟 d.
Figure 02_image1555
步驟-c產物(422.8 mg，＜ 0.245 mmol)溶解於TFA (1 mL)中。該反應經攪拌持續20分鐘，接著直接地藉由HPLC (5至25%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。經兩個步驟，產量169.7 mg，29.2%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 704.0, [(M + 3H)/3]+ = 469.6。步驟 e.
Figure 02_image1557
步驟-d產物(169.7 mg，0.0923 mmol)溶解於MeOH (1.5 mL)中，且該溶液在冰水浴中冷卻。經1小時分成數份添加水(1 mL)中之LiOH單水合物(21 mg，0.5 mmol)。在攪拌隔夜之後，該反應混合物用Dowex 50W x 8氫型酸化且經由RPLC (0至30%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量107.9 mg，66.9%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 663.8, [(M + 3H)/3]+ = 442.9。實例 12. 合成結合物 2
類似於結合物1 (實例9)使用Int-3 (實例11)製備標題結合物。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出63561 Da之平均質量(DAR = 3.3)。產量43.4 mg，43%產率。圖10顯示結合物2之非還原SDS-PAGE。實例 13. 合成 Int-4
Figure 02_image1559
步驟 a.
Figure 02_image1561
經火焰乾燥之反應燒瓶用氮氣沖洗且饋入紮那米韋中間物(實例2) (343.2 mg，0.6 mmol)及無水DCM (1.5 mL)。該溶液在冰水浴中冷卻且相繼添加DIPEA (234 mg，1.8 mmol)、氯甲酸4-硝基苯酯(121 mg，0.6 mmol)及DMAP (67.4 mg，0.6 mmol)。所得混合物經攪拌持續15分鐘，接著添加額外量之氯甲酸4-硝基苯酯(121 mg，0.6 mmol)。在攪拌持續2小時之後，添加水(0.2 mL)以淬滅未反應之氯甲酸酯。在攪拌持續10分鐘之後，向該反應混合物中添加炔丙基-PEG4-胺(185 mg，0.8 mmol)於無水DMF (0.5 mL)中之溶液。該反應繼續進行1小時且接著直接地經由RPLC (100 g，5至60%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。所收集之溶離份經凍乾。產量355 mg，71.3%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 830.2。步驟 b.
Figure 02_image1563
步驟-a產物(355 mg，0.428 mmol)溶解於TFA (1 mL)中。該反應經攪拌隔夜，接著直接地藉由RPLC (5至25%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。經兩個步驟，產量260.2 mg，70.9%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 630.2。步驟 c.
Figure 02_image1565
步驟-b產物(260.2mg, 0.303 mmol)溶解於MeOH (1.5 mL)中。在該溶液在冰水浴中冷卻之後，經1小時分成數份添加LiOH單水合物(42 mg，1 mmol)於水(1 mL)中之溶液。該反應經攪拌隔夜，接著用Dowex 50W x 8氫型酸化且藉由RPLC (0至50%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量78.1 mg，99%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 590.2。實例 14. 合成結合物 3
類似於結合物1 (實例9)使用Int-4 (實例13)製備標題結合物。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出61182 Da之平均質量(DAR = 3.4)。產量50.89 mg，51%產率。圖11顯示結合物3之非還原SDS-PAGE。實例 15. 合成 Int-5
Figure 02_image1567
步驟 a.
Figure 02_image1569
經火焰乾燥之反應燒瓶用氮氣沖洗且饋入3-((S)-1-乙醯胺基-2-乙基丁基)-4-(第三丁氧羰基胺基)-2-羥基環戊烷甲酸(1S, 2S, 3R, 4R)-甲酯(320.4 mg，0.8 mmol)及無水DCM (2 mL)。該溶液在冰水浴中冷卻且相繼添加DIPEA (312 mg，2.4 mmol)、氯甲酸4-硝基苯酯(161.3 mg，0.8 mmol)及DMAP (98 mg，0.8 mmol)。所得混合物經攪拌持續15分鐘，接著添加額外量之氯甲酸4-硝基苯酯(161.3 mg，0.8 mmol)。該反應經攪拌持續2小時，接著添加水(0.2 mL)以淬滅未反應之氯甲酸酯。在攪拌持續10分鐘之後，添加炔丙基-PEG4-胺(259 mg，1.12 mmol)於無水DMF (0.5 mL)中之溶液。該反應經攪拌持續1小時且接著直接地藉由RPLC (100 g，5至60%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。所收集之溶離份經凍乾。產量391.2 mg，74.4%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 658.3, [M – Boc + H]+ = 558.3。步驟 b.
Figure 02_image1571
步驟-a產物(391.2 mg，0.595 mmol)溶解於TFA (0.8 mL)中，且該溶液在室溫下攪拌持續20分鐘。其接著直接地藉由RPLC (100 g，5至60%乙腈及水)經純化。產量323.2 mg，81%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 558.3。步驟 c.
Figure 02_image1573
向步驟-b產物(323.2 mg，0.482 mmol)於THF (2 mL)中之溶液中添加N,N’-雙-Boc-1-脒基吡唑(224.4 mg，0.723 mmol)及PIPEA (260 mg，2 mmol)。該反應混合物經攪拌持續1天且接著用水(3 mL)及EtOAc/己烷(1:1，8 mL)萃取。有機層經Na2 SO4 乾燥且藉由旋轉蒸發經濃縮。殘餘物再溶解於TFA (約1 mL)中，且該溶液經攪拌隔夜。其接著直接地藉由RPLC (100 g，0至30%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。所收集之溶離份經凍乾。產量254.2 mg，83.2%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 600.3, [M – Boc + H]+ = 300.6。步驟 d.
Figure 02_image1575
步驟-c產物(254.2mg, 0.356 mmol)溶解於THF (1.5 mL)中，且該溶液在冰水浴中冷卻。添加CaCl2 二水合物(419 mg，2.85 mmol)，接著經1小時分成數份添加水(2 mL)中之1.8 mL KOH (112 mg，2 mmol)。再攪拌持續3小時之後，該反應混合物藉由Dowex 50W x 8氫型酸化且藉由RPLC (0至30%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量102 mg，49.8%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 586.4, [(M + 2H)/2]+ = 293.8。實例 16. 合成結合物 4
類似於結合物1 (實例9)使用Int-5 (實例15)製備標題結合物。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出63002 Da之平均質量(DAR = 3.4)。產量49.315 mg，49%產率。圖12顯示結合物4之非還原SDS-PAGE。實例 17. 合成 Int-6
Figure 02_image1577
步驟 a.
Figure 02_image1579
經火焰乾燥之反應燒瓶用氮氣沖洗且饋入3-((S)-1-乙醯胺基-2-乙基丁基)-4-(第三丁氧羰基胺基)-2-羥基環戊烷甲酸(1S, 2S, 3R, 4R)-甲酯(280.4 mg，0.7 mmol)及無水DCM (1 mL)。在攪拌以溶解起始材料之後，DMAP (85.7 mg，0.7 mmol)、碳酸雙(五氟苯基)酯(295.6 mg，0.75 mmol)相繼添加至該溶液中。所得混合物經攪拌持續1小時，接著添加至連接體-2 (實例5) (157.5 mg，0.22 mmol)於無水DMF (1 mL)及DIPEA (130 mg，1 mmol)中之溶液中。該反應經攪拌隔夜且藉由RPLC (50 g，5至90%乙腈及水)經純化。所收集之溶離份經凍乾。產量134.1 mg，40.7%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 748.6。步驟 b.
Figure 02_image1581
步驟-a產物(134.1 mg，0.0896 mmol)溶解於TFA (0.5 mL)中。該溶液經攪拌持續20分鐘，接著直接地藉由RPLC (50 g，5至60%乙腈及水)經純化。產量108.4 mg，93.4%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 648.3, [(M + 3H)/3]+ = 432.8。步驟 c.
Figure 02_image1583
向步驟-b產物(108.4 mg，0.0837 mmol)於無水THF (1 mL)中之溶液中添加N,N’-雙-Boc-1-脒基吡唑(81.3 mg，0.285 mmol)及DIEPA (65 mg，0.5 mmol)。該反應在室溫下經攪拌持續2.5天，接著直接地藉由RPLC (100 g，40至75%乙腈及水)經純化。產量73.6 mg，49.4%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 3H)/3]+ = 594.2。步驟 d.
Figure 02_image1585
步驟-c產物(73.6 mg，0.041 mmol)溶解於TFA (0.5 mL)中。該溶液經攪拌持續20分鐘，接著直接地藉由RPLC (50 g，5至60%乙腈及水)經純化。產量62.1 mg，94.1%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 690.4, [(M + 3H)/3]+ = 460.8。步驟 e.
Figure 02_image1587
THF (3 mL)中之步驟-d產物(62.1 mg，0.0386 mmol)在冰水浴中冷卻且經1小時分成數份添加45% w/w KOH溶液(0.2 mL)。該反應再攪拌持續2小時，接著用二噁烷(0.8 mL)中之4N HCl溶液酸化且用己烷(10 mL)及水(1.5 mL)萃取。水層藉由HPLC (0至20%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量36.2 mg，59.4%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 676.5, [(M + 3H)/3]+ = 451.4。實例 18. 合成結合物 5
類似於結合物1 (實例9)使用Int-6 (實例17)製備標題結合物。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出63561 Da之平均質量(DAR = 3.3)。產量43.4 mg，43%產率。圖13顯示結合物5之非還原SDS-PAGE。實例 19. 合成 Int-7
Figure 02_image1589
步驟 a.
Figure 02_image1591
經5分鐘分成數份向炔丙基-PEG4-酸(609 mg，2.34 mmol)及NH-雙(PEG1-疊氮化物) (500 mg，2.055 mmol)於無水DMF (2 mL)中之溶液中添加HATU (889.7 mg，2.34 mmol)。在攪拌以溶解所有偶合試劑之後，添加DIPEA (390 mg，3 mmol)且繼續攪拌持續1小時。其接著直接地藉由RPLC (100 g，5至40%乙腈及水)經純化。產量918 mg，92%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 486.2。步驟 b.
Figure 02_image1593
步驟-a產物(918 mg，1.89 mmol)溶解於THF中，且該溶液經冷卻至約13℃。經10分鐘分成數份添加三苯膦(1.141 g，4.35 mmol)。所得混合物在約13℃至室溫下經攪拌持續2小時。添加LiOH單水合物(42 mg，1 mmol)於水(2 mL)及MeOH (1 mL)中之溶液。在繼續攪拌持續20小時之後，該反應藉由RPLC (100 g，0至30%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量825 mg，65.9%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 434.4。步驟 c.
Figure 02_image1595
經火焰乾燥之反應燒瓶用氮氣沖洗且饋入紮那米韋中間物(實例2) (865 mg，1.51 mmol)及無水DCM (5 mL)。在攪拌以溶解起始材料之後，該溶液在冰水浴中冷卻且相繼添加氯甲酸4-硝基苯酯(365.3 mg，1.81 mmol)、DMAP (152.2 mg，0.755 mmol)。移除冰水浴，且該混合物經攪拌持續3小時。添加額外量之氯甲酸4-硝基苯酯(304.4 mg，1.51 mmol)，且繼續攪拌持續1小時。該反應接著用水(1 mL)淬滅。在劇烈攪拌持續1小時之後，該反應混合物用水(20 mL × 2)及DCM (20 mL)萃取。有機層經攪拌隔夜，經Na2 SO4 乾燥且藉由旋轉蒸發經濃縮。該材料無需進一步純化繼續用於後續步驟。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 738.2。步驟 d.
Figure 02_image1597
步驟-b產物(429.7 mg，0.65 mmol)及DIPEA (260 mg，2 mmol)於無水THF (1 mL)中之溶液逐滴添加至步驟-c產物中。所得混合物經攪拌持續2小時，接著直接地藉由RPLC (100 g，10至65%乙腈及水)經純化。所收集之溶離份中的乙腈在室溫下藉由旋轉蒸發經移除。異質水層用EtOAc (200 mL)萃取，接著用EtOAc (50 mL)反萃取。經組合之有機層經Na2 SO4 乾燥且藉由旋轉蒸發經濃縮至乾。產量442 mg，41.7%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 815.8, [(M - Boc + 2H)/2]+ = 765.8, [(M - 2Boc + 2H)/2]+ = 716。步驟 e.
Figure 02_image1599
步驟-d產物(441 mg，0.271 mmol)溶解於TFA (1 mL)中。該反應經攪拌持續20分鐘，接著直接地藉由HPLC (5至20%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量308 mg，77.9%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 615.8, [(M + 3H)/3]+ = 411。步驟 f.
Figure 02_image1601
步驟-e產物(308 mg，0.211 mmol)溶解於MeOH (1 mL)及水(0.5 mL)中，且該溶液在冰水浴中冷卻。經1小時分成數份添加LiOH單水合物(42 mg，1 mmol)於水(1 mL)中之溶液。該反應經攪拌隔夜，藉由二噁烷(0.25 mL)中之4 N HCl溶液酸化，且藉由RPLC (0至20%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量198 mg，64%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 575.8, [(M + 3H)/3]+ = 384.2。實例 20. 合成結合物 6
類似於結合物1 (實例9)使用Int-7 (實例19) (SEQ ID NO: 18)製備標題結合物。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出62854. Da之平均質量(DAR = 3.1)。產量175.4 mg，50%產率。圖14顯示結合物6之非還原SDS-PAGE。所得之結合物在圖43中示出。實例 21. 合成 Int-8
Figure 02_image1603
步驟 a.
Figure 02_image1605
5-乙醯胺基-7,8,9-O-三乙醯基-2,6-無水-4-疊氮基-3,4,5-三去氧-D-甘油-D-半乳-壬-2-烯酸甲酯(1.8 g，4.0 mmol)溶解於40 mL甲醇中且接著用400 mg 5% Pd/C及1.1 g Boc酐(5.0 mmol)處理，接著該反應混合物在室溫下在氫氣氛圍下經攪拌持續1小時。藉由過濾移除鈀-木炭。濾液經濃縮且無需純化即用於下一步驟。步驟 b.
Figure 02_image1607
來自前一步驟之產物溶解於20 mL無水甲醇中且接著在冰水浴中冷卻下用2 mL甲醇中之甲醇鈉(0.5 M)逐滴處理。2小時之後，藉由LCMS測定反應之進展。該反應用1N HCl淬滅至pH 5-6。所得溶液經濃縮且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以5%至100%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀使用0.1% TFA作為修飾劑經純化。藉由LCMS發現之離子：(M+H)+ =405步驟 c.
Figure 02_image1609
5-乙醯胺基-2,6-無水-4-[(第三丁氧羰基)胺基]-3,4,5-三去氧-D-赤式-壬-2-烯酸甲酯(0.4 g，1 mmol)溶解於10 mL丙酮、4 mL 2,2-二甲氧基丙烷及20 mg對甲苯磺酸水合物(0.1 mmol)中。所得溶液在室溫下攪拌隔夜，接著用1 mL飽和NaHCO3 淬滅。該混合物經濃縮且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以5%至100%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀不使用修飾劑經純化。藉由LCMS發現之離子：(M+H)+ =445。步驟 d.
Figure 02_image1611
氫化鈉(40 mg，60%於油中，1.0 mmol)在冰水浴冷卻下添加至5 mL無水THF中之5-乙醯胺基-2,6-無水-4-[(第三丁氧羰基)胺基]-3,4,5-三去氧-8,9-O-(1-甲基亞乙基)-D-赤式-壬-2-烯酸甲酯(0.25 g，0.50 mmol)中。所得溶液經攪拌持續0.5小時，接著添加溴乙酸苯甲酯(0.23 g，1.0 mmol)。所得溶液經攪拌持續2小時且用5 mL水中之10%氯化銨淬滅。接著，該溶液用50 mL乙酸乙酯稀釋。分離有機層且經硫酸鈉乾燥。經乾燥之有機溶液經濃縮且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以5%至100%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀不使用修飾劑經純化。藉由LCMS發現之離子：(M+H)+ =593。實例 22. 合成 Int-9
Figure 02_image1613
步驟 a.
Figure 02_image1605
5-乙醯胺基-7,8,9-O-三乙醯基-2,6-無水-4-疊氮基-3,4,5-三去氧-D-甘油-D-半乳-壬-2-烯酸甲酯(10 g，22 mmol)溶解於100 ml甲醇中且接著用油浴加熱至60℃，SnCl2 (5.7 g，20 mmol)分成3份添加至該溶液中(小心，氣體釋出)。該反應混合物經攪拌持續10 min，此時藉由HPLC發現反應完成。該反應溶液在劇烈攪拌下緩慢地添加至50 ml飽和NaHCO3 溶液及50 g矽藻土之溶液中。過濾所得漿液。濾液經Boc2 O (6.6 g，30 mmol，1.5 eq)處理。在室溫下2小時之後，該溶液經濃縮以移除大部分甲醇，溶解於200 ml DCM中，且用100 ml DCM萃取兩次。經組合之萃取物經硫酸鈉乾燥，過濾且無需進一步純化即用於下一步驟中。粗物質產量12 g，100%。藉由LCMS發現之離子：M+H =531。步驟 b.
Figure 02_image1607
來自前一步驟之材料溶解於60 ml無水甲醇中，接著在冰水浴中冷卻下用10 ml甲醇中之甲醇鈉(0.5 M)處理。藉由LCMS監測反應之進展，其在2 h之後完成。該反應用1N HCl淬滅至pH 5-6。所得溶液經濃縮且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以0%至30%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀使用0.1% TFA作為修飾劑經純化。產物之產量7.2 g，80%。藉由LCMS發現之離子：M+H =405。步驟 c.
Figure 02_image1617
前一步驟之產物之溶液(3.5 g，8.5 mmol)、CDI (2.8 g，2 eq)、三甲胺(4.2 ml，30 mmol)及DMAP (240 mg，2 mmol)在乙腈(50 ml)中加熱隔夜，接著濃縮且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以0%至30%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀不使用修飾劑經純化。所需產物之產量2.3 g，60%。藉由LCMS發現之離子：M+H =431。步驟 d.
Figure 02_image1619
氫化鈉(400 mg，60%於油中，10 mmol)在冰水浴下添加至50 ml無水THF (濕度敏感性反應)中之前一步驟之產物(1.45 g，3.3 mmol)中。所得溶液經攪拌持續0.5小時，接著溴-乙酸第三丁酯(2 g，10 mmol)添加至上述溶液中，所得溶液加熱至60℃隔夜且用乙酸淬滅。所得溶液經濃縮且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以0%至50%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀使用TFA作為修飾劑經純化。產量1 g，57%。藉由LCMS發現之離子：M+H =593。步驟 e.
Figure 02_image1621
前一步驟之產物(1.2 g，2.2 mmol)在室溫下與10 ml TFA一起攪拌隔夜，且藉由LCMS監測保護基脫除之進展。所得溶液經濃縮且無需純化即用於下一步驟。殘餘物再溶解於20 ml THF中，接著N,N'-雙-boc-1-脒基吡唑(1 g，3.3 mmol)、4-二甲基胺基吡啶(120 mg，1 mmol)及三乙胺(0.7 ml，5 mmol)添加至該溶液中，且所得溶液加熱至60℃持續2小時。所得溶液經濃縮且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以0%至50%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀不使用修飾劑經純化。產量700 mg，84%。藉由LCMS發現之離子：M+H =631。步驟 f.
Figure 02_image1623
在室溫下向連接體-3 (如實例19中所述經製備) (73 mgg，0.14 mmol)及前一步驟之產物(200 mg，0.32 mmol，2.2 eq)於DMF (30 ml)中之溶液中添加EDC (100 mg，0.5 mmol)、HOAt (65 mg，3 mmol)及DIEA (0.14 ml，1 mmol)。該溶液經攪拌隔夜。所得溶液經濃縮且經純化且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以0%至50%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀不使用修飾劑經純化。產量120 mg，52%。藉由LCMS發現之離子：M/2+H =830。步驟 g.
Figure 02_image1625
2 ml H2O中之氫氧化鋰(24 mg，1 mmol)添加至前一步驟之產物(120 mg，0.07 mmol)於2 ml THF及1 ml MeOH中之溶液中，LCMS監測反應之進展。在完成之後，向該溶液中添加AMBERLITE® IRN-77離子交換樹脂以調節至pH1，接著過濾所得溶液且濾液經濃縮且無需純化即用於下一步驟。所得化合物在室溫下經2 ml TFA處理，該溶液在40℃下攪拌隔夜，接著濃縮且藉由以0%至20%乙腈及水溶離之HPLC使用TFA作為修飾劑經純化。產量60 mg，74%產率。藉由LCMS發現之離子：[M/2]+ 1 =589.8。實例 23. 神經胺糖酸酶抑制分析
如下文所述執行使用2’-(4-甲基繖形酮基)-α-D-N-乙醯基神經胺糖酸(MUNANA)受質之神經胺糖酸酶抑制分析。簡言之，50 μL經純化、重組流感病毒神經胺糖酸酶(0.1 ng/µL，50 mM Tris、5 mM CaCl2、200 mM NaCl，pH 7.5)與50 μL抑制劑混合且在室溫下培育持續30 min。在適當範圍內之至少5種濃度之各抑制劑用於各重複。在培育之後，50 μL在50 mM Tris、5 mM CaCl2、200 mM NaCl (pH 7.5)中之400 µM MUNANA添加至該溶液中以使用12-尖端移液管(Eppendorf)開始反應。陽性及陰性對照物包括於各12-孔泳道中。在板上針對各泳道開始反應之後，反應混合物立即裝載於SpectraMax M5 (Molecular Devices)上，其中在365 nm之激發波長及445 nm之發射波長下經25 min過程對螢光定量。選擇其中陽性對照物產生大約1,000之螢光信號之單一時間點。所有分析均一式三份進行且使用GraphPad Prism以log[抑制劑]對抑制百分率之S型擬合計算各抑制劑之IC50值。圖15顯示在結合物1及Int-2之線性範圍內以RFU/min計之動力學數據的曲線，其顯示作為神經胺糖酸酶抑制劑之結合物1之較大功效。圖16及圖17分別顯示結合物1-6針對rH1N1神經胺糖酸酶及rH3N2神經胺糖酸酶之分析結果(表2)。 表2：結合物針對H1N1及H3N2神經胺糖酸酶之IC50值
結合物編號 H1N1 IC50 (nM) H3N2 IC50 (nM)
結合物1 3.9 32.5
結合物2 3.7 17.6
結合物3 3.6 38
結合物4 1.9 17.2
結合物5 1.1 14.3
結合物6 4.1 29.8
實例 24 ：細胞毒性分析
測試結合物1、2、3及6之細胞毒性。一式三份製備以10 µM開始之各結合物之十種兩倍連續稀釋液，用於接種96-孔培養板中之MDCK細胞。在處理之後四天使用CellTiter-GLO套組測定細胞生存力。使用XLfit劑量反應模型計算細胞毒性濃度之50% (CC50 ) (表3)。關於所測試之所有化合物，未觀察到高達10 μM之細胞毒性，例外為結合物3。在結合物3之情況下，細胞病理效應(CPE)分析(參見實例23)中之EC50 比此分析中之CC50 低725倍。 表3：細胞毒性測試
結合物編號 CC50 (µM)
結合物1 ＞10
結合物2 ＞10
結合物3 7.98
結合物6 ＞10
PBS ＞10
紮那米韋 ＞10
實例 25. 細胞病理效應分析 基於 CPE 之微量中和分析 #1
為了量測神經胺糖酸酶結合物保護哺乳動物細胞以抵禦流感病毒之感染及破壞的能力，進行基於細胞病理效應(CPE)之微量中和分析。簡言之，一式兩份製備以0.25 µM開始之各結合物之二十種兩倍連續稀釋液，用於一小時接種96-孔板中接種之MDCK細胞。INFV CA/09病毒以感染複數(MOI) 0.001添加至細胞中用於一小時培育。在培育後第四天，細胞用結晶紫染色且讀取光學密度以使用XLfit劑量反應模型計算各TA之50%有效濃度(EC50)。紮那米韋用作比較物及陽性對照物。人類Fc作為陰性對照物包括在內。結合物1、2、3及6均證明瞭優於紮那米韋對照物之效能，證明EC50比紮那米韋低42至227倍(表4)。 表4：基於CPE之微量中和分析#1
結合物編號 EC50 (nM)
1 2.0574
2 4.1487
3 11.007
6 5.2167
PBS N/C
人類Fc N/C
紮那米韋† 468.7
N/C：無法計算 † 開始濃度10000 nM基於 CPE 之微量中和分析 #2
進行額外基於CPE之微量中和分析以進一步評估結合物6及結合物7之活體外活性。簡言之，以160 nM之開始濃度製備測試物品，且製備總計十種2倍稀釋液。該等測試物品稀釋液接著與相對於單層感染複數為0.001之流感A病毒(INFV CA/09)預混合。一小時之後，該測試物品+病毒混合物添加至在96-孔板中在標準條件下生長至70 - 80%匯合之Madin-Darby犬腎(MDCK)細胞中。同樣處理紮那米韋對照物，除了開始濃度為9600 nM，因為預期其不如正在測試之結合物有效。在培育四天之後，單層用結晶紫染色且測定光學密度(反映單層健康)以使用XLfit劑量反應模型(idbs; https://www.idbs.com)計算50%有效濃度(EC50)。
如表5所示，濃度為496 nM之紮那米韋使病毒介導之細胞病理效應減半。相比之下，結合物6係大約100倍更具活性，其中EC50僅為4.64 nM。結合物7進一步改良活性達大約15倍，從而使EC50減至亞nM水準。 表5：基於CPE之微量中和分析#2
結合物編號 EC50 (nM)
6 4.64
7 0.31
紮那米韋 496
實例 26. 細胞生存力分析
A549細胞在化合物處理之前一天接種於96-孔板中。細胞用濃度為1 µM – 10 nM之結合物3 (圖18A)、結合物4 (圖18B)或結合物6 (圖18C)處理持續24小時。接著使用Cell Titer Glow (Promega)量測細胞生存力。結果表示三個生物重複樣品之平均值及SD。在用於病毒生長分析(實例27)之任何濃度下，針對任何濃度之任何結合物均未觀察到對細胞生存力之影響。實例 27. 病毒生長分析
為了量測神經胺糖酸酶結合物抑制人類上皮細胞中之所關注之致病性流感病毒株的生長之能力，進行病毒斑塊減少分析。簡言之，A549細胞在化合物處理之前一天接種於24-孔板中。細胞用濃度為1 µM – 10 nM之化合物處理持續2小時且經MOI為0.01之所指示病毒株感染以用於一小時培育。移除病毒，洗滌細胞且以濃度1 µM – 10 nM再應用化合物。在所指示之時間點收集上清液且在MDCK細胞中使用斑塊分析方法進行滴定。結果表示三個生物重複樣品之平均值及SD。奧司他韋用作比較物及陽性對照物。結合物3 (圖19A-19E)、結合物4 (圖20A-E)或結合物6 (圖21A-21E及圖22A-22E)均證明瞭優於奧司他韋對照物之效能，顯示在低100倍濃度下類似或(通常)優於奧司他韋之斑塊減少。使用細胞生存力分析(實例26)針對各測試物品評估該等化合物(以評估測試物品之潛在細胞毒性)對A549細胞之影響。簡言之，A549細胞在化合物處理之前一天接種於96-孔板中。細胞用濃度為1 µM – 10 nM之化合物處理持續24小時.接著使用Cell Titer Glow (Promega)量測細胞生存力。結果表示三個生物重複樣品之平均值及SD。實例 28. 小鼠血清半衰期
藥物動力學(PK)研究使用在20與22公克之間的雌性CD-1小鼠(Charles River Laboratories)。小鼠藉助於尾靜脈經IV注射50 mg/kg之測試物品(10 ml/kg之劑量體積)。動物經圈養於標準IACUC批准之圈養條件下。在適當時間，對動物進行非末端放血(眶後、頰或藉由尾靜脈)，其中血液經收集於EDTA管中以預防凝血。所收集之血液經離心(2,000 x g，持續10分鐘)且抽出血漿以隨時間分析測試物品濃度。
藉由如下夾心ELISA量測在各時間點處結合物6或hIgG1 Fc之血漿濃度：結合物6分子經捕捉於經神經胺糖酸酶包被之板或經抗hIgG1抗體包被之板上且接著使用HRP結合之抗人類IgG-Fc抗體進行偵測。hIgG1使用抗hIgG1 Fc抗體經捕捉。在GraphPad Prism中使用結合物6 (或hIgG1 Fc)之4PL非線性迴歸標準曲線計算蛋白質濃度。更詳細方法描述提供於下文中。
Qiagen Ni-NTA HisSorb板(目錄號35061, Qiagen)經來自A/California/04/2009 (H1N1) (11058-VNAHC, Sino Bio)之神經胺糖酸酶或在1X KPL包被緩衝液中之抗IgG1 Fc抗體(5150-0041, SeraCare)包被。在其中該抗IgG1 Fc抗體用於捕捉測試物品之情況下，選擇捕捉及偵測結合不同抗原決定基之抗IgG1 Fc抗體。板在室溫下經培育持續1小時。血漿樣品之連續稀釋液經塗板且在室溫下經培育持續2 h (樣品稀釋劑：0.5%脫脂奶粉+ 3%山羊血清於PBS 0.05% Tween20中；原生小鼠血漿最終濃度為1:900)。在各板上一式兩份進行介於500 – 0.230 ng/mL範圍內之結合物6或hIgG1 Fc標準曲線。
在2 h培育之後，板在具有0.05% Tween20之300 uL PBS中洗滌5次。結合於板上之神經胺糖酸酶(或抗hIgG1 Fc抗體)的結合物6接著在室溫下用1:2000稀釋於樣品稀釋劑中之HRP結合之抗人類IgG Fc F(ab’)2 (Jackson 709-036-098)探測持續1小時。板接著在具有0.05% Tween20之300 uL PBS中洗滌8次且用TMB受質顯影持續7分鐘。該反應用1N H2SO4停止。在450 nm下讀取吸光度。相似方案用於hIgG1 Fc，其中僅抗hIgG1 Fc抗體用於捕捉。使用神經胺糖酸酶或抗hIgG1 Fc抗體捕捉在不同時間點處量測之結合物6之量在實驗誤差內為相似的，表明完整結合物活體內穩定。
使用GraphPad Prism Version 6，根據結合物6 (或hIgG1 Fc)標準曲線之非線性迴歸分析(S型，4PL分析)內推測試樣品中之總結合物6 (或hIgG1 Fc)。使用WinNonlin軟體計算PK參數。比較結合物6及hIgG1 Fc之曲線顯示於圖23中且關鍵PK參數之概述提供於表6中。意外地，結合物6之血漿暴露及終末半衰期顯著優於野生型hIgG1 Fc。結合物6在8天內之AUC比hIgG1 Fc高3倍，且結合物6之終末半衰期為214小時，對人類IgG1 Fc之52小時。 表6：與hIgG1 Fc相比結合物6之小鼠PK
半衰期(h) AUC 最後(h*mg/mL)
結合物6 214 33100
hIgG1 51.8 10600
實例 29. 結合物 6 在致死性小鼠流感模型中之功效：研究 #1
在雌性BALB/c小鼠中針對致死性INFV A H1N1流感感染評估結合物6。該實驗包含7組，每組5隻小鼠。在第0天，所有小鼠均用1xLD90 H1N1 A/Texas/36/91攻擊。第1-6組在攻擊之前4小時接受IV治療(表7)。人類IgG1 (單獨Fc)作為額外陰性對照物包括在內。第7組藉助於經口遞送接受磷酸奧司他韋，在感染後8小時開始，每天兩次，持續5天。在攻擊之後監測所有小鼠之重量減輕(圖24，表8)及存活率(圖25，表9)，持續15天。
經結合物6治療之小鼠在所測試之所有濃度下在使用單一劑量時均顯示100%存活率，分別與媒劑對照組及hIgG1對照組之20%及0%存活率相比。當與媒劑組(p=0.0135)相比時，結果為統計學顯著的，儘管具有小的組大小(n=5)。當與磷酸奧司他韋組相比時，結合物6在低500倍之累積劑量(mg/kg)下證明相似功效。小鼠在所有結合物6劑量下在該實驗之整個過程中維持其重量，優於奧司他韋對照組。 表7：研究設計
組 n=5 攻擊 第0 天 化合物 劑量 (mg/kg) 治療 途徑/ 時程
1 流感A病毒，H1N1病毒株A/Texas/36/91，藉助於IN途徑。 媒劑(PBS) N/A IV，q.d. 攻擊前4小時
2 單獨Fc 50
3 結合物6 50
4 結合物6 10
5 結合物6 2
6 結合物6 0.4
7 奧司他韋(TamifluTM ) 20 PO, b.i.d. 攻擊後8小時，持續5天
表8：每天重量平均值
感染後天數 每天平均重量( 僅第1 及2 組增加小鼠數目)
媒劑(PBS) 單獨Fc 結合物6 磷酸奧司他韋
50 mg/kg 50 mg/kg 10 mg/kg 2 mg/kg 0.4 mg/kg 20 mg/kg
0 17.9 (5) 17.9 (5) 18.7 19.3 18.5 18.8 18.8
1 18.0 (5) 18.0 (5) 18.8 19.36 18.6 18.8 18.9
2 18.5 (5) 18.8 (5) 19.2 19.6 19.4 18.8 19.2
3 17.7 (5) 17.7 (5) 18.9 19.5 19.1 18.9 19.1
4 17.2 (5) 17.0 (5) 19.5 19.9 19.3 18.9 18.9
5 16.3 (5) 15.8 (5) 19.2 19.8 19.5 18.7 18.8
6 15.6 (4) 15.0 (5) 19.1 19.9 19.5 18.7 18.4
7 15.5 (2) 14.0 (2) 18.8 19.6 19.2 18.9 17.3
8 17.2 (1)    19.1 20.0 19.7 19.2 17.1
9 20.1 (1)    18.7 19.3 19.1 18.8 17.8
10 20.0 (1)    19.1 20.1 19.5 19.3 18.9
11 20.4 (1)    19.0 19.8 19.2 19.2 18.7
12 20.6 (1)    19.6 20.3 19.8 19.3 19.2
13 20.3 (1)    19.2 20.4 19.7 19.7 19.3
14 20.7 (1)    19.5 20.6 19.9 19.8 19.6
表9：小鼠存活率
化合物 劑量 平均 存活期 存活率% 相對媒劑之顯著性(p)
媒劑(PBS) N/A 7 20 N/A
單獨Fc 50 mg/kg 7 0 0.8335
結合物6 50 mg/kg 15 100 0.0135
結合物6 10 mg/kg 15 100 0.0135
結合物6 2 mg/kg 15 100 0.0135
結合物6 0.4 mg/kg 15 100 0.0135
磷酸奧司他韋 20 mg/kg B.I.D 15 100 0.0135
實例 30. 結合物 6 在致死性小鼠流感模型中之功效：研究 #2
在雌性BALB/c小鼠中針對致死性INFV A H3N2流感感染評估結合物6。該實驗包含11組，每組5隻小鼠。在第0天，所有小鼠均用1xLD90 H3N2 A/Hong Kong/1/68攻擊。第1-10組在攻擊之前4小時接受IV治療(表10)。人類IgG1 (單獨Fc)作為額外陰性對照物包括在內。第11組藉助於經口遞送接受磷酸奧司他韋，在感染後8小時開始，每天兩次，持續5天。在攻擊之後監測所有小鼠之重量減輕(圖26)及存活率(圖27，表11)，持續15天。
經結合物6治療之小鼠在使用低至0.4 mg/kg之單一劑量時顯示100%存活率，且在使用0.2 mg/kg之單一劑量時顯示80%存活率，分別與媒劑對照組及hIgG1對照組之0%存活率相比。80%小鼠在奧司他韋對照組中存活。當與媒劑組(p=0.0128)相比時，結果為統計學顯著的，儘管具有小的組大小(n=5)。當與磷酸奧司他韋組相比時，結合物6在低1000倍之累積劑量(mg/kg)下證明相似功效。小鼠在所有結合物6劑量下在低至0.4 mg/kg時維持其重量在5%內，優於奧司他韋對照組。 表10：研究設計
組 n=5 攻擊 第0 天 測試物品 劑量 (mg/kg) 治療 途徑/ 時程 讀出/ 終點
1 H3N2 A/Hong Kong/1/68，藉助於IN途徑 媒劑(PBS) N/A IV，q.d. 攻擊前4小時 在攻擊之後監測每天重量及健康分數，持續15天。 存活率%
2 單獨Fc 50
3 結合物6 50
4 2
5 0.4
6 0.2
7 0.1
8 0.05
9 0.025
10 0.0125
11 奧司他韋(TamifluTM ) 20 PO，b.i.d. 在攻擊之後8小時，持續5天
表11：小鼠存活率
化合物 劑量 平均存 活期( 天) 存活率% 相對媒劑之顯著性(p- 值)
媒劑(PBS) N/A 9 0 N/A
Fc對照物 50 mg/kg 8 0 0.2498
結合物6 50 mg/kg 15 100 0.002
2 mg/kg 15 100 0.002
0.4 mg/kg 15 100 0.002
0.2 mg/kg 15 80 0.0128
0.1 mg/kg 9 20 0.8264
0.05 mg/kg 9 20 0.5769
0.025 mg/kg 8 20 ＞0.9999
0.0125 mg/kg 11 0 0.4703
磷酸奧司他韋 (B.I.D，持續5天) 20 mg/kg 15 80 0.0052
實例 31. 合成 Int-10
Figure 02_image1627
步驟 a.
Figure 02_image1629
5-乙醯胺基-7,8,9-O-三乙醯基-2,6-無水-4-疊氮基-3,4,5-三去氧-D-甘油-D-半乳-壬-2-烯酸甲酯(SM-1，10 g，22 mmol)溶解於100 ml甲醇中且接著用油浴加熱至60℃，SnCl2 (5.7 g，20 mmol)分成3份添加至該溶液中(小心，氣體釋出)。該反應混合物經攪拌持續10 min，此時藉由HPLC發現反應完成。該反應溶液在劇烈攪拌下緩慢地添加至50 ml飽和NaHCO3 溶液及50 g矽藻土之溶液中。過濾所得漿液。濾液經Boc2 O (6.6 g，30 mmol，1.5 eq)處理。在室溫下2小時之後，該溶液經濃縮以移除大部分甲醇，溶解於200 ml DCM中，且用100 ml DCM萃取兩次。經組合之萃取物經硫酸鈉乾燥，過濾且無需進一步純化即用於下一步驟中。粗物質產量12 g，100%。藉由LCMS發現之離子：M+H =531。步驟 b.
Figure 02_image1631
來自前一步驟之材料溶解於60 ml無水甲醇中，接著在冰水浴中冷卻下用10 ml甲醇中之甲醇鈉(0.5 M)處理。藉由LCMS監測反應之進展，其在2 h之後完成。該反應用1N HCl淬滅至pH 5-6。所得溶液經濃縮且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以0%至30%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀使用0.1% TFA作為修飾劑經純化。產物之產量7.2 g，80%。藉由LCMS發現之離子：M+H =405。步驟 c.
Figure 02_image1633
前一步驟之中間物之溶液(3.5 g，8.5 mmol)、CDI (2.8 g，2 eq)、三甲胺(4.2 ml，30 mmol)及DMAP (240 mg，2 mmol)在DMF (50 ml)中在60℃下加熱隔夜，接著濃縮且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以0%至30%乙腈及所生成物溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀不使用修飾劑經純化。所需產物之產量2.3 g，60%。藉由LCMS發現之離子：M+H =431。步驟 d.
Figure 02_image1635
氫化鈉(400 mg，60%於油中，10 mmol)在冰水浴下添加至50 ml無水THF (濕度敏感性反應)中之Int-4 (1.45 g，3.3 mmol)中。所得溶液經攪拌持續0.5小時，接著溴乙酸第三丁酯(2 g，10 mmol)添加至上述溶液中。所得溶液加熱至60℃隔夜且用乙酸淬滅，經濃縮且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以0%至50%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀使用TFA作為修飾劑經純化。產量1 g，57%。藉由LCMS發現之離子：M+H =593。(藉由HPLC發現該反應相當乾淨，但分離產量低)步驟 f.
Figure 02_image1621
前一步驟之中間物(1.2 g，2.2 mmol)在室溫下與10 ml TFA一起攪拌隔夜。藉由LCMS監測保護基脫除之進展。所得溶液經濃縮且無需純化即用於下一步驟。
前一反應之殘餘物溶解於20 ml THF中，接著N,N'-雙-boc-1-脒基吡唑(1 g，3.3 mmol)、4-二甲基胺基吡啶(120 mg，1 mmol)及三乙胺(0.7 ml，5 mmol)添加至該溶液中，且所得溶液加熱至60℃持續2小時。所得溶液經濃縮且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以0%至50%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀不使用修飾劑經純化。產量700 mg，84%。藉由LCMS發現之離子：M+H =631。步驟 g.
Figure 02_image1638
在室溫下向連接體-3 (如實例19中所述經製備) (73 mg，0.14 mmol)及前一步驟之中間物(200 mg，0.32 mmol，2.2 eq)於DMF (30 ml)中之溶液中添加EDC (100 mg，0.5 mmol)、HOAt (65 mg，3 mmol)及DIEA (0.14 ml，1 mmol)。該溶液經攪拌隔夜。所得溶液經濃縮且經純化且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以0%至50%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀不使用修飾劑經純化。產量120 mg，52%。藉由LCMS發現之離子：M/2+H =830。步驟 h.
Figure 02_image1640
2 ml水中之氫氧化鋰(24 mg，1 mmol)添加至前一步驟之中間物(120 mg，0.07 mmol)於2 ml THF及1 ml MeOH中之溶液中。在藉由LCMS發現該反應完成之後，用AMBERLITE® IRN-77離子交換樹脂淬滅該溶液以調節至pH = 1，接著過濾該溶液且濾液經濃縮且無需進一步純化即用於下一步驟。
前一步驟之中間物在室溫下在40℃下在2 ml TFA中經處理隔夜。粗反應物經濃縮且藉由使用0%至20%乙腈及水之HPLC使用TFA作為修飾劑經純化。產量60 mg，74%產率。藉由LCMS發現之離子：[M/2]+ 1 =589.8。實例 32. 合成結合物 7
Fc-PEG4-疊氮化物(具有SEQ ID NO: 38之序列的各Fc域單體)於PBSx1緩衝溶液中之溶液(100 mg，1.28 μmol，6.1 mL，MW=57260 Da，DAR=3.6)添加至Int-10 (如實例31中所述經製備) (TFA鹽，44 mg，0.031 mmol)及剛剛製備之CuSO4 (0.7 mL 50.0 mM, 20 eq)、參(3-羥基丙基三唑基甲基)-胺(THPTA，0.7 mL 50.0 mM, 20 eq)及抗壞血酸鈉(1.05 mL 50.0 mM, 30 eq)之pH 7.4 PBS溶液中。所得均質溶液藉由搖桿台攪拌持續12 h。粗溶液用pH 7.4 PBS稀釋至1 mg/mL之最終濃度，且經超濾(10,000 MWCO)兩次至1 mL體積。粗混合物接著1:10稀釋於PBS pH 7.4中，且相繼使用MabSelect Sure Resin (GE Healthcare, Chicago, IL, USA)、尺寸排阻層析法經純化。經純化材料使用NANODROP™ UV可見光光譜儀(使用基於結合中所用之Fc之胺基酸序列計算的消光係數經定量，且使用離心濃縮機(10,000 MWCO)經濃縮至大約10 mg/mL。經純化分子使用4-12% Bis Tris SDS PAGE凝膠藉由將1-2 µg每種分子裝載至該凝膠中且使用速染藍(instant Blue)染色進行染色而經分析。各凝膠包括具有經指示分子量標準之分子量梯。產率典型地為40-60%。MALDI MS分析顯示質量範圍(60000-90000)，其中質量之平均值為63633。平均DAR=4.5。實例 33. 結合物 6 在致死性小鼠流感模型中之功效：研究 #3
在雌性BALB/c小鼠中針對致死性INFV A H1N1流感感染評估結合物6。該實驗包含7組，每組5隻小鼠。在第0天，所有小鼠均用1xLD90 H1N1 A/Texas/36/91攻擊。第1-6組在攻擊之前28天接受IV治療(表12)。媒劑(PBS)作為額外陰性對照物包括在內。第7組藉助於經口遞送接受磷酸奧司他韋，在感染後8小時開始，每天兩次，持續5天。在攻擊之後監測所有小鼠之存活率(圖31A-31F)，持續15天。
經結合物6治療之小鼠在低至2.5 mg/kg之所有濃度下在使用單一劑量時均顯示100%存活率，且在1.25 mg/kg下顯示80%存活率，與媒劑對照組之0%存活率相比。磷酸奧司他韋對照組中之所有小鼠均存活。當與磷酸奧司他韋組相比時，結合物6在低20倍之累積劑量(mg/kg)下證明與奧司他韋相似之功效，不過事實上，所有結合物6組均在感染之前28天給藥一次。 表12：研究設計
組 n=5 攻擊 第 0 天 化合物 劑量 (mg/kg) 治療 途徑 / 時程
1 流感A病毒，H1N1病毒株A/Texas/36/91，藉助於IN途徑。 媒劑(PBS) N/A IV，q.d. 攻擊前28天
2 結合物6 50
3 結合物6 10
4 結合物6 5
5 結合物6 2.5
6 結合物6 1.25   
7 奧司他韋(TamifluTM ) 20 PO, b.i.d. 攻擊後8小時，持續5天
實例 34. 結合物 6 在致死性小鼠流感模型中之功效：研究 #4
在雌性BALB/c小鼠中針對致死性INFV A H1N1流感感染評估結合物6。該實驗包含13組，每組5隻小鼠。在第0天，所有小鼠均用1xLD90 H1N1 A/Texas/36/91攻擊。所有結合物6組(8-13)在感染前及後不同時間接受單一10 mg/kg IV劑量，如表13所概述。媒劑(PBS)及單獨Fc作為陰性對照物包括在內。第3-7組藉助於經口遞送接受磷酸奧司他韋(20 mg/kg)，在感染後不同時間點開始，每天兩次，持續5天，如表13所概述。在攻擊之後監測所有小鼠之存活率(圖32A-32F)，持續15天。
當經治療直至感染後24 h時，經結合物6治療之小鼠在使用單一10 mg/kg劑量時顯示100%存活率，且在感染後48及72 h分別顯示60及80%存活率。在磷酸奧司他韋組中，在其中感染後48及72 h起始治療之組中，存活率分別急劇地降至0%及20%。此等結果表明關於治療流感A感染，結合物6潛在地具有相對奧司他韋卓越之治療窗。 表13：研究設計
組(N=5) 流感A 病毒 株 測試物品 途徑，時程 劑量 (mg/kg)
給藥時間安排( 小時)
1 A/Texas/36/91 (H1N1) 藉助於IN 媒劑(PBS) IV，單一 --- T-4
2 單獨Fc IV，單一 10 T-4
3 奧司他韋 PO，bid × 5天 20 T+8
4 奧司他韋 PO，bid × 5天 20 T+24
5 奧司他韋 PO，bid × 5天 20 T+48
6 奧司他韋 PO，bid × 5天 20 T+72
7 奧司他韋 PO，bid × 5天 20 T+96
8 結合物6 IV，單一 10 T-4
9 結合物6 IV，單一 10 T+8
10 結合物6 IV，單一 10 T+24
11 結合物6 IV，單一 10 T+48
12 結合物6 IV，單一 10 T+72
13 結合物6 IV，單一 10 T+96
實例 35. 結合物 6 毒性研究
在14天大鼠劑量範圍測量儀毒性研究中評估結合物6之安全性。大鼠在該研究之第0及7天藉由靜脈內投與經投與5 mpk、20 mpk或50 mpk之結合物6。與媒劑對照物相比，在所測試之任何劑量下均未觀察到對體重增加(圖33)、器官重量、食物消耗的顯著影響。血漿暴露(藉由AUC量測)隨劑量按比例增加。此等臨床前安全性結果與高治療指數一致。觀察結果之概述提供於表14中。 表14. 14天的大鼠劑量範圍測量儀毒性研究之概述
參數 在最高劑量(50 mpk) 下之發現， 與媒劑相比
臨床觀察結果 無發現
血液學 相對媒劑無改變
臨床化學 相對媒劑無改變
凝血 相對媒劑無改變
尿分析 相對媒劑無改變
組織病理學 無觀察結果
實例 36. 藉由三種不同途徑發現結合物 6 在致死性小鼠流感模型中針對劑量之功效：研究 #5
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8週)中針對致死性IAV H1N1流感感染評估結合物6。攻擊病毒(A/Texas/36/91)係能夠在小鼠中引起致死性感染之小鼠適應性分離株。該實驗包含15組，每組5隻小鼠。在第0天，所有小鼠均在經異氟烷輕微麻醉之後藉由鼻內接種經50 µl體積之病毒(1x LD90)攻擊。第1-14組在攻擊之前4小時接受單一治療(表15)。為了測定藉由不同給藥途徑之結合物6之效能，匹配濃度之結合物(10、2、0.4及0.1 mg/kg)經IV、IM或SC給藥。除了單獨媒劑(PBS)組以外，人類IgG1 (單獨Fc)亦作為額外陰性對照物(第2組)包括在內。第15組藉助於經口遞送接受磷酸奧司他韋，在感染後8小時開始，每天兩次，持續5天。監測所有小鼠之存活率(表15)，持續14天。
經結合物6治療之小鼠在第14天針對具有10、2或0.4 mg/kg之單一劑量之流感(H1N1)的攻擊顯示100%存活率，與給藥途徑無關。僅在最低測試物品濃度下，在IV、IM及SC給藥(表16：分別為60、80及100%存活率)之間可見單一小鼠差異。此等結果強烈地表明，結合物6之保護性肺濃度可藉由多種給藥途徑達成。 表15：研究設計
組 n=5 攻擊 第0 天 化合物 劑量 (mg/kg) 給藥途徑 治療 途徑/ 時程
1 流感A病毒(H1N1)A/Texas/36/91 藉助於IN 媒劑(PBS) N/A    單一劑量，病毒攻擊之前4小時
2 單獨Fc 50 IV
3 結合物6 10 IV
4 結合物6 2
5 結合物6 0.4
6 結合物6 0.1
7 結合物6 10 IM
8 結合物6 2
9 結合物6 0.4
10 結合物6 0.1
11 結合物6 10 SC
12 結合物6 2
13 結合物6 0.4
14 結合物6 0.1
15 奧司他韋(TamifluTM ) 20 PO b.i.d. 攻擊後8小時，持續5天
表16：小鼠存活率
測試物品 mg/kg 給藥途徑 存活率% ( 第14 天)
媒劑(PBS) na IV 0
hIgG1 (單獨Fc) 10 IV 0
結合物6 10 IV 100
2 100
0.4 100
0.1 60
結合物6 10 IM 100
2 100
0.4 100
0.1 80
結合物6 10 SC 100
2 100
0.4 100
0.1 100
奧司他韋 20 PO 100
實例 37. 結合物 6 在致死性小鼠流感模型中針對奧司他韋抗性分離株之功效：研究 #6
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8週)中針對致死性IAV H1N1流感感染評估結合物6。攻擊病毒(A/Perth/261/2009)係小鼠適應性分離株，其攜帶H275Y突變，從而導致抵抗神經胺糖酸酶抑制劑奧司他韋。該實驗包含10組，每組5隻小鼠。在第0天，所有小鼠均藉由鼻內接種至經異氟烷輕微麻醉之小鼠經50 µl體積之A/Perth/261/2009 (H1N1) (1x LD90)攻擊。第1-9組在攻擊之前4小時藉由IV接受單一治療(表17)。除了單獨媒劑(PBS)組以外，人類IgG1 (單獨Fc)亦作為額外陰性對照物包括在內。第10組藉助於經口遞送接受磷酸奧司他韋，在感染後8小時開始，每天兩次，持續5天。在攻擊之後監測所有小鼠之存活率(圖34A-34D，表18)及重量減輕(圖35，表19)，持續15天。
經結合物6治療之小鼠針對具有50、10及2 mg/kg之單一劑量之流感(A/Perth/261/2009)的攻擊顯示100%存活率。此外，儘管具有小的組大小(n=5)，此等結果相對於媒劑對照物為統計學上顯著的(表18)。在0.4、0.2或0.1 mg/kg之結合物6濃度下，存活率為60%，而若以單獨媒劑(PBS)或hIgG1 (單獨Fc)給藥，則無小鼠存活至該研究結束。奧司他韋組僅具有單一動物存活(20%功效)，即使使用先前顯示出具有保護性以抵禦奧司他韋敏感性分離株之劑量進行治療(20 mg/kg，bid × 5天)。此等結果確認該攻擊病毒抵抗奧司他韋，且對結合物6敏感。
結合物6針對含有H275Y突變之突變體之效能進一步由體重數據支持(圖35，表19)。接受單一劑量之2 mg/kg或更高濃度之結合物6的組證明瞭5%或更低短暫重量減輕。 表17：研究設計
組 n=5 攻擊 第0 天 化合物 劑量 (mg/kg) 治療 途徑/ 時程
1 流感A病毒(H1N1)  A/Perth/261/2009，藉助於IN途徑。 媒劑(PBS) N/A IV，q.d. 攻擊前4小時
2 單獨Fc 50
3 結合物6 50
4 結合物6 10
5 結合物6 2
6 結合物6 0.4
7 結合物6 0.2
8 結合物6 0.1
9 結合物6 0.05
10 奧司他韋(TamifluTM ) 20 PO，b.i.d. 攻擊後8小時，持續5天
表18：小鼠存活率
化合物 劑量 中值存 活期 存活率% 相對媒劑之顯著性(p)
媒劑(PBS) N/A 7 0 N/A
單獨Fc 50 mg/kg 6 0 ns
結合物6 50 mg/kg 未定義 100 0.0027
結合物6 10 mg/kg 未定義 100 0.0027
結合物6 2 mg/kg 未定義 100 0.0027
結合物6 0.4 mg/kg 未定義 60 0.1167
結合物6 0.2 mg/kg 未定義 60 0.0185
結合物6 0.1 mg/kg 未定義 60 0.1047
結合物6 0.05 mg/kg 7 0 0.9241
磷酸奧司他韋 20 mg/kg B.I.D 7 20 0.3470
表19：每天重量平均值
感染後天數 每天平均重量( 若小於5 ，則在括號中顯示小鼠數)
媒劑(PBS) 單獨Fc 結合物6 磷酸奧司他韋
50 mg/kg 50 mg/kg 10 mg/kg 2 mg/kg 0.4 mg/kg 0.2 mg/kg 0.1 mg/kg 0.05 mg/kg 20 mg/kg
0 100 (5) 100 (5) 100 100 100 100 100 100 100 100
1 103 (5) 104 (5) 101 101 102 102 103 105 102 105
2 102 (5) 105 (5) 103 101 103 100 102 102 101 102
3 93 (5) 97 (5) 101 101 98 92 98 95 94 95
4 88 (5) 90 (5) 95 98 99 91 98 92 90 93
5 85 (5) 85 (5) 94 98 98 91 98 92 89 92
6 83 (4) 88 (3) 100 100 99 88 95 85 84 (4) 86
7 79 (3) 90 (2) 103 99 95 90 (3) 94 83 (4) 77 (1) 86 (3)
8 75 (2) 81 (1) 102 99 97 93 (3) 94 (4) 87 (3) 78 (1) 85 (2)
9       106 104 104 101 (3) 101 (4) 95 (3)    86 (2)
10       105 102 103 100 (3) 99 (4) 97 (3)    95 (1)
11       106 102 104 102 (3) 104 (4) 102 (3)    97 (1)
12       108 104 105 102 (3) 105 (3) 107 (3)    104 (1)
13       107 103 105 102 (3) 105 (3) 107 (3)    104 (1)
14       107 103 105 102 (3) 106 (3) 108 (3)    104 (1)
15       100 100 100 100 (3) 100 (3) 100 (3)    100 (1)
實例 38. 在 IV 投與測試物品之後的 7 天大鼠 PK 研究
由Seventh Wave實驗室(Maryland Heights, MO)使用46-49日齡之雄性Sprague Dawley大鼠執行大鼠藥物動力學(PK)研究。大鼠藉助於尾靜脈經IV注射75 mg/kg之測試物品(5 ml/kg之劑量體積)。動物經圈養於標準IACUC批准之圈養條件下。在適當時間，對動物進行非末端放血(眶後、頰或藉由尾靜脈)，其中血液經收集於K2 EDTA管中以預防凝血。所收集之血液經離心(2,000 xg ，持續10分鐘)且抽出血漿以隨時間分析測試物品濃度。
藉由如下夾心ELISA量測在各時間點處結合物6或hIgG1 Fc之血漿濃度：結合物6分子經捕捉於經神經胺糖酸酶包被之板或經抗hIgG1抗體包被之板上且接著使用HRP結合之抗人類IgG-Fc抗體進行偵測。hIgG1使用抗hIgG1 Fc抗體經捕捉。在GraphPad Prism中使用結合物6 (或hIgG1 Fc)標準曲線之4PL非線性迴歸計算蛋白質濃度。更詳細方法描述提供於下文中。
Nunc Maxisorp 96-孔板(目錄號12-565-136, ThermoFisher)經1X KPL包被緩衝液(5150-0041, SeraCare)中來自A/California/04/2009 (H1N1) (11058-VNAHC, Sino Biological)之神經胺糖酸酶或抗IgG1 Fc抗體包被。在其中該抗IgG1 Fc抗體用於捕捉測試物品之情況下，選擇捕捉及偵測結合不同抗原決定基之抗IgG1 Fc抗體。板在室溫下在軌道板式振盪器上(500 rpm)經培育持續1 h。血漿樣品之連續稀釋液經塗板且在室溫下經培育持續2 h (樣品稀釋劑：1% BSA於PBS 0.05% Tween 20中+原生大鼠血漿最終濃度為1:900)。在各板上一式兩份進行介於500 – 0.230 ng/mL範圍內之結合物6或hIgG1 Fc標準曲線。
在2 h培育之後，板在具有0.05% Tween 20之300 µL PBS中洗滌5次。結合於板上之神經胺糖酸酶(或抗hIgG1 Fc抗體)的結合物6接著在室溫下用1:1,000稀釋於樣品稀釋劑中之HRP結合之抗人類IgG Fc F(ab’)2 (709-036-098, Jackson)探測持續1 h。板接著在具有0.05% Tween 20之300 uL PBS中洗滌8次且用TMB受質顯影持續7-8分鐘。該反應用1N H2 SO4 停止。在450 nm下讀取吸光度。相似方案用於hIgG1 Fc，其中僅抗hIgG1 Fc抗體用於捕捉。使用神經胺糖酸酶或抗hIgG1 Fc抗體捕捉在不同時間點處量測之結合物6之量在實驗誤差內為相似的，表明完整結合物活體內穩定。使用GraphPad Prism Version 6，根據結合物6 (或hIgG1 Fc)標準曲線之非線性迴歸分析(S型，4PL分析)內推測試樣品中之總結合物6 (或hIgG1 Fc)。比較結合物6及hIgG1 Fc之曲線顯示於圖36中。使用神經胺糖酸酶或抗hIgG1 Fc抗體捕捉在不同時間點處量測之結合物6之量在實驗誤差內為相似的，表明完整結合物活體內穩定。實例 39. 在 IV 投與測試物品之後的 14 天大鼠 PK 研究
由Seventh Wave實驗室(Maryland Heights, MO)使用46-49日齡之雄性Sprague Dawley大鼠執行大鼠PK研究。大鼠在第1及8天藉助於尾靜脈經IV注射5、20或50 mg/kg之測試物品(5 ml/kg之劑量體積)。動物經圈養於標準IACUC批准之圈養條件下。在適當時間，對動物進行非末端放血(眶後、頰或藉由尾靜脈)，其中血液經收集於K2 EDTA管中以預防凝血。所收集之血液經離心(2,000 xg ，持續10分鐘)且抽出血漿以隨時間分析測試物品濃度。
藉由如下夾心ELISA量測在各時間點處結合物6之血漿濃度：結合物6分子經捕捉於經神經胺糖酸酶包被之板上且接著使用HRP結合之抗人類IgG-Fc抗體進行偵測。hIgG1使用抗hIgG1 Fc抗體經捕捉。在GraphPad Prism中使用結合物6標準曲線之4PL非線性迴歸計算蛋白質濃度。更詳細方法描述提供於下文中。
Nunc Maxisorp 96-孔板(目錄號12-565-136, ThermoFisher)經1X KPL包被緩衝液(5150-0041, SeraCare)中來自A/California/04/2009 (H1N1) (11058-VNAHC, Sino Biological)之神經胺糖酸酶包被。板在室溫下在軌道板式振盪器上(500 rpm)經培育持續1 h。血漿樣品之連續稀釋液經塗板且在室溫下經培育持續2 h (樣品稀釋劑：1% BSA於PBS 0.05% Tween 20中+原生大鼠血漿最終濃度為1:900)。在各板上一式兩份進行介於500 – 0.230 ng/mL範圍內之結合物6標準曲線。
在2 h培育之後，板在具有0.05% Tween 20之300 µL PBS中洗滌5次。結合於板上之神經胺糖酸酶的結合物6接著在室溫下用1:1,000稀釋於樣品稀釋劑中之HRP結合之抗人類IgG Fc F(ab’)2 (709-036-098, Jackson)探測持續1 h。板接著在具有0.05% Tween 20之300 uL PBS中洗滌8次且用TMB受質顯影持續7-8分鐘。該反應用1N H2 SO4 停止。在450 nm下讀取吸光度。
使用GraphPad Prism Version 6，根據結合物6標準曲線之非線性迴歸分析(S型，4PL分析)內推測試樣品中之總結合物6 (或hIgG1 Fc)。圖37中所示之比較結合物6之曲線證明瞭線性劑量比例。實例 40. 比較測試物品之 IV 及 SC 投與之 28 天大鼠 PK 研究
由Seventh Wave實驗室(Maryland Heights, MO)使用46-49日齡之雄性Sprague Dawley大鼠執行大鼠PK研究。大鼠經IV或SC注射5 mg/kg之測試物品(5 ml/kg之劑量體積)。動物經圈養於標準IACUC批准之圈養條件下。在適當時間，對動物進行非末端放血(眶後、頰或藉由尾靜脈)，其中血液經收集於K2 EDTA管中以預防凝血。所收集之血液經離心(2,000 xg ，持續10分鐘)且抽出血漿以隨時間分析測試物品濃度。
藉由如下夾心ELISA量測在各時間點處結合物6或hIgG1 Fc之血漿濃度：結合物6分子經捕捉於經神經胺糖酸酶包被之板上且接著使用HRP結合之抗人類IgG-Fc抗體進行偵測。在GraphPad Prism中使用結合物6標準曲線之4PL非線性迴歸計算蛋白質濃度。更詳細方法描述提供於下文中。
Nunc Maxisorp 96-孔板(目錄號12-565-136, ThermoFisher)經1X KPL包被緩衝液(5150-0041, SeraCare)中來自A/California/04/2009 (H1N1) (11058-VNAHC, Sino Biological)之神經胺糖酸酶包被。板在室溫下在軌道板式振盪器上(500 rpm)經培育持續1 h。血漿樣品之連續稀釋液經塗板且在室溫下經培育持續2 h (樣品稀釋劑：1% BSA於PBS 0.05% Tween 20中+原生大鼠血漿最終濃度為1:900)。在各板上一式兩份進行介於500 – 0.230 ng/mL範圍內之結合物6標準曲線。
在2 h培育之後，板在具有0.05% Tween 20之300 µL PBS中洗滌5次。結合於板上之神經胺糖酸酶的結合物6接著在室溫下用1:1,000稀釋於樣品稀釋劑中之HRP結合之抗人類IgG Fc F(ab’)2 (709-036-098, Jackson)探測持續1 h。板接著在具有0.05% Tween 20之300 µL PBS中洗滌8次且用TMB受質顯影持續7-8分鐘。該反應用1N H2 SO4 停止。在450 nm下讀取吸光度。
使用GraphPad Prism Version 6，根據結合物6標準曲線之非線性迴歸分析(S型，4PL分析)內推測試樣品中之總結合物6 (或hIgG1 Fc)。圖38中比較結合物6之曲線顯示，SC及IV血漿水準在24 h時會聚且直至336 h時在實驗誤差內相似。實例 41. 在 IV 投與測試物品之後的 28 天非人類靈長類動物 PK 研究
由BTS Research (San Diego, CA)使用體重介於2.5-6.5 kg範圍內之4.5-8歲雄性及雌性食蟹獼猴執行非人類靈長類動物(NHP)PK研究。NHP藉助於隱靜脈或頭靜脈經IV注射5或20 mg/kg之測試物品(5 ml/kg之劑量體積)。動物經圈養於標準IACUC批准之圈養條件下。在適當時間，對動物進行非末端放血(藉助於股靜脈或頭靜脈)，其中血液經收集於K2 EDTA管中以預防凝血。所收集之血液經離心(2,000 xg ，持續10分鐘)且抽出血漿以隨時間分析測試物品濃度。
藉由如下夾心ELISA量測在各時間點處結合物6之血漿濃度：結合物6分子經捕捉於經神經胺糖酸酶包被之板上且接著使用HRP結合之抗人類IgG-Fc抗體進行偵測。在GraphPad Prism中使用結合物6標準曲線之4PL非線性迴歸計算蛋白質濃度。更詳細方法描述提供於下文中。
Nunc Maxisorp 96-孔板(目錄號12-565-136, ThermoFisher)經1X KPL包被緩衝液(5150-0041, SeraCare)中來自A/California/04/2009 (H1N1) (11058-VNAHC, Sino Biological)之神經胺糖酸酶包被。板在室溫下在軌道板式振盪器上(500 rpm)經培育持續1 h。血漿樣品之連續稀釋液經塗板且在室溫下經培育持續2 h (樣品稀釋劑：1% BSA於PBS 0.05% Tween 20中+原生食蟹獼猴血漿最終濃度為1:2,500)。在各板上一式兩份進行介於500 – 0.230 ng/mL範圍內之結合物6標準曲線。
在2 h培育之後，板在具有0.05% Tween 20之300 µL PBS中洗滌5次。結合於板上之神經胺糖酸酶的結合物6接著在室溫下用1:1,000稀釋於樣品稀釋劑中之HRP結合之抗人類IgG Fc F(ab’)2 (709-036-098, Jackson)探測持續1 h。板接著在具有0.05% Tween 20之300 µL PBS中洗滌8次且用TMB受質顯影持續7-8分鐘。該反應用1N H2 SO4 停止。在450 nm下讀取吸光度。
使用GraphPad Prism Version 6，根據結合物6 (或hIgG1 Fc)標準曲線之非線性迴歸分析(S型，4PL分析)內推測試樣品中之總結合物6。使用WinNonlin軟體計算PK參數。比較結合物6之曲線顯示於圖39中且關鍵PK參數之概述提供於表20中。劑量反應在5與20 mg/kg IV之間呈線性，導致在兩種劑量之間大約9天之半衰期(可與小鼠/大鼠相當)。 表20：結合物6之食蟹獼猴PK
結合物6 半衰期(h) AUC 最後(h*mg/mL)
5 mg/kg IV 230 6240
20 mg/kg IV 197 25400
實例 42. 在 IV 投與測試物品之後的小鼠肺分佈 PK 研究
使用6週齡雄性CD-1小鼠執行小鼠PK研究。小鼠藉助於尾靜脈經IV注射10 mg/kg之測試物品(5 ml/kg之劑量體積)。動物經圈養於標準IACUC批准之圈養條件下。在所指示之時間點，對該等動物實施安樂死以在K2 EDTA管中收集血液(藉助於心臟穿刺)且收集肺。血液經離心(2,000 xg ，持續10分鐘)以獲得血漿。對肺稱重，且在具有無菌一次性杵之1.5 ml管(Z359947, Sigma)中在包含11.64 mL組織蛋白萃取試劑(78510, Thermo Scientific)、0.24 ml蛋白酶抑制劑混合液(78410, Thermo Scientific)及0.12 ml EDTA之100 µL均質化緩衝液中均質化。在1-2 min均質化之後，用均質化緩衝液將體積調節至1 mL且該等樣品在冰上經培育持續20 min，其中藉由輕柔渦旋進行週期性混合。均質液以8,000 xg 離心持續10 min且保留上清液以隨時間分析測試物品濃度。
藉由如下夾心ELISA量測在各時間點處結合物6之血漿及肺濃度：結合物6分子經捕捉於經神經胺糖酸酶包被之板上且使用HRP結合之抗人類IgG-Fc抗體進行偵測。在GraphPad Prism中使用結合物6標準曲線之4PL非線性迴歸計算蛋白質濃度。更詳細方法描述提供於下文中。
Nunc Maxisorp 96-孔板(目錄號12-565-136, ThermoFisher)經1X KPL包被緩衝液(5150-0041, SeraCare)中來自A/California/04/2009 (H1N1) (11058-VNAHC, Sino Biological)之神經胺糖酸酶包被。板在室溫下在軌道板式振盪器上(500 rpm)經培育持續1 h。血漿樣品之連續稀釋液經塗板且在室溫下經培育持續2 h (樣品稀釋劑：1% BSA於PBS 0.05% Tween 20中+原生小鼠血漿最終濃度為1:100)。在各板上一式兩份進行介於500 – 0.230 ng/mL範圍內之結合物6標準曲線。
在2 h培育之後，板在具有0.05% Tween 20之300 µL PBS中洗滌5次。結合於板上之神經胺糖酸酶的結合物6接著在室溫下用1:1,000稀釋於樣品稀釋劑中之HRP結合之抗人類IgG Fc F(ab’)2 (709-036-098, Jackson)探測持續1 h。板接著在具有0.05% Tween 20之300 µL PBS中洗滌8次且用TMB受質顯影持續7-8分鐘。該反應用1N H2 SO4 停止。在450 nm下讀取吸光度。
使用GraphPad Prism Version 6，根據結合物6標準曲線之非線性迴歸分析(S型，4PL分析)內推測試樣品中之總結合物6。比較結合物6血漿及肺濃度之曲線顯示於圖40中。意外地，肺Cmax 在t = 1 h時實現(19.5 μg/g肺組織，約310 nM)。相對於血漿，存在結合物6之大約10%肺暴露實例 43. 比較測試物品之 IV 、 SC 及 IM 投與之 5 天小鼠 PK 研究
使用6週齡雄性CD-1小鼠執行小鼠PK研究。小鼠藉助於尾靜脈經IV注射5 mg/kg之測試物品(5 ml/kg之劑量體積)。動物經圈養於標準IACUC批准之圈養條件下。在適當時間，對動物進行非末端放血(眶後、頰或藉由尾靜脈)，其中血液經收集於K2 EDTA管中以預防凝血。所收集之血液經離心(2,000 xg ，持續10分鐘)且抽出血漿以隨時間分析測試物品濃度。
藉由如下夾心ELISA量測在各時間點處結合物6之血漿濃度：結合物6分子經捕捉於經神經胺糖酸酶包被之板上且接著使用HRP結合之抗人類IgG-Fc抗體進行偵測。在GraphPad Prism中使用結合物6 (或hIgG1 Fc)標準曲線之4PL非線性迴歸計算蛋白質濃度。更詳細方法描述提供於下文中。
Nunc Maxisorp 96-孔板(目錄號12-565-136, ThermoFisher)經1X KPL包被緩衝液(5150-0041, SeraCare)中來自A/California/04/2009 (H1N1) (11058-VNAHC, Sino Biological)之神經胺糖酸酶包被。板在室溫下在軌道板式振盪器上(500 rpm)經培育持續1 h。血漿樣品之連續稀釋液經塗板且在室溫下經培育持續2 h (樣品稀釋劑：1% BSA於PBS 0.05% Tween 20中+原生小鼠血漿最終濃度為1:100)。在各板上一式兩份進行介於500 – 0.230 ng/mL範圍內之結合物6標準曲線。
在2 h培育之後，板在具有0.05% Tween 20之300 µL PBS中洗滌5次。結合於板上之神經胺糖酸酶的結合物6接著在室溫下用1:1,000稀釋於樣品稀釋劑中之HRP結合之抗人類IgG Fc F(ab’)2 (709-036-098, Jackson)探測持續1 h。板接著在具有0.05% Tween 20之300 µL PBS中洗滌8次且用TMB受質顯影持續7-8分鐘。該反應用1N H2 SO4 停止。在450 nm下讀取吸光度。
使用GraphPad Prism Version 6，根據結合物6標準曲線之非線性迴歸分析(S型，4PL分析)內推測試樣品中之總結合物6。比較結合物6之曲線顯示於圖41中。針對IV、IM及SC之暴露水準為相似的，其中AUC分別為2082、1944及2500。實例 44. 小鼠功效及多物種 PK 支持人類個體中之罕見預防性給藥
使用基於小鼠、大鼠及靈長類動物PK研究之小鼠功效給藥的異速生長定標來預測人類個體中之給藥及PK參數。在28天小鼠預防研究(參見實例33)中，異速生長定標係基於2.5 mg/kg有效劑量下之曲線下面積(AUC)。
關於單獨食蟹獼猴異速生長定標，使用簡單異速生長等式基於食蟹獼猴PK數據(實例41)計算人類清除(CL)：CL(人類) = CL(猴) • [BW(人類)/BW(猴)]w ，其中BW =體重且w係固定於0.85處之定標指數。單獨食蟹獼猴定標之結果提供於表21中。
關於小鼠-大鼠-食蟹獼猴異速生長定標，根據以下異速生長等式以log-log刻度針對動物體重(BW)繪製動物物種之人類清除(CL)：CL = a•BWx ，其中a為係數且x為該異速生長等式之指數。係數a及指數x分別自線性迴歸線之截距及斜率計算。小鼠-大鼠-食蟹獼猴定標之結果提供於表22中。
藉由上述各別算法計算之人類清除值接著用於使用以下等式計算實現3700 ug-h/mL之功效AUC標靶所需的相應人類劑量(小鼠2.5 mg/kg劑量，實例33)：劑量= CL•AUC。 表21：單獨食蟹獼猴異速生長定標(β = 0.85)
功效曲線下面積(AUC) 3700 μg-h/mL
人類清除(CL) 0.43 mL/min
人類劑量 95.46 mg，1.4 mg/kg
表22. 小鼠-大鼠-食蟹獼猴異速生長定標(β = 0.97)
功效曲線下面積(AUC) 3700 μg-h/mL
人類清除(CL) 0.59 mL/min
人類劑量 130.98 mg，1.9 mg/kg
實例 45. 合成 Int-11
Figure 02_image1642
步驟 a.
Figure 02_image1644
(4-溴丁基)胺基甲酸第三丁酯(11.2 g，60 mmol)及(4-胺基丁基)胺基甲酸第三丁酯(10 g，40 mmol)溶解於DMF (150 mL)中之溶液用碳酸鉀(16.4 g，120 mmol)處理，接著在80℃下攪拌持續6 h。該反應混合物分配於DCM (500 ml)與鹽水(100 ml)之間。分離有機層且用鹽水洗滌，接著經硫酸鈉乾燥。過濾該溶液，濃縮，且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以10%至100%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀使用0.1% TFA作為修飾劑經純化。產物之產量11.0 g，77%。藉由LCMS發現之離子：M+H =360.4步驟 b.
Figure 02_image1646
前一步驟之產物(0.4 g，1.11 mmol)及Fmoc-OSu (0.45 mg，1.3 mmol)溶解於DCM (10 mL)中，接著用N-甲基嗎啉(0.22 ml，2 mmol)處理，且在室溫下攪拌持續1 h。該反應經濃縮且經純化且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以10%至100%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀不使用0.1% TFA作為修飾劑經純化。產物之產量450 mg，69%。藉由LCMS發現之離子：M/2+H =582.4。步驟 c.
Figure 02_image1648
前一步驟之產物(0.4 g，0.7 mmol)在室溫下用TFA (5 mL)處理持續0.5小時，接著濃縮至乾且無需進一步純化即用於下一步驟中。此步驟之產率為定量的。藉由LCMS發現之離子：M/2+H =382.3。步驟 d.
Figure 02_image1650
來自前一步驟之Fmoc二胺(24 mg，0.063 mmol)添加至羧酸(80 mg，0.126 mmol，描述於合成Int-10步驟f中)於DMF (5 mL)中之溶液中，接著相繼用HATU (50 mg，0.13 mmol)、N-甲基嗎啉(0.06 ml，0.50 mmol)處理。在攪拌持續1 h之後，所得溶液經濃縮且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以10%至100%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀不使用TFA作為修飾劑經純化。產物之產量80 mg，79%。藉由LCMS發現之離子：M/2+H =803.9。步驟 e.
Figure 02_image1652
前一步驟之產物(80 mg，0.050 mmol)用DMF (2 mL)中之1% DBU (1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一-7-烯)處理且在室溫下經攪拌。當藉由LCMS發現該反應完成時(15 min)，其經濃縮，接著用TFA (2 mL)處理且在室溫下經攪拌持續30 min。反應溶液經濃縮且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以10%至100%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀使用0.1% TFA作為修飾劑經純化。產物之產量為52 mg，呈TFA鹽形式。藉由LCMS發現之離子：M/2+H =492.7。步驟 f.
Figure 02_image1654
前一步驟之產物溶解於水(2 mL)中，接著用氫氧化鋰(12 mg，0.50 mmol，於1 mL水中)溶液處理。藉由LCMS監測所得反應。在攪拌持續10 min之後，該反應用0.1 ml乙酸淬滅。所得溶液經濃縮且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以0%至30%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀使用0.1% TFA作為修飾劑經純化。產物之產量：30 mg，呈TFA鹽形式，66%。藉由LCMS發現之離子：M/2+H =452.7。M/3+H =302.1。實例 46. 合成 Int-12
Figure 02_image1656
步驟 a.
Figure 02_image1658
向(4-溴丁基)胺基甲酸第三丁酯(4.8 g，19 mmol)及炔丙基-PEG4胺(2 g，8.6 mmol)於DMF (50 mL)中之溶液中添加碳酸鉀(3.6 g，26 mmol)。該溶液在80℃下攪拌持續6 h，接著分配於DCM (200 ml)與鹽水(50 ml)之間。分離有機層，用鹽水洗滌，經硫酸鈉乾燥，過濾，且濃縮，接著藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以10%至100%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀使用0.1% TFA作為修飾劑經純化。產物之產量3.5 g，70%。藉由LCMS發現之離子：M/2+H =574.4。步驟 b.
Figure 02_image1660
前一步驟之產物(3.5 g，8.6 mmol)在室溫下用TFA (20 ml)處理持續0.5小時，接著濃縮至乾，溶解於水中，經冷凍，經凍乾，且無需進一步純化即用於下一步驟中。此步驟之產率為定量的。藉由LCMS發現之離子：M/2+H =374.3。步驟 c.
Figure 02_image1662
來自前一步驟之二胺TFA鹽(37 mg，0.1 mmol)添加至羧酸(130 mg，0.2 mmol，描述於合成Int-10步驟f中)於10 ml DMF中之溶液中，接著用HATU (80 mg，0.2 mmol)及N-甲基嗎啉(0.25 mL，2 mmol)處理。所得溶液經攪拌持續1 h，接著經濃縮且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以10%至100%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀不使用0.1% TFA作為修飾劑經純化。產物之產量120 mg，75%。藉由LCMS發現之離子：M/2+H =799.9。步驟 d.
Figure 02_image1664
前一步驟之產物(120 mg，0.075 mmol)用2 ml三氟乙酸處理且在室溫下經攪拌持續30 min。所得溶液經濃縮，溶解於水(2 mL)中，接著用氫氧化鋰(12 mg，0.5 mmol)溶解於水(1 mL)中之溶液處理。所得溶液經攪拌10 min，接著用0.1 ml乙酸製成略微具酸性，經濃縮且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以0%至30%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀使用0.1% TFA作為修飾劑經純化。產物之產量48 mg，呈TFA鹽形式，57%。藉由LCMS發現之離子：M/2+H =559.757。M/3+H =373.5。實例 47. 合成結合物 8
h-IgG1 Fc-PEG4-疊氮化物於PBSx1緩衝溶液中之溶液(100 mg，1.71 μmol，7.011 mL，MW=58200 Da，DAR=3.7)添加至炔衍生之小分子(Int-12 TFA鹽，45 mg，0.031 mmol)及剛剛製備之CuSO4 (0.7 mL 50.0 mM, 20 eq)、參(3-羥基丙基三唑基甲基)-胺(THPTA，0.7 mL 50.0 mM, 20 eq)及抗壞血酸鈉(1.05 mL 50.0 mM, 30 eq)之pH 7.4 PBS溶液中。所得均質溶液藉由搖桿台攪拌持續12 h。粗溶液用pH 7.4 PBS稀釋至1 mg/mL之最終濃度，且經超濾(10,000 MWCO)兩次至1 mL體積。粗混合物接著1:10稀釋於PBS pH 7.4中，且相繼使用MabSelect Sure Resin (GE Healthcare, Chicago, IL, USA)、尺寸排阻層析法經純化。經純化材料使用NANODROP™ UV可見光光譜儀(使用基於結合中所用之Fc之胺基酸序列計算的消光係數經定量，且使用離心濃縮機(10,000 MWCO)經濃縮至大約10 mg/mL。經純化分子使用4-12% Bis Tris SDS PAGE凝膠藉由將1-2 µg每種分子裝載至該凝膠中且使用instant Blue染色進行染色而經分析。各凝膠包括具有經指示分子量標準之分子量梯(圖42)。產率典型地為40-60%。MALDI MS分析顯示質量範圍(60000-90000)，其中質量之平均值為62358。平均DAR=3。實例 48. 在 CPE 分析中且在致死性小鼠流感模型中比較所選擇之抑制劑與其 Fc- 結合物之活體外及活體內效能
為了證明本文所述之神經胺糖酸酶抑制劑與Fc的結合在病毒複製分析中且在活體內功效模型中增強其活性，吾人在細胞病理效應(CPE)分析中且在致死性小鼠流感感染模型中比較所選擇之未結合抑制劑與其Fc結合物之活性。關於CPE微量中和分析，一式兩份製備以160 nM或400 nM (關於紮那米韋及奧司他韋對照物，9600 nM)開始之各測試物品(TA)之十種兩倍連續稀釋液，用於一小時接種感染複數(MOI)為0.001之INFV A (A/CA/09 H1N1)及MOI為0.01之INFV B，以用於一小時培育。該TA-病毒混合物接著添加至接種於96-孔板中之MDCK細胞中，且培育持續一小時。在INFV A感染後第3天及INFV B (B/Brisbane)感染後第5天，細胞經固定且用結晶紫染色且讀取光學密度以使用XLfit劑量反應模型計算各TA之50%有效濃度(EC50 )。亦使用以160 nM或400 nM開始之各TA之十種兩倍連續稀釋液評估各TA之固有細胞毒性，該等稀釋液一式兩份經製備以用於接種96-孔培養板中之MDCK細胞。在治療之後3及5天使用CellTiter-Glo套組測定細胞生存力。使用XLfit劑量反應模型計算細胞毒性濃度之50% (CC50 )。直至所測試之最高濃度，關於任何TA均未觀察到細胞毒性。基於CPE之微量中和分析之概述顯示於表23中。 表23. 基於CPE之微量中和分析
   EC50 對 INFV A (nM) EC50 對 INFV B (nM)
奧司他韋 390.0 1065.0
紮那米韋 264.8 382.6
Int-7 ( 對應於結合物 6 之靶向部分 ) 665.7 106.6
Int-12 ( 對應於結合物 8 之靶向部分 ) 15.4 0.6
結合物 6 4.0 52.1
結合物 8 0.6 0.3
概述於表23中之數據證明該等神經胺糖酸酶二聚體之Fc結合形式在CPE微量中和分析中具有優於其未結合配對物之活性。當比較結合物6與Int-7時，分別觀察到相對INFV A及INFV B之166倍及2倍增強。當比較結合物8與Int-12時，分別觀察到相對INFV A及INFV B之26倍及2倍增強。
使用雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories, 6-8週)在致死性IAV H1N1流感感染模型中比較結合物6與表23中所概述之該研究之最有效神經胺糖酸酶抑制劑二聚體(Int-11，對應於Int-12但不具有三聚體連接體之單獨二聚體，允許結合於Fc)。攻擊病毒(A/Puerto Rico/08/1934, aka PR8)係小鼠適應性分離株，具有每隻小鼠大約30個斑塊形成單位(pfu)之LD90 。
該實驗包含8組，每組5隻小鼠。在第0天，所有小鼠均藉由鼻內接種至經氯胺酮/甲苯噻嗪之混合物(分別為150及10 mg/kg)麻醉之小鼠經50 µl體積之PR8 (10x LD90 )攻擊。在攻擊之後2小時，各組藉由IV接受媒劑、單獨hIgG1 Fc、結合物6或Int-11之單一治療(表24；第1-6組)。第7組亦藉由IV接受Int-11 (15 mg/kg)，每天兩次(bid)，持續5天。第8組經口(PO)接受奧司他韋(15 mg/kg)，bid，持續5天。在病毒攻擊之後監測所有小鼠之存活率(表25)及重量減輕(數據未示)，持續10天。
如所預期，經媒劑或單獨hIgG1 Fc治療之小鼠截至第7天死於感染(表25)。經10個劑量(總計150 mg/小鼠)之奧司他韋治療之小鼠證明統計學上顯著的死亡延遲，但直至第10天僅有單一動物存活。接受0.3或3 mg/kg之單一劑量之結合物6的所有小鼠均存活至該研究結束且在該實驗之過程中顯示淨重量增加。重要的是，接受0.3或3 mg/kg之Int-11的所有小鼠均在該研究之過程中死亡，相對於媒劑及單獨hIgG1 Fc對照物僅具有最短(2天或更短)死亡延遲。由於hIgG1 Fc不具有固有抗病毒活性(第2組)，這表明結合物6之經極大改良活性係由Fc上之多價呈現引起的經改良親合力之結果，如概述於表23中之結果以及Fc介導之免疫銜接的經改良藥物動力學及作用所表明。單獨抑制劑二聚體與結合物6之間的活性差異在兩種劑量濃度下均為統計學上顯著的(比較第3組及第6組，及第4組及第5組；表25)。以質量計，需要高500倍之累積劑量之Int-11來觀察到與結合物6相等之功效。 表24：研究設計
組 n=5 攻擊 第 0 天 化合物 劑量 (mg/kg) 治療 途徑 / 時程
1 流感A病毒(H1N1)  A/Puerto Rico/08/1934，藉助於IN途徑。 媒劑(PBS) N/A IV，單一劑量，在感染後2小時開始
2 單獨hIgG1 Fc 3
3 結合物6 3
4 結合物6 0.3
5 Int-11 0.3
6 Int-11 3
7 Int-11 15 IV，bid ，持續 5 天 ，在感染後2小時開始
8 奧司他韋(TAMIFLUTM ) 20 PO，bid ，持續 5 天 ，在感染後2小時開始
表25：小鼠存活率
組 測試物品 劑量(mg/kg) 給藥時程 存活率% 相對媒劑之顯著性 相對Int-11 之顯著性 0.3 mg/kg* 或3 mg/kg^
1 媒劑(PBS)    IV，單一 0      
2 單獨hIgG1 Fc 3 IV，單一 0 NS   
3 結合物6 3 IV，單一 100 0.0027 0.0035^
4 結合物6 0.3 IV，單一 100 0.0027 0.0027*
5 Int-11 0.3 IV，單一 0 0.0027   
6 Int-11 3 IV，單一 0 0.0027   
7 Int-11 15 IV，bid × 5天 100 0.0027   
8 奧司他韋 15 PO，bid × 5天 20 0.0027   
實例 49. 合成 Int-13 ((5R)-((1R)- 乙醯胺基 -(2S)- 甲氧基 -(2S)- 甲基戊基 )-(4S)-E/Z-[3-( 炔丙基 -PEG4)- 丙烯基 ]- 吡咯啶 -(2R)- 甲酸 )
Figure 02_image1666
步驟 a. (2R)-((1R)- 乙醯胺基 -(2S)- 甲氧基 -(2S)- 甲基戊基 )-(5R)- 羧基 -(3S)-Z- 丙烯基吡咯啶 -1- 甲酸第三丁酯。
向(5R)-((1R)-乙醯胺基-(2S)-甲氧基-(2S)-甲基戊基)-(4S)-Z-丙烯基吡咯啶-(2R)-甲酸, HCI鹽(根據參考文獻JACS , 2002,124 , 4716-4721經製備；1.0 mmol)於乙腈(10 mL)中之攪拌混合物中添加三甲基氫氧化銨(1.5 mmol)。在室溫下攪拌持續3 h之後，添加二碳酸二-第三丁酯(4 eqmol)。在反應完成時，所有揮發物均根據真空技術經蒸發。殘餘物用水(10 ml)稀釋。添加乙酸乙酯(10 ml)，且添加1 M硫酸水溶液直至水層達到pH約為3。用乙酸乙酯之額外兩個等分試樣(10 mL)洗滌水層。經組合之有機物經硫酸鈉乾燥，過濾且濃縮。殘餘物藉由層析技術經純化以提供所需產物。步驟 b. (2R)-((1R)- 乙醯胺基 -(2S)- 甲氧基 -(2S)- 甲基戊基 )-(5R)- 羧基甲基 -(3S)-Z- 丙烯基吡咯啶 -1- 甲酸第三丁酯。
向(2R)-((1R)-乙醯胺基-(2S)-甲氧基-(2S)-甲基戊基)-(5R)-羧基-(3S)-Z-丙烯基吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(1.0 mmol)於二氯甲烷(5.0 mL)及甲醇(1.0 mL)中之0℃攪拌混合物中緩慢地添加(三甲基矽烷基)重氮甲烷(1.1 mmol)。該混合物經攪拌直至完成，同時輕柔地使溫度達到環境溫度。所有揮發物均根據真空技術經蒸發。必要時，殘餘物藉由層析技術經純化以提供所需產物。步驟 c. (2R)-((1R)- 乙醯胺基 -(2S)- 甲氧基 -(2S)- 甲基戊基 )-(5R)- 羧基甲基 -(3S)- 甲醯基吡咯啶 -1- 甲酸第三丁酯。
(2R)-((1R)-乙醯胺基-(2S)-甲氧基-(2S)-甲基戊基)-(5R)-羧基甲基-(3S)-Z-丙烯基吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(1 mmol)於二氯甲烷(15 mL)中之室溫混合物經冷卻至-78℃。臭氧鼓泡通過該溶液，直至溶解之臭氧的淡藍色持續。氮氣鼓泡通過該溶液，直至藍色消失，接著添加二甲硫醚(4.0 mmol)，燒瓶經轉移至冷凍器(-20℃)中且靜置持續1小時。濃縮該溶液且殘餘物藉由層析技術經純化以提供所需產物。步驟 d. (2R)-((1R)- 乙醯胺基 -(2S)- 甲氧基 -(2S)- 甲基戊基 )-(5R)- 羧基甲基 -(3S)-E/Z-[3-( 炔丙基 -PEG4)- 丙烯基 ] 吡咯啶 -1- 甲酸第三丁酯。
向炔丙基-PEG4-溴化鏻(1.0 mmol)於DMF (5.0 mL)中之0℃攪拌混合物中添加氫化鈉(1.1 mmol)，且10分鐘之後，溫度升至環境溫度。繼續攪拌持續1 h，接著添加DMF (1.0 mL)中之(2R)-((1R)-乙醯胺基-(2S)-甲氧基-(2S)-甲基戊基)-(5R)-羧基甲基-(3S)-甲醯基吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(1.0 mmol)。在完成時，該反應藉由飽和氯化銨溶液淬滅。用乙酸乙酯萃取該水溶液數次，且經組合之有機相用鹽水洗滌，乾燥，且蒸發。殘餘物藉由層析技術經純化以提供所需產物。步驟 e. (2R)-((1R)- 乙醯胺基 -(2S)- 甲氧基 -(2S)- 甲基戊基 )-(5R)- 羧基 -(3S) E/Z-[3-( 炔丙基 -PEG4)- 丙烯基 ] 吡咯啶 -1- 甲酸第三丁酯。
向(2R)-((1R)-乙醯胺基-(2S)-甲氧基-(2S)-甲基戊基)-(5R)-羧基甲基-(3S)-E/Z-[3-(炔丙基-PEG4)-丙烯基]吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(1.0 mmol)於四氫呋喃(12.0 mL)及水(3.0 mL)中之0℃攪拌混合物中添加氫氧化鋰(1.1 mmol)。繼續攪拌且溫度在15分鐘之後升至環境溫度。在完成時，藉助於過量添加AMBERLITE® IRN-77樹脂使該溶液達到酸性pH。過濾該混合物且濾液根據真空技術經濃縮，生成標題化合物。必要時，殘餘物藉由層析技術經純化以提供所需產物。步驟 f. (5R)-((1R)- 乙醯胺基 -(2S)- 甲氧基 -(2S)- 甲基戊基 )-(4S)-E/Z-[3-( 炔丙基 -PEG4)- 丙烯基 ]- 吡咯啶 -(2R)- 甲酸。
向(2R)-((1R)-乙醯胺基-(2S)-甲氧基-(2S)-甲基戊基)-(5R)-羧基-(3S) E/Z-[3-(炔丙基-PEG4)-丙烯基]吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(1.0 mmol)及2-甲基-2-丁烯(0.5 mL)於二氯甲烷(8.0 mL)中之0℃攪拌混合物中添加三氟乙酸(4.0 mL)。10分鐘之後，溫度升至環境溫度。在完成時，所有揮發物均根據真空技術經蒸發。殘餘物藉由層析技術經純化以提供所需產物。實例 50. 合成結合物 9
hIgG1 Fc-PEG4-疊氮化物於pH 7.4 PBS x 1緩衝溶液中之溶液(100 mg，1.71 µmol，7.011 mL，MW = 58,200 Da，DAR = 3.7)添加至Int-13 ((5R)-((1R)-乙醯胺基-(2S)-甲氧基-(2S)-甲基戊基)-(4S)-E/Z-[3-(炔丙基-PEG4)-丙烯基]-吡咯啶-(2R)-甲酸) (0.031 mmol)、硫酸銅(0.62 mmol)、參(3-羥基丙基三唑基甲基)-胺(0.62 mmol)及抗壞血酸鈉(0.93 mmol)之pH 7.4 PBS x 1緩衝溶液(2.45 mL)中。所得均質溶液用搖桿台輕柔地震盪持續12 h。粗溶液用pH 7.4 PBS稀釋至1 mg/mL之最終濃度，且經超濾(10,000 MWCO)兩次至1 mL體積。粗混合物接著1:10稀釋於PBS pH 7.4中，且相繼使用MabSelect Sure Resin (GE Healthcare, Chicago, IL, USA)、尺寸排阻層析法經純化。經純化材料使用NANODROP™ UV可見光光譜儀(使用基於結合中所用之Fc之胺基酸序列計算的消光係數經定量，且使用離心濃縮機(10,000 MWCO)經濃縮至大約10 mg/mL。經純化分子使用4-12% Bis Tris SDS PAGE凝膠藉由將1-2 ug每種分子裝載至該凝膠中且使用instant Blue染色進行染色而經分析。各凝膠包括具有經指示分子量標準之分子量梯。使用MALDI MS分析來測定平均DAR。實例 51. 合成炔丙基 -PEG4- 溴化鏻。
Figure 02_image1668
炔丙基-PEG4-溴化物(1.0 mmol)及三苯膦(1.2 mmol)於甲苯(10 mL)中之混合物經回流。在完成時，該混合物冷卻至環境溫度。過濾固體且無需任何額外純化即用於下一步驟。實例 52. 合成 Int-14 ((5R)-[(1R)-( 炔丙基 -PEG4- 羧醯胺 )-(2S)- 甲氧基 -(2S)- 甲基戊基 ]-(4S)-Z- 丙烯基吡咯啶 -(2R)- 甲酸 , HCI 鹽 )
Figure 02_image1670
步驟 a. N-{(2.S)- 甲氧基 -((1R)-[1-(4- 甲氧基苯甲基 )-5- 側氧基 -(3S)-Z- 丙烯基吡咯啶 -(2R)- 基 ]-(2S)- 甲基戊基 }-( 炔丙基 -PEG4)- 甲醯胺。
向{(2S)-甲氧基-(1R)-[1-(4-甲氧基苯甲基)-5-側氧基-(3S)-Z-丙烯基吡咯啶-(2R)-基]-(2S)-甲基戊基}-胺基甲酸第三丁酯(其根據參考文獻JACS , 2002,124 , 4716-4721經製備；1.0 mmol)於無水二氯甲烷(5 mL)中之0℃攪拌混合物中添加三氟乙酸(10 mmol)，且溫度升至環境溫度。在完成時，在減壓下移除溶劑。所得殘餘物溶解於二氯甲烷(20 mL)中且用飽和碳酸氫鈉水溶液萃取。分離有機層，乾燥(硫酸鈉)，過濾且蒸發。粗胺溶解於DMF (5 mL)中且在0℃下在攪拌下用炔丙基-PEG4-酸(1.1 mmol)、二異丙基乙胺(3.0 mmol)及HATU (1.1 mmol)處理。在反應完成時，所有揮發物均根據真空技術經蒸發。殘餘物溶解於乙酸乙酯(15 ml)中，且相繼用飽和碳酸氫鈉水溶液(10 mL)、1 M硫酸水溶液(10 mL)洗滌。經組合之有機物經硫酸鈉乾燥，過濾且濃縮。殘餘物藉由層析技術經純化以提供所需產物。步驟 b. (2R)-((1R)-( 炔丙基 -PEG4- 羧醯胺 )-(2S)- 甲氧基 -(2S)- 甲基戊基 )-(5R)- 側氧基 -(3S)-Z- 丙烯基吡咯啶 -1- 甲酸第三丁酯。
在45℃下在1 h期間分成小份向N-{(2.S)-甲氧基-(1R)-[1-(4-甲氧基苯甲基)-5-側氧基-(3S)-Z-丙烯基吡咯啶-(2R)-基]-(2S)-甲基戊基}-(炔丙基-PEG4)-甲醯胺(1.0 mmol)於乙腈及水之混合物(10:1，5 mL)中之攪拌溶液中添加硝酸鈰銨(2.0 mmol)，且繼續攪拌直至完成。該反應用飽和碳酸氫鈉水溶液(5 mL)淬滅。水層用EtOAc (3 × 10 mL)萃取，經組合之有機層經乾燥(硫酸鈉)且蒸發以生成粗物質，其無需進一步純化即用於下一步驟。該材料溶解於乙腈(5 mL)中，相繼添加碳酸二-第三丁酯(1.5 mmol)、三乙胺(2.0 mmol)及DMAP (催化量)。在完成時，該反應用飽和氯化銨溶液(5 mL)淬滅。水層用EtOAc (3 × 10 mL)萃取，且經組合之有機層經乾燥(硫酸鈉)。所有揮發物均根據真空技術經移除。必要時，殘餘物藉由層析技術經純化以提供所需產物。步驟 c. (2R)-((1R)-( 炔丙基 -PEG4- 羧醯胺 )-(2S)- 甲氧基 -(2S)- 甲基戊基 )-(5R/S)- 甲氧基 -(3S)-Z- 丙烯基吡咯啶 -1- 甲酸第三丁酯。
向(2R)-((1R)-(炔丙基-PEG4-羧醯胺)-(2S)-甲氧基-(2S)-甲基戊基)-(5R)-側氧基-(3S)-Z-丙烯基吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(1.0 mmol)於THF (8 mL)中之-78℃攪拌溶液中添加SUPER-HYDRIDE® (1 M於THF中，2.2 mmol)。30 min之後，該反應混合物用飽和碳酸氫鈉水溶液(4 mL)及30%過氧化氫(5滴)淬滅。該混合物加溫至rt且再攪拌持續30 min且水層用EtOAc (3 × 10 mL)萃取。經組合之有機層經乾燥(硫酸鈉)且蒸發溶劑以生成半胺醛，其無需進一步純化即使用。在rt下向上述產物於甲醇(16 mL)中之溶液中添加對甲苯磺酸水合物(0.1 mmol)。該反應混合物經攪拌隔夜且用飽和碳酸氫鈉水溶液(10 mL)淬滅。在減壓下移除甲醇，水(10 mL)添加至所得殘餘物中且用EtOAc (3 × 10 mL)萃取。分離有機物且經鹽水及硫酸鈉乾燥，過濾且濃縮。必要時，殘餘物藉由層析技術經純化以提供所需產物。步驟 d. (2R)-((1R)-( 炔丙基 -PEG4- 羧醯胺 )-(2S)- 甲氧基 -(2S)- 甲基戊基 )-(5R)- 氰基 -(3S)-Z- 丙烯基吡咯啶 -1- 甲酸第三丁酯。
向(2R)-((1R)-(炔丙基-PEG4-羧醯胺)-(2S)-甲氧基-(2S)-甲基戊基)-(5R/S)-甲氧基-(3S)-Z-丙烯基吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(1.0 mmol)於二氯甲烷(20 mL)中之-78℃攪拌溶液中相繼添加氰化三甲基矽烷(2.0 mmol)、三氟化硼乙醚(1.2 mmol)。該反應混合物經3 h時期自-78℃經攪拌至-50℃。添加飽和碳酸氫鈉水溶液(40 mL)且水層用EtOAc (3 × 15 mL)萃取。經組合之有機層經乾燥(硫酸鈉)，過濾且在減壓下濃縮。由差向異構氰基衍生物之混合物組成的所得殘餘物藉由層析技術經純化以提供所需產物。步驟 e. (5R)-[(1R)-( 炔丙基 -PEG4- 羧醯胺 )-(2S)- 甲氧基 -(2S)- 甲基戊基 ]-(4S)-Z- 丙烯基吡咯啶 -(2R)- 甲酸 , HCI 鹽。
在rt下向(2R)-((1R)-(炔丙基-PEG4-羧醯胺)-(2S)-甲氧基-(2S)-甲基戊基)-(5R)-氰基-(3S)-Z-丙烯基吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(1.0 mmol)於AcOH (10 mL)中之溶液中添加12N HCI (10 mL)。該溶液在rt下經攪拌直至完成，在減壓下蒸發溶劑。必要時，殘餘物藉由層析技術經純化以提供所需產物。實例 53. 合成結合物 10
hIgG1 Fc-PEG4-疊氮化物於pH 7.4 PBS x 1緩衝溶液中之溶液(100 mg，1.71 µmol，7.011 mL，MW = 58,200 Da，DAR = 3.7)添加至Int-14 ((5R)-[(1R)-(炔丙基-PEG4-羧醯胺)-(2S)-甲氧基-(2S)-甲基戊基]-(4S)-Z-丙烯基吡咯啶-(2R)-甲酸, HCI鹽) (0.031 mmol)、硫酸銅(0.62 mmol)、參(3-羥基丙基三唑基甲基)-胺(0.62 mmol)及抗壞血酸鈉(0.93 mmol)之pH 7.4 PBS x 1緩衝溶液(2.45 mL)中。所得均質溶液用搖桿台輕柔地震盪持續12 h。粗溶液用pH 7.4 PBS稀釋至1 mg/mL之最終濃度，且經超濾(10,000 MWCO)兩次至1 mL體積。粗混合物接著1:10稀釋於PBS pH 7.4中，且相繼使用MabSelect Sure Resin (GE Healthcare, Chicago, IL, USA)、尺寸排阻層析法經純化。經純化材料使用NANODROP™ UV可見光光譜儀(使用基於結合中所用之Fc之胺基酸序列計算的消光係數經定量，且使用離心濃縮機(10,000 MWCO)經濃縮至大約10 mg/mL。經純化分子使用4-12% Bis Tris SDS PAGE凝膠藉由將1-2 μg每種分子裝載至該凝膠中且使用instant Blue染色進行染色而經分析。各凝膠包括具有經指示分子量標準之分子量梯。使用MALDI MS分析來測定平均DAR。實例 54. 合成 Int-15, HCI 鹽
Figure 02_image1672
步驟 a. N-{(2.S)- 甲氧基 -((1R)-[1-(4- 甲氧基苯甲基 )-5- 側氧基 -(3S)-Z- 丙烯基吡咯啶 -(2R)- 基 ]-(2S)- 甲基戊基 }-(3- 丁炔基 )- 甲醯胺。
向{(2S)-甲氧基-(1R)-[1-(4-甲氧基苯甲基)-5-側氧基-(3S)-Z-丙烯基吡咯啶-(2R)-基]-(2S)-甲基戊基}-胺基甲酸第三丁酯(其根據參考文獻JACS , 2002,124 , 4716-4721經製備；1.0 mmol)於無水二氯甲烷(5 mL)中之0℃攪拌混合物中添加三氟乙酸(10 mmol)，且溫度升至環境溫度。在完成時，在減壓下移除溶劑。所得殘餘物溶解於二氯甲烷(20 mL)中且用飽和碳酸氫鈉水溶液萃取。分離有機層，乾燥(硫酸鈉)，過濾且蒸發。粗胺溶解於DMF (5 mL)中且在0℃下在攪拌下用4-戊炔酸(1.1 mmol)、二異丙基乙胺(3.0 mmol)及HATU (1.1 mmol)處理。在反應完成時，所有揮發物均根據真空技術經蒸發。殘餘物溶解於乙酸乙酯(15 ml)中，且相繼用飽和碳酸氫鈉水溶液(10 mL)、1 M硫酸水溶液(10 mL)洗滌。經組合之有機物經硫酸鈉乾燥，過濾且濃縮。殘餘物藉由層析技術經純化以提供所需產物。步驟 b. (2R)-((1R)-(4- 戊炔醯基 )-(2S)- 甲氧基 -(2S)- 甲基戊基 )-(5R)- 側氧基 -(3S)-Z- 丙烯基吡咯啶 -1- 甲酸第三丁酯。
在45℃下在1 h期間分成小份向N-{(2.S)-甲氧基-(1R)-[1-(4-甲氧基苯甲基)-5-側氧基-(3S)-Z-丙烯基吡咯啶-(2R)-基]-(2S)-甲基戊基}-(3-丁炔基)-甲醯胺(1.0 mmol)於乙腈及水之混合物(10:1，5 mL)中之攪拌溶液中添加硝酸鈰銨(2.0 mmol)，且繼續攪拌直至完成。該反應用飽和碳酸氫鈉水溶液(5 mL)淬滅。水層用EtOAc (3 × 10 mL)萃取，經組合之有機層經乾燥(硫酸鈉)且蒸發以生成粗物質，其無需進一步純化即用於下一步驟。該材料溶解於乙腈(5 mL)中，相繼添加碳酸二-第三丁酯(1.5 mmol)、三乙胺(2.0 mmol)及DMAP (催化量)。在完成時，該反應用飽和氯化銨溶液(5 mL)淬滅。水層用EtOAc (3 × 10 mL)萃取，且經組合之有機層經乾燥(硫酸鈉)。所有揮發物均根據真空技術經移除。必要時，殘餘物藉由層析技術經純化以提供所需產物。步驟 c. (2R)-((1R)-(4- 戊炔醯基 )-(2S)- 甲氧基 -(2S)- 甲基戊基 )-(5R/S)- 甲氧基 -(3S)-Z- 丙烯基吡咯啶 -1- 甲酸第三丁酯。
向(2R)-((1R)- (2R)-((1R)-(4-戊炔醯基)-(2S)-甲氧基-(2S)-甲基戊基)-(5R)-側氧基-(3S)-Z-丙烯基吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(1.0 mmol)於THF (8 mL)中之-78℃攪拌溶液中添加SUPER-HYDRIDE® (1 M於THF中，2.2 mmol)。30 min之後，該反應混合物用飽和碳酸氫鈉水溶液(4 mL)及30%過氧化氫(5滴)淬滅。該混合物加溫至rt且再攪拌持續30 min且水層用EtOAc (3 × 10 mL)萃取。經組合之有機層經乾燥(硫酸鈉)且蒸發溶劑以生成半胺醛，其無需進一步純化即使用。在rt下向上述產物於甲醇(16 mL)中之溶液中添加對甲苯磺酸水合物(0.1 mmol)。該反應混合物經攪拌隔夜且用飽和碳酸氫鈉水溶液(10 mL)淬滅。在減壓下移除甲醇，水(10 mL)添加至所得殘餘物中且用EtOAc (3 × 10 mL)萃取。分離有機物且經鹽水及硫酸鈉乾燥，過濾且濃縮。必要時，殘餘物藉由層析技術經純化以提供所需產物。步驟 d. (2R)-((1R)-(4- 戊炔醯基 )-(2S)- 甲氧基 -(2S)- 甲基戊基 )-(5R)- 氰基 -(3S)-Z- 丙烯基吡咯啶 -1- 甲酸第三丁酯。
向(2R)-((1R)-(4-戊炔醯基)-(2S)-甲氧基-(2S)-甲基戊基)-(5R/S)-甲氧基-(3S)-Z-丙烯基吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(1.0 mmol)於二氯甲烷(20 mL)中之-78℃攪拌溶液中相繼添加氰化三甲基矽烷(2.0 mmol)、三氟化硼乙醚(1.2 mmol)。該反應混合物經3 h時期自-78℃經攪拌至-50℃。添加飽和碳酸氫鈉水溶液(40 mL)且水層用EtOAc (3 × 15 mL)萃取。經組合之有機層經乾燥(硫酸鈉)，過濾且在減壓下濃縮。由差向異構氰基衍生物之混合物組成的所得殘餘物藉由層析技術經純化以提供所需產物。步驟 e.
向N-{(2.S)-甲氧基-(1R)-[1-(4-甲氧基苯甲基)-5-側氧基-(3S)-Z-丙烯基吡咯啶-(2R)-基]-(2S)-甲基戊基}-(3-丁炔基)-甲醯胺(1.0 mmol)、雙-[N'-(2-疊氮基乙基)]-亞胺基二乙醯胺(0.5 mmol)、1H-1,2,3-三唑-4-甲胺, 1-(苯基甲基)-N,N-雙[1-(苯基甲基)-1H-1,2,3-三唑-4-基]甲基]-(0.1 mmol)及抗壞血酸鈉(1.0 mmol)於乙醇(5 mL)及水(5 mL)中之攪拌混合物中添加硫酸銅(0.1 mmol)。在完成時，該反應用SiliaMetSTAAcONa (0.3 mmol)處理持續30分鐘。過濾該反應且所有揮發物均根據真空技術經蒸發。殘餘物藉由層析技術經純化以提供所需產物。步驟 f.
向步驟e.之中間物(1.0 mmol)、炔丙基-PEG4-酸(1.05 mmol)及DIPEA (3.0 mmol)於DMF (10 mL)中之0℃攪拌溶液中添加HATU (2.0 mmol)。所有揮發物均根據真空技術經蒸發且殘餘物藉由層析技術經純化以提供所需產物。步驟 g. Int-15, HCl 鹽
在rt下向步驟f.之中間物(1.0 mmol)於AcOH (10 mL)中之溶液中添加12N HCI (10 mL)。該溶液在rt下經攪拌直至完成，在減壓下蒸發溶劑。必要時，殘餘物藉由層析技術經純化以提供所需產物。實例 55. 合成結合物 11
hIgG1 Fc-PEG4-疊氮化物於pH 7.4 PBS x 1緩衝溶液中之溶液(100 mg，1.71 µmol，7.011 mL，MW = 58,200 Da，DAR = 3.7)添加至Int-15 HCI鹽(0.031 mmol)、硫酸銅(0.62 mmol)、參(3-羥基丙基三唑基甲基)-胺(0.62 mmol)及抗壞血酸鈉(0.93 mmol)之pH 7.4 PBS x 1緩衝溶液(2.45 mL)中。所得均質溶液用搖桿台輕柔地震盪持續12 h。粗溶液用pH 7.4 PBS稀釋至1 mg/mL之最終濃度，且經超濾(10,000 MWCO)兩次至1 mL體積。粗混合物接著1:10稀釋於PBS pH 7.4中，且相繼使用MabSelect Sure Resin (GE Healthcare, Chicago, IL, USA)、尺寸排阻層析法經純化。經純化材料使用NANODROP™ UV可見光光譜儀(使用基於結合中所用之Fc之胺基酸序列計算的消光係數經定量，且使用離心濃縮機(10,000 MWCO)經濃縮至大約10 mg/mL。經純化分子使用4-12% Bis Tris SDS PAGE凝膠藉由將1-2 μg每種分子裝載至該凝膠中且使用instant Blue染色進行染色而經分析。各凝膠包括具有經指示分子量標準之分子量梯。使用MALDI MS分析來測定平均DAR。實例 56. 合成雙 -[N'-(2- 疊氮基乙基 )]- 亞胺基二乙醯胺。
Figure 02_image1674
步驟 a. 雙 -[N'-(2- 疊氮基乙基 )]-N-Boc- 亞胺基二乙醯胺。
向N-Boc-亞胺基二乙酸(1.0 mmol)、2-疊氮基乙-1-胺鹽酸鹽(2.0 mmol)及DIPEA (6.0 mmol)於DMF (10 mL)中之0℃攪拌溶液中添加HATU (2.0 mmol)。所有揮發物均根據真空技術經蒸發且殘餘物藉由層析技術經純化以提供所需產物。步驟 b. 雙 -[N'-(2- 疊氮基乙基 )]- 亞胺基二乙醯胺。
向雙-[N'-(2-疊氮基乙基)]-N-Boc-亞胺基二乙醯胺(1.0 mmol)及2-甲基-2-丁烯(0.5 mL)於二氯甲烷(8.0 mL)中之0℃攪拌混合物中添加三氟乙酸(4.0 mL)。10分鐘之後，溫度升至環境溫度。在完成時，所有揮發物均根據真空技術經蒸發。殘餘物藉由層析技術經純化以提供所需產物。實例 57. 合成 Int-16
結合於PEG4 -炔連接體且可進一步結合於Fc域或白蛋白之磺基紮那米韋單體係根據以下合成流程產生。磺基紮那米韋起始材料係根據Hadházi等人 A sulfozanamivir analogue has potent anti-influenza virus activity.ChemMedChem Comm. 13:785-789 (2018)產生。
Figure 02_image1676
實例 58. 合成 Int-17
結合於PEG4 -炔連接體且可進一步結合於Fc域或白蛋白之磺基紮那米韋二聚體係根據以下合成流程產生。磺基紮那米韋起始材料係根據Hadházi等人 A sulfozanamivir analogue has potent anti-influenza virus activity.ChemMedChem Comm. 13:785-789 (2018)產生。
Figure 02_image1678
實例 59. 合成結合物 12
經疊氮基官能化之無糖基化Fc (70 mg，4.7 mL，1.3709 µmol)之溶液添加至含有炔衍生之小分子(29.8 mg，0.0216 mmol，Int-7)之15 mL離心管中。在輕柔地震盪以溶解所有固體之後，向該混合物中添加206 µl L-抗壞血酸鈉(59.4 mg，0.3 mmol)、硫酸銅(II) (15.9 mg，0.1 mmol)及THPTA (43.5 mg，0.1 mmol)於PBS 7.4緩衝液(1 ml)中之混合溶液。所得混合物輕柔地震盪隔夜。其相繼藉由在蛋白A管柱上之親和層析法、如實例8所述之尺寸排阻層析法經純化。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出56,177 Da之平均質量(DAR = 3.6)。產量10.1 mg，14%產率。結合物12之非還原SDS-PAGE提供於圖54中。實例 60. 合成 Int-18
Figure 02_image1680
步驟 a. 合成 (17-{4-[( 第三丁氧羰基 ) 胺基 ] 丁基 }-16- 側氧基 -4,7,10,13- 四氧雜 -17- 氮雜二十一 -1- 炔 -21- 基 ) 胺基甲酸第三丁酯
Figure 02_image1682
在室溫下向[氮烷二基二(丁烷-4,1-二基)]雙胺基甲酸二-第三丁酯(1.5 g，4.17 mmol，來自實例45步驟a)及炔丙基-PEG4-酸(1.08 g，4.17 mmol)於DCM (40 mL)中之溶液中添加EDC (1.0 g，5 mmol)、HOBt (650 mg，5 mmol)及DIEA (1.4 ml，10mmol)，接著在室溫下攪拌隔夜。所得溶液經濃縮且經純化且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以10%至100%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀不使用修飾劑經純化。產量1.9 g，76%。藉由LCMS發現之離子：M+H =602.4。步驟 b. 合成 N,N- 雙 (4- 胺基丁基 )-4,7,10,13- 四氧雜十六 -15- 炔 -1- 醯胺
Figure 02_image1684
(17-{4-[(第三丁氧羰基)胺基]丁基}-16-側氧基-4,7,10,13-四氧雜-17-氮雜二十一-1-炔-21-基)胺基甲酸第三丁酯(1.90，3.1 mmol)在室溫下用20 ml TFA處理持續0.5小時，接著濃縮至乾且無需進一步純化即用於下一步驟中。此步驟之產率為定量的。藉由LCMS發現之離子：M/2+H =402.3。步驟 c. 合成經完全保護之 Int-18
Figure 02_image1686
N,N-雙(4-胺基丁基)-4,7,10,13-四氧雜十六-15-炔-1-醯胺(0.150 g，0.32 mmol)添加至醚連接之紮那米韋酸(0.400 g，0.63 mmol，描述於實例31步驟f中)於DCM (10 mL)中之溶液中，接著在室溫下用EDC (0.200 g，1.0 mmol)、HOBt (0.135 g，1.00 mmol)及DIEA (0.14 ml，1.00 mmol)處理隔夜。所得溶液經濃縮且經純化且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以10%至100%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀不使用0.1% TFA作為修飾劑經純化。產物之產量310 mg，60.3%。藉由LCMS發現之離子：M/2+H =813.9。步驟 d. 合成 Int-18
Figure 02_image1688
前一步驟之產物(300 mg，0.18 mmol)用三氟乙酸(2 mL)處理且在室溫下經攪拌持續30 min。所得溶液經濃縮，再溶解於水(2 mL)中，接著用氫氧化鋰(24 mg，1 mmol)溶解於水(1 mL)中之溶液處理。該反應經攪拌10 min，接著用0.1 ml乙酸淬滅，經濃縮且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以0%至50%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀使用0.1% TFA作為修飾劑經純化。產物之產量140 mg，52%。藉由LCMS發現之離子：M/2+H =573.8, M/3+H =382.9。實例 61. 合成用於結合物 13a 之 PEG4- 疊氮基 Fc 製備 DMF/PBS 中之 0.05M PEG4- 疊氮基 NHS 酯溶液
PEG4-疊氮基NHS酯(80.5 mg)在0℃下溶解於DMF (0.50 mL)中且在0℃下藉由添加3.50 mL PBS 1x緩衝液經稀釋至4.063 mL。使用此溶液，藉由調節此PEG4-疊氮基NHS酯PBS x1溶液之當量數來製備具有多種藥物-抗體比率(DAR)值之其他PEG4-疊氮基Fc。製備 PEG4- 疊氮基 Fc
0.05M PEG4-疊氮基NHS酯PBS x1緩衝溶液(0.0984 mL，4.92 μmol，2.5當量)添加至h-IgG1 Fc溶液(105 mg於5.031 mL pH 7.4 PBS中，MW~53,360 Da，1.968 μmol)中且該混合物在環境溫度下輕柔地震盪持續12小時。該溶液使用離心濃縮機(30,000 MWCO)經濃縮至約1.5 mL之體積。粗混合物1:10稀釋於PBS pH 7.4中，且再次經濃縮。重複此洗滌程序，共計三次。用此程序移除未反應之疊氮基試劑。經濃縮Fc-PEG4-疊氮化物用pH 7.4 PBS 1x緩衝液稀釋至5.03 mL且準備用於點擊結合。經純化材料使用NANODROP™ UV可見光光譜儀(使用基於h-IgG1之胺基酸序列計算的消光係數)經定量。在緩衝液交換/純化之後，產率為定量的。
編碼本文所述任何結合物之Fc的核酸構築體可包括編碼包括Lys447(例如，C末端離胺酸殘基)及/或N末端鼠類IgG信號序列之Fc之胺基酸序列的核酸序列。表現後，Fc之C末端離胺酸及(若存在之)N末端鼠類IgG信號序列經蛋白水解裂解，由此產生具有缺少Lys447(例如，缺少C末端離胺酸殘基)及(若存在於表現構築體中) N末端鼠類IgG信號序列之胺基酸序列的Fc。C末端離胺酸之存在或不存在不改變Fc或相應結合物之性質。實例 62. 合成結合物 13a
製備點擊試劑溶液：PBS緩衝溶液中之0.0050M CuSO4 ：20.0 mg CuSO4 溶解於25.0 mL PBS x1中，接著採用22.0 mL上述CuSO4 溶液且添加189.4 mg BTTAA及1090 mg抗壞血酸鈉以生成澄清溶液(0.0050M CuSO4、0.020M BTTAA及0.25M抗壞血酸鈉)。
經疊氮基官能化之Fc (100 mg，4.79 mL，1.87 µmol，SEQ ID NO: 35)之溶液添加至含有炔衍生之小分子Int-18 (11.2 mg，0.00750 mmol，在實例60中製備)之15 mL離心管中。在輕柔地震盪以溶解所有固體之後，該溶液用3.00 mL上述點擊試劑溶液處理。所得無色均質溶液輕柔地震盪隔夜。其相繼藉由在蛋白A管柱上之親和層析法、尺寸排阻層析法(參見實例10中之一般結合物純化方案)經純化。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出55,913 Da之平均質量(DAR = 1.7)。產量54.0 mg，54%產率。
編碼結合物13a之Fc之核酸構築體包含編碼SEQ ID NO：35之胺基酸序列的核酸，該胺基酸序列包含C末端離胺酸殘基及N末端鼠類IgG信號序列。表現後，結合物13a之Fc之C末端離胺酸及N末端鼠類IgG信號序列經蛋白水解裂解，由此產生具有缺少Lys447(例如，缺少C末端離胺酸殘基)及N末端鼠類IgG信號序列之序列的Fc。C末端離胺酸之存在或不存在不改變Fc或相應結合物之性質。實例 63. 合成結合物 13b 、結合物 13c 、結合物 13d 、結合物 13e 、結合物 13f 及結合物 13g
用於結合物13b、結合物13c、結合物13d、結合物13e、結合物13f及結合物13g之PEG4-疊氮基Fc類似於結合物13a之PEG4-疊氮基Fc經製備(實例61)，如下表中所述調節PEG4-疊氮基NHS酯之當量數。結合物13b、結合物13c、結合物13d、結合物13e、結合物13f及結合物13g類似於實例62中之結合物13a經製備，其中靶向部分(Int-18)之當量數係基於所需DAR值(表26)經調節，且所用的點擊試劑溶液之體積係如用於實例62之程序中所用的相同體積。DAR值、分子量及產量列於下表中。產物結合物相繼藉由在蛋白A管柱上之親和層析法、如實例8所述之尺寸排阻層析法經純化。結合物13a-13g之非還原SDS-PAGE提供於圖55中。 表26：結合物13a-13g之產率
樣品名稱 PEG4- 疊氮基NHS 酯之當量數 DAR ( 平均值) MALDI 質量Da ( 平均值) 靶向部分(TM) TM 之當量數 蛋白質類型 產率(%)
結合物13a 2.5 1.7 55913 Int-18 4 hIgG1 Fc 54%
結合物13b 4.5 2.7 57278 Int-18 6 hIgG1 Fc 50%
結合物13c 6.5 3.8 58908 Int-18 8 hIgG1 Fc 60%
結合物13d 8.5 4.7 60149 Int-18 10 hIgG1 Fc 54%
結合物13e 11 5.8 61726 Int-18 12 hIgG1 Fc 55%
結合物13f 18 8.2 65146 Int-18 16 hIgG1 Fc 53%
結合物13g 25 10.3 68153 Int-18 20 hIgG1 Fc 45%
實例 64. 結合物 6 之活體外穩定性
為了證明結合物6之活體外穩定性，使用小鼠及人類新鮮經K2 EDTA處理之血漿及肝微粒體。活體外小鼠及人類血漿穩定性藉由在37℃下藉由MALDI-TOF質譜偵測來比較血漿中24 h培育之後的藥物:抗體比率(DAR)包膜經測定。亦在37℃下在培育24 h之後藉由MALDI-TOF質譜偵測來執行使用小鼠及人類微粒體之肝微粒體穩定性。這係為了鑑別Fc蛋白、連接體或標靶部分上之潛在代謝不穩定位點。64.1 血漿穩定性樣品製備
首先，60 µL 3 mg/ml之結合物6與120 µL血漿混合。各血漿類型等分至2個管中。來自各血漿類型之一個等分試樣立即經冷凍。剩餘等分試樣置於水浴(37℃)中持續24小時。MAGNE®蛋白A珠粒(Promega)藉由輕柔渦旋該等珠粒至懸浮液中經平衡。針對兩種血漿類型一式兩份，50 µL珠粒漿液添加至1.5 mL微離心管中且置於磁性台架上持續10秒。10秒之後，移出且棄去該儲存緩衝液。500 µL結合/洗滌緩衝液(0.1% BSA於1X PBS pH 7.4中)添加至含有該等珠粒之1.5 mL微離心管中。該等珠粒經混合(渦旋)且置於磁性台架上持續10秒。10秒之後，移出且棄去該結合/洗滌緩衝液。50 µL緩衝液(1x PBS，pH 7.4)添加至含有該等珠粒之微離心管中。50 µL血漿混合物添加至該等珠粒中且輕柔渦旋以混合。使用管式震盪器，使該樣品在室溫下混合持續60分鐘，確保該等珠粒保持呈懸浮狀態。在混合之後，該管置於磁性台架上持續10秒且移除上清液。添加500 µL緩衝液(1x PBS，pH 7.4)且輕柔渦旋以混合。在混合之後，該管置於磁性台架上持續10秒，隨後移出且棄去洗滌緩衝液。重複該洗滌步驟，共計2次洗滌。在用500 µL緩衝液(1x PBS，pH 7.4)進行2次洗滌之後，分別用500 µL、200 µL及100 µL水執行3次洗滌。適當體積之水添加至該管中且輕柔渦旋以充分混合，且接著置於磁性台架上持續10秒，隨後移出且棄去水。在用水進行第三次洗滌之後，30 µL溶離緩衝液(90:10:0.4 水:乙腈:TFA)添加至該等珠粒中。使用管式震盪器，使該溶離緩衝液及樣品在室溫下混合持續30分鐘。在混合之後，該管置於磁性台架上持續10秒，移出且保留含有該樣品之溶離緩衝液。2 µL樣品與2 µL MALDI基質(20 mg/mL芥子酸於70:30:0.1 水:乙腈:TFA中)混合且滴於使用雙層技術之MALDI標靶板上。接著藉由MALDI-TOF質譜法分析該樣品。64.2 肝微粒體樣品製備
用500 mM Tris-HCl (pH 7.5)及50 mM氯化鎂六水合物製備10x緩衝液。ACV-006在1x PBS (pH 7.4)中經稀釋至50 µM。解凍且渦旋肝微粒體。肝微粒體之各樣本之等分試樣在70℃下經熱滅活持續15分鐘，以用作對照物。根據表27製備用於兩種樣本之反應混合物。管在水浴(37℃)中經培育持續24小時。萃取樣品以使用MAGNE®蛋白A珠粒(Promega)根據來自59.1之方案進行分析。 表27：0.5 mg/mL最終微粒體濃度，使用5 µM結合物6
   經熱滅活 肝
總計 400 μL 400 μL
水 286 μL 286 μL
10x緩衝液 40 μL 40 μL
微粒體(20 mg/mL) 10 μL 10 μL
化合物(50 µM) 40 μL 40 μL
NADPH再生溶液A 20 μL 20 μL
NADPH再生溶液B 4 μL 4 μL
64.3 樣品及數據分析
使用Bruker Compass Flex Control 3.4版採集樣品以獲得全掃描MALDI-TOF質譜(表28)。BSA用作針對採集質量範圍之內部校準物。進一步用Bruker Compass Flex Analysis 3.4版軟體分析數據。另外，比較對照物之DAR模式與測試樣品之DAR模式。 表28：質譜儀(MS)參數
質譜儀 Bruker Microflex LT
偵測
質量範圍 17-141 kDa
采樣率及數位儀設置 0.5
偵測器增益 2.05x
基線偏移調節 0%
模擬偏移 0.5 mV
雷射頻率 60 Hz
光譜儀   
離子源1 (IS1) 20.03 kV
離子源2 (IS2) 18.12 kV (90.5% IS1)
透鏡 7.17 kV (35.8% IS1)
脈衝離子引出 1010 ns
樣品容器
隨機漫步 部分樣品
雷射發射 100/截面
總雷射發射 500
光柵處之發射 20
光柵發射直徑極限 2000 μm
設置   
雷射全域衰減器偏移 0%
雷射衰減器偏移 20%
雷射衰減器範圍 30%
數位儀靈敏度(全刻度) 100 mV
數位儀模擬偏移線性 0.5 mV
數位儀數位偏移線性 0 cnt
偵測器增益電壓-線性基底 2500 V
偵測器增益電壓-線性升壓 0 V
校準   
牛血清白蛋白 [M+2H], [M+H], [2M+H]
64.4 結果
在小鼠及人類新鮮經K2 EDTA處理之血漿及肝微粒體中測試測試化合物結合物6 (圖43)之活體外穩定性。
結合物6以1 mg/mL之最終濃度經摻加至新鮮K2 EDTA小鼠及人類血漿中。血漿分成2個等分實驗，一個立即經冷凍，且另一個在37℃水浴經培育持續24小時。在培育結束時，藉由MAGNE®蛋白A磁性珠粒自血漿基質萃取樣品。在血漿培育之後，藉由MALDI-TOF質譜法分析樣品之DAR改變。在小鼠(圖44)或人類(圖45)血漿培育中未發現結合物6產生任何DAR改變。
在50 mM pH 7.5 Tris-HCl緩衝溶液中以5 μM之最終濃度測試結合物6肝微粒體穩定性，該緩衝溶液含有最終濃度為0.5 mg/mL之活性或經熱滅活肝微粒體及最終濃度為5 mM之MgCl2 。所有樣品均在37℃恆定溫度下經培育，且在培育期間使用磷酸菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)再生溶液來提供連續輔因子可用性。進行培育持續24小時。在培育結束時，藉由蛋白A磁性珠粒自微粒體基質萃取樣品。在肝微粒體培育之後，藉由MALDI-TOF質譜法分析樣品之DAR改變。在小鼠(圖46)或人類(圖47)肝微粒體培育中未發現結合物6產生任何DAR改變。
在37℃下培育持續24 h之後的活體外血漿穩定性表明，小鼠或人類中缺乏結合物6 Fc、連接體或靶向部分之降解。同樣，在小鼠及人類肝微粒體中培育之後觀察到缺乏降解，表明代謝物不存在。此等活體外穩定性研究之結果支持存在如下穩定化合物，其具有可能具有生物易感性之降解劑。實例 65. 結合物 13 在致死性小鼠模型中在不同藥物 : 抗體比率 (DAR) 下針對流感 A (H1N1) 之功效
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8週)中針對致死性IAV H1N1流感感染評估結合物13。攻擊病毒(A/Puerto Rico/8/1934)係能夠在小鼠中引起致死性感染之小鼠適應性分離株。該實驗包含13組，每組5隻小鼠。在第0天，所有小鼠均在經氯胺酮/甲苯噻嗪之混合物(分別為150及10 mg/kg)麻醉之後藉由鼻內接種經30 µl體積之病毒(3x LD95)攻擊。
第1-13組在測試物品或媒劑(PBS)之病毒攻擊之後2小時接受單一IV治療。該研究評估了對應於結合物13a、結合物13c、結合物13d及結合物13g (DAR分別為1.7、3.8、5.8及10.3)之4種不同DAR之結合物13構築體。結合物13a、結合物13c、結合物13d及結合物13g之合成描述於實例61-實例63中。各構築體在0.03、0.1及0.3 mg/kg下經評估。針對各結合物之一般研究設計概述於表29中。 表29：DAR掃描之一般研究設計
組 結合物 DAR 途徑/ 時程 劑量(mg/kg) 劑量體積(ml/kg)
1 結合物13a 1.7 IV，T+2小時 0.3 5
2 結合物13a 1.7 IV，T+2小時 0.1 5
3 結合物13a 1.7 IV，T+2小時 0.03 5
4 結合物13c 3.8 IV，T+2小時 0.3 5
5 結合物13c 3.8 IV，T+2小時 0.1 5
6 結合物13c 3.8 IV，T+2小時 0.03 5
7 結合物13d 5.8 IV，T+2小時 0.3 5
8 結合物13d 5.8 IV，T+2小時 0.1 5
9 結合物13d 5.8 IV，T+2小時 0.03 5
10 結合物13g 10.3 IV，T+2小時 0.3 5
11 結合物13g 10.3 IV，T+2小時 0.1 5
12 結合物13g 10.3 IV，T+2小時 0.03 5
13 媒劑(PBS) Na IV，T+2小時 na 5
所有構築體在0.3 mg/kg下均為完全保護性的，相比之下，構築體在0.03 mg/kg下均不具活性(針對所有組，0%存活率)，指示該低劑量低於閾值有效劑量。然而，接受0.1 mg/kg之結合物之組可能有區別(表30)。在此劑量水準下，DAR為1.7、3.8及5.8之結合物比經單獨媒劑治療之小鼠顯著更具保護性(p=0.0027)。然而，高DAR構築體(10.3)未比經單獨媒劑治療之小鼠顯著更具保護性(p=0.091)。使高DAR構築體喪失活性之潛在機制目前尚未可知，但可能由數種因素引起，包括抗體再循環之干擾，導致較短半衰期。 表30：DAR範圍研究(0.1 mg/kg劑量組)
結合物 DAR 存活率% 顯著性*
結合物13a 1.7 60 p=0.0027
結合物13c 3.8 40 p=0.0027
結合物13d 5.8 80 p=0.0027
結合物13g 10.3 0 p=0.091**
* =相對於經單獨媒劑(PBS)治療之小鼠的顯著性，藉由對數秩(Mantel-Cox)測試。 ** =不顯著
實例 66. 結合物 6 及結合物 12 之活體內功效
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8週)中針對致死性IAV H1N1流感感染評估結合物6及結合物12 (模擬N297A處之Fc突變)。攻擊病毒(A/Puerto Rico/8/34)係小鼠適應性分離株。該實驗包含每組5隻小鼠。小鼠經氯胺酮/甲苯噻嗪(150/10 mg/kg)麻醉且藉由鼻內接種經30 µL體積之流感病毒(3-5x LD95 )攻擊。在感染後2 h藉由IV投與單一1個劑量之治療。PBS作為陰性對照物給予。在攻擊之後監測所有小鼠之%體重減輕(圖48)及存活率(圖49)，持續15天。實例 67. 結合物 6 及結合物 12 之活體外 Fcγ 受體 IIIA 結合
藉由ELISA針對FcyRIIIA評估結合物6及結合物12 (模擬N297A處之Fc突變)之結合。板經1 µg/mL之重組人類FcγRIIIA包被隔夜。次日，板用1% BSA溶液阻斷持續1 h。結合物以介於0.01 - 1000 nM範圍內之劑量反應添加至板中且培育持續2 h。藉由用過氧化酶結合之抗人類Fc培育持續1 h且後續用TMB受質試劑培育持續10-15 min來偵測結合。藉由讀取450 nm下之吸光度來測定結合(圖50及圖51)。實例 68. 活體內結合物 6 血漿樣品分析
藉由神經胺糖酸酶捕捉偵測ELISA來定量血漿樣品中之結合物6。簡言之，分子經捕捉於經神經胺糖酸酶包被之板上且接著使用HRP結合之抗人類IgG-Fc抗體進行偵測。在GraphPad Prism中使用結合物6標準曲線之4PL非線性迴歸計算蛋白質濃度。更詳細方法描述提供於下文中。
Nunc Maxisorp 96-孔板(目錄號12-565-136, ThermoFisher)經1X KPL包被緩衝液(5150-0041, SeraCare)中來自A/California/04/2009 (H1N1) (11058-VNAHC, Sino Biological)之0.1U/孔之神經胺糖酸酶包被。板在室溫下在軌道板式振盪器上(500 rpm)經培育持續1 h。血漿樣品之連續稀釋液經塗板且在室溫下經培育持續2小時(樣品稀釋劑：0.5% BSA於PBS 0.025% Tween 20中+原生食蟹獼猴血漿最終濃度為1:2,500)。在各板上一式兩份進行介於0.230-500 ng/mL範圍內之結合物6標準曲線。在2 h培育之後，板在具有0.05% Tween 20之300 µL PBS中洗滌5次。結合於板上之神經胺糖酸酶的結合物接著在室溫下用1:1,000稀釋於樣品稀釋劑中之HRP結合之抗人類IgG Fc F(ab’)2 (709-036-098, Jackson)探測持續1 h。板接著在具有0.05% Tween 20之300 µL PBS中洗滌8次且用TMB受質顯影持續7-8分鐘。該反應用1N H2 SO4 停止。在450 nm下讀取吸光度。使用GraphPad Prism Version 6，根據標準曲線之非線性迴歸分析(S型，4PL分析)內推血漿樣品中之結合物6。
接著使用所得平均血漿濃度，使用Phoenix WinNonlin 7.0藉由非房室分析來計算藥物動力學參數。毒物動力學 (TK) 、第 2 組 (IV ， 5 mg/kg) 及第 3 組 (IV ， 20 mg/kg)
在投與之後第1天(表31)及第8天(表32)，濃度在相同劑量組內之雄性與雌性動物之間可相當。平均血漿暴露看來在這兩天內大約與劑量成比例地增加。在第2劑量投與之後，在不同劑量組中注意到約30%之輕微積聚。不同劑量組中第1天及第8天平均血漿濃度之曲線顯示於圖52中。 表31：毒物動力學，第1天
劑量 (mg/kg) 途徑 性別 濃度(µg/mL) ，時間(h) Tmax (h) Cmax (μg/mL) AUC0-t (µg•h/mL)
0.083 1 2 4 8 24 72 120 168
5 IV F 112 78.8 85.8 71.0 75.1 52.5 38.6 18.5 22.3 0.083 112 6190
   IV M 101 84.6 107 75.3 72.5 38.1 29.8 35.3 15.8 2 107 5970
      平均值 107 81.7 96.5 73.2 73.8 45.3 34.2 26.9 19.0 1.04 110 6080
20 IV F 449 510 353 331 303 134 105 63.6 46.6 1 510 18800
   IV M 448 422 485 373 329 160 96.0 76.2 53.4 2 485 20500
      平均值 449 466 419 352 316 147 100 69.9 50.0 1.50 497 19600
表32：毒物動力學，第8天
劑量 (mg/kg) 途徑 性別 濃度(µg/mL) ，時間(h) Tmax (h) Cmax (μg/mL) AUC0-t (µg•h/mL)
0.083 1 2 4 8 24 72 120 168
5 IV F 111 111 99.3 82.3 100 52.2 46.7 35.0 33.9 1 111 7970
   IV M 113 114 113 78.4 74.4 54.7 35.2 47.1 28.2 1 114 7700
      平均值 112 112 106 80.4 87.3 53.5 41.0 41.1 31.0 1 112 7830
20 IV F 398 359 319 315 298 190 126 99.3 85.5 0.083 398 23900
   IV M 391 443 354 435 263 219 143 142 83.8 1 443 27800
      平均值 394 401 337 375 280 205 134 120 84.7 0.542 420 25800
藥物動力學 (PK) 、第 4 組 (IV ， 10 mg/kg) 及第 5 組 (SC ， 10 mg/kg)
在IV投與之後，雄性及雌性動物之血漿濃度可相當。在IV投與之後觀察到極低清除，導致長的終末半衰期(表33A及表33B)。 表33A：雄性及雌性動物之血漿濃度
劑量 (mg/kg) 途徑 性別 濃度(µg/mL) ，時間(h)
0.083 1 2 4 8 24 72 120 168 336 504 672
5 IV F 166 174 220 153 144 58.6 40.6 21.2 20.7 14.7 n/a 2.7
5 IV M 191 135 258 161 154 71 43.7 47.6 32 22.9 n/a 5.3
表33B：雄性及雌性動物之PK參數
Tmax (h) C0 (µg/mL) Cmax (µg/mL) AUC 最後 (h*µg/mL) AUCINF_obs (h*µg/mL) 半衰期 (h) Cl_obs (mL/min/kg) Vss_obs (mL/kg) Vz_obs (mL/kg)
1 166 220 13700 14400 170 0.00579 68.9 85.1
1 204 258 19400 20800 183 0.004 56.6 63.2
在SC投與之後，在給藥之後72小時達到實現最大濃度之時間，但濃度在給藥後672小時內可量測(表34A及表34B)。SC給藥之後的生物可用性高達大約139%。在10 mg/kg IV與SC投與之間隨時間之血漿濃度的比較顯示於圖53中。 表34A：雄性及雌性動物之血漿濃度
途徑 劑量(mg/kg) 性別 濃度(µg/mL) ，時間(h)
0.083 0.5 1 4 8 24 72 120 168 336 504 672
SC 10 F n/a 1.9 5.3 23.1 39.5 54 58.6 66.9 54 28.4 18.9 6.4
SC 10 M n/a 0.3 2.1 19.9 28.1 46.8 64.9 54.7 57.2 26.8 25.5 8.6
表34B：雄性及雌性動物之PK參數
Tmax Cmax AUC0-t F
(h) (µg/mL) (µg×h/mL) (%)
120 66.9 22600 137%
72 64.9 23300 141%
實例 69. 結合物 6 在致死性小鼠模型中針對流感 A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1) 之功效
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8週)中針對致死性IAV H1N1流感感染評估結合物6。攻擊病毒(A/Puerto Rico/8/1934)係能夠在小鼠中引起致死性感染之小鼠適應性分離株。該實驗包含7組，每組5隻小鼠。在第0天，所有小鼠均在經氯胺酮/甲苯噻嗪之混合物(分別為150及10 mg/kg)麻醉之後藉由鼻內接種經30 µl體積之病毒(3x LD95)攻擊。每天記錄死亡率及體重且具有20%體重減輕之任何動物均評為死亡。測試組在結合物6、hIgG1 Fc對照物或媒劑(PBS)之病毒攻擊之後2小時接受單一IV治療。接受奧司他韋之動物每天給藥，每天兩次，持續5天，在病毒攻擊之後2小時開始。研究設計概述於表35中。 表35：針對流感A/PR/8/34 (h1N1)研究之研究設計
組 測試物品 途徑/ 時程 劑量(mg/kg) 劑量體積(ml/kg) 小鼠數
1 媒劑 IV，T+2 h。 na 5 5
2 hIgG1 Fc IV，T+2 h。 10 5 5
3 奧司他韋 PO，bid × 5，T+2 h。 20 5 5
4 奧司他韋 PO，bid × 5，T+2 h。 5 5 5
5 結合物6 IV，T+2 h。 10 5 5
6 結合物6 IV，T+2 h。 2 5 5
7 結合物6 IV，T+2 h。 0.4 5 5
如所預期，接受媒劑或單獨hIgG1 Fc之小鼠截至第6天死於感染。同樣，經低劑量(5 mg/kg；bid，持續5天)之奧司他韋治療的小鼠截至第8天達到死亡(表36)。然而，以相同給藥時程接受20 mg/kg之奧司他韋的小鼠完全經保護(p=0.0027)。與使用奧司他韋所見形成對比，經結合物6治療之小鼠在來自單一IV劑量之所有劑量水準(10、2及0.4 mg/kg)下均完全經保護(p=0.0027)。 表36：針對流感A/PR/8/34 (H1N1)研究之存活率(第14天)
測試物品 劑量 存活率% 顯著性*
hIgG1 Fc 10 0 p=0.85**
奧司他韋 20 100 p=0.0027
奧司他韋 5 0 p=0.091**
結合物6 10 100 p=0.0027
結合物6 2 100 p=0.0027
結合物6 0.4 100 p=0.0027
* =相對於經單獨媒劑(PBS)治療之小鼠的顯著性，藉由對數秩(Mantel-Cox)測試。 ** =不顯著
結合物6之效能進一步藉由每天體重量測值支持。如所預期，經媒劑或hIgG1 Fc治療之小鼠證明體重平穩下降，直至其超過20%，此時其經評為死亡(表37)。經5 mg/kg之奧司他韋治療之組亦呈現一致的重量減輕，直至第8天達到死亡。經高劑量(20 mg/kg)之奧司他韋治療之小鼠顯示平穩但降低的體重減輕，其在第8天達到14%，接著恢復。
與經對照物及奧司他韋治療之小鼠形成對比，接受結合物6之彼等組在該研究中維持健康體重，即使在最低劑量濃度(0.4 mg/kg)下(表37)。在2 mg/kg劑量組中，經結合物6治療之小鼠中的最大短暫重量減輕在第14天僅為2%。結合物6之存活率及體重量測值均證明使用低至0.4 mg/kg之單一IV劑量時的穩固保護以抵禦流感A/Puerto Rico/8/1934。 表37：小鼠體重數據(相對於第0天之% BW)。5隻小鼠之平均值；*一旦組內之第一隻動物達到死亡，數據即不包括在內
攻擊後天數 媒劑(PBS) hIgG1 Fc (mg/kg) 奧司他韋(mg/kg) 結合物6 (mg/kg)
10 20 5 10 2 0.4
0 100 100 100 100 100 100 100
1 99 99 102 99 103 102 101
2 102 102 103 96 104 102 103
3 96 96 102 95 102 102 100
4 89 88 100 90 103 100 100
5 82 81 95 89 102 99 99
6 77 77 98 90 102 100 101
7       90 84 103 101 102
8       86 78 105 101 102
9       91    101 102 102
10       95    102 101 103
11       97    102 101 102
12       97    101 99 102
13       97    103 100 102
14       96    104 98 101
實例 70. 合成結合物 14
類似於結合物13a (實例62)使用PEG-疊氮基-Fc (SEQ ID NO:35)及Int-7 (實例19)製備標題結合物。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出56,502. Da之平均質量(DAR = 2.1)。產量43.4 mg，43.4%。實例 71. 合成結合物 15
類似於實例62 (結合物13a)藉由PEG4-疊氮基-Fc (SEQ ID NO: 35，實例61)及Int-12 (實例46)製備此結合物。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出56,528. Da之平均質量(DAR = 2.2)。產量40.0 mg，40.0%。實例 72. 合成結合物 16
類似於實例62 (結合物13a)藉由PEG4-疊氮基-Fc (SEQ ID NO: 35，實例61)及Int-10 (實例31)製備此結合物。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出56,507. Da之平均質量(DAR = 2.1)。產量41.7 mg，42%。實例 73. 合成 Int-19
Figure 02_image1690
步驟 a.
Figure 02_image1692
向[2-(2-溴乙氧基)乙基]胺基甲酸第三丁酯(1.8 g，6.6 mmol)及炔丙基-PEG4胺(0.7 g，3.0 mmol)於30 ml DMF中之溶液中添加碳酸鉀(1.2 g，9 mmol)。該反應在80℃下攪拌持續6 h，且接著分配於DCM (200 mL)與鹽水(50 mL)之間。分離有機層且用鹽水洗滌，且經無水硫酸鈉乾燥。在過濾時，所得濾液經濃縮且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以10%至100%乙腈及水溶離之IscoCOMBIFLASH®液體層析儀使用0.1% TFA作為修飾劑經純化。產物之產量1.0 g，65%。藉由LCMS發現之離子：M/2+H =606.4。步驟 b.
Figure 02_image1694
前一步驟之產物(1.0 g，1.6 mmol)在室溫下用TFA (10 mL)處理持續0.5小時，接著濃縮至乾且無需進一步純化即用於下一步驟中。此步驟之產率為定量的。藉由LCMS發現之離子：M/2+H =406.3。步驟 c.
Figure 02_image1696
前一步驟之產物(120 mg，0.17 mmol)用醚紮那米韋酸(230 mg，0.38 mmol，實例31)於10 ml DMF中之溶液處理。向此溶液中添加EDC (100 mg，0.5 mmol)、HOBt (65 mg，0.5 mmol)及DIEA (0.14 ml，1 mmol)。所得溶液在室溫下經攪拌隔夜，接著經純化且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以10%至100%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀不使用TFA作為修飾劑經純化。產物之產量180 mg，60.2%。藉由LCMS發現之離子：M/2+H =816.9。步驟 d.
Figure 02_image1698
前一步驟之產物(180 mg，0.11 mmol)在室溫下用三氟乙酸(2 mL)處理持續30 min。所得溶液經濃縮且溶解於水(2 mL)中，接著用氫氧化鋰(24 mg，1 mmol)溶解於H2O (1 mL)中之溶液處理。所得反應經攪拌10 min，接著用0.1 ml乙酸淬滅。該溶液經濃縮且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以0%至50%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀使用0.1% TFA作為修飾劑經純化。產物之產量140 mg，52%。藉由LCMS發現之離子：M/2+H =575.8, M/3+H =384.2。實例 74. 合成結合物 17
類似於實例62 (結合物13a)藉由PEG4-疊氮基-Fc (SEQ ID NO: 35，實例61)及Int-19 (實例73)製備此結合物。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出56,672. Da之平均質量(DAR = 2.2)。產量36.7 mg，36.7%。實例 75. 合成 Int-20
Figure 02_image1700
步驟 a.
Figure 02_image1702
向亞胺基二乙酸二乙酯(3.1 g，16.06 mmol)於無水DMF (36 mL)中之溶液中添加苯甲基溴(2.38 mL，19.64 mmol)及碳酸鉀(6.44 g，46.46 mmol)。所得混合物在70℃下加熱持續16小時。在冷卻至室溫之後，該反應混合物用水稀釋且用第三丁基甲醚(3 × 100 mL)萃取。有機層用鹽水洗滌，經Na2 SO4 乾燥且過濾，接著濃縮。殘餘物藉由正相矽膠層析法(Isco，0至10%乙酸乙酯及己烷)經純化。產量3.13 g，69.8%。藉由LCMS發現之離子：[M+H]+ = 280.2。步驟 b.
Figure 02_image1704
來自步驟-a之二乙酯(3.2 g，11.2 mmol)於無水THF (5 mL)中之溶液在0℃下在氮氣下緩慢地添加至含有THF (2 mL)中之LiALH4 (425 mg，14.2 mmol)的圓底燒瓶中。注射器用THF (2 × 5 mL)沖洗。所得混合物緩慢地加溫至室溫隔夜。緩慢地添加甲醇(2 mL)以淬滅該反應，隨後添加NaOH水溶液(1 mL)。所得混合物經攪拌持續1小時，接著在真空下過濾。濾液經濃縮且無需純化即用於下一步驟。產量2.4 g，109%。藉由LCMS發現之離子：[M+H]+ = 196.2。步驟 c.
Figure 02_image1706
無水THF (4 mL)中之前一步驟之產物(1.02 g，5.24 mmol)在0℃下在氮氣下緩慢地添加至含有NaH (60%純度，2.09 g，52.4 mmol)及THF (5 mL)之燒瓶中。所得混合物經攪拌持續1小時，隨後逐滴添加THF (20 mL)中之3-(Boc-胺基)丙基溴(3.8 g，15.7 mmol)。該反應混合物緩慢地溫至室溫且攪拌持續3天。該反應冷卻至0℃，接著用水(6 mL)淬滅且攪拌持續1小時。其用乙酸乙酯(2 × 100 mL)萃取。經組合之有機層用1N HCl水溶液及鹽水洗滌。其經Na2 SO4 乾燥，過濾且濃縮。殘餘物藉由正相層析法(Isco，0至5%甲醇及二氯甲烷)經純化。產量984 mg，37%。藉由LCMS發現之離子，[M+H]+ = 510.0。步驟 d.
Figure 02_image1708
氫氧化鈀(543 mg，0.77 mmol)在H2 氛圍下添加至含有無水甲醇(19.5 mL)中之步驟-c產物(985.3 mg，1.93 mmol)的燒瓶中。所得混合物在室溫下經攪拌持續16小時。其接著經矽藻土墊過濾且用甲醇洗滌，且濃縮。殘餘物無需純化繼續用於下一步驟。產量828.6 mg，102%。藉由LCMS發現之離子，[M+H]+ = 420.0。步驟 e.
Figure 02_image1710
H2 O:THF (1:1，16 mL)中之步驟-d產物(829 mg，1.97 mmol)冷卻至0℃。向此溶液中添加Na2 CO3 (314 mg，2.96 mmol)，隨後添加Fmoc N-羥基丁二醯亞胺酯(826 mg，2.37 mmol)。所得混合物加溫至室溫且攪拌直至藉由LCMS發現完成，接著用乙酸乙酯萃取。有機層用鹽水洗滌且經Na2 SO4 乾燥，過濾且濃縮。殘餘物藉由正相層析法(Isco，0至60%乙酸乙酯及己烷)經純化。產量784 mg，62%。藉由LCMS發現之離子，[M+H-Boc]+ = 542.0。步驟 f.
Figure 02_image1712
步驟-e產物(1.01 g，1.57 mmol)在室溫下在TFA (5 mL)及CH2 Cl2 (9 mL)中經攪拌持續1小時，接著在減壓下濃縮。殘餘物藉由RPLP (Isco，5至100%甲醇及水，不具有修飾劑)經純化。產量903 mg，86%。藉由LCMS發現之離子，[M+H]+ = 442.2。步驟 g.
Figure 02_image1714
向醚紮那米韋酸(340 mg，0.49 mmol)、步驟-f產物(111 mg，0.25 mmol，實例31)及HATU (206 mg，0.53 mmol)於無水DMF (3 mL)中之混合物中添加DIEA (162 mg，1.23 mmol)。所得混合物在室溫下經攪拌持續1小時，接著直接地藉由RPLC (Isco，30至100%甲醇及水，不具有修飾劑)經純化。產量249 mg，61%。藉由LCMS發現之離子，[(M+2H)/2]+ = 833.8。步驟 h.
Figure 02_image1716
向步驟-g產物(249 mg，0.15 mmol)於無水DMF (0.5 mL)中之溶液中添加SilaMetS Thiol (1.2 g，1.47 mmol)及1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一-7-烯(12 mg，0.07 mmol)。所得混合物經攪拌持續1.5小時，接著直接地經過濾至含有HATU (69 mg，0.18 mmol)、炔丙基PEG-4酸(43 mg，0.16 mmol)及DIEA (43 mg，0.33 mmol)之小瓶。該反應混合物經攪拌持續1小時，接著直接地藉由RPLC (Isco，30至100%甲醇及水，不具有修飾劑)經純化。產量298 mg，118%。藉由LCMS發現之離子，[(M+2H-Boc)/2]+ = 843.9。步驟 i.
Figure 02_image1718
步驟-h產物(298 mg，0.18 mmol)溶解於TFA (3 mL)及CH2 Cl2 (3 mL)中，且該溶液在室溫下經攪拌持續16小時。其接著在減壓下濃縮且藉由HPLC (ACCQ Isco，0至25%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量112 mg，44%。藉由LCMS發現之離子，[(M+2H)/2]+ = 643.8及[(M+3H)/3]+ = 429.6。步驟 j.
Figure 02_image1720
向步驟-i產物(112 mg，0.072 mmol)於MeOH (4 mL)及水(2 mL)中之溶液中添加LiOH (10.6 mg，0.43 mmol)。所得溶液在室溫下經攪拌持續1小時，接著用TFA酸化且在減壓下濃縮。殘餘物藉由HPLC (ACCQ Isco，0至25%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量37 mg，36%。藉由LCMS發現之離子，[(M+2H)/2]+ = 603.8, [(M+3H)/3]+ = 402.9。實例 76. 合成結合物 18
經疊氮基官能化之無糖基化Fc (100 mg，5.4 mL，1.87 µmol，SEQ ID NO: 35)之溶液添加至含有炔衍生之小分子(16.1 mg，0.011 mmol，Int-20)之15 mL離心管中。在輕柔地震盪以溶解所有固體之後，該混合物添加至3 mL L-抗壞血酸鈉(149 mg，0.75 mmol，0.25 M)、硫酸銅(II) (2.4 mg，0.015 mmol，0.005 M)及BTTAA (25.8 mg，0.6 mmol，0.02 M)於PBS 7.4緩衝液中之預混合溶液中。所得溶液輕柔地震盪隔夜。其相繼藉由在蛋白A管柱上之親和層析法、尺寸排阻層析法(參見實例10中之一般結合物純化方案)經純化。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出56826 Da之平均質量(DAR 2.2)。產量36.64 mg，37%。
編碼結合物18之Fc之核酸構築體包含編碼SEQ ID NO：35之胺基酸序列的核酸，該胺基酸序列包含C末端離胺酸殘基及N末端鼠類IgG信號序列。表現後，結合物18之Fc之C末端離胺酸及N末端鼠類IgG信號序列經蛋白水解裂解，由此產生具有缺少Lys447(例如，缺少C末端離胺酸殘基)及N末端鼠類IgG信號序列之序列的Fc。C末端離胺酸之存在或不存在不改變Fc或相應結合物之性質。實例 77. 合成 Int-21
Figure 02_image1722
步驟 a.
Figure 02_image1724
向2-(2-Boc-胺基乙氧基)乙醇(6.15 g，30 mmol)於無水DCM (60 ml)中之溶液中添加DIPEA (7.8 g，60 mmol)及DMAP (366.6 mg，3 mmol)。接著經30分鐘分成數份添加對甲苯磺醯氯(6.86 g，36 mmol)。在所得混合物經攪拌持續3天之後，其藉由旋轉蒸發經濃縮且藉由(20%至70%乙腈/水，不具有修飾劑)經純化。產量3.71 g，34.4%。藉由LCMS發現之離子：[M -Boc + H]+ = 260。步驟 b.
Figure 02_image1726
向步驟-a產物(2.1 g，5.83 mmol)於無水THF (10 ml)中之溶液中添加碳酸鈉(1.24 g，11.7 mmol)及單-N-Boc-1,4-二胺基丁烷(1.32 g，7 mmol)。所得混合物在60℃下加熱持續1天。接著濾出鹽，且濾液藉由旋轉蒸發經濃縮。殘餘物經由RPLC (100 g，5至50%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量1.94 g，88.6%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 376.0。步驟 c.
Figure 02_image1728
向炔丙基PEG-4酸(781 mg，3 mmol)及HATU (1.14 g，3 mmol)於無水DMF (3 ml)中之溶液中添加DIPEA (390 mg，3 mmol)，隨後添加步驟-b產物(940 mg，2.5 mmol)及DIPEA (390 mg，3 mmol)於無水DMF (3 ml)中之溶液。該反應混合物經攪拌持續30分鐘，接著直接地經由RPLC (100 g，5至80%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量960.2 mg，65.3%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 618.3, [M - Boc + H]+ = 518.3。步驟 d.
Figure 02_image1730
步驟-c產物(960.2 mg，1.63 mmol)溶解於無水THF (6 ml)中。添加二噁烷(4 ml)中之4N HCl溶液，且該反應混合物經攪拌隔夜。其接著藉由旋轉蒸發經濃縮。殘餘物用水(3 ml × 3)及乙酸乙酯(10 ml)萃取。經組合之水層經凍乾。產量760 mg，95.1%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 418.0。步驟 e.
Figure 02_image1732
經20分鐘分成數份向醚紮那米韋酸(315 mg，0.5 mmol)及HATU (190 mg，0.5 mmol)於無水DMF (1 ml)中之混合物中添加步驟-d二胺產物(148 mg，0.3 mmol)及DIPEA (165 mg，1.5 mmol)於無水DMF (1 ml)中之溶液。在添加之後，該反應再攪拌持續30分鐘且直接地藉由RPLC (50 g，30至90%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量233 mg，56.7%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 821.3。步驟 f.
Figure 02_image1734
步驟-e產物(233 mg，0.142 mmol)溶解於TFA (1.5 ml)中，且該溶液在30℃下加熱持續30分鐘。其接著經濃縮且直接地藉由RPLC (0%至30%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量120 mg，57.4%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 621.4, [(M + 3H)/3]+ = 414.7。步驟 g.
Figure 02_image1736
向步驟-f產物(120 mg，0.0816 mmol)於MeOH (2 ml)中之溶液中添加水(2 ml)中之LiOH單水合物(63 mg，1.5 mmol)溶液。所得混合物經攪拌持續1.5小時且接著藉由旋轉蒸發經濃縮。殘餘物藉由二噁烷(0.5 ml)中之4N HCl溶液酸化且藉由HPLC (0至15%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量98.2 mg，86.6%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 581.8,[(M + 3H)/3]+ = 388.2。實例 78. 合成結合物 19
類似於實例62 (結合物13a)藉由PEG4-疊氮基-Fc (SEQ ID NO: 35，實例61)及Int-21 (實例78)製備此結合物。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出56,548. Da之平均質量(DAR = 2.1)。產量39.7 mg，39.7%。實例 79. 合成 Int-22
Figure 02_image1738
步驟 a.
Figure 02_image1740
向醚紮那米韋酸(1.8 g，2.8 mmol 實例31)及炔丙基-PEG4-胺(0.82 g，3.5 mmol. 1.2 eq.)於二氯甲烷(50 mL)中之混合物中添加EDC (1.0 g，5 mmol)、HOBt (0. 65 g，5 mmol)及DIEA (1.4 ml，10 mmol)。所得溶液在室溫下經攪拌隔夜，濃縮，且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以10%至100%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀不使用0.1% TFA作為修飾劑經純化。產物之產量1.35 g，50.2%。藉由LCMS發現之離子：M+H =830.4。步驟 b.
Figure 02_image1742
前一步驟之產物(1.35 g，1.6 mmol)在室溫下用三氟乙酸(20 mL)處理持續30 min。所得溶液經濃縮，溶解於水(10 mL)及MeOH (10 mL)中，接著用水(10 mL)中之氫氧化鋰(120 mg，5 mmol)溶液處理。該反應溶液經攪拌10 min，接著用0.5 ml乙酸淬滅。該反應經濃縮且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以0%至50%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀使用0.1% TFA作為修飾劑經純化。產物之產量510 mg，52.8%。藉由LCMS發現之離子：M+H =604.3。實例 80. 合成結合物 20
類似於實例62 (結合物13a)藉由PEG4-疊氮基-Fc (SEQ ID NO: 35，實例61)及Int-22 (實例79)製備此結合物。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出55,508. Da之平均質量(DAR = 2.3)。產量37.0 mg，37.0%。實例 81. 合成 Int-23
Figure 02_image1744
步驟 a.
Figure 02_image1746
向N-Boc-1.4-二胺基丁烷(941.5 mg，5 mmol)於無水THF (10 ml)中之溶液中添加碳酸鈉(1.06 g，10 mmol)及3-(Boc-胺基)丙基溴(1.43 g，6 mmol)。所得混合物在50℃下加熱持續1天。接著濾出鹽，且藉由旋轉蒸發經濃縮。殘餘物藉由RPLC (100 g，5至50%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量1.35 g，58.8%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 346.0。步驟 b.
Figure 02_image1748
向炔丙基PEG-4酸(781 mg，3 mmol)及HATU (1.14 g，3 mmol)於無水DMF (3 ml)中之溶液中添加DIPEA (390 mg，3 mmol)，隨後添加步驟-a產物(863.8 mg，2.5 mmol)及DIPEA (390 mg，3 mmol)於無水DMF (3 ml)中之溶液。該反應混合物經攪拌持續30分鐘，接著直接地藉由RPLC (100 g，5至80%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量1.19 g，81%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 588.3。步驟 c.
Figure 02_image1750
步驟-b產物(1.19 g，2.02 mmol)溶解於無水THF (6 ml)中。添加二噁烷(4.5 ml)中之4N HCl溶液，且該反應混合物經攪拌持續1天。其接著藉由旋轉蒸發經濃縮。殘餘物用水(3 ml × 3)及乙酸乙酯(15 ml)萃取。經組合之水層經凍乾。產量940 mg，定量產率。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 388.3。步驟 d.
Figure 02_image1752
向醚紮那米韋酸(315 mg，0.5 mmol，實例31)及HATU (209.1 mg，0.55 mmol)於無水DMF (1 ml)中之混合物中添加DIPEA (65 mg，0.5 mmol)。5分鐘之後，經20分鐘分成數份添加步驟-c產物(170 mg，0.439 mmol)及DIPEA (130 mg，1 mmol)於無水DMF (1 ml)中之溶液。該反應再攪拌持續30分鐘，接著直接地藉由RPLC (50 g，30至90%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量208 mg，51.6%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 806.7。步驟 e.
Figure 02_image1754
步驟-d產物(208 mg，0.129 mmol)溶解於TFA (1.5 ml)中，且該溶液在30℃下加熱持續30分鐘。其接著直接地藉由RPLC (100 g，0至30%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量134 mg，72%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 606.8, [(M + 3H)/3]+ = 405.0。步驟 f.
Figure 02_image1756
向步驟-e產物(134 mg，0.093 mmol)於MeOH (2 ml)中之溶液中添加LiOH單水合物(63 mg，1.5 mmol)於水(2 ml)中之溶液。所得混合物經攪拌持續1.5小時且接著藉由旋轉蒸發經濃縮。殘餘物藉由二噁烷(0.5 ml)中之4N HCl溶液酸化且藉由HPLC (0至15%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量78.4 mg，62%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 566.4, [(M + 3H)/3]+ = 378.4。實例 82. 合成結合物 21
類似於實例62 (結合物13a)藉由PEG4-疊氮基-Fc (SEQ ID NO: 35，實例61)及Int-23 (實例81)製備此結合物。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出56,503. Da之平均質量(DAR = 2.2)。產量34.4 mg，34%。實例 83. 在細胞病理效應 (CPE) 分析中結合物 13 至 21 針對高致病性 H7N9 流感 A 及兩種流感 B 分離株之活性
在CPE分析中以100、10、1及0.1 nM之濃度運作總計9種結合物(表38)且與利巴韋林比較。該CPE分析遵循標準方法，但簡言之，利用96-孔板中之MDCK細胞的80-100%匯合單層。一式三份向其中添加測試物品且使其在37℃(+ 5% CO2 )下培育，直至CPE效應在視覺上顯而易見。一旦注意到CPE，細胞層即用0.011%中性紅染色持續大約2小時。其後，添加Sorensen檸檬酸鹽緩衝液/乙醇之50:50混合物且使其培育持續30 min，接著在分光光度計上讀取A540 且藉由迴歸分析計算EC50 /CC50 值。
所有結合物均針對流感B/Florida/4/2006分離株具有顯著活性，其中EC50 值介於3.05至33.5 nm範圍內(表39)。平均言之，結合物證明瞭相比利巴韋林(EC50 3,250 nM)之275倍效能優勢。結合物針對流感B/Brisbane/60/2008之活性極其類似於針對B/Florida所見，例外為結合物14，其具有大於100 nM之EC50 重要的是，所有結合物亦針對高致病性流感A/Anhui/1/2013 (H7N9)分離株極具活性。與針對利巴韋林之14,000 nM相比，針對所有結合物之平均EC50 針對此分離株(介於12至28.5 nM範圍內)為21.2 nM。最後，在所測試之濃度下未偵測到該等結合物對MDCK單層之細胞毒性效應。 表38：結合物及特性
結合物 Int Fc 域 DAR 連接體 注釋
13 18 SEQ ID NO: 35 2.2 15個原子 醚，二聚體
14 7 SEQ ID NO: 35 2.1 15個原子 胺基甲酸酯，二聚體
15 12 SEQ ID NO: 35 2.2 15個原子 醚，二聚體
16 9 SEQ ID NO: 35 2.1 17個原子 醚，二聚體
17 19 SEQ ID NO: 35 2.2 17個原子 醚，二聚體
18 20 SEQ ID NO: 35 2.2 19個原子 醚，二聚體
19 21 SEQ ID NO: 35 2.1 16個原子 醚，二聚體
20 22 SEQ ID NO: 35 2.3 na 醚，單體
21 23 SEQ ID NO: 35 2.2 14個原子 醚，二聚體
表39：在CPE分析中結合物針對流感亞型之活性
結合物 EC50 (nM)*
A/Anhui/1/2013 (H7N9) B/Brisbane/60/2008 B/Florida/4/2006
(人畜共患性禽流感) (Victoria譜系) (Yamagata譜系)
利巴韋林 14000 3300 3250
13 24 21 33.5
14 12 ＞100 18.5
15 21.5 5.95 4.6
16 28.5 14.5 11
17 28** 11 13
18 31 4.35 3.05
19 14.5 6.8 4.55
20 20.5 12.5 14.5
21 17.5 4.05 3.05
* 2個值之平均值(VIS + NR)
**藉由VIS發現EC50為28，藉由NR發現＞100
實例 84. 合成結合物 22 步驟 a. 合成 PEG4- 疊氮基 IVIG
製備DMF/PBS中之0.05M PEG4-疊氮基NHS酯溶液：6.05 mg PEG4-疊氮基NHS酯在0℃下溶解於0.050 mL DMF中且在0℃下藉由添加0.250 mL PBS 1x緩衝液經稀釋至0.305 mL。使用此溶液，藉由調節此PEG4-疊氮基NHS酯PBS溶液之當量數來製備具有多種DAR值之其他PEG4-疊氮基IVIG。
製備PEG4-疊氮基IVIG：0.05M PEG4-疊氮基NHS酯PBS緩衝溶液(0.301 mL，15.0 μmol，5.5當量)添加至IVIG (Intravenous Immune Globulin, Baxter))溶液(407 mg於9.25 mL pH 7.4 PBS中，MW~148863 Da，1.968 μmol)中且該混合物在環境溫度下輕柔地震盪持續12小時。該溶液使用離心濃縮機(100,000 MWCO)經濃縮至約1.5 mL之體積。粗混合物1:10稀釋於PBS pH 7.4中，且再次經濃縮。重複此洗滌程序，共計三次。用此洗滌程序移除小分子試劑。經濃縮IVIG-PEG4-疊氮化物用pH 7.4 PBS 1x緩衝液稀釋至9.25 mL且準備用於點擊結合。經純化材料使用NANODROP™ UV可見光光譜儀(使用基於IVIG之胺基酸序列計算的消光係數)經定量。產率係在純化之後定量的。步驟 b. 合成結合物
製備點擊試劑溶液：PBS緩衝溶液中之0.0050M CuSO4 ：10.0 mg CuSO4 溶解於12.53 mL PBS x1中，接著採用6.00 mL 0.0050M CuSO4 溶液且添加57.7 mg BTTAA (CAS編號1334179-85-9)及297.6 mg抗壞血酸鈉以生成點擊試劑溶液(0.0050M CuSO4、0.020M BTTAA及0.25M抗壞血酸鈉)。
經疊氮基官能化之IVIG (140 mg，3.17 mL，0.936 µmol，IVIG-連接體-1-疊氮化物)之溶液添加至含有炔衍生之小分子(8.4 mg，0.00618 mmol，，6.6 eq，描述於實例60中)之15 mL離心管中。在輕柔地震盪以溶解所有固體之後，1.50 mL上述點擊試劑溶液(L-抗壞血酸鈉，0.25 M, 74.2 mg，0.374 mmol，硫酸銅(II) 0.0050M，1.2 mg，0.0075 mmol，及BTTAA 0.020M，12.9 mg，0.0300 mmol)。所得混合物輕柔地震盪隔夜。其相繼藉由在蛋白A管柱上之親和層析法、尺寸排阻層析法(參見實例10中之結合物純化方案)經純化。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出151873 Da之平均質量(DAR = 2.7)。產量51.0 mg，36%產率。實例 85. 合成結合物 23
類似於結合物22，取代點擊結合步驟中之適當炔官能化之小分子(描述於實例81中之Int-23)來製備結合物23。實例 86. 合成結合物 24
類似於結合物22，取代點擊結合步驟中之適當炔官能化之小分子(描述於實例19中)來製備結合物24。實例 87. 結合物 13 、 14 及 21 在致死性小鼠模型中針對流感 B 之功效
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8週)中針對致死性流感B流感感染評估結合物。攻擊病毒(B/Malaysia/2506/04)係能夠在小鼠中引起致死性感染之小鼠適應性分離株。該實驗包含11組，每組5隻小鼠。在第0天，所有小鼠均在經氯胺酮/甲苯噻嗪之混合物(分別為150及10 mg/kg)麻醉之後藉由鼻內接種經30 µl (大約每隻小鼠1E4)體積之病毒(3x LD95)攻擊。
所有組均在病毒攻擊之後2小時接受測試物品、媒劑(PBS)或單獨Fc對照物(hIgG1 Fc)之單一IV治療。該研究評估結合於一致Fc單體(分別為結合物13、14及21)之Int-18、Int-7及Int-23，在3.0、1.0及0.3 mg/kg下進行測試。監測小鼠持續2週且超過20%體重減輕或被發現垂死之動物經評為死亡。
經媒劑或單獨Fc對照物治療之所有小鼠截至第7天均達到死亡。相比之下，接受結合物13、14及21之小鼠在接受0.3 mg/kg之單一IV劑量之後完全經保護(表40)。如所預期，接受1.0或3.0 mg/kg之結合物之組亦完全經保護。所有結合物針對流感B之效能進一步藉由每天體重量測值(表41)支持，該等每天體重量測值顯示任何結合物治療之組在整個研究中少於5%之短暫下降。結合物13、14及21之活性以劑量計可與結合物6針對流感A H1N1及H3N2亞型之活性相當。由於結合物6及14具有一致靶向部分(對應於Int-7)，單一結合物可針對顯性季節性流感類型(流感A (H1N1)、流感A (H3N2)及流感B)具活性。 表40. 在研究結束時(第14天)之死亡率數據。5隻小鼠之平均值；藉由對數秩(Mantel-Cox)測試計算之p-值
化合物 劑量(mg/kg) 存活率% 相對媒劑之顯著性(p- 值)
媒劑(PBS) na 0 na
單獨Fc 3.0 0 p=1
結合物13 0.3 100 (0.0027)
1.0 100 (0.0027)
3.0 100 (0.0027)
結合物14 0.3 100 p=0.0027
1.0 100 p=0.0027
3.0 100 p=0.0027
結合物21 0.3 100 (0.0027)
1.0 100 (0.0027)
3.0 100 (0.0027)
表41：小鼠體重數據(相對於第0天之% BW)。5隻小鼠之平均值；*一旦組內之第一隻動物達到死亡，數據即不包括在內
攻擊後天數 媒劑(PBS) 單獨Fc 結合物14 (mg/kg)
3.0 0.3 1.0 3.0
0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0
1 98.1 98.1 99.3 99.1 96.5
2 99.6 96.7 98.6 98.6 98.3
3 96.4 94.9 96.8 97.0 98.7
4 89.8 87.8 98.4 97.5 97.8
5 83.6 80.8 97.4 97.8 98.0
6 79.0 76.1 96.9 98.3 99.7
7 * * 99.2 100.5 100.6
8 * * 100.3 101.9 101.1
9 * * 102.5 100.4 100.6
10 * * 100.6 102.0 101.2
11 * * 100.9 100.9 100.9
12 * * 101.8 101.7 101.8
13 * * 101.4 101.7 101.4
14 * * 102.2 102.6 102.2
實例 88. 合成用於結合物 25 、結合物 26 、結合物 27 及結合物 28 之 PEG4- 疊氮基 Fc
製備DMF/PBS x1中之0.05M PEG4-疊氮基NHS酯溶液：27.40 mg PEG4-疊氮基NHS酯在0℃下溶解於0.155 mL DMF中且在0℃下藉由添加1.200 mL PBS 1x緩衝液經稀釋。使用此溶液，藉由調節此PEG4-疊氮基NHS酯PBS x1溶液之當量數來製備具有多種DAR值之其他PEG4-疊氮基Fc。
製備PEG4-疊氮基Fc (SEQ ID NO: 48)：0.05M PEG4-疊氮基NHS酯PBS x1緩衝溶液(0.0984 mL，4.92 μmol，2.5當量)添加至h-IgG1 Fc (SEQ ID NO: 48)溶液(234 mg於13.605 mL pH 7.4 PBS中，MW~57,976 Da，4.036 μmol)中且該混合物在環境溫度下輕柔地震盪持續2小時。該溶液使用離心濃縮機(30,000 MWCO)經濃縮至約2 mL之體積。粗混合物1:7稀釋於PBS pH 7.4中，且再次經濃縮。重複此洗滌程序，共計三次。用此洗滌程序移除小分子試劑。經濃縮Fc (SEQ ID NO: 48)-PEG4-疊氮化物用pH 7.4 PBS 1x緩衝液稀釋至13.60 mL且準備用於點擊結合。經純化材料使用NANODROP™ UV可見光光譜儀(使用基於h-IgG1之胺基酸序列計算的消光係數)經定量。
PEG4-疊氮基Fc (SEQ ID NO: 50)之製備類似於上述PEG4-疊氮基Fc (SEQ ID NO: 48)。實例 89. 合成結合物 25
製備點擊試劑溶液：PBS x1緩衝溶液中之0.0050M CuSO4 ：10.0 mg CuSO4 溶解於12.53 mL PBS x1中，接著採用10.00 mL此CuSO4 溶液且添加86.1 mg BTTAA及495.3 mg抗壞血酸鈉以生成點擊試劑溶液(0.0050M CuSO4、0.020M BTTAA及0.25M抗壞血酸鈉)。此點擊試劑溶液將用於結合物25及結合物26。
經疊氮基官能化之Fc (78.0 mg，4.535 mL，1.35 µmol，SEQ ID NO: 48-PEG4-疊氮化物)之溶液添加至含有炔衍生之小分子(13.2 mg，8.88 μmol，Int-23)之15 mL離心管中。在輕柔地震盪以溶解所有固體之後，向該混合物中添加2.153 mL上述點擊試劑溶液(L-抗壞血酸鈉，0.25 M, 106.6 mg，0.538 mmol，硫酸銅(II) 0.0050M，1.72 mg，0.0107 mmol，及BTTAA 0.020M，18.5 mg，0.0431 mmol)。所得混合物在環境溫度下輕柔地震盪持續6小時。其相繼藉由在蛋白A管柱上之親和層析法、尺寸排阻層析法(參見實例10中之結合物純化方案)經純化。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出60973 Da之平均質量(DAR = 2.1)。產量50.3 mg，64%產率。
編碼結合物25之Fc之核酸構築體包含編碼SEQ ID NO：48之胺基酸序列的核酸，該胺基酸序列包含C末端離胺酸殘基及N末端鼠類IgG信號序列。表現後，結合物25之Fc之C末端離胺酸及N末端鼠類IgG信號序列經蛋白水解裂解，由此產生具有缺少Lys447(例如，缺少C末端離胺酸殘基)及N末端鼠類IgG信號序列之序列的Fc。C末端離胺酸之存在或不存在不改變Fc或相應結合物之性質。實例 90. 合成結合物 26
結合物26之製備類似於結合物25，其中使用同一批次之PEG4-疊氮基Fc (SEQ ID NO: 48)及炔衍生之小分子(Int-7)。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出61068 Da之平均質量(DAR = 2.2)。產量49.5 mg，63%產率。實例 91. 合成結合物 27
製備點擊試劑溶液：PBS x1緩衝溶液中之0.0050M CuSO4 ：10.0 mg CuSO4 溶解於12.53 mL PBS x1中，接著採用12.00 mL此CuSO4 溶液且添加103.3 mg BTTAA及594.3 mg抗壞血酸鈉以生成點擊試劑溶液(0.0050M CuSO4、0.020M BTTAA及0.25M抗壞血酸鈉)。此點擊試劑溶液將用於結合物28。
經疊氮基官能化之Fc (80.0 mg，4.535 mL，1.38 µmol，SEQ ID NO: 50-PEG4-疊氮化物)之溶液添加至含有炔衍生之小分子(13.5 mg，9.10 μmol，Int-23)之15 mL離心管中。在輕柔地震盪以溶解所有固體之後，向該混合物中添加2.21 mL上述點擊試劑溶液(L-抗壞血酸鈉，0.25 M, 109.3. mg，0.552 mmol，硫酸銅(II) 0.0050M，1.76 mg，0.0110 mmol，及BTTAA 0.020M，19.0 mg，0.0441 mmol)。所得混合物在環境溫度下輕柔地震盪持續6小時。其相繼藉由在蛋白A管柱上之親和層析法、尺寸排阻層析法(參見實例10中之結合物純化方案)經純化。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出61447 Da之平均質量(DAR = 2.5)。產量37.1mg，46%產率。
編碼結合物27之Fc之核酸構築體包含編碼SEQ ID NO：50之胺基酸序列的核酸，該胺基酸序列包含C末端離胺酸殘基及N末端鼠類IgG信號序列。表現後，結合物27之Fc之C末端離胺酸及N末端鼠類IgG信號序列經蛋白水解裂解，由此產生具有缺少Lys447(例如，缺少C末端離胺酸殘基)及N末端鼠類IgG信號序列之序列的Fc。C末端離胺酸之存在或不存在不改變Fc或相應結合物之性質。實例 92. 合成結合物 28
結合物28之製備類似於結合物27，其中使用同一批次之PEG4-疊氮基Fc (SEQ ID NO: 50)及炔衍生之小分子(Int-7)。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出61388 Da之平均質量(DAR = 2.4)。產量44.6 mg，56%產率。實例 93. 在細胞病理效應 (CPE) 分析中結合物 6 及結合物 21 針對高致病性流感 A (H5N1 、 H7N9) 之活性
針對BSL-3 (高致病性)流感A進行活體外分析以測定本發明結合物之效能，且一般地遵循標準程序。簡言之，不同濃度之結合物與病毒(大約250 TCID50 )混合且使其在35℃下培育持續一小時。在培育之後，該混合物添加至MDCK細胞之80-90%匯合單層中。在90分鐘培育之後，洗滌細胞且再應用結合物。該單層隨後用羧甲基纖維素覆蓋以使病毒擴散降至最低且使其培育持續兩天。在兩天培養之後，細胞用PBS洗滌且用10%福馬林固定。在固定之後，該MDCK單層用Triton X-100滲透且用針對流感核蛋白之小鼠mAb免疫染色。單層經讀取，且計算每個孔之經染色面積以測定EC50/100 值。
該研究之結果概述於表42中且證明結合物6及結合物21針對具有大流行潛力之高度致病性病毒株的效能。重要的是，兩種結合物針對四種H5N1及一種H7N9分離株產生15 nM或低於15 nM之EC100 值。相比之下，奧司他韋僅針對一種分離株(A/Vietnam/1194/2004)具有大約15 nM之EC100 且針對其他高致病性病毒株具有介於125至＞1000 nM範圍內之值。此等結果表明，結合物6及結合物21治療由強毒流感引起之大流行病的潛力優於奧司他韋之彼潛力。 表42：結合物6及結合物21針對高致病性流感分離株之活體外活性
高致病性流感 EC100 (nM) (MDCK 細胞中之CPE)
H5N1 媒劑 結合物6 結合物21 奧司他韋
A/Indonesia/5/2005 (演化支2.1) N/A 約15 ＜15 約200 - 500
A/Vietnam/1194/2004 (演化支1) N/A 約15 ＜15 約15
A/turkey/Turkey/1/2005 (演化支2.2) N/A ＜15 ＜15 約125 - 250
A/Hong Kong/156/1997 (演化支0) N/A 約15 ＜15 ＞1000
H7N9            
A/Anhui/01/2013 N/A ＜15 ＜15 約500 - 1000
H1N1 ( 陽性對照物)            
A/Netherlands/602/2009 N/A ＜15 ＜15 約1000
實例 94. 在細胞病理效應 (CPE) 分析中結合物 6 及結合物 21 針對在不同感染複數 (MOI) 下之流感 A (H1N1) 之活性
MDCK細胞以4×104 個細胞/孔接種於96孔板(經TC處理)中之MEM培養基中且在37℃、5% CO2 下經培育持續18-24 h。在1.93 - 10000 nM之間劑量範圍內之測試物品(紮那米韋、奧司他韋、巴洛沙韋、結合物6及結合物21)在室溫(RT)下用病毒:細胞感染複數(MOI)在0.001 - 1之間的流感A/WSN/1933培育持續1 h。1 h之後，經預培育之病毒及測試物品添加至MDCK細胞之90-100%匯合單層中且在RT下經培育持續1 h。
1 h之後，補充有L-麩醯胺及青黴素/鏈黴素之MEM培養基添加至孔中。經感染細胞在37℃、5% CO2 下經培育持續72 h。在固定細胞且用結晶紫染色之後測定CPE。使用GraphPad Prism 6軟體用非線性迴歸分析計算EC50。表43中提供之該CPE分析之結果指示，結合物6及結合物21活體外勝過護理標準劑，尤其在高MOI下。 表43：結合物6及結合物12針對在不同感染複數下之流感A (H1N1)之活體外活性
EC50 (nM) H1N1 A/WSN/1933 (MDCK 細胞中之CPE)
   MOI 0.001 MOI 0.01 MOI 0.1 MOI 1
紮那米韋 137 938 ＞10000 ＞10000
奧司他韋 525 1896 ＞10000 ＞10000
巴洛沙韋 5 4 79 ＞100
結合物6 9 15 ＞100 ＞100
結合物12 0.6 2 7 10
實例 95. 結合物 6 在致死性嚴重複合型免疫缺乏小鼠模型中針對流感 A (H1N1) 之功效
在雄性BALB/c嚴重複合型免疫缺乏(SCID)小鼠(Stock #001803；Jackson Laboratories，6-8週齡)中針對致死性流感A感染評估結合物。攻擊病毒(A/Puerto Rico/08/1934)係能夠在小鼠中引起致死性感染之小鼠適應性分離株。該實驗包含5組，每組5隻小鼠。在第0天，所有小鼠均在經氯胺酮及甲苯噻嗪之混合物(分別為150及10 mg/kg)麻醉之後藉由鼻內接種經30 µl (大約每隻小鼠1E3)體積之病毒(3x LD95)攻擊。
所有組均在病毒攻擊後2小時接受測試物品結合物6、媒劑(PBS)或單獨Fc對照物(hIgG1 Fc)之單一IV治療。該研究評估結合物6之3種不同劑量濃度(0.3、1.0或3.0 mg/kg)。監測小鼠持續5週且超過20%體重減輕或被發現垂死之動物經評為死亡。亦記錄體重以監測該等動物之一般健康狀況。
經媒劑或單獨Fc對照物治療之所有小鼠截至第2週均達到死亡。相比之下，接受結合物6之小鼠在接受1或3 mg/kg之單一IV劑量之後在該研究之持續時間內完全經保護(圖56，表44)。當結合物6之劑量降低至0.3 mg/kg時，存活截至研究結束下降至20%。0.3 mg/kg劑量完全經保護持續3週。結合物6在此嚴重免疫缺乏模型中之效能進一步由體重數據支持(圖57，表45)。接受1或3 mg/kg劑量濃度之結合物6之組在該研究的整個過程中僅證明瞭少於3%之短暫體重減輕。此外，在研究結束時，兩個劑量組均顯示淨重量增加(分別為7.5及2.2%)。用最低濃度之結合物6 (0.3 mg/kg)給藥的組在該研究之前3週內具有少於4%之短暫體重減輕，接著在第4週顯示感染病徵，其最終導致五隻動物中之四隻死亡。總之，此等數據藉由用低至1 mg/kg之結合物之單一IV劑量保護經致死性攻擊之小鼠證明瞭結合物6之效能。另外，此保護作用係長期持續的，超過該研究之5週持續時間。此在完全缺乏清除流感感染所必需的T及B免疫細胞之小鼠的極端免疫缺乏模型中實現。此數據支持使用結合物6來治療免疫勝任及缺乏患者群體。 表44：每週研究劑量組之死亡率
測試物品 存活率% ( 病毒攻擊後天數)
7 14 21 28 35
媒劑 80 0 0 0 0
單獨Fc 80 0 0 0 0
結合物6 (3 mg/kg) 100 100 100 100 100
結合物6 (1 mg/kg) 100 100 100 100 100
結合物6 (0.3 mg/kg) 100 100 100 80 20
表45：研究動物在35天內或直至組內第一例死亡時之平均組體重
天 媒劑 單獨Fc 結合物6 劑量
         3 mg/kg 1 mg/kg 0.3 mg/kg
0 100 100 100 100 100
1 99.5 99.8 99.6 99.4 98.6
2 98.8 99.2 99.9 99.1 98.9
3 97.7 96.8 101 100.6 97.9
4 94.4 95.4 99.4 98.4 98.5
5 93.7 90.7 100.6 97.9 99.3
6 88.7 83.9 101.2 98.7 98.1
7 81.1 77.6 101.8 98 96.9
8       101.3 99.7 98.9
9       102.6 100.7 98.8
10       101.6 99.8 99.4
11       101.6 99.7 100.3
12       101.8 100.2 100.7
13       102.3 101 100.7
14       103.9 100.5 99.9
15       104.3 101.8 102.3
16       104.3 102 101.3
17       104.3 100.6 102
18       105.4 103.9 100.5
21       105.7 105.9 96.8
22       105.5 103.4 93.9
23       105.6 106.9 91
24       108.4 102.9   
25       106.4 102.7   
26       108.4 103.9   
27       108.6 103.5   
28       109.1 104.7   
29       108.96 104.5   
30       109 105.8   
31       108.2 104.9   
35       107.5 102.2   
實例 96. 結合物 6 在肺中之劑量依賴性病毒清除
在鼻內經3×102 PFU/小鼠(3x LD95 )之小鼠適應性流感A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1)攻擊之6-8週雌性BALB/c小鼠(Charles River)中進行功效研究。結合物6或人類IgG1 Fc對照物在攻擊後2 h以0.1 – 3 mg/kg之單一靜脈內(IV)劑量經投與。奧司他韋經口給藥，每天兩次，持續4天，在感染後2 h以5或15 mg/kg開始。記錄體重(BW)持續4天。在感染後4天，藉由CO2 處死小鼠且收集肺葉。肺使用MagNALyser (Roche)用1 mL PBS中之1 mm矽珠均質化。在6,000 rpm下進行均質化持續60 s且在運行之間在冰上冷凍持續5 min。在肺均質化之後，管在600 x g下經離心持續10 min且上清液經轉移至新管中。
為了測定肺中之病毒負荷(以斑塊形成單位(PFU)量度)，將肺均質液之上清液稀釋於感染緩衝液中，介於10-1至10-6範圍內。100 µL病毒稀釋液添加至24孔板中之MDCK細胞之匯合單層中且在室溫下經培育持續1 h，其中每15 min搖動。在移除病毒之後，含有Avicel之液體覆蓋培養基添加至MDCK細胞中。細胞在37℃、5% CO2 下經培育持續40 h。在培育之後，移除該培養基且細胞用結晶紫染色以對斑塊計數。相對於肺重量計算PFU (PFU/g肺)。
該研究之結果證明低劑量之結合物6快速地降低病毒負荷數量級，優於奧司他韋(TAMIFLU®) (圖58，表46)。此觀察結果具有臨床顯著性，因為嚴重流感感染係由病毒自初始上呼吸道感染移動至肺引起的。 表46：感染後第4天之病毒負荷
測試物品[mg/kg] Log 減少 (PFU/mL) Log 減少 (PFU/g)
PBS [0] 0.00 0.00
hIgG1 Fc [3] -0.04 0.26
奧司他韋[5] 0.24 0.43
奧司他韋[15] 0.52 0.75
結合物6 [0.1] 0.60 0.79
結合物6 [0.3] 1.33 1.55
結合物6 [1] 2.25 2.34
結合物6 [3] 3.20 3.40
實例 97. 結合物 6 劑量依賴性減少肺中之發炎細胞因子
在鼻內經3×102 PFU/小鼠(3x LD95 )之小鼠適應性流感A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1)攻擊之6-8週雌性BALB/c小鼠(Charles River)中進行功效研究。結合物6或人類IgG1 Fc對照物在攻擊後2 h以0.1 – 3 mg/kg之單一靜脈內(IV)劑量經投與。奧司他韋經口給藥，每天兩次，持續4天，在感染後2 h以5或15 mg/kg開始。記錄體重(BW)持續4天。在感染後4天，藉由CO2 處死小鼠且收集肺葉。肺使用MagNALyser (Roche)用1 mL PBS中之1 mm矽珠均質化。在6,000 rpm下進行均質化持續60 s且在運行之間在冰上冷凍持續5 min。在肺均質化之後，管在600 x g下經離心持續10 min且上清液經轉移至新管中。
關於細胞因子分析，肺均質液之上清液連續2倍稀釋於96孔板中。INF-γ、TNF-α、IL-6、MIP-1α及MCP-1之細胞因子水準藉由ELISA根據製造商之說明書(R&D Systems)測定。
嚴重流感之發病率及死亡率最終係由肺中由病毒誘導之促發炎細胞因子之流入引起的。使用Fc-結合物治療流感之一種潛在考慮係Fc片段是否將惡化細胞因子誘導之發炎。H1N1致死性感染模型之結果顯示剛好相反：結合物6劑量依賴性減少受感染肺組織中之促發炎細胞因子(例如，TNFα及IL-6) (圖59，表47)。 表47：感染後第4天之細胞因子反應
與未受感染對照物相比之倍數轉變
測試物品[mg/kg] INFy TNFa IL-6 MCP-1 MIP-1a
PBS [0] 0.4 2.2 4.6 16.3 16.4
hIgG1 Fc [3] 0.5 2.2 6.2 20.2 16.8
奧司他韋[5] 0.2 1.7 4.0 11.7 7.5
奧司他韋[15] 0.2 1.8 3.5 10.5 6.1
結合物6 [0.1] 0.3 1.5 3.0 10.8 7.9
結合物6 [0.3] 0.2 1.2 1.9 6.7 7.4
結合物6 [1] 0.2 1.1 1.9 6.1 3.6
結合物6 [3] 0.8 1.1 1.4 2.8 2.6
未受感染 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
實例 98. 活體內結合物 6 血漿樣品分析。 CD-1 及 BALB/c 嚴重複合型免疫缺乏小鼠中之 PK 比較。
藉由神經胺糖酸酶捕捉偵測ELISA來定量血漿樣品中之結合物6。簡言之，分子經捕捉於經神經胺糖酸酶包被之板上且接著使用HRP結合之抗人類IgG-Fc抗體進行偵測。在GraphPad Prism中使用結合物6標準曲線之4PL非線性迴歸計算蛋白質濃度。更詳細方法描述提供於下文中。
Nunc Maxisorp 96-孔板(目錄號12-565-136, ThermoFisher)經1X KPL包被緩衝液(5150-0041, SeraCare)中來自A/California/04/2009 (H1N1) (11058-VNAHC, Sino Biological)之0.1U/孔之神經胺糖酸酶包被。板在室溫下在軌道板式振盪器上(500 rpm)經培育持續1 h。血漿樣品之連續稀釋液經塗板且在室溫下經培育持續2小時(樣品稀釋劑：0.5% BSA於PBS 0.025% Tween 20中+原生小鼠血漿最終濃度為1:2,500)。在各板上一式兩份進行介於0.230-500 ng/mL範圍內之結合物6標準曲線。在2 h培育之後，板在具有0.05% Tween 20之300 µL PBS中洗滌5次。結合於板上之神經胺糖酸酶的結合物接著在室溫下用1:1,000稀釋於樣品稀釋劑中之HRP結合之抗人類IgG Fc F(ab’)2 (709-036-098, Jackson)探測持續1 h。板接著在具有0.05% Tween 20之300 µL PBS中洗滌8次且用TMB受質顯影持續7-8分鐘。該反應用1N H2 SO4 停止。在450 nm下讀取吸光度。使用GraphPad Prism Version 6，根據標準曲線之非線性迴歸分析(S型，4PL分析)內推血漿樣品中之結合物6。PK 型態， CD-1 對 BALB/c SCID 小鼠
結合物6以5 mg/kg經靜脈內投與至SCID及CD-1 (免疫勝任)小鼠，證明瞭相似PK型態(圖60)。濃度在取樣時間點處為可相當的。兩相PK型態相繼包含24小時分佈相、狹窄消除相。結合物6血漿水準在該研究之一週過程中相對於Cmax 水準保持較高(約10 µg/ml)。實例 99. 合成炔丙基二胺中心連接體
Figure 02_image1758
步驟 a.
Figure 02_image1760
2-(2-Boc-胺基乙氧基)乙醇(16.0 g，78.0 mmol)及CBr4 (31.0 g，93.5 mmol)於DCM (100 mL)中之溶液在0℃下經15分鐘用PPh3 (24.5 g，93.5 mmol)緩慢地處理(放熱)。在添加過程中，內部溫度保持低於30℃。在添加PPh3 之後，該反應在室溫下經攪拌隔夜。粗反應物經濃縮為油狀物，接著藉由正相層析法用10%乙酸乙酯/己烷至80%乙酸乙酯/己烷溶離經純化。收集管內部含有油小液滴之溶離份經組合且濃縮為無色油狀物。產量18.1 g，86%。步驟 b.
Figure 02_image1762
步驟-a產物(10 g，37.3 mmol)、苯甲胺(1.60 g，14.9 mmol)及K2 CO3 (6.19 g，44.8 mmol)於DMF (20 mL)中之溶液在75℃油浴中加熱持續8 h。過濾該混合物，濃縮且藉由RPLC (5% ACN/水至100% ACN)經純化。產量6.8 g，95%。步驟 c.
Figure 02_image1764
向步驟-b產物(5.35 g，8.98 mmol)於CHCl3 /EtOH (1:20，100 mL)中之溶液中添加20% Pd(OH)2 /C (1.26 g，1/80 mmol)。該反應在環境溫度下在氫氣球下經攪拌隔夜。該反應混合物經矽藻土墊過濾。移出溶劑且無需純化繼續用於後續步驟。步驟 d.
Figure 02_image1766
步驟-c產物再溶解於20 mL DMF/二氯甲烷(1:5)中。向此遊離胺溶液中添加炔丙基PEG4酸(2.36 g，8.98 mmol)、EDCI (2.57 g，13.5 mmol)、HOAt (1.83 g，13.5 mmol)及胡尼西氏鹼(3.13 mL，18.0 mmol)。該反應混合物經過濾持續四小時，接著濃縮且藉由RPLC (10% ACN/水至60% ACN/水經純化。經兩個步驟，產量4.00 g，70%。藉由LCMS發現之離子：[M – Boc + H]+ = 534.2, [M + H]+ = 634.2。步驟 e.
Figure 02_image1768
步驟-d產物(4.00 g，6.31 mmol)用二噁烷(30 mL)中之4N HCl處理持續2小時。藉由旋轉蒸發移除過多HCl及二噁烷，且剩餘物進一步在高真空下乾燥以生成呈2HCl鹽形式之Int-10。產量3.15 g，99%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 434.2。實例 100. 合成 Int-7a (C7-C7 異構體 )
Figure 02_image1770
步驟 a.
Figure 02_image1772
5-乙醯胺基-7,8,9-O-三乙醯基-2,6-無水-4-疊氮基-3,4,5-三去氧-D-甘油-D-半乳-壬-2-烯酸甲酯(30 g，65.7 mmol)溶解於甲醇(100 mL)中且與Lindlar催化劑(15 g)組合。所得混合物用氫氣沖洗且攪拌持續5小時，每30分鐘用氫氣沖洗通過頂部空間之氫氣。在如藉由HPLC所測定完成反應之後，該催化劑經矽藻土過濾。濾液用於下一步驟。
來自前一步驟之粗胺(18.9 g，43.8 mmol)用甲醇(100 mL)中之N,N'-雙-boc-1-脒基吡唑(14.3 g，46.0 mmol)及DIEA (9.9 mL，57.0 mmol)處理。所得溶液在室溫下經攪拌，直至所有起始材料均經消耗，如藉由LCMS所測定(約30 min)。該溶液經濃縮為泡沫且在高真空下儲存隔夜，接著無需進一步純化用於下一步驟。
來自前一步驟之粗三-乙酸酯(43.8 mmol)溶解於100 ml無水甲醇中，接著在室溫下用甲醇中之甲醇鈉(1.9 mL，甲醇中之25%溶液，8.76 mmol)。藉由LCMS監測反應之進展，其在10分鐘之後完成。該反應用1N HCl淬滅至pH約為7。所得溶液經濃縮且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以10%至100%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀經純化。無TFA修飾劑用於此純化。產物之產量15.6 g，65%。步驟 b.
Figure 02_image1774
步驟-a產物(5.47 g，10 mmol)及DMAP (1.222 g，10 mmol)之混合物溶解於無水THF (30 ml)中。在冰水浴中冷卻之後，該溶液緩慢地用1,1’-羰基二咪唑(2.6 g，16 mmol)處理，接著在0℃下經攪拌持續30分鐘，隨後在60℃下加熱持續2小時。其接著冷卻至室溫且用水(50 ml)及EtOAc/己烷(1:1，100 ml)萃取。有機層用水(50 ml × 3)洗滌，經Na2 SO4 乾燥且藉由旋轉蒸發經濃縮。白色泡沫狀產物進一步在高真空下乾燥且無需進一步純化繼續用於後續步驟。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 573.2。步驟 c.
Figure 02_image1776
含有步驟-b產物之反應燒瓶用氮氣真空沖洗且溶解於無水DCM (50 ml)中，接著在冰水浴中冷卻。經20分鐘分成數份向該經冷卻溶液中相繼添加DMAP (4.89 g，40 mmol)、氯甲酸4-硝基苯酯(6.05 g，30 mmol)。該溶液在0℃下經攪拌，接著加溫至室溫持續1小時。LCMS顯示起始材料1 h，因此添加額外DMAP (1.22 g，10 mmol)及氯甲酸4-硝基苯酯(1 g，5 mmol)。繼續該反應持續4小時，接著用兩個矽膠管柱(220 g，藉由20% EtOAc及己烷預濕潤)純化且用20%至80% EtOAc及己烷溶離。經兩個步驟，產量4.42 g，59.9%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 738.2步驟 d.
Figure 02_image1778
經30分鐘分成數份向步驟-c產物(3.2 g. 4.34 mmol)於無水DCM (3 ml)中之溶液中添加炔丙基二胺中心連接體(1.26 g，2.5 mmol，描述於實例99中)及DIPEA (1.68 g，13 mmol)於無水DMF (5 ml)中之混合物。該反應在室溫下經攪拌持續2小時。其接著經濃縮且藉由RPLC (30%至90%乙腈及水，不使用TFA修飾劑)經純化。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 815.8, [(M - Boc + 2H)/2]+ = 765.8, [(M - 2Boc + 2H)/2]+ = 716。產量3.33 g，94.2%。步驟 e.
Figure 02_image1780
步驟-d產物(3.33 g，2.04 mmol)溶解於DCM (5 ml)及TFA (5 ml)中，接著在35℃下經攪拌持續約6小時。藉由LCMS監測該反應。當完成時，該溶液經濃縮且藉由RPLC (5至30%乙腈及水，不使用TFA)經純化。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 615.8, [(M + 3H)/3]+ = 411。產量2.29 g，91.3%。步驟 f.
Figure 02_image1782
步驟-e產物(61.5 mg，0.05 mmol)溶解於MeOH/水(1:1，0.6 ml)中。在該溶液經冷卻至-6℃(鹽/冰浴)之後，逐滴添加1.0 M LiOH (0.3 ml，0.3 mmol)且該反應經攪拌持續30分鐘。其接著用二噁烷溶液(75 µl)中之4N HCl淬滅至pH約為7.0且直接地藉由製備型HPLC (Isco ACCQ製備型，Luna 5 µm C18(2) 100 Å LC管柱100 mm × 30 mm；梯度：0%乙腈/水持續2 min，接著經12 min 0%至15%乙腈/水，接著在15%乙腈下等度持續10 min，使用0.1% TFA)經純化。產量45 mg，65.3%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 575.8, [(M + 3H)/3]+ = 384.2。分析滯留時間：6.013 min。條件：Phenomenex Gemini HPLC管柱，3 µm WX-C18 110 Å，100 mm × 3 mm，經25分鐘用5-95%乙腈及水梯度溶離，使用0.1% TFA。實例 101. 合成 Int-7b (C7-C9 異構體 )
Figure 02_image1784
類似於Int-7a (C7-C7異構體，實例100)製備C7-C9雜二聚體(Int-7b)，例外在於該反應在0℃下進行且藉由HPLC監測(滯留時間：6.112 min。條件：參見實例100，合成Int-7a且當C7-C9異構體佔優勢時停止(約3 h)。此異構體使用用於分離Int-7a之相同條件經分離。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 575.8, [(M + 3H)/3]+ = 384.2。實例 102. 合成 Int-7c (C9-C9 異構體 )
Figure 02_image1786
類似於Int-7a (C7-C7異構體，實例100)製備Int-7c (C9-C9異構體)，例外在於該反應在0℃下進行且藉由HPLC監測(滯留時間：6.232 min。條件：參見實例100，合成Int-7a且當C9-C9異構體佔優勢時停止(約6 h)。此異構體使用用於分離Int-7a之相同條件經分離。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 575.8, [(M + 3H)/3]+ = 384.2。實例 103. 合成 Int-7 ( 丙酮化合物途徑 )
Figure 02_image1788
步驟 a.
Figure 02_image1790
5-乙醯胺基-7,8,9-O-三乙醯基-2,6-無水-4-疊氮基-3,4,5-三去氧-D-甘油-D-半乳-壬-2-烯酸甲酯(10.0 g，22 mmol)溶解於60 ml無水甲醇中，接著在冰水浴中冷卻下用20 ml甲醇中之甲醇鈉(0.5 M於甲醇中，10 mmol)處理。藉由LCMS監測反應之進展，其在2小時之後完成。反應溶液之pH接著藉由使用Amberlite IRN-77離子交換樹脂經調節至5至6之值。過濾該混合物以移除該樹脂且在真空下蒸發至乾。所得油狀物無需進一步純化即用於下一步驟。藉由LCMS發現之離子：M+H =331.1。步驟 b.
Figure 02_image1792
向前一步驟之產物於70 ml丙酮中之溶液中添加30 ml 2,2-二甲氧基丙烷及對甲苯磺酸1水合物(400 mg，2.0 mmol)，所得溶液在室溫下經攪拌隔夜。在此時間結束時，添加碳酸氫鈉(170 mg，2.0 mmol)，且該混合物濃縮至乾。所得殘餘物無需純化即用於下一步驟。藉由LCMS發現之離子：M+H =371.2。步驟 c.
Figure 02_image1794
向來自前一步驟之材料於60 ml甲醇中之溶液中添加5.0 g Lindlar催化劑。所得混合物每30分鐘用氫氣沖洗且經攪拌持續5小時。在如藉由HPLC所測定完成反應之後，該催化劑經矽藻土濾出。濾液經濃縮且無需純化即用於下一步驟。
60 ml THF中之前一步驟之粗產物用N,N'-雙-boc-1-脒基吡唑(9.3 g，30.0 mmol)及DIEA (9.9 mL，57.0 mmol)處理。所得溶液在室溫下經攪拌，直至所有起始材料均經消耗，如藉由LCMS所測定(4 h)。該溶液經濃縮且藉由用20%至80%乙酸乙酯/二氯甲烷溶離之急驟層析法經純化。經四個步驟，產量8.8 g，59.0%。藉由LCMS發現之離子：M+H 587.3。步驟 d.
Figure 02_image1796
含有前一步驟之產物(6.5 g，11 mmol)之反應燒瓶用氮氣真空沖洗且溶解於無水二氯甲烷(100 ml)中。在該溶液在冰水浴中冷卻之後，添加DMAP (4.89 g，40 mmol)且攪拌以溶解，接著分成數份添加氯甲酸4-硝基苯酯(5.58 g，28 mmol)，同時在0℃至室溫下攪拌持續1小時。LCMS顯示起始材料1 h，因此添加額外DMAP (1.22 g，10 mmol)及氯甲酸4-硝基苯酯(1.0 g，5 mmol)。再繼續該反應持續4小時，接著濃縮且藉由用20%至80%乙酸乙酯/二氯甲烷溶離之急驟層析法經純化。產量5.1 g，59.9%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 752.2步驟 e.
Figure 02_image1798
向來自前一步驟之碳酸硝基苯酯(1.8 g. 2.3 mmol)於無水二氯甲烷(20 ml)中之溶液中添加中心連接體(0.51 g，1.0 mmol，經30分鐘分成數份添加)及DIPEA (1.4 ml，10 mmol)於無水DMF (20 ml)中之混合物。該反應在室溫下經攪拌隔夜，接著濃縮且藉由用0%至10%甲醇/二氯甲烷溶離之急驟層析法經純化。產量1.35 g，80%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 830.4, [(M - Boc + 2H)/2]+ = 780.4, [(M - 2Boc + 2H)/2]+ = 730.4。步驟 f.
Figure 02_image1800
前一步驟之產物(200 mg，0.2 mmol)溶解於2 ml MeOH及2 ml THF中，接著用氫氧化鋰(24 mg，1 mmol)溶解於2 ml水中之溶液處理。該反應在室溫下經攪拌持續10 min，此時HPLC顯示反應完成。反應溶液之pH藉由使用Amberlite IRN-77離子交換樹脂經調節至5至6之值，過濾以移除該樹脂。粗產物在真空下蒸發至乾且無需純化即用於下一步驟。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 815.4, [(M - Boc + 2H)/2]+ = 765.4, [(M - 2Boc + 2H)/2]+ = 715.4。步驟 g.
Figure 02_image1802
步驟g之產物(400 mg，0.25 mmol)溶解於5 ml二氯甲烷及5 ml TFA中，且所得反應溶液在室溫下經攪拌。藉由LCMS監測反應之進展。在反應完成之後(6 h)，該溶液經汽提至乾且接著溶解於4 ml水及4 ml乙腈中。所得溶液在室溫下再攪拌持續2小時，此時LCMS顯示丙酮化合物保護基之完全保護基脫除。此混合物經濃縮且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以5%至40%乙腈/水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀使用0.1% TFA作為修飾劑經純化。產量270 mg，68.0 %。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 575.8, [(M + 3H)/3]+ = 384.2。實例 104. Int-7a 、 Int-7b 及 Int-7c 之 NMR 結果 Int-7a 之 NMR
Figure 02_image1804
1 H NMR (500 MHz, 甲醇-d 4 ) δ 5.91-5.89 (m, 2H), 5.00-4.96 (m, 2H), 4.58-4.53 (m, 2H),4.42-4.37(m, 2H), 4.20 – 4.17 (m, 6H), 4.02-3.97 (m, 2H), 3.78 – 3.49 (m, 28H), 3.29-3.18 (m, 4H), 2.86 (t,J = 2.6 Hz, 1H), 2.85-2.72 (m, 2H), 1.96 (s, 3H), 1.95 (s, 3H) 。
13 C NMR (125 MHz, MeOD) δ 171.73, 170.80, 170.29, 161.95, 156.06, 155.08, 154.99, 144.07, 143.93, 116.41, 114.10, 106.03, 105.86, 77.71, 74.46, 73.22, 68.62, 68.54, 68.50, 68.38, 68.12, 68.00, 67.94, 67.67, 67.64, 67.53, 67.20, 66.96, 65.44, 61.53, 56.17, 49.74, 49.64, 47.37, 45.17, 39.16, 39.06, 31.73, 19.96, 19.92。Int-7b 之 NMR
Figure 02_image1806
1 H NMR (500 MHz, 甲醇-d 4 ) δ 5.91-5.87 (m, 2H), 5.04-4.95 (m, 1H), 4.58-4.48 (m, 2H), 4.45-4.37 (m, 3H), 4.20 – 4.10 (m, 5H), 4.08 – 3.98 (m, 2H), 3.79-3.44 (m, 29H), 3.29 – 3.18 (m, 4H), 2.88-2.70 (m, 3H), 2.02 (s, 3H), 1.96-1.94 (m, 3H)。
1 H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 8.28 (d, J = 8.4 Hz, 2H, -NH), 7.98 (d, J = 11.5 Hz, 2H, -NH), 7.78 (d, J = 8.7 Hz, 2H, -NH), 7.60 (t, J = 8.5 Hz, 2H, -NH), 7.20 (bs, 2H, -NH), 7.06 (bs, 2H, -NH), 5.69 (bs, 1H), 5.67 (d, J=2.4 Hz, 1H), 4.83 (dd, J = 9.2, 2.2 Hz, 1H), 4.45 (dt, J = 9, 2.5 Hz, 1H), 4.37 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 4.33-4.24 (m, 2H), 4.13 (d, J = 2.5 Hz, 2H), 4.05-4.32 (m, 41H), 3.23 (m, 1H), 3.15-3.09 (m, 2H), 3.06-3.02 (m, 2H), 2.59 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 1.91 (s, 3H), 1.78 (s, 3H)。
13 C NMR (125 MHz, MeOD) δ:173.19, 172.98, 172.25, 171.75, 164.26, 163.82, 157.88, 157.55, 156.51, 146.09, 107.21, 106.93, 106.59, 79.22, 76.19, 75.92, 74.72, 74.68, 70.12, 70.08, 70.03, 69.99, 69.92, 69.88, 69.66, 69.48, 69.12, 69.01, 68.94, 68.73, 68.69, 68.50, 68.19, 67.08, 66.93, 66.79, 63.04, 57.68, 51.24, 51.15, 50.13, 48.87, 48.72, 46.72, 46.58, 46.23, 40.64, 40.41, 33.21, 21.49, 21.45, 21.40。Int-7c 之 NMR
Figure 02_image1808
1 H NMR (500 MHz, 甲醇-d 4 ) δ: 5.88 (d, J = 2.6 Hz, 2H), 4.50 (dt, J = 8.5, 2.7 Hz, 2H), 4.43 (ddd, J = 9.7, 3.9, 1.5 Hz, 2H), 4.39 (dd, J = 11.5, 2.4 Hz, 2H), 4.25 – 4.16 (m, 2H), 4.19 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 4.13 (dt, J = 11.5, 5.9 Hz, 2H), 4.05 (m, 2H), 3.77 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 3.72 – 3.55 (m, 22H), 3.51 (m, 4H), 3.35 – 3.23 (m, 4H), 2.86 (t, J = 2.4 Hz, 1H), 2.74 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 2.02 (s, 6H)。
13 C NMR (125 MHz, MeOD) δ:173.03, 163.76, 157.89, 157.54, 145.60, 107.21, 79.28, 76.29, 74.70, 70.11, 70.07, 70.03, 69.92, 69.70, 69.47, 68.96, 68.89, 68.72, 68.54, 68.19, 67.05, 66.75, 57.69, 50.09, 48.69, 48.08, 46.10, 40.44, 40.38, 33.23, 21.42。實例 105. 合成 Int-60
Figure 02_image1810
步驟 a.
向先前製備之醚-紮那米韋酸(1.00 g，1.586 mmol，實例31)、2-疊氮基乙胺鹽酸鹽(213 mg，1.744 mmol)及DIPEA (1.105 mL，6.343 mmol)於DMF (8.0 mL)中之0℃攪拌溶液中添加HATU (615 mg，1.618 mmol)。溫度升至環境溫度且繼續攪拌直至完成。所有揮發物均根據真空技術經移除。殘餘物溶解於乙酸乙酯中，相繼用1 M硫酸水溶液(1 × 50 mL)、飽和碳酸氫鈉水溶液(3 × 20 mL)及鹽水(1 × 50 mL)洗滌。所得有機層經硫酸鎂乾燥，過濾，且所有揮發物均根據真空技術經移除。以此方式，以高純度獲得816 mg所需中間物疊氮化物且無需任何進一步純化即用於下一步驟。(藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 699.2)。向所述粗材料(816 mg，1.168 mmol)、二炔丙基胺(54 mg，0.584 mmol)、參((1-苯甲基-4-三唑基)甲基)胺(31 mg，0.058 mmol)及抗壞血酸鈉(58 mg，0.292 mmol)於乙醇(10 mL)及水(5 mL)中之攪拌溶液中添加硫酸銅(10 mg，0.061 mmol)。在完成時，添加銅淨化劑SiliaMetSTAAcONa (300 mg，裝載0.45 mmol/g)且繼續攪拌持續1 h。藉助於二氯甲烷過濾該混合物。用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌濾液。水層另外用二氯甲烷洗滌(3次)。經組合之有機物經硫酸鎂乾燥，過濾且濃縮。殘餘物藉由矽石管柱使用相繼以0%至100%己烷及乙酸乙酯、0%至30%二氯甲烷及溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析法經純化。產量817 mg，94%產率。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 745.8, [(M + 3H)/3]+ = 497.5。步驟 b.
向步驟a產物(817 mg，0.548 mmol)、炔丙基-PEG4-酸(185 mg，0.712 mmol)及DIPEA (286 uL, 1.644 mmol)於DMF (7.0 mL)中之0℃攪拌溶液中添加HATU (212 mg，0.544 mmol)。溫度升至環境溫度且繼續攪拌直至完成。所有揮發物均根據真空技術經移除。殘餘物藉由HPLC (0至90%甲醇及水)經純化。產量520 mg，56%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 866.8, [(M + 3H)/3]+ = 578.4。步驟 c.
攪拌步驟b化合物(520 mg，0.300 mmol)於2-甲基-2-丁烯(0.25 mL)、二氯甲烷(4.0 mL)及TFA (2.0 mL)中之攪拌溶液，直至氣體逸出停止。所有揮發物均根據真空技術經移除。殘餘物藉由HPLC (0至30%甲醇及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量221 mg，47%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 666.8, [(M + 3H)/3]+ = 444.8。步驟 d.
向步驟c產物(221 mg，0.142 mmol)於水(3.0 mL)中之0℃攪拌溶液中添加氫氧化鋰(20 mg，0.850 mmol)。該反應用乙酸(120 µL)淬滅，且所有揮發物均根據真空技術經移除。殘餘物藉由HPLC (0至20%甲醇及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量130 mg，62%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 626.8, [(M + 3H)/3]+ = 418.2。實例 106. 合成結合物 29
經疊氮基官能化之無糖基化Fc (SEQ ID NO: 35)於pH 7.4 PBS x 1緩衝溶液(100 mg，10 mL，1.874 µmol)中之溶液添加至含有炔衍生之小分子(17 mg，0.0112 mmol；實例105，Int-60)、硫酸銅(4 mg，0.0225 mmol)、參(3-羥基丙基三唑基甲基)-胺(39 mg，0.0900 mmol)及抗壞血酸鈉(7.4 mg，0.375 mmol)之pH 7.4 PBS x 1緩衝溶液(10.50 mL)的離心管中。所得混合物輕柔地震盪隔夜。其相繼藉由在蛋白A管柱上之親和層析法、尺寸排阻層析法(參見實例10)經純化。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出56938 Da之平均質量(DAR = 2.3)。產量49.9 mg，49%產率。
編碼結合物29之Fc之核酸構築體包含編碼SEQ ID NO：35之胺基酸序列的核酸，該胺基酸序列包含C末端離胺酸殘基及N末端鼠類IgG信號序列。表現後，結合物29之Fc之C末端離胺酸及N末端鼠類IgG信號序列經蛋白水解裂解，由此產生具有缺少Lys447(例如，缺少C末端離胺酸殘基)及N末端鼠類IgG信號序列之序列的Fc。C末端離胺酸之存在或不存在不改變Fc或相應結合物之性質。實例 107. 合成 Int-65
Figure 02_image1811
步驟 a.
向先前製備之醚-紮那米韋酸(2.00 g，3.172 mmol，實例31)及4-甲基嗎啉(0.628 mL，5.709 mmol)於四氫呋喃(30 mL)中之0℃攪拌溶液中添加氯甲酸異丁酯(0.617 mL，4.7574 mmol)。10分鐘之後，溫度增加至環境溫度且繼續攪拌持續20分鐘。溫度減回0℃，且一次性添加硼氫化鈉(360 mg，9.515 mmol)，隨後經5分鐘逐滴添加(10 mL)。在完成時，該反應用乙酸(2.860 mL，50 mmol)淬滅，且5分鐘之後，溫度升至環境溫度，同時繼續攪拌直至氣體逸出停止。所有揮發物均經蒸發且殘餘物懸浮於二氯甲烷中且經過濾。濾液經濃縮且殘餘物藉由矽石管柱使用以20%至100%己烷及乙酸乙酯溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析法使用3%甲醇作為修飾劑經純化。產量1.302 g，66%產率。藉由LCMS發現之離子：[(M + H)]+ = 617.2。步驟 b.
向步驟a產物(1.25 g，2.027 mmol)及DIPEA (1.095 mL，6.284 mmol)於二氯甲烷(15 mL)中之0℃攪拌溶液中添加甲烷磺醯氯(0.314 mmol，4.054 mmol)。在完成時，該反應用水(15 mL)處理。分離各層，且二氯甲烷層相繼經鹽水、硫酸鎂乾燥，且過濾。該溶液經濃縮且殘餘物溶解於DMF (10 mL)中，且添加疊氮化鈉(264 mg，4.054 mmol)，同時溫度升至50℃。18 h之後觀察到完成，且所有揮發物均根據真空技術經蒸發。殘餘物藉由矽石管柱使用以20%至100%己烷及乙酸乙酯溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析法使用3%甲醇作為修飾劑經純化。產量767 mg，59%產率。藉由LCMS發現之離子：[(M + H)]+ = 642.2。步驟 c.
向步驟b產物(496 mg，0.773 mmol)、二炔丙基胺(36 mg，0.386 mmol)、參((1-苯甲基-4-三唑基)甲基)胺(41 mg，0.077 mmol)及抗壞血酸鈉(115 mg，0.580 mmol)於乙醇(16 mL)及水(8 mL)中之攪拌溶液中添加硫酸銅(13 mg，0.081 mmol)。在完成時，添加銅淨化劑SiliaMetSTAAcONa (600 mg，裝載0.45 mmol/g)且繼續攪拌持續1 h。藉助於二氯甲烷過濾該混合物。用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌濾液。水層另外用二氯甲烷洗滌(3次)。經組合之有機物經硫酸鎂乾燥，過濾且所有揮發物均根據真空技術經蒸發。向殘餘物、炔丙基-PEG4-酸(151 mg，0.580 mmol) )及DIPEA (337 µL, 1.933 mmol)於DMF (10.0 mL)中之0℃攪拌溶液中添加HATU (220 mg，0.580 mmol)。溫度升至環境溫度且繼續攪拌直至完成。所有揮發物均根據真空技術經移除。殘餘物藉由HPLC (0至90%甲醇及水)經純化。產量457 mg，73%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 809.8, [(M + 2H - Boc)/2]+ = 759.8。步驟 d.
攪拌步驟c化合物(451 mg，0.279 mmol)於2-甲基-2-丁烯(0.25 mL)、二氯甲烷(4.0 mL)及TFA (2.0 mL)中之攪拌溶液，直至氣體逸出停止。所有揮發物均根據真空技術經移除。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 609.8, [(M + 3H)/3]+ = 407.0。向殘餘物於四氫呋喃(6 mL)及水(6 mL)中之0℃攪拌溶液中添加氫氧化鋰(240 mg，10.03 mmol)。在完成時，該反應用乙酸(0.638 mL，11.14 mmol)淬滅，且所有揮發物均根據真空技術經移除。殘餘物藉由HPLC (0至90%甲醇及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量209 mg，67%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 569.8, [(M + 2H - Boc)/2]+ = 380.3。實例 108. 合成結合物 30
經疊氮基官能化之無糖基化Fc (實例7，SEQ ID NO: 35)於pH 7.4 PBS x 1緩衝溶液(50 mg，5 mL，1.874 µmol)中之溶液添加至含有炔衍生之小分子(8.7 mg，0.0064 mmol，Int-65)、硫酸銅(2 mg，0.013 mmol)、參(3-羥基丙基三唑基甲基)-胺(22 mg，0.0508 mmol)及抗壞血酸鈉(25 mg，0.127 mmol)之pH 7.4 PBS x 1緩衝溶液(9.50 mL)的離心管中。所得混合物輕柔地震盪隔夜。其相繼藉由在蛋白A管柱上之親和層析法、尺寸排阻層析法(參見實例10)經純化。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出61548 Da之平均質量(DAR = 2.4)。產量32.33 mg，67%產率。
編碼結合物30之Fc之核酸構築體包含編碼SEQ ID NO：35之胺基酸序列的核酸，該胺基酸序列包含C末端離胺酸殘基及N末端鼠類IgG信號序列。表現後，結合物30之Fc之C末端離胺酸及N末端鼠類IgG信號序列經蛋白水解裂解，由此產生具有缺少Lys447(例如，缺少C末端離胺酸殘基)及N末端鼠類IgG信號序列之序列的Fc。C末端離胺酸之存在或不存在不改變Fc或相應結合物之性質。實例 109 ：合成碳酸對硝基苯酯紮那米韋中間物
Figure 02_image1812
步驟 a.
Figure 02_image1790
三乙醯氧基-疊氮基紮那米韋中間物(10.0 g，22 mmol)溶解於60 ml無水甲醇中，接著在冰水浴中冷卻下用20 ml甲醇中之甲醇鈉(0.5 M於甲醇中，10 mmol)處理。藉由LCMS監測反應之進展，其在2小時之後完成。反應溶液之pH接著藉由使用Amberlite IRN-77離子交換樹脂經調節至5至6之值。過濾該混合物以移除該樹脂且在真空下蒸發至乾。所得油狀物無需進一步純化即用於下一步驟。藉由LCMS發現之離子：M+H =331.1。步驟 b.
Figure 02_image1792
向前一步驟之產物於70 ml丙酮中之溶液中添加30 ml 2,2-二甲氧基丙烷及對甲苯磺酸1水合物(400 mg，2.0 mmol)，所得溶液在室溫下經攪拌隔夜。在此時間結束時，添加碳酸氫鈉(170 mg，2.0 mmol)，且該混合物濃縮至乾。所得殘餘物無需純化即用於下一步驟。藉由LCMS發現之離子：M+H =371.2。步驟 c 及 d.
Figure 02_image1815
向來自前一步驟之材料於60 ml甲醇中之溶液中添加5.0 g Lindlar催化劑。所得混合物每30分鐘用氫氣沖洗且經攪拌持續5小時。在如藉由HPLC所測定完成反應之後，該催化劑經矽藻土濾出。濾液經濃縮且無需純化即用於下一步驟。
60 ml THF中之前一步驟之粗產物用N,N'-雙-boc-1-脒基吡唑(9.3 g，30.0 mmol)及DIEA (9.9 ml，57.0 mmol)處理。所得溶液在室溫下經攪拌，直至所有起始材料均經消耗，如藉由LCMS所測定(4 h)。該溶液經濃縮且藉由用20%至80%乙酸乙酯/二氯甲烷溶離之急驟層析法經純化。經四個步驟，產量8.8 g，59.0%。藉由LCMS發現之離子：M+H 587.3。步驟 e.
Figure 02_image1796
含有前一步驟之產物(6.5 g，11 mmol)之反應燒瓶用氮氣真空沖洗且溶解於無水二氯甲烷(100 ml)中。在該溶液在冰水浴中冷卻之後，添加DMAP (4.89 g，40 mmol)且攪拌以溶解，接著分成數份添加氯甲酸4-硝基苯酯(5.58 g，28 mmol)，同時在0℃至室溫下攪拌持續1小時。LCMS顯示起始材料1 h，因此添加額外DMAP (1.22 g，10 mmol)及氯甲酸4-硝基苯酯(1.0 g，5 mmol)。再繼續該反應持續4小時，接著濃縮且藉由用20%至80%乙酸乙酯/二氯甲烷溶離之急驟層析法經純化。產量5.1 g，59.9%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 752.2。實例 110. 合成 Int-71
Figure 02_image1818
步驟 a.
Figure 02_image1724
向2-(2-Boc-胺基乙氧基)乙醇(6.15 g，30 mmol)於無水DCM (60 ml)中之溶液中添加DIPEA (7.8 g，60 mmol)及DMAP (366.6 mg，3 mmol)。接著經30分鐘分成數份添加對甲苯磺醯氯(6.86 g，36 mmol)。在所得混合物經攪拌持續3天之後，其藉由旋轉蒸發經濃縮且藉由RPLC (20%至70%乙腈/水)經純化。產量3.71 g，34.4%。藉由LCMS發現之離子：[M -Boc + H]+ = 260。步驟 b.
Figure 02_image1821
向步驟-a產物(2.1 g，5.83 mmol)於無水THF (10 ml)中之溶液中添加碳酸鈉(1.24 g，11.7 mmol)及N-Boc-1,4-二胺基丁烷(1.32 g，7 mmol)。所得混合物在60℃下加熱持續1天。接著濾出鹽，且濾液藉由旋轉蒸發經濃縮。殘餘物藉由RPLC (100 g，5至50%乙腈及水)經純化。產量1.94 g，88.6%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 376.0。步驟 c.
Figure 02_image1728
向炔丙基PEG-4酸(781 mg，3 mmol)及HATU (1.14 g，3 mmol)於無水DMF (3 ml)中之溶液中添加DIPEA (390 mg，3 mmol)，隨後添加步驟-b產物(940 mg，2.5 mmol)及DIPEA (390 mg，3 mmol)於無水DMF (3 ml)中之溶液。該反應混合物經攪拌持續30分鐘，接著直接地藉由RPLC (5%至80%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量960.2 mg，65.3%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 618.3, [M - Boc + H]+ = 518.3。步驟 d.
Figure 02_image1730
步驟-c產物(960.2 mg，1.63 mmol)溶解於無水THF (6 ml)中。添加二噁烷(4 ml)中之4N HCl溶液，且該反應混合物經攪拌隔夜。其接著藉由旋轉蒸發經濃縮。殘餘物用水(3 × 3 ml)及乙酸乙酯(10 ml)萃取。經組合之水層經凍乾。產量760 mg，95.1%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 418.0。步驟 e.
Figure 02_image1825
經20分鐘分成數份向步驟-d產物(556.2 mg，1.13 mmol)及DIPEA (741 mg，5.7 mmol)於無水DMF (3 ml)中之混合物中添加紮那米韋之碳酸對硝基苯酯(1.67 g，2.26 mmol，描述於實例109中)。該反應經攪拌持續1小時，接著直接地藉由RPLC (30%至90%乙腈/水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量1.35 g，74%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 807.9。步驟 f.
Figure 02_image1827
步驟-e產物(1.35 g，0.836 mmol)溶解於TFA (5 ml)中。該反應在30℃下加熱持續1小時，其直接地藉由RPLC (0%至35%乙腈/水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量1.00 g，82.9%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 607.8。步驟 g.
Figure 02_image1829
步驟-f產物(1.00 g，0.693 mmol)溶解於MeOH (12 ml)中，接著在冰水浴中冷卻。其接著經LiOH單水合物(286 mg，6.6 mmol)於水(9 ml)中之溶液處理。所得混合物經攪拌隔夜且接著藉由二噁烷(2 ml)中之4N HCl溶液酸化。在有機溶劑藉由旋轉蒸發經移除之後，殘餘物藉由製備型HPLC (Isco ACCQ製備型，Luna 5 µm C18(2) 100 Å LC管柱100 mm × 30 mm；梯度：0%乙腈/水持續2 min，接著經12 min 0%至15%乙腈/水，接著在15%乙腈下等度持續10 min，使用0.1% TFA)經純化。產量275.9 mg，29.2%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 567.8, [(M + 3H)/3]+ = 378.9。實例 111. 合成結合物 31
向15-ml無菌離心管中饋入抗壞血酸鈉(68.1 mg，0.344 mmol)、THPTA (14.9 mg，0.0344 mmol)、炔衍生之小分子(17.5 mg，0.00953 mmol，描述於實例110中)及緩衝液PBS 7.4 (1 ml)。在藉由渦旋經攪拌以溶解所有物質之後，相繼添加Peg 4疊氮基Fc (50 mg，0.0008588 mmol，描述於實例7中 SEQ ID No. 18)、CuSO4 (2.05 mg，0.0129 mmol)於PBS (0.5 ml)中之溶液。該混合物輕柔地經旋轉持續20小時，接著相繼藉由蛋白-A管柱上之親和層析法、尺寸排阻層析法經純化。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出63586 Da之平均質量(DAR = 3.8)。產量32.8 mg，66%產率。實例 112. 合成 Int-72
Figure 02_image1831
步驟 a.
Figure 02_image1833
向N-Boc-1,4-二胺基丁烷(1.56 g，8.28 mmol)於無水DMF (7 ml)中之溶液中添加碳酸鈉(742 mg，7 mmol)及5-(Boc-胺基)-1-戊基溴(1.73 g，6.5 mmol)。所得混合物在50℃下加熱持續24小時。接著濾出鹽，且濾液藉由旋轉蒸發經濃縮。殘餘物藉由RPLC (5%至50%乙腈/水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量2 g，63.2%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 374.4。步驟 b.
Figure 02_image1835
向炔丙基PEG-4酸(1.3 g，5 mmol)及HATU (2.1 g，5.5 mmol)於無水DMF (6 ml)中之溶液中添加DIPEA (1.3 g，10 mmol)。5分鐘之後，該反應混合物添加至步驟-a產物(2 g，4.1 mmol)中且經攪拌持續1小時。其接著直接地藉由RPLC (5%至80%乙腈/水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量2.34 g，95%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 616.4, [M – Boc + H]+ = 516.4。步驟 c.
Figure 02_image1837
步驟-b產物(2.34 g，3.8 mmol)溶解於無水THF (12 ml)中。添加二噁烷(10 ml)中之4N HCl溶液，且該反應混合物經攪拌隔夜。其接著藉由旋轉蒸發經濃縮。殘餘物再溶解於乙腈/水(1:1，約16 ml)中，且該溶液經凍乾。粗產物無需進一步純化繼續用於後續步驟。產量1.91 g，定量產率。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 416.4。步驟 d.
Figure 02_image1839
經20分鐘分成數份向紮那米韋之碳酸對硝基苯酯(2.25 g，3.05 mmol，描述於實例109中)於無水DCM (3 ml)中之溶液中添加步驟-c產物(610 mg，1.249 mmol)及DIPEA (1.05 g，8.1 mmol)於無水DMF (4 ml)中之混合物。在攪拌持續1小時之後，該反應混合物經濃縮且藉由RPLC (30%至80%乙腈/水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量1.73 g，85.9%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 806.8, [(M - Boc + 2H)/2]+ = 756.8。步驟 e.
Figure 02_image1841
步驟-d產物(1.73 g，1.073 mmol)溶解於TFA (5 ml)中。在該溶液在30℃下加熱持續3小時之後，其直接地藉由RPLC (0%至35%乙腈/水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量1.176 g，76.1%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 606.8, [(M + 3H)/3]+ = 405。步驟 f.
Figure 02_image1843
步驟-e產物(1.176 g，0.817 mmol)溶解於MeOH (12 ml)中，且該溶液在冰水浴中冷卻。其逐滴經LiOH單水合物(344.4 mg，8.2 mmol)於水(9 ml)中之溶液處理。所得混合物經攪拌隔夜且接著藉由二噁烷(2 ml)中之4N HCl溶液酸化。在有機溶劑藉由旋轉蒸發經移除之後，殘餘物藉由製備型HPLC (Isco ACCQ製備型，Luna 5 µm C18(2) 100 Å LC管柱100 mm × 30 mm；梯度：0%乙腈/水持續2 min，接著經12 min 0%至15%乙腈/水，接著在15%乙腈下等度持續10 min，使用0.1% TFA)經純化。產量108 mg，9.7%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 566.8, [(M + 3H)/3]+ = 378.2。實例 113. 合成結合物 32
向15-ml無菌離心管中饋入抗壞血酸鈉(68.1 mg，0.344 mmol)、THPTA (14.9 mg，0.0344 mmol)、實例112之產物Int-72 (17.5 mg，0.00953 mmol)及PBS 7.4 (1 ml)。在藉由渦旋經攪拌以溶解所有物質之後，相繼添加疊氮基Fc (50 mg，0.0008588 mmol，描述於實例7中，SEQ ID NO: 4)、CuSO4 (2.05 mg，0.0129 mmol)於PBS (0.5 ml)中之溶液。該混合物經旋轉持續20小時。其相繼藉由在蛋白A管柱上之親和層析法、尺寸排阻層析法經純化。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出63588. Da之平均質量(DAR = 3.8)。產量30.9 mg，62%產率。
編碼結合物32之Fc之核酸構築體包含編碼SEQ ID NO：4之胺基酸序列的核酸，該胺基酸序列包含C末端離胺酸殘基。表現後，結合物32之Fc之C末端離胺酸經蛋白水解裂解，由此產生具有缺少Lys447(例如，缺少C末端離胺酸殘基)之序列的Fc。C末端離胺酸之存在或不存在不改變Fc或相應結合物之性質。實例 114. 合成 Int-73
Figure 02_image1845
步驟 a.
Figure 02_image1847
經10分鐘分成數份向紮那米韋之碳酸對硝基苯酯(698.4 mg，0.95 mmol，描述於實例109中)於無水DCM (2 ml)中之溶液中添加炔丙基二胺中心連接體(209 mg，0.426 mmol，描述於實例110中)及DIPEA (330.8 mg，2.56 mmol)於無水DMF (2 ml)中之混合物。該反應在室溫下攪拌持續1小時。其接著經濃縮且藉由RPLC (30%至85%乙腈/水，不使用TFA修飾劑)經純化。產量531 mg，69.2%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 807.8, [(M - Boc + 2H)/2]+ = 757.8。步驟 b.
Figure 02_image1849
步驟-b產物(531 mg，0.329 mmol)溶解於DCM (1.5 ml)及TFA (1.5 ml)中，接著在35℃下經攪拌持續3小時。其經濃縮且藉由RPLC (5%至30%乙腈/水，不使用TFA修飾劑)經純化。產量387 mg，97.1%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 607.6, [(M + 3H)/3]+ = 405.4。步驟 c.
Figure 02_image1851
步驟-b產物(121.4 mg，0.1 mmol)溶解於1.0 M NaCl溶液(3 ml)及乙腈(1 ml)中。在該溶液經冷卻至-8℃(鹽/冰浴)之後，逐滴添加1.0 M NaOH (0.4 mL，0.4 mmol)且該反應在-14℃至-8℃下經攪拌持續6小時。其接著用二噁烷溶液(100 µl)中之4N HCl中和且直接地藉由製備型HPLC (Isco ACCQ製備型，Luna 5 µm C18(2) 100 Å LC管柱100 mm × 30 mm；梯度：0%乙腈/水持續2 min，接著經12 min 0%至17.8%乙腈/水，接著在17.8%乙腈下等度持續10 min，使用0.1% TFA)經純化。產量85.5 mg，62.8%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 567.8, [(M + 3H)/3]+ = 378.9。實例 115. 合成 Int-74
Figure 02_image1853
步驟 a.
Figure 02_image1855
向N-Boc-2-(2-胺基-乙氧基)乙胺(1.2 g，5 mmol)於無水DMF (5 ml)中之溶液中添加碳酸鈉(691 mg，5 mmol)及N-Boc-6-溴-己胺(1.4 g，5 mmol)。所得混合物在70℃下加熱持續24小時。接著濾出鹽，且濾液藉由旋轉蒸發經濃縮。殘餘物藉由RPLC (5%至50%乙腈/水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量444 mg，22%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 404.3。步驟 b.
Figure 02_image1857
向炔丙基PEG-4酸(342.6 mg，1.32 mmol)及HATU (601.5 mg，1.58 mmol)於無水DMF (2 ml)中之溶液中添加DIPEA (258 mg，2 mmol)。5分鐘之後，該反應混合物添加至步驟-a產物(444.3 mg，0.858 mmol)中且經攪拌持續1小時。其接著直接地藉由RPLC (5%至80%乙腈/水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量297.1 mg，53.6%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 646.2, [M – Boc + H]+ = 546.2。步驟 c.
Figure 02_image1859
步驟-b產物(297.1 mg，0.46 mmol)溶解於無水THF (2 ml)中。添加二噁烷(4 ml)中之4N HCl溶液，且該反應混合物經攪拌隔夜。其接著藉由旋轉蒸發經濃縮且藉由製備型HPLC (5%至50%乙腈/水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量239.6 mg，77.3%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 446.2。步驟 d.
Figure 02_image1861
經10分鐘分成數份向紮那米韋之碳酸對硝基苯酯(523.8 mg，0.71 mmol，描述於實例109中)於無水DCM (2 ml)中之溶液中添加步驟-c產物(239.6 mg，0.356 mmol)及DIPEA (245.5 mg，1.9 mmol)於無水DMF (2 ml)中之混合物。該反應在室溫下攪拌持續1小時。其接著經濃縮且藉由RPLC (30%至85%乙腈/水，不使用TFA修飾劑)經純化。產量553 mg，96.5%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 821.8, [(M - Boc + 2H)/2]+ = 771.8。步驟 e.
Figure 02_image1863
步驟-d產物(553 mg，0.343 mmol)溶解於DCM (1.5 ml)及TFA (1.5 ml)中，接著在35℃下經攪拌持續3小時。其經濃縮且藉由RPLC (5%至30%乙腈/水，不使用TFA修飾劑)經純化。產量424.6 mg，99.6%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 621.6, [(M + 3H)/3]+ = 415.0。步驟 f.
Figure 02_image1865
步驟-e產物(424.6 mg，0342 mmol)溶解於1.0 M NaCl溶液(4 ml)及乙腈(4 ml)中。在該溶液經冷卻至-11℃(鹽/冰浴)之後，逐滴添加1.0 M NaOH (1.53 mL，1.53 mmol)且該反應在-14℃至-8℃下經攪拌持續6小時。其接著用二噁烷溶液(375 µl)中之4N HCl淬滅且直接地藉由製備型HPLC (Isco ACCQ製備型，Luna 5 µm C18(2) 100 Å LC管柱100 mm × 30 mm；梯度：0%乙腈/水持續2 min，接著經13.6 min 0%至20.9%乙腈/水，接著在20.9%乙腈下等度持續10 min，使用0.1% TFA)經純化。產量439 mg，92.3%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 581.8, [(M + 3H)/3]+ = 388.2。實例 116. 合成 Int-75
Figure 02_image1867
步驟 a.
Figure 02_image1869
(4-側氧基丁基)胺基甲酸第三丁酯(850 mg，4.54 mg)及N-{2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙基}胺基甲酸第三丁酯(1.99 g，8 mmol)之混合物溶解於DCM (30 ml)中且經Na2 SO4 乾燥。在過濾且濃縮之後，殘餘物再溶解於無水DCM (20 ml)中。經1小時分成數份相繼添加乙酸(641 mg，11 mmol)、三乙醯氧基硼氫化鈉(3.4 g，16 mmol)。該反應混合物經攪拌隔夜，接著用AcOH (3 ml)及MeOH (10 ml)淬滅。過濾該混合物，且濾液藉由旋轉蒸發經濃縮且藉由RPLC (5%至45%乙腈及水)經純化。產量618 mg，32.5%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 420.4。步驟 b.
Figure 02_image1871
類似於實例115之步驟-b產物製備此化合物。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 662.4 , [M – Boc + H]+ = 562.4。步驟 c.
Figure 02_image1873
類似於實例115之步驟-c產物製備此化合物。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 462.4。步驟 d.
Figure 02_image1875
類似於實例115之步驟-d產物製備此化合物。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 829.8, [(M - Boc + 2H)/2]+ = 779.8。步驟 e.
Figure 02_image1877
類似於實例115之步驟-e產物製備此化合物。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 629.8, [(M + 3H)/3]+ = 420.2。步驟 f.
Figure 02_image1879
類似於實例115之步驟-f產物製備此化合物。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 598.8, [(M + 3H)/3]+ = 393.6。實例 117. 合成 Int-76
Figure 02_image1881
步驟 a.
Figure 02_image1883
向N-Boc-peg-1甲苯磺酸鹽(1.54 g，4.28 mmol，描述於實例110中)於無水THF (8 ml)中之溶液中添加N-2{2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙基}胺基甲酸第三丁酯(1.59 g，6.42 mmol)及碳酸鈉(453.7 mg，4.28 mmol)。所得混合物在50℃下加熱持續24小時。過濾該固體且用乙腈洗滌。濾液經濃縮且藉由RPLC (100 g，5至90%乙腈及水)經純化。產量1.15 g，61.7%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 436.4。步驟 b.
Figure 02_image1885
類似於實例115之步驟-b產物製備此化合物。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 678.2, [M – Boc + H]+ = 578.2。步驟 c.
Figure 02_image1887
類似於實例115之步驟-c產物製備此化合物。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 478.2。步驟 d.
Figure 02_image1889
類似於實例115之步驟-d產物製備此化合物。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 837.6, [(M - Boc + 2H)/2]+ = 767.8。步驟 e.
Figure 02_image1891
類似於實例115之步驟-e產物製備此化合物。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 637.5, [(M + 3H)/3]+ = 425.6。步驟 f.
Figure 02_image1893
類似於實例115之步驟-f產物製備此化合物。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 597.8, [(M + 3H)/3]+ = 399.0。實例 118 合成 Int-67
Figure 02_image1895
步驟 a.
Figure 02_image1897
先前製備之醚紮那米韋酸起始材料(0.90 g，1.43 mmol，描述於實例22中)及N-甲基嗎啉(0.23 mL，2.14 mmol)溶解於THF (35 mL)中且在氮氣氛圍下冷卻至0℃(冰水浴)。經5分鐘時期藉助於注射器逐滴添加氯甲酸異丁酯(0.24 mL，1.85 mmol，於2 mL DCM中)。該混合物在0℃下經攪拌持續30分鐘，接著在環境溫度下經攪拌持續15 min，且接著冷卻至0℃，經5分鐘向其中逐滴添加硼氫化鈉(540 mg，14.3 mmol，溶解於5 mL甲醇中)。該反應經攪拌持續15分鐘，此時所有起始材料均已經消耗(藉由LC/MS)。添加數滴(約1 mL)冰乙酸以酸化該混合物(pH~5)。該混合物用乙酸乙酯及水稀釋且經萃取至乙酸乙酯中(3次)。有機層用鹽水洗滌，且有機萃取物經硫酸鈉乾燥，且在旋轉蒸發儀上經濃縮。粗材料藉由矽膠層析法經純化，首先經乾燥於矽藻土上，且接著經30 min用DCM中之0%-10%甲醇溶離。產量0.66 g，75%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 617.2。步驟 b.
Figure 02_image1899
向前一步驟之產物(0.66 g，1.10 mmol)於20 mL DCM中之攪拌混合物中添加三乙胺(0.30 mL，1.3 mmol)。該混合物在氮氣氛圍下冷卻至0℃(冰水浴)，接著經5分鐘藉助於注射器逐滴用甲磺醯氯(0.15 g，1.3 mmol)處理。移除冰浴且該反應經攪拌持續45分鐘。該反應用飽和碳酸氫鈉水溶液淬滅，接著經萃取至DCM中(3次)。經組合之有機萃取物用鹽水洗滌，經硫酸鈉乾燥且在旋轉蒸發儀上經濃縮。產量0.74 g，99%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 695.2。該中間物無需純化即用於下一步驟。步驟 c.
Figure 02_image1901
來自前一步驟之甲磺酸鹽(0.74 g，1.1 mmol)在80℃下與3 eq疊氮化鈉(0.21 g，3.3 mmol)一起在DMF (5 mL)中經攪拌持續5小時。該混合物用水稀釋，經萃取至DCM中(3次)。經組合之有機萃取物用鹽水洗滌，經硫酸鈉乾燥且濃縮。產量0.67 g，95%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 642.4。該疊氮化物無需純化即用於下一步驟。步驟 d.
Figure 02_image1903
來自前一步驟之疊氮化物(0.67 g，1.04 mmol)在1個大氣壓之氫氣下在Lindlar催化劑(300 mg)存在下在甲醇(20 mL)中經攪拌持續12小時。該混合物經矽藻土過濾且濃縮以提供呈澄清油狀物之標題化合物。該胺無需純化即用於下一步驟。產量0.37 g，54%產率，3個步驟。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 616.2。步驟 e.
Figure 02_image1905
EDC (150 mg，0.78 mmol)添加至來自前一步驟之胺(370 mg，0.60 mmol)、炔丙基-peg4-甲酸(188 mg，0.72 mmol)及三乙胺(0.100 mL，0.72 mmoL)溶解於DMF (4 mL)中之攪拌溶液中。該反應在環境溫度下經攪拌持續2小時，接著直接地藉由RPLC (10%-95%乙腈/水，無修飾劑，30分鐘梯度)經純化。彙集純溶離份且凍乾且直接地用於下一步驟。產量490 mg，80%。藉由LC/MS發現之離子：[M+H]+ = 858.2步驟 f.
Figure 02_image1907
前一步驟之產物(490 mg，0.57 mmol)在TFA (4 mL)中經攪拌持續45分鐘，接著濃縮且在旋轉蒸發儀上與甲醇共沸(3次)。藉由LC/MS發現之離子：[M+H]+ = 658.2。殘餘物在含有LiOH (43 mg，1.8 mmol)之1/1甲醇/水中經攪拌持續30分鐘。該反應用數滴冰乙酸中和且體積在旋轉蒸發儀上減半。粗產物藉由半製備型HPLC (0%-75%乙腈/水，0.1% TFA，30分鐘梯度)經純化。彙集純溶離份且凍乾以提供標題化合物。產量105 mg，29%產率，3個步驟。藉由LC/MS發現之離子：[M+H]+ = 618.2。實例 119. 合成 Int-68
Figure 02_image1909
步驟 a.
Figure 02_image1911
氯甲酸對硝基苯酯(0.23 g，1.14 mmol)添加至一級醇(0.47 g，0.76 mmol 描述於實例118中)及三乙胺(0.21 mL，1.52 mmol)溶解於DCM (15 mL，無水)中之攪拌混合物中。該反應經攪拌持續1小時，接著添加額外三甲胺(0.21 mL)及氯甲酸對硝基苯酯(230 mg)，且再繼續攪拌1小時，此時該混合物用水稀釋，且經萃取至DCM中(3次)。經組合之有機萃取物用鹽水洗滌且經硫酸鈉乾燥。藉由旋轉蒸發移除溶劑。粗殘餘物溶解於DCM (3 mL)中，經裝載於矽藻土上且藉由矽膠層析法(0%至70%乙酸乙酯/己烷，30分鐘梯度)經純化。彙集純溶離份且濃縮以提供呈白色固體狀之標題化合物。產量525 mg，88%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 782.2。步驟 b.
Figure 02_image1913
三乙胺(0.14 mL，0.97 mmol)添加至炔丙基-peg4-胺(181 mg，0.78 mmol)於1 mL乙腈中之攪拌溶液中。該三乙胺/炔丙基-peg4-胺混合物添加至前一步驟之產物(510 mg，0.65 mmol，於2 mL乙腈)中且經攪拌持續1小時，此時所有起始材料均已經消耗。在旋轉蒸發儀上移除溶劑。粗殘餘物藉由RPLC (20-95%乙腈/水，30 min梯度，無修飾劑)經純化。產量475 mg，83%。藉由LC/MS發現之離子：[M+H]+ = 874.2。步驟 c.
Figure 02_image1915
前一步驟之產物(475 mg，0.54 mmol)在TFA (5 mL)中經攪拌持續2小時且接著濃縮且在旋轉蒸發儀上與甲醇共沸(3次)。藉由LC/MS發現之離子：[M+H]+ = 674.2。殘餘物在含有LiOH (49 mg，1.6 mmol)之1/1甲醇/水混合物中經攪拌持續30分鐘。該反應用冰乙酸中和且接著藉由旋轉蒸發經濃縮。產物藉由半製備型HPLC (0%-75%乙腈/水，0.1% TFA，30分鐘梯度)經純化。彙集純溶離份且凍乾。產量204 mg，59%。藉由LCMS發現之離子：[M+H]+ = 634.2。實例 120 合成 Int-77
Figure 02_image1917
步驟 a.
Figure 02_image1919
HATU (0.44 g，1.16 mmol，於1.5 mL DMF中)逐滴添加至炔丙基-peg4-胺(0.24 g，1.05 mmol)、雙-Boc-D-鳥胺酸(0.35 g，1.05 mmol)及三乙胺(0.59 mL，4.21 mmol)於DMF (2 mL)中之攪拌溶液中。該反應在環境溫度下經攪拌持續1小時，接著直接地藉由RPLC (5%-90%乙腈/水，0.1% TFA，35分鐘梯度)經純化。彙集純溶離份且凍乾以提供呈黏性澄清油狀物之產物。藉由LC/MS發現之離子：[M+H]+ = 546.2
該經Boc保護之中間物在環境溫度下在二噁烷(10 mL)中之4N HCL中經攪拌持續45分鐘。藉由旋轉蒸發移除溶劑，接著所得殘餘物溶解於DI水(20 mL)中，經冷凍，且凍乾以提供呈澄清油狀物之產物。產量310 mg，70%產率，2個步驟。藉由LCMS發現之離子：[M+H]+ = 346.2步驟 b .
Figure 02_image1921
乙腈(2 mL)中之前一步驟之產物(96 mg，0.28 mmol)及三乙胺(0.15 mL，1.11 mmol)添加至紮那米韋之碳酸對硝基苯酯(435 mg，0.56 mmol，描述於實例118中，於6 mL乙腈中)之攪拌溶液中，且在環境溫度下經攪拌持續12小時，接著在80℃下經攪拌持續2小時。移除溶劑且粗殘餘物藉由RPLC (10-95%乙腈/水，無修飾劑，35分鐘梯度)經純化。彙集純溶離份且在旋轉蒸發儀上經濃縮。藉由LC/MS發現之離子：[(M+2H)/2]+ = 815.8
此中間物在TFA (5 mL)中經攪拌持續45分鐘，接著濃縮且在高真空下乾燥。藉由LCMS發現之離子，[(M+2H)/2]+ = 615.8。
此TFA鹽在0℃下在含有LiOH (27 mg，1.11 mmol)之(1/1) MeOH/DI水(5 mL)中經攪拌持續30分鐘。該混合物用冰乙酸酸化(約pH~5)。藉由旋轉蒸發移除甲醇且所得殘餘物藉由半製備型HPLC (5%-70%乙腈/水，0.1% TFA，35分鐘梯度)經純化。彙集純溶離份且凍乾。產量35 mg，11%產率，3個步驟。藉由LC/MS發現之離子：[(M+2H)/2]+ = 575.8。實例 121. 合成 Int-78
Figure 02_image1923
步驟 a.
Figure 02_image1925
炔丙基-Peg4-酸(640 mg，2.46 mmol)、二醇-HCl鹽(350 mg，2.46 mmol)、EDC (471 mg，2.46 mmol)、HOBt (377 mg，2.46 mmol)及三乙胺(249 mg，2.46 mmol)在環境溫度下在DMF (3 mL)中經攪拌持續4小時。該混合物直接地藉由RPLC (0%-80%乙腈/水，無修飾劑，35分鐘梯度)經純化。彙集純溶離份且濃縮以提供呈澄清油狀物之產物。產量580 mg，68%。藉由LCMS發現之離子：[M+H]+ = 348.4。步驟 b.
Figure 02_image1927
氯甲酸對硝基苯酯(1.23 g，1.25 mmol)添加至前一步驟之產物(530 mg，6.10 mmol)及三乙胺(925 mg，9.15 mmol)於DCM (25 mL)中之攪拌溶液中，接著在氮氣氛圍下冷卻至0℃。該混合物在0℃下經攪拌持續15分鐘且接著在室溫下經攪拌持續2小時。該反應用DI水稀釋且經萃取至DCM (3 × 20 mL)中。經組合之有機萃取物用鹽水洗滌且經硫酸鈉乾燥。粗殘餘物藉由矽膠層析法(10%-100%乙酸乙酯/己烷，25分鐘梯度)經純化以提供呈白色固體狀之產物。產量250 mg，24%。藉由LCMS發現之離子：[M+H]+ = 678.2。步驟 c.
Figure 02_image1929
乙腈(2 mL)中之經胺官能化之紮那米韋(505 mg，0.82 mmol，描述於實例118中)及三乙胺(0.15 mL，1.11 mmol)添加至前一步驟之產物(220 mg，0.37 mmol)於乙腈(10 mL)中之攪拌溶液中，且在環境溫度下經攪拌持續4小時。該反應在旋轉蒸發儀上經濃縮。所得殘餘物藉由RPLC (15%-95%乙腈/水，無修飾劑，35分鐘梯度)經純化。彙集純溶離份且在旋轉蒸發儀上經濃縮。藉由LC/MS發現之離子：[(M+2H)/2]+ = 815.2。
此中間物在TFA (5 mL)中經攪拌持續45分鐘，接著濃縮且在高真空下乾燥。藉由LC/MS發現之離子：[(M+2H)/2]+ = 615.2。
所得TFA鹽在0℃下在含有LiOH (71 mg，2.98 mmol)之(1/1) MeOH/DI水(5 mL)中經攪拌持續30分鐘。該混合物用冰乙酸酸化(約pH~5)。甲醇藉由旋轉蒸發儀經移除且藉由半製備型HPLC (5%-70%乙腈/水，0.1% TFA，35分鐘梯度)經純化。彙集純溶離份且凍乾。產量125 mg，29%，3個步驟。藉由LC/MS發現之離子：[(M+2H)/2]+ = 575.8。實例 122. 合成 Int-4a
Figure 02_image1931
步驟 a.
Figure 02_image1933
炔丙基-Peg 4-胺(165 mg，0.71 mmol)添加至紮那米韋之碳酸對硝基苯酯(350 mg，0.47 mmol，描述於實例109中)於乙腈(20 mL)中之攪拌溶液中。該反應在環境溫度下經攪拌持續1小時，接著藉由旋轉蒸發移除溶劑。該殘餘物藉由RPLC (10%-95%乙腈/水，無修飾劑，30分鐘梯度)經純化。彙集純溶離份且凍乾以提供呈白色固體狀之經boc保護中間物。藉由LCMS發現之離子：[M+H]+ = 830.2。
此中間物在環境溫度下在TFA (5 mL)中經攪拌持續30分鐘。藉由旋轉蒸發儀移除溶劑且殘餘物藉由RPLC (10%-95%乙腈/水，0.1% TFA，35分鐘梯度)經純化。彙集純溶離份且凍乾以提供呈白色固體狀之產物。產量155 mg，52%產率，2個步驟。藉由LCMS發現之離子：[M+H]+ = 630.2。步驟 b.
Figure 02_image1935
前一步驟之產物(140 mg，0.22 mmol)在0℃下在含有LiOH (21 mg，0.89 mmol)之1:3 甲醇:水混合物(8 mL)中經攪拌持續20分鐘。該混合物用數滴冰乙酸酸化且在旋轉蒸發儀上濃縮。粗材料藉由半製備型HPLC (5%-95%乙腈/水，0.1% TFA，30分鐘梯度)經純化。彙集純溶離份且凍乾以提供呈白色固體狀之產物。產量60 mg，45%。藉由LCMS發現之離子：[M+H]+ = 590.2。
1 H NMR (500 MHz, 甲醇-d 4 ) δ 5.86 (d,J = 2.6 Hz, 1H), 4.99 (dd,J = 9.0, 2.7 Hz, 1H), 4.55 (dd,J = 9.7, 2.7 Hz, 1H), 4.38 (dd,J = 8.6, 2.6 Hz, 1H), 4.24 – 4.14 (m, 1H), 4.19 (d, J=2.6 Hz, 2H), 4.02-3.98 (m, 1H), 3.74 – 3.59 (m, 13H), 3.54 (t,J = 5.6 Hz, 2H), 3.52-3.48 (m, 1H), 3.29-3.22 (m, 2H), 2.84 (t,J = 2.4 Hz, 1H), 1.96 (s, 3H)。
13 C NMR (126 MHz, MeOD) δ 172.33, 163.68, 157.54, 156.58, 106.80, 79.23, 75.91, 74.56, 70.18, 70.13, 69.96, 69.87, 69.59, 69.51, 69.14, 68.74, 62.98, 57.67, 51.11, 40.54, 21.37。實例 123. 合成 Int-4b
Figure 02_image1937
經Peg官能化之中間物(100 mg，0.13 mmol，描述於實例122中)在環境溫度下在含有LiOH (12 mg，0.52 mmol)之1:3 甲醇:水混合物(5 mL)中經攪拌持續2小時。該混合物用冰乙酸酸化且藉由旋轉蒸發經濃縮。粗材料藉由RPLC (DI水中之5-95%乙腈，0.1% TFA, 30分鐘梯度)經純化。彙集純溶離份且凍乾以提供呈白色固體狀之產物。產量21 mg，31%。藉由LCMS發現之離子：[M+H]+ = 590.2。
1 H NMR (甲醇-d 4 ) δ: 5.86 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 4.48 (dd, J = 8.6, 2.7 Hz, 1H), 4.42 (dd, J = 9.6, 1.4 Hz, 1H), 4.38 (d, J=12 Hz, 1H), 4.22 – 4.19 (m, 1H), 4.19 (d, J =2.4 Hz, 2H), 4.16-4.12 (dd, J = 11.5, 6 Hz, 1H), 4.09 – 4.02 (m, 1H), 3.75 – 3.58 (m, 13H), 3.55 (t, J = 5.5 Hz, 2H), 3.33-3.29 (m, 2H), 2.84 (t, J = 2.4 Hz, 1H), 2.02 (s, 3H)。
13 C NMR (126 MHz, MeOD) δ 172.94, 163.82, 157.90, 157.53, 106.80, 79.23, 76.18, 74.55, 70.19, 70.13, 69.96, 69.90, 69.61, 68.96, 68.74, 68.17, 66.69, 57.67, 50.11, 40.43, 21.33。實例 124. 用於合成疊氮基 Fc 之一般程序
製備DMF/PBS中之PEG4-疊氮基NHS酯溶液(0.050 M)：16.75 mg PEG4-疊氮基NHS酯在0℃下溶解於0.100 mL DMF中且在0℃下藉由添加PBS 1x緩衝液經稀釋至0.837 mL。使用此溶液，藉由調節此PEG4-疊氮基NHS酯PBS溶液之當量數來製備具有多種DAR值之其他PEG4-疊氮基Fc。
編碼本文所述任何結合物之Fc的核酸構築體可包括編碼包括C末端離胺酸殘基及/或N末端鼠類IgG信號序列之Fc之胺基酸序列(例如，SEQ ID NO：48-53中任一者)的核酸。表現後，結合物之Fc之C末端離胺酸及N末端鼠類IgG信號序列經蛋白水解裂解，由此產生具有缺少Lys447(例如，缺少C末端離胺酸殘基)及N末端鼠類IgG信號序列之序列的Fc。C末端離胺酸之存在或不存在不改變Fc或相應結合物之性質。
預處理h-lgG1 Fc，SEQ ID NO: 48 (107.2 mg於8.800 mL pH 7.4 PBS中，MW~57891 Da，1.852 μmol)：該Fc溶液經轉移至四個離心濃縮機(30,000 MWCO，15 mL)中且用PBS x1緩衝液稀釋至15 mL且經濃縮至約1.5 mL之體積。殘餘物1:10稀釋於PBS pH 7.4中，且再次經濃縮。重複此洗滌程序，共計四次，隨後稀釋至8.80 mL。
製備PEG4-疊氮基Fc：0.050M PEG4-疊氮基NHS酯PBS緩衝溶液(0.593 mL，29.6 μmol，16當量)添加至上述h-IgG1 Fc (SEQ ID NO: 48)溶液中且該混合物在環境溫度下經震盪旋轉持續2小時。該溶液藉由使用四個離心濃縮機(30,000 MWCO，15 mL) 經濃縮至約1.5 mL之體積。粗混合物1:10稀釋於PBS pH 7.4中，且再次經濃縮。重複此洗滌程序，共計三次。經濃縮Fc-PEG4-疊氮化物用pH 7.4 PBS緩衝液稀釋至8.80 mL且準備用於點擊結合。經純化材料使用NANODROP™ UV可見光光譜儀(使用基於h-IgG1之胺基酸序列計算的消光係數)經定量。產率係在純化之後定量的。實例 125. 合成結合物 34
經疊氮基官能化之Fc (40 mg，2.5 mL，0.69 µmol，描述於疊氮基Fc之一般製備中，實例124，SEQ ID No. 18)之溶液添加至含有炔衍生之小分子(6.0 mg，8.23 µmol，Int-67實例118)之15 mL離心管中。在輕柔地攪拌以溶解所有固體之後，向該混合物中添加L-抗壞血酸鈉鹽(54 mg，0.27 mmol)、硫酸銅(II) (0.88 mg，5.5 µmol)及BTTA (9.4 mg，22 µmol)於PBS 7.4緩衝液(1.09 mL)中之溶液。所得混合物輕柔地經旋轉隔夜。其接著相繼藉由在蛋白A管柱上之親和層析法、尺寸排阻層析法(參見一般結合物純化方案)經純化。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出64,678 Da之平均質量(DAR = 7.2)。產量24 mg，54%產率。實例 126. 合成結合物 35
經疊氮基官能化之Fc (40 mg，2.5 mL，0.69 µmol，描述於疊氮基Fc之一般製備中，實例124，SEQ ID No. 18)之溶液添加至含有炔衍生之小分子(6.1 mg，8.23 µmol，Int-68 實例119)之15 mL離心管中。在輕柔地攪拌以溶解所有固體之後，向該混合物中添加L-抗壞血酸鈉鹽(54 mg，0.27 mmol)、硫酸銅(II) (0.88 mg，5.5 µmol)及BTTA (9.4 mg，22 µmol)於PBS 7.4緩衝液(1.09 mL)中之溶液。所得溶液輕柔地經旋轉隔夜。其接著相繼藉由在蛋白A管柱上之親和層析法、尺寸排阻層析法(參見一般結合物純化方案)經純化。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出64,830 Da之平均質量(DAR = 7.3)。產量23 mg，52%產率。實例 127. 合成結合物 36
經疊氮基官能化之Fc (50 mg，2.5 mL，0.86 µmol，描述於疊氮基Fc之一般製備中，實例124，SEQ ID No. 18)之溶液添加至含有炔衍生之小分子(7.1 mg，5.2 µmol，Int-77，實例120)之15 mL離心管中。在輕柔地攪拌以溶解所有固體之後，向該混合物中添加L-抗壞血酸鈉鹽(68 mg，0.34 mmol)、硫酸銅(II) (1.1 mg，6.9 µmol)及BTTA (12 mg，27 µmol)於PBS 7.4緩衝液(1.37 mL)中之溶液。所得混合物輕柔地經旋轉隔夜。其接著相繼藉由在蛋白A管柱上之親和層析法、尺寸排阻層析法(參見一般結合物純化方案)經純化。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出63,300 Da之平均質量(DAR = 3.6)。產量37 mg，73%產率。實例 128. 合成結合物 37
經疊氮基官能化之Fc (70 mg，2.5 mL，1.2 µmol，描述於疊氮基Fc之一般製備中，實例124，SEQ ID No. 18)之溶液添加至含有炔衍生之小分子(13.3 mg，9.6 µmol，Int 78，實例121)之15 mL離心管中。在輕柔地攪拌以溶解所有固體之後，向該混合物中添加L-抗壞血酸鈉鹽(96 mg，0.48 mmol)、硫酸銅(II) (1.6 mg，10 µmol)及BTTA (17 mg，38 µmol)於PBS 7.4緩衝液(1.92 mL)中之溶液。所得混合物輕柔地震盪隔夜。其接著相繼藉由在蛋白A管柱上之親和層析法、尺寸排阻層析法(參見一般結合物純化方案)經純化。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出63,574 Da之平均質量(DAR = 3.6)。產量42 mg，61%產率。實例 129. 合成結合物 33
製備點擊試劑溶液：PBS緩衝溶液中之0.0050M CuSO4 ：10.0 mg CuSO4 溶解於12.53 mL PBS中，接著採用5.00 mL此CuSO4 溶液且添加43.1 mg BTTAA (CAS編號1334179-85-9)及247.5 mg抗壞血酸鈉以生成點擊試劑溶液(0.0050M CuSO4、0.020M BTTAA及0.25M抗壞血酸鈉)。
向15 mL離心管中之經疊氮基官能化之Fc (104.9 mg，8.60 mL，18.1 µmol；實例124，SEQ ID NO: 73)之溶液中添加炔衍生之小分子(29.7 mg，19.9 μmol，描述於實例100中，Fc上2.5當量各疊氮基)。在輕柔地攪拌以溶解所有固體之後，該混合物用點擊試劑溶液(4.34 mL) (L-抗壞血酸鈉，0.25 M，1086 μmol，硫酸銅(II) 0.0050M，21.7 μmol，及BTTAA 0.020M，86.9 μmol)處理。所得混合物在環境溫度下輕柔地經旋轉持續6小時。其相繼藉由在蛋白A管柱上之親和層析法、尺寸排阻層析法(參見一般結合物純化方案)經純化。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出64550 Da之平均質量(DAR = 4.6)。產量90.7 mg，具有98%純度。所得之結合物在圖61中示出。
編碼結合物33之Fc之核酸構築體包含編碼SEQ ID NO：64之胺基酸序列的核酸，該胺基酸序列包含C末端離胺酸殘基。表現後，結合物33之Fc之C末端離胺酸經蛋白水解裂解，由此產生具有SEQ ID NO：73之序列的Fc。C末端離胺酸之存在或不存在不改變Fc或相應結合物之性質。實例 130. 結合物 33 在致死性小鼠模型中針對流感 B/Brisbane/60/2008 之功效
在雌性BALB/c小鼠(Jackson Laboratories，6-8週齡)中針對致死性流感B流感感染評估測試物品。攻擊病毒(B/Brisbane/60/2008)係能夠在小鼠中引起致死性感染之小鼠適應性分離株。該實驗包含10組，每組5隻小鼠。在第0天，所有小鼠均在經異氟烷麻醉之後藉由鼻內接種經50 µl體積(每隻小鼠大約1E5個病毒)之病毒(3x LD95)攻擊。
所有組均在病毒攻擊後兩小時接受結合物33 (實例129)、媒劑(PBS)或單獨Fc對照物(hIgG1 Fc)之單一IV治療。另一組在病毒攻擊之後8小時開始用奧司他韋(20 mg/kg，bid，持續5天)經口治療。
該研究評估結合物33之7種不同劑量濃度(10、3、1、0.3、0.1、0.03及0.01 mg/kg)。監測小鼠持續2週且超過20%體重減輕或被發現垂死之動物經評為死亡。亦記錄體重以監測該等動物之一般健康狀況。
如所預期，經媒劑或單獨Fc對照物治療之所有小鼠截至第8天均達到死亡。相比之下，接受結合物33之所有小鼠在接受自10降至0.3 mg/kg之單一IV劑量之後在該研究之持續時間內完全經保護(表48)。相比之下，經奧司他韋治療之組僅引起40%存活率，儘管此等小鼠在該實驗的過程中所接受之累積劑量為200 mg/kg。結合物33之效能進一步藉由每天體重量測值(表49；僅示出組內之第一例死亡之前的數據)支持。經0.3 mg/kg之結合物33治療的小鼠僅證明一天達到7%最大值之短暫體重減輕。總之，此研究證明瞭結合物33之效能，如藉由指示針對Yamagata譜系之流感病毒株的流感B感染之兩個參數(存活率及體重)所量測。 表48：存活率%
感染後天數 PBS Fc 結合物33 奧司他韋
      (10 mg/kg) (10至0.3 mg/kg) (0.1 mg/kg) (0.03 mg/kg) (0.01 mg/kg)   
0 100 100 100 100 100 100 100
1 100 100 100 100 100 100 100
2 100 100 100 100 100 100 100
3 100 100 100 100 100 100 100
4 60 100 100 100 100 100 100
5 40 40 100 100 60 80 40
6 0 0 100 60 60 40 0
7 0 0 100 60 60 0 0
8 0 0 100 60 60 0 0
9 0 0 100 60 60 0 0
10 0 0 100 60 60 0 0
11 0 0 100 60 60 0 0
12 0 0 100 60 60 0 0
13 0 0 100 60 60 0 0
14 0 0 100 60 60 0 0
表49：體重(gm)
感染後 天數 PBS Fc 結合物33 奧司他韋
      (10 mg/kg) (10 mg/kg) (3 mg/kg) (1 mg/kg) (0.3 mg/kg) (0.1 mg/kg) (0.03 mg/kg) (0.01 mg/kg)   
0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
1 99 101 103 98 98 98 98 99 98 98
2 95 97 100 99 97 101 97 97 97 97
3 87 90 101 98 96 97 93 95 92 89
4 82 84 104 99 99 97 93 93 88 85
5 78 79 102 99 99 97 92    84 79
6       98 96 98 93       79   
7       102 98 100 96            
8       101 98 98 97            
9       104 101 102 101            
10       103 100 101 101            
11       104 102 101 101            
12       104 101 102 102            
13       103 102 102 102            
14       103 102 102 101            
實例 131. 區域異構體之表徵
單體及二聚體中間物可呈特定區域異構體或區域異構體之混合物形式產生。實例100-102顯示如何製備Int-7區域異構體(C7-C7，實例100；C7-C9，實例101；C9-C9，實例102；C7-C7最佳化，實例103)。其中所述之方法可用於分離本文所述之任何中間物的區域異構體之混合物。表50提供先前所述之預結合中間物合成中之C7及C9連接單體及C7-C7、C7-C9及C9-C9連接二聚體之相對百分比(%)量的表徵。 表50：區域異構體分析
Int 實例 單體(M) 或二聚體(D) %C7 %C7-C9 %C9
Int-2 實例6 D 95 5   
Int-3 實例11 D 70 30   
Int-4 實例13 M 58    42
Int-4a 實例122 M       97
Int-7 實例19 D 3 2 95
Int-7a 實例100 D 100      
Int-7b 實例101 D 5 95   
Int-7c 實例102 D       100
Int-25 N/A D    5 95
Int-26 N/A D 25 50 25
Int-27 N/A D 29 35 36
Int-28 N/A D 5 28 67
Int-31 N/A D 90      
Int-34 N/A D 12 6 82
Int-37 N/A M       95
Int-71 實例110 D 3 97   
Int-72 實例112 D    100   
實例 132. 經皮下給予之結合物 33 在致死性小鼠模型中針對流感 A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) 之功效
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8週)中針對致死性IAV H1N1流感感染評估結合物33。攻擊病毒(A/Puerto Rico/8/1934)係能夠在小鼠中引起致死性感染之小鼠適應性分離株。該實驗包含6組，每組5隻小鼠。在第0天，所有小鼠均在經氯胺酮/甲苯噻嗪之混合物(分別為150及10 mg/kg)麻醉之後藉由鼻內接種經30 µl體積之病毒(3x LD95 )攻擊。每天記錄死亡率及體重且具有20%體重減輕之任何動物均評為死亡。
測試組在病毒攻擊後2小時接受結合物33、hIgG1 Fc對照物或媒劑(PBS)之單一皮下(SC)治療。研究設計概述於表51中。 表51：針對流感A/PR/8/34 (H1N1)研究之研究設計
組 測試物品 途徑/ 時程 劑量(mg/kg) 劑量體積(ml/kg) 小鼠數
1 媒劑 SC，T+2 h。 na 10 5
2 hIgG1 Fc SC，T+2 h。 1 10 5
3 結合物33 SC，T+2 h。 1 10 5
4 結合物33 SC，T+2 h。 0.3 10 5
5 結合物33 SC，T+2 h。 0.1 10 5
6 結合物33 SC，T+2 h。 0.03 10 5
如所預期，接受媒劑或hIgG1 Fc對照物之小鼠在第6-7天死於感染(表52)。然而，經結合物33治療之小鼠在1、0.3及0.1 mg/kg劑量水準下完全經保護。使用結合物33時之死亡率僅在最低劑量濃度0.03 mg/kg下可見。 表52：截至研究日之存活率百分比(n=5)
感染後天數 媒劑 hIgG1 Fc 結合物33
      (1.0 mg/kg) (1.0 mg/kg) (0.3 mg/kg) (0.1 mg/kg) (0.03 mg/kg)
0 100 100 100 100 100 100
1 100 100 100 100 100 100
2 100 100 100 100 100 100
3 100 100 100 100 100 100
4 100 100 100 100 100 100
5 100 100 100 100 100 100
6 40 60 100 100 100 100
7 0 0 100 100 100 60
8 0 0 100 100 100 0
9 0 0 100 100 100 0
10 0 0 100 100 100 0
11 0 0 100 100 100 0
12 0 0 100 100 100 0
13 0 0 100 100 100 0
14 0 0 100 100 100 0
結合物33之效能進一步藉由每天體重量測值支持。如所預期，經媒劑或hIgG1 Fc治療之小鼠證明體重平穩下降，直至其超過20%，此時其經評為死亡(表53)。
與對照小鼠形成對比，接受1、0.3及0.1 mg/kg之結合物33之彼等組在該研究中維持健康體重且僅證明少於8%之短暫體重下降(0.1 mk/kg劑量組，第8天；表53)。結合物33之存活率及體重量測值均證明使用低至0.1 mg/kg之單一SC劑量時的穩固保護以抵禦流感A/Puerto Rico/8/1934之致死性攻擊。 表53：體重數據(gm)
感染後天數 媒劑 hIgG1 Fc 結合物33
      (1.0 mg/kg) (1.0 mg/kg) (0.3 mg/kg) (0.1 mg/kg) (0.03 mg/kg)  
0 100 100 100 100 100 100  
1 98.1 97.6 98 98.6 98.7 98.5  
2 100.9 99 100.3 101.3 101.6 99.9  
3 94.1 92.6 98.4 100.5 96.5 93.9  
4 86 85.7 102.6 99.2 93.5 88.6  
5 79.8 79.1 98.2 97.7 94.9 86.5  
6 75.3 75.2 102.2 102.3 99.4 84.6  
7       103.5 102.9 95.2 78.4  
8       101.8 103.2 92.4     
9       101.2 102.9 95.4     
10       101.3 102.5 98.8     
11       102.8 102.6 98.7     
12       102.4 100.7 98.6     
13       102.2 101.1 98.3     
14       100.2 102 99.6     
實例 133. 結合物 33 針對 A/PR/8/1934 (H1N1) 之功效、肺 PFU 負荷及細胞因子水準
在鼻內經3E2 PFU/小鼠(3x LD95 )之小鼠適應性流感A/PR /8/1934 (H1N1)攻擊之6-8週雌性BALB/c小鼠(Charles River)中進行結合物33之功效研究。結合物33或人類IgG1 Fc對照物在攻擊後2 h以0.1 – 3 mg/kg之單一皮下(SC)劑量經投與。奧司他韋經口給藥，每天兩次，持續4天，在感染後2 h以5或50 mg/kg開始。巴洛沙韋再懸浮於0.5%甲基纖維素中且經口給藥，每天兩次，持續4天，在感染後2 h以30 mg/kg開始(表54)。記錄體重(BW)持續4天(圖62A-62B)。在感染後4天，藉由CO2 處死小鼠且收集肺葉。肺使用MagNALyser (Roche)用1 mL PBS中之1 mm矽珠均質化。在6,000 rpm下進行均質化持續60 s且在運行之間在冰上冷凍持續5 min。在肺均質化之後，管在600 x g下經離心持續10 min且上清液經轉移至新管中。 表54：研究設計
測試物品(DAR) 途徑/時程 劑量[mg/kg]
        
hIgG1 Fc IV，T+2 h 3
奧司他韋 PO，BID × 4 5
奧司他韋 PO，BID × 4 50
巴洛沙韋 SC，BID × 4 30
結合物33 (4.7) SC，T+2 h 0.1
結合物33 (4.7) SC，T+2 h 0.3
結合物33 (4.7) SC，T+2 h 1
結合物33 (4.7) SC，T+2 h 3
未受感染 N/A N/A
關於PFU測定，肺均質液之上清液在感染緩衝液中經稀釋，介於10-1 至10-6 範圍內。100 μL病毒稀釋液添加至24孔板中之MDCK細胞之匯合單層中且在室溫下經培育持續1 h，其中每15 min搖動。在移除病毒之後，含有Avicel之液體覆蓋培養基添加至MDCK細胞中。細胞在37℃、5% CO2 下經培育持續40 h。在培育之後，移除培養基且細胞用結晶紫染色以對斑塊計數且相對於肺重量計算斑塊形成單位(PFU) (PFU/g肺)。
關於細胞因子分析，肺均質液之上清液連續2倍稀釋於96孔板中。INF-γ、TNF-α、IL-6、MIP-1α及MCP-1之細胞因子水準藉由ELISA根據製造商之說明書(R&D Systems)測定。在小鼠模型中用流感進行致死性攻擊之後，在感染後第4天測定肺PFU負荷(圖63A-63B)及肺細胞因子水準(分別地，表55及表56)。結合物33證明瞭病毒負荷之劑量依賴性log減少，在0.1 mg/kg下為0.7，在0.3 mg/kg下為1.88，在1 mg/kg下為3且在3 mg/kg下為3.8。5 mg/kg及50 mg/kg之奧司他韋對病毒負荷具有適度影響，分別導致0.86及2 log減少。巴洛沙韋減少病毒負荷至低於偵測極限1e2 PFU/mL，由此如與PBS對照物相比減少病毒負荷達＞ 5.99 log。
如所預期，在陰性對照物PBS與hIgG1 Fc之間未觀察到生物相關差異。
結合物33在小鼠模型中在經流感A攻擊之感染後第4天以劑量依賴性方式減少病毒負荷(表55，圖64A-64B)。同樣，結合物33在小鼠模型中在經流感A攻擊之感染後第4天證明與未受感染對照物相比，TNF-α、IL-6、INF-γ、MCP-1及MIP-1α (分別地，圖65A-65E)之細胞因子水準的劑量依賴性倍數減少(表56)。 表55：PFU負荷
測試物品[mg/kg] PFU/g Log 減少
PBS [0]PBS 3.26E+07 0.0
hIgG1 Fc [3] 1.74E+07 0.364
奧司他韋[5] 4.78E+06 0.86
奧司他韋[50] 3.81E+05 2
巴洛沙韋[30] ＜1.00E+02* ＞5.99*
結合物33[0.1] 6.85E+06 0.715
結合物33 [0.3] 5.31E+05 1.88
結合物33 [1] 3.69E+04 2.99
結合物33 [3] 5.84E+03 3.77
* 巴洛沙韋減少病毒負荷至低於偵測極限。 表56：肺細胞因子水準
測試物品[mg/kg] INF-γ TNF-α IL-6 MCP-1 MIP-1α
PBS [0] 1.6 1.4 4.2 38.6 18.1
hIgG1 Fc [3] 1.7 1.2 3.3 36.3 15.9
奧司他韋[5] 1.0 0.8 1.8 24.0 6.3
奧司他韋[50] 0.8 0.8 1.4 16.2 4.0
巴洛沙韋[30] 1.2 1.0 1.0 1.0 0.8
結合物33 [0.1] 1.1 0.7 0.8 19.1 5.6
結合物33 [0.3] 1.1 0.9 0.8 9.6 3.9
結合物33 [1] 0.9 0.7 1.1 5.7 1.7
結合物33 [3] 0.8 0.7 1.1 1.8 1.0
未受感染 1 1 1 1 1
結合物33之最高測試濃度3 mg/kg證明瞭在感染過程中無重量減輕，與未受感染對照小鼠相似(表57)。 表57：體重數據(%減少)
測試物品[mg/kg] 第0 天 第1 天 第2 天 第3 天 第4 天
PBS [0] 0 -3.5 -2.86 -10.96 -17.32
hIgG1 Fc [3] 0 -2.6 -1.3 -9.58 -15.6
奧司他韋[5] 0 -2.86 -2.42 -8.16 -13.88
奧司他韋[50] 0 -3.78 -2.12 -3.22 -5.74
巴洛沙韋[30] 0 -2.38 -2.82 -2.6 -0.18
結合物33 [0.1] 0 -3.24 -2.32 -10.12 -11.46
結合物33 [0.3] 0 -2.16 1.34 -3.4 -4.36
結合物33 [1] 0 -1.5 -0.9 -1.98 -0.9
結合物33 [3] 0 -1.7 -1.6 -1.9 0.52
未受感染 0 1.02 -0.14 -0.16 2.8
實例 134. 結合物 33 在致死性嚴重複合型免疫缺乏 (SCID) 小鼠模型中針對流感 A (H1N1) 之功效
在雌性BALB/c scid小鼠(Jackson Laboratories，6-8週齡)中針對致死性流感A流感感染評估測試物品。攻擊病毒(A/Puerto Rico/8/1934)係能夠在小鼠中引起致死性感染之小鼠適應性分離株。該實驗包含11組，每組5隻小鼠。在第0天，所有小鼠均在經氯胺酮/甲苯噻嗪之混合物(分別為150及10 mg/kg)麻醉之後藉由鼻內接種經30 µl (大約每隻小鼠1E3個病毒)體積之病毒(3x LD95)攻擊。
各組在病毒攻擊後兩小時接受媒劑(PBS)、hIgG1 Fc對照物或結合物33 (3、1、0.3、0.1、0.03 mg/kg)之單一SC治療。該研究之一個獨立研究組由3組經巴洛沙韋瑪波地爾(DC Chemicals, Shanghai, China)經口治療之小鼠組成，每天兩次，持續1天；亦在病毒攻擊後2小時開始。監測小鼠持續2週且超過20%體重減輕或被發現垂死之動物經評為死亡。
在研究結束時(第14天)，接受結合物33之小鼠在3與0.1 mg/kg之間的所有劑量濃度下均完全經保護(表58)。結合物33僅在最低測試濃度0.03 mg/kg下無法提供保護以抵禦致死性病毒攻擊。如所預期，接受媒劑或hIgG1 Fc之組未受到保護。經巴洛沙韋治療之小鼠亦受到保護，但在60及20 mg/kg之顯著較高累積劑量下，在6 mg/kg之總劑量下，僅40%小鼠存活至第14天。 表58：第14天之存活率%。
媒劑 hIgG1 Fc 巴洛沙韋 結合物33
(PBS) (3.0 mg/kg) (30 mg/kg) (10 mg/kg) (3.0 mg/kg) (3.0 mg/kg) (1.0 mg/kg) (0.3 mg/kg) (0.1 mg/kg) (0.03 mg/kg)
0 0 100 100 40 100 100 100 100 0
結合物33在此嚴重免疫缺乏模型中之效能基於體重亦為顯而易見的(表59)。基於死亡率讀數提供完全保護之結合物最低濃度為0.1 mg/kg。在此劑量水準下，該組之最大平均重量減輕為短暫的，且導致少於5%減少(發生於第2天)。此外，與未受感染小鼠相比，在1及3 mg/kg劑量水準下之組的體重差異在第14天顯示少於2%差異。
總之，此數據藉由用低至0.1 mg/kg之結合物之單一SC劑量保護經致死性攻擊之小鼠證明瞭結合物33之效能。此在完全缺乏清除流感感染所必需的T及B免疫細胞之小鼠的嚴重免疫缺乏模型中實現。此數據支持使用結合物33來治療免疫缺乏患者群體。 表59：截止日之%平均體重。(mg/kg)。僅示出組內之第一例死亡之前的數據。
Figure 02_image1939
實例 135. 經皮下給予之結合物 33 在致死性小鼠模型中針對流感 A/California/07/2009 (H1N1)pdm 之功效
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8週)中針對致死性IAV H1N1流感感染評估結合物33。攻擊病毒(A/California/07/2009 (H1N1)pdm)係能夠在小鼠中引起致死性感染之大流行分離株。該實驗包含6組，每組5隻小鼠。在第0天，所有小鼠均在經氯胺酮/甲苯噻嗪之混合物(分別為150及10 mg/kg)麻醉之後藉由鼻內接種經30 µl體積之病毒(3x LD95)攻擊。每天記錄死亡率及體重且具有20%體重減輕之任何動物均評為死亡。
測試組在病毒攻擊後2小時接受結合物33、hIgG1 Fc對照物或媒劑(PBS)之單一皮下(SC)治療。研究設計及劑量水準概述於表60中。 表60：針對流感A/California/07/2009 (H1N1)pdm研究之研究設計
組 測試物品 途徑/ 時程 劑量(mg/kg) 劑量體積(ml/kg) 小鼠數
1 媒劑 SC，T+2 h。 na 10 5
2 hIgG1 Fc SC，T+2 h。 1 10 5
3 結合物33 SC，T+2 h。 1 10 5
4 結合物33 SC，T+2 h。 0.3 10 5
5 結合物33 SC，T+2 h。 0.1 10 5
6 結合物33 SC，T+2 h。 0.03 10 5
如所預期，接受媒劑或hIgG1 Fc對照物之小鼠在第6-7天死於感染(表61)。然而，經結合物33治療之小鼠在1 mg/kg下完全經保護，且在0.3下幾乎如此(80%存活率)。使用結合物33時之顯著死亡率僅在較低劑量濃度0.1及0.03 mg/kg下可見。 表61：截止日之存活率百分比。(mg/kg)
天 媒劑 hIgG1 Fc 結合物33
      (1.0 mg/kg) (1.0 mg/kg) (0.3 mg/kg) (0.1 mg/kg) (0.03 mg/kg)
0 100 100 100 100 100 100
1 100 100 100 100 100 100
2 100 100 100 100 100 100
3 100 100 100 100 100 100
4 100 100 100 100 100 100
5 40 20 100 100 60 80
6 0 20 100 80 20 20
7 0 0 100 80 0 0
8 0 0 100 80 0 0
9 0 0 100 80 0 0
10 0 0 100 80 0 0
11 0 0 100 80 0 0
12 0 0 100 80 0 0
13 0 0 100 80 0 0
14 0 0 100 80 0 0
結合物33之效能進一步藉由每天體重量測值支持。如所預期，經媒劑或hIgG1 Fc治療之小鼠證明體重平穩下降，直至其超過20%，此時其經評為死亡(表62)。
與對照小鼠形成對比，接受1 mg/kg之結合物33之小鼠僅證明大約10%之短暫體重下降，在第3天達到峰值(表62)。結合物33之存活率及體重量測值均證明使用經SC投與之單一1 mg/kg劑量時的穩固保護以抵禦流感A/California/07/2009 (H1N1)pdm之致死性攻擊。針對此研究中所用之臨床相關大流行病毒株之活性支持結合物33在治療嚴重流感感染時的效用。 表62：截止日之%平均體重。(mg/kg)。僅示出組內之第一例死亡之前的數據。
感染後天數 媒劑 hIgG1 Fc 結合物33
      (1.0 mg/kg) (1.0 mg/kg) (0.3 mg/kg) (0.1 mg/kg) (0.03 mg/kg)
0 100 100 100 100 100 100
1 99.5 97.9 96.8 96.7 98 98.7
2 97.1 97.2 99.5 99.2 98 98.4
3 86.5 86.0 89.7 89.6 87.6 88.8
4 80.3 80.3 91.6 88.5 81.3 81.9
5 76.2 76.6 92.9 91.0 76.8 77.9
6       94.7 90.5      
7       94.2         
8       95.4         
9       98.0         
10       96.8         
11       98.8         
12       97.7         
13       100.1         
14       100.5         
實例 136. 經靜脈內 (IV) 給予之結合物 33 在延遲治療之致死性小鼠模型中針對流感 A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1) 之功效。
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8週)中針對致死性流感A (H1N1)感染評估結合物33。攻擊病毒(A/Puerto Rico/8/1934)係能夠在小鼠中引起致死性感染之小鼠適應性分離株。在第0天，所有小鼠均在經氯胺酮/甲苯噻嗪之混合物(分別為150及10 mg/kg)麻醉之後藉由鼻內接種經30 µl體積之病毒(3x LD95)攻擊。每天記錄死亡率及體重且具有20%體重減輕之任何動物均評為死亡。
研究設計詳述於表63中，且由多個研究組組成。對照研究組包含媒劑(PBS)及單獨hIgG1 Fc組，在病毒攻擊之後24小時給藥(未受感染組亦為此研究組之一部分)。第二研究組由以其人類化劑量之4倍給予之奧司他韋組成，其中治療之起始經延遲持續24、48或72小時。最後3個研究組由以10、3或1 mg/kg之單一IV劑量投與之結合物33組成；各研究組以與上述奧司他韋研究組相同的時程給藥。
如所預期，媒劑及hIgG1 Fc當在病毒攻擊之後24小時給予時不具保護性且截至第7天導致完全死亡。確定的是，當給藥經延遲24小時時，即使人類化劑量之4倍的奧司他韋(200 mg/kg累積劑量)亦僅為部分有效的(表64；40%存活率)。然而，結合物33在相同24小時給藥時程時在所有濃度(10、3及1 mg/kg)下均為完全保護性的。
當給藥經延遲達病毒攻擊之後完整48小時時，奧司他韋不再有效(0%存活率)，而結合物33在10及3 mg/kg下為80%保護性的。當給藥經延遲直至72小時時，僅10 mg/kg劑量之結合物33證明部分保護作用(40%)。結合物33之功效基於每天體重量測值亦為顯而易見的(表65)。這在T+24小時組中尤其顯著，其中針對任何結合物33組均觀察到少於3%減少，其為短暫的且發生於第1天。在此研究中，結合物33比用於流感之獲批治療奧司他韋更有效。 表63：研究設計
組 流感A 病毒株 測試物品 途徑，時程 第一劑量( 小時) 劑量(mg/kg) 劑量體積(ml/kg) N (balb/c)
1 A/PR/8/34 (H1N1) 3E2 PFU/小鼠 PBS IV，單一 T+24 --- 5 5
2 hIgG1 Fc IV，單一 T+24 10 5 5
3 奧司他韋 PO，bid × 5天 T+24 20 10 5
4 T+48
5 T+72
6 結合物33 IV，單一 T+24 10 5 5
7 T+48
8 T+72
9 結合物33 IV，單一 T+24 3 5 5
10 T+48
11 T+72
12 結合物33 IV，單一 T+24 1 5 5
13 T+48
14 T+72
15 未受感染BW對照物
表64：截止日之存活率%。測試物品/劑量/治療起始時間
Figure 02_image1941
表65：體重數據(gm)。mpk = mg/kg。僅示出組內之第一例死亡之前的數據。測試物品/劑量/治療起始時間
Figure 02_image1943
實例 137. 合成結合物 38 (Int-73) 、結合物 39 (Int-74) 、結合物 40 (Int-75) 及結合物 41 (Int-76)
向15-ml無菌離心管中饋入抗壞血酸鈉(68.3 mg，0.345 mmol)、BTTAA (11.9 mg，0.0276 mmol)、實例114之產物(Int-73)、實例115之產物(Int-74)、實例116之產物(Int-75)或實例117之產物(Int-76) (0.00953 mmol)及PBS 7.4 (1 ml)。該等試劑經渦旋直至均質，接著相繼與疊氮基Fc (50 mg，0.0008624 mmol，描述於實例124中，SEQ ID NO: 73)、CuSO4 (1.1 mg，0.0069 mmol)於水(0.5 ml)中之溶液混合。該混合物經旋轉持續12小時，接著相繼藉由蛋白A管柱上之親和層析法、尺寸排阻層析法經純化。結合物藉由Maldi TOF分析經表徵(典型地，DAR = 4.5)。產率典型地為50%。
編碼結合物38-41之Fc之核酸構築體包含編碼SEQ ID NO：64之胺基酸序列的核酸，該胺基酸序列包含C末端離胺酸殘基。表現後，結合物38-41之Fc之C末端離胺酸經蛋白水解裂解，由此產生具有SEQ ID NO：73之序列的Fc。C末端離胺酸之存在或不存在不改變Fc或相應結合物之性質。實例 138. 合成 Int-79
Figure 02_image1945
步驟 a.
Figure 02_image1946
紮那米韋-醚-酸(0.90 g，1.43 mmol，實例31)及N-甲基嗎啉(0.23 mL，2.14 mmol)溶解於THF (35 mL)中且在氮氣氛圍下冷卻至0℃(冰水浴)。經5分鐘時期藉助於注射器逐滴添加氯甲酸異丁酯(0.24 mL，1.85 mmol，於2 mL DCM中)。該混合物在0℃下經攪拌持續30分鐘，接著在環境溫度下經攪拌持續15 min，且接著冷卻至0℃。經5分鐘逐滴添加硼氫化鈉(540 mg，14.3 mmol，溶解於5 mL甲醇中)。該反應經攪拌持續15分鐘，此時所有起始材料均已經消耗(藉由LC/MS)。添加數滴(約1 mL)冰乙酸以酸化該混合物(pH~5)。用乙酸乙酯及水稀釋且經萃取至乙酸乙酯中(3次)。有機層用鹽水洗滌，且有機萃取物經硫酸鈉乾燥，且在旋轉蒸發儀上經濃縮。粗材料藉由矽膠層析法(首先裝載於矽藻土上) (DCM中之0-10%甲醇，30 min)經純化。產量0.66 g，75%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 617.2。步驟 b.
Figure 02_image1948
向醇(0.66, 1.1 mol，於20 mL CH2 Cl2 中)之攪拌混合物中添加三乙胺(0.30 mL，1.3 mmol)。該混合物在1大氣壓之氮氣下冷卻至0℃(冰水浴)且經5分鐘藉助於注射器逐滴添加甲磺醯氯(150 mg，1.3 mmol)。移除冰浴且該反應經攪拌持續45分鐘。該混合物用飽和碳酸氫鈉水溶液稀釋，經萃取至DCM中(3次)。經組合之有機萃取物用鹽水洗滌，經硫酸鈉乾燥且在旋轉蒸發儀上經濃縮。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 695.2。該中間物無需純化即用於下一步驟。
該紮那米韋甲磺酸鹽在80℃下在DMF中與3 eq疊氮化鈉一起經攪拌持續5小時。該混合物用水稀釋，經萃取至DCM中(3次)。經組合之有機萃取物用鹽水洗滌，經硫酸鈉乾燥且濃縮。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 695.2。該疊氮化物無需純化即用於下一步驟。
該紮那米韋疊氮化物(670 mg，1.04 mmol)在1個大氣壓之氫氣下在Lindlar催化劑(300 mg)存在下在甲醇(20 mL)中經攪拌持續12小時。該混合物經矽藻土過濾且濃縮以提供呈澄清油狀物之標題化合物。該胺無需純化即用於下一步驟。產量0.37 g，54%產率，3個步驟。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 616.2。步驟 c.
Figure 02_image1950
3-(苯甲基胺基)丙酸甲酯(1 g，5.2 mmol)、4-溴丁酸甲酯(1.2 g，6.2 mmol)及二異丙基乙胺(1.34 mL，7.8 mmol)在65℃下在DMF (5 mL)中經攪拌持續4小時。藉由旋轉蒸發儀移除大部分溶劑且粗材料藉由矽膠層析法(Isco，DCM中之0至9%甲醇，30分鐘梯度)經純化以提供呈澄清油狀物之經苯甲基保護中間物。該經苯甲基保護中間物在1個大氣壓之氫氣下在20%氫氧化鈀/碳(300 mg)存在下在甲醇(20 mL)中經攪拌持續12小時。該混合物經矽藻土過濾且濃縮以提供呈澄清油狀物之標題化合物。產量0.72 g，69%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 204.2。步驟 d.
Figure 02_image1952
DMF (2 mL)中之步驟-c產物(0.70 g，2.16 mmol)、炔丙基PEG-4酸(0.63 mg，2.38 mmol) HATU (1.26 g，3.24 mmol)在室溫下經攪拌，隨後添加DIEA (1.15 mL，6.49 mmol)。該反應混合物經攪拌持續2小時，接著藉由逆相液體層析法(Isco，5至50%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量840 mg，87%。藉由LCMS發現之離子，[M+H]+ = 446.2。步驟 e.
Figure 02_image1954
步驟-d產物(840 mg，1.85 mmol)及LiOH (113.1 mg，4.72 mmol)於H2 O:MeOH (1:2，9 mL)中之溶液在室溫下經攪拌持續2小時。接著，該溶液用TFA酸化。所得溶液經濃縮，接著藉由逆相液體層析法(Isco，0%至20%乙腈及水)經純化。產量454.5 mg，59%。藉由LCMS發現之離子，[M+H]+ = 418.2。步驟 f.
Figure 02_image1956
在室溫下向步驟-b產物(334.7 mg，0.52 mmol)、步驟-e產物(102 mg，0.24 mmol)及HATU (273.25 mg，0.704 mmol)於無水DMF (3 mL)中之溶液中添加DIEA (217 mg，16.4 mmol)。所得混合物經攪拌持續1小時，接著藉由RPLC (20%至100%甲醇及水，不具有修飾劑)經純化。產量206.5 mg，55%。藉由LCMS發現之離子，[(M+2H)/2]+ = 806.8。步驟 g.
Figure 02_image1958
CH2 Cl2 (5 mL)中之步驟-f產物(206.5 mg，0.128 mmol)及TFA (3 mL)在室溫下經攪拌隔夜，接著在減壓下濃縮。所得殘餘物藉由半製備型HPLC (0%至30%乙腈/水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量144.5 mg，69%。藉由LCMS發現之離子，[(M+2H)/2]+ = 606.8。步驟 h.
Figure 02_image1959
向步驟-g產物(144.5 mg，0.119 mmol)於MeOH (9 mL)及水(3 mL)中之溶液中添加LiOH (18 mg，0.75 mmol)。所得溶液在室溫下經攪拌持續1小時，接著用TFA酸化且在減壓下濃縮。殘餘物藉由半製備型HPLC (0%至25%乙腈/水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量45 mg，28%。藉由LCMS發現之離子，[(M+2H)/2]+ = 566.8。實例 139. 合成結合物 42
經疊氮基官能化之Fc (50 mg，5.4 mL，0.859 µmol，實例124，SEQ ID NO: 18)之溶液添加至含有炔衍生之小分子(7.87 mg，0.057 mmol，實例138)之10 mL離心管中。在輕柔地震盪以溶解所有固體之後，該混合物添加至3 mL L-抗壞血酸鈉(0.68 mg，0.34 mmol，0.25 M)、硫酸銅(II) (1.1 mg，0.0069 mmol，0.005 M)及BTTAA (11.8 mg，0.027 mmol，0.02 M)於PBS 7.4緩衝液中之預混合溶液中。所得溶液輕柔地經旋轉隔夜。其相繼藉由在蛋白A管柱上之親和層析法、尺寸排阻層析法(參見一般結合物純化方案)經純化。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出63623 Da之平均質量(DAR 3.8)。產量36.01 mg，72%。實例 140. 合成 Int-80
Figure 02_image1960
步驟 a.
Figure 02_image1962
向紮那米韋之碳酸對硝基苯酯(0.3 g，0.4 mmol，實例103)於無水二氯甲烷(5 ml)中之溶液中添加無水DMF (5 ml)中之炔丙基-PEG4-甲胺(0.11 g，0.44 mmol)及DIPEA (0.14 mL，1.0 mmol)。該反應在室溫下經攪拌隔夜，接著濃縮且藉由用0 %至10%甲醇/二氯甲烷溶離之急驟層析法經純化。產量0.28 g，81%。藉由LCMS發現之離子：(M + H)+ = 858.4, (M - Boc)+H+ = 758.4。步驟 b.
Figure 02_image1964
前一步驟之產物(280 mg，0.2 mmol)溶解於2 ml MeOH及2 ml THF中，接著用氫氧化鋰(24 mg，1 mmol)溶解於2 ml水中之溶液處理。該反應在室溫下經攪拌持續10 min，此時HPLC顯示反應完成。反應之pH藉由使用Amberlite IRN-77離子交換樹脂經調節至5至6之值，接著過濾以移除該樹脂。粗濾液在真空下蒸發至乾且無需純化即用於下一步驟，且產率為定量的。藉由LCMS發現之離子：(M + H)+ = 844.4, (M - Boc + H)+ = 744.4。步驟 c.
Figure 02_image1966
步驟-b產物溶解於2 ml二氯甲烷及2 ml TFA中，且在室溫下經攪拌。藉由LCMS監測反應之進展。在反應完成之後(6 h)，該溶液經汽提至乾且接著溶解於2 ml水及2 ml乙腈中。所得溶液在室溫下再攪拌持續2小時，此時LCMS顯示丙酮化合物保護基之完全保護基脫除。此混合物經濃縮且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以5%至40%乙腈/水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀使用0.1% TFA作為修飾劑經純化。產量180 mg，78.0 %。藉由LCMS發現之離子：(M + H)+ = 604.2。實例 141. 與 Int-4 相比關於 Int-80 之穩定性數據
Int-80 (實例140)及Int-4 (實例13)以10 mg/mL溶解於去離子水中且接著1:10稀釋於1X PBS中至1 mg/mL之最終濃度。樣品在37℃或60℃下經培育持續1週。25 µL等分試樣經稀釋於75 µL水中以用於HPLC分析。使用具有Phenomenex Biozen PS-C18管柱(150×2.1 mm，1.6 um)之Waters Acquity H-Class UPLC，如下運行水中之0.1%甲酸至乙腈中之0.1%甲酸的梯度：5% B持續0-1 min，1-20 min 5-20% B。使用二極體陣列偵測器在240 nm下進行偵測。Int-80在60℃下歷經1週具有少於1%降解，而Int-4在相同時期內顯示15%降解(圖66)實例 142. 合成結合物 43
製備點擊試劑溶液：PBS x1緩衝溶液中之0.0050M CuSO4：10.0 mg CuSO4溶解於12.53 mL PBS x1中，接著採用10.00 mL此CuSO4溶液且添加86.1 mg BTTAA及495.3 mg抗壞血酸鈉以生成點擊試劑溶液(0.0050M CuSO4、0.020M BTTAA及0.25M抗壞血酸鈉)。
經疊氮基官能化之Fc (78.0 mg，4.535 mL，1.35 µmol，實例124，SEQ ID NO: 73)之溶液添加至含有炔衍生之小分子(13.2 mg，8.88 µmol，Int-80, 實例140)之15 mL離心管中。在輕柔地震盪以溶解所有固體之後，向該混合物中添加2.153 mL上述點擊試劑溶液(L-抗壞血酸鈉，0.25 M, 106.6 mg，0.538 mmol，硫酸銅(II) 0.0050M，1.72 mg，0.0107 mmol，及BTTAA 0.020M，18.5 mg，0.0431 mmol)。所得混合物在環境溫度下輕柔地經旋轉持續6小時。其相繼藉由在蛋白A管柱上之親和層析法、尺寸排阻層析法(參見結合物純化方案)經純化。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出64,012 Da之平均質量(DAR = 7.0)。產量50.3 mg，62%產率。
編碼結合物43之Fc之核酸構築體包含編碼SEQ ID NO：64之胺基酸序列的核酸，該胺基酸序列包含C末端離胺酸殘基。表現後，結合物43之Fc之C末端離胺酸經蛋白水解裂解，由此產生具有SEQ ID NO：73之序列的Fc。C末端離胺酸之存在或不存在不改變Fc或相應結合物之性質。實例 143. 合成 Int-81
Figure 02_image1968
步驟 a.
Figure 02_image1969
經15分鐘向用冰水浴冷卻之N-Boc-N-Me-甘油醇(3.5 g，20 mmol)於DMSO (20 mL)中之充分攪拌溶液中相繼添加烯丙基溴(3.6 g，30.0 mmol)、經精細研磨KOH粉末(3.5 g，30.0 mmol)。所得溶液在室溫下經攪拌隔夜。所得混合物分配於5% HOAc水溶液(50 mL)與乙酸乙酯(200 ml)之間。分離有機層，用鹽水洗滌，經硫酸鈉乾燥，過濾，且濃縮，接著藉由用10%至80%乙酸乙酯/己烷溶離之急驟層析法經純化。產物之產量4.1 g，95%。藉由LCMS發現之離子：M+H =216.3。步驟 b.
Figure 02_image1971
臭氧在-78℃下鼓泡通過來自步驟a之化合物(8.0 g，37 mmol)於MeOH (50 mL)及DCM (50 ml)中之溶液，直至出現淡藍色。未反應之臭氧藉由用氧氣鼓泡持續10分鐘經移除，接著經10分鐘分成小份添加NaBH4 (1.6 g，40 mmol)。在所有NaBH4 經添加之後，該混合物逐漸地加溫至室溫。所得溶液分配於乙酸乙酯(100 ml)與鹽水(50 ml)之間。分離有機層，用鹽水洗滌，經硫酸鈉乾燥，過濾，濃縮為油狀物，且接著藉由用10%至80%乙酸乙酯/二氯甲烷溶離之急驟層析法經純化。產物之產量5.0 g，62%。藉由LCMS發現之離子：M+H =220.2。步驟 c.
Figure 02_image1973
在0℃下經15分鐘緩慢地向前一步驟之產物(4.4 g，20 mmol)及CBr4 (10.0 g，30.0 mmol)於DCM (50 mL)中之溶液中添加PPh3 (8.0 g，30 mmol)(放熱)。在添加過程中，內部溫度保持低於30℃。在添加PPh3 之後，該反應在室溫下經攪拌隔夜。粗反應物經濃縮為油狀物，接著藉由正相層析法用10%乙酸乙酯/己烷至80%乙酸乙酯/己烷溶離經純化。收集管內部含有油小液滴之溶離份經組合且濃縮為無色油狀物。4.0 g，70.5%。藉由LCMS發現之離子：M+H =282.1。步驟 d.
Figure 02_image1975
步驟c產物(4 g，14 mmol)、苯甲胺(0.60 g，5.7 mmol)及K2 CO3 (2.35 g，17 mmol)於DMF (20 mL)中之溶液在75℃油浴中加熱持續8 h。過濾該混合物，濃縮，且藉由RPLC (5% ACN/水至100% ACN)經純化。產量2.1 g，72.7 %。步驟 e.
Figure 02_image1977
向步驟-d產物(1.3 g，2.0 mmol)溶解於CHCl3 /EtOH (1:20，20 mL)中之溶液中添加20% Pd(OH)2 /C (0.50 g)。該反應在環境溫度下在來自氣球之氫氣下經攪拌隔夜。該反應混合物經矽藻土墊過濾，接著藉助於旋轉蒸發儀經濃縮且無需進一步純化繼續用於後續步驟。步驟 f.
Figure 02_image1979
步驟-e產物溶解於10 mL DMF中，接著在室溫下用炔丙基PEG4酸(0.52 g，2.0 mmol)、EDCI (0.6 g，3.0 mmol)、HOAt (0.45 g，3 mol)及胡尼西氏鹼(0.7 mL，5.0 mmol)處理。該反應混合物經過濾持續四小時，接著濃縮且藉由RPLC (10% ACN/水至60% ACN/水)經純化。經兩個步驟，產量0.43 g，65%。藉由LCMS發現之離子：[M – Boc + H]+ = 562.4, [M + H]+ = 662.4。步驟 g.
Figure 02_image1981
步驟-d產物(70 mg，0.1 mmol)在室溫下用TFA (2 mL)處理持續2小時。TFA藉由旋轉蒸發經移除，且剩餘油狀物進一步在高真空下乾燥持續12 h以生成呈雙-TFA鹽形式之所需產物。產率為定量的。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 462.4。步驟 h.
Figure 02_image1983
向描述於實例109中之碳酸硝基苯酯(0.72 g. 0.95 mmol)於無水DMF (5 ml)中之溶液中添加步驟g二胺(0.3 g，0.43 mmol，經30分鐘分成數份添加)及DIPEA (0.28 mL，2 mmol)於無水DMF (20 ml)中之混合物。該反應在室溫下經攪拌隔夜，接著濃縮且藉由用0 %至10%甲醇/二氯甲烷溶離之急驟層析法經純化。產量0.63 g，86%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 844.4, [(M - Boc + 2H)/2]+ = 794.4, [(M - 2Boc + 2H)/2]+ = 744.4。步驟 i.
Figure 02_image1985
前一步驟之產物(600 mg，0.35 mmol)溶解於5 ml MeOH及5 ml THF中，接著用氫氧化鋰(48 mg，2 mmol)溶解於2 ml水中之溶液處理。該反應在室溫下經攪拌持續10 min，此時HPLC顯示反應完成。該反應溶液之pH藉由使用Amberlite IRN-77離子交換樹脂經調節至5至6之值，接著過濾以移除該樹脂。粗產物藉由旋轉蒸發經蒸發至乾且無需純化即用於下一步驟。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 829.9, [(M - Boc + 2H)/2]+ = 779.4, [(M - 2Boc + 2H)/2]+ = 729.4。步驟 j.
Figure 02_image1987
步驟-i產物溶解於5 ml二氯甲烷及5 ml TFA中，且在室溫下經攪拌。藉由LCMS監測反應之進展。在反應完成之後(6 h)，該溶液經汽提至乾且接著溶解於4 ml水及4 ml甲醇中。所得溶液在室溫下再攪拌持續2小時，此時LCMS顯示丙酮化合物保護基之完全保護基脫除。此混合物經濃縮且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以5%至40%乙腈/水溶離之IscoCombiFlash液體層析儀使用0.1% TFA作為修飾劑經純化。產量380 mg，71.0 %。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 589.8, [(M + 3H)/3]+ = 392.5。實例 144. 合成 Int-82
Figure 02_image1989
類似於實例143 Int-81製備標題化合物，其中步驟a中之N-Boc-N-Me-甘油醇經N-Boc-N-乙基-甘油醇取代。藉由LCMS發現之離子：[M/2]+ 1 = 603.8, [M/3]+ 1 = 402.9。實例 145. 合成 Int-83
Figure 02_image1991
步驟 a.
Figure 02_image1993
經CBZ保護之胺基-peg1-溴化物(7.6 g，25.2 mmol)、苯甲胺(1.1 g，10.1 mmol)及碳酸鉀(2.8 g，2.8 mmol)在60℃下在DMF (10 mL)中經攪拌持續12小時。該溶液在旋轉蒸發儀上經濃縮且藉由矽膠層析法(DCM中之0-10%甲醇，30分鐘梯度)經純化以提供呈澄清黏性油狀物之產物。產量3.2公克，57%。藉由LC/MS發現之離子，[M+H]+ =550.2。步驟 b.
Figure 02_image1995
步驟a產物(1.9 g，3.5 mmol)溶解於THF (20 mL)中且在氮氣氛圍下藉助於冰/水浴冷卻至0℃。經10分鐘時期藉助於注射器逐滴添加LAH (6.9 ml，13.8 mmol，2M於THF中)。該混合物在回流下經攪拌持續2小時，接著藉助於冰/水浴冷卻至0℃。逐滴添加1 mL水，隨後逐滴添加1 mL NaOH水溶液(15重量%)。添加3 mL水且該混合物經攪拌持續15分鐘，此時添加2 g硫酸鎂。該混合物經攪拌持續10分鐘，接著經矽藻土過濾，用額外2個10 ml THF部分洗滌且經組合之濾液藉由旋轉蒸發儀經濃縮。殘餘物溶解於乙腈(20 mL)中，添加三乙胺(1.4g, 13.8 mmol)及boc酐(3.0 g，13.8 mmol)。該混合物經攪拌持續45分鐘，濃縮且藉由逆相HPLC (5-95%乙腈/去離子水，0.1% TFA修飾劑，30分鐘梯度)經純化。產量1.4 g，79%。藉由LC/MS發現之離子，[M+H]+ = 510.2。步驟 c.
Figure 02_image1997
此實例之步驟b.產物(1 g，1.9 mmol)在1個大氣壓之氫氣下在氫氧化鈀(200 mg)存在下在甲醇(25 mL)中經攪拌持續2小時。該混合物經矽藻土過濾且濃縮以提供呈澄清油狀物之產物，其無需進一步純化即使用。產量0.73 g，89%。藉由LC/MS發現之離子，[M+H]+ = 420.4。步驟 d.
Figure 02_image1999
步驟c產物(0.73 g，1.7 mmol)、炔丙基-peg4-甲苯磺酸鹽(0.91 g，2.4 mmol)及二異丙基乙胺(0.76 g，5.9 mmol)在85℃下在DMF (5 mL)中經攪拌持續4小時。該混合物在旋轉蒸發儀上經濃縮，接著藉由逆相HPLC (5-95%乙腈/DI水，0.1% TFA修飾劑，30分鐘梯度)經純化以提供呈澄清黏性油狀物之產物。產量0.89 g，82%。藉由LC/MS發現之離子，[M+H]+ = 634.4。步驟 e.
Figure 02_image2001
步驟d.產物(0.89 g，1.4 mml)在環境溫度下在4N HCl (於二噁烷中)中經攪拌持續45分鐘。該混合物在旋轉蒸發儀上經濃縮且與苯共沸(3次)。所得殘餘物溶解於DI水(15 mL)中，經冷凍且凍乾以提供呈澄清油狀物之產物雙-HCl鹽。產量0.65 g，91%。藉由LC/MS發現之離子，[M+H}+ = 434.4。步驟 f.
Figure 02_image2003
此化合物之合成中的剩餘四個步驟類似於實例143 Int-81之合成中所用之彼等步驟。藉由LCMS發現之離子：(M+2H)/2 =575.8實例 146a. Int-83 之替代合成 I
Figure 02_image2005
描述於實例145中之產物Int-83可替代地使用本專利中所述之方法由熟習此項技術者使用上述反應流程來製備。實例 146b. Int-83 之替代合成 II
實例145中所述之產物Int-83可以由熟習此項技術者使用該專利中所述之方法，使用以下反應方案來替代地製備。
Figure 02_image2007
合成 a .
Figure 02_image2008
向用冰水浴冷卻之N-Boc-N-Me-甘胺醇(3.5 g，20 mmol)在DMSO(20 mL)中充分攪拌之溶液中添加烯丙基溴(3.6 g，30.0 mmol)，然後在15分鐘內添加精細研磨KOH粉末(3.5 g，30.0 mmol)。將所得溶液在室溫攪拌隔夜。所得混合物分配於5% HOAc水溶液(50 mL)與乙酸乙酯(200 ml)之間。分離有機層，用鹽水洗滌，經硫酸鈉乾燥，過濾，且濃縮，接著藉由用10%至80%乙酸乙酯/己烷溶離之急驟層析法經純化。產物之產量4.1g，95%。藉由LCMS發現之離子：M+H =216.3。合成 b .
Figure 02_image2010
在-78℃下，將臭氧鼓泡通過a (8.0 g，37 mmol)之MeOH(50 mL)及DCM(50 ml)溶液，直到出現淺藍色。藉由用氧氣鼓泡10分鐘來移除未反應之臭氧，然後在10分鐘內分小部分添加NaBH4 (1.6 g，40 mmol)。加入所有NaBH4 後，將混合物逐漸溫熱至室溫。所得溶液分配於乙酸乙酯(100 ml)與鹽水(50 ml)之間。分離有機層，用鹽水洗滌，經硫酸鈉乾燥，過濾，濃縮為油狀物，且接著藉由用10%至80%乙酸乙酯/二氯甲烷溶離之急驟層析法經純化。產物之產量5.0 g，62%。藉由LCMS發現之離子：M+H =220.2。合成 c .
Figure 02_image2012
在15分鐘內，向在冰浴中冷卻之b(4.4 g，20 mmol)及CBr4 (10.0 g，30.0 mmol)在DCM(50 mL)中之溶液中緩慢加入PPh3 (8.0 g，30 mmol)(放熱)。在添加過程中，內部溫度保持低於30℃。加入PPh3 後，將反應在室溫攪拌隔夜。將粗反應物濃縮成油狀物，然後藉由正相層析法純化，用10%乙酸乙酯/己烷至80%乙酸乙酯/己烷溶離。藉由LCMS檢查收集管內部含有油滴之溶離份，然後合併並濃縮成無色油狀物。4.0 g, 70.5%。藉由LCMS發現之離子：M+H =282.1。合成 d.
Figure 02_image2014
將c(4.4 g，15.5 mmol)、炔丙基-PEG4-胺(1.5 g，6.4 mmol)及DIPEA(3.3 g，25.8 mmol)之DMF(20 mL)溶液在油浴中於75℃加熱持續18h。過濾該混合物，濃縮，且藉由RPLC (5% ACN/水至100% ACN)經純化。產量3.85 g，92%。LC/MS: [M+H] = 634.2。合成 e .
Figure 02_image2016
將產物d(3.85，6.1 mmol)在室溫下用HCl(4 N之二噁烷溶液，15 mL)處理2小時。藉由旋轉蒸發移除溶劑，並將剩餘之油狀物溶解在二水(20 mL)中冷凍，並凍乾，得到淺黃色油狀產物。產量為定量的。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 434.2。合成 f.
Figure 02_image2018
在1小時內，向f (0.68 g，1.34 mmol)及DIPEA(0.87g，6.7 mmol)溶於無水DMF(5 ml)中之溶液中分批加入f(2.1 g，2.8 mmol)。將反應在室溫攪拌隔夜，然後濃縮並藉由急驟層析法純化，用0%至10%之甲醇/二氯甲烷溶離。產量1.45 g，67%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 829.8。合成 g.
Figure 02_image2020
將產物f(1.45 g，0.87 mmol)溶解於3 ml MeOH中，然後用溶解在去離子水(6 mL)中之氫氧化鋰(90 mg，3.8 mmol)溶液處理。將反應在室溫攪拌15分鐘，此時LCMS顯示反應完成。該反應溶液之pH藉由使用Amberlite IRN-77離子交換樹脂經調節至5至6之值，接著過濾以移除該樹脂。濾液藉由旋轉蒸發濃縮至乾，無需進一步純化即可用於下一步。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 815.9。
將水解產物溶於二氯甲烷(5 mL)及TFA(10 mL)中，並在室溫下攪拌。藉由LCMS監測反應之進展。Boc完全移除後(約4小時)，用旋轉蒸發儀濃縮溶液至乾，然後溶於8 ml水中。將所得溶液在室溫下再攪拌2小時，此時LCMS顯示出丙酮化物保護基團之完全移除。此混合物經濃縮且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以5%至40%乙腈/水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀使用0.1% TFA作為修飾劑經純化。三個步驟之產量780 mg，65.0 %。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 575.8, [(M + 3H)/3]+ = 384.8。實例 147. 用於選擇抗性流感病毒之連續繼代實驗
為了評估在病毒抑制劑之選擇性壓力下開發耐藥性突變型病病毒株之潛力，相對奧司他韋及巴洛沙韋比較物，用結合物6及33進行連續繼代研究。連續繼代研究使用A549或MDCK細胞來進行。如下進行繼代：每孔(12-孔) 150,000個A549或MDCK細胞接種於500 µl DMEM 10% FBS、1% PS、1% NaPyr及1% HEPES中且經培育持續大約24小時。一旦細胞達到大約80%匯合，其用PBS洗滌一次且在正常培養條件下在化合物或單獨PBS存在下經培育持續2小時。如最大病毒抑制所需最佳化測試物品濃度，同時維持充足病毒產生以用於後續繼代。連續繼代實驗中所用之測試物品濃度顯示於圖67及68中。細胞接著在室溫下在含有PBS、牛白蛋白35%及Ca2+ /Mg2+ 之緩衝液中以MOI 0.01或0.05 (分別地，MDCK及A549細胞；150 μl稀釋於感染緩衝液中)受感染，隨後移除接種物且用DMEM 1% PS、1% NaPyr及1% HEPES (無FBS)洗滌細胞一次。細胞接著在稀釋於DMEM 1% PS、1% NaPyr、1% HEPES及1 µg/ml經TPCK處理之胰蛋白酶中之測試物品存在下經培育持續24小時。在培育之後，收集病毒上清液，且藉由離心(5 min，4℃，1,400xg)移除細胞及碎片。上清液接著用於： i藉由斑塊分析定量病毒效價 ii 進行血細胞凝集分析以確定該病毒是否逃逸化合物抑制 iii 在化合物存在下再感染剛剛接種之A549或MDCK細胞。
重複該過程持續10個繼代，或直至關於奧司他韋及巴洛沙韋對照物觀察到抗性。一旦在兩個連續繼代中偵測到在藥物存在下增加之效價，該等病毒即可經斑塊純化。在斑塊純化之後，所有8個基因組區段可經測序且與經PBS治療之對照病毒相比以偵測逃逸突變。兩個不同連續繼代實驗之概述顯示於圖67及68中。在圖67中概述之實驗中，使用經A/California/04/09/ H1N1 pdm感染之A549細胞比較結合物6與奧司他韋及巴洛沙韋。結合物6、巴洛沙韋及奧司他韋分別以0.5 nM、0.5 nM及200 nM使用。在11次繼代之過程中，關於結合物6未觀察到病毒效價之增加(表明未出現抗性突變體)，而巴洛沙韋及奧司他韋效價分別在第5次及第11次繼代之後增加至類似於PBS對照物中所觀察到之彼等水準的水準。在圖68中概述之實驗中，使用經A/WSN/1933 H1N1感染之MDCK細胞比較結合物6及33與奧司他韋及巴洛沙韋。結合物6、結合物33、巴洛沙韋及奧司他韋分別以4 nM、2 nM、4 nM及50 nM使用。在10次繼代之過程中，關於結合物6或33未觀察到病毒效價之增加(表明未出現抗性突變體)，而巴洛沙韋及奧司他韋效價分別在第5次及第10次繼代之後增加至類似於PBS對照物中所觀察到之彼等水準的水準。實例 148. 合成結合物 6a
使用Int-7a(實例100)，類似於結合物6(實例20)製備標題結合物。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出62063 Da之平均質量(DAR = 2.7)。產量175.4 mg，50%產率。實例 149. 合成結合物 6b
使用Int-7b(實例101)，類似於結合物6(實例20)製備標題結合物。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出62063 Da之平均質量(DAR = 2.8)。產量175.4 mg，50%產率。實例 150. 合成結合物 6c
使用Int-7c(實例102)，類似於結合物6(實例20)製備標題結合物。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出62782 Da之平均質量(DAR = 3.2)。產量175.4 mg，50%產率。實例 151. 合成結合物 44
藉由PEG4-疊氮基-Fc(SEQ ID NO：73，如實例124中製備)及Int-22(實例79)類似於實例80(結合物20)製備該結合物。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出62,882 Da之平均質量(DAR = 5.6)。
編碼結合物44之Fc之核酸構築體包含編碼SEQ ID NO：64之胺基酸序列的核酸，該胺基酸序列包含C末端離胺酸殘基。表現後，結合物44之Fc之C末端離胺酸經蛋白水解裂解，由此產生具有SEQ ID NO：73之序列的Fc。C末端離胺酸之存在或不存在不改變Fc或相應結合物之性質。實例 152. 抗體依賴性細胞毒性檢定
測試結合物6及結合物33之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。將單層MDCK細胞用MOI為0.001-10之A型流感或B型流感病毒株感染，並在5% CO2 中於37℃培育18-24小時。ADCC係根據製造商之說明使用商業報告細胞株(PROMEGA)確定。簡而言之，將測試物品以1至10,000 nM之濃度添加至適當之孔中，並在5% CO2 中於37℃培育15 m。藉由讀取發光來對ADCC進行定量。對結合物6進行了抗A/PR/8/1934流感(H1N1)之測試，顯示ADCC依賴於MOI之增加(圖69)，MOI為1時ADCC呈劑量依賴性之增加(圖70)。對結合物33進行了抗流感A/PR/8/1934(H1N1)、流感A/CA/07/2009(H1N1)及流感A/HK/1/1968(H3N2)圖71A-71C及流感B/Malaysia/2506/2004(Victoria，圖72)之測試，顯示了結合物33引起MOI依賴性ADCC增加。結合物33亦顯示MOI為1(圖73A)及MOI為10(圖73B)之針對流感A/PR/8/1934(H1N1)之ADCC劑量依賴性增加。單株抗體Gedivumab(Genentech)用作陽性對照，比較全長抗體與Fc結合物之受體結合。當針對流感A/PR/8/1934(H1N1，圖74)進行測試時，Gedivumab亦顯示出ADCC之MOI依賴性增加，並且在MOI為1(圖75A)及MOI為10(圖75B)時，顯示出針對流感A/PR/8/1934(H1N1)之ADCC劑量依賴性增加。實例 153. 抗體依賴性細胞吞噬檢定
測試結合物6及結合物33之細胞吞噬作用。將單層MDCK細胞用MOI為0.001-10之A型或B型流感病毒株感染，並在5% CO2 中於37℃培育18-24小時。ADCP係根據製造商之說明使用商業報告細胞株(PROMEGA)確定。簡而言之，將測試物品以1至10,000 nM之濃度添加至適當之孔中，並在5% CO2 中於37℃培育15 m。藉由讀取發光來對ADCP進行定量。對結合物6進行了抗A/PR/8/1934(H1N1)流感之測試，顯示了ADCP依賴於MOI之增加(圖76)，以及MOI為1(圖77A)及MOI為10(圖77B)時ADCP劑量依賴性增加。對結合物33進行了抗流感A/PR/8/1934(H1N1)、流感A/CA/07/2009(H1N1)及流感A/HK/1/1968(H3N2)(分別見圖78A-78C)及流感B/Malaysia/2506/2004(Victoria，圖79)之測試，顯示結合物33引起MOI依賴性ADCP增加。結合物33亦顯示出在MOI為1(圖80A)及MOI為10(圖80B)時針對流感A/PR/8/1934(H1N1)之ADCP劑量依賴性增加。Gedivumab(Genentech)用作陽性對照，以比較全長抗體與Fc結合物之受體結合。當針對A/PR/8/1934流感進行測試時，Gedivumab亦顯示ADCP之MOI依賴性增加(H1N1，圖81)，並且在MOI為1(圖82A)及MOI為10(圖82B)時，顯示針對A/PR/8/1934(H1N1)流感之ADCP劑量依賴性增加。實例 154. 活 A 型流感病毒或神經胺糖酸酶抗性突變體之裂解物之神經胺糖酸酶抑制作用
神經胺糖酸酶抑制作用(NAI)。將測試物品與神經胺糖酸酶(Sino Biological)或活病毒在37℃、5% CO2 下培育20分鐘。將2'-(4-甲基繖形基)-α-D-N乙醯神經胺酸受質添加至適當之孔中，並在37℃、5% CO2 下培育1小時。藉由讀取355 nm激發/460 nm發射之螢光來確定NAI。測定了神經胺糖酸酶抗性突變體及活流感病毒之神經胺糖酸酶抑制作用(表66、表67、表68及表69)。 表66：神經胺糖酸酶抗性突變體之裂解物之神經胺糖酸酶抑制作用
H1N1 WT H1N1 H275Y H3N2 WT H3N2 E119V H3N2 R292K H5N1 WT H7N9 WT
   TM DAR 中心連接體 Fc IC50 [nM] IC50 [nM] IC50 [nM] IC50 [nM] IC50 [nM] IC50 [nM] IC50 [nM]
奧司他韋 N/A N/A N/A N/A 3.80 743.90 2.18 455.70 8015.00 15.44 2.95
紮那米韋 N/A N/A N/A N/A 2.15 1.93 4.27 112.60 116.50 2.05 11.11
Int-7a N/A N/A 15個原子 N/A 22.58 9.42 21.11 679.40 993.60 17.06 49.04
Int-7b N/A N/A 15個原子 N/A 34.82 13.84 32.07 1079.00 1584.00 29.56 87.54
Int-7b N/A N/A 15個原子 N/A 2002.00 872.40 2914.00 ＞10,000 ＞10,000 2706.00 3325.00
結合物6a Int-7a 2.7 15個原子 SEQ ID NO: 18 0.37 0.43 4.14 4.66 4.85 0.59 1.18
結合物6b Int-7b 2.8 15個原子 SEQ ID NO: 18 0.24 0.30 2.05 3.67 7.41 0.54 0.98
結合物6c Int-7c 3.2 15個原子 SEQ ID NO: 18 0.98 0.66 35.60 4423.00 1451.00 1.25 10.41
結合物33 Int-7a 4.5 15個原子 SEQ ID NO: 73 1.39 2.61 13.09 13.21 17.69 3.51 5.66
表67：活A型流感病毒之神經胺糖酸酶抑制作用
A/PR/8/1934 (H1N1) A/Ca/7/2009 (H1N1) A/HK/1/1968 (H3N2) B/Brisbane 60/2008 (Victoria) B/Florida/4/2006 (Yamagata)
   TM DAR 中心連接體 Fc IC50 [nM] IC50 [nM] IC50 [nM] IC50 [nM] IC50 [nM]
奧司他韋 N/A N/A N/A N/A 3.76 0.88 0.16 36.61 24.65
紮那米韋 N/A N/A N/A N/A 0.35 0.28 0.43 6.74 3.60
Int-7a N/A N/A 15個原子 N/A 0.45 2.10 3.62 13.54 25.54
Int-7b N/A N/A 15個原子 N/A 0.98 3.78 5.57 16.03 17.26
Int-7c N/A N/A 15個原子 N/A 150.90 399.40 467.50 1942.00 5512.00
結合物6a Int-7a 2.7 15個原子 SEQ ID NO: 18 0.22 0.56 0.41 2.24 4.65
結合物6b Int-7b 2.8 15個原子 SEQ ID NO: 18 0.14 0.25 0.30 1.39 2.30
結合物6c Int-7c 3.2 15個原子 SEQ ID NO: 18 0.29 0.35 0.60 99.08 44.37
結合物33 Int-7a 4.5 15個原子 SEQ ID NO: 73 1.12 2.05 1.71 7.75 16.47
表68：針對H3N2 WT、E119V突變體或活流感A/Ca/07/2009之神經胺糖酸酶抑制作用
分子 TM DAR Fc 中心連接體 H3N2 WT IC50 [nM] H3N2 E119V IC50 [nM] A/Ca/07/2009pdm IC50 [nM]
奧司他韋 N/A N/A N/A N/A 2.873 150.1 0.7411
紮那米韋 N/A N/A N/A N/A 6.302 35.68 0.8452
Int-3 N/A N/A N/A 27個原子 31.25 108.3 1.172
Int-4a N/A N/A N/A N/A 32.94 147.1 7.102
Int-7a N/A N/A N/A 15個原子 33.62 185.9 3.825
Int-7c N/A N/A N/A 15個原子 4428 13972 470.5
Int-22 N/A N/A N/A N/A 13.25 23.23 1.295
Int-73 N/A N/A N/A 14個原子 33.63 174.3 4.605
Int-74 N/A N/A N/A 16個原子 32.89 157.9 1.551
Int-75 N/A N/A N/A 17個原子 34.51 164 1.759
Int-76 N/A N/A N/A 18個原子 32.95 166.4 2.07
Int-80 N/A N/A N/A N/A 80.97 628.9 21.89
Int-91 N/A N/A N/A N/A 95.7 529 46
結合物6 Int-7 3.3 SEQ ID NO: 18 15個原子 206.5 3610 1.366
結合物33 Int-7a 6.1 SEQ ID NO: 73 15個原子 3.051 2.913 0.2656
結合物33 Int-7a 6.8 SEQ ID NO: 73 15個原子 6.197 86.06 0.1007
結合物43 Int-80 7.0 SEQ ID NO: 73 N/A 11.28 11.64 1.231
結合物44 Int-22 5.6 SEQ ID NO: 73 N/A 6.815 5.816 0.7677
表69：利用NA裂解物反應之神經胺糖酸酶抑制檢定[nM]
測試物品 TM DAR 中心連接體 IAV H1N1 NA 裂解物
0.1 U/mL 1 U/mL 10 U/mL
奧司他韋 N/A N/A N/A 2.162 19.45 729.9
紮那米韋 N/A N/A N/A 0.6719 7.765 76.53
Int-7 N/A N/A 15個原子 1958 12987 ＞10,000
Int-23 N/A N/A 14個原子 0.2684 2.625 27.78
結合物6 Int-7 3.3 15個原子 16.28 13214 ＞10,000
結合物21 Int-7 2.2 14個原子 0.5004 2.65 9.101
實例 155. 細胞病理效應檢定
為了量測結合物6及結合物33保護哺乳動物細胞免受流感病毒感染及破壞之能力，如實例25中所述，伴以很小變化，進行了基於細胞病理效應(CPE)之微量中和檢定。簡而言之，用A型或B型流感病毒株以0.001-1之適當MOI感染單層MDCK細胞。加入濃度範圍在0.1-10,000 nM之間之測試物品，並在37℃、5% CO2 下培育3天(對於A型流感)或5天(對於B型流感)。藉由讀取595 nm處之吸光度，藉由結晶紫染色確定CPE。結果顯示在下表70、表71、表72及表73中。  表70：針對流感A/PR/8/1934(H1N1)之CPE
分子 TM DAR Fc 中心連接體 MOI 0.01 MOI 0.1 MOI 1
EC50 [nM]
奧司他韋 N/A N/A N/A N/A 3005 ＞10,000 ＞10,000
巴洛沙韋 N/A N/A N/A N/A 0.4466 5.126 7.993
結合物6 Int-7 3.3 SEQ ID NO: 18 15個原子 0.3561 35.52 1802
結合物33 Int-7a 4.5 SEQ ID NO: 73 15個原子 0.2669 2.458 77.97
表71：針對流感A/Ca/07/2009(H1N1)之CPE
分子 TM DAR Fc 中心連接體 MOI 0.01 MOI 0.1 MOI 1
EC50 [nM]
奧司他韋 N/A N/A N/A N/A 288.2 ＞10,000 ＞10,000
巴洛沙韋 N/A N/A N/A N/A 1.439 3.186 11.3
結合物6 Int-7 3.3 SEQ ID NO: 18 15個原子 18.13 513.4 ＞1,000
結合物33 Int-7a 4.5 SEQ ID NO: 73 15個原子 1.845 39.66 ＞1,000
表72：針對流感A/WSN/1933之CPE(t = -1 h)
分子 TM DAR Fc 中心連接體 MOI 0.001 MOI 0.01 MOI 0.1 MOI 1 MOI 10
EC50 [nM]
奧司他韋 N/A N/A N/A N/A 3911 ＞10,000 ＞10,000 ＞10,000 ＞10,000
巴洛沙韋 N/A N/A N/A N/A 1.261 3.64 8.306 8.266 17.1
Int-7a N/A N/A N/A 15個原子 8.704 13.22 2758 ＞10,000 ＞10,000
結合物33 Int-7a 4.5 SEQ ID NO: 73 15個原子 3.097 2.754 8.147 868.1 ＞10,000
表73.針對B型流感之CPE(t = -1 h)
分子 TM DAR Fc 中心連接體 B/Brisbane B/Florida B/Malaysia
EC50 [nM]
奧司他韋 N/A N/A N/A N/A 969.1 ＞10,000 5694
巴洛沙韋 N/A N/A N/A N/A 240.4 30.57 2294
Int-7a N/A N/A N/A 15個原子 ＜1.93 ＜1.93 0.8237
結合物33 Int-7a 4.5 SEQ ID NO: 73 15個原子 3.699 0.1946 10.48
實例 156. 合成結合物 45
使用PEG4-疊氮基-Fc(SEQ ID NO：72(結合物45a)或SEQ ID NO：73(結合物45b)，如實例124製備)及Int-83 (實例145)，類似於結合物33(實例129)製備結合物45。結合物45b之經純化製劑之Maldi TOF分析給出62,927 Da之平均質量(DAR = 4.2)。本文還描述了具有變化之DAR之結合物45a之製備(實例199)。在使用術語結合物45之情況下，不應將其視為僅限於任何特定之DAR。所得之結合物在圖102中示出。
如本文所使用，術語結合物45意欲包括結合物45a及結合物45b。申請者注意到，SEQ ID NO：72(結合物45a)及SEQ ID NO：73(結合物45b)分別僅在Fc同種異型G1m(f)及G1m(fa)上不同。就本文所述之性質而言，預期不同之同種異型表現相同。
編碼結合物45a之Fc之核酸構築體包括編碼包含C端離胺酸殘基之SEQ ID NO：63之胺基酸序列的核酸。表現後，結合物45a之Fc之C端離胺酸被蛋白水解裂解，產生具有SEQ ID NO：72之序列之Fc。同樣，編碼結合物45b之Fc之核酸構築體包括編碼SEQ ID NO：64之胺基酸序列之核酸，而所得之Fc具有SEQ ID NO：73之序列。C端離胺酸之存在或不存在不會改變Fc或相應結合物之性質。實例 157. 結合物 45b 在致死性嚴重複合型免疫缺乏 (SCID) 小鼠模型中針對流感 A (H1N1) 之功效
在雌性BALB/c scid小鼠(Jackson Laboratories，6-8週齡)中針對致死性流感A流感感染評估測試物品。攻擊病毒(A/Puerto Rico/8/1934)係能夠在小鼠中引起致死性感染之小鼠適應性分離株。該實驗包含10組，每組5隻小鼠。在第0天，所有小鼠均在經氯胺酮/甲苯噻嗪之混合物(分別為150及10 mg/kg)麻醉之後藉由鼻內接種經30 µl (大約每隻小鼠1E3個病毒)體積之病毒(3x LD95)攻擊。
在病毒攻擊後兩小時，各組接受了媒劑(PBS)、hIgG1 Fc對照或結合物45b之單一SC處理。該研究之一個獨立研究組由3組經巴洛沙韋瑪波地爾(DC Chemicals, Shanghai, China)經口治療之小鼠組成，每天兩次，持續1天；亦在病毒攻擊後2小時開始。研究設計在表74中概述。監測小鼠持續4週且超過20%體重減輕或被發現垂死之動物經評為死亡。  表74：SCID研究之研究設計
組 流感 病 毒株 測試物品 途徑/ 時程 劑量(mg/kg) 劑量體積(ml/kg) N (balb/c)
1 A/PR/8/34 2E2 PFU/小鼠 PBS SC，T+2 h --- 10 5
2 hIgG1 SC，T+2 h 3 10 5
3 巴洛沙韋 PO，bid x 1天 10 10 5
4 巴洛沙韋 PO，bid x 1天 3 10 5
5 結合物45b SC，T+2 h 10 10 5
6 SC，T+2 h 3 10 5
7 SC，T+2 h 1 10 5
8 SC，T+2 h 0.3 10 5
9 SC，T+2 h 0.1 10 5
10 未感染BW對照物 5
在研究結束時(第28天)，接受結合物45b之小鼠在10至0.3 mg/kg之所有劑量濃度下均受到完全保護(表75)。結合物45b僅在最低0.1 mg/kg測試濃度下無法抵抗致死病毒攻擊。如所預期，接受媒劑或hIgG1 Fc之組未受到保護。用巴洛沙韋治療之小鼠亦受到保護，但是在20 mg/kg之明顯更高累積劑量下(存活率80%)，在6 mg/kg之總劑量下，只有60%之小鼠存活至第28天。  表75：存活率百分比
媒劑 hIgG1 Fc 巴洛沙韋(20) 巴洛沙韋(6) 結合物45b (mg/kg)
天 10 3 1 0.3 0.1 對照物
0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
1 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
2 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
3 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
4 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
5 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
6 80 80 100 100 100 100 100 100 60 100
7 20 20 100 100 100 100 100 100 100 100
8 0 0 100 100 100 100 100 100 100 100
9 0 0 100 100 100 100 100 100 100 100
10 0 0 100 100 100 100 100 100 100 100
11 0 0 100 100 100 100 100 100 100 100
12 0 0 100 100 100 100 100 100 100 100
13 0 0 100 100 100 100 100 100 100 100
14 0 0 100 80 100 100 100 100 100 100
15 0 0 100 80 100 100 100 100 100 100
16 0 0 100 60 100 100 100 100 100 100
17 0 0 100 60 100 100 100 100 100 100
18 0 0 100 60 100 100 100 100 100 100
19 0 0 100 60 100 100 100 100 100 100
20 0 0 100 60 100 100 100 100 100 100
21 0 0 100 60 100 100 100 100 100 100
22 0 0 100 60 100 100 100 100 100 100
23 0 0 100 60 100 100 100 100 80 100
24 0 0 80 60 100 100 100 100 40 100
25 0 0 80 60 100 100 100 100 20 100
26 0 0 80 60 100 100 100 100 20 100
27 0 0 80 60 100 100 100 100 0 100
28 0 0 80 60 100 100 100 100 0 100
對照物=未感染
結合物45b在此嚴重免疫缺乏模型中之效能基於體重亦為顯而易見的(表76)。基於死亡率讀數提供完全保護之結合物最低濃度為0.3 mg/kg。在此劑量水準下，該組之最大平均重量減輕為短暫的，且導致少於3%減少(發生於第4天)。此外，與未感染之小鼠相比，所有完全保護組之體重差異可以忽略不計。  表76：體重百分比
天 媒劑 hIgG1 Fc 巴洛沙韋(20) 巴洛沙韋(6) 結合物45b (mg/kg) 對照物
10 3 1 0.3 0.1
0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
1 99.2 97.6 93.8 96.9 95.8 97.4 98 99 98 101.8
2 101.3 98.7 98.3 98.1 96.7 99.5 96.3 98.3 102.6 100.8
3 95.4 94.9 100.3 98.3 100.6 97.9 100.9 99.6 101 101
4 92.3 90.1 103.3 100.8 100.8 101.3 102.4 97.5 99.2 104.6
5 86.5 84.9 103.2 100.5 102.2 102 102.7 99.8 99.2 103.3
6 78.8 78 100.6 99.7 101.5 101.5 101.4 102 99.2 103.3
7 103.6 100 103.5 101.8 100.5 100.7 101.6 103.7
8 104.2 100.2 103.7 103.1 100.4 103.3 102.7 101.7
9 101.4 97.3 103.6 101.5 100.5 103.1 102.9 102.1
10 100.9 96 102.8 100.8 101.8 104.2 102.7 101.7
11 102.3 98.3 104.2 103.7 102.4 104.5 103.3 103.8
12 103 95.3 105.4 105.9 103 105.4 103.8 103.9
13 103.5 93.4 103.6 105.1 104.1 105.2 104 103.9
14 102.3 91.8 103.3 103.6 103.2 104.8 102.6 103.1
15 102.2 104.2 105.8 102.5 104.8 104.7 103.1
16 102.3 102 101.9 104 104.6 100.1 102.1
17 103.3 102 103.3 104.4 103.8 101.4 102.8
18 103.3 106.4 105.3 105.8 105.1 100.4 104.1
19 105.4 106.6 103.6 106.5 105.6 96.7 103.5
20 105.9 105.1 102.1 105.5 106.3 92.9 103.8
21 106.6 108.6 102.8 106.5 107.6 90.6 106
22 103.8 109.1 103.1 105.7 107.3 86.7 102.1
23 102.1 106.3 101.8 105.5 105.3 99.3
24 100 107.9 104 106 104.8 103.7
25 108.6 105.3 104.9 106.1 104.8
26 110 107.3 107.9 105.4 105.2
27 109 106.8 106 102.1 104
28 108.2 106.2 106.7 101.2 104.4
對照物=未感染
總之，此等數據藉由用低至0.3 mg/kg之結合物之單一SC劑量保護經致死性攻擊之小鼠證明瞭結合物45b之效能。此在完全缺乏清除流感感染所必需的T及B免疫細胞之小鼠的嚴重免疫缺乏模型中實現。此等數據支持使用結合物45b治療免疫缺乏患者群體。實例 158. 經皮下給予之結合物 45b 在致死性小鼠模型中針對流感 A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) 之功效
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8週)中針對致死性IAV H1N1流感感染評估結合物45b。攻擊病毒(A/Puerto Rico/8/1934)係能夠在小鼠中引起致死性感染之小鼠適應性分離株。該實驗包含7組，每組5隻小鼠。在第0天，所有小鼠均在經氯胺酮/甲苯噻嗪之混合物(分別為150及10 mg/kg)麻醉之後藉由鼻內接種經30 µl體積之病毒(3x LD95)攻擊。每天記錄死亡率及體重持續14天且具有20%體重減輕之任何動物均評為死亡。
測試組在病毒攻擊後2小時接受了結合物45b(1、0.3、0.1、0.03或0.01 mg/kg)、hIgG1 Fc對照或媒劑(PBS)之單一皮下(SC)處理。研究設計在表77中概述。  表77：針對流感A/PR/8/34(H1N1)研究之研究設計
組 測試物品 途徑/ 時程 劑量(mg/kg) 劑量體積 (ml/kg) 小鼠數
1 媒劑 SC，T+2 h na 10 5
2 hIgG1 Fc SC，T+2 h 1 10 5
3 結合物45b SC，T+2 h 1 10 5
4 SC，T+2 h 0.3 10 5
5 SC，T+2 h 0.1 10 5
6 SC，T+2 h 0.03 10 5
7 SC，T+2 h 0.01 10 5
如所預期，接受媒劑或hIgG1 Fc對照物之小鼠在第6天死於感染(表78)。然而，經結合物45b治療之小鼠在1、0.3及0.1 mg/kg劑量水準下完全經保護。使用結合物45b時之死亡率僅在最低劑量濃度0.03及0.01 mg/kg下可見。  表78：存活率百分比
結合物45b (mg/kg)
天 媒劑 hIgG1 Fc 1 0.3 0.1 0.03 0.01
0 100 100 100 100 100 100 100
1 100 100 100 100 100 100 100
2 100 100 100 100 100 100 100
3 100 100 100 100 100 100 100
4 100 100 100 100 100 100 100
5 60 40 100 100 100 100 100
6 0 0 100 100 100 100 60
7 0 0 100 100 100 80 0
8 0 0 100 100 100 0 0
9 0 0 100 100 100 0 0
10 0 0 100 100 100 0 0
11 0 0 100 100 100 0 0
12 0 0 100 100 100 0 0
13 0 0 100 100 100 0 0
14 0 0 100 100 100 0 0
結合物45b之效能進一步藉由每天體重量測值支持。如所預期，經媒劑或hIgG1 Fc治療之小鼠證明體重平穩下降，直至其超過20%，此時其經評為死亡(表78)。
與對照小鼠形成對比，接受1、0.3及0.1 mg/kg之結合物45b之彼等組在整個研究中均維持健康體重且僅證明少於7%之短暫體重下降(0.1 mk/kg劑量組，第7天；表79)。結合物45b之存活率及體重量測值均證明使用低至0.1 mg/kg之單一SC劑量時的穩固保護以抵禦流感A/Puerto Rico/8/1934之致死性攻擊。  表79：體重百分比
結合物45b (mg/kg)
天 媒劑 hIgG1 Fc 1 0.3 0.1 0.03 0.01
0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0
1 97.0 98.0 97.7 96.7 98.2 98.8 96.2
2 98.6 99.9 100.8 101.9 101.0 100.5 100.4
3 90.7 92.4 98.8 98.9 96.7 93.3 92.0
4 82.1 83.4 97.7 97.5 95.1 87.5 84.7
5 76.2 76.9 98.4 96.3 94.7 87.6 79.3
6 102.1 102.4 99.7 84.1 76.8
7 101.8 103.1 93.8 78.8
8 100.1 102.3 98.3
9 103.4 103.7 104.3
10 103.9 104.6 102.2
11 101.8 102.5 101.7
12 100.9 101.0 102.3
13 106.0 104.8 105.6
14 106.6 104.0 105.0
實例 159. 經皮下給予之結合物 45b 在致死性小鼠模型中針對流感 A/California/07/2009 (H1N1)pdm 之功效
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8週)中針對致死性IAV H1N1流感感染評估結合物45b。攻擊病毒(A/California/07/2009 (H1N1)pdm)係能夠在小鼠中引起致死性感染之大流行分離株。該實驗包含5組，每組5隻小鼠。在第0天，所有小鼠均在經氯胺酮/甲苯噻嗪之混合物(分別為150及10 mg/kg)麻醉之後藉由鼻內接種經30 µl體積之病毒(3x LD95)攻擊。每天記錄死亡率及體重且具有20%體重減輕之任何動物均評為死亡。
測試組在病毒攻擊後2小時接受了結合物45b或媒劑(PBS)之單一皮下(SC)處理。表80總結了研究設計及劑量水準。  表80：針對流感A/California/07/2009 (H1N1)pdm研究之研究設計
組 測試物品 途徑/ 時程 劑量(mg/kg) 劑量體積 (ml/kg) 小鼠數
1 媒劑 SC，T+2 h na 10 5
2 結合物45b SC，T+2 h 3 10 5
3 結合物45b SC，T+2 h 1 10 5
4 結合物45b SC，T+2 h 0.3 10 5
5 結合物45b SC，T+2 h 0.1 10 5
如預期，接受媒劑之小鼠截至第7天死於感染(表81)。但是，用結合物45b處理之小鼠在低至0.3 mg/kg之濃度下受到完全保護，而在0.1 mg/kg之濃度下受到部分保護(存活率60%)。以小於1 mg/kg之單一劑量達成針對高毒力大流行病毒株之全面保護，證明了結合物45b對於臨床相關A型流感之效能。  表81：存活率百分比
天 媒劑 結合物45b (mg/kg)
      3 1 0.3 0.1
0 100 100 100 100 100
1 100 100 100 100 100
2 100 100 100 100 100
3 100 100 100 100 100
4 100 100 100 100 100
5 80 100 100 100 80
6 40 100 100 100 80
7 0 100 100 100 60
8 0 100 100 100 60
9 0 100 100 100 60
10 0 100 100 100 60
11 0 100 100 100 60
12 0 100 100 100 60
13 0 100 100 100 60
14 0 100 100 100 60
結合物45b之效能進一步藉由每天體重量測值支持。如所預期，經媒劑治療之小鼠證明體重平穩下降，直至其超過20%，此時其經評為死亡(表82)。
與對照小鼠形成對比，接受3、1或0.3 mg/kg之結合物45b之小鼠僅證明大約10%之短暫體重下降，在第3-5天達到峰值(表82)。在研究結束時(第14天)，此等小鼠之體重基本恢復(或超過了其初始體重)。結合物45b之存活率及體重量測值均證明使用經SC投與之單一0.3 mg/kg劑量時的穩固保護以抵禦流感A/California/07/2009 (H1N1)pdm之致死性攻擊。針對此研究中所用之臨床相關大流行病毒株之活性支持結合物45b在治療嚴重流感感染時的效用。  表82：體重百分比
天 媒劑 結合物 45b (mg/kg)
      3 1 0.3 0.1
0 100 100 100 100 100
1 96.9 95.9 97.1 96.3 96.1
2 99.8 98.2 99.2 100.3 101.5
3 90 94.2 91.1 91.7 90.1
4 81 91.2 89.7 88.1 83.2
5 77.8 94.2 93.2 90.4 82.1
6 97.8 97.4 92.1
7 97.6 96.3 90.3
8 98.6 96.4 91.4
9 101.3 98.9 94
10 99.3 98.9 92.8
11 100.4 101.7 95.3
12 99.5 100.8 96.7
13 100.1 100.9 97.3
14 103.3 103.3 99.9
實例 160. 經皮下給予之結合物 45b 在致死性小鼠模型中針對流感 A/Hong Kong/1/1968 (H3N2) 之功效。
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8週)中針對致死性IAV H3N2流感感染評估結合物45b。攻擊病毒(A/Hong Kong/1/1968)係能夠在小鼠中引起致死性感染之小鼠適應性分離株。該實驗包含3組，每組5隻小鼠。在第0天，所有小鼠均在經氯胺酮/甲苯噻嗪之混合物(分別為150及10 mg/kg)麻醉之後藉由鼻內接種經30 µl體積之病毒(3x LD95)攻擊。每天記錄死亡率及體重且具有20%體重減輕之任何動物均評為死亡。
測試組在病毒攻擊後2小時接受了結合物45b或媒劑(PBS)之單皮下(SC)處理。研究設計在表83中概述。  表83：流感A/Hong Kong/1/1968 (H3N2)研究之研究設計
組 測試物品 途徑/ 時程 劑量(mg/kg) 劑量體積 (ml/kg) 小鼠數
1 媒劑 SC，T+2 h na 10 5
2 結合物45b SC，T+2 h 1 10 5
3 結合物45b SC，T+2 h 0.3 10 5
如預期，接受媒劑之小鼠截至第7天死於感染(表84)。然而，經結合物45b治療之小鼠在1及0.3 mg/kg劑量水準下完全經保護。在該研究中，結合物45b之劑量不低於0.3 mg/kg。  表84：存活率百分比
天 媒劑 結合物45b (mg/kg)
      1 0.3
0 100 100 100
1 100 100 100
2 100 100 100
3 100 100 100
4 100 100 100
5 40 100 100
6 20 100 100
7 0 100 100
8 0 100 100
9 0 100 100
10 0 100 100
11 0 100 100
12 0 100 100
13 0 100 100
14 0 100 100
結合物45b之效能進一步藉由每天體重量測值支持。如所預期，經媒劑治療之小鼠證明體重平穩下降，直至其超過20%，此時其經評為死亡(表85)。
與對照組小鼠相比，接受1及0.3 mg/kg結合物45b之彼等組在整個研究過程中保持了近乎健康體重，並且在恢復接近初始體重之前截至研究結束，從未表現出超過11%之短暫體重下降(表85)。結合物45b之存活率及體重量測值均證明使用低至0.3 mg/kg之單一SC劑量時的穩固保護以抵禦流感A(H3N2)之致死性攻擊。  表85：體重百分比
天 媒劑 結合物45b (mg/kg)
      1 0.3
0 100 100 100
1 99.2 96 98.1
2 94.1 94.2 94.4
3 89.5 91 89.1
4 88.6 94.1 90.5
5 84.1 93.1 89.1
6 96.3 90.6
7 95 90.2
8 97.3 92.8
9 96.7 93.2
10 97.8 94.6
11 99.9 97.5
12 98.3 97.4
13 98.9 99.5
14 98.6 100.2
實例 161. 結合物 45b 在致死性小鼠模型中抗 B 型流感 (Victoria 譜系 ) 之功效
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8週)中針對致死性B型流感感染評估結合物45b。攻擊病毒(B/Malaysia/8/1934)係能夠在小鼠中引起致死性感染之小鼠適應性分離株。該實驗包含6組，每組5隻小鼠。在第0天，所有小鼠均在經氯胺酮/甲苯噻嗪之混合物(分別為150及10 mg/kg)麻醉之後藉由鼻內接種經30 µl (大約每隻小鼠1E4)體積之病毒(3x LD95)攻擊。
所有組均在病毒攻擊之後2小時接受測試物品、媒劑(PBS)或單獨Fc對照物(hIgG1 Fc)之單一SC治療。該研究評估了結合物45b之1、0.3、0.1及0.03 mg/kg之濃度。監測小鼠持續2週且超過20%體重減輕或被發現垂死之動物經評為死亡。
經媒劑或單獨Fc對照物治療之所有小鼠截至第7天均達到死亡。相反，接受1、0.3或0.1 mg/kg結合物45b之小鼠在接受單次SC劑量後得到完全保護(表86)。每日身體量測值(表87)進一步支持了結合物45b對B型流感之效能，該等量測值在0.3 mg/kg時顯示出小於5%之短暫下降。  表86：存活率百分比
天 媒劑 hIgG1 Fc (1) 結合物45b (mg/kg)
         1 0.3 0.1 0.03
0 100 100 100 100 100 100
1 100 100 100 100 100 100
2 100 100 100 100 100 100
3 100 100 100 100 100 100
4 100 100 100 100 100 100
5 100 100 100 100 100 100
6 100 80 100 100 100 100
7 0 0 100 100 100 20
8 0 0 100 100 100 0
9 0 0 100 100 100 0
10 0 0 100 100 100 0
11 0 0 100 100 100 0
12 0 0 100 100 100 0
13 0 0 100 100 100 0
14 0 0 100 100 100 0
表87：體重百分比
天 媒劑 hIgG1 Fc (1) 結合物 45b (mg/kg)
         1 0.3 0.1 0.03
0 100 100 100 100 100 100
1 98.1 97 98.1 98.2 97.8 98.7
2 98.7 99.7 101.7 100.6 101.5 102.7
3 97.8 97.7 102.1 98.4 101.6 101.3
4 88 87.7 99.8 96.9 96.8 92
5 78.3 80.6 99.6 95.4 94.5 83.8
6 77.9 77.6 102.5 100.1 90.7 80
7 103.5 100.7 86.1 75.3
8 103 100.3 86.3
9 103.2 101.1 91.5
10 102.8 101 94
11 101.2 99.7 94.1
12 101.9 99.9 96.1
13 102.9 101.6 97.6
14 102.5 99.9 98.6
實例 162. 結合物 45b 在致死性小鼠模型中抗 B 型流感 (Yamagata 譜系 ) 之功效
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8週)中針對致死性B型流感感染評估結合物45b。攻擊病毒(B/Florida/4/2006)係能夠在小鼠中引起致死性感染之小鼠適應性分離株。該實驗包含7組，每組5隻小鼠。在第0天，所有小鼠均在經氯胺酮/甲苯噻嗪之混合物(分別為150及10 mg/kg)麻醉之後藉由鼻內接種經30 µl (大約每隻小鼠3E4)體積之病毒(3x LD95)攻擊。
所有組均在病毒攻擊之後2小時接受測試物品、媒劑(PBS)或單獨Fc對照物(hIgG1 Fc)之單一SC治療。該研究評估結合物45b之3至0.03 mg/kg之濃度。監測小鼠持續2週且超過20%體重減輕或被發現垂死之動物經評為死亡。
用媒劑處理之所有小鼠截至第8天均死亡，而hIgG1 Fc對照具有80%之死亡率。相反，在所有測試濃度下接受單次SC劑量後，接受結合物45b之小鼠均受到完全保護(表88)。  表88：存活率百分比
天 媒劑 hIgG1 Fc (1) 結合物45b (mg/kg)
         3 1 0.3 0.1 0.03
0 100 100 100 100 100 100 100
1 100 100 100 100 100 100 100
2 100 100 100 100 100 100 100
3 100 100 100 100 100 100 100
4 100 100 100 100 100 100 100
5 100 100 100 100 100 100 100
6 100 100 100 100 100 100 100
7 40 60 100 100 100 100 100
8 0 40 100 100 100 100 100
9 0 20 100 100 100 100 100
10 0 20 100 100 100 100 100
11 0 20 100 100 100 100 100
12 0 20 100 100 100 100 100
13 0 20 100 100 100 100 100
14 0 20 100 100 100 100 100
每日身體量測結果進一步證明了結合物45b對B型流感病毒(Yamagata)之效能(表89)，該等量測結果在最低測試濃度0.03 mg/kg時，短暫下降小於4%。 表89：體重百分比
天 媒劑 hIgG1 Fc (1) 結合物45b (mg/kg)
         3 1 0.3 0.1 0.03
0 100 100 100 100 100 100 100
1 98.7 100.5 97.8 99.2 99.1 98.7 96.8
2 99.6 99.8 99.1 98.4 98.9 99.4 98.6
3 98.7 99.3 100.8 101.2 101.2 103.8 100.9
4 89.8 91 100.4 99.3 98.3 98.5 97.3
5 84.6 87.6 99.2 97.5 98 98.2 96.2
6 80.2 86.6 103.4 100.7 100.9 101.8 100.4
7 75.5 79.9 101.3 102.3 100.8 101.4 96.9
8 102.7 103 103 102.7 99.2
9 100.2 101.9 101.7 100 99
10 102.6 102.8 101.7 101.3 100.7
11 103 105.1 104.1 102.3 101.9
12 101 103.2 101.8 100.2 100.1
13 103.3 104.9 103.9 103.7 104.2
14 101.8 104.6 103.1 101.6 102.1
實例 163. 在 28 天之小鼠預防模型中，結合物 45b 對 H1N1 、 H3N2 及 B 型流感 (Victoria) 之功效
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8週)中，針對藉由季節性流感亞型(H1N1、H3N2及B(Victoria譜系))之致死性攻擊，評估了結合物45b。實驗包括13組，每組5隻小鼠，第6組(媒劑，A/HK/1/68攻擊)除外，該組由4隻動物組成。在第0天，以單劑量3、1或0.3 mg/kg對小鼠皮下(SC)投與結合物45b。對照小鼠亦藉由相同途徑僅用媒劑(PBS)或hIgG1 Fc治療。投與測試物品後之28天，使用以下季節性流感亞型之一(3x LD95 )，對小鼠進行鼻內攻擊：  A/California/07/2009 (H1N1) A/Hong Kong/1/1968 (H3N2) B/Malaysia/8/1934 (B；Victoria譜系)
對於病毒攻擊，用氯胺酮/甲苯噻嗪混合物(分別為150及10 mg/kg)麻醉小鼠，並以30 µl之體積給予病毒。每天記錄死亡率及體重且具有20%體重減輕之任何動物均評為死亡。
對於研究之H1N1組，所有接受媒劑治療之小鼠僅截至第7天死於感染。單獨Fc對照物亦不具有保護性，在研究結束時(第42天，病毒攻擊後14天)存活率僅為20%。然而，在1 mg/kg之單次SC劑量後，結合物45b對此大流行分離株具有完全保護作用(P = 0.0020；表90)。即使以最低測試濃度(0.3 mg/kg)，亦有80%之小鼠存活至研究結束。每日體重(BW)百分比量測結果進一步支持了該模型中結合物45b之功效(表91)，在1 mg/kg下，小鼠具有12.1%之短暫減輕，此情況對於此高致病性病毒株而言係典型的，到研究結束已基本上恢復(起始值之96.5%)。  表90： H1N1存活率百分比
天 媒劑 hIgG1 Fc (3) 結合物45b (mg/kg)
         3 1 0.3
0 100 100 100 100 100
1 100 100 100 100 100
2 100 100 100 100 100
3 100 100 100 100 100
4 100 100 100 100 100
5 100 40 100 100 100
6 20 40 100 100 80
7 0 20 100 100 80
8 0 20 100 100 80
9 0 20 100 100 80
10 0 20 100 100 80
11 0 20 100 100 80
12 0 20 100 100 80
13 0 20 100 100 80
14 0 20 100 100 80
表91： H1N1體重百分比*
天 媒劑 hIgG1 Fc (3) 結合物45b (mg/kg)
         3 1 0.3
0 100 100 100 100 100
1 100.2 93.6 99.6 93 97
2 97.1 93 99.5 93 97.7
3 89.1 87 92.7 88.1 90.9
4 82.3 80.6 89.8 89.1 89.4
5 77.7 77.4 89 88 87.2
6 88.9 87.9 87
7 90.9 90.7
8 92.1 90.5
9 92.9 90.4
10 96 92.2
11 95.1 94.5
12 94.7 94.3
13 96.2 96.2
14 97 96.5
*注意，僅在組內第一例死亡之前提供BW
對於研究之H3N2組(A/Hong Kong/1/1968)，所有接受媒劑治療之小鼠僅截至第8天就死於感染。與僅使用媒劑之治療相反，即使在0.3 mg/kg之劑量水準下，所有結合物45b濃度亦均具有完全保護作用(P = 0.0007；表92)。如該研究之H1N1組所見，每日BW量測結果進一步證明了結合物45b對H3N2亞型之功效(表93)，在0.3 mg/kg下，小鼠之短暫減輕少於11%，且到研究結束時BW基本上恢復(初始值之98.4%)。  表92： H3N2存活率百分比
天 媒劑 結合物45b (mg/kg)
      3 1 0.3
0 100 100 100 100
1 100 100 100 100
2 100 100 100 100
3 100 100 100 100
4 100 100 100 100
5 100 100 100 100
6 100 100 100 100
7 75 100 100 100
8 0 100 100 100
9 0 100 100 100
10 0 100 100 100
11 0 100 100 100
12 0 100 100 100
13 0 100 100 100
14 0 100 100 100
表93： H3N2體重百分比
天 媒劑 結合物45b (mg/kg)
      3 1 0.3
0 100 100 100 100
1 98.4 99.2 99.1 100
2 93.7 98.5 97.7 99.1
3 88.2 96.7 94.6 95.3
4 88.5 97.3 93.4 95.6
5 86.2 95.8 94 92.6
6 81.4 96.8 94.6 89.3
7 77 99.8 97.1 89.6
8 100.3 97.8 91.5
9 98.2 96.9 91.7
10 101.3 101.2 96.8
11 100.5 100.8 97.9
12 98.6 99.7 96.5
13 99.3 98.3 97
14 99.7 100.1 98.4
該研究之最終組確定了結合物45b抗B型流感之Victoria譜系之功效。在本研究其他組中通常發現，截至第7天，僅接受媒劑治療之小鼠死於感染。與針對H1N1亞型之結果相似，在投與結合物45b一個月後，1 mg/kg之單一SC劑量可以完全抵抗B型流感之致死攻擊(表94；P = 0.0031)。在最低測試濃度(0.1 mg/kg)下，60%之小鼠存活。與研究之其他組一樣，BW數據支持結合物45b之效能。針對B/Malaysia病毒株，以1 mg/kg治療之動物表現出小於6%之暫時性BW減輕，該暫時性BW減輕研究結束前已恢復(表95；100.2%)。  表94： B型流感存活率百分比
天 媒劑 結合物45b (mg/kg)
      3 1 0.3
0 100 100 100 100
1 100 100 100 100
2 100 100 100 100
3 100 100 100 100
4 100 100 100 100
5 100 100 100 100
6 60 100 100 100
7 0 100 100 100
8 0 100 100 40
9 0 100 100 40
10 0 100 100 40
11 0 100 100 40
12 0 100 100 40
13 0 100 100 40
14 0 100 100 40
表95： B型流感體重百分比
天 媒劑 結合物45b (mg/kg)
      3 1 0.3
0 100 100 100 100
1 97.3 98.7 97.2 98.6
2 97.1 98.8 98.9 99.2
3 96.4 99.2 98.6 98.6
4 88.5 99.6 98.3 96.8
5 80.8 96.2 95.8 90
6 77 96.5 94.5 86.2
7 97.8 95.5 82.8
8 100.5 97 81.6
9 100.1 97.3
10 102.3 99.7
11 102.3 100.3
12 100.7 98.7
13 98.7 98.3
14 101.6 100.2
實例 164. 活體外斑塊減少檢定
在接種在24孔板中之Madin Darby犬腎臟(MDCK)細胞中進行斑塊減少檢定。將500,000個MDCK細胞接種在0.5 mL含10% FBS之培養基(DMEM)中，並培育約24小時。在含PBS、35%牛白蛋白及Ca2+ /mg2+ 之緩衝液中進行測試物品及所用病毒H1N1 WT(A/California/12/2012)及H275Y(A/Texas/23/2012)、H3N2 WT(A/Washington/12/2007)及E119V(A/Texas/12/2007)及B(B/Malaysia/2506/2004)之稀釋。將結合物45b及巴洛沙韋、紮那米韋、奧司他韋比較物在室溫下與病毒一起預培育30分鐘，然後將其在移除培養基並用PBS洗滌一次後添加至MDCK細胞之單層中。選擇每種藥物-病毒組合之MOI以靶向PBS對照孔中之30個斑塊。吸附進行1小時，移除病毒-測試物品混合物，並將感染之細胞在測試物品存在下培育48小時，該測試物品用1.25% Avicel、DMEM、0.01%DEAE-葡聚糖及2 µg/mLTPCK胰蛋白酶之混合物稀釋。48小時後，移除Avicel混合物，並用多聚甲醛固定細胞，並用1%結晶紫染色以對斑塊計數。所有藥物均以六種濃度測試，濃度範圍為0.3至100 nM。使用GraphPad Prism軟體計算EC50 值(nM)。結果總結在表96中。  表96： WT及NA突變流感病毒株之結合物45b斑塊減少檢定EC50 值之概述
分子 EC50 (nM)
A/CA/12/2012 (H1N1) A/TX/23/2012 (H1N1) H275Y A/WA/12/2007 (H3N2) A/TX/12/2007 (H3N2) E119V B/Malaysia/2506/2004
結合物45b 1 1.2 ≤0.3 1.2 4.1
巴洛沙韋 4 1.6 4.8 3.2 8.4
紮那米韋 35 93.8 ＞100 74 17.3
奧司他韋 ＞100 ＞100 29.6 ＞100 22.1
結合物45b在斑塊減少檢定中證明了其對所有H1N1、H3N2及B病毒株之有效活性，產生之EC50 值低於所有三種比較劑之EC50 值(表96)。此外，賦予耐奧司他韋性之NA突變E119V及H275Y之存在對結合物45b之活性影響很小。實例 165. 用於選擇抗性流感病毒之連續繼代實驗
為了評估在病毒抑制劑之選擇性壓力下開發耐藥性突變型病毒株之潛力，相對奧司他韋及巴洛沙韋比較物，用結合物45b進行連續繼代研究。使用MDCK細胞進行了連續繼代研究。如下進行繼代：每孔(24-孔) 500,000個MDCK細胞接種於500 µl DMEM 10% FBS、1% PS、1% NaPyr及1% HEPES中且經培育持續大約24小時。一旦細胞達到大約80%匯合，其用PBS洗滌一次且在正常培養條件下在化合物或單獨PBS存在下經培育持續2小時。如最大病毒抑制所需最佳化選擇劑濃度，同時維持充足病毒產生以用於後續繼代。連續繼代實驗中使用之結合物45b、巴洛沙韋及奧司他韋之濃度分別為4 nM、4 nM及200 nM。細胞在室溫下在含有PBS、牛白蛋白35%及Ca2+ /Mg2+ 之緩衝液中以0.01之MOI經A/California/07/2009 H1N1 pdm感染，隨後移除接種物且用DMEM 1% PS、1% NaPyr及1% HEPES (無FBS)洗滌細胞一次。細胞接著在稀釋於DMEM 1% PS、1% NaPyr、1% HEPES及2 µg/ml經TPCK處理之胰蛋白酶中之選擇劑存在下經培育持續24小時。在培育之後，收集病毒上清液，且藉由離心(5 min，4℃，1,400xg)移除細胞及碎片。上清液接著用於：  i藉由斑塊分析對病毒效價進行定量 ii 進行血細胞凝集分析以確定該病毒是否逃逸化合物抑制 iii 在化合物存在下再感染剛剛接種之MDCK細胞
針對10次繼代來重複該過程。一旦偵測到在藥物存在下增加之效價，該等病毒即可經斑塊純化。在斑塊純化之後，所有8個基因組區段皆可經測序且與經PBS處理之對照病毒相比以偵測逃逸突變。圖83示出了連續繼代之概述。在10次繼代之過程中，關於結合物45b未觀察到病毒效價之增加(表明未出現抗性突變體)，而巴洛沙韋及奧司他韋效價分別在第6次及第8次繼代之後增加至類似於PBS對照物中所觀察到之彼等水準的水準。實例 166. 細胞病理效應檢定
為了量測結合物45b保護哺乳動物細胞免於被流感病毒感染及破壞之能力，如實例25中所述，伴以很小變化，進行了基於細胞病理效應(CPE)之微量中和檢定。簡而言之，用A型或B型流感病毒株以0.001-1之適當MOI感染單層MDCK細胞。加入濃度範圍在0.1-10,000 nM之間之測試物品，並在37℃，5% CO2 下培育3天(對於A型流感)或5天(對於B型流感)。藉由讀取595 nm處之吸光度，藉由結晶紫染色確定CPE。結果顯示在下表97及表98中。  表97：在MOI為0.01或MOI 0.001下，結合物45b對流感A H1N1之CPE(CPE [nM])
分子 TM DAR Fc 中心連接體 A/WSN/1933 A/CA/07/2009pdm A/CA/12/2012 H275 A/Texas/23/2012 H275Y 突變體
奧司他韋 N/A N/A N/A N/A ＞10,000 34.2 107.6 ＞10,000
紮那米韋 N/A N/A N/A N/A N/A 33.16 54.59 327.7
結合物45b Int-83 4.2 SEQ ID NO: 73 15個原子 3.676 2.964 0.7043 2.101
巴洛沙韋 N/A N/A N/A N/A 11.35 2.216 3.718 3.318
表98：在MOI 0.01或MOI 0.001下，結合物45b對流感A H3N2之CPE(CPE [nM])
分子 TM DAR Fc 中心連接體 A/HK/1/1968 A/Wisconsin/04/2018 A/Bethesda/956/2006 R292K 突變體 A/Washington/12/2007 A/Texas/12/2007 E119V 突變體
奧司他韋 N/A N/A N/A N/A 0.7444 151.1 ＞10,000 1.908 351.4
紮那米韋 N/A N/A N/A N/A ＜0.3 308 9591 1.968 2.096
結合物45b Int-83 4.2 SEQ ID NO: 73 15個原子 ＜0.3 8.99 54.01 0.04449 0.6594
巴洛沙韋 N/A N/A N/A N/A 2.596 4.916 17.15 0.5252 5.602
實例 167. 用活 A 型流感病毒或神經胺糖酸酶抗性突變體之裂解物抑制神經胺糖酸酶
神經胺糖酸酶抑制作用(NAI)。將測試物品與神經胺糖酸酶(Sino Biological)或活病毒在37℃，5% CO2 下培育20分鐘。將2'-(4-甲基繖形基)-α-D-N乙醯神經胺酸受質添加至適當之孔中，並在37℃，5% CO2 下培育1小時。藉由讀取355 nm激發/460 nm發射之螢光來確定NAI。確定了神經胺糖酸酶抗性突變體及活流感病毒之神經胺糖酸酶抑制作用(表99、表100、表101、表102及表103)。  表99：針對活流感A (H1N1)病毒之NAI
分子 TM DAR Fc 中心連接體 A/Ca/07/2009 (H1N1)pdm IC50 [nM] A/PR/8/1934 (H1N1) IC50 [nM] A/California/12/2012 (H1N1)pdm09 IC50 [nM] A/Texas/23/2012 (H1N1)pdm09 H275Y IC50 [nM]
奧司他韋 N/A N/A N/A N/A 0.9103 2.427 1.28 367.9
紮那米韋 N/A N/A N/A N/A 0.5634 0.6041 0.8891 0.8505
Int-83 N/A N/A N/A 15個原子 28.59 4.231 45.08 26.47
結合物45b Int-83 4.8 SEQ ID NO: 73 15個原子 0.8124 0.07184 2.527 1.471
*所有活病毒均以1e6 PFU測試。 表100：針對活流感A (H3N2)病毒之NAI
分子 TM DAR Fc 中心連接體 A/Wash/1/2007 (H3N2) IC50 [nM] A/Texas/12/2007 (H3N2) E119V IC50 [nM] A/Texas/71/2017 (H3N2) IC50 [nM] A/Bethesda/956/2006 (H3N2) R292K* IC50 [nM]
奧司他韋 N/A N/A N/A N/A 0.2086 114.2 0.9502 4667
紮那米韋 N/A N/A N/A N/A 4.845 3.085 2.321 31.59
Int-83 N/A N/A N/A 15個原子 99.05 50.22 301.1 1147
結合物45b Int-83 4.8 SEQ ID NO: 73 15個原子 0.0233 2.79 11.3 23.55
*所有活病毒均以1e6 PFU測試(以1e5 PFU測試之R292K除外) 表101：針對活流感A (H1N1)pdm09病毒之NAI
分子 TM DAR Fc 中心連接體 A/Illinois/08/2018 (H1N1)pdm09 I38 WT IC50 [nM] A/Illinois/37/2018 (H1N1)pdm09 I38L IC50 [nM] A/Illinois/08/2018 (H1N1)pdm09 I38T IC50 [nM]
奧司他韋 N/A N/A N/A N/A 0.43 0.71 0.58
紮那米韋 N/A N/A N/A N/A 0.37 0.47 0.50
Int-83 N/A N/A N/A 15個原子 5.90 6.16 4.81
結合物45b Int-83 4.8 SEQ ID NO: 73 15個原子 0.04 0.10 0.01
*所有活病毒均以1e7 PFU測試。 表102：針對活流感A (H3N2)病毒之NAI
分子 TM DAR Fc 中心連接體 A/Louisiana/50/2017 (H3N2) I38 WT IC50 [nM] A/Louisiana/49/2017 (H3N2) I38M IC50 [nM]
奧司他韋 N/A N/A N/A N/A 0.26 0.19
紮那米韋 N/A N/A N/A N/A 0.48 0.37
Int-83 N/A N/A N/A 15個原子 47.72 26.09
結合物45b Int-83 4.8 SEQ ID NO: 73 15個原子 4.58 5.13
*所有活病毒均以1e7 PFU測試。 表103：針對B型流感病毒之NAI
分子 TM DAR Fc 中心連接體 B/Florida/4/2006 (Yamagata) IC50 [nM] B/Malaysia/2506/2004 (Victoria) IC50 [nM] B/Colorado/6/2017 (Victoria) IC50 [nM]
奧司他韋 N/A N/A N/A N/A 14.37 32.02 35.03
紮那米韋 N/A N/A N/A N/A 4.755 4.147 5.112
Int-83 N/A N/A N/A 15個原子 275.3 273.1 124.8
結合物45b Int-83 4.8 SEQ ID NO: 73 15個原子 2.888 1.514 19.83
*所有活病毒均以1e6 PFU測試。實例 168. 抗體依賴性細胞吞噬檢定
測試結合物45b之抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)。將單層MDCK細胞用MOI為0.001-10之A型或B型流感病毒株感染，並在5% CO2 中於37℃培育18-24小時。ADCP係根據製造商之說明使用商業報告細胞株(PROMEGA)確定。簡而言之，將測試物品以1至10,000 nM之濃度添加至適當之孔中，並在5% CO2 中於37℃培育15 m。藉由讀取發光來定量ADCP。針對流感A/PR/8/1934(H1N1)、流感A/CA/07/2009(H1N1)及流感A/HK/1/1968(H3N2)(分別為表104-106)及流感B/Malaysia/2506/2004(Victoria，表107)，測試結合物45b及單獨Fc(SEQ ID NO：73，類似於實例124製備)，顯示結合物45b引起MOI依賴性ADCP增加。在10之MOI下，結合物45b亦顯示了針對流感A/PR/8/1934(H1N1)、流感A/CA/07/2009(H1N1)及流感A/HK/1/1968(H3N2)(分別為表108-110)及流感B/Malaysia/2506/2004(Victoria，表111)之ADCP劑量依賴性增加。  表104：結合物45b針對A型流感之MOI依賴性ADCP增加(倍數誘導)
流感 A/PR/8/1934 (H1N1) MOI 單獨Fc 結合物45b[ 1 µM]
0 1 1
0.1 1.13 1.8
0.3 1.21 9.95
1 0.96 13.77
3 1.1 14.94
10 1.05 13.76
表105：結合物45b針對A型流感之MOI依賴性ADCP增加(倍數誘導)
流感A/CA/7/2009 (H1N1)pdm MOI 單獨Fc 結合物45b[ 1 µM]
0 0.98 1.02
0.1 1.14 6.33
0.3 1.03 22.16
1 0.99 18.27
3 0.93 19.61
10 1.05 21.11
表106：結合物45b針對A型流感之MOI依賴性ADCP增加(倍數誘導)
流感 A/HK/1/1968 (H3N2) MOI 單獨Fc 結合物45b[ 1 µM]
0 1.02 0.98
0.1 1.07 1.48
0.3 1.05 2.63
1 1.18 2.74
3 1.01 4.3
10 1.06 4.39
表107：結合物45b針對B型流感之MOI依賴性ADCP增加(倍數誘導)
流感 B/Malaysia/2506/2004 MOI 單獨Fc 結合物45b[ 1 µM]
0 1.07 0.93
0.1 0.98 1.67
0.3 0.99 6.93
1 1.14 25.86
3 1.11 34.29
10 1 30.38
表108：在MOI 10下，結合物45b針對A型流感之劑量依賴性ADCP增加(倍數誘導)
流感A/PR/8/1934 (H1N1) [nM] 單獨Fc 結合物45b
0 0.96 1.04
100 1.22 3.44
300 1.56 7
1000 1.91 17.04
3000 2.22 28.54
10000 3.08 44.93
表109：在MOI 10下，結合物45b針對A型流感之劑量依賴性ADCP增加(倍數誘導)
流感A/CA/7/2009 (H1N1)pdm [nM] 單獨Fc 結合物45b
0 0.98 1.02
100 1.64 2.32
300 1.74 5.41
1000 2.15 10.04
3000 2.13 24.28
10000 2.24 33.87
表110：在MOI 10下，結合物45b針對A型流感之劑量依賴性ADCP增加(倍數誘導)
流感A/HK/1/1968 (H3N2) [nM] 單獨Fc 結合物45b
0 1.01 0.99
100 1.03 1.81
300 1.48 3.33
1000 2.29 6.09
3000 2.87 9.01
10000 2.11 9.96
表111：在MOI 10下，結合物45b針對流感B/Malaysia/2506/2004之劑量依賴性ADCP增加(倍數誘導)
流感 B/Malaysia/2506/2004 MOI 單獨Fc 結合物45b
0 1.15 0.85
100 1.3 6.67
300 2.09 26.21
1000 2.32 61.43
3000 3.26 96.95
10000 3.91 104.49
實例 169. 抗體依賴性細胞毒性檢定
測試結合物45b之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。將單層MDCK細胞用MOI為0.001-10之A型或B型流感病毒株感染，並在5% CO2 中於37℃培育18-24小時。ADCC係根據製造商之說明使用商業報告細胞株(PROMEGA)確定。簡而言之，將測試物品以1至10,000 nM之濃度添加至適當之孔中，並在5% CO2 中於37℃培育15 m。藉由讀取發光來對ADCC進行定量。針對流感A/PR/8/1934(H1N1)、流感A/CA/07/2009(H1N1)及流感A/HK/1/1968(H3N2)(分別為表112-114)及流感B/Malaysia/2506/2004(Victoria，表115)，測試結合物45b及單獨Fc(SEQ ID NO：73，類似於實例124製備)，顯示結合物45b引起MOI依賴性ADCC增加。在10之MOI下，結合物45b亦顯示了針對流感A/PR/8/1934(H1N1)、流感A/CA/07/2009(H1N1)及流感A/HK/1/1968(H3N2)(分別為表116-118)及流感B/Malaysia/2506/2004(Victoria，表119)之ADCC劑量依賴性增加。  表112：結合物45b針對A型流感之MOI依賴性ADCC增加(倍數誘導)
流感 A/PR/8/1934 (H1N1) MOI 單獨Fc 結合物45b[ 1 µM]
0 0.97 1.03
0.1 1.22 1.54
0.3 1.27 2.27
1 1.47 4.03
3 1.92 6.14
10 2.34 11.46
表113：結合物45b針對A型流感之MOI依賴性ADCC增加
流感A/CA/7/2009 (H1N1)pdm MOI 單獨Fc 結合物45b[ 1 µM]
0 1.02 0.98
0.1 1.23 1.48
0.3 1.4 2.21
1 1.62 3.74
3 1.74 6.08
10 2.14 9.59
表114：結合物45b針對A型流感之MOI依賴性ADCC增加(倍數誘導)
流感 A/HK/1/1968 (H3N2) MOI 單獨Fc 結合物45b[ 1 µM]
0 0.99 1.01
0.1 1.31 1.46
0.3 1.66 2.17
1 2.48 3.4
3 1.43 2.74
10 0.89 2.34
表115：結合物45b針對B型流感之MOI依賴性ADCC增加(倍數誘導)
流感 B/Malaysia/2506/2004 MOI 單獨Fc 結合物45b[ 1 µM]
0 0.97 1.03
0.1 1.27 3.6
0.3 1.64 9.38
1 2.36 22.09
3 2.65 26.21
10 2.87 34.46
表116：在MOI 10下，結合物45b針對A型流感之劑量依賴性ADCC增加(倍數誘導)
流感A/PR/8/1934 (H1N1) [nM] 單獨Fc 結合物45b
0 0.93 1.07
100 1.12 1.78
300 1.25 3.8
1000 1.4 5.16
3000 1.19 7.09
10000 1.03 5.68
表117：在MOI 10下，結合物45b針對A型流感之劑量依賴性ADCC增加(倍數誘導)
流感A/CA/7/2009 (H1N1)pdm [nM] 單獨Fc 結合物45b
0 0.91 1.09
100 1.16 3.44
300 1.02 5.53
1000 1.21 6.18
3000 1.17 6.05
10000 1.15 5.48
表118：在MOI 10下，結合物45b針對A型流感之劑量依賴性ADCC增加(倍數誘導)
流感 A/HK/1/1968 (H3N2) [nM] 單獨 Fc 結合物 45
0 0.97 1.03
100 1.11 1.42
300 1.15 2.24
1000 1.11 2.93
3000 1.11 3.08
10000 1.09 2.67
表119：在MOI 10下，結合物45b針對流感B/Malaysia/2506/2004之劑量依賴性ADCC增加(倍數誘導)
流感 B/Malaysia/2506/2004 MOI 單獨Fc 結合物45
0 0.96 1.04
100 1.18 4.16
300 1.11 5.34
1000 1.18 15.21
3000 1.04 14.84
10000 1.02 12.11
實例 170. 結合物 45b 在致死性小鼠流感模型中之功效： 研究編號 58
針對雌性BALB/c小鼠(6-8週齡，n = 5隻/組)中之致死性A/PR/8/1934(3E2 PFU)流感，對結合物45b進行了評估。研究設計在表120中顯示。在感染後t = + 2 h(SC)用測試物品對小鼠進行治療，其中使用單一劑量之結合物45b，或者每天兩次對照藥物持續4天。每天監測所有小鼠之體重。感染後第4天處死小鼠，並收穫兩個肺葉。將肺均質化以確定病毒負荷及免疫反應。數據展示於表121-123中。  表120：功效研究編號58設計
組 測試物品(DAR) 途徑/ 時程 劑量[mg/kg] 劑量/ 天[mg/kg]
1 PBS SC, T+2h N/A N/A
2 hIgG1 Fc SC, T+2h 3 3
3 奧司他韋 PO, BID x 4 5 10
4 奧司他韋 PO, BID x 4 50 100
5 巴洛沙韋 PO, BID x 4 15 30
6 結合物45b(4.8) SC, T+2h 0.1 0.1
7 結合物45b (4.8) SC, T+2h 0.3 0.3
8 結合物45b(4.8) SC, T+2h 1 1
9 結合物45b(4.8) SC, T+2h 3 3
10 未感染 N/A N/A N/A
表121：感染後第4天之病毒負荷(PFU/g)
組 測試物品[mg/kg] PFU/g Log 減少 PFU/g
1 PBS [0] 1.92E+07 0.00
2 hIgG1 Fc [3] 5.12E+07 -0.43
3 奧司他韋[5] 2.86E+06 0.83
4 奧司他韋[50] 2.66E+06 0.86
5 巴洛沙韋[15] BLD (＜10) N/A (＞6)
6 結合物45b[0.1] 1.50E+06 1.11
7 結合物45b[0.3] 1.26E+05 2.18
8 結合物45b[1] 1.32E+04 3.16
9 結合物45b[3] 5.00E+03 3.58
10 未感染 BLD N/A
表122：感染後第4天之細胞因子水準
測試物品[mg/kg] TNF- α[pg/mL] IL-6 [pg/mL] MCP-1 [pg/mL] MIP-1 α [pg/mL] KC [pg/mL]
PBS [0] 1077.2 1446.6 21219.9 3750.8 8090.4
hIgG1 Fc [3] 958.6 1129.5 20534.7 3545.1 7730.8
奧司他韋[5] 861.6 714.2 5301.6 1439.8 3466.4
奧司他韋[50] 501.7 467.1 4572.8 948.2 2705.5
巴洛沙韋[15] 522.5 308.7 338.7 185.6 392.0
結合物45b[0.1] 515.3 470.5 6807.3 1506.5 2954.1
結合物45b[0.3] 521.7 424.9 2957.5 820.1 1788.5
結合物45b[1] 460.0 329.8 2005.2 451.7 1262.8
結合物45b[3] 464.8 309.2 739.4 246.4 678.8
未感染 488.0 312.6 423.9 177.8 444.6
表123：與未感染對照相比，感染後第4天之細胞因子水準之倍數變化
測試物品 [mg/kg] TNF- α IL-6 MCP-1 MIP-1 α KC
PBS [0] 2.21 4.63 50.06 21.10 18.20
hIgG1 Fc [3] 1.96 3.61 48.44 19.94 17.39
奧司他韋[5] 1.77 2.28 12.51 8.10 7.80
奧司他韋[50] 1.03 1.49 10.79 5.33 6.09
巴洛沙韋[15] 1.07 0.99 0.80 1.04 0.88
結合物45b[0.1] 1.06 1.51 16.06 8.48 6.65
結合物45b[0.3] 1.07 1.36 6.98 4.61 4.02
結合物45b[1] 0.94 1.05 4.73 2.54 2.84
結合物45b[3] 0.95 0.99 1.74 1.39 1.53
未感染 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
實例 171. 結合物 45b 在致死性小鼠流感模型中之功效： 研究編號 55
在雌性BALB/c小鼠(6-8週齡，n = 5隻/組)中針對A/CA/07/2009致死性流感(3E4 PFU)評估結合物45b。研究設計在表124中顯示。在感染後t = + 2 h(SC)用測試物品對小鼠進行治療，其中使用單一劑量之結合物45b，或者每天兩次對照藥物持續4天。每天監測所有小鼠之體重。感染後第4天處死小鼠，並收穫兩個肺葉。將肺均質化以確定病毒負荷及免疫反應。數據展示於表125及表126A-126B中。  表124： 功效研究編號58：研究設計
組 測試物品(DAR) 途徑/ 時程 劑量[mg/kg] 劑量/ 天[mg/kg]
1 PBS SC, T+2h N/A N/A
2 hIgG1 Fc SC, T+2h 30 30
3 奧司他韋 PO, BID x 4 5 10
4 巴洛沙韋 PO, BID x 4 15 30
4 結合物45b(4.8) SC, T+2h 0.3 0.3
6 結合物45b(4.8) SC, T+2h 1 1
7 結合物45b(4.8) SC, T+2h 3 3
8 結合物45b(4.8) SC, T+2h 30 30
9 未感染 N/A N/A N/A
表125：感染後第4天之病毒負荷(PFU/g)
組 測試物品 [mg/kg] PFU/g Log 減少 PFU/g
1 PBS [0] 1.71E+07 0.00
2 hIgG1 Fc [30] 1.08E+07 0.20
3 奧司他韋[5] 2.05E+07 -0.08
4 巴洛沙韋[15] 1.51E+02 5.06
5 結合物45b[0.1] 8.81E+06 0.29
6 結合物45b[0.3] 4.25E+06 0.60
7 結合物45b[1] 1.24E+05 2.14
8 結合物45b[3] 3.72E+03 3.66
9 未感染 0.00 0.00
表126A：感染後第4天之細胞因子水準
測試物品[mg/kg] TNF-α [pg/mL] IL-6 [pg/mL] MCP-1 [pg/mL] MIP-1α [pg/mL] KC [pg/mL]
PBS [0] 1409.1 728.1 10139.0 2439.6 2542.4
hIgG1 Fc [30] 1489.6 709.6 9414.3 2245.0 2212.8
奧司他韋[5] 1260.1 714.2 8891.9 1454.1 2327.7
巴洛沙韋[15] 586.5 238.5 378.5 175.0 247.7
結合物45b[0.3] 1211.4 426.2 4059.8 886.7 1530.2
結合物45b[1] 1069.7 378.9 3874.0 765.3 1759.6
結合物45b[3] 1069.6 427.6 2457.6 720.0 1478.5
結合物45b[30] 662.5 284.2 1185.6 406.4 1069.3
未感染 523.1 227.3 247.5 179.6 293.1
表126B：與未感染之對照組相比，感染後第4天之細胞因子水準之倍數變化
測試物品[mg/kg] INF- γ TNF- α IL-6 MCP-1 MIP-1 α KC
PBS [0] 3.39 2.69 3.20 40.96 13.59 8.67
hIgG1 Fc [3] 3.06 2.85 3.12 38.03 12.50 7.55
奧司他韋[5] 2.44 2.41 2.59 35.92 8.10 7.94
巴洛沙韋[15] 0.94 1.12 1.05 1.53 0.97 0.85
結合物45b[0.3] 1.98 2.32 1.87 16.40 4.94 5.22
結合物45b[1] 1.87 2.04 1.67 15.65 4.26 6.00
結合物45b[3] 1.85 2.04 1.88 9.93 4.01 5.04
結合物45b[30] 1.18 1.27 1.25 4.79 2.26 3.65
未感染 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
實例 172. 結合物 45b 之活體外跨物種 Fc 受體結合
結合物45b與多種物種之Fcγ受體之結合係使用下述ELISA方法進行。於4℃下，將Nunc Maxisorp 96孔板用碳酸鹽緩衝液中之1 µg(100 µL/孔)之結合物45b包被隔夜。未結合之人類IgG1 Fc及同型對照抗體亦在相同條件下包被隔夜。第二天，將板用300 µL/孔之補充有0.05%Tween 20(PBST)之1X PBS pH 7.4洗滌5次，然後在室溫下、在軌道板式振盪器上用200 µL/孔之PBST中之1% BSA封閉1小時。將板用300 µL/孔PBST洗滌5次，然後在室溫下，伴以振盪，用稀釋液(於PBS 0.025% Tween 20中之0.5% BSA)中之重組His標記之Fcγ受體(0.5-1,000 ng；100 µL/孔)之重複2倍連續稀釋液培育2小時。以25 ng/100 µL/孔之起始濃度篩選了人及食蟹獼猴FcγR1/CD64。將板用300 µL/孔PBST洗滌5次，然後在室溫下，伴以振盪，用100 µL/孔之在稀釋液中以1:1,000稀釋之小鼠抗His HRP抗體(目錄號MAB050H，R＆D Systems)培育1小時。將板用300 µL/孔PBST洗滌8次，洗滌之間培育1分鐘，然後用100 µL/孔TMB受質試劑顯影5-10分鐘。用100 µL/孔之1N H2 SO4 終止反應，並使用EnSpire多模式讀板器(PerkinElmer)在450 nm處讀取吸光度。使用結合曲線之非線性迴歸分析(Sigmoidal，4PL)，使用GraphPad Prism版本8計算半最大有效濃度(EC50 )。基本上如針對具有以下修改之Fcγ結合ELISA所述，進行結合物45b與來自多個物種之FcRn受體之結合。封閉步驟之後，在pH 5.8，FcRn結合之最佳pH及pH 7.4之條件下一式兩份進行結合檢定。
結合物45b以與人類IgG1 Fc相當之親合力與小鼠、人類、大鼠及食蟹獼猴之Fcγ受體結合(表127)。與免疫抑制性Fcγ受體相比，結合物45b以更高親合力來結合免疫活化Fcγ受體。在pH 5.8時，結合物45b以與人類IgG1 Fc同等之親合力結合來自所有物種之FcRn受體。如所預期，在pH 7.4下，結合物45b FcRn之結合降低(表127)。  表127：結合物45b之跨物種Fc受體結合
EC50 [nM]
物種 Fc 受體 信號/ 功能 結合物45 hIgG1 Fc hIgG1
小鼠 FcγR1/CD64 活化 12 9 3
FcγR2B/CD32b 抑制 228 135 153
FcγR3/CD16 活化 ＞455 ＞455 ＞455
FcγR4/CD16-2 活化 3 0.5 6E-07
FcRn pH 5.8 IgG，白蛋白再循環 6 6 5
FcRn pH 7.4 IgG，白蛋白再循環 80 14 40
人類 FcγR1/CD64 活化 12 12 7
FcγR2A/CD32a (R167) 抑制 334 193 144
FcγR3A/CD16a 活化 20 9 2
FcγR3B/CD16b 活化 ＞455 ＞455 ＞455
FcRn pH 5.8 IgG，白蛋白再循環 49 49 44
FcRn pH 7.4 IgG，白蛋白再循環 ＞455 ＞455 ＞455
大鼠 FcγR1/CD64 活化 7 3 2
FcγR2A/CD32a 抑制 ＞455 ＞455 1
FcγR2B/CD32b 抑制 561 49 208
FcγR3A/CD16a 活化 6 3 0.008
FcRn pH 5.8 IgG，白蛋白再循環 25 15 13
FcRn pH 7.4 IgG，白蛋白再循環 104 ＞230 ＞230
食蟹獼猴 FcγR1/CD64 活化 24 18 0.37
FcγR2A/CD32a 抑制 1995 688 693
FγR2B/CD32b 抑制 11 6 1
FcγR3/CD16 活化 ＞320 ＞320 ＞320
FcRn pH 5.8 IgG，白蛋白再循環 31 17 28
FcRn pH 7.4 IgG，白蛋白再循環 88 32 78
實例 173. 比較結合物 45b 之 IV 、 SC 及 IM 投與之 7 天小鼠 PK 研究
使用6週齡雄性CD-1小鼠執行小鼠PK研究。向小鼠IV、SC及IM注射5 mg/kg之測試物品(5 ml/kg之劑量體積)。動物經圈養於標準IACUC批准之圈養條件下。在適當時間，對動物進行非末端放血(眶後、頰或藉由尾靜脈)，其中血液經收集於K2 EDTA管中以預防凝血。所收集之血液經離心(2,000 xg ，持續10分鐘)且抽出血漿以隨時間分析測試物品濃度。藉由夾心ELISA，如下量測各時間點之結合物45b之血漿濃度：在神經胺糖酸酶包被之板上捕獲結合物45b分子，然後使用HRP結合之抗人IgG-Fc抗體進行偵測。使用結合物45b(或hIgG1 Fc)標準曲線之4PL非線性迴歸在GraphPad Prism中計算蛋白質濃度。更詳細方法描述在上文提供。比較結合物45b之曲線在圖84中示出，並且圖85顯示了比較hIgG1 Fc(SEQ ID NO：73)之曲線。SC及IM之結合物45b血漿暴露水準相當，且SC或IM途徑產生之生物利用度約為IV投與之77%(表128-130)。注射後約24小時，所有途徑之結合物45b血漿濃度均相等。 表128：小鼠PK 5 mg/kg IV投與
小鼠 時間   
(h)
0.0833 1 3 5 24 48 72 96 168
劑量(mg/kg) 途徑 動物 濃度 Tmax (h) C0(ug/mL) Cmax(ug/mL) AUC 最後(h*ug/mL) AUCINF_obs(h*ug/mL) 半衰期(h) Cl_obs(mL/min/kg) Vss_obs(mL/kg) Vz_obs(mL/kg)
(ug/mL)
5 IV 平均 35.8 30.1 20.8 23 11.1 11.3 6.9 8.08 5.21 0.0833 36.4 35.8 1600 2560 128 0.0325 336 361
表129：小鼠PK 5 mg/kg IM投與
時間   
(h)
0.25 1 3 5 24 48 72 96 168
劑量 (mg/kg) 途徑 動物 濃度 Tmax (h) Cmax (ug/mL) AUC 最後 (h*ug/mL) AUCINF_obs (h*ug/mL)
(ug/mL)
5 IM 平均 0.195 1.44 3.69 3.83 8.52 10.9 7.94 7.35 5.56 48 10.9 1240 2720
表130：小鼠PK 5 mg/kg SC投與
時間   
(h)
0.25 1 3 5 24 48 72 96 168
劑量 (mg/kg) 途徑 動物 濃度 Tmax (h) Cmax (ug/mL) AUC 最後 (h*ug/mL) AUCINF_pred (h*ug/mL)
(ug/mL)
5 SC 平均 0.148 0.387 3.23 2.55 8.89 9.29 9.13 7.49 5.46 48 9.29 1220 2280
實例 174. 比較結合物 45b 之劑量線性之 7 天小鼠 PK 研究
使用6週齡雄性CD-1小鼠執行小鼠PK研究。用1、3、10、30或100 mg/kg之測試物品(5 ml/kg劑量體積) SC注射小鼠。動物經圈養於標準IACUC批准之圈養條件下。在適當時間，對動物進行非末端放血(眶後、頰或藉由尾靜脈)，其中血液經收集於K2 EDTA管中以預防凝血。所收集之血液經離心(2,000 x g，持續10分鐘)且抽出血漿以隨時間分析測試物品濃度。藉由夾心ELISA，如下量測各時間點之結合物45b之血漿濃度：在神經胺糖酸酶包被之板上捕獲結合物45b分子，然後使用HRP結合之抗人IgG-Fc抗體進行偵測。使用結合物45b(或hIgG1 Fc)標準曲線之4PL非線性迴歸在GraphPad Prism中計算蛋白質濃度。更詳細方法描述在上文提供。比較藉由NA及Fc捕獲偵測到之結合物45b之曲線分別在圖86及圖87中示出。在小鼠中，觀察到結合物45b之1至100 mg/kg SC投與之合理線性劑量比例(表131)。 表131： 1-100 mg/kg之小鼠PK劑量比例性
時間
(h)
0.25 0.5 1 2 4 24 96 120 168
劑量(mg/kg) 途徑 動物 濃度 D 途徑 劑量 (mg) Tmax (h) Cmax (h*ug/mL) AUC 最後 (h*ug/mL) AUCINF_pred (h*ug/mL)
(ug/mL)
1 SC 1 0.83 缺失 5.9 0.764 9.39 4.11 1.1 2.13 0.317 1 SC 1 4 9.39 436 465
3 SC 3 0.355 0.0874 1.02 0.52 5.16 11.4 9.84 8.32 6.84 3 SC 3 24 11.4 1520 2900
10 SC 10 1.01 0.879 1.81 4.65 15.5 41.3 18.4 26.7 15 10 SC 10 24 41.3 4280 6650
30 SC 30 0.179 0.616 5.71 7.6 56 125 75 83.7 49.7 30 SC 30 24 125 14200 22300
100 SC 100 22.4 72.3 313 446 733 657 183 246 160 100 SC 100 4 733 60700 75300
實例 175. IV 或 SC 投與結合物 45b 後之 14 天大鼠 PK 研究
由Seventh Wave實驗室(Maryland Heights, MO)使用46-49日齡之雄性Sprague Dawley大鼠執行大鼠PK研究。藉由尾靜脈給大鼠IV注射5 mg/kg結合物45b或向其SC注射5或50 mg/kg測試物品(5 ml/kg劑量體積)(圖88-89)。動物經圈養於標準IACUC批准之圈養條件下。在適當時間，對動物進行非末端放血(眶後、頰或藉由尾靜脈)，其中血液經收集於K2 EDTA管中以預防凝血。所收集之血液經離心(2,000 xg ，持續10分鐘)且抽出血漿以隨時間分析測試物品濃度(表132)。藉由夾心ELISA如下量測各時間點結合物45b之血漿濃度：在神經胺糖酸酶包被之板上捕獲結合物45b分子，然後使用HRP結合之抗人IgG-Fc抗體偵測(表133-134)。使用抗hIgG1 Fc抗體捕獲hIgG1。使用結合物45b標準曲線之4PL非線性迴歸在GraphPad Prism中計算蛋白質濃度。更詳細方法描述在上文提供。圖88中所示之比較結合物45b之曲線顯示線性劑量比例性。IV及SC投與之結合物45b血漿水準在注射後24小時會聚(圖89)。數據展示於表135及136中。  表132：大鼠PK研究設計
血漿收集時間點
劑量/ 劑量途徑 10min IV; 30min SC 1h 4h 8h 24h 72h 120h 168h 336h
組1(n=3) 5 mpk IV X X X X X X X X X
組2 (n=3) 5 mpk SC X X X X X X X X X
組3 (n=3) 50 mpk SC X X X X X X X X X
表133： H1N1(A/CA/04/2009)NA捕獲
5 mpk IV 5 mpk SC 50 mpk SC
g1.1 g1.2 g1.3 g2.1 g2.2 g2.3 g3.1 g3.2 g3.3
時間 (h) n1 n2 n1 n2 n1 n2 n1 n2 n1 n2 n1 n2 n1 n2 n1 n2 n1 n2
10m/30m 139.0184 116.434 128.9835 126.3728 99.90003 96.30608 0.336397 0.352108 0.26567 0.24961 0.259523 0.205043 1.111022 1.021191 2.951729 3.184274 3.78442 3.30374
1 103.0288 107.5882 108.6186 112.708 80.42177 83.55724 0.601405 0.600861 0.50378 0.53983 0.680512 0.48924 2.858977 6.907325 4.617704 7.575 8.21763
4 67.18744 70.49817 65.26259 59.96993 52.09719 60.13481 3.331236 3.577401 3.291326 3.31843 3.942251 3.945549 19.50094 17.82466 17.83342 19.84081 27.2367 27.0064
8 49.96849 56.19489 56.94676 57.68125 48.90448 55.23444 9.120017 8.164349 6.224308 6.16066 7.856424 7.047854 43.56345 44.30664 55.25942 53.41513 58.2069 56.4707
24 33.99514 33.83988 34.76042 33.60106 33.04519 32.52448 24.64741 22.57097 19.34957 21.3297 20.90625 23.61215 156.8759 159.158 210.1323 209.9947 208.024 181.09
72 24.03197 23.99513 26.1422 25.50985 23.92523 24.53129 26.81972 23.95593 19.1652 23.1289 18.91189 16.60657 142.6993 137.0533 152.6497 155.1297 149.881 142.385
120 17.28743 17.88652 18.16672 17.61109 17.14011 16.81636 18.13665 18.07425 15.58847 19.193 16.70847 16.4339 117.7776 112.064 136.8244 141.3221 137.704 132.748
168 16.37894 14.18949 15.0406 14.28349 12.29568 13.27299 16.36903 16.31503 13.37669 14.9629 12.9219 12.3945 100.8302 116.8275 99.00073 118.0093 97.4236 96.2287
336 8.706758 9.475766 8.069783 8.240227 7.314977 7.120923 8.57262 8.694249 6.866837 7.0874 7.635397 7.876635 53.87703 51.16129 57.02179 55.22173 54.121 59.193
表134：hIgG Fc捕獲
5 mpk IV 5 mpk SC 50 mpk SC
g1.1 g1.2 g1.3 g2.1 g2.2 g2.3 g3.1 g3.2 g3.3
時間 (h) n1 n2 n1 n2 n1 n2 n1 n2 n1 n2 n1 n2 n1 n2 n1 n2 n1 n2
10m/30m 131.8211 132.2644 138.5205 124.2897 92.28536 93.95777 0.301641 0.272994 0.3302 0.58892 0.071346 0.209457 0.85958 2.600291 2.362582 2.417453 3.26701 3.24606
1 105.1676 118.2516 111.4847 110.7111 83.06342 83.13157 0.492532 0.510306 0.372862 0.35967 0.267192 0.28284 2.328096 2.360296 3.618227 3.5931 7.33632 7.4207
4 61.3296 59.41234 59.52775 47.35522 53.9032 61.12485 3.615572 3.792592 3.297844 3.46322 4.157923 4.501974 20.52563 19.67262 19.46794 19.46851 28.6829 31.5564
8 50.28953 48.15108 52.90292 48.1017 48.46983 8.261891 9.08554 6.598579 5.92739 8.778635 7.990053 45.29742 44.30181 54.38999 63.46517 61.1055 70.8567
24 29.91591 30.67022 30.25926 31.29131 28.39885 29.88579 23.96117 19.31521 16.86928 17.6982 17.00515 18.2297 155.7401 138.399 200.935 236.9577 239.536 249.133
72 19.38442 21.26014 20.06189 20.38354 17.46987 18.56471 19.96086 21.67188 15.66477 16.3864 19.15136 19.56853 152.6623 171.8249 181.134 173.9026 186.293 194.744
120 12.13442 13.49033 12.39415 11.80685 13.47915 12.68468 14.71684 15.61295 11.56458 11.8629 14.66388 14.79211 113.865 103.0581 131.7811 129.7576 153.859 149.209
168 14.61786 14.48309 13.2966 13.12374 12.4622 13.06133 13.73621 9.73 11.21421 12.2178 14.54814 12.79694 94.56107 112.0218 105.5593 101.004 104.147 113.431
336 8.33093 8.680053 7.88281 7.805351 6.912784 6.784823 7.736292 7.661658 6.466908 6.00365 7.32696 6.554063 49.96583 43.11898 58.15043 57.84531 54.516 49.5564
表135：大鼠PK 5 mg/kg IV投與
大鼠 時間   
(h)
0.167 1 4 8 24 72 120 168 336
劑量(mg/kg) 濃度 Tmax (h) C0 (ug/mL) Cmax (ug/mL) AUC 最後 (h*ug/mL) AUCINF_obs (h*ug/mL) 半衰期 (h) Cl_obs (mL/min/kg) Vss_obs (mL/kg) Vz_obs (mL/kg)
(ug/mL)
5 118 99.3 62.5 54.2 33.6 24.7 17.5 14.2 8.15 0.167 122 118 6340 8690 199 0.00959 144 166
表136：大鼠PK 5 mg/kg及50 mg/kg SC投與
大鼠 時間   
(h)
0.5 1 4 8 24 72 120 168 336
劑量 (mg/kg) 途徑 動物 濃度 Tmax (h) Cmax (ug/mL) AUC 最後 (h*ug/mL) AUCINF_obs (h*ug/mL)
(ug/mL)
5 SC 平均 0.278 0.569 3.57 7.43 22.1 21.4 17.4 14.4 7.79 24 22.1 4860 6970
50 SC 平均 2.56 6.04 21.5 51.9 188 147 130 105 55.1 24 188 35800 49800
實例 176. SC 投與結合物 45b 後之 14 天非人類 靈長類動物 PK 研究
由Charles River使用體重介於2.5-6.5 kg範圍內之4.5-8歲雄性及雌性食蟹獼猴執行非人類靈長類動物(NHP)PK研究。在第1天及第8天經SC向NHP注射5或20 mg/kg之測試物品(5 ml/kg劑量體積)。動物經圈養於標準IACUC批准之圈養條件下。在適當時間，對動物進行非末端放血(藉助於股靜脈或頭靜脈)，其中血液經收集於K2 EDTA管中以預防凝血。所收集之血液經離心(2,000 xg ，持續10分鐘)且抽出血漿以隨時間分析測試物品濃度(表137)。藉由夾心ELISA如下量測各時間點之結合物45b之血漿濃度：在神經胺糖酸酶包被之板上捕獲結合物45b分子，然後使用HRP結合之抗人IgG-Fc抗體進行偵測(圖90-91)。使用結合物45b標準曲線之4PL非線性迴歸在GraphPad Prism中計算蛋白質濃度。更詳細方法描述在上文提供。比較結合物45b之曲線在圖92中示出。劑量反應在5至20 mg/kg SC之間呈線性關係。在第8天第二次投與結合物45b後，觀察到結合物45b之積累。 表137：每週第二次給藥後，猴子PK高暴露
時間  
(h)  
0.0833 1 2 4 8 24 72 120 168  
劑量(mg/kg) 途徑 組 動物 濃度 Tmax (h) Cmax (h*ug/mL) AUC 最後 (h*ug/mL)
(ug/mL)
5 SC D1 平均 blq 1.05 3.62 9.91 17.9 22.2 26.1 23.8 20 72 26.1 3800
   D8 平均 24.3 19.4 25.7 31 61 47.3 54.1 42.8 33.3 8 61 7740
20 SC D1 平均 blq 10.9 6.77 28.8 61.9 101 107 71.6 85.1 72 107 14600
   D8 平均 63.4 59.5 70.4 107 150 197 167 139 99.1 24 197 25400
實例 177. 結合物 45b 在致死性小鼠流感模型中針對奧司他韋抗性分離株之功效
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8週)中針對致死性IAV H1N1流感感染評估結合物45b。攻擊病毒(A/Perth/261/2009)係小鼠適應性分離株，其攜帶H275Y突變，從而導致抵抗神經胺糖酸酶抑制劑奧司他韋。
該實驗包含9組，每組5隻小鼠。在第0天，所有小鼠均藉由鼻內接種至經異氟烷輕微麻醉之小鼠經50 µl體積之A/Perth/261/2009 (H1N1) (2x LD90)攻擊。攻擊後2小時，第1-8組接受SC單次治療。除了單獨媒劑(PBS)組以外，人類IgG1 (單獨Fc)亦作為額外陰性對照物包括在內。第9組藉助於經口遞送接受磷酸奧司他韋，在感染後8小時開始，每天兩次，持續5天(表138)。攻擊後14天，監測所有小鼠之存活率(表139)及體重減輕(表140)。
用結合物45b治療之小鼠以10、3、1及0.3 mg/kg之單劑量顯示出抗流感(A/Perth/261/2009)攻擊之100%存活率。此外，儘管組大小較小(n=5)，但此等結果相對於媒劑對照物為統計學上顯著的(表139)。
如果使用媒劑(PBS)給藥，沒有小鼠存活至研究結束，且如果僅用hIgG1 Fc治療，則只有20%存活。奧司他韋組沒有存活者，即使使用先前顯示出具有保護性以抵禦奧司他韋敏感性分離株之劑量進行治療(20 mg/kg，bid × 5天)。此等結果確認該攻擊病毒抵抗奧司他韋，且對結合物45敏感。
體重數據進一步支持結合物45b對含有H275Y突變之流感之效能(表140)。接受單一劑量之1 mg/kg或更高濃度之結合物45b之組顯示出3%或更低之短暫體重減輕，該體重減輕在研究結束前得以恢復。  表138：研究設計
組 n=5 攻擊 第0 天 化合物 劑量 (mg/kg) 治療 途徑/ 時程
1 流感A病毒(H1N1) A/Perth/261/2009，經由IN途徑。 媒劑(PBS) N/A SC，q.d. 攻擊後2小時
2 單獨Fc 10
3 結合物45b 10
4 結合物45b 3
5 結合物45b 1
6 結合物45b 0.3
7 結合物45b 0.1
8 結合物45b 0.03
9 奧司他韋(TamifluTM ) 20 PO，b.i.d. 攻擊後8小時，持續 5天
表139：存活率百分比
` 測試劑(mg/kg) 結合物45b (mg/kg)
天 媒劑 hIgG1 Fc (10) 奧司他韋(200) 10 3 1 0.3 0.1 0.03
0 100 100 100 100 100 100 100 100 100
1 100 100 100 100 100 100 100 100 100
2 100 100 100 100 100 100 100 100 100
3 100 100 100 100 100 100 100 100 100
4 100 80 80 100 100 100 100 100 80
5 100 60 60 100 100 100 100 80 40
6 80 60 0 100 100 100 100 0 0
7 0 40 0 100 100 100 100 0 0
8 0 20 0 100 100 100 100 0 0
9 0 20 0 100 100 100 100 0 0
10 0 20 0 100 100 100 100 0 0
11 0 20 0 100 100 100 100 0 0
12 0 20 0 100 100 100 100 0 0
13 0 20 0 100 100 100 100 0 0
14 0 20 0 100 100 100 100 0 0
相對於媒劑之顯著性 na 0.665 0.0035 0.0035 0.0035 0.0035 0.0035 ns ns
表140：體重百分比(公克)
測試劑(mg/kg) 結合物45b (mg/kg)
天 媒劑 hIgG1 Fc (10) 奧司他韋(200) 10 3 1 0.3 0.1
0 100 100 100 100 100 100 100 100
1 101 101 102 99 97 98 96 97
2 98 100 99 101 99 102 99 98
3 91 93 89 101 95 97 94 89
4 89 88 84 101 95 97 95 84
5 89 89 82 104 100 101 98 83
6 79 85 74 100 94 97 93 74
7 78 83 105 100 102 97
8 84 105 100 103 98
9 85 101 98 101 96
10 90 103 98 101 98
11 92 102 98 101 97
12 99 105 103 103 102
13 101 106 103 103 102
14 98 104 101 101 101
實例 178. 結合物 45b 在致死性小鼠流感模型中針對第二奧司他韋抗性分離株之功效
在類似於實例177中所示之研究中，測試結合物45b對攜帶賦予對奧司他韋之抗性之H275Y突變之第二流感A (H1N1)分離株之活性。對於此研究，突變在A/Texas/23/2012中進行。如前所述，使用BALB/c小鼠(Charles River；6-8週)，並用2X LD95(5E4 pfu/小鼠)鼻內攻擊。奧司他韋之經口劑量為20 mg/kg，bid，持續5天，在病毒攻擊後2小時開始。如表141所列，所有其他測試物品皆進行SC給藥。監測動物14天，每天記錄體重(BW)。如果動物之BW重減輕達到20%，則將其記錄為死亡。  表141：研究設計
組 流感 病 毒株 測試物品 途徑/ 時程 劑量(mg/kg) N (balb/c)
1 A/Texas/23/2012 pdm (H275Y) (H1N1) 5E4 PFU/小鼠 PBS SC，T+2 h --- 5
2 hIgG1 SC，T+2 h 3 5
3 奧司他韋 PO, bid x 5 (T+2 h) 20 5
4 結合物45b SC，T+2 h 3 5
5 結合物45b SC，T+2 h 1 5
6 結合物45b SC，T+2 h 0.3 5
7 結合物45b SC，T+2 h 0.1 5
與先前研究相似，媒劑及單獨hIgG1 Fc(SEQ ID NO：73)對照物都沒有提供對致死攻擊之保護(分別為20%及0%存活率；表142)。相反，用0.3至3.0 mg/kg範圍內之濃度之結合物45b治療之組可完全免受致死攻擊。此外，0.1 mg/kg之結合物45b表現出部分保護作用，在研究之14天中，存活率為60%。但是，總劑量200 mg之奧司他韋不能如預期保護小鼠免受病毒攻擊。BW數據(表143；經記錄直至組內第一例死亡為止)反映了存活率結果，在受保護組中僅出現了短暫重量減輕(結合物45，0.3至3.0 mg/kg)。在此研究中測試之奧司他韋突變(H275Y)係臨床相關之突變，此研究表明該突變對結合物45b高度敏感。  表142：存活率百分比
測試劑(mg/kg) 結合物45b (mg/kg)
天 媒劑 hIgG1 Fc (1) 奧司他韋(200) 3 1 0.3 0.1
0 100 100 100 100 100 100 100
1 100 100 100 100 100 100 100
2 100 100 100 100 100 100 100
3 100 100 100 100 100 100 100
4 100 100 100 100 100 100 100
5 20 60 20 100 100 100 60
6 20 0 0 100 100 100 60
7 20 0 0 100 100 100 60
8 20 0 0 100 100 100 60
9 20 0 0 100 100 100 60
10 20 0 0 100 100 100 60
11 20 0 0 100 100 100 60
12 20 0 0 100 100 100 60
13 20 0 0 100 100 100 60
14 20 0 0 100 100 100 60
表143：體重百分比(公克)
測試劑(mg/kg) 結合物45b (mg/kg)
天 媒劑 hIgG1 Fc (1) 奧司他韋(200) 3 1 0.3 0.1
0 100 100 100 100 100 100 100
1 100 99 97 99 98 97 98
2 95 93 92 96 96 93 94
3 88 85 84 93 90 85 86
4 82 80 78 95 90 84 80
5 78 75 94 90 84 79
6 96 94 85
7 101 97 89
8 100 96 88
9 101 99 91
10 99 99 91
11 100 99 92
12 101 99 94
13 100 98 94
14 103 101 99
實例 179. 經皮下給予之結合物 45b 在致死性小鼠模型中針對流感 A/WSN/1933 (H1N1) 之功效
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8週)中針對致死性IAV H1N1流感感染評估結合物45b。攻擊病毒(A/WSN/1933)係能夠在小鼠中引起致死性感染之小鼠適應性分離株。該實驗包含7組，每組5隻小鼠。在第0天，所有小鼠均在經氯胺酮/甲苯噻嗪之混合物(分別為150及10 mg/kg)麻醉之後藉由鼻內接種經30 µl (2E3個病毒/小鼠)體積之病毒(3x LD95)攻擊。每天記錄死亡率及體重，持續21天，且具有20%體重減輕之任何動物均評為死亡。
測試組在劑量體積為10 ml/kg之病毒攻擊後2小時接受3、1、0.3、0.1或0.03 mg/kg之結合物45b或hIgG1 Fc對照或媒劑(PBS)之單次皮下(SC)治療。研究設計在表144中概述。  表144：研究設計
組 流感病毒株 測試物品 途徑/ 時程 劑量(mg/kg) N (balb/c)
1 A/WSN/1933 (H1N1) ~2E3 PFU/小鼠 PBS SC，T+2 h --- 5
2 hIgG1 SC，T+2 h 1 5
3 結合物45b SC，T+2 h 3 5
4 結合物45b SC，T+2 h 1 5
5 結合物45b SC，T+2 h 0.3 5
6 結合物45b SC，T+2 h 0.1 5
7 結合物45b SC，T+2 h 0.03 5
如預期，接受媒劑或hIgG1 Fc對照之小鼠分別在第7天或第8天死於感染(表145)。但是，在低至0.3 mg/kg之濃度下，用結合物45b治療之小鼠可得到完全保護，在0.1 mg/kg之濃度下可得到80%之保護。僅在最低劑量濃度為0.03 mg/kg時才能觀察到結合物45b完全失去保護作用。  表145：存活率百分比
天 媒劑 hIgG1 Fc 結合物45b (mg/kg)
3 1 0.3 0.1 0.03
0 100 100 100 100 100 100 100
1 100 100 100 100 100 100 100
2 100 100 100 100 100 100 100
3 100 100 100 100 100 100 100
4 100 100 100 100 100 100 100
5 100 100 100 100 100 100 100
6 40 60 100 100 100 100 100
7 0 20 100 100 100 100 100
8 0 0 100 100 100 100 40
9 0 0 100 100 100 80 0
10 0 0 100 100 100 80 0
11 0 0 100 100 100 80 0
12 0 0 100 100 100 80 0
13 0 0 100 100 100 80 0
14 0 0 100 100 100 80 0
每日體重量測結果與存活率觀察結果一致。如所預期，經媒劑或hIgG1 Fc治療之小鼠證明體重平穩下降，直至其超過20%，此時其經評為死亡(表146)。
與對照小鼠形成對比，接受3、1及0.3 mg/kg之結合物45b之彼等組在該研究中維持健康體重且僅證明少於3%之短暫體重下降(1 mk/kg劑量組，第18天；表146)。結合物45b之存活率及體重量測結果均證明使用低至0.3 mg/kg之單一SC劑量時的穩固保護以抵禦流感A/WSN/1933之致死性攻擊。  表146：體重百分比
結合物 45b (mg/kg)
天 媒劑 hIgG1 Fc 3 1 0.3 0.1 0.03
0 100 100 100 100 100 100 100
1 96.8 96.6 98.5 98.9 99 96.9 99.4
2 99.9 98.1 100.9 99.9 100.5 101.2 100.7
3 92 90.8 101.1 100.6 99 97 94.8
4 83.5 85.3 98.4 98.2 96 94.6 92.4
5 79.7 82.3 99 102.5 99.2 94.2 91.5
6 76.1 78.8 101.2 105.4 102.1 90.9 87.3
7 100 102.8 101.6 84.8 82.3
8 98.4 101.9 100.8 81.9 76
9 102.2 102.8 101.6 84.3
10 101.9 103 101.7
11 101.3 102.1 99.5
12 99.5 99.9 99.3
13 100 101.8 101.7
14 102.1 102.3 102.7
15 99.8 101.6 101.6
16 100.1 102.1 103.1
17 98.7 98.7 100.5
18 99.3 97.8 99.4
19 98.8 98.3 100.2
20 100.1 100.1 100.8
21 102.3 100.5 101.1
實例 180. 經靜脈內給予之結合物 45b 在延遲治療之致死性小鼠模型中針對流感 A/Texas/36/91 (H1N1) 之功效。
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8週)中針對致死性流感A (H1N1)感染評估結合物45b。攻擊病毒(A/Texas/36/91)係能夠在小鼠中引起致死性感染之小鼠適應性分離株。在第0天，所有小鼠均在經氯胺酮/甲苯噻嗪之混合物(分別為150及10 mg/kg)麻醉之後藉由鼻內接種經50 µl體積之病毒(2x LD95；約75個病毒/小鼠)攻擊。每天記錄死亡率、臨床體征及體重，持續15天，並將體重減輕20%之任何動物記為死亡。
研究設計詳述於表147中，且由多個研究組組成。對照研究組包含媒劑(PBS)及單獨hIgG1 Fc組，在病毒攻擊之後24小時給藥(未受感染組亦為此研究組之一部分)。第二研究組由以其人類化劑量之4倍給予之奧司他韋組成，其中治療之起始經延遲24、48、72或96小時。最終研究組由以1或3 mg/kg之單一IV劑量投與之結合物45b組成；各研究組以與上述奧司他韋研究組相同的時程給藥。
如所預期，媒劑及hIgG1 Fc當在病毒攻擊之後24小時給予時不具保護性且截至第6天導致完全死亡。在此項研究中，當給藥經延遲24小時時，人類化劑量之4倍的奧司他韋(200 mg/kg累積劑量)亦僅為部分有效的(表148；80%存活率)。攻擊後48小時，奧司他韋之功效下降得更低，只有40%之小鼠存活至研究結束。如果將奧司他韋治療延遲至72或96小時，則沒有任何保護作用。
相反，當給藥延遲24小時時，結合物45b在1及3 mg/kg下具有完全保護性。攻擊後48小時，3 mg/kg組仍受到完全保護，而1 mg/kg組則幾乎受到完全保護，存活率為80%。在72小時時，1 mg/kg亦顯示出80%之保護，但是3 mg/kg僅顯示了20%之保護。以存活率衡量，在該延遲治療模型中，1及3 mg/kg之結合物45b劑量組均顯示出比奧司他韋更強之效能。同樣值得注意地，結合物45b之總劑量為1或3 mg/kg，而奧司他韋之劑量為200 mg/kg。
如預期，體重數據支持了存活率發現(表149)，並且總體上顯示經結合物45b治療之小鼠具有出色體重保持率。儘管在統計學上不顯著，但是即使用奧司他韋治療之組接受了更高劑量，重量亦能在經結合物45b治療之小鼠中更好地保持。  表147：研究設計
組 (n=5) 攻擊 ( 第0 天) 測試物品 治療 讀出
劑量 (mg/kg) 時程(pi) 途徑
1 流感A病毒，H1N1病毒株A/TX/36/91，經由IN途徑 媒劑(PBS) N/A 24小時 單次治療 IV 每天重量及健康評分監測，持續總共15天。 (第0天 – 第14天pi) 存活率%
2 hIgG1 Fc 3 24小時
3 結合物45b 3 24小時
4 48小時
5 72小時
6 96小時
7 1 24小時
8 48小時
9 72小時
10 96小時
11 磷酸奧司他韋 20 24小時 PO，bid，持續5天
12 48小時
13 72小時
14 96小時
15 原生小鼠：未治療且未感染
表148：存活率百分比
結合物45b (mg/kg) 結合物45b (mg/kg) 奧司他韋(mg/kg)
1 3 20
天 媒劑 hIgG1 Fc 24 h 48 h 72 h 96 h 24 h 48 h 72 h 96 h 24 h 48 h 72 h 96 h
0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
1 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
2 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
3 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
4 80 100 100 80 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
5 20 60 100 80 80 40 100 100 20 60 100 100 60 0
6 0 0 100 80 80 0 100 100 20 0 100 100 40 0
7 0 0 100 80 80 0 100 100 20 0 100 60 0 0
8 0 0 100 80 80 0 100 100 20 0 80 40 0 0
9 0 0 100 80 80 0 100 100 20 0 80 40 0 0
10 0 0 100 80 80 0 100 100 20 0 80 40 0 0
11 0 0 100 80 80 0 100 100 20 0 80 40 0 0
12 0 0 100 80 80 0 100 100 20 0 80 40 0 0
13 0 0 100 80 80 0 100 100 20 0 80 40 0 0
14 0 0 100 80 80 0 100 100 20 0 80 40 0 0
表149：體重百分比
結合物45b (mg/kg) 結合物45b (mg/kg) 奧司他韋(mg/kg) 原生
1 3 20
天 媒劑 hIgG1 Fc 24 h 48 h 72 h 96 h 24 h 48 h 72 h 96 h 24 h 48 h 72 h 96 h
0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
1 98 100 98 98 98 100 103 102 100 101 98 101 99 99 99
2 96 102 97 97 99 99 104 103 100 100 99 99 99 99 102
3 88 93 92 90 91 90 99 95 92 92 94 93 89 89 103
4 83 87 93 88 85 85 99 92 85 85 95 92 86 84 101
5 78 81 95 91 83 79 103 96 79 80 94 91 82 78 101
6 73 79 98 93 87 76 105 97 91 80 91 88 83 103
7 100 95 87 106 102 92 88 84 81 103
8 101 99 93 108 105 99 91 88 104
9 98 98 96 103 103 100 97 91 104
10 100 99 98 105 105 100 100 93 105
11 100 98 98 103 105 100 101 91 104
12 101 100 99 104 107 99 102 93 106
13 100 99 100 105 106 99 101 94 105
14 101 100 101 107 107 102 103 96 105
實例 181. 在 14 天食蟹獼猴劑量範圍測量儀毒性研究中評估之結合物 45b 之安全性
在研究之第0天及第7天，藉由皮下注射向食蟹獼猴投與5 mpk或20 mpk或50 mpk之結合物45b。與媒劑對照物相比，在所測試之任何劑量下均未觀察到對體重增加、器官重量、食物消耗的顯著影響。血漿暴露(藉由AUC量測)隨劑量按比例增加。基於毒理學研究中最高劑量之AUC比與致死小鼠流感模型中28天保護免受流感感染所需之AUC之比值，此等臨床前安全性結果與高治療指數(54X)一致。在任何測試劑量下均未觀察到與測試物品相關之不良影響。觀察結果之概述提供於表150中。  表150： 14天劑量範圍測量儀毒性研究總結
參數 與媒劑相比， 在最高劑量 (50mpk) 下之發現
臨床觀察 沒有發現
血液學 與媒劑比沒有變化
臨床化學 與媒劑比沒有變化
凝血 與媒劑比沒有變化
尿分析 與媒劑比沒有變化
免疫表型 與媒劑比沒有變化
細胞因子 與媒劑比沒有變化
組織病理學 沒有發現
實例 182. 在非致死性雪貂模型中，皮下 給予之 結合物 45b 對抗流感 A/California/07/2009(H1N1)pdm 之功效。
人們普遍認為雪貂中之A型流感感染具有與人類中所見相似的發病機制。因此，在非致死性雪貂模型中對結合物45b進行了測試，該模型受到具有臨床適切性之流感A/CA/07/09及H1N1大流行病毒株之攻擊。簡而言之，雄性雪貂(3-5個月齡)係從Tripe F農場獲得，並被證實缺乏針對A型H1N1流感之抗體。在攻擊前24±2.0小時，每只雪貂在單次靜脈內(IV)注射中接受結合物45b、媒劑(PBS)或hIgG1 Fc，或者在接種流感病毒前4±0.5小時藉由經口管飼法接受磷酸奧司他韋(20 mg/kg)。接種病毒後，連續5天每天兩次(間隔12±1.5小時)投與奧司他韋。表151中詳細列出了測試濃度及實驗設計。
在用氯胺酮(25 mg/kg)及甲苯噻嗪(2 mg/kg)麻醉後，用0.5 mL體積之1E6個流感A/California/07/2009(H1N1)感染顆粒對雪貂進行鼻內攻擊。還如上所述將動物麻醉以投與測試物品。研究持續時間為14天，且讀數由每日體重(BW)、臨床體征、體溫及表151所列時間之鼻洗液(0.5 mL)或咽拭子組成。使用MDCK細胞之標準斑塊檢定法測定鼻洗液中之病毒負荷。咽拭子之病毒負荷使用標準qPCR方法進行。在5分鐘、2小時、24小時、72小時及120小時時，亦從第6組動物(用3 mg/kg之結合物45b給藥)獲得血漿樣品。如表152中詳述，用媒劑(PBS)或僅Fc治療之對照動物在第1天開始減輕BW，在第6天達到峰值(分別為10.8%及10.1%)。在最低結合物45b劑量(0.3 mg/kg)下，BW亦有類似下降。相比之下，用1至30 mg/kg之結合物治療之雪貂顯示出BW減輕減少了大約50%。
如基於BW所預測，結合物45b亦顯示出減輕了鼻洗液(雪貂感染流感之主要部位)之病毒負荷\(表153及表154)。結合物45b之功效在第2天之負荷中最顯著地證明，其中相對於媒劑治療之動物，在最高劑量下達成接近2對數減少。此外，用結合物45b之病毒效價降低在30 mg/kg與1 mg/kg之間係劑量反應性的。在第4天效價中，此趨勢在很大程度上重複，儘管由於免疫系統在非致死性雪貂模型中起著更大作用而略微減弱(由第2天到第4天媒劑處理之效價之降低來證明)。
基於兩個主要研究讀數(鼻效價及BW)，此等數據共同證明了在反映人類疾病之重要模型中，結合物45b在治療濃度下達到上呼吸道之能力。 表151：研究設計及給藥時程
組 N 測試材料 途徑/ 時程 劑量 (mg/kg) 鼻洗液 ( 天) 咽拭子 ( 天)
1 5 PBS(媒劑) IV，單次，T-24 h --- 2,4,6,8 2,4,6,8
2 5 hIgG1 Fc IV，單次，T-24 h 30 2,4,6,8 ---
3 5 奧司他韋1 PO，bid x 5天，-4 h 20 2,4,6,8 ---
4 5 結合物45b IV，單次，T-24 h 30 2,4,6,8 2,4,6,8
5 5 結合物45b IV，單次，T-24 h 10 2,4,6,8 2,4,6,8
6 5 結合物45b IV，單次，T-24 h 3 2,4,6,8 2,4,6,8
7 5 結合物45b IV，單次，T-24 h 1 2,4,6,8 2,4,6,8
8 5 結合物45b IV，單次，T-24 h 0.3 2,4,6,8 ---
表152：每天平均體重變化(初始%)
組 天
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
G1 0.08 -4.34 -5.60 -6.15 -7.31 -10.80 -9.77 -7.61 -7.05 -5.67 -5.20 -5.53 -4.36 -4.23
G2 -1.90 -6.35 -7.19 -7.60 -8.02 -10.06 -9.71 -9.54 -7.71 -6.66 -5.94 -6.38 -7.32 -4.99
G3 1.78 -0.39 -0.90 -0.14 -0.90 -1.78 -1.00 -1.19 -2.57 0.04 0.39 0.10 0.22 2.15
G4 -1.59 -4.47 -3.26 -3.10 -3.81 -5.23 -5.34 -5.47 -5.51 -5.14 -5.12 -4.56 -5.23 -4.56
G5 0.41 -3.45 -2.95 -3.33 -2.90 -3.65 -4.03 -4.00 -4.46 -3.29 -3.29 -3.89 -3.06 -2.69
G6 -0.51 -6.03 -4.55 -3.43 -4.19 -5.72 -4.99 -5.90 -4.81 -4.09 -4.23 -2.51 -3.33 -2.69
G7 -0.47 -4.76 -5.29 -4.43 -5.97 -6.10 -5.95 -5.33 -4.98 -4.27 -4.17 -2.85 -4.17 -3.39
G8 0.10 -5.50 -7.74 -8.98 -9.76 -11.52 -9.16 -8.35 -7.73 -6.06 -4.63 -4.84 -4.53 -4.24
表153：鼻洗液中之病毒負荷(Log10)
第2 天 第4 天 第6 天 第8 天
G1 6.12 4.36 低於LOD 低於LOD
G2 6.31 4.42 低於LOD 低於LOD
G3 5.80 -- -- 低於LOD 低於LOD
G4 4.26 3.12 低於LOD 低於LOD
G5 4.34 3.37 低於LOD 低於LOD
G6 5.11 3.44 低於LOD 低於LOD
G7 5.62 3.84 低於LOD 低於LOD
G8 6.07 3.56 低於LOD 低於LOD
表154：相對於媒劑(G1)之病毒負荷變化(Log 10)
   第2 天 第4 天 第6 天 第8 天
G1 0.00 0.00 na na
G2 0.19 0.06 na na
G3 -0.32 -- -- na na
G4 -1.86 -1.24 na na
G5 -1.79 -0.99 na na
G6 -1.01 -0.92 na na
G7 -0.50 -0.52 na na
G8 -0.06 -0.80 na na
還記錄了溫度變化(上午及下午)，並列在表155中。在研究過程中溫度之變化很大程度上支持了結合物45b在鼻負荷及體重方面所觀察到之功效。最顯著地，相對於經媒劑治療之雪貂，用結合物45b或奧司他韋治療時動物顯示出升高溫度的時間總體上減少。
在此研究中，每天對動物進行觀察，並對流感之臨床症狀及其嚴重程度進行評分。在此非致死模型中，打噴嚏係技術人員記錄之主要疾病體征(表156)。相對於媒劑治療之雪貂，用結合物45b或陽性對照治療之動物顯示較少打噴嚏之情形，相對於第1組，打噴嚏可以更快地消退。為了清楚起見，0.3 mg/kg治療組以及媒劑及奧司他韋組之圖示于圖96中。
在此研究中，藉由所有讀數(鼻負荷、體重、體溫及臨床評分)證明了結合物45b相對於媒劑治療之動物的有效活性。重要地，結合物45b在降低鼻洗液中之病毒負荷(其為本研究之主要讀數)方面比明顯更高劑量之奧司他韋更有效。在公認為模擬人類疾病之重要模型中觀察到之結合物45b之功效支持了該候選藥物之治療潛力。 表155：研究中之溫度變化
按天及時間(上午/下午)之以度(℃)為單位之平均變化
組 1 (AM) 1 (PM) 2 (AM) 2 (PM) 3 (AM) 3 (PM) 4 (AM) 4 (PM) 5 (AM) 5 (PM) 6 (AM) 7 (AM) 8 (AM) 9 (AM) 10 (AM) 11 (AM) 12 (AM) 13 (AM) 14 (AM)
G1 0.8 0.9 0.2 0.5 0.8 0.2 0.1 -1.1 0.5 -0.1 0.5 0.6 0.0 0.6 0.2 0.4 0.5 0.3 -0.4
G2 1.2 0.8 -0.3 0.1 -1.1 0.7 0.5 -0.2 0.0 -0.4 0.8 0.6 0.5 0.5 0.0 0.8 0.5 0.5 -0.4
G3 -0.4 -0.1 0.8 0.0 -0.6 -0.3 0.5 -1.7 -0.3 -0.8 0.2 -0.1 -0.2 0.1 -1.2 -0.1 0.4 0.1 -0.1
G4 -0.9 -0.3 0.6 -0.8 -1.4 -0.5 0.2 -1.4 -0.9 -1.2 0.3 0.0 -0.4 0.5 0.3 0.1 0.1 0.3 -0.8
G5 -0.2 -0.1 0.7 -0.7 -0.8 -0.7 -0.4 -1.7 -0.1 -1.1 0.2 0.0 -0.2 0.1 -0.2 0.2 0.1 0.1 -0.4
G6 0.1 0.6 1.1 -0.1 -1.2 -0.8 0.7 -0.5 -0.7 -0.7 0.8 0.3 -0.4 0.2 0.4 0.1 0.1 0.5 -0.5
G7 -0.3 0.0 0.8 -0.5 -1.8 -0.4 -0.3 -1.1 -0.6 -0.9 -0.4 0.6 -0.1 -0.7 -0.2 0.1 0.3 0.5 0.1
G8 -0.1 0.6 0.8 0.1 -1.6 -0.4 0.3 -0.6 -0.2 -1.0 0.0 -0.3 0.1 -0.4 -0.2 0.2 0.1 0.2 -0.1
表156：臨床評分
組 每天具有臨床體征之動物之數目
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
G1 0 3 2 2 3 2 4 4 2 3 3 0 2 0
G2 0 1 2 1 1 3 2 2 3 3 0 0 0 0
G3 0 0 2 2 1 1 2 1 0 1 0 0 1 0
G4 0 2 1 2 3 1 1 1 1 2 1 0 0 0
G5 0 2 2 2 2 0 0 1 1 1 0 0 0 0
G6 0 1 1 2 1 0 2 0 0 3 0 0 0 0
G7 0 2 2 1 1 2 3 1 1 1 0 1 0 0
G8 0 1 2 1 1 3 1 1 1 0 1 0 0 0
實例 183. 單次 IV 注射 3 mg/kg 後，雪貂中結合物 45b 之 5 天 PK 分析
雪貂PK研究係由IIT研究所(IITRI)使用3-5個月齡之雄性雪貂進行的。在用1 x 106 個斑塊形成單位(PFU)之A/California/07/2009(H1N1)流感病毒鼻內攻擊前24小時，以3 mg/kg(2 mL劑量體積)之單次靜脈內(IV)注射方式對雪貂(n = 5)投與結合物45b。在給藥及病毒攻擊之前，使用氯胺酮(25 mg/kg)及甲苯噻嗪(2 mg/kg)混合物將雪貂麻醉。給藥後5分鐘、2、24、72及120小時收集血液(約0.5-1 mL)，並處理血漿。在第2、4、6及8天收集洗鼻液(0.5 mL在PBS中)。在神經胺糖酸酶(NA)或Fc包被之板上捕獲結合物45b分子，然後使用HRP結合之抗人IgG-Fc抗體進行偵測。使用結合物45b標準曲線之4PL非線性迴歸在GraphPad Prism中計算蛋白質濃度。使用Phoenix WinNonlin 7.0將平均血漿濃度用於計算藥代動力學參數。更詳細方法描述提供於下文中。
在NA捕獲ELISA中，Nunc Maxisorp 96-孔板(目錄號12-565-136, ThermoFisher)經1X KPL包被包被緩衝液(目錄號5150-0041, SeraCare)中來自A/California/04/2009 (H1N1) (目錄號11058-VNAHC, Sino Biological)之0.1U/孔之NA包被包被。板在室溫下在軌道板式振盪器上(500 rpm)經培育持續1 h。將血漿樣品之連續稀釋液塗板並在室溫下，伴以振盪，培育2小時(樣品稀釋液：0.5% BSA於PBS 0.025% Tween 20中 +原生雪貂血漿最終濃度為1:100；從鼻洗樣品中除去血漿)。在各板上一式兩份運行0.230至500 ng/mL之結合物45b標準曲線。在2 h培育之後，板在具有0.05% Tween 20之300 µL PBS中洗滌5次。然後用在樣品稀釋液中以1：2,000稀釋之HRP結合抗人IgG Fc F(ab')2(目錄號709-036-098，Jackson)探測與板上NA結合之結合物，在室溫下培育1小時。然後將板在含有0.05%Tween 20之300 µL PBS中洗滌8次，並用TMB受質顯影7-8分鐘。該反應用1N H2 SO4 停止。使用EnSpire多模式讀板器(PerkinElmer)在450 nm處讀取吸光度。根據標準曲線之非線性迴歸分析(Sigmoidal，4PL分析)，使用GraphPad Prism版本8對血漿樣品中之結合物45b進行插值。接著使用所得平均血漿濃度，使用Phoenix WinNonlin 7.0藉由非房室分析來計算藥物動力學參數。
在Fc捕獲ELISA中，將Nunc Maxisorp 96孔板(目錄號12-565-136，ThermoFisher)在4℃下用碳酸鹽緩衝液(目錄號C3041，MilliporeSigma)中之0.1 µg/100 µL/孔之小鼠抗人類IgG(CH2域)純系R10Z8E9(目錄號MCA5748G，BioRad)包被隔夜。將板用300 µL/孔PBST洗滌5次，並在室溫下、在軌道板式振盪器上(500 rpm)、伴以振盪，用PBST中之200 µL/孔5%脫脂奶粉(目錄號9999S，Cell Signaling Technology)封閉1小時。將血漿樣品之連續稀釋液塗板並在室溫下、伴以振盪，培育2小時(樣品稀釋液：2.5%脫脂奶粉於PBS 0.025%Tween 20中 +原生雪貂血漿最終濃度為1:100；從鼻洗樣品中除去血漿)。在各板上一式兩份運行0.03至55 ng/mL之結合物45b標準曲線。培育2小時後，將板用300 µL/孔PBST洗滌5次。然後在室溫下、伴以振盪，用100 µL/孔之在樣品稀釋液中以1:2,000稀釋之HRP結合抗人IgG Fc F(ab')2(目錄號709-036-098，Jackson Immunoresearch)探測結合至板上Fc之結合物1小時。然後將板在300 µL/孔之PBST中洗滌8次，並用100 µL/孔之TMB受質試劑(目錄號555214，BD)顯影7-8分鐘。用100 µL/孔之1N H2 SO4 終止反應，並使用EnSpire多模式讀板器(PerkinElmer)在450 nm處讀取吸光度。使用非線性迴歸分析及如上所述計算之PK參數對血漿樣品中之結合物45b進行插值。
比較血漿及鼻洗液中之結合物45b水準之PK曲線分別顯示在圖93及圖94中。對於NA及Fc捕獲ELISA，觀察到相似之結合物45b血漿暴露水準。單次IV給予3 mg/kg後第5天，平均結合物45b雪貂血漿濃度約為10 µg/mL。在相匹配之時間點，鼻洗液之水準約為血漿水準之3-5%。實例 184. 在高病毒攻擊致死小鼠模型中皮下給予之結合物 45b 針對流感 A/PR/8/34(H1N1) 之功效
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8週)中針對致死性IAV H1N1流感感染評估結合物45b。攻擊病毒(A/PR/8/34)係能夠在小鼠中引起致死性感染之小鼠適應性分離株。該實驗包含10組，每組5隻小鼠，分為2個實驗組。在第0天，小鼠均在經氯胺酮/甲苯噻嗪之混合物(分別為150及10 mg/kg)麻醉之後藉由鼻內接種經30 µl體積(2x LD95；1x；組1-5)或50x LD95(25x；組6-10)之病毒攻擊。每天記錄死亡率及體重，持續14天，且具有20%體重減輕之任何動物均評為死亡。測試組在劑量為10 ml/kg之病毒攻擊後2小時接受3、1、0.3或0.1 mg/kg之結合物45b之單次皮下(SC)治療。研究設計在表157中概述。
在1x研究組中，經媒劑治療之小鼠在第6天死於攻擊病毒。相比之下，結合物45b表現出非凡之效能，並以最低劑量完全保護了1x病毒攻擊之小鼠(表158A)。對於所有結合物45b治療之小鼠，體重數據(表159A)顯示出重量之短暫減輕，該重量減輕在研究結前時已基本恢復。
在受到25倍以上病毒(50x LD95)攻擊之組中，小鼠更快地死於感染，到第5天80%死亡，並且到第6天100%死亡(表158B)。用結合物45b治療之小鼠在1或3 mg/kg之劑量下得到完全保護，而0.3 mg/kg之組之存活率為60%。令人驚訝地，即使受到更大病毒攻擊，1 mg/kg及3 mg/kg之治療亦僅表現出體重之適度下降，並以淨體重增加結束了本研究(表159B)。
此研究表明，即使在以極高病毒效價進行攻擊之情況下，結合物45b之效能亦很非凡。 表157：一般研究設計
組 流感 A 病 毒株 測試物品 途徑，時程 (T+2 小時 ) 劑量 (mg/kg) N
1 A/PR/8/34 (H1N1)3E2 PFU/小鼠，經由IN 媒劑(PBS) SC，單次 --- 5
2 結合物45b SC，單次 3 5
3 結合物45b SC，單次 1 5
4 結合物45b SC，單次 0.3 5
5 結合物45b SC，單次 0.1 5
6 A/PR/8/34 (H1N1)7.5E3 PFU/小鼠，經由IN 媒劑(PBS) SC，單次 --- 5
7 結合物45b SC，單次 3 5
8 結合物45b SC，單次 1 5
9 結合物45b SC，單次 0.3 5
10 結合物45b SC，單次 0.1 5
表158A：存活率百分比(1x攻擊)
結合物45b (mg/kg)
天 媒劑 3 1 0.3 0.1
0 100 100 100 100 100
1 100 100 100 100 100
2 100 100 100 100 100
3 100 100 100 100 100
4 100 100 100 100 100
5 100 100 100 100 100
6 0 100 100 100 100
7 0 100 100 100 100
8 0 100 100 100 100
9 0 100 100 100 100
10 0 100 100 100 100
11 0 100 100 100 100
12 0 100 100 100 100
13 0 100 100 100 100
14 0 100 100 100 100
表158B：存活率百分比(25x攻擊)
結合物45b (mg/kg)
天 媒劑 3 1 0.3 0.1
0 100 100 100 100 100
1 100 100 100 100 100
2 100 100 100 100 100
3 100 100 100 100 100
4 100 100 100 100 100
5 20 100 100 80 60
6 0 100 100 60 0
7 0 100 100 60 0
8 0 100 100 60 0
9 0 100 100 60 0
10 0 100 100 60 0
11 0 100 100 60 0
12 0 100 100 60 0
13 0 100 100 60 0
14 0 100 100 60 0
表159A：體重百分比(1x攻擊)
結合物45b (mg/kg)
天 媒劑 3 1 0.3 0.1
0 100 100 100 100 100
1 98.5 97.5 96.1 96.6 98.2
2 99.6 98.2 99.9 97.5 100
3 92.8 97.4 98.6 95.8 96.8
4 85.7 98.7 98.9 93.7 90.4
5 79 98.4 100.1 95.6 92.4
6 99.5 99.2 96.7 91.4
7 100.7 101.3 98.9 88.5
8 97.8 99.2 96.9 nd
9 102.9 103.2 100.7 92.1
10 101.4 101.4 99.7 95.9
11 100.9 101.5 99.6 96.7
12 102.1 104.5 100.9 98.8
13 102.7 102.6 101.8 99.3
14 101.9 103.4 101.1 98.6
nd = 未進行 表159B：體重百分比(25x攻擊)
結合物45b (mg/kg)
天 媒劑 3 1 0.3 0.1
0 100 100 100 100 100
1 97.2 96.6 97.4 97.6 98.6
2 95 99.6 100.9 98 98.7
3 nd nd nd nd nd
4 79.9 98.5 90.3 82.8 82.5
5 75.7 100.3 91.5 82.7 76.7
6 100.2 96.4
7 102.2 99.1
8 99.5 97.5
9 104.3 103
10 103.5 102.2
11 102.9 103.4
12 105.5 106.1
13 105.8 105.1
14 103.9 106
nd = 未進行實例 185. 在細胞病理效應 (CPE) 分析中結合物 45b 針對高致病性流感 A (H5N1 、 H7N9) 之活性
針對BSL-3 (高致病性)流感A進行活體外分析以測定結合物45b之效能，且一般地遵循標準程序。簡而言之，將不同濃度之測試物品與病毒(大約250 TCID50 )混合，並在35℃下培育1小時。在培育之後，該混合物添加至MDCK細胞之80-90%匯合單層中。培育90分鐘後，洗滌細胞，並重新施加測試物品。該單層隨後用羧甲基纖維素覆蓋以使病毒擴散降至最低且使其培育持續兩天。培養兩天後，將細胞用PBS洗滌並用10%福爾馬林固定。在固定之後，該MDCK單層用Triton X-100滲透且用針對流感核蛋白之小鼠mAb免疫染色。單層經讀取，且計算每個孔之經染色面積以測定EC50/100 值。
該研究結果總結在表160中，並證明結合物45b對具有大流行潛力之高致病性病毒株之效能。重要地，結合物45b對四個H5N1及一個H7N9分離株產生之IC50 值等於或低於17 nM。相反，在該組中，奧司他韋及紮那米韋表現出對高致病病毒株之不完全覆蓋。最值得注意地，他們缺乏針對重要H7N9分離株之活性。然而，結合物45b對此分離株具有很高效能(0.5 nM)。此等結果表明，結合物45b治療由高毒力流感引起之大流行病之潛力優於奧司他韋及紮那米韋，並且大致等於巴洛沙韋。  表160：結合物45b針對高致病流感分離株之活體外活性。
針對病毒複製之IC50 ( 以nM 為單位)
流感類型 HA/NA 類型 結合物45b 結合物6 奧司他韋 巴洛沙韋 紮那米韋
A/Vietnam/1194/2004 H5N1(演化支1) 5.3 0.5 168.7 1.7 16.9
A/Indonesia/05/2005 H5N1(演化支2.1) 16.9 0.5 ≥ 300 1.7 16.9
A/Turkey/turkey/1/2005 H5N1(演化支2.2) 1.7 0.5 168.7 1.7 5.3
A/Hong Kong/156/ H5N1(演化支0) 0.5 1.7 ≥ 300 1.7 53.3
A/Anhui/1/2013 H7N9 0.5 0.2 ≥ 300 5.3 ≥ 300
A/Netherlands/602/2009 H1N1* 1.7 0.5 ≥ 300 1.7 ≥ 300
* ：季節性比較物
實例 186. 單次 IV 注射 30 、 10 、 3 、 1 或 0.3 mg/kg 後，雪貂鼻洗液中結合物 45b 之 8 天 PK 分析
雪貂PK研究係由IIT研究所(IITRI)使用3-5個月齡之雄性雪貂進行的。在用1 x 106 個斑塊形成單位(PFU)之A/California/07/2009(H1N1)流感病毒進行鼻內攻擊之前24小時，藉由30、10、3、1或0.3 mg/kg(2 mL劑量體積)單次靜脈內(IV)注射給雪貂(n = 5)投與結合物45b。在給藥及病毒攻擊之前，使用氯胺酮(25 mg/kg)及甲苯噻嗪(2 mg/kg)混合物將雪貂麻醉。攻擊後第2、4、6及8天藉由用氯胺酮(25 mg/kg)及甲苯噻嗪(2 mg/kg)麻醉動物，將0.5 mL補充有青黴素(100 U/mL)、鏈黴素(100 µg/mL)及慶大黴素(50 µg/mL)之無菌PBS注射至各鼻孔，並將排出之液體收集至樣品杯中，收集鼻洗液。記錄回收之鼻洗液之體積，並藉由Fc捕獲ELISA確定結合物45b之濃度。在神經胺糖酸酶包被之板或抗hIgG1抗體包被之板上捕獲結合物45b分子，然後使用HRP結合之抗人IgG-Fc抗體進行偵測。使用抗hIgG1 Fc抗體捕獲hIgG1。
簡而言之，將Nunc Maxisorp 96孔板(目錄號12-565-136，ThermoFisher)在4℃下用碳酸鹽緩衝液(目錄號C3041，MilliporeSigma)中之0.1 µg/100 µL/孔之小鼠抗人IgG(CH2域)純系R10Z8E9(目錄號MCA5748G，BioRad)包被隔夜。將板用300 µL/孔PBST洗滌5次，並在室溫下、在軌道板式振盪器上(500 rpm)、伴以振盪，用PBST中之200 µL/孔5%脫脂奶粉(目錄號9999S，Cell Signaling Technology)封閉1小時。最初將鼻洗樣品在基質匹配之稀釋液(來自原生動物之鼻洗液於具有0.5% BSA及0.025% Tween 20之PBS中之1:10稀釋液)中1:10稀釋，然後連續3倍稀釋，並每孔添加100 µL至板中，並在室溫下、伴以振盪，培育2小時。在各板上一式兩份運行0.03至55 ng/mL之結合物45b標準曲線。培育2小時後，將板用300 µL/孔PBST洗滌5次。然後在室溫下、伴以振盪，用100 µL/孔之在樣品稀釋液中以1:2,000稀釋之HRP結合抗人IgG Fc F(ab')2(目錄號709-036-098，Jackson Immunoresearch)探測結合至板上Fc之結合物45b持續1小時。然後將板在300 µL/孔之PBST中洗滌8次，並用100 µL/孔之TMB受質試劑(目錄號555214，BD)顯影7-8分鐘。用100 µL/孔之1N H2 SO4 終止反應，並使用ENSPIRE®多模式讀板器(PerkinElmer)在450 nm處讀取吸光度。根據標準曲線之非線性迴歸分析(Sigmoidal，4PL分析)，使用GraphPad Prism版本8對雪貂洗鼻液樣品中之結合物45b進行插值。比較雪貂鼻洗液中之結合物45b之PK曲線顯示在圖94及圖95中。在0.3 mg/kg IV與30 mg/kg IV之間觀察到結合物45b雪貂鼻洗液水準之劑量成比例增加。0.3 mg/kg隊列之8天時間點低於Fc捕獲偵測之極限(1 ng/mL)。實例 187. 藉由三種不同途徑給藥之致死性小鼠流感模型中結合物 45b 對流感 A (H1N1) 之功效
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8週)中針對致死性IAV H1N1流感感染評估結合物45b。攻擊病毒(A/California/07/2009)係能夠在小鼠中引起致死性感染之大流行分離株。該實驗包含10組，每組5隻小鼠。在第0天，所有小鼠均在經氯胺酮/甲苯噻嗪(分別為100及10 mg/kg)輕微地麻醉之後藉由鼻內接種經30 µl體積之病毒(3x LD95 ；約3E4個病毒/小鼠)攻擊。各組在攻擊後2小時接受靜脈內(IV)、肌內(IM)或皮下(SC)之結合物45b或媒劑(PBS)之單次治療(表160)。每天監測死亡率及體重(BW)，持續14天。體重減輕超過20%之任何小鼠均被視為死亡。  表160：一般研究設計
組 流感 A 毒株 測試物品 途徑，時程 (T+2 h) 劑量 (mg/kg) N
1 A/CA/07/09 (H1N1) 3E4 PFU/小鼠，經由IN 媒劑(PBS) IV，單次 --- 5
2 結合物45b IV，單次 1 5
3 結合物45b IV，單次 0.3 5
4 結合物45b IV，單次 0.1 5
5 結合物45b IM，單次 1 5
6 結合物45b IM，單次 0.3 5
7 結合物45b IM，單次 0.1 5
8 結合物45b SC，單次 1 5
9 結合物45b SC，單次 0.3 5
10 結合物45b SC，單次 0.1 5
為了測定藉由不同給藥途徑之結合物45b之效能，匹配濃度之結合物(1、0.3及0.1 mg/kg)經IV、IM或SC給藥。如藉由存活率所量測，藉由在0.1 mg/kg下之任何給藥途徑，所有給藥途徑均係100%有效的，先前將0.1 mg/kg確定為當SC給予結合物45b時之最低有效劑量(表161)。但是，截至第6天，接受媒劑治療之小鼠死亡率達到80%。當藉由存活率量測時，此等數據證明了結合物45b之等效效能，而與給藥途徑無關。  表161：存活率百分比
媒劑 結合物 45b ( 給藥途徑 ) (mg/kg)
IV IM SC
天 1 0.3 0.1 1 0.3 0.1 1 0.3 0.1
0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
1 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
2 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
3 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
4 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
5 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
6 20 100 100 100 100 100 100 100 100 100
7 20 100 100 100 100 100 100 100 100 100
8 20 100 100 100 100 100 100 100 100 100
9 20 100 100 100 100 100 100 100 100 100
10 20 100 100 100 100 100 100 100 100 100
11 20 100 100 100 100 100 100 100 100 100
12 20 100 100 100 100 100 100 100 100 100
13 20 100 100 100 100 100 100 100 100 100
14 20 100 100 100 100 100 100 100 100 100
體重數據有力地支持了存活率數據，證明了結合物45b在任一給藥途徑下均具有很高之效能(表162)。作為此高毒力大流行分離株之典型表現，小鼠在第3天或第4天出現約10%之BW減輕。令人驚訝地，相同劑量濃度之間之BW差異隨給藥途徑僅有極小變化(見斜體，表162)。來自該研究之BW數據進一步支持了以上結論，即無論給藥途徑如何，結合物45b均係有效的。  表162：體重百分比*
媒劑 結合物 45b ( 給藥途徑 ) (mg/kg)
IV IM SC
天 1 0.3 0.1 1 0.3 0.1 1 0.3 0.1
0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
1 96.3 96.6 98.5 96.9 97.6 98 100 100.3 99.9 101.1
2 96.8 100.7 100.7 100.3 101.8 100.2 100.9 101.9 101.3 101.4
3 87.7 91.4 90.8 91.9 92.3 91.3 90.4 93.1 90.8 90.7
4 82.8 94.3 91.1 89.8 94.5 91.4 89 91.3 88 88.4
5 80.8 97.5 94.2 92.2 96.6 93.5 93.1 95.1 90 89.5
6 78.9 97.4 95.5 93.2 96.8 95.2 94.8 96.8 90.6 90.1
7 100.1 97.5 96.8 99.7 96.7 96.7 96.9 95 92.9
8 98.5 97 95.1 98.4 94.9 96.4 97.1 94.8 93.2
9 99.8 96.8 95.7 98.5 94.8 95.7 96.6 93.8 93.3
10 99.3 97.3 95.5 98.7 94.8 97.7 95.2 94.8 93.9
11 103.4 100.8 101.4 103.3 100.1 101.1 100.2 99.4 98.1
12 102.3 100.4 100.3 101.7 99.4 100.5 99.1 98.2 98
13 102.2 100 99.8 101.4 99.5 101.1 99 98.7 98.4
14 103.6 101.8 100.4 102.5 101.2 102.7 101.9 100.4 99.9
*數據為直到組中首例死亡為止之組平均值
藉由兩種不同讀數，發現結合物45b如果藉由IV、SC或IM給藥途徑給藥係同樣有效的。結合物45b之給藥途徑撓性係顯著優點，允許針對醫院及門診環境採用不同製劑及給藥途徑(如果需要)。實例 188 合成結合物 46
製備點擊試劑溶液：PBS緩衝溶液中之0.0050M CuSO4 ：10.0 mg CuSO4 溶解於12.53 mL PBS中，接著採用5.00 mL此CuSO4 溶液且添加43.1 mg BTTAA (CAS編號1334179-85-9)及247.5 mg抗壞血酸鈉以生成點擊試劑溶液(0.0050M CuSO4、0.020M BTTAA及0.25M抗壞血酸鈉)。
向在15 mL離心管中之疊氮基官能化Fc(65.5 mg，10.0 mL，1.13 µmol，疊氮基DAR〜5.9，SEQ ID NO：76)之溶液中添加炔烴衍生之小分子(22.7 mg，15.2 μmol，Int-83. 實例145中所述，每Fc疊氮基3.0當量)。輕輕攪拌使所有固體溶解後，將混合物用點擊試劑溶液(1.80 mL)處理。所得混合物在環境溫度下輕柔地經旋轉持續12小時。其相繼藉由在蛋白A管柱上之親和層析法、尺寸排阻層析法(參見一般結合物純化方案)經純化。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出66,420 Da之平均質量(DAR = 5.8)。產量57 mg，具有98%純度。所得之結合物在圖102中示出。
申請者注意到，可以使用具有對應於Fc同種異型差異之胺基酸序列為SEQ ID NO：77之Fc域來替代地製備結合物46。就本文所述之性質而言，預期不同之同種異型表現相同。
申請者進一步注意到，編碼結合物46之Fc之核酸構築體包括編碼包括C端離胺酸殘基之SEQ ID NO：67之胺基酸序列之核酸。表現後，結合物46之Fc之C端離胺酸被蛋白水解裂解，產生具有SEQ ID NO：76之序列之Fc。C端離胺酸之存在或不存在不會改變Fc或相應結合物之性質。實例 189. IV 投與結合物 45b 及結合物 46 後，為期 30 天之非人類 靈長類動物 PK 比較研究
由BTS Research (San Diego, CA)使用體重介於3.5-8.5 kg範圍內之5-9歲雄性及雌性食蟹獼猴執行非人類靈長類動物(NHP)PK研究。NHP經IV注射2 mg/kg之測試物品(0.4 mL/kg之劑量體積)。動物經圈養於標準IACUC批准之圈養條件下。在適當時間，對動物進行非末端放血(藉助於股靜脈或頭靜脈)，其中血液經收集於K2 EDTA管中以預防凝血。所收集之血液經離心(2,000 xg ，持續10分鐘)且抽出血漿以隨時間分析測試物品濃度(表163)。藉由夾心ELISA量測各時間點之結合物45b及結合物46之血漿濃度。簡而言之，將測試物品捕獲在Fc包被之板上，然後使用HRP結合之抗人IgG-Fc抗體進行偵測。使用結合物45b或結合物46標準曲線之4PL非線性迴歸在GraphPad Prism中計算蛋白質濃度。更詳細方法描述在上文提供。比較結合物45b及結合物46之曲線在圖97中示出。與結合物45b之約10天相比，結合物46之終末半衰期顯著改善，約為45天。結合物46之AUC為結合物45b之AUC之2倍(表163)。 表163：猴子PK，結合物45b與結合物46
時間(h)
0.25 4 8 24 72 120 168 240 336 672
劑量(mg/kg) 途徑 結合物 濃度 Tmax Cmax AUC 最後 半衰期
(ug/mL) (h) (ug/mL) (h*ug/mL) (h)
2 IV 結合物45b 平均 32.6 24.8 20.1 14.1 9.97 7.61 6.33 4.47 3.62 1.47 0.25 32.6 3450 249
2 IV 結合物46 平均 35.4 29 25.7 20.5 15.1 13 11.2 10.4 8.71 7.97 0.25 35.4 7210 1080
實例 190. 在細胞病理效應 (CPE) 檢定中，結合物 45b 及標準護理比較物對 A 型季節性、大流行及耐藥流感病毒株之活性
如實例166中所述進行活體外檢定，以測定與奧司他韋、紮那米韋及巴洛沙韋之對照物相比，結合物45b之效能，並且通常遵循標準程序。數據展示於表164-167中。  表164：針對MDCK SIAT1細胞中流感A/CA/07/2009(H1N1)pdm之CPE
分子 MOI 0.001 EC50 [nM] MOI 0.01 EC50 [nM]
奧司他韋 18.54 34.2
紮那米韋 16.321 33.16
結合物45b 0.8355 2.964
巴洛沙韋 ＜0.3 2.216
表165：針對MDCK SIAT1細胞中A型流感WT及H275Y突變體(H1N1)之CPE
EC50 [nM] 流感 A/California/12/2012 (H1N1) 流感A/Texas/23/2012 (H1N1) H275Y
分子 MOI 0.001 MOI 0.01 MOI 0.001 MOI 0.01
奧司他韋 107.6 1653 ＞10,000 ＞10,000
紮那米韋 54.59 558.1 327.7 ＞10,000
結合物45b 0.7043 20.1 2.101 81.86
巴洛沙韋 3.718 4.924 3.318 21.24
表166：針對MDCK SIAT1細胞中之A型流感WT及E119V突變體(H3N2)之CPE
細胞病理效應EC50 [nM] 流感A/Washington/12/2007 (H3N2) 流感A/Texas/12/2007 (H3N2) E119V
分子 MOI 0.001 MOI 0.01 MOI 0.001 MOI 0.01
奧司他韋 N/A 12.39 96.04 ＞10,000
紮那米韋 N/A 29.57 50.17 940.1
結合物45b N/A 0.0637 1.193 43.12
巴洛沙韋 N/A 0.9758 5.196 27.87
表167：在MOI 0.01下，針對B型流感之CPE [nM]
分子 TM DAR Fc 中心連接體 B/Florida/4/2006 B/Brisbane/60/2008 B/Malaysia/2506/2004 B/Colorado/6/2017
奧司他韋 N/A N/A N/A N/A 1203 1568 735.7 ＞10,000
紮那米韋 N/A N/A N/A N/A 61.57 607.9 360.7 2746
結合物45b Int-83 4.2 SEQ ID NO: 73 15個原子 10.78 7.291 6.252 25.93
巴洛沙韋 N/A N/A N/A N/A 20.95 46.84 61.33 100.9
實例 191. 比較結合物 45b 之血漿及上皮襯裡液 (ELF) 濃度之 14 天小鼠 PK 研究
使來自Charles River Laboratories之雌性BALB/c小鼠在研究開始前適應5天。各籠子圈養3-6隻動物，自由進食及飲水。所有程序均按照NeoSome IACUC政策及準則執行。小鼠經皮下(SC)注射20 mg/kg之測試物品(10 mL/kg之劑量體積)。在選定時間點，藉由CO2 吸入使3隻小鼠安樂死。藉由心臟穿刺將血液收集至K2 EDTA管中以保留血漿。采血後，藉由暴露氣管，插入23G導管適配器並用無菌1X PBS pH 7.4進行2 x 0.5 mL沖洗來進行支氣管肺泡灌洗(BAL)。記錄並保留回收之液體量。一旦BAL程序完成，取出肺部、稱重並儲存在-80℃。傾析血漿及BAL液體(BALF)之等分試樣，然後在-80℃儲存樣品以用於尿素定量檢定。將收集之BALF在室溫下以12,000 RPM離心5分鐘以沈澱肺泡巨噬細胞，並且沈澱物及上清液均儲存在-80℃下直至發運至主管者。如上詳述，藉由間接ELISA量測各時間點之結合物45b之血漿濃度。簡而言之，在神經胺糖酸酶(NA)包被之板上捕獲結合物45b分子，然後使用HRP結合之抗人類IgG Fcγ特異性F(ab')2 進行偵測。對如上所述收穫之BALF進行相同ELISA。在GraphPad Prism中使用結合物45b標準曲線之4PL非線性迴歸計算結合物45b血漿濃度。如前所述(Rennard等，1986J Appl Physiol 60：532-538)，使用尿素作為稀釋標記來確定ELF體積及ELF中之結合物45b濃度。將結合物45b與ELF水準進行比較之曲線在圖98中示出。截至注射後2小時，在剩下時間過程中，結合物45b上皮襯裡液(ELF)之水準約為血漿暴露水準(AUC)之60%，表明結合物45b幾乎立即從血漿分配至肺部ELF(圖98，表168)。  表168：在2週內小鼠結合物45b血漿及ELF水準。
時間
(h)
1 2 4 8 24 48 72 120 168 336
組 濃度 Tmax Cmax AUC 最後
(ug/mL) (h) (ug/mL) (h*ug/mL)
ELF 5.61 29.9 70.6 98.4 149 105 94.2 49.5 47.4 16.1 24 149 19000
血漿 30.7 63.9 110 180 197 178 144 104 87 29.4 24 197 32500
實例 192. 比較 SCID 小鼠中結合物 45b 之 IV 、 SC 及 IM 投與之 7 天小鼠 PK 研究。
小鼠PK研究係使用6週齡之缺乏適應性免疫系統之雄性嚴重複合型免疫缺乏(SCID)小鼠進行的。小鼠經IV、SC或IM注射5 mg/kg之測試物品(10 mL/kg之劑量體積)。動物經圈養於標準IACUC批准之圈養條件下。在適當時間，對動物進行非末端放血(眶後、頰或藉由尾靜脈)，其中血液經收集於K2 EDTA管中以預防凝血。所收集之血液經離心(2,000 xg ，持續10分鐘)且抽出血漿以隨時間分析測試物品濃度。如上詳述，藉由ELISA量測各時間點之結合物45b之血漿濃度。簡而言之，在神經胺糖酸酶(NA)包被之板上捕獲結合物45b分子，然後使用HRP結合之抗人類IgG Fcγ特異性F(ab')2 進行偵測。對於Fc捕獲ELISA，使用抗hIgG1 Fc抗體捕獲hIgG1，然後使用結合了HRP之抗人類IgG Fcγ特異性F(ab')2 進行偵測。使用結合物45b標準曲線之4PL非線性迴歸在GraphPad Prism中計算蛋白質濃度。在圖99-100中顯示了比較7天中SCID小鼠中之結合物45b PK特性之曲線。SC及IM之結合物45b血漿暴露水準相當，與IV投與相比，SC或IM途徑產生之生物利用度約為77%。注射後約24小時，所有給藥途徑之結合物45b血漿濃度均相等。實例 193. 比較結合物 45b 與結合物 46 之 SC 投與之 7 天小鼠 PK 研究
使用6週齡雄性CD-1小鼠執行小鼠PK研究。大鼠經SC注射10 mg/kg之測試物品(10 mL/kg之劑量體積)。動物經圈養於標準IACUC批准之圈養條件下。在適當時間，對動物進行非末端放血(眶後、頰或藉由尾靜脈)，其中血液經收集於K2 EDTA管中以預防凝血。所收集之血液經離心(2,000 xg ，持續10分鐘)且抽出血漿以隨時間分析測試物品濃度。如上詳述，藉由間接ELISA量測各時間點之結合物45b之血漿濃度。簡而言之，將結合物45b分子捕獲在神經胺糖酸酶(NA)包被之板上，然後使用HRP結合之抗人類IgG Fcγ特異性F(ab')2 進行偵測。使用結合物45b標準曲線之4PL非線性迴歸在GraphPad Prism中計算蛋白質濃度。比較結合物45b及結合物46之7天PK特性之曲線在圖101中示出。結合物46之血漿暴露水準比結合物46高約50%。與WT人類IgG1相比，已知人類IgG1 YTE Fc變異體在小鼠中之半衰期縮短，此歸因於在中性pH下增強之小鼠FcRn之結合，從而抵消了改善之在酸性pH下與小鼠FcRn之結合(Dall'Acqua等人2002J Immunol 169：5171-5180)。實例 194. 結合物 45b 及巴洛沙韋之組合治療
細胞病理效應(CPE)。單層MDCK Siat1細胞被A型流感亞型感染，其適當MOI在0.01-1之間變化。結合物45b單獨或與1-1,000 nM範圍內濃度之標準護理劑(例如巴洛沙韋)組合測試，並在37℃，5% CO2 下針對A型流感培育3天。藉由讀取595 nm處之吸光度，藉由結晶紫染色確定CPE。數據展示於表169-172中。當與巴洛沙韋組合使用時，結合物45b有效抑制病毒複製之濃度顯著低於單獨使用時之濃度(EC50 降低幅度＞ 10倍)，即使當巴洛沙韋之濃度低於其EC50 時亦如此。  表169：在CPE中，在固定濃度之巴洛沙韋存在下，針對MOI 0.01下之MDCK SIAT細胞中之A/CA/07/2009(H1N1)pdm流感之結合物45b EC50 之變化
分子 巴洛沙韋[nM] MOI 0.01 EC50 [nM]
結合物45 0 7.369
1 0.7347
2 ＜0.39
4 ＜0.39
8 ＜0.39
16 ＜0.39
32 ＜0.39
64 ＜0.39
單獨巴洛沙韋之EC50 = 2.41 nM 表170：在CPE檢定中，在固定濃度之巴洛沙韋存在下，針對MOI 0.1下之MDCK SIAT細胞中之A/CA/07/2009(H1N1)pdm流感之結合物45b EC50 之變化
分子 巴洛沙韋[nM] MOI 0.1 EC50 [nM]
結合物45b 0 ＞100 (405.5)
1 9.169
2 4.671
4 ＜0.39
8 ＜0.39
16 ＜0.39
32 ＜0.39
64 ＜0.39
單獨巴洛沙韋之EC50 = 7.95 nM 表171：在CPE檢定中，在固定濃度之巴洛沙韋存在下，針對MOI 0.01下之MDCK SIAT細胞中之A/Texas/71/2017 (H3N2)pdm流感之結合物45b EC50 之變化
分子 巴洛沙韋[nM] MOI 0.01 EC50 [nM]
結合物45b 0 45.93
1 5.242
2 2.429
4 0.8822
8 0.2175
16 0.02432
32 0.04907
64 0.1346
單獨巴洛沙韋之EC50 = 8.238 nM 表172：在CPE檢定中，在固定濃度之巴洛沙韋存在下，針對MOI 0.1下之MDCK SIAT細胞中之A/Texas/71/2017 (H3N2)pdm流感之結合物45b EC50之變化
分子 巴洛沙韋[nM] MOI 0.1 EC50 [nM]
結合物45b 0 30015
1 105
2 100.9
4 10.17
8 ＜0.39
16 ＜0.39
32 ＜0.39
64 ＜0.39
單獨巴洛沙韋之EC50 = 17.31 nM實例 195. 合成 Int-91
Figure 02_image2022
步驟 a.
Figure 02_image2023
向先前製備之紮那米韋衍生物(1.993 g，2.362 mmol，實例79中所述之Int-22)在甲醇(30 mL)中之0℃攪拌溶液中加入DBU(2.4 mL)。將溫度升至環境溫度，並且1小時後，反應僅發展為所需產物。藉由旋轉蒸發移除所有揮發物。殘餘物藉由矽膠管柱使用IscoCombiFlash液相層析法純化，用0%至30%之甲醇及二氯甲烷溶離。產量1.584 g，82%。藉由LCMS發現之離子：[(M + H + Na)]+ = 840.0，[(M + H)]+ = 818.2。步驟 b.
Figure 02_image2025
在1小時內，藉由注射器幫浦，向步驟a產物(500 mg，0.611 mmol)在吡啶(15.0 mL)中之0℃攪拌溶液中加入甲苯磺醯氯(146 mg，0.764 mmol)5.0 mL二氯甲烷)。甲苯磺醯氯完全消耗後(HPLC監測)，以相同之方式加入等分之甲苯磺醯氯，且將此添加重複另外兩次(反應結束時甲苯磺醯氯之總當量為5)。用甲醇(0.5 mL)淬滅反應，並藉由旋轉蒸發移除所有揮發物。殘餘物藉由矽膠管柱使用Isco COMBIFLASH®液相層析法純化，用0%至30%之甲醇及二氯甲烷溶離。產量0.429 g，72%。藉由LCMS發現之離子：[(M + H)]+ = 972.2。步驟 c.
Figure 02_image2027
向步驟b之產物(547 mg，0.563 mmol)在DMF(5.0 mL)中之攪拌溶液中，加入18-冠-6(59 mg，0.225 mmol)及疊氮化鈉(183 mg，2.814 mmol)，然後升溫至50℃。藉由LCMS完成反應後，藉由旋轉蒸發移除所有揮發物。殘餘物藉由矽膠管柱使用Isco COMBIFLASH®液相層析法純化，用0%至30%之甲醇及二氯甲烷溶離。產量0.333 g，70%。藉由LCMS發現之離子：[(M + H)]+ = 843.2。步驟 d.
Figure 02_image2029
向步驟c產物(548 mg，0.650 mmol)在THF(8.0 mL)中之攪拌溶液中，加入環丙烷酸之N-羥基琥珀醯亞胺酯(237 mg，1.300 mmol)及三甲基膦(133 μL，1.300 mmol)。藉由LCMS完成後，藉由旋轉蒸發移除所有揮發物。殘餘物藉由矽膠管柱使用Isco COMBIFLASH®液相層析法純化，用0%至50%之甲醇及二氯甲烷溶離。產量0.488 g，85%。藉由LCMS發現之離子：[(M + H)]+ = 885.2。步驟 e.
Figure 02_image2031
向步驟d產物(488 mg，0.551 mmol)之四氫呋喃及水(2.0 mL)之0℃攪拌溶液中加入氫氧化鋰(14 mg，0.606 mmol)。藉由LCMS完成後，加入amberliteIRN-77，直到發現pH為酸性。混合物用乙酸乙酯過濾，並棄去樹脂。藉由旋轉蒸發移除所有揮發物，並將粗物質溶於二氯甲烷(4.0 mL)及TFA(2.0 mL)。完成後，所有揮發物藉由旋轉蒸發蒸發。殘餘物藉由HPLC (0至40%甲醇及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量370 mg，86%。藉由LCMS發現之離子：[(M + H)]+ = 671.2。實例 196. 合成結合物 47
將疊氮基官能化之Fc(50 mg，5.0 mL，0.862 μmol，SEQ ID NO：73，DAR-7.0)溶液添加至40 mL離心管中，該離心管中含有炔烴官能化之小分子(6.1 mg，7.760 μmol，Int-91，如實例195所述製備)。輕輕振盪以溶解所有固體後，向其中加入L-抗壞血酸鈉(12.3 mg，62.08 µmol)、硫酸銅(II)(2.5 mg，15.52 µmol)及BTTAA(26.7 mg，62.08 µmol)於PBS 7.4緩衝液(6.984 mL)中之溶液。所得混合物輕柔地震盪隔夜。其相繼藉由在蛋白A管柱上之親和層析法、尺寸排阻層析法(參見本文提供之一般結合物純化方案)經純化。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出64,423 Da之平均質量(DAR = 6.9)。產量35.3 mg，70%產率。
編碼結合物47之Fc之核酸構築體包含編碼SEQ ID NO：64之胺基酸序列的核酸，該胺基酸序列包含C末端離胺酸殘基。表現後，結合物47之Fc之C末端離胺酸經蛋白水解裂解，由此產生具有SEQ ID NO：73之序列的Fc。C末端離胺酸之存在或不存在不改變Fc或相應結合物之性質。實例 197. 合成胺基甲酸酯 Int-92
Figure 02_image2033
步驟 a.
Figure 02_image2034
將如實例21所述製備之中間體(5.15 g，12.74 mmol)溶解在丙酮(100 mL)中。加入了Amberlite IRN-77酸性樹脂，使當用pH試紙量測時，pH達到約4。加熱反應物直至所有原料耗盡。冷卻後，將反應過濾，並將濾液藉由旋轉蒸發濃縮。殘餘物藉由矽膠管柱使用Isco COMBIFLASH®液相層析法純化，用0%至30%之甲醇及二氯甲烷溶離。產量3.535 g，62%。藉由LCMS發現之離子：[(M + H + Na)]+ = 467.2，[(M + H - t-Bu)]+ = 389.2，[(M + H - Boc)]+ = 345.2。步驟 b.
Figure 02_image2036
向步驟a產物(3.258 g，7.391 mmol)及對硝基苯酚氯甲酸酯(2.979 g，14.78 mmol)於吡啶(80 mL)中之攪拌溶液中加入DMAP(1.806 g，14.78 mmol)。18小時後，加入另外對硝基苯酚氯甲酸酯(1.490 g，7.391 mmol)及DMAP(0.903 g，7.391 mmol)。反應完成後，藉由旋轉蒸發移除所有揮發物。將殘餘物吸收在DCM(250 mL)中，並過濾。濾液用2 N硫酸溶液(3×100 mL)洗滌，然後用碳酸氫鈉飽和溶液(3×100 mL)洗滌。將有機物用鹽水(200 mL)乾燥，然後用硫酸鎂乾燥，過濾並濃縮。殘餘物藉由矽膠管柱使用Isco COMBIFLASH®液相層析法純化，用0%至100%之丙酮及己烷溶離。產量4.122 g，91%。藉由LCMS發現之離子：[(M + H + Na)]+ = 632.1，[(M + H)]+ = 554.0，[(M + H - Boc)]+ = 510.2。步驟 c.
Figure 02_image2038
向步驟b產物(4.00 g，6.562 mmol)及DIPEA(2.400 mL，13.78 mmol)於DCM(40 mL)中之0℃攪拌溶液中，加入炔丙基-PEG4-胺。將溫度升至環境溫度，並繼續攪拌直至完成(藉由LCMS檢測)。藉由旋轉蒸發移除所有揮發物。殘餘物藉由矽膠管柱使用Isco COMBIFLASH®液相層析法純化，用0%至50%之甲醇及二氯甲烷溶離。產量4.130g，90%。藉由LCMS發現之離子：[(M + H + Na)]+ = 724.1，[(M + H - Boc)]+ = 602.2。步驟 d.
Figure 02_image2040
將步驟c之產物(4.13 g，5.885 mmol)溶於乙酸(24 mL)及水(12 mL)中，然後攪拌直至藉由LCMS觀察到完全轉化。藉由旋轉蒸發濃縮反應。藉由注射器幫浦，向該殘餘物(4.60 g，5.340 mmol)在吡啶(150 mL)中之攪拌溶液中緩慢加入Tosyl-Cl(1.392 g，7.299 mmol)在DCM(10 mL)中之溶液。在消耗Tos-Cl後，添加額外之量(1.392 g，7.299 mmol)。原料完全轉化後，藉由旋轉蒸發移除所有揮發物。殘餘物藉由矽膠管柱使用Isco COMBIFLASH®液相層析法純化，用0%至50%之甲醇及二氯甲烷溶離。產量3.380 g，71%。藉由LCMS發現之離子：[(M + H + Na)]+ = 838.0，[(M + H - Boc)]+ = 716.2。步驟 e.
Figure 02_image2042
向步驟d甲苯磺酸酯(3.280 g，4.020 mmol)於DMF(30 mL)中之攪拌溶液中，加入18-冠-6(425 mg，1.608 mmol)及疊氮化鈉(1.307 g，20.10 mmol)，然後溫度升至50℃。藉由LCMS完成後，所有揮發物藉由旋轉蒸發而蒸發。殘餘物藉由矽膠管柱使用Isco COMBIFLASH®液相層析法純化，用0%至50%之甲醇及二氯甲烷溶離。產量2.651 g，96%。藉由LCMS發現之離子：[(M + H + Na)]+ = 709.2，[(M + H - Boc)]+ = 587.2。步驟 f.
Figure 02_image2044
向步驟e產物(2.649 mg，3.858 mmol)在THF(20 mL)中之攪拌溶液中加入環丙烷酸之N-羥基琥珀醯亞胺基酯(1.413 g，7.715 mmol)及三甲基膦(795 μL，7.715 mmol)。藉由LCMS完成反應後，所有揮發物藉由旋轉蒸發蒸發。殘餘物藉由矽膠管柱使用Isco COMBIFLASH®液相層析法純化，用0%至50%之甲醇及二氯甲烷溶離。產量1.744 g，62%。藉由LCMS發現之離子：[(M + H)]+ = 729.2。步驟 g.
Figure 02_image2046
向步驟f產物(1.744 g，2.393 mmol)在DCM(15 mL)中之0℃攪拌溶液中加入TFA(15 mL)，然後將溫度升至環境溫度。消耗完所有原料後，藉由旋轉蒸發移除揮發物。該粗產物之LCMS分析表明[(M + H)] + ＝ 629.2。將該物質溶於DIPEA(7.502 mL，43.07 mmol)在DCM(15 mL)中之0℃攪拌溶液中，並用雙-Boc-對硝基苯酚氯甲酸酯(817 mg，2.632 mmol)處理。消耗原料後，藉由旋轉蒸發移除所有揮發物。殘餘物藉由矽膠管柱使用Isco COMBIFLASH®液相層析法純化，用0%至50%之甲醇及二氯甲烷溶離。產量631 mg，30%。藉由LCMS發現之離子：[(M + H)]+ = 871.2。步驟 h.
Figure 02_image2048
向步驟g產物(315 mg，0.362 mmol)之乙腈(4.0 mL)及1.0 M NaCl水溶液(8 mL)之0℃攪拌溶液中，加入1.0 M NaOH水溶液(15 mg，380 µL，0.380 mmol)。繼續攪拌隔夜，同時使溫度逐漸達到環境溫度。用乙酸(100 μL)淬滅反應，並藉由旋轉蒸發移除所有揮發物。將殘餘物懸浮在DCM∶MeOH ＝ 9∶1中並過濾。藉由旋轉蒸發移除所有揮發物。該粗物質之LCMS分析顯示出具有期望之[(M + H)]+ ＝ 857.2之主峰。將殘餘物溶於DCM(3.0 mL)及TFA(3.0 mL)中以除去boc基團。藉由LCMS完成後，藉由旋轉蒸發移除所有揮發物。殘餘物藉由HPLC (0至40%甲醇及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量370 mg，86%。藉由LCMS發現之離子：[(M + H)]+ = 657.2。實例 198. 合成結合物 48
將疊氮基官能化之Fc(33.3 mg，3.33 mL，0.576 μmol，SEQ ID NO：73；DAR-7.0)之溶液添加至50 mL離心管中，該離心管中含有炔烴官能化之小分子(6.1 mg，7.760 μmol，Int-92，如實例197所述製備)。輕輕振盪以溶解所有固體後，將此溶液添加至L-抗壞血酸鈉(8.6 mg，11.21 µmol)、硫酸銅(II)(2.5 mg，15.52 µmol)及BTTAA(26.7 mg，62.08 µmol)於PBS 7.4緩衝液(6.984 mL)中之溶液。所得溶液輕柔地經旋轉隔夜。其相繼藉由在蛋白A管柱上之親和層析法、尺寸排阻層析法(參見本文所述之一般結合物純化方案)經純化。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出63,734 Da之平均質量(DAR = 6.2)。產量35.3 mg，63%產率。
編碼結合物48之Fc之核酸構築體包含編碼SEQ ID NO：64之胺基酸序列的核酸，該胺基酸序列包含C末端離胺酸殘基。表現後，結合物48之Fc之C末端離胺酸經蛋白水解裂解，由此產生具有SEQ ID NO：73之序列的Fc。C末端離胺酸之存在或不存在不改變Fc或相應結合物之性質。實例 199. DAR 對神經胺糖酸酶抑制作用之影響 神經胺糖酸酶抑制 (NAI)
將測試物品與指定PFU/mL之活病毒在37℃，5% CO2 下培育20分鐘。將NA-Fluor受質添加至適當之孔中，並在37℃，5% CO2 下培育1小時。藉由讀取355 nm激發/460 nm發射之螢光來確定NAI。使用以下公式計算%NAI：%NAI =(1-(FI帶有 TA 之病毒 -FI無病毒 ))/( FI僅病毒 -FI無病毒 )x 100。使用GraphPad Prism中之非線性迴歸分析軟體計算IC50 。
結合物45a顯示出抗流感A/PR/8/1934(H1N1)之DAR依賴性增加之活性，在DAR 3.3或更高下達到最大活性(表173)。
A/Bethesda/956/2006(H3N2)R292K突變體顯示出對奧司他韋之抗性並顯示對紮那米韋之敏感性降低。結合物45a對抗該突變體並未改變，並且證明了DAR依賴性增加之活性，在DAR 3.3或更高下對抗流感達到最大活性(表173)。  表173：針對流感A (H1N1)及(H3N2)亞型之結合物110之IC50 概述
測試物品 DAR IC50 [nM] A/PR/8/1934 (H1N1) IC50 [nM] A/Bethesda/956/2006 (H3N2) R292K
奧司他韋 N/A 5.276 ＞1,000
紮那米韋 N/A 1.072 20.79
Int-83 N/A 11.48 510.6
結合物45a 0.4 23.61 78.79
結合物45a 1 12.25 29.31
結合物45a 3.3 2.772 4.166
結合物45a 4.7 2.706 3.13
結合物45a 5.1 3.259 3.583
結合物45a 7.3 3.098 2.509
實例 200. 繼發性感染小鼠模型 MRSA 繼發性細菌感染模型。
在用3E3 PFU/小鼠(亞致死)之A/CA/07/2009(H1N1)pdm(Virapur，批號E1020A1)鼻內攻擊之6-8週齡雌性BALB/c小鼠(Charles River)中進行了功效研究。攻擊後2小時以0.3-3 mg/kg之單一皮下(SC)劑量投與結合物45b或人類IgG1 Fc對照。感染後第6天，用5E7菌落形成單位(CFU)之亞致死劑量之耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)TCH1516鼻內攻擊小鼠(圖104)。
為了確定細菌之肺負荷，用CO2 處死小鼠，收穫兩個肺葉以測定MRSA感染後24小時之細菌負荷。肺使用MagNALyser (Roche)用1 mL PBS中之1 mm矽珠均質化。在6,000 rpm下進行均質化持續60 s且在運行之間在冰上冷凍持續5 min。對於CFU測定，將肺勻漿在PBS中連續稀釋10倍，然後塗鋪至LA板上。計算出相對於肺部重量之CFU(CFU/g肺)。為了進行存活率研究，監測動物之總體健康狀況，並每天記錄體重(BW)，持續14天。垂死動物或體重(BW)減輕＞20%之動物記錄為死亡。使用GraphPad Prism(6.07版)進行存活率、BW曲線及統計分析。
結合物45b表現出針對細菌超感染小鼠模型之保護，該模型具有亞致死性流感A/CA/07/2009(H1N1)pdm攻擊，隨後具有MRSA亞致死性感染。累積地，兩次亞致死感染在用hIgG1 Fc治療之小鼠中導致100%之死亡率(圖105A)。以0.3或3 mg/kg之劑量進行之結合物45b治療-以預防流感疾病-使得小鼠100%存活。與hIgG1 Fc相比，在用MRSA攻擊後24小時，結合物45b證明減少了肺中之細菌負荷(圖105B)。結合物45b處理後之細菌負荷與僅用MRSA攻擊之小鼠中觀察到之負荷相當。
此等數據證明結合物45b在減輕由流感感染如金黃色葡萄球菌超感染引起之併發症中之潛力，所述併發症導致與流感感染有關之死亡。肺炎鏈球菌繼發性細菌感染模型
在用3E1 PFU/小鼠(亞致死)之A/CA/07/2009(H1N1)pdm(Virapur，批號1512B4)鼻內攻擊之6-8週齡雌性BALB/c小鼠(Charles River)中進行了功效研究(圖106)。攻擊後2小時，以單一皮下(SC)劑量以0.3 mg/kg投與結合物45b或人類IgG1 Fc對照。感染後第6天，以1E5 CFU之亞致死劑量之肺炎鏈球菌(SPN)菌株6301鼻內攻擊小鼠。監測動物之總體健康狀況，並在14天內每天記錄體重。垂死動物或BW減輕＞20%或更大之動物記錄為死亡。使用GraphPad Prism(6.07版)進行存活率、BW曲線及統計分析。
結合物45b表現出針對流感A/CA/07/2009(H1N1)pdm亞致死性攻擊，繼之以SPN亞致死性感染之細菌超感染小鼠模型之保護作用。累積地，兩次亞致死性感染導致用hIgG1 Fc治療之小鼠100%死亡。以0.3 mg/kg之劑量進行結合物45b治療-以預防流感疾病-使得小鼠100%存活，表明結合物45b在緩解針對最常見細菌超感染肺炎鏈球菌之流感感染引起之併發症中之潛力(圖107)。細菌超感染大大增加了與流感有關之死亡率。實例 201. 結合物 45a 治療 BALB/c 小鼠 A/Vietnam/1203/2004(H5N1) 病毒感染之劑量最佳化研究
從Charles River Laboratories(Wilmington，MA)獲得雌性18-20g BALB/c小鼠用於該實驗。使用前將小鼠隔離6天，並在猶他州立大學實驗動物研究中心(Laboratory Animal Research Center of Utah State University)用Teklad Rodent Diet(Harlan Teklad)及自來水飼養。
高致病性禽流感A/Vietnam/1203/2004(H5N1)從疾病控制中心(Atlanta, GA)獲得。在Madin-Darby犬腎(MDCK)細胞(美國典型培養物保藏中心，Manassas, VA)中進行病毒繁殖。親代病毒繼代一次以製備攻擊庫。然後在使用前在MDCK細胞中滴定攻擊庫。
表174中描述了動物數量及研究組。藉由在病毒感染前7天或病毒感染後4小時一次皮下(sc)注射0.3、1、3及10 mg/kg劑量之結合物45a來治療各組小鼠。從感染後4小時開始，每天兩次藉由經口管飼法，投與用作病毒攻擊劑量之陽性對照之奧司他韋(10 mg/kg)。用作安慰劑之未結合之Fc以與結合物45a相似之方式投與。另外，保持三隻未治療之對照小鼠用於重量比較。
對於流感病毒攻擊，藉由i.p.注射氯胺酮/甲苯噻嗪(50 mg/kg//5 mg/kg)將小鼠麻醉，然後藉由鼻內途徑每隻小鼠以90 μl接種體積用約5個斑塊形成單位(1x LD90 )之病毒攻擊。
在治療之前對小鼠稱重，然後在以後每隔一天稱重，以評估治療對改善由於病毒感染引起之重量減輕之效果。直到第21天，觀察所有小鼠之發病率及死亡率。
產生Kaplan-Meier存活率曲線，並藉由Log-rank(Mantel-Cox)測試進行比較，然後使用Prism 8.3(GraphPad Software Inc.)中之Gehan-Breslow-Wilcoxon測試進行成對比較。藉由單因子方差分析(ANOVA)，然後使用Prism 8.3進行Tukey之多重比較測試來分析平均體重。  表174：針對功效之劑量最佳化研究
數目/ 籠 組編號 已感染 是或否 化合物 劑量 治療時程 觀察/ 測試
10 1 是 結合物45a 10 mg/kg 一次， 感染前7天 直至第21天觀察重量減輕及死亡率
10 3 是 結合物45a 3 mg/kg
10 5 是 結合物45a 1 mg/kg
10 7 是 結合物45a 0.3 mg/kg
10 9 是 安慰劑 (未結合Fc，SEQ ID NO: 72) - 一次， 感染後4 h
10 11 是 結合物45a 10 mg/kg
10 13 是 結合物45a 3 mg/kg
10 15 是 結合物45a 1 mg/kg
10 17 是 結合物45a 0.3 mg/kg
10 19 是 奧司他韋 30 mg/kg/天 b.i.d. x 5d，感染後4h開始
3 2 否 觀察未經治療之小鼠之正常重量增加
在病毒感染前7天用結合物45a治療後，對10 mg/kg劑量觀察到100%之保護，對於0.3及3 mg/kg劑量觀察到80%之保護，對於1 mg/kg劑量觀察到70%之保護(圖108A)。安慰劑組之30%存活率係異常的，因此1 mg/kg之劑量不能提供明顯保護作用。另外，所有劑量皆為防止重量減輕提供了顯著保護(圖108B)。
病毒感染後4小時用結合物45a處理後，對於1、3及10 mg/kg劑量觀察到100%之保護，對於0.3 mg/kg劑量觀察到70%之保護(圖109A)。由於在安慰劑組中觀察到30%之存活率，因此0.3 mg/kg劑量未提供明顯保護作用。此外，所有劑量皆為防止重量減輕提供了顯著保護(圖109B)。實例 202. 酶聯凝集素檢定 (ELLA) 。
ELLA檢定如Gao等人(J. Vis . Exp. Doi:10.3791/54573, 2016)報道來進行，伴以少量修改。簡而言之，在4℃下將Nunc Maxisorp 96孔板(ThermoFisher)用1x KPL包被緩衝液(SeraCare)中之2.5 µg胎球蛋白(Sigma-Aldrich)包被隔夜。第二天，用補充有0.05% Tween 20 (PBST)之pH 7.4之PBS洗滌板。測試物品以0.001-1000 nM來測試，並以50 µL/孔添加。以1e5-1e6 PFU/孔及50 µL/孔添加流感病毒。將板在37℃，5% CO2 下培育16-18小時。洗滌板後，以0.13 µg添加與HRP結合之花生凝集素(PNA-HRP)持續2小時，再次洗滌並用100 µL/孔TMB受質(BD)顯影3-5分鐘。用100 µL/孔之1N H2 SO4 終止反應。使用EnSpire多模式讀板器在450 nm處讀取吸光度。使用非線性迴歸分析(劑量反應(抑制))，使用GraphPad Prism版本8計算IC50 。
與奧司他韋或紮那米韋相比，以在代表性A及B型流感病毒株之間之IC50 ，結合物45b在ELLA中具有增強之效能(表175)。 表175：結合物45b在酶聯凝集素檢定(ELLA)中針對A型及B型流感之活性(IC50 )
流感病毒株 亞型/ 譜系 結合物45b [nM] hIgG1 Fc [nM] 奧司他韋[nM] 紮那米韋[nM]
A/PR/8/1934 H1N1 0.11 ＞ 1,000 25.4 3.8
A/CA/7/2009 H1N1pdm 0.02 ＞ 1,000 0.99 0.09
A/Hong Kong/1/1968 H3N2 0.003 ＞ 1,000 0.07 0.24
B/Florida/4/2006 Yamagata 0.02 ＞ 1,000 1.00 0.09
B/Malaysia/2506/2004 Victoria 0.15 ＞ 1,000 3.2 9.3
實例 203. 允許與流感病毒神經胺糖酸酶潛在多價結合之結合物 45b 屬性
結合物45b包含具有N端延伸之hIgG1 Fc域(SEQ ID NO：73)之Int-83之化學及生物學上穩定之結合物。如圖110B所示，Int-83包含紮那米韋二聚體，該等二聚體藉由紮那米韋C7羥基上之胺基甲酸甲酯部分對稱地稠合至可撓性15 Å中心連接體，該中心連接體將紮那米韋單體隔開約18 Å。藉由基於32原子可撓性聚乙二醇(PEG)之交聯劑，將Int-83之多個拷貝與Fc域上表面暴露之離胺酸殘基結合，此當連接體完全擴展時，將該等殘基從Fc表面突出35-40 Å(圖110B)。暴露於特定溶劑之離胺酸殘基係結合位點(圖110B)。在結合物45b中使用之Int-83與Fc之平均比率為4.5:1。結合物45b之合成在實例156中描述。原則上，較佳結合位點之空間分佈(圖110B)與交聯劑之長度及可撓性相結合，可使結合物45b同時與四聚體中之多個NA活性位點(約45或70 Å，分別見圖110A)相互作用。另外，結合物45b中之Int-83之間隔允許跨越同一病毒體(25-30 Å)上或兩個病毒體(16 Å)上之相鄰NA四聚體之NA活性位點進行橋接。結合物 45b 之活體外通用活性及低抗性潛力
吾人使用標準神經胺糖酸酶抑制(NAI)檢定方法，採用小分子受質，研究了在沒有免疫結合之情況下結合物45b之固有抗病毒活性。結合物45b表現出對A及B型流感之有效活性，分別對流感A H1N1病毒株之中值IC50 為1.7 nM(n = 7，範圍從1.1 nM至4.8 nM)，對流感A H3N2毒株之中值IC50 為4.2 nM (n = 6，範圍從0.3 nM至14.9 nM)，並且針對B型流感病毒株之中值IC50 為4.4 nM (n = 6，範圍從1.0 nM至20.7 nM)(表176)。通常，結合物45b之表現與紮那米韋及奧司他韋相似，但是針對B型流感病毒比奧司他韋更有效(表176)。重要地，針對已批准之神經胺糖酸酶抑制劑易感性下降之臨床相關變異體之結合物45b IC50 並未改變。在H1N1亞型中，結合物45b之抗H275Y活性為1.7 nM，在H3N2亞型中，抗E119V活性為2.6 nM，抗R292K活性為1.2 nM，或在B型中抗R152K活性為6.7 nM。針對此等變異體，奧司他韋或紮那米韋之效能分別損失高達＞ 100倍或＞ 10倍(表177)。結合物45b保留了針對H5N1及H7N9病毒細胞裂解物之有效活性，IC50 分別為1.9 nM及1.2 nM(表178)。奧司他韋及紮那米韋之針對H5N1之活性相當，但是奧司他韋及紮那米韋失去針對H7N9之活性，IC50 分別＞ 1 µM或＞ 100 nM(表178)。  表176：結合物45b在神經胺糖酸酶抑制(中值IC50 )及基於細胞之細胞病理效應檢定(中值EC50 )中針對流感A (H1N1)、(H3N2)及流感B (Yamagata及Victoria譜系)之通用廣譜活性。
分子 類型/ 亞型 IC50 [nM] EC50 [nM]
結合物45b A (H1N1) 1.7 1.9
A (H3N2) 4.2 0.9
B 4.4 7.4
奧司他韋 A (H1N1) 2.2 2414
A (H3N2) 0.4 8185
B 37.7 758.5
紮那米韋 A (H1N1) 1.0 1093
A (H3N2) 1.3 ＞10,000
B 6.3 80.2
表177：結合物45b對神經胺糖酸酶抑制作用敏感性降低之變異體之活性(IC50 )
活流感病毒株 變 異 體 亞型/ 譜系 結合物45b [nM] 奧司他韋[nM] 紮那米韋[nM]
A/Texas/23/2012 H275Y H1N1pdm09 1.7 507.1 1.1
A/Texas/12/2007 E119V H3N2 2.6 148.9 3.8
A/Bethesda/956/2006 R292K H3N2 1.2 ＞1000 22.18
B/Memphis/20/1996 R152K Yamagata 6.7 ＞1000 125.5
表178：結合物45b對流感A H5N1及H7N9之細胞裂解物在神經胺糖酸酶抑制中之活性(IC50 )
以下之NA 細胞裂解物 亞型/ 譜系 結合物45b [nM] 奧司他韋[nM] 紮那米韋[nM]
A/Anhui/1/2005 H5N1 1.9 3.7 0.6
A/Shanghai/1/2013 H7N9 1.2 ＞1,000 100.4
接下來，吾人在酶聯凝集素檢定法(ELLA)中測試了結合物45b之活性，其中大糖蛋白用作受質。ELLA檢定中唾液酸(Sia)之呈遞與細胞表面NA受質之呈遞更相似。結果，進入受質之機會更加有限，並且已證明ELLA檢定中之NA活性受阻止進入NA活性位點之因素之影響(Chen Y.Q等人，J. Virol. 93: doi.10.1128/JVI.01526-18, 2019)。有趣地，與如上所述之使用小分子受質之NA抑制結果相比，結合物45b相對於紮那米韋及奧司他韋抗A/PR/8/1934(H1N1)之活性增強(＞ 10x)(表179)。對於結合物45b，Fc域對相鄰NA內或NA間四聚體NA活性位點之空間位阻，或引起病毒聚集之多價靶標參與可能有助於ELLA檢定中觀察到之效能增強。  表179：結合物45b在CPE中對A型及B型流感之廣譜活性(EC50 )。
流感病毒株 亞型 / 譜系 結合物 45b [nM] 奧司他韋 [nM] 紮那米韋 [nM]
A/WSN/1933 H1N1 0.2059 51.36 29.12
A/PR/8/1934 H1N1 0.782 1461 7581
A/PR/8/1934 (小鼠適應性) H1N1 32.49 ＞10,000 未測試
A/CA/7/2009 H1N1pdm 2.964 34.2 33.16
A/CA/12/2012 H1N1pdm09 0.4931 ＞10,000 1093
A/Texas/23/2012 H275Y H1N1pdm09 2.886 ＞10,000 ＞10,000
A/Illinois/08/2018 H1N1pdm09 9.584 3366 4278
A/Illinois/37/2018 I38L H1N1pdm09 0.4304 200.4 179.1
A/Illinois/08/2018 I38T H1N1pdm09 1.35 ＞10,000 ＞10,000
A/Hong Kong/1/1968 (小鼠適應性) H3N2 36.57 6369 未測試
A/Texas/71/2017 H3N2 0.3748 ＞10,000 ＞10,000
A/Washington/01/2007 H3N2 0.04449 1.908 1.968
A/Texas/12/2007 E119V H3N2 0.6594 351.4 2.096
A/Louisiana/50/2017 H3N2 1.41 ＞10,000 ＞10,000
A/Louisiana/49/2017 I38M H3N2 0.606 ＞10,000 4815
A/Bethesda/956/2006 R292K H3N2 20.1 1653 558.1
B/Florida/4/2006 Yamagata 12.8 1030 76.89
B/Brisbane/60/2008 Victoria 6.288 487 254.2
B/Malaysia/2506/2004 Victoria 1.512 471.2 83.52
B/Colorado/6/2017 Victoria 8.485 4480 56.98
在基於細胞之細胞病理效應(CPE)檢定中，觀察到結合物45b與紮那米韋及奧司他韋之間之更大區別。在MDCK SIAT1中或對於MDCK細胞中之小鼠適應性流感株，結合物45b表現出對A型及B型流感之有效活性，分別對於流感A H1N1病毒株之中值EC50 為1.3 nM (n = 6，0.43 nM至32.4 nM)，對於流感A H3N2毒株之中值EC50 為0.9 nM(n = 4，0.04 nM至36.6 nM)，並且對於B型流感病毒株之中值EC50 為7.4 nM (n = 4，1.5 nM至12.8 nM) (表179)。值得注意地，結合物45b對某些測試之流感病毒株比對奧司他韋及紮那米韋之活性高3個對數(表176)。在基於細胞之微量中和試驗中針對高致病性毒株測試結合物45b時，相對於H5N1毒株(n = 4)，結合物45b之EC50 為1.7 nM，並且相對於H7N9毒株(n = 1)，EC50 為5.3 nM (表180)。MDCK-SIAT1或MDCK細胞中結合物45b之CC50 ＞ 10,000 nM(數據未顯示)。因此，在基於細胞之檢定中，針對A型及B型流感之結合物45b之計算選擇性指數(SI)＞ 1,000x。  表180：結合物45b在微量中和作用中對高致病性流感A (H5N1)及(H7N9)之廣譜活性(IC50 )。
流感病毒株 亞型/ 譜系 結合物45b [nM] 奧司他韋 [nM] 紮那米韋 [nM]
A/Vietnam/1194/2004 H5N1 1.7 168.7 16.9
A/Indonesia/05/2005 H5N1 1.7 ＞300 16.9
A/turkey/Turkey/1/2005 H5N1 1.7 168.7 5.3
A/Hong Kong/156/97 H5N1 1.7 ＞300 53.3
A/Anhui/1/ 2013 H7N9 5.3 ＞300 ＞300
A/Netherlands/602/2009* H1N1pdm09 1.7 ＞300 ＞300
*大流行病對照A型流感病毒株
除CPE分析外，還使用感染了A/CA/07/2009(H1N1)pdm流感之MDCK細胞進行了連續繼代實驗，以比較結合物45b對兩種商業上佔主導地位之流感抗病毒藥奧司他韋及巴洛沙韋之抗性。結合物45b之抗性特性優於兩種比較劑，並且在整個實驗之10次繼代中均未顯示抗病毒活性降低。在第6及8代繼代後，巴洛沙韋及奧司他韋之抗病毒活性分別降至無藥對照之活性。在隨後奧司他韋繼代中來自耐藥性病毒斑塊之病毒基因組之測序表明，耐藥性係由臨床(REF)上已觀察到之NA活性位點突變(E119K)引起的。結合物 45b 引起之免疫細胞結合
選擇人類IgG1 Fc域作為結合物45b之蛋白質載體，乃因其係循環半衰期最長之活化性最高之人抗體IgG同型。儘管利用結合物45b之異質離胺酸結合策略，與未結合之Fc對照及人類IgG1相比，吾人觀察到用結合物45b測試之所有人及鼠Fcγ受體之相似Fcγ受體結合(圖111A-111H)。在功能性檢定中，針對感染流感A/PR/8/1934 (H1N1)之MDCK SIat1細胞，結合物45b在MOI依賴性方面(圖111I)及劑量依賴性方面(圖111J)誘導有效抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。因此，結合物45b可與Fcγ受體結合並在功能上與免疫細胞結合。結合物 45b 在多種致死性流感攻擊模型中高度有效
在活體外觀察到之結合物45b之效能及抗病毒譜在動物感染模型中轉化為功效。在致死小鼠攻擊模型中，單劑量0.3 mg/kg或更低皮下(SC)劑量之結合物45b對A/CA/07/2009(H1N1)pdm、A/WSN/1933(H1N1)、A/CA/12/2012(H1N1)pdm09、A/Texas/23/2012(H1N1)pdm09 H275Y變異體、A/Hong Kong/1/1968(H3N2)、B/Florida/4/2006(Yamagata)及B/Malaysia/2506/2004(Victoria)(圖112A-112H)具有完全保護。在最小保護劑量之後，用結合物45b治療通常僅導致有限暫時性體重減輕(圖113A-113H)。當在小鼠中針對禽流感大流行毒株A/Vietnam/1203/2004(H5N1)進行測試時，結合物45b在0.3 mg/kg時顯示出70%之保護，在1 mg/kg或更高時顯示出100%之保護(圖112I)。小鼠中人類化劑量之6倍之奧司他韋僅具有90%之保護性(圖112I)。
為了更好地對結合物45b之功效進行定量，並與奧司他韋進行比較，在採用小鼠適應性A/PR/8/1934流感病毒(H1N1)之致死性攻擊模型下，在感染後4天量測肺中之病毒負荷及細胞因子水準。在該模型中，結合物45b之最小保護劑量為0.1 mg/kg(SC)(圖112A)，並伴有約5%之短暫體重(BW)減輕(圖113A)。結合物45b展示肺病毒負荷(肺組織中PFU/g)劑量依賴性地降低，在0.1 mg/kg下為1.06對數，在0.3 mg/kg下為2.12對數，並且在1 mg/kg下為3.17對數並且在3 mg/kg下為3.63對數，如藉由斑塊檢定確定。相比之下，以人當量劑量(5 mg/kg) (BID x 4天)或以10倍人當量劑量(50 mg/kg)(BID x 4天)給藥之奧司他韋顯示沒有劑量反應，且導致約0.8對數之中等病毒負荷減少。有趣地，測試之兩種奧司他韋劑量導致不同之存活率結果。持續5天BID給藥之5 mg/kg或50 mg/kg之奧司他韋分別引起0%存活率或80%存活率(圖114A-114B)。
為了理解結合物45b在減少可能導致肺損傷之潛在有害免疫反應中之有效性，在同一時間點量測了特定炎症及肺損傷細胞因子之水準。結合物45b以劑量依賴之方式有效地降低了水準，在3 mg/kg之劑量下測得之所有細胞因子均接近與未感染之對照相似之水準(圖112K-112L及圖115A-115C)。總體而言，對於所有測試細胞因子而言，結合物45b誘導之細胞因子減少之幅度要比用人當量劑量之奧司他韋治療所提供之幅度更為明顯，並且對於KC、MIP-1a、MCP-1而言，優於以10倍人類當量劑量之奧司他韋治療之小鼠(圖112K-112L及圖115A-115C)。此等數據表明，結合物45b誘導病毒負荷之有效劑量依賴性降低，這與結合物45b引起之肺中細胞因子水準降低有關，用奧司他韋未觀察到肺中細胞因子水準降低。
對於結合物45b，評估給藥途徑對功效之影響。在使用針對A/CA/07/2009(H1N1)pdm之小鼠之致死性攻擊模型中，在靜脈內(IV)、肌內(IM)或SC投與後，結合物45b在0.1 mg/kg時具有完全保護性(圖116A-116B)。當比較IV、IM或SC給藥後小鼠之血漿水準時，如藉由酶聯免疫吸附(ELISA)檢定所確定，結合物45b之血漿水準在24小時後係相當的。值得注意地，使用兩種不同ELISA捕獲方法來量測血漿中之結合物45b水準，一種利用抗人Fc捕獲抗體來量測Fc水準，一種利用病毒NA捕獲來偵測完整結合物(圖116C-116D)。藉由兩種方法量測之結合物45b之血漿水準在實驗誤差內係相同的，這表明結合物45b作為完整結合物在體內係穩定的。結合物 45b 在免疫受損之宿主中高度有效
嚴重感染流感及因流感感染引起併發症之高風險人群包括老年人及免疫受損之人群。為了確定結合物45b在免疫受損背景下之有效性，吾人確定了結合物45b在缺乏成熟T細胞及B細胞且補體缺陷之嚴重複合型免疫缺乏(SCID)小鼠中之功效。結合物45b顯示在感染了A/CA/07/2009(H1N1)pdm之SCID小鼠中在0.3 mg/kg之單劑量下具有完全保護(圖112M)，該0.3 mg/kg之單劑量對於具有免疫能力之小鼠係相同保護劑量。
綜上所述，此等結果凸顯了結合物45b在健康及高危人群中提供普遍流感防護之潛力。結合物 45b 展示了預防模型中之長期作用
藥代動力學(PK)分析、預防功效及臨床前毒理學研究進一步凸顯了使用結合物45b作為持久、長效劑預防普遍流感之潛力。在小鼠及食蟹獼猴中單次IV投與後確定結合物45b之半衰期，在1週及4週PK研究中分別為5-10天。此等結果對於mAB而言係典型的，並藉由結合物45b、hIgG1 Fc及全長人類IgG1同型對照抗體針對鼠、食蟹獼猴及人FcRn之pH依賴性之結合曲線相當得到了支持(圖117A-117-C)。結合物45b在1-100 mg/kg之寬劑量範圍內在小鼠中表現出劑量線性PK(圖118A)。在小鼠模型中，結合物45b在血漿與肺之間建立快速平衡，從而允許針對治療適應症之作用迅速起效，並以高水準分佈至上皮襯裡液(ELF)(圖118B)。ELF中高水準之結合物45b迅速出現並維持在血漿水準之約60% (圖118B)。
為了評估結合物45b在預防環境中之功效，並確定在致死流感攻毒模型中進行保護所必需之目標血漿水準，在感染前28天向小鼠給藥。1 mg/kg之單次SC劑量可以完全預防流感A/CA/07/2009(H1N1)pdm、A/HK/1/1968(H3N2)、B/Malaysia/2506/2004(Victoria)及B/Florida/4/2006(Yamagata)(圖118C-118F)。感染時測得之保護所需之相應結合物45b血漿水準為0.5 µg/mL(8 nM，數據未顯示)。多物種PK及保護所需之結合物45b之目標血漿水準將用於評估對人類進行長期預防所需之人類劑量，並在臨床前毒理學研究中用於評估結合物45b之治療範圍(therapeutic margin)。在食蟹獼猴中進行之為期兩週之劑量範圍發現毒性研究中，在最高測試劑量(20 mg/kg)下未觀察到不良事件。在20 mg/kg劑量給予之猴子及1 mg/kg劑量給予之小鼠中，基於血漿暴露比之治療指數(TI)＞ 50(表181及182)。該安全界限結合併入結合物45b之高效能及持續暴露之異速生長縮放(allometric scaling)(數據未顯示)，表明在人類中一至兩劑結合物45b可達成保護以應對整個流感季節。  表181：結合物45b在小鼠中之劑量比例性
測試物品 劑量 [mg/kg] Tmax [h] Cmax [µg/mL] AUC [h x µg/mL]
結合物45b 1 4 9.39 436
3 24 11.4 1520
10 24 41.3 4280
30 24 125 14200
100 4 733 60700
表182：食蟹獼猴中結合物45b之劑量比例性
測試物品 天 劑量[mg/kg] Tmax [h] Cmax [µg/mL] AUC [h x µg/mL]
結合物45b 1 5 72 26.1 3800
8 5 8 61 7740
1 20 72 107 14600
8 20 24 197 25400
在食蟹獼猴毒理學研究中，以5或20 mg/kg之劑量兩次每週SC給藥後，未觀察到對BW、臨床化學、血液學、凝血、細胞因子或尿液分析之不利影響(數據未顯示)。實例 204. 確定致死小鼠流感模型中結合物 45a 對流感 A (H1N1) 之最佳藥物抗體比 (DAR) 。
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8週)之致死H1N1流感感染模型中評估了結合物45a之DAR變異體。攻擊病毒(A/Puerto Rico/8/1934)係能夠在小鼠中引起致死性感染之小鼠適應性分離株。實驗包括2個研究組，共25組，每組5隻小鼠。在第0天，所有小鼠均在經氯胺酮/甲苯噻嗪(分別為100及10 mg/kg)輕微地麻醉之後藉由鼻內接種經30 µl體積之病毒(3x LD95 ；約2E4個病毒/小鼠)攻擊。在藉由肌內(IM)投與病毒攻擊後2小時，各組接受結合物45a、結合物45a之DAR變異體、僅Fc或媒劑(PBS)之單次治療。測試結合物45a變異體之平均DAR為0.4、1.0、3.3、4.7、5.1或7.3。每天監測死亡率及體重(BW)，持續14天。體重減輕超過20%之任何小鼠均被視為死亡。表183及184總結了各研究組之實驗概述。 表183：低平均DAR組研究設計
組 流感A 病毒株(IN 攻擊) 測試物品 DAR 途徑，時程 劑量 (mg/kg) 化合物製備 N
劑量體積 ml/kg mg/ml 所需體積(ml)
1 A/PR/8/34 (H1N1) 3E2 PFU/小鼠 媒劑(PBS) --- IM，單次，T+2 h --- 5 --- 1 5
2 單獨Fc --- IM，單次，T+2 h 0.3 5 0.06 1 5
3 結合物45a 0.4 IM，單次，T+2 h 0.3 5 0.06 1 5
4 結合物45a 0.4 IM，單次，T+2 h 0.1 5 0.02 1 5
5 結合物45a 0.4 IM，單次，T+2 h 0.03 5 0.006 1 5
6 結合物45a 1 IM，單次，T+2 h 0.3 5 0.06 1 5
7 結合物45a 1 IM，單次，T+2 h 0.1 5 0.02 1 5
8 結合物45a 1 IM，單次，T+2 h 0.03 5 0.006 1 5
9 結合物45a 3.3 IM，單次，T+2 h 0.3 5 0.06 1 5
10 結合物45a 3.3 IM，單次，T+2 h 0.1 5 0.02 1 5
11 結合物45a 3.3 IM，單次，T+2 h 0.03 5 0.006 1 5
12 結合物45a 4.7 IM，單次，T+2 h 0.3 5 0.06 1 5
13 結合物45a 4.7 IM，單次，T+2 h 0.1 5 0.02 1 5
14 結合物45a 4.7 IM，單次，T+2 h 0.03 5 0.006 1 5
表184：高DAR組研究設計
組 流感A 病毒株(IN 攻擊) 測試物品 DAR 途徑，時程 劑量 (mg/kg) 化合物製備 N
劑量體積 ml/kg mg/ml 所需體積(ml)
1 A/PR/8/34 (H1N1) 3E2 PFU/小鼠 媒劑(PBS) --- IM，單次，T+2 h --- 5 --- 1 5
2 單獨Fc --- IM，單次，T+2 h 0.3 5 0.06 1 5
3 結合物45a 4.7 IM，單次，T+2 h 0.3 5 0.06 1 5
4 結合物45a 4.7 IM，單次，T+2 h 0.1 5 0.02 1 5
5 結合物45a 4.7 IM，單次，T+2 h 0.03 5 0.006 1 5
6 結合物45a 5.1 IM，單次，T+2 h 0.3 5 0.06 1 5
7 結合物45a 5.1 IM，單次，T+2 h 0.1 5 0.02 1 5
8 結合物45a 5.1 IM，單次，T+2 h 0.03 5 0.006 1 5
9 結合物45a 7.3 IM，單次，T+2 h 0.3 5 0.06 1 5
10 結合物45a 7.3 IM，單次，T+2 h 0.1 5 0.02 1 5
11 結合物45a 7.3 IM，單次，T+2 h 0.03 5 0.006 1 5
在第一個研究組中，以0.03、0.1及0.3 mg/kg之濃度運行平均DAR為0.4、1.0、3.3或4.7之變異體(相對於病毒攻擊，在T + 2h進行單次IM投與)。在該研究中，用媒劑(PBS)治療之小鼠截至第7天死於感染，且用僅Fc(SEQ ID NO：72)治療之小鼠在第6天死亡(表185)。相反，在最高劑量濃度(0.3 mg/kg)下，平均DAR為1.0、3.3及4.7之結合物45a變異體得到了完全保護。只有0.4平均DAR結合物無法提供保護，小鼠截至第9天達到死亡，表明其具有測試之結合物中最低之平均DAR效能。在下一個最低之結合物劑量(0.1 mg/kg)下，僅用平均DAR為3.3或4.7之結合物治療之小鼠受到完全保護。在此劑量下，兩種較低之平均DAR結合物(0.4及1.0)分別在第7天及第9天死亡。在最終劑量組(0.03 mg/kg)中，只有平均DAR為4.7之結合物45a變異體才顯示出任何效能(80%存活率)。根據死亡率數據，在該研究組中有明顯之趨勢，即隨平均DAR增加，效能亦增加。
第一研究組之BW數據支持死亡率數據中所見之趨勢(表186)。例如，在0.3 mg/kg劑量組中，基於死亡率之平均DAR為1.0、3.3及4.7之結合物45a變異體都具有保護性，但接受1.0平均DAR變異體之小鼠之BW減輕比較高平均DAR構築體高。當劑量降低至0.1 mg/kg時，1.0平均DAR變異體會導致失去保護作用。類似地，在0.1 mg/kg下，基於死亡率接受3.3平均DAR變異體之小鼠受到保護，免受致死攻擊，但與用4.7平均DAR變異體治療之動物相比，BW減輕更大。藉由兩個研究讀數(死亡率及BW)，隨著平均DAR之增加，效能亦增加。 表185：第1組之死亡率數據(存活率%)。
攻擊後天數 媒劑(PBS) 單獨Fc 平均DAR
0.4 1.0 3.3 4.7
(0.3 mpk) (0.3 mpk) (0.1 mpk) (0.03 mpk) (0.3 mpk) (0.1 mpk) (0.03 mpk) (0.3 mpk) (0.1 mpk) (0.03 mpk) (0.3 mpk) (0.1 mpk) (0.03 mpk)
0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
1 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
2 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
3 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
4 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
5 80 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
6 40 0 100 60 80 100 100 80 100 100 100 100 100 100
7 0 40 0 0 100 80 0 100 100 80 100 100 100
8 20 100 20 100 100 60 100 100 100
9 0 100 0 100 100 20 100 100 80
10 100 100 100 0 100 100 80
11 100 100 100 100 100 80
12 100 100 100 100 100 80
13 100 100 100 100 100 80
14 100 100 100 100 100 80
表186： 研究組1之體重數據。平均組體重，直到組內第一例死亡。
攻擊後天數 媒劑 (PBS) 單獨 Fc 平均 DAR
0.4 1.0 3.3 4.7
(0.3 mpk) (0.3 mpk) (0.1 mpk) (0.03 mpk) (0.3 mpk) (0.1 mpk) (0.03 mpk) (0.3 mpk) (0.1 mpk) (0.03 mpk) (0.3 mpk) (0.1 mpk) (0.03 mpk)
0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
1 96.9 98.8 98.2 97.9 97.7 98 97.6 97.9 97 97.1 99.9 97.7 97.8 99.8
2 100 101.9 101.2 100.3 99.8 99.9 99.6 100.9 101.8 99.2 102.9 102.4 100.9 100.7
3 93.1 93.4 96.8 95 98.3 96.3 96.6 94.3 100.1 97.7 98.1 101.3 98.2 99.4
4 83.6 83.3 89 84.7 88.1 91.6 88.8 86.3 99.7 93.9 92 100.9 95 97.2
5 79.9 80 86.3 81.8 84.2 95.6 89.1 82.9 101.1 96.3 91.8 100.4 97.4 98.9
6 81.8 76.9 77.5 95.7 84.5 77.4 102.3 96.6 88.8 103.5 99.9 97.5
7 76.8 91.4 78.9 103.6 92.3 82.4 105 100.8 91.3
8 95.7 104.5 92.9 103.9 101.3 85.3
9 97.2 104.2 96.4 103.9 103.4 83.9
10 98.5 105 98.2 107.8 104.3
11 98.2 104.7 99.8 106.8 103.5
12 98.9 105.1 102.9 108.7 104.5
13 99.7 107.2 104.3 110.5 106.1
14 99.9 105.8 103.6 109 104.7
在研究之第2組中，以與第1組相同之劑量水準(0.3、0.1及0.03 mg/kg)評估了平均DAR為4.7、5.1及7.3之結合物45a變異體。與在第1組中看到之結果相反，將平均DAR增加至4.7以上不會增加結合物45a之效能。基於死亡率及BW，所有三種DAR變異體之效能大致相等(分別為表187及188)。在此等較高之DAR構築體中僅觀察到細微差異，該等細微差異在功效模型中觀察到之正常實驗誤差範圍內(請注意，第2組中經媒劑治療之動物之死亡時間稍早)。後面觀點包括觀察到4.7平均DAR結合物在第一組中以0.03 mg/kg之劑量具有保護作用，但在第二組中沒有保護作用。兩個研究組之結果共同地顯示，平均DAR最高達到4.7時，效能顯著提高，但是平均DAR之進一步提高並未轉化為更高之效能。因此，4.7之平均DAR係獲得結合物45a之最大效能之最小平均DAR。 表187：第2組之死亡率數據(存活率%)
攻擊後天數 媒劑(PBS) 單獨Fc 平均DAR
4.7 5.1 7.3
(0.3 mpk) (0.3 mpk) (0.1 mpk) (0.03 mpk) (0.3 mpk) (0.1 mpk) (0.03 mpk) (0.3 mpk) (0.1 mpk) (0.03 mpk)
0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
1 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
2 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
3 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
4 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
5 40 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
6 0 40 100 100 100 100 100 100 100 100 100
7 0 100 100 60 100 100 80 100 100 100
8 100 100 60 100 100 40 100 100 80
9 100 100 40 100 100 20 100 100 40
10 100 100 0 100 80 0 100 100 0
11 100 100 100 80 100 100
12 100 100 100 80 100 100
13 100 100 100 80 100 100
14 100 100 100 80 100 100
表188： 第2組之BW數據：平均組BW，直到組內第一例死亡
攻擊後天數 媒劑(PBS) 單獨Fc 平均DAR
4.7 5.1 7.3
(0.3 mpk) (0.3 mpk) (0.1 mpk) (0.03 mpk) (0.3 mpk) (0.1 mpk) (0.03 mpk) (0.3 mpk) (0.1 mpk) (0.03 mpk)
0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
1 99.5 98.4 98.4 98.3 98.2 98.1 98.5 98.6 99.4 96.5 99.4
2 98.7 100.3 99.9 100.5 99.3 97.7 98.5 101.3 100.2 102 99.1
3 93.7 95.8 99.8 100.7 99.3 101.1 99.7 100.8 100.7 100.9 100.3
4 81 84.9 99.6 99 93.2 98 95.4 93.5 100.1 99.9 97.4
5 77.7 81.2 100 98.8 91.5 98.5 97.1 91 96.7 99.7 93.7
6 76.9 100 98.9 86 99.9 95.6 85.9 100.3 99.2 88.6
7 102.5 100.5 81.6 102 88.8 82.9 103.4 97.8 85.3
8 102.8 100.8 103.3 87.8 103.5 98.8
9 101.9 103.3 104.9 89.4 104.5 102.3
10 103.6 105.4 105.6 95.3 106.4 105
11 103.4 104 105.1 106.2 103.9
12 104 104 104.5 105.4 104.2
13 103.8 104 105.1 104.9 103.1
14 102.3 102.5 102.8 103.1 103.1
實例 205. 確定致死小鼠模型中針對 A 型流感大流行毒株 (A/California/12/2012; H1N1) 之結合物 45a 之效能 。
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8週)之致死H1N1流感感染模型中評估了結合物45a。攻擊病毒(A/CA/12/2012)係能夠在小鼠中引起致死性感染之大流行分離株。該實驗由7組組成，每組5隻小鼠。在第0天，所有小鼠均在經氯胺酮/甲苯噻嗪(分別為100及10 mg/kg)輕微地麻醉之後藉由鼻內接種經30 µl體積之病毒(3x LD95 ；3E4個病毒/小鼠)攻擊。在藉由肌內(IM)投與(右側)病毒攻擊後2小時，各組接受結合物45a、hIgG1 Fc或媒劑(PBS)之單一治療。結合物45a之測試濃度為3、1、0.3、0.1及0.03 mg/kg。每天監測死亡率及體重(BW)，持續21天。BW減輕超過20%之任何小鼠均被視為死亡。實驗概述總結在表189中。  表189：研究概述
組 測試物品 途徑/ 時程 劑量(mg/kg) 劑量體積(ml/kg) mg/ml 所需體積(ml) N (balb/c)
1 PBS IM，T+2 h --- 5 --- 1 5
2 單獨Fc IM，T+2 h 3 5 0.6 1 5
3 結合物45a IM，T+2 h 3 5 0.6 1 5
4 IM，T+2 h 1 5 0.2 1 5
5 IM，T+2 h 0.3 5 0.06 1 5
6 IM，T+2 h 0.1 5 0.02 1 5
7 IM，T+2 h 0.03 5 0.006 1 5
在此研究中，結合物45a之單次IM投與在0.3、1及3 mg/kg下可完全保護小鼠免受大流行性病季節性(H1N1)流感分離株之致死攻擊(表190)。此外，在兩個最低劑量組(0.1及0.03 mg/kg)中觀察到部分保護(相對於媒劑)，分別具有60%及20%之存活率。相反，用媒劑治療之動物截至第8天死於感染，而用僅hIgG1 Fc處理之動物達到80%之死亡率。BW數據亦支持結合物45a之效能。用完全保護性劑量(3、1及0.3 mg/kg)治療之小鼠在第3-5天顯示短暫BW減輕，然後直至研究結束(第21天)穩定恢復BW(表191)。此研究藉由死亡率及BW讀數共同地證明了結合物45a對重要大流行性流感分離株之效能。 表190：存活率百分比
攻擊後天數 媒劑(PBS) hIgG1 Fc 結合物45a
(3 mpk) (3 mpk) (1 mpk) (0.3 mpk) (0.1 mpk) (0.03 mpk)
0 100 100 100 100 100 100 100
1 100 100 100 100 100 100 100
2 100 100 100 100 100 100 100
3 100 100 100 100 100 100 100
4 100 100 100 100 100 100 100
5 40 60 100 100 100 60 20
6 20 20 100 100 100 60 20
7 20 20 100 100 100 60 20
8 0 20 100 100 100 60 20
9 20 100 100 100 60 20
10 20 100 100 100 60 20
11 20 100 100 100 60 20
12 20 100 100 100 60 20
13 20 100 100 100 60 20
14 20 100 100 100 60 20
15 20 100 100 100 60 20
16 20 100 100 100 60 20
17 20 100 100 100 60 20
18 20 100 100 100 60 20
19 20 100 100 100 60 20
20 20 100 100 100 60 20
21 20 100 100 100 60 20
表191：平均體重減輕(%)，直到組內第一例死亡
攻擊后天數 媒劑 (PBS) hIgG1 Fc 結合物45a
(3 mpk) (3 mpk) (1 mpk) (0.3 mpk) (0.1 mpk) (0.03 mpk)
0 100 100 100 100 100 100 100
1 97.8 99 96.8 97.9 97.1 99.8 98.4
2 91.6 92 96 93.8 91.8 90.8 91
3 84.5 86.9 93.5 92.2 87.1 84.7 84.3
4 80.4 82.5 95.8 92.3 88.1 80.1 80.3
5 76.5 77.6 95.2 90.6 86.9 78.2 76.6
6 98.2 94.5 89.7
7 97.7 92.8 89.9
8 98.6 94.1 91.4
9 98.3 96.8 92.7
10 99.7 98.2 95
11 102.8 100.3 98.7
12 99.6 99 96.2
13 101.4 101.8 97.5
14 101.5 100.8 96.4
15 100.8 99.1 96.6
16 100.4 101.4 97.7
17 102.7 103.9 100.1
18 102.4 102.5 98.6
19 103.9 103.9 100.9
20 104.6 104.1 100.3
21 104 103.9 99.5
實例 206. 與巴洛沙韋組合之結合物 45b 在致死小鼠流感模型中對流感 A (H1N1) 之功效
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8週)中針對致死性IAV H1N1流感感染評估結合物45b。攻擊病毒(A/California/07/2009)係能夠在小鼠中引起致死性感染之大流行分離株。該實驗包含11組，每組5隻小鼠。在第0天，所有小鼠均在經氯胺酮/甲苯噻嗪(分別為100及10 mg/kg)輕微地麻醉之後藉由鼻內接種經30 µl體積之病毒(3x LD95 ；約3E4個病毒/小鼠)攻擊。各組接受用媒劑、結合物45b、巴洛沙韋瑪波地爾(DC Chemicals，目錄號DC11056；懸浮於0.5%甲基纖維素中)或組合治療(攻擊後2小時)。將巴洛沙韋經口(PO)給藥，每天兩次，持續3天，並以單劑量皮下(SC)投與結合物45b(表192)。每天監測死亡率及體重(BW)，持續14天。BW減輕超過20%之任何小鼠均被視為死亡。  表192：研究設計
組 流感A 毒株 測試物品 途徑，時程 (T+2 小時) 劑量 (mg/kg) N
1 A/CA/07/09 (H1N1) 3E4 PFU/小鼠，經由IN 媒劑(PBS) SC，單次 --- 5
2 結合物45b SC，單次 0.01 5
3 結合物45b SC，單次 0.03 5
4 結合物45b SC，單次 0.1 5
5 結合物45b SC，單次 0.3 5
6 巴洛沙韋 PO，bid x 3天 1 5
7 巴洛沙韋 PO，bid x 3天 3 5
8 巴洛沙韋 PO，bid x 3天 10 5
9 巴洛沙韋 PO，bid x 3天 3 5
結合物45b SC，單次 0.01 5
10 巴洛沙韋 PO，bid x 3天 3 5
結合物45b SC，單次 0.03 5
11 巴洛沙韋 PO，bid x 3天 3 5
結合物45b SC，單次 0.1 5
為了分開確定結合物45b及巴洛沙韋之效能，確定各分子之劑量範圍。對於結合物45b，0.1及0.3 mg/kg之劑量具有保護性，而0.01及0.03之劑量並非基於存活率(表193)。對於巴洛沙韋，1及3 mg/kg之劑量能延遲，但不能在第14天之前預防死亡。相反，劑量為10 mg/kg之巴洛沙韋具有80%之防護作用。
對於組合研究，將中等劑量之巴洛沙韋(3 mg/kg)與0.01、0.03及0.1 mg/kg之結合物45b一起給藥(9-11組)。如表193所示，0.03 mg/kg之結合物45b或3 mg/kg之巴洛沙韋都不能個別地保護。但是，重要地，在研究過程中，其組合表現出80%之保護作用(第10組)。 表193：存活率%
天 媒劑 結合物45b (mg/kg) (SC ，單次) 巴洛沙韋(mg/kg) (PO, bid x3 天) 結合物45b / 巴洛沙韋組合(mg/kg)
0.01 0.03 0.1 0.3 1 3 10 0.01 / 3 0.03 / 3 0.1 / 3
0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
1 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
2 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
3 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
4 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
5 20 60 60 100 100 100 100 100 100 100 100
6 0 20 40 100 100 100 100 100 100 100 100
7 0 20 20 100 100 100 100 100 100 100 100
8 0 0 0 100 100 100 80 100 100 100 100
9 0 0 0 100 100 40 0 100 0 80 100
10 0 0 0 100 100 0 0 80 0 80 100
11 0 0 0 100 100 0 0 80 0 80 100
12 0 0 0 100 100 0 0 80 0 80 100
13 0 0 0 100 100 0 0 80 0 80 100
14 0 0 0 100 100 0 0 80 0 80 100
體重數據進一步說明了組合投與之兩種分子之活性增強(表194)。當以0.1/3 mg/kg(結合物45b/巴洛沙韋)給藥時，觀察到BW減輕顯著降低。劑量為0.1 mg/kg之結合物45b本身具有保護作用，但動物在第4天之BW下降了18.8%。但是，此劑量與非保護性劑量之巴洛沙韋(3 mg/kg)一起投與使最大BW減輕降至4.5%(第11組)。 表194：體重%
天 媒劑 結合物45b (mg/kg) (SC ，單次) 巴洛沙韋(mg/kg) (PO ，bid x3 天) 結合物45b / 巴洛沙韋組合(mg/kg)
0.01 0.03 0.1 0.3 1 3 10 0.01 / 3 0.03 / 3 0.1 / 3
0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
1 96.9 97.9 97 97.7 99.8 99.2 97.1 95.9 97.5 96.7 96.8
2 94.3 96.8 95.2 97.3 99.3 99.8 99 101.8 98.9 95.4 98
3 85.4 86.3 85.5 85.5 88.4 90.3 92.1 97.4 94 93.2 95.5
4 78.9 79.8 79.8 81.2 86 90.5 92.5 98 94.2 92.7 95.5
5 77.2 78.7 79.3 81.6 95.3 94.6 97.3 100.8 99.1 96.9 100
6 83.9 98.6 91.1 89.9 98.9 93.3 94.3 99.2
7 85.8 99.1 84.6 83.3 91.1 85.6 87.8 100.4
8 87.9 99.6 79.5 77.9 86.9 79.4 83.9 99.8
9 90 99.1 75.7 86.4 74.8 85.2 102.4
10 89.2 99.9 88.2 100.4
11 92.8 99.9 101
12 97.7 100.8 100.9
13 98.7 101.8 100.3
14 101 101.4 102.1
在此重要研究中，兩個不同組證明了聯合用巴洛沙韋增強了結合物45b之效能。同樣，不容忽視的係兩種化合物不會互相抑制活性之關鍵觀察。相反的情況係真實的以及組合更有效之觀察結果係可能會轉化為臨床之益處。實例 207. 替代合成結合物 45a
Figure 02_image2050
步驟 a.
Figure 02_image2052
在室溫下，用硫酸銅(II)(0.0027 g，0.0168 mmol)、抗壞血酸鈉(0.0133 g，0.067 mmol)及THPTA(0.0116 g，0.027 mmol)在水(1.5 mL)中之溶液處理疊氮基PEG4-TFP酯(0.1 g，0.067 mmol)及炔烴官能化二聚體(0.0383 g，0.0871 mmol)之DMF(2.0 mL)溶液。然後將反應物用氮氣真空沖洗3次並在氮氣氣氛下攪拌。30分鐘後之LCMS顯示原料已完全消耗。反應用400 µL乙酸酸化，然後直接藉由反相層析法純化，以含0.1%TFA之5%至100%乙腈/水之梯度溶離。合併含有產物之溶離份，冷凍並凍乾隔夜。三TFA鹽之產率為69%。藉由LCMS發現之離子：(M+2H)+2 = 795.4，(M+3H)+3 = 530.8，(M+4H)+4 = 398.4。步驟 b.
Figure 02_image2054
用來自上一步驟之固體TFP酯(0.0273 g，17.17 µmol)處理Fc(0.100g在5.2 mL中，1.717 µmol，MW = 58,218，SEQ ID NO：72)在pH = 7.4 PBS緩衝液中之溶液。用硼酸鹽緩衝液(120 µL，1M，pH 8.5)將pH調節至約7.0，然後在室溫下輕輕搖動。1.5小時後之Maldi TOF顯示平均DAR為3.3，在進一步混合後沒有變化。24小時後，添加另外TFP酯(0.0073 g，4.6 µmol)，並繼續搖動另外3h。根據一般純化方法，將粗結合物經蛋白A及SEC純化。蛋白A處理後之總產率為約83%，且SEC處理後之總產率為約77%。純化之結合物之Maldi TOF顯示平均質量為63,574，此相當於平均DAR為4.0。
實例207中所述之替代合成係有利的，乃因其避免了將Fc暴露於銅+2及抗壞血酸鈉，從而產生較純淨之粗結合物，其在單獨蛋白A純化之後藉由分析型SEC為98.9%純。以此純度水準下，可以消除SEC純化，此係非常耗時且昂貴的。初始嘗試使用疊氮基-PEG4-NHS酯僅僅係部分成功的，因為NHS酯之反應性太強而無法純化，並且粗點擊反應混合物必須與Fc混合，因此必須移除銅及移除高分子量聚集體(由於暴露於抗壞血酸鈉)。同樣，此方法不會產生大於2之DAR。後續嘗試使用反應性較低之活性酯(TFP四氟苯酚)，其穩定性足以承受反相純化及凍乾，使得與疊氮基TFP酯之點擊反應可以與Fc分開進行，純化，然後與Fc混合。在實例207中，平均DAR達到4.0，並且藉由添加更多TFP酯可以達到更高DAR。
編碼結合物45a之Fc之核酸構築體包含編碼SEQ ID NO：63之胺基酸序列的核酸，該胺基酸序列包含C末端離胺酸殘基。表現後，結合物45a之Fc之C末端離胺酸經蛋白水解裂解，由此產生具有SEQ ID NO：72之序列的Fc。C末端離胺酸之存在或不存在不改變Fc或相應結合物之性質。實例 208. 與巴洛沙韋組合之結合物 45a 對致死性小鼠流感模型之流感 A (H1N1) 之功效 ( 確認研究 )
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8週)中針對致死IAV H1N1流感感染，評估了結合物45a與巴洛沙韋瑪波地爾(BXM)之組合。此係對實例206之接續，實例206在初始實驗中測試了相同組合，但是使用了皮下給藥途徑之結合物45a代替了本研究中使用之肌內注射(IM)。攻擊病毒(A/California/07/2009)係能夠在小鼠中引起致死性感染之大流行分離株。該實驗包含8組，每組5隻小鼠。在第0天，所有小鼠均在經氯胺酮/甲苯噻嗪(分別為100及10 mg/kg)輕微地麻醉之後藉由鼻內接種經30 µl體積之病毒(3x LD95 ；3E4個病毒/小鼠)攻擊。各組接受媒劑、僅hIgG1 Fc、結合物45a、BXM(DC Chemicals，目錄號DC11056；懸浮於0.5%甲基纖維素中)或組合治療(攻擊後2小時)。BXM經口(PO)給藥，每天兩次，持續3天，並藉由IM以單劑量投與結合物45a(表195)。每天監測死亡率及體重(BW)，持續21天。連續2天體重減輕超過20%之任何小鼠均被評為死亡。  表195：結合物45a及BXM組合研究之研究設計
組 流感A 病 毒株 測試物品 途徑，時程 (T+2 小時) 劑量 (mg/kg) N
1 A/CA/07/09 (H1N1) 3E4 PFU/小鼠，經由IN 媒劑(PBS) IM，單次 --- 5
2 hIgG1 Fc IM，單次 0.1 5
3 結合物45a IM，單次 0.03 5
4 結合物45a IM，單次 0.1 5
5 BXM PO，bid x 3天 3 5
6 BXM PO，bid x 3天 10 5
7 BXM PO，bid x 3天 3 5
結合物45a IM，單次 0.03 5
8 BXM PO，bid x 3天 3 5
結合物45a IM，單次 0.1 5
為了分開確定結合物45a及BXM之效能，確定各分子之劑量範圍。對於結合物45a，基於存活率0.1 mg/kg之劑量具有保護性，而0.03 mg/kg之劑量並非具有保護性(表196)。對於BXM，接受10 mg/kg(bid x 3天)之組受到保護，而接受相同劑量方案之3 mg/kg之組則不受保護。投與媒劑或僅hIgG1 Fc之組不受保護。根據上述結果，結合物45a(0.1 mg/kg)與BXM(3 mg/kg)之組合亦得到了充分保護。
第7組動物接受亞有效水準之結合物45a(0.03 mg/kg)及BXM(3 mg/kg)之組合。儘管當個別地投與時，兩種測試物品都沒有明顯保護作用，但組合時其具有完全保護作用(表196)。第7組之動物亦僅表現出短暫BW減輕，其不超過5.2%(第3天)(表197)。到研究結束時，該組已超過其初始BW，在第21天達到初始BW之106.3%。除了在結合物45a與BXM之間不表現出任何拮抗作用外，發現相反情況，表明與這兩種治療劑共同治療之額外益處。 表196：研究組之存活率%
對照物 結合物45a (mg/kg) (IM ，單次) 巴洛沙韋(mg/kg) (PO ，bid x3 天) 結合物45a / 巴洛沙韋組合(mg/kg)
天 媒劑 hIgG1 Fc (0.1 mg/kg) 0.03 0.1 3 10 0.03 / 3 0.1 / 3
0 100 100 100 100 100 100 100 100
1 100 100 100 100 100 100 100 100
2 100 100 100 100 100 100 100 100
3 100 100 100 100 100 100 100 100
4 100 100 80 100 100 100 100 100
5 80 60 60 100 100 100 100 100
6 80 20 20 100 100 100 100 100
7 60 0 20 100 100 100 100 100
8 0 20 100 60 100 100 100
9 20 100 0 100 100 100
10 20 100 100 100 100
11 20 100 100 100 100
12 20 100 100 100 100
13 20 100 100 100 100
14 20 100 100 100 100
15 20 100 100 100 100
16 20 100 100 100 100
17 20 100 100 100 100
18 20 100 100 100 100
19 20 100 100 100 100
20 20 100 100 100 100
21 20 100 100 100 100
表197： 按天列出之平均體重(組平均值；直到組中第一例死亡)
對照物 結合物45a (mg/kg) (IM ，單次) 巴洛沙韋(mg/kg) (PO ，bid x3 天) 結合物45a / 巴洛沙韋組合(mg/kg)
天 媒劑 hIgG1 Fc (0.1 mg/kg) 0.03 0.1 3 10 0.03 / 3 0.1 / 3
0 100 100 100 100 100 100 100 100
1 102.1 100.2 99.9 99.6 97.9 97.9 100.3 100
2 94.9 94.3 93.3 95 90.5 98.7 99.9 99.6
3 85 84.2 83.1 83.7 88.5 94.6 94.8 94.3
4 81.3 79.6 79.7 81.4 90.7 95.8 96.9 96.1
5 82.4 80.1 82.3 88.3 95.3 99.4 100.9 100.4
6 91.1 87.7 96.7 99 99.2
7 91.7 81 89.6 96.8 98.5
8 96.9 76.7 90.9 101.6 101.9
9 95.7 92.6 99.1 99
10 99.4 98.2 101.7 102.3
11 98.6 95.8 98.7 100.3
12 98.4 96.8 100.7 99.9
13 101 99.5 102.9 101.1
14 102.3 99.2 103.7 103.6
15 101.2 97.8 102.1 100.2
16 102.8 99.5 103.1 102.8
17 101.9 98.3 102.7 101.1
18 102.3 97.1 101.7 100.1
19 103.9 98.9 101.6 100.6
20 103.9 98.9 104.5 102.6
21 107 101.2 106.3 103.8
實例 209. 在致死小鼠模型中測定針對 2020-2021 北半球四價疫苗 (A/Hawaii/70/2019pdm; H1N1) 之成分之結合物 45a 之效能。
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8週)之致死H1N1流感感染模型中評估了結合物45a。攻擊病毒(A/Hawaii/70/2019)係能夠在小鼠中引起致死性感染之大流行H1N1分離株。其亦係2020-2021年北半球四價疫苗之推薦成分。
實驗包括9組，每組5隻小鼠。在第0天，所有小鼠均在經氯胺酮/甲苯噻嗪(分別為100及10 mg/kg)麻醉之後藉由鼻內接種經30 µl體積之病毒(2x LD95 ；2E3個病毒/小鼠)攻擊。在藉由肌內(IM，5 ml/kg劑量體積)投與(右腹)病毒攻擊後2小時，各組接受了結合物45a、hIgG1 Fc或媒劑(PBS)之單次治療。結合物45a之測試濃度為3、1、0.3、0.1、0.03及0.01 mg/kg。未感染之組亦包括在研究中作為對照。每天監測死亡率及體重(BW)，持續21天。連續兩天保持BW減輕20%之任何小鼠均被視為死亡。實驗概述總結在表198中。
在此研究中，結合物45a之單次IM投與在0.3、1及3 mg/kg下完全保護了小鼠免受A/HA/70/2019(H1N1)致死性攻擊(表199)。與媒劑治療之動物相比，在此等劑量水準下結合物45a之效能顯著(P = 0.0031)。相比之下，用媒劑及hIgG1 Fc治療之動物在第5天達到了100%之死亡率。在0.1及0.03 mg/kg劑量組(分別為60%及20%存活率)中亦看到了部分保護，但與媒劑治療之動物相比，統計不顯著。總之，存活率數據表明結合物45a對此重要流感分離株有效，並且在較低劑量組中有明顯的劑量反應(圖119)。
BW數據亦支持結合物45a之效能。經過完全保護性劑量(3、1及0.3 mg/kg)治療之小鼠在第3天顯示短暫BW減輕(在結合物45a劑量為0.3 mg/kg之情況下，最大BW減輕為12%)，直到研究結束(第21天)穩定地恢復BW (表200)。BW趨勢反映了該研究之存活率結果，並支持了結合物針對此H1N1分離株之功效。
此研究共同證明，藉由死亡率及BW讀數，結合物45a對重要大流行性流感分離株之效能。由於已選擇將A/HA/70/2019列入2020年北半球疫苗，因此其視為臨床上相關之分離株並對公共健康構成威脅。單一IM劑量為0.3 mg/kg之結合物45a對此大流行病毒株之效能支持其作為流感治療劑之持續研發。 表198：針對A/HA/70/2019之結合物45a效能研究概述
組 流感 A 病毒株 (IN 攻擊 ) 測試物品 途徑，時程 劑量 (mg/kg) 劑量體積 (ml/kg) 小鼠之數目
1 未感染 媒劑(PBS) IM，單次，T+2 h --- 5 5
2 A/HA/70/2019 (H1N1)    約2E3 pfu/ml 媒劑(PBS) IM，單次，T+2 h --- 5 5
3 hIgG1 Fc (SEQ ID NO: 72) IM，單次，T+2 h 0.3 5 5
4 結合物45a IM，單次，T+2 h 3 5 5
5 結合物45a IM，單次，T+2 h 1 5 5
6 結合物45a IM，單次，T+2 h 0.3 5 5
7 結合物45a IM，單次，T+2 h 0.1 5 5
8 結合物45a IM，單次，T+2 h 0.03 5 5
9 結合物45a IM，單次，T+2 h 0.01 5 5
表199：按組別及日期列出之動物存活率百分比
對照物 結合物45a(mg/kg) (IM ，單次)
天 未感染 媒劑 hIgG1 Fc (0.3 mg/kg) (SEQ ID NO: 72) 3 1 0.3 0.1 0.03 0.01
0 100 100 100 100 100 100 100 100 100
1 100 100 100 100 100 100 100 100 100
2 100 100 100 100 100 100 100 100 100
3 100 100 100 100 100 100 100 100 100
4 100 60 60 100 100 100 100 100 80
5 100 0 0 100 100 100 60 20 60
6 100 100 100 100 60 20 60
7 100 100 100 100 60 20 40
8 100 100 100 100 60 20 0
9 100 100 100 100 60 20
10 100 100 100 100 60 20
11 100 100 100 100 60 20
12 100 100 100 100 60 20
13 100 100 100 100 60 20
14 100 100 100 100 60 20
15 100 100 100 100 60 20
16 100 100 100 100 60 20
17 100 100 100 100 60 20
18 100 100 100 100 60 20
19 100 100 100 100 60 20
20 100 100 100 100 60 20
21 100 100 100 100 60 20
表200： 按天列出之平均體重百分比(組平均值；直到組內第一例死亡)
對照物 結合物45a(mg/kg) (IM ，單次)
天 未感染 媒劑 hIgG1 Fc (0.3 mg/kg) 3 1 0.3 0.1 0.03 0.01
0 100 100 100 100 100 100 100 100 100
1 100.8 97.9 97.2 98.6 98.4 98.1 98.5 98.4 99.2
2 103.2 93.9 94.3 100.3 98.9 96.5 96.3 95.9 95.5
3 100.9 84.3 84.8 94.1 92.6 88 85.8 86.2 84.1
4 103.4 78.2 95.1 95.3 88.2 84.1 81.3 81.2
5 103.1 97.5 96.2 91.5 82.7 77
6 105.5 100.3 99.2 96.3
7 104.4 99.6 99.1 95.6
8 105.1 102.2 102.4 100.5
9 104.7 100.7 100.7 99.9
10 103.9 101.6 100.9 100.2
11 106.8 102.3 101.7 100.9
12 108.7 102.8 103.4 101.9
13 105.7 102.1 102.3 101.5
14 108.7 102.9 104.7 103.8
15 110.15 103.1 104 102.8
16 106.5 100.9 101.5 99.5
17 105.5 100.7 101 100.3
18 106.1 100.6 101.6 100.5
19 107.7 100.9 103 101.5
20 107.2 99.9 102.5 101.5
21 107.6 102.5 102.8 104.2
實例 210. 結合物 45a 在 4 週致死小鼠模型中抗 流感 A/Puerto Rico/8/1934(H1N1) 之功效
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8週)中針對致死性IAV H1N1流感感染評估結合物45a。攻擊病毒(A/Puerto Rico/8/1934)係能夠在小鼠中引起致死性感染之小鼠適應性分離株。該實驗包含7組，每組5隻小鼠。在第0天，所有小鼠均在經氯胺酮/甲苯噻嗪之混合物(分別為150及10 mg/kg)麻醉之後藉由鼻內(IN)接種經30 µl體積之病毒(3x LD95)攻擊。唯一例外係第1組，該組由用作體重(BW)對照之未感染之小鼠組成。每天記錄死亡率及體重，持續28天，且連續2天重量累計減輕20%之任何動物均被評為死亡。
測試組在病毒攻擊2小時後接受結合物45a(0.01至0.3 mg/kg)、僅hIgG1 Fc(0.3 mg/kg，SEQ ID NO：72)或媒劑(PBS)之單次肌內(IM)注射。以5 ml/kg之劑量注射在右後肢之大腿肌肉中。  表201：研究概述
組 流感A 測試物品 途徑，時程 劑量(mg/kg) N
1 未感染 媒劑(PBS) IM，單次，T+2 h --- 5
2 A/PR/8/34 (H1N1)    3E2 PFU/小鼠 媒劑(PBS) IM，單次，T+2 h --- 5
3 hIgG1 Fc IM，單次，T+2 h 0.3 5
4 結合物45a IM，單次，T+2 h 0.3 5
5 結合物45a IM，單次，T+2 h 0.1 5
6 結合物45a IM，單次，T+2 h 0.03 5
7 結合物45a IM，單次，T+2 h 0.01 5
用僅媒劑治療之動物在第5天開始死亡，至第7天達到100%死亡率。類似地，用僅hIgG1 Fc治療之小鼠(缺乏結合物之抗病毒部分)在第7天已經完全死於感染(圖120及表202)。相反，接受0.1及0.3 mg/kg結合物45a之組受到完全保護，直到研究在第28天結束。相對於用僅媒劑治療之小鼠，該存活率差異具有統計顯著性(藉由Log-rank(Mantel-Cox)檢驗，兩組之P = 0.0020)。然而，以0.01及0.03 mg/kg之劑量水準投與之結合物45a係亞有效的，小鼠分別在第8天及第7天達到100%之死亡率(圖120及表202)。  表202：各研究組之按天列出之存活率%
對照物 結合物45a(mg/kg)
天 未感染 媒劑 hIgG1 Fc (0.3 mg/kg) 0.3 0.1 0.03 0.01
0 100 100 100 100 100 100 100
1 100 100 100 100 100 100 100
2 100 100 100 100 100 100 100
3 100 100 100 100 100 100 100
4 100 100 100 100 100 100 100
5 100 80 100 100 100 100 100
6 100 20 40 100 100 80 80
7 100 0 0 100 100 0 20
8 100 100 100 0
9 100 100 100
10 100 100 100
11 100 100 100
12 100 100 100
13 100 100 100
14 100 100 100
15 100 100 100
16 100 100 100
17 100 100 100
18 100 100 100
19 100 100 100
20 100 100 100
21 100 100 100
22 100 100 100
23 100 100 100
24 100 100 100
25 100 100 100
26 100 100 100
27 100 100 100
28 100 100 100
除了存活率以外，整個研究過程中還每天監測BW。到研究結束時，未感染之小鼠(第1組)之BW穩定增加，達到其初始BW之108.7%，表明測試動物之總體健康狀況良好(表203)。相反，陰性對照組(2及3)在第1天開始減輕BW，直到每組中之第一隻動物分別在第5天及第6天死亡。在組內第一例死亡後，由於該組成為有偏倚之群體，因此未記錄BW值。
用保護劑量之結合物45a(第4及第5組)治療之小鼠僅表現出短暫的小於5%之BW減輕。到研究結束時，這兩個組均超過了其初始BW(分別為105.9及108.7%)。如預期，接受亞保護劑量之結合物45a之小鼠(第6組及第7組)顯示出穩定之重量減輕，直到動物開始死亡。
總之，該數據表明結合物45a對抗流感A (H1N1)致死性攻擊之效能。值得注意地，小於1 mg/kg之單次IM注射實現保護。最後，在病毒攻擊後對動物進行整整4週之追蹤，表明受保護之動物極有可能完全清除了感染。  表203： 按天列出之平均體重%(組平均值；直到組內第一例死亡)
對照物 結合物45a(mg/kg) (IM ，單次)
天 未感染 媒劑 hIgG1 Fc (0.3 mg/kg) 0.3 0.1 0.03 0.01
0 100 100 100 100 100 100 100
1 100.5 98.1 97.7 96 98.7 98.5 98.2
2 101.3 97.8 98.3 96.5 99 100.4 98.4
3 102 92.1 92.7 97.2 98.3 94.6 94.4
4 103.2 84.3 85.1 97.4 95.3 89.2 87.7
5 106.5 80.8 101.2 102.3 89.1 83.9
6 104.9 74.7 99.7 98.6 81.4 77.9
7 106.8 102.6 101.3
8 108.3 102.3 102.7
9 103.6 99.6 101.7
10 108.4 103.9 105.4
11 105.1 100.5 102.4
12 108 103.8 107.1
13 107.7 102.9 105.1
14 106.3 102.9 105.3
15 106.6 103.4 105.9
16 104.2 101.2 102.9
17 104.9 101.2 103.9
18 107 103.9 106.9
19 107.3 104.3 106.1
20 105.6 103 105.7
21 104.7 103 105.6
22 108.5 106.8 107.8
23 106.8 103.5 106
24 106.4 101.4 107.7
25 106.1 103.2 107
26 109.3 106.1 109.4
27 108 105.1 107.8
28 108.7 105.9 108.7
實例 211. 在致死小鼠模型中，結合物 45a 及奧司他韋對流感 H1N1A/CA/12/2012 及 A/PR/8/1934 之功效。
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8週)中，針對藉由兩種流感H1N1亞型(A/PR/8/34及A/CA12/12)之致死性攻擊，評價了結合物45a及奧司他韋。該實驗包括10組，每組5隻小鼠，分為兩個實驗組(表204)。在T + 2h，以0.3 mg/kg之單劑量肌內(IM)投與小鼠結合物45a。同樣在T + 2h，以5或50 mg/kg經口投與奧司他韋，每天兩次，持續5天。對照小鼠用媒劑(PBS)或僅hIgG1 Fc進行IM治療。在化合物投與前兩個小時，用3x LD95 之A/PR/8/34(3E2 pfu)或A/CA/12/12(3E4 pfu)對小鼠進行鼻內攻擊。對於病毒攻擊，用氯胺酮/甲苯噻嗪混合物(分別為150及10 mg/kg)麻醉小鼠，並以30 µl之體積給予病毒。每天記錄死亡率及體重(BW)，持續14天，並且任何BW減輕20%之動物均被評為死亡。
在A/PR/8/34攻擊下，接受媒劑或僅Fc(SEQ ID NO：72)治療之小鼠截至第7天死於感染，而以0.3 mg/kg投與結合物45a之小鼠受到了完全保護(表205)。對於用奧司他韋治療之動物，50 mg/kg之劑量具有80%之保護性，而5 mg/kg之劑量僅將死亡延遲至第10天。針對A/CA/12/12，到第6天，媒劑及Fc對照動物之死亡率達到100%，再次，0.3 mg/kg劑量之結合物45a具有完全保護作用。相反，奧司他韋在5 mg/kg時無保護作用，甚至50 mg/kg劑量組之存活率亦僅為40%。兩個研究組之BW數據都支持死亡率發現(表205-208)。
總之，該數據表明，即使持續5天每天兩次以5或50 mg/kg給予奧司他韋，單次0.3 mg/kg劑量之結合物亦優於奧司他韋。 表204：研究設計
組 流感A 病毒株(IN 攻擊) 測試物品 DAR 途徑，時程 劑量 (mg/kg) 化合物製備 N
劑量體積 ml/kg mg/ml 所需體積(ml)
1 A/PR/8/34 (H1N1) 3E2 PFU/小鼠    媒劑(PBS) --- IM，單次，T+2 h --- 5 --- 1 5
2 單獨Fc --- IM，單次，T+2 h 0.3 5 0.06 1 5
3 結合物45a 4.6 IM，單次，T+2 h 0.3 5 0.06 1 5
4 奧司他韋 --- PO，bid x 5天 5 10 0.5 14 5
5 奧司他韋 --- PO，bid x 5天 50 10 5 14 5
研究組II
6 A/CA/12/12 (H1N1) 3E4 PFU/小鼠 媒劑(PBS) --- IM，單次，T+2 h --- 5 --- 1 5
7 單獨Fc --- IM，單次，T+2 h 0.3 5 0.06 1 5
8 結合物45a 4.6 IM，單次，T+2 h 0.3 5 0.06 1 5
9 奧司他韋 --- PO，bid x 5天 5 10 0.5 14 5
10 奧司他韋 --- PO，bid x 5天 50 10 5 14 5
表205： A/PR/8/34之存活率%
攻擊後天數 媒劑(PBS) 單獨Fc (0.3 mpk) 結合物45a (0.3 mpk) 奧司他韋 (5 mpk) 奧司他韋 (50 mpk)
0 100 100 100 100 100
1 100 100 100 100 100
2 100 100 100 100 100
3 100 100 100 100 100
4 100 100 100 100 100
5 100 100 100 100 100
6 0 60 100 100 100
7 0 100 100 100
8 100 60 100
9 100 40 100
10 100 0 80
11 100 80
12 100 80
13 100 80
14 100 80
表206： A/CA/12/2012攻擊小鼠之存活率%。
攻擊後天數 媒劑(PBS) 單獨Fc (0.3 mpk) 結合物45a (0.3 mpk) 奧司他韋 (5 mpk) 奧司他韋 (50 mpk)
0 100 100 100 100 100
1 100 100 100 100 100
2 100 100 100 100 100
3 100 100 100 100 100
4 80 100 100 100 100
5 0 20 100 20 40
6 0 100 20 40
7 100 20 40
8 100 0 40
9 100 40
10 100 40
11 100 40
12 100 40
13 100 40
14 100 40
表207： A/PR/8/34攻擊之小鼠之平均BW%，直到組內第一例死亡
攻擊後天數 媒劑(PBS) 單獨Fc (0.3 mpk) 結合物45a (0.3 mpk) 奧司他韋 (5 mpk) 奧司他韋 (50 mpk)
0 100 100 100 100 100
1 98.9 100.2 99.6 98.5 98.6
2 102 104.2 102.5 100.7 99.2
3 94.7 97.1 100.6 99.4 100.3
4 85.8 88.8 100.9 93.5 97.9
5 78.9 81.5 99 88.5 90.5
6 74.9 77.6 102 90 96
7 104 84.5 89.7
8 103.9 79.4 84.2
9 104.6 86.3
10 105.4 90.3
11 103.4
12 103.9
13 104.3
14 106.3
表208： A/CA/12/2012攻擊之小鼠之平均BW%，直到組內第一例死亡
攻擊後天數 媒劑(PBS) 單獨Fc (0.3 mpk) 結合物45a (0.3 mpk) 奧司他韋 (5 mpk) 奧司他韋 (50 mpk)
0 100 100 100 100 100
1 99.6 97.6 100.2 98.3 98.9
2 92.2 90.6 91.2 92.9 93.5
3 85.4 83.5 86.7 86.4 86.3
4 78 77.9 85.5 80.9 82.2
5 87.2 76.2 78.7
6 90.7
7 94.2
8 96.3
9 97.8
10 100
11 98.6
12 98.1
13 98.5
14 100.4
實例 212. 在 28 天之小鼠預防模型中，結合物 45a 對抗流感 B/Florida/4/2006(Yamagata) 之功效。
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8週)中，針對B型流感季節性流感亞型(B/Florida/4/2006)之致死性攻擊，評估了結合物45a。該實驗包含7組，每組5隻小鼠。在第0天，以單劑量3、1、0.3、0.01或0.3 mg/kg對小鼠皮下(SC)投與結合物45a。對照小鼠亦藉由相同途徑用媒劑(PBS)或僅hIgG1 Fc治療。投與測試物品後之第二十八天，用3x LD95 之B/Florida對小鼠進行鼻內攻擊。表209提供了實驗設計之概述。為進行病毒攻擊，用氯胺酮/甲苯噻嗪混合物(分別為150及10 mg/kg)麻醉小鼠，並以30 µl之體積給予病毒。每天記錄死亡率及體重(BW)，持續21天，並將體重減輕20%之任何動物評為死亡。
用僅媒劑治療之小鼠在第7天死亡，而用僅Fc陰性對照物治療之小鼠截至第8天死於感染(表210)。相反，在研究過程中接受1或3 mg/kg結合物45a之小鼠受到完全保護。以0.3 mg/kg治療之第4組動物亦表現出80%之存活率。在0.1 mg/kg之劑量濃度下，存活率下降至40%，並且在0.03 mg/kg下，結合物45a沒有提供保護。BW數據(表211)反映了死亡率結果，且接受完全保護性劑量(1及3 mg/kg)之小鼠在第4天顯示短暫的少於5%之BW下降，之後恢復其初始BW。
總之，此等數據支持結合物45a對重要季節性流感亞型具有穩健之效能。其亦證明了結合物45a作為流感之長期預防劑之效用。 表209：一般研究設計
組 流感B 病毒株(IN 攻擊) 測試物品 DAR 途徑，時程 劑量 (mg/kg) 化合物製備 N
給藥時序 劑量體積 ml/kg mg/ml 所需體積(ml)
1 B/FL/4/2006 (Yamagata) 5E4 PFU/小鼠 媒劑(PBS) --- SC，單次 --- T-28天 10 --- 1.5 5
2 單獨Fc --- SC，單次 3 T-28天 10 0.3 1.5 5
3 結合物45a 4.7 SC，單次 3 T-28天 10 0.3 1.5 5
4 結合物45a 4.7 SC，單次 1 T-28天 10 0.1 1.5 5
5 結合物45a 4.7 SC，單次 0.3 T-28天 10 0.03 1.5 5
6 結合物45a 4.7 SC，單次 0.1 T-28天 10 0.01 1.5 5
7 結合物45a 4.7 SC，單次 0.03 T-28天 10 0.003 1.5 5
表210：研究組存活率%
感染後天數 媒劑(PBS) 單獨Fc (3 mpk) 結合物45a (3 mpk) 結合物45a (1 mpk) 結合物45a (0.3 mpk) 結合物45a (0.1 mpk) 結合物45a (0.03 mpk)
0 100 100 100 100 100 100 100
1 100 100 100 100 100 100 100
2 100 100 100 100 100 100 100
3 100 100 100 100 100 100 100
4 100 100 100 100 100 100 100
5 100 100 100 100 100 100 100
6 60 100 100 100 100 100 100
7 0 20 100 100 80 80 80
8 0 100 100 80 40 0
9 100 100 80 40
10 100 100 80 40
11 100 100 80 40
12 100 100 80 40
13 100 100 80 40
14 100 100 80 40
15 100 100 80 40
16 100 100 80 40
17 100 100 80 40
18 100 100 80 40
19 100 100 80 40
20 100 100 80 40
21 100 100 80 40
表211：每天平均BW%，直到組內第一例死亡為止
感染後天數 媒劑(PBS) 單獨Fc (3 mpk) 結合物45a (3 mpk) 結合物45a (1 mpk) 結合物45a (0.3 mpk) 結合物45a (0.1 mpk) 結合物45a (0.03 mpk)
0 100 100 100 100 100 100 100
1 97 94.9 97.1 98.3 96.9 96.9 97.2
2 97.8 96.3 97.7 98.5 99.5 97.9 98.9
3 93.9 94.3 99.9 100.9 99.7 97.6 98.8
4 84.5 85.3 95.8 95.8 90.9 88.9 89.3
5 81.4 83.1 102 99.4 95.1 90.6 87.5
6 76.5 78.2 101.1 99.8 91.9 85.9 81.9
7 98.7 97.9 87 79.5 76
8 99.6 97.9 88
9 99.6 99
10 99.9 100.2
11 101.9 100.7
12 99.5 99.4
13 100 99.4
14 99.4 101
15 98 97
16 100 99.4
17 97.5 98.2
18 99.4 100.4
19 98.8 100.9
20 100.8 101.9
21 100 100.1
實例 213. Fc 介導之結合物 45a 之免疫貢獻
在用3E2 PFU/小鼠(3x LD95 )之小鼠適應性A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)或3e4 PFU/小鼠之流感A/CA/07/2009(H1N1)pdm鼻內攻擊之6-8週雌性BALB/c小鼠(Charles River)或Fcer1g-/- 583模型(Taconic)中進行了功效研究。攻擊後2小時，如所指示以單劑量皮下(SC)或肌內(IM)投與AVC或對照-人類IgG1 Fc或PBS-，劑量為0.03-3 mg/kg。每天記錄體重(BW)。死亡定義為連續兩天體重減輕在20%以上或當動物垂死時。
為了進行病毒負荷及細胞因子分析，在感染後4天，藉由CO2 處死小鼠並收穫兩個肺葉。肺使用MagNALyser (Roche)用1 mL PBS中之1 mm矽珠均質化。在6,000 rpm下進行均質化持續60 s且在運行之間在冰上冷凍持續5 min。在肺均質化之後，將管在600 x g下離心持續10 min且將上清液轉移至新管中。為進行PFU測定，肺均質液之上清液在感染緩衝液中經稀釋，介於10-1 至10-6 範圍內。100 μL病毒稀釋液添加至24孔板中之MDCK細胞之匯合單層中且在室溫下經培育持續1 h，其中每15 min搖動。在移除病毒之後，含有Avicel之液體覆蓋培養基添加至MDCK細胞中。將細胞在37℃，5% CO2 下培育40小時。在培育之後，移除培養基且細胞用結晶紫染色以對斑塊計數，且相對於肺重量計算斑塊形成單位(PFU) (PFU/g肺)。為進行細胞因子分析，肺均質液之上清液連續2倍稀釋於96孔板中。IL-6、MIP-1α及MCP-1之細胞因子水準藉由ELISA根據製造商之說明書(R&D Systems)測定。
0.03 mg/kg或更高劑量之結合物45a對Balb/C(WT)及Fcer1g-/- (KO)小鼠之流感A/CA/07/2009(H1N1)pdm致死性攻擊具有完全保護作用(參見表212)，表明結合物45a之保護獨立於Fc介導之免疫貢獻。 表212：結合物45a在Balb/C小鼠(WT)或Fcer1g-/- (KO)小鼠中對流感A/CA/07/2009(H1N1)pdm之功效。
測試物品[mg/kg] 給藥途徑 小鼠背景 存活率%
hIgG1 Fc [1] IM WT 0
結合物45a [0.03] IM WT 100
結合物45a [0.1] IM WT 100
結合物45a [0.3] IM WT 100
結合物45a [1] IM WT 100
hIgG1 Fc [1] IM KO 0
結合物45a [0.03] IM KO 100
結合物45a [0.1] IM KO 100
結合物45a [0.3] IM KO 100
結合物45a [1] IM KO 100
在Balb/C小鼠中，劑量為0.1 mg/kg或更高劑量之結合物45a對流感A/PR/8/1934(H1N1)之致死性攻擊具有完全保護性(參見表213)。為了確定在WT Balb/c小鼠中之免疫貢獻，製備了結合物45a之無糖基化之Fc突變體(N297A)之形式，結合物49(例如，包含SEQ ID NO：72之進一步包含N297A突變之Fc)。已知該Fc突變體導致很大程度上廢除之免疫效應子功能。結合物49在0.1 mg/kg時亦具有保護性，表明由結合物45a賦予之保護獨立於Fc介導之免疫貢獻。為了確定結合物45a之功效係否可以藉由增加Fc介導之免疫效應子功能來增強，將結合物45a形式結合至包含DE(S239D/I332E)突變之Fc(例如，包含SEQ ID NO：72之進一步包含S239D/I332E突變之Fc)，結合物50。結合物50在0.1 mg/kg或更高之劑量下具有完全保護性，這與結合物45a之活性相當。然而，在用0.03 mg/kg之結合物50治療後，一隻小鼠存活。因此，結合物45a在DAR 4.5之活性獨立於Fc介導之免疫貢獻。  表213： AVC對Balb/C小鼠(WT)之流感A/PR/8/1934(H1N1)之功效。
測試物品[mg/kg] 給藥途徑 Fc 存活率%
hIgG1 Fc [1] IM WT 0
結合物45a [0.01] IM WT 0
結合物45a [0.03] IM WT 0
結合物45a [0.1] IM WT 100
結合物45a [0.3] IM WT 100
結合物49 [0.01] IM N297A 0
結合物49 [0.03] IM N297A 0
結合物49 [0.1] IM N297A 100
結合物49 [0.3] IM N297A 100
結合物49 [1] IM N297A 100
結合物50 [0.01] IM S239D/I332E 0
結合物50 [0.03] IM S239D/I332E 20
結合物50 [0.1] IM S239D/I332E 100
結合物50 [0.3] IM S239D/I332E 100
在小鼠模型中用流感進行致死攻擊後，在感染後第4天確定肺PFU負荷及肺細胞因子水準。結合物45a及結合物49顯示出病毒負荷之劑量依賴性對數減少至相當水準(參見表214)。與結合物45a或結合物49相比，結合物50顯示出0.1 mg/kg下分別0.96對數或0.83對數之更高病毒負荷減少。如所預期，在陰性對照物PBS與hIgG1 Fc之間未觀察到生物相關差異。  表214：在小鼠模型中，用流感A/PR/8/1934(H1N1)攻擊之感染後第4天，結合物引起之病毒負荷減少。
測試物品[mg/kg] 給藥途徑 PFU/g Log 減少
PBS SC 2.19E+07 0.00
hIgG1 Fc [3] SC 2.85E+07 -0.11
結合物45a [0.03] SC 1.84E+07 0.07
結合物45a [0.1] SC 6.34E+06 0.54
結合物45a [0.3] SC 2.63E+05 1.92
結合物45a [1] SC 9.99E+03 3.34
結合物45a [3] SC 1.53E+03 4.16
結合物49 [0.03] SC 9.06E+06 0.38
結合物49 [0.1] SC 4.68E+06 0.67
結合物49 [0.3] SC 1.36E+05 2.21
結合物49 [1] SC 4.57E+04 2.68
結合物49 [3] SC 5.89E+03 3.57
結合物50 [0.1] SC 6.40E+05 1.53
類似地，結合物45a及結合物49劑量依賴性地將細胞因子IL-6、MIP-1a、MCP-1減少至相似水準(參見表215)。至於0.1 mg/kg之結合物50，IL-6及MIP-1a之水準略低，但觀察到相當之水準。與結合物45a及結合物49相比，0.1 mg/kg之結合物50顯示MCP-1水準顯著增加。如所預期，在陰性對照物PBS與hIgG1 Fc之間未觀察到生物相關差異。 表215：在小鼠模型中，用A型流感攻擊感染後第4天，IL-6、MIP-1α及MCP-1之細胞因子水準相對於未感染對照之倍數變化。
測試物品[mg/kg] IL-6 MCP-1 MIP-1 α
PBS 4.4 30.0 13.7
hIgG1 Fc [3] 4.6 31.9 15.4
結合物45a [0.03] 3.1 14.8 14.3
結合物45a [0.1] 2.5 10.2 7.1
結合物45a [0.3] 2.1 3.2 3.7
結合物45a [1] 2.0 1.2 2.2
結合物45a [3] 2.0 1.2 2.1
結合物49 [0.03] 2.3 19.4 10.6
結合物49 [0.1] 2.4 11.1 5.7
結合物49 [0.3] 2.9 10.7 5.0
結合物49 [1] 2.5 4.7 2.4
結合物49 [3] 2.3 4.5 2.2
結合物50 [0.1] 1.9 25.6 4.9
未感染 1.0 1.0 1.0
實例 214. 結合物 45a 對流感 2020-2021 疫苗毒株之功效 神經胺糖酸酶抑制 (NAI) 。
使用商業NA-Fluor套組測定NAI活性。簡而言之，將活病毒調整為1e5 PFU/mL，並添加至96孔板(黑色)中之適當孔中。將測試物品以0.001至1,000 nM範圍內之濃度添加至適當之孔中。病毒及測試物品在37℃，5% CO2 下培育20-30分鐘。接下來，將NA受質添加至各孔中，並在37℃，5% CO2 下培育1小時。藉由讀取355 nm激發/460 nm發射之螢光來確定NAI。使用非線性迴歸分析(劑量反應(抑制))，使用GraphPad Prism版本8計算IC50 。
結合物45a在針對北半球2020-21流感疫苗毒株之NAI方面之效能(IC50 )與奧司他韋或紮那米韋相當(表216)。 表216：結合物45a在針對北半球流感疫苗毒株2020-21之神經胺糖酸酶抑制(NAI)檢定中之活性(IC50 )
流感病毒株 亞型/ 譜系 結合物45a [nM] 奧司他韋[nM] 紮那米韋[nM]
A/Hawaii/70/2019 H1N1pdm09 0.21 0.32 0.26
A/Hong Kong/2671/2019 H3N2 4.8 0.76 1.05
B/Phuket/3073/2013 Yamagata 4.58 24.44 2.78
B/Washington/02/2019 Victoria 3.11 16.71 2.3
酶聯凝集素檢定 (ELLA) 。
在4℃下將Nunc Maxisorp 96孔板(ThermoFisher)以1x KPL包被緩衝液(SeraCare)中之2.5 µg胎球蛋白(Sigma-Aldrich)包被隔夜。第二天，用補充有0.05% Tween 20(PBST)之pH 7.4之PBS洗滌板。測試物品之測試濃度為0.001-1000 nM，並以50 µL/孔添加。在50 µL/孔中以5e4-5e5 PFU/mL添加流感病毒。將板在37℃，5% CO2 下培育16-18小時。洗滌板後，以0.13 µg在100 uL緩衝液中添加與HRP結合之花生凝集素(PNA-HRP)持續2 h，再次洗滌並用100 µL/孔之TMB受質(BD)顯影3-5分鐘。用100 µL/孔之1N H2 SO4 終止反應。使用EnSpire多模式讀板器在450 nm處讀取吸光度。使用非線性迴歸分析(劑量反應(抑制))，使用GraphPad Prism版本8計算IC50 。
與奧司他韋或紮那米韋相比，結合物45a針對北半球之流感疫苗毒株2020-21之NAI之效能(IC50 )增加(表217)。 表217：結合物45a在酶聯凝集素檢定(ELLA)中對北半球流感疫苗毒株2020-21之活性(IC50 )
流感病毒株 亞型/ 譜系 結合物45a [nM] hIgG1 Fc [nM] 奧司他韋[nM] 紮那米韋[nM]
A/Hawaii/70/2019 H1N1pdm09 0.2 ＞1,000 5.9 2.7
A/Hong Kong/2671/2019 H3N2 0.1 ＞1,000 0.3 0.4
B/Phuket/3073/2013 Yamagata 2.8 ＞1,000 28.8 9
B/Washington/02/2019 Victoria 3.9 ＞1,000 47.9 6.6
斑塊減少檢定 (PRA) 。
將範圍從0.3至100 nM之測試物品與病毒一起在室溫(RT)下於PBS中含有0.28%牛血清白蛋白及Ca2+ /mg2+ 之緩衝液中預先培育30分鐘。用PBS洗滌24孔板中之匯合之Madin Darby犬腎(MDCK)細胞單層一次。培育測試物品及病毒後，將兩者都添加至MDCK細胞中。選擇每種藥物-病毒組合之MOI以靶向PBS對照孔中之30個斑塊。1小時後移除病毒及測試物品，並將感染之細胞在35℃下於測試物品存在之情況下培育48小時，所述測試物品於1.25%Avicel、DMEM、0.01%DEAE-葡聚糖及2 µg/mL TPCK胰蛋白酶之混合物中稀釋。48小時後，移除Avicel混合物，將細胞用多聚甲醛固定並用1%結晶紫染色以對斑塊計數。使用非線性迴歸分析(劑量反應(抑制))，使用GraphPad Prism版本8計算EC50 。
與奧司他韋、紮那米韋或巴洛沙韋相比，結合物45a之針對北半球流感疫苗毒株2020-21疫苗毒株之PRA之效能(EC50 )提高(表218)。 表218：結合物45a在針對北半球流感疫苗毒株2020-21疫苗毒株之斑塊減少檢定(PRA)中之活性(EC50 )
流感病毒株 亞型/ 譜系 結合物45a [nM] 奧司他韋[nM] 紮那米韋[nM] 巴洛沙韋[nM]
A/Hawaii/70/2019 H1N1pdm09 0.14 7.08 3.69 10.3
B/Phuket/3073/2013 Yamagata 2.61 28.5 13.9 30.96
B/Washington/02/2019 Victoria 7.46 28.72 9.77 18.27
細胞病理效應 (CPE) 。
將96孔板中之匯合MDCK Siat1細胞單層與濃度為0.01-10,000 nM範圍內之測試物品一起培育。在室溫下培育1小時後，以MOI 0.01加入流感病毒。在室溫下再培育1小時後，將板在37℃，5% CO2 下培育3天(對於A型流感)或5天(對於B型流感)。藉由讀取595 nm處之吸光度，藉由結晶紫染色確定CPE。使用非線性迴歸分析(劑量反應(抑制))，使用GraphPad Prism版本8計算EC50 。
與奧司他韋、紮那米韋或巴洛沙韋相比，結合物45a之針對北半球流感疫苗毒株2020-21疫苗毒株之PRA之效能(EC50 )增加(表219)。 表219：結合物45a在針對北半球流感疫苗毒株2020-21之細胞病理效應(CPE)檢定中之活性(EC50 )
流感病毒株 亞型/ 譜系 結合物45a [nM] 奧司他韋[nM] 紮那米韋[nM] 巴洛沙韋[nM]
A/Hawaii/70/2019 H1N1pdm09 1.65 326.6 686.2 11.1
A/Hong Kong/2671/2019 H3N2 0.38 7.7 170 1
B/Phuket/3073/2013 Yamagata 0.33 27.6 5.2 10.01
B/Washington/02/2019 Victoria 1.06 1028 1.93 9.98
圖1係描繪例如藉助於連接體使神經胺糖酸酶抑制劑單體或二聚體結合於Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽之例示性方法之圖像。 圖2顯示由具有SEQ ID NO: 1之序列的Fc域單體形成之Fc域之非還原及還原SDS-PAGE及示意圖。 圖3顯示由具有SEQ ID NO: 3之序列的Fc域單體形成之Fc域之非還原及還原SDS-PAGE及示意圖。 圖4顯示由具有SEQ ID NO: 5之序列的Fc域單體形成之Fc域之非還原及還原SDS-PAGE及示意圖。 圖5顯示由具有SEQ ID NO: 7之序列的Fc域單體形成之Fc域之非還原及還原SDS-PAGE及示意圖。 圖6顯示由具有SEQ ID NO: 9之序列的Fc域單體形成之Fc域之非還原及還原SDS-PAGE及示意圖。 圖7顯示由具有SEQ ID NO: 12之序列的Fc域單體形成之Fc域之非還原及還原SDS-PAGE及示意圖。 圖8顯示由具有SEQ ID NO: 14之序列的Fc域單體形成之Fc域之非還原及還原SDS-PAGE及示意圖。 圖9顯示結合物1之非還原SDS-PAGE。 圖10顯示結合物2之非還原SDS-PAGE。 圖11顯示結合物3之非還原SDS-PAGE。 圖12顯示結合物4之非還原SDS-PAGE。 圖13顯示結合物5之非還原SDS-PAGE。 圖14顯示結合物6之非還原SDS-PAGE。 圖15係顯示H1N1神經胺糖酸酶抑制分析中針對Int-2及結合物1之IC50值的圖。 圖16係顯示H1N1神經胺糖酸酶抑制分析中針對結合物1-6之IC50值的圖。 圖17係顯示H3N2神經胺糖酸酶抑制分析中針對結合物1-6之IC50值的圖。 圖18A-18C係一系列圖，其顯示經結合物3 (圖18A)、結合物4 (圖18B)或結合物6 (圖18C)治療之A549細胞的細胞生存力。 圖19A-19E係一系列圖，其顯示結合物3抑制人類上皮細胞中之致病性流感病毒株A/WSN/33 H1N1 (圖19A)、A/Wyoming/3/03 H3N2 (圖19B)、A/California/04/09 H1N1 pdm (圖19C)、A/Vietnam/1203/04 H5N1 HALo (圖19D)或B/Lee/40 Victoria (圖19E)之生長的能力。 圖20A-20E係一系列圖，其顯示結合物4抑制人類上皮細胞中之致病性流感病毒株A/WSN/33 H1N1 (圖20A)、A/Wyoming/3/03 H3N2 (圖20B)、A/California/04/09 H1N1 pdm (圖20C)、A/Vietnam/1203/04 H5N1 HALo (圖20D)或B/Lee/40 Victoria (圖20E)之生長的能力。 圖21A-21E係一系列圖，其顯示結合物6抑制人類上皮細胞中之致病性流感病毒株A/WSN/33 H1N1 (圖21A)、A/Wyoming/3/03 H3N2 (圖21B)、A/California/04/09 H1N1 pdm (圖21C)、A/Vietnam/1203/04 H5N1 HALo (圖21D)或B/Lee/40 Victoria (圖21E)之生長的能力。 圖22A-22E係一系列圖，其顯示與奧司他韋相比，結合物6抑制人類上皮細胞中之致病性流感病毒株A/WSN/33 H1N1 (圖22A)、A/Wyoming/3/03 H3N2 (圖22B)、A/California/04/09 H1N1 pdm (圖22C)、B/Lee/40 Victoria (圖22D)或A/Vietnam/1203/04 (圖22E)之生長的能力。 圖23係顯示與單獨Fc (hIgG1)相比結合物6之相對小鼠血清濃度的圖。 圖24係顯示在致死性小鼠流感模型中結合物6對小鼠重量之影響的圖。該研究如實例29所述來執行。 圖25係顯示在致死性小鼠流感模型中結合物6對存活率之影響的圖。該研究如實例29所述來執行。 圖26係顯示顯示在致死性小鼠流感模型中結合物6對小鼠重量之影響的圖。該研究如實例30所述來執行。 圖27係顯示在致死性小鼠流感模型中結合物6對存活率之影響的圖。該研究如實例30所述來執行。 圖28係描繪例如藉助於連接體使神經胺糖酸酶抑制劑單體或二聚體結合於Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽，藉由肟結合於胺基酸殘基(例如，表面暴露離胺酸之氮原子)之方法之圖像。 圖29係描繪例如藉助於連接體使神經胺糖酸酶抑制劑單體或二聚體結合於Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽，藉由硫醚結合於胺基酸殘基(例如，表面暴露離胺酸之氮原子)之方法之圖像。 圖30係描繪例如藉助於連接體使神經胺糖酸酶抑制劑單體或二聚體結合於Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽，藉由再橋接半胱胺酸結合，例如再橋接半胱胺酸結合於Fc域單體或Fc域中之兩個鉸鏈半胱胺酸的一對硫原子之方法之圖像。 圖31A-31F係一系列圖，其顯示在致死性小鼠流感模型中經結合物6治療之小鼠之存活率。小鼠經奧司他韋(TamifluTM )對照物，20 mg/kg，每天2次，感染後8小時開始(圖31A)；結合物6，50 mg/kg，在感染之前28天1劑(圖31B)；結合物6，10 mg/kg，在感染之前28天1劑(圖31C)；結合物6，5 mg/kg，在感染之前28天1劑(圖31D)；結合物6，2.5 mg/kg，在感染之前28天1劑(圖31E)；或結合物6，1.25 mg/kg，在感染之前28天1劑(圖31F)治療。此研究如實例33所述來執行。 圖32A-32F係一系列圖，其顯示顯示如與奧司他韋(TamifluTM )相比，結合物6延伸治療窗，如藉由致死性小鼠流感模型中之存活率所測定。小鼠經媒劑(PBS)，單獨Fc 10 mpk，或結合物6，在感染之前4小時(圖32A)；結合物6或奧司他韋(TamifluTM )，感染後8小時(圖32B)；結合物6或奧司他韋(TamifluTM )，感染後24小時(圖32C)；結合物6或奧司他韋(TamifluTM )，感染後48小時(圖32D)；結合物6或奧司他韋(TamifluTM )，感染後72小時(圖32E)；或結合物6或奧司他韋(TamifluTM )，感染後96小時(圖32F)治療。該研究如實例34所述來執行。 圖33係顯示在14天大鼠劑量範圍測量儀毒性研究中在投與結合物6之後未觀察到體重增加之顯著效應的圖。該研究如實例35所述來執行。 圖34A-34D係一系列圖，其顯示顯示如與奧司他韋(TamifluTM )相比，結合物6延伸治療窗，如藉由致死性小鼠流感模型中之存活率所測定。小鼠經奧司他韋(TamifluTM )對照物，20 mg/kg，每天2次，感染後8小時開始(圖34A)；結合物6，10 mg/kg，在感染之前4小時1劑(圖34B)；結合物6，2 mg/kg，在感染之前4小時1劑(圖34C)；或結合物6，0.4 mg/kg，在感染之前4天1劑(圖34D)治療。該研究如實例37所述來執行。 圖35係顯示在致死性小鼠流感模型中結合物6對小鼠重量之影響的圖。該研究如實例37所述來執行。 圖36係顯示在IV投與結合物6之後之7天大鼠藥物動力學研究的圖。該研究如實例38所述來執行。 圖37係顯示在IV投與結合物6之後之14天大鼠藥物動力學研究的圖。該研究如實例39所述來執行。 圖38係顯示比較IV與SC投與結合物6之28天大鼠藥物動力學研究的圖。該研究如實例40所述來執行。 圖39係顯示在IV投與結合物6之後之28天非人類靈長類動物藥物動力學研究的圖。該研究如實例41所述來執行。 圖40係顯示在IV投與結合物6之後之小鼠肺分佈藥物動力學研究的圖。該研究如實例42所述來執行。 圖41係顯示比較IV、SC及IM投與結合物6之5天小鼠藥物動力學研究的圖。該研究如實例43所述來執行。 圖42顯示結合物8之非還原SDS-PAGE。 圖43顯示結合物6之結構。 圖44係顯示24小時活體外小鼠血漿穩定性研究之圖，該研究比較與對照物及純化合物相比在37℃下培育持續24 h之結合物6。 圖45係顯示24小時活體外人類血漿穩定性研究之圖，該研究比較與對照物及純化合物相比在37℃下培育持續24 h之結合物6。 圖46係顯示24小時小鼠肝微粒體穩定性研究之圖，該研究比較在37℃下在小鼠肝微粒體細胞及作為對照物之經熱滅活小鼠肝微粒體細胞中培育持續24 h之結合物6。 圖47係顯示24小時人類肝微粒體穩定性研究之圖，該研究比較在37℃下在人類肝微粒體細胞及作為對照物之經熱滅活小鼠肝微粒體細胞中培育持續24 h之結合物6。 圖48係顯示病毒攻擊後經15天小鼠之%體重改變的圖。該研究如實例66所述來執行。 圖49係顯示病毒攻擊後經15天小鼠之存活率%的圖。該研究如實例66所述來執行。 圖50係顯示與hIgG1 Fc (WT)及hIgG1 Fc (N297A)相比結合物6及結合物12與Fcγ受體IIIA的結合之圖。該研究如實例67所述來執行。 圖51係顯示結合物6及結合物與Fcγ受體IIIA的結合之圖。該研究如實例67所述來執行。 圖52係顯示在IV投與結合物6之後之7天非人類靈長類動物毒物動力學研究的圖。該研究如實例68所述來執行。 圖53係顯示比較IV與SC投與結合物6之28天非人類靈長類動物藥物動力學研究的圖。該研究如實例68所述來執行。 圖54顯示結合物12之非還原SDS-PAGE。 圖55顯示具有不同藥物:抗體(DAR)比率值之結合物13 (結合物13a、結合物13b、結合物13c、結合物13d、結合物13e、結合物13f及結合物13g)之非還原SDS-PAGE。 圖56係顯示病毒攻擊後經35天免疫受損小鼠之存活率%的圖。0.3 mg/kg結合物6治療組保持100%存活率，但在該圖中為清晰起見略有偏移。該研究如實例95所述來執行 圖57係顯示病毒攻擊後經35天免疫受損小鼠之%體重改變的圖。該研究如實例95所述來執行。 圖58係顯示結合物6之投與在經流感A (H1N1)感染之小鼠模型的肺中引起劑量依賴性病毒清除且此病毒清除大於PBS對照物、單獨Fc對照物或奧司他韋對照物之圖。此研究如實例96所述來執行。 圖59係顯示結合物6之投與在經流感A (H1N1)感染之小鼠模型的肺中引起發炎細胞因子之劑量依賴性減少的圖。此研究如實例97所述來執行。 圖60係顯示結合物6在BALB/c SCID (免疫受損)小鼠及CD-1小鼠(免疫勝任)中之藥物動力學的圖。此研究如實例98所述來執行。 圖61係描繪結合物33之圖像。 圖62A-62B係顯示鼻內經小鼠適應性流感A.PR/8/1934 (H1N1)攻擊(3x LD95 )之BALB/c小鼠之體重改變(%)的圖。此研究如實例133所述來執行。 圖63A係顯示感染後第4天之病毒負荷之圖。此研究如實例133所述來執行。 圖63B係顯示感染後第4天之病毒負荷之log減少的圖。此研究如實例133所述來執行。 圖64A係顯示與PBS對照物或單獨Fc對照物相比，結合物33之投與在經流感A (H1N1)感染之小鼠模型中引起病毒負荷之劑量依賴性減少的圖。此研究如實例133所述來執行。 圖64B係顯示感染後第4天之病毒負荷之log減少的圖。此研究如實例133所述來執行。 圖65A-65E係一系列條形圖，其顯示結合物33之投與引起TNF-α (圖65A)、IL-6 (圖65B)、INF-γ (圖65C)、MCP-1 (圖65D)及MIP-1α (圖65E)之細胞因子水準的劑量依賴性倍數減少。此研究如實例133所述來執行。 圖66係層析圖，其顯示在37℃及60℃下培育第7天與Int-4相比Int-80之穩定性。此研究如實例142所述來執行。 圖67係顯示在結合物6、奧司他韋、巴洛沙韋或PBS對照物存在下A549細胞中之A/CA/09 pdm之連續繼代的圖，以評估在病毒抑制劑之選擇性壓力下開發耐藥性突變型病毒株之潛力。此研究如實例147所述來執行。 圖68係顯示在結合物6、結合物33、奧司他韋、巴洛沙韋或PBS對照物存在下MDCK細胞中之A/WSN/1933之連續繼代的圖，以評估在病毒抑制劑之選擇性壓力下開發耐藥性突變型病毒株之潛力。此研究如實例147所述來執行。 圖69係顯示結合物6針對流感A H1N1之ADCC之MOI依賴性增加的圖。此研究如實例152所描述來執行。 圖70係顯示在MOI為1時，結合物6針對A/PR/8/1934流感病毒(H1N1)之ADCC劑量依賴性增加之圖。此研究如實例152所描述來執行。 圖71A-71C係顯示結合物33針對流感A/PR/8/1934(H1N1，圖71A)、流感A/CA/07/2009(H1N1)pdm(圖71B)及流感A/HK/1/1968(H3N2，圖71C)之MOI依賴性增加之圖。此研究如實例152所描述來執行。 圖72係顯示結合物33針對流感B/Malaysia/2506/2004(Victoria)之ADCC中MOI依賴性增加之圖。此研究如實例152所描述來執行。 圖73A-73B係顯示在MOI為1(圖73A)及MOI為10(圖73B)時，結合物33針對流感A/PR/8/1934之ADCC之劑量依賴性增加之圖。此研究如實例152所描述來執行。 圖74係顯示對照全長單株抗體Gedivumab (Genentech)針對流感A/PR/8/1934(H1N1)之ADCC之MOI依賴性增加之圖。此研究如實例152所描述來執行。 圖75A-75B係顯示MOI為1(圖75A)及MOI為10(圖75B)時，對照全長單株抗體Gedivumab (Genentech)針對A/PR/8/1934流感之ADCC之劑量依賴性增加之圖。此研究如實例152所描述來執行。 圖76係顯示結合物6針對流感A H1N1之ADCP之MOI依賴性增加之圖。此研究如實例153所描述來執行。 圖77A-77B係顯示在MOI為1(圖77A)及MOI為10(圖77B)時，結合物6針對流感A/PR/8/1934(H1N1)之ADCP之劑量依賴性增加之圖。此研究如實例153所描述來執行。 圖78A-78C係顯示結合物33針對流感A/PR/8/1934(H1N1，圖78A)、流感A/CA/07/2009(H1N1)pdm(圖78B)及流感A/HK/1/1968(H3N2，圖78C)之MOI依賴性增加之圖。此研究如實例153所描述來執行。 圖79係顯示結合物33針對流感B/Malaysia/2506/2004(Victoria)之ADCP之MOI依賴性增加之圖。此研究如實例153所描述來執行。 圖80A-80B係顯示在MOI為1(圖80A)及MOI為10(圖80B)時，結合物33針對流感A/PR/8/1934之ADCP之劑量依賴性增加之圖。此研究如實例153所描述來執行。 圖81係顯示對照全長單株抗體Gedivumab(Genentech)針對流感A/PR/8/1934(H1N1)之ADCP之MOI依賴性增加之圖。此研究如實例153所描述來執行。 圖82A-82B係顯示MOI為1(圖82A)及MOI為10(圖82B)時，對照全長單株抗體Gedivumab(Genentech)針對流感A/PR/8/1934之ADCP之劑量依賴性增加之圖。此研究如實例153所描述來執行。 圖83係顯示在結合物45b、奧司他韋、巴洛沙韋或PBS對照物存在下MDCK細胞中之A/Ca/07/2009 (H1N1)pdm之連續繼代的圖，以評估在病毒抑制劑之選擇性壓力下開發耐藥性突變型病毒株之潛力。此研究如實例165所描述來執行。 圖84係顯示在比較IV、SC及IM投與之小鼠PK研究中，結合物45b之血漿水準之圖。藉由NA捕獲確定血漿濃度水準。此研究如實例173所描述來執行。 圖85係顯示在比較IV、SV及IM投與之小鼠PK研究中，結合物45b之血漿水準之圖。血漿濃度水準藉由hIgG Fc捕獲來測定。此研究如實例173所描述來執行。 圖86係顯示藉由NA捕獲確定之結合物45b之血漿水準之劑量線性之圖。此研究如實例174所描述來執行。 圖87係顯示藉由hIgG捕獲確定之結合物45b之血漿水準之劑量線性之圖。此研究如實例174所描述來執行。 圖88係顯示在大鼠PK研究中在50 mg/kg及5 mg/kg SC給藥下結合物45b之血漿濃度之圖。藉由使用神經胺糖酸酶包被之板之ELISA測定血漿濃度。此研究如實例175所描述來執行。 圖89係顯示比較5 mg/kg結合物45b之IV及SV投與之血漿結合物45b濃度之圖。藉由使用神經胺糖酸酶包被之板之ELISA測定血漿濃度。此研究如實例175所描述來執行。 圖90係顯示非人靈長類動物、食蟹獼猴中結合物45b之血漿濃度之圖。藉由使用神經胺糖酸酶包被之板之ELISA測定血漿濃度。此研究如實例176所描述來執行。 圖91係顯示非人靈長類動物、食蟹獼猴中結合物45b之血漿濃度之圖。藉由hIgG Fc捕獲來測定血漿濃度。此研究如實例176所描述來執行。 圖92係顯示在非人靈長類動物、食蟹獼猴中自第1天至第14天之結合物45b之血漿濃度之圖。藉由神經胺糖酸酶(NA)捕獲及Fc捕獲來測定血漿濃度。此研究如實例176所描述來執行。 圖93係顯示在雪貂PK研究中藉由神經胺糖酸酶(NA)捕獲及Fc捕獲測定之結合物45b(3 mpk IV)之血漿水準之圖。此研究如實例183所描述來執行。 圖94係顯示雪貂PK研究中藉由H1N1神經胺糖酸酶(NA)捕獲測定之結合物45b之鼻洗液水準之圖。此研究如實例186所描述來執行。 圖95係顯示雪貂PK研究中藉由hIgG Fc捕獲測定之結合物45b之鼻洗液水準之圖。此研究如實例186所描述來執行。 圖96係顯示與奧司他韋(10 mg/kg，bid x5)或媒劑相比，投與結合物45b(0.3 mg/kg，單次)後之臨床觀察結果之比較之圖。此研究如實例182所描述來執行。 圖97係顯示在非人靈長類動物PK研究中與結合物46(2 mpk IV)相比，藉由Fc捕獲測定之結合物45b(2 mpk IV)之血漿水準之圖。此研究如實例189所描述來執行。 圖98係顯示小鼠中與結合物45b之上皮襯裡液(ELF)水準相比，結合物45b之血漿濃度水準之圖。此研究如實例191所描述來執行。 圖99係顯示SCID小鼠PK研究中藉由H1N1 Fc捕獲測定之結合物45b之血漿水準之圖。此研究如實例192所描述來執行。 圖100係顯示SCID小鼠PK研究中藉由神經胺糖酸酶(NA)捕獲測定之結合物45b之血漿水準之圖。此研究如實例192所描述來執行。 圖101係顯示在小鼠PK研究中與結合物46相比，藉由神經胺糖酸酶(NA)捕獲測定之結合物45b之血漿水準之圖。此研究如實例193所描述來執行。 圖102係描繪結合物45及結合物46之影像。 圖103係描繪疊氮基官能化之Fc域單體或Fc域與預結合中間體(Int)之示例性點擊化學結合之影像。 圖104係描繪如實例200中所述之耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)繼發性細菌感染模型之實驗程序之影像。 圖105A-105B係顯示用結合物45b治療後繼發性感染小鼠模型之存活率百分比(圖105A)及CFU/g肺(圖105B)之圖。此研究如實例200所描述來執行。 圖106係描繪如實例200中所述之肺炎鏈球菌繼發性細菌感染模型之實驗程序之影像。 圖107係描繪在用結合物45b治療後在肺炎鏈球菌之繼發性感染模型中小鼠之存活率百分比之圖。此研究如實例200所描述來執行。 圖108A-108B係顯示在用流感A/Vietnam/1203/2004(H5N1)進行病毒攻擊前7天單次用結合物45a治療後小鼠之存活率(圖108A)及平均體重(圖108B)之圖。在攻擊性感染及用結合物45a治療後，對於10 mg/kg劑量觀察到100%保護，對於0.3及3.0 mg/kg劑量觀察到80%保護，以及對於1 mg/kg劑量觀察到70%保護(圖108A)。安慰劑組之30%存活率係異常的，因此1 mg/kg之劑量不能提供明顯保護作用。另外，所有劑量均提供了顯著保護以防體重減輕(圖108B)。(*P＜0.05, **P＜0.01, ****P＜0.0001)。此研究如實例201所描述來執行。 圖109A-109B係顯示在用流感A/Vietnam/1203/2004(H5N1)病毒攻擊後4小時單次使用結合物45a治療後小鼠之存活率(圖109A)及平均體重(圖109B)之圖。在攻擊感染及用結合物45a治療後，對於1、3及10 mg/kg劑量觀察到100%保護，且對於0.3 mg/kg劑量觀察到70%保護(圖109A)。安慰劑組之30%存活率係異常的，因此0.3 mg/kg之劑量不能提供明顯保護作用。另外，所有劑量皆提供了顯著保護以防止體重減輕(圖109B)。(*P＜0.05, **P＜0.01, ****P＜0.0001)。此研究如實例201所描述來執行。 圖110A係描繪與A/California/04/2009 H1N1神經胺糖酸酶(NA)(PDB代碼3TI5)複合之四聚體紮那米韋(以球棒模型顯示)之晶體結構示意圖之影像。顯示了四聚體內相鄰NA活性位點之間之線性距離。突出顯示選擇用於連接至Fc載體(經由NHS酯)之紮那米韋上之C7位置。紮那米韋上之C7暴露於溶劑中，且在空間上不受阻礙，可與C7結合，而對結合親和力之影響最小。此研究如實例203所描述來執行。 圖110B係經修飾以顯示出在結合物45b中使用之僅Fc構築體邊界之全長hIgG1(PDB代碼1HZH)之結構之半透明分子表面示意圖的影像。以綠色示出在結合物45b中優先結合之離胺酸之位置。結合物45b係紮那米韋二聚體之多價結合物(Int-83，結構如右側所示)，其與N端延伸之hIgG1 Fc上之離胺酸穩定結合，平均藥物-抗體比率(DAR)為4.5:1。Fc域表面之結合離胺酸之空間排列以及PEG連接體之長度及可撓性導致在結合物45b上形成Int.83二聚體群集，其中紮那米韋二聚體之間存在足夠間隔(＞ 90 A)，以允許單個結合物45b分子同時接合於一個NA四聚體內、同一病毒顆粒上之相鄰NA四聚體之間或不同病毒顆粒上之NA四聚體之間的多個活性位點。此研究如實例203所描述來執行。 圖111A-111J係顯示結合物45b與Fcγ受體結合並觸發ADCC之圖。圖111A-111D顯示結合物45b結合人Fcγ RI(圖111A)、RIIa(圖111B)、RIIb(圖111C)及RIIIa(圖111D)，如藉由ELISA測定的。圖111E-111H顯示了結合物45b與鼠類Fcγ RI(圖111E)、RIII(圖111F)、RIIb(圖111G)及RIV(圖111H)結合。圖111I-111J顯示使用報道細胞，結合物45b以劑量(圖111I)及MOI(圖111J)依賴性誘導抗體依賴性細胞毒性。此研究如實例203所描述來執行。 圖112A-112M係顯示結合物45b在Balb/C小鼠中抗流感致死性攻擊之功效之圖。圖112A係顯示在感染後2小時以0.01-1 mg/kg之範圍SC給藥之結合物45b針對流感A/PR/8/1934(H1N1)致死性攻擊的在存活率方面之劑量反應的圖。圖112B-112H係顯示SC投與之最小保護劑量之結合物45b針對流感A/CA/07/2009(H1N1)pdm(圖112B)、A/WSN/1933(H1N1)(圖112C)、A/CA/12/2012(H1N1)pdm09(圖112D)、A/Texas/23/2012(H1N1)pdm09 H275Y(圖112E)、A/Hong Kong/1/1968(H3N2)(圖112F)、B/Florida/4/2006(Yamagata)(圖112G)及B/Malaysia/2506/2004(Victoria)(圖112H)之功效之圖。圖112I係顯示結合物45針對BSL-3病毒株A/Vietnam/1203/2005(H5N1)之功效之圖。圖112J係顯示感染後第4天肺中病毒負荷之條形圖。圖112K-112L係描繪IL-6(圖112K)及MCP-1(圖112L)之肺細胞因子水準之圖。圖112M係顯示SC投與之結合物45b對流感A/PR/8/1934(H1N1)之最小保護劑量之圖。此研究如實例203所描述來執行。 圖113A-113J係藉由體重變化百分數顯示結合物45b在Balb/C小鼠中抵抗流感致死性攻擊之功效之圖。圖113A係顯示在感染後2小時以0.01-1 mg/kg之範圍SC給藥之結合物45b針對流感A/PR/8/1934(H1N1)致死性攻擊的劑量反應的圖。圖113B-113H顯示在針對流感A/CA/07/2009(H1N1)pdm(圖113B)、A/WSN/1933(H1N1)(圖113C)、A/CA/12/2012(H1N1)pdm09(圖113D)、A/Texas/23/2012(H1N1)pdm09 H275Y(圖113E)、A/Hong Kong/1/1968(H3N2)(圖113F)、B/Florida/4/2006(Yamagata)(圖113G)及B/Malaysia/2506/2004(Victoria)(圖113H) SC投與最小保護劑量之結合物45b之後的體重變化百分比。圖113I係顯示結合物45b針對BSL-3病毒株A/Vietnam/1203/2005(H5N1)之功效之圖。圖113J係顯示當針對流感A/PR/8/1934(H1N1) SC投與最小保護劑量之結合物45b時體重變化之圖。此研究如實例203所描述來執行。 圖114A-114B係一對圖，其顯示在A/PR/8/1934(H1N1)致死小鼠模型中，奧司他韋在5 mg/kg(BID x 5天)之人當量劑量下或在50 mg/kg(BID x 5天)之10倍人當量劑量下在存活率(圖114A)及體重變化(圖114B)方面之功效。 圖115A-115C係顯示在用A/PR/8/1934(H1N1)致死性攻擊之感染後第4天NF-α(圖115A)、KC(圖115B)、MIP-1α(圖115C)之肺細胞因子水準的條形圖。 圖116A-116B係描繪了在SC、IM或IV投與單一劑量後結合物45b針對流感A/CA/07/2009(H1N1)pdm之在存活率百分比(圖111A)及體重變化百分比(圖116B)方面之功效之圖。 圖116C-116D係描繪在小鼠中SC、IM或IV投與單一劑量後，在168小時內藉由NA捕獲(圖116C)或Fc捕獲(圖116D)測定之結合物45b之血漿水準之圖。 圖117A-117C係顯示與人(圖117A)、食蟹獼猴(圖117B)及小鼠(圖117C)之hIgG1 Fc或全長IgG1同型對照相當之FcRn結合模式之圖，在pH 5.8下具有更強之結合並且在pH 7.4下結合降低。 圖118A-118F係描繪結合物45b之長作用持續時間之圖。圖118A係顯示在小鼠中SC投與後1-100 mg/kg之結合物45b劑量反應之血漿水準之圖。圖118B係描繪在小鼠之血漿、ELF及肺中SC給藥後結合物45b之水準之圖。圖118C-F顯示在致死攻擊前28天給藥之結合物45b提供之針對流感A/CA/07/2009(H1N1)pdm(圖118C)、A/HK/1/1968(H3N2)(圖118D)、B/Malaysia/2506/2004(Victoria)(圖118E)及B/Florida/4/2006(Yamagata)(圖118F)在存活率百分比方面之保護。 圖119係描繪較低結合物45a劑量組之存活率曲線之圖。此研究如實例209所描述來執行。 圖120係描述對照及結合物45a在0.3及0.03 mg/kg下之Kaplan-Meier存活率曲線之圖。此研究如實例210所描述來執行。

Claims (308)

  1. 一種由式(D-I)、(M-I)、(1)或(2)中任一者描述之結合物，
    Figure 03_image001
    、
    Figure 03_image003
    、
    Figure 03_image005
    或
    Figure 03_image007
    ; (D-I)            (M-I)                 (1)                    (2) 其中各A1 及各A2 係獨立地由式(A-I)-(A-XII)描述：
    Figure 03_image009
    、
    Figure 03_image011
    、
    Figure 03_image013
    、
    Figure 03_image015
    、
    Figure 03_image017
    、 (A-I)                (A-II)                (A-III)                   (A-IV)                (A-V)
    Figure 03_image019
    、
    Figure 03_image021
    、
    Figure 03_image023
    、
    Figure 03_image025
    、 (A-VI)              (A-VII)             (A-VIII)               (A-IX)
    Figure 03_image027
    、
    Figure 03_image029
    、
    Figure 03_image031
    ; (A-X)                (A-XI)                         (A-XII) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ； R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br； R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H； R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ； X係選自-O-及-S-； Y係選自：
    Figure 03_image2071
    R6 係選自
    Figure 03_image035
    、
    Figure 03_image037
    、
    Figure 03_image039
    、
    Figure 03_image041
    、
    Figure 03_image043
    、
    Figure 03_image045
    、
    Figure 03_image047
    、
    Figure 03_image049
    、
    Figure 03_image051
    、
    Figure 03_image053
    、
    Figure 03_image055
    、
    Figure 03_image057
    、
    Figure 03_image059
    、
    Figure 03_image061
    、
    Figure 03_image063
    、
    Figure 03_image065
    、
    Figure 03_image067
    、
    Figure 03_image069
    、
    Figure 03_image071
    、
    Figure 03_image073
    、
    Figure 03_image075
    、
    Figure 03_image077
    、
    Figure 03_image079
    、
    Figure 03_image081
    、
    Figure 03_image083
    、
    Figure 03_image085
    、
    Figure 03_image087
    、
    Figure 03_image089
    、
    Figure 03_image091
    、
    Figure 03_image093
    、
    Figure 03_image095
    及
    Figure 03_image097
    ； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； n為1或2； 各E包含Fc域單體、白蛋白、白蛋白結合肽或Fc結合肽； L係連接體，該連接體共價附接至E且附接至各A1 或各A1 及A2 之各Y； T為1至20之整數，且 式(D-I)、(M-I)、(1)或(2)中之各波浪線指示L共價附接至各E； 或其醫藥學上可接受之鹽。
  2. 如請求項1之結合物，其中該結合物係由式(D-I)描述：
    Figure 03_image001
    (D-I) 其中各A1 及各A2 係獨立地選自式(A-I)-(A-XII)中任一者； 各E包含Fc域單體、白蛋白、白蛋白結合肽或Fc結合肽； n為1或2； T為1至20之整數；且 連接至E之波浪線指示各A1 -L-A2 共價附接至E， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  3. 如請求項2之結合物，其中各A1 及各A2 係獨立地選自式(A-I)、(A-II)、(A-VI)或(A-VII)中任一者； 各E包含Fc域單體、白蛋白、白蛋白結合肽或Fc結合肽； n為1或2； T為1至20之整數；且 連接至E之波浪線指示各A1 -L-A2 共價附接至E， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  4. 如請求項3之結合物，其中各A1 及各A2 由式(A-I)描述或其醫藥學上可接受之鹽。
  5. 如請求項1至4中任一項之結合物，其中該結合物係由式(D-II)描述：
    Figure 03_image225
    (D-II) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  6. 如請求項5之結合物，其中該結合物係由式(D-II-1)描述：
    Figure 03_image227
    (D-II-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  7. 如請求項6之結合物，其中該結合物係由式(D-II-2)描述：
    Figure 03_image229
    (D-II-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  8. 如請求項7之結合物，其中該結合物係由式(D-II-3)描述：
    Figure 03_image231
    (D-II-3) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  9. 如請求項8之結合物，其中L’為氮原子。
  10. 如請求項9之結合物，其中該結合物具有選自以下之結構：
    Figure 03_image233
    、
    Figure 03_image2111
    或
    Figure 03_image2113
    。
  11. 如請求項6之結合物，其中該結合物係由式(D-II-4)描述：
    Figure 03_image239
    (D-II-4) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  12. 如請求項11之結合物，其中該結合物係由式(D-II-5)描述：
    Figure 03_image241
    (D-II-5) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  13. 如請求項12之結合物，其中L’為氮原子。
  14. 如請求項13之結合物，其中該結合物具有選自以下之結構：
    Figure 03_image243
    、
    Figure 03_image2118
    或
    Figure 03_image2120
    。
  15. 如請求項11之結合物，其中該結合物具有結構
    Figure 03_image291
    或其醫藥學上可接受之鹽。
  16. 如請求項6之結合物，其中該結合物係由式(D-II-6)描述：
    Figure 03_image257
    (D-II-6) 其中R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； 或其醫藥學上可接受之鹽。
  17. 如請求項16之結合物，其中R7 選自C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基。
  18. 如請求項16或17之結合物，其中R7 選自甲基、乙基、丙基或丁基。
  19. 如請求項16至18中任一項之結合物，其中該結合物係由式(D-II-7)描述：
    Figure 03_image259
    (D-II-7) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  20. 如請求項19之結合物，其中該結合物係由式(D-II-8)描述：
    Figure 03_image2125
    (D-II-8) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  21. 如請求項20之結合物，其中該結合物具有結構：
    Figure 03_image2127
    或
    Figure 03_image2129
    ， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  22. 如請求項21之結合物，其中該結合物係由以下描述
    Figure 03_image267
    ， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  23. 如請求項16至18中任一項之結合物，其中該結合物係由式(D-II-9)描述：
    Figure 03_image2132
    (D-II-9) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  24. 如請求項23之結合物，其中該結合物係由式(D-II-10)描述：
    Figure 03_image287
    (D-II-10) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  25. 如請求項24之結合物，其中該結合物具有結構
    Figure 03_image2135
    或其醫藥學上可接受之鹽。
  26. 如請求項2或3之結合物，其中該結合物係由式(D-III)描述：
    Figure 03_image293
    (D-III) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  27. 如請求項26之結合物，其中該結合物係由式(D-III-1)描述：
    Figure 03_image295
    (D-III-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  28. 如請求項27之結合物，其中該結合物係由式(D-III-2)描述：
    Figure 03_image297
    (D-III-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  29. 如請求項28之結合物，其中該結合物係由式(D-III-3)描述：
    Figure 03_image299
    (D-III-3) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  30. 如請求項27之結合物，其中該結合物係由式(D-III-4)描述：
    Figure 03_image301
    (D-III-4) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  31. 如請求項30之結合物，其中該結合物係由式(D-III-5)描述：
    Figure 03_image303
    (D-III-5) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  32. 如請求項27之結合物，其中該結合物係由式(D-III-6)描述：
    Figure 03_image305
    (D-III-6) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  33. 如請求項32之結合物，其中該結合物係由式(D-III-7)描述：
    Figure 03_image307
    (D-III-7) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  34. 如請求項27之結合物，其中該結合物係由式(D-III-8)描述：
    Figure 03_image309
    (D-III-8) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  35. 如請求項34之結合物，其中該結合物係由式(D-III-9)描述：
    Figure 03_image311
    (D-III-9) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  36. 如請求項2之結合物，其中該結合物係由式(D-IV)描述：
    Figure 03_image313
    (D-IV) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  37. 如請求項36之結合物，其中該結合物係由式(D-IV-1)描述：
    Figure 03_image315
    (D-IV-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  38. 如請求項37之結合物，其中該結合物係由式(D-IV-2)描述：
    Figure 03_image2149
    (D-IV-2) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  39. 如請求項2或3之結合物，其中該結合物係由式(D-V)描述：
    Figure 03_image319
    (D-V) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  40. 如請求項39之結合物，其中該結合物係由式(D-V-1)描述：
    Figure 03_image321
    (D-V-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  41. 如請求項40之結合物，其中該結合物係由式(D-V-2)描述：
    Figure 03_image323
    (D-V-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  42. 如請求項41之結合物，其中該結合物係由式(D-V-3)描述：
    Figure 03_image325
    (D-V-3) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  43. 如請求項42之結合物，其中L’為氮原子。
  44. 如請求項42之結合物，其中y1 及y2 各自為1，y1 及y2 各自為2，或y1 及y2 各自為3。
  45. 如請求項40之結合物，其中該結合物係由式(D-V-4)描述：
    Figure 03_image327
    (D-III-4) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  46. 如請求項45之結合物，其中該結合物係由式(D-V-5)描述：
    Figure 03_image329
    (D-V-5) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  47. 如請求項46之結合物，其中L'為氮原子。
  48. 如請求項46之結合物，其中y1 及y2 各自為1，y1 及y2 各自為2，或y1 及y2 各自為3。
  49. 如請求項39之結合物，其中該結合物係由式(D-V-6)描述：
    Figure 03_image331
    (D-V-6) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  50. 如請求項49之結合物，其中該結合物係由式(D-V-7)描述：
    Figure 03_image333
    (D-V-7) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  51. 如請求項50之結合物，其中該結合物係由式(D-V-8)描述：
    Figure 03_image335
    (D-V-8) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  52. 如請求項51之結合物，其中L'為氮原子。
  53. 如請求項51之結合物，其中y1 及y2 各自為1，y1 及y2 各自為2，或y1 及y2 各自為3。
  54. 如請求項49之結合物，其中該結合物係由式(D-V-9)描述：
    Figure 03_image337
    (D-V-9) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  55. 如請求項51之結合物，其中該結合物係由式(D-V-10)描述：
    Figure 03_image339
    (D-V-10) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  56. 如請求項55之結合物，其中L'為氮原子。
  57. 如請求項56之結合物，其中y1 及y2 各自為1，y1 及y2 各自為2，或y1 及y2 各自為3。
  58. 如請求項2或3之結合物，其中該結合物係由式(D-VI)描述：
    Figure 03_image341
    (D-VI) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  59. 如請求項58之結合物，其中該結合物係由式(D-VI-1)描述：
    Figure 03_image343
    (D-VI-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  60. 如請求項59之結合物，其中該結合物係由式(D-VI-2)描述：
    Figure 03_image345
    (D-VI-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  61. 如請求項60之結合物，其中該結合物係由式(D-VI-3)描述：
    Figure 03_image347
    (D-VI-3) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  62. 如請求項59之結合物，其中該結合物係由式(D-VI-4)描述：
    Figure 03_image349
    (D-VI-4) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  63. 如請求項62之結合物，其中該結合物係由式(D-VI-5)描述：
    Figure 03_image351
    (D-VI-5) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  64. 如請求項59之結合物，其中該結合物係由式(D-VI-6)描述：
    Figure 03_image353
    (D-VI-6) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  65. 如請求項64之結合物，其中該結合物係由式(D-VI-7)描述：
    Figure 03_image355
    (D-VI-7) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  66. 如請求項59之結合物，其中該結合物係由式(D-VI-8)描述：
    Figure 03_image357
    (D-VI-8) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  67. 如請求項66之結合物，其中該結合物係由式(D-VI-9)描述：
    Figure 03_image359
    (D-VI-9) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  68. 如請求項2或3之結合物，其中該結合物係由式(D-VII)描述：
    Figure 03_image361
    (D-VII) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  69. 如請求項39至68中任一項之結合物，其中R1 為-OH。
  70. 如請求項39至68中任一項之結合物，其中R1 為-NH2 。
  71. 如請求項39至68中任一項之結合物，其中R1 為-NHC(=NH)NH2 。
  72. 如請求項2之結合物，其中該結合物係由式(D-VIII)描述：
    Figure 03_image363
    (D-VIII) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  73. 如請求項72之結合物，其中該結合物係由式(D-VIII-1)描述：
    Figure 03_image365
    (D-VIII-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  74. 如請求項73之結合物，其中該結合物係由式(D-VIII-2)描述：
    Figure 03_image367
    (D-VIII-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  75. 如請求項74之結合物，其中該結合物係由式(D-VIII-3)描述：
    Figure 03_image369
    (D-VIII-3) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  76. 如請求項75之結合物，其中L’為氮原子。
  77. 如請求項75之結合物，其中該結合物具有選自以下之結構：
    Figure 03_image371
    、
    Figure 03_image373
    或
    Figure 03_image375
    。
  78. 如請求項73之結合物，其中該結合物係由式(D-VIII-4)描述：
    Figure 03_image377
    (D-VIII-4) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  79. 如請求項78之結合物，其中該結合物係由式(D-VIII-5)描述：
    Figure 03_image379
    (D-VIII-5) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  80. 如請求項79之結合物，其中L’為氮原子。
  81. 如請求項79之結合物，其中該結合物具有選自以下之結構：
    Figure 03_image381
    、
    Figure 03_image383
    或
    Figure 03_image385
    。
  82. 如請求項78之結合物，其中該結合物係由以下結構描述：
    Figure 03_image2185
    。
  83. 如請求項73之結合物，其中該結合物係由式(D-VIII-6)描述：
    Figure 03_image389
    (D-VIII-6) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  84. 如請求項83之結合物，其中該結合物係由式(D-VIII-7)描述：
    Figure 03_image391
    (D-VIII-7) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  85. 如請求項73之結合物，其中該結合物係由式(D-VIII-8)描述：
    Figure 03_image393
    (D-VIII-8) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  86. 如請求項85之結合物，其中該結合物係由式(D-VIII-9)描述：
    Figure 03_image395
    (D-VIII-9) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  87. 如請求項72之結合物，其中該結合物係由式(D-VIII-10)描述：
    Figure 03_image397
    (D-VIII-10) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  88. 如請求項87之結合物，其中該結合物係由式(D-VIII-11)描述：
    Figure 03_image399
    (D-VIII-11) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  89. 如請求項2之結合物，其中該結合物係由式(D-IX)描述：
    Figure 03_image401
    (D-IX) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  90. 如請求項89之結合物，其中該結合物係由式(D-IX-1)描述：
    Figure 03_image403
    (D-IX-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  91. 如請求項90之結合物，其中該結合物係由式(D-IX-2)描述：
    Figure 03_image405
    (D-IX-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  92. 如請求項90之結合物，其中該結合物係由式(D-IX-3)描述：
    Figure 03_image407
    (D-IX-3) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  93. 如請求項90之結合物，其中該結合物係由式(D-IX-4)描述：
    Figure 03_image409
    (D-IX-4) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  94. 如請求項90之結合物，其中該結合物係由式(D-IX-5)描述：
    Figure 03_image411
    (D-IX-5) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  95. 如請求項90之結合物，其中該結合物係由式(D-IX-6)描述：
    Figure 03_image413
    (D-IX-6) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  96. 如請求項2之結合物，其中該結合物係由式(D-X)描述：
    Figure 03_image2200
    (D-X) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  97. 如請求項96之結合物，其中該結合物係由式(D-X-1)描述：
    Figure 03_image2202
    (D-X-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  98. 如請求項97之結合物，其中該結合物係由式(D-X-2)描述：
    Figure 03_image2204
    (D-X-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  99. 如請求項97之結合物，其中該結合物係由式(D-X-3)描述：
    Figure 03_image2206
    (D-X-3) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  100. 如請求項1至99中任一項之結合物，其中L或L’包含一或多個視情況經取代C1-C20伸烷基、視情況經取代C1-C20伸雜烷基、視情況經取代C2-C20伸烯基、視情況經取代C2-C20伸雜烯基、視情況經取代C2-C20伸炔基、視情況經取代C2-C20伸雜炔基、視情況經取代C3-C20伸環烷基、視情況經取代C3-C20伸雜環烷基、視情況經取代C4-C20伸環烯基、視情況經取代C4-C20伸雜環烯基、視情況經取代C8-C20伸環炔基、視情況經取代C8-C20伸雜環炔基、視情況經取代C5-C15伸芳基、視情況經取代C2-C15伸雜芳基、O、S、NRi 、P、羰基、硫羰基、磺醯基、磷酸酯基、磷醯基或亞胺基， 其中Ri 為H、視情況經取代C1-C20烷基、視情況經取代C1-C20雜烷基、視情況經取代C2-C20烯基、視情況經取代C2-C20雜烯基、視情況經取代C2-C20炔基、視情況經取代C2-C20雜炔基、視情況經取代C3-C20環烷基、視情況經取代C3-C20雜環烷基、視情況經取代C4-C20環烯基、視情況經取代C4-C20雜環烯基、視情況經取代C8-C20環炔基、視情況經取代C8-C20雜環炔基、視情況經取代C5-C15芳基或視情況經取代C2-C15雜芳基。
  101. 如請求項100之結合物，其中L或L’之骨架係由一或多個視情況經取代C1-C20伸烷基、視情況經取代C1-C20伸雜烷基、視情況經取代C2-C20伸烯基、視情況經取代C2-C20伸雜烯基、視情況經取代C2-C20伸炔基、視情況經取代C2-C20伸雜炔基、視情況經取代C3-C20伸環烷基、視情況經取代C3-C20伸雜環烷基、視情況經取代C4-C20伸環烯基、視情況經取代C4-C20伸雜環烯基、視情況經取代C8-C20伸環炔基、視情況經取代C8-C20伸雜環炔基、視情況經取代C5-C15伸芳基、視情況經取代C2-C15伸雜芳基、O、S、NRi 、P、羰基、硫羰基、磺醯基、磷酸酯基、磷醯基或亞胺基組成， 其中Ri 為H、視情況經取代C1-C20烷基、視情況經取代C1-C20雜烷基、視情況經取代C2-C20烯基、視情況經取代C2-C20雜烯基、視情況經取代C2-C20炔基、視情況經取代C2-C20雜炔基、視情況經取代C3-C20環烷基、視情況經取代C3-C20雜環烷基、視情況經取代C4-C20環烯基、視情況經取代C4-C20雜環烯基、視情況經取代C8-C20環炔基、視情況經取代C8-C20雜環炔基、視情況經取代C5-C15芳基或視情況經取代C2-C15雜芳基。
  102. 如請求項100或101之結合物，其中L或L'經側氧基取代。
  103. 如請求項1至102中任一項之結合物，其中L或L'之主鏈包含不超過250個原子。
  104. 如請求項1至103中任一項之結合物，其中L或L'能夠形成醯胺、胺基甲酸酯、磺醯基或脲鍵鍵。
  105. 如請求項1至99中任一項之結合物，其中L或L'為鍵。
  106. 如請求項1至99中任一項之結合物，其中L或L'為原子。
  107. 如請求項1至106中任一項之結合物，其中各L係由式(D-L-I)描述：
    Figure 03_image423
    (D-L-I) 其中LA 係由式GA1 -(ZA1 )g1 -(YA1 )h1 -(ZA2 )i1 -(YA2 )j1 -(ZA3 )k1 -(YA3 )l1 - (ZA4 )m1 -(YA4 )n1 -(ZA5 )o1 -GA2 描述； LB 由式GB1 -(ZB1 )g2 -(YB1 )h2 -(ZB2 )i2 -(YB2 )j2 -(ZB3 )k2 -(YB3 )l2 -(ZB4 )m2 -(YB4 )n2 - (ZB5 )o2 -GB2 描述； LC 由式GC1 -(ZC1 )g3 -(YC1 )h3 -(ZC2 )i3 -(YC2 )j3 -(ZC3 )k3 -(YC3 )l3 -(ZC4 )m3 -(YC4 )n3 - (ZC5 )o3 -GC2 描述； GA1 為附接至Q之鍵； GA2 為附接至A1之鍵； GB1 為附接至Q之鍵； GB2 為附接至A2之鍵； GC1 為附接至Q之鍵； GC2 係附接至E之鍵或能夠與結合於E之官能基反應的官能基(例如，順丁烯二醯亞胺及半胱胺酸、胺及經活化羧酸、硫醇及順丁烯二醯亞胺、經活化磺酸及胺、異氰酸酯及胺、疊氮化物及炔以及烯烴及四嗪)； ZA1 、ZA2 、ZA3 、ZA4 、ZA5 、ZB1 、ZB2 、ZB3 、ZB4 、ZB5 、ZC1 、ZC2 、ZC3 、ZC4 及ZC5 各自獨立地為視情況經取代C1-C20伸烷基、視情況經取代C1-C20伸雜烷基、視情況經取代C2-C20伸烯基、視情況經取代C2-C20伸雜烯基、視情況經取代C2-C20伸炔基、視情況經取代C2-C20伸雜炔基、視情況經取代C3-C20伸環烷基、視情況經取代C3-C20伸雜環烷基、視情況經取代C4-C20伸環烯基、視情況經取代C4-C20伸雜環烯基、視情況經取代C8-C20伸環炔基、視情況經取代C8-C20伸雜環炔基、視情況經取代C5-C15伸芳基或視情況經取代C2-C15伸雜芳基； YA1 、YA2 、YA3 、YA4 、YB1 、YB2 、YB3 、YB4 、YC1 、YC2 、YC3 及YC4 各自獨立地為O、S、NRi 、P、羰基、硫羰基、磺醯基、磷酸酯基、磷醯基或亞胺基； Ri 為H、視情況經取代C1-C20烷基、視情況經取代C1-C20雜烷基、視情況經取代C2-C20烯基、視情況經取代C2-C20雜烯基、視情況經取代C2-C20炔基、視情況經取代C2-C20雜炔基、視情況經取代C3-C20環烷基、視情況經取代C3-C20雜環烷基、視情況經取代C4-C20環烯基、視情況經取代C4-C20雜環烯基、視情況經取代C8-C20環炔基、視情況經取代C8-C20雜環炔基、視情況經取代C5-C15芳基或視情況經取代C2-C15雜芳基； g1、h1、i1、j1、k1、l1、m1、n1、o1、g2、h2、i2、j2、k2、l2、m2、n2、o2、g3、h3、i3、j3、k3、l3、m3、n3及o3各自獨立地為0或1； Q為氮原子、視情況經取代C1-C20伸烷基、視情況經取代C1-C20伸雜烷基、視情況經取代C2-C20伸烯基、視情況經取代C2-C20伸雜烯基、視情況經取代C2-C20伸炔基、視情況經取代C2-C20伸雜炔基、視情況經取代C3-C20伸環烷基、視情況經取代C3-C20伸雜環烷基、視情況經取代C4-C20伸環烯基、視情況經取代C4-C20伸雜環烯基、視情況經取代C8-C20伸環炔基、視情況經取代C8-C20伸雜環炔基、視情況經取代C5-C15伸芳基或視情況經取代C2-C15伸雜芳基。
  108. 如請求項107之結合物，其中L係選自
    Figure 03_image425
    、
    Figure 03_image427
    、
    Figure 03_image429
    、
    Figure 03_image431
    、
    Figure 03_image433
    、
    Figure 03_image435
    、
    Figure 03_image437
    、
    Figure 03_image439
    、
    Figure 03_image441
    、
    Figure 03_image443
    、
    Figure 03_image445
    、
    Figure 03_image447
    、
    Figure 03_image449
    、
    Figure 03_image451
    、
    Figure 03_image453
    、
    Figure 03_image455
    、
    Figure 03_image457
    、
    Figure 03_image459
    、
    Figure 03_image461
    、
    Figure 03_image463
    、
    Figure 03_image465
    、
    Figure 03_image467
    、
    Figure 03_image469
    、
    Figure 03_image471
    、
    Figure 03_image473
    、
    Figure 03_image475
    、
    Figure 03_image477
    、
    Figure 03_image479
    、
    Figure 03_image481
    、
    Figure 03_image483
    、
    Figure 03_image485
    、
    Figure 03_image487
    、
    Figure 03_image489
    、
    Figure 03_image491
    、
    Figure 03_image493
    、
    Figure 03_image495
    、
    Figure 03_image497
    、
    Figure 03_image499
    、
    Figure 03_image501
    、
    Figure 03_image503
    、
    Figure 03_image505
    、
    Figure 03_image507
    、
    Figure 03_image509
    、
    Figure 03_image511
    、
    Figure 03_image513
    、
    Figure 03_image515
    、
    Figure 03_image517
    、
    Figure 03_image519
    、
    Figure 03_image521
    、
    Figure 03_image523
    、
    Figure 03_image525
    、
    Figure 03_image527
    、
    Figure 03_image529
    、
    Figure 03_image531
    、
    Figure 03_image533
    、
    Figure 03_image535
    、
    Figure 03_image537
    、
    Figure 03_image539
    、
    Figure 03_image541
    、
    Figure 03_image543
    、
    Figure 03_image545
    、
    Figure 03_image547
    、
    Figure 03_image549
    、
    Figure 03_image551
    、
    Figure 03_image553
    、
    Figure 03_image555
    、
    Figure 03_image557
    、
    Figure 03_image559
    、
    Figure 03_image561
    、
    Figure 03_image563
    、
    Figure 03_image565
    、
    Figure 03_image567
    、
    Figure 03_image569
    、
    Figure 03_image571
    、
    Figure 03_image573
    、
    Figure 03_image575
    、
    Figure 03_image577
    、
    Figure 03_image579
    、
    Figure 03_image581
    、
    Figure 03_image583
    、
    Figure 03_image585
    、
    Figure 03_image587
    、
    Figure 03_image589
    、
    Figure 03_image591
    、
    Figure 03_image593
    、
    Figure 03_image595
    、
    Figure 03_image597
    ；
    Figure 03_image599
    ；
    Figure 03_image601
    ；
    Figure 03_image603
    ；
    Figure 03_image605
    ；
    Figure 03_image607
    ；
    Figure 03_image609
    ；
    Figure 03_image611
    ；
    Figure 03_image613
    ；
    Figure 03_image615
    ；
    Figure 03_image617
    ；或
    Figure 03_image619
    ； 其中z1 及z2 各自獨立地為1至20之整數；且 R9 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基。
  109. 如請求項108之結合物，其中Y為：
    Figure 03_image721
    (-NH(C=O)O-)且L為：
    Figure 03_image587
    。
  110. 如請求項108之結合物，其中Y為：
    Figure 03_image2309
    (-NH(C=O)O-)並且L為：
    Figure 03_image2311
    。
  111. 如請求項108之結合物，其中Y為：
    Figure 03_image2309
    (-NH(C=O)O-)並且L為：
    Figure 03_image2314
    。
  112. 如請求項108之結合物，其中Y為：
    Figure 03_image728
    (-O-)且L為：
    Figure 03_image593
    。
  113. 如請求項1之結合物，其中該結合物係由式(M-I)描述：
    Figure 03_image003
    (M-I) 其中各A1 係獨立地選自式(A-I)-(A-XII)中任一者； 各E包含Fc域單體、白蛋白、白蛋白結合肽或Fc結合肽； n為1或2； T為1至20之整數；且 L係共價附接至E及A1 中每一者之連接體， 連接至E之波浪線指示各A1 -L共價附接至E； 或其醫藥學上可接受之鹽。
  114. 如請求項113之結合物，其中各A1 係獨立地選自式(A-I)、(A-II)、(A-VI)或(A-VII)中任一者； 各E包含Fc域單體、白蛋白、白蛋白結合肽或Fc結合肽，且 連接至E之波浪線指示各A1 -L共價附接至E； 或其醫藥學上可接受之鹽。
  115. 如請求項114之結合物，其中各A1 獨立地選自式(A-I)。
  116. 如請求項115之結合物，其中該結合物係由式(M-II)描述：
    Figure 03_image734
    (M-II) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  117. 如請求項116之結合物，其中該結合物係由式(M-II-1)描述：
    Figure 03_image736
    (M-II-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  118. 如請求項117之結合物，其中該結合物係由式(M-II-2)描述：
    Figure 03_image738
    (M-II-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  119. 如請求項118之結合物，其中該結合物係由式(M-II-3)描述：
    Figure 03_image740
    (M-II-3) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 為1至20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  120. 如請求項119之結合物，其中該結合物係由式(M-II-4)描述：
    Figure 03_image742
    (M-II-4) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  121. 如請求項120之結合物，其中該結合物係由式(M-II-5)描述：
    Figure 03_image744
    (M-II-5) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 為1至20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  122. 如請求項121之結合物，其中該結合物具有結構
    Figure 03_image746
    或其醫藥學上可接受之鹽。
  123. 如請求項116之結合物，其中該結合物係由式(M-II-6)描述：
    Figure 03_image748
    ， (M-II-6) 其中R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； 或其醫藥學上可接受之鹽。
  124. 如請求項123之結合物，其中R7 選自C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基。
  125. 如請求項123或124之結合物，其中R7 選自甲基、乙基、丙基或丁基。
  126. 如請求項123至125中任一項之結合物，其中該結合物係由式(M-II-7)描述：
    Figure 03_image2326
    ， (M-II-7) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  127. 如請求項126之結合物，其中該結合物係由式(M-II-8)描述：
    Figure 03_image752
    (M-II-8) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 為1至20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  128. 如請求項127之結合物，其中該結合物具有結構
    Figure 03_image754
    或其醫藥學上可接受之鹽。
  129. 如請求項127之結合物，其中該結合物係由式(M-II-9)描述：
    Figure 03_image756
    (M-II-9) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  130. 如請求項129之結合物，其中該結合物係由式(M-II-10)描述：
    Figure 03_image758
    (M-II-10) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 為1至20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  131. 如請求項130之結合物，其中該結合物具有結構
    Figure 03_image760
    或其醫藥學上可接受之鹽。
  132. 如請求項113或114之結合物，其中該結合物係由式(M-III)描述：
    Figure 03_image762
    (M-III) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  133. 如請求項132之結合物，其中該結合物係由式(M-III-1)描述：
    Figure 03_image764
    (M-III-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  134. 如請求項133之結合物，其中該結合物係由式(M-III-2)描述：
    Figure 03_image766
    (M-III-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  135. 如請求項134之結合物，其中該結合物係由式(M-III-3)描述：
    Figure 03_image768
    (M-III-3) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  136. 如請求項133之結合物，其中該結合物係由式(M-III-4)描述：
    Figure 03_image770
    (M-III-4) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  137. 如請求項136之結合物，其中該結合物係由式(M-III-5)描述：
    Figure 03_image772
    (M-III-5) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  138. 如請求項133之結合物，其中該結合物係由式(M-III-6)描述：
    Figure 03_image774
    (M-III-6) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  139. 如請求項138之結合物，其中該結合物係由式(M-III-7)描述：
    Figure 03_image776
    (M-III-7) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  140. 如請求項133之結合物，其中該結合物係由式(M-III-8)描述：
    Figure 03_image778
    (M-III-8) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  141. 如請求項140之結合物，其中該結合物係由式(M-III-9)描述：
    Figure 03_image780
    (M-III-9) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  142. 如請求項113之結合物，其中該結合物係由式(M-IV)描述：
    Figure 03_image782
    (M-IV) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  143. 如請求項142之結合物，其中該結合物係由式(M-IV-1)描述：
    Figure 03_image784
    (M-IV-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  144. 如請求項143之結合物，其中該結合物係由式(M-IV-2)描述：
    Figure 03_image786
    (M-IV-2) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  145. 如請求項113或114之結合物，其中該結合物係由式(M-V)描述：
    Figure 03_image788
    (M-V) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  146. 如請求項145之結合物，其中該結合物係由式(M-V-1)描述：
    Figure 03_image790
    (M-V-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  147. 如請求項146之結合物，其中該結合物係由式(M-V-2)描述：
    Figure 03_image792
    (M-V-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  148. 如請求項147之結合物，其中該結合物係由式(M-V-3)描述：
    Figure 03_image794
    (M-V-3) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 為1至20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  149. 如請求項148之結合物，其中該結合物係由式(M-V-4)描述：
    Figure 03_image796
    (M-V-4) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  150. 如請求項149之結合物，其中該結合物係由式(M-V-5)描述：
    Figure 03_image798
    (M-V-5) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 為1至20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  151. 如請求項145之結合物，其中該結合物係由式(M-V-6)描述：
    Figure 03_image800
    (M-V-6) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  152. 如請求項151之結合物，其中該結合物係由式(M-V-7)描述：
    Figure 03_image802
    (M-V-7) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  153. 如請求項152之結合物，其中該結合物係由式(M-V-8)描述：
    Figure 03_image804
    (M-V-8) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 為1至20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  154. 如請求項151之結合物，其中該結合物係由式(M-V-9)描述：
    Figure 03_image806
    (M-V-9) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  155. 如請求項154之結合物，其中該結合物係由式(M-V-10)描述：
    Figure 03_image808
    (M-V-10) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 為1至20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  156. 如請求項113或114之結合物，其中該結合物係由式(M-VI)描述：
    Figure 03_image810
    (M-VI) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  157. 如請求項156之結合物，其中該結合物係由式(M-VI-1)描述：
    Figure 03_image812
    (M-VI-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  158. 如請求項157之結合物，其中該結合物係由式(M-VI-2)描述：
    Figure 03_image814
    (M-VI-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  159. 如請求項158之結合物，其中該結合物係由式(M-VI-3)描述：
    Figure 03_image816
    (M-VI-3) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  160. 如請求項157之結合物，其中該結合物係由式(M-VI-4)描述：
    Figure 03_image818
    (M-VI-4) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  161. 如請求項160之結合物，其中該結合物係由式(M-VI-5)描述：
    Figure 03_image820
    (M-VI-5) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  162. 如請求項157之結合物，其中該結合物係由式(M-VI-6)描述：
    Figure 03_image822
    (M-VI-6) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  163. 如請求項162之結合物，其中該結合物係由式(M-VI-7)描述：
    Figure 03_image824
    (M-VI-7) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  164. 如請求項157之結合物，其中該結合物係由式(M-VI-8)描述：
    Figure 03_image826
    (M-VI-8) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  165. 如請求項164之結合物，其中該結合物係由式(M-VI-9)描述：
    Figure 03_image828
    (M-VI-9) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  166. 如請求項113之結合物，其中該結合物係由式(M-VII)描述：
    Figure 03_image830
    (M-VII) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  167. 如請求項113至166中任一項之結合物，其中R1 為OH。
  168. 如請求項113至166中任一項之結合物，其中R1 為NH2 。
  169. 如請求項113至166中任一項之結合物，其中R1 為-NHC(=NH)NH2 。
  170. 如請求項113之結合物，其中該結合物係由式(M-VIII)描述：
    Figure 03_image832
    (M-VIII) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  171. 如請求項170之結合物，其中該結合物係由式(M-VIII-1)描述：
    Figure 03_image834
    (M-VIII-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  172. 如請求項171之結合物，其中該結合物係由式(M-VIII-2)描述：
    Figure 03_image836
    (M-VIII-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  173. 如請求項172之結合物，其中該結合物係由式(M-VIII-3)描述：
    Figure 03_image838
    (M-VIII-3) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 為1至20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  174. 如請求項173之結合物，其中該結合物係由式(M-VIII-4)描述：
    Figure 03_image840
    (M-VIII-4) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  175. 如請求項174之結合物，其中該結合物係由式(M-VIII-5)描述：
    Figure 03_image842
    (M-VIII-5) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 為1至20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  176. 如請求項175之結合物，其中該結合物具有結構：
    Figure 03_image844
    或其醫藥學上可接受之鹽。
  177. 如請求項171之結合物，其中該結合物係由式(M-VIII-6)描述：
    Figure 03_image846
    (M-VIII-6) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  178. 如請求項177之結合物，其中該結合物係由式(M-VIII-7)描述：
    Figure 03_image848
    (M-VIII-7) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  179. 如請求項171之結合物，其中該結合物係由式(M-VIII-8)描述：
    Figure 03_image850
    (M-VIII-8) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  180. 如請求項179之結合物，其中該結合物係由式(M-VIII-9)描述：
    Figure 03_image852
    (M-VIII-9) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  181. 如請求項180之結合物，其中該結合物係由式(M-VIII-10)描述：
    Figure 03_image854
    (M-VIII-10) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  182. 如請求項181之結合物，其中該結合物係由式(M-VIII-11)描述：
    Figure 03_image856
    (M-VIII-11) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  183. 如請求項113之結合物，其中該結合物係由式(M-IX)描述：
    Figure 03_image858
    (M-IX) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  184. 如請求項183之結合物，其中該結合物係由式(M-IX-1)描述：
    Figure 03_image860
    (M-IX-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  185. 如請求項184之結合物，其中該結合物係由式(M-IX-2)描述：
    Figure 03_image862
    (M-IX-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  186. 如請求項184之結合物，其中該結合物係由式(M-IX-3)描述：
    Figure 03_image864
    (M-IX-3) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  187. 如請求項184之結合物，其中該結合物係由式(M-IX-4)描述：
    Figure 03_image866
    (M-IX-4) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  188. 如請求項184之結合物，其中該結合物係由式(M-IX-5)描述：
    Figure 03_image868
    (M-IX-5) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  189. 如請求項184之結合物，其中該結合物係由式(M-IX-6)描述：
    Figure 03_image870
    (M-IX-6) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  190. 如請求項113之結合物，其中該結合物係由式(M-X)描述：
    Figure 03_image2388
    (M-X) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  191. 如請求項190之結合物，其中該結合物係由式(M-X-1)描述：
    Figure 03_image2390
    (M-X-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  192. 如請求項191之結合物，其中該結合物係由式(M-X-2)描述：
    Figure 03_image2392
    (M-X-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  193. 如請求項190之結合物，其中該結合物係由式(M-X-3)描述：
    Figure 03_image1304
    (M-X-3) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  194. 如請求項113至193中任一項之結合物，其中L或L’包含一或多個視情況經取代C1-C20伸烷基、視情況經取代C1-C20伸雜烷基、視情況經取代C2-C20伸烯基、視情況經取代C2-C20伸雜烯基、視情況經取代C2-C20伸炔基、視情況經取代C2-C20伸雜炔基、視情況經取代C3-C20伸環烷基、視情況經取代C3-C20伸雜環烷基、視情況經取代C4-C20伸環烯基、視情況經取代C4-C20伸雜環烯基、視情況經取代C8-C20伸環炔基、視情況經取代C8-C20伸雜環炔基、視情況經取代C5-C15伸芳基、視情況經取代C2-C15伸雜芳基、O、S、NRi 、P、羰基、硫羰基、磺醯基、磷酸酯基、磷醯基或亞胺基， 其中Ri 為H、視情況經取代C1-C20烷基、視情況經取代C1-C20雜烷基、視情況經取代C2-C20烯基、視情況經取代C2-C20雜烯基、視情況經取代C2-C20炔基、視情況經取代C2-C20雜炔基、視情況經取代C3-C20環烷基、視情況經取代C3-C20雜環烷基、視情況經取代C4-C20環烯基、視情況經取代C4-C20雜環烯基、視情況經取代C8-C20環炔基、視情況經取代C8-C20雜環炔基、視情況經取代C5-C15芳基或視情況經取代C2-C15雜芳基。
  195. 如請求項194之結合物，其中L或L’之骨架係由一或多個視情況經取代C1-C20伸烷基、視情況經取代C1-C20伸雜烷基、視情況經取代C2-C20伸烯基、視情況經取代C2-C20伸雜烯基、視情況經取代C2-C20伸炔基、視情況經取代C2-C20伸雜炔基、視情況經取代C3-C20伸環烷基、視情況經取代C3-C20伸雜環烷基、視情況經取代C4-C20伸環烯基、視情況經取代C4-C20伸雜環烯基、視情況經取代C8-C20伸環炔基、視情況經取代C8-C20伸雜環炔基、視情況經取代C5-C15伸芳基、視情況經取代C2-C15伸雜芳基、O、S、NRi 、P、羰基、硫羰基、磺醯基、磷酸酯基、磷醯基或亞胺基組成， 其中Ri 為H、視情況經取代C1-C20烷基、視情況經取代C1-C20雜烷基、視情況經取代C2-C20烯基、視情況經取代C2-C20雜烯基、視情況經取代C2-C20炔基、視情況經取代C2-C20雜炔基、視情況經取代C3-C20環烷基、視情況經取代C3-C20雜環烷基、視情況經取代C4-C20環烯基、視情況經取代C4-C20雜環烯基、視情況經取代C8-C20環炔基、視情況經取代C8-C20雜環炔基、視情況經取代C5-C15芳基或視情況經取代C2-C15雜芳基。
  196. 如請求項194或195之結合物，其中L或L'經側氧基取代。
  197. 如請求項113至196中任一項之結合物，其中L或L'之主鏈包含不超過250個原子。
  198. 如請求項113至197中任一項之結合物，其中L或L'能夠形成醯胺、胺基甲酸酯、磺醯基或脲鍵聯。
  199. 如請求項113至193中任一項之結合物，其中L或L'為鍵。
  200. 如請求項113至193中任一項之結合物，其中L或L'為原子。
  201. 如請求項113至200中任一項之結合物，其中各L係由式(M-L-I)描述： J1 -(Q1 )g -(T1 )h -(Q2 )i -(T2 )j -(Q3 )k -(T3 )l -(Q4 )m -(T4 )n -(Q5 )o -J2 其中J1 為附接至A1 之鍵； J2 係附接至E之鍵或能夠與結合於E之官能基反應的官能基(例如，順丁烯二醯亞胺及半胱胺酸、胺及經活化羧酸、硫醇及順丁烯二醯亞胺、經活化磺酸及胺、異氰酸酯及胺、疊氮化物及炔以及烯烴及四嗪)； Q1 、Q2 、Q3 、Q4 及Q5 各自獨立地為視情況經取代C1-C20伸烷基、視情況經取代C1-C20伸雜烷基、視情況經取代C2-C20伸烯基、視情況經取代C2-C20伸雜烯基、視情況經取代C2-C20伸炔基、視情況經取代C2-C20伸雜炔基、視情況經取代C3-C20伸環烷基、視情況經取代C3-C20伸雜環烷基、視情況經取代C4-C20伸環烯基、視情況經取代C4-C20伸雜環烯基、視情況經取代C8-C20伸環炔基、視情況經取代C8-C20伸雜環炔基、視情況經取代C5-C15伸芳基或視情況經取代C2-C15伸雜芳基； T1 、T2 、T3 、T4 各自獨立地為O、S、NRi 、P、羰基、硫羰基、磺醯基、磷酸酯基、磷醯基或亞胺基； Ri 為H、視情況經取代C1-C20烷基、視情況經取代C1-C20雜烷基、視情況經取代C2-C20烯基、視情況經取代C2-C20雜烯基、視情況經取代C2-C20炔基、視情況經取代C2-C20雜炔基、視情況經取代C3-C20環烷基、視情況經取代C3-C20雜環烷基、視情況經取代C4-C20環烯基、視情況經取代C4-C20雜環烯基、視情況經取代C8-C20環炔基、視情況經取代C8-C20雜環炔基、視情況經取代C5-C15芳基或視情況經取代C2-C15雜芳基。
  202. 如請求項1至201中任一項之結合物，其中R1 為-NHC(=NH)NH2 。
  203. 如請求項1至202中任一項之結合物，其中R2 為-F。
  204. 如請求項1至203中任一項之結合物，其中R3 為-F。
  205. 如請求項1至204中任一項之結合物，其中R4 為–CO2 H。
  206. 如請求項1至205中任一項之結合物，其中R5 為–COCH3 。
  207. 如請求項1至206中任一項之結合物，其中連接至E之波浪線指示各A1 -L或各A1 -L-A2 之L共價附接至E之溶劑暴露離胺酸之氮原子。
  208. 如請求項1至206中任一項之結合物，其中連接至E之波浪線指示各A1 -L或各A1 -L-A2 之L共價附接至E之溶劑暴露離胺酸之硫原子。
  209. 如請求項1至208中任一項之結合物，其中各E為Fc域單體。
  210. 如請求項209之結合物，其中n為2，且各E二聚以形成Fc域。
  211. 如請求項2至4中任一項之結合物，其中n為2，各E為Fc域單體，各E二聚以形成Fc域，且該結合物係由式(D-I-1)描述：
    Figure 03_image924
    (D-I-1) 其中J為Fc域；且 T為1至20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  212. 如請求項211之結合物，其中該結合物具有結構
    Figure 03_image926
    ， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  213. 如請求項113至115中任一項之結合物，其中n為2，各E為Fc域單體，各E二聚以形成Fc域，且該結合物係由式(M-I-1)描述：
    Figure 03_image928
    (M-I-1) 其中J為Fc域；且 T為1至20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  214. 如請求項209至213中任一項之結合物，其中各E包含與SEQ ID NO: 1-138中任一者之序列至少95%一致的胺基酸序列。
  215. 如請求項214之結合物，其中各E包含與SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 95中任一者之序列至少95%一致的胺基酸序列。
  216. 如請求項215之結合物，其中各 E包含SEQ ID NO: 62之胺基酸序列。
  217. 如請求項215之結合物，其中各 E包含SEQ ID NO: 63之胺基酸序列。
  218. 如請求項215之結合物，其中各 E包含SEQ ID NO: 64之胺基酸序列。
  219. 如請求項215之結合物，其中各 E包含SEQ ID NO: 67之胺基酸序列。
  220. 如請求項215之結合物，其中各 E包含SEQ ID NO: 68之胺基酸序列。
  221. 如請求項215之結合物，其中各 E包含SEQ ID NO: 72之胺基酸序列。
  222. 如請求項215之結合物，其中各 E包含SEQ ID NO: 73之胺基酸序列。
  223. 如請求項215之結合物，其中各 E包含SEQ ID NO: 76之胺基酸序列。
  224. 如請求項215之結合物，其中各 E包含SEQ ID NO: 77之胺基酸序列。
  225. 如請求項215之結合物，其中各 E包含SEQ ID NO: 80之胺基酸序列。
  226. 如請求項215之結合物，其中各 E包含SEQ ID NO: 81之胺基酸序列。
  227. 如請求項215之結合物，其中各 E包含SEQ ID NO: 82之胺基酸序列。
  228. 如請求項215之結合物，其中各 E包含SEQ ID NO: 85之胺基酸序列。
  229. 如請求項215之結合物，其中各 E包含SEQ ID NO: 86之胺基酸序列。
  230. 如請求項215之結合物，其中各 E包含SEQ ID NO: 90之胺基酸序列。
  231. 如請求項215之結合物，其中各 E包含SEQ ID NO: 91之胺基酸序列。
  232. 如請求項215之結合物，其中各 E包含SEQ ID NO: 94之胺基酸序列。
  233. 如請求項215之結合物，其中各 E包含SEQ ID NO: 95之胺基酸序列。
  234. 如請求項209至233中任一項之結合物，其中T為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
  235. 一種如請求項209至233中任一項之結合物之群體，其中T之平均值為1至10。
  236. 如請求項235之結合物之群體，其中T之平均值為1至5。
  237. 如請求項235之結合物之群體，其中T之平均值為3至7。
  238. 如請求項236或237之結合物之群體，其中T之平均值為3.5至5.5。
  239. 如請求項236或237之結合物之群體，其中T之平均值為約4.5。
  240. 如請求項235之結合物之群體，其中T之平均值為5至10。
  241. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至234中任一項之結合物，或如請求項235至240之結合物之群體，或其醫藥學上可接受之鹽，及醫藥學上可接受之賦形劑。
  242. 一種用於治療具有病毒感染或據推測具有病毒感染之個體之方法，該方法包括向該個體投與有效量的如請求項1至241中任一項之結合物或組合物。
  243. 一種用於預防性治療有需要之個體的病毒感染之方法，該方法包括向該個體投與有效量的如請求項1至241中任一項之結合物或組合物。
  244. 如請求項242或243之方法，其中該病毒感染係由流感病毒或副流感病毒引起。
  245. 如請求項242至244中任一項之方法，其中該病毒感染為A型、B型或C型流感病毒或副流感病毒。
  246. 如請求項242至245中任一項之方法，其中該個體係免疫受損的。
  247. 如請求項242至246中任一項之方法，其中該個體已經診斷患有體液免疫缺乏、T細胞缺乏、嗜中性白血球減少症、無脾或補體缺乏。
  248. 如請求項242至247中任一項之方法，其中該個體正在經免疫抑制性療法治療或即將經免疫抑制性療法治療。
  249. 如請求項242至248中任一項之方法，其中該個體已經診斷患有引起免疫抑制之疾病。
  250. 如請求項249之方法，其中該疾病為癌症或獲得性免疫缺乏症候群。
  251. 如請求項250之方法，其中該癌症為白血病、淋巴瘤或多發性骨髓瘤。
  252. 如請求項242至251中任一項之方法，其中該個體已經受或即將經受造血幹細胞移植。
  253. 如請求項242至252中任一項之方法，其中該個體已經受或即將經受器官移植。
  254. 如請求項242至253中任一項之方法，其中該個體患有繼發性感染或處於繼發性感染之風險中。
  255. 一種預防經診斷患有流感感染之個體之繼發性感染的方法，其中該方法包括向該個體投與如請求項1至241中任一項之結合物或組合物。
  256. 如請求項254或255之方法，其中該繼發性感染係呼吸道感染。
  257. 如請求項254至256中任一項之方法，其中該繼發性感染與肺炎相關。
  258. 如請求項254至257中任一項之方法，其中該繼發性感染係細菌感染、病毒感染或真菌感染。
  259. 如請求項258之方法，其中該繼發性感染係細菌感染。
  260. 如請求項259之方法，其中該繼發性感染係耐甲氧西林之金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcus aureus ；MRSA)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae )、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa )或流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae )感染。
  261. 如請求項260之方法，其中該細菌感染係MRSA。
  262. 如請求項260之方法，其中該細菌感染係肺炎鏈球菌(S. pneumoniae )。
  263. 如請求項242至262中任一項之方法，其中該結合物或組合物係肌內、靜脈內、皮內、動脈內、腹膜內、病變內、顱內、關節內、前列腺內、胸膜內、氣管內、鼻內、玻璃體內、陰道內、直腸內、經表面、腫瘤內、經腹膜、皮下、結膜下、囊內、經黏膜、心包內、臍內、眼內、經口、經局部、藉由吸入、藉由注射或藉由輸注投與。
  264. 如請求項242至263中任一項之方法，其中該個體經第二治療劑治療。
  265. 如請求項264之方法，其中該第二治療劑為抗病毒劑。
  266. 如請求項264之方法，其中該抗病毒劑係選自匹莫維地爾(pimovidir)、奧司他韋(oseltamivir)、紮那米韋(zanamivir)、帕拉米韋(peramivir)、拉尼米韋(laninamivir)、金剛烷胺或金剛乙胺。
  267. 如請求項266之方法，其中該第二治療劑為抗病毒疫苗。
  268. 如請求項267之方法，其中該抗病毒疫苗在該個體中引起針對A型、B型或C型流感病毒或副流感病毒之免疫反應。
  269. 如請求項265之方法，其中該抗病毒劑係巴洛沙韋(baloxavir)。
  270. 如請求項265之方法，其中該結合物及巴洛沙韋依次投與。
  271. 如請求項265之方法，其中該結合物及巴洛沙韋同時投與。
  272. 如請求項242至271中任一項之方法，其中該結合物由式(D-II-6)來描述。
  273. 如請求項272之方法，其中R7 選自C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基。
  274. 如請求項272或273之方法，其中R7 選自甲基、乙基、丙基或丁基。
  275. 如請求項272至274之方法，其中該結合物由式(D-II-7)來描述。
  276. 如請求項242至275中任一項之方法，其中各E具有與SEQ ID NO：63-68中任一者之序列至少95%一致的序列。
  277. 如請求項242至275中任一項之方法，其中各E具有與SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：73之序列至少95%一致的序列。
  278. 如請求項242至275中任一項之方法，其中各E具有與SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：76或SEQ ID NO：77之序列至少95%一致的序列。
  279. 如請求項242至275中任一項之方法，其中該結合物為結合物45或結合物46。
  280. 一種治療或預防個體之病毒感染之方法，該方法包括向該個體投與： a) 如請求項1至241中任一項之結合物或組合物；及 b) 第二治療劑。
  281. 如請求項280之方法，其中在該個體已具有病毒感染、據推測具有病毒感染或已暴露於病毒之後，將該結合物投與該個體。
  282. 如請求項280之方法，其中該結合物預防性地投與該個體。
  283. 如請求項278至282中任一項之方法，其中在該個體已具有病毒感染、據推測具有病毒感染或已暴露於該病毒之後，將該第二治療劑投與該個體。
  284. 如請求項278至283中任一項之方法，其中該第二治療劑預防性地投與該個體。
  285. 如請求項278至284中任一項之方法，其中該第二治療劑在該結合物之2天內投與。
  286. 如請求項278至285中任一項之方法，其中該第二治療劑係抗病毒劑。
  287. 如請求項286之方法，其中該抗病毒劑係匹莫維地爾、奧司他韋、紮那米韋、帕拉米韋、拉尼米韋、金剛烷胺、巴洛沙韋瑪波地爾(baloxavirmarboxil)、巴洛沙韋酸(baloxavir acid)、金剛乙胺或或其醫藥學上可接受之鹽。
  288. 如請求項287之方法，其中該抗病毒劑係巴洛沙韋瑪波地爾、巴洛沙韋酸或其醫藥學上可接受之鹽。
  289. 如請求項第288之方法，其中該巴洛沙韋瑪波地爾、巴洛沙韋酸或其醫藥學上可接受之鹽以20 mg與90 mg之間之量投與。
  290. 如請求項286之方法，其中該巴洛沙韋瑪波地爾、巴洛沙韋酸或其醫藥學上可接受之鹽經口投與。
  291. 如請求項289或290之方法，其中該巴洛沙韋瑪波地爾、巴洛沙韋酸或其醫藥學上可接受之鹽以單一劑量投與。
  292. 如請求項289或290之方法，其中該巴洛沙韋瑪波地爾、巴洛沙韋酸或其醫藥學上可接受之鹽以一個以上劑量投與。
  293. 如請求項289至292中任一項之方法，其中該巴洛沙韋瑪波地爾、巴洛沙韋酸或其醫藥學上可接受之鹽以20 mg與40 mg之間之量投與。
  294. 如請求項289至292中任一項之方法，其中該巴洛沙韋瑪波地爾、巴洛沙韋酸或其醫藥學上可接受之鹽以30 mg與80 mg之間之量投與。
  295. 如請求項278至294中任一項之方法，其中該結合物由式(D-II-6)來描述。
  296. 如請求項295之方法，其中R7 選自C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基。
  297. 如請求項295或296之方法，其中R7 選自甲基、乙基、丙基或丁基。
  298. 如請求項295至297中任一項之方法，其中該結合物由式(D-II-7)來描述。
  299. 如請求項280至298中任一項之方法，其中各E具有與SEQ ID NO：63-68中任一者之序列至少95%一致的序列。
  300. 如請求項299之方法，其中各E具有與SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：73之序列至少95%一致的序列。
  301. 如請求項300之方法，其中各E具有與SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：76或SEQ ID NO：77之序列至少95%一致的序列。
  302. 如請求項280至298中任一項之方法，其中該結合物為結合物45或結合物46。
  303. 如請求項280至302中任一項之方法，其中該結合物係肌內、靜脈內、皮內、動脈內、腹膜內、病變內、顱內、關節內、前列腺內、胸膜內、氣管內、鼻內、玻璃體內、陰道內、直腸內、經表面、腫瘤內、經腹膜、皮下、結膜下、囊內、經黏膜、心包內、臍內、眼內、經口、經局部、藉由吸入、藉由注射或藉由輸注投與。
  304. 如請求項303之方法，其中該結合物靜脈內投與。
  305. 如請求項303之方法，其中該結合物皮下投與。
  306. 如請求項303之方法，其中該結合物肌內投與。
  307. 如請求項280至306中任一項之方法，其中該病毒感染由流感病毒或副流感病毒引起。
  308. 如請求項307之方法，其中該病毒為A型、B型或C型流感病毒或副流感病毒。
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