TW202104176A - 用於治療病毒感染之組合物及方法 - Google Patents

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Abstract

用於治療病毒感染之組合物及方法包括含有連接於Fc單體、Fc域及Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽之病毒神經胺糖酸酶抑制劑(例如，紮那米韋(zanamivir)、帕拉米韋(peramivir)或其類似物)之結合物。詳言之，結合物可用於治療病毒感染(例如，流感病毒感染)。

Description

用於治療病毒感染之組合物及方法
對於用於流感之新穎抗病毒治療之需求很顯著且在醫學領域中尤其至關重要。流感病毒(流感之病原體)每年造成三百萬至五百萬例嚴重疾病，且在全世界造成大約500,000例死亡。雖然大多數人在約一週至兩週內完全地自流感恢復，但其他人會發展危及生命之倂發症，諸如肺炎。因此，流感可為致命的，尤其對於年輕人、老人或慢性病患。具有微弱或受損免疫系統之人，諸如具有晚期HIV感染之人或移植患者(其免疫系統在醫學上受到抑制以預防移植器官排斥)處於與流感有關之倂發症的較大風險中。懷孕婦女及幼兒亦處於倂發症之高風險中。
用於流感之抗病毒治療之開發已成為一項持續挑戰。數種流感抗病毒劑已獲得批准用於臨床，且當製備疫苗時，此等劑在調節疾病嚴重程度及控制氾流行病方面發揮重要作用。然而，已出現針對最常用之抑制劑的耐藥性菌株。
流感抗病毒劑主要靶向在流感病毒粒子之表面上呈現之蛋白質。流感病毒之包膜含有兩種免疫顯性醣蛋白，即血球凝集素及神經胺糖酸酶，其在病毒感染及擴散中發揮關鍵作用。血球凝集素經由其與表面唾液酸之相互作用實現該病毒與宿主細胞之附接，尤其起始進入。神經胺糖酸酶為外切糖苷酶，其在受感染宿主細胞之表面上裂解來自聚醣結構之唾液酸(末端神經胺糖酸殘基)，從而釋放後代病毒且允許該病毒自該宿主細胞擴散至未受感染周圍細胞。神經胺糖酸酶之抑制因此充當抗病毒藥物之藥理學標靶。用於減少病毒擴散之病毒神經胺糖酸酶抑制劑已經鑑別，包括奧司他韋(oseltamivir)(TamifluTM )、紮那米韋(zanamivir)(RelenzaTM )及帕拉米韋(peramivir)(RapivabTM )。
然而，移植接受者之流感的特徵仍在於延長之病毒遮蔽，從而增加發展耐藥性菌株之可能性。需要用於治療流感之新的更有效療法。
本發明係關於用於抑制病毒生長之結合物、組合物及方法，及用於治療病毒感染之方法。詳言之，該等結合物含有抑制流感病毒神經胺糖酸酶之部分(例如，紮那米韋、帕拉米韋或其類似物)之單體或二聚體，其結合於Fc單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽。該等結合物中之神經胺糖酸酶抑制劑(例如，紮那米韋、帕拉米韋或其類似物)靶向在病毒粒子之表面上的神經胺糖酸酶。該等結合物中之Fc單體或Fc域結合於免疫細胞(例如，嗜中性粒細胞)上之FcγR (例如，FcRn、FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIc、FcγRIIIa及FcγRIIIb)以活化吞噬作用及效應子功能，諸如抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)，因此由免疫細胞吞沒及破壞病毒粒子且進一步增強該等結合物之抗病毒活性。該白蛋白或白蛋白結合肽可例如藉由使白蛋白結合於再循環之新生兒Fc受體而延長該結合物之半衰期。該等組合物適用於抑制病毒生長之方法及治療病毒感染(諸如藉由A型流感病毒、B型流感病毒及C型流感病毒引起之彼等)之方法。
在一態樣中，本發明提供一種由式(1)描述之結合物：
Figure 02_image002
(1) 其中各A1 及各A2 係獨立地選自式(A-I)-(A-XII)中任一者：
Figure 02_image005
、
Figure 02_image007
、
Figure 02_image009
、
Figure 02_image011
、
Figure 02_image013
、 (A-I)             (A-II)                      (A-III)                          (A-IV)                (A-V)
Figure 02_image015
、
Figure 02_image017
、
Figure 02_image019
、
Figure 02_image021
、 (A-VI)         (A-VII)                          (A-VIII)               (A-IX)
Figure 02_image023
、
Figure 02_image025
、
Figure 02_image027
； (A-X)                 (A-XI)                      (A-XII) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ；R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br；R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H；R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ；X係選自-O-及-S-；Y係選自
Figure 02_image029
R6 係選自
Figure 02_image031
、
Figure 02_image033
、
Figure 02_image035
、
Figure 02_image037
、
Figure 02_image039
、
Figure 02_image041
、
Figure 02_image043
、
Figure 02_image045
、
Figure 02_image047
、
Figure 02_image049
、
Figure 02_image051
、
Figure 02_image053
、
Figure 02_image055
、
Figure 02_image057
、
Figure 02_image059
、
Figure 02_image061
、
Figure 02_image063
、
Figure 02_image065
、
Figure 02_image067
、
Figure 02_image069
、
Figure 02_image071
、
Figure 02_image073
、
Figure 02_image075
、
Figure 02_image077
、
Figure 02_image079
、
Figure 02_image081
、
Figure 02_image083
、
Figure 02_image085
、
Figure 02_image087
、
Figure 02_image089
、
Figure 02_image091
及
Figure 02_image093
； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；各E包含Fc域單體(例如，具有SEQ ID NO: 1-68中任一者之序列的Fc域單體)；各A1 -L-A2 中之L係共價附接至各E中之鉸鏈半胱胺酸的硫原子且附接至A1 及A2 中每一者之連接體；T為1至20之整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，且連接至兩個E之兩條波浪線指示各A1 -L-A2 共價附接(例如，藉助於共價鍵或連接體)至兩個E中之兩個鉸鏈半胱胺酸的一對硫原子，或其醫藥學上可接受之鹽。當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各A1 -L-A2 可獨立地經選擇(例如，獨立地選自本文所述之A1 -L-A2 結構中任一者)。
在另一態樣中，本發明提供一種由式(1)描述之結合物：
Figure 02_image095
(1) 其中各A1 及各A2 係獨立地選自式(A-I)-(A-V)中任一者：
Figure 02_image005
、
Figure 02_image007
、
Figure 02_image009
、
Figure 02_image011
、
Figure 02_image013
； (A-I)                         (A-II)                      (A-III)                          (A-IV)                (A-V) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ；R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br；R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H；R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ；X係選自-O-及-S-；Y係選自
Figure 02_image096
Figure 02_image098
R6 係選自
Figure 02_image031
、
Figure 02_image033
、
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、
Figure 02_image037
、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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Figure 02_image061
、
Figure 02_image063
、
Figure 02_image065
、
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、
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、
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、
Figure 02_image073
、
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、
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、
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、
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、
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、
Figure 02_image087
、
Figure 02_image089
、
Figure 02_image091
及
Figure 02_image093
； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；各E包含Fc域單體(例如，具有SEQ ID NO: 1-68中任一者之序列的Fc域單體)；各A1 -L-A2 中之L係共價附接至各E中之鉸鏈半胱胺酸的硫原子且附接至A1 及A2 中每一者之連接體；T為1至20之整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，且連接至兩個E之兩條波浪線指示各A1 -L-A2 共價附接(例如，藉助於共價鍵或連接體)至兩個E中之兩個鉸鏈半胱胺酸的一對硫原子，或其醫藥學上可接受之鹽。當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各A1 -L-A2 可獨立地經選擇(例如，獨立地選自本文所述之A1 -L-A2 結構中任一者)。
在另一態樣中，本發明提供一種由式(1)描述之結合物：
Figure 02_image002
(1) 其中各A1 及各A2 係獨立地選自式(A-VI)-(A-IX)中任一者：
Figure 02_image015
、
Figure 02_image017
、
Figure 02_image019
、
Figure 02_image021
； (A-VI)                (A-VII)               (A-VIII)             (A-IX) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ；R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br；R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H；R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ；X係選自-O-及-S-；Y係選自
Figure 02_image114
Figure 02_image116
R6 係選自
Figure 02_image031
、
Figure 02_image033
、
Figure 02_image035
、
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、
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、
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、
Figure 02_image043
、
Figure 02_image045
、
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、
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、
Figure 02_image051
、
Figure 02_image053
、
Figure 02_image055
、
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Figure 02_image059
、
Figure 02_image061
、
Figure 02_image063
、
Figure 02_image065
、
Figure 02_image067
、
Figure 02_image069
、
Figure 02_image071
、
Figure 02_image073
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Figure 02_image075
、
Figure 02_image077
、
Figure 02_image079
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、
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、
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、
Figure 02_image087
、
Figure 02_image089
、
Figure 02_image091
及
Figure 02_image093
； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；各E包含Fc域單體(例如，具有SEQ ID NO: 1-68中任一者之序列的Fc域單體)；各A1 -L-A2 中之L係共價附接至各E中之鉸鏈半胱胺酸的硫原子且附接至A1 及A2 中每一者之連接體；T為1至20之整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，且連接至兩個E之兩條波浪線指示各A1 -L-A2 共價附接(例如，藉助於共價鍵或連接體)至兩個E中之兩個鉸鏈半胱胺酸的一對硫原子，或其醫藥學上可接受之鹽。當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各A1 -L-A2 可獨立地經選擇(例如，獨立地選自本文所述之A1 -L-A2 結構中任一者)。
在另一態樣中，本發明提供一種由式(2)描述之結合物：
Figure 02_image120
(2) 其中各A1 係獨立地選自式(A-I)-(A-XII)中任一者：
Figure 02_image005
、
Figure 02_image007
、
Figure 02_image009
、
Figure 02_image011
、
Figure 02_image013
、 (A-I)             (A-II)                      (A-III)                          (A-IV)                (A-V)
Figure 02_image015
、
Figure 02_image017
、
Figure 02_image019
、
Figure 02_image021
、 (A-VI)                (A-VII)              (A-VIII)              (A-IX)
Figure 02_image023
、
Figure 02_image025
、
Figure 02_image027
； (A-X)                 (A-XI)                      (A-XII) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ；R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br；R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H；R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ；X係選自-O-及-S-；Y係選自
Figure 02_image125
R6 係選自
Figure 02_image031
、
Figure 02_image033
、
Figure 02_image035
、
Figure 02_image037
、
Figure 02_image039
、
Figure 02_image041
、
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Figure 02_image045
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、
Figure 02_image049
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Figure 02_image051
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Figure 02_image053
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、
Figure 02_image061
、
Figure 02_image063
、
Figure 02_image065
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Figure 02_image067
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Figure 02_image069
、
Figure 02_image071
、
Figure 02_image073
、
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、
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、
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、
Figure 02_image081
、
Figure 02_image083
、
Figure 02_image085
、
Figure 02_image087
、
Figure 02_image089
、
Figure 02_image091
及
Figure 02_image093
； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；各E包含Fc域單體(例如，具有SEQ ID NO: 1-68中任一者之序列的Fc域單體)；各L-A1 中之L係共價附接至E中之鉸鏈半胱胺酸的硫原子且附接至A1 之連接體；T為1至20之整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，且連接至兩個硫原子之兩條波浪線指示各L-A1 共價(例如，藉助於共價鍵或連接體)附接至兩個E中之兩個鉸鏈半胱胺酸的一對硫原子，或其醫藥學上可接受之鹽。當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各A1 可獨立地選自式(A-I)-(A-XII)中任一者。
在另一態樣中，本發明提供一種由式(2)描述之結合物：
Figure 02_image120
(2) 其中各A1 係獨立地選自式(A-I)-(A-V)中任一者：
Figure 02_image005
、
Figure 02_image007
、
Figure 02_image009
、
Figure 02_image011
、
Figure 02_image013
； (A-I)             (A-II)                      (A-III)                          (A-IV)                (A-V) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ；R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br；R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H；R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ；X係選自-O-及-S-；Y係選自
Figure 02_image133
Figure 02_image135
R6 係選自
Figure 02_image031
、
Figure 02_image033
、
Figure 02_image035
、
Figure 02_image037
、
Figure 02_image039
、
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、
Figure 02_image043
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Figure 02_image045
、
Figure 02_image047
、
Figure 02_image049
、
Figure 02_image051
、
Figure 02_image053
、
Figure 02_image055
、
Figure 02_image057
、
Figure 02_image059
、
Figure 02_image061
、
Figure 02_image063
、
Figure 02_image065
、
Figure 02_image067
、
Figure 02_image069
、
Figure 02_image071
、
Figure 02_image073
、
Figure 02_image075
、
Figure 02_image077
、
Figure 02_image079
、
Figure 02_image081
、
Figure 02_image083
、
Figure 02_image085
、
Figure 02_image087
、
Figure 02_image089
、
Figure 02_image091
及
Figure 02_image093
； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； 各E包含Fc域單體(例如，具有SEQ ID NO: 1-68中任一者之序列的Fc域單體)；各L-A1 中之L係共價附接至E中之鉸鏈半胱胺酸的硫原子且附接至A1 之連接體；T為1至20之整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，且連接至兩個硫原子之兩條波浪線指示各L-A1 共價附接(例如，藉助於共價鍵或連接體)至兩個E中之兩個鉸鏈半胱胺酸的一對硫原子，或其醫藥學上可接受之鹽。當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各A1 可獨立地選自式(A-I)-(A-V)中任一者。
在另一態樣中，本發明提供一種由式(2)描述之結合物：
Figure 02_image120
(2) 其中各A1 係獨立地選自式(A-VI)-(A-IX)中任一者：
Figure 02_image015
、
Figure 02_image017
、
Figure 02_image019
、
Figure 02_image021
； (A-VI)                (A-VII)               (A-VIII)             (A-IX) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ；R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br；R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H；R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ；X係選自-O-及-S-；Y係選自
Figure 02_image140
Figure 02_image142
R6 係選自
Figure 02_image031
、
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、
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、
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、
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Figure 02_image053
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Figure 02_image055
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Figure 02_image063
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Figure 02_image065
、
Figure 02_image067
、
Figure 02_image069
、
Figure 02_image071
、
Figure 02_image073
、
Figure 02_image075
、
Figure 02_image077
、
Figure 02_image079
、
Figure 02_image081
、
Figure 02_image083
、
Figure 02_image085
、
Figure 02_image087
、
Figure 02_image089
、
Figure 02_image091
及
Figure 02_image093
； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； 各E包含Fc域單體(例如，具有SEQ ID NO: 1-68中任一者之序列的Fc域單體)；各L-A1 中之L係共價附接至E中之鉸鏈半胱胺酸的硫原子且附接至A1 之連接體；T為1至20之整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，且連接至兩個硫原子之兩條波浪線指示各L-A1 共價附接(例如，藉助於共價鍵或連接體)至兩個E中之兩個鉸鏈半胱胺酸的一對硫原子，或其醫藥學上可接受之鹽。當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各A1 可獨立地選自式(A-VI)-(A-IX)中任一者。
在前述實施例中任一者之一些實施例中，各E包括具有SEQ ID NO: 1-68中任一者之序列的Fc域單體。
在一些實施例中，各E包含序列 MVRSDKTHTCPPCPPC*KC*PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKHHHHHH (SEQ ID NO: 10)。
在一些實施例中，各E包含序列 MVRSDKTHTCPPCPPC*KC*PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 11)。
在一些實施例中，該硫原子對中之至少一者係對應於SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之鉸鏈半胱胺酸，亦即SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys10、Cys13、Cys16或Cys18 (例如，其硫原子)的硫原子。在一些實施例中，該硫原子對係對應於SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11中之Cys10及Cys13、SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11中之Cys10及Cys16、SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11中之Cys 30及Cys18、SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11中之Cys13及Cys 36、SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11中之Cys13及Cys 38及/或SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11中之Cys 36及Cys 38 (例如，其硫原子)的硫原子。
在一些實施例中，當T為2時，該硫原子對係SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11中之Cys10及Cys13或SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11中之Cys 36及Cys 38 (例如，對應於其之硫原子)。
在一些實施例中，該硫原子對包括來自各E之半胱胺酸之一硫原子，亦即，L-A連同其所附接之硫原子形成兩個Fc域(例如，包含SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之序列的兩個Fc域)之間的橋。在一些實施例中，該硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys10(例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys10(例如，其硫原子)的硫原子。在一些實施例中，該硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子。在一些實施例中，該硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys16 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys16 (例如，其硫原子)的硫原子。在一些實施例中，該硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys18 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys18 (例如，其硫原子)的硫原子。
在一些實施例中，當T為2時，硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子，及對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子。在一些實施例中，當T為2時，硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子，及對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys16 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys16 (例如，其硫原子)的硫原子。在一些實施例中，當T為2時，硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子，及對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys18 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys18 (例如，其硫原子)的硫原子。
在一些實施例中，當T為2時，硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子，及對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys16 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys16 (例如，其硫原子)的硫原子。在一些實施例中，當T為2時，硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子，及對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys18 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys18 (例如，其硫原子)的硫原子。
在一些實施例中，當T為2時，硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys16 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys16 (例如，其硫原子)的硫原子，及對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys18 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys18 (例如，其硫原子)的硫原子。
在一些實施例中，當T為3時，硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子；對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子；及對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys16 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys16 (例如，其硫原子)的硫原子。在一些實施例中，當T為3時，硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子；對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子；及對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys18 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys18 (例如，其硫原子)的硫原子。在一些實施例中，當T為3時，硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子；對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys18 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys18 (例如，其硫原子)的硫原子；及對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys16 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys16 (例如，其硫原子)的硫原子。在一些實施例中，當T為3時，硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子；對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys18 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys18 (例如，其硫原子)的硫原子；及對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys16 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys16 (例如，其硫原子)的硫原子。
在一些實施例中，當T為3時，硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子；對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子；對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys16 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys16 (例如，其硫原子)的硫原子；及對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys18 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys18 (例如，其硫原子)的硫原子。
在一些實施例中，該結合物具有結構：
Figure 02_image144
其中a、b、c及d各自獨立地為0或1且其中當a、b、c或d為0時，兩個硫原子形成二硫鍵。
在一些實施例中，a為1且b、c及d為0。在一些實施例中，a及b為1且c及d為0。在一些實施例中，a及c為1且b及d為0。在一些實施例中，a及d為1且b及c為0。在一些實施例中，a、b及c為1且d為0。在一些實施例中，a、b及d為1且c為0。在一些實施例中，a、c及d為1且b為0。在一些實施例中，b及c為1且a及d為0。在一些實施例中，b及d為1且a及c為0。在一些實施例中，b、c及d為1且a為0。在一些實施例中，c及d為1且a及b為0。在一些實施例中，a、b、c及d為1。
在一些實施例中，各E包含序列 MVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 4)。
在一些實施例中，各E包含序列 MVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 33)。
在一些實施例中，該硫原子對中之至少一者係對應於SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 33之鉸鏈半胱胺酸，亦即Cys10及/或Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子。在一些實施例中，該硫原子對係對應於SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 33中之Cys10及Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子。
在一些實施例中，該硫原子對包括來自各E之半胱胺酸之一硫原子，亦即，L-A連同其所附接之硫原子形成兩個Fc域(例如，包含SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 33之序列的兩個Fc域)之間的橋。在一些實施例中，該硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 33之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 33之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子。在一些實施例中，該硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 33之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 33之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子。在一些實施例中，當T為2時，硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 33之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 33之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子，及對應於來自一個E之SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 33之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 33之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子。
在一些實施例中，該結合物具有結構：
Figure 02_image146
其中a及b各自獨立地為0或1且其中當a或b為0時，兩個硫原子形成二硫鍵。在一些實施例中，a為1且b為0。在一些實施例中，a為0且b為1。在一些實施例中，a及b為1。
在一些實施例中，各E包含序列 MVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKHHHHHH (SEQ ID NO: 8)。
在一些實施例中，該硫原子對中之至少一者係對應於SEQ ID NO: 8之鉸鏈半胱胺酸，亦即Cys10及/或Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子。在一些實施例中，該硫原子對係對應於SEQ ID NO: 8中之Cys10及Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子。
在一些實施例中，該硫原子對包括來自各E之半胱胺酸之一硫原子，亦即，L-A連同其所附接之硫原子形成兩個Fc域(例如，包含SEQ ID NO: 8之序列的兩個Fc域)之間的橋。在一些實施例中，該硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 8之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 8之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子。在一些實施例中，該硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 8之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 8之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子。在一些實施例中，當T為2時，硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 8之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 8之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子，及對應於來自一個E之SEQ ID NO: 8之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 8之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子。
在一些實施例中，該結合物具有結構：
Figure 02_image148
其中a及b各自獨立地為0或1且其中當a或b為0時，兩個硫原子形成二硫鍵。在一些實施例中，a為1且b為0。在一些實施例中，a為0且b為1。在一些實施例中，a及b為1。
在另一態樣中，本發明亦提供描述於任何前述態樣中之結合物之群體，其中T之平均值為1至20 (例如，T之平均值為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15或15至20)。在一些實施例中，T之平均值為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。
在另一態樣中，本發明提供一種由式(3)描述之結合物：
Figure 02_image150
(3) 其中各A1 及各A2 係獨立地選自式(A-I)-(A-VII)中任一者：
Figure 02_image005
、
Figure 02_image007
、
Figure 02_image009
、
Figure 02_image011
、
Figure 02_image013
、 (A-I)             (A-II)                      (A-III)                          (A-IV)                (A-V)
Figure 02_image015
、
Figure 02_image017
、
Figure 02_image019
、
Figure 02_image021
、 (A-VI)         (A-VII)                          (A-VIII)              (A-IX)
Figure 02_image023
、
Figure 02_image025
、
Figure 02_image027
； (A-X)                 (A-XI)                      (A-XII) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ；R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br；R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H；R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ；X係選自-O-及-S-；Y係選自
Figure 02_image153
Figure 02_image155
R6 係選自
Figure 02_image031
、
Figure 02_image033
、
Figure 02_image035
、
Figure 02_image037
、
Figure 02_image039
、
Figure 02_image041
、
Figure 02_image043
、
Figure 02_image045
、
Figure 02_image047
、
Figure 02_image049
、
Figure 02_image051
、
Figure 02_image053
、
Figure 02_image055
、
Figure 02_image057
、
Figure 02_image059
、
Figure 02_image061
、
Figure 02_image063
、
Figure 02_image065
、
Figure 02_image067
、
Figure 02_image069
、
Figure 02_image071
、
Figure 02_image073
、
Figure 02_image075
、
Figure 02_image077
、
Figure 02_image079
、
Figure 02_image081
、
Figure 02_image083
、
Figure 02_image085
、
Figure 02_image087
、
Figure 02_image089
、
Figure 02_image091
及
Figure 02_image093
； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；E包含Fc域單體或Fc域(例如Fc域單體或Fc域，各Fc域單體獨立地具有SEQ ID NO: 1-68中任一者之序列)；各A1 -L-A2 中之L係共價附接至E中之鉸鏈半胱胺酸的硫原子且附接至A1 及A2 中每一者之連接體；T為1至20之整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，且連接至E之波浪線指示各A1 -L-A2 共價(例如，藉助於共價鍵或連接體)附接至E中之鉸鏈半胱胺酸的硫原子，或其醫藥學上可接受之鹽。當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各A1 -L-A2 可獨立地經選擇(例如，獨立地選自本文所述之A1 -L-A2 結構中任一者)。
在另一態樣中，本發明提供一種由式(3)描述之結合物：
Figure 02_image150
(3) 其中各A1 及各A2 係獨立地選自式(A-I)-(A-V)中任一者：
Figure 02_image005
、
Figure 02_image007
、
Figure 02_image009
、
Figure 02_image011
、
Figure 02_image013
； (A-I)             (A-II)                      (A-III)                          (A-IV)                (A-V) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ；R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br；R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H；R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ；X係選自-O-及-S-；Y係選自
Figure 02_image157
R6 係選自
Figure 02_image031
、
Figure 02_image033
、
Figure 02_image035
、
Figure 02_image037
、
Figure 02_image039
、
Figure 02_image041
、
Figure 02_image043
、
Figure 02_image045
、
Figure 02_image047
、
Figure 02_image049
、
Figure 02_image051
、
Figure 02_image053
、
Figure 02_image055
、
Figure 02_image057
、
Figure 02_image059
、
Figure 02_image061
、
Figure 02_image063
、
Figure 02_image065
、
Figure 02_image067
、
Figure 02_image069
、
Figure 02_image071
、
Figure 02_image073
、
Figure 02_image075
、
Figure 02_image077
、
Figure 02_image079
、
Figure 02_image081
、
Figure 02_image083
、
Figure 02_image085
、
Figure 02_image087
、
Figure 02_image089
、
Figure 02_image091
及
Figure 02_image093
； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；E包含Fc域單體或Fc域(例如Fc域單體或Fc域，各Fc域單體獨立地具有SEQ ID NO: 1-68中任一者之序列)；各A1 -L-A2 中之L係共價附接至E中之鉸鏈半胱胺酸的硫原子且附接至A1 及A2 中每一者之連接體；T為1至20之整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，且連接至E之波浪線指示各A1 -L-A2 共價附接(例如，藉助於共價鍵或連接體)至E中之鉸鏈半胱胺酸的硫原子，或其醫藥學上可接受之鹽。當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各A1 -L-A2 可獨立地經選擇(例如，獨立地選自本文所述之A1 -L-A2 結構中任一者)。
在另一態樣中，本發明提供一種由式(3)描述之結合物：
Figure 02_image150
(3) 其中各A1 及各A2 係獨立地選自式(A-VI)-(A-IX)中任一者：
Figure 02_image015
、
Figure 02_image017
、
Figure 02_image019
、
Figure 02_image021
； (A-VI)         (A-VII)                          (A-VIII)              (A-IX) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ；R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br；R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H；R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ；X係選自-O-及-S-；Y係選自
Figure 02_image160
R6 係選自
Figure 02_image031
、
Figure 02_image033
、
Figure 02_image035
、
Figure 02_image037
、
Figure 02_image039
、
Figure 02_image041
、
Figure 02_image043
、
Figure 02_image045
、
Figure 02_image047
、
Figure 02_image049
、
Figure 02_image051
、
Figure 02_image053
、
Figure 02_image055
、
Figure 02_image057
、
Figure 02_image059
、
Figure 02_image061
、
Figure 02_image063
、
Figure 02_image065
、
Figure 02_image067
、
Figure 02_image069
、
Figure 02_image071
、
Figure 02_image073
、
Figure 02_image075
、
Figure 02_image077
、
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、
Figure 02_image081
、
Figure 02_image083
、
Figure 02_image085
、
Figure 02_image087
、
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、
Figure 02_image091
及
Figure 02_image093
； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；E包含Fc域單體或Fc域(例如Fc域單體或Fc域，各Fc域單體獨立地具有SEQ ID NO: 1-68中任一者之序列)；各A1 -L-A2 中之L係共價附接至E中之鉸鏈半胱胺酸的硫原子且附接至A1 及A2 中每一者之連接體；T為1至20之整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，且連接至E之波浪線指示各A1 -L-A2 共價附接(例如，藉助於共價鍵或連接體)至E中之鉸鏈半胱胺酸的硫原子，或其醫藥學上可接受之鹽。當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各A1 -L-A2 可獨立地經選擇(例如，獨立地選自本文所述之A1 -L-A2 結構中任一者)。
在一些實施例中，各E包括具有SEQ ID NO: 1-68中任一者之序列的Fc域單體。
在一些實施例中，各E包含序列 MVRSDKTHTCPPCPPC*KC*PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKHHHHHH (SEQ ID NO: 10)。
在一些實施例中，各E包含序列 MVRSDKTHTCPPCPPC*KC*PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 11)。
在一些實施例中，該硫原子對中之至少一者係對應於SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之鉸鏈半胱胺酸，亦即SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys10、Cys13、Cys16或Cys18 (例如，其硫原子)的硫原子。在一些實施例中，該硫原子對係對應於SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11中之Cys10及Cys13、SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11中之Cys10及Cys16、SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11中之Cys 30及Cys18、SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11中之Cys13及Cys 36、SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11中之Cys13及Cys 38及/或SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11中之Cys 36及Cys 38 (例如，其硫原子)的硫原子。
在一些實施例中，當T為2時，該硫原子對係對應於SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11中之Cys10及Cys13及SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11中之Cys 36及Cys 38 (例如，其硫原子)的硫原子。
在一些實施例中，該硫原子對包括來自各E之半胱胺酸之一硫原子，亦即，L-A連同其所附接之硫原子形成兩個Fc域(例如，包含SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 1之序列的兩個Fc域)之間的橋。在一些實施例中，該硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子。在一些實施例中，該硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子。在一些實施例中，該硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys16 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys16 (例如，其硫原子)的硫原子。在一些實施例中，該硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys18 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys18 (例如，其硫原子)的硫原子。
在一些實施例中，當T為2時，硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子，及對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子。在一些實施例中，當T為2時，硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子，及對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys16 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys16 (例如，其硫原子)的硫原子。在一些實施例中，當T為2時，硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子，及對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys18 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys18 (例如，其硫原子)的硫原子。
在一些實施例中，當T為2時，硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子，及對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys16 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys16 (例如，其硫原子)的硫原子。在一些實施例中，當T為2時，硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子，及對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys18 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys18 (例如，其硫原子)的硫原子。
在一些實施例中，當T為2時，硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys16 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys16 (例如，其硫原子)的硫原子，及對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys18 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys18 (例如，其硫原子)的硫原子。
在一些實施例中，當T為3時，硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子；對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子；及對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys16 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys16 (例如，其硫原子)的硫原子。在一些實施例中，當T為3時，硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子；對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子；及對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys18 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys18 (例如，其硫原子)的硫原子。在一些實施例中，當T為3時，硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子；對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys18 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys18 (例如，其硫原子)的硫原子；及對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys16 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys16 (例如，其硫原子)的硫原子。在一些實施例中，當T為3時，硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子；對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys18 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys18 (例如，其硫原子)的硫原子；及對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys16 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys16 (例如，其硫原子)的硫原子。
在一些實施例中，當T為3時，硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子；對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子；對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys16 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys16 (例如，其硫原子)的硫原子；及對應於來自一個E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys18 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys18 (例如，其硫原子)的硫原子。
在一些實施例中，該結合物具有結構：
Figure 02_image163
其中a、b、c及d各自獨立地為0或1且其中當a、b、c或d為0時，兩個硫原子形成二硫鍵。
在一些實施例中，a為1且b、c及d為0。在一些實施例中，a及b為1且c及d為0。在一些實施例中，a及c為1且b及d為0。在一些實施例中，a及d為1且b及c為0。在一些實施例中，a、b及c為1且d為0。在一些實施例中，a、b及d為1且c為0。在一些實施例中，a、c及d為1且b為0。在一些實施例中，b及c為1且a及d為0。在一些實施例中，b及d為1且a及c為0。在一些實施例中，b、c及d為1且a為0。在一些實施例中，c及d為1且a及b為0。在一些實施例中，a、b、c及d為1。
在一些實施例中，各E包含序列 MVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 4)。
在一些實施例中，各E包含序列 MVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 33)。
在一些實施例中，該硫原子對中之至少一者係對應於SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 33之鉸鏈半胱胺酸，亦即Cys10及/或Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子。在一些實施例中，該硫原子對係對應於SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 33中之Cys10及Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子。
在一些實施例中，該硫原子對包括來自各E之半胱胺酸之一硫原子，亦即，L-A連同其所附接之硫原子形成兩個Fc域(例如，包含SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 33之序列的兩個Fc域)之間的橋。在一些實施例中，該硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 33之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 33之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子。在一些實施例中，該硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 33之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 33之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子。在一些實施例中，當T為2時，硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 33之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 33之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子，及對應於來自一個E之SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 33之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 33之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子。
在一些實施例中，該結合物具有結構：
Figure 02_image165
其中a及b各自獨立地為0或1且其中當a或b為0時，兩個硫原子形成二硫鍵。在一些實施例中，a為1且b為0。在一些實施例中，a為0且b為1。在一些實施例中，a及b為1。
在一些實施例中，各E包含序列 MVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKHHHHHH (SEQ ID NO: 8)。
在一些實施例中，該硫原子對中之至少一者係對應於SEQ ID NO: 8之鉸鏈半胱胺酸，亦即Cys10及/或Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子。在一些實施例中，該硫原子對係對應於SEQ ID NO: 8中之Cys10及Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子。
在一些實施例中，該硫原子對包括來自各E之半胱胺酸之一硫原子，亦即，L-A連同其所附接之硫原子形成兩個Fc域(例如，包含SEQ ID NO: 8之序列的兩個Fc域)之間的橋。在一些實施例中，該硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 8之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 8之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子。在一些實施例中，該硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 8之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 8之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子。在一些實施例中，當T為2時，硫原子對係對應於來自一個E之SEQ ID NO: 8之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 8之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子，及對應於來自一個E之SEQ ID NO: 8之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子及對應於來自另一E之SEQ ID NO: 8之Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子。
在一些實施例中，該結合物具有結構：
Figure 02_image167
其中a及b各自獨立地為0或1且其中當a或b為0時，兩個硫原子形成二硫鍵。在一些實施例中，a為1且b為0。在一些實施例中，a為0且b為1。在一些實施例中，a及b為1。
在另一態樣中，本發明提供一種由式(4)描述之結合物：
Figure 02_image169
(4) 其中各A1 係獨立地選自式(A-I)-(A-XII)中任一者：
Figure 02_image005
、
Figure 02_image007
、
Figure 02_image009
、
Figure 02_image011
、
Figure 02_image013
、 (A-I)             (A-II)                      (A-III)                          (A-IV)                (A-V)
Figure 02_image015
、
Figure 02_image017
、
Figure 02_image019
、
Figure 02_image021
、 (A-VI)         (A-VII)                          (A-VIII)              (A-IX)
Figure 02_image023
、
Figure 02_image025
、
Figure 02_image027
； (A-X)                 (A-XI)                      (A-XII) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ；R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br；R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H；R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ；X係選自-O-及-S-；Y係選自
Figure 02_image177
Figure 02_image179
R6 係選自
Figure 02_image031
、
Figure 02_image033
、
Figure 02_image035
、
Figure 02_image037
、
Figure 02_image039
、
Figure 02_image041
、
Figure 02_image043
、
Figure 02_image045
、
Figure 02_image047
、
Figure 02_image049
、
Figure 02_image051
、
Figure 02_image053
、
Figure 02_image055
、
Figure 02_image057
、
Figure 02_image059
、
Figure 02_image061
、
Figure 02_image063
、
Figure 02_image065
、
Figure 02_image067
、
Figure 02_image069
、
Figure 02_image071
、
Figure 02_image073
、
Figure 02_image075
、
Figure 02_image077
、
Figure 02_image079
、
Figure 02_image081
、
Figure 02_image083
、
Figure 02_image085
、
Figure 02_image087
、
Figure 02_image089
、
Figure 02_image091
及
Figure 02_image093
； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； E包含Fc域單體或Fc域(例如Fc域單體或Fc域，各Fc域單體獨立地具有SEQ ID NO: 1-68中任一者之序列)；各L-A1 中之L係共價附接至E中之鉸鏈半胱胺酸的硫原子且附接至A1 之連接體；T為1至20之整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)；且連接至E之波浪線指示各L-A1 共價附接(例如，藉助於共價鍵或連接體)至E中之鉸鏈半胱胺酸的硫原子，或其醫藥學上可接受之鹽。當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各A1 可獨立地選自式(A-I)-(A-XII)中任一者。
在另一態樣中，本發明提供一種由式(4)描述之結合物：
Figure 02_image169
(4) 其中各A1 係獨立地選自式(A-I)-(A-V)中任一者：
Figure 02_image005
、
Figure 02_image007
、
Figure 02_image009
、
Figure 02_image011
、
Figure 02_image013
； (A-I)             (A-II)                      (A-III)                          (A-IV)                (A-V) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ；R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br；R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H；R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ；X係選自-O-及-S-；Y係選自
Figure 02_image186
R6 係選自
Figure 02_image031
、
Figure 02_image033
、
Figure 02_image035
、
Figure 02_image037
、
Figure 02_image039
、
Figure 02_image041
、
Figure 02_image043
、
Figure 02_image045
、
Figure 02_image047
、
Figure 02_image049
、
Figure 02_image051
、
Figure 02_image053
、
Figure 02_image055
、
Figure 02_image057
、
Figure 02_image059
、
Figure 02_image061
、
Figure 02_image063
、
Figure 02_image065
、
Figure 02_image067
、
Figure 02_image069
、
Figure 02_image071
、
Figure 02_image073
、
Figure 02_image075
、
Figure 02_image077
、
Figure 02_image079
、
Figure 02_image081
、
Figure 02_image083
、
Figure 02_image085
、
Figure 02_image087
、
Figure 02_image089
、
Figure 02_image091
及
Figure 02_image093
； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； E包含Fc域單體或Fc域(例如Fc域單體或Fc域，各Fc域單體獨立地具有SEQ ID NO: 1-68中任一者之序列)；各L-A1 中之L係共價附接至E中之鉸鏈半胱胺酸的硫原子且附接至A1 之連接體；T為1至20之整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)；且連接至E之波浪線指示各L-A1 共價附接(例如，藉助於共價鍵或連接體)至E中之鉸鏈半胱胺酸的硫原子，或其醫藥學上可接受之鹽。當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各A1 可獨立地選自式(A-I)-(A-V)中任一者。
在另一態樣中，本發明提供一種由式(4)描述之結合物：
Figure 02_image169
(4) 其中各A1 係獨立地選自式(A-VI)-(A-IX)中任一者：
Figure 02_image015
、
Figure 02_image017
、
Figure 02_image019
、
Figure 02_image021
； (A-VI)         (A-VII)                          (A-VIII)               (A-IX) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ；R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br；R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H；R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ；X係選自-O-及-S-；Y係選自
Figure 02_image193
R6 係選自
Figure 02_image031
、
Figure 02_image033
、
Figure 02_image035
、
Figure 02_image037
、
Figure 02_image039
、
Figure 02_image041
、
Figure 02_image043
、
Figure 02_image045
、
Figure 02_image047
、
Figure 02_image049
、
Figure 02_image051
、
Figure 02_image053
、
Figure 02_image055
、
Figure 02_image057
、
Figure 02_image059
、
Figure 02_image061
、
Figure 02_image063
、
Figure 02_image065
、
Figure 02_image067
、
Figure 02_image069
、
Figure 02_image071
、
Figure 02_image073
、
Figure 02_image075
、
Figure 02_image077
、
Figure 02_image079
、
Figure 02_image081
、
Figure 02_image083
、
Figure 02_image085
、
Figure 02_image087
、
Figure 02_image089
、
Figure 02_image091
及
Figure 02_image093
； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； E包含Fc域單體或Fc域(例如Fc域單體或Fc域，各Fc域單體獨立地具有SEQ ID NO: 1-68中任一者之序列)；各L-A1 中之L係共價附接至E中之鉸鏈半胱胺酸的硫原子且附接至A1 之連接體；T為1至20之整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)；且連接至E之波浪線指示各L-A1 共價附接(例如，藉助於共價鍵或連接體)至E中之鉸鏈半胱胺酸的硫原子，或其醫藥學上可接受之鹽。當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各A1 可獨立地選自式(A-VI)-(A-IX)中任一者。
在一些實施例中，各E包括具有SEQ ID NO: 1-68中任一者之序列的Fc域單體。
在一些實施例中，各E包含序列 MVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 4)。
在一些實施例中，各E包含序列 MVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 33)。
在一些實施例中，該等硫原子之至少一者係對應於SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 33之鉸鏈半胱胺酸，亦即Cys10及/或Cys13 (例如，其硫原子)的硫原子。在一些實施例中，該等硫原子係對應於SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 33中之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子。在一些實施例中，對應於SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 33中之Cys10 (例如，其硫原子)的硫原子。
在一些實施例中，該結合物具有結構：
Figure 02_image195
其中a及b各自獨立地為0或1且其中當a或b為0時，該等硫原子為硫醇。在一些實施例中，a為1且b為0。在一些實施例中，a為0且b為1。在一些實施例中，a及b為1。
在另一態樣中，本發明提供結合物之群體，其中T之平均值為1至20 (例如，T之平均值為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15或15至20)。在一些實施例中，T之平均值為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。
在另一態樣中，本發明提供一種由式(3)描述之結合物：
Figure 02_image150
(3) 其中各A1 及各A2 係獨立地選自式(A-I)-(A-XII)中任一者：
Figure 02_image005
、
Figure 02_image007
、
Figure 02_image009
、
Figure 02_image011
、
Figure 02_image013
、 (A-I)             (A-II)                      (A-III)                          (A-IV)                (A-V)
Figure 02_image015
、
Figure 02_image017
、
Figure 02_image019
、
Figure 02_image021
、 (A-VI)         (A-VII)                          (A-VIII)              (A-IX)
Figure 02_image023
、
Figure 02_image025
、
Figure 02_image027
； (A-X)                 (A-XI)                      (A-XII) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ；R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br；R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H；R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ；X係選自-O-及-S-；Y係選自
Figure 02_image198
Figure 02_image200
R6 係選自
Figure 02_image031
、
Figure 02_image033
、
Figure 02_image035
、
Figure 02_image037
、
Figure 02_image039
、
Figure 02_image041
、
Figure 02_image043
、
Figure 02_image045
、
Figure 02_image047
、
Figure 02_image049
、
Figure 02_image051
、
Figure 02_image053
、
Figure 02_image055
、
Figure 02_image057
、
Figure 02_image059
、
Figure 02_image061
、
Figure 02_image063
、
Figure 02_image065
、
Figure 02_image067
、
Figure 02_image069
、
Figure 02_image071
、
Figure 02_image073
、
Figure 02_image075
、
Figure 02_image077
、
Figure 02_image079
、
Figure 02_image081
、
Figure 02_image083
、
Figure 02_image085
、
Figure 02_image087
、
Figure 02_image089
、
Figure 02_image091
及
Figure 02_image093
； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；E包含Fc域單體或Fc域(例如Fc域單體或Fc域，各Fc域單體獨立地具有SEQ ID NO: 1-68中任一者之序列)；各A1 -L-A2 中之L係共價附接至E中之表面暴露離胺酸的氮原子且附接至A1 及A2 中每一者之連接體；T為1至20之整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，且連接至E之波浪線指示各A1 -L-A2 共價附接(例如，藉助於共價鍵或連接體)至E中之表面暴露離胺酸的氮原子，或其醫藥學上可接受之鹽。當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各A1 -L-A2 可獨立地經選擇(例如，獨立地選自本文所述之A1 -L-A2 結構中任一者)。
在另一態樣中，本發明提供一種由式(3)描述之結合物：
Figure 02_image150
(3) 其中各A1 及各A2 係獨立地選自式(A-I)-(A-V)中任一者：
Figure 02_image005
、
Figure 02_image007
、
Figure 02_image009
、
Figure 02_image011
、
Figure 02_image013
； (A-I)             (A-II)                      (A-III)                          (A-IV)                (A-V) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ；R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br；R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H；R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ；X係選自-O-及-S-；Y係選自
Figure 02_image205
R6 係選自
Figure 02_image031
、
Figure 02_image033
、
Figure 02_image035
、
Figure 02_image037
、
Figure 02_image039
、
Figure 02_image041
、
Figure 02_image043
、
Figure 02_image045
、
Figure 02_image047
、
Figure 02_image049
、
Figure 02_image051
、
Figure 02_image053
、
Figure 02_image055
、
Figure 02_image057
、
Figure 02_image059
、
Figure 02_image061
、
Figure 02_image063
、
Figure 02_image065
、
Figure 02_image067
、
Figure 02_image069
、
Figure 02_image071
、
Figure 02_image073
、
Figure 02_image075
、
Figure 02_image077
、
Figure 02_image079
、
Figure 02_image081
、
Figure 02_image083
、
Figure 02_image085
、
Figure 02_image087
、
Figure 02_image089
、
Figure 02_image091
及
Figure 02_image093
； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；E包含Fc域單體或Fc域(例如Fc域單體或Fc域，各Fc域單體獨立地具有SEQ ID NO: 1-68中任一者之序列)；各A1 -L-A2 中之L係共價附接至E中之表面暴露離胺酸的氮原子且附接至A1 及A2 中每一者之連接體；T為1至20之整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，且連接至E之波浪線指示各A1 -L-A2 共價附接(例如，藉助於共價鍵或連接體)至E中之表面暴露離胺酸的氮原子，或其醫藥學上可接受之鹽。當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各A1 -L-A2 可獨立地經選擇(例如，獨立地選自本文所述之A1 -L-A2 結構中任一者)。
在另一態樣中，本發明提供一種由式(3)描述之結合物：
Figure 02_image150
(3) 其中各A1 及各A2 係獨立地選自式(A-VI)-(A-IX)中任一者：
Figure 02_image015
、
Figure 02_image017
、
Figure 02_image019
、
Figure 02_image021
； (A-VI)         (A-VII)                        (A-VIII)               (A-IX) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ；R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br；R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H；R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ；X係選自-O-及-S-；Y係選自
Figure 02_image208
R6 係選自
Figure 02_image031
、
Figure 02_image033
、
Figure 02_image035
、
Figure 02_image037
、
Figure 02_image039
、
Figure 02_image041
、
Figure 02_image043
、
Figure 02_image045
、
Figure 02_image047
、
Figure 02_image049
、
Figure 02_image051
、
Figure 02_image053
、
Figure 02_image055
、
Figure 02_image057
、
Figure 02_image059
、
Figure 02_image061
、
Figure 02_image063
、
Figure 02_image065
、
Figure 02_image067
、
Figure 02_image069
、
Figure 02_image071
、
Figure 02_image073
、
Figure 02_image075
、
Figure 02_image077
、
Figure 02_image079
、
Figure 02_image081
、
Figure 02_image083
、
Figure 02_image085
、
Figure 02_image087
、
Figure 02_image089
、
Figure 02_image091
及
Figure 02_image093
； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；E包含Fc域單體或Fc域(例如Fc域單體或Fc域，各Fc域單體獨立地具有SEQ ID NO: 1-68中任一者之序列)；各A1 -L-A2 中之L係共價附接至E中之表面暴露離胺酸的氮原子且附接至A1 及A2 中每一者之連接體；T為1至20之整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，且連接至E之波浪線指示各A1 -L-A2 共價附接(例如，藉助於共價鍵或連接體)至E中之表面暴露離胺酸的氮原子，或其醫藥學上可接受之鹽。當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各A1 -L-A2 可獨立地經選擇(例如，獨立地選自本文所述之A1 -L-A2 結構中任一者)。
在另一態樣中，本發明提供一種由式(4)描述之結合物：
Figure 02_image210
(4) 其中各A1 係獨立地選自式(A-I)-(A-XII)中任一者：
Figure 02_image005
、
Figure 02_image007
、
Figure 02_image009
、
Figure 02_image011
、
Figure 02_image013
、 (A-I)             (A-II)                      (A-III)                          (A-IV)                (A-V)
Figure 02_image015
、
Figure 02_image017
、
Figure 02_image019
、
Figure 02_image021
、 (A-VI)                (A-VII)                   (A-VIII)              (A-IX)
Figure 02_image023
、
Figure 02_image025
、
Figure 02_image027
； (A-X)                 (A-XI)                      (A-XII) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ；R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br；R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H；R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ；X係選自-O-及-S-；Y係選自
Figure 02_image212
Figure 02_image214
R6 係選自
Figure 02_image031
、
Figure 02_image033
、
Figure 02_image035
、
Figure 02_image037
、
Figure 02_image039
、
Figure 02_image041
、
Figure 02_image043
、
Figure 02_image045
、
Figure 02_image047
、
Figure 02_image049
、
Figure 02_image051
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Figure 02_image053
、
Figure 02_image055
、
Figure 02_image057
、
Figure 02_image059
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Figure 02_image061
、
Figure 02_image063
、
Figure 02_image065
、
Figure 02_image067
、
Figure 02_image069
、
Figure 02_image071
、
Figure 02_image073
、
Figure 02_image075
、
Figure 02_image077
、
Figure 02_image079
、
Figure 02_image081
、
Figure 02_image083
、
Figure 02_image085
、
Figure 02_image087
、
Figure 02_image089
、
Figure 02_image091
及
Figure 02_image093
； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；E包含Fc域單體或Fc域(例如Fc域單體或Fc域，各Fc域單體獨立地具有SEQ ID NO: 1-68中任一者之序列)；各L-A1 中之L係共價附接至E中之表面暴露離胺酸的氮原子且附接至A1 之連接體；T為1至20之整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，連接至E之波浪線指示各L-A1 共價附接(例如，藉助於共價鍵或連接體)至E中之表面暴露離胺酸的氮原子，或其醫藥學上可接受之鹽。當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各A可獨立地選自式(A-I)-(A-XII)中任一者。
在另一態樣中，本發明提供一種由式(4)描述之結合物：
Figure 02_image210
(4) 其中各A1 係獨立地選自式(A-I)-(A-V)中任一者：
Figure 02_image005
、
Figure 02_image007
、
Figure 02_image009
、
Figure 02_image011
、
Figure 02_image013
； (A-I)             (A-II)                      (A-III)                          (A-IV)                (A-V) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ；R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br；R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H；R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ；X係選自-O-及-S-；Y係選自
Figure 02_image217
Figure 02_image219
R6 係選自
Figure 02_image031
、
Figure 02_image033
、
Figure 02_image035
、
Figure 02_image037
、
Figure 02_image039
、
Figure 02_image041
、
Figure 02_image043
、
Figure 02_image045
、
Figure 02_image047
、
Figure 02_image049
、
Figure 02_image051
、
Figure 02_image053
、
Figure 02_image055
、
Figure 02_image057
、
Figure 02_image059
、
Figure 02_image061
、
Figure 02_image063
、
Figure 02_image065
、
Figure 02_image067
、
Figure 02_image069
、
Figure 02_image071
、
Figure 02_image073
、
Figure 02_image075
、
Figure 02_image077
、
Figure 02_image079
、
Figure 02_image081
、
Figure 02_image083
、
Figure 02_image085
、
Figure 02_image087
、
Figure 02_image089
、
Figure 02_image091
及
Figure 02_image093
； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；E包含Fc域單體或Fc域(例如Fc域單體或Fc域，各Fc域單體獨立地具有SEQ ID NO: 1-68中任一者之序列)；各L-A1 中之L係共價附接至E中之表面暴露離胺酸的氮原子且附接至A1 之連接體；T為1至20之整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，連接至E之波浪線指示各L-A1 共價附接(例如，藉助於共價鍵或連接體)至E中之表面暴露離胺酸的氮原子，或其醫藥學上可接受之鹽。當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各A1 可獨立地選自式(A-I)-(A-V)中任一者。
在另一態樣中，本發明提供一種由式(4)描述之結合物：
Figure 02_image210
(4) 其中各A1 係獨立地選自式(A-VI)-(A-IX)中任一者：
Figure 02_image015
、
Figure 02_image017
、
Figure 02_image019
、
Figure 02_image021
； (A-VI)         (A-VII)                          (A-VIII)               (A-IX) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ；R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br；R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H；R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ；X係選自-O-及-S-；Y係選自
Figure 02_image226
R6 係選自
Figure 02_image031
、
Figure 02_image033
、
Figure 02_image035
、
Figure 02_image037
、
Figure 02_image039
、
Figure 02_image041
、
Figure 02_image043
、
Figure 02_image045
、
Figure 02_image047
、
Figure 02_image049
、
Figure 02_image051
、
Figure 02_image053
、
Figure 02_image055
、
Figure 02_image057
、
Figure 02_image059
、
Figure 02_image061
、
Figure 02_image063
、
Figure 02_image065
、
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、
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、
Figure 02_image071
、
Figure 02_image073
、
Figure 02_image075
、
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、
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、
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、
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、
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、
Figure 02_image087
、
Figure 02_image089
、
Figure 02_image091
及
Figure 02_image093
； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；E包含Fc域單體或Fc域(例如Fc域單體或Fc域，各Fc域單體獨立地具有SEQ ID NO: 1-68中任一者之序列)；各L-A1 中之L係共價附接至E中之表面暴露離胺酸的氮原子且附接至A之連接體；T為1至20之整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，連接至E之波浪線指示各L-A1 共價附接(例如，藉助於共價鍵或連接體)至E中之表面暴露離胺酸的氮原子，或其醫藥學上可接受之鹽。當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各A1 可獨立地選自式(A-VI)-(A-IX)中任一者。
在另一態樣中，本發明提供一種由式(5)描述之結合物：
Figure 02_image230
(5) 其中各Int係獨立地選自表1之任一中間物；E包含Fc域單體或Fc域(例如Fc域單體或Fc域，各Fc域單體獨立地具有SEQ ID NO: 1-68中任一者之序列)；各L-Int中之L係共價附接至E中之表面暴露離胺酸的氮原子且附接至Int之連接體；T為1至20之整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，連接至E之波浪線指示各L-Int共價附接(例如，藉助於共價鍵或連接體)至E中之表面暴露離胺酸的氮原子或表面暴露半胱胺酸的硫原子，或其醫藥學上可接受之鹽。當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各Int可獨立地選自表1之任一中間物。
表1之中間物可藉由熟習此項技術者已知之任何合適方法，包括本文所述或例示之任何方法結合於Fc域或Fc域單體(例如，藉助於連接體)。在一些實施例中，該結合物(例如，由式(5)描述之結合物)包含E，其中E為Fc域單體或Fc域(例如Fc域單體或Fc域，各Fc域單體獨立地具有SEQ ID NO: 1-68中任一者之序列)。在較佳實施例中，E之一或多個表面暴露離胺酸殘基的一或多個氮原子或E中之一或多個表面暴露半胱胺酸的一或多個硫原子共價結合於連接體(例如，PEG2 -PEG20 連接體)。結合於E之連接體可經官能化，以致其可反應以與本文所述之任何Int (例如，表1之Int)形成共價鍵。在較佳實施例中，E結合於經疊氮基官能化之連接體且Int (例如，表1之Int)經炔基官能化。E之連接體-疊氮基及Int之連接體-炔結合(例如，藉由點擊化學)形成本發明結合物，例如由式(5)描述之結合物。在其他實施例中，E結合於經炔基官能化之連接體且Int (例如，表1之Int)經疊氮基官能化。E之連接體-炔及Int之連接體-疊氮基結合(例如，藉由點擊化學)形成本發明結合物，例如由式(5)描述之結合物。 表1：中間物
Figure 02_image232
Figure 02_image234
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Figure 02_image264
Figure 02_image266
Figure 02_image268
在一些實施例中，各E包括具有SEQ ID NO: 1-68中任一者之序列的Fc域單體。
在一些實施例中，E包括序列 MVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 4)。
在一些實施例中，各E包括序列 MVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 33)。
在一些實施例中，E包括序列 MVRSDKTHTCPPCPPC*KC*PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKHHHHHH (SEQ ID NO: 10)
在一些實施例中，各E包含序列 MVRSDKTHTCPPCPPC*KC*PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 11)。
在前述三個態樣之一些實施例中，該氮原子為表面暴露離胺酸之氮，例如對應於SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Lys35、Lys63、Lys77、Lys79、Lys106、Lys123、Lys129、Lys181、Lys203、Lys228或Lys236 (例如，其氮原子)的氮原子。在一些實施例中，該氮原子係對應於SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Lys65、Lys79、Lys108、Lys230及/或Lys238 (例如，其氮原子)的氮原子。
在一些實施例中，該結合物具有結構：
Figure 02_image270
其中a、b、c、d及e各自獨立地為0或1且其中當a、b、c、d或e為0時，兩個氮原子為NH2 。在一些實施例中，a為1且b、c、d及e為0。在一些實施例中，b為1且a、c、d及e為0。在一些實施例中，c為1且a、b、d及e為0。在一些實施例中，d為1且a、b、c及e為0。在一些實施例中，e為1且a、b、c及d為0。在一些實施例中，a及b為1且c、d及e為0。在一些實施例中，a及c為1且b、d及e為0。在一些實施例中，a及d為1且b、c及e為0。在一些實施例中，a及e為1且b、c及d為0。在一些實施例中，b及c為1且a、d及e為0。在一些實施例中，b及d為1且a、c及e為0。在一些實施例中，b及e為1且a、c及d為0。在一些實施例中，c及d為1且a、b及e為0。在一些實施例中，c及e為1且a、b及d為0。在一些實施例中，d及e為1且a、b及c為0。在一些實施例中，a、b及c為1且d及e為0。在一些實施例中，a、b及d為1且c及e為0。在一些實施例中，a、b及e為1且c及d為0。在一些實施例中，a、c及d為1且b及e為0。在一些實施例中，a、c及e為1且b及d為0。在一些實施例中，a、d及e為1且b及c為0。在一些實施例中，b、c及d為1且a及e為0。在一些實施例中，b、d及e為1且a及c為0。在一些實施例中，c、d及e為1且a及b為0。
在另一態樣中，本發明提供描述於任何前述態樣中之結合物之群體，其中T之平均值為1至20 (例如，T之平均值為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15或15至20)。在一些實施例中，T之平均值為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。
在本文所述之結合物的一些實施例中，該結合物形成包括Fc域之均二聚體。
在本文所述之結合物的一些實施例中，E與另一E均二聚以形成Fc域。
在另一態樣中，本發明提供一種由式(3)描述之結合物：
Figure 02_image150
(3) 其中各A1 及各A2 係獨立地選自式(A-I)-(A-XII)中任一者：
Figure 02_image005
、
Figure 02_image007
、
Figure 02_image009
、
Figure 02_image011
、
Figure 02_image013
、 (A-I)             (A-II)                      (A-III)                          (A-IV)                (A-V)
Figure 02_image015
、
Figure 02_image017
、
Figure 02_image019
、
Figure 02_image021
、 (A-VI)         (A-VII)                   (A-VIII)       (A-IX)
Figure 02_image023
、
Figure 02_image025
、
Figure 02_image027
； (A-X)                 (A-XI)                      (A-XII) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ；R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br；R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H；R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ；X係選自-O-及-S-；Y係選自
Figure 02_image274
Figure 02_image276
R6 係選自
Figure 02_image031
、
Figure 02_image033
、
Figure 02_image035
、
Figure 02_image037
、
Figure 02_image039
、
Figure 02_image041
、
Figure 02_image043
、
Figure 02_image045
、
Figure 02_image047
、
Figure 02_image049
、
Figure 02_image051
、
Figure 02_image053
、
Figure 02_image055
、
Figure 02_image057
、
Figure 02_image059
、
Figure 02_image061
、
Figure 02_image063
、
Figure 02_image065
、
Figure 02_image067
、
Figure 02_image069
、
Figure 02_image071
、
Figure 02_image073
、
Figure 02_image075
、
Figure 02_image077
、
Figure 02_image079
、
Figure 02_image081
、
Figure 02_image083
、
Figure 02_image085
、
Figure 02_image087
、
Figure 02_image089
、
Figure 02_image091
及
Figure 02_image093
； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； E包含白蛋白(例如，具有SEQ ID NO: 69-71中任一者之序列的白蛋白)、白蛋白結合肽或Fc結合肽；各A1 -L-A2 中之L係獨立地共價附接至E中之表面暴露半胱胺酸的硫原子或表面暴露離胺酸的氮原子且附接至A1 及A2 中每一者之連接體；T為1至20之整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，且連接至E之波浪線指示各A1 -L-A2 獨立地共價附接(例如，藉助於鍵或連接體)至E中之溶劑暴露半胱胺酸的硫原子或溶劑暴露離胺酸的氮原子，或其醫藥學上可接受之鹽。當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各A1 -L-A2 可獨立地經選擇(例如，獨立地選自本文所述之A1 -L-A2 結構中任一者)。
在另一態樣中，本發明提供一種由式(3)描述之結合物：
Figure 02_image150
(3) 其中各A1 及各A2 係獨立地選自式(A-I)-(A-V)中任一者：
Figure 02_image005
、
Figure 02_image007
、
Figure 02_image009
、
Figure 02_image011
、
Figure 02_image013
； (A-I)             (A-II)                      (A-III)                          (A-IV)                (A-V) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ；R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br；R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H；R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ；X係選自-O-及-S-；Y係選自
Figure 02_image279
R6 係選自
Figure 02_image031
、
Figure 02_image033
、
Figure 02_image035
、
Figure 02_image037
、
Figure 02_image039
、
Figure 02_image041
、
Figure 02_image043
、
Figure 02_image045
、
Figure 02_image047
、
Figure 02_image049
、
Figure 02_image051
、
Figure 02_image053
、
Figure 02_image055
、
Figure 02_image057
、
Figure 02_image059
、
Figure 02_image061
、
Figure 02_image063
、
Figure 02_image065
、
Figure 02_image067
、
Figure 02_image069
、
Figure 02_image071
、
Figure 02_image073
、
Figure 02_image075
、
Figure 02_image077
、
Figure 02_image079
、
Figure 02_image081
、
Figure 02_image083
、
Figure 02_image085
、
Figure 02_image087
、
Figure 02_image089
、
Figure 02_image091
及
Figure 02_image093
； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； E包含白蛋白(例如，具有SEQ ID NO: 69-71中任一者之序列的白蛋白)、白蛋白結合肽或Fc結合肽；各A1 -L-A2 中之L係獨立地共價附接至E中之表面暴露半胱胺酸的硫原子或表面暴露離胺酸的氮原子且附接至A1 及A2 中每一者之連接體；T為1至20之整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，且連接至E之波浪線指示各A1 -L-A2 獨立地共價附接(例如，藉助於鍵或連接體)至E中之溶劑暴露半胱胺酸的硫原子或溶劑暴露離胺酸的氮原子，或其醫藥學上可接受之鹽。當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各A1 -L-A2 可獨立地經選擇(例如，獨立地選自本文所述之A1 -L-A2 結構中任一者)。
在另一態樣中，本發明提供一種由式(3)描述之結合物：
Figure 02_image150
(3) 其中各A1 及各A2 係獨立地選自式(A-VI)-(A-IX)中任一者：
Figure 02_image015
、
Figure 02_image017
、
Figure 02_image019
、
Figure 02_image021
； (A-VI)         (A-VII)                          (A-VIII)              (A-IX) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ；R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br；R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H；R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ；X係選自-O-及-S-；Y係選自
Figure 02_image282
R6 係選自
Figure 02_image031
、
Figure 02_image033
、
Figure 02_image035
、
Figure 02_image037
、
Figure 02_image039
、
Figure 02_image041
、
Figure 02_image043
、
Figure 02_image045
、
Figure 02_image047
、
Figure 02_image049
、
Figure 02_image051
、
Figure 02_image053
、
Figure 02_image055
、
Figure 02_image057
、
Figure 02_image059
、
Figure 02_image061
、
Figure 02_image063
、
Figure 02_image065
、
Figure 02_image067
、
Figure 02_image069
、
Figure 02_image071
、
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、
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、
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、
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、
Figure 02_image083
、
Figure 02_image085
、
Figure 02_image087
、
Figure 02_image089
、
Figure 02_image091
及
Figure 02_image093
； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； E包含白蛋白(例如，具有SEQ ID NO: 69-71中任一者之序列的白蛋白)、白蛋白結合肽或Fc結合肽；各A1 -L-A2 中之L係獨立地共價附接至E中之表面暴露半胱胺酸的硫原子或表面暴露離胺酸的氮原子且附接至A1 及A2 中每一者之連接體；T為1至20之整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，且連接至E之波浪線指示各A1 -L-A2 獨立地共價附接(例如，藉助於鍵或連接體)至E中之溶劑暴露半胱胺酸的硫原子或溶劑暴露離胺酸的氮原子，或其醫藥學上可接受之鹽。當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各A1 -L-A2 可獨立地經選擇(例如，獨立地選自本文所述之A1 -L-A2 結構中任一者)。
在另一態樣中，本發明提供一種由式(4)描述之結合物：
Figure 02_image283
(4) 其中各A1 係獨立地選自式(A-I)-(A-XII)中任一者：
Figure 02_image005
、
Figure 02_image007
、
Figure 02_image009
、
Figure 02_image011
、
Figure 02_image013
、 (A-I)             (A-II)                      (A-III)                          (A-IV)                (A-V)
Figure 02_image015
、
Figure 02_image017
、
Figure 02_image019
、
Figure 02_image021
、 (A-VI)         (A-VII)                          (A-VIII)               (A-IX)
Figure 02_image023
、
Figure 02_image025
、
Figure 02_image027
； (A-X)                 (A-XI)                      (A-XII) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ；R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br；R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H；R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ；X係選自-O-及-S-；Y係選自
Figure 02_image285
Figure 02_image287
R6 係選自
Figure 02_image031
、
Figure 02_image033
、
Figure 02_image035
、
Figure 02_image037
、
Figure 02_image039
、
Figure 02_image041
、
Figure 02_image043
、
Figure 02_image045
、
Figure 02_image047
、
Figure 02_image049
、
Figure 02_image051
、
Figure 02_image053
、
Figure 02_image055
、
Figure 02_image057
、
Figure 02_image059
、
Figure 02_image061
、
Figure 02_image063
、
Figure 02_image065
、
Figure 02_image067
、
Figure 02_image069
、
Figure 02_image071
、
Figure 02_image073
、
Figure 02_image075
、
Figure 02_image077
、
Figure 02_image079
、
Figure 02_image081
、
Figure 02_image083
、
Figure 02_image085
、
Figure 02_image087
、
Figure 02_image089
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及
Figure 02_image093
； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； E包含白蛋白(例如，具有SEQ ID NO: 69-71中任一者之序列的白蛋白)、白蛋白結合肽或Fc結合肽；各L-A1 中之L係獨立地共價附接至E中之表面暴露半胱胺酸的硫原子或表面暴露離胺酸的氮原子且附接至A1 之連接體；T為1至20之整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)；且連接至E之波浪線指示各L-A1 獨立地共價附接(例如，藉助於鍵或連接體)至E中之溶劑暴露半胱胺酸的硫原子或溶劑暴露離胺酸的氮原子，或其醫藥學上可接受之鹽。當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各A可獨立地選自式(A-I)-(A-XII)中任一者。
在另一態樣中，本發明提供一種由式(4)描述之結合物：
Figure 02_image283
(4) 其中各A1 係獨立地選自式(A-I)-(A-V)中任一者：
Figure 02_image005
、
Figure 02_image007
、
Figure 02_image009
、
Figure 02_image011
、
Figure 02_image013
； (A-I)             (A-II)                      (A-III)                          (A-IV)                (A-V) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ；R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br；R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H；R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ；X係選自-O-及-S-；Y係選自
Figure 02_image290
Figure 02_image292
R6 係選自
Figure 02_image031
、
Figure 02_image033
、
Figure 02_image035
、
Figure 02_image037
、
Figure 02_image039
、
Figure 02_image041
、
Figure 02_image043
、
Figure 02_image045
、
Figure 02_image047
、
Figure 02_image049
、
Figure 02_image051
、
Figure 02_image053
、
Figure 02_image055
、
Figure 02_image057
、
Figure 02_image059
、
Figure 02_image061
、
Figure 02_image063
、
Figure 02_image065
、
Figure 02_image067
、
Figure 02_image069
、
Figure 02_image071
、
Figure 02_image073
、
Figure 02_image075
、
Figure 02_image077
、
Figure 02_image079
、
Figure 02_image081
、
Figure 02_image083
、
Figure 02_image085
、
Figure 02_image087
、
Figure 02_image089
、
Figure 02_image091
及
Figure 02_image093
； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； E包含白蛋白(例如，具有SEQ ID NO: 69-71中任一者之序列的白蛋白)、白蛋白結合肽或Fc結合肽；各L-A1 中之L係獨立地共價附接至E中之表面暴露半胱胺酸的硫原子或表面暴露離胺酸的氮原子且附接至A1 之連接體；T為1至20之整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)；且連接至E之波浪線指示各L-A獨立地共價附接(例如，藉助於鍵或連接體)至E中之溶劑暴露半胱胺酸的硫原子或溶劑暴露離胺酸的氮原子，或其醫藥學上可接受之鹽。當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各A1 可獨立地選自式(A-I)-(A-V)中任一者。
在另一態樣中，本發明提供一種由式(4)描述之結合物：
Figure 02_image283
(4) 其中各A1 係獨立地選自式(A-VI)-(A-IX)中任一者：
Figure 02_image015
、
Figure 02_image017
、
Figure 02_image019
、
Figure 02_image021
； (A-VI)         (A-VII)                          (A-VIII)              (A-IX) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ；R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br；R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H；R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ；X係選自-O-及-S-；Y係選自
Figure 02_image294
R6 係選自
Figure 02_image031
、
Figure 02_image033
、
Figure 02_image035
、
Figure 02_image037
、
Figure 02_image039
、
Figure 02_image041
、
Figure 02_image043
、
Figure 02_image045
、
Figure 02_image047
、
Figure 02_image049
、
Figure 02_image051
、
Figure 02_image053
、
Figure 02_image055
、
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、
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、
Figure 02_image061
、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
Figure 02_image075
、
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、
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、
Figure 02_image081
、
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、
Figure 02_image085
、
Figure 02_image087
、
Figure 02_image089
、
Figure 02_image091
及
Figure 02_image093
； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； E包含白蛋白(例如，具有SEQ ID NO: 69-71中任一者之序列的白蛋白)、白蛋白結合肽或Fc結合肽；各L-A1 中之L係獨立地共價附接至E中之表面暴露半胱胺酸的硫原子或表面暴露離胺酸的氮原子且附接至A1 之連接體；T為1至20之整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)；且連接至E之波浪線指示各L-A1 獨立地共價附接(例如，藉助於鍵或連接體)至E中之溶劑暴露半胱胺酸的硫原子或溶劑暴露離胺酸的氮原子，或其醫藥學上可接受之鹽。當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各A可獨立地選自式(A-VI)-(A-IX)中任一者。
在另一態樣中，本發明提供一種由式(5)描述之結合物：
Figure 02_image230
(5) 其中各Int係獨立地選自表1之任一中間物；E包含白蛋白(例如，具有SEQ ID NO: 69-71中任一者之序列的白蛋白)、白蛋白結合肽或Fc結合肽；各L-Int中之L係獨立地共價附接至E中之表面暴露半胱胺酸的硫原子或表面暴露離胺酸的氮原子且附接至Int之連接體；T為1至20之整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)；且連接至E之波浪線指示各L-Int獨立地共價附接至E中之溶劑暴露半胱胺酸的硫原子或溶劑暴露離胺酸的氮原子，或其醫藥學上可接受之鹽。當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各Int可獨立地選自表1之任一中間物。
表1之中間物可藉由熟習此項技術者已知之任何合適方法，包括本文所述或例示之任何方法結合於白蛋白、白蛋白結合肽或Fc結合肽(例如，藉助於連接體)。在一些實施例中，該結合物(例如，由式(5)描述之結合物)包含E，其中E為白蛋白(例如，具有SEQ ID NO: 69-71中任一者之序列的白蛋白)、白蛋白結合肽或Fc結合肽。在較佳實施例中，E之一或多個表面暴露離胺酸殘基的一或多個氮原子或E中之一或多個表面暴露半胱胺酸的一或多個硫原子共價結合於連接體(例如，PEG2 -PEG20 連接體)。結合於E之連接體可經官能化，以致其可反應以與本文所述之任何Int (例如，表1之Int)形成共價鍵。在較佳實施例中，E結合於經疊氮基官能化之連接體且Int (例如，表1之Int)經炔基官能化。E之連接體-疊氮基及Int之連接體-炔結合(例如，藉由點擊化學)形成本發明結合物，例如由式(5)描述之結合物。在其他實施例中，E結合於經炔基官能化之連接體且Int (例如，表1之Int)經疊氮基官能化。E之連接體-炔及Int之連接體-疊氮基結合(例如，藉由點擊化學)形成本發明結合物，例如由式(5)描述之結合物。
在一些實施例中，各E包括具有SEQ ID NO: 69-71中任一者之序列的白蛋白。
在一些實施例中，T為1且L-A共價附接至對應於SEQ ID NO: 69之Cys34之硫原子。
在另一態樣中，本發明提供描述於任何前述態樣中之結合物之群體，其中T之平均值為1至20 (例如，T之平均值為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15或15至20)。在一些實施例中，T之平均值為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。
在另一態樣中，本發明提供一種結合物，其包括(i)第一部分A1 ；(ii)第二部分A2 ；(iii) Fc域單體或Fc域；及(iv)共價附接至A1 及A2 且附接至該Fc域單體或該Fc域之連接體；其中各A1 及各A2 係獨立地選自式(A-I)-(A-XII)中任一者：
Figure 02_image005
、
Figure 02_image007
、
Figure 02_image009
、
Figure 02_image011
、
Figure 02_image013
、 (A-I)             (A-II)                      (A-III)                          (A-IV)                (A-V)
Figure 02_image015
、
Figure 02_image017
、
Figure 02_image019
、
Figure 02_image021
、 (A-VI)         (A-VII)                          (A-VIII)              (A-IX)
Figure 02_image023
、
Figure 02_image025
、
Figure 02_image027
； (A-X)                 (A-XI)                      (A-XII) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ；R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br；R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H；R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ；X係選自-O-及-S-；Y係選自
Figure 02_image298
Figure 02_image300
R6 係選自
Figure 02_image031
、
Figure 02_image033
、
Figure 02_image035
、
Figure 02_image037
、
Figure 02_image039
、
Figure 02_image041
、
Figure 02_image043
、
Figure 02_image045
、
Figure 02_image047
、
Figure 02_image049
、
Figure 02_image051
、
Figure 02_image053
、
Figure 02_image055
、
Figure 02_image057
、
Figure 02_image059
、
Figure 02_image061
、
Figure 02_image063
、
Figure 02_image065
、
Figure 02_image067
、
Figure 02_image069
、
Figure 02_image071
、
Figure 02_image073
、
Figure 02_image075
、
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、
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、
Figure 02_image081
、
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、
Figure 02_image085
、
Figure 02_image087
、
Figure 02_image089
、
Figure 02_image091
及
Figure 02_image093
； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基，或其醫藥學上可接受之鹽。
在另一態樣中，本發明提供一種結合物，其包括(i)第一部分A1 ；(ii)第二部分A2 ；(iii) Fc域單體或Fc域；及(iv)共價附接至A1 及A2 且附接至該Fc域單體或該Fc域之連接體；其中各A1 及各A2 係獨立地選自式(A-I)-(A-V)中任一者：
Figure 02_image005
、
Figure 02_image007
、
Figure 02_image009
、
Figure 02_image011
、
Figure 02_image013
； (A-I)             (A-II)                      (A-III)                          (A-IV)                (A-V) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ；R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br；R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H；R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ；X係選自-O-及-S-；Y係選自
Figure 02_image304
R6 係選自
Figure 02_image031
、
Figure 02_image033
、
Figure 02_image035
、
Figure 02_image037
、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
Figure 02_image087
、
Figure 02_image089
、
Figure 02_image091
及
Figure 02_image093
； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基，或其醫藥學上可接受之鹽。
在另一態樣中，本發明提供一種結合物，其包括(i)第一部分A1 ；(ii)第二部分A2 ；(iii) Fc域單體或Fc域；及(iv)共價附接至A1 及A2 且附接至該Fc域單體或該Fc域之連接體；其中各A1 及各A2 係獨立地選自式(A-VI)-(A-IX)中任一者：
Figure 02_image015
、
Figure 02_image017
、
Figure 02_image019
、
Figure 02_image021
； (A-VI)         (A-VII)                          (A-VIII)              (A-IX) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ；R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br；R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H；R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ；X係選自-O-及-S-；Y係選自
Figure 02_image340
R6 係選自
Figure 02_image031
、
Figure 02_image033
、
Figure 02_image035
、
Figure 02_image037
、
Figure 02_image039
、
Figure 02_image041
、
Figure 02_image043
、
Figure 02_image045
、
Figure 02_image047
、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
Figure 02_image083
、
Figure 02_image085
、
Figure 02_image087
、
Figure 02_image089
、
Figure 02_image091
及
Figure 02_image093
； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基，或其醫藥學上可接受之鹽。
在另一態樣中，本發明提供一種結合物，其包括(i)第一部分Int；(ii) Fc域單體或Fc域；及(iv)共價附接至Int且附接至該Fc域單體或該Fc域之連接體；其中各Int係獨立地選自表1之任一中間物。
在另一態樣中，本發明提供一種結合物，其包括(i)第一部分A1 ；(ii)第二部分A2 ；(iii)白蛋白、白蛋白結合肽或Fc結合肽；及(iv)共價附接至A1 及A2 且附接至該白蛋白、該白蛋白結合肽或該Fc結合肽之連接體；其中各A1 及各A2 係獨立地選自式(A-I)-(A-XII)中任一者：
Figure 02_image005
、
Figure 02_image007
、
Figure 02_image009
、
Figure 02_image011
、
Figure 02_image013
、 (A-I)             (A-II)                      (A-III)                          (A-IV)                (A-V)
Figure 02_image015
、
Figure 02_image017
、
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、
Figure 02_image021
、 (A-VI)         (A-VII)                          (A-VIII)               (A-IX)
Figure 02_image023
、
Figure 02_image025
、
Figure 02_image027
； (A-X)                 (A-XI)                      (A-XII) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ；R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br；R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H；R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ；X係選自-O-及-S-；Y係選自
Figure 02_image350
R6 係選自
Figure 02_image031
、
Figure 02_image033
、
Figure 02_image035
、
Figure 02_image037
、
Figure 02_image039
、
Figure 02_image041
、
Figure 02_image043
、
Figure 02_image045
、
Figure 02_image047
、
Figure 02_image049
、
Figure 02_image051
、
Figure 02_image053
、
Figure 02_image055
、
Figure 02_image057
、
Figure 02_image059
、
Figure 02_image061
、
Figure 02_image063
、
Figure 02_image065
、
Figure 02_image067
、
Figure 02_image069
、
Figure 02_image071
、
Figure 02_image073
、
Figure 02_image075
、
Figure 02_image077
、
Figure 02_image079
、
Figure 02_image081
、
Figure 02_image083
、
Figure 02_image085
、
Figure 02_image087
、
Figure 02_image089
、
Figure 02_image091
及
Figure 02_image093
； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基，或其醫藥學上可接受之鹽。
在另一態樣中，本發明提供一種結合物，其包括(i)第一部分A1 ；(ii)第二部分A2 ；(iii)白蛋白、白蛋白結合肽或Fc結合肽；及(iv)共價附接至A1 及A2 且附接至該白蛋白、該白蛋白結合肽或該Fc結合肽之連接體；其中各A1 及各A2 係獨立地選自式(A-I)-(A-V)中任一者：
Figure 02_image005
、
Figure 02_image007
、
Figure 02_image009
、
Figure 02_image011
、
Figure 02_image013
； (A-I)             (A-II)                      (A-III)                          (A-IV)                (A-V) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ；R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br；R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H；R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ；X係選自-O-及-S-；Y係選自
Figure 02_image353
Figure 02_image355
R6 係選自
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、
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Figure 02_image037
、
Figure 02_image039
、
Figure 02_image041
、
Figure 02_image043
、
Figure 02_image045
、
Figure 02_image047
、
Figure 02_image049
、
Figure 02_image051
、
Figure 02_image053
、
Figure 02_image055
、
Figure 02_image057
、
Figure 02_image059
、
Figure 02_image061
、
Figure 02_image063
、
Figure 02_image065
、
Figure 02_image067
、
Figure 02_image069
、
Figure 02_image071
、
Figure 02_image073
、
Figure 02_image075
、
Figure 02_image077
、
Figure 02_image079
、
Figure 02_image081
、
Figure 02_image083
、
Figure 02_image085
、
Figure 02_image087
、
Figure 02_image089
、
Figure 02_image091
及
Figure 02_image093
； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基，或其醫藥學上可接受之鹽。
在另一態樣中，本發明提供一種結合物，其包括(i)第一部分A1 ；(ii)第二部分A2 ；(iii)白蛋白、白蛋白結合肽或Fc結合肽；及(iv)共價附接至A1 及A2 且附接至該白蛋白、該白蛋白結合肽或該Fc結合肽之連接體；其中各A1 及各A2 係獨立地選自式(A-VI)-(A-IX)中任一者：
Figure 02_image015
、
Figure 02_image017
、
Figure 02_image019
、
Figure 02_image021
； (A-VI)         (A-VII)                          (A-VIII)              (A-IX) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ；R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br；R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H；R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ；X係選自-O-及-S-；Y係選自
Figure 02_image357
Figure 02_image359
R6 係選自
Figure 02_image031
、
Figure 02_image033
、
Figure 02_image035
、
Figure 02_image037
、
Figure 02_image039
、
Figure 02_image041
、
Figure 02_image043
、
Figure 02_image045
、
Figure 02_image047
、
Figure 02_image049
、
Figure 02_image051
、
Figure 02_image053
、
Figure 02_image055
、
Figure 02_image057
、
Figure 02_image059
、
Figure 02_image061
、
Figure 02_image063
、
Figure 02_image065
、
Figure 02_image067
、
Figure 02_image069
、
Figure 02_image071
、
Figure 02_image073
、
Figure 02_image075
、
Figure 02_image077
、
Figure 02_image079
、
Figure 02_image081
、
Figure 02_image083
、
Figure 02_image085
、
Figure 02_image087
、
Figure 02_image089
、
Figure 02_image091
及
Figure 02_image093
； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基，或其醫藥學上可接受之鹽。
在另一態樣中，本發明提供一種由式(D-I)描述之結合物：
Figure 02_image366
(D-I) 其中各A1 及各A2 係獨立地選自式(A-I)-(A-XII)中任一者：
Figure 02_image005
、
Figure 02_image007
、
Figure 02_image009
、
Figure 02_image011
、
Figure 02_image013
、 (A-I)             (A-II)                      (A-III)                        (A-IV)                 (A-V)
Figure 02_image015
、
Figure 02_image017
、
Figure 02_image019
、
Figure 02_image021
、 (A-VI)         (A-VII)                          (A-VIII)               (A-IX)
Figure 02_image023
、
Figure 02_image025
、
Figure 02_image027
； (A-X)                 (A-XI)                      (A-XII) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ；R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br；R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H；R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ；X係選自-O-及-S-；Y係選自
Figure 02_image373
Figure 02_image375
R6 係選自
Figure 02_image031
、
Figure 02_image033
、
Figure 02_image035
、
Figure 02_image037
、
Figure 02_image039
、
Figure 02_image041
、
Figure 02_image043
、
Figure 02_image045
、
Figure 02_image047
、
Figure 02_image049
、
Figure 02_image051
、
Figure 02_image053
、
Figure 02_image055
、
Figure 02_image057
、
Figure 02_image059
、
Figure 02_image061
、
Figure 02_image063
、
Figure 02_image065
、
Figure 02_image067
、
Figure 02_image069
、
Figure 02_image071
、
Figure 02_image073
、
Figure 02_image075
、
Figure 02_image077
、
Figure 02_image079
、
Figure 02_image081
、
Figure 02_image083
、
Figure 02_image085
、
Figure 02_image087
、
Figure 02_image089
、
Figure 02_image091
及
Figure 02_image093
； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；各E包含Fc域單體(例如，具有SEQ ID NO: 1-68中任一者之序列的Fc域單體)、白蛋白(例如，具有SEQ ID NO: 69-71中任一者之序列的白蛋白)、白蛋白結合肽或Fc結合肽；n為1或2；T為1至20之整數(例如，T為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)；且L係共價附接至E、A1 及A2 中每一者之連接體，或其醫藥學上可接受之鹽。當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各A1 -L-A2 可獨立地經選擇(例如，獨立地選自本文所述之A1 -L-A2 結構中任一者)。
在另一態樣中，本發明提供一種由式(D-I)描述之結合物：
Figure 02_image366
(D-I) 其中各A1 及各A2 係獨立地選自式(A-I)-(A-V)中任一者：
Figure 02_image005
、
Figure 02_image007
、
Figure 02_image009
、
Figure 02_image011
、
Figure 02_image013
； (A-I)             (A-II)                      (A-III)                          (A-IV)                (A-V) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ；R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br；R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H；R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ；X係選自-O-及-S-；Y係選自
Figure 02_image395
R6 係選自
Figure 02_image031
、
Figure 02_image033
、
Figure 02_image035
、
Figure 02_image037
、
Figure 02_image039
、
Figure 02_image041
、
Figure 02_image043
、
Figure 02_image045
、
Figure 02_image047
、
Figure 02_image049
、
Figure 02_image051
、
Figure 02_image053
、
Figure 02_image055
、
Figure 02_image057
、
Figure 02_image059
、
Figure 02_image061
、
Figure 02_image063
、
Figure 02_image065
、
Figure 02_image067
、
Figure 02_image069
、
Figure 02_image071
、
Figure 02_image073
、
Figure 02_image075
、
Figure 02_image077
、
Figure 02_image079
、
Figure 02_image081
、
Figure 02_image083
、
Figure 02_image085
、
Figure 02_image087
、
Figure 02_image089
、
Figure 02_image091
及
Figure 02_image093
； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；各E包含Fc域單體(例如，具有SEQ ID NO: 1-68中任一者之序列的Fc域單體)、白蛋白(例如，具有SEQ ID NO: 69-71中任一者之序列的白蛋白)、白蛋白結合肽或Fc結合肽；n為1或2；T為1至20之整數(例如，T為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)；且L係共價附接至E、A1 及A2 中每一者之連接體，或其醫藥學上可接受之鹽。當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各A1 -L-A2 可獨立地經選擇(例如，獨立地選自本文所述之A1 -L-A2 結構中任一者)。
在另一態樣中，本發明提供一種由式(D-I)描述之結合物：
Figure 02_image366
(D-I) 其中各A1 及各A2 係獨立地選自式(A-VI)-(A-IX)中任一者：
Figure 02_image015
、
Figure 02_image017
、
Figure 02_image019
、
Figure 02_image021
； (A-VI)         (A-VII)                          (A-VIII)              (A-IX) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ；R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br；R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H；R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ；X係選自-O-及-S-；Y係選自
Figure 02_image398
R6 係選自
Figure 02_image031
、
Figure 02_image033
、
Figure 02_image035
、
Figure 02_image037
、
Figure 02_image039
、
Figure 02_image041
、
Figure 02_image043
、
Figure 02_image045
、
Figure 02_image047
、
Figure 02_image049
、
Figure 02_image051
、
Figure 02_image053
、
Figure 02_image055
、
Figure 02_image057
、
Figure 02_image059
、
Figure 02_image061
、
Figure 02_image063
、
Figure 02_image065
、
Figure 02_image067
、
Figure 02_image069
、
Figure 02_image071
、
Figure 02_image073
、
Figure 02_image075
、
Figure 02_image077
、
Figure 02_image079
、
Figure 02_image081
、
Figure 02_image083
、
Figure 02_image085
、
Figure 02_image087
、
Figure 02_image089
、
Figure 02_image091
及
Figure 02_image093
； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；各E包含Fc域單體(例如，具有SEQ ID NO: 1-68中任一者之序列的Fc域單體)、白蛋白(例如，具有SEQ ID NO: 69-71中任一者之序列的白蛋白)、白蛋白結合肽或Fc結合肽；n為1或2；T為1至20之整數(例如，T為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)；且L係共價附接至E、A1 及A2 中每一者之連接體，或其醫藥學上可接受之鹽。當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各A1 -L-A2 可獨立地經選擇(例如，獨立地選自本文所述之A1 -L-A2 結構中任一者)。
在一些實施例中，該結合物由式(D-II)描述：
Figure 02_image401
(D-II) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-II-1)描述：
Figure 02_image403
(D-II-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-II-2)描述：
Figure 02_image405
(D-II-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-II-3)描述：
Figure 02_image407
(D-II-3) 其中L’係L之剩餘部分，且y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數(例如，y1 及y2 各自獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，L’為氮原子。
在一些實施例中，該結合物具有選自以下之結構：
Figure 02_image409
、
Figure 02_image411
或
Figure 02_image413
。
在一些實施例中，該結合物由式(D-II-4)描述：
Figure 02_image415
(D-II-4) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-II-5)描述：
Figure 02_image417
(D-II-5) 其中L’係L之剩餘部分，且y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數(例如，y1 及y2 各自獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，L’為氮原子。
在一些實施例中，該結合物具有選自以下之結構：
Figure 02_image419
、
Figure 02_image421
或
Figure 02_image423
， 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物具有選自以下之結構：
Figure 02_image425
、
Figure 02_image427
、
Figure 02_image429
或
Figure 02_image431
， 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-II-6)描述：
Figure 02_image433
， (D-II-6) 其中R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-II-7)描述：
Figure 02_image435
(D-II-7) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-II-8)描述：
Figure 02_image437
； (D-II-8) 其中L’係L之剩餘部分，且y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數(例如，y1 及y2 各自獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，L’為氮原子。
在一些實施例中，該結合物具有結構
Figure 02_image439
或
Figure 02_image441
， 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物具有結構
Figure 02_image443
、
Figure 02_image445
、
Figure 02_image447
或
Figure 02_image449
， 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物具有結構
Figure 02_image451
、
Figure 02_image453
、
Figure 02_image455
或
Figure 02_image457
， 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-II-9)描述：
Figure 02_image459
； (D-II-9) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-II-10)描述：
Figure 02_image461
； (D-II-10) 其中L’係L之剩餘部分，且y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數(例如，y1 及y2 各自獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，L’為氮原子。
在一些實施例中，該結合物具有結構：
Figure 02_image463
， 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物具有結構：
Figure 02_image465
， 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-III)描述：
Figure 02_image467
(D-III) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-III-1)描述：
Figure 02_image469
(D-III-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-III-2)描述：
Figure 02_image471
(D-III-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-III-3)描述：
Figure 02_image473
(D-III-3) 其中L’係L之剩餘部分，且y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數(例如，y1 及y2 各自獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，L’為氮原子。
在一些實施例中，該結合物由式(D-III-4)描述：
Figure 02_image475
(D-III-4) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-III-5)描述：
Figure 02_image477
(D-III-5) 其中L’係L之剩餘部分，且y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數(例如，y1 及y2 各自獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，L’為氮原子。
在一些實施例中，該結合物由式(D-III-6)描述：
Figure 02_image479
(D-III-6) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-III-7)描述：
Figure 02_image481
(D-III-7) 其中L’係L之剩餘部分，且y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數(例如，y1 及y2 各自獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，L’為氮原子。
在一些實施例中，該結合物由式(D-III-8)描述：
Figure 02_image483
(D-III-8) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-III-9)描述：
Figure 02_image485
(D-III-9) 其中L’係L之剩餘部分，且y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數(例如，y1 及y2 各自獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，L’為氮原子。
在一些實施例中，該結合物由式(D-IV)描述：
Figure 02_image487
(D-IV) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-IV-1)描述：
Figure 02_image489
(D-IV-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-IV-2)描述：
Figure 02_image491
(D-IV-2)
其中L’係L之剩餘部分，且y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數(例如，y1 及y2 各自獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，L’為氮原子。在一些實施例中，該結合物由式(D-V)描述：
Figure 02_image493
(D-V) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-V-1)描述：
Figure 02_image495
(D-V-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-V-2)描述：
Figure 02_image497
(D-V-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-V-3)描述：
Figure 02_image499
(D-V-3) 其中L’係L之剩餘部分，且y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數(例如，y1 及y2 各自獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，L’為氮原子。在一些實施例中，y1 及y2 各自為1，y1 及y2 各自為2，或y1 及y2 各自為3。
在一些實施例中，該結合物由式(D-V-4)描述：
Figure 02_image501
(D-V-4) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-V-5)描述：
Figure 02_image503
(D-V-5) 其中L’係L之剩餘部分，且y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數(例如，y1 及y2 各自獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，L’為氮原子。在一些實施例中，y1 及y2 各自為1，y1 及y2 各自為2，或y1 及y2 各自為3。
在一些實施例中，該結合物由式(D-V-6)描述：
Figure 02_image505
(D-V-6) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-V-7)描述：
Figure 02_image507
(D-V-7) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-V-8)描述：
Figure 02_image509
(D-V-8) 其中L’係L之剩餘部分，且y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數(例如，y1 及y2 各自獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，L’為氮原子。在一些實施例中，y1 及y2 各自為1，y1 及y2 各自為2，或y1 及y2 各自為3。
在一些實施例中，該結合物由式(D-V-9)描述：
Figure 02_image511
(D-V-9) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-V-10)描述：
Figure 02_image513
(D-V-10) 其中L’係L之剩餘部分，且y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數(例如，y1 及y2 各自獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，L’為氮原子。在一些實施例中，y1 及y2 各自為1，y1 及y2 各自為2，或y1 及y2 各自為3。
在一些實施例中，該結合物由式(D-VI)描述：
Figure 02_image515
(D-VI) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-VI-1)描述：
Figure 02_image517
(D-VI-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-VI-2)描述：
Figure 02_image519
(D-VI-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-VI-3)描述：
Figure 02_image521
(D-VI-3) 其中L’係L之剩餘部分，且y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數(例如，y1 及y2 各自獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，L’為氮原子。在一些實施例中，y1 及y2 各自為1，y1 及y2 各自為2，或y1 及y2 各自為3。
在一些實施例中，該結合物由式(D-VI-4)描述：
Figure 02_image523
(D-VI-4) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-VI-5)描述：
Figure 02_image525
(D-VI-5) 其中L’係L之剩餘部分，且y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數(例如，y1 及y2 各自獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，L’為氮原子。在一些實施例中，y1 及y2 各自為1，y1 及y2 各自為2，或y1 及y2 各自為3。
在一些實施例中，該結合物由式(D-VI-6)描述：
Figure 02_image527
(D-VI-6) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-VI-7)描述：
Figure 02_image529
(D-VI-7) 其中L’係L之剩餘部分，且y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數(例如，y1 及y2 各自獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，L’為氮原子。在一些實施例中，y1 及y2 各自為1，y1 及y2 各自為2，或y1 及y2 各自為3。
在一些實施例中，該結合物由式(D-VI-8)描述：
Figure 02_image531
(D-VI-8) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-VI-9)描述：
Figure 02_image533
(D-VI-9) 其中L’係L之剩餘部分，且y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數(例如，y1 及y2 各自獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，L’為氮原子。在一些實施例中，y1 及y2 各自為1，y1 及y2 各自為2，或y1 及y2 各自為3。
在一些實施例中，該結合物由式(D-VII)描述：
Figure 02_image535
(D-VII) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，R1 為OH。在本文所述之任何態樣之一些實施例中，R1 為NH2 。在本文所述之任何態樣之一些實施例中，R1 為-NHC(=NH)NH2 。
在一些實施例中，該結合物由式(D-VIII)描述：
Figure 02_image537
(D-VIII) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-VIII-1)描述：
Figure 02_image539
(D-VIII-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-VIII-2)描述：
Figure 02_image541
(D-VIII-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-VIII-3)描述：
Figure 02_image543
(D-VIII-3) 其中L’係L之剩餘部分，且y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數(例如，y1 及y2 各自獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，L’為氮原子。
在一些實施例中，該結合物具有選自以下之結構：
Figure 02_image545
、
Figure 02_image547
或
Figure 02_image549
， 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-VIII-4)描述：
Figure 02_image551
(D-VIII-4) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-VIII-5)描述：
Figure 02_image553
(D-VIII-5) 其中L’係L之剩餘部分，且y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數(例如，y1 及y2 各自獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，L’為氮原子。
在一些實施例中，該結合物具有選自以下之結構：
Figure 02_image555
、
Figure 02_image557
或
Figure 02_image559
或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由以下結構描述：
Figure 02_image561
或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-VIII-6)描述：
Figure 02_image563
(D-VIII-6) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-VIII-7)描述：
Figure 02_image565
(D-VIII-7) 其中L’係L之剩餘部分，且y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數(例如，y1 及y2 各自獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，L’為氮原子。
在一些實施例中，該結合物由式(D-VIII-8)描述：
Figure 02_image567
(D-VIII-8) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-VIII-9)描述：
Figure 02_image569
(D-VIII-9) 其中L'係L之剩餘部分，且y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數(例如，y1 及y2 各自獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，L'為氮原子。
在一些實施例中，該結合物由式(D-VIII-10)描述：
Figure 02_image571
(D-VIII-10) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-VIII-11)描述：
Figure 02_image573
(D-VIII-11) 其中L'係L之剩餘部分，且y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數(例如，y1 及y2 各自獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，L'為氮原子。
在一些實施例中，該結合物由式(D-IX)描述：
Figure 02_image575
(D-IX) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-IX-1)描述：
Figure 02_image577
(D-IX-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-IX-2)描述：
Figure 02_image579
(D-IX-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-IX-3)描述：
Figure 02_image581
(D-IX-3) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-IX-4)描述：
Figure 02_image583
(D-IX-4) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-IX-5)描述：
Figure 02_image585
(D-IX-5) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-IX-6)描述：
Figure 02_image587
(D-IX-6) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-X)描述：
Figure 02_image589
(D-X) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-X-1)描述：
Figure 02_image591
(D-X-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-X-2)描述：
Figure 02_image593
(D-X-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(D-X-3)描述：
Figure 02_image595
(D-X-3) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，L或L'包括一或多個視情況經取代C1-C20伸烷基、視情況經取代C1-C20伸雜烷基、視情況經取代C2-C20伸烯基、視情況經取代C2-C20伸雜烯基、視情況經取代C2-C20伸炔基、視情況經取代C2-C20伸雜炔基、視情況經取代C3-C20伸環烷基、視情況經取代C3-C20伸雜環烷基、視情況經取代C4-C20伸環烯基、視情況經取代C4-C20伸雜環烯基、視情況經取代C8-C20伸環炔基、視情況經取代C8-C20伸雜環炔基、視情況經取代C5-C15伸芳基、視情況經取代C2-C15伸雜芳基、O、S、NRi 、P、羰基、硫羰基、磺醯基、磷酸酯基、磷醯基或亞胺基，其中Ri 為H、視情況經取代C1-C20烷基、視情況經取代C1-C20雜烷基、視情況經取代C2-C20烯基、視情況經取代C2-C20雜烯基、視情況經取代C2-C20炔基、視情況經取代C2-C20雜炔基、視情況經取代C3-C20環烷基、視情況經取代C3-C20雜環烷基、視情況經取代C4-C20環烯基、視情況經取代C4-C20雜環烯基、視情況經取代C8-C20環炔基、視情況經取代C8-C20雜環炔基、視情況經取代C5-C15芳基或視情況經取代C2-C15雜芳基。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，L或L'之骨架由一或多個視情況經取代C1-C20伸烷基、視情況經取代C1-C20伸雜烷基、視情況經取代C2-C20伸烯基、視情況經取代C2-C20伸雜烯基、視情況經取代C2-C20伸炔基、視情況經取代C2-C20伸雜炔基、視情況經取代C3-C20伸環烷基、視情況經取代C3-C20伸雜環烷基、視情況經取代C4-C20伸環烯基、視情況經取代C4-C20伸雜環烯基、視情況經取代C8-C20伸環炔基、視情況經取代C8-C20伸雜環炔基、視情況經取代C5-C15伸芳基、視情況經取代C2-C15伸雜芳基、O、S、NRi 、P、羰基、硫羰基、磺醯基、磷酸酯基、磷醯基或亞胺基組成，其中Ri 為H、視情況經取代C1-C20烷基、視情況經取代C1-C20雜烷基、視情況經取代C2-C20烯基、視情況經取代C2-C20雜烯基、視情況經取代C2-C20炔基、視情況經取代C2-C20雜炔基、視情況經取代C3-C20環烷基、視情況經取代C3-C20雜環烷基、視情況經取代C4-C20環烯基、視情況經取代C4-C20雜環烯基、視情況經取代C8-C20環炔基、視情況經取代C8-C20雜環炔基、視情況經取代C5-C15芳基或視情況經取代C2-C15雜芳基。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，L或L'係經側氧基取代。在一些實施例中，L或L'之骨架包含不超過250個原子。在一些實施例中，L或L'能夠形成醯胺、胺基甲酸酯、磺醯基或脲連接。在一些實施例中，L或L'為鍵。在一些實施例中，L或L'為原子。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，各L由式(D-L-I)描述：
Figure 02_image597
(D-L-I) 其中LA 由式GA1 -(ZA1 )g1 -(YA1 )h1 -(ZA2 )i1 -(YA2 )j1 -(ZA3 )k1 -(YA3 )l1 -(ZA4 )m1 -(YA4 )n1 -(ZA5 )o1 -GA2 描述；LB 由式GB1 -(ZB1 )g2 -(YB1 )h2 -(ZB2 )i2 -(YB2 )j2 -(ZB3 )k2 -(YB3 )l2 -(ZB4 )m2 -(YB4 )n2 -(ZB5 )o2 -GB2 描述；LC 由式GC1 -(ZC1 )g3 -(YC1 )h3 -(ZC2 )i3 -(YC2 )j3 -(ZC3 )k3 -(YC3 )l3 -(ZC4 )m3 -(YC4 )n3 -(ZC5 )o3 -GC2 描述；GA1 係附接至Q之鍵；GA2 係附接至A1之鍵；GB1 係附接至Q)之鍵；GB2 係附接至A2之鍵；GC1 係附接至Q之鍵；GC2 係附接至E之鍵或能夠與結合於E之官能基反應的官能基(例如，順丁烯二醯亞胺及半胱胺酸、胺及經活化羧酸、硫醇及順丁烯二醯亞胺、經活化磺酸及胺、異氰酸酯及胺、疊氮化物及炔以及烯烴及四嗪)；ZA1 、ZA2 、ZA3 、ZA4 、ZA5 、ZB1 、ZB2 、ZB3 、ZB4 、ZB5 、ZC1 、ZC2 、ZC3 、ZC4 及ZC5 各自獨立地為視情況經取代C1-C20伸烷基、視情況經取代C1-C20伸雜烷基、視情況經取代C2-C20伸烯基、視情況經取代C2-C20伸雜烯基、視情況經取代C2-C20伸炔基、視情況經取代C2-C20伸雜炔基、視情況經取代C3-C20伸環烷基、視情況經取代C3-C20伸雜環烷基、視情況經取代C4-C20伸環烯基、視情況經取代C4-C20伸雜環烯基、視情況經取代C8-C20伸環炔基、視情況經取代C8-C20伸雜環炔基、視情況經取代C5-C15伸芳基或視情況經取代C2-C15伸雜芳基；YA1 、YA2 、YA3 、YA4 、YB1 、YB2 、YB3 、YB4 、YC1 、YC2 、YC3 及YC4 各自獨立地為O、S、NRi 、P、羰基、硫羰基、磺醯基、磷酸酯基、磷醯基或亞胺基；Ri 為H、視情況經取代C1-C20烷基、視情況經取代C1-C20雜烷基、視情況經取代C2-C20烯基、視情況經取代C2-C20雜烯基、視情況經取代C2-C20炔基、視情況經取代C2-C20雜炔基、視情況經取代C3-C20環烷基、視情況經取代C3-C20雜環烷基、視情況經取代C4-C20環烯基、視情況經取代C4-C20雜環烯基、視情況經取代C8-C20環炔基、視情況經取代C8-C20雜環炔基、視情況經取代C5-C15芳基或視情況經取代C2-C15雜芳基；g1、h1、i1、j1、k1、l1、m1、n1、o1、g2、h2、i2、j2、k2、l2、m2、n2、o2、g3、h3、i3、j3、k3、l3、m3、n3及o3各自獨立地為0或1；Q為氮原子、視情況經取代C1-C20伸烷基、視情況經取代C1-C20伸雜烷基、視情況經取代C2-C20伸烯基、視情況經取代C2-C20伸雜烯基、視情況經取代C2-C20伸炔基、視情況經取代C2-C20伸雜炔基、視情況經取代C3-C20伸環烷基、視情況經取代C3-C20伸雜環烷基、視情況經取代C4-C20伸環烯基、視情況經取代C4-C20伸雜環烯基、視情況經取代C8-C20伸環炔基、視情況經取代C8-C20伸雜環炔基、視情況經取代C5-C15伸芳基或視情況經取代C2-C15伸雜芳基。
在一些實施例中，LC 可具有兩個附接至Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽之點(例如，兩個GC2 )。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，L包括聚乙二醇(PEG)連接體。PEG連接體包括具有重複單元結構(-CH2 CH2 O-)n 之連接體，其中n為2至100之整數。聚乙二醇連接體可共價接合神經胺糖酸酶抑制劑及E (例如，在式(M-I)-(M-X)中任一者之結合物中)。聚乙二醇連接體可共價接合第一神經胺糖酸酶抑制劑及第二神經胺糖酸酶抑制劑(例如，在式(D-I)-(D-X)中任一者之結合物中)。聚乙二醇連接體可共價接合神經胺糖酸酶抑制劑二聚體及E (例如，在式(D-I)-(D-X)中任一者之結合物中)。聚乙二醇連接體可選自PEG2 至PEG100 中任一者(例如，PEG2 、PEG3 、PEG4 、PEG5 、PEG5 -PEG10 、PEG10 -PEG20 、PEG20 -PEG30 、PEG30 -PEG40 、PEG50 -PEG60 、PEG60 -PEG70 、PEG70 -PEG80 、PEG80 -PEG90 、PEG90 -PEG100 )。在一些實施例中，Lc 包括PEG連接體，其中LC 共價附接至Q及E中每一者。
在一些實施例中，L為
Figure 02_image599
、
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；或
Figure 02_image787
， 其中z1 及z2 各自獨立地為1至20之整數；且R9 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基。
在一些實施例中，L為
Figure 02_image789
、
Figure 02_image791
、
Figure 02_image793
、
Figure 02_image795
、
Figure 02_image797
、
Figure 02_image799
、
Figure 02_image801
、
Figure 02_image803
、
Figure 02_image805
、
Figure 02_image807
、
Figure 02_image809
、
Figure 02_image811
、
Figure 02_image813
、
Figure 02_image815
、
Figure 02_image817
、
Figure 02_image819
、
Figure 02_image821
、
Figure 02_image823
、
Figure 02_image825
、
Figure 02_image827
、
Figure 02_image829
、
Figure 02_image831
、
Figure 02_image833
、、
Figure 02_image835
、
Figure 02_image837
、
Figure 02_image839
、
Figure 02_image841
、
Figure 02_image843
、
Figure 02_image845
、
Figure 02_image847
、
Figure 02_image849
、
Figure 02_image851
、
Figure 02_image853
、
Figure 02_image855
、
Figure 02_image857
、
Figure 02_image859
、
Figure 02_image861
、
Figure 02_image863
、
Figure 02_image865
、
Figure 02_image867
、
Figure 02_image869
；
Figure 02_image871
、
Figure 02_image873
；
Figure 02_image875
、
Figure 02_image877
；
Figure 02_image879
、
Figure 02_image881
；
Figure 02_image883
、
Figure 02_image885
或
Figure 02_image887
其中R*為鍵或包括視情況經取代C1-C20伸烷基、視情況經取代C1-C20伸雜烷基、視情況經取代C2-C20伸烯基、視情況經取代C2-C20伸雜烯基、視情況經取代C2-C20伸炔基、視情況經取代C2-C20伸雜炔基、視情況經取代C3-C20伸環烷基、視情況經取代C3-C20伸雜環烷基、視情況經取代C4-C20伸環烯基、視情況經取代C4-C20伸雜環烯基、視情況經取代C8-C20伸環炔基、視情況經取代C8-C20伸雜環炔基、視情況經取代C5-C15伸芳基、視情況經取代C2-C15伸雜芳基、O、S、NRi 、P、羰基、硫羰基、磺醯基、磷酸酯基及亞胺基中之一或多者，且其中Ri 為H、視情況經取代C1-C20烷基、視情況經取代C1-C20雜烷基、視情況經取代C2-C20烯基、視情況經取代C2-C20雜烯基、視情況經取代C2-C20炔基、視情況經取代C2-C20雜炔基、視情況經取代C3-C20環烷基、視情況經取代C3-C20雜環烷基、視情況經取代C4-C20環烯基、視情況經取代C4-C20雜環烯基、視情況經取代C8-C20環炔基、視情況經取代C8-C20雜環炔基、視情況經取代C5-C15芳基或視情況經取代C2-C15雜芳基。
在一些實施例中，Y為：
Figure 02_image889
(-NH(C=O)O-)且L為：
Figure 02_image753
。
在一些實施例中，Y為：
Figure 02_image889
(-NH(C=O)O-)且L為：
Figure 02_image757
。
在一些實施例中，Y為：
Figure 02_image889
(-NH(C=O)O-)且L為：
Figure 02_image761
。
在一些實施例中，Y為：
Figure 02_image894
(-O-)且L為：
Figure 02_image767
。
在另一態樣中，本發明提供一種由式(M-I)描述之結合物：
Figure 02_image897
(M-I) 其中各A1 係獨立地選自式(A-I)-(A-XII)中任一者：
Figure 02_image005
、
Figure 02_image007
、
Figure 02_image009
、
Figure 02_image011
、
Figure 02_image013
、 (A-I)             (A-II)                      (A-III)                          (A-IV)                (A-V)
Figure 02_image015
、
Figure 02_image017
、
Figure 02_image019
、
Figure 02_image021
、 (A-VI)                (A-VII)                   (A-VIII)              (A-IX)
Figure 02_image023
、
Figure 02_image025
、
Figure 02_image027
； (A-X)                 (A-XI)                      (A-XII) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ；R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br；R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H；R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ；X係選自-O-及-S-；Y係選自
Figure 02_image904
R6 係選自
Figure 02_image031
、
Figure 02_image033
、
Figure 02_image035
、
Figure 02_image037
、
Figure 02_image039
、
Figure 02_image041
、
Figure 02_image043
、
Figure 02_image045
、
Figure 02_image047
、
Figure 02_image049
、
Figure 02_image051
、
Figure 02_image053
、
Figure 02_image055
、
Figure 02_image057
、
Figure 02_image059
、
Figure 02_image061
、
Figure 02_image063
、
Figure 02_image065
、
Figure 02_image067
、
Figure 02_image069
、
Figure 02_image071
、
Figure 02_image073
、
Figure 02_image075
、
Figure 02_image077
、
Figure 02_image079
、
Figure 02_image081
、
Figure 02_image083
、
Figure 02_image085
、
Figure 02_image087
、
Figure 02_image089
、
Figure 02_image091
及
Figure 02_image093
； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；各E包含Fc域單體(例如，具有SEQ ID NO: 1-68中任一者之序列的Fc域單體)、白蛋白(例如，具有SEQ ID NO: 69-71中任一者之序列的白蛋白)、白蛋白結合肽或Fc結合肽；n為1或2；T為1至20之整數(例如，T為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)；且L係共價附接至E及A1 中每一者之連接體，或其醫藥學上可接受之鹽。當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各A1 可獨立地選自式(A-I)-(A-XII)中任一者。
在另一態樣中，本發明提供一種由式(M-I)描述之結合物：
Figure 02_image897
(M-I) 其中各A1 係獨立地選自式(A-I)-(A-V)中任一者：
Figure 02_image005
、
Figure 02_image007
、
Figure 02_image009
、
Figure 02_image011
、
Figure 02_image013
； (A-I)             (A-II)                      (A-III)                          (A-IV)                       (A-V) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ；R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br；R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H；R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ；X係選自-O-及-S-；Y係選自
Figure 02_image910
R6 係選自
Figure 02_image031
、
Figure 02_image033
、
Figure 02_image035
、
Figure 02_image037
、
Figure 02_image039
、
Figure 02_image041
、
Figure 02_image043
、
Figure 02_image045
、
Figure 02_image047
、
Figure 02_image049
、
Figure 02_image051
、
Figure 02_image053
、
Figure 02_image055
、
Figure 02_image057
、
Figure 02_image059
、
Figure 02_image061
、
Figure 02_image063
、
Figure 02_image065
、
Figure 02_image067
、
Figure 02_image069
、
Figure 02_image071
、
Figure 02_image073
、
Figure 02_image075
、
Figure 02_image077
、
Figure 02_image079
、
Figure 02_image081
、
Figure 02_image083
、
Figure 02_image085
、
Figure 02_image087
、
Figure 02_image089
、
Figure 02_image091
及
Figure 02_image093
； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；各E包含Fc域單體(例如，具有SEQ ID NO: 1-68中任一者之序列的Fc域單體)、白蛋白(例如，具有SEQ ID NO: 69-71中任一者之序列的白蛋白)、白蛋白結合肽或Fc結合肽；n為1或2；T為1至20之整數(例如，T為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)；且L係共價附接至E及A1 中每一者之連接體，或其醫藥學上可接受之鹽。當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各A1 可獨立地選自式(A-I)-(A-V)中任一者。
在另一態樣中，本發明提供一種由式(M-I)描述之結合物：
Figure 02_image897
(M-I) 其中各A1 係獨立地選自式(A-VI)-(A-IX)中任一者：
Figure 02_image015
、
Figure 02_image017
、
Figure 02_image019
、
Figure 02_image021
； (A-VI)                (A-VII)                          (A-VIII)       (A-IX) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ；R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br；R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H；R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ；X係選自-O-及-S-；Y係選自
Figure 02_image913
R6 係選自
Figure 02_image031
、
Figure 02_image033
、
Figure 02_image035
、
Figure 02_image037
、
Figure 02_image039
、
Figure 02_image041
、
Figure 02_image043
、
Figure 02_image045
、
Figure 02_image047
、
Figure 02_image049
、
Figure 02_image051
、
Figure 02_image053
、
Figure 02_image055
、
Figure 02_image057
、
Figure 02_image059
、
Figure 02_image061
、
Figure 02_image063
、
Figure 02_image065
、
Figure 02_image067
、
Figure 02_image069
、
Figure 02_image071
、
Figure 02_image073
、
Figure 02_image075
、
Figure 02_image077
、
Figure 02_image079
、
Figure 02_image081
、
Figure 02_image083
、
Figure 02_image085
、
Figure 02_image087
、
Figure 02_image089
、
Figure 02_image091
及
Figure 02_image093
； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；各E包含Fc域單體(例如，具有SEQ ID NO: 1-68中任一者之序列的Fc域單體)、白蛋白(例如，具有SEQ ID NO: 69-71中任一者之序列的白蛋白)、白蛋白結合肽或Fc結合肽；n為1或2；T為1至20之整數(例如，T為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)；且L係共價附接至E及A1 中每一者之連接體，或其醫藥學上可接受之鹽。當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各A1 可獨立地選自式(A-VI)-(A-IX)中任一者。
在一些實施例中，該結合物由式(M-II)描述：
Figure 02_image915
(M-II) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-II-1)描述：
Figure 02_image917
(M-II-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-II-2)描述：
Figure 02_image919
(M-II-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-II-3)描述：
Figure 02_image921
(M-II-3) 其中L'係L之剩餘部分，且y1 為1-20之整數(例如，y1 為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-II-4)描述：
Figure 02_image923
(M-II-4) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-II-5)描述：
Figure 02_image925
(M-II-5) 其中L'係L之剩餘部分，且y1 為1-20之整數(例如，y1 為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物具有結構
Figure 02_image927
， 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-II-6)描述：
Figure 02_image929
； (M-II-6) 其中R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-II-7)描述：
Figure 02_image931
(M-II-7) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-II-8)描述：
Figure 02_image933
； (M-II-8) 其中L'係L之剩餘部分，且y1 為1-20之整數(例如，y1 為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物具有結構
Figure 02_image935
。
在一些實施例中，該結合物由式(M-II-9)描述：
Figure 02_image937
； (M-II-9) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-II-10)描述：
Figure 02_image939
； (M-II-10) 其中L'係L之剩餘部分，且y1為1-20之整數(例如，y1為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物具有結構
Figure 02_image941
或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-III)描述：
Figure 02_image943
(M-III) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-III-1)描述：
Figure 02_image945
(M-III-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-III-2)描述：
Figure 02_image947
(M-III-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-III-3)描述：
Figure 02_image949
(M-III-3) 其中L'係L之剩餘部分，且y1 為1-20之整數(例如，y1 為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-III-4)描述：
Figure 02_image951
(M-III-4) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-III-5)描述：
Figure 02_image953
(M-III-5) 其中L'係L之剩餘部分，且y1 為1-20之整數(例如，y1 為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-III-6)描述：
Figure 02_image955
(M-III-6) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-III-7)描述：
Figure 02_image957
(M-III-7) 其中L'係L之剩餘部分，且y1 為1-20之整數(例如，y1 為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-III-8)描述：
Figure 02_image959
(M-III-8) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-III-9)描述：
Figure 02_image961
(M-III-9) 其中L'係L之剩餘部分，且y1 為1-20之整數(例如，y1 為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-IV)描述：
Figure 02_image963
(M-IV) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-IV-1)描述：
Figure 02_image965
(M-IV-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-IV-2)描述：
Figure 02_image967
(M-IV-2) 其中L'係L之剩餘部分，且y1 為1-20之整數(例如，y1 為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-V)描述：
Figure 02_image969
(M-V) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-V-1)描述：
Figure 02_image971
(M-V-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-V-2)描述：
Figure 02_image973
(M-V-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-V-3)描述：
Figure 02_image975
(M-V-3) 其中L'係L之剩餘部分，且y1 為1-20之整數(例如，y1 為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-V-4)描述：
Figure 02_image977
(M-V-4) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-V-5)描述：
Figure 02_image979
(M-V-5) 其中L'係L之剩餘部分，且y1 為1-20之整數(例如，y1 為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-V-6)描述：
Figure 02_image981
(M-V-6) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-V-7)描述：
Figure 02_image983
(M-V-7) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-V-8)描述：
Figure 02_image985
(M-V-8) 其中L'係L之剩餘部分，且y1 為1-20之整數(例如，y1 為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-V-9)描述：
Figure 02_image987
(M-V-9) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-V-10)描述：
Figure 02_image989
(M-V-10) 其中L'係L之剩餘部分，且y1 為1-20之整數(例如，y1 為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-VI)描述：
Figure 02_image991
(M-VI) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-VI-1)描述：
Figure 02_image993
(M-VI-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-VI-2)描述：
Figure 02_image995
(M-VI-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-VI-3)描述：
Figure 02_image997
(M-VI-3) 其中L'係L之剩餘部分，且y1 為1-20之整數(例如，y1 為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-VI-4)描述：
Figure 02_image999
(M-VI-4) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-VI-5)描述：
Figure 02_image1001
(M-VI-5) 其中L'係L之剩餘部分，且y1 為1-20之整數(例如，y1 為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-VI-6)描述：
Figure 02_image1003
(M-VI-6) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-VI-7)描述：
Figure 02_image1005
(M-VI-7) 其中L'係L之剩餘部分，且y1 為1-20之整數(例如，y1 為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-VI-8)描述：
Figure 02_image1007
(M-VI-8) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-VI-9)描述：
Figure 02_image1009
(M-VI-9) 其中L'係L之剩餘部分，且y1 為1-20之整數(例如，y1 為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-VII)描述：
Figure 02_image1011
(M-VII) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，R1 為OH。在本文所述之任何態樣之一些實施例中，R1 為NH2 。在本文所述之任何態樣之一些實施例中，R1 為-NHC(=NH)NH2 。
在一些實施例中，該結合物由式(M-VIII)描述：
Figure 02_image1013
(M-VIII) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-VIII-1)描述：
Figure 02_image1015
(M-VIII-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-VIII-2)描述：
Figure 02_image1017
(M-VIII-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-VIII-3)描述：
Figure 02_image1019
(M-VIII-3) 其中L'係L之剩餘部分，且y1 為1-20之整數(例如，y1 為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-VIII-4)描述：
Figure 02_image1021
(M-VIII-4) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-VIII-5)描述：
Figure 02_image1023
(M-VIII-5) 其中L'係L之剩餘部分，且y1 為1-20之整數，或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物具有結構
Figure 02_image1025
或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-VIII-6)描述：
Figure 02_image1027
(M-VIII-6) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-VIII-7)描述：
Figure 02_image1029
(M-VIII-7) 其中L'係L之剩餘部分，且y1 為1-20之整數(例如，y1 為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-VIII-8)描述：
Figure 02_image1031
(M-VIII-8) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-VIII-9)描述：
Figure 02_image1033
(M-VIII-9) 其中L'係L之剩餘部分，且y1 為1-20之整數(例如，y1 為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-VIII-10)描述：
Figure 02_image1035
(M-VIII-10) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-VIII-11)描述：
Figure 02_image1037
(M-VIII-11) 其中L'係L之剩餘部分，且y1 為1-20之整數(例如，y1 為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-IX)描述：
Figure 02_image1039
(M-IX) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-IX-1)描述：
Figure 02_image1041
(M-IX-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-IX-2)描述：
Figure 02_image1043
(M-IX-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-IX-3)描述：
Figure 02_image1045
(M-IX-3) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-IX-4)描述：
Figure 02_image1047
(M-IX-4) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-IX-5)描述：
Figure 02_image1049
(M-IX-5) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-IX-6)描述：
Figure 02_image1051
(M-IX-6) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-X)描述：
Figure 02_image1053
(M-X) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-X-1)描述：
Figure 02_image1055
(M-X-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-X-2)描述：
Figure 02_image1057
(M-X-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，該結合物由式(M-X-3)描述：
Figure 02_image1059
(M-X-3) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，L或L'包含一或多個視情況經取代C1-C20伸烷基、視情況經取代C1-C20伸雜烷基、視情況經取代C2-C20伸烯基、視情況經取代C2-C20伸雜烯基、視情況經取代C2-C20伸炔基、視情況經取代C2-C20伸雜炔基、視情況經取代C3-C20伸環烷基、視情況經取代C3-C20伸雜環烷基、視情況經取代C4-C20伸環烯基、視情況經取代C4-C20伸雜環烯基、視情況經取代C8-C20伸環炔基、視情況經取代C8-C20伸雜環炔基、視情況經取代C5-C15伸芳基、視情況經取代C2-C15伸雜芳基、O、S、NRi 、P、羰基、硫羰基、磺醯基、磷酸酯基、磷醯基或亞胺基，其中Ri 為H、視情況經取代C1-C20烷基、視情況經取代C1-C20雜烷基、視情況經取代C2-C20烯基、視情況經取代C2-C20雜烯基、視情況經取代C2-C20炔基、視情況經取代C2-C20雜炔基、視情況經取代C3-C20環烷基、視情況經取代C3-C20雜環烷基、視情況經取代C4-C20環烯基、視情況經取代C4-C20雜環烯基、視情況經取代C8-C20環炔基、視情況經取代C8-C20雜環炔基、視情況經取代C5-C15芳基或視情況經取代C2-C15雜芳基。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，L或L'之骨架由一或多個視情況經取代C1-C20伸烷基、視情況經取代C1-C20伸雜烷基、視情況經取代C2-C20伸烯基、視情況經取代C2-C20伸雜烯基、視情況經取代C2-C20伸炔基、視情況經取代C2-C20伸雜炔基、視情況經取代C3-C20伸環烷基、視情況經取代C3-C20伸雜環烷基、視情況經取代C4-C20伸環烯基、視情況經取代C4-C20伸雜環烯基、視情況經取代C8-C20伸環炔基、視情況經取代C8-C20伸雜環炔基、視情況經取代C5-C15伸芳基、視情況經取代C2-C15伸雜芳基、O、S、NRi 、P、羰基、硫羰基、磺醯基、磷酸酯基、磷醯基或亞胺基組成，其中Ri 為H、視情況經取代C1-C20烷基、視情況經取代C1-C20雜烷基、視情況經取代C2-C20烯基、視情況經取代C2-C20雜烯基、視情況經取代C2-C20炔基、視情況經取代C2-C20雜炔基、視情況經取代C3-C20環烷基、視情況經取代C3-C20雜環烷基、視情況經取代C4-C20環烯基、視情況經取代C4-C20雜環烯基、視情況經取代C8-C20環炔基、視情況經取代C8-C20雜環炔基、視情況經取代C5-C15芳基或視情況經取代C2-C15雜芳基。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，L或L'係經側氧基取代。在一些實施例中，L或L'之骨架包含不超過250個原子。在一些實施例中，L或L'能夠形成醯胺、胺基甲酸酯、磺醯基或脲連接。在一些實施例中，L或L'為鍵。在一些實施例中，L或L'為原子。在一些實施例中，L'為氮原子。
在一些實施例中，各L由式(M-L-1)描述：
Figure 02_image1061
其中：J1 係附接至A1之鍵；J2 係附接至E之鍵或能夠與結合於E之官能基反應的官能基(例如，順丁烯二醯亞胺及半胱胺酸、胺及經活化羧酸、硫醇及順丁烯二醯亞胺、經活化磺酸及胺、異氰酸酯及胺、疊氮化物及炔以及烯烴及四嗪)；Q1 、Q2 、Q3 、Q4 及Q5 各自獨立地為視情況經取代C1-C20伸烷基、視情況經取代C1-C20伸雜烷基、視情況經取代C2-C20伸烯基、視情況經取代C2-C20伸雜烯基、視情況經取代C2-C20伸炔基、視情況經取代C2-C20伸雜炔基、視情況經取代C3-C20伸環烷基、視情況經取代C3-C20伸雜環烷基、視情況經取代C4-C20伸環烯基、視情況經取代C4-C20伸雜環烯基、視情況經取代C8-C20伸環炔基、視情況經取代C8-C20伸雜環炔基、視情況經取代C5-C15伸芳基或視情況經取代C2-C15伸雜芳基；T1 、T2 、T3 、T4 各自獨立地為O、S、NRi 、P、羰基、硫羰基、磺醯基、磷酸酯基、磷醯基或亞胺基；Ri 為H、視情況經取代C1-C20烷基、視情況經取代C1-C20雜烷基、視情況經取代C2-C20烯基、視情況經取代C2-C20雜烯基、視情況經取代C2-C20炔基、視情況經取代C2-C20雜炔基、視情況經取代C3-C20環烷基、視情況經取代C3-C20雜環烷基、視情況經取代C4-C20環烯基、視情況經取代C4-C20雜環烯基、視情況經取代C8-C20環炔基、視情況經取代C8-C20雜環炔基、視情況經取代C5-C15芳基或視情況經取代C2-C15雜芳基；且g、h、i、j、k、l、m、n及o各自獨立地為0或1；或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，J2 可具有兩個附接至Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽之點(例如，兩個J2 )。
在一些實施例中，L為
Figure 02_image1063
、
Figure 02_image1065
、
Figure 02_image1067
、
Figure 02_image1069
或
Figure 02_image1071
， 其中d為1至20之整數(例如，d為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)。
在一些實施例中，L為
Figure 02_image1073
、
Figure 02_image1075
、
Figure 02_image1077
、
Figure 02_image1079
、
Figure 02_image1081
、
Figure 02_image1083
、
Figure 02_image1085
、
Figure 02_image1087
、
Figure 02_image1089
、
Figure 02_image1091
、
Figure 02_image1093
、
Figure 02_image1095
、
Figure 02_image1097
、
Figure 02_image1099
、
Figure 02_image1101
或
Figure 02_image1103
， 其中d及e各自獨立地為1至26之整數；或其醫藥學上可接受之鹽。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，L包括聚乙二醇(PEG)連接體。PEG連接體包括具有重複單元結構(-CH2 CH2 O-)n 之連接體，其中n為2至100之整數。聚乙二醇連接體可共價接合神經胺糖酸酶抑制劑及E (例如，在式(M-I)-(M-X)中任一者之結合物中)。聚乙二醇連接體可共價接合第一神經胺糖酸酶抑制劑及第二神經胺糖酸酶抑制劑(例如，在式(D-I)-(D-X)中任一者之結合物中)。聚乙二醇連接體可共價接合神經胺糖酸酶抑制劑二聚體及E (例如，在式(D-I)-(D-X)中任一者之結合物中)。聚乙二醇連接體可選自PEG2 至PEG100 中任一者(例如，PEG2 、PEG3 、PEG4 、PEG5 、PEG5 -PEG10 、PEG10 -PEG20 、PEG20 -PEG30 、PEG30 -PEG40 、PEG50 -PEG60 、PEG60 -PEG70 、PEG70 -PEG80 、PEG80 -PEG90 、PEG90 -PEG100 )。在一些實施例中，Lc 包括PEG連接體，其中LC 共價附接至Q及E中每一者。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，R1 為-NHC(=NH)NH2 。在本文所述之任何態樣之一些實施例中，R2 為-F。在本文所述之任何態樣之一些實施例中，R3 為-F。在本文所述之任何態樣之一些實施例中，R4 為–CO2 H。在本文所述之任何態樣之一些實施例中，R5 為–COCH3 。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，L共價附接至E之表面暴露離胺酸的氮原子或L共價附接至E之表面暴露半胱胺酸的硫原子。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E為Fc域單體。在一些實施例中，n為2且各E二聚以形成Fc域。
在一些實施例中，n為2，各E為Fc域單體，各E二聚以形成Fc域，且該結合物由式(D-I-1)描述：
Figure 02_image1105
(D-I-1) 其中J為Fc域；且T為1至20之整數(例如，T為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，n為2，各E為Fc域單體，各E二聚以形成Fc域，且該結合物由式(M-I-1)描述：
Figure 02_image1107
(M-I-1) 其中J為Fc域；且T為1至20之整數(例如，T為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其醫藥學上可接受之鹽。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E具有SEQ ID NO: 1-68中任一者之序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E為白蛋白、白蛋白結合肽或Fc結合肽。在其中E為白蛋白、白蛋白結合肽或Fc結合肽之一些實施例中，n為1。
在一些實施例中，n為1，E為白蛋白、白蛋白結合肽或Fc結合肽且該結合物由式(D-I-2)描述：
Figure 02_image1109
(D-I-2) 其中E為白蛋白、白蛋白結合肽或Fc結合肽；且T為1至20之整數，或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，n為1，E為白蛋白、白蛋白結合肽或Fc結合肽且該結合物由式(M-I-2)描述：
Figure 02_image1111
(M-I-2) 其中E為白蛋白、白蛋白結合肽或Fc結合肽；且T為1至20之整數，或其醫藥學上可接受之鹽。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E為具有SEQ ID NO: 69-71中任一者之序列的白蛋白。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，T為1、2、3、4或5。
在另一態樣中，本發明提供具有本文所述之任何結合物之結構的結合物之群體(例如，具有式(1)-(5)、(D-I)-(D-X)、(D’-I)、(M-I)-(M-X)或(M’-I)中任一式之結合物之群體)，其中T之平均值為1至20 (例如，T之平均值為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15或15至20)。在一些實施例中，T之平均值為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各A1 -L-A2 可獨立地經選擇(例如，獨立地選自本文所述之A1 -L-A2 結構中任一者)。在一些實施例中，E可結合於2、3、4、5、6、7、8、9、10個或10個以上不同A1 -L-A2 部分。在一些實施例中，E結合於第一A1 -L-A2 部分及第二A1 -L-A2 部分。在一些實施例中，第一A1 -L-A2 部分之A1 及A2 係獨立地選自式(A-III)-(A-V)中任一者：
Figure 02_image009
、
Figure 02_image011
、
Figure 02_image013
； (A-III)                     (A-IV)                            (A-V) 且第二A1 -L-A2 部分之A1 及A2 係獨立地選自式(A-I)、(A-II)、(A-VI)、(A-VII)、(A-VIII)及(A-IX)中任一者：
Figure 02_image005
、
Figure 02_image007
、
Figure 02_image015
、
Figure 02_image017
、
Figure 02_image019
、 (A-I)             (A-II)                        (A-VI)                   (A-VII)                   (A-VIII)
Figure 02_image021
。 (A-IX)
在一些實施例中，第一A1 -L-A2 部分各自特異性地結合於E之離胺酸殘基(例如，E之表面暴露離胺酸殘基的氮原子)，且第二A1 -L-A2 部分各自特異性地結合於E之半胱胺酸殘基(例如，E之表面暴露半胱胺酸殘基的硫原子)。在一些實施例中，第一A1 -L-A2 部分各自特異性地結合於E之半胱胺酸殘基(例如，E之表面暴露半胱胺酸殘基的硫原子)，且第二A1 -L-A2 部分各自特異性地結合於E之離胺酸殘基(例如，E之表面暴露離胺酸殘基的氮原子)。
在一些實施例中，結合於E之第一A1 -L-A2 部分的數目為1至10之整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。在一些實施例中，結合於E之第二A1 -L-A2 部分的數目為1至10之整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各A1 -L可獨立地經選擇(例如，獨立地選自本文所述之A1 -L結構中任一者)。在一些實施例中，E可結合於2、3、4、5、6、7、8、9、10個或10個以上不同A1 -L部分。在一些實施例中，E結合於第一A1 -L部分及第二A1 -L部分。在一些實施例中，第一A1 -L部分之A1 係選自式(A-III)-(A-V)中任一者：
Figure 02_image009
、
Figure 02_image011
、
Figure 02_image013
； (A-III)                     (A-IV)                            (A-V) 且第二A1 -L部分之A1 係選自式(A-I)、(A-II)、(A-VI)、(A-VII)、(A-VIII)或(A-IX)中任一者：
Figure 02_image005
、
Figure 02_image007
、
Figure 02_image015
、
Figure 02_image017
、
Figure 02_image019
、 (A-I)             (A-II)                        (A-VI)                  (A-VII)                   (A-VIII)
Figure 02_image021
。 (A-IX)
在一些實施例中，第一A1 -L部分各自特異性地結合於E之離胺酸殘基(例如，E之表面暴露離胺酸殘基的氮原子)，且第二A1 -L部分各自特異性地結合於E之半胱胺酸殘基(例如，E之表面暴露半胱胺酸殘基的硫原子)。在一些實施例中，第一A1 -L部分各自特異性地結合於E之半胱胺酸殘基(例如，E之表面暴露半胱胺酸殘基的硫原子)，且第二A1 -L部分各自特異性地結合於E之離胺酸殘基(例如，E之表面暴露離胺酸殘基的氮原子)。
在一些實施例中，結合於E之第一A1 -L部分的數目為1至10之整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。在一些實施例中，結合於E之第二A1 -L部分的數目為1至10之整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)。
在另一態樣中，本發明提供一種由式(D’-I)描述之結合物：
Figure 02_image1113
(D’-I) 其中各A1 係獨立地選自式(A-III)-(A-V)中任一者：
Figure 02_image009
、
Figure 02_image011
、
Figure 02_image013
； (A-III)                     (A-IV)                            (A-V) 其中各A2 係獨立地選自式(A-I)、(A-II)、(A-VI)、(A-VII)、(A-VIII)及(A-IX)中任一者：
Figure 02_image005
、
Figure 02_image007
、
Figure 02_image015
、
Figure 02_image017
、
Figure 02_image019
、 (A-I)             (A-II)                        (A-VI)                  (A-VII)                   (A-VIII)
Figure 02_image021
； (A-IX) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ；R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br；R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H；R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ；X係選自-O-及-S-；Y係選自
Figure 02_image1115
R6 係選自
Figure 02_image031
、
Figure 02_image033
、
Figure 02_image035
、
Figure 02_image037
、
Figure 02_image039
、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
Figure 02_image091
及
Figure 02_image093
； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；各E包含Fc域單體(例如，具有SEQ ID NO: 1-68中任一者之序列的Fc域單體)、白蛋白(例如，具有SEQ ID NO: 69-71中任一者之序列的白蛋白)、白蛋白結合肽或Fc結合肽；n為1或2；T1 為1至10之整數(例如，T1 為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)；L1 係共價附接至E及各A1 之連接體；T1 為1至10之整數(例如，T1 為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)；L2 係共價附接至E及各A2 之連接體；T2 為1至10之整數(例如，T2 為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)，或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，各A1 -L-A1 特異性地結合於E之離胺酸殘基(例如，E之表面暴露離胺酸殘基的氮原子)，且各A2 -L-A2 特異性地結合於E之半胱胺酸殘基(例如，E之表面暴露半胱胺酸殘基的硫原子)。在一些實施例中，各A1 -L-A1 部分特異性地結合於E之半胱胺酸殘基(例如，E之表面暴露半胱胺酸殘基的硫原子)，且各A2 -L-A2 部分特異性地結合於E之離胺酸殘基(例如，E之表面暴露離胺酸殘基的氮原子)。
在另一態樣中，本發明提供一種由式(M’-I)描述之結合物：
Figure 02_image1125
(M’-I) 其中各A1 係獨立地選自式(A-III)-(A-V)中任一(M-IX)：
Figure 02_image009
、
Figure 02_image011
、
Figure 02_image013
； (A-III)                     (A-IV)                            (A-V) 其中各A2 係獨立地選自式(A-I)、(A-II)、(A-VI)、(A-VII)、(A-VIII)及(A-IX)中任一者：
Figure 02_image005
、
Figure 02_image007
、
Figure 02_image015
、
Figure 02_image017
、
Figure 02_image019
、 (A-I)             (A-II)                        (A-VI)                  (A-VII)                   (A-VIII)
Figure 02_image021
； (A-IX) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ；R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br；R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H；R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ；X係選自-O-及-S-；Y係選自
Figure 02_image1127
R6 係選自
Figure 02_image031
、
Figure 02_image033
、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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及
Figure 02_image093
； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；各E包含Fc域單體(例如，具有SEQ ID NO: 1-68中任一者之序列的Fc域單體)、白蛋白(例如，具有SEQ ID NO: 69-71中任一者之序列的白蛋白)、白蛋白結合肽或Fc結合肽；n為1或2；T1 為1至10之整數(例如，T1 為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)；L1 係共價附接至E及A1 之連接體；T1 為1至10之整數(例如，T1 為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)；L2 係共價附接至E及A2 之連接體；T2 為1至10之整數(例如，T2 為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)，或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，各A1 -L特異性地結合於E之離胺酸殘基(例如，E之表面暴露離胺酸殘基的氮原子)，且各A2 -L特異性地結合於E之半胱胺酸殘基(例如，E之表面暴露半胱胺酸殘基的硫原子)。在一些實施例中，各A1 -L部分特異性地結合於E之半胱胺酸殘基(例如，E之表面暴露半胱胺酸殘基的硫原子)，且各A2 -L部分特異性地結合於E之離胺酸殘基(例如，E之表面暴露離胺酸殘基的氮原子)。
在另一態樣中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含本文所述之任何結合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-X)、(D’-I)、(M-I)-(M-X)或(M’-I)中任一者之結合物)或其醫藥學上可接受之鹽，及醫藥學上可接受之賦形劑。
在另一態樣中，本發明提供一種用於治療具有病毒感染或據推測具有病毒感染之個體之方法，該方法包括向該個體投與有效量的本文所述之結合物或組合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-X)、(D’-I)、(M-I)-(M-X)或(M’-I)中任一者之結合物)中任一者。
在另一態樣中，本發明提供一種用於預防性治療有需要之個體的病毒感染之方法，該方法包括向該個體投與有效量的本文所述之結合物或組合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-X)、(D’-I)、(M-I)-(M-X)或(M’-I)中任一者之結合物)中任一者。
在一些實施例中，該病毒感染係由流感病毒或副流感病毒引起。在一些實施例中，該病毒感染為A型、B型或C型流感病毒或副流感病毒。
在一些實施例中，該個體係免疫受損的。
在一些實施例中，該個體已經診斷患有體液免疫缺乏、T細胞缺乏、嗜中性白血球減少症、無脾或補體缺乏。
在一些實施例中，該個體正在經免疫抑制性療法治療或即將經免疫抑制性療法治療。
在一些實施例中，該個體已經診斷患有引起免疫抑制之疾病。在一些實施例中，該疾病為癌症或獲得性免疫缺乏症候群。在一些實施例中，該癌症為白血病、淋巴瘤或多發性骨髓瘤。
在一些實施例中，該個體已經受或即將經受造血幹細胞移植。
在一些實施例中，其中該個體已經受或即將經受器官移植。
在一些實施例中，該結合物或組合物肌肉內、靜脈內、皮內、動脈內、腹膜內、病變內、顱內、關節內、前列腺內、胸膜內、氣管內、鼻內、玻璃體內、陰道內、直腸內、經表面、腫瘤內、經腹膜、皮下、結膜下、囊內、經黏膜、心包內、臍內、眼內、經口、經局部、藉由吸入、藉由注射或藉由輸注經投與。
在一些實施例中，該個體經第二治療劑治療。在一些實施例中，該第二治療劑為抗病毒劑。在一些實施例中，該抗病毒劑係選自奧司他韋、紮那米韋、帕拉米韋、拉尼米韋(laninamivir)、金剛烷胺或金剛乙胺。在一些實施例中，該第二治療劑為病毒疫苗。在一些實施例中，該病毒疫苗在該個體中引起針對A型、B型或C型流感病毒或副流感病毒之免疫反應。
在一些實施例中，在式(1)-(5)、(D-I)-(D-X)、(D’-I)、(M-I)-(M-X)或(M’-I)中任一者(例如，式(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(D-I)、(D-II)、(D-II-1)、(D-II-2)、(D-II-3)、(D-II-4)、(D-II-5)、(D-II-6)、(D-II-7)、(D-II-8)、(D-II-9)、(D-II-10)、(D-III)、(D-III-1)、(D-III-2)、(D-III-3)、(D-III-4)、(D-III-5)、(D-III-6)、(D-III-7)、(D-III-8)、(D-III-9)、(D-IV)、(D-IV-1)、(D-IV-2)、(D-V)、(D-V-1)、(D-V-2)、(D-V-3)、(D-V-4)、(D-V-5)、(D-V-6)、(D-V-7)、(D-V-8)、(D-V-9)、(D-V-10)、(D-VI)、(D-VI-1)、(D-VI-2)、(D-VI-3)、(D-VI-4)、(D-VI-5)、(D-VI-6)、(D-VI-7)、(D-VI-8)、(D-VI-9)、(D-VII)、(D-VIII)、(D-VIII-1)、(D-VIII-2)、(D-VIII-3)、(D-VIII-4)、(D-VIII-5)、(D-VIII-6)、(D-VIII-7)、(D-VIII-8)、(D-VIII-9)、(D-VIII-10)、(D-VIII-11)、(D-IX)、(D-IX-1)、(D-IX-2)、(D-IX-3)、(D-IX-4)、(D-IX-5)、(D-IX-6)、(D-X)、(D-X-1)、(D-X-2)、(D-X-3)、(D’-I)、(M-I)、(M-II)、(M-II-1)、(M-II-2)、(M-II-3)、(M-II-4)、(M-II-5)、(M-II-6)、(M-II-7)、(M-II-8)、(M-II-9)、(M-II-10)、(M-III)、(M-III-1)、(M-III-2)、(M-III-3)、(M-III-4)、(M-III-5)、(M-III-6)、(M-III-7)、(M-III-8)、(M-III-9)、(M-IV)、(M-IV-1)、(M-IV-2)、(M-V)、(M-V-1)、(M-V-2)、(M-V-3)、(M-V-4)、(M-V-5)、(M-V-6)、(M-V-7)、(M-V-8)、(M-V-9)、(M-V-10)、(M-VI)、(M-VI-1)、(M-VI-2)、(M-VI-3)、(M-VI-4)、(M-VI-5)、(M-VI-6)、(M-VI-7)、(M-VI-8)、(M-VI-9)、(M-VII)、(M-VIII)、(M-VIII-1)、(M-VIII-2)、(M-VIII-3)、(M-VIII-4)、(M-VIII-5)、(M-VIII-6)、(M-VIII-7)、(M-VIII-8)、(M-VIII-9)、(M-VIII-10)、(M-VIII-11)、(M-IX)、(M-IX-1)、(M-IX-2)、(M-IX-3)、(M-IX-4)、(M-IX-5)、(M-IX-6)、(M-X)、(M-X-1)、(M-X-2)、(M-X-3)或(M’-I)中任一者)中，含Fc域組合物可取代Fc域且含Fc域-單體組合物可取代Fc域單體。在本文所述之式中任一者(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-X)、(D’-I)、(M-I)-(M-X)或(M’-I)中任一者)中，當n為1時，E為含Fc域-單體組合物。在本文所述之式中任一者(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-X)、(D’-I)、(M-I)-(M-X)或(M’-I)中任一者)中，當n為2時，E為含Fc域組合物。
在某些實施例中，該含Fc域組合物為抗體或抗體片段。抗體可包括免疫球蛋白之任何形式、重鏈抗體、輕鏈抗體、基於LRR之抗體或具有抗體樣特性之其他蛋白骨架，以及此項技術中已知之任何其他免疫結合部分，包括抗體片段(例如，Fab、Fab'、Fab’2、F(ab')2、Fd、Fv、Feb、scFv或SMIP)。不同類別之抗體的次單元結構及三維組態為此項技術中已知的。抗體片段可包括如下結合部分，其包括源於抗體或與抗體具有顯著同源性之部分，諸如抗體之抗原決定區。例示性抗體片段包括Fab、Fab'、Fab’2、F(ab')2、Fd、Fv、Feb、scFv及SMIP。
在特定實施例中，該抗體或抗體片段為人類、小鼠、駱駝科動物(例如，美洲駝、羊駝或駱駝)、山羊、綿羊、兔、雞、豚鼠、倉鼠、馬或大鼠抗體或抗體片段。在特定實施例中，該抗體為IgG、IgA、IgD、IgE、IgM或內體。在某些實施例中，該抗體片段包括scFv、sdAb、dAb、Fab、Fab'、Fab'2、F(ab')2、Fd、Fv、Feb或SMIP。
在一些實施例中，該含Fc域組合物(例如，抗體或抗體片段)對一或多種標靶(例如，抗原)賦予結合特異性。
在一些實施例中，由該含Fc域組合物(例如，抗體或抗體片段)結合之該一或多種標靶(例如，抗原)為病毒(例如，流感)蛋白，諸如神經胺糖酸酶或血球凝集素。在一些實施例中，該抗體或抗體片段識別病毒表面抗原。在一些實施例中，該抗體或抗體片段靶向血球凝集素。血球凝集素靶向抗體包括單株抗體，諸如CR6261、CR8020、MEDI8852、MHAA4549A及VIS410。在一些實施例中，該抗體或抗體片段係靶向流感血球凝集素之廣泛中和抗體或抗體片段(例如，描述於Wu等人, J. Mol. Biol. 429:2694–2709 (2017)中之抗體或抗體片段)。在一些實施例中，該抗體或抗體片段靶向病毒基質蛋白(例如，基質2蛋白)。TCN032為基質2蛋白靶向性單株抗體。
在一些實施例中，該含Fc域組合物(例如，抗體或抗體片段)包括一或多種單域抗體(sdAb)。在一些實施例中，該含Fc域組合物為如下抗體或抗體片段，其包括具有流感A反應性之sdAb，諸如結合於流感A之血球凝集素之sdAb (例如SD36或SD38，描述於Laursen等人 Science. 362:598-602 (2018)中)。在一些實施例中，該含Fc域組合物為如下抗體或抗體片段，其包括具有流感B反應性之sdAb，諸如結合於流感B之血球凝集素之sdAb (例如SD83或SD84，描述於Laursen等人 Science. 362:598-602 (2018)中)。
在一些實施例中，該含Fc域組合物係包括2種或2種以上(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10種或10種以上) sdAb之多域抗體(MDAb)或多域抗體片段。在一些實施例中，該MDAb或其片段包括結合於流感A之血球凝集素之一或多種sdAB，及結合於流感B之血球凝集素之一或多種sdAb。在一些實施例中，該MDAb為JNJ-7445 (亦稱作MD3606)，其描述於Laursen等人 Science. 362:598-602 (2018)中。簡言之，JNJ-7445係包括結合於流感A之血球凝集素之兩種sdAb (SD36及SD38)及結合於流感B之血球凝集素之兩種sdAb (SD83及SD84)的MDAb，該等sdAb連接至Fc域(IgG1)。該等sdAb藉由用流感疫苗及H7及H2重組血球凝集素使美洲駝免疫而產生。
在另一態樣中，本發明包括由式(1)-(5)、(D-I)-(D-X)、(D’-I)、(M-I)-(M-X)或(M’-I)中任一者(例如，式(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(D-I)、(D-II)、(D-II-1)、(D-II-2)、(D-II-3)、(D-II-4)、(D-II-5)、(D-II-6)、(D-II-7)、(D-II-8)、(D-II-9)、(D-II-10)、(D-III)、(D-III-1)、(D-III-2)、(D-III-3)、(D-III-4)、(D-III-5)、(D-III-6)、(D-III-7)、(D-III-8)、(D-III-9)、(D-IV)、(D-IV-1)、(D-IV-2)、(D-V)、(D-V-1)、(D-V-2)、(D-V-3)、(D-V-4)、(D-V-5)、(D-V-6)、(D-V-7)、(D-V-8)、(D-V-9)、(D-V-10)、(D-VI)、(D-VI-1)、(D-VI-2)、(D-VI-3)、(D-VI-4)、(D-VI-5)、(D-VI-6)、(D-VI-7)、(D-VI-8)、(D-VI-9)、(D-VII)、(D-VIII)、(D-VIII-1)、(D-VIII-2)、(D-VIII-3)、(D-VIII-4)、(D-VIII-5)、(D-VIII-6)、(D-VIII-7)、(D-VIII-8)、(D-VIII-9)、(D-VIII-10)、(D-VIII-11)、(D-IX)、(D-IX-1)、(D-IX-2)、(D-IX-3)、(D-IX-4)、(D-IX-5)、(D-IX-6)、(D-X)、(D-X-1)、(D-X-2)、(D-X-3)、(D’-I)、(M-I)、(M-II)、(M-II-1)、(M-II-2)、(M-II-3)、(M-II-4)、(M-II-5)、(M-II-6)、(M-II-7)、(M-II-8)、(M-II-9)、(M-II-10)、(M-III)、(M-III-1)、(M-III-2)、(M-III-3)、(M-III-4)、(M-III-5)、(M-III-6)、(M-III-7)、(M-III-8)、(M-III-9)、(M-IV)、(M-IV-1)、(M-IV-2)、(M-V)、(M-V-1)、(M-V-2)、(M-V-3)、(M-V-4)、(M-V-5)、(M-V-6)、(M-V-7)、(M-V-8)、(M-V-9)、(M-V-10)、(M-VI)、(M-VI-1)、(M-VI-2)、(M-VI-3)、(M-VI-4)、(M-VI-5)、(M-VI-6)、(M-VI-7)、(M-VI-8)、(M-VI-9)、(M-VII)、(M-VIII)、(M-VIII-1)、(M-VIII-2)、(M-VIII-3)、(M-VIII-4)、(M-VIII-5)、(M-VIII-6)、(M-VIII-7)、(M-VIII-8)、(M-VIII-9)、(M-VIII-10)、(M-VIII-11)、(M-IX)、(M-IX-1)、(M-IX-2)、(M-IX-3)、(M-IX-4)、(M-IX-5)、(M-IX-6)、(M-X)、(M-X-1)、(M-X-2)、(M-X-3)或(M’-I)中任一者)描述之結合物，其中E為抗體或抗體片段。在其中E為抗體或抗體片段之較佳實施例中，n為1。在一些實施例中，該抗體或抗體片段包括本文所述之任何抗體或抗體片段，諸如結合於病毒血球凝集素之單株抗體(例如，CR6261、CR8020、MEDI8852、MHAA4549A或VIS410)；靶向病毒血球凝集素之廣泛中和抗體或抗體片段(例如，描述於Wu等人, J. Mol. Biol. 429:2694–2709 (2017)中之抗體或抗體片段)；靶向病毒血球凝集素之sdAb (例如，SD36、SD38、SD83或SD84)；或靶向病毒血球凝集素之MDAb或其片段(例如，JNJ-7445)。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 1之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 1之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 2之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 2之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 3之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 3之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 4之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 4之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 5之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 5之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 6之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 6之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 7之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 7之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 8之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 8之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 9之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 9之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 10之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 10之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 11之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 12之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 12之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 13之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 13之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 14之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 14之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 15之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 15之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 16之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 16之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 17之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 17之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 18之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 18之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 19之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 19之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 20之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 20之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 21之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 21之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 22之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 22之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 23之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 23之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 24之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 24之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 25之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 25之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 26之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 26之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 27之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 27之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 28之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 28之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 29之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 29之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 30之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 30之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 31之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 31之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 32之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 32之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 33之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 33之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 34之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 34之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 35之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 35之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 36之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 36之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 37之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 37之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 38之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 38之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 39之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 39之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 40之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 40之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 41之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 41之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 42之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 42之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 43之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 43之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 44之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 45之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 46之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 46之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 47之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 47之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 48之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 48之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 49之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 49之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 50之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 50之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 51之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 51之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 52之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 52之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 53之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 53之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 54之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 54之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 55之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 55之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 56之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 56之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 57之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 57之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 58之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 58之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 59之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 59之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 60之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 60之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 61之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 61之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 62之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 62之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 63之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 63之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 64之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 64之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 65之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 65之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 66之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 66之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 67之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 67之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 68之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 68之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 69之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 69之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 70之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 70之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，E (例如，各E)包括SEQ ID NO: 71之胺基酸序列。在一些實施例中，E包括與SEQ ID NO: 71之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在其中E包括Fc域單體的本文所述之任何態樣之一些實施例中，該Fc域單體(例如，具有SEQ ID NO: 1-68中任一者之序列的Fc域單體)包括對應於M252Y/S254T/T256E (YTE)之三重突變。如本文所用，應理解「對應於」(例如，特定SEQ ID NO.之)特定胺基酸殘基之胺基酸包括熟習此項技術者將理解與(例如，該特定序列之)該特定殘基比對的任何胺基酸殘基。例如，SEQ ID NO: 1-68中任一者可發生突變以包括YTE突變。
在其中E包括Fc域單體的本文所述之任何態樣之一些實施例中，該Fc域單體(例如，具有SEQ ID NO: 1-68中任一者之序列的Fc域單體)包括對應於M428L/N434S (LS)之雙重突變型。如本文所用，應理解「對應於」(例如，特定SEQ ID NO.之)特定胺基酸殘基之胺基酸包括熟習此項技術者將理解與(例如，該特定序列之)該特定殘基比對的任何胺基酸殘基。例如，SEQ ID NO: 1-68中任一者可發生突變以包括LS突變。
在其中E包括Fc域單體的本文所述之任何態樣之一些實施例中，該Fc域單體(例如，具有SEQ ID NO: 1-68中任一者之序列的Fc域單體)包括對應於N434H之突變型。如本文所用，應理解「對應於」(例如，特定SEQ ID NO.之)特定胺基酸殘基之胺基酸包括熟習此項技術者將理解與(例如，該特定序列之)該特定殘基比對的任何胺基酸殘基。例如，SEQ ID NO: 1-68中任一者可發生突變以包括N434H突變。
在其中E包括Fc域單體的本文所述之任何態樣之一些實施例中，該Fc域單體(例如，具有SEQ ID NO: 1-68中任一者之序列的Fc域單體)包括對應於C220S之突變型。如本文所用，應理解「對應於」(例如，特定SEQ ID NO.之)特定胺基酸殘基之胺基酸包括熟習此項技術者將理解與(例如，該特定序列之)該特定殘基比對的任何胺基酸殘基。例如，SEQ ID NO: 1-68中任一者可發生突變以包括C220S突變。
在其中E包括Fc域單體的本文所述之任何態樣之一些實施例中，該Fc域單體(例如，具有SEQ ID NO: 1-68中任一者之序列的Fc域單體)係該Fc域單體之片段(例如，來自SEQ ID NO: 1-68之至少25個(例如，20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50個或更多)、至少50個(例如，51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75個或更多)、至少75個(例如，75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100個或更多)連續胺基酸長的片段。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-X)、(D’-I)、(M-I)-(M-X)或(M’-I)中任一者之結合物)，E之一或多個表面暴露離胺酸殘基的一或多個氮原子或E中之一或多個表面暴露半胱胺酸的一或多個硫原子共價結合於連接體(例如，PEG2 -PEG20 連接體)。結合於E之連接體可經官能化，以致其可反應以與本文所述之任何A1 -L或任何A2 -L-A1 之L形成共價鍵。在較佳實施例中，E結合於經疊氮基官能化之連接體且A1 -L或任何A2 -L-A1 之L經炔基官能化。E之連接體-疊氮基及A1 -L或A2 -L-A1 之連接體-炔結合(例如，藉由點擊化學)形成本發明結合物，例如由式(1)-(5)、(D-I)-(D-X)、(D’-I)、(M-I)-(M-X)或(M’-I)中任一者描述之結合物。在其他實施例中，E結合於經炔基官能化之連接體且任何A1 -L或任何A2 -L-A1 之L經疊氮基官能化。E之連接體-炔及A1 -L或A2 -L-A1 之連接體-疊氮基結合(例如，藉由點擊化學)形成本發明結合物，例如由式(1)-(5)、(D-I)-(D-X)、(D’-I)、(M-I)-(M-X)或(M’-I)描述之結合物。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，式(1)-(5)、(D-I)-(D-X)、(D’-I)、(M-I)-(M-X)或(M’-I)中任一者之波浪線可表示E與A1 -L或A2 -L-A1 之L之間的共價鍵。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，式(1)-(5)、(D-I)-(D-X)、(D’-I)、(M-I)-(M-X)或(M’-I)中任一者之波浪線可表示E之一或多個胺基酸側鏈(例如，E之一或多個表面暴露離胺酸殘基的一或多個氮原子或E中之一或多個表面暴露半胱胺酸的一或多個硫原子)已結合於連接體(例如，PEG2 -PEG20 連接體)，其中該連接體已經反應性部分官能化，以致該反應性部分與本文所述之任何A1 -L或任何A2 -L-A1 之L形成共價鍵(例如，藉由經疊氮基官能化之連接體與經炔官能化之連接體之間的點擊化學，如上文所述)。在本文所述之任何態樣之一些實施例中，A1 及/或A2 具有由(A-I)描述之結構：
Figure 02_image005
(A-I)。
在較佳實施例中，其中A1 及/或A2 具有由(A-I)描述之結構：R1 為-NHC(=NH)NH2 ，R4 為-CO2 H，R5 為-COCH3 ，及/或X為-O-。在較佳實施例中，A1 及/或A2 具有由下式描述之紮那米韋結構：
Figure 02_image1129
。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，A1 及/或A2 具有由(A-II)描述之結構：
Figure 02_image007
(A-II)。
在較佳實施例中，其中A1 及/或A2 具有由(A-II)描述之結構：R1 為-NHC(=NH)NH2 ，R2 為H或F，R3 為H或F，R4 為-CO2 H，R5 為-COCH3 ，及/或X為-O-。在較佳實施例中，A1 及/或A2 具有由下式描述之結構：
Figure 02_image1132
或
Figure 02_image1134
。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，A1 及/或A2 具有由(A-III)描述之結構：
Figure 02_image009
(A-III)。
在較佳實施例中，其中A1 及/或A2 具有由(A-III)描述之結構：R1 為-NHC(=NH)NH2 ，R4 為-CO2 H，及/或R5 為-COCH3 。在較佳實施例中，A1 及/或A2 具有由下式描述之帕拉米韋結構：
Figure 02_image1136
。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，A1 及/或A2 具有由(A-IV)描述之結構：
Figure 02_image011
(A-IV)。
在較佳實施例中，其中A1 及/或A2 具有由(A-IV)描述之結構：R1 為-NHC(=NH)NH2 ，R4 為-CO2 H，及/或R5 為-COCH3 。在較佳實施例中，A1 及/或A2 具有由下式描述之結構：
Figure 02_image1138
。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，A1 及/或A2 具有由(A-V)描述之結構：
Figure 02_image013
(A-V)。
在較佳實施例中，其中A1 及/或A2 具有由(A-V)描述之結構：R1 為-NHC(=NH)NH2 ，R4 為-CO2 H，及/或R5 為-COCH3 。在較佳實施例中，A1 及/或A2 具有由下式描述之結構：
Figure 02_image1140
。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，A1 及/或A2 具有由(A-VI)描述之結構：
Figure 02_image015
(A-VI)。
在較佳實施例中，其中A1 及/或A2 具有由(A-VI)描述之結構：R1 為-NHC(=NH)NH2 ，R4 為-CO2 H，R5 為-COCH3 ，及/或X為-O-。在較佳實施例中，A1 及/或A2 具有由下式描述之紮那米韋結構：
Figure 02_image1142
。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，A1 及/或A2 具有由(A-VII)描述之結構：
Figure 02_image017
(A-VII)。
在較佳實施例中，其中A1 及/或A2 具有由(A-VII)描述之結構：R1 為-NHC(=NH)NH2 ，R2 為H或F，R3 為H或F，R4 為-CO2 H，R5 為-COCH3 ，及/或X為-O-。在較佳實施例中，A1 及/或A2 具有由下式描述之結構：
Figure 02_image1144
或
Figure 02_image1146
。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，A1 及/或A2 具有由(A-VIII)描述之結構：
Figure 02_image019
(A-VIII)。
在較佳實施例中，其中A1 及/或A2 具有由(A-VIII)描述之結構：R1 為-NHC(=NH)NH2 ，R5 為-COCH3 ，及/或X為-O-。在較佳實施例中，A1 及/或A2 具有由下式描述之結構：
Figure 02_image1148
。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，A1 及/或A2 具有由(A-IX)描述之結構：
Figure 02_image021
(A-IX)。
在較佳實施例中，其中A1 及/或A2 具有由(A-IX)描述之結構：R1 為-NHC(=NH)NH2 ，R2 為H或F，R3 為H或F，R5 為-COCH3 ，及/或X為-O-。在較佳實施例中，A1 及/或A2 具有由下式描述之結構：
Figure 02_image1150
或
Figure 02_image1152
。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，A1 及/或A2 具有由(A-X)描述之結構：
Figure 02_image023
(A-X)。
在較佳實施例中，其中A1 及/或A2 具有由(A-X)描述之結構：R1 為-NHC(=NH)NH2 ，R3 為H，R5 為-COCH3 ，及/或X為-O-。在較佳實施例中，A1 及/或A2 具有由下式描述之磺基紮那米韋結構：
Figure 02_image1154
。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，A1 及/或A2 具有由(A-XI)描述之結構：
Figure 02_image025
(A-XI)。
在較佳實施例中，其中A1 及/或A2 具有由(A-XI)描述之結構：R4 為-CO2 H，及/或R5 為-COCH3 。在較佳實施例中，該烯烴為(E)、(Z)或(E)/(Z)之外消旋混合物。在較佳實施例中，A1 及/或A2 具有由下式描述之A-315675 (Abbott)結構：
Figure 02_image1156
。
在本文所述之任何態樣之一些實施例中，A1 及/或A2 具有由(A-XII)描述之結構：
Figure 02_image027
(A-XII)。
在較佳實施例中，其中A1 及/或A2 具有由(A-XII)描述之結構：R4 為-CO2 H。在較佳實施例中，A1 及/或A2 具有由下式描述之A-315675 (Abbott)結構：
Figure 02_image1158
。
在一些實施例中，該結合物為結合物1或其任何區域異構體，且藥物:抗體比率(DAR) (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。
在一些實施例中，該結合物為結合物2或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。
在一些實施例中，該結合物為結合物3或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。
在一些實施例中，該結合物為結合物4或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。
在一些實施例中，該結合物為結合物5或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。
在一些實施例中，該結合物為結合物6或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。
在一些實施例中，該結合物為結合物7或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。
在一些實施例中，該結合物為結合物8或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。
在一些實施例中，該結合物為結合物9或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。
在一些實施例中，該結合物為結合物10或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。
在一些實施例中，該結合物為結合物11或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。
在一些實施例中，該結合物為結合物12或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。
在一些實施例中，該結合物為結合物13或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。
在一些實施例中，該結合物為結合物14或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。
在一些實施例中，該結合物為結合物15或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。
在一些實施例中，該結合物為結合物16或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。
在一些實施例中，該結合物為結合物17或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。
在一些實施例中，該結合物為結合物18或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。
在一些實施例中，該結合物為結合物19或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。
在一些實施例中，該結合物為結合物20或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。
在一些實施例中，該結合物為結合物21或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。
在一些實施例中，該結合物為結合物22或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。
在一些實施例中，該結合物為結合物23或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。
在一些實施例中，該結合物為結合物24或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。
在一些實施例中，該結合物為結合物25或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。
在一些實施例中，該結合物為結合物26或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。
在一些實施例中，該結合物為結合物27或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。
在一些實施例中，該結合物為結合物28或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。
在一些實施例中，該結合物為結合物29或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。
在一些實施例中，該結合物為結合物30或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。
在一些實施例中，該結合物為結合物31或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。
在一些實施例中，該結合物為結合物32或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。
在一些實施例中，該結合物為結合物33或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。
在一些實施例中，該結合物為結合物34或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。
在一些實施例中，該結合物為結合物35或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。
在一些實施例中，該結合物為結合物36或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。
在一些實施例中，該結合物為結合物37或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。
在一些實施例中，該結合物為結合物38或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。
在一些實施例中，該結合物為結合物39或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。
在一些實施例中，該結合物為結合物40或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。
在一些實施例中，該結合物為結合物41或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。
在一些實施例中，該結合物為結合物42或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。
在一些實施例中，該結合物為結合物43或其任何區域異構體，且DAR (例如，T)係在0.5與10.0之間，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些實施例中，DAR係在0.5與2.0之間、在2.0與4.0之間、在4.0與6.0之間、在6.0與8.0之間或在8.0與10.0之間。定義
為了促進理解本發明，下文定義多個術語。本文所定義之術語具有如本發明相關領域中之一般技術者通常所理解的含義。諸如「一(a)」、「一(an)」及「該(the)」之術語不意欲僅指單一實體，而包括可用於說明之特定實例所屬的一般類別。該術語在本文中用於描述本發明之特定實施例，但其使用不會限定本發明，除非如申請專利範圍中所概述。
如本文所用，術語「神經胺糖酸酶抑制劑」或「「病毒神經胺糖酸酶抑制劑」係指減少酶流感病毒神經胺糖酸酶(例如，來自A型、B型或C型流感病毒)之活性之化合物。神經胺糖酸酶抑制劑可藉由熟習此項技術者已知之方法，例如藉由流感病毒斑塊減少分析中病毒複製之減少，例如低於20 μM (例如，低於10 μM、5 μM、2 μM、1 μM、500 nM或100 nM)之濃度來鑑別。熟習此項技術者已知之病毒神經胺糖酸酶抑制劑包括紮那米韋、磺基紮那米韋、帕拉米韋及A-315675 (Abbott) (參見例如Hadházi等人 A sulfozanamivir analogue has potent anti-influenza virus activity.ChemMedChem Comm. 13:785-789 (2018)及In vitro characterization of A-315675, a highly potent inhibitor of A and B strain of influenze virus neuraminidases and influenza virus replication.Antimicrobial Agents and Chemotherapy 46(4):1014-1021 (2002))。本發明之病毒神經胺糖酸酶抑制劑包括紮那米韋、磺基紮那米韋、帕拉米韋、A-315675及其類似物，諸如式(A-I)-(A-XII)之病毒神經胺糖酸酶抑制劑：
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、 (A-I)             (A-II)                      (A-III)                          (A-IV)                (A-V)
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、 (A-VI)                (A-VII)                   (A-VIII)               (A-IX)
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、
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、
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； (A-X)                 (A-XI)                      (A-XII) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ；R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br；R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H；R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ；X係選自-O-及-S-；Y係選自
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R6 係選自
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及
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； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；且R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基。
如本文所用，術語「抑制神經胺糖酸酶活性」係指小於或等於1,000 nM之IC50 ，例如，如根據本文實例2中之神經胺糖酸酶抑制分析所量測。特定言之，IC50 表示活體外50%抑制所需之流感病毒神經胺糖酸酶抑制劑濃度。在一些態樣中，根據神經胺糖酸酶抑制分析小於或等於100 nM或小於或等於10 nM之IC50 指示抑制神經胺糖酸酶活性之化合物。
「病毒感染」意指病毒(例如，流感病毒)在宿主生物體(例如，人類個體)中之致病性生長。病毒感染可為其中病毒群體之存在正在損害宿主身體之任何情形。因此，當個體之身體中或身體上存在過量病毒群體時，或當病毒群體之存在正在損害該個體之細胞或其他組織時，該個體「正在經受」病毒感染。
如本文所用，術語「Fc域單體」係指如下多肽鏈，其包括至少一個鉸鏈域及第二及第三抗體恆定域(CH 2及CH 3)或其功能片段(例如，能夠(i)與另一Fc域單體二聚以形成Fc域，及(ii)結合於Fc受體之片段。該Fc域單體可為任何免疫球蛋白抗體同型，包括IgG、IgE、IgM、IgA或IgD (例如，IgG)。另外，該Fc域單體可為IgG亞型(例如，IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgG4) (例如，IgG1)。Fc域單體不包括免疫球蛋白中能夠充當抗原-識別區之任何部分，例如可變域或互補決定區(CDR)。如本文所述之結合物中的Fc域單體可含有相對於野生型Fc域單體序列之一或多種改變(例如，1-10、1-8、1-6、1-4種胺基酸取代、添加或缺失)，其改變Fc域與Fc受體之間的相互作用。合適改變之實例為此項技術中已知的。在某些實施例中，人類Fc域單體(例如IgG重鏈，諸如IgG1)包含自Asn208、Glu216、Asp221、Lys222或Cys226中任一者延伸至Lys447處之重鏈羧基端的區。該Fc區之C端Lys447可或可不存在，不影響該Fc區之結構或穩定性。除非本文中另外規定，否則該IgG或Fc域單體中胺基酸殘基之編號係根據針對抗體之EU編號系統，該系統亦稱為Kabat EU指數，如例如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest , 第5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991中所述。
如本文所用，術語「Fc域」係指兩種Fc域單體之二聚體，其能夠結合Fc受體。在野生型Fc域中，兩種Fc域單體藉由兩個CH 3抗體恆定域之間的相互作用二聚化，在一些實施例中，兩種二聚化Fc域單體之鉸鏈域之間形成一或多個二硫鍵。
術語「共價附接」係指結合物中藉由共價鍵彼此連接之兩個部分，該共價鍵形成於該結合物之該兩個部分中的兩個原子之間。
如本文所用，術語「Fc結合肽」係指係指具有5至50個(例如，5至40個、5至30個、5至20個、5至15個、5至10個、10至50個、10至30個或10至20個)胺基酸殘基之胺基酸序列之多肽，其對Fc域(諸如本文所述之任何Fc域)具有親和力且具有結合該Fc域之功能。Fc結合肽肽可具有不同起源，例如合成、人類、小鼠或大鼠。本發明之Fc結合肽包括已經工程改造以包括一或多個(例如，兩個、三個、四個或五個)溶劑暴露半胱胺酸或離胺酸殘基之Fc結合肽，其可提供用於結合於本發明化合物(例如，結合於神經胺糖酸酶抑制劑單體或二聚體，包括藉助於連接體)之位點。最佳地，該Fc結合肽將含有單一溶劑暴露半胱胺酸或離胺酸，因此使得本發明化合物能夠位點特異性結合。Fc結合肽可僅包括天然存在之胺基酸殘基，或可包括一或多個非天然存在之胺基酸殘基。在包括時，非天然存在之胺基酸殘基(例如，非天然存在之胺基酸殘基的側鏈)可用作用於本發明化合物(例如，神經胺糖酸酶抑制劑單體或二聚體，包括藉助於連接體)之附接點。本發明之Fc結合肽可為直鏈或環狀的。本發明之Fc結合肽包括熟習此項技術者已知之任何Fc結合肽。
如此處所用，術語「白蛋白」係指包含對應於天然存在之白蛋白(例如，人類血清白蛋白)或其變異體(諸如天然存在之白蛋白的經工程改造變異體)之胺基酸徐麗麗餓之多肽。白蛋白之變異體包括多態性、諸如域及子域之片段及融合蛋白(例如，具有諸如多肽連接體之C端或N端融合之白蛋白)。較佳地，白蛋白具有人類血清白蛋白(HSA)或其變異體或片段之胺基酸序列，最佳地具有其功能變異體或片段之胺基酸序列。本發明之白蛋白包括與SEQ ID NO: 69-71中任一者具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之蛋白。本發明之白蛋白包括已經工程改造以包括一或多個(例如，兩個、三個、四個或五個)溶劑暴露半胱胺酸或離胺酸殘基之白蛋白，其可提供用於結合於本發明化合物(例如，結合於神經胺糖酸酶抑制劑單體或二聚體，包括藉助於連接體)之位點。最佳地，該白蛋白將含有單一溶劑暴露半胱胺酸或離胺酸，因此使得本發明化合物能夠位點特異性結合。白蛋白可僅包括天然存在之胺基酸殘基，或可包括一或多個非天然存在之胺基酸殘基。在包括時，非天然存在之胺基酸殘基(例如，非天然存在之胺基酸殘基的側鏈)可用作用於本發明化合物(例如，神經胺糖酸酶抑制劑單體或二聚體，包括藉助於連接體)之附接點。
如本文所用，術語「白蛋白結合肽」係指具有5至50個(例如，5至40個、5至30個、5至20個、5至15個、5至10個、10至50個、10至30個或10至20個)胺基酸殘基之胺基酸序列之多肽，其對白蛋白(諸如本文所述之任何白蛋白)具有親和力且具有結合該白蛋白之功能。較佳地，白蛋白結合肽結合於天然存在之血清白蛋白，最佳地人類血清白蛋白。白蛋白結合肽可具有不同起源，例如合成、人類、小鼠或大鼠。本發明之白蛋白結合肽包括已經工程改造以包括一或多個(例如，兩個、三個、四個或五個)溶劑暴露半胱胺酸或離胺酸殘基之白蛋白結合肽，其可提供用於結合於本發明化合物(例如，結合於神經胺糖酸酶抑制劑單體或二聚體，包括藉助於連接體)之位點。最佳地，該白蛋白結合肽將含有單一溶劑暴露半胱胺酸或離胺酸，因此使得本發明化合物能夠位點特異性結合。白蛋白結合肽可僅包括天然存在之胺基酸殘基，或可包括一或多個非天然存在之胺基酸殘基。在包括時，非天然存在之胺基酸殘基(例如，非天然存在之胺基酸殘基的側鏈)可用作用於本發明化合物(例如，神經胺糖酸酶抑制劑單體或二聚體，包括藉助於連接體)之附接點。本發明之白蛋白結合肽可為直鏈或環狀的。本發明之白蛋白結合肽包括熟習此項技術者已知之任何白蛋白結合肽，其實例提供於本文中。進一步例示性白蛋白結合肽提供於美國專利申請案第2005/0287153號中，該美國專利申請案以引用之方式整體倂入本文中。
如本文所用，諸如表面暴露半胱胺酸或表面暴露離胺酸之「表面暴露胺基酸」或「溶劑暴露胺基酸」係指如下胺基酸，其易接近圍繞該蛋白質之溶劑。表面暴露胺基酸可為天然存在的，或該蛋白質之經工程改造變異體(例如，取代或插入)。在一些實施例中，表面暴露胺基酸係如下胺基酸，其在經取代時未實質上改變該蛋白質之三維結構。
如本文所用，術語「連接體」、「L」及「L'」係指結合物中之兩種或兩種以上組分之間(例如，本文所述之結合物中的兩種神經胺糖酸酶抑制劑之間、本文所述之結合物中的神經胺糖酸酶抑制劑與Fc域或白蛋白之間及本文所述之結合物中的兩種神經胺糖酸酶抑制劑之二聚體與Fc域或白蛋白之間)的共價連接。在一些實施例中，本文所述之結合物可含有具有三價結構之連接體(例如，三價連接體)。三價連接體具有三個臂，其中各臂共價連接至該結合物之組分(例如，結合於第一神經胺糖酸酶抑制劑之第一臂、結合於第二神經胺糖酸酶抑制劑之第二臂及結合於Fc域或白蛋白之第三臂)。
可用作連接體之分子包括至少兩個官能基，該等官能基可為相同或不同的，例如兩個羧酸基、兩個胺基、兩個磺酸基、羧酸基及順丁烯二醯亞胺基、羧酸基及炔基、羧酸基及胺基、羧酸基及磺酸基、胺基及順丁烯二醯亞胺基、胺基及炔基或胺基及磺酸基。第一官能基可與該結合物中之第一組分形成共價連接且第二官能基可與該結合物中之第二組分形成共價連接。在三價連接體之一些實施例中，連接體之兩個臂可含有兩種二羧酸，其中第一羧酸可與該結合物中之第一神經胺糖酸酶抑制劑形成共價連接且第二羧酸可與該結合物中之第二神經胺糖酸酶抑制劑形成共價連接且該連接體之第三臂可與該結合物中之Fc域或白蛋白形成共價連接。二羧酸之實例進一步描述於本文中。在一些實施例中，含有一或多個順丁烯二醯亞胺基之分子可用作連接體，其中該順丁烯二醯亞胺基可與該結合物中之組分(例如，Fc域或白蛋白)的半胱胺酸形成碳-硫連接。在一些實施例中，含有一或多個炔基之分子可用作連接體，其中該炔基可與該結合物中之組分(例如，Fc域或白蛋白)的疊氮化物形成1,2,3-三唑連接。在一些實施例中，含有一或多個疊氮基之分子可用作連接體，其中該疊氮基可與該結合物中之組分(例如，Fc域或白蛋白)的炔形成1,2,3-三唑連接。在一些實施例中，含有一或多個雙碸基之分子可用作連接體，其中該雙碸基可與該結合物中之組分(例如，Fc域或白蛋白)的胺基形成連接。在一些實施例中，含有一或多個磺酸基之分子可用作連接體，其中該磺酸基可與該結合物中之組分形成磺醯胺連接。在一些實施例中，含有一或多個異氰酸酯基之分子可用作連接體，其中該異氰酸酯基可與該結合物中之組分形成脲連接。在一些實施例中，含有一或多個鹵烷基之分子可用作連接體，其中該鹵烷基可與該結合物中之組分形成共價連接，例如C-N及C-O連接。
在一些實施例中，連接體提供兩種或兩種以上組分之間的空間、剛性及/或柔性。在一些實施例中，連接體可為鍵，例如共價鍵。術語「鍵」係指化學鍵，例如醯胺鍵、二硫鍵、C-O鍵、C-N鍵、N-N鍵、C-S鍵或由化學反應(例如，化學結合)產生之任何種類的鍵。在一些實施例中，連接體包括不超過250個原子。在一些實施例中，連接體包括不超過250個非氫原子。在一些實施例中，連接體之骨架包括不超過250個原子。連接體之「骨架」係指連接體中之原子，其合起來形成自結合物之一部分至該結合物之另一部分之最短路徑(例如，連接第一神經胺糖酸酶抑制劑及第二神經胺糖酸酶抑制劑的最短路徑)。連接體之骨架中的原子直接地參與連接結合物之一部分至該結合物之另一部分(例如，連接第一神經胺糖酸酶抑制劑及第二神經胺糖酸酶抑制劑)。例如，附接於連接體之骨架中的碳之氫原子未被視為直接地參與連接該結合物之一部分至該結合物之另一部分。
在一些實施例中，連接體可包含源於例如合成聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)聚合物)之合成基團。在一些實施例中，連接體可包含一或多個胺基酸殘基，諸如D-或L-胺基酸殘基。在一些實施例中，連接體可為胺基酸序列(例如，1-25個胺基酸、1-10個胺基酸、1-9個胺基酸、1-8個胺基酸、1-7個胺基酸、1-6個胺基酸、1-5個胺基酸、1-4個胺基酸、1-3個胺基酸、1-2個胺基酸或1個胺基酸之序列)之殘基。在一些實施例中，連接體可包含一或多個(例如，1-100個、1-50個、1-25個、1-10個、1-5個或1-3個)視情況經取代伸烷基、視情況經取代伸雜烷基(例如，PEG單元)、視情況經取代伸烯基、視情況經取代伸雜烯基、視情況經取代伸炔基、視情況經取代伸雜炔基、視情況經取代伸環烷基、視情況經取代伸雜環烷基、視情況經取代伸環烯基、視情況經取代伸雜環烯基、視情況經取代伸環炔基、視情況經取代伸雜環炔基、視情況經取代伸芳基、視情況經取代伸雜芳基(例如，吡啶)、O、S、NRi (Ri 為H、視情況經取代烷基、視情況經取代雜烷基、視情況經取代烯基、視情況經取代雜烯基、視情況經取代炔基、視情況經取代雜炔基、視情況經取代環烷基、視情況經取代雜環烷基、視情況經取代環烯基、視情況經取代雜環烯基、視情況經取代環炔基、視情況經取代雜環炔基、視情況經取代芳基或視情況經取代雜芳基)、P、羰基、硫羰基、磺醯基、磷酸酯基、磷醯基或亞胺基。例如，連接體可包含一或多個視情況經取代C1-C20伸烷基、視情況經取代C1-C20伸雜烷基(例如，PEG單元)、視情況經取代C2-C20伸烯基(例如，C2伸烯基)、視情況經取代C2-C20伸雜烯基、視情況經取代C2-C20伸炔基、視情況經取代C2-C20伸雜炔基、視情況經取代C3-C20伸環烷基(例如，伸環丙基、伸環丁基)、視情況經取代C3-C20伸雜環烷基、視情況經取代C4-C20伸環烯基、視情況經取代C4-C20伸雜環烯基、視情況經取代C8-C20伸環炔基、視情況經取代C8-C20伸雜環炔基、視情況經取代C5-C15伸芳基(例如，C6伸芳基)、視情況經取代C2-C15伸雜芳基(例如，咪唑、吡啶)、O、S、NRi (Ri 為H、視情況經取代C1-C20烷基、視情況經取代C1-C20雜烷基、視情況經取代C2-C20烯基、視情況經取代C2-C20雜烯基、視情況經取代C2-C20炔基、視情況經取代C2-C20雜炔基、視情況經取代C3-C20環烷基、視情況經取代C3-C20雜環烷基、視情況經取代C4-C20環烯基、視情況經取代C4-C20雜環烯基、視情況經取代C8-C20環炔基、視情況經取代C8-C20雜環炔基、視情況經取代C5-C15芳基或視情況經取代C2-C15雜芳基)、P、羰基、硫羰基、磺醯基、磷酸酯基、磷醯基或亞胺基。
如本文所用，術語「烷基」、「烯基」及「炔基」包括直鏈及分支鏈單價取代基，以及其組合，當未經取代時僅含有C及H。當烷基包括至少一個碳-碳雙鍵或碳-碳三鍵時，該烷基可分別稱作「烯基」或「炔基」。烷基、烯基或炔基之單價不包括該烷基、烯基或炔基上視情況存在之取代基。例如，若烷基、烯基或炔基附接於化合物，則該烷基、烯基或炔基之單價係指其附接於該化合物且不包括可存在於該烷基、烯基或炔基上之任何額外取代基。在一些實施例中，烷基或雜烷基可含有例如1-20、1-18、1-16、1-14、1-12、1-10、1-8、1-6、1-4或1-2個碳原子(例如，C1-C20、C1-C18、C1-C16、C1-C14、C1-C12、C1-C10、C1-C8、C1-C6、C1-C4或C1-C2)。在一些實施例中，烯基、雜烯基、炔基或雜炔基可含有例如2-20、2-18、2-16、2-14、2-12、2-10、2-8、2-6或2-4個碳原子(例如，C2-C20、C2-C18、C2-C16、C2-C14、C2-C12、C2-C10、C2-C8、C2-C6或C2-C4)。實例包括但不限於甲基、乙基、異丁基、第二丁基、第三丁基、2-丙烯基及3-丁炔基。
如本文所用，術語「環烷基」表示單價飽和或不飽和非芳族環烷基。環烷基可具有例如三個至二十個碳(例如，C3-C7、C3-C8、C3-C9、C3-C10、C3-C11、C3-C12、C3-C14、C3-C16、C3-C18或C3-C20環烷基)。環烷基之實例包括但不限於環丙基、環丁基、環戊基、環己基及環庚基。當環烷基包括至少一個碳-碳雙鍵時，該環烷基可稱作「環烯基」。環烯基可具有例如四個至二十個碳(例如，C4-C7、C4-C8、C4-C9、C4-C10、C4-C11、C4-C12、C4-C14、C4-C16、C4-C18或C4-C20環烯基)。例示性環烯基包括但不限於環戊烯基、環己烯基及環庚烯基。當環烷基包括至少一個碳-碳三鍵時，該環烷基可稱作「環炔基」。環炔基可具有例如八個至二十個碳(例如，C8-C9、C8-C10、C8-C11、C8-C12、C8-C14、C8-C16、C8-C18或C8-C20環炔基)。術語「環烷基」亦包括具有橋接多環結構之環狀化合物，其中一或多個碳橋接單環之兩個不相鄰成員，例如雙環[2.2.1.]庚基及金剛烷。術語「環烷基」亦包括二環、三環及四環稠環結構，例如十氫化萘及螺環化合物。如本文所用，術語「芳基」係指就電子分佈而言在環系統中具有芳香性特徵之任何單環或稠環二環或三環系統，例如苯基、萘基或菲。在一些實施例中，環系統含有5-15個環成員原子或5-10個環成員原子。芳基可具有例如五個至十五個碳(例如，C5-C6、C5-C7、C5-C8、C5-C9、C5-C10、C5-C11、C5-C12、C5-C13、C5-C14或C5-C15芳基)。術語「雜芳基」亦指含有一或多個(例如，1-4、1-3、1、2、3或4個)選自O、S及N之雜原子之該等單環或稠合二環系統。雜芳基可具有例如兩個至十五個碳(例如，C2-C3、C2-C4、C2-C5、C2-C6、C2-C7、C2-C8、C2-C9、C2-C10、C2-C11、C2-C12、C2-C13、C2-C14或C2-C15雜芳基)。雜原子之包括允許包括欲被視為芳族之5-員環以及6-員環。因此，典型雜芳基系統包括例如吡啶基、嘧啶基、吲哚基、苯并咪唑基、苯并三唑基、異喹啉基、喹啉基、苯并噻唑基、苯并呋喃基、噻吩基、呋喃基、噻唑基、噁唑基、異噁唑基、苯并惡唑基、苯并異噁唑基及咪唑基。因為互變異構體為可能的，故諸如鄰苯二甲醯亞胺基之基團亦被視為雜芳基。在一些實施例中，芳基或雜芳基為視情況含有1-2個氮原子之5或6員芳環系統。在一些實施例中，芳基或雜芳基為視情況經取代苯基、吡啶基、吲哚基、嘧啶基、噠嗪基、苯并噻唑基、苯并咪唑基、吡唑基、咪唑基、異噁唑基、噻唑基或咪唑并吡啶基。在一些實施例中，芳基為苯基。在一些實施例中，芳基可視情況經諸如芳基取代基(例如，聯苯基)之取代基取代。
術語「烷芳基」係指連接至伸烷基、伸烯基或伸炔基之芳基。一般而言，若化合物附接於烷芳基，則該烷芳基之伸烷基、伸烯基或伸炔基部分附接於該化合物。在一些實施例中，烷芳基為C6-C35烷芳基(例如，C6-C16、C6-C14、C6-C12、C6-C10、C6-C9、C6-C8、C7或C6烷芳基)，其中碳數目指示該烷芳基之芳基部分及伸烷基、伸烯基或伸炔基部分中的碳之總數。烷芳基之實例包括但不限於(C1-C8)伸烷基(C6-C12)芳基、(C2-C8)伸烯基(C6-C12)芳基或(C2-C8)伸炔基(C6-C12)芳基。在一些實施例中，烷芳基為苯甲基或苯乙基。在雜烷芳基中，一或多個選自N、O及S之雜原子可存在於該烷芳基之伸烷基、伸烯基或伸炔基部分中及/或可存在於該烷芳基之芳基部分中。在視情況經取代烷芳基中，取代基可存在於該烷芳基之伸烷基、伸烯基或伸炔基部分上及/或可存在於該烷芳基之芳基部分上。
如本文所用，術語「胺基」表示–N(Rx )2 或–N+ (Rx )3 ，其中Rx 各自獨立地為H、烷基、烯基、炔基、芳基、烷芳基、環烷基，或兩個Rx 組合形成雜環烷基。在一些實施例中，胺基為-NH2 。
如本文所用，術語「烷胺基」係指本文所述之胺基，其附接於伸烷基(例如，C1-C5伸烷基)、伸烯基(例如，C2-C5伸烯基)或伸炔基(例如，C2-C5伸烯基)。一般而言，若化合物附接於烷胺基，則該烷胺基之伸烷基、伸烯基或伸炔基部分附接於該化合物。烷胺基之胺基部分係指–N(Rx )2 或–N+ (Rx )3 ，其中Rx 各自獨立地為H、烷基、烯基、炔基、芳基、烷芳基、環烷基，或兩個Rx 組合形成雜環烷基。在一些實施例中，烷胺基之胺基部分為-NH2 。烷胺基之實例為C1-C5烷胺基，例如C2烷胺基(例如，CH2 CH2 NH2 或CH2 CH2 N(CH3 )2 )。在雜烷胺基中，一或多個(例如，1-4、1-3、1、2、3或4個)選自N、O及S之雜原子可存在於該雜烷胺基之伸烷基、伸烯基或伸炔基部分中。在一些實施例中，烷胺基可視情況經取代。在經取代烷胺基中，取代基可存在於該烷胺基之伸烷基、伸烯基或伸炔基部分上及/或可存在於該烷胺基之胺基部分上。
如本文所用，術語「烷醯胺」係指如下醯胺基，其附接於伸烷基(例如，C1-C5伸烷基)、伸烯基(例如，C2-C5伸烯基)或伸炔基(例如，C2-C5伸烯基)。一般而言，若化合物附接於烷醯胺基，則該烷醯胺之伸烷基、伸烯基或伸炔基部分附接於該化合物。烷醯胺之醯胺部分係指–C(O)-N(Rx )2 ，其中Rx 各自獨立地為H、烷基、烯基、炔基、芳基、烷芳基、環烷基，或兩個Rx 組合形成雜環烷基。在一些實施例中，烷醯胺之醯胺部分為-C(O)NH2 。烷醯胺基可為-(CH2 )2 -C(O)NH2 或-CH2 -C(O)NH2 。在雜烷醯胺基中，一或多個(例如，1-4、1-3、1、2、3或4個)選自N、O及S之雜原子可存在於該雜烷醯胺基之伸烷基、伸烯基或伸炔基部分中。在一些實施例中，烷醯胺基可視情況經取代。在經取代烷醯胺基中，取代基可存在於該烷醯胺基之伸烷基、伸烯基或伸炔基部分上及/或可存在於該烷醯胺基之醯胺部分上。
如本文所用，術語「伸烷基」、「伸烯基」及「伸炔基」係指具有規定大小之二價基團。在一些實施例中，伸烷基可含有例如1-20、1-18、1-16、1-14、1-12、1-10、1-8、1-6、1-4或1-2個碳原子(例如，C1-C20、C1-C18、C1-C16、C1-C14、C1-C12、C1-C10、C1-C8、C1-C6、C1-C4或C1-C2)。在一些實施例中，伸烯基或伸炔基可含有例如2-20、2-18、2-16、2-14、2-12、2-10、2-8、2-6或2-4個碳原子(例如，C2-C20、C2-C18、C2-C16、C2-C14、C2-C12、C2-C10、C2-C8、C2-C6或C2-C4)。伸烷基、伸烯基及/或伸炔基包括直鏈及分支鏈形式，以及其組合。伸烷基、伸烯基或伸炔基之二價不包括該伸烷基、伸烯基或伸炔基上視情況存在之取代基。例如，兩種神經胺糖酸酶抑制劑可藉助於包括伸烷基、伸烯基及/或伸炔基或其組合之連接體彼此附接。該連接體中之伸烷基、伸烯基及/或伸炔基中每一者關於伸烷基、伸烯基及/或伸炔基之任一末端上的兩個附接被視為二價。例如，若連接體包括-(視情況經取代伸烷基)-(視情況經取代伸烯基)-(視情況經取代伸烷基)-，則該伸烯基關於其與該連接體之末端處的兩個伸烷基之附接被視為二價。伸烯基上之視情況存在之取代基未包括於該伸烯基之二價中。伸烷基、伸烯基或伸炔基(例如，連接體中之伸烷基、伸烯基或伸炔基)之二價性質係指該基團的兩個末端且不包括可存在於伸烷基、伸烯基或伸炔基中之視情況存在之取代基。因為其為二價，故其可使結合物之多個(例如，兩個)部分(例如，第一神經胺糖酸酶抑制劑及第二神經胺糖酸酶抑制劑)連接在一起。伸烷基、伸烯基及/或伸炔基可由典型地適用作如本文所陳述之烷基、烯基及炔基之取代基的基團取代。例如，C=O係由側氧基(=O)取代之C1伸烷基。例如，-HCR-C≡C-可被視為視情況經取代伸炔基且被視為二價基團，即使其具有視情況存在之取代基R。伸雜烷基、伸雜烯基及/或伸雜炔基係指包括一或多個(例如，1-4、1-3、1、2、3或4個)雜原子(例如，N、O及S)之伸烷基、伸烯基及/或伸炔基。例如，聚乙二醇(PEG)聚合物或PEG聚合物中之PEG單元-(CH2 )2 -O-被視為含有一或多個氧原子之伸雜烷基。
如本文所用，術語「伸環烷基」係指使化合物之兩個部分連接在一起之二價環狀基團。例如，伸環烷基內之一個碳可連接至該化合物之一部分，而該伸環烷基內之另一碳可連接至該化合物之另一部分。伸環烷基可包括飽和或不飽和非芳族環狀基團。伸環烷基可在該伸環烷基之環狀部分中具有例如三個至二十個碳(例如，C3-C7、C3-C8、C3-C9、C3-C10、C3-C11、C3-C12、C3-C14、C3-C16、C3-C18或C3-C20伸環烷基)。當伸環烷基包括至少一個碳-碳雙鍵時，該伸環烷基可稱作「伸環烯基」。伸環烯基可在該伸環烯基之環狀部分中具有例如四個至二十個碳(例如，C4-C7、C4-C8、C4-C9、C4-C10、C4-C11、C4-C12、C4-C14、C4-C16、C4-C18或C4-C20伸環烯基)。當伸環烷基包括至少一個碳-碳三鍵時，該伸環烷基可稱作「伸環炔基」。伸環炔基可在該伸環炔基之環狀部分中具有例如四個至二十個碳(例如，C4-C7、C4-C8、C4-C9、C4-C10、C4-C11、C4-C12、C4-C14、C4-C16、C4-C18或C8-C20伸環炔基)。伸環烷基可由典型地適用作如本文所陳述之烷基、烯基及炔基之取代基的基團取代。伸雜環烷基係指包括一或多個(例如，1-4、1-3、1、2、3或4個)雜原子(例如，N、O及S)之伸環烷基。伸環烷基之實例包括但不限於伸環丙基及伸環丁基。四氫呋喃可被視為伸雜環烷基。
如本文所用，術語「伸芳基」係指使化合物之多個(例如，兩個或三個)部分連接在一起之多價(例如，二價或三價)芳基。例如，伸芳基內之一個碳可連接至該化合物之一部分，而該伸芳基內之另一碳可連接至該化合物之另一部分。伸芳基可在該伸芳基之芳基部分中具有例如五個至十五個碳(例如，C5-C6、C5-C7、C5-C8、C5-C9、C5-C10、C5-C11、C5-C12、C5-C13、C5-C14或C5-C15伸芳基)。伸芳基可由典型地適用作如本文所陳述之烷基、烯基及炔基之取代基的基團取代。伸雜芳基係指包括一或多個(例如，1-4、1-3、1、2、3或4個)雜原子(例如，N、O及S)之芳族基團。伸雜芳基可具有例如兩個至十五個碳(例如，C2-C3、C2-C4、C2-C5、C2-C6、C2-C7、C2-C8、C2-C9、C2-C10、C2-C11、C2-C12、C2-C13、C2-C14或C2-C15伸雜芳基)。
如本文所用，術語「視情況經取代」係指具有0、1或多個取代基，諸如0-25、0-20、0-10或0-5個取代基。取代基包括但不限於烷基、烯基、炔基、芳基、烷芳基、醯基、雜芳基、雜烷基、雜烯基、雜炔基、雜烷芳基、鹵素、側氧基、氰基、硝基、胺基、烷胺基、羥基、烷氧基、烷醯基、羰基、胺甲醯基、胍基、脲基、脒基、上述基團或部分中任一者及上述基團或部分中任一者之雜形式。取代基包括但不限於F、Cl、甲基、苯基、苯甲基、OR、NR2 、SR、SOR、SO2 R、OCOR、NRCOR、NRCONR2 、NRCOOR、OCONR2 、RCO、COOR、烷基-OOCR、SO3 R、CONR2 、SO2 NR2 、NRSO2 NR2 、CN、CF3 、OCF3 、SiR3 及NO2 ，其中R各自獨立地為H、烷基、烯基、芳基、雜烷基、雜烯基或雜芳基，且其中同一或相鄰原子上之兩個視情況存在之取代基可接合以形成含有3–8個成員的稠合、視情況經取代芳族或非芳族、飽和或不飽和環，或同一原子上之兩個視情況存在之取代基可接合以形成含有3–8個成員的視情況經取代芳族或非芳族、飽和或不飽和環。視情況經取代基團或部分係指其中一個原子(例如，氫原子)視情況經另一取代基置換之基團或部分(例如，上述基團或部分中任一者)。例如，視情況經取代烷基可為視情況經取代甲基，其中該甲基之氫原子由例如OH置換。作為另一實例，雜烷基或其二價配對物伸雜烷基上之取代基可置換碳上之氫或諸如N之雜原子上的氫。例如，基團-R-NH-R-中之氫原子可經烷醯胺取代基取代，例如-R-N[(CH2 C(O)N(CH3 )2 ]-R。
一般而言，視情況存在之取代基為非干擾取代基。「非干擾取代基」係指如下取代基，其保留本文所述之結合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-X)、(D’-I)、(M-I)-(M-X)或(M’-I)中任一者之結合物)結合於病毒神經胺糖酸酶或抑制流感病毒的增殖之能力。因此，在一些實施例中，該取代基可改變該活性之程度。然而，只要該結合物保留結合於病毒神經胺糖酸酶或抑制病毒增殖之能力，該取代基就將歸類為「非干擾」。例如，非干擾取代基將保留該化合物基於病毒斑塊減少分析中10 μM或更低之IC50值(諸如在實例2中基於小於500 nM之針對流感病毒神經胺糖酸酶的IC50值)提供抗病毒功效之能力。因此，基於斑塊減少或流感病毒神經胺糖酸酶抑制，該取代基可改變抑制之程度。然而，只要本文中之該等化合物(諸如式(A-I)、(A-II)、(A-III)、(A-IV)、(A-V)、(A-VI)、(A-VII)、(A-VIII)、(A-IX)、(A-X)、(A-XI)及(A-XII)化合物)保留抑制流感病毒神經胺糖酸酶活性之能力，該取代基就將歸類為「非干擾」。用於測定病毒斑塊減少或任何化合物抑制流感病毒神經胺糖酸酶之能力之多種分析在此項技術中可獲得且一些例示於下文實例中。
術語「雜」在用於描述化學基團或部分時係指具有至少一個非碳或氫之雜原子，例如N、O及S。若上述基團或部分中任一者均含有至少一個雜原子，則其可稱為雜。例如，雜環烷基、雜環烯基或雜環炔基係指具有一或多個獨立地選自例如N、O及S之雜原子之環烷基、環烯基或環炔基。雜環烯基之實例為順丁烯二醯亞胺基。例如，雜芳基係指具有一或多個獨立地選自例如N、O及S之雜原子之芳族基團。一或多個雜原子亦可包括於置換如本文所述之基團或部分中的氫原子之取代基中。例如，在視情況經取代雜芳基中，若該雜芳基中之一個氫原子經取代基(例如，甲基)置換，則該取代基亦可含有一或多個雜原子(例如，甲醇)。
如本文所用，術語「醯基」係指具有如下結構之基團：
Figure 02_image1172
，其中Rz 為視情況經取代烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、烷芳基、烷胺基、雜烷基、雜烯基、雜炔基、雜環烷基、雜環烯基、雜環炔基、雜芳基、雜烷芳基或雜烷胺基。
如本文所用，術語「鹵基」或「鹵素」係指任何鹵素原子，例如F、Cl、Br或I。若本文所述之基團或部分中任一者均含有至少一個鹵素原子，則其可稱為「鹵基部分」，諸如鹵烷基。
如本文所用，術語「羥基」表示-OH基團。
如本文所用，術語「側氧基」係指具有結構=O之取代基，其中在原子與氧原子之間存在雙鍵。
如本文所用，術語「羰基」係指具有如下結構之基團：
Figure 02_image1174
。
如本文所用，術語「硫羰基」係指具有如下結構之基團：
Figure 02_image1176
如本文所用，術語「磷酸酯基」表示具有如下結構之基團：
Figure 02_image1178
。
如本文所用，術語「磷醯基」表示具有如下結構之基團：
Figure 02_image1180
或
Figure 02_image1182
。
如本文所用，術語「磺醯基」表示具有如下結構之基團：
Figure 02_image1184
。
如本文所用，術語「亞胺基」表示具有如下結構之基團：
Figure 02_image1186
，其中R為視情況存在之取代基。
如本文所用，術語「N -保護基」表示在合成程序期間意欲保護胺基以抵禦非所需反應之彼等基團。通常使用之N -保護基揭示於Greene, 「Protective Groups in Organic Synthesis,」 第5版(John Wiley & Sons, New York, 2014)中，其以引用之方式倂入本文中。N -保護基包括例如醯基、芳醯基及胺甲醯基，諸如甲醯基、乙醯基、丙醯基、特戊醯基、第三丁基乙醯基、2-氯乙醯基、2-溴乙醯基、三氟乙醯基、三氯乙醯基、鄰苯二甲醯基、鄰硝基苯氧基乙醯氯、α-氯丁醯基、苯甲醯基、羧基苯甲基(CBz)、4-氯苯甲醯基、4-溴苯甲醯基、4-硝基苯甲醯基，及對掌性助劑，諸如經保護或未經保護D、L或D, L-胺基酸殘基，諸如丙胺酸、白胺酸、苯丙胺酸；含磺醯基之基團，諸如苯磺醯基及對甲苯磺醯基；胺基甲酸酯形成基團，諸如苯甲氧基羰基、對-氯苯甲氧基羰基、對-甲氧基苯甲氧基羰基、對硝基苯甲氧基羰基、2-硝基苯甲氧基羰基、對-溴苯甲氧基羰基、3,4-二甲氧基苯甲氧基羰基、3,5-二甲氧基苯甲氧基羰基、2,4-二甲氧基苯甲氧基羰基、4-甲氧基苯甲氧基羰基、2-硝基-4,5-二甲氧基苯甲氧基羰基、3,4,5-三甲氧基苯甲氧基羰基、1-(對-聯苯基)-1-甲基乙氧基羰基、α,α-二甲基-3,5-二甲氧基苯甲氧基羰基、二苯甲基氧基羰基、第三丁基氧基羰基(BOC)、二異丙基甲氧基羰基、異丙氧基羰基、乙氧基羰基、甲氧基羰基、烯丙氧基羰基、2,2,2,-三氯乙氧基羰基、苯氧基羰基、4-硝基苯氧基羰基、茀基-9-甲氧基羰基(Fmoc)、環戊基氧基羰基、金剛烷基氧基羰基、環己基氧基羰基及苯基硫羰基；烷芳基，諸如苯甲基、三苯基甲基及苯甲氧基甲基；及矽烷基，諸如三甲基矽烷基。
如本文所用，術語「胺基酸」意謂天然存在之胺基酸及非天然存在之胺基酸。
如本文所用，術語「天然存在之胺基酸」意謂包括Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr及Val之胺基酸。
如本文所用，術語「非天然存在之胺基酸」意謂未天然產生或發現於哺乳動物中之α胺基酸。非天然存在之胺基酸之實例包括D-胺基酸；具有附接於半胱胺酸之硫原子的乙醯基胺基甲基之胺基酸；聚乙二醇化胺基酸；式NH2 (CH2 )n COOH之ω胺基酸，其中n為2-6，中性非極性胺基酸，諸如肌胺酸、第三丁基丙胺酸、第三丁基甘胺酸、N-甲基異白胺酸及正白胺酸；氧基甲硫胺酸；苯基甘胺酸；瓜胺酸；甲硫胺酸亞碸；磺基丙胺酸；鳥胺酸；二胺基丁酸；3-胺基丙胺酸；3-羥基-D-脯胺酸；2,4-二胺基丁酸；2-胺基戊酸；2-胺基辛酸、2-羧基哌嗪；哌嗪-2-甲酸、2-胺基-4苯基丁酸；3-(2-萘基)丙胺酸，及羥基脯胺酸。其他胺基酸為α-胺基丁酸、α-胺基-α-甲基丁酸酯、胺基環丙烷-羧酸酯、胺基異丁酸、胺基降冰片基-羧酸酯、L-環己基丙胺酸、環戊基丙胺酸、L-N-甲基白胺酸、L-N-甲基甲硫胺酸、L-N-甲基正纈胺酸、L-N-甲基苯基丙胺酸、L-N-甲基脯胺酸、L-N-甲基絲胺酸、L-N-甲基色胺酸、D-鳥胺酸、L-N-甲基乙基甘胺酸、L-正白胺酸、α-甲基-胺基異丁酸酯、α-甲基環己基丙胺酸、D-α-甲基丙胺酸、D-α-甲基精胺酸、D-α-甲基天冬醯胺、D-α-甲基天冬胺酸、D-α-甲基半胱胺酸、D-α-甲基麩醯胺、D-α-甲基組胺酸、D-α-甲基異白胺酸、D-α-甲基白胺酸、D-α-甲基離胺酸、D-α-甲基甲硫胺酸、D-α-甲基鳥胺酸、D-α-甲基苯丙胺酸、D-α-甲基脯胺酸、D-α-甲基絲胺酸、D-N-甲基絲胺酸、D-α-甲基酥胺酸、D-α-甲基色胺酸、D-α-甲基酪胺酸、D-α-甲基纈胺酸、D-N-甲基丙胺酸、D-N-甲基精胺酸、D-N-甲基天冬醯胺、D-N-甲基天冬胺酸、D-N-甲基半胱胺酸、D-N-甲基麩醯胺、D-N-甲基麩胺酸鹽、D-N-甲基組胺酸、D-N-甲基異白胺酸、D-N-甲基白胺酸、D-N-甲基離胺酸、N-甲基環己基丙胺酸、D-N-甲基鳥胺酸、N-甲基甘胺酸、N-甲基胺基異丁酸鹽、N-(1-甲基丙基)甘胺酸、N-(2-甲基丙基)甘胺酸、D-N-甲基色胺酸、D-N-甲基酪胺酸、D-N-甲基纈胺酸、γ-胺基丁酸、L-第三丁基甘胺酸、L-乙基甘胺酸、L-高苯丙胺酸、L-α-甲基精胺酸、L-α-甲基天冬胺酸、L-α-甲基半胱胺酸、L-α-甲基麩醯胺、L-α-甲基組胺酸、L-α-甲基異白胺酸、L-α-甲基白胺酸、L-α-甲基甲硫胺酸、L-α-甲基正纈胺酸、L-α-甲基苯丙胺酸、L-α-甲基絲胺酸、L-α-甲基色胺酸、L-α-甲基纈胺酸、N-(N-(2,2-二苯基乙基)胺甲醯基甲基甘胺酸、1-羧基-1-(2,2-二苯基-乙基胺基)環丙烷、4-羥基脯胺酸、鳥胺酸、2-胺基苯甲醯基(鄰胺基苯甲醯基)、D-環己基丙胺酸、4-苯基-苯丙胺酸、L-瓜胺酸、α-環己基甘胺酸、L-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲酸、L-噻唑啶-4-甲酸、L-高酪胺酸、L-2-呋喃基丙胺酸、L-組胺酸(3-甲基)、N-(3-胍基丙基)甘胺酸、O-甲基-L-酪胺酸、O-聚醣-絲胺酸、間-酪胺酸、正-酪胺酸、L-N,N′,N″-三甲基離胺酸、高離胺酸、正離胺酸、N-聚醣天冬醯胺、7-羥基-1,2,3,4-四氫-4-氟苯丙胺酸、4-甲基苯丙胺酸、雙-(2-吡啶甲基)胺、五氟苯丙胺酸、吲哚啉-2-甲酸、2-胺基苯甲酸、3-胺基-2-萘甲酸、不對稱二甲基精胺酸、L-四氫異喹啉-1-甲酸、D-四氫異喹啉-1-甲酸、1-胺基-環己烷乙酸、D/L-烯丙基甘胺酸、4-胺基苯甲酸、1-胺基-環丁烷甲酸、2或3或4-胺基環己烷甲酸、1-胺基-1-環戊烷甲酸、1-胺基茚滿-1-甲酸、4-胺基-吡咯啶-2-甲酸、2-胺基萘滿-2-甲酸、氮雜環丁烷-3-甲酸、4-苯甲基-吡咯啶-2-甲酸、第三丁基甘胺酸、b-(苯并噻唑基-2-基)-丙胺酸、b-環丙基丙胺酸、5,5-二甲基-1,3-噻唑啶-4-甲酸、(2R,4S)4-羥基哌啶-2-甲酸、(2S,4S)及(2S,4R)-4-(2-萘基甲氧基)-吡咯啶-2-甲酸、(2S,4S)及(2S,4R)4-苯氧基-吡咯啶-2-甲酸、(2R,5S)及(2S,5R)-5-苯基-吡咯啶-2-甲酸、(2S,4S)-4-胺基-1-苯甲醯基-吡咯啶-2-甲酸、第三丁基丙胺酸、(2S,5R)-5-苯基-吡咯啶-2-甲酸、1-胺基甲基-環己烷-乙酸、3,5-雙-(2-胺基)乙氧基-苯甲酸、3,5-二胺基-苯甲酸、2-甲基胺基-苯甲酸、N-甲基鄰胺基苯甲酸、L-N-甲基丙胺酸、L-N-甲基精胺酸、L-N-甲基天冬醯胺、L-N-甲基天冬胺酸、L-N-甲基半胱胺酸、L-N-甲基麩醯胺、L-N-甲基麩胺酸、L-N-甲基組胺酸、L-N-甲基異白胺酸、L-N-甲基離胺酸、L-N-甲基正白胺酸、L-N-甲基鳥胺酸、L-N-甲基酥胺酸、L-N-甲基酪胺酸、L-N-甲基纈胺酸、L-N-甲基-第三丁基甘胺酸、L-正纈胺酸、α-甲基-γ-胺基丁酸鹽、4,4′-二苯基丙胺酸、α-甲基環戊基丙胺酸、α-甲基-α-萘基丙胺酸、α-甲基青黴胺、N-(4-胺基丁基)甘胺酸、N-(2-胺基乙基)甘胺酸、N-(3-胺基丙基)甘胺酸、N-胺基-α-甲基丁酸鹽、α-萘基丙胺酸、N-苯甲基甘胺酸、N-(2-胺甲醯基乙基)甘胺酸、N-(胺甲醯基甲基)甘胺酸、N-(2-羧基乙基)甘胺酸、N-(羧基甲基)甘胺酸、N-環丁基甘胺酸、N-環癸基甘胺酸、N-環庚基甘胺酸、N-環己基甘胺酸、N-環癸基甘胺酸、N-環十二烷基甘胺酸、N-環辛基甘胺酸、N-環丙基甘胺酸、N-環十一烷基甘胺酸、N-(2,2-二苯基乙基)甘胺酸、N-(3,3-二苯基丙基)甘胺酸、N-(3-胍基丙基)甘胺酸、N-(1-羥基乙基)甘胺酸、N-(羥基乙基))甘胺酸、N-(咪唑基乙基))甘胺酸、N-(3-吲哚基乙基)甘胺酸、N-甲基-γ-胺基丁酸鹽、D-N-甲基甲硫胺酸、N-甲基環戊基丙胺酸、D-N-甲基苯丙胺酸、D-N-甲基脯胺酸、D-N-甲基酥胺酸、N-(1-甲基乙基)甘胺酸、N-甲基-萘基丙胺酸、N-甲基青黴胺、N-(p-羥基苯基)甘胺酸、N-(硫甲基)甘胺酸、青黴胺、L-α-甲基丙胺酸、L-α-甲基天冬醯胺、L-α-甲基-第三丁基甘胺酸、L-甲基乙基甘胺酸、L-α-甲基麩胺酸鹽、L-α-甲基高苯丙胺酸、N-(2-甲基硫乙基)甘胺酸、L-α-甲基離胺酸、L-α-甲基正白胺酸、L-α-甲基鳥胺酸、L-α-甲基脯胺酸、L-α-甲基酥胺酸、L-α-甲基酪胺酸、L-N-甲基-高苯丙胺酸、N-(N-(3,3-二苯基丙基)胺甲醯基甲基甘胺酸、L-焦麩胺酸、D-焦麩胺酸、O-甲基-L-絲胺酸、O-甲基-L-高絲胺酸、5-羥基離胺酸、α-羧基麩胺酸鹽、苯基甘胺酸、L-哌可酸(高脯胺酸)、L-高白胺酸、L-離胺酸(二甲基)、L-2-萘基丙胺酸、L-二甲基多巴或L-二甲氧基-苯丙胺酸、L-3-吡啶基丙胺酸、L-組胺酸(苯甲醯基氧基甲基)、N-環庚基甘胺酸、L-二苯丙胺酸、O-甲基-L-高酪胺酸、L-β-高離胺酸、O-聚醣-酥胺酸、鄰-酪胺酸、L-N,N′-二甲基離胺酸、L-高精胺酸、新色胺酸、3-苯并噻吩基丙胺酸、異喹啉-3-甲酸、二胺基丙酸、高半胱胺酸、3,4-二甲氧基苯丙胺酸、4-氯苯丙胺酸、L-1,2,3,4-四氫去甲哈爾滿-3-甲酸、金剛烷基丙胺酸、對稱二甲基精胺酸、3-羧基硫代嗎啉、D-1,2,3,4-四氫去甲哈爾滿-3-甲酸、3-胺基苯甲酸、3-胺基-1-羧基甲基-吡啶-2-酮、1-胺基-1-環己烷甲酸、2-胺基環戊烷甲酸、1-胺基-1-環丙烷甲酸、2-胺基茚滿-2-甲酸、4-胺基-四氫噻喃-4-甲酸、氮雜環丁烷-2-甲酸、b-(苯并噻唑-2-基)-丙胺酸、新戊基甘胺酸、2-羧基甲基哌啶、b-環丁基丙胺酸、烯丙基甘胺酸、二胺基丙酸、高-環己基丙胺酸、(2S,4R)- 4-羥基哌啶-2-甲酸、八氫吲哚-2-甲酸、(2S,4R)及(2S,4R)-4-(2-萘基)、吡咯啶-2-甲酸、哌啶甲酸、(2S,4R)及(2S,4S)-4-(4-苯基苯甲基)吡咯啶-2-甲酸、(3S)-1-吡咯啶-3-甲酸、(2S,4S)-4-三苯甲基巰基-吡咯啶-2-甲酸、(2S,4S)-4-巰基脯胺酸、第三丁基甘胺酸、N,N-雙(3-胺基丙基)甘胺酸、1-胺基-環己烷-1-甲酸、N-巰基乙基甘胺酸及硒並半胱胺酸。在一些實施例中，胺基酸殘基可為帶電的或極性。帶電胺基酸包括丙胺酸、離胺酸、天冬胺酸或麩胺酸，或其非天然存在之類似物。極性胺基酸包括麩醯胺、天冬醯胺、組胺酸、絲胺酸、酥胺酸、酪胺酸、甲硫胺酸或色胺酸，或其非天然存在之類似物。特定言之，預期在一些實施例中，胺基酸中之末端胺基可為醯胺基或胺基甲酸酯基。
如本文所用，術語「百分比(%)一致性」係指候選序列(例如，Fc-IgG或其片段)中之胺基酸殘基的百分率，該等胺基酸殘基在比對該等序列且必要時引入間隙以實現最大百分比一致性之後與參考序列之胺基酸殘基一致(亦即，可在該等候選及參考序列中之一或兩者中引入間隙以進行最佳比對且出於比較目的可忽略非同源序列)。用於達成測定百分比一致性之目的的比對可以在此項技術之技能內的多種方式實現，例如使用公開可得之電腦軟體，諸如BLAST、ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可確定用於量測比對之適當參數，包括在所比較之序列的全長內實現最大比對所需之任何算法。在一些實施例中，既定候選序列相對、與或針對既定參考序列之百分比胺基酸序列一致性(其或者可表述為具有或包括相對、與或針對既定參考序列之某一百分比胺基酸序列一致性的既定候選序列)計算如下： 100 × (A/B之分數) 其中A係在候選序列與參考序列之比對中經評分為一致之胺基酸殘基的數目，且其中B係參考序列中之胺基酸殘基的總數。在其中候選序列之長度不等於參考序列之長度的一些實施例中，候選序列與參考序列之百分比胺基酸序列一致性將不等於參考序列與候選序列之百分比胺基酸序列一致性。
當如上文所述針對最大對應進行比對時，若兩個聚核苷酸或多肽序列中之核苷酸或胺基酸的序列相同，則該兩個序列被稱為「一致」。兩個序列之間的比較典型地藉由在比較窗中比較該等序列來執行以鑑別且比較具有序列相似性之局部區。如本文所用，「比較窗」係指至少約15個鄰近位置、約20個鄰近位置、約25個鄰近位置或更多(例如，約30個至約75個鄰近位置或約40個至約50個鄰近位置)之區段，其中在序列及相同數目之鄰近位置的參考序列經最佳比對之後，該兩個序列可進行比較。
如本文所用，術語「治療(treating)」或「以治療(to treat)」係指個體之病毒感染(例如病毒感染，諸如流感感染)之治療性治療。在一些實施例中，治療性治療可減慢病毒感染之進展、改良個體之結果及/或消除該感染。在一些實施例中，個體之病毒感染之治療性治療可緩解(alleby way ofte)或改善與該病毒感染相關的一或多種症狀或病狀，削弱病毒程度，穩定化病毒感染之狀態，預防病毒感染之擴散，及/或延遲或減慢病毒感染之進展，如與該治療性治療不存在下該病毒感染之狀態及/或病狀相比。
如本文所用，術語「T之平均值」係指結合於結合物群體內之Fc域或白蛋白的神經胺糖酸酶抑制劑單體或神經胺糖酸酶抑制劑二聚體之平均數。在一些實施例中，在結合物群體內，結合於Fc域單體之神經胺糖酸酶抑制劑單體或神經胺糖酸酶抑制劑二聚體之平均數可為1至20 (例如，T之平均值為1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15或15至20)。在一些實施例中，T之平均值為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。
如本文所用，術語「個體」可為人類、非人類靈長類動物或其他哺乳動物，諸如但不限於犬、貓、馬、牛、豬、火雞、山羊、魚、猴、雞、大鼠、小鼠及綿羊。
如本文所用，術語「治療有效量」係指有效誘導個體之所需效應或治療具有本文所述之病狀或病症(例如病毒感染，諸如流感感染)的個體之量，例如醫藥劑量。本文中亦應瞭解，「治療有效量」可解釋為給出所需治療及/或預防效應之量，以一或多個劑量或以任何劑量或途徑服用，及/或單獨或與其他治療劑(例如，本文素數之抗病毒劑)組合服用。例如，在投與用於治療病毒感染之本文所述之結合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-X)、(D’-I)、(M-I)-(M-X)或(M’-I)中任一者之結合物)的情況下，結合物之治療有效量為例如以下量，如與不投與該結合物時獲得的反應相比，該量足以預防、減慢或逆轉病毒感染之進展。
如本文所用，術語「醫藥組合物」係指含有至少一種活性成分(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-X)、(D’-I)、(M-I)-(M-X)或(M’-I)中任一者之結合物)以及一或多種賦形劑及稀釋劑以使該活性成分能夠適用於投與方法之藥用或醫藥調配物。本發明之醫藥組合物包括可與本文所述之結合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-X)、(D’-I)、(M-I)-(M-X)或(M’-I)中任一者之結合物)相容的醫藥學上可接受之組分。
如本文所用，術語「醫藥學上可接受之載劑」係指醫藥組合物中之賦形劑或稀釋劑。例如，醫藥學上可接受之載劑可為能夠懸浮或溶解活性結合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-X)或(M-I)-(M-VI)中任一者之結合物)的媒劑。醫藥學上可接受之載劑必須可與該調配物之其他成分相容且對接受者無害。在本發明中，醫藥學上可接受之載劑必須向本文所述之結合物提供適當醫藥穩定性。載劑之性質隨投與模式變化。例如，關於經口投與，固體載劑為較佳的；關於靜脈內投與，一般使用水溶液載劑(例如，WFI及/或緩衝溶液)。
如本文所用，術語「醫藥學上可接受之鹽」表示本文所述之結合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-X)、(D’-I)、(M-I)-(M-X)或(M’-I)中任一者之結合物)的鹽，其在合理醫學判斷之範圍內適用於本文所述之方法而無不當毒性、刺激及/或過敏性反應。醫藥學上可接受之鹽為此項技術中熟知的。例如，醫藥學上可接受之鹽描述於：Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use (P.H. Stahl及C.G. Wermuth編), Wiley-VCH, 2008中。該等鹽可在本文所述之結合物的最終分離及純化期間當場製備，或藉由使游離鹼基與合適有機酸反應而單獨製備。
術語「藥物:抗體比率」或「DAR」係指結合於本文所述之抗體、Fc域或白蛋白之小分子藥物部分的平均數(例如，小分子藥物單體或二聚體之平均數)。在本文所述之一些實施例中，DAR係由「T」表示(例如，在式(1)-(5)、(D-I)-(D-X)、(D’-I)、(M-I)-(M-X)或(M’-I)中)。如本文所用，結合於Fc域、抗體或白蛋白之各單體部分(例如，各紮那米韋或帕拉米韋單體)或各二聚體部分(例如，各紮那米韋或帕拉米韋二聚體)對應於DAR值1.0 (例如，「T」值為1.0)。例如，結合於4個紮那米韋單體之Fc域將具有DAR 4.0 (例如，「T」為4.0)。結合於4個紮那米韋二聚體(例如，總計8個紮那米韋分子)之Fc域亦將具有DAR 4.0 (例如，「T」為4.0)。DAR亦可經計算為分子群體(諸如Fc域、抗體或白蛋白之群體)之平均DAR。DAR值可影響藥物之功效、效能、藥物動力學或毒性。
如本文所用，術語「約」指示±5%之偏差(deby way oftion)。例如，約10%係指9.5%至10.5%。
以值之範圍提供之任何值均包括上限及下限，及含於該等上限及下限內之任何值。
如本文所用，術語「(1)-(5)、(D-I)-(D-X)、(D’-I)、(M-I)-(M-X)或(M’-I)」表示式(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(D-I)、(D-II)、(D-II-1)、(D-II-2)、(D-II-3)、(D-II-4)、(D-II-5)、(D-II-6)、(D-II-7)、(D-II-8)、(D-II-9)、(D-II-10)、(D-III)、(D-III-1)、(D-III-2)、(D-III-3)、(D-III-4)、(D-III-5)、(D-III-6)、(D-III-7)、(D-III-8)、(D-III-9)、(D-IV)、(D-IV-1)、(D-IV-2)、(D-V)、(D-V-1)、(D-V-2)、(D-V-3)、(D-V-4)、(D-V-5)、(D-V-6)、(D-V-7)、(D-V-8)、(D-V-9)、(D-V-10)、(D-VI)、(D-VI-1)、(D-VI-2)、(D-VI-3)、(D-VI-4)、(D-VI-5)、(D-VI-6)、(D-VI-7)、(D-VI-8)、(D-VI-9)、(D-VII)、(D-VIII)、(D-VIII-1)、(D-VIII-2)、(D-VIII-3)、(D-VIII-4)、(D-VIII-5)、(D-VIII-6)、(D-VIII-7)、(D-VIII-8)、(D-VIII-9)、(D-VIII-10)、(D-VIII-11)、(D-IX)、(D-IX-1)、(D-IX-2)、(D-IX-3)、(D-IX-4)、(D-IX-5)、(D-IX-6)、(D-X)、(D-X-1)、(D-X-2)、(D-X-3)、(D’-I)、(M-I)、(M-II)、(M-II-1)、(M-II-2)、(M-II-3)、(M-II-4)、(M-II-5)、(M-II-6)、(M-II-7)、(M-II-8)、(M-II-9)、(M-II-10)、(M-III)、(M-III-1)、(M-III-2)、(M-III-3)、(M-III-4)、(M-III-5)、(M-III-6)、(M-III-7)、(M-III-8)、(M-III-9)、(M-IV)、(M-IV-1)、(M-IV-2)、(M-V)、(M-V-1)、(M-V-2)、(M-V-3)、(M-V-4)、(M-V-5)、(M-V-6)、(M-V-7)、(M-V-8)、(M-V-9)、(M-V-10)、(M-VI)、(M-VI-1)、(M-VI-2)、(M-VI-3)、(M-VI-4)、(M-VI-5)、(M-VI-6)、(M-VI-7)、(M-VI-8)、(M-VI-9)、(M-VII)、(M-VIII)、(M-VIII-1)、(M-VIII-2)、(M-VIII-3)、(M-VIII-4)、(M-VIII-5)、(M-VIII-6)、(M-VIII-7)、(M-VIII-8)、(M-VIII-9)、(M-VIII-10)、(M-VIII-11)、(M-IX)、(M-IX-1)、(M-IX-2)、(M-IX-3)、(M-IX-4)、(M-IX-5)、(M-IX-6)、(M-X)、(M-X-1)、(M-X-2)、(M-X-3)或(M’-I)中任一者)。
本文所述之結合物之其他特徵及優勢將由實施方式及申請專利範圍顯而易知。
本發明提供用於治療病毒感染(例如，流感病毒感染)之結合物、組合物及方法。本文所揭示之結合物包括病毒神經胺糖酸酶抑制劑(例如，紮那米韋、帕拉米韋或其類似物)之單體或二聚體，其結合於Fc單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽。該等結合物中之神經胺糖酸酶抑制劑(例如，紮那米韋、帕拉米韋或其類似物)靶向在病毒粒子之表面上的神經胺糖酸酶。該等結合物中之Fc單體或Fc域結合於免疫細胞(例如，嗜中性粒細胞)上之FcγR (例如，FcRn、FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIc、FcγRIIIa及FcγRIIIb)以活化吞噬作用及效應子功能，諸如抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)，因此由免疫細胞吞沒及破壞病毒粒子且進一步增強該等結合物之抗病毒活性。該白蛋白或白蛋白結合肽可例如藉由使白蛋白結合於再循環之新生兒Fc受體而延長該結合物之半衰期。該等組合物適用於抑制病毒生長之方法及治療病毒感染(諸如藉由A型流感病毒、B型流感病毒及C型流感病毒引起之彼等)之方法。I. 病毒感染
本文所述之化合物及醫藥組合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-X)、(D’-I)、(M-I)-(M-X)或(M’-I)中任一者之結合物)可用於治療病毒感染(例如流感病毒感染，諸如流感A、B、C或副流感)。
病毒感染係指病毒(例如，流感病毒)在宿主生物體(例如，人類個體)中之致病性生長。病毒感染可為其中病毒群體之存在正在損害宿主身體之任何情形。因此，當個體之身體中或身體上存在過量病毒群體時，或當病毒群體之存在正在損害該個體之細胞或其他組織時，該個體正在經受病毒感染。
流感(通常稱作「流感(flu)」)係由流感病毒引起之傳染病。症狀可為輕微至嚴重。最常見症狀包括：高燒、流鼻涕、喉嚨痛、肌肉疼痛、頭痛、咳嗽及感覺疲倦。此等症狀典型地在暴露於病毒之後兩天開始且大多數情況下持續不足一週。然而，咳嗽可持續超過兩週。關於兒童，可存在噁心及嘔吐，但其在成人中不常見。流感倂發症可包括病毒性肺炎、繼發性細菌性肺炎、鼻竇感染及諸如哮喘或心臟衰竭之先前健康問題惡化。嚴重倂發症可出現於具有經削弱免疫系統之個體中，諸如年輕人、老年人、具有削弱免疫系統之疾病的彼等個體及經歷導致免疫系統削弱之療法治療的彼等個體。
三種類型之流感病毒影響人類個體，即A型、B型及C型。通常，該病毒藉由咳嗽或噴嚏在空氣中擴散。咸信此主要在相對較短距離內出現。其亦可藉由接觸由該病毒污染之表面且接著接觸嘴或眼睛來擴散。人在其顯示症狀之前及期間可傳染其他人。感染可藉由針對該病毒測試喉嚨、唾液或鼻子經確認。可獲得多種快速測試；然而，即使結果為陰性，人們仍可具有感染。偵測病毒之RNA的一種類型之聚合酶鏈反應可用於診斷流感感染。II. 本發明結合物
本文提供適用於治療病毒感染(例如，流感感染)之合成結合物。本文所揭示之結合物包括結合於一或多種神經胺糖酸酶抑制劑單體或兩種神經胺糖酸酶抑制劑(例如，選自紮那米韋、磺基紮那米韋、帕拉米韋、A-315675或其類似物)之一或多種二聚體的Fc域或白蛋白。兩種神經胺糖酸酶抑制劑之二聚體包括一種神經胺糖酸酶抑制劑(例如，式(A-I)、(A-II)、(A-III)、(A-IV)、(A-V)、(A-VI)、(A-VII)、(A-VIII)、(A-IX)、(A-X)、(A-XI)或(A-XII)之第一神經胺糖酸酶抑制劑)及第二神經胺糖酸酶抑制劑(例如，式(A-I)、(A-II)、(A-III)、(A-IV)、(A-V)、(A-VI)、(A-VII)、(A-VIII)、(A-IX)、(A-X)、(A-XI)或(A-XII)之第二神經胺糖酸酶抑制劑)。該等第一及第二神經胺糖酸酶抑制劑藉助於連接體彼此連接。
不受理論束縛，在一些態樣中，本文所述之結合物經由該等結合物中之神經胺糖酸酶抑制劑部分與病毒粒子之表面上的蛋白質之間之相互作用結合於該病毒粒子之表面(例如，在流感病毒粒子之表面上結合於病毒神經胺糖酸酶)。神經胺糖酸酶抑制劑破壞神經胺糖酸酶，神經胺糖酸酶為包膜醣蛋白，其在受感染宿主細胞之表面上裂解來自聚醣結構之唾液酸(亦即，末端神經胺糖酸殘基)，從而釋放後代病毒且允許該病毒自該宿主細胞擴散至未受感染周圍細胞。
本發明結合物包括結合於Fc域、Fc單體或Fc結合肽之神經胺糖酸酶抑制劑單體及二聚體。本文所述之結合物中的Fc域結合於免疫細胞上之FcγR (例如，FcRn、FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIc、FcγRIIIa及FcγRIIIb)。本文所述之結合物中的Fc域結合於免疫細胞上之FcγR會活化吞噬作用及效應子功能，諸如抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)，因此由免疫細胞吞沒及破壞病毒粒子且進一步增強該等結合物之抗病毒活性。
本發明結合物包括結合於白蛋白或白蛋白結合肽之神經胺糖酸酶抑制劑單體及二聚體。該白蛋白或白蛋白結合肽可例如藉由使白蛋白結合於再循環之新生兒Fc受體而延長該結合物之半衰期。
本文所提供之結合物係由式(1)-(5)、(D-I)-(D-X)、(D’-I)、(M-I)-(M-X)或(M’-I)中任一者描述。在一些實施例中，本文所述之結合物包括結合於Fc域或白蛋白之神經胺糖酸酶抑制劑的一或多種單體。在一些實施例中，本文所述之結合物包括結合於Fc域或白蛋白之神經胺糖酸酶抑制劑的一或多種二聚體。在一些實施例中，當n為2時，E (Fc域單體)二聚以形成Fc域。
本文所述之結合物可使用此項技術中可獲得之化學合成技術來合成。在無法獲得用於結合之官能基的情況下，分子可使用此項技術中熟知之習知化學合成技術衍生化。在一些實施例中，本文所述之結合物含有一或多個對掌性中心。該等結合物包括經分離立體異構體形式中任一者，以及具有變化之對掌性純度程度之立體異構體的混合物，包括外消旋混合物。其亦涵蓋可形成之多種非對映異構體、對映異構體及互變異構體。神經胺糖酸酶抑制劑
本文所述之結合物之組分為流感病毒神經胺糖酸酶抑制劑部分。流感病毒神經胺糖酸酶抑制劑破壞神經胺糖酸酶，神經胺糖酸酶為包膜醣蛋白，其在受感染宿主細胞之表面上裂解來自聚醣結構之唾液酸(亦即，末端神經胺糖酸殘基)，從而釋放後代病毒且允許該病毒自該宿主細胞擴散至未受感染周圍細胞。流感病毒神經胺糖酸酶抑制劑之實例包括紮那米韋(Relenza)、磺基紮那米韋、A-315675及帕拉米韋。另外，紮那米韋、磺基紮那米韋、A-315675及帕拉米韋之衍生物(諸如文獻中發現之彼等)具有神經胺糖酸酶抑制劑活性且適用作本文中該等化合物之神經胺糖酸酶抑制劑部分(參見例如Hadházi等人 A sulfozanamivir analogue has potent anti-influenza virus activity.ChemMedChem Comm. 13:785-789 (2018)及In vitro characterization of A-315675, a highly potent inhibitor of A and B strain of influenze virus neuraminidases and influenza virus replication.Antimicrobial Agents and Chemotherapy 46(4):1014-1021 (2002))。
本文所述之結合物分成兩種類型：(1)結合於Fc域或白蛋白之神經胺糖酸酶抑制劑的一或多種二聚體，及(2)結合於Fc域或白蛋白之神經胺糖酸酶抑制劑的一或多種單體。神經胺糖酸酶抑制劑之二聚體藉助於連接體(諸如本文所述之連接體)彼此連接。
本發明之病毒神經胺糖酸酶抑制劑包括紮那米韋、磺基紮那米韋、A-315675、帕拉米韋及其類似物，諸如式(A-I)-(A-XII)之病毒神經胺糖酸酶抑制劑：
Figure 02_image005
、
Figure 02_image007
、
Figure 02_image009
、
Figure 02_image011
、
Figure 02_image013
、 (A-I)             (A-II)                      (A-III)                        (A-IV)                 (A-V)
Figure 02_image015
、
Figure 02_image017
、
Figure 02_image019
、
Figure 02_image021
、 (A-VI)         (A-VII)                          (A-VIII)              (A-IX)
Figure 02_image023
、
Figure 02_image025
、
Figure 02_image027
； (A-X)                 (A-XI)                      (A-XII) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ；R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br；R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H；R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ；X係選自-O-及-S-；Y係選自
Figure 02_image1189
Figure 02_image1191
R6 係選自
Figure 02_image031
、
Figure 02_image033
、
Figure 02_image035
、
Figure 02_image037
、
Figure 02_image039
、
Figure 02_image041
、
Figure 02_image043
、
Figure 02_image045
、
Figure 02_image047
、
Figure 02_image049
、
Figure 02_image051
、
Figure 02_image053
、
Figure 02_image055
、
Figure 02_image057
、
Figure 02_image059
、
Figure 02_image061
、
Figure 02_image063
、
Figure 02_image065
、
Figure 02_image067
、
Figure 02_image069
、
Figure 02_image071
、
Figure 02_image073
、
Figure 02_image075
、
Figure 02_image077
、
Figure 02_image079
、
Figure 02_image081
、
Figure 02_image083
、
Figure 02_image085
、
Figure 02_image087
、
Figure 02_image089
、
Figure 02_image091
及
Figure 02_image093
； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基；且R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基。最佳地，式(A-I)、(A-II)、(A-III)、(A-IV)、(A-V)、(A-VI)、(A-VII)、(A-VIII)、(A-IX)、(A-X)、(A-XI)或(A-XII)之病毒神經胺糖酸酶抑制劑經由Y附接於該結合物。
較佳地，該病毒神經胺糖酸酶抑制劑係選自紮那米韋、磺基紮那米韋、帕拉米韋或A-315675：
Figure 02_image1199
、
Figure 02_image1154
、
Figure 02_image1201
、
Figure 02_image1203
。 紮那米韋                  磺基紮那米韋、       帕拉米韋                  A-315675連接於 Fc 域或白蛋白之神經胺糖酸酶抑制劑之二聚體的結合物
本文所述之結合物包括共價連接於神經胺糖酸酶抑制劑之一或多種二聚體的Fc域及Fc單體、Fc結合肽及白蛋白或白蛋白結合肽。兩種神經胺糖酸酶抑制劑之二聚體包括第一神經胺糖酸酶抑制劑(例如，式(A-I)-(A-XII)之第一病毒神經胺糖酸酶抑制劑)及第二神經胺糖酸酶抑制劑(例如，式(A-I)-(A-XII)之第二病毒神經胺糖酸酶抑制劑)。該等第一及第二神經胺糖酸酶抑制劑藉助於連接體(諸如本文所述之連接體)彼此連接。在神經胺糖酸酶抑制劑之二聚體的一些實施例中，該等第一及第二神經胺糖酸酶抑制劑為相同的。在一些實施例中，該等第一及第二神經胺糖酸酶抑制劑為不同的。
神經胺糖酸酶抑制劑之二聚體包括紮那米韋或其類似物(例如，(A-I)、(A-II)、(A-VI)、(A-VII)、(A-VIII)或(A-IX))之均二聚體。例如，本發明之神經胺糖酸酶抑制劑二聚體包括具有結構A1 -L-A2 之二聚體，其中各A1 及各A2 係選自(A-I)、(A-II)、(A-VI)、(A-VII)、(A-VIII)及(A-IX)。
神經胺糖酸酶抑制劑之二聚體包括帕拉米韋或其類似物(例如，(A-III)、(A-IV)或(A-V))之均二聚體。例如，本發明之神經胺糖酸酶抑制劑二聚體包括具有結構A1 -L-A2 之二聚體，其中各A1 及各A2 係選自(A-III)、(A-IV)及(A-V)。
神經胺糖酸酶抑制劑之二聚體包括包含紮那米韋或其類似物及帕拉米韋或其類似物之雜二聚體(例如，(A-I)-(A-IX))。例如，本發明之神經胺糖酸酶抑制劑二聚體包括具有結構A1 -L-A2 之二聚體，其中各A1 係選自(A-I)、(A-II)、(A-VI)、(A-VII)、(A-VIII)及(A-IX)，且各A2 係選自(A-III)、(A-IV)及(A-V)。
在一些實施例中，當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各A1 -L-A2 可獨立地經選擇(例如，獨立地選自本文所述之A1 -L-A2 結構中任一者)。在一些實施例中，E可結合於2、3、4、5、6、7、8、9、10個或10個以上不同A1 -L-A2 部分。在一些實施例中，E結合於第一A1 -L-A2 部分及第二A1 -L-A2 部分。在一些實施例中，第一A1 -L-A2 部分之A1 及A2 係獨立地選自式(A-III)-(A-V)中任一者：
Figure 02_image009
、
Figure 02_image011
、
Figure 02_image013
； (A-III)                     (A-IV)                            (A-V) 且第二A1 -L-A2 部分之A1 及A2 係獨立地選自式(A-I)、(A-II)、(A-VI)、(A-VII)、(A-VIII)或(A-IX)中任一者：
Figure 02_image005
、
Figure 02_image007
、
Figure 02_image015
、
Figure 02_image017
、
Figure 02_image019
、 (A-I)             (A-II)                        (A-VI)                  (A-VII)                   (A-VIII)
Figure 02_image021
。 (A-IX)
在一些實施例中，第一A1 -L-A2 部分特異性地結合於E之離胺酸殘基(例如，E之表面暴露離胺酸殘基的氮原子)，且第二A1 -L-A2 部分特異性地結合於E之半胱胺酸殘基(例如，E之表面暴露半胱胺酸殘基的硫原子)。在一些實施例中，第一A1 -L-A2 部分特異性地結合於E之半胱胺酸殘基(例如，E之表面暴露半胱胺酸殘基的硫原子)，且第二A1 -L-A2 部分特異性地結合於E之離胺酸殘基(例如，E之表面暴露離胺酸殘基的氮原子)。
在一些實施例中，本發明提供由以下各式描述之結合物或其醫藥學上可接受之鹽;
Figure 02_image002
； (1)
Figure 02_image150
； (3)
Figure 02_image366
； (D-I)
Figure 02_image401
； (D-II)
Figure 02_image403
； (D-II-1)
Figure 02_image405
； (D-II-2)
Figure 02_image407
； (D-II-3)
Figure 02_image415
； (D-II-4)
Figure 02_image417
； (D-II-5)
Figure 02_image433
； (D-II-6)
Figure 02_image435
； (D-II-7)
Figure 02_image437
； (D-II-8)
Figure 02_image1212
； (D-II-9)
Figure 02_image461
； (D-II-10)
Figure 02_image467
； (D-III)
Figure 02_image469
； (D-III-1)
Figure 02_image471
； (D-III-2)
Figure 02_image473
； (D-III-3)
Figure 02_image475
； (D-III-4)
Figure 02_image477
； (D-III-5)
Figure 02_image479
； (D-III-6)
Figure 02_image481
； (D-III-7)
Figure 02_image483
； (D-III-8)
Figure 02_image485
； (D-III-9)
Figure 02_image487
； (D-IV)
Figure 02_image489
； (D-IV-1)
Figure 02_image491
； (D-IV-2)
Figure 02_image493
； (D-V)
Figure 02_image495
； (D-V-1)
Figure 02_image497
； (D-V-2)
Figure 02_image499
； (D-V-3)
Figure 02_image501
； (D-V-4)
Figure 02_image503
； (D-V-5)
Figure 02_image505
； (D-V-6)
Figure 02_image507
； (D-V-7)
Figure 02_image509
； (D-V-8)
Figure 02_image511
； (D-V-9)
Figure 02_image513
； (D-V-10)
Figure 02_image515
； (D-VI)
Figure 02_image517
； (D-VI-1)
Figure 02_image519
； (D-VI-2)
Figure 02_image521
； (D-VI-3)
Figure 02_image523
； (D-VI-4)
Figure 02_image525
； (D-VI-5)
Figure 02_image527
； (D-VI-6)
Figure 02_image529
； (D-VI-7)
Figure 02_image531
； (D-VI-8)
Figure 02_image533
； (D-VI-9)
Figure 02_image535
； (D-VII)
Figure 02_image537
； (D-VIII)
Figure 02_image539
； (D-VIII-1)
Figure 02_image541
； (D-VIII-2)
Figure 02_image543
； (D-VIII-3)
Figure 02_image551
； (D-VIII-4)
Figure 02_image553
； (D-VIII-5)
Figure 02_image563
； (D-VIII-6)
Figure 02_image565
； (D-VIII-7)
Figure 02_image567
； (D-VIII-8)
Figure 02_image569
； (D-VIII-9)
Figure 02_image571
； (D-VIII-10)
Figure 02_image573
； (D-VIII-11)
Figure 02_image575
； (D-IX)
Figure 02_image577
； (D-IX-1)
Figure 02_image579
； (D-IX-2)
Figure 02_image581
； (D-IX-3)
Figure 02_image583
； (D-IX-4)
Figure 02_image585
； (D-IX-5)
Figure 02_image587
； (D-IX-6)
Figure 02_image1263
； (D-X)
Figure 02_image1265
； (D-X-1)
Figure 02_image1267
； (D-X-2)
Figure 02_image1269
；或 (D-X-3)
Figure 02_image1113
； (D’-I) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在本文所述之結合物中，連接至E之波浪線指示神經胺糖酸酶抑制劑之一或多種(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20種)二聚體可附接於Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽。在一些實施例中，當n為1時，神經胺糖酸酶抑制劑之一或多種(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10種)二聚體可附接於Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽。在一些實施例中，當n為2時，神經胺糖酸酶抑制劑之一或多種(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20種)二聚體可附接於Fc域。本文所述之結合物中的波浪線不應解釋為神經胺糖酸酶抑制劑之一或多種二聚體與Fc域或白蛋白中之原子之間的單鍵。在一些實施例中，當T為1時，神經胺糖酸酶抑制劑之一種二聚體可附接於Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽中之原子。在一些實施例中，當T為2時，神經胺糖酸酶抑制劑之兩種二聚體可附接於Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽中之原子。
如本文進一步描述，本文所述之結合物中的連接體(例如，L或L')可為分支鏈結構。如本文進一步描述，本文所述之結合物中的連接體(例如，L或L')可為多價結構，例如分別具有兩個或三個臂之二價或三價結構。在一些實施例中，當該連接體具有三個臂時，該等臂中之兩者可附接於第一及第二神經胺糖酸酶抑制劑且第三個臂可附接於Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽。
在如由以上各式表示之具有共價連接於神經胺糖酸酶抑制劑之一或多種二聚體之Fc域的結合物中，當n為2時，兩種Fc域單體(各Fc域單體由E表示)二聚以形成Fc域。連接於 Fc 域或白蛋白之神經胺糖酸酶抑制劑之單體的結合物
在一些實施例中，本文所述之結合物包括共價連接於神經胺糖酸酶抑制劑之一或多種單體的Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽。Fc域單體或白蛋白及神經胺糖酸酶抑制劑之一或多種單體的結合物可藉由經由連接體(諸如本文所述之任何連接體)使該Fc域或白蛋白連接於神經胺糖酸酶抑制劑之各單體來形成。
在本文所述之具有共價連接於神經胺糖酸酶抑制劑之一或多種單體之Fc域或白蛋白的結合物中，連接至E之波浪線指示神經胺糖酸酶抑制劑之一或多種(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20種)單體可附接於Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽。在一些實施例中，當n為1時，神經胺糖酸酶抑制劑之一或多種(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10種)單體可附接於Fc域單體或白蛋白。在一些實施例中，當n為2時，神經胺糖酸酶抑制劑之一或多種(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20種)單體可附接於Fc域。本文所述之結合物中的波浪線不應解釋為神經胺糖酸酶抑制劑之一或多種單體與Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽中之原子之間的單鍵。在一些實施例中，當T為1時，神經胺糖酸酶抑制劑之一種單體可附接於Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽中之原子。在一些實施例中，當T為2時，神經胺糖酸酶抑制劑之兩種單體可附接於Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽中之原子。
在一些實施例中，當T大於1 (例如，T為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)時，各A1 -L可獨立地經選擇(例如，獨立地選自本文所述之A1 -L結構中任一者)。在一些實施例中，E可結合於2、3、4、5、6、7、8、9、10個或10個以上不同A1 -L部分。在一些實施例中，E結合於第一A1 -L部分及第二A1 -L部分。在一些實施例中，第一A1 -L部分之A1 係選自式(A-III)-(A-V)中任一者：
Figure 02_image009
、
Figure 02_image011
、
Figure 02_image013
； (A-III)                     (A-IV)                            (A-V) 且第二A1 -L部分之A1 係選自式(A-I)、(A-II)、(A-VI)、(A-VII)、(A-VIII)或(A-IX)中任一者：
Figure 02_image005
、
Figure 02_image007
、
Figure 02_image015
、
Figure 02_image017
、
Figure 02_image019
、 (A-I)             (A-II)                        (A-VI)                  (A-VII)                   (A-VIII)
Figure 02_image021
。 (A-IX)
在一些實施例中，第一A1 -L部分特異性地結合於E之離胺酸殘基(例如，E之表面暴露離胺酸殘基的氮原子)，且第二A1 -L部分特異性地結合於E之半胱胺酸殘基(例如，E之表面暴露半胱胺酸殘基的硫原子)。在一些實施例中，第一A1 -L部分特異性地結合於E之半胱胺酸殘基(例如，E之表面暴露半胱胺酸殘基的硫原子)，且第二A1 -L部分特異性地結合於E之離胺酸殘基(例如，E之表面暴露離胺酸殘基的氮原子)。
如本文進一步描述，本文所述之具有共價連接於神經胺糖酸酶抑制劑之一或多種單體的Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽之結合物中的連接體(例如，L或L')可為具有兩個臂之二價結構。二價連接體中之一個臂可附接於神經胺糖酸酶抑制劑之單體且另一臂可附接於Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽。
在一些實施例中，本文所提供之含有共價連接於神經胺糖酸酶抑制劑之一或多種單體的Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽之結合物係由以下各式中任一者描述：
Figure 02_image1271
； (2)
Figure 02_image1273
； (4)
Figure 02_image230
(5)
Figure 02_image897
； (M-I)
Figure 02_image915
； (M-II)
Figure 02_image917
； (M-II-1)
Figure 02_image919
； (M-II-2)
Figure 02_image921
； (M-II-3)
Figure 02_image923
； (M-II-4)
Figure 02_image925
； (M-II-5)
Figure 02_image929
； (M-II-6)
Figure 02_image931
； (M-II-7)
Figure 02_image933
； (M-II-8)
Figure 02_image937
； (M-II-9)
Figure 02_image939
； (M-II-10)
Figure 02_image943
； (M-III)
Figure 02_image945
； (M-III-1)
Figure 02_image947
； (M-III-2)
Figure 02_image949
； (M-III-3)
Figure 02_image951
； (M-III-4)
Figure 02_image953
； (M-III-5)
Figure 02_image955
； (M-III-6)
Figure 02_image957
； (M-III-7)
Figure 02_image959
； (M-III-8)
Figure 02_image961
； (M-III-9)
Figure 02_image963
； (M-IV)
Figure 02_image965
； (M-IV-1)
Figure 02_image967
； (M-IV-2)
Figure 02_image969
； (M-V)
Figure 02_image971
； (M-V-1)
Figure 02_image973
； (M-V-2)
Figure 02_image975
； (M-V-3)
Figure 02_image977
； (M-V-4)
Figure 02_image979
； (M-V-5)
Figure 02_image981
； (M-V-6)
Figure 02_image983
； (M-V-7)
Figure 02_image985
； (M-V-8)
Figure 02_image987
； (M-V-9)
Figure 02_image989
； (M-V-10)
Figure 02_image991
； (M-VI)
Figure 02_image993
； (M-VI-1)
Figure 02_image995
； (M-VI-2)
Figure 02_image997
； (M-VI-3)
Figure 02_image999
； (M-VI-4)
Figure 02_image1001
； (M-VI-5)
Figure 02_image1003
； (M-VI-6)
Figure 02_image1005
； (M-VI-7)
Figure 02_image1007
； (M-VI-8)
Figure 02_image1009
； (M-VI-9)
Figure 02_image1011
； (M-VII)
Figure 02_image1013
； (M-VIII)
Figure 02_image1015
； (M-VIII-1)
Figure 02_image1017
； (M-VIII-2)
Figure 02_image1019
； (M-VIII-3)
Figure 02_image1021
； (M-VIII-4)
Figure 02_image1023
； (M-VIII-5)
Figure 02_image1027
； (M-VIII-6)
Figure 02_image1029
； (M-VIII-7)
Figure 02_image1031
； (M-VIII-8)
Figure 02_image1033
； (M-VIII-9)
Figure 02_image1035
； (M-VIII-10)
Figure 02_image1037
； (M-VIII-11)
Figure 02_image1039
； (M-IX)
Figure 02_image1041
； (M-IX-1)
Figure 02_image1043
； (M-IX-2)
Figure 02_image1045
； (M-IX-3)
Figure 02_image1047
； (M-IX-4)
Figure 02_image1049
； (M-IX-5)
Figure 02_image1051
； (M-IX-6)
Figure 02_image1329
； (M-X)
Figure 02_image1330
； (M-X-1)
Figure 02_image1332
； (M-X-2)
Figure 02_image1334
；或 (M-X-3)
Figure 02_image1125
； (M’-I) 或其醫藥學上可接受之鹽。
在如由以上各式表示之具有共價連接於神經胺糖酸酶抑制劑之一或多種單體之Fc域的結合物中，當n為2時，兩種Fc域單體(各Fc域單體由E表示)二聚以形成Fc域。包括紮那米韋或其類似物之結合物之區域異構體
結合物(例如，如本文中詳細描述之單體或二聚體結合物)可以混合物或區域異構體形式產生。出於諸如容易合成、熱穩定性、氧化穩定性、藥物動力學(例如，代謝穩定性或生物可用性)、效應子結合或治療功效之原因，特定區域異構體或區域異構體之混合物可為較佳的。
在一些實施例中，本發明結合物包括紮那米韋或其類似物(例如，(A-I)、(A-II)、(A-VI)、(A-VII)、(A-VIII)、(A-IX)或(A-X)中任一者)。紮那米韋或其類似物可經由例如C7位置(參見例如(A-I)、(A-II)或(A-X))或經由C9位置(參見例如(A-VI)或(A-VII))結合於Fc域或白蛋白(例如，藉助於連接體)：
Figure 02_image005
(A-I)，C7結合，
Figure 02_image007
(A-II)，C7結合，
Figure 02_image023
(A-X)，C7結合，
Figure 02_image015
(A-VI)，C9結合，
Figure 02_image017
(A-VII)，C9結合。
本發明包括單體結合物群體(例如，式(M-I)結合物群體)，其中該結合物群體包括本文所述之單體結合物中任一者及一或多種其相應區域異構體。例如，結合物群體可包括(1)在C7位置結合(例如，藉助於連接體)於Fc域或白蛋白之紮那米韋或其類似物，及(2)在C9位置結合(例如，藉助於連接體)於Fc域或白蛋白之紮那米韋或其類似物。
單體結合物群體可具有規定之C7連接結合物:C9連接結合物比率。例如，結合物群體可具有實質上100% C-7連接結合物及實質上0% C-9連接結合物。結合物群體可具有約95% C-7連接結合物及約5% C-9連接結合物。結合物群體可具有約90% C-7連接結合物及約10% C-9連接結合物。結合物群體可具有約85% C-7連接結合物及約15% C-9連接結合物。結合物群體可具有約80% C-7連接結合物及約20% C-9連接結合物。結合物群體可具有約75% C-7連接結合物及約25% C-9連接結合物。結合物群體可具有約70% C-7連接結合物及約30% C-9連接結合物。結合物群體可具有約65% C-7連接結合物及約35% C-9連接結合物。結合物群體可具有約60% C-7連接結合物及約40% C-9連接結合物。結合物群體可具有約55% C-7連接結合物及約45% C-9連接結合物。結合物群體可具有約50% C-7連接結合物及約50% C-9連接結合物。結合物群體可具有約45% C-7連接結合物及約55% C-9連接結合物。結合物群體可具有約40% C-7連接結合物及約60% C-9連接結合物。結合物群體可具有約35% C-7連接結合物及約65% C-9連接結合物。結合物群體可具有約30% C-7連接結合物及約70% C-9連接結合物。結合物群體可具有約25% C-7連接結合物及約75% C-9連接結合物。結合物群體可具有約20% C-7連接結合物及約80% C-9連接結合物。結合物群體可具有約15% C-7連接結合物及約85% C-9連接結合物。結合物群體可具有約10% C-7連接結合物及約90% C-9連接結合物。結合物群體可具有實質上0% C-7連接結合物及實質上100% C-9連接結合物。
結合物群體可具有大於99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%、80%、75%、70%、60%、65%、60%、55%或50% C7連接結合物。
結合物群體可具有少於50%、40%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%或1% C9連接結合物。
本發明亦包括二聚體結合物群體(例如，式(D-I)結合物群體)，其中該結合物群體包括本文所述之二聚體結合物中任一者及一或多種其相應區域異構體。例如，結合物群體可包括(1) C7-C7二聚體(例如，該二聚體之紮那米韋或其類似物部分在其各別C7位置結合(例如，藉助於連接體)於Fc域或白蛋白)，(2) C9-C9二聚體(例如，該二聚體之紮那米韋或其類似物部分在其各別C9位置結合(例如，藉助於連接體)於Fc域或白蛋白)，及/或(3) C7-C7二聚體(例如，一個紮那米韋或其類似物部分經由其C7位置結合(例如，藉助於連接體)於Fc域或白蛋白且另一紮那米韋或其類似物部分經由其C9位置結合(例如，藉助於連接體)於Fc域或白蛋白)。
二聚體結合物群體可具有規定之C7-C7連接結合物:C7-C9連接結合物:C9-C9連接結合物比率。例如，結合物群體可具有實質上100% C7-C7連接結合物及實質上0% C7-C9或C9-C9連接結合物。結合物群體可具有實質上100% C9-C9連接結合物及實質上0% C7-C7或C7-C9連接結合物。結合物群體可具有實質上100% C7-C9連接結合物及實質上0% C7-C7或C9-C9連接結合物。
結合物群體可具有大於99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%、80%、75%、70%、60%、65%、60%、55%或50% C7-C7連接結合物。
結合物群體可具有少於50%、40%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%或1% C9-C9連接結合物。
結合物群體可具有少於50%、40%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%或1% C7-C9連接結合物。
關於上述區域異構體群體中任一者，A1 及/或A2 (例如，(M-I)或(D-I)中)可選自紮那米韋或本文所述之紮那米韋類似物中任一者(例如，(A-I)、(A-II)、(A-VI)、(A-VII)、(A-VIII)、(A-IX)或(A-X)中任一者)。詳言之，C7連接紮那米韋或其類似物係由(A-I)、(A-II)及(A-X)描述，且C9連接紮那米韋或其類似物係由(A-VI)或(A-VII)描述。用於製備區域異構體(例如，C7、C9、C7-C7、C7-C9及C9-C9連接區域異構體)之例示性方法描述於實例100-103、123及124中。在一些情況下，具有95%或更多、96%或更多、97%或更多、98%或更多、99%或更多或實質上100% C7連接單體結合物或C7-C7連接二聚體結合物可為較佳的。在此等情況下，用實質上形成C7連接單體或C7-C7連接二聚體中間物之方法(諸如描述於例如實例103及123中之方法)製備該中間物可為較佳的。實例103之方法係主要用於獲得C7或C7-C7連接中間物且可用於製備本文所述之任何中間物之例示性方法。
在較佳實施例中，該結合物為式(D-I)-(D-X)、(D’-I)、(M-I)-(M-X)或(M’-I)中任一者之結合物，其中A1 及/或A2 係由式(A-I)、(A-II)或(A-X)描述且Y為
Figure 02_image1337
，其中R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基。在較佳實施例中，A1 及/或A2 係由式(A-I)描述(例如，紮那米韋)。在較佳實施例中，R7 為C1-C20烷基(例如，-CH3 、-CH2 CH3 、-CH2 CH2 CH3 )。該等結合物已顯示出展現增加之C7連接穩定性，導致較少C7至C9遷移。因此，預期所得產物更加均質且展現增加之功效。III. Fc 域單體及 Fc 域
Fc域單體包括鉸鏈域、CH 2抗體恆定域及CH 3抗體恆定域。該Fc域單體可具有免疫球蛋白抗體同型IgG、IgE、IgM、IgA或IgD。該Fc域單體亦可具有任何免疫球蛋白抗體同型(例如，IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgG4)。該Fc域單體可具有任何免疫球蛋白抗體同種異型(例如，IGHG1*01 (亦即，G1m(za))、IGHG1*07 (亦即，G1m(zax))、IGHG1*04 (亦即，G1m(zav))、IGHG1*03 (G1m(f))、IGHG1*08 (亦即，G1m(fa))、IGHG2*01、IGHG2*06、IGHG2*02、IGHG3*01、IGHG3*05、IGHG3*10、IGHG3*04、IGHG3*09、IGHG3*11、IGHG3*12、IGHG3*06、IGHG3*07、IGHG3*08、IGHG3*13、IGHG3*03、IGHG3*14、IGHG3*15、IGHG3*16、IGHG3*17、IGHG3*18、IGHG3*19、IGHG2*04、IGHG4*01、IGHG4*03或IGHG4*02) (如描述於例如Vidarsson等人 IgG subclasses and allotypes: from structure to effector function.Frontiers in Immunology . 5(520):1-17 (2014)中)。該Fc域單體亦可屬任何物種，例如人類、鼠科動物或小鼠。Fc域單體之二聚體係可結合於Fc受體之Fc域，該Fc受體係位於白細胞表面上之受體。
在一些實施例中，本文所述之結合物中的Fc域單體可相對於具有SEQ ID NO: 1-68中任一者之序列的Fc域單體含有一或多種胺基酸取代、添加及/或缺失。在一些實施例中，如本文所述之結合物中的Fc域單體中之Asn可由Ala置換以便預防N連接之糖基化(參見例如SEQ ID NO: 12-15，其中Asn至Ala取代用*標記)。在一些實施例中，本文所述之結合物中的Fc域單體亦可含有額外Cys添加(參見例如SEQ ID NO: 9、10及11，其中Cys添加用*標記)。
在一些實施例中，如本文所述之結合物中的Fc域單體包括額外部分，例如附接於該Fc域單體之N或C端之白蛋白結合肽、純化肽(例如，六組胺酸肽(HHHHHH (SEQ ID NO: 72))或信號序列(例如，IL2信號序列MYRMQLLSCIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 73))。在一些實施例中，該結合物中之Fc域單體不含任何類型之抗體可變區，例如VH 、VL 、互補決定區(CDR)或高變區(HVR)。
在一些實施例中，如本文所述之結合物中的Fc域單體可具有與下文所示之SEQ ID NO: 1-68中任一者之序列至少95%一致(例如，97%、99%或99.5%一致)的序列。在一些實施例中，如本文所述之結合物中的Fc域單體可具有下文所示之SEQ ID NO: 1-68中任一者之序列。 SEQ ID NO: 1：N端(粗體)具有IL2信號序列之鼠科動物Fc-IgG2aMYRMQLLSCIALSLALVTNS PRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK SEQ ID NO: 2：成熟鼠科動物Fc-IgG2a PRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK SEQ ID NO: 3：N端(粗體)具有IL2信號序列且添加有N端MVRS胺基酸殘基(加下劃線)之人類Fc-IgG1MYRMQLLSCIALSLALVTNS MVRS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 4：添加有N端MVRS胺基酸殘基(加下劃線)之成熟人類Fc-IgG1MVRS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 5：N端具有IL2信號序列(粗體)且C端具有六組胺酸肽(斜體)之鼠科動物Fc-IgG2aMYRMQLLSCIALSLALVTNS PRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGKHHHHHH SEQ ID NO: 6：C端具有六組胺酸肽(斜體)之成熟鼠科動物Fc-IgG2a PRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGKHHHHHH SEQ ID NO: 7：N端具有IL2信號序列(粗體)、添加有N端MVRS胺基酸殘基(加下劃線)且C端具有六組胺酸肽(斜體)之人類Fc-IgG1MYRMQLLSCIALSLALVTNS MVRS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKHHHHHH SEQ ID NO: 8：C端具有六組胺酸肽(斜體)且添加有N端MVRS胺基酸殘基(加下劃線)之成熟人類Fc-IgG1MVRS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKHHHHHH SEQ ID NO: 9：N端具有IL2信號序列(粗體)、添加有N端MVRS胺基酸殘基(加下劃線)、鉸鏈區中具有兩個額外半胱胺酸(*)且C端具有六組胺酸肽(斜體)之人類Fc-IgG1MYRMQLLSCIALSLALVTNS MVRS DKTHTCPPCPPC*KC*PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKHHHHHH SEQ ID NO: 10：添加有N端MVRS胺基酸殘基(加下劃線)、鉸鏈區中具有兩個額外半胱胺酸(*)且C端具有六組胺酸肽(斜體)之成熟人類Fc-IgG1MVRS DKTHTCPPCPPC*KC*PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKHHHHHH SEQ ID NO: 11：添加有N端MVRS胺基酸殘基(加下劃線)且鉸鏈區中具有兩個額外半胱胺酸(*)之成熟人類Fc-IgG1MVRS DKTHTCPPCPPC*KC*PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 12：N端具有IL2信號序列(粗體)、具有Asn至Ala取代(*)且C端具有六組胺酸肽(斜體)之鼠科動物Fc-IgG2aMYRMQLLSCIALSLALVTNS PRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYA* STLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGKHHHHHH SEQ ID NO: 13：具有Asn至Ala取代(*)且C端具有六組胺酸肽(斜體)之成熟鼠科動物Fc-IgG2a PRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYA*STLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGKHHHHHH SEQ ID NO: 14：N端具有IL2信號序列(粗體)、添加有N端MVRS胺基酸殘基(加下劃線)、具有Asn至Ala取代(*)且C端具有六組胺酸肽(斜體)之人類Fc-IgG1MYRMQLLSCIALSLALVTNS MVRS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYA*STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKHHHHHH SEQ ID NO: 15：具有Asn至Ala取代(*)、添加有N端MVRS胺基酸殘基(加下劃線)且C端具有六組胺酸肽(斜體)之成熟人類Fc-IgG1MVRS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYA*STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKHHHHHH SEQ ID NO: 16：N端具有人類血清白蛋白信號序列(粗體)且添加有N端ISAMVRS胺基酸殘基(加下劃線)之人類IgG1 FcMKWVTFISLLFLFSSAYS ISAMVRS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 17：N端具有人類血清白蛋白信號序列(粗體)、添加有N端ISAMVRS胺基酸殘基(加下劃線)、具有C端G4S連接體(斜體)且具有C端c-Myc標籤(加下劃線、斜體)之人類IgG1 FcMKWVTFISLLFLFSSAYS ISAMVRS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGG GSEQKLISEEDL SEQ ID NO: 18：添加有N端ISAMVRS胺基酸殘基(加下劃線)、具有C端G4S連接體(斜體)且具有C端c-Myc標籤(加下劃線、斜體)之成熟人類IgG1 FcISAMVRS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGG GSEQKLISEEDL SEQ ID NO: 19：具有人類血清白蛋白信號序列(粗體)、添加有N端ISAMVRS胺基酸殘基(加下劃線)且具有離胺酸至絲胺酸修飾(*)以預防此位點處之離胺酸結合之人類IgG1 FcMKWVTFISLLFLFSSAYS ISAMVRS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPS*DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 20：添加有N端ISAMVRS胺基酸殘基(加下劃線)且具有離胺酸至絲胺酸修飾(*)以預防此位點處之離胺酸結合之成熟人類IgG1 FcISAMVRS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPS*DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 21：N端具有人類血清白蛋白信號序列(粗體)、添加有N端ISAMVRS胺基酸殘基(加下劃線)、具有離胺酸至絲胺酸修飾(*)以預防此位點處之離胺酸結合、具有C端G4S連接體(斜體)且具有C端C-Myc標籤(加下劃線、斜體)之人類IgG1 FcMKWVTFISLLFLFSSAYS ISAMVRS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPS(*)DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSEQKLISEEDL SEQ ID NO: 22：添加有N端ISAMVRS胺基酸殘基(加下劃線)、具有離胺酸至絲胺酸修飾(*)以預防此位點處之離胺酸結合、具有C端G4S連接體(斜體)且具有C端C-Myc標籤(加下劃線、斜體)之成熟人類IgG1 FcISAMVRS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPS(*)DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSEQKLISEEDL SEQ ID NO: 23：N端具有人類血清白蛋白信號序列(粗體)、添加有N端ISAMVRS胺基酸殘基(加下劃線)、具有Asn至Ala取代(*)、具有C端G4S連接體(斜體)且具有C端C-myc標籤(加下劃線、斜體)之人類IgG1 FcMKWVTFISLLFLFSSAYS ISAMVRS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYA(*)STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSEQKLISEEDL SEQ ID NO: 24：添加有N端ISAMVRS胺基酸殘基(加下劃線)、具有Asn至Ala取代(*)、具有C端G4S連接體(斜體)且具有C端C-myc標籤(加下劃線、斜體)之成熟人類IgG1 FcISAMVRS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYA(*)STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSEQKLISEEDL SEQ ID NO: 25：N端具有人類血清白蛋白信號序列(粗體)、添加有N端ISAMVRS胺基酸殘基(加下劃線)、具有H310A (*)及H435A (*)突變以妨礙FcRn結合、具有C端G4S (斜體)且具有C端C-myc標籤(加下劃線、斜體)之人類IgG1 FcMKWVTFISLLFLFSSAYS ISAMVRS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLA(*)QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA(*)KGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNAYTQKSLSLSPGGGGGSEQKLISEEDL SEQ ID NO: 26：N端具有人類血清白蛋白信號序列(粗體)、添加有N端ISAMVRS胺基酸殘基(加下劃線)、具有H310A (*)及H435A (*)突變以妨礙FcRn結合、具有C端G4S (斜體)且具有C端C-myc標籤(加下劃線、斜體)之成熟人類IgG1 FcISAMVRS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLA(*)QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA(*)KGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNAYTQKSLSLSPGGGGGSEQKLISEEDL SEQ ID NO: 27：N端具有人類血清白蛋白信號序列(粗體)、添加有N端ISAMVRS胺基酸殘基(加下劃線)、具有C端G4S連接體(斜體)且具有C端突變型(離胺酸至苯丙胺酸，粗體) C-myc標籤(加下劃線、斜體)之人類IgG1 FcMKWVTFISLLFLFSSAYS ISAMVRS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSEQF LISEEDL SEQ ID NO: 28：添加有N端ISAMVRS胺基酸殘基(加下劃線)、具有C端G4S連接體(斜體)且具有C端突變型(離胺酸至苯丙胺酸，粗體) C-myc標籤(加下劃線、斜體)之成熟人類IgG1 FcISAMVRS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGG GSEQF LISEEDL SEQ ID NO: 29：N端具有人類血清白蛋白信號序列(粗體)、添加有N端ISAMVRS胺基酸殘基(加下劃線)、具有Asn至Ala取代(*)、具有C端G4S連接體(斜體)且具有C端突變型(離胺酸至苯丙胺酸，粗體) C-myc標籤(加下劃線、斜體)之人類IgG1 FcMKWVTFISLLFLFSSAYS ISAMVRS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYA(*)STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGG GS EQF LISEEDL SEQ ID NO: 30：添加有N端MVRS胺基酸殘基(加下劃線)、具有Asn至Ala取代(*)、具有C端G4S連接體(斜體)且具有C端突變型(離胺酸至苯丙胺酸，粗體) C-myc標籤(加下劃線、斜體)之成熟人類IgG1 FcISAMVRS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYA(*)STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGG GSEQF LISEEDL SEQ ID NO: 31：N端具有人類血清白蛋白信號序列(粗體)、具有同種異型G1m(fa) (粗斜體)、具有C端G4S連接體(斜體)且具有C端突變型(離胺酸至苯丙胺酸，粗體) C-myc標籤(加下劃線)之人類IgG1 Fc MKWVTFISLLFLFSSAYS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGS EQFLISEEDL SEQ ID NO: 32：N端具有人類血清白蛋白信號序列(粗體)、具有同種異型G1m(fa) (粗斜體)之人類IgG1 FcMKWVTFISLLFLFSSAYS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 33：具有YTE三重突變(粗體及加下劃線)且添加有N端MVRS胺基酸殘基(加下劃線)之成熟人類IgG1 FcMVRS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL Y I T R E PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 34：N端具有人類血清白蛋白信號序列(粗體)、含有在成熟人類IgG1 Fc之N端構成全鉸鏈區之殘基EPKSS(加下劃線)、具有Cys至Ser取代(#)、具有同種異型G1m(fa) (粗斜體)之人類IgG1 FcMKWVTFISLLFLFSSAYS EPKSS (#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:35：N端具有鼠科動物IgG信號序列(粗體)、自成熟人類IgG1 Fc之N端移除EPKSSD鉸鏈殘基、具有同種異型G1m(fa) (粗斜體)之人類IgG1 FcMGWSCIILFLVATATGVHS KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:36：具有YTE三重突變(粗體及加下劃線)、自成熟人類IgG1 Fc之N端移除EPKSSD鉸鏈殘基、具有同種異型G1m(fa) (粗斜體)之成熟人類IgG1 Fc KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL Y I T R E PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:37：具有LS雙重突變(粗體及加下劃線)、自成熟人類IgG1 Fc之N端移除EPKSSD鉸鏈殘基、具有同種異型G1m(fa) (粗斜體)之成熟人類IgG1 Fc KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV L HEALH S HYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:38：N端具有人類血清白蛋白信號序列(粗體)、具有YTE三重突變(粗體及加下劃線)、具有同種異型G1m(fa) (粗斜體)、具有C端G4S連接體(斜體)且具有C端C-myc標籤(加下劃線)之成熟人類IgG1 FcMKWVTFISLLFLFSSAYS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL Y I T R E PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGS EQKLISEEDL SEQ ID NO:39：成熟人類Fc IgG1，其中X1 為Met或Trp，X2 為Ser或Thr，X3 為Thr或Glu，X4 為Asp或Glu，且X5 為Leu或Met，X6 為Met或Leu，且X7 為Asn或Ser DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLX1 IX2 RX3 PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRX4 EX5 TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVX6 HEALHX7 HYTQKSLSLSPG SEQ ID NO:40：成熟人類Fc IgG1，其中X4 為Asp或Glu，且X5 為Leu或Met DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRX4 EX5 TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG SEQ ID NO:41：具有YTE三重突變(粗體及加下劃線)之成熟人類Fc IgG1，且其中X4 為Asp或Glu，且X5 為Leu或Met DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL Y I T R E PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRX4 EX5 TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG SEQ ID NO:42：具有YTE三重突變(粗體及加下劃線)、具有同種異型G1m(fa) (粗斜體)之成熟人類Fc IgG1 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL Y I T R E PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG SEQ ID NO:43：具有YTE三重突變(粗體及加下劃線)、具有同種異型G1m(f) (粗斜體)之成熟人類Fc IgG1 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL Y I T R E PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR E E M TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG SEQ ID NO:44：具有LS雙重突變(粗體及加下劃線)之成熟人類Fc IgG1，且其中X4 為Asp或Glu，且X5 為Leu或Met DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRX4 EX5 TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV L HEALH S HYTQKSLSLSPG SEQ ID NO:45：具有LS雙重突變(粗體及加下劃線)、具有同種異型G1m(fa) (粗斜體)之成熟人類Fc IgG1 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV L HEALH S HYTQKSLSLSPG SEQ ID NO:46：具有LS雙重突變(粗體及加下劃線)、具有同種異型G1m(f) (粗斜體)之成熟人類Fc IgG1 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR E E M TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV L HEALH S HYTQKSLSLSPG SEQ ID NO:47：具有小鼠重鏈MIgG Vh信號序列(粗體)、具有Cys至Ser取代(#)之成熟人類Fc IgG1，且其中X1 為Met或Trp，X2 為Ser或Thr，X3 為Thr或Glu，X4 為Asp或Glu，且X5 為Leu或Met，X6 為Met或Leu，且X7 為Asn或SerMGWSCIILFLVATATGVHS NVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLX1 IX2 RX3 PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRX4 EX5 TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVX6 HEALHX7 HYTQKSLSLSPG SEQ ID NO:48：具有小鼠重鏈MIgG Vh信號序列(粗體)、具有Cys至Ser取代(#)、具有同種異型G1m(fa) (粗斜體)之成熟人類IgG1 FcMGWSCIILFLVATATGVHS NVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:49：具有小鼠重鏈MIgG Vh信號序列(粗體)、具有Cys至Ser取代(#)、具有同種異型G1m(f) (粗斜體)之成熟人類IgG1 FcMGWSCIILFLVATATGVHS NVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR E E M TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:50：具有小鼠重鏈MIgG Vh信號序列(粗體)、具有Cys至Ser取代(#)、具有M428L、N434S突變(粗體/加下劃線)、具有同種異型G1m(fa) (粗斜體)之成熟人類IgG1 FcMGWSCIILFLVATATGVHS NVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV L HEALH S HYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 51：具有小鼠重鏈MIgG Vh信號序列(粗體)、具有Cys至Ser取代(#)、具有M428L、N434S突變(粗體/加下劃線)、具有同種異型G1m(f) (粗斜體)之成熟人類IgG1 FcMGWSCIILFLVATATGVHS NVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR E E M TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV L HEALH S HYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:52：具有小鼠重鏈MIgG Vh信號序列(粗體)、具有Cys至Ser取代(#)、具有YTE三重突變(粗體及加下劃線)、具有同種異型G1m(fa) (粗斜體)之成熟人類IgG1 FcMGWSCIILFLVATATGVHS NVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL Y I T R E PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:53：具有小鼠重鏈MIgG Vh信號序列(粗體)、具有Cys至Ser取代(#)、具有YTE三重突變(粗體及加下劃線)、具有同種異型G1m(f) (粗斜體)之成熟人類IgG1 FcMGWSCIILFLVATATGVHS NVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL Y I T R E PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR E E M TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:54：具有小鼠重鏈MIgG Vh信號序列(粗體)、添加有N端ISAMVRS胺基酸殘基(斜體)、具有M428L、N434S突變(粗體/加下劃線)、具有G4S連接體(斜體)且具有C端C-myc-標籤(加下劃線)、具有同種異型G1m(f) (粗斜體)之成熟人類IgG1 FcMGWSCIILFLVATATGVHS ISAMVRS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR E E M TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV L HEALH S HYTQKSLSLSPGGGGGS EQKLISEEDL SEQ ID NO:55：具有小鼠重鏈MIgG Vh信號序列(粗體)、添加有N端ISAMVRS胺基酸殘基(斜體)、具有M428L、N434S突變(粗體/加下劃線)、具有G4S連接體(斜體)、具有C端C-myc-標籤(加下劃線)、具有同種異型G1m(fa) (粗斜體)之成熟人類IgG1 FcMGWSCIILFLVATATGVHS ISAMVRS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV L HEALH S HYTQKSLSLSPGGGGGS EQKLISEEDL SEQ ID NO:56：具有小鼠重鏈MIgG Vh信號序列(粗體)、添加有N端ISAMVRS胺基酸殘基(斜體)、具有YTE三重突變(粗體/加下劃線)、具有G4S連接體(斜體)且具有C端C-myc-標籤(加下劃線)、具有同種異型G1m(f) (粗斜體)之成熟人類IgG1 FcMGWSCIILFLVATATGVHS ISAMVRS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL Y I T R E PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR E E M TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGS EQKLISEEDL SEQ ID NO:57：具有小鼠重鏈MIgG Vh信號序列(粗體)、添加有N端ISAMVRS胺基酸殘基(斜體)、具有YTE三重突變體(粗體/加下劃線)、具有G4S連接體(斜體)、具有C端C-myc-標籤(加下劃線)、具有同種異型G1m(fa) (粗斜體)之成熟人類IgG1 FcMGWSCIILFLVATATGVHS ISAMVRS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL Y I T R E PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGS EQKLISEEDL SEQ ID NO:58：具有小鼠重鏈MIgG1信號序列(粗體)、具有Cys至Ser取代(#)、具有C端G4S (斜體)且具有C端IgA肽(加下劃線)、具有同種異型G1m(fa) (粗斜體)之成熟人類IgG1MGWSCIILFLVATATGVHS EPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGS QRNPRLRLIRRHPTLRIPPI SEQ ID NO:59：具有小鼠重鏈MIgG1信號序列(粗體)、具有Cys至Ser取代(#)、具有M428L、N434S突變(粗體/加下劃線)、具有C端G4S (斜體)且具有C端IgA肽(加下劃線)、具有同種異型G1m(fa) (粗斜體)之成熟人類IgG1MGWSCIILFLVATATGVHS EPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV L HEALH S HYTQKSLSLSPGGGGGS QRNPRLRLIRRHPTLRIPPI SEQ ID NO:60：成熟人類Fc IgG1，Z1 為Cys或Ser，且其中X1 為Met或Trp，X2 為Ser或Thr，X3 為Thr或Glu，X4 為Asp或Glu，且X5 為Leu或Met，X6 為Met或Leu，且X7 為Asn或Ser NVNHKPSNTKVDKKVEPKSZ1 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLX1 IX2 RX3 PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRX4 EX5 TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVX6 HEALHX7 HYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:61：成熟人類Fc IgG1，Cys至Ser取代(#)，且其中X1 為Met或Trp，X2 為Ser或Thr，X3 為Thr或Glu，X4 為Asp或Glu，且X5 為Leu或Met，X6 為Met或Leu，且X7 為Asn或Ser NVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLX1 IX2 RX3 PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRX4 EX5 TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVX6 HEALHX7 HYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:62：成熟人類IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)，X4 為Asp或Glu，且X5 為Leu或Met NVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRX4 EX5 TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:63：成熟人類IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)、同種異型G1m(f) (粗斜體) NVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR E E M TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:64：成熟人類IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)、同種異型G1m(fa) (粗斜體) NVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:65：成熟人類IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)、M428L、N434S突變(粗體/加下劃線)、同種異型G1m(fa) (粗斜體) NVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV L HEALH S HYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 66：成熟人類IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)、M428L、N434S突變(粗體/加下劃線)、同種異型G1m(f) (粗斜體) NVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR E E M TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV L HEALH S HYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:67：成熟人類IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)、YTE三重突變(粗體及加下劃線)、同種異型G1m(fa) (粗斜體) NVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL Y I T R E PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR D E L TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:68：成熟人類IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)、YTE三重突變(粗體及加下劃線)、同種異型G1m(f) (粗斜體) NVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL Y I T R E PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR E E M TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
如本文所定義，Fc域包括藉由CH 3抗體恆定域之間的相互作用二聚化之兩種Fc域單體，以及在兩種二聚化Fc域單體之鉸鏈域之間形成的一或多個二硫鍵。Fc域形成結合於Fc受體，例如Fc-γ受體(亦即，Fcγ受體(FcγR))、Fc-α受體(亦即，Fcα受體(FcαR))、Fc-ε受體(亦即，Fcε受體(FcεR))及/或新生兒Fc受體(FcRn)之最小結構。在一些實施例中，本發明之Fc域結合於Fcγ受體(例如，FcRn、FcγRI (CD64)、FcγRIIa (CD32)、FcγRIIb (CD32)、FcγRIIIa (CD16a)、FcγRIIIb (CD16b))及/或FcγRIV及/或新生兒Fc受體(FcRn)。
在一些實施例中，本發明之Fc域單體或Fc域為無糖基化Fc域單體或Fc域(例如，維持銜接於Fc受體(例如，FcRn)之Fc域單體或及Fc域。例如，該Fc域係維持銜接於Fc受體之無糖基化IgG1變異體(例如，在糖基化基序之N297及/或T299處具有胺基酸取代之IgG1)。例示性無糖基化Fc域及用於製備無糖基化Fc域之方法為此項技術中已知的，例如，如描述於Sazinsky S.L.等人, Aglycosylated immunoglobulin G1 variants productively engage activating Fc receptors, PNAS, 2008, 105(51):20167-20172中，該文獻整體倂入本文中。
在一些實施例中，本發明之Fc域或Fc域單體經工程改造以增強與新生兒Fc受體(FcRn)之結合。例如，該Fc域可包括對應於M252Y/S254T/T256E (YTE)之三重突變(例如IgG1，諸如具有YTE突變之人類或人類化IgG1，例如SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:56或SEQ ID NO:57)。該Fc域可包括對應於M428L/N434S (LS)之雙重突變體(例如IgG1，諸如具有LS突變之人類或人類化IgG1，諸如SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:59)。該Fc域可包括對應於N434H之單一突變體(例如IgG1，諸如具有N434H突變之人類或人類化IgG1)。該Fc域可包括對應於C220S之單一突變體(例如IgG1，諸如具有C220S突變之人類或人類化IgG1，諸如SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68)。該Fc域可包括增強與FcRn之結合之上述突變中的一或多者之組合。增強之與FcRn之結合可增加含Fc域之結合物的半衰期。例如，相對於具有不含增強FcRn結合之突變之相應Fc域的結合物，增加結合於FcRn之一或多種胺基酸突變(例如，YTE突變、LS突變或N434H突變)之倂入可增加該結合物的半衰期達5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%或更高。具有增強之與FcRN之結合的例示性Fc域及用於製備具有增強之與FcRN之結合的Fc域之方法為此項技術中已知的，例如，如描述於Maeda, A.等人, Identification of human IgG1 variant with enhanced FcRn binding and without increased binding to rheumatoid factor autoantibody, MABS, 2017, 9(5):844-853中，該文獻整體倂入本文中。如本文所用，應理解「對應於」(例如，特定SEQ ID NO.之)特定胺基酸殘基之胺基酸包括熟習此項技術者將理解與(例如，該特定序列之)該特定殘基比對的任何胺基酸殘基。例如，SEQ ID NO: 1-68中任一者可藉由使該胺基酸序列之「相應殘基」突變而發生突變以包括YTE突變、LS突變及/或N434H突變。
如本文所用，應理解「對應於」特定SEQ ID NO.之特定半胱胺酸殘基之硫原子包括熟習此項技術者將理解與該特定序列之特定半胱胺酸比對的任何半胱胺酸殘基之硫原子。下文提供人類IgG1 (UniProtKB: P01857；SEQ ID NO: 94)、人類IgG2 (UniProtKB: P01859；SEQ ID NO: 95)、人類IgG3 (UniProtKB: P01860；SEQ ID NO: 96)及人類IgG4 (UniProtKB: P01861；SEQ ID NO: 97)之蛋白質序列比對(用Clustal Omega Multiple Pairwise Alignment比對)。該比對指示彼此「對應」之半胱胺酸殘基(例如，半胱胺酸殘基之硫原子) (在盒中且由•符號指示)。熟習此項技術者將能夠容易地執行與本發明之任何IgG變異體的該種比對以確定半胱胺酸中對應於本文所述之特定SEQ ID NO. (例如，SEQ ID NO: 1-68中任一者)之特定半胱胺酸的任何硫原子之硫原子。例如，熟習此項技術者將能夠容易地確定SEQ ID NO: 10之Cys10 (該Fc域之鉸鏈區之保守CPPC基序的第一個半胱胺酸)對應於例如IgG1之Cys109、IgG2之Cys106、IgG3之Cys156、SEQ ID NO: 1之Cys29、SEQ ID NO: 2之Cys9、SEQ ID NO: 3之Cys30或SEQ ID NO: 10之Cys10。
在一些實施例中，本發明之Fc域或Fc域單體具有SEQ ID NO: 39-68中任一者之序列，可進一步包括N端處之額外胺基酸(Xaa)x及/或C端處之額外胺基酸(Xaa)z，其中Xaa為任何胺基酸且x及z為大於或等於零之整數，一般地小於100，較佳地小於10且更佳地為0、1、2、3、4或5。在一些實施例中，該等額外胺基酸與SEQ ID NO: 94之一或多個連續胺基酸至少70% (例如，70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致。例如，該等額外胺基酸可為C端處對應於IgG1 (SEQ ID NO: 94)之Lys330之單一胺基酸。
如本文所用，應理解「對應於」特定SEQ ID NO.之特定離胺酸殘基之氮原子包括熟習此項技術者將理解與該特定序列之特定離胺酸比對的任何離胺酸殘基之氮原子。下文提供人類IgG1 (UniProtKB: P01857；SEQ ID NO: 94)、人類IgG2 (UniProtKB: P01859；SEQ ID NO: 95)、人類IgG3 (UniProtKB: P01860；SEQ ID NO: 96)及人類IgG4 (UniProtKB: P01861；SEQ ID NO: 97)之蛋白質序列比對(用Clustal Omega Multiple Pairwise Alignment比對)。該比對指示彼此「對應」之離胺酸殘基(例如，離胺酸殘基之氮原子) (在盒中且由*符號指示)。熟習此項技術者將能夠容易地執行與本發明之任何IgG變異體的該種比對以確定離胺酸中對應於本文所述之特定SEQ ID NO. (例如，SEQ ID NO: 1-68中任一者)之特定離胺酸的任何氮原子之氮原子。例如，熟習此項技術者將能夠容易地確定SEQ ID NO: 10之Lys35對應於例如IgG1之Lys129、IgG2之Lys126、IgG3之Lys176、SEQ ID NO: 1之Lys51、SEQ ID NO: 2之Lys31、SEQ ID NO: 3之Lys50或SEQ ID NO: 10之Lys30。IgG1 (SEQ ID NO: 94) 、 IgG2 (SEQ ID NO: 95) 、 IgG3 (SEQ ID NO: 96) 及 IgG4 (SEQ ID NO: 97) 之蛋白質序列比對
Figure 02_image1339
免疫細胞活化
Fc-γ受體(FcγR)結合免疫球蛋白G (IgG)之Fc部分且在免疫活化及調節中發揮重要作用。例如，免疫複合物(IC)中之IgG Fc域以高親合力銜接FcγR，因此觸發調節免疫細胞活化之信號傳導級聯。人類FcγR家族含有數種活化受體(FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIc、FcγRIIIa及FcγRIIIb)及一種抑制受體(FcγRIIb)。FcγR信號傳導藉由細胞內域介導，該等細胞內域含有用於活化FcγR之免疫酪胺酸活化基序(ITAM)及用於抑制受體FcγRIIb之免疫酪胺酸抑制基序(ITIM)。在一些實施例中，Fc域與FcγR之結合使Src家族激酶進行ITAM磷酸化；此活化Syk家族激酶且誘導包括PI3K及Ras路徑之下游信號傳導網路。
在本文所述之結合物中，結合物中包括神經胺糖酸酶抑制劑之單體或二聚體的部分結合於且抑制病毒神經胺糖酸酶，導致抑制病毒複製，而該等結合物之Fc域部分結合於免疫細胞上之FcγR (例如，FcRn、FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIc、FcγRIIIa及FcγRIIIb)且活化吞噬作用及效應子功能，諸如抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)，因此由免疫細胞吞沒及破壞病毒粒子且進一步增強該等結合物之抗病毒活性。可藉由本文所述之結合物活化的免疫細胞之實例包括但不限於巨噬細胞、嗜中性粒細胞、嗜曙紅細胞、嗜鹼細胞、淋巴細胞、濾泡性樹突狀細胞、天然殺手細胞及肥大細胞。IV. 白蛋白及白蛋白結合肽 白蛋白
本發明之白蛋白可為天然存在之白蛋白或其變異體，諸如天然存在之白蛋白的經工程改造變異體。變異體包括多態性、諸如域及子域之片段及融合蛋白。白蛋白可包括自任何來源獲得之白蛋白之序列。較佳地，該來源為哺乳動物，諸如人類或牛。最佳地，該白蛋白為人類血清白蛋白(HSA)或其變異體。人類血清白蛋白包括具有天然存在於人類中之胺基酸序列之任何白蛋白及其變異體。白蛋白編碼序列可藉由熟習此項技術者已知用於分離對應於人類基因之cDNA且對該cDNA進行測序之方法獲得。本發明之白蛋白可包括以SEQ ID NO: 69或SEQ ID NO: 70提供的人類血清白蛋白(HSA)之胺基酸序列，或以SEQ ID NO: 71提供的小鼠血清白蛋白(MSA)之胺基酸序列，或其變異體或片段，較佳地其功能變異體或片段。片段或變異體可或可不為功能性的，或可在某種程度上保持白蛋白之功能。例如，片段或變異體可保持與白蛋白受體(諸如HSA或MSA)結合之能力，達親本白蛋白(例如，產生該片段或變異體之親本白蛋白)之該能力的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或105%。相對結合能力可藉由此項技術中已知之方法，諸如藉由表面電漿共振來測定。
該白蛋白可為白蛋白之天然存在之多態變異體，諸如人類血清白蛋白。一般而言，人類血清白蛋白之變異體或片段將具有人類血清白蛋白或小鼠血清白蛋白之配位體結合活性的至少5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%或70%，且較佳地80%、90%、95%、100%或105%或更高。
該白蛋白可包括牛血清白蛋白之胺基酸序列。牛血清白蛋白包括具有天然存在於牛中之胺基酸序列之任何白蛋白，例如，如藉由Swissprot寄存編號P02769所述，及如本文所定義的其變異體。牛血清白蛋白亦包括如本文所定義之全長牛血清白蛋白或其變異體之片段。
該白蛋白可包含源於犬(例如，Swissprot寄存編號P49822-1)、豬(例如，Swissprot寄存編號P08835-1)、山羊(例如，Sigma產品編號A2514或A4164)、貓(例如，Swissprot寄存編號P49064-1)、雞(例如，Swissprot寄存編號P19121-1)、卵白蛋白(例如，雞卵白蛋白) (例如，Swissprot寄存編號P01012-1)、火雞卵白蛋白(例如，Swissprot寄存編號O73860-1)、驢(例如，Swissprot寄存編號Q5XLE4-1)、豚鼠(例如，Swissprot寄存編號Q6WDN9-1)、倉鼠(例如，如描述於DeMarco等人 International Journal for Parasitology 37(11): 1201-1208 (2007)中)、馬(例如，Swissprot寄存編號P35747-1)、恆河猴(例如，Swissprot寄存編號Q28522-1)、小鼠(例如，Swissprot寄存編號P07724-1)、鴿子(例如，如由Khan等人 Int. J. Biol. Macromol. 30(3-4),171-8 (2002)所定義)、兔(例如，Swissprot寄存編號P49065-1)、大鼠(例如，Swissprot寄存編號P02770-1)或綿羊(例如，Swissprot寄存編號P14639-1)之血清白蛋白之一的白蛋白之序列，且包括如本文所定義之其變異體及片段。
熟習此項技術者已知白蛋白之多種天然存在之突變體形式。白蛋白之天然存在之突變體形式描述於例如Peters等人All About Albumin: Biochemistry, Genetics and Medical Applications , Academic Press, Inc., San Diego, Calif., 第170-181頁(1996)中。本發明之白蛋白包括天然存在之白蛋白的變異體。變異型白蛋白係指具有至少一種胺基酸突變，諸如藉由插入、缺失或取代產生之胺基酸突變(保守或非保守)的白蛋白，其限制條件在於該等改變產生尚未顯著改變至少一種基礎特性(例如，尚未改變超過5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%或40%)之白蛋白。可定義白蛋白之活性的例示性特性包括結合活性(例如，包括對膽紅素或諸如長鏈脂肪酸之脂肪酸的結合特異性或親和力)、容積滲透濃度或在特定pH範圍內之行為。
典型地，白蛋白變異體將與天然存在之白蛋白(諸如SEQ ID NO: 69-71中任一者之白蛋白)具有至少40%、至少50%、至少60%且較佳地至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%胺基酸序列一致性。
用於產生及純化重組人類白蛋白之方法為充分確立的(Sleep等人. Biotechnology, 8(1):42-6 (1990))，且包括用於醫藥應用之重組人類白蛋白的產生(Bosse等人 J Clin Pharmacol 45(1):57-67 (2005))。HSA之三維結構已藉由X射線結晶學(Carter等人 Science. 244(4909): 1195-8(1998))；Sugio等人 Protein Eng. 12(6):439-46 (1999))闡明。HSA多肽鏈具有35個半胱胺酸殘基，該等殘基形成17個二硫鍵；及在成熟蛋白質之位置34處的一個未配對(例如，游離)半胱胺酸。HSA之Cys-34已用於使分子結合於白蛋白(Leger等人 Bioorg Med Chem Lett 14(17):4395-8 (2004)；Thibaudeau等人 Bioconjug Chem 16(4):1000-8 (2005))，且提供用於位點特異性結合之位點。 SEQ ID NO:69 (人類血清白蛋白(HSA)，變異體1) DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL SEQ ID NO:70 (人類血清白蛋白(HSA)，變異體2) RGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL SEQ ID NO:71 (小鼠血清白蛋白(MSA)) RGVFRREAHKSEIAHRYNDLGEQHFKGLVLIAFSQYLQKCSYDEHAKLVQEVTDFAKTCVADESAANCDKSLHTLFGDKLCAIPNLRENYGELADCCTKQEPERNECFLQHKDDNPSLPPFERPEAEAMCTSFKENPTTFMGHYLHEVARRHPYFYAPELLYYAEQYNEILTQCCAEADKESCLTPKLDGVKEKALVSSVRQRMKCSSMQKFGERAFKAWAVARLSQTFPNADFAEITKLATDLTKVNKECCHGDLLECADDRAELAKYMCENQATISSKLQTCCDKPLLKKAHCLSEVEHDTMPADLPAIAADFVEDQEVCKNYAEAKDVFLGTFLYEYSRRHPDYSVSLLLRLAKKYEATLEKCCAEANPPACYGTVLAEFQPLVEEPKNLVKTNCDLYEKLGEYGFQNAILVRYTQKAPQVSTPTLVEAARNLGRVGTKCCTLPEDQRLPCVEDYLSAILNRVCLLHEKTPVSEHVTKCCSGSLVERRPCFSALTVDETYVPKEFKAETFTFHSDICTLPEKEKQIKKQTALAELVKHKPKATAEQLKTVMDDFAQFLDTCCKAADKDTCFSTEGPNLVTRCKDALA白蛋白之結合
本發明之白蛋白可結合於(例如，藉助於共價鍵)任何本發明化合物(例如，藉助於神經胺糖酸酶抑制劑單體或二聚體之連接體部分)。該白蛋白可藉由熟習此項技術者熟知用於產生小分子-蛋白結合物之任何方法結合於任何本發明化合物。此可包括共價結合於溶劑暴露胺基酸，諸如溶劑暴露半胱胺酸或離胺酸。例如，人類血清白蛋白可藉由共價連接於對應於SEQ ID NO: 69之Cys34或SEQ ID NO: 70之Cys40的硫原子而結合於本發明化合物。
本發明之白蛋白可藉助於位於該白蛋白之C末端或N末端的10個胺基酸殘基內之胺基酸結合於任何本發明化合物。白蛋白可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20個或20個以上胺基酸之C端或N端多肽融合。該C端或N端多肽融合可包括一或多個溶劑暴露半胱胺酸或離胺酸殘基，該等殘基可用於共價結合本發明化合物(例如，結合於神經胺糖酸酶抑制劑單體或二聚體，包括藉助於連接體)。
本發明之白蛋白包括已經工程改造以包括一或多個溶劑暴露半胱胺酸或離胺酸殘基之任何白蛋白，其可提供用於結合於本發明化合物(例如，結合於神經胺糖酸酶抑制劑單體或二聚體，包括藉助於連接體)之位點。最佳地，該白蛋白將含有單一溶劑暴露半胱胺酸或離胺酸，因此使得本發明化合物能夠位點特異性結合。
用於產生包括一或多個結合勝任半胱胺酸殘基之經工程改造白蛋白變異體之例示性方法提供於美國專利申請案第2017/0081389號中，該案以引用之方式整體倂入本文中。簡言之，較佳白蛋白變異體係包含單一、溶劑暴露、未配對(例如，游離)半胱胺酸殘基，因此使得連接體能夠位點特異性結合於該半胱胺酸殘基之彼等變異體。
已經工程改造以使得能夠化學結合於溶劑暴露、未配對半胱胺酸殘基之白蛋白包括以下白蛋白變異體： (a) 在對應於SEQ ID NO: 69之L585、D1、A2、D562、A364、A504、E505、T79、E86、D129、D549、A581、D121、E82、S270、Q397及A578中任一者的胺基酸殘基處由半胱胺酸取代非半胱胺酸胺基酸殘基之白蛋白； (b) 在鄰近對應於SEQ ID NO: 69之L585、D1、A2、D562、A364、A504、E505、T79、E86、D129、D549、A581、D121、E82、S270、Q397及A578中任一者的胺基酸殘基之N端或C端側的位置處具有半胱胺酸插入之白蛋白； (c)如下白蛋白，其經工程改造以在對應於SEQ ID NO: 69之C369、C361、C91、C177、C567、C316、C75、C169、C124或C558中任一者的殘基處具有含游離硫醇基之未配對半胱胺酸，且其可或可不藉由對應於SEQ ID NO: 69之C360、C316、C75、C168、C558、C361、C91、C124、C169或C567的殘基之缺失或取代產生；及/或 (d) 添加半胱胺酸至白蛋白之N端或C端。
在本發明之一些實施例中，(a)、(b)、(c)及/或(d)之取代、缺失、添加或插入事件的淨結果係該多肽序列之結合勝任半胱胺酸殘基之數目相對於親本白蛋白序列有所增加。在本發明之一些實施例中，(a)、(b)、(c)及/或(d)之取代、缺失、添加或插入事件的淨結果係該多肽序列之結合勝任半胱胺酸殘基之數目為1，因此使得能夠位點特異性結合。
較佳白蛋白變異體亦包括具有單一溶劑暴露離胺酸殘基，因此使得連接體能夠位點特異性結合於該離胺酸殘基之白蛋白。該等變異體可藉由工程改造白蛋白，包括任何前述方法(例如，插入、缺失、取代或C端或N端融合)來產生。白蛋白結合肽
生物活性化合物與白蛋白結合肽之結合可改變該生物活性化合物之藥效，包括組織攝取、滲透及擴散的改變。在一較佳實施例中，如與單獨本發明化合物(例如，神經胺糖酸酶抑制劑單體或二聚體，藉助於連接體)相比，白蛋白結合肽與該化合物之結合會增加該化合物之功效或減少毒性。
本發明之白蛋白結合肽包括具有5至50個(例如，5至40個、5至30個、5至20個、5至15個、5至10個、10至50個、10至30個或10至20個)胺基酸殘基之胺基酸序列之任何多肽，其對白蛋白(諸如本文所述之任何白蛋白)具有親和力且具有結合該白蛋白之功能。較佳地，白蛋白結合肽結合於天然存在之血清白蛋白，最佳地人類血清白蛋白。白蛋白結合肽可具有不同起源，例如合成、人類、小鼠或大鼠。本發明之白蛋白結合肽包括已經工程改造以包括一或多個(例如，兩個、三個、四個或五個)溶劑暴露半胱胺酸或離胺酸殘基之白蛋白結合肽，其可提供用於結合於本發明化合物(例如，結合於神經胺糖酸酶抑制劑單體或二聚體，包括藉助於連接體)之位點。最佳地，該白蛋白結合肽將含有單一溶劑暴露半胱胺酸或離胺酸，因此使得本發明化合物能夠位點特異性結合。白蛋白結合肽可僅包括天然存在之胺基酸殘基，或可包括一或多個非天然存在之胺基酸殘基。在包括時，非天然存在之胺基酸殘基(例如，非天然存在之胺基酸殘基的側鏈)可用作用於本發明化合物(例如，神經胺糖酸酶抑制劑單體或二聚體，包括藉助於連接體)之附接點。本發明之白蛋白結合肽可為直鏈或環狀的。本發明之白蛋白結合肽包括熟習此項技術者已知之任何白蛋白結合肽，其實例提供於本文中。
白蛋白結合肽及包括白蛋白結合肽之結合物較佳地以如下親和力結合白蛋白(例如，人類血清白蛋白)，該親和力之特徵在於小於約100 μM，較佳地小於約100 nM，且最佳地不會實質上結合其他血漿蛋白質之解離常數Kd。該等化合物之特定實例為直鏈或環狀肽，其長度較佳地在約10個與20個胺基酸殘基之間，視情況在N端或C端或該兩處經修飾。
白蛋白結合肽包括包含以下通式之直鏈及環狀肽，其中Xaa為任何胺基酸： SEQ ID NO:74 Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Phe-Cys-Xaa-Asp-Trp-Pro-Xaa-Xaa-Xaa-Ser-Cys SEQ ID NO:75 Val-Cys-Tyr-Xaa-Xaa-Xaa-Ile-Cys-Phe SEQ ID NO:76 Cys-Tyr-Xaa-Pro-Gly-Xaa-Cys SEQ ID NO:77 Asp-Xaa-Cys-Leu-Pro-Xaa-Trp-Gly-Cys-Leu-Trp SEQ ID NO:78 Trp-Cys-Asp-Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Ala-Xaa-Asp-Leu-Cys SEQ ID NO:79 Asp-Leu-Val-Xaa-Leu-Gly-Leu-Glu-Cys-Trp
本發明之白蛋白結合肽進一步包括以下肽序列中任一者，其可為直鏈或環狀： SEQ ID NO:80         DLCLRDWGCLW SEQ ID NO:81         DICLPRWGCLW SEQ ID NO:82         MEDICLPRWGCLWGD SEQ ID NO:83         QRLMEDICLPRWGCLWEDDE SEQ ID NO:84         QGLIGDICLPRWGCLWGRSV SEQ ID NO:85         QGLIGDICLPRWGCLWGRSVK SEQ ID NO:86         EDICLPRWGCLWEDD SEQ ID NO:87         RLMEDICLPRWGCLWEDD SEQ ID NO:88         MEDICLPRWGCLWEDD SEQ ID NO:89         MEDICLPRWGCLWED SEQ ID NO:90         RLMEDICLARWGCLWEDD SEQ ID NO:91         EVRSFCTRWPAEKSCKPLRG SEQ ID NO:92         RAPESFVCYWETICFERSEQ SEQ ID NO:93         EMCYFPGICWM
SEQ ID NO: 74-93之白蛋白結合肽可進一步包括N端處之額外胺基酸(Xaa)x及/或C端處之額外胺基酸(Xaa)z，其中Xaa為任何胺基酸且x及z為大於或等於零之整數，一般地小於100，較佳地小於10且更佳地為0、1、2、3、4或5。
進一步例示性白蛋白結合肽提供於美國專利申請案第2005/0287153號中，該美國專利申請案以引用之方式整體倂入本文中。白蛋白結合肽之結合
本發明之白蛋白結合肽可結合於(例如，藉助於共價鍵)任何本發明化合物(例如，藉助於神經胺糖酸酶抑制劑單體或二聚體之連接體部分)。該白蛋白結合肽可藉由熟習此項技術者已知用於產生肽-小分子結合物之任何方法結合於任何本發明化合物。此可包括共價結合於胺基酸殘基(諸如半胱胺酸、離胺酸或非天然胺基酸)之側鏈基團。或者，共價結合可出現於C端(例如，結合於C端羧酸，或結合於C端殘基之側鏈基團)或N端(例如，結合於N端胺基，或結合於N端胺基酸之側鏈基團)。V. 連接體
連接體係指本文所述之結合物中的兩種或兩種以上組分之間(例如，本文所述之結合物中的兩種神經胺糖酸酶抑制劑之間、本文所述之結合物中的神經胺糖酸酶抑制劑與Fc域或白蛋白之間及本文所述之結合物中的兩種神經胺糖酸酶抑制劑之二聚體與Fc域或白蛋白之間)的連接。具有共價連接於神經胺糖酸酶抑制劑之二聚體之 Fc 域或白蛋白的結合物中之連接體
在如本文所述之含有共價連接於神經胺糖酸酶抑制劑之一或多種二聚體的Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽之結合物中，該結合物中之連接體(例如，L或L’)可為分支鏈結構。如本文進一步描述，本文所述之結合物中的連接體(例如，L或L’)可為多價結構，例如分別具有兩個或三個臂之二價或三價結構。在一些實施例中，當該連接體具有三個臂時，該等臂中之兩者可附接於第一及第二神經胺糖酸酶抑制劑且第三個臂可附接於Fc域單體及Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽。在一些實施例中，當該連接體具有兩個臂時，一個臂可附接於Fc域或白蛋白且另一臂可附接於兩種神經胺糖酸酶抑制劑之一。在其他實施例中，具有兩個臂之連接體可用於附接含有共價連接於神經胺糖酸酶抑制劑之一或多種二聚體的Fc域或白蛋白之結合物上的兩種神經胺糖酸酶抑制劑。
在一些實施例中，具有共價連接於神經胺糖酸酶抑制劑之一或多種二聚體的Fc域或白蛋白之結合物中之連接體係由式(D-L-I)描述：
Figure 02_image597
(L-I) 其中LA 由式GA1 -(ZA1 )g1 -(YA1 )h1 -(ZA2 )i1 -(YA2 )j1 -(ZA3 )k1 -(YA3 )l1 -(ZA4 )m1 -(YA4 )n1 -(ZA5 )o1 -GA2 描述；LB 由式GB1 -(ZB1 )g2 -(YB1 )h2 -(ZB2 )i2 -(YB2 )j2 -(ZB3 )k2 -(YB3 )l2 -(ZB4 )m2 -(YB4 )n2 -(ZB5 )o2 -GB2 描述；LC 由式GC1 -(ZC1 )g3 -(YC1 )h3 -(ZC2 )i3 -(YC2 )j3 -(ZC3 )k3 -(YC3 )l3 -(ZC4 )m3 -(YC4 )n3 -(ZC5 )o3 -GC2 描述；GA1 係附接至式(D-L-I)中的Q之鍵；GA2 係附接至第一神經胺糖酸酶抑制劑(例如，A1 )之鍵；GB1 係附接至式(D-L-I)中的Q之鍵；GB2 係附接至第二神經胺糖酸酶抑制劑(例如，A2 )之鍵；GC1 係附接至式(D-L-I)中的Q之鍵；GC2 係附接至Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽之鍵或能夠與結合於Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽之官能基反應的官能基(例如，順丁烯二醯亞胺及半胱胺酸、胺及經活化羧酸、硫醇及順丁烯二醯亞胺、經活化磺酸及胺、異氰酸酯及胺、疊氮化物及炔以及烯烴及四嗪)；ZA1 、ZA2 、ZA3 、ZA4 、ZA5 、ZB1 、ZB2 、ZB3 、ZB4 、ZB5 、ZC1 、ZC2 、ZC3 、ZC4 及ZC5 各自獨立地為視情況經取代C1-C20伸烷基、視情況經取代C1-C20伸雜烷基、視情況經取代C2-C20伸烯基、視情況經取代C2-C20伸雜烯基、視情況經取代C2-C20伸炔基、視情況經取代C2-C20伸雜炔基、視情況經取代C3-C20伸環烷基、視情況經取代C3-C20伸雜環烷基、視情況經取代C4-C20伸環烯基、視情況經取代C4-C20伸雜環烯基、視情況經取代C8-C20伸環炔基、視情況經取代C8-C20伸雜環炔基、視情況經取代C5-C15伸芳基或視情況經取代C2-C15伸雜芳基；YA1 、YA2 、YA3 、YA4 、YB1 、YB2 、YB3 、YB4 、YC1 、YC2 、YC3 及YC4 各自獨立地為O、S、NRi 、P、羰基、硫羰基、磺醯基、磷酸酯基、磷醯基或亞胺基；Ri 為H、視情況經取代C1-C20烷基、視情況經取代C1-C20雜烷基、視情況經取代C2-C20烯基、視情況經取代C2-C20雜烯基、視情況經取代C2-C20炔基、視情況經取代C2-C20雜炔基、視情況經取代C3-C20環烷基、視情況經取代C3-C20雜環烷基、視情況經取代C4-C20環烯基、視情況經取代C4-C20雜環烯基、視情況經取代C8-C20環炔基、視情況經取代C8-C20雜環炔基、視情況經取代C5-C15芳基或視情況經取代C2-C15雜芳基；g1、h1、i1、j1、k1、l1、m1、n1、o1、g2、h2、i2、j2、k2、l2、m2、n2、o2、g3、h3、i3、j3、k3、l3、m3、n3及o3各自獨立地為0或1；Q為氮原子、視情況經取代C1-C20伸烷基、視情況經取代C1-C20伸雜烷基、視情況經取代C2-C20伸烯基、視情況經取代C2-C20伸雜烯基、視情況經取代C2-C20伸炔基、視情況經取代C2-C20伸雜炔基、視情況經取代C3-C20伸環烷基、視情況經取代C3-C20伸雜環烷基、視情況經取代C4-C20伸環烯基、視情況經取代C4-C20伸雜環烯基、視情況經取代C8-C20伸環炔基、視情況經取代C8-C20伸雜環炔基、視情況經取代C5-C15伸芳基或視情況經取代C2-C15伸雜芳基。
在一些實施例中，LC 可具有兩個附接至Fc域之點(例如，兩個GC2 )。在一些實施例中，L包括聚乙二醇(PEG)連接體。PEG連接體包括具有重複單元結構(-CH2 CH2 O-)n 之連接體，其中n為2至100之整數。聚乙二醇連接體可共價接合神經胺糖酸酶抑制劑及E (例如，在式(M-I)-(M-X)中任一者之結合物中)。聚乙二醇連接體可共價接合第一神經胺糖酸酶抑制劑及第二神經胺糖酸酶抑制劑(例如，在式(D-I)-(D-X)中任一者之結合物中)。聚乙二醇連接體可共價接合神經胺糖酸酶抑制劑二聚體及E (例如，在式(D-I)-(D-X)中任一者之結合物中)。聚乙二醇連接體可選自PEG2 至PEG100 中任一者(例如，PEG2 、PEG3 、PEG4 、PEG5 、PEG5 -PEG10 、PEG10 -PEG20 、PEG20 -PEG30 、PEG30 -PEG40 、PEG50 -PEG60 、PEG60 -PEG70 、PEG70 -PEG80 、PEG80 -PEG90 、PEG90 -PEG100 )。在一些實施例中，Lc 包括PEG連接體，其中LC 共價附接至Q及E中每一者。
可用於本文所述之結合物中的式(D-L-I)之連接體包括但不限於
Figure 02_image599
、
Figure 02_image601
、
Figure 02_image603
、
Figure 02_image605
、
Figure 02_image607
、
Figure 02_image609
、
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；
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；或
Figure 02_image787
， 其中z1 及z2 各自獨立地為1至20之整數；且R9 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基。
式(D-L-I)之連接體亦可包括以下任一者：
Figure 02_image1408
Figure 02_image1410
Figure 02_image1412
Figure 02_image1414
具有共價連接於神經胺糖酸酶抑制劑之單體之 Fc 域或白蛋白的結合物中之連接體
在如本文所述之含有共價連接於神經胺糖酸酶抑制劑之一或多種單體的Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽之結合物中，該結合物中之連接體(例如，L或L’)可為具有兩個臂之二價結構。二價連接體中之一個臂可附接於神經胺糖酸酶抑制劑之單體且另一臂可附接於Fc域單體及Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽。在一些實施例中，本文所述之結合物中的神經胺糖酸酶抑制劑之一或多種單體可各自獨立地連接於Fc域單體及Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽中之原子。
在一些實施例中，連接體係由式(M-L-I)描述： J1 -(Q1 )g -(T1 )h -(Q2 )i -(T2 )j -(Q3 )k -(T3 )l -(Q4 )m -(T4 )n -(Q5 )o -J2 其中J1 係附接至神經胺糖酸酶抑制劑之鍵；J2 係附接至Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽之鍵或能夠與結合於Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽之官能基反應的官能基(例如，順丁烯二醯亞胺及半胱胺酸、胺及經活化羧酸、硫醇及順丁烯二醯亞胺、經活化磺酸及胺、異氰酸酯及胺、疊氮化物及炔以及烯烴及四嗪)；Q1 、Q2 、Q3 、Q4 及Q5 各自獨立地為視情況經取代C1-C20伸烷基、視情況經取代C1-C20伸雜烷基、視情況經取代C2-C20伸烯基、視情況經取代C2-C20伸雜烯基、視情況經取代C2-C20伸炔基、視情況經取代C2-C20伸雜炔基、視情況經取代C3-C20伸環烷基、視情況經取代C3-C20伸雜環烷基、視情況經取代C4-C20伸環烯基、視情況經取代C4-C20伸雜環烯基、視情況經取代C8-C20伸環炔基、視情況經取代C8-C20伸雜環炔基、視情況經取代C5-C15伸芳基或視情況經取代C2-C15伸雜芳基；T1 、T2 、T3 、T4 各自獨立地為O、S、NRi、P、羰基、硫羰基、磺醯基、磷酸酯基、磷醯基或亞胺基；Ri為H、視情況經取代C1-C20烷基、視情況經取代C1-C20雜烷基、視情況經取代C2-C20烯基、視情況經取代C2-C20雜烯基、視情況經取代C2-C20炔基、視情況經取代C2-C20雜炔基、視情況經取代C3-C20環烷基、視情況經取代C3-C20雜環烷基、視情況經取代C4-C20環烯基、視情況經取代C4-C20雜環烯基、視情況經取代C8-C20環炔基、視情況經取代C8-C20雜環炔基、視情況經取代C5-C15芳基或視情況經取代C2-C15雜芳基；且g、h、i、j、k、l、m、n及o各自獨立地為0或1。
在一些實施例中，J2 可具有兩個附接至Fc域單體及Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽之點(例如，兩個J2 )。
可用於本文所述之結合物中的式(M-L-I)之連接體包括但不限於
Figure 02_image1416
Figure 02_image1418
或
Figure 02_image1420
， 其中d為1至20之整數(例如，d為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)。
可用於本文所述之結合物中的式(M-L-I)之連接體包括但不限於
Figure 02_image1422
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及
Figure 02_image1430
，其中d及e各自獨立地為1至26之整數。連接基團
在一些實施例中，連接體提供此處所述之結合物中的神經胺糖酸酶抑制劑與Fc域單體及Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽之間或本文所述之結合物中之兩種神經胺糖酸酶抑制劑的空間、剛性及/或柔性。在一些實施例中，連接體可為鍵，例如共價鍵，例如醯胺鍵、二硫鍵、C-O鍵、C-N鍵、N-N鍵、C-S鍵或由化學反應(例如，化學結合)產生之任何種類的鍵。在一些實施例中，連接體(如式(1)-(5)、(D-I)-(D-X)、(D’-I)、(M-I)-(M-X)或(M’-I)中任一者所示之L或L’)包括不超過250個原子(例如，1-2、1-4、1-6、1-8、1-10、1-12、1-14、1-16、1-18、1-20、1-25、1-30、1-35、1-40、1-45、1-50、1-55、1-60、1-65、1-70、1-75、1-80、1-85、1-90、1-95、1-100、1-110、1-120、1-130、1-140、1-150、1-160、1-170、1-180、1-190、1-200、1-210、1-220、1-230、1-240或1-250個原子；250、240、230、220、210、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、28、26、24、22、20、18、16、14、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個原子)。在一些實施例中，連接體(L或L)包括不超過250個非氫原子(例如，1-2、1-4、1-6、1-8、1-10、1-12、1-14、1-16、1-18、1-20、1-25、1-30、1-35、1-40、1-45、1-50、1-55、1-60、1-65、1-70、1-75、1-80、1-85、1-90、1-95、1-100、1-110、1-120、1-130、1-140、1-150、1-160、1-170、1-180、1-190、1-200、1-210、1-220、1-230、1-240或1-250個非氫原子；250、240、230、220、210、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、28、26、24、22、20、18、16、14、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個非氫原子)。在一些實施例中，連接體(L或L)之骨架包括不超過250個原子(例如，1-2、1-4、1-6、1-8、1-10、1-12、1-14、1-16、1-18、1-20、1-25、1-30、1-35、1-40、1-45、1-50、1-55、1-60、1-65、1-70、1-75、1-80、1-85、1-90、1-95、1-100、1-110、1-120、1-130、1-140、1-150、1-160、1-170、1-180、1-190、1-200、1-210、1-220、1-230、1-240或1-250個原子；250、240、230、220、210、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、28、26、24、22、20、18、16、14、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個原子)。連接體之「骨架」係指連接體中之原子，其合起來形成自結合物之一部分至該結合物之另一部分之最短路徑。連接體之骨架中之原子直接地參與連接該結合物之一部分至該結合物之另一部分。例如，附接於連接體之骨架中的碳之氫原子未被視為直接地參與連接該結合物之一部分至該結合物之另一部分。
可用於製備連接體(L或L’)之分子包括至少兩個官能基，例如兩個羧酸基。在三價連接體之一些實施例中，連接體之兩個臂可含有兩種二羧酸，其中第一羧酸可與該結合物中之第一神經胺糖酸酶抑制劑形成共價連接且第二羧酸可與該結合物中之第二神經胺糖酸酶抑制劑形成共價連接且該連接體之第三臂可與該結合物中之Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽形成共價連接(例如，C-O鍵)。在二價連接體之一些實施例中，該二價連接體可含有兩種羧酸，其中第一羧酸可與該結合物中之一種組分(例如，神經胺糖酸酶抑制劑)形成共價連接且第二羧酸可與該結合物中之另一組分(例如，Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽)形成共價連接(例如，C-S鍵或C-N鍵)。
在一些實施例中，二羧酸分子可用作連接體(例如，二羧酸連接體)。例如，在含有共價連接於神經胺糖酸酶抑制劑之一或多種二聚體的Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽之結合物中，二羧酸分子中之第一羧酸可與第一神經胺糖酸酶抑制劑之羥基或胺基形成共價連接且第二羧酸可與第二神經胺糖酸酶抑制劑之羥基或胺基形成共價連接。
可用於形成連接體之二羧酸分子之實例包括但不限於：
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其中n為1至20之整數(例如，n為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)。
可用於形成連接體之二羧酸分子之其他實例包括但不限於：
Figure 02_image1485
Figure 02_image1487
在一些實施例中，二羧酸分子(諸如本文所述者)可進一步官能化以含有一或多個額外官能基。二羧酸可進一步官能化，例如以提供與Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽之附接點(例如，藉助於連接體，諸如PEG連接體)。
在一些實施例中，當該神經胺糖酸酶抑制劑附接於Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽時，連接基團可包含包括由1至25個原子間隔之羧酸部分及胺基部分的部分。該等連接基團之實例包括但不限於：
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其中n為1至20之整數(例如，n為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)。
在一些實施例中，可包含包括羧酸部分及胺基部分之部分之連接基團(諸如本文所述者)可進一步官能化以含有一或多個額外官能基。該等連接基團可進一步官能化，例如以提供與Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽之附接點(例如，藉助於連接體，諸如PEG連接體)。
在一些實施例中，當該神經胺糖酸酶抑制劑附接於Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽時，連接基團可包含包括由1至25個原子間隔之兩個或胺基部分(例如，二胺基部分)之部分。該等連接基團之實例包括但不限於：
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其中n為1至20之整數(例如，n為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)。
在一些實施例中，可包括二胺基部分之連接基團(諸如本文所述者)可進一步官能化以含有一或多個額外官能基。該等二胺基連接基團可進一步官能化，例如以提供與Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽之附接點(例如，藉助於連接體，諸如PEG連接體)。
在一些實施例中，含有疊氮基之分子可用於形成連接體，其中該疊氮基可與炔進行環加成以形成1,2,3-三唑連接。在一些實施例中，含有炔基之分子可用於形成連接體，其中該炔基可與疊氮化物進行環加成以形成1,2,3-三唑連接。在一些實施例中，含有順丁烯二醯亞胺基之分子可用於形成連接體，其中該順丁烯二醯亞胺基可與半胱胺酸反應以形成C-S連接。在一些實施例中，含有一或多個磺酸基之分子可用於形成連接體，其中該磺酸基可與神經胺糖酸酶抑制劑中之連接氮形成磺醯胺連接。在一些實施例中，含有一或多個異氰酸酯基之分子可用於形成連接體，其中該異氰酸酯基可與神經胺糖酸酶抑制劑中之連接氮形成脲連接。在一些實施例中，含有一或多個鹵烷基之分子可用於形成連接體，其中該鹵烷基可與神經胺糖酸酶抑制劑形成共價連接，例如C-N及C-O連接。
在一些實施例中，連接體(L或L’)可包含源於例如合成聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)聚合物)之合成基團。在一些實施例中，連接體可包含一或多個胺基酸殘基。在一些實施例中，連接體可為胺基酸序列(例如，1-25個胺基酸、1-10個胺基酸、1-9個胺基酸、1-8個胺基酸、1-7個胺基酸、1-6個胺基酸、1-5個胺基酸、1-4個胺基酸、1-3個胺基酸、1-2個胺基酸或1個胺基酸之序列)。在一些實施例中，連接體(L或L’)可包括一或多個視情況經取代C1-C20伸烷基、視情況經取代C1-C20伸雜烷基(例如，PEG單元)、視情況經取代C2-C20伸烯基(例如，C2伸烯基)、視情況經取代C2-C20伸雜烯基、視情況經取代C2-C20伸炔基、視情況經取代C2-C20伸雜炔基、視情況經取代C3-C20伸環烷基(例如，伸環丙基、伸環丁基)、視情況經取代C3-C20伸雜環烷基、視情況經取代C4-C20伸環烯基、視情況經取代C4-C20伸雜環烯基、視情況經取代C8-C20伸環炔基、視情況經取代C8-C20伸雜環炔基、視情況經取代C5-C15伸芳基(例如，C6伸芳基)、視情況經取代C2-C15伸雜芳基(例如，咪唑、吡啶)、O、S、NRi (Ri 為H、視情況經取代C1-C20烷基、視情況經取代C1-C20雜烷基、視情況經取代C2-C20烯基、視情況經取代C2-C20雜烯基、視情況經取代C2-C20炔基、視情況經取代C2-C20雜炔基、視情況經取代C3-C20環烷基、視情況經取代C3-C20雜環烷基、視情況經取代C4-C20環烯基、視情況經取代C4-C20雜環烯基、視情況經取代C8-C20環炔基、視情況經取代C8-C20雜環炔基、視情況經取代C5-C15芳基或視情況經取代C2-C15雜芳基)、P、羰基、硫羰基、磺醯基、磷酸酯基、磷醯基或亞胺基。結合化學
神經胺糖酸酶抑制劑單體或二聚體(例如，在式(1)-(5)、(D-I)-(D-X)、(D’-I)、(M-I)-(M-X)或(M’-I)中任一者之結合物中)可例如藉助於連接體，藉由熟習此項技術者已知之任何標準結合化學結合於Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽。特定地涵蓋以下結合化學，例如關於使PEG連接體(例如，官能化PEG連接體)結合於Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽。
使用連接體使結合物中之兩種或兩種以上組分共價結合可使用熟知有機化學合成技術及方法來實現。兩種組分上之互補官能基可彼此反應以形成共價鍵。互補反應性官能基之實例包括但不限於例如順丁烯二醯亞胺及半胱胺酸、胺及經活化羧酸、硫醇及順丁烯二醯亞胺、經活化磺酸及胺、異氰酸酯及胺、疊氮化物及炔以及烯烴及四嗪。與多肽(例如，Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽)之位點特異性結合可使用此項技術中已知之技術來實現。用於使小分子位點特異性結合於Fc域之例示性技術提供於Agarwall. P.等人 Bioconjugate Chem. 26:176-192 (2015)中。
能夠與胺基反應之官能基之其他實例包括例如烷基化劑及醯化劑。代表性烷基化劑包括：(i) α-鹵基乙醯基，例如XCH2 CO- (其中X=Br、Cl或I)；(ii) N-順丁烯二醯亞胺基，其可經由Michael類型反應或經由藉由增加環羰基進行醯化而與胺基反應；(iii)芳基鹵化物，例如硝基鹵基芳族基團；(iv)烷基鹵化物；(v)能夠與胺基形成席夫氏鹼之醛或酮；(vi)可與胺基、巰基或酚式羥基反應之環氧化物，例如表氯醇及雙環氧乙烷；(vii)含氯s-三嗪，其可對諸如胺基、巰基及羥基之親核試劑具反應性；(viii)氮丙啶，其可藉由開環對諸如胺基之親核試劑具反應性；(ix)方酸二乙酯；及(x) α-鹵基烷基醚。
胺基反應性醯化劑之實例包括例如(i)異氰酸酯及異硫氰酸酯；(ii)磺醯氯；(iii)醯基鹵；(iv)活性酯，例如硝基苯酯或N-羥基丁二醯亞胺酯或其衍生物(例如，疊氮基-PEG2 -PEG40 -NHS酯)；(v)酸酐，例如混合、對稱或N-羧基酐；(vi)醯基疊氮化物；及(vii)醯亞胺酯。醛及酮可與胺反應以形成席夫氏鹼，席夫氏鹼可經由還原胺化穩定化。
應理解，某些官能基可在反應之前轉化為其他官能基，例如以賦予額外反應性或選擇性。適用於此目的之實例包括使用諸如二羧酸酐之試劑使胺轉化為羧基；使用諸如N-乙醯基高半胱胺酸硫內酯、S-乙醯基巰基丁二酸酐、2-亞胺基硫雜環戊烷或含硫醇之丁二醯亞胺基衍生物之試劑使胺轉化為硫醇；使用諸如α -鹵基乙酸酯之試劑使硫醇轉化為羧基；使用諸如乙烯亞胺或2-溴乙胺之試劑使硫醇轉化為胺；使用諸如碳化二亞胺之試劑、隨後二胺使羧基轉化為胺；及使用諸如甲苯磺醯氯之試劑、隨後用硫代乙酸酯進行酯基轉移且用乙酸鈉水解為硫醇而使醇轉化為硫醇。
在一些實施例中，本發明之連接體(例如L或L’，諸如D-L-I之LC )結合(例如，藉由本文所述之任何方法)於E (例如，Fc域或白蛋白)。在本發明之較佳實施例中，該連接體藉助於以下進行結合：(a)硫脲連接(亦即，-NH(C=S)NH-)於E之離胺酸；(b)胺基甲酸酯連接(亦即，-NH(C=O)-O)於E之離胺酸；(c)在離胺酸與E之間藉由還原胺化實現之胺連接(亦即，-NHCH2 )；(d)醯胺(亦即，-NH-(C=O)CH2 )於E之離胺酸；(e)連接體之順丁烯二醯亞胺至E之半胱胺酸之間的半胱胺酸-順丁烯二醯亞胺結合；(f)在連接體與E之碳水化合物(例如，Fc域單體或Fc域之糖基)之間藉由還原胺化實現之胺連接(亦即，-NHCH2 )；(g)再橋接半胱胺酸結合，其中該連接體結合於E之兩個半胱胺酸；(h)在連接體與E之碳水化合物(例如，Fc域單體或Fc域之糖基)之間的肟連接；(i)在連接體與E之胺基酸殘基之間的肟連接；(j)在連接體與E之間的疊氮基連接；(k)連接體直接醯化為E；或(l)在連接體與E之間的硫醚連接。
在一些實施例中，連接體結合於E，其中該連接包括結構-NH(C=NH)X-，其中X為O、HN或鍵。在一些實施例中，連接體結合於E，其中在連接體之剩餘部分與E之間的連接包括結構-NH(C=O)NH-。
在一些實施例中，連接體(例如活性酯，例如硝基苯酯或N-羥基丁二醯亞胺酯或其衍生物(例如，官能化PEG連接體(例如，疊氮基-PEG2 -PEG40 -NHS酯)結合於E，其中T (例如，DAR)在0.5與10.0之間，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在此等情況下，E-(PEG2 -PEG40 )-疊氮化物可經由點擊結合與具有末端炔連接體(例如L或L’，諸如D-L-I之LC )之Int反應。在點擊結合期間，銅催化之疊氮化物(例如，Fc-(PEG2 -PEG40 )-疊氮化物)與炔(例如，具有末端炔連接體(例如L或L’，諸如D-L-I之LC 之Int)之反應形成5員雜原子環。在一些實施例中，結合於E之連接體為末端炔且結合於具有末端疊氮化物之Int。E-(PEG2 -PEG40 )-疊氮化物之製備之例示性製備描述於實例7、8、61、84、88及124中。經由點擊結合製備之結合物之例示性圖描繪於圖43及61中。熟習此項技術者應容易瞭解來自點擊化學結合之最終產物。
例示性連接策略(例如，用於使神經胺糖酸酶抑制劑之單體或二聚體連接於E之方法，諸如藉助於連接體)進一步描繪於圖1、28、29、30、43及61中。VI. 組合療法 抗病毒劑
在一些實施例中，一或多種抗病毒劑可與本文所述之結合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-X)、(D’-I)、(M-I)-(M-X)或(M’-I)中任一者之結合物)組合投與(例如，實質上同時投與(例如，在同一醫藥組合物中或在獨立醫藥組合物中)或在不同時間獨立地投與)。
在一些實施例中，該抗病毒劑係用於治療流感病毒之抗病毒劑。例如，該抗病毒劑可為M2離子通道阻斷劑、神經胺糖酸酶抑制劑(例如，長效神經胺糖酸酶抑制劑)、聚合酶抑制劑、血球凝集素抑制劑、融合蛋白抑制劑、COX-2抑制劑或PPAR促效劑。該抗病毒劑可靶向病毒或宿主個體。與本文所述之結合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-X)、(D’-I)、(M-I)-(M-X)或(M’-I)中任一者之結合物)組合使用的用於治療流感病毒之抗病毒劑可選自奧司他韋、紮那米韋、帕拉米韋、拉尼米韋、CS-8958、金剛烷胺、金剛乙胺、藍藻抗病毒蛋白-N、cap依賴性核酸內切酶抑制劑(例如，巴洛沙韋酯)、聚合酶抑制劑(例如，T-705)、PB2抑制劑(例如，JNJ-63623872)、結合之唾液酸酶(例如，DAS181)、噻唑啶(例如，硝唑尼特)、COX抑制劑、PPAR促效劑、靶向血球凝集素之抗體(例如單株抗體，諸如CR6261、CR8020、MEDI8852、MHAA4549A或VIS410)或靶向宿主或病毒基因之siRNA或其前藥，或其醫藥學上可接受之鹽。抗病毒疫苗
在一些實施例中，本文所述之結合物中任一者(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-X)、(D’-I)、(M-I)-(M-X)或(M’-I)中任一者之結合物)與抗病毒疫苗(例如，在針對病毒之個體中引起免疫反應之組合物)組合投與。該抗病毒疫苗可與該等結合物實質上同時投與(例如，在同一醫藥組合物中或在獨立醫藥組合物中)，或可在該等結合物之前或之後(例如，在1天、2天、5天、1週、2週、3週、1個月、2個月、6個月或12個月或更久時期內)經投與。
在一些實施例中，該病毒疫苗包含在該個體中引起針對A型、B型、C型流感病毒或副流感病毒之免疫反應之免疫原。在一些實施例中，該免疫原為不活化病毒(例如，該疫苗係含有經純化且不活化材料A型、B型、C型流感病毒或副流感病毒或其任何組合之三價流感疫苗)。在一些實施例中，該疫苗呈肌肉內注射液形式給予。在一些實施例中，該疫苗係含有已經減弱(削弱)之活病毒之活病毒疫苗。在一些實施例中，該疫苗呈鼻內噴霧劑形式經投與。VII. 方法
本文所述之方法包括例如進行保護以抵禦或治療個體之病毒感染(例如，流感病毒感染)之方法及預防、穩定化或抑制病毒粒子之生長之方法。治療個體之病毒感染(例如，流感病毒感染)之方法包括向該個體投與本文所述之結合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-X)、(D’-I)、(M-I)-(M-X)或(M’-I)中任一者之結合物)或其醫藥組合物。在一些實施例中，該病毒感染係由流感病毒(例如， A型、B型、C型流感病毒或副流感病毒)引起。在一些實施例中，該病毒感染係由抗性病毒菌株引起。預防、穩定化或抑制病毒粒子之生長或預防病毒之複製及擴散的方法包括使該病毒或易經受病毒生長之位點與本文所述之結合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-X)、(D’-I)、(M-I)-(M-X)或(M’-I)中任一者之結合物)或其醫藥組合物接觸。
此外，本文所述之方法亦包括藉由向個體投與本文所述之結合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-X)、(D’-I)、(M-I)-(M-X)或(M’-I)中任一者之結合物)來進行保護以抵禦或治療個體之病毒感染之方法。在一些實施例中，該方法進一步包括向該個體投與抗病毒劑或抗病毒疫苗。
本文所述之方法亦包括藉由向個體投與(1)本文所述之結合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-X)、(D’-I)、(M-I)-(M-X)或(M’-I)中任一者之結合物)及(2)抗病毒劑或抗病毒疫苗來進行保護以抵禦或治療該個體之病毒感染的方法。本文所述之方法亦包括藉由使病毒或易經受病毒生長之位點與(1)本文所述之結合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-X)、(D’-I)、(M-I)-(M-X)或(M’-I)中任一者之結合物)及(2)抗病毒劑或抗病毒疫苗接觸來預防、穩定化或抑制病毒粒子之生長或預防病毒之複製或擴散的方法。
在一些實施例中，首先投與本文所述之結合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-X)、(D’-I)、(M-I)-(M-X)或(M’-I)中任一者之結合物)，隨後單獨投與抗病毒劑或抗病毒疫苗。在一些實施例中，首先投與抗病毒劑或抗病毒疫苗，隨後單獨投與本文所述之結合物。在一些實施例中，實質上同時投與本文所述之結合物及抗病毒劑或抗病毒疫苗(例如，在同一醫藥組合物中或在獨立醫藥組合物中)。在一些實施例中，首先投與本文所述之結合物或抗病毒劑或抗病毒疫苗，隨後實質上同時投與本文所述之結合物及抗病毒劑或抗病毒疫苗(例如，在同一醫藥組合物中或在獨立醫藥組合物中)。在一些實施例中，首先實質上同時投與本文所述之結合物及抗病毒劑或抗病毒疫苗(例如，在同一醫藥組合物中或在獨立醫藥組合物中)，隨後單獨投與本文所述之結合物或抗病毒劑或抗病毒疫苗。在一些實施例中，當本文所述之結合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-X)、(D’-I)、(M-I)-(M-X)或(M’-I)中任一者之結合物)及抗病毒劑或抗病毒疫苗合起來(例如，在同一或獨立醫藥組合物中實質上同時，或在同一治療方案中獨立地)經投與時，該結合物及該抗病毒劑或抗病毒疫苗中每一者對病毒複製之抑制可大於(例如，在較低濃度下出現)當在治療方案中單獨使用每一者時該結合物及該抗病毒劑或抗病毒疫苗中每一者對病毒複製之抑制。VIII. 醫藥組合物及製劑
本文所述之結合物可經調配於用於本文所述之方法的醫藥組合物中。在一些實施例中，本文所述之結合物可單獨經調配於醫藥組合物中。在一些實施例中，本文所述之結合物可與抗病毒劑或抗病毒疫苗組合經調配於醫藥組合物中。在一些實施例中，該醫藥組合物包括本文所述之結合物(例如，由式(1)-(5)、(D-I)-(D-X)、(D’-I)、(M-I)-(M-X)或(M’-I)中任一者描述之結合物)及醫藥學上可接受之載劑及賦形劑。
該等醫藥組合物中可接受之載劑及賦形劑在所用之劑量及濃度下對接受者無毒。可接受之載劑及賦形劑可包括緩衝液，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽、HEPES及TAE；抗氧化劑，諸如抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑，諸如氯化六烴季銨、十八烷基二甲基苯甲基氯化銨、間苯二酚及苯紮氯銨；蛋白質，諸如人類血清白蛋白、明膠、右旋糖苷及免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸殘基，諸如甘胺酸、麩醯胺、組胺酸及離胺酸；及碳水化合物，諸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖及山梨糖醇。
其他賦形劑之實例包括但不限於抗黏劑、黏合劑、包衣、壓縮助劑、崩解劑、染料、潤膚劑、乳化劑、填充劑(稀釋劑)、成膜劑或包衣、調味劑、芳香劑、助流劑(流動增強劑)、潤滑劑、吸附劑、懸浮或分散劑或甜味劑。例示性賦形劑包括但不限於：丁基化羥基甲苯(BHT)、碳酸鈣、磷酸鈣(一氫)、硬脂酸鈣、交聯羧甲纖維素、交聯聚乙烯吡咯啶酮、檸檬酸、交聯聚維酮、半胱胺酸、乙基纖維素、明膠、羥基丙基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、乳糖、硬脂酸鎂、麥芽糖醇、甘露糖醇、甲硫胺酸、甲基纖維素、對羥基苯甲酸甲酯、微晶纖維素、聚乙二醇、聚維酮、預膠凝澱粉、對羥基苯甲酸丙酯、視黃醇棕櫚酸酯、蟲膠、二氧化矽、羧基甲基纖維素鈉、檸檬酸鈉、乙醇酸澱粉鈉、山梨糖醇、澱粉(玉米)、硬脂酸、硬脂酸、蔗糖、滑石、二氧化鈦、維他命A、維他命E、維他命C及木糖醇。
本文中之結合物可具有可離子化基團以便能夠呈醫藥學上可接受之鹽形式製備。此等鹽可為涉及無機或有機酸之酸加成鹽，或該等鹽在本文中之結合物的酸性形式之情況下可由無機或有機鹼製備。該等結合物經常地呈醫藥學上可接受之鹽形式經製備或使用，該等醫藥學上可接受之鹽呈醫藥學上可接受之酸或鹼的加成產物形式經製備。合適的醫藥學上可接受之酸及鹼為此項技術中熟知的，諸如用於形成酸加成鹽之鹽酸、硫酸、氫溴酸、乙酸、乳酸、檸檬酸或酒石酸，及用於形成鹼式鹽之氫氧化鉀、氫氧化鈉、氫氧化銨、咖啡因、多種胺及其類似物。用於製備適當鹽之方法為此項技術中充分確立的。
代表性酸加成鹽包括但不限於乙酸鹽、己二酸鹽、褐藻酸鹽、抗壞血酸鹽、天冬胺酸鹽、苯磺酸鹽、本甲酸鹽、硫酸氫鹽、硼酸鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、檸檬酸鹽、環戊烷丙酸鹽、二葡糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙烷磺酸鹽、反丁烯二酸鹽、葡庚糖酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、氫溴酸鹽、鹽酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基-乙烷磺酸鹽、乳糖酸鹽、乳酸鹽、月桂酸鹽、月桂基硫酸鹽、蘋果酸鹽、順丁烯二酸鹽、丙二酸鹽、己烷磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、菸鹼酸鹽、硝酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、雙羥萘酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、磷酸鹽、苦味酸鹽、特戊酸鹽、丙酸鹽、硬脂酸鹽、丁二酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽、十一烷酸鹽及戊酸鹽。代表性鹼金屬或鹼土金屬鹽包括但不限於鈉、鋰、鉀、鈣及鎂；以及無毒銨、四級銨及胺陽離子，包括但不限於銨、四甲基銨、四乙基銨、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺及乙胺。
視投與途徑及劑量而定，用於本文所述之方法中的本文中之結合物或其醫藥組合物將經調配成合適醫藥組合物以允許容易遞送。結合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-X)、(D’-I)、(M-I)-(M-X)或(M’-I)中任一者之結合物)或其醫藥組合物可經調配以肌肉內、靜脈內(例如，呈無菌溶液形式且在適用於靜脈內使用之溶劑系統中)、皮內、動脈內、腹膜內、病變內、顱內、關節內、前列腺內、胸膜內、氣管內、鼻內、玻璃體內、陰道內、直腸內、經表面、腫瘤內、經腹膜、皮下、結膜下、囊內、經黏膜、心包內、臍內、眼內、經口(例如，錠劑、膠囊、囊片、囊形片或糖漿)、經表面(例如，呈乳膏、凝膠、洗劑或軟膏形式)、經局部、藉由吸入、藉由注射或藉由輸注(例如，連續輸注、直接地浸泡標靶細胞之局部灌注、導管、灌洗、呈乳膏或脂質組合物形式)經投與。視投與途徑而定，本文中之結合物或其醫藥組合物可呈例如錠劑、膠囊、丸劑、散劑、顆粒劑、懸浮液、乳液、溶液、凝膠(包括水凝膠)、糊劑、軟膏、乳膏、膏藥、灌藥、滲透遞送器件、栓劑、灌腸劑、可注射劑、植入物、噴霧劑、適用於離子導入遞送之製劑或氣霧劑之形式。該等組合物可根據習知醫藥規範經調配。
本文所述之結合物可以此項技術中已知之多種方式經調配。關於用作人類及動物個體之治療，本文所述之結合物可經調配為醫藥或獸醫學組合物。視欲治療之個體(例如，人類)、投與模式及所需治療類型(例如，預防或療法)而定，本文所述之結合物係以與此等參數一致之方式經調配。該等技術之概述發現於Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第22版, Lippincott Williams & Wilkins (2012)；及Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, 第4版, J. Swarbrick及J. C. Boylan, Marcel Dekker, New York (2013)中，該等文獻各自以引用之方式倂入本文中。
調配物可以適用於全身性投與或表面或局部投與之方式經製備。全身性調配物包括經設計用於注射(例如，肌肉內、靜脈內或皮下注射)之彼等調配物，或可經製備用於經皮、經黏膜或經口投與。該調配物一般將包括稀釋劑以及在一些情況下佐劑、緩衝液及防腐劑。該等結合物亦可呈脂質體組合物形式或呈微乳液形式經投與。全身性投與亦可包括相對非侵襲性方法，諸如使用栓劑、經皮貼片、經黏膜遞送及鼻內投與。經口投與亦適用於本文中之結合物。合適形式包括糖漿、膠囊及錠劑，如此項技術中應理解。該等醫藥組合物可呈可注射調配物形式非經腸投與。用於注射之醫藥組合物可使用無菌溶液或任何醫藥學上可接受之液體作為媒劑經調配。調配物可經製備為適用於在注射之前溶解或懸浮於液體中之固體形式或經製備為乳液。醫藥學上可接受之媒劑包括但不限於無菌水、生理食鹽水及細胞培養基(例如，杜氏改良伊格爾培養基(DMEM)、α改良伊格爾培養基(α-MEM)、F-12培養基)。該等可注射組合物亦可含有一定量之無毒輔助物質，諸如濕潤或乳化劑、pH緩衝劑，諸如乙酸鈉及山梨醇酐單月桂酸酯。調配方法為此項技術中已知的，參見例如Pharmaceutical Preformulation and Formulation, 第2版, M. Gibson, Taylor & Francis Group, CRC Press (2009)。
該等醫藥組合物可呈經口調配物形式經製備。用於經口使用之調配物包括含有活性成分與無毒醫藥學上可接受之賦形劑的混合物之錠劑。此等賦形劑可為例如惰性稀釋劑或填充劑(例如，蔗糖、山梨糖醇、糖、甘露糖醇、微晶纖維素、包括馬鈴薯澱粉在內之澱粉、碳酸鈣、氯化鈉、乳糖、磷酸鈣、硫酸鈣或磷酸鈉)；造粒及崩解劑(例如，包括微晶纖維素在內之纖維素衍生物、包括馬鈴薯澱粉在內之澱粉、交聯羧甲纖維素鈉、褐藻酸鹽或褐藻酸)；黏合劑(例如，蔗糖、葡萄糖、山梨糖醇、阿拉伯膠、褐藻酸、褐藻酸鈉、明膠、澱粉、預膠凝澱粉、微晶纖維素、矽酸鎂鋁、羧基甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、乙基纖維素、聚乙烯吡咯啶酮或聚乙二醇)；及潤滑劑、助流劑及抗黏劑(例如，硬脂酸鎂、硬脂酸鋅、硬脂酸、矽石、氫化植物油或滑石)。用於經口使用之調配物亦可呈可咀嚼錠劑形式，或呈硬明膠膠囊形式，其中活性成分與惰性固體稀釋劑(例如，馬鈴薯澱粉、乳糖、微晶纖維素、碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土)混合，或呈軟明膠膠囊形式，其中活性成分與水或油介質(例如，花生油、液體石蠟或橄欖油)混合。散劑、顆粒劑及集結粒可使用上文關於錠劑及膠囊所提及之成分以習知方式使用例如混合器、流體床裝置或噴霧乾燥設備經製備。用於經口調配物之其他醫藥學上可接受之賦形劑包括但不限於著色劑、調味劑、增塑劑、保濕劑及緩衝劑。用於經口使用之調配物亦可呈可咀嚼錠劑形式，或呈硬明膠膠囊形式，其中活性成分與惰性固體稀釋劑(例如，馬鈴薯澱粉、乳糖、微晶纖維素、碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土)混合，或呈軟明膠膠囊形式，其中活性成分與水或油介質(例如，花生油、液體石蠟或橄欖油)混合。散劑、顆粒劑及集結粒可使用上文關於錠劑及膠囊所提及之成分以習知方式使用例如混合器、流體床裝置或噴霧乾燥設備經製備。
本文所述之結合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-X)、(D’-I)、(M-I)-(M-X)或(M’-I)中任一者之結合物)或其醫藥組合物的溶解或擴散控制釋放可藉由該結合物之錠劑、膠囊、集結粒或顆粒劑調配物之適當塗佈，或藉由將該結合物倂入至適當基質中來實現。控制釋放包衣可包括上文所提及之塗佈物質及/或例如蟲膠、蜂蠟、葡萄糖蠟、蓖麻蠟、巴西棕櫚蠟、硬脂醇、單硬脂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、硬脂酸棕櫚酸甘油酯、乙基纖維素、丙烯酸系樹脂、dl-聚乳酸、乙酸丁酸纖維素、聚氯乙烯、聚乙酸乙烯酯、乙烯基吡咯啶酮、聚乙烯、聚甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸甲酯、2-羥基甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯水凝膠、1,3丁二醇、乙二醇甲基丙烯酸酯及/或聚乙二醇中之一或多者。在控制釋放基質調配物中，基質材料亦可包括例如氫化甲基纖維素、巴西棕櫚蠟及硬脂醇、卡伯波934、矽酮、三硬脂酸甘油酯、丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯、聚乙烯及/或鹵代碳氟化合物。
該醫藥組合物可如所需呈單位劑型形成。包括於該等醫藥組合物中之活性組分(例如，本文所述之結合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-X)、(D’-I)、(M-I)-(M-X)或(M’-I))的量使得提供在指定範圍內之合適劑量(例如，在0.01-100 mg/kg體重範圍內之劑量)。IX. 投與途徑及劑量
在本文所述之任何方法中，本文中之結合物可藉由用於治療或提供保護以抵禦病毒感染(例如，流感感染)，或用於預防、穩定化或抑制病毒(例如，流感病毒)之增殖或擴散的任何適當途徑經投與。本文所述之結合物可用醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑或賦形劑投與至人類、家養寵物、家畜或其他動物。在一些實施例中，投與包括經肌肉內、靜脈內(例如，呈無菌溶液形式且在適用於靜脈內使用之溶劑系統中)、皮內、動脈內、腹膜內、病變內、顱內、關節內、前列腺內、胸膜內、氣管內、鼻內、玻璃體內、陰道內、直腸內、經表面、腫瘤內、經腹膜、皮下、結膜下、囊內、經黏膜、心包內、臍內、眼內、經口(例如，錠劑、膠囊、囊片、囊形片或糖漿)、經表面(例如，呈乳膏、凝膠、洗劑或軟膏形式)、經局部、藉由吸入、藉由注射或藉由輸注(例如，連續輸注、直接地浸泡標靶細胞之局部灌注、導管、灌洗、呈乳膏或脂質組合物形式)投與本文所述之結合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-X)、(D’-I)、(M-I)-(M-X)或(M’-I)中任一者之結合物)或組合物中任一者。在一些實施例中，若除了本文所述之結合物以外亦投與抗病毒劑，則該抗病毒劑或其醫藥組合物亦可以本文所述之投與途徑中任一者經投與。
本文所述之結合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-X)、(D’-I)、(M-I)-(M-X)或(M’-I)或其醫藥組合物之劑量取決於如下因素，包括投與途徑、欲治療之疾病(例如，病毒感染的程度及/或病狀)及物理特徵，例如個體之年齡、重量、一般健康狀況。典型地，含於單一劑量內之該結合物或其醫藥組合物之量可係有效地預防、延遲或治療病毒感染而不誘導顯著毒性之量。醫藥組合物可包括介於0.01至500 mg/kg範圍內(例如，0.01、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、150、200、250、300、350、400、450或500 mg/kg)且在一更特定實施例中介於約0.1至約30 mg/kg範圍內且在一更特定實施例中介於約1至約30 mg/kg範圍內之劑量的本文所述之結合物。在一些實施例中，當本文所述之結合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-X)、(D’-I)、(M-I)-(M-X)或(M’-I)中任一者之結合物)及抗病毒劑或抗病毒疫苗組合(例如，在同一或獨立醫藥組合物中實質上同時，或在同一治療方案中獨立地)經投與時，本文所述之結合物的所需劑量可低於若該結合物單獨用於治療方案中時該結合物之所需劑量。
本文所述之結合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-X)、(D’-I)、(M-I)-(M-X)或(M’-I)中任一者之結合物)或其醫藥組合物可例如每天、每週、每個月、每半年、每年一或多次(例如，1-10次或更多次；1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次)，或如醫學上必要時經投與至有需要之個體。劑量可以單一或多劑量方案經提供。投與之間的時間安排可在醫學病狀改良時減少，或在患者之健康狀況下降時增加。投與之劑量及頻率可由醫師根據諸如感染程度及個體之不同參數之習知因素經調適。實例
提出以下實例以便向一般技術者提供可如何使用、製備及評估本文所述之組合物及方法之描述，且不意欲僅例示本發明且不意欲限制被本發明者視為其發明之發明的範圍。實例 1 ：製備 Fc 構築體
藉由固相合成來合成構成蛋白構築體(SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、12及14)之胺基酸的逆轉譯。寡核苷酸模板經選殖至pcDNA3.1 (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)中之選殖位點BamHI及XhoI (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)處且包括源於人類介白素-2或人類白蛋白之信號序列。該等pcDNA3.1質體經轉型至Top10大腸桿菌細胞(LifeTech)中。使用PURELINK® HiPure Plasmid Filter Maxiprep套組(LifeTech)對DNA進行擴增，萃取，且純化。該質體DNA使用ExpiFectamine™ 293轉染套組(LifeTech)根據製造商之方案經遞送至HEK-293細胞中。細胞經離心，過濾，且使用MabSelect Sure Resin (GE Healthcare, Chicago, IL, USA)純化上清液。經純化分子使用4-12% Bis Tris SDS PAGE凝膠藉由將1-2 µg每種分子裝載至該凝膠中且使用instant Blue染色進行染色而經分析。各凝膠包括具有經指示分子量標準之分子量梯(圖2-8)。經還原及非還原泳道由「R」及「NR」表示。圖2-8分別顯示由具有SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、12及14之序列的Fc域單體形成之Fc域之非還原及還原SDS-PAGE。實例 2. 合成紮那米韋中間物
Figure 02_image1493
步驟 a.
Figure 02_image1495
5-乙醯胺基-7,8,9-O-三乙醯基-2,6-無水-4-疊氮基-3,4,5-三去氧-D-甘油-D-半乳-壬-2-烯酸甲酯(4.56 g，10.0 mmol)溶解於無水THF (15 mL)中，且該溶液經冷卻至大約13℃。經20分鐘分成數份添加三苯膦(2.89 g，11 mmol)。所得混合物在大約13℃至室溫下經攪拌持續2小時，接著逐滴添加LiOH (24 mg，1 mmol)於水(1.5 mL)中之溶液。在攪拌持續28小時之後，向反應混合物中添加N,N'-雙-boc-1-脒基吡唑(3.26 g，10.5 mmol)及4-二甲基胺基吡啶(244.4 mg，2 mmol)。該反應攪拌持續1.5天。其接著用乙酸乙酯:己烷之1:1混合物(100 mL)稀釋且用水(30 mL)萃取。水層用乙酸乙酯(30 mL)反萃取。經組合之有機層藉由旋轉蒸發經濃縮。殘餘物經由C18逆相管柱層析法(150 g，25至70%乙腈及水)經純化。所收集之溶離份在室溫下藉由旋轉蒸發經濃縮。產生渾濁水溶液且大部分產物呈凝膠形式沉積於燒瓶上。該溶液接著用乙酸乙酯(150 mL)萃取。有機層用於再溶解凝膠材料。其接著經Na2 SO4 乾燥，藉由旋轉蒸發經濃縮，且進一步在高真空下乾燥以提供呈白色泡沫狀之標題化合物。產量6.24 g，92.8%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 673.2。步驟 b.
Figure 02_image1497
來自步驟-a之產物(6.24 g，9.28 mmol)於無水MeOH (20 mL)中之溶液在冰水浴中冷卻且緩慢地添加甲醇鈉於MeOH中之0.5 M溶液(26 mL，13 mmol)。該反應攪拌持續1小時，接著藉由逐滴添加HCl於二噁烷(3 mL)中之4 N溶液小心地將其pH調節至7至7.5。在不高於室溫之溫度下藉由旋轉蒸發移除溶劑。殘餘物用乙酸乙酯及己烷之2:1混合物(150 mL)稀釋，且所得溶液用水(20 mL)萃取。水層用乙酸乙酯(30 mL)反萃取。經組合之有機層經Na2 SO4 乾燥，藉由旋轉蒸發經濃縮，且進一步在高真空下乾燥。產物無需進一步純化繼續用於後續步驟。產量5.03 g，99.2%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 547.2。步驟 c.
Figure 02_image1499
無水DCM (6 mL)中之步驟-b產物(713 mg，1.3 mmol)在冰水浴中冷卻且添加4-二甲基胺基吡啶(159.8 mg，1.3 mmol)及DIPEA (520 mg，4 mmol)。接著向該混合物中逐滴添加氯甲酸4-硝基苯酯(356.6 mg，2.2 mmol)於無水DCM (2 mL)中之溶液。接著移除冰水浴，且該反應混合物攪拌持續3小時且藉由LCMS進行監測(需要時可添加額外氯甲酸4-硝基苯酯)。在該反應完成之後，其用水(10 mL)淬滅，且有機層經萃取且藉由旋轉蒸發經濃縮。殘餘物藉由C18逆相管柱層析法(100 g，20至70%乙腈及水)經純化。所收集之溶離份中的乙腈在室溫下藉由旋轉蒸發經移除。水層接著用乙酸乙酯及己烷之1:1混合物(120 mL)萃取。水層用乙酸乙酯(30 mL)反萃取。經組合之有機層經Na2 SO4 乾燥，藉由旋轉蒸發經濃縮，且進一步在高真空下乾燥以提供呈白色固體狀之標題化合物。產量520 mg，70%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 573.2。實例 3. 合成連接體 -1
Figure 02_image1501
步驟 a.
Figure 02_image1503
經25分鐘分成數份向Z-D-麩胺酸γ-甲酯(2.0 g，6.77 mmol)及甘胺酸甲酯HCl (1.282 g，10.2 mmol)於無水DMF (7 mL)中之混合物中相繼添加DIPEA (2.02 g，15.57 mmol)、HATU (2.66 g，7.0 mmol)。在HATU溶解之後，添加額外量之DIPEA (1.15 g，8.8 mmol)。該反應混合物攪拌持續1.5小時，接著用5% HCl水溶液(100 mL)及EtOAc (100 mL × 2)萃取。有機層藉由旋轉蒸發經濃縮。殘餘物用水(100 mL)及EtOAc/己烷(2:1，150 mL)再萃取。有機層經Na2 SO4 乾燥，藉由旋轉蒸發經濃縮且進一步在高真空下乾燥為白色固體。粗產物無需進一步純化繼續用於後續步驟。產量2.3 g，93%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 367。步驟 b.
Figure 02_image1505
步驟-a產物(2.3 g，6.29 mmol)溶解於MeOH及THF之1:1混合物(10 mL)中。在該溶液在冰水浴中冷卻之後，經1.5小時分成數份添加水(9 mL)中之LiOH單水合物(630 mg，15 mmol)溶液。再攪拌持續2小時之後，該反應混合物用二噁烷(3.7 mL)中之4N HCl中和。有機溶劑在室溫下藉由旋轉蒸發部分地經移除。剩餘材料直接地藉由RPLC (150 g，0至39%乙腈及水)經純化。經兩個步驟，產量2.03 g，88.7%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 339.2。步驟 c.
Figure 02_image1507
藉助於注射泵以11 mL/h之速率向步驟-b產物(1.41 g，4.17 mmol)及N-Boc-1,6-二胺基己烷(1.99 g，9.2 mmol)於無水DMF (6 mL)及DIPEA (1.3 g，10 mmol)中之混合物中添加HATU (3.5 g，9.2 mmol)於DMF (10 mL)中之溶液。在HATU完成添加時，該反應再攪拌持續30分鐘且直接地藉由RPLC (150 g，10至50%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量1.3 g，42.4%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 735, [M – Boc + H]+ = 635.4。步驟 d.
Figure 02_image1509
步驟-c產物(1.3 g，1.77 mmol)溶解於MeOH (20 mL)中，且Pd/C添加至該溶液中。該混合物在氫氣下攪拌持續4小時。濾出Pd/C，且濾液藉由旋轉蒸發經濃縮且進一步在高真空下乾燥。產量1.03 g，96.9%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 601。步驟 e.
Figure 02_image1511
經火焰乾燥之反應燒瓶用氮氣沖洗且饋入4-疊氮基丁酸(77 mg，0.6 mmol)、N-羥基丁二醯亞胺(92 mg，0.8 mmol)及無水DMF (0.5 mL)。該混合物經攪拌以溶解固體，且接著添加DCC (125.5 mg，0.608 mmol)。在攪拌持續一小時之後，步驟-d產物(300 mg，0.5 mmol)添加至該反應混合物中。該反應經攪拌持續6小時且直接地使用RPLC (150 g，10至70%乙腈及水，使用01.% TFA作為修飾劑)經純化。所收集之溶離份經凍乾為白色固體(LCMS：[M + H]+ = 712, [M – Boc + H]+ = 612)。該材料再溶解於DCM (約2 mL)及TFA (約1 mL)中且攪拌持續15分鐘。其接著藉由旋轉蒸發經濃縮，且殘餘物藉由RPLC (50 g，0至40%乙腈及水)經純化。產量255 mg，68. 9%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 512, [(M + 2H)/2]+ = 256。實例 4. 合成 Int-1
Figure 02_image1513
步驟 a.
Figure 02_image1515
向紮那米韋中間物(實例2) (532.5 mg，0.93 mmol)於無水THF (2 mL)中之溶液中相繼添加DMAP (490 mg，4 mmol)、碳酸雙(五氟苯基)酯(385 mg，0.911 mmol)。在攪拌隔夜之後，連接體-1 (實例3) (245.6 mg，0.332 mmol)於無水DMF (1 mL)及DIPEA (91 mg，0.3 mmol)中之溶液添加至該反應混合物中。該反應繼續進行2小時，接著藉由RPLC (100 g，5至67%乙腈及水)經純化。產量135 mg，23.8%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 845.9。步驟 b.
Figure 02_image1517
步驟-a產物(135 mg，0.079 mmol)溶解於TFA (0.5 mL)中，且該溶液在室溫下攪拌持續20分鐘。其接著直接地藉由RPLC (50 g，5至32%乙腈及水)經純化。產量88 mg，85.1%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 654.8。步驟 c.
Figure 02_image1519
步驟-b產物(88 mg，0.0673 mmol)於MeOH (1.5 mL)中之溶液在冰水浴中冷卻且添加水(0.5 mL)中之LiOH (5 mg，0.2 mmol)。在該混合物攪拌持續5小時之後，其用二噁烷(0.1 mL)中之4N HCl溶液酸化且藉由HPLC (5至20%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量76.4 mg，78%。藉由LCM發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 614.8。實例 5. 合成連接體 -2
Figure 02_image1521
步驟 a.
Figure 02_image1523
向炔丙基-PEG4-酸(364.4 mg，1.4 mmol)於無水DMF (2 mL)中之溶液中添加HATU (558.9 mg，1.47 mmol)。在攪拌以溶解所有偶合試劑之後，添加DIPEA (390 mg，3 mmol)且攪拌持續10分鐘。添加連接體-1步驟-d產物(實例3，步驟d) (701.1 mg，1.167 mmol)於無水DMF (1 mL)中之溶液。所得混合物經攪拌持續30小時且直接地藉由RPLC (100 g，5至60%乙腈及水)經純化。產量830 mg，84.4%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 843。步驟 b.
Figure 02_image1525
步驟-a產物溶解於THF (5 mL)中且用二噁烷(2.5 mL)中之4N HCl溶液處理。在室溫下攪拌隔夜之後，該反應混合物藉由旋轉蒸發經濃縮。殘餘物再溶解於乙腈/水(1:1，16 mL)中，且該溶液經凍乾。粗產物無需進一步純化繼續用於後續步驟。產量761.8 mg，100%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 643.8。實例 6. 合成 Int-2
Figure 02_image1527
步驟 a.
Figure 02_image1529
經火焰乾燥之反應燒瓶用氮氣沖洗且饋入紮那米韋中間物(實例2) (533.6 mg，0.812 mmol)、DMAP (99.8 mg，0.81 mmol)及無水DCM (1 mL)。在攪拌以溶解起始材料之後，該溶液在冰水浴中冷卻且添加氯甲酸4-硝基苯酯(242 mg，1.2 mmol)。所得混合物經攪拌持續5小時，接著添加至連接體-2 (實例5) (228.4 mg，0.319 mmol)於無水DMF (1 mL)及DIPEA (130 mg，1 mmol)中之溶液中。該反應經攪拌隔夜且藉由RPLC (150 g，20至65%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。所收集之溶離份經凍乾。產量178.3 mg，30.4%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 920.5, [(M + 3H)/3]+ = 614.2。步驟 b.
Figure 02_image1531
步驟-a產物(178.3 mg，0.0969 mmol)溶解於TFA (0.5 mL)中。該反應經攪拌持續20分鐘，接著直接地藉由HPLC (0至25%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量91.8 mg，56.8%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 720.4, [(M + 3H)/3]+ = 480.6。步驟 c.
Figure 02_image1533
步驟-b產物(91.8 mg，0.055 mmol)溶解於MeOH (1 mL)中，且該溶液在冰水浴中冷卻。經1小時分成數份添加水(1 mL)中之LiOH單水合物(21 mg，0.5 mmol)。再攪拌持續2小時之後，該反應混合物用二噁烷(0.3 mL)中之4N HCl溶液酸化且藉由HPLC (0至20%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量36.2 mg，59.4%.%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 680.3, [(M + 3H)/3]+ = 454.0。實例 7. 合成 h-IgG1 Fc-PEG4- 疊氮化物
PEG4-疊氮基NHS酯(98%，180 μmol，9.5當量，71.4 mg於0.5 mL DMF中且用pH 7.4 PBS 1x緩衝溶液稀釋至3.60 mL)添加至h-IgG1 Fc (SEQ ID NO: 4)之溶液(1103 mg於70.0 mL pH 7.4 PBS中，MW~58,000 Da，19.0 μmol)中且該混合物在環境溫度下輕柔地震盪持續12小時。該溶液使用離心濃縮機(30,000 MWCO)經濃縮至約1.5 mL之體積。粗混合物1:10稀釋於PBS pH 7.4中，且再次經濃縮。重複此洗滌程序，共計三次。用此洗滌程序移除小分子試劑。經濃縮Fc-PEG4-疊氮化物用pH 7.4 PBS 1x緩衝液稀釋至70.0 mL且準備用於點擊結合。經純化材料使用Nanodrop™ UV可見光光譜儀(使用基於h-IgG1之胺基酸序列計算的消光係數)經定量。產率係在純化之後定量的。藉由MALDI測定，DAR = 4.3。DAR值可藉由以接近線性關係改變PEG4-疊氮基NHS酯之當量數經調節。例如，當使用7.0當量之PEG4-疊氮化物NHS酯時，DAR值將為3.0。實例 8. 合成重組小鼠血清白蛋白 (MSA)-PEG4- 疊氮化物
PEG4-疊氮基NHS酯(98%，81.7 μmol，4.5當量，32.4 mg於0.3 mL DMF中且用pH 7.4 PBS 1x緩衝溶液稀釋至1.63 mL)添加至重組小鼠血清白蛋白(SEQ ID NO: 71)之溶液(1200 mg於75.0 mL pH 7.4 PBS中，MW~66,000 Da，18.2 μmol)中且該混合物在環境溫度下輕柔地震盪持續12小時。該溶液使用離心濃縮機(30,000 MWCO)經濃縮至約1.5 mL之體積。粗混合物1:10稀釋於PBS pH 7.4中，且再次經濃縮。重複此洗滌程序，共計三次。用此洗滌程序移除小分子試劑。經濃縮MSA-PEG4-疊氮化物用pH 7.4 PBS 1x緩衝液稀釋至75.0 mL且準備用於點擊結合。經純化材料使用Nanodrop™ UV可見光光譜儀(使用基於h-IgG1之胺基酸序列計算的消光係數)經定量。產率係在純化之後定量的。藉由MALDI測定，DAR = 3.5。DAR值可藉由類似於h-IgG1 Fc (實例7)改變PEG4-疊氮基NHS酯之當量數經調節。實例 9. 合成結合物 1
h-IgG1 Fc-PEG4-疊氮化物(實例7) (50 mg，2.815 mL，0.8591 µmol)之PBS溶液添加至含有Int-2 (實例6) (35.2 mg，0.02217 mmol)之15 mL離心管中。在輕柔地震盪該混合物以溶解所有Int-2之後，添加344 µl L-抗壞血酸鈉(59.4 mg，0.3 mmol)、硫酸銅(II) (10 mg，0.05 mmol)及THPTA (23 mg，0.05 mmol)於PBS 7.4緩衝液(1 mL)中之溶液。所得混合物輕柔地震盪隔夜。其相繼藉由在蛋白A管柱上之親和力層析法、如實例8所述之尺寸排阻層析法經純化。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出63797 Da之平均質量(DAR = 3.4)。產量27.39 mg，55%產率。圖9顯示結合物1之非還原SDS-PAGE。實例 10. 純化結合物
粗混合物1:10稀釋於PBS pH 7.4中，且相繼使用MabSelect Sure Resin (GE Healthcare, Chicago, IL, USA)、尺寸排阻層析法(HiLoad 26/600 Superdex200 pg, GE Healthcare, Chicago, IL, USA)經純化。彙集含有經純化結合物之溶離份且使用離心濃縮機(30,000 MWCO)經濃縮至大約20 mg/mL。經純化材料使用Nanodrop™ UV可見光光譜儀使用基於hIgG1 Fc(myc)之胺基酸序列計算的消光係數經定量。經純化分子使用4-12% Bis Tris SDS PAGE凝膠藉由將1 µg每種分子裝載至該凝膠中且使用Instant Blue (Expedeon, San Diego, CA, USA)進行染色而經分析。各凝膠包括具有經指示分子量標準之分子量梯。藉由Agilent Analytical HPLC計算產量且測定純度。藉由Maldi MS發現產物峰及MW且計算最終DAR。實例 11. 合成 Int-3
Figure 02_image1535
步驟 a.
Figure 02_image1537
向炔丙基-PEG4-酸(260 mg，1 mmol)及HATU (380.2 mg，1 mmol)於無水DMF (1 mL)中之溶液中添加DIPEA (130 mg)。在攪拌5分鐘之後，添加NH-雙(PEG3-Boc) (500 mg，0.881 mmol)且在室溫下繼續攪拌隔夜。其接著直接地藉由RPLC 9100 g，5至50%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量683 mg，95.8%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 810.4, [M - Boc + H]+ = 710.4, [(M - 2Boc + 2H)/2]+ = 305.8。步驟 b.
Figure 02_image1539
步驟-a產物溶解於TFA (1 mL)中。該溶液經攪拌持續2小時且接著直接地經由RPLC (100 g，0至30%乙腈及水)經純化。產量589 mg，98.7%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 305.8。步驟 c.
Figure 02_image1541
經火焰乾燥之反應燒瓶用氮氣沖洗且饋入紮那米韋中間物(實例2) (572 mg，1 mmol)及無水DCM (1 mL)。在攪拌以溶解起始材料之後，該溶液在冰水浴中冷卻且相繼添加氯甲酸4-硝基苯酯(302.4 mg，1.5 mmol)、DMAP (22.4 mg，0.2 mmol)。所得混合物經攪拌持續5小時，接著添加淬滅水(0.2 mL)。在攪拌持續10分鐘之後，添加無水DMF (1 mL)及DIPEA (163.8 mg，1.26 mmol)中之步驟-b產物(256.7 mg，0.355 mmol)。繼續攪拌持續2小時且接著該反應直接地藉由RPLC (150 g，20至65%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。所收集之溶離份經凍乾。所需產物之產量422.8 mg，其受到一些雜質污染，＜69%產率。該材料無需進一步純化繼續用於後續步驟。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 903.9, [(M + 3H)/3]+ = 603.2。步驟 d.
Figure 02_image1543
步驟-c產物(422.8 mg，＜ 0.245 mmol)溶解於TFA (1 mL)中。該反應經攪拌持續20分鐘，接著直接地藉由HPLC (5至25%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。經兩個步驟，產量169.7 mg，29.2%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 704.0, [(M + 3H)/3]+ = 469.6。步驟 e.
Figure 02_image1545
步驟-d產物(169.7 mg，0.0923 mmol)溶解於MeOH (1.5 mL)中，且該溶液在冰水浴中冷卻。經1小時分成數份添加水(1 mL)中之LiOH單水合物(21 mg，0.5 mmol)。在攪拌隔夜之後，該反應混合物用Dowex 50W x 8氫型酸化且經由RPLC (0至30%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量107.9 mg，66.9%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 663.8, [(M + 3H)/3]+ = 442.9。實例 12. 合成結合物 2
類似於結合物1 (實例9)使用Int-3 (實例11)製備標題結合物。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出63561 Da之平均質量(DAR = 3.3)。產量43.4 mg，43%產率。圖10顯示結合物2之非還原SDS-PAGE。實例 13. 合成 Int-4
Figure 02_image1547
步驟 a.
Figure 02_image1549
經火焰乾燥之反應燒瓶用氮氣沖洗且饋入紮那米韋中間物(實例2) (343.2 mg，0.6 mmol)及無水DCM (1.5 mL)。該溶液在冰水浴中冷卻且相繼添加DIPEA (234 mg，1.8 mmol)、氯甲酸4-硝基苯酯(121 mg，0.6 mmol)及DMAP (67.4 mg，0.6 mmol)。所得混合物經攪拌持續15分鐘，接著添加額外量之氯甲酸4-硝基苯酯(121 mg，0.6 mmol)。在攪拌持續2小時之後，添加水(0.2 mL)以淬滅未反應之氯甲酸酯。在攪拌持續10分鐘之後，向該反應混合物中添加炔丙基-PEG4-胺(185 mg，0.8 mmol)於無水DMF (0.5 mL)中之溶液。該反應繼續進行1小時且接著直接地經由RPLC (100 g，5至60%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。所收集之溶離份經凍乾。產量355 mg，71.3%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 830.2。步驟 b.
Figure 02_image1551
步驟-a產物(355 mg，0.428 mmol)溶解於TFA (1 mL)中。該反應經攪拌隔夜，接著直接地藉由RPLC (5至25%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。經兩個步驟，產量260.2 mg，70.9%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 630.2。步驟 c.
Figure 02_image1553
步驟-b產物(260.2mg, 0.303 mmol)溶解於MeOH (1.5 mL)中。在該溶液在冰水浴中冷卻之後，經1小時分成數份添加LiOH單水合物(42 mg，1 mmol)於水(1 mL)中之溶液。該反應經攪拌隔夜，接著用Dowex 50W x 8氫型酸化且藉由RPLC (0至50%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量78.1 mg，99%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 590.2。實例 14. 合成結合物 3
類似於結合物1 (實例9)使用Int-4 (實例13)製備標題結合物。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出61182 Da之平均質量(DAR = 3.4)。產量50.89 mg，51%產率。圖11顯示結合物3之非還原SDS-PAGE。實例 15. 合成 Int-5
Figure 02_image1555
步驟 a.
Figure 02_image1557
經火焰乾燥之反應燒瓶用氮氣沖洗且饋入3-((S)-1-乙醯胺基-2-乙基丁基)-4-(第三丁氧羰基胺基)-2-羥基環戊烷甲酸(1S, 2S, 3R, 4R)-甲酯(320.4 mg，0.8 mmol)及無水DCM (2 mL)。該溶液在冰水浴中冷卻且相繼添加DIPEA (312 mg，2.4 mmol)、氯甲酸4-硝基苯酯(161.3 mg，0.8 mmol)及DMAP (98 mg，0.8 mmol)。所得混合物經攪拌持續15分鐘，接著添加額外量之氯甲酸4-硝基苯酯(161.3 mg，0.8 mmol)。該反應經攪拌持續2小時，接著添加水(0.2 mL)以淬滅未反應之氯甲酸酯。在攪拌持續10分鐘之後，添加炔丙基-PEG4-胺(259 mg，1.12 mmol)於無水DMF (0.5 mL)中之溶液。該反應經攪拌持續1小時且接著直接地藉由RPLC (100 g，5至60%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。所收集之溶離份經凍乾。產量391.2 mg，74.4%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 658.3, [M – Boc + H]+ = 558.3。步驟 b.
Figure 02_image1559
步驟-a產物(391.2 mg，0.595 mmol)溶解於TFA (0.8 mL)中，且該溶液在室溫下攪拌持續20分鐘。其接著直接地藉由RPLC (100 g，5至60%乙腈及水)經純化。產量323.2 mg，81%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 558.3。步驟 c.
Figure 02_image1561
向步驟-b產物(323.2 mg，0.482 mmol)於THF (2 mL)中之溶液中添加N,N’-雙-Boc-1-脒基吡唑(224.4 mg，0.723 mmol)及PIPEA (260 mg，2 mmol)。該反應混合物經攪拌持續1天且接著用水(3 mL)及EtOAc/己烷(1:1，8 mL)萃取。有機層經Na2 SO4 乾燥且藉由旋轉蒸發經濃縮。殘餘物再溶解於TFA (約1 mL)中，且該溶液經攪拌隔夜。其接著直接地藉由RPLC (100 g，0至30%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。所收集之溶離份經凍乾。產量254.2 mg，83.2%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 600.3, [M – Boc + H]+ = 300.6。步驟 d.
Figure 02_image1563
步驟-c產物(254.2mg, 0.356 mmol)溶解於THF (1.5 mL)中，且該溶液在冰水浴中冷卻。添加CaCl2 二水合物(419 mg，2.85 mmol)，接著經1小時分成數份添加水(2 mL)中之1.8 mL KOH (112 mg，2 mmol)。再攪拌持續3小時之後，該反應混合物藉由Dowex 50W x 8氫型酸化且藉由RPLC (0至30%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量102 mg，49.8%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 586.4, [(M + 2H)/2]+ = 293.8。實例 16. 合成結合物 4
類似於結合物1 (實例9)使用Int-5 (實例15)製備標題結合物。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出63002 Da之平均質量(DAR = 3.4)。產量49.315 mg，49%產率。圖12顯示結合物4之非還原SDS-PAGE。實例 17. 合成 Int-6
Figure 02_image1565
步驟 a.
Figure 02_image1567
經火焰乾燥之反應燒瓶用氮氣沖洗且饋入3-((S)-1-乙醯胺基-2-乙基丁基)-4-(第三丁氧羰基胺基)-2-羥基環戊烷甲酸(1S, 2S, 3R, 4R)-甲酯(280.4 mg，0.7 mmol)及無水DCM (1 mL)。在攪拌以溶解起始材料之後，DMAP (85.7 mg，0.7 mmol)、碳酸雙(五氟苯基)酯(295.6 mg，0.75 mmol)相繼添加至該溶液中。所得混合物經攪拌持續1小時，接著添加至連接體-2 (實例5) (157.5 mg，0.22 mmol)於無水DMF (1 mL)及DIPEA (130 mg，1 mmol)中之溶液中。該反應經攪拌隔夜且藉由RPLC (50 g，5至90%乙腈及水)經純化。所收集之溶離份經凍乾。產量134.1 mg，40.7%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 748.6。步驟 b.
Figure 02_image1569
步驟-a產物(134.1 mg，0.0896 mmol)溶解於TFA (0.5 mL)中。該溶液經攪拌持續20分鐘，接著直接地藉由RPLC (50 g，5至60%乙腈及水)經純化。產量108.4 mg，93.4%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 648.3, [(M + 3H)/3]+ = 432.8。步驟 c.
Figure 02_image1571
向步驟-b產物(108.4 mg，0.0837 mmol)於無水THF (1 mL)中之溶液中添加N,N’-雙-Boc-1-脒基吡唑(81.3 mg，0.285 mmol)及DIEPA (65 mg，0.5 mmol)。該反應在室溫下經攪拌持續2.5天，接著直接地藉由RPLC (100 g，40至75%乙腈及水)經純化。產量73.6 mg，49.4%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 3H)/3]+ = 594.2。步驟 d.
Figure 02_image1573
步驟-c產物(73.6 mg，0.041 mmol)溶解於TFA (0.5 mL)中。該溶液經攪拌持續20分鐘，接著直接地藉由RPLC (50 g，5至60%乙腈及水)經純化。產量62.1 mg，94.1%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 690.4, [(M + 3H)/3]+ = 460.8。步驟 e.
Figure 02_image1575
THF (3 mL)中之步驟-d產物(62.1 mg，0.0386 mmol)在冰水浴中冷卻且經1小時分成數份添加45% w/w KOH溶液(0.2 mL)。該反應再攪拌持續2小時，接著用二噁烷(0.8 mL)中之4N HCl溶液酸化且用己烷(10 mL)及水(1.5 mL)萃取。水層藉由HPLC (0至20%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量36.2 mg，59.4%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 676.5, [(M + 3H)/3]+ = 451.4。實例 18. 合成結合物 5
類似於結合物1 (實例9)使用Int-6 (實例17)製備標題結合物。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出63561 Da之平均質量(DAR = 3.3)。產量43.4 mg，43%產率。圖13顯示結合物5之非還原SDS-PAGE。實例 19. 合成 Int-7
Figure 02_image1577
步驟 a.
Figure 02_image1579
經5分鐘分成數份向炔丙基-PEG4-酸(609 mg，2.34 mmol)及NH-雙(PEG1-疊氮化物) (500 mg，2.055 mmol)於無水DMF (2 mL)中之溶液中添加HATU (889.7 mg，2.34 mmol)。在攪拌以溶解所有偶合試劑之後，添加DIPEA (390 mg，3 mmol)且繼續攪拌持續1小時。其接著直接地藉由RPLC (100 g，5至40%乙腈及水)經純化。產量918 mg，92%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 486.2。步驟 b.
Figure 02_image1581
步驟-a產物(918 mg，1.89 mmol)溶解於THF中，且該溶液經冷卻至約13℃。經10分鐘分成數份添加三苯膦(1.141 g，4.35 mmol)。所得混合物在約13℃至室溫下經攪拌持續2小時。添加LiOH單水合物(42 mg，1 mmol)於水(2 mL)及MeOH (1 mL)中之溶液。在繼續攪拌持續20小時之後，該反應藉由RPLC (100 g，0至30%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量825 mg，65.9%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 434.4。步驟 c.
Figure 02_image1583
經火焰乾燥之反應燒瓶用氮氣沖洗且饋入紮那米韋中間物(實例2) (865 mg，1.51 mmol)及無水DCM (5 mL)。在攪拌以溶解起始材料之後，該溶液在冰水浴中冷卻且相繼添加氯甲酸4-硝基苯酯(365.3 mg，1.81 mmol)、DMAP (152.2 mg，0.755 mmol)。移除冰水浴，且該混合物經攪拌持續3小時。添加額外量之氯甲酸4-硝基苯酯(304.4 mg，1.51 mmol)，且繼續攪拌持續1小時。該反應接著用水(1 mL)淬滅。在劇烈攪拌持續1小時之後，該反應混合物用水(20 mL × 2)及DCM (20 mL)萃取。有機層經攪拌隔夜，經Na2 SO4 乾燥且藉由旋轉蒸發經濃縮。該材料無需進一步純化繼續用於後續步驟。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 738.2。步驟 d.
Figure 02_image1585
步驟-b產物(429.7 mg，0.65 mmol)及DIPEA (260 mg，2 mmol)於無水THF (1 mL)中之溶液逐滴添加至步驟-c產物中。所得混合物經攪拌持續2小時，接著直接地藉由RPLC (100 g，10至65%乙腈及水)經純化。所收集之溶離份中的乙腈在室溫下藉由旋轉蒸發經移除。異質水層用EtOAc (200 mL)萃取，接著用EtOAc (50 mL)反萃取。經組合之有機層經Na2 SO4 乾燥且藉由旋轉蒸發經濃縮至乾。產量442 mg，41.7%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 815.8, [(M - Boc + 2H)/2]+ = 765.8, [(M - 2Boc + 2H)/2]+ = 716。步驟 e.
Figure 02_image1587
步驟-d產物(441 mg，0.271 mmol)溶解於TFA (1 mL)中。該反應經攪拌持續20分鐘，接著直接地藉由HPLC (5至20%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量308 mg，77.9%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 615.8, [(M + 3H)/3]+ = 411。步驟 f.
Figure 02_image1589
步驟-e產物(308 mg，0.211 mmol)溶解於MeOH (1 mL)及水(0.5 mL)中，且該溶液在冰水浴中冷卻。經1小時分成數份添加LiOH單水合物(42 mg，1 mmol)於水(1 mL)中之溶液。該反應經攪拌隔夜，藉由二噁烷(0.25 mL)中之4 N HCl溶液酸化，且藉由RPLC (0至20%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量198 mg，64%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 575.8, [(M + 3H)/3]+ = 384.2。實例 20. 合成結合物 6
類似於結合物1 (實例9)使用Int-7 (實例19)製備標題結合物。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出62854. Da之平均質量(DAR = 3.1)。產量175.4 mg，50%產率。圖14顯示結合物6之非還原SDS-PAGE。實例 21. 合成 Int-8
Figure 02_image1591
步驟 a.
Figure 02_image1593
5-乙醯胺基-7,8,9-O-三乙醯基-2,6-無水-4-疊氮基-3,4,5-三去氧-D-甘油-D-半乳-壬-2-烯酸甲酯(1.8 g，4.0 mmol)溶解於40 mL甲醇中且接著用400 mg 5% Pd/C及1.1 g Boc酐(5.0 mmol)處理，接著該反應混合物在室溫下在氫氣氛圍下經攪拌持續1小時。藉由過濾移除鈀-木炭。濾液經濃縮且無需純化即用於下一步驟。步驟 b.
Figure 02_image1595
來自前一步驟之產物溶解於20 mL無水甲醇中且接著在冰水浴中冷卻下用2 mL甲醇中之甲醇鈉(0.5 M)逐滴處理。2小時之後，藉由LCMS測定反應之進展。該反應用1N HCl淬滅至pH 5-6。所得溶液經濃縮且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以5%至100%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀使用0.1% TFA作為修飾劑經純化。藉由LCMS發現之離子：(M+H)+ =405步驟 c.
Figure 02_image1597
5-乙醯胺基-2,6-無水-4-[(第三丁氧羰基)胺基]-3,4,5-三去氧-D-赤式-壬-2-烯酸甲酯(0.4 g，1 mmol)溶解於10 mL丙酮、4 mL 2,2-二甲氧基丙烷及20 mg對甲苯磺酸水合物(0.1 mmol)中。所得溶液在室溫下攪拌隔夜，接著用1 mL飽和NaHCO3 淬滅。該混合物經濃縮且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以5%至100%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀不使用修飾劑經純化。藉由LCMS發現之離子：(M+H)+ =445。步驟 d.
Figure 02_image1599
氫化鈉(40 mg，60%於油中，1.0 mmol)在冰水浴冷卻下添加至5 mL無水THF中之5-乙醯胺基-2,6-無水-4-[(第三丁氧羰基)胺基]-3,4,5-三去氧-8,9-O-(1-甲基亞乙基)-D-赤式-壬-2-烯酸甲酯(0.25 g，0.50 mmol)中。所得溶液經攪拌持續0.5小時，接著添加溴乙酸苯甲酯(0.23 g，1.0 mmol)。所得溶液經攪拌持續2小時且用5 mL水中之10%氯化銨淬滅。接著，該溶液用50 mL乙酸乙酯稀釋。分離有機層且經硫酸鈉乾燥。經乾燥之有機溶液經濃縮且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以5%至100%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀不使用修飾劑經純化。藉由LCMS發現之離子：(M+H)+ =593。實例 22. 合成 Int-9
Figure 02_image1601
步驟 a.
Figure 02_image1593
5-乙醯胺基-7,8,9-O-三乙醯基-2,6-無水-4-疊氮基-3,4,5-三去氧-D-甘油-D-半乳-壬-2-烯酸甲酯(10 g，22 mmol)溶解於100 ml甲醇中且接著用油浴加熱至60℃，SnCl2 (5.7 g，20 mmol)分成3份添加至該溶液中(小心，氣體釋出)。該反應混合物經攪拌持續10 min，此時藉由HPLC發現反應完成。該反應溶液在劇烈攪拌下緩慢地添加至50 ml飽和NaHCO3 溶液及50 g矽藻土之溶液中。過濾所得漿液。濾液經Boc2 O (6.6 g，30 mmol，1.5 eq)處理。在室溫下2小時之後，該溶液經濃縮以移除大部分甲醇，溶解於200 ml DCM中，且用100 ml DCM萃取兩次。經組合之萃取物經硫酸鈉乾燥，過濾且無需進一步純化即用於下一步驟中。粗物質產量12 g，100%。藉由LCMS發現之離子：M+H =531。步驟 b.
Figure 02_image1595
來自前一步驟之材料溶解於60 ml無水甲醇中，接著在冰水浴中冷卻下用10 ml甲醇中之甲醇鈉(0.5 M)處理。藉由LCMS監測反應之進展，其在2 h之後完成。該反應用1N HCl淬滅至pH 5-6。所得溶液經濃縮且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以0%至30%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀使用0.1% TFA作為修飾劑經純化。產物之產量7.2 g，80%。藉由LCMS發現之離子：M+H =405。步驟 c.
Figure 02_image1605
前一步驟之產物之溶液(3.5 g，8.5 mmol)、CDI (2.8 g，2 eq)、三甲胺(4.2 ml，30 mmol)及DMAP (240 mg，2 mmol)在乙腈(50 ml)中加熱隔夜，接著濃縮且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以0%至30%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀不使用修飾劑經純化。所需產物之產量2.3 g，60%。藉由LCMS發現之離子：M+H =431。步驟 d.
Figure 02_image1607
氫化鈉(400 mg，60%於油中，10 mmol)在冰水浴下添加至50 ml無水THF (濕度敏感性反應)中之前一步驟之產物(1.45 g，3.3 mmol)中。所得溶液經攪拌持續0.5小時，接著溴-乙酸第三丁酯(2 g，10 mmol)添加至上述溶液中，所得溶液加熱至60℃隔夜且用乙酸淬滅。所得溶液經濃縮且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以0%至50%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀使用TFA作為修飾劑經純化。產量1 g，57%。藉由LCMS發現之離子：M+H =593。步驟 e.
Figure 02_image1609
前一步驟之產物(1.2 g，2.2 mmol)在室溫下與10 ml TFA一起攪拌隔夜，且藉由LCMS監測保護基脫除之進展。所得溶液經濃縮且無需純化即用於下一步驟。殘餘物再溶解於20 ml THF中，接著N,N'-雙-boc-1-脒基吡唑(1 g，3.3 mmol)、4-二甲基胺基吡啶(120 mg，1 mmol)及三乙胺(0.7 ml，5 mmol)添加至該溶液中，且所得溶液加熱至60℃持續2小時。所得溶液經濃縮且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以0%至50%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀不使用修飾劑經純化。產量700 mg，84%。藉由LCMS發現之離子：M+H =631。步驟 f.
Figure 02_image1611
在室溫下向連接體-3 (如實例19中所述經製備) (73 mgg，0.14 mmol)及前一步驟之產物(200 mg，0.32 mmol，2.2 eq)於DMF (30 ml)中之溶液中添加EDC (100 mg，0.5 mmol)、HOAt (65 mg，3 mmol)及DIEA (0.14 ml，1 mmol)。該溶液經攪拌隔夜。所得溶液經濃縮且經純化且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以0%至50%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀不使用修飾劑經純化。產量120 mg，52%。藉由LCMS發現之離子：M/2+H =830。步驟 g.
Figure 02_image1613
2 ml H2O中之氫氧化鋰(24 mg，1 mmol)添加至前一步驟之產物(120 mg，0.07 mmol)於2 ml THF及1 ml MeOH中之溶液中，LCMS監測反應之進展。在完成之後，向該溶液中添加AMBERLITE® IRN-77離子交換樹脂以調節至pH1，接著過濾所得溶液且濾液經濃縮且無需純化即用於下一步驟。所得化合物在室溫下經2 ml TFA處理，該溶液在40℃下攪拌隔夜，接著濃縮且藉由以0%至20%乙腈及水溶離之HPLC使用TFA作為修飾劑經純化。產量60 mg，74%產率。藉由LCMS發現之離子：[M/2]+1 =589.8。實例 23. 神經胺糖酸酶抑制分析
如下文所述執行使用2’-(4-甲基傘形酮基)-α-D-N-乙醯基神經胺糖酸(MUNANA)受質之神經胺糖酸酶抑制分析。簡言之，50 μL經純化、重組流感病毒神經胺糖酸酶(0.1 ng/µL，50 mM Tris、5 mM CaCl2、200 mM NaCl，pH 7.5)與50 μL抑制劑混合且在室溫下培育持續30 min。在適當範圍內之至少5種濃度之各抑制劑用於各重複。在培育之後，50 μL在50 mM Tris、5 mM CaCl2、200 mM NaCl (pH 7.5)中之400 µM MUNANA添加至該溶液中以使用12-尖端移液管(Eppendorf)開始反應。陽性及陰性對照物包括於各12-孔泳道中。在板上針對各泳道開始反應之後，反應混合物立即裝載於SpectraMax M5 (Molecular Devices)上，其中在365 nm之激發波長及445 nm之發射波長下經25 min過程對螢光定量。選擇其中陽性對照物產生大約1,000之螢光信號之單一時間點。所有分析均一式三份進行且使用GraphPad Prism以log[抑制劑]對抑制百分率之S型擬合計算各抑制劑之IC50值。圖15顯示在結合物1及Int-2之線性範圍內以RFU/min計之動力學數據的曲線，其顯示作為神經胺糖酸酶抑制劑之結合物1之較大功效。圖16及圖17分別顯示結合物1-6針對rH1N1神經胺糖酸酶及rH3N2神經胺糖酸酶之分析結果(表2)。 表2：結合物針對H1N1及H3N2神經胺糖酸酶之IC50值
結合物編號 H1N1 IC50 (nM) H3N2 IC50 (nM)
結合物1 3.9 32.5
結合物2 3.7 17.6
結合物3 3.6 38
結合物4 1.9 17.2
結合物5 1.1 14.3
結合物6 4.1 29.8
實例 24 ：細胞毒性分析
測試結合物1、2、3及6之細胞毒性。一式三份製備以10 µM開始之各結合物之十種兩倍連續稀釋液，用於接種96-孔培養板中之MDCK細胞。在處理之後四天使用CellTiter-GLO套組測定細胞性能。使用XLfit劑量反應模型計算細胞毒性濃度之50% (CC50 ) (表3)。關於所測試之所有化合物，未觀察到高達10 μM之細胞毒性，例外為結合物3。在結合物3之情況下，細胞病理效應(CPE)分析(參見實例23)中之EC50 比此分析中之CC50 低725倍。 表3：細胞毒性測試
結合物編號 CC50 (µM)
結合物1 ＞10
結合物2 ＞10
結合物3 7.98
結合物6 ＞10
PBS ＞10
紮那米韋 ＞10
實例 25. 細胞病理效應分析 基於 CPE 之微量中和分析 #1
為了量測神經胺糖酸酶結合物保護哺乳動物細胞以抵禦流感病毒之感染及破壞的能力，進行基於細胞病理效應(CPE)之微量中和分析。簡言之，一式兩份製備以0.25 µM開始之各結合物之二十種兩倍連續稀釋液，用於一小時接種96-孔板中接種之MDCK細胞。INFV CA/09病毒以感染複數(MOI) 0.001添加至細胞中用於一小時培育。在培育後第四天，細胞用結晶紫染色且讀取光學密度以使用XLfit劑量反應模型計算各TA之50%有效濃度(EC50)。紮那米韋用作比較物及陽性對照物。人類Fc作為陰性對照物包括在內。結合物1、2、3及6均證明了優於紮那米韋對照物之效能，證明EC50比紮那米韋低42至227倍(表4)。 表4：基於CPE之微量中和分析#1
結合物編號 EC50 (nM)
1 2.0574
2 4.1487
3 11.007
6 5.2167
PBS N/C
人類Fc N/C
紮那米韋† 468.7
N/C：無法計算 † 開始濃度10000 nM基於 CPE 之微量中和分析 #2
進行額外基於CPE之微量中和分析以進一步評估結合物6及結合物7之活體外活性。簡言之，以160 nM之開始濃度製備測試物件，且製備總計十種2倍稀釋液。該等測試物件稀釋液接著與相對於單層感染複數為0.001之流感A病毒(INFV CA/09)預混合。一小時之後，該測試物件+病毒混合物添加至在96-孔板中在標準條件下生長至70 - 80%匯合之Madin-Darby犬腎(MDCK)細胞中。同樣處理紮那米韋對照物，除了開始濃度為9600 nM，因為預期其不如正在測試之結合物有效。在培育四天之後，單層用結晶紫染色且測定光學密度(反映單層健康)以使用XLfit劑量反應模型(idbs; https://www.idbs.com)計算50%有效濃度(EC50)。
如表5所示，濃度為496 nM之紮那米韋使病毒介導之細胞病理效應減半。相比之下，結合物6係大約100倍更具活性，其中EC50僅為4.64 nM。結合物7進一步改良活性達大約15倍，從而使EC50減至亞nM水準。 表5：基於CPE之微量中和分析#2
結合物編號 EC50 (nM)
6 4.64
7 0.31
紮那米韋 496
實例 26. 細胞性能分析
A549細胞在化合物處理之前一天接種於96-孔板中。細胞用濃度為1 µM – 10 nM之結合物3 (圖18A)、結合物4 (圖18B)或結合物6 (圖18C)處理持續24小時。接著使用Cell Titer Glow (Promega)量測細胞性能。結果表示三個生物重複樣品之平均值及SD。在用於病毒生長分析(實例27)之任何濃度下，針對任何濃度之任何結合物均未觀察到對細胞性能之影響。實例 27. 病毒生長分析
為了量測神經胺糖酸酶結合物抑制人類上皮細胞中之所關注之致病性流感病毒菌株的生長之能力，進行病毒斑塊減少分析。簡言之，A549細胞在化合物處理之前一天接種於24-孔板中。細胞用濃度為1 µM – 10 nM之化合物處理持續2小時且經MOI為0.01之所指示病毒菌株感染以用於一小時培育。移除病毒，洗滌細胞且以濃度1 µM – 10 nM再應用化合物。在所指示之時間點收集上清液且在MDCK細胞中使用斑塊分析方法進行滴定。結果表示三個生物重複樣品之平均值及SD。奧司他韋用作比較物及陽性對照物。結合物3 (圖19A-19E)、結合物4 (圖20A-E)或結合物6 (圖21A-21E及圖22A-22E)均證明了優於奧司他韋對照物之效能，顯示在低100倍濃度下類似或(通常)優於奧司他韋之斑塊減少。使用細胞性能分析(實例26)針對各測試物件評估該等化合物(以評估測試物件之潛在細胞毒性)對A549細胞之影響。簡言之，A549細胞在化合物處理之前一天接種於96-孔板中。細胞用濃度為1 µM – 10 nM之化合物處理持續24小時.接著使用Cell Titer Glow (Promega)量測細胞性能。結果表示三個生物重複樣品之平均值及SD。實例 28. 小鼠血清半衰期
藥物動力學(PK)研究使用在20與22公克之間的雌性CD-1小鼠(Charles River Laboratories)。小鼠藉助於尾靜脈經IV注射50 mg/kg之測試物件(10 ml/kg之劑量體積)。動物經圈養於標準IACUC批准之圈養條件下。在適當時間，對動物進行非末端放血(眶後、頰或藉由尾靜脈)，其中血液經收集於EDTA管中以預防凝血。所收集之血液經離心(2,000 x g，持續10分鐘)且抽出血漿以隨時間分析測試物件濃度。
藉由如下夾心ELISA量測在各時間點處結合物6或hIgG1 Fc之血漿濃度：結合物6分子經捕捉於經神經胺糖酸酶塗佈之板或經抗hIgG1抗體塗佈之板上且接著使用HRP結合之抗人類IgG-Fc抗體進行偵測。hIgG1使用抗hIgG1 Fc抗體經捕捉。在GraphPad Prism中使用結合物6 (或hIgG1 Fc)之4PL非線性迴歸標準曲線計算蛋白質濃度。更詳細方法描述提供於下文中。
Qiagen Ni-NTA HisSorb板(目錄號35061, Qiagen)經來自A/California/04/2009 (H1N1) (11058-VNAHC, Sino Bio)之神經胺糖酸酶或在1X KPL塗佈緩衝液中之抗IgG1 Fc抗體(5150-0041, SeraCare)塗佈。在其中該抗IgG1 Fc抗體用於捕捉測試物件之情況下，選擇捕捉及偵測結合不同抗原決定基之抗IgG1 Fc抗體。板在室溫下經培育持續1小時。血漿樣品之連續稀釋液經塗板且在室溫下經培育持續2 h (樣品稀釋劑：0.5%脫脂奶粉+ 3%山羊血清於PBS 0.05% Tween20中；原生小鼠血漿最終濃度為1:900)。在各板上一式兩份進行介於500 – 0.230 ng/mL範圍內之結合物6或hIgG1 Fc標準曲線。
在2 h培育之後，板在具有0.05% Tween20之300 uL PBS中洗滌5次。結合於板上之神經胺糖酸酶(或抗hIgG1 Fc抗體)的結合物6接著在室溫下用1:2000稀釋於樣品稀釋劑中之HRP結合之抗人類IgG Fc F(ab’)2 (Jackson 709-036-098)探測持續1小時。板接著在具有0.05% Tween20之300 uL PBS中洗滌8次且用TMB受質顯影持續7分鐘。該反應用1N H2SO4停止。在450 nm下讀取吸光度。相似方案用於hIgG1 Fc，其中僅抗hIgG1 Fc抗體用於捕捉。使用神經胺糖酸酶或抗hIgG1 Fc抗體捕捉在不同時間點處量測之結合物6之量在實驗誤差內為相似的，表明完整結合物活體內穩定。
使用Graphpad Prism Version 6，根據結合物6 (或hIgG1 Fc)標準曲線之非線性迴歸分析(S型，4PL分析)內推測試樣品中之總結合物6 (或hIgG1 Fc)。使用WinNonlin軟體計算PK參數。比較結合物6及hIgG1 Fc之曲線顯示於圖23中且關鍵PK參數之概述提供於表6中。意外地，結合物6之血漿暴露及終末半衰期顯著優於野生型hIgG1 Fc。結合物6在8天內之AUC比hIgG1 Fc高3倍，且結合物6之終末半衰期為214小時，對人類IgG1 Fc之52小時。 表6：與hIgG1 Fc相比結合物6之小鼠PK
半衰期(h) AUC 最後(h*mg/mL)
結合物6 214 33100
hIgG1 51.8 10600
實例 29. 結合物 6 在致死性小鼠流感模型中之功效：研究 #1
在雌性BALB/c小鼠中針對致死性INFV A H1N1流感感染評估結合物6。該實驗包含7組，每組5只小鼠。在第0天，所有小鼠均用1xLD90 H1N1 A/Texas/36/91攻擊。第1-6組在攻擊之前4小時接受IV治療(表7)。人類IgG1 (單獨Fc)作為額外陰性對照物包括在內。第7組藉助於經口遞送接受磷酸奧司他韋，在感染後8小時開始，每天兩次，持續5天。在攻擊之後監測所有小鼠之重量損失(圖24，表8)及生存(圖25，表9)，持續15天。
經結合物6治療之小鼠在所測試之所有濃度下在使用單一劑量時均顯示100%生存，分別與媒劑對照組及hIgG1對照組之20%及0%生存相比。當與媒劑組(p=0.0135)相比時，結果為統計學顯著的，儘管具有小的組大小(n=5)。當與磷酸奧司他韋組相比時，結合物6在低500倍之累積劑量(mg/kg)下證明相似功效。小鼠在所有結合物6劑量下在該實驗之整個過程中維持其重量，優於奧司他韋對照組。 表7：研究設計
組 n=5 攻擊 第0 天 化合物 劑量 (mg/kg) 治療 途徑/ 時程
1 流感A病毒，H1N1菌株A/Texas/36/91，藉助於IN途徑。 媒劑(PBS) N/A IV，q.d. 攻擊前4小時
2 單獨Fc 50
3 結合物6 50
4 結合物6 10
5 結合物6 2
6 結合物6 0.4
7 奧司他韋(TamifluTM ) 20 PO, b.i.d. 攻擊後8小時，持續5天
表8：每天重量平均值
感染後天數 每天平均重量( 僅第1 及2 組增加小鼠數目)
媒劑(PBS) 單獨Fc 結合物6 磷酸奧司他韋
50 mg/kg 50 mg/kg 10 mg/kg 2 mg/kg 0.4 mg/kg 20 mg/kg
0 17.9 (5) 17.9 (5) 18.7 19.3 18.5 18.8 18.8
1 18.0 (5) 18.0 (5) 18.8 19.36 18.6 18.8 18.9
2 18.5 (5) 18.8 (5) 19.2 19.6 19.4 18.8 19.2
3 17.7 (5) 17.7 (5) 18.9 19.5 19.1 18.9 19.1
4 17.2 (5) 17.0 (5) 19.5 19.9 19.3 18.9 18.9
5 16.3 (5) 15.8 (5) 19.2 19.8 19.5 18.7 18.8
6 15.6 (4) 15.0 (5) 19.1 19.9 19.5 18.7 18.4
7 15.5 (2) 14.0 (2) 18.8 19.6 19.2 18.9 17.3
8 17.2 (1)    19.1 20.0 19.7 19.2 17.1
9 20.1 (1)    18.7 19.3 19.1 18.8 17.8
10 20.0 (1)    19.1 20.1 19.5 19.3 18.9
11 20.4 (1)    19.0 19.8 19.2 19.2 18.7
12 20.6 (1)    19.6 20.3 19.8 19.3 19.2
13 20.3 (1)    19.2 20.4 19.7 19.7 19.3
14 20.7 (1)    19.5 20.6 19.9 19.8 19.6
表9：小鼠生存
化合物 劑量 平均生存 % 生存 相對媒劑之顯著性(p)
媒劑(PBS) N/A 7 20 N/A
單獨Fc 50 mg/kg 7 0 0.8335
結合物6 50 mg/kg 15 100 0.0135
結合物6 10 mg/kg 15 100 0.0135
結合物6 2 mg/kg 15 100 0.0135
結合物6 0.4 mg/kg 15 100 0.0135
磷酸奧司他韋 20 mg/kg B.I.D 15 100 0.0135
實例 30. 結合物 6 在致死性小鼠流感模型中之功效：研究 #2
在雌性BALB/c小鼠中針對致死性INFV A H3N2流感感染評估結合物6。該實驗包含11組，每組5只小鼠。在第0天，所有小鼠均用1xLD90 H3N2 A/Hong Kong/1/68攻擊。第1-10組在攻擊之前4小時接受IV治療(表10)。人類IgG1 (單獨Fc)作為額外陰性對照物包括在內。第11組藉助於經口遞送接受磷酸奧司他韋，在感染後8小時開始，每天兩次，持續5天。在攻擊之後監測所有小鼠之重量損失(圖26)及生存(圖27，表11)，持續15天。
經結合物6治療之小鼠在使用低至0.4 mg/kg之單一劑量時顯示100%生存，且在使用0.2 mg/kg之單一劑量時顯示80%生存，分別與媒劑對照組及hIgG1對照組之0%生存相比。80%小鼠在奧司他韋對照組中生存。當與媒劑組(p=0.0128)相比時，結果為統計學顯著的，儘管具有小的組大小(n=5)。當與磷酸奧司他韋組相比時，結合物6在低1000倍之累積劑量(mg/kg)下證明相似功效。小鼠在所有結合物6劑量下在低至0.4 mg/kg時維持其重量在5%內，優於奧司他韋對照組。 表10：研究設計
組 n=5 攻擊 第0 天 測試物件 劑量 (mg/kg) 治療 途徑/ 時程 讀出/ 終點
1 H3N2 A/Hong Kong/1/68，藉助於IN途徑 媒劑(PBS) N/A IV，q.d. 攻擊前4小時 在攻擊之後監測每天重量及健康分數，持續15天。 %生存
2 單獨Fc 50
3 結合物6 50
4 2
5 0.4
6 0.2
7 0.1
8 0.05
9 0.025
10 0.0125
11 奧司他韋(TamifluTM ) 20 PO，b.i.d. 在攻擊之後8小時，持續5天
表11：小鼠生存
化合物 劑量 平均生存( 天) % 生存 相對媒劑之顯著性(p- 值)
媒劑(PBS) N/A 9 0 N/A
Fc對照物 50 mg/kg 8 0 0.2498
結合物6 50 mg/kg 15 100 0.002
2 mg/kg 15 100 0.002
0.4 mg/kg 15 100 0.002
0.2 mg/kg 15 80 0.0128
0.1 mg/kg 9 20 0.8264
0.05 mg/kg 9 20 0.5769
0.025 mg/kg 8 20 ＞0.9999
0.0125 mg/kg 11 0 0.4703
磷酸奧司他韋 (B.I.D，持續5天) 20 mg/kg 15 80 0.0052
實例 31. 合成 Int-10
Figure 02_image1615
步驟 a.
Figure 02_image1617
5-乙醯胺基-7,8,9-O-三乙醯基-2,6-無水-4-疊氮基-3,4,5-三去氧-D-甘油-D-半乳-壬-2-烯酸甲酯(SM-1，10 g，22 mmol)溶解於100 ml甲醇中且接著用油浴加熱至60℃，SnCl2 (5.7 g，20 mmol)分成3份添加至該溶液中(小心，氣體釋出)。該反應混合物經攪拌持續10 min，此時藉由HPLC發現反應完成。該反應溶液在劇烈攪拌下緩慢地添加至50 ml飽和NaHCO3 溶液及50 g矽藻土之溶液中。過濾所得漿液。濾液經Boc2 O (6.6 g，30 mmol，1.5 eq)處理。在室溫下2小時之後，該溶液經濃縮以移除大部分甲醇，溶解於200 ml DCM中，且用100 ml DCM萃取兩次。經組合之萃取物經硫酸鈉乾燥，過濾且無需進一步純化即用於下一步驟中。粗物質產量12 g，100%。藉由LCMS發現之離子：M+H =531。步驟 b.
Figure 02_image1619
來自前一步驟之材料溶解於60 ml無水甲醇中，接著在冰水浴中冷卻下用10 ml甲醇中之甲醇鈉(0.5 M)處理。藉由LCMS監測反應之進展，其在2 h之後完成。該反應用1N HCl淬滅至pH 5-6。所得溶液經濃縮且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以0%至30%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀使用0.1% TFA作為修飾劑經純化。產物之產量7.2 g，80%。藉由LCMS發現之離子：M+H =405。步驟 c.
Figure 02_image1621
前一步驟之中間物之溶液(3.5 g，8.5 mmol)、CDI (2.8 g，2 eq)、三甲胺(4.2 ml，30 mmol)及DMAP (240 mg，2 mmol)在DMF (50 ml)中在60℃下加熱隔夜，接著濃縮且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以0%至30%乙腈及所生成物溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀不使用修飾劑經純化。所需產物之產量2.3 g，60%。藉由LCMS發現之離子：M+H =431。步驟 d.
Figure 02_image1623
氫化鈉(400 mg，60%於油中，10 mmol)在冰水浴下添加至50 ml無水THF (濕度敏感性反應)中之Int-4 (1.45 g，3.3 mmol)中。所得溶液經攪拌持續0.5小時，接著溴乙酸第三丁酯(2 g，10 mmol)添加至上述溶液中。所得溶液加熱至60℃隔夜且用乙酸淬滅，經濃縮且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以0%至50%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀使用TFA作為修飾劑經純化。產量1 g，57%。藉由LCMS發現之離子：M+H =593。(藉由HPLC發現該反應相當乾淨，但分離產量低)步驟 f.
Figure 02_image1609
前一步驟之中間物(1.2 g，2.2 mmol)在室溫下與10 ml TFA一起攪拌隔夜。藉由LCMS監測保護基脫除之進展。所得溶液經濃縮且無需純化即用於下一步驟。
前一反應之殘餘物溶解於20 ml THF中，接著N,N'-雙-boc-1-脒基吡唑(1 g，3.3 mmol)、4-二甲基胺基吡啶(120 mg，1 mmol)及三乙胺(0.7 ml，5 mmol)添加至該溶液中，且所得溶液加熱至60℃持續2小時。所得溶液經濃縮且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以0%至50%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀不使用修飾劑經純化。產量700 mg，84%。藉由LCMS發現之離子：M+H =631。步驟 g.
Figure 02_image1626
在室溫下向連接體-3 (如實例19中所述經製備) (73 mgg，0.14 mmol)及前一步驟之中間物(200 mg，0.32 mmol，2.2 eq)於DMF (30 ml)中之溶液中添加EDC (100 mg，0.5 mmol)、HOAt (65 mg，3 mmol)及DIEA (0.14 ml，1 mmol)。該溶液經攪拌隔夜。所得溶液經濃縮且經純化且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以0%至50%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀不使用修飾劑經純化。產量120 mg，52%。藉由LCMS發現之離子：M/2+H =830。步驟 h.
Figure 02_image1628
2 ml水中之氫氧化鋰(24 mg，1 mmol)添加至前一步驟之中間物(120 mg，0.07 mmol)於2 ml THF及1 ml MeOH中之溶液中。在藉由LCMS發現該反應完成之後，用AMBERLITE® IRN-77離子交換樹脂淬滅該溶液以調節至pH = 1，接著過濾該溶液且濾液經濃縮且無需進一步純化即用於下一步驟。
前一步驟之中間物在室溫下在40℃下在2 ml TFA中經處理隔夜。粗反應物經濃縮且藉由使用0%至20%乙腈及水之HPLC使用TFA作為修飾劑經純化。產量60 mg，74%產率。藉由LCMS發現之離子：[M/2]+1 =589.8。實例 32. 合成結合物 7
Fc-PEG4-疊氮化物(具有SEQ ID NO: 38之序列的各Fc域單體)於PBSx1緩衝溶液中之溶液(100 mg，1.28 μmol，6.1 mL，MW=57260 Da，DAR=3.6)添加至Int-10 (如實例31中所述經製備) (TFA鹽，44 mg，0.031 mmol)及新鮮製備之CuSO4 (0.7 mL 50.0 mM, 20 eq)、參(3-羥基丙基三唑基甲基)-胺(THPTA，0.7 mL 50.0 mM, 20 eq)及抗壞血酸鈉(1.05 mL 50.0 mM, 30 eq)之pH 7.4 PBS溶液中。所得均質溶液藉由搖桿台攪拌持續12 h。粗溶液用pH 7.4 PBS稀釋至1 mg/mL之最終濃度，且經超濾(10,000 MWCO)兩次至1 mL體積。粗混合物接著1:10稀釋於PBS pH 7.4中，且相繼使用MabSelect Sure Resin (GE Healthcare, Chicago, IL, USA)、尺寸排阻層析法經純化。經純化材料使用Nanodrop™ UV可見光光譜儀(使用基於結合中所用之Fc之胺基酸序列計算的消光係數經定量，且使用離心濃縮機(10,000 MWCO)經濃縮至大約10 mg/mL。經純化分子使用4-12% Bis Tris SDS PAGE凝膠藉由將1-2 µg每種分子裝載至該凝膠中且使用速染藍(instant Blue)染色進行染色而經分析。各凝膠包括具有經指示分子量標準之分子量梯。產率典型地為40-60%。MALDI MS分析顯示質量範圍(60000-90000)，其中質量之平均值為63633。平均DAR=4.5。實例 33. 結合物 6 在致死性小鼠流感模型中之功效：研究 #3
在雌性BALB/c小鼠中針對致死性INFV A H1N1流感感染評估結合物6。該實驗包含7組，每組5只小鼠。在第0天，所有小鼠均用1xLD90 H1N1 A/Texas/36/91攻擊。第1-6組在攻擊之前28天接受IV治療(表12)。媒劑(PBS)作為額外陰性對照物包括在內。第7組藉助於經口遞送接受磷酸奧司他韋，在感染後8小時開始，每天兩次，持續5天。在攻擊之後監測所有小鼠之生存(圖31A-31F)，持續15天。
經結合物6治療之小鼠在低至2.5 mg/kg之所有濃度下在使用單一劑量時均顯示100%生存，且在1.25 mg/kg下顯示80%生存，與媒劑對照組之0%生存相比。磷酸奧司他韋對照組中之所有小鼠均生存。當與磷酸奧司他韋組相比時，結合物6在低20倍之累積劑量(mg/kg)下證明與奧司他韋相似之功效，不過事實上，所有結合物6組均在感染之前28天給藥一次。 表12：研究設計
組 n=5 攻擊 第0 天 化合物 劑量 (mg/kg) 治療 途徑/ 時程
1 流感A病毒，H1N1菌株A/Texas/36/91，藉助於IN途徑。 媒劑(PBS) N/A IV，q.d. 攻擊前28天
2 結合物6 50
3 結合物6 10
4 結合物6 5
5 結合物6 2.5
6 結合物6 1.25   
7 奧司他韋(TamifluTM ) 20 PO, b.i.d. 攻擊後8小時，持續5天
實例 34. 結合物 6 在致死性小鼠流感模型中之功效：研究 #4
在雌性BALB/c小鼠中針對致死性INFV A H1N1流感感染評估結合物6。該實驗包含13組，每組5只小鼠。在第0天，所有小鼠均用1xLD90 H1N1 A/Texas/36/91攻擊。所有結合物6組(8-13)在感染前及後不同時間接受單一10 mg/kg IV劑量，如表13所概述。媒劑(PBS)及單獨Fc作為陰性對照物包括在內。第3-7組藉助於經口遞送接受磷酸奧司他韋(20 mg/kg)，在感染後不同時間點開始，每天兩次，持續5天，如表13所概述。在攻擊之後監測所有小鼠之生存(圖32A-32F)，持續15天。
當經治療直至感染後24 h時，經結合物6治療之小鼠在使用單一10 mg/kg劑量時顯示100%生存，且在感染後48及72 h分別顯示60及80%生存。在磷酸奧司他韋組中，在其中感染後48及72 h起始治療之組中，生存分別急劇地降至0%及20%。此等結果表明關於治療流感A感染，結合物6潛在地具有相對奧司他韋卓越之治療窗。 表13：研究設計
組(N=5) 流感A 菌株 測試物件 途徑，時程 劑量 (mg/kg)
給藥時間安排( 小時)
1 A/Texas/36/91 (H1N1) 藉助於IN 媒劑(PBS) IV，單一 --- T-4
2 單獨Fc IV，單一 10 T-4
3 奧司他韋 PO，bid × 5天 20 T+8
4 奧司他韋 PO，bid × 5天 20 T+24
5 奧司他韋 PO，bid × 5天 20 T+48
6 奧司他韋 PO，bid × 5天 20 T+72
7 奧司他韋 PO，bid × 5天 20 T+96
8 結合物6 IV，單一 10 T-4
9 結合物6 IV，單一 10 T+8
10 結合物6 IV，單一 10 T+24
11 結合物6 IV，單一 10 T+48
12 結合物6 IV，單一 10 T+72
13 結合物6 IV，單一 10 T+96
實例 35. 結合物 6 毒性研究
在14天大鼠劑量範圍測量儀毒性研究中評估結合物6之安全性。大鼠在該研究之第0及7天藉由靜脈內投與經投與5 mpk、20 mpk或50 mpk之結合物6。與媒劑對照物相比，在所測試之任何劑量下均未觀察到對體重增加(圖33)、器官重量、食物消耗的顯著影響。血漿暴露(藉由AUC量測)隨劑量按比例增加。此等臨床前安全性結果與高治療指數一致。觀察結果之概述提供於表14中。 表14. 14天大鼠劑量範圍測量儀毒性研究之概述
參數 在最高劑量(50 mpk) 下之發現， 與媒劑相比
臨床觀察結果 無發現
血液學 相對媒劑無改變
臨床化學 相對媒劑無改變
凝血 相對媒劑無改變
尿分析 相對媒劑無改變
組織病理學 無觀察結果
實例 36. 藉由三種不同途徑發現結合物 6 在致死性小鼠流感模型中針對劑量之功效：研究 #5
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8週)中針對致死性IAV H1N1流感感染評估結合物6。攻擊病毒(A/Texas/36/91)係能夠在小鼠中引起致死性感染之小鼠適應性分離株。該實驗包含15組，每組5只小鼠。在第0天，所有小鼠均在經異氟烷輕微麻醉之後藉由鼻內接種經50 µl體積之病毒(1x LD90)攻擊。第1-14組在攻擊之前4小時接受單一治療(表15)。為了藉由不同給藥途徑測定結合物6之效能，匹配濃度之結合物(10、2、0.4及0.1 mg/kg)經IV、IM或SC給藥。除了單獨媒劑(PBS)組以外，人類IgG1 (單獨Fc)亦作為額外陰性對照物(第2組)包括在內。第15組藉助於經口遞送接受磷酸奧司他韋，在感染後8小時開始，每天兩次，持續5天。監測所有小鼠之生存(表15)，持續14天。
經結合物6治療之小鼠在第14天針對具有10、2或0.4 mg/kg之單一劑量之流感(H1N1)的攻擊顯示100%生存，與給藥途徑無關。僅在最低測試物件濃度下，在IV、IM及SC給藥(表16：分別為60、80及100%生存)之間可見單一小鼠差異。此等結果強烈地表明，結合物6之保護性肺濃度可藉由多種給藥途徑達成。 表15：研究設計
組 n=5 攻擊 第0 天 化合物 劑量 (mg/kg) 給藥途徑 治療 途徑/ 時程
1 流感A病毒(H1N1)A/Texas/36/91 藉助於IN 媒劑(PBS) N/A    單一劑量，病毒攻擊之前4小時
2 單獨Fc 50 IV
3 結合物6 10 IV
4 結合物6 2
5 結合物6 0.4
6 結合物6 0.1
7 結合物6 10 IM
8 結合物6 2
9 結合物6 0.4
10 結合物6 0.1
11 結合物6 10 SC
12 結合物6 2
13 結合物6 0.4
14 結合物6 0.1
15 奧司他韋(TamifluTM ) 20 PO b.i.d. 攻擊後8小時，持續5天
表16：小鼠生存
測試物件 mg/kg 給藥途徑 % 生存 ( 第14 天)
媒劑(PBS) na IV 0
hIgG1 (單獨Fc) 10 IV 0
結合物6 10 IV 100
2 100
0.4 100
0.1 60
結合物6 10 IM 100
2 100
0.4 100
0.1 80
結合物6 10 SC 100
2 100
0.4 100
0.1 100
奧司他韋 20 PO 100
實例 37. 結合物 6 在致死性小鼠流感模型中針對奧司他韋抗性分離株之功效：研究 #6
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8週)中針對致死性IAV H1N1流感感染評估結合物6。攻擊病毒(A/Perth/261/2009)係小鼠適應性分離株，其攜帶H275Y突變，從而導致抵抗神經胺糖酸酶抑制劑奧司他韋。該實驗包含10組，每組5只小鼠。在第0天，所有小鼠均藉由鼻內接種至經異氟烷輕微麻醉之小鼠經50 µl體積之A/Perth/261/2009 (H1N1) (1x LD90)攻擊。第1-9組在攻擊之前4小時藉由IV接受單一治療(表17)。除了單獨媒劑(PBS)組以外，人類IgG1 (單獨Fc)亦作為額外陰性對照物包括在內。第10組藉助於經口遞送接受磷酸奧司他韋，在感染後8小時開始，每天兩次，持續5天。在攻擊之後監測所有小鼠之生存(圖34A-34D，表18)及重量損失(圖35，表19)，持續15天。
經結合物6治療之小鼠針對具有50、10及2 mg/kg之單一劑量之流感(A/Perth/261/2009)的攻擊顯示100%生存。此外，儘管具有小的組大小(n=5)，此等結果相對於媒劑對照物為統計學上顯著的(表18)。在0.4、0.2或0.1 mg/kg之結合物6濃度下，生存為60%，而若以單獨媒劑(PBS)或hIgG1 (單獨Fc)給藥，則無小鼠生存至該研究結束。奧司他韋組僅具有單一動物生存(20%功效)，即使使用先前顯示出具有保護性以抵禦奧司他韋敏感性分離株之劑量進行治療(20 mg/kg，bid × 5天)。此等結果確認該攻擊病毒抵抗奧司他韋，且對結合物6敏感。
結合物6針對含有H275Y突變之突變體之效能進一步由體重數據支持(圖35，表19)。接受單一劑量之2 mg/kg或更高濃度之結合物6的組證明了5%或更低短暫重量損失。 表17：研究設計
組 n=5 攻擊 第0 天 化合物 劑量 (mg/kg) 治療 途徑/ 時程
1 流感A病毒(H1N1)  A/Perth/261/2009，藉助於IN途徑。 媒劑(PBS) N/A IV，q.d. 攻擊前4小時
2 單獨Fc 50
3 結合物6 50
4 結合物6 10
5 結合物6 2
6 結合物6 0.4
7 結合物6 0.2
8 結合物6 0.1
9 結合物6 0.05
10 奧司他韋(TamifluTM ) 20 PO，b.i.d. 攻擊後8小時，持續5天
表18：小鼠生存
化合物 劑量 中值生存 % 生存 相對媒劑之顯著性(p)
媒劑(PBS) N/A 7 0 N/A
單獨Fc 50 mg/kg 6 0 ns
結合物6 50 mg/kg 未定義 100 0.0027
結合物6 10 mg/kg 未定義 100 0.0027
結合物6 2 mg/kg 未定義 100 0.0027
結合物6 0.4 mg/kg 未定義 60 0.1167
結合物6 0.2 mg/kg 未定義 60 0.0185
結合物6 0.1 mg/kg 未定義 60 0.1047
結合物6 0.05 mg/kg 7 0 0.9241
磷酸奧司他韋 20 mg/kg B.I.D 7 20 0.3470
表19：每天重量平均值
感染後天數 每天平均重量( 若小於5 ，則在括號中顯示小鼠#)
媒劑(PBS) 單獨Fc 結合物6 磷酸奧司他韋
50 mg/kg 50 mg/kg 10 mg/kg 2 mg/kg 0.4 mg/kg 0.2 mg/kg 0.1 mg/kg 0.05 mg/kg 20 mg/kg
0 100 (5) 100 (5) 100 100 100 100 100 100 100 100
1 103 (5) 104 (5) 101 101 102 102 103 105 102 105
2 102 (5) 105 (5) 103 101 103 100 102 102 101 102
3 93 (5) 97 (5) 101 101 98 92 98 95 94 95
4 88 (5) 90 (5) 95 98 99 91 98 92 90 93
5 85 (5) 85 (5) 94 98 98 91 98 92 89 92
6 83 (4) 88 (3) 100 100 99 88 95 85 84 (4) 86
7 79 (3) 90 (2) 103 99 95 90 (3) 94 83 (4) 77 (1) 86 (3)
8 75 (2) 81 (1) 102 99 97 93 (3) 94 (4) 87 (3) 78 (1) 85 (2)
9       106 104 104 101 (3) 101 (4) 95 (3)    86 (2)
10       105 102 103 100 (3) 99 (4) 97 (3)    95 (1)
11       106 102 104 102 (3) 104 (4) 102 (3)    97 (1)
12       108 104 105 102 (3) 105 (3) 107 (3)    104 (1)
13       107 103 105 102 (3) 105 (3) 107 (3)    104 (1)
14       107 103 105 102 (3) 106 (3) 108 (3)    104 (1)
15       100 100 100 100 (3) 100 (3) 100 (3)    100 (1)
實例 38. 在 IV 投與測試物件之後的 7 天大鼠 PK 研究
由Seventh Wave實驗室(Maryland Heights, MO)使用46-49日齡之雄性Sprague Dawley大鼠執行大鼠藥物動力學(PK)研究。大鼠藉助於尾靜脈經IV注射75 mg/kg之測試物件(5 ml/kg之劑量體積)。動物經圈養於標準IACUC批准之圈養條件下。在適當時間，對動物進行非末端放血(眶後、頰或藉由尾靜脈)，其中血液經收集於K2 EDTA管中以預防凝血。所收集之血液經離心(2,000 xg ，持續10分鐘)且抽出血漿以隨時間分析測試物件濃度。
藉由如下夾心ELISA量測在各時間點處結合物6或hIgG1 Fc之血漿濃度：結合物6分子經捕捉於經神經胺糖酸酶塗佈之板或經抗hIgG1抗體塗佈之板上且接著使用HRP結合之抗人類IgG-Fc抗體進行偵測。hIgG1使用抗hIgG1 Fc抗體經捕捉。在GraphPad Prism中使用結合物6 (或hIgG1 Fc)標準曲線之4PL非線性迴歸計算蛋白質濃度。更詳細方法描述提供於下文中。
Nunc Maxisorp 96-孔板(目錄號12-565-136, ThermoFisher)經1X KPL塗佈緩衝液(5150-0041, SeraCare)中來自A/California/04/2009 (H1N1) (11058-VNAHC, Sino Biological)之神經胺糖酸酶或抗IgG1 Fc抗體塗佈。在其中該抗IgG1 Fc抗體用於捕捉測試物件之情況下，選擇捕捉及偵測結合不同抗原決定基之抗IgG1 Fc抗體。板在室溫下在軌道板式振盪器上(500 rpm)經培育持續1 h。血漿樣品之連續稀釋液經塗板且在室溫下經培育持續2 h (樣品稀釋劑：1% BSA於PBS 0.05% Tween 20中+原生大鼠血漿最終濃度為1:900)。在各板上一式兩份進行介於500 – 0.230 ng/mL範圍內之結合物6或hIgG1 Fc標準曲線。
在2 h培育之後，板在具有0.05% Tween 20之300 uL PBS中洗滌5次。結合於板上之神經胺糖酸酶(或抗hIgG1 Fc抗體)的結合物6接著在室溫下用1:1,000稀釋於樣品稀釋劑中之HRP結合之抗人類IgG Fc F(ab’)2 (709-036-098, Jackson)探測持續1 h。板接著在具有0.05% Tween 20之300 uL PBS中洗滌8次且用TMB受質顯影持續7-8分鐘。該反應用1N H2 SO4 停止。在450 nm下讀取吸光度。相似方案用於hIgG1 Fc，其中僅抗hIgG1 Fc抗體用於捕捉。使用神經胺糖酸酶或抗hIgG1 Fc抗體捕捉在不同時間點處量測之結合物6之量在實驗誤差內為相似的，表明完整結合物活體內穩定。使用Graphpad Prism Version 6，根據結合物6 (或hIgG1 Fc)標準曲線之非線性迴歸分析(S型，4PL分析)內推測試樣品中之總結合物6 (或hIgG1 Fc)。比較結合物6及hIgG1 Fc之曲線顯示於圖36中。使用神經胺糖酸酶或抗hIgG1 Fc抗體捕捉在不同時間點處量測之結合物6之量在實驗誤差內為相似的，表明完整結合物活體內穩定。實例 39. 在 IV 投與測試物件之後的 14 天大鼠 PK 研究
由Seventh Wave實驗室(Maryland Heights, MO)使用46-49日齡之雄性Sprague Dawley大鼠執行大鼠PK研究。大鼠在第1及8天藉助於尾靜脈經IV注射5、20或50 mg/kg之測試物件(5 ml/kg之劑量體積)。動物經圈養於標準IACUC批准之圈養條件下。在適當時間，對動物進行非末端放血(眶後、頰或藉由尾靜脈)，其中血液經收集於K2 EDTA管中以預防凝血。所收集之血液經離心(2,000 xg ，持續10分鐘)且抽出血漿以隨時間分析測試物件濃度。
藉由如下夾心ELISA量測在各時間點處結合物6之血漿濃度：結合物6分子經捕捉於經神經胺糖酸酶塗佈之板上且接著使用HRP結合之抗人類IgG-Fc抗體進行偵測。hIgG1使用抗hIgG1 Fc抗體經捕捉。在GraphPad Prism中使用結合物6標準曲線之4PL非線性迴歸計算蛋白質濃度。更詳細方法描述提供於下文中。
Nunc Maxisorp 96-孔板(目錄號12-565-136, ThermoFisher)經1X KPL塗佈緩衝液(5150-0041, SeraCare)中來自A/California/04/2009 (H1N1) (11058-VNAHC, Sino Biological)之神經胺糖酸酶塗佈。板在室溫下在軌道板式振盪器上(500 rpm)經培育持續1 h。血漿樣品之連續稀釋液經塗板且在室溫下經培育持續2 h (樣品稀釋劑：1% BSA於PBS 0.05% Tween 20中+原生大鼠血漿最終濃度為1:900)。在各板上一式兩份進行介於500 – 0.230 ng/mL範圍內之結合物6標準曲線。
在2 h培育之後，板在具有0.05% Tween 20之300 uL PBS中洗滌5次。結合於板上之神經胺糖酸酶的結合物6接著在室溫下用1:1,000稀釋於樣品稀釋劑中之HRP結合之抗人類IgG Fc F(ab’)2 (709-036-098, Jackson)探測持續1 h。板接著在具有0.05% Tween 20之300 uL PBS中洗滌8次且用TMB受質顯影持續7-8分鐘。該反應用1N H2 SO4 停止。在450 nm下讀取吸光度。
使用Graphpad Prism Version 6，根據結合物6標準曲線之非線性迴歸分析(S型，4PL分析)內推測試樣品中之總結合物6 (或hIgG1 Fc)。圖37中所示之比較結合物6之曲線證明了線性劑量比例。實例 40. 比較測試物件之 IV 及 SC 投與之 28 天大鼠 PK 研究
由Seventh Wave實驗室(Maryland Heights, MO)使用46-49日齡之雄性Sprague Dawley大鼠執行大鼠PK研究。大鼠經IV或SC注射5 mg/kg之測試物件(5 ml/kg之劑量體積)。動物經圈養於標準IACUC批准之圈養條件下。在適當時間，對動物進行非末端放血(眶後、頰或藉由尾靜脈)，其中血液經收集於K2 EDTA管中以預防凝血。所收集之血液經離心(2,000 xg ，持續10分鐘)且抽出血漿以隨時間分析測試物件濃度。
藉由如下夾心ELISA量測在各時間點處結合物6或hIgG1 Fc之血漿濃度：結合物6分子經捕捉於經神經胺糖酸酶塗佈之板上且接著使用HRP結合之抗人類IgG-Fc抗體進行偵測。在GraphPad Prism中使用結合物6標準曲線之4PL非線性迴歸計算蛋白質濃度。更詳細方法描述提供於下文中。
Nunc Maxisorp 96-孔板(目錄號12-565-136, ThermoFisher)經1X KPL塗佈緩衝液(5150-0041, SeraCare)中來自A/California/04/2009 (H1N1) (11058-VNAHC, Sino Biological)之神經胺糖酸酶塗佈。板在室溫下在軌道板式振盪器上(500 rpm)經培育持續1 h。血漿樣品之連續稀釋液經塗板且在室溫下經培育持續2 h (樣品稀釋劑：1% BSA於PBS 0.05% Tween 20中+原生大鼠血漿最終濃度為1:900)。在各板上一式兩份進行介於500 – 0.230 ng/mL範圍內之結合物6標準曲線。
在2 h培育之後，板在具有0.05% Tween 20之300 uL PBS中洗滌5次。結合於板上之神經胺糖酸酶的結合物6接著在室溫下用1:1,000稀釋於樣品稀釋劑中之HRP結合之抗人類IgG Fc F(ab’)2 (709-036-098, Jackson)探測持續1 h。板接著在具有0.05% Tween 20之300 uL PBS中洗滌8次且用TMB受質顯影持續7-8分鐘。該反應用1N H2 SO4 停止。在450 nm下讀取吸光度。
使用Graphpad Prism Version 6，根據結合物6標準曲線之非線性迴歸分析(S型，4PL分析)內推測試樣品中之總結合物6 (或hIgG1 Fc)。圖38中比較結合物6之曲線顯示，SC及IV血漿水準在24 h時會聚且直至336 h時在實驗誤差內相似。實例 41. 在 IV 投與測試物件之後的 28 天非人類靈長類動物 PK 研究
由BTS Research (San Diego, CA)使用體重介於2.5-6.5 kg範圍內之4.5-8歲雄性及雌性食蟹獼猴執行非人類靈長類動物(NHP) PK研究。NHP藉助於隱靜脈或頭靜脈經IV注射5或20 mg/kg之測試物件(5 ml/kg之劑量體積)。動物經圈養於標準IACUC批准之圈養條件下。在適當時間，對動物進行非末端放血(藉助於股靜脈或頭靜脈)，其中血液經收集於K2 EDTA管中以預防凝血。所收集之血液經離心(2,000 xg ，持續10分鐘)且抽出血漿以隨時間分析測試物件濃度。
藉由如下夾心ELISA量測在各時間點處結合物6之血漿濃度：結合物6分子經捕捉於經神經胺糖酸酶塗佈之板上且接著使用HRP結合之抗人類IgG-Fc抗體進行偵測。在GraphPad Prism中使用結合物6標準曲線之4PL非線性迴歸計算蛋白質濃度。更詳細方法描述提供於下文中。
Nunc Maxisorp 96-孔板(目錄號12-565-136, ThermoFisher)經1X KPL塗佈緩衝液(5150-0041, SeraCare)中來自A/California/04/2009 (H1N1) (11058-VNAHC, Sino Biological)之神經胺糖酸酶塗佈。板在室溫下在軌道板式振盪器上(500 rpm)經培育持續1 h。血漿樣品之連續稀釋液經塗板且在室溫下經培育持續2 h (樣品稀釋劑：1% BSA於PBS 0.05% Tween 20中+原生食蟹獼猴血漿最終濃度為1:2,500)。在各板上一式兩份進行介於500 – 0.230 ng/mL範圍內之結合物6標準曲線。
在2 h培育之後，板在具有0.05% Tween 20之300 uL PBS中洗滌5次。結合於板上之神經胺糖酸酶的結合物6接著在室溫下用1:1,000稀釋於樣品稀釋劑中之HRP結合之抗人類IgG Fc F(ab’)2 (709-036-098, Jackson)探測持續1 h。板接著在具有0.05% Tween 20之300 uL PBS中洗滌8次且用TMB受質顯影持續7-8分鐘。該反應用1N H2 SO4 停止。在450 nm下讀取吸光度。
使用Graphpad Prism Version 6，根據結合物6 (或hIgG1 Fc)標準曲線之非線性迴歸分析(S型，4PL分析)內推測試樣品中之總結合物6。使用WinNonlin軟體計算PK參數。比較結合物6之曲線顯示於圖39中且關鍵PK參數之概述提供於表20中。劑量反應在5與20 mg/kg IV之間呈線性，導致在兩種劑量之間大約9天之半衰期(可與小鼠/大鼠相當)。 表20：結合物6之食蟹獼猴PK
結合物6 半衰期(h) AUC 最後(h*mg/mL)
5 mg/kg IV 230 6240
20 mg/kg IV 197 25400
實例 42. 在 IV 投與測試物件之後的小鼠肺分佈 PK 研究
使用6週齡雄性CD-1小鼠執行小鼠PK研究。小鼠藉助於尾靜脈經IV注射10 mg/kg之測試物件(5 ml/kg之劑量體積)。動物經圈養於標準IACUC批准之圈養條件下。在所指示之時間點，對該等動物實施安樂死以在K2 EDTA管中收集血液(藉助於心臟穿刺)且收集肺。血液經離心(2,000 xg ，持續10分鐘)以獲得血漿。對肺稱重，且在具有無菌一次性杵之1.5 ml管(Z359947, Sigma)中在包含11.64 mL組織蛋白萃取試劑(78510, Thermo Scientific)、0.24 ml蛋白酶抑制劑混合液(78410, Thermo Scientific)及0.12 ml EDTA之100 uL均質化緩衝液中均質化。在1-2 min均質化之後，用均質化緩衝液將體積調節至1 mL且該等樣品在冰上經培育持續20 min，其中藉由輕柔渦旋進行週期性混合。均質液以8,000 xg 離心持續10 min且保留上清液以隨時間分析測試物件濃度。
藉由如下夾心ELISA量測在各時間點處結合物6之血漿及肺濃度：結合物6分子經捕捉於經神經胺糖酸酶塗佈之板上且使用HRP結合之抗人類IgG-Fc抗體進行偵測。在GraphPad Prism中使用結合物6標準曲線之4PL非線性迴歸計算蛋白質濃度。更詳細方法描述提供於下文中。
Nunc Maxisorp 96-孔板(目錄號12-565-136, ThermoFisher)經1X KPL塗佈緩衝液(5150-0041, SeraCare)中來自A/California/04/2009 (H1N1) (11058-VNAHC, Sino Biological)之神經胺糖酸酶塗佈。板在室溫下在軌道板式振盪器上(500 rpm)經培育持續1 h。血漿樣品之連續稀釋液經塗板且在室溫下經培育持續2 h (樣品稀釋劑：1% BSA於PBS 0.05% Tween 20中+原生小鼠血漿最終濃度為1:100)。在各板上一式兩份進行介於500 – 0.230 ng/mL範圍內之結合物6標準曲線。
在2 h培育之後，板在具有0.05% Tween 20之300 uL PBS中洗滌5次。結合於板上之神經胺糖酸酶的結合物6接著在室溫下用1:1,000稀釋於樣品稀釋劑中之HRP結合之抗人類IgG Fc F(ab’)2 (709-036-098, Jackson)探測持續1 h。板接著在具有0.05% Tween 20之300 uL PBS中洗滌8次且用TMB受質顯影持續7-8分鐘。該反應用1N H2 SO4 停止。在450 nm下讀取吸光度。
使用Graphpad Prism Version 6，根據結合物6標準曲線之非線性迴歸分析(S型，4PL分析)內推測試樣品中之總結合物6。比較結合物6血漿及肺濃度之曲線顯示於圖40中。意外地，肺Cmax 在t = 1 h時實現(19.5 μg/g肺組織，約310 nM)。相對於血漿，存在結合物6之大約10%肺暴露實例 43. 比較測試物件之 IV 、 SC 及 IM 投與之 5 天小鼠 PK 研究
使用6週齡雄性CD-1小鼠執行小鼠PK研究。小鼠藉助於尾靜脈經IV注射5 mg/kg之測試物件(5 ml/kg之劑量體積)。動物經圈養於標準IACUC批准之圈養條件下。在適當時間，對動物進行非末端放血(眶後、頰或藉由尾靜脈)，其中血液經收集於K2 EDTA管中以預防凝血。所收集之血液經離心(2,000 xg ，持續10分鐘)且抽出血漿以隨時間分析測試物件濃度。
藉由如下夾心ELISA量測在各時間點處結合物6之血漿濃度：結合物6分子經捕捉於經神經胺糖酸酶塗佈之板上且接著使用HRP結合之抗人類IgG-Fc抗體進行偵測。在GraphPad Prism中使用結合物6 (或hIgG1 Fc)標準曲線之4PL非線性迴歸計算蛋白質濃度。更詳細方法描述提供於下文中。
Nunc Maxisorp 96-孔板(目錄號12-565-136, ThermoFisher)經1X KPL塗佈緩衝液(5150-0041, SeraCare)中來自A/California/04/2009 (H1N1) (11058-VNAHC, Sino Biological)之神經胺糖酸酶塗佈。板在室溫下在軌道板式振盪器上(500 rpm)經培育持續1 h。血漿樣品之連續稀釋液經塗板且在室溫下經培育持續2 h (樣品稀釋劑：1% BSA於PBS 0.05% Tween 20中+原生小鼠血漿最終濃度為1:100)。在各板上一式兩份進行介於500 – 0.230 ng/mL範圍內之結合物6標準曲線。
在2 h培育之後，板在具有0.05% Tween 20之300 uL PBS中洗滌5次。結合於板上之神經胺糖酸酶的結合物6接著在室溫下用1:1,000稀釋於樣品稀釋劑中之HRP結合之抗人類IgG Fc F(ab’)2 (709-036-098, Jackson)探測持續1 h。板接著在具有0.05% Tween 20之300 uL PBS中洗滌8次且用TMB受質顯影持續7-8分鐘。該反應用1N H2 SO4 停止。在450 nm下讀取吸光度。
使用Graphpad Prism Version 6，根據結合物6標準曲線之非線性迴歸分析(S型，4PL分析)內推測試樣品中之總結合物6。比較結合物6之曲線顯示於圖41中。針對IV、IM及SC之暴露水準為相似的，其中AUC分別為2082、1944及2500。實例 44. 小鼠功效及多物種 PK 支持人類個體中之罕見預防性給藥
使用基於小鼠、大鼠及靈長類動物PK研究之小鼠功效給藥的異速生長定標來預測人類個體中之給藥及PK參數。在28天小鼠預防研究(參見實例33)中，異速生長定標係基於2.5 mg/kg有效劑量下之曲線下面積(AUC)。關於單獨食蟹獼猴異速生長定標，使用簡單異速生長等式基於食蟹獼猴PK數據(實例41)計算人類清除(CL)：CL(人類) = CL(猴) • [BW(人類)/BW(猴)]w ，其中BW =體重且w係固定於0.85處之定標指數。單獨食蟹獼猴定標之結果提供於表21中。
關於小鼠-大鼠-食蟹獼猴異速生長定標，根據以下異速生長等式以log-log刻度針對動物體重(BW)繪製動物物種之人類清除(CL)：CL = a•BWx ，其中a為係數且x為該異速生長等式之指數。係數a及指數x分別自線性迴歸線之截距及斜率計算。小鼠-大鼠-食蟹獼猴定標之結果提供於表22中。
藉由上述各別算法計算之人類清除值接著用於使用以下等式計算實現3700 ug-h/mL之功效AUC標靶所需的相應人類劑量(小鼠2.5 mg/kg劑量，實例33)：劑量= CL•AUC。 表21：單獨食蟹獼猴異速生長定標(β = 0.85)
功效曲線下面積(AUC) 3700 μg-h/mL
人類清除(CL) 0.43 mL/min
人類劑量 95.46 mg，1.4 mg/kg
表22. 小鼠-大鼠-食蟹獼猴異速生長定標(β = 0.97)
功效曲線下面積(AUC) 3700 μg-h/mL
人類清除(CL) 0.59 mL/min
人類劑量 130.98 mg，1.9 mg/kg
實例 45. 合成 Int-11
Figure 02_image1630
步驟 a.
Figure 02_image1632
(4-溴丁基)胺基甲酸第三丁酯(11.2 g，60 mmol)及(4-胺基丁基)胺基甲酸第三丁酯(10 g，40 mmol)溶解於DMF (150 mL)中之溶液用碳酸鉀(16.4 g，120 mmol)處理，接著在80℃下攪拌持續6 h。該反應混合物分配於DCM (500 ml)與鹽水(100 ml)之間。分離有機層且用鹽水洗滌，接著經硫酸鈉乾燥。過濾該溶液，濃縮，且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以10%至100%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀使用0.1% TFA作為修飾劑經純化。產物之產量11.0 g，77%。藉由LCMS發現之離子：M+H =360.4步驟 b.
Figure 02_image1634
前一步驟之產物(0.4 g，1.11 mmol)及Fmoc-OSu (0.45 mg，1.3 mmol)溶解於DCM (10 mL)中，接著用N-甲基嗎啉(0.22 ml，2 mmol)處理，且在室溫下攪拌持續1 h。該反應經濃縮且經純化且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以10%至100%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀不使用0.1% TFA作為修飾劑經純化。產物之產量450 mg，69%。藉由LCMS發現之離子：M/2+H =582.4。步驟 c.
Figure 02_image1636
前一步驟之產物(0.4 g，0.7 mmol)在室溫下用TFA (5 mL)處理持續0.5小時，接著濃縮至乾且無需進一步純化即用於下一步驟中。此步驟之產率為定量的。藉由LCMS發現之離子：M/2+H =382.3。步驟 d.
Figure 02_image1638
來自前一步驟之Fmoc二胺(24 mg，0.063 mmol)添加至羧酸(80 mg，0.126 mmol，描述於合成Int-10步驟f中)於DMF (5 mL)中之溶液中，接著相繼用HATU (50 mg，0.13 mmol)、N-甲基嗎啉(0.06 ml，0.50 mmol)處理。在攪拌持續1 h之後，所得溶液經濃縮且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以10%至100%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀不使用TFA作為修飾劑經純化。產物之產量80 mg，79%。藉由LCMS發現之離子：M/2+H =803.9。步驟 e.
Figure 02_image1640
前一步驟之產物(80 mg，0.050 mmol)用DMF (2 mL)中之1% DBU (1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一-7-烯)處理且在室溫下經攪拌。當藉由LCMS發現該反應完成時(15 min)，其經濃縮，接著用TFA (2 mL)處理且在室溫下經攪拌持續30 min。反應溶液經濃縮且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以10%至100%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀使用0.1% TFA作為修飾劑經純化。產物之產量為52 mg，呈TFA鹽形式。藉由LCMS發現之離子：M/2+H =492.7。步驟 f.
Figure 02_image1642
前一步驟之產物溶解於水(2 mL)中，接著用氫氧化鋰(12 mg，0.50 mmol，於1 mL水中)溶液處理。藉由LCMS監測所得反應。在攪拌持續10 min之後，該反應用0.1 ml乙酸淬滅。所得溶液經濃縮且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以0%至30%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀使用0.1% TFA作為修飾劑經純化。產物之產量：30 mg，呈TFA鹽形式，66%。藉由LCMS發現之離子：M/2+H =452.7。M/3+H =302.1。實例 46. 合成 Int-12
Figure 02_image1644
步驟 a.
Figure 02_image1646
向(4-溴丁基)胺基甲酸第三丁酯(4.8 g，19 mmol)及炔丙基-PEG4胺(2 g，8.6 mmol)於DMF (50 mL)中之溶液中添加碳酸鉀(3.6 g，26 mmol)。該溶液在80OC下攪拌持續6 h，接著分配於DCM (200 ml)與鹽水(50 ml)之間。分離有機層，用鹽水洗滌，經硫酸鈉乾燥，過濾，且濃縮，接著藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以10%至100%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀使用0.1% TFA作為修飾劑經純化。產物之產量3.5 g，70%。藉由LCMS發現之離子：M/2+H =574.4。步驟 b.
Figure 02_image1648
前一步驟之產物(3.5 g，8.6 mmol)在室溫下用TFA (20 ml)處理持續0.5小時，接著濃縮至乾，溶解於水中，經冷凍，經凍乾，且無需進一步純化即用於下一步驟中。此步驟之產率為定量的。藉由LCMS發現之離子：M/2+H =374.3。步驟 c.
Figure 02_image1650
來自前一步驟之二胺TFA鹽(37 mg，0.1 mmol)添加至羧酸(130 mg，0.2 mmol，描述於合成Int-10步驟f中)於10 ml DMF中之溶液中，接著用HATU (80 mg，0.2 mmol)及N-甲基嗎啉(0.25 mL，2 mmol)處理。所得溶液經攪拌持續1 h，接著經濃縮且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以10%至100%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀不使用0.1% TFA作為修飾劑經純化。產物之產量120 mg，75%。藉由LCMS發現之離子：M/2+H =799.9。步驟 d.
Figure 02_image1652
前一步驟之產物(120 mg，0.075 mmol)用2 ml三氟乙酸處理且在室溫下經攪拌持續30 min。所得溶液經濃縮，溶解於水(2 mL)中，接著用氫氧化鋰(12 mg，0.5 mmol)溶解於水(1 mL)中之溶液處理。所得溶液經攪拌10 min，接著用0.1 ml乙酸製成略微具酸性，經濃縮且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以0%至30%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀使用0.1% TFA作為修飾劑經純化。產物之產量48 mg，呈TFA鹽形式，57%。藉由LCMS發現之離子：M/2+H =559.757。M/3+H =373.5。實例 47. 合成結合物 8
h-IgG1 Fc-PEG4-疊氮化物於PBSx1緩衝溶液中之溶液(100 mg，1.71 μmol，7.011 mL，MW=58200 Da，DAR=3.7)添加至炔衍生之小分子(Int-12 TFA鹽，45 mg，0.031 mmol)及新鮮製備之CuSO4 (0.7 mL 50.0 mM, 20 eq)、參(3-羥基丙基三唑基甲基)-胺(THPTA，0.7 mL 50.0 mM, 20 eq)及抗壞血酸鈉(1.05 mL 50.0 mM, 30 eq)之pH 7.4 PBS溶液中。所得均質溶液藉由搖桿台攪拌持續12 h。粗溶液用pH 7.4 PBS稀釋至1 mg/mL之最終濃度，且經超濾(10,000 MWCO)兩次至1 mL體積。粗混合物接著1:10稀釋於PBS pH 7.4中，且相繼使用MabSelect Sure Resin (GE Healthcare, Chicago, IL, USA)、尺寸排阻層析法經純化。經純化材料使用Nanodrop™ UV可見光光譜儀(使用基於結合中所用之Fc之胺基酸序列計算的消光係數經定量，且使用離心濃縮機(10,000 MWCO)經濃縮至大約10 mg/mL。經純化分子使用4-12% Bis Tris SDS PAGE凝膠藉由將1-2 µg每種分子裝載至該凝膠中且使用instant Blue染色進行染色而經分析。各凝膠包括具有經指示分子量標準之分子量梯(圖42)。產率典型地為40-60%。MALDI MS分析顯示質量範圍(60000-90000)，其中質量之平均值為62358。平均DAR=3。實例 48. 在 CPE 分析中且在致死性小鼠流感模型中比較所選擇之抑制劑與其 Fc- 結合物之活體外及活體內效能
為了證明本文所述之神經胺糖酸酶抑制劑與Fc的結合在病毒複製分析中且在活體內功效模型中增強其活性，吾人在細胞病理效應(CPE)分析中且在致死性小鼠流感感染模型中比較所選擇之未結合抑制劑與其Fc結合物之活性。關於CPE微量中和分析，一式兩份製備以160 nM或400 nM (關於紮那米韋及奧司他韋對照物，9600 nM)開始之各測試物件(TA)之十種兩倍連續稀釋液，用於一小時接種感染複數(MOI)為0.001之INFV A (A/CA/09 H1N1)及MOI為0.01之INFV B，以用於一小時培育。該TA-病毒混合物接著添加至接種於96-孔板中之MDCK細胞中，且培育持續一小時。在INFV A感染後第3天及INFV B (B/Brisbane)感染後第5天，細胞經固定且用結晶紫染色且讀取光學密度以使用XLfit劑量反應模型計算各TA之50%有效濃度(EC50 )。亦使用以160 nM或400 nM開始之各TA之十種兩倍連續稀釋液評估各TA之固有細胞毒性，該等稀釋液一式兩份經製備以用於接種96-孔培養板中之MDCK細胞。在治療之後3及5天使用CellTiter-Glo套組測定細胞性能。使用XLfit劑量反應模型計算細胞毒性濃度之50% (CC50 )。直至所測試之最高濃度，關於任何TA均未觀察到細胞毒性。基於CPE之微量中和分析之概述顯示於表23中。 表23. 基於CPE之微量中和分析
   EC50 對INFV A (nM) EC50 對INFV B (nM)
奧司他韋 390.0 1065.0
紮那米韋 264.8 382.6
Int-7 ( 對應於結合物6 之靶向部分) 665.7 106.6
Int-12 ( 對應於結合物8 之靶向部分) 15.4 0.6
結合物6 4.0 52.1
結合物8 0.6 0.3
概述於表23中之數據證明該等神經胺糖酸酶二聚體之Fc結合形式在CPE微量中和分析中具有優於其未結合配對物之活性。當比較結合物6與Int-7時，分別觀察到相對INFV A及INFV B之166倍及2倍增強。當比較結合物8與Int-12時，分別觀察到相對INFV A及INFV B之26倍及2倍增強。
使用雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories, 6-8週)在致死性IAV H1N1流感感染模型中比較結合物6與表23中所概述之該研究之最有效神經胺糖酸酶抑制劑二聚體(Int-11，對應於Int-12但不具有三聚體連接體之單獨二聚體，允許結合於Fc)。攻擊病毒(A/Puerto Rico/08/1934, aka PR8)係小鼠適應性分離株，具有每只小鼠大約30個斑塊形成單元(pfu)之LD90 。
該實驗包含8組，每組5只小鼠。在第0天，所有小鼠均藉由鼻內接種至經氯胺酮/甲苯噻嗪之混合物(分別為150及10 mg/kg)麻醉之小鼠經50 µl體積之PR8 (10x LD90 )攻擊。在攻擊之後2小時，各組藉由IV接受媒劑、單獨hIgG1 Fc、結合物6或Int-11之單一治療(表24；第1-6組)。第7組亦藉由IV接受Int-11 (15 mg/kg)，每天兩次(bid)，持續5天。第8組經口(PO)接受奧司他韋(15 mg/kg)，bid，持續5天。在病毒攻擊之後監測所有小鼠之生存(表25)及重量損失(數據未示)，持續10天。
如所預期，經媒劑或單獨hIgG1 Fc治療之小鼠截至第7天屈服於感染(表25)。經10個劑量(總計150 mg/小鼠)之奧司他韋治療之小鼠證明統計學上顯著的死亡延遲，但直至第10天僅有單一動物生存。接受0.3或3 mg/kg之單一劑量之結合物6的所有小鼠均生存至該研究結束且在該實驗之過程中顯示淨重量增加。重要的是，接受0.3或3 mg/kg之Int-11的所有小鼠均在該研究之過程中死亡，相對於媒劑及單獨hIgG1 Fc對照物僅具有最短(2天或更短)死亡延遲。由於hIgG1 Fc不具有固有抗病毒活性(第2組)，這表明結合物6之經極大改良活性係由Fc上之多價呈現引起的經改良親合力之結果，如概述於表23中之結果以及Fc介導之免疫銜接的經改良藥物動力學及作用所表明。單獨抑制劑二聚體與結合物6之間的活性差異在兩種劑量濃度下均為統計學上顯著的(比較第3組及第6組，及第4組及第5組；表25)。以質量計，需要高500倍之累積劑量之Int-11來觀察到與結合物6相等之功效。 表24：研究設計
組 n=5 攻擊 第0 天 化合物 劑量 (mg/kg) 治療 途徑/ 時程
1 流感A病毒(H1N1)  A/Puerto Rico/08/1934，藉助於IN途徑。 媒劑(PBS) N/A IV，單一劑量，在感染後2小時開始
2 單獨hIgG1 Fc 3
3 結合物6 3
4 結合物6 0.3
5 Int-11 0.3
6 Int-11 3
7 Int-11 15 IV，bid ，持續5 天 ，在感染後2小時開始
8 奧司他韋(TamifluTM ) 20 PO，bid ，持續5 天 ，在感染後2小時開始
表25：小鼠生存
組 測試物件 劑量(mg/kg) 給藥時程 % 生存 相對媒劑之顯著性 相對Int-11 之顯著性 0.3 mg/kg* 或3 mg/kg^
1 媒劑(PBS)    IV，單一 0      
2 單獨hIgG1 Fc 3 IV，單一 0 NS   
3 結合物6 3 IV，單一 100 0.0027 0.0035^
4 結合物6 0.3 IV，單一 100 0.0027 0.0027*
5 Int-11 0.3 IV，單一 0 0.0027   
6 Int-11 3 IV，單一 0 0.0027   
7 Int-11 15 IV，bid × 5天 100 0.0027   
8 奧司他韋 15 PO，bid × 5天 20 0.0027   
實例 49. 合成 Int-13 ((5R)-((1R)- 乙醯胺基 -(2S)- 甲氧基 -(2S)- 甲基戊基 )-(4S)-E/Z-[3-( 炔丙基 -PEG4)- 丙烯基 ]- 吡咯啶 -(2R)- 甲酸 )
Figure 02_image1654
步驟 a. (2R)-((1R)- 乙醯胺基 -(2S)- 甲氧基 -(2S)- 甲基戊基 )-(5R)- 羧基 -(3S)-Z- 丙烯基吡咯啶 -1- 甲酸第三丁酯。
向(5R)-((1R)-乙醯胺基-(2S)-甲氧基-(2S)-甲基戊基)-(4S)-Z-丙烯基吡咯啶-(2R)-甲酸, HCI鹽(根據參考文獻JACS , 2002,124 , 4716-4721經製備；1.0 mmol)於乙腈(10 mL)中之攪拌混合物中添加三甲基氫氧化銨(1.5 mmol)。在室溫下攪拌持續3 h之後，添加二碳酸二-第三丁酯(4 eqmol)。在反應完成時，所有揮發物均根據真空技術經蒸發。殘餘物用水(10 ml)稀釋。添加乙酸乙酯(10 ml)，且添加1 M硫酸水溶液直至水層達到pH約為3。用乙酸乙酯之額外兩個等分試樣(10 mL)洗滌水層。經組合之有機物經硫酸鈉乾燥，過濾且濃縮。殘餘物藉由層析技術經純化以提供所需產物。步驟 b. (2R)-((1R)- 乙醯胺基 -(2S)- 甲氧基 -(2S)- 甲基戊基 )-(5R)- 羧基甲基 -(3S)-Z- 丙烯基吡咯啶 -1- 甲酸第三丁酯。
向(2R)-((1R)-乙醯胺基-(2S)-甲氧基-(2S)-甲基戊基)-(5R)-羧基-(3S)-Z-丙烯基吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(1.0 mmol)於二氯甲烷(5.0 mL)及甲醇(1.0 mL)中之0℃攪拌混合物中緩慢地添加(三甲基矽烷基)重氮甲烷(1.1 mmol)。該混合物經攪拌直至完成，同時輕柔地使溫度達到環境溫度。所有揮發物均根據真空技術經蒸發。必要時，殘餘物藉由層析技術經純化以提供所需產物。步驟 c. (2R)-((1R)- 乙醯胺基 -(2S)- 甲氧基 -(2S)- 甲基戊基 )-(5R)- 羧基甲基 -(3S)- 甲醯基吡咯啶 -1- 甲酸第三丁酯。
(2R)-((1R)-乙醯胺基-(2S)-甲氧基-(2S)-甲基戊基)-(5R)-羧基甲基-(3S)-Z-丙烯基吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(1 mmol)於二氯甲烷(15 mL)中之室溫混合物經冷卻至-78℃。臭氧鼓泡通過該溶液，直至溶解之臭氧的淡藍色持續。氮氣鼓泡通過該溶液，直至藍色消失，接著添加二甲硫醚(4.0 mmol)，燒瓶經轉移至冷凍器(-20℃)中且靜置持續1小時。濃縮該溶液且殘餘物藉由層析技術經純化以提供所需產物。步驟 d. (2R)-((1R)- 乙醯胺基 -(2S)- 甲氧基 -(2S)- 甲基戊基 )-(5R)- 羧基甲基 -(3S)-E/Z-[3-( 炔丙基 -PEG4)- 丙烯基 ] 吡咯啶 -1- 甲酸第三丁酯。
向炔丙基-PEG4-溴化鏻(1.0 mmol)於DMF (5.0 mL)中之0℃攪拌混合物中添加氫化鈉(1.1 mmol)，且10分鐘之後，溫度升至環境溫度。繼續攪拌持續1 h，接著添加DMF (1.0 mL)中之(2R)-((1R)-乙醯胺基-(2S)-甲氧基-(2S)-甲基戊基)-(5R)-羧基甲基-(3S)-甲醯基吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(1.0 mmol)。在完成時，該反應藉由飽和氯化銨溶液淬滅。用乙酸乙酯萃取該水溶液數次，且經組合之有機相用鹽水洗滌，乾燥，且蒸發。殘餘物藉由層析技術經純化以提供所需產物。步驟 e. (2R)-((1R)- 乙醯胺基 -(2S)- 甲氧基 -(2S)- 甲基戊基 )-(5R)- 羧基 -(3S) E/Z-[3-( 炔丙基 -PEG4)- 丙烯基 ] 吡咯啶 -1- 甲酸第三丁酯。
向(2R)-((1R)-乙醯胺基-(2S)-甲氧基-(2S)-甲基戊基)-(5R)-羧基甲基-(3S)-E/Z-[3-(炔丙基-PEG4)-丙烯基]吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(1.0 mmol)於四氫呋喃(12.0 mL)及水(3.0 mL)中之0℃攪拌混合物中添加氫氧化鋰(1.1 mmol)。繼續攪拌且溫度在15分鐘之後升至環境溫度。在完成時，藉助於過量添加AMBERLITE® IRN-77樹脂使該溶液達到酸性pH。過濾該混合物且濾液根據真空技術經濃縮，生成標題化合物。必要時，殘餘物藉由層析技術經純化以提供所需產物。步驟 f. (5R)-((1R)- 乙醯胺基 -(2S)- 甲氧基 -(2S)- 甲基戊基 )-(4S)-E/Z-[3-( 炔丙基 -PEG4)- 丙烯基 ]- 吡咯啶 -(2R)- 甲酸。
向(2R)-((1R)-乙醯胺基-(2S)-甲氧基-(2S)-甲基戊基)-(5R)-羧基-(3S) E/Z-[3-(炔丙基-PEG4)-丙烯基]吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(1.0 mmol)及2-甲基-2-丁烯(0.5 mL)於二氯甲烷(8.0 mL)中之0℃攪拌混合物中添加三氟乙酸(4.0 mL)。10分鐘之後，溫度升至環境溫度。在完成時，所有揮發物均根據真空技術經蒸發。殘餘物藉由層析技術經純化以提供所需產物。實例 50. 合成結合物 9
hIgG1 Fc-PEG4-疊氮化物於pH 7.4 PBS x 1緩衝溶液中之溶液(100 mg，1.71 umol，7.011 mL，MW = 58,200 Da，DAR = 3.7)添加至Int-13 ((5R)-((1R)-乙醯胺基-(2S)-甲氧基-(2S)-甲基戊基)-(4S)-E/Z-[3-(炔丙基-PEG4)-丙烯基]-吡咯啶-(2R)-甲酸) (0.031 mmol)、硫酸銅(0.62 mmol)、參(3-羥基丙基三唑基甲基)-胺(0.62 mmol)及抗壞血酸鈉(0.93 mmol)之pH 7.4 PBS x 1緩衝溶液(2.45 mL)中。所得均質溶液用搖桿台輕柔地震盪持續12 h。粗溶液用pH 7.4 PBS稀釋至1 mg/mL之最終濃度，且經超濾(10,000 MWCO)兩次至1 mL體積。粗混合物接著1:10稀釋於PBS pH 7.4中，且相繼使用MabSelect Sure Resin (GE Healthcare, Chicago, IL, USA)、尺寸排阻層析法經純化。經純化材料使用Nanodrop™ UV可見光光譜儀(使用基於結合中所用之Fc之胺基酸序列計算的消光係數經定量，且使用離心濃縮機(10,000 MWCO)經濃縮至大約10 mg/mL。經純化分子使用4-12% Bis Tris SDS PAGE凝膠藉由將1-2 ug每種分子裝載至該凝膠中且使用instant Blue染色進行染色而經分析。各凝膠包括具有經指示分子量標準之分子量梯。使用MALDI MS分析來測定平均DAR。實例 51. 合成炔丙基 -PEG4- 溴化鏻。
Figure 02_image1656
炔丙基-PEG4-溴化物(1.0 mmol)及三苯膦(1.2 mmol)於甲苯(10 mL)中之混合物經回流。在完成時，該混合物冷卻至環境溫度。過濾固體且無需任何額外純化即用於下一步驟。實例 52. 合成 Int-14 ((5R)-[(1R)-( 炔丙基 -PEG4- 羧醯胺 )-(2S)- 甲氧基 -(2S)- 甲基戊基 ]-(4S)-Z- 丙烯基吡咯啶 -(2R)- 甲酸 , HCI 鹽 )
Figure 02_image1658
步驟 a. N-{(2.S)- 甲氧基 -((1R)-[1-(4- 甲氧基苯甲基 )-5- 側氧基 -(3S)-Z- 丙烯基吡咯啶 -(2R)- 基 ]-(2S)- 甲基戊基 }-( 炔丙基 -PEG4)- 甲醯胺。
向{(2S)-甲氧基-(1R)-[1-(4-甲氧基苯甲基)-5-側氧基-(3S)-Z-丙烯基吡咯啶-(2R)-基]-(2S)-甲基戊基}-胺基甲酸第三丁酯(其根據參考文獻JACS , 2002,124 , 4716-4721經製備；1.0 mmol)於無水二氯甲烷(5 mL)中之0℃攪拌混合物中添加三氟乙酸(10 mmol)，且溫度升至環境溫度。在完成時，在減壓下移除溶劑。所得殘餘物溶解於二氯甲烷(20 mL)中且用飽和碳酸氫鈉水溶液萃取。分離有機層，乾燥(硫酸鈉)，過濾且蒸發。粗胺溶解於DMF (5 mL)中且在0℃下在攪拌下用炔丙基-PEG4-酸(1.1 mmol)、二異丙基乙胺(3.0 mmol)及HATU (1.1 mmol)處理。在反應完成時，所有揮發物均根據真空技術經蒸發。殘餘物溶解於乙酸乙酯(15 ml)中，且相繼用飽和碳酸氫鈉水溶液(10 mL)、1 M硫酸水溶液(10 mL)洗滌。經組合之有機物經硫酸鈉乾燥，過濾且濃縮。殘餘物藉由層析技術經純化以提供所需產物。步驟 b. (2R)-((1R)-( 炔丙基 -PEG4- 羧醯胺 )-(2S)- 甲氧基 -(2S)- 甲基戊基 )-(5R)- 側氧基 -(3S)-Z- 丙烯基吡咯啶 -1- 甲酸第三丁酯。
在45℃下在1 h期間分成小份向N-{(2.S)-甲氧基-(1R)-[1-(4-甲氧基苯甲基)-5-側氧基-(3S)-Z-丙烯基吡咯啶-(2R)-基]-(2S)-甲基戊基}-(炔丙基-PEG4)-甲醯胺(1.0 mmol)於乙腈及水之混合物(10:1，5 mL)中之攪拌溶液中添加硝酸鈰銨(2.0 mmol)，且繼續攪拌直至完成。該反應用飽和碳酸氫鈉水溶液(5 mL)淬滅。水層用EtOAc (3 × 10 mL)萃取，經組合之有機層經乾燥(硫酸鈉)且蒸發以生成粗物質，其無需進一步純化即用於下一步驟。該材料溶解於乙腈(5 mL)中，相繼添加碳酸二-第三丁酯(1.5 mmol)、三乙胺(2.0 mmol)及DMAP (催化量)。在完成時，該反應用飽和氯化銨溶液(5 mL)淬滅。水層用EtOAc (3 × 10 mL)萃取，且經組合之有機層經乾燥(硫酸鈉)。所有揮發物均根據真空技術經移除。必要時，殘餘物藉由層析技術經純化以提供所需產物。步驟 c. (2R)-((1R)-( 炔丙基 -PEG4- 羧醯胺 )-(2S)- 甲氧基 -(2S)- 甲基戊基 )-(5R/S)- 甲氧基 -(3S)-Z- 丙烯基吡咯啶 -1- 甲酸第三丁酯。
向(2R)-((1R)-(炔丙基-PEG4-羧醯胺)-(2S)-甲氧基-(2S)-甲基戊基)-(5R)-側氧基-(3S)-Z-丙烯基吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(1.0 mmol)於THF (8 mL)中之-78℃攪拌溶液中添加SUPER-HYDRIDE® (1 M於THF中，2.2 mmol)。30 min之後，該反應混合物用飽和碳酸氫鈉水溶液(4 mL)及30%過氧化氫(5滴)淬滅。該混合物加溫至rt且再攪拌持續30 min且水層用EtOAc (3 × 10 mL)萃取。經組合之有機層經乾燥(硫酸鈉)且蒸發溶劑以生成半胺醛，其無需進一步純化即使用。在rt下向上述產物於甲醇(16 mL)中之溶液中添加對甲苯磺酸水合物(0.1 mmol)。該反應混合物經攪拌隔夜且用飽和碳酸氫鈉水溶液(10 mL)淬滅。在減壓下移除甲醇，水(10 mL)添加至所得殘餘物中且用EtOAc (3 × 10 mL)萃取。分離有機物且經鹽水及硫酸鈉乾燥，過濾且濃縮。必要時，殘餘物藉由層析技術經純化以提供所需產物。步驟 d. (2R)-((1R)-( 炔丙基 -PEG4- 羧醯胺 )-(2S)- 甲氧基 -(2S)- 甲基戊基 )-(5R)- 氰基 -(3S)-Z- 丙烯基吡咯啶 -1- 甲酸第三丁酯。
向(2R)-((1R)-(炔丙基-PEG4-羧醯胺)-(2S)-甲氧基-(2S)-甲基戊基)-(5R/S)-甲氧基-(3S)-Z-丙烯基吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(1.0 mmol)於二氯甲烷(20 mL)中之-78℃攪拌溶液中相繼添加氰化三甲基矽烷(2.0 mmol)、三氟化硼乙醚(1.2 mmol)。該反應混合物經3 h時期自-78℃經攪拌至-50℃。添加飽和碳酸氫鈉水溶液(40 mL)且水層用EtOAc (3 × 15 mL)萃取。經組合之有機層經乾燥(硫酸鈉)，過濾且在減壓下濃縮。由差向異構氰基衍生物之混合物組成的所得殘餘物藉由層析技術經純化以提供所需產物。步驟 e. (5R)-[(1R)-( 炔丙基 -PEG4- 羧醯胺 )-(2S)- 甲氧基 -(2S)- 甲基戊基 ]-(4S)-Z- 丙烯基吡咯啶 -(2R)- 甲酸 , HCI 鹽。
在rt下向(2R)-((1R)-(炔丙基-PEG4-羧醯胺)-(2S)-甲氧基-(2S)-甲基戊基)-(5R)-氰基-(3S)-Z-丙烯基吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(1.0 mmol)於AcOH (10 mL)中之溶液中添加12N HCI (10 mL)。該溶液在rt下經攪拌直至完成，在減壓下蒸發溶劑。必要時，殘餘物藉由層析技術經純化以提供所需產物。實例 53. 合成結合物 10
hIgG1 Fc-PEG4-疊氮化物於pH 7.4 PBS x 1緩衝溶液中之溶液(100 mg，1.71 umol，7.011 mL，MW = 58,200 Da，DAR = 3.7)添加至Int-14 ((5R)-[(1R)-(炔丙基-PEG4-羧醯胺)-(2S)-甲氧基-(2S)-甲基戊基]-(4S)-Z-丙烯基吡咯啶-(2R)-甲酸, HCI鹽) (0.031 mmol)、硫酸銅(0.62 mmol)、參(3-羥基丙基三唑基甲基)-胺(0.62 mmol)及抗壞血酸鈉(0.93 mmol)之pH 7.4 PBS x 1緩衝溶液(2.45 mL)中。所得均質溶液用搖桿台輕柔地震盪持續12 h。粗溶液用pH 7.4 PBS稀釋至1 mg/mL之最終濃度，且經超濾(10,000 MWCO)兩次至1 mL體積。粗混合物接著1:10稀釋於PBS pH 7.4中，且相繼使用MabSelect Sure Resin (GE Healthcare, Chicago, IL, USA)、尺寸排阻層析法經純化。經純化材料使用Nanodrop™ UV可見光光譜儀(使用基於結合中所用之Fc之胺基酸序列計算的消光係數經定量，且使用離心濃縮機(10,000 MWCO)經濃縮至大約10 mg/mL。經純化分子使用4-12% Bis Tris SDS PAGE凝膠藉由將1-2 ug每種分子裝載至該凝膠中且使用instant Blue染色進行染色而經分析。各凝膠包括具有經指示分子量標準之分子量梯。使用MALDI MS分析來測定平均DAR。實例 54. 合成 Int-15, HCI 鹽
Figure 02_image1660
步驟 a. N-{(2.S)- 甲氧基 -((1R)-[1-(4- 甲氧基苯甲基 )-5- 側氧基 -(3S)-Z- 丙烯基吡咯啶 -(2R)- 基 ]-(2S)- 甲基戊基 }-(3- 丁炔基 )- 甲醯胺。
向{(2S)-甲氧基-(1R)-[1-(4-甲氧基苯甲基)-5-側氧基-(3S)-Z-丙烯基吡咯啶-(2R)-基]-(2S)-甲基戊基}-胺基甲酸第三丁酯(其根據參考文獻JACS , 2002,124 , 4716-4721經製備；1.0 mmol)於無水二氯甲烷(5 mL)中之0℃攪拌混合物中添加三氟乙酸(10 mmol)，且溫度升至環境溫度。在完成時，在減壓下移除溶劑。所得殘餘物溶解於二氯甲烷(20 mL)中且用飽和碳酸氫鈉水溶液萃取。分離有機層，乾燥(硫酸鈉)，過濾且蒸發。粗胺溶解於DMF (5 mL)中且在0℃下在攪拌下用4-戊炔酸(1.1 mmol)、二異丙基乙胺(3.0 mmol)及HATU (1.1 mmol)處理。在反應完成時，所有揮發物均根據真空技術經蒸發。殘餘物溶解於乙酸乙酯(15 ml)中，且相繼用飽和碳酸氫鈉水溶液(10 mL)、1 M硫酸水溶液(10 mL)洗滌。經組合之有機物經硫酸鈉乾燥，過濾且濃縮。殘餘物藉由層析技術經純化以提供所需產物。步驟 b. (2R)-((1R)-(4- 戊炔醯基 )-(2S)- 甲氧基 -(2S)- 甲基戊基 )-(5R)- 側氧基 -(3S)-Z- 丙烯基吡咯啶 -1- 甲酸第三丁酯。
在45℃下在1 h期間分成小份向N-{(2.S)-甲氧基-(1R)-[1-(4-甲氧基苯甲基)-5-側氧基-(3S)-Z-丙烯基吡咯啶-(2R)-基]-(2S)-甲基戊基}-(3-丁炔基)-甲醯胺(1.0 mmol)於乙腈及水之混合物(10:1，5 mL)中之攪拌溶液中添加硝酸鈰銨(2.0 mmol)，且繼續攪拌直至完成。該反應用飽和碳酸氫鈉水溶液(5 mL)淬滅。水層用EtOAc (3 × 10 mL)萃取，經組合之有機層經乾燥(硫酸鈉)且蒸發以生成粗物質，其無需進一步純化即用於下一步驟。該材料溶解於乙腈(5 mL)中，相繼添加碳酸二-第三丁酯(1.5 mmol)、三乙胺(2.0 mmol)及DMAP (催化量)。在完成時，該反應用飽和氯化銨溶液(5 mL)淬滅。水層用EtOAc (3 × 10 mL)萃取，且經組合之有機層經乾燥(硫酸鈉)。所有揮發物均根據真空技術經移除。必要時，殘餘物藉由層析技術經純化以提供所需產物。步驟 c. (2R)-((1R)-(4- 戊炔醯基 )-(2S)- 甲氧基 -(2S)- 甲基戊基 )-(5R/S)- 甲氧基 -(3S)-Z- 丙烯基吡咯啶 -1- 甲酸第三丁酯。
向(2R)-((1R)- (2R)-((1R)-(4-戊炔醯基)-(2S)-甲氧基-(2S)-甲基戊基)-(5R)-側氧基-(3S)-Z-丙烯基吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(1.0 mmol)於THF (8 mL)中之-78℃攪拌溶液中添加SUPER-HYDRIDE® (1 M於THF中，2.2 mmol)。30 min之後，該反應混合物用飽和碳酸氫鈉水溶液(4 mL)及30%過氧化氫(5滴)淬滅。該混合物加溫至rt且再攪拌持續30 min且水層用EtOAc (3 × 10 mL)萃取。經組合之有機層經乾燥(硫酸鈉)且蒸發溶劑以生成半胺醛，其無需進一步純化即使用。在rt下向上述產物於甲醇(16 mL)中之溶液中添加對甲苯磺酸水合物(0.1 mmol)。該反應混合物經攪拌隔夜且用飽和碳酸氫鈉水溶液(10 mL)淬滅。在減壓下移除甲醇，水(10 mL)添加至所得殘餘物中且用EtOAc (3 × 10 mL)萃取。分離有機物且經鹽水及硫酸鈉乾燥，過濾且濃縮。必要時，殘餘物藉由層析技術經純化以提供所需產物。步驟 d. (2R)-((1R)-(4- 戊炔醯基 )-(2S)- 甲氧基 -(2S)- 甲基戊基 )-(5R)- 氰基 -(3S)-Z- 丙烯基吡咯啶 -1- 甲酸第三丁酯。
向(2R)-((1R)-(4-戊炔醯基)-(2S)-甲氧基-(2S)-甲基戊基)-(5R/S)-甲氧基-(3S)-Z-丙烯基吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(1.0 mmol)於二氯甲烷(20 mL)中之-78℃攪拌溶液中相繼添加氰化三甲基矽烷(2.0 mmol)、三氟化硼乙醚(1.2 mmol)。該反應混合物經3 h時期自-78℃經攪拌至-50℃。添加飽和碳酸氫鈉水溶液(40 mL)且水層用EtOAc (3 × 15 mL)萃取。經組合之有機層經乾燥(硫酸鈉)，過濾且在減壓下濃縮。由差向異構氰基衍生物之混合物組成的所得殘餘物藉由層析技術經純化以提供所需產物。步驟 e.
向N-{(2.S)-甲氧基-(1R)-[1-(4-甲氧基苯甲基)-5-側氧基-(3S)-Z-丙烯基吡咯啶-(2R)-基]-(2S)-甲基戊基}-(3-丁炔基)-甲醯胺(1.0 mmol)、雙-[N'-(2-疊氮基乙基)]-亞胺基二乙醯胺(0.5 mmol)、1H-1,2,3-三唑-4-甲胺, 1-(苯基甲基)-N,N-雙[1-(苯基甲基)-1H-1,2,3-三唑-4-基]甲基]-(0.1 mmol)及抗壞血酸鈉(1.0 mmol)於乙醇(5 mL)及水(5 mL)中之攪拌混合物中添加硫酸銅(0.1 mmol)。在完成時，該反應用SiliaMetS TAAcONa (0.3 mmol)處理持續30分鐘。過濾該反應且所有揮發物均根據真空技術經蒸發。殘餘物藉由層析技術經純化以提供所需產物。步驟 f.
向步驟e.之中間物(1.0 mmol)、炔丙基-PEG4-酸(1.05 mmol)及DIPEA (3.0 mmol)於DMF (10 mL)中之0℃攪拌溶液中添加HATU (2.0 mmol)。所有揮發物均根據真空技術經蒸發且殘餘物藉由層析技術經純化以提供所需產物。步驟 g. Int-15, HCl 鹽
在rt下向步驟f.之中間物(1.0 mmol)於AcOH (10 mL)中之溶液中添加12N HCI (10 mL)。該溶液在rt下經攪拌直至完成，在減壓下蒸發溶劑。必要時，殘餘物藉由層析技術經純化以提供所需產物。實例 55. 合成結合物 11
hIgG1 Fc-PEG4-疊氮化物於pH 7.4 PBS x 1緩衝溶液中之溶液(100 mg，1.71 umol，7.011 mL，MW = 58,200 Da，DAR = 3.7)添加至Int-15 HCI鹽(0.031 mmol)、硫酸銅(0.62 mmol)、參(3-羥基丙基三唑基甲基)-胺(0.62 mmol)及抗壞血酸鈉(0.93 mmol)之pH 7.4 PBS x 1緩衝溶液(2.45 mL)中。所得均質溶液用搖桿台輕柔地震盪持續12 h。粗溶液用pH 7.4 PBS稀釋至1 mg/mL之最終濃度，且經超濾(10,000 MWCO)兩次至1 mL體積。粗混合物接著1:10稀釋於PBS pH 7.4中，且相繼使用MabSelect Sure Resin (GE Healthcare, Chicago, IL, USA)、尺寸排阻層析法經純化。經純化材料使用Nanodrop™ UV可見光光譜儀(使用基於結合中所用之Fc之胺基酸序列計算的消光係數經定量，且使用離心濃縮機(10,000 MWCO)經濃縮至大約10 mg/mL。經純化分子使用4-12% Bis Tris SDS PAGE凝膠藉由將1-2 ug每種分子裝載至該凝膠中且使用instant Blue染色進行染色而經分析。各凝膠包括具有經指示分子量標準之分子量梯。使用MALDI MS分析來測定平均DAR。實例 56. 合成雙 -[N'-(2- 疊氮基乙基 )]- 亞胺基二乙醯胺。
Figure 02_image1662
步驟 a. 雙 -[N'-(2- 疊氮基乙基 )]-N-Boc- 亞胺基二乙醯胺。
向N-Boc-亞胺基二乙酸(1.0 mmol)、2-疊氮基乙-1-胺鹽酸鹽(2.0 mmol)及DIPEA (6.0 mmol)於DMF (10 mL)中之0℃攪拌溶液中添加HATU (2.0 mmol)。所有揮發物均根據真空技術經蒸發且殘餘物藉由層析技術經純化以提供所需產物。步驟 b. 雙 -[N'-(2- 疊氮基乙基 )]- 亞胺基二乙醯胺。
向雙-[N'-(2-疊氮基乙基)]-N-Boc-亞胺基二乙醯胺(1.0 mmol)及2-甲基-2-丁烯(0.5 mL)於二氯甲烷(8.0 mL)中之0℃攪拌混合物中添加三氟乙酸(4.0 mL)。10分鐘之後，溫度升至環境溫度。在完成時，所有揮發物均根據真空技術經蒸發。殘餘物藉由層析技術經純化以提供所需產物。實例 57. 合成 Int-16
結合於PEG4 -炔連接體且可進一步結合於Fc域或白蛋白之磺基紮那米韋單體係根據以下合成流程產生。磺基紮那米韋起始材料係根據Hadházi等人 A sulfozanamivir analogue has potent anti-influenza virus activity.ChemMedChem Comm. 13:785-789 (2018)產生。
Figure 02_image1664
實例 58. 合成 Int-17
結合於PEG4 -炔連接體且可進一步結合於Fc域或白蛋白之磺基紮那米韋二聚體係根據以下合成流程產生。磺基紮那米韋起始材料係根據Hadházi等人 A sulfozanamivir analogue has potent anti-influenza virus activity.ChemMedChem Comm. 13:785-789 (2018)產生。
Figure 02_image1666
實例 59. 合成結合物 12
經疊氮基官能化之無糖基化Fc (70 mg，4.7 mL，1.3709 µmol)之溶液添加至含有炔衍生之小分子(29.8 mg，0.0216 mmol，Int-7)之15 mL離心管中。在輕柔地震盪以溶解所有固體之後，向該混合物中添加206 µl L-抗壞血酸鈉(59.4 mg，0.3 mmol)、硫酸銅(II) (15.9 mg，0.1 mmol)及THPTA (43.5 mg，0.1 mmol)於PBS 7.4緩衝液(1 ml)中之混合溶液。所得混合物輕柔地震盪隔夜。其相繼藉由在蛋白A管柱上之親和力層析法、如實例8所述之尺寸排阻層析法經純化。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出56,177 Da之平均質量(DAR = 3.6)。產量10.1 mg，14%產率。結合物12之非還原SDS-PAGE提供於圖54中。實例 60. 合成 Int-18
Figure 02_image1668
步驟 a. 合成 (17-{4-[( 第三丁氧羰基 ) 胺基 ] 丁基 }-16- 側氧基 -4,7,10,13- 四氧雜 -17- 氮雜二十一 -1- 炔 -21- 基 ) 胺基甲酸第三丁酯
Figure 02_image1670
在室溫下向[氮烷二基二(丁烷-4,1-二基)]雙胺基甲酸二-第三丁酯(1.5 g，4.17 mmol，來自實例45步驟a)及炔丙基-PEG4-酸(1.08 g，4.17 mmol)於DCM (40 mL)中之溶液中添加EDC (1.0 g，5 mmol)、HOBt (650 mg，5 mmol)及DIEA (1.4 ml，10mmol)，接著在室溫下攪拌隔夜。所得溶液經濃縮且經純化且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以10%至100%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀不使用修飾劑經純化。產量1.9 g，76%。藉由LCMS發現之離子：M+H =602.4。步驟 b. 合成 N,N- 雙 (4- 胺基丁基 )-4,7,10,13- 四氧雜十六 -15- 炔 -1- 醯胺
Figure 02_image1672
(17-{4-[(第三丁氧羰基)胺基]丁基}-16-側氧基-4,7,10,13-四氧雜-17-氮雜二十一-1-炔-21-基)胺基甲酸第三丁酯(1.90，3.1 mmol)在室溫下用20 ml TFA處理持續0.5小時，接著濃縮至乾且無需進一步純化即用於下一步驟中。此步驟之產率為定量的。藉由LCMS發現之離子：M/2+H =402.3。步驟 c. 合成經完全保護之 Int-18
Figure 02_image1674
N,N-雙(4-胺基丁基)-4,7,10,13-四氧雜十六-15-炔-1-醯胺(0.150 g，0.32 mmol)添加至醚連接之紮那米韋酸(0.400 g，0.63 mmol，描述於實例31步驟f中)於DCM (10 mL)中之溶液中，接著在室溫下用EDC (0.200 g，1.0 mmol)、HOBt (0.135 g，1.00 mmol)及DIEA (0.14 ml，1.00 mmol)處理隔夜。所得溶液經濃縮且經純化且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以10%至100%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀不使用0.1% TFA作為修飾劑經純化。產物之產量310 mg，60.3%。藉由LCMS發現之離子：M/2+H =813.9。步驟 d. 合成 Int-18
Figure 02_image1676
前一步驟之產物(300 mg，0.18 mmol)用三氟乙酸(2 mL)處理且在室溫下經攪拌持續30 min。所得溶液經濃縮，再溶解於水(2 mL)中，接著用氫氧化鋰(24 mg，1 mmol)溶解於水(1 mL)中之溶液處理。該反應經攪拌10 min，接著用0.1 ml乙酸淬滅，經濃縮且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以0%至50%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀使用0.1% TFA作為修飾劑經純化。產物之產量140 mg，52%。藉由LCMS發現之離子：M/2+H =573.8, M/3+H =382.9。實例 61. 合成用於結合物 13a 之 PEG4- 疊氮基 Fc c- 製備 DMF/PBS 中之 0.05M PEG4- 疊氮基 NHS 酯溶液
PEG4-疊氮基NHS酯(80.5 mg)在0℃下溶解於DMF (0.50 mL)中且在0℃下藉由添加3.50 mL PBS 1x緩衝液經稀釋至4.063 mL。使用此溶液，藉由調節此PEG4-疊氮基NHS酯PBS x1溶液之當量數來製備具有多種藥物-抗體比率(DAR)值之其他PEG4-疊氮基Fc。製備 PEG4- 疊氮基 Fc
0.05M PEG4-疊氮基NHS酯PBS x1緩衝溶液(0.0984 mL，4.92 μmol，2.5當量)添加至h-IgG1 Fc溶液(105 mg於5.031 mL pH 7.4 PBS中，MW~53,360 Da，1.968 μmol)中且該混合物在環境溫度下輕柔地震盪持續12小時。該溶液使用離心濃縮機(30,000 MWCO)經濃縮至約1.5 mL之體積。粗混合物1:10稀釋於PBS pH 7.4中，且再次經濃縮。重複此洗滌程序，共計三次。用此程序移除未反應之疊氮基試劑。經濃縮Fc-PEG4-疊氮化物用pH 7.4 PBS 1x緩衝液稀釋至5.03 mL且準備用於點擊結合。經純化材料使用Nanodrop™ UV可見光光譜儀(使用基於h-IgG1之胺基酸序列計算的消光係數)經定量。在緩衝液交換/純化之後，產率為定量的。實例 62. 合成結合物 13a
製備點擊試劑溶液：PBS緩衝溶液中之0.0050M CuSO4 ：20.0 mg CuSO4 溶解於25.0 mL PBS x1中，接著採用22.0 mL上述CuSO4 溶液且添加189.4 mg BTTAA及1090 mg抗壞血酸鈉以生成澄清溶液(0.0050M CuSO4、0.020M BTTAA及0.25M抗壞血酸鈉)。經疊氮基官能化之Fc (100 mg，4.79 mL，1.87 µmol，CTP-161-4A-連接體-1-疊氮化物)之溶液添加至含有炔衍生之小分子Int-18 (11.2 mg，0.00750 mmol，在實例60中製備)之15 mL離心管中。在輕柔地震盪以溶解所有固體之後，該溶液用3.00 mL上述點擊試劑溶液處理。所得無色均質溶液輕柔地震盪隔夜。其相繼藉由在蛋白A管柱上之親和力層析法、尺寸排阻層析法(參見實例10中之一般結合物純化方案)經純化。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出55,913 Da之平均質量(DAR = 1.7)。產量54.0 mg，54%產率。實例 63. 合成結合物 13b 、結合物 13c 、結合物 13d 、結合物 13e 、結合物 13f 及結合物 13g
用於結合物13b、結合物13c、結合物13d、結合物13e、結合物13f及結合物13g之PEG4-疊氮基Fc類似於結合物13a之PEG4-疊氮基Fc經製備(實例61)，如下表中所述調節PEG4-疊氮基NHS酯之當量數。結合物13b、結合物13c、結合物13d、結合物13e、結合物13f及結合物13g類似於實例62中之結合物13a經製備，其中靶向部分(Int-18)之當量數係基於所需DAR值(表26)經調節，且所用的點擊試劑溶液之體積係如用於實例62之程序中所用的相同體積。DAR值、分子量及產量列於下表中。產物結合物相繼藉由在蛋白A管柱上之親和力層析法、如實例8所述之尺寸排阻層析法經純化。結合物13a-13g之非還原SDS-PAGE提供於圖55中。 表26：結合物13a-13g之產率
樣品名稱 PEG4- 疊氮基NHS 酯之當量數 DAR ( 平均值) MALDI 質量Da ( 平均值) 靶向部分(TM) TM 之當量數 蛋白質類型 產率(%)
結合物13a 2.5 1.7 55913 Int-18 4 hIgG1 Fc 54%
結合物13b 4.5 2.7 57278 Int-18 6 hIgG1 Fc 50%
結合物13c 6.5 3.8 58908 Int-18 8 hIgG1 Fc 60%
結合物13d 8.5 4.7 60149 Int-18 10 hIgG1 Fc 54%
結合物13e 11 5.8 61726 Int-18 12 hIgG1 Fc 55%
結合物13f 18 8.2 65146 Int-18 16 hIgG1 Fc 53%
結合物13g 25 10.3 68153 Int-18 20 hIgG1 Fc 45%
實例 64. 結合物 6 之活體外穩定性
為了證明結合物6之活體外穩定性，使用小鼠及人類新鮮經K2 EDTA處理之血漿及肝微粒體。活體外小鼠及人類血漿穩定性藉由在37℃下藉由MALDI-TOF質譜偵測來比較血漿中24 h培育之後的藥物:抗體比率(DAR)包膜經測定。亦在37℃下在培育24 h之後藉由MALDI-TOF質譜偵測來執行使用小鼠及人類微粒體之肝微粒體穩定性。這係為了鑑別Fc蛋白、連接體或標靶部分上之潛在代謝不穩定位點。64.1 血漿穩定性樣品製備
首先，60 µL 3 mg/ml之結合物6與120 µL血漿混合。各血漿類型等分至2個管中。來自各血漿類型之一個等分試樣立即經冷凍。剩餘等分試樣置於水浴(37℃)中持續24小時。MAGNE®蛋白A珠粒(Promega)藉由輕柔渦旋該等珠粒至懸浮液中經平衡。針對兩種血漿類型一式兩份，50 µL珠粒漿液添加至1.5 mL微離心管中且置於磁性台架上持續10秒。10秒之後，移出且棄去該儲存緩衝液。500 µL結合/洗滌緩衝液(0.1% BSA於1X PBS pH 7.4中)添加至含有該等珠粒之1.5 mL微離心管中。該等珠粒經混合(渦旋)且置於磁性台架上持續10秒。10秒之後，移出且棄去該結合/洗滌緩衝液。50 µL緩衝液(1x PBS，pH 7.4)添加至含有該等珠粒之微離心管中。50 µL血漿混合物添加至該等珠粒中且輕柔渦旋以混合。使用管式震盪器，使該樣品在室溫下混合持續60分鐘，確保該等珠粒保持呈懸浮狀態。在混合之後，該管置於磁性台架上持續10秒且移除上清液。添加500 µL緩衝液(1x PBS，pH 7.4)且輕柔渦旋以混合。在混合之後，該管置於磁性台架上持續10秒，隨後移出且棄去洗滌緩衝液。重複該洗滌步驟，共計2次洗滌。在用500 µL緩衝液(1x PBS，pH 7.4)進行2次洗滌之後，分別用500 µL、200 µL及100 µL水執行3次洗滌。適當體積之水添加至該管中且輕柔渦旋以充分混合，且接著置於磁性台架上持續10秒，隨後移出且棄去水。在用水進行第三次洗滌之後，30 µL溶離緩衝液(90:10:0.4 水:乙腈:TFA)添加至該等珠粒中。使用管式震盪器，使該溶離緩衝液及樣品在室溫下混合持續30分鐘。在混合之後，該管置於磁性台架上持續10秒，移出且保留含有該樣品之溶離緩衝液。2 µL樣品與2 µL MALDI基質(20 mg/mL芥子酸於70:30:0.1 水:乙腈:TFA中)混合且滴於使用雙層技術之MALDI標靶板上。接著藉由MALDI-TOF質譜法分析該樣品。64.2 肝微粒體樣品製備
用500 mM Tris-HCl (pH 7.5)及50 mM氯化鎂六水合物製備10x緩衝液。ACV-006在1x PBS (pH 7.4)中經稀釋至50 µM。解凍且渦旋肝微粒體。肝微粒體之各樣本之等分試樣在70℃下經熱滅活持續15分鐘，以用作對照物。根據表27製備用於兩種樣本之反應混合物。管在水浴(37℃)中經培育持續24小時。萃取樣品以使用MAGNE®蛋白A珠粒(Promega)根據來自59.1之方案進行分析。 表27：0.5 mg/mL最終微粒體濃度，使用5 µM結合物6
   經熱滅活 肝
總計 400 μL 400 μL
水 286 μL 286 μL
10x緩衝液 40 μL 40 μL
微粒體(20 mg/mL) 10 μL 10 μL
化合物(50 µM) 40 μL 40 μL
NADPH再生溶液A 20 μL 20 μL
NADPH再生溶液B 4 μL 4 μL
64.3 樣品及數據分析
使用Bruker Compass Flex Control 3.4版採集樣品以獲得全掃描MALDI-TOF質譜(表28)。BSA用作針對採集質量範圍之內部校準物。進一步用Bruker Compass Flex Analysis 3.4版軟體分析數據。另外，比較對照物之DAR模式與測試樣品之DAR模式。 表28：質譜儀(MS)參數
質譜儀 Bruker Microflex LT
偵測
質量範圍 17-141 kDa
采樣率及數位儀設置 0.5
偵測器增益 2.05x
基線偏移調節 0%
模擬偏移 0.5 mV
雷射頻率 60 Hz
光譜儀   
離子源1 (IS1) 20.03 kV
離子源2 (IS2) 18.12 kV (90.5% IS1)
透鏡 7.17 kV (35.8% IS1)
脈衝離子引出 1010 ns
樣品容器
隨機漫步 部分樣品
雷射發射 100/截面
總雷射發射 500
光柵處之發射 20
光柵發射直徑極限 2000 um
設置   
雷射全域衰減器偏移 0%
雷射衰減器偏移 20%
雷射衰減器範圍 30%
數位儀靈敏度(全刻度) 100 mV
數位儀模擬偏移線性 0.5 mV
數位儀數位偏移線性 0 cnt
偵測器增益電壓-線性基底 2500 V
偵測器增益電壓-線性升壓 0 V
校準   
牛血清白蛋白 [M+2H], [M+H], [2M+H]
64.4 結果
在小鼠及人類新鮮經K2 EDTA處理之血漿及肝微粒體中測試測試化合物結合物6 (圖43)之活體外穩定性。
結合物6以1 mg/mL之最終濃度經摻加至新鮮K2 EDTA小鼠及人類血漿中。血漿分成2個等分實驗，一個立即經冷凍，且另一個在37℃水浴經培育持續24小時。在培育結束時，藉由MAGNE®蛋白A磁性珠粒自血漿基質萃取樣品。在血漿培育之後，藉由MALDI-TOF質譜法分析樣品之DAR改變。在小鼠(圖44)或人類(圖45)血漿培育中未發現結合物6產生任何DAR改變。
在50 mM pH 7.5 Tris-HCl緩衝溶液中以5 μM之最終濃度測試結合物6肝微粒體穩定性，該緩衝溶液含有最終濃度為0.5 mg/mL之活性或經熱滅活肝微粒體及最終濃度為5 mM之MgCl2 。所有樣品均在37℃恆定溫度下經培育，且在培育期間使用磷酸菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)再生溶液來提供連續輔因子可用性。進行培育持續24小時。在培育結束時，藉由蛋白A磁性珠粒自微粒體基質萃取樣品。在肝微粒體培育之後，藉由MALDI-TOF質譜法分析樣品之DAR改變。在小鼠(圖46)或人類(圖47)肝微粒體培育中未發現結合物6產生任何DAR改變。
在37℃下培育持續24 h之後的活體外血漿穩定性表明，小鼠或人類中缺乏結合物6 Fc、連接體或靶向部分之降解。同樣，在小鼠及人類肝微粒體中培育之後觀察到缺乏降解，表明代謝物不存在。此等活體外穩定性研究之結果支持存在如下穩定化合物，其具有可能具有生物易感性之降解劑。實例 65. 結合物 13 在致死性小鼠模型中在不同藥物 : 抗體比率 (DAR) 下針對流感 A (H1N1) 之功效
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8週)中針對致死性IAV H1N1流感感染評估結合物13。攻擊病毒(A/Puerto Rico/8/1934)係能夠在小鼠中引起致死性感染之小鼠適應性分離株。該實驗包含13組，每組5只小鼠。在第0天，所有小鼠均在經氯胺酮/甲苯噻嗪之混合物(分別為150及10 mg/kg)麻醉之後藉由鼻內接種經30 µl體積之病毒(3x LD95)攻擊。
第1-13組在測試物件或媒劑(PBS)之病毒攻擊之後2小時接受單一IV治療。該研究評估了對應於結合物13a、結合物13c、結合物13d及結合物13g (DAR分別為1.7、3.8、5.8及10.3)之4種不同DAR之結合物13構築體。結合物13a、結合物13c、結合物13d及結合物13g之合成描述於實例61-實例63中。各構築體在0.03、0.1及0.3 mg/kg下經評估。針對各結合物之一般研究設計概述於表29中。 表29：DAR掃描之一般研究設計
組 結合物 DAR 途徑/ 時程 劑量(mg/kg) 劑量體積(ml/kg)
1 結合物13a 1.7 IV，T+2小時 0.3 5
2 結合物13a 1.7 IV，T+2小時 0.1 5
3 結合物13a 1.7 IV，T+2小時 0.03 5
4 結合物13c 3.8 IV，T+2小時 0.3 5
5 結合物13c 3.8 IV，T+2小時 0.1 5
6 結合物13c 3.8 IV，T+2小時 0.03 5
7 結合物13d 5.8 IV，T+2小時 0.3 5
8 結合物13d 5.8 IV，T+2小時 0.1 5
9 結合物13d 5.8 IV，T+2小時 0.03 5
10 結合物13g 10.3 IV，T+2小時 0.3 5
11 結合物13g 10.3 IV，T+2小時 0.1 5
12 結合物13g 10.3 IV，T+2小時 0.03 5
13 媒劑(PBS) Na IV，T+2小時 na 5
所有構築體在0.3 mg/kg下均為完全保護性的，相比之下，構築體在0.03 mg/kg下均不具活性(針對所有組，0%生存)，指示該低劑量低於閾值有效劑量。然而，接受0.1 mg/kg之結合物之組可能有區別(表30)。在此劑量水準下，DAR為1.7、3.8及5.8之結合物比經單獨媒劑治療之小鼠顯著更具保護性(p=0.0027)。然而，高DAR構築體(10.3)未比經單獨媒劑治療之小鼠顯著更具保護性(p=0.091)。使高DAR構築體喪失活性之潛在機制目前尚未可知，但可能由數種因素引起，包括抗體再循環之干擾，導致較短半衰期。 表30：DAR範圍研究(0.1 mg/kg劑量組)
結合物 DAR % 生存 顯著性*
結合物13a 1.7 60 p=0.0027
結合物13c 3.8 40 p=0.0027
結合物13d 5.8 80 p=0.0027
結合物13g 10.3 0 p=0.091**
*   =相對於經單獨媒劑(PBS)治療之小鼠的顯著性，藉由對數秩(Mantel-Cox)測試。 ** =不顯著
實例 66. 結合物 6 及結合物 12 之活體內功效
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8週)中針對致死性IAV H1N1流感感染評估結合物6及結合物12 (模擬N297A處之Fc突變)。攻擊病毒(A/Puerto Rico/8/34)係小鼠適應性分離株。該實驗包含每組5只小鼠。小鼠經氯胺酮/甲苯噻嗪(150/10 mg/kg)麻醉且藉由鼻內接種經30 µL體積之流感病毒(3-5x LD95 )攻擊。在感染後2 h藉由IV投與單一1個劑量之治療。PBS作為陰性對照物給予。在攻擊之後監測所有小鼠之%體重損失(圖48)及生存(圖49)，持續15天。實例 67. 結合物 6 及結合物 12 之活體外 Fcγ 受體 IIIA 結合
藉由ELISA針對FcyRIIIA評估結合物6及結合物12 (模擬N297A處之Fc突變)之結合。板經1 µg/mL之重組人類FcγRIIIA塗佈隔夜。次日，板用1% BSA溶液阻斷持續1 h。結合物以介於0.01 - 1000 nM範圍內之劑量反應添加至板中且培育持續2 h。藉由用過氧化酶結合之抗人類Fc培育持續1 h且後續用TMB受質試劑培育持續10-15 min來偵測結合。藉由讀取450 nm下之吸光度來測定結合(圖50及圖51)。實例 68. 活體內結合物 6 血漿樣品分析
藉由神經胺糖酸酶捕捉偵測ELISA來定量血漿樣品中之結合物6。簡言之，分子經捕捉於經神經胺糖酸酶塗佈之板上且接著使用HRP結合之抗人類IgG-Fc抗體進行偵測。在GraphPad Prism中使用結合物6標準曲線之4PL非線性迴歸計算蛋白質濃度。更詳細方法描述提供於下文中。
Nunc Maxisorp 96-孔板(目錄號12-565-136, ThermoFisher)經1X KPL塗佈緩衝液(5150-0041, SeraCare)中來自A/California/04/2009 (H1N1) (11058-VNAHC, Sino Biological)之0.1 U/孔之神經胺糖酸酶塗佈。板在室溫下在軌道板式振盪器上(500 rpm)經培育持續1 h。血漿樣品之連續稀釋液經塗板且在室溫下經培育持續2小時(樣品稀釋劑：0.5% BSA於PBS 0.025% Tween 20中+原生食蟹獼猴血漿最終濃度為1:2,500)。在各板上一式兩份進行介於0.230-500 ng/mL範圍內之結合物6標準曲線。在2 h培育之後，板在具有0.05% Tween 20之300 µL PBS中洗滌5次。結合於板上之神經胺糖酸酶的結合物接著在室溫下用1:1,000稀釋於樣品稀釋劑中之HRP結合之抗人類IgG Fc F(ab’)2 (709-036-098, Jackson)探測持續1 h。板接著在具有0.05% Tween 20之300 uL PBS中洗滌8次且用TMB受質顯影持續7-8分鐘。該反應用1N H2 SO4 停止。在450 nm下讀取吸光度。使用GraphPad Prism Version 6，根據標準曲線之非線性迴歸分析(S型，4PL分析)內推血漿樣品中之結合物6。
接著使用所得平均血漿濃度，使用Phoenix WinNonlin 7.0藉由非房室分析來計算藥物動力學參數。毒物動力學 (TK) 、第 2 組 (IV ， 5 mg/kg) 及第 3 組 (IV ， 20 mg/kg)
在投與之後第1天(表31)及第8天(表32)，濃度在相同劑量組內之雄性與雌性動物之間可相當。平均血漿暴露看來在這兩天內大約與劑量成比例地增加。在第2劑量投與之後，在不同劑量組中注意到約30%之輕微積聚。不同劑量組中第1天及第8天平均血漿濃度之曲線顯示於圖52中。 表31：毒物動力學，第1天
劑量 (mg/kg) 途徑 性別 濃度 (µg/mL) ，時間 (h) Tmax (h) Cmax (μg/mL) AUC0-t (µg•h/mL)
0.083 1 2 4 8 24 72 120 168
5 IV F 112 78.8 85.8 71.0 75.1 52.5 38.6 18.5 22.3 0.083 112 6190
   IV M 101 84.6 107 75.3 72.5 38.1 29.8 35.3 15.8 2 107 5970
      平均值 107 81.7 96.5 73.2 73.8 45.3 34.2 26.9 19.0 1.04 110 6080
20 IV F 449 510 353 331 303 134 105 63.6 46.6 1 510 18800
   IV M 448 422 485 373 329 160 96.0 76.2 53.4 2 485 20500
      平均值 449 466 419 352 316 147 100 69.9 50.0 1.50 497 19600
表32：毒物動力學，第8天
劑量 (mg/kg) 途徑 性別 濃度(µg/mL) ，時間(h) Tmax (h) Cmax (μg/mL) AUC0-t (µg•h/mL)
0.083 1 2 4 8 24 72 120 168
5 IV F 111 111 99.3 82.3 100 52.2 46.7 35.0 33.9 1 111 7970
   IV M 113 114 113 78.4 74.4 54.7 35.2 47.1 28.2 1 114 7700
      平均值 112 112 106 80.4 87.3 53.5 41.0 41.1 31.0 1 112 7830
20 IV F 398 359 319 315 298 190 126 99.3 85.5 0.083 398 23900
   IV M 391 443 354 435 263 219 143 142 83.8 1 443 27800
      平均值 394 401 337 375 280 205 134 120 84.7 0.542 420 25800
藥物動力學 (PK) 、第 4 組 (IV ， 10 mg/kg) 及第 5 組 (SC ， 10 mg/kg)
在IV投與之後，雄性及雌性動物之血漿濃度可相當。在IV投與之後觀察到極低清除，導致長的終末半衰期(表33A及表33B)。 表33A：雄性及雌性動物之血漿濃度
劑量 (mg/kg) 途徑 性別 濃度(µg/mL) ，時間(h)
0.083 1 2 4 8 24 72 120 168 336 504 672
5 IV F 166 174 220 153 144 58.6 40.6 21.2 20.7 14.7 n/a 2.7
5 IV M 191 135 258 161 154 71 43.7 47.6 32 22.9 n/a 5.3
表33B：雄性及雌性動物之PK參數
Tmax (h) C0 (µg/mL) Cmax (µg/mL) AUC 最後 (h*µg/mL) AUCINF_obs (h*µg/mL) 半衰期 (h) Cl_obs (mL/min/kg) Vss_obs (mL/kg) Vz_obs (mL/kg)
1 166 220 13700 14400 170 0.00579 68.9 85.1
1 204 258 19400 20800 183 0.004 56.6 63.2
在SC投與之後，在給藥之後72小時達到實現最大濃度之時間，但濃度在給藥後672小時內可量測(表34A及表34B)。SC給藥之後的生物可用性高達大約139%。在10 mg/kg IV與SC投與之間隨時間之血漿濃度的比較顯示於圖53中。 表34A：雄性及雌性動物之血漿濃度
途徑 劑量(mg/kg) 性別 濃度(µg/mL) ，時間(h)
0.083 0.5 1 4 8 24 72 120 168 336 504 672
SC 10 F n/a 1.9 5.3 23.1 39.5 54 58.6 66.9 54 28.4 18.9 6.4
SC 10 M n/a 0.3 2.1 19.9 28.1 46.8 64.9 54.7 57.2 26.8 25.5 8.6
表34B：雄性及雌性動物之PK參數
Tmax Cmax AUC0-t F
(h) (µg/mL) (µg×h/mL) (%)
120 66.9 22600 137%
72 64.9 23300 141%
實例 69. 結合物 6 在致死性小鼠模型中針對流感 A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1) 之功效
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8週)中針對致死性IAV H1N1流感感染評估結合物6。攻擊病毒(A/Puerto Rico/8/1934)係能夠在小鼠中引起致死性感染之小鼠適應性分離株。該實驗包含7組，每組5只小鼠。在第0天，所有小鼠均在經氯胺酮/甲苯噻嗪之混合物(分別為150及10 mg/kg)麻醉之後藉由鼻內接種經30 µl體積之病毒(3x LD95)攻擊。每天記錄死亡率及體重且具有20%體重損失之任何動物均評分為死亡。測試組在結合物6、hIgG1 Fc對照物或媒劑(PBS)之病毒攻擊之後2小時接受單一IV治療。接受奧司他韋之動物每天給藥，每天兩次，持續5天，在病毒攻擊之後2小時開始。研究設計概述於表35中。 表35：針對流感A/PR/8/34 (h1N1)研究之研究設計
組 測試物件 途徑/ 時程 劑量(mg/kg) 劑量體積(ml/kg) 小鼠#
1 媒劑 IV，T+2 h。 na 5 5
2 hIgG1 Fc IV，T+2 h。 10 5 5
3 奧司他韋 PO，bid × 5，T+2 h。 20 5 5
4 奧司他韋 PO，bid × 5，T+2 h。 5 5 5
5 結合物6 IV，T+2 h。 10 5 5
6 結合物6 IV，T+2 h。 2 5 5
7 結合物6 IV，T+2 h。 0.4 5 5
如所預期，接受媒劑或單獨hIgG1 Fc之小鼠截至第6天屈服於感染。同樣，經低劑量(5 mg/kg；bid，持續5天)之奧司他韋治療的小鼠截至第8天達到死亡(表36)。然而，以相同給藥時程接受20 mg/kg之奧司他韋的小鼠完全經保護(p=0.0027)。與使用奧司他韋所見形成對比，經結合物6治療之小鼠在來自單一IV劑量之所有劑量水準(10、2及0.4 mg/kg)下均完全經保護(p=0.0027)。 表36：針對流感A/PR/8/34 (H1N1)研究之生存(第14天)
測試物件 劑量 % 生存 顯著性*
hIgG1 Fc 10 0 p=0.85**
奧司他韋 20 100 p=0.0027
奧司他韋 5 0 p=0.091**
結合物6 10 100 p=0.0027
結合物6 2 100 p=0.0027
結合物6 0.4 100 p=0.0027
*   =相對於經單獨媒劑(PBS)治療之小鼠的顯著性，藉由對數秩(Mantel-Cox)測試。 ** =不顯著
結合物6之效能進一步藉由每天體重量測值支持。如所預期，經媒劑或hIgG1 Fc治療之小鼠證明體重平穩下降，直至其超過20%，此時其經評分為死亡(表37)。經5 mg/kg之奧司他韋治療之組亦呈現一致的重量損失，直至第8天達到死亡。經高劑量(20 mg/kg)之奧司他韋治療之小鼠顯示平穩但降低的體重損失，其在第8天達到14%，接著恢復。
與經對照物及奧司他韋治療之小鼠形成對比，接受結合物6之彼等組在該研究中維持健康體重，即使在最低劑量濃度(0.4 mg/kg)下(表37)。在2 mg/kg劑量組中，經結合物6治療之小鼠中的最大短暫重量損失在第14天僅為2%。結合物6之生存及體重量測值均證明使用低達0.4 mg/kg之單一IV劑量時的穩固保護以抵禦流感A/Puerto Rico/8/1934。 表37：小鼠體重數據(相對於第0天之% BW) 。5只小鼠之平均值；*一旦組內之第一隻動物達到死亡，數據即不包括在內
攻擊後天數 媒劑(PBS) hIgG1 Fc (mg/kg) 奧司他韋(mg/kg) 結合物6 (mg/kg)
10 20 5 10 2 0.4
0 100 100 100 100 100 100 100
1 99 99 102 99 103 102 101
2 102 102 103 96 104 102 103
3 96 96 102 95 102 102 100
4 89 88 100 90 103 100 100
5 82 81 95 89 102 99 99
6 77 77 98 90 102 100 101
7       90 84 103 101 102
8       86 78 105 101 102
9       91    101 102 102
10       95    102 101 103
11       97    102 101 102
12       97    101 99 102
13       97    103 100 102
14       96    104 98 101
實例 70. 合成結合物 14
類似於結合物13a (實例61)使用PEG-疊氮基-Fc (SEQ ID NO:35)及Int-7 (實例19)製備標題結合物。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出56,502. Da之平均質量(DAR = 2.1)。產量43.4 mg，43.4%。實例 71. 合成結合物 15
類似於實例62 (結合物13a)藉由PEG4-疊氮基-Fc (SEQ ID NO: 35，實例61)及Int-12 (實例46)製備此結合物。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出56,528. Da之平均質量(DAR = 2.2)。產量40.0 mg，40.0%。實例 72. 合成結合物 16
類似於實例62 (結合物13a)藉由PEG4-疊氮基-Fc (SEQ ID NO: 35，實例61)及Int-10 (實例31)製備此結合物。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出56,507. Da之平均質量(DAR = 2.1)。產量41.7 mg，42%。實例 73. 合成 Int-19
Figure 02_image1678
步驟 a.
Figure 02_image1680
向[2-(2-溴乙氧基)乙基]胺基甲酸第三丁酯(1.8 g，6.6 mmol)及炔丙基-PEG4胺(0.7 g，3.0 mmol)於30 ml DMF中之溶液中添加碳酸鉀(1.2 g，9 mmol)。該反應在80℃下攪拌持續6 h，且接著分配於DCM (200 mL)與鹽水(50 mL)之間。分離有機層且用鹽水洗滌，且經無水硫酸鈉乾燥。在過濾時，所得濾液經濃縮且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以10%至100%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀使用0.1% TFA作為修飾劑經純化。產物之產量1.0 g，65%。藉由LCMS發現之離子：M/2+H =606.4。步驟 b.
Figure 02_image1682
前一步驟之產物(1.0 g，1.6 mmol)在室溫下用TFA (10 mL)處理持續0.5小時，接著濃縮至乾且無需進一步純化即用於下一步驟中。此步驟之產率為定量的。藉由LCMS發現之離子：M/2+H =406.3。步驟 c.
Figure 02_image1684
前一步驟之產物(120 mg，0.17 mmol)用醚紮那米韋酸(230 mg，0.38 mmol，實例31)於10 ml DMF中之溶液處理。向此溶液中添加EDC (100 mg，0.5 mmol)、HOBt (65 mg，0.5 mmol)及DIEA (0.14 ml，1 mmol)。所得溶液在室溫下經攪拌隔夜，接著經純化且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以10%至100%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀不使用TFA作為修飾劑經純化。產物之產量180 mg，60.2%。藉由LCMS發現之離子：M/2+H =816.9。步驟 d.
Figure 02_image1686
前一步驟之產物(180 mg，0.11 mmol)在室溫下用三氟乙酸(2 mL)處理持續30 min。所得溶液經濃縮且溶解於水(2 mL)中，接著用氫氧化鋰(24 mg，1 mmol)溶解於H2O (1 mL)中之溶液處理。所得反應經攪拌10 min，接著用0.1 ml乙酸淬滅。該溶液經濃縮且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以0%至50%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀使用0.1% TFA作為修飾劑經純化。產物之產量140 mg，52%。藉由LCMS發現之離子：M/2+H =575.8, M/3+H =384.2。實例 74. 合成結合物 17
類似於實例62 (結合物13a)藉由PEG4-疊氮基-Fc (SEQ ID NO: 35，實例61)及Int-19 (實例73)製備此結合物。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出56,672. Da之平均質量(DAR = 2.2)。產量36.7 mg，36.7%。實例 75. 合成 Int-20
Figure 02_image1688
步驟 a.
Figure 02_image1690
向亞胺基二乙酸二乙酯(3.1 g，16.06 mmol)於無水DMF (36 mL)中之溶液中添加苯甲基溴(2.38 mL，19.64 mmol)及碳酸鉀(6.44 g，46.46 mmol)。所得混合物在70℃下加熱持續16小時。在冷卻至室溫之後，該反應混合物用水稀釋且用第三丁基甲醚(3 × 100 mL)萃取。有機層用鹽水洗滌，經Na2 SO4 乾燥且過濾，接著濃縮。殘餘物藉由正相矽膠層析法(Isco，0至10%乙酸乙酯及己烷)經純化。產量3.13 g，69.8%。藉由LCMS發現之離子：[M+H]+ = 280.2。步驟 b.
Figure 02_image1692
來自步驟-a之二乙酯(3.2 g，11.2 mmol)於無水THF (5 mL)中之溶液在0℃下在氮氣下緩慢地添加至含有THF (2 mL)中之LiALH4 (425 mg，14.2 mmol)的圓底燒瓶中。注射器用THF (2 × 5 mL)沖洗。所得混合物緩慢地加溫至室溫隔夜。緩慢地添加甲醇(2 mL)以淬滅該反應，隨後添加NaOH水溶液(1 mL)。所得混合物經攪拌持續1小時，接著在真空下過濾。濾液經濃縮且無需純化即用於下一步驟。產量2.4 g，109%。藉由LCMS發現之離子：[M+H]+ = 196.2。步驟 c.
Figure 02_image1694
無水THF (4 mL)中之前一步驟之產物(1.02 g，5.24 mmol)在0℃下在氮氣下緩慢地添加至含有NaH (60%純度，2.09 g，52.4 mmol)及THF (5 mL)之燒瓶中。所得混合物經攪拌持續1小時，隨後逐滴添加THF (20 mL)中之3-(Boc-胺基)丙基溴(3.8 g，15.7 mmol)。該反應混合物緩慢地溫至室溫且攪拌持續3天。該反應冷卻至0℃，接著用水(6 mL)淬滅且攪拌持續1小時。其用乙酸乙酯(2 × 100 mL)萃取。經組合之有機層用1N HCl水溶液及鹽水洗滌。其經Na2 SO4 乾燥，過濾且濃縮。殘餘物藉由正相層析法(Isco，0至5%甲醇及二氯甲烷)經純化。產量984 mg，37%。藉由LCMS發現之離子，[M+H]+ = 510.0。步驟 d.
Figure 02_image1696
氫氧化鈀(543 mg，0.77 mmol)在H2 氛圍下添加至含有無水甲醇(19.5 mL)中之步驟-c產物(985.3 mg，1.93 mmol)的燒瓶中。所得混合物在室溫下經攪拌持續16小時。其接著經矽藻土墊過濾且用甲醇洗滌，且濃縮。殘餘物無需純化繼續用於下一步驟。產量828.6 mg，102%。藉由LCMS發現之離子，[M+H]+ = 420.0。步驟 e.
Figure 02_image1698
H2 O:THF (1:1，16 mL)中之步驟-d產物(829 mg，1.97 mmol)冷卻至0℃。向此溶液中添加Na2 CO3 (314 mg，2.96 mmol)，隨後添加Fmoc N-羥基丁二醯亞胺酯(826 mg，2.37 mmol)。所得混合物加溫至室溫且攪拌直至藉由LCMS發現完成，接著用乙酸乙酯萃取。有機層用鹽水洗滌且經Na2 SO4 乾燥，過濾且濃縮。殘餘物藉由正相層析法(Isco，0至60%乙酸乙酯及己烷)經純化。產量784 mg，62%。藉由LCMS發現之離子，[M+H-Boc]+ = 542.0。步驟 f.
Figure 02_image1700
步驟-e產物(1.01 g，1.57 mmol)在室溫下在TFA (5 mL)及CH2 Cl2 (9 mL)中經攪拌持續1小時，接著在減壓下濃縮。殘餘物藉由RPLP (Isco，5至100%甲醇及水，不具有修飾劑)經純化。產量903 mg，86%。藉由LCMS發現之離子，[M+H]+ = 442.2。步驟 g.
Figure 02_image1702
向醚紮那米韋酸(340 mg，0.49 mmol)、步驟-f產物(111 mg，0.25 mmol，實例31)及HATU (206 mg，0.53 mmol)於無水DMF (3 mL)中之混合物中添加DIEA (162 mg，1.23 mmol)。所得混合物在室溫下經攪拌持續1小時，接著直接地藉由RPLC (Isco，30至100%甲醇及水，不具有修飾劑)經純化。產量249 mg，61%。藉由LCMS發現之離子，[(M+2H)/2]+ = 833.8。步驟 h.
Figure 02_image1704
向步驟-g產物(249 mg，0.15 mmol)於無水DMF (0.5 mL)中之溶液中添加SilaMetS Thiol (1.2 g，1.47 mmol)及1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一-7-烯(12 mg，0.07 mmol)。所得混合物經攪拌持續1.5小時，接著直接地經過濾至藉助於含有HATU (69 mg，0.18 mmol)、炔丙基PEG-4酸(43 mg，0.16 mmol)及DIEA (43 mg，0.33 mmol)。該反應混合物經攪拌持續1小時，接著直接地藉由RPLC (Isco，30至100%甲醇及水，不具有修飾劑)經純化。產量298 mg，118%。藉由LCMS發現之離子，[(M+2H-Boc)/2]+ = 843.9。步驟 i.
Figure 02_image1706
步驟-h產物(298 mg，0.18 mmol)溶解於TFA (3 mL)及CH2 Cl2 (3 mL)中，且該溶液在室溫下經攪拌持續16小時。其接著在減壓下濃縮且藉由HPLC (ACCQ Isco，0至25%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量112 mg，44%。藉由LCMS發現之離子，[(M+2H)/2]+ = 643.8及[(M+3H)/3]+ = 429.6。步驟 j.
Figure 02_image1708
向步驟-i產物(112 mg，0.072 mmol)於MeOH (4 mL)及水(2 mL)中之溶液中添加LiOH (10.6 mg，0.43 mmol)。所得溶液在室溫下經攪拌持續1小時，接著用TFA酸化且在減壓下濃縮。殘餘物藉由HPLC (ACCQ Isco，0至25%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量37 mg，36%。藉由LCMS發現之離子，[(M+2H)/2]+ = 603.8, [(M+3H)/3]+ = 402.9。實例 76. 合成結合物 18
經疊氮基官能化之無糖基化Fc (100 mg，5.4 mL，1.87 µmol，SEQ ID NO: 35)之溶液添加至含有炔衍生之小分子(16.1 mg，0.011 mmol，Int-20)之15 mL離心管中。在輕柔地震盪以溶解所有固體之後，該混合物添加至3 mL L-抗壞血酸鈉(149 mg，0.75 mmol，0.25 M)、硫酸銅(II) (2.4 mg，0.015 mmol，0.005 M)及BTTAA (25.8 mg，0.6 mmol，0.02 M)於PBS 7.4緩衝液中之預混合溶液中。所得溶液輕柔地震盪隔夜。其相繼藉由在蛋白A管柱上之親和力層析法、尺寸排阻層析法(參見實例10中之一般結合物純化方案)經純化。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出56826 Da之平均質量(DAR 2.2)。產量36.64 mg，37%。實例 77. 合成 Int-21
Figure 02_image1710
步驟 a.
Figure 02_image1712
向2-(2-Boc-胺基乙氧基)乙醇(6.15 g，30 mmol)於無水DCM (60 ml)中之溶液中添加DIPEA (7.8 g，60 mmol)及DMAP (366.6 mg，3 mmol)。接著經30分鐘分成數份添加對甲苯磺醯氯(6.86 g，36 mmol)。在所得混合物經攪拌持續3天之後，其藉由旋轉蒸發經濃縮且藉由(20%至70%乙腈/水，不具有修飾劑)經純化。產量3.71 g，34.4%。藉由LCMS發現之離子：[M -Boc + H]+ = 260。步驟 b.
Figure 02_image1714
向步驟-a產物(2.1 g，5.83 mmol)於無水THF (10 ml)中之溶液中添加碳酸鈉(1.24 g，11.7 mmol)及單-N-Boc-1,4-二胺基丁烷(1.32 g，7 mmol)。所得混合物在60℃下加熱持續1天。接著濾出鹽，且濾液藉由旋轉蒸發經濃縮。殘餘物經由RPLC (100 g，5至50%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量1.94 g，88.6%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 376.0。步驟 c.
Figure 02_image1716
向炔丙基PEG-4酸(781 mg，3 mmol)及HATU (1.14 g，3 mmol)於無水DMF (3 ml)中之溶液中添加DIPEA (390 mg，3 mmol)，隨後添加步驟-b產物(940 mg，2.5 mmol)及DIPEA (390 mg，3 mmol)於無水DMF (3 ml)中之溶液。該反應混合物經攪拌持續30分鐘，接著直接地經由RPLC (100 g，5至80%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量960.2 mg，65.3%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 618.3, [M - Boc + H]+ = 518.3。步驟 d.
Figure 02_image1718
步驟-c產物(960.2 mg，1.63 mmol)溶解於無水THF (6 ml)中。添加二噁烷(4 ml)中之4N HCl溶液，且該反應混合物經攪拌隔夜。其接著藉由旋轉蒸發經濃縮。殘餘物用水(3 ml × 3)及乙酸乙酯(10 ml)萃取。經組合之水層經凍乾。產量760 mg，95.1%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 418.0。步驟 e.
Figure 02_image1720
經20分鐘分成數份向醚紮那米韋酸(315 mg，0.5 mmol)及HATU (190 mg，0.5 mmol)於無水DMF (1 ml)中之混合物中添加步驟-d二胺產物(148 mg，0.3 mmol)及DIPEA (165 mg，1.5 mmol)於無水DMF (1 ml)中之溶液。在添加之後，該反應再攪拌持續30分鐘且直接地藉由RPLC (50 g，30至90%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量233 mg，56.7%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 821.3。步驟 f.
Figure 02_image1722
步驟-e產物(233 mg，0.142 mmol)溶解於TFA (1.5 ml)中，且該溶液在30℃下加熱持續30分鐘。其接著經濃縮且直接地藉由RPLC (0%至30%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量120 mg，57.4%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 621.4, [(M + 3H)/3]+ = 414.7。步驟 g.
Figure 02_image1724
向步驟-f產物(120 mg，0.0816 mmol)於MeOH (2 ml)中之溶液中添加水(2 ml)中之LiOH單水合物(63 mg，1.5 mmol)溶液。所得混合物經攪拌持續1.5小時且接著藉由旋轉蒸發經濃縮。殘餘物藉由二噁烷(0.5 ml)中之4N HCl溶液酸化且藉由HPLC (0至15%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量98.2 mg，86.6%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 581.8,[(M + 3H)/3]+ = 388.2。實例 78. 合成結合物 19
類似於實例62 (結合物13a)藉由PEG4-疊氮基-Fc (SEQ ID NO: 35，實例61)及Int-21 (實例78)製備此結合物。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出56,548. Da之平均質量(DAR = 2.1)。產量39.7 mg，39.7%。實例 79. 合成 Int-22
Figure 02_image1726
步驟 a.
Figure 02_image1728
向醚紮那米韋酸(1.8 g，2.8 mmol 實例31)及炔丙基-PEG4-胺(0.82 g，3.5 mmol. 1.2 eq.)於二氯甲烷(50 mL)中之混合物中添加EDC (1.0 g，5 mmol)、HOBt (0. 65 g，5 mmol)及DIEA (1.4 ml，10 mmol)。所得溶液在室溫下經攪拌隔夜，濃縮，且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以10%至100%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀不使用0.1% TFA作為修飾劑經純化。產物之產量1.35 g，50.2%。藉由LCMS發現之離子：M+H =830.4。步驟 b.
Figure 02_image1730
前一步驟之產物(1.35 g，1.6 mmol)在室溫下用三氟乙酸(20 mL)處理持續30 min。所得溶液經濃縮，溶解於水(10 mL)及MeOH (10 mL)中，接著用水(10 mL)中之氫氧化鋰(120 mg，5 mmol)溶液處理。該反應經攪拌10 min，接著用0.5 ml乙酸淬滅。該反應經濃縮且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以0%至50%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀使用0.1% TFA作為修飾劑經純化。產物之產量510 mg，52.8%。藉由LCMS發現之離子：M+H =604.3。實例 80. 合成結合物 20
類似於實例62 (結合物13a)藉由PEG4-疊氮基-Fc (SEQ ID NO: 35，實例61)及Int-22 (實例79)製備此結合物。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出55,508. Da之平均質量(DAR = 2.3)。產量37.0 mg，37.0%。實例 81. 合成 Int-23
Figure 02_image1732
步驟 a.
Figure 02_image1734
向N-Boc-1.4-二胺基丁烷(941.5 mg，5 mmol)於無水THF (10 ml)中之溶液中添加碳酸鈉(1.06 g，10 mmol)及3-(Boc-胺基)丙基溴(1.43 g，6 mmol)。所得混合物在50℃下加熱持續1天。接著濾出鹽，且藉由旋轉蒸發經濃縮。殘餘物藉由RPLC (100 g，5至50%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量1.35 g，58.8%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 346.0。步驟 b.
Figure 02_image1736
向炔丙基PEG-4酸(781 mg，3 mmol)及HATU (1.14 g，3 mmol)於無水DMF (3 ml)中之溶液中添加DIPEA (390 mg，3 mmol)，隨後添加步驟-a產物(863.8 mg，2.5 mmol)及DIPEA (390 mg，3 mmol)於無水DMF (3 ml)中之溶液。該反應混合物經攪拌持續30分鐘，接著直接地藉由RPLC (100 g，5至80%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量1.19 g，81%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 588.3。步驟 c.
Figure 02_image1738
步驟-b產物(1.19 g，2.02 mmol)溶解於無水THF (6 ml)中。添加二噁烷(4.5 ml)中之4N HCl溶液，且該反應混合物經攪拌持續1天。其接著藉由旋轉蒸發經濃縮。殘餘物用水(3 ml × 3)及乙酸乙酯(15 ml)萃取。經組合之水層經凍乾。產量940 mg，定量產率。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 388.3。步驟 d.
Figure 02_image1740
向醚紮那米韋酸(315 mg，0.5 mmol，實例31)及HATU (209.1 mg，0.55 mmol)於無水DMF (1 ml)中之混合物中添加DIPEA (65 mg，0.5 mmol)。5分鐘之後，經20分鐘分成數份添加步驟-c產物(170 mg，0.439 mmol)及DIPEA (130 mg，1 mmol)於無水DMF (1 ml)中之溶液。該反應再攪拌持續30分鐘，接著直接地藉由RPLC (50 g，30至90%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量208 mg，51.6%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 806.7。步驟 e.
Figure 02_image1742
步驟-d產物(208 mg，0.129 mmol)溶解於TFA (1.5 ml)中，且該溶液在30℃下加熱持續30分鐘。其接著直接地藉由RPLC (100 g，0至30%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量134 mg，72%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 606.8, [(M + 3H)/3]+ = 405.0。步驟 f.
Figure 02_image1744
向步驟-e產物(134 mg，0.093 mmol)於MeOH (2 ml)中之溶液中添加LiOH單水合物(63 mg，1.5 mmol)於水(2 ml)中之溶液。所得混合物經攪拌持續1.5小時且接著藉由旋轉蒸發經濃縮。殘餘物藉由二噁烷(0.5 ml)中之4N HCl溶液酸化且藉由HPLC (0至15%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量78.4 mg，62%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 566.4, [(M + 3H)/3]+ = 378.4。實例 82. 合成結合物 21
類似於實例62 (結合物13a)藉由PEG4-疊氮基-Fc (SEQ ID NO: 35，實例61)及Int-23 (實例81)製備此結合物。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出56,503. Da之平均質量(DAR = 2.2)。產量34.4 mg，34%。實例 83. 在細胞病理效應 (CPE) 分析中結合物 13 至 21 針對高致病性 H7N9 流感 A 及兩種流感 B 分離株之活性
在CPE分析中以100、10、1及0.1 nM之濃度運作總計9種結合物(表38)且與利巴韋林比較。該CPE分析遵循標準方法，但簡言之，利用96-孔板中之MDCK細胞的80-100%匯合單層。一式三份向其中添加測試物件且使其在37℃(+ 5% CO2 )下培育，直至CPE效應在視覺上顯而易見。一旦注意到CPE，細胞層即用0.011%中性紅染色持續大約2小時。其後，添加Sorensen檸檬酸鹽緩衝液/乙醇之50:50混合物且使其培育持續30 min，接著在分光光度計上讀取A540 且藉由迴歸分析計算EC50 /CC50 值。
所有結合物均針對流感B/Florida/4/2006分離株具有顯著活性，其中EC50 值介於3.05至33.5 nm範圍內(表39)。平均言之，結合物證明瞭相比利巴韋林(EC50 3,250 nM)之275倍效能優勢。結合物針對流感B/Brisbane/60/2008之活性極其類似於針對B/Florida所見，例外為結合物14，其具有大於100 nM之EC50
重要的是，所有結合物亦針對高致病性流感A/Anhui/1/2013 (H7N9)分離株極具活性。與針對利巴韋林之14,000 nM相比，針對所有結合物之平均EC50 針對此分離株(介於12至28.5 nM範圍內)為21.2 nM。最後，在所測試之濃度下未偵測到該等結合物對MDCK單層之細胞毒性效應。 表38：結合物及特性
結合物 Int Fc 域 DAR 連接體 注釋
13 18 SEQ ID NO: 35 2.2 15個原子 醚，二聚體
14 7 SEQ ID NO: 35 2.1 15個原子 胺基甲酸酯，二聚體
15 12 SEQ ID NO: 35 2.2 15個原子 醚，二聚體
16 9 SEQ ID NO: 35 2.1 17個原子 醚，二聚體
17 19 SEQ ID NO: 35 2.2 17個原子 醚，二聚體
18 20 SEQ ID NO: 35 2.2 19個原子 醚，二聚體
19 21 SEQ ID NO: 35 2.1 16個原子 醚，二聚體
20 22 SEQ ID NO: 35 2.3 na 醚，單體
21 23 SEQ ID NO: 35 2.2 14個原子 醚，二聚體
表39：在CPE分析中結合物針對流感亞型之活性
結合物 EC50 (nM)*
A/Anhui/1/2013 (H7N9) B/Brisbane/60/2008 B/Florida/4/2006
(人畜共患性，aby way ofn) (Victoria譜系) (Yamagata譜系)
利巴韋林 14000 3300 3250
13 24 21 33.5
14 12 ＞100 18.5
15 21.5 5.95 4.6
16 28.5 14.5 11
17 28** 11 13
18 31 4.35 3.05
19 14.5 6.8 4.55
20 20.5 12.5 14.5
21 17.5 4.05 3.05
* 2個值之平均值(VIS + NR)
**藉由VIS發現EC50為28，藉由NR發現＞100
實例 84. 合成結合物 22 步驟 a. 合成 PEG4- 疊氮基 IVIG
製備DMF/PBS中之0.05M PEG4-疊氮基NHS酯溶液：6.05 mg PEG4-疊氮基NHS酯在0℃下溶解於0.050 mL DMF中且在0℃下藉由添加0.250 mL PBS 1x緩衝液經稀釋至0.305 mL。使用此溶液，藉由調節此PEG4-疊氮基NHS酯PBS溶液之當量數來製備具有多種DAR值之其他PEG4-疊氮基IVIG。
製備PEG4-疊氮基IVIG：0.05M PEG4-疊氮基NHS酯PBS緩衝溶液(0.301 mL，15.0 μmol，5.5當量)添加至IVIG (Intravenous Immune Globulin, Baxter))溶液(407 mg於9.25 mL pH 7.4 PBS中，MW~148863 Da，1.968 μmol)中且該混合物在環境溫度下輕柔地震盪持續12小時。該溶液使用離心濃縮機(100,000 MWCO)經濃縮至約1.5 mL之體積。粗混合物1:10稀釋於PBS pH 7.4中，且再次經濃縮。重複此洗滌程序，共計三次。用此洗滌程序移除小分子試劑。經濃縮IVIG-PEG4-疊氮化物用pH 7.4 PBS 1x緩衝液稀釋至9.25 mL且準備用於點擊結合。經純化材料使用NANODROP™ UV可見光光譜儀(使用基於IVIG之胺基酸序列計算的消光係數)經定量。產率係在純化之後定量的。步驟 b. 合成結合物
製備點擊試劑溶液：PBS緩衝溶液中之0.0050M CuSO4 ：10.0 mg CuSO4 溶解於12.53 mL PBS x1中，接著採用6.00 mL 0.0050M CuSO4 溶液且添加57.7 mg BTTAA (CAS編號1334179-85-9)及297.6 mg抗壞血酸鈉以生成點擊試劑溶液(0.0050M CuSO4、0.020M BTTAA及0.25M抗壞血酸鈉)。
經疊氮基官能化之IVIG (140 mg，3.17 mL，0.936 µmol，IVIG-連接體-1-疊氮化物)之溶液添加至含有炔衍生之小分子(8.4 mg，0.00618 mmol，，6.6 eq，描述於實例60中)之15 mL離心管中。在輕柔地震盪以溶解所有固體之後，1.50 mL上述點擊試劑溶液(L-抗壞血酸鈉，0.25 M, 74.2 mg，0.374 mmol，硫酸銅(II) 0.0050M，1.2 mg，0.0075 mmol，及BTTAA 0.020M，12.9 mg，0.0300 mmol)。所得混合物輕柔地震盪隔夜。其相繼藉由在蛋白A管柱上之親和力層析法、尺寸排阻層析法(參見實例10中之結合物純化方案)經純化。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出151873 Da之平均質量(DAR = 2.7)。產量51.0 mg，36%產率。實例 85. 合成結合物 23
類似於結合物22，取代點擊結合步驟中之適當炔官能化之小分子(描述於實例81中之Int-23)來製備結合物23。實例 86. 合成結合物 24
類似於結合物22，取代點擊結合步驟中之適當炔官能化之小分子(描述於實例19中)來製備結合物24。實例 87. 結合物 13 、 14 及 21 在致死性小鼠模型中針對流感 B 之功效
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8週)中針對致死性流感B流感感染評估結合物。攻擊病毒(B/Malaysia/2506/04)係能夠在小鼠中引起致死性感染之小鼠適應性分離株。該實驗包含11組，每組5只小鼠。在第0天，所有小鼠均在經氯胺酮/甲苯噻嗪之混合物(分別為150及10 mg/kg)麻醉之後藉由鼻內接種經30 µl (大約每只小鼠1E4)體積之病毒(3x LD95)攻擊。
所有組均在病毒攻擊之後2小時接受測試物件、媒劑(PBS)或單獨Fc對照物(hIgG1 Fc)之單一IV治療。該研究評估結合於一致Fc單體(分別為結合物13、14及21)之Int-18、Int-7及Int-23，在3.0、1.0及0.3 mg/kg下進行測試。監測小鼠持續2週且超過20%體重損失或被發現垂死之動物經評分為死亡。
經媒劑或單獨Fc對照物治療之所有小鼠截至第7天均達到死亡。相比之下，接受結合物13、14及21之小鼠在接受0.3 mg/kg之單一IV劑量之後完全經保護(表40)。如所預期，接受1.0或3.0 mg/kg之結合物之組亦完全經保護。所有結合物針對流感B之效能進一步藉由每天體重量測值(表41)支持，該等每天體重量測值顯示任何結合物治療之組在整個研究中少於5%之短暫下降。結合物13、14及21之活性以劑量計可與結合物6針對流感A H1N1及H3N2亞型之活性相當。由於結合物6及14具有一致靶向部分(對應於Int-7)，單一結合物可針對顯性季節性流感類型(流感A (H1N1)、流感A (H3N2)及流感B)具活性。 表40. 在研究結束時(第14天)之死亡率數據。5只小鼠之平均值；藉由對數秩(Mantel-Cox)測試計算之p-值
化合物 劑量(mg/kg) % 生存 相對媒劑之顯著性(p- 值)
媒劑(PBS) na 0 na
單獨Fc 3.0 0 p=1
結合物13 0.3 100 (0.0027)
1.0 100 (0.0027)
3.0 100 (0.0027)
結合物14 0.3 100 p=0.0027
1.0 100 p=0.0027
3.0 100 p=0.0027
結合物21 0.3 100 (0.0027)
1.0 100 (0.0027)
3.0 100 (0.0027)
表41：小鼠體重數據(相對於第0天之% BW)。5只小鼠之平均值；*一旦組內之第一隻動物達到死亡，數據即不包括在內
攻擊後天數 媒劑(PBS) 單獨Fc 結合物14 (mg/kg)
3.0 0.3 1.0 3.0
0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0
1 98.1 98.1 99.3 99.1 96.5
2 99.6 96.7 98.6 98.6 98.3
3 96.4 94.9 96.8 97.0 98.7
4 89.8 87.8 98.4 97.5 97.8
5 83.6 80.8 97.4 97.8 98.0
6 79.0 76.1 96.9 98.3 99.7
7 * * 99.2 100.5 100.6
8 * * 100.3 101.9 101.1
9 * * 102.5 100.4 100.6
10 * * 100.6 102.0 101.2
11 * * 100.9 100.9 100.9
12 * * 101.8 101.7 101.8
13 * * 101.4 101.7 101.4
14 * * 102.2 102.6 102.2
實例 88. 合成用於結合物 25 、結合物 26 、結合物 27 及結合物 28 之 PEG4- 疊氮基 Fc
製備DMF/PBS x1中之0.05M PEG4-疊氮基NHS酯溶液：27.40 mg PEG4-疊氮基NHS酯在0℃下溶解於0.155 mL DMF中且在0℃下藉由添加1.200 mL PBS 1x緩衝液經稀釋。使用此溶液，藉由調節此PEG4-疊氮基NHS酯PBS x1溶液之當量數來製備具有多種DAR值之其他PEG4-疊氮基Fc。
製備PEG4-疊氮基Fc (SEQ ID NO: 48)：0.05M PEG4-疊氮基NHS酯PBS x1緩衝溶液(0.0984 mL，4.92 μmol，2.5當量)添加至h-IgG1 Fc (SEQ ID NO: 48)溶液(234 mg於13.605 mL pH 7.4 PBS中，MW~57,976 Da，4.036 μmol)中且該混合物在環境溫度下輕柔地震盪持續2小時。該溶液使用離心濃縮機(30,000 MWCO)經濃縮至約2 mL之體積。粗混合物1:7稀釋於PBS pH 7.4中，且再次經濃縮。重複此洗滌程序，共計三次。用此洗滌程序移除小分子試劑。經濃縮Fc (SEQ ID NO: 48)-PEG4-疊氮化物用pH 7.4 PBS 1x緩衝液稀釋至13.60 mL且準備用於點擊結合。經純化材料使用Nanodrop™ UV可見光光譜儀(使用基於h-IgG1之胺基酸序列計算的消光係數)經定量。
PEG4-疊氮基Fc (SEQ ID NO: 50)之製備類似於上述PEG4-疊氮基Fc (SEQ ID NO: 48)。實例 89. 合成結合物 25
製備點擊試劑溶液：PBS x1緩衝溶液中之0.0050M CuSO4 ：10.0 mg CuSO4 溶解於12.53 mL PBS x1中，接著採用10.00 mL此CuSO4 溶液且添加86.1 mg BTTAA及495.3 mg抗壞血酸鈉以生成點擊試劑溶液(0.0050M CuSO4、0.020M BTTAA及0.25M抗壞血酸鈉)。此點擊試劑溶液將用於結合物25及結合物26。
經疊氮基官能化之Fc (78.0 mg，4.535 mL，1.35 µmol，SEQ ID NO: 48-PEG4-疊氮化物)之溶液添加至含有炔衍生之小分子(13.2 mg，8.88 μmol，Int-23)之15 mL離心管中。在輕柔地震盪以溶解所有固體之後，向該混合物中添加2.153 mL上述點擊試劑溶液(L-抗壞血酸鈉，0.25 M, 106.6 mg，0.538 mmol，硫酸銅(II) 0.0050M，1.72 mg，0.0107 mmol，及BTTAA 0.020M，18.5 mg，0.0431 mmol)。所得混合物在環境溫度下輕柔地震盪持續6小時。其相繼藉由在蛋白A管柱上之親和力層析法、尺寸排阻層析法(參見實例10中之結合物純化方案)經純化。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出60973 Da之平均質量(DAR = 2.1)。產量50.3 mg，64%產率。實例 90. 合成結合物 26
結合物26之製備類似於結合物25，其中使用同一批次之PEG4-疊氮基Fc (SEQ ID NO: 48)及炔衍生之小分子(Int-7)。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出61068 Da之平均質量(DAR = 2.2)。產量49.5 mg，63%產率。實例 91. 合成結合物 27
製備點擊試劑溶液：PBS x1緩衝溶液中之0.0050M CuSO4 ：10.0 mg CuSO4 溶解於12.53 mL PBS x1中，接著採用12.00 mL此CuSO4 溶液且添加103.3 mg BTTAA及594.3 mg抗壞血酸鈉以生成點擊試劑溶液(0.0050M CuSO4、0.020M BTTAA及0.25M抗壞血酸鈉)。此點擊試劑溶液將用於結合物28。
經疊氮基官能化之Fc (80.0 mg，4.535 mL，1.38 µmol，SEQ ID NO: 50-PEG4-疊氮化物)之溶液添加至含有炔衍生之小分子(13.5 mg，9.10 μmol，Int-23)之15 mL離心管中。在輕柔地震盪以溶解所有固體之後，向該混合物中添加2.21 mL上述點擊試劑溶液(L-抗壞血酸鈉，0.25 M, 109.3. mg，0.552 mmol，硫酸銅(II) 0.0050M，1.76 mg，0.0110 mmol，及BTTAA 0.020M，19.0 mg，0.0441 mmol)。所得混合物在環境溫度下輕柔地震盪持續6小時。其相繼藉由在蛋白A管柱上之親和力層析法、尺寸排阻層析法(參見實例10中之結合物純化方案)經純化。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出61447 Da之平均質量(DAR = 2.5)。產量37.1mg，46%產率。實例 92. 合成結合物 28
結合物28之製備類似於結合物27，其中使用同一批次之PEG4-疊氮基Fc (SEQ ID NO: 50)及炔衍生之小分子(Int-7)。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出61388 Da之平均質量(DAR = 2.4)。產量44.6 mg，56%產率。實例 93. 在細胞病理效應 (CPE) 分析中結合物 6 及結合物 21 針對高致病性流感 A (H5N1 、 H7N9) 之活性
針對BSL-3 (高致病性)流感A進行活體外分析以測定本發明結合物之效能，且一般地遵循標準程序。簡言之，不同濃度之結合物與病毒(大約250 TCID50 )混合且使其在35℃下培育持續一小時。在培育之後，該混合物添加至MDCK細胞之80-90%匯合單層中。在90分鐘培育之後，洗滌細胞且再應用結合物。該單層隨後用羧甲基纖維素覆蓋以使病毒擴散降至最低且使其培育持續兩天。在兩天培養之後，細胞用PBS洗滌且用10%福馬林固定。在固定之後，該MDCK單層用Triton X-100滲透且用針對流感核蛋白之小鼠mAb免疫染色。單層經讀取，且計算每個孔之經染色面積以測定EC50/100 值。
該研究之結果概述於表42中且證明結合物6及結合物21針對具有大流行潛力之高度致病性菌株的效能。重要的是，兩種結合物針對四種H5N1及一種H7N9分離株產生15 nM或低於15 nM之EC100 值。相比之下，奧司他韋僅針對一種分離株(A/Vietnam/1194/2004)具有大約15 nM之EC100 且針對其他高致病性菌株具有介於125至＞1000 nM範圍內之值。此等結果表明，結合物6及結合物21治療由強毒流感引起之大流行病的潛力優於奧司他韋之彼潛力。 表42：結合物6及結合物21針對高致病性流感分離株之活體外活性
高致病性流感 EC100 (nM) (MDCK 細胞中之CPE)
H5N1 媒劑 結合物6 結合物21 奧司他韋
A/Indonesia/5/2005 (演化支2.1) N/A 約15 ＜15 約200 - 500
A/Vietnam/1194/2004 (演化支1) N/A 約15 ＜15 約15
A/turkey/Turkey/1/2005 (演化支2.2) N/A ＜15 ＜15 約125 - 250
A/Hong Kong/156/1997 (演化支0) N/A 約15 ＜15 ＞1000
H7N9            
A/Anhui/01/2013 N/A ＜15 ＜15 約500 - 1000
H1N1 ( 陽性對照物)            
A/Netherlands/602/2009 N/A ＜15 ＜15 約1000
實例 94. 在細胞病理效應 (CPE) 分析中結合物 6 及結合物 21 針對在不同感染複數 (MOI) 下之流感 A (H1N1) 之活性
MDCK細胞以4×104 個細胞/孔接種於96孔板(經TC處理)中之MEM培養基中且在37℃、5% CO2 下經培育持續18-24 h。在1.93 - 10000 nM之間劑量範圍內之測試物件(紮那米韋、奧司他韋、巴洛沙韋、結合物6及結合物21)在室溫(RT)下用病毒:細胞感染複數(MOI)在0.001 - 1之間的流感A/WSN/1933培育持續1 h。1 h之後，經預培育之病毒及測試物件添加至MDCK細胞之90-100%匯合單層中且在RT下經培育持續1 h。
1 h之後，補充有L-麩醯胺及青黴素/鏈黴素之MEM培養基添加至孔中。經感染細胞在37C、5% CO2 下經培育持續72 h。在固定細胞且用結晶紫染色之後測定CPE。使用Graphpad Prism 6軟體用非線性迴歸分析計算EC50。表43中提供之該CPE分析之結果指示，結合物6及結合物21活體外勝過護理標準劑，尤其在高MOI下。 表43：結合物6及結合物12針對在不同感染複數下之流感A (H1N1)之活體外活性
EC50 (nM) H1N1 A/WSN/1933 (MDCK 細胞中之CPE)
   MOI 0.001 MOI 0.01 MOI 0.1 MOI 1
紮那米韋 137 938 ＞10000 ＞10000
奧司他韋 525 1896 ＞10000 ＞10000
巴洛沙韋 5 4 79 ＞100
結合物6 9 15 ＞100 ＞100
結合物12 0.6 2 7 10
實例 95. 結合物 6 在致死性嚴重複合型免疫缺乏小鼠模型中針對流感 A (H1N1) 之功效
在雄性BALB/c嚴重複合型免疫缺乏(SCID)小鼠(Stock #001803；Jackson Laboratories，6-8週齡)中針對致死性流感A感染評估結合物。攻擊病毒(A/Puerto Rico/08/1934)係能夠在小鼠中引起致死性感染之小鼠適應性分離株。該實驗包含5組，每組5只小鼠。在第0天，所有小鼠均在經氯胺酮及甲苯噻嗪之混合物(分別為150及10 mg/kg)麻醉之後藉由鼻內接種經30 µl (大約每只小鼠1E3)體積之病毒(3x LD95)攻擊。
所有組均在病毒攻擊後2小時接受測試物件結合物6、媒劑(PBS)或單獨Fc對照物(hIgG1 Fc)之單一IV治療。該研究評估結合物6之3種不同劑量濃度(0.3、1.0或3.0 mg/kg)。監測小鼠持續5週且超過20%體重損失或被發現垂死之動物經評分為死亡。亦記錄體重以監測該等動物之一般健康狀況。
經媒劑或單獨Fc對照物治療之所有小鼠截至第2週均達到死亡。相比之下，接受結合物6之小鼠在接受1或3 mg/kg之單一IV劑量之後在該研究之持續時間內完全經保護(圖56，表44)。當結合物6之劑量降低至0.3 mg/kg時，生存截至研究結束下降至20%。0.3 mg/kg劑量完全經保護持續3週。結合物6在此嚴重免疫缺乏模型中之效能進一步由體重數據支持(圖57，表45)。接受1或3 mg/kg劑量濃度之結合物6之組在該研究的整個過程中僅證明了少於3%之短暫體重損失。此外，在研究結束時，兩個劑量組均顯示淨重量增加(分別為7.5及2.2%)。用最低濃度之結合物6 (0.3 mg/kg)給藥的組在該研究之前3週內具有少於4%之短暫體重損失，接著在第4週顯示感染病徵，其最終導致五隻動物中之四隻死亡。總之，此等數據藉由用低達1 mg/kg之結合物之單一IV劑量保護經致死性攻擊之小鼠證明了結合物6之效能。另外，此保護作用係長期持續的，超過該研究之5週持續時間。此在完全缺乏清除流感感染所必需的T及B免疫細胞之小鼠的極端免疫缺乏模型中實現。此數據支持使用結合物6來治療免疫勝任及缺乏患者群體。 表44：每週研究劑量組之死亡率
測試物件 % 生存 ( 病毒攻擊後天數)
7 14 21 28 35
媒劑 80 0 0 0 0
單獨Fc 80 0 0 0 0
結合物6 (3 mg/kg) 100 100 100 100 100
結合物6 (1 mg/kg) 100 100 100 100 100
結合物6 (0.3 mg/kg) 100 100 100 80 20
表45：研究動物在35天內或直至組內第一例死亡時之平均組體重
天 媒劑 單獨Fc 結合物6 劑量
         3 mg/kg 1 mg/kg 0.3 mg/kg
0 100 100 100 100 100
1 99.5 99.8 99.6 99.4 98.6
2 98.8 99.2 99.9 99.1 98.9
3 97.7 96.8 101 100.6 97.9
4 94.4 95.4 99.4 98.4 98.5
5 93.7 90.7 100.6 97.9 99.3
6 88.7 83.9 101.2 98.7 98.1
7 81.1 77.6 101.8 98 96.9
8       101.3 99.7 98.9
9       102.6 100.7 98.8
10       101.6 99.8 99.4
11       101.6 99.7 100.3
12       101.8 100.2 100.7
13       102.3 101 100.7
14       103.9 100.5 99.9
15       104.3 101.8 102.3
16       104.3 102 101.3
17       104.3 100.6 102
18       105.4 103.9 100.5
21       105.7 105.9 96.8
22       105.5 103.4 93.9
23       105.6 106.9 91
24       108.4 102.9   
25       106.4 102.7   
26       108.4 103.9   
27       108.6 103.5   
28       109.1 104.7   
29       108.96 104.5   
30       109 105.8   
31       108.2 104.9   
35       107.5 102.2   
實例 96. 結合物 6 在肺中之劑量依賴性病毒清除
在鼻內經3×102 PFU/小鼠(3x LD95 )之小鼠適應性流感A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1)攻擊之6-8週雌性BALB/c小鼠(Charles River)中進行功效研究。結合物6或人類IgG1 Fc對照物在攻擊後2 h以0.1 – 3 mg/kg之單一靜脈內(IV)劑量經投與。奧司他韋經口給藥，每天兩次，持續4天，在感染後2 h以5或15 mg/kg開始。記錄體重(BW)持續4天。在感染後4天，藉由CO2 處死小鼠且收集肺葉。肺使用MagNA Lyser (Roche)用1 mL PBS中之1 mm矽石珠粒均質化。在6,000 rpm下進行均質化持續60 s且在運行之間在冰上冷凍持續5 min。在肺均質化之後，管在600 x g下經離心持續10 min且上清液經轉移至新管中。
為了測定肺中之病毒負荷(以斑塊形成單元(PFU)量度)，將肺均質液之上清液稀釋於感染緩衝液中，介於10-1至10-6範圍內。100 µL病毒稀釋液添加至24孔板中之MDCK細胞之匯合單層中且在室溫下經培育持續1 h，其中每15 min搖動。在移除病毒之後，含有Avicel之液體覆蓋培養基添加至MDCK細胞中。細胞在37℃、5% CO2 下經培育持續40 h。在培育之後，移除該培養基且細胞用結晶紫染色以對斑塊計數。相對於肺重量計算PFU (PFU/g肺)。
該研究之結果證明低劑量之結合物6快速地降低病毒負荷數量級，優於奧司他韋(TAMIFLU®) (圖58，表46)。此觀察結果具有臨床顯著性，因為嚴重流感感染係由病毒自初始上呼吸道感染移動至肺引起的。 表46：感染後第4天之病毒負荷
測試物件[mg/kg] Log 減少 (PFU/mL) Log 減少 (PFU/g)
PBS [0] 0.00 0.00
hIgG1 Fc [3] -0.04 0.26
奧司他韋[5] 0.24 0.43
奧司他韋[15] 0.52 0.75
結合物6 [0.1] 0.60 0.79
結合物6 [0.3] 1.33 1.55
結合物6 [1] 2.25 2.34
結合物6 [3] 3.20 3.40
實例 97. 結合物 6 劑量依賴性減少肺中之發炎細胞因子
在鼻內經3×102 PFU/小鼠(3x LD95 )之小鼠適應性流感A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1)攻擊之6-8週雌性BALB/c小鼠(Charles River)中進行功效研究。結合物6或人類IgG1 Fc對照物在攻擊後2 h以0.1 – 3 mg/kg之單一靜脈內(IV)劑量經投與。奧司他韋經口給藥，每天兩次，持續4天，在感染後2 h以5或15 mg/kg開始。記錄體重(BW)持續4天。在感染後4天，藉由CO2 處死小鼠且收集肺葉。肺使用MagNA Lyser (Roche)用1 mL PBS中之1 mm矽石珠粒均質化。在6,000 rpm下進行均質化持續60 s且在運行之間在冰上冷凍持續5 min。在肺均質化之後，管在600 x g下經離心持續10 min且上清液經轉移至新管中。
關於細胞因子分析，肺均質液之上清液連續2倍稀釋於96孔板中。INF-γ、TNF-α、IL-6、MIP-1α及MCP-1之細胞因子水準藉由ELISA根據製造商之說明書(R&D Systems)測定。
嚴重流感之發病率及死亡率最終係由肺中由病毒誘導之促發炎細胞因子之流入引起的。使用Fc-結合物治療流感之一種潛在考慮係Fc片段是否將惡化細胞因子誘導之發炎。H1N1致死性感染模型之結果顯示剛好相反：結合物6劑量依賴性減少受感染肺組織中之促發炎細胞因子(例如，TNFα及IL-6) (圖59，表47)。 表47：感染後第4天之細胞因子反應
與未受感染對照物相比之倍數轉變
測試物件[mg/kg] INFy TNFa IL-6 MCP-1 MIP-1a
PBS [0] 0.4 2.2 4.6 16.3 16.4
hIgG1 Fc [3] 0.5 2.2 6.2 20.2 16.8
奧司他韋[5] 0.2 1.7 4.0 11.7 7.5
奧司他韋[15] 0.2 1.8 3.5 10.5 6.1
結合物6 [0.1] 0.3 1.5 3.0 10.8 7.9
結合物6 [0.3] 0.2 1.2 1.9 6.7 7.4
結合物6 [1] 0.2 1.1 1.9 6.1 3.6
結合物6 [3] 0.8 1.1 1.4 2.8 2.6
未受感染 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
實例 98. 活體內結合物 6 血漿樣品分析。 CD-1 及 BALB/c 嚴重複合型免疫缺乏小鼠中之 PK 比較。
藉由神經胺糖酸酶捕捉偵測ELISA來定量血漿樣品中之結合物6。簡言之，分子經捕捉於經神經胺糖酸酶塗佈之板上且接著使用HRP結合之抗人類IgG-Fc抗體進行偵測。在GraphPad Prism中使用結合物6標準曲線之4PL非線性迴歸計算蛋白質濃度。更詳細方法描述提供於下文中。
Nunc Maxisorp 96-孔板(目錄號12-565-136, ThermoFisher)經1X KPL塗佈緩衝液(5150-0041, SeraCare)中來自A/California/04/2009 (H1N1) (11058-VNAHC, Sino Biological)之0.1U/孔之神經胺糖酸酶塗佈。板在室溫下在軌道板式振盪器上(500 rpm)經培育持續1 h。血漿樣品之連續稀釋液經塗板且在室溫下經培育持續2小時(樣品稀釋劑：0.5% BSA於PBS 0.025% Tween 20中+原生小鼠血漿最終濃度為1:2,500)。在各板上一式兩份進行介於0.230-500 ng/mL範圍內之結合物6標準曲線。在2 h培育之後，板在具有0.05% Tween 20之300 µL PBS中洗滌5次。結合於板上之神經胺糖酸酶的結合物接著在室溫下用1:1,000稀釋於樣品稀釋劑中之HRP結合之抗人類IgG Fc F(ab’)2 (709-036-098, Jackson)探測持續1 h。板接著在具有0.05% Tween 20之300 uL PBS中洗滌8次且用TMB受質顯影持續7-8分鐘。該反應用1N H2 SO4 停止。在450 nm下讀取吸光度。使用GraphPad Prism Version 6，根據標準曲線之非線性迴歸分析(S型，4PL分析)內推血漿樣品中之結合物6。PK 型態， CD-1 對 BALB/c SCID 小鼠
結合物6以5 mg/kg經靜脈內投與至SCID及CD-1 (免疫勝任)小鼠，證明了相似PK型態(圖60)。濃度在取樣時間點處為可相當的。兩相PK型態相繼包含24小時分佈相、狹窄消除相。結合物6血漿水準在該研究之一週過程中相對於Cmax 水準保持較高(約10 µg/ml)。實例 99. 合成炔丙基二胺中央連接體
Figure 02_image1746
步驟 a.
Figure 02_image1748
2-(2-Boc-胺基乙氧基)乙醇(16.0 g，78.0 mmol)及CBr4 (31.0 g，93.5 mmol)於DCM (100 mL)中之溶液在0℃下經15分鐘用PPh3 (24.5 g，93.5 mmol)緩慢地處理(放熱)。在添加過程中，內部溫度保持低於30℃。在添加PPh3 之後，該反應在室溫下經攪拌隔夜。粗反應物經濃縮為油狀物，接著藉由正相層析法用10%乙酸乙酯/己烷至80%乙酸乙酯/己烷溶離經純化。收集管內部含有油小液滴之溶離份經組合且濃縮為無色油狀物。產量18.1 g，86%。步驟 b.
Figure 02_image1750
步驟-a產物(10 g，37.3 mmol)、苯甲胺(1.60 g，14.9 mmol)及K2 CO3 (6.19 g，44.8 mmol)於DMF (20 mL)中之溶液在75℃油浴中加熱持續8 h。過濾該混合物，濃縮且藉由RPLC (5% ACN/水至100% ACN)經純化。產量6.8 g，95%。步驟 c.
Figure 02_image1752
向步驟-b產物(5.35 g，8.98 mmol)於CHCl3 /EtOH (1:20，100 mL)中之溶液中添加20% Pd(OH)2 /C (1.26 g，1/80 mmol)。該反應在環境溫度下在氫氣球下經攪拌隔夜。該反應混合物經矽藻土墊過濾。移出溶劑且無需純化繼續用於後續步驟。步驟 d.
Figure 02_image1754
步驟-c產物再溶解於20 mL DMF/二氯甲烷(1:5)中。向此游離胺溶液中添加炔丙基PEG4酸(2.36 g，8.98 mmol)、EDCI (2.57 g，13.5 mmol)、HOAt (1.83 g，13.5 mmol)及胡尼西氏鹼(3.13 mL，18.0 mmol)。該反應混合物經過濾持續四小時，接著濃縮且藉由RPLC (10% ACN/水至60% ACN/水經純化。經兩個步驟，產量4.00 g，70%。藉由LCMS發現之離子：[M – Boc + H]+ = 534.2, [M + H]+ = 634.2。步驟 e.
Figure 02_image1756
步驟-d產物(4.00 g，6.31 mmol)用二噁烷(30 mL)中之4N HCl處理持續2小時。藉由旋轉蒸發移除過多HCl及二噁烷，且剩餘物進一步在高真空下乾燥以生成呈2HCl鹽形式之Int-10。產量3.15 g，99%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 434.2。實例 100. 合成 Int-7a (C7-C7 異構體 )
Figure 02_image1758
步驟 a.
Figure 02_image1760
5-乙醯胺基-7,8,9-O-三乙醯基-2,6-無水-4-疊氮基-3,4,5-三去氧-D-甘油-D-半乳-壬-2-烯酸甲酯(30 g，65.7 mmol)溶解於甲醇(100 mL)中且與Lindlar催化劑(15 g)組合。所得混合物用氫氣沖洗且攪拌持續5小時，每30分鐘用氫氣沖洗通過頂部空間之氫氣。在如藉由HPLC所測定完成反應之後，該催化劑經矽藻土過濾。濾液用於下一步驟。
來自前一步驟之粗胺(18.9 g，43.8 mmol)用甲醇(100 mL)中之N,N'-雙-boc-1-脒基吡唑(14.3 g，46.0 mmol)及DIEA (9.9 mL，57.0 mmol)處理。所得溶液在室溫下經攪拌，直至所有起始材料均經消耗，如藉由LCMS所測定(約30 min)。該溶液經濃縮為泡沫且在高真空下儲存隔夜，接著無需進一步純化用於下一步驟。
來自前一步驟之粗三-乙酸酯(43.8 mmol)溶解於100 ml無水甲醇中，接著在室溫下用甲醇中之甲醇鈉(1.9 mL，甲醇中之25%溶液，8.76 mmol)。藉由LCMS監測反應之進展，其在10分鐘之後完成。該反應用1N HCl淬滅至pH約為7。所得溶液經濃縮且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以10%至100%乙腈及水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀經純化。無TFA修飾劑用於此純化。產物之產量15.6 g，65%。步驟 b.
Figure 02_image1762
步驟-a產物(5.47 g，10 mmol)及DMAP (1.222 g，10 mmol)之混合物溶解於無水THF (30 ml)中。在冰水浴中冷卻之後，該溶液緩慢地用1,1’-羰基二咪唑(2.6 g，16 mmol)處理，接著在0℃下經攪拌持續30分鐘，隨後在60℃下加熱持續2小時。其接著冷卻至室溫且用水(50 ml)及EtOAc/己烷(1:1，100 ml)萃取。有機層用水(50 ml × 3)洗滌，經Na2 SO4 乾燥且藉由旋轉蒸發經濃縮。白色泡沫狀產物進一步在高真空下乾燥且無需進一步純化繼續用於後續步驟。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 573.2。步驟 c.
Figure 02_image1764
含有步驟-b產物之反應燒瓶用氮氣真空沖洗且溶解於無水DCM (50 ml)中，接著在冰水浴中冷卻。經20分鐘分成數份向該經冷卻溶液中相繼添加DMAP (4.89 g，40 mmol)、氯甲酸4-硝基苯酯(6.05 g，30 mmol)。該溶液在0℃下經攪拌，接著加溫至室溫持續1小時。LCMS顯示起始材料1 h，因此添加額外DMAP (1.22 g，10 mmol)及氯甲酸4-硝基苯酯(1 g，5 mmol)。繼續該反應持續4小時，接著用兩個矽膠管柱(220 g，藉由20% EtOAc及己烷預濕潤)純化且用20%至80% EtOAc及己烷溶離。經兩個步驟，產量4.42 g，59.9%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 738.2步驟 d.
Figure 02_image1766
經30分鐘分成數份向步驟-c產物(3.2 g. 4.34 mmol)於無水DCM (3 ml)中之溶液中添加炔丙基二胺中央連接體(1.26 g，2.5 mmol，描述於實例99中)及DIPEA (1.68 g，13 mmol)於無水DMF (5 ml)中之混合物。該反應在室溫下經攪拌持續2小時。其接著經濃縮且藉由RPLC (30%至90%乙腈及水，不使用TFA修飾劑)經純化。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 815.8, [(M - Boc + 2H)/2]+ = 765.8, [(M - 2Boc + 2H)/2]+ = 716。產量3.33 g，94.2%。步驟 e.
Figure 02_image1768
步驟-d產物(3.33 g，2.04 mmol)溶解於DCM (5 ml)及TFA (5 ml)中，接著在35℃下經攪拌持續約6小時。藉由LCMS監測該反應。當完成時，該溶液經濃縮且藉由RPLC (5至30%乙腈及水，不使用TFA)經純化。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 615.8, [(M + 3H)/3]+ = 411。產量2.29 g，91.3%。步驟 f.
Figure 02_image1770
步驟-e產物(61.5 mg，0.05 mmol)溶解於MeOH/水(1:1，0.6 ml)中。在該溶液經冷卻至-6℃(鹽/冰浴)之後，逐滴添加1.0 M LiOH (0.3 ml，0.3 mmol)且該反應經攪拌持續30分鐘。其接著用二噁烷溶液(75 µl)中之4N HCl淬滅至pH約為7.0且直接地藉由製備型HPLC (Isco ACCQ製備型，Luna 5 µm C18(2) 100 Å LC管柱100 mm × 30 mm；梯度：0%乙腈/水持續2 min，接著經12 min 0%至15%乙腈/水，接著在15%乙腈下等度持續10 min，使用0.1% TFA)經純化。產量45 mg，65.3%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 575.8, [(M + 3H)/3]+ = 384.2。分析滯留時間：6.013 min。條件：Phenomemex Gemini HPLC管柱，3 µm WX-C18 110 Å，100 mm × 3 mm，經25分鐘用5-95%乙腈及水梯度溶離，使用0.1% TFA。實例 101. 合成 Int-7b (C7-C9 異構體 )
Figure 02_image1772
類似於Int-7a (C7-C7異構體，實例100)製備C7-C9雜二聚體(Int-7b)，例外在於該反應在0℃下進行且藉由HPLC監測(滯留時間：6.112 min。條件：參見實例100，合成Int-7a且當C7-C9異構體佔優勢時停止(約3 h)。此異構體使用用於分離Int-7a之相同條件經分離。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 575.8, [(M + 3H)/3]+ = 384.2。實例 102. 合成 Int-7c (C9-C9 異構體 )
Figure 02_image1774
類似於Int-7a (C7-C7異構體，實例100)製備Int-7c (C9-C9異構體)，例外在於該反應在0℃下進行且藉由HPLC監測(滯留時間：6.232 min。條件：參見實例100，合成Int-7a且當C9-C9異構體佔優勢時停止(約6 h)。此異構體使用用於分離Int-7a之相同條件經分離。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 575.8, [(M + 3H)/3]+ = 384.2。實例 103. 合成 Int-7 ( 丙酮化合物途徑 )
Figure 02_image1776
步驟 a.
Figure 02_image1778
5-乙醯胺基-7,8,9-O-三乙醯基-2,6-無水-4-疊氮基-3,4,5-三去氧-D-甘油-D-半乳-壬-2-烯酸甲酯(10.0 g，22 mmol)溶解於60 ml無水甲醇中，接著在冰水浴中冷卻下用20 ml甲醇中之甲醇鈉(0.5 M於甲醇中，10 mmol)處理。藉由LCMS監測反應之進展，其在2小時之後完成。反應溶液之pH接著藉由使用Amberlite IRN-77離子交換樹脂經調節至5至6之值。過濾該混合物以移除該樹脂且在真空下蒸發至乾。所得油狀物無需進一步純化即用於下一步驟。藉由LCMS發現之離子：M+H =331.1。步驟 b.
Figure 02_image1780
向前一步驟之產物於70 ml丙酮中之溶液中添加30 ml 2,2-二甲氧基丙烷及對甲苯磺酸1水合物(400 mg，2.0 mmol)，所得溶液在室溫下經攪拌隔夜。在此時間結束時，添加碳酸氫鈉(170 mg，2.0 mmol)，且該混合物濃縮至乾。所得殘餘物無需純化即用於下一步驟。藉由LCMS發現之離子：M+H =371.2。步驟 c.
Figure 02_image1782
向來自前一步驟之材料於60 ml甲醇中之溶液中添加5.0 g Lindlar催化劑。所得混合物每30分鐘用氫氣沖洗且經攪拌持續5小時。在如藉由HPLC所測定完成反應之後，該催化劑經矽藻土濾出。濾液經濃縮且無需純化即用於下一步驟。
60 ml THF中之前一步驟之粗產物用N,N'-雙-boc-1-脒基吡唑(9.3 g，30.0 mmol)及DIEA (9.9 mL，57.0 mmol)處理。所得溶液在室溫下經攪拌，直至所有起始材料均經消耗，如藉由LCMS所測定(4 h)。該溶液經濃縮且藉由用20%至80%乙酸乙酯/二氯甲烷溶離之急驟層析法經純化。經四個步驟，產量8.8 g，59.0%。藉由LCMS發現之離子：M+H 587.3。步驟 d.
Figure 02_image1784
含有前一步驟之產物(6.5 g，11 mmol)之反應燒瓶用氮氣真空沖洗且溶解於無水二氯甲烷(100 ml)中。在該溶液在冰水浴中冷卻之後，添加DMAP (4.89 g，40 mmol)且攪拌以溶解，接著分成數份添加氯甲酸4-硝基苯酯(5.58 g，28 mmol)，同時在0℃至室溫下攪拌持續1小時。LCMS顯示起始材料1 h，因此添加額外DMAP (1.22 g，10 mmol)及氯甲酸4-硝基苯酯(1.0 g，5 mmol)。再繼續該反應持續4小時，接著濃縮且藉由用20%至80%乙酸乙酯/二氯甲烷溶離之急驟層析法經純化。產量5.1 g，59.9%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 752.2步驟 e.
Figure 02_image1786
向來自前一步驟之碳酸硝基苯酯(1.8 g. 2.3 mmol)於無水二氯甲烷(20 ml)中之溶液中添加中央連接體(0.51 g，1.0 mmol，經30分鐘分成數份添加)及DIPEA (1.4 ml，10 mmol)於無水DMF (20 ml)中之混合物。該反應在室溫下經攪拌隔夜，接著濃縮且藉由用0%至10%甲醇/二氯甲烷溶離之急驟層析法經純化。產量1.35 g，80%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 830.4, [(M - Boc + 2H)/2]+ = 780.4, [(M - 2Boc + 2H)/2]+ = 730.4。步驟 f.
Figure 02_image1788
前一步驟之產物(200 mg，0.2 mmol)溶解於2 ml MeOH及2 ml THF中，接著用氫氧化鋰(24 mg，1 mmol)溶解於2 ml水中之溶液處理。該反應在室溫下經攪拌持續10 min，此時HPLC顯示反應完成。反應溶液之pH藉由使用Amberlite IRN-77離子交換樹脂經調節至5至6之值，過濾以移除該樹脂。粗產物在真空下蒸發至乾且無需純化即用於下一步驟。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 815.4, [(M - Boc + 2H)/2]+ = 765.4, [(M - 2Boc + 2H)/2]+ = 715.4。步驟 g.
Figure 02_image1790
步驟g之產物(400 mg，0.25 mmol)溶解於5 ml二氯甲烷及5 ml TFA中，且所得反應溶液在室溫下經攪拌。藉由LCMS監測反應之進展。在反應完成之後(6 h)，該溶液經汽提至乾且接著溶解於4 ml水及4 ml乙腈中。所得溶液在室溫下再攪拌持續2小時，此時LCMS顯示丙酮化合物保護基之完全保護基脫除。此混合物經濃縮且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以5%至40%乙腈/水溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析儀使用0.1% TFA作為修飾劑經純化。產量270 mg，68.0 %。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 575.8, [(M + 3H)/3]+ = 384.2。實例 104. Int-7a 、 Int-7b 及 Int-7c 之 NMR 結果 Int-7a 之 NMR
Figure 02_image1792
1 H NMR (500 MHz, 甲醇-d 4 ) δ 5.91-5.89 (m, 2H), 5.00-4.96 (m, 2H), 4.58-4.53 (m, 2H),4.42-4.37(m, 2H), 4.20 – 4.17 (m, 6H), 4.02-3.97 (m, 2H), 3.78 – 3.49 (m, 28H), 3.29-3.18 (m, 4H), 2.86 (t,J = 2.6 Hz, 1H), 2.85-2.72 (m, 2H), 1.96 (s, 3H), 1.95 (s, 3H) 。
13 C NMR (125 MHz, MeOD) δ 171.73, 170.80, 170.29, 161.95, 156.06, 155.08, 154.99, 144.07, 143.93, 116.41, 114.10, 106.03, 105.86, 77.71, 74.46, 73.22, 68.62, 68.54, 68.50, 68.38, 68.12, 68.00, 67.94, 67.67, 67.64, 67.53, 67.20, 66.96, 65.44, 61.53, 56.17, 49.74, 49.64, 47.37, 45.17, 39.16, 39.06, 31.73, 19.96, 19.92。Int-7b 之 NMR
Figure 02_image1794
1 H NMR (500 MHz, 甲醇-d 4 ) δ 5.91-5.87 (m, 2H), 5.04-4.95 (m, 1H), 4.58-4.48 (m, 2H), 4.45-4.37 (m, 3H), 4.20 – 4.10 (m, 5H), 4.08 – 3.98 (m, 2H), 3.79-3.44 (m, 29H), 3.29 – 3.18 (m, 4H), 2.88-2.70 (m, 3H), 2.02 (s, 3H), 1.96-1.94 (m, 3H)。
1 H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 8.28 (d, J = 8.4 Hz, 2H, -NH), 7.98 (d, J = 11.5 Hz, 2H, -NH), 7.78 (d, J = 8.7 Hz, 2H, -NH), 7.60 (t, J = 8.5 Hz, 2H, -NH), 7.20 (bs, 2H, -NH), 7.06 (bs, 2H, -NH), 5.69 (bs, 1H), 5.67 (d, J=2.4 Hz, 1H), 4.83 (dd, J = 9.2, 2.2 Hz, 1H), 4.45 (dt, J = 9, 2.5 Hz, 1H), 4.37 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 4.33-4.24 (m, 2H), 4.13 (d, J = 2.5 Hz, 2H), 4.05-4.32 (m, 41H), 3.23 (m, 1H), 3.15-3.09 (m, 2H), 3.06-3.02 (m, 2H),  2.59 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 1.91 (s, 3H), 1.78 (s, 3H)。
13 C NMR (125 MHz, MeOD) δ:173.19, 172.98, 172.25, 171.75, 164.26, 163.82, 157.88, 157.55, 156.51, 146.09, 107.21, 106.93, 106.59, 79.22, 76.19, 75.92, 74.72, 74.68, 70.12, 70.08, 70.03, 69.99, 69.92, 69.88, 69.66, 69.48, 69.12, 69.01, 68.94, 68.73, 68.69, 68.50, 68.19, 67.08, 66.93, 66.79, 63.04, 57.68, 51.24, 51.15, 50.13, 48.87, 48.72, 46.72, 46.58, 46.23, 40.64, 40.41, 33.21, 21.49, 21.45, 21.40。Int-7c 之 NMR
Figure 02_image1796
1 H NMR (500 MHz, 甲醇-d 4 ) δ: 5.88 (d, J = 2.6 Hz, 2H), 4.50 (dt, J = 8.5, 2.7 Hz, 2H), 4.43 (ddd, J = 9.7, 3.9, 1.5 Hz, 2H), 4.39 (dd, J = 11.5, 2.4 Hz, 2H), 4.25 – 4.16 (m, 2H), 4.19 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 4.13 (dt, J = 11.5, 5.9 Hz, 2H), 4.05 (m, 2H), 3.77 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 3.72 – 3.55 (m, 22H), 3.51 (m, 4H), 3.35 – 3.23 (m, 4H), 2.86 (t, J = 2.4 Hz, 1H), 2.74 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 2.02 (s, 6H)。
13 C NMR (125 MHz, MeOD) δ:173.03, 163.76, 157.89, 157.54, 145.60, 107.21, 79.28, 76.29, 74.70, 70.11, 70.07, 70.03, 69.92, 69.70, 69.47, 68.96, 68.89, 68.72, 68.54, 68.19, 67.05, 66.75, 57.69, 50.09, 48.69, 48.08, 46.10, 40.44, 40.38, 33.23, 21.42。實例 105. 合成 Int-60
Figure 02_image1798
步驟 a.
向先前製備之醚-紮那米韋酸(1.00 g，1.586 mmol，實例31)、2-疊氮基乙胺鹽酸鹽(213 mg，1.744 mmol)及DIPEA (1.105 mL，6.343 mmol)於DMF (8.0 mL)中之0℃攪拌溶液中添加HATU (615 mg，1.618 mmol)。溫度升至環境溫度且繼續攪拌直至完成。所有揮發物均根據真空技術經移除。殘餘物溶解於乙酸乙酯中，相繼用1 M硫酸水溶液(1 × 50 mL)、飽和碳酸氫鈉水溶液(3 × 20 mL)及鹽水(1 × 50 mL)洗滌。所得有機層經硫酸鎂乾燥，過濾，且所有揮發物均根據真空技術經移除。以此方式，以高純度獲得816 mg所需中間物疊氮化物且無需任何進一步純化即用於下一步驟。(藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 699.2)。向所述粗材料(816 mg，1.168 mmol)、二炔丙基胺(54 mg，0.584 mmol)、參((1-苯甲基-4-三唑基)甲基)胺(31 mg，0.058 mmol)及抗壞血酸鈉(58 mg，0.292 mmol)於乙醇(10 mL)及水(5 mL)中之攪拌溶液中添加硫酸銅(10 mg，0.061 mmol)。在完成時，添加銅淨化劑SiliaMetS TAAcONa (300 mg，裝載0.45 mmol/g)且繼續攪拌持續1 h。藉助於二氯甲烷過濾該混合物。用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌濾液。水層另外用二氯甲烷洗滌(3次)。經組合之有機物經硫酸鎂乾燥，過濾且濃縮。殘餘物藉由矽石管柱使用相繼以0%至100%己烷及乙酸乙酯、0%至30%二氯甲烷及溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析法經純化。產量817 mg，94%產率。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 745.8, [(M + 3H)/3]+ = 497.5。步驟 b.
向步驟a產物(817 mg，0.548 mmol)、炔丙基-PEG4-酸(185 mg，0.712 mmol)及DIPEA (286 uL, 1.644 mmol)於DMF (7.0 mL)中之0℃攪拌溶液中添加HATU (212 mg，0.544 mmol)。溫度升至環境溫度且繼續攪拌直至完成。所有揮發物均根據真空技術經移除。殘餘物藉由HPLC (0至90%甲醇及水)經純化。產量520 mg，56%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 866.8, [(M + 3H)/3]+ = 578.4。步驟 c.
攪拌步驟b化合物(520 mg，0.300 mmol)於2-甲基-2-丁烯(0.25 mL)、二氯甲烷(4.0 mL)及TFA (2.0 mL)中之攪拌溶液，直至氣體逸出停止。所有揮發物均根據真空技術經移除。殘餘物藉由HPLC (0至30%甲醇及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量221 mg，47%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 666.8, [(M + 3H)/3]+ = 444.8。步驟 d.
向步驟c產物(221 mg，0.142 mmol)於水(3.0 mL)中之0℃攪拌溶液中添加氫氧化鋰(20 mg，0.850 mmol)。該反應用乙酸(120 uL)淬滅，且所有揮發物均根據真空技術經移除。殘餘物藉由HPLC (0至20%甲醇及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量130 mg，62%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 626.8, [(M + 3H)/3]+ = 418.2。實例 106. 合成結合物 29
經疊氮基官能化之無糖基化Fc (SEQ ID NO: 35)於pH 7.4 PBS x 1緩衝溶液(100 mg，10 mL，1.874 µmol)中之溶液添加至含有炔衍生之小分子(17 mg，0.0112 mmol；實例105，Int-60)、硫酸銅(4 mg，0.0225 mmol)、參(3-羥基丙基三唑基甲基)-胺(39 mg，0.0900 mmol)及抗壞血酸鈉(7.4 mg，0.375 mmol)之pH 7.4 PBS x 1緩衝溶液(10.50 mL)的離心管中。所得混合物輕柔地震盪隔夜。其相繼藉由在蛋白A管柱上之親和力層析法、尺寸排阻層析法(參見實例10)經純化。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出56938 Da之平均質量(DAR = 2.3)。產量49.9 mg，49%產率。實例 107. 合成 Int-65
Figure 02_image1800
步驟 a.
向先前製備之醚-紮那米韋酸(2.00 g，3.172 mmol，實例31)及4-甲基嗎啉(0.628 mL，5.709 mmol)於四氫呋喃(30 mL)中之0℃攪拌溶液中添加氯甲酸異丁酯(0.617 mL，4.7574 mmol)。10分鐘之後，溫度增加至環境溫度且繼續攪拌持續20分鐘。溫度減回0℃，且一次性添加硼氫化鈉(360 mg，9.515 mmol)，隨後經5分鐘逐滴添加(10 mL)。在完成時，該反應用乙酸(2.860 mL，50 mmol)淬滅，且5分鐘之後，溫度升至環境溫度，同時繼續攪拌直至氣體逸出停止。所有揮發物均經蒸發且殘餘物懸浮於二氯甲烷中且經過濾。濾液經濃縮且殘餘物藉由矽石管柱使用以20%至100%己烷及乙酸乙酯溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析法使用3%甲醇作為修飾劑經純化。產量1.302 g，66%產率。藉由LCMS發現之離子：[(M + H)]+ = 617.2。步驟 b.
向步驟a產物(1.25 g，2.027 mmol)及DIPEA (1.095 mL，6.284 mmol)於二氯甲烷(15 mL)中之0℃攪拌溶液中添加甲烷磺醯氯(0.314 mmol，4.054 mmol)。在完成時，該反應用水(15 mL)處理。分離各層，且二氯甲烷層相繼經鹽水、硫酸鎂乾燥，且過濾。該溶液經濃縮且殘餘物溶解於DMF (10 mL)中，且添加疊氮化鈉(264 mg，4.054 mmol)，同時溫度升至50℃。18 h之後觀察到完成，且所有揮發物均根據真空技術經蒸發。殘餘物藉由矽石管柱使用以20%至100%己烷及乙酸乙酯溶離之Isco COMBIFLASH®液體層析法使用3%甲醇作為修飾劑經純化。產量767 mg，59%產率。藉由LCMS發現之離子：[(M + H)]+ = 642.2。步驟 c.
向步驟b產物(496 mg，0.773 mmol)、二炔丙基胺(36 mg，0.386 mmol)、參((1-苯甲基-4-三唑基)甲基)胺(41 mg，0.077 mmol)及抗壞血酸鈉(115 mg，0.580 mmol)於乙醇(16 mL)及水(8 mL)中之攪拌溶液中添加硫酸銅(13 mg，0.081 mmol)。在完成時，添加銅淨化劑SiliaMetS TAAcONa (600 mg，裝載0.45 mmol/g)且繼續攪拌持續1 h。藉助於二氯甲烷過濾該混合物。用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌濾液。水層另外用二氯甲烷洗滌(3次)。經組合之有機物經硫酸鎂乾燥，過濾且所有揮發物均根據真空技術經蒸發。向殘餘物、炔丙基-PEG4-酸(151 mg，0.580 mmol) )及DIPEA (337 uL, 1.933 mmol)於DMF (10.0 mL)中之0℃攪拌溶液中添加HATU (220 mg，0.580 mmol)。溫度升至環境溫度且繼續攪拌直至完成。所有揮發物均根據真空技術經移除。殘餘物藉由HPLC (0至90%甲醇及水)經純化。產量457 mg，73%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 809.8, [(M + 2H - Boc)/2]+ = 759.8。步驟 d.
攪拌步驟c化合物(451 mg，0.279 mmol)於2-甲基-2-丁烯(0.25 mL)、二氯甲烷(4.0 mL)及TFA (2.0 mL)中之攪拌溶液，直至氣體逸出停止。所有揮發物均根據真空技術經移除。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 609.8, [(M + 3H)/3]+ = 407.0。向殘餘物於四氫呋喃(6 mL)及水(6 mL)中之0℃攪拌溶液中添加氫氧化鋰(240 mg，10.03 mmol)。在完成時，該反應用乙酸(0.638 mL，11.14 mmol)淬滅，且所有揮發物均根據真空技術經移除。殘餘物藉由HPLC (0至90%甲醇及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量209 mg，67%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 569.8, [(M + 2H - Boc)/2]+ = 380.3。實例 108. 合成結合物 30
經疊氮基官能化之無糖基化Fc (實例7，SEQ ID NO: 35)於pH 7.4 PBS x 1緩衝溶液(50 mg，5 mL，1.874 µmol)中之溶液添加至含有炔衍生之小分子(8.7 mg，0.0064 mmol，Int-65)、硫酸銅(2 mg，0.013 mmol)、參(3-羥基丙基三唑基甲基)-胺(22 mg，0.0508 mmol)及抗壞血酸鈉(25 mg，0.127 mmol)之pH 7.4 PBS x 1緩衝溶液(9.50 mL)的離心管中。所得混合物輕柔地震盪隔夜。其相繼藉由在蛋白A管柱上之親和力層析法、尺寸排阻層析法(參見實例10)經純化。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出61548 Da之平均質量(DAR = 2.4)。產量32.33 mg，67%產率。實例 109 ：合成碳酸對硝基苯酯紮那米韋中間物
Figure 02_image1802
步驟 a.
Figure 02_image1778
三乙醯氧基-疊氮基紮那米韋中間物(10.0 g，22 mmol)溶解於60 ml無水甲醇中，接著在冰水浴中冷卻下用20 ml甲醇中之甲醇鈉(0.5 M於甲醇中，10 mmol)處理。藉由LCMS監測反應之進展，其在2小時之後完成。反應溶液之pH接著藉由使用Amberlite IRN-77離子交換樹脂經調節至5至6之值。過濾該混合物以移除該樹脂且在真空下蒸發至乾。所得油狀物無需進一步純化即用於下一步驟。藉由LCMS發現之離子：M+H =331.1。步驟 b.
Figure 02_image1780
向前一步驟之產物於70 ml丙酮中之溶液中添加30 ml 2,2-二甲氧基丙烷及對甲苯磺酸1水合物(400 mg，2.0 mmol)，所得溶液在室溫下經攪拌隔夜。在此時間結束時，添加碳酸氫鈉(170 mg，2.0 mmol)，且該混合物濃縮至乾。所得殘餘物無需純化即用於下一步驟。藉由LCMS發現之離子：M+H =371.2。步驟 c 及 d.
Figure 02_image1804
向來自前一步驟之材料於60 ml甲醇中之溶液中添加5.0 g Lindlar催化劑。所得混合物每30分鐘用氫氣沖洗且經攪拌持續5小時。在如藉由HPLC所測定完成反應之後，該催化劑經矽藻土濾出。濾液經濃縮且無需純化即用於下一步驟。
60 ml THF中之前一步驟之粗產物用N,N'-雙-boc-1-脒基吡唑(9.3 g，30.0 mmol)及DIEA (9.9 ml，57.0 mmol)處理。所得溶液在室溫下經攪拌，直至所有起始材料均經消耗，如藉由LCMS所測定(4 h)。該溶液經濃縮且藉由用20%至80%乙酸乙酯/二氯甲烷溶離之急驟層析法經純化。經四個步驟，產量8.8 g，59.0%。藉由LCMS發現之離子：M+H 587.3。步驟 e.
Figure 02_image1784
含有前一步驟之產物(6.5 g，11 mmol)之反應燒瓶用氮氣真空沖洗且溶解於無水二氯甲烷(100 ml)中。在該溶液在冰水浴中冷卻之後，添加DMAP (4.89 g，40 mmol)且攪拌以溶解，接著分成數份添加氯甲酸4-硝基苯酯(5.58 g，28 mmol)，同時在0℃至室溫下攪拌持續1小時。LCMS顯示起始材料1 h，因此添加額外DMAP (1.22 g，10 mmol)及氯甲酸4-硝基苯酯(1.0 g，5 mmol)。再繼續該反應持續4小時，接著濃縮且藉由用20%至80%乙酸乙酯/二氯甲烷溶離之急驟層析法經純化。產量5.1 g，59.9%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 752.2。實例 110. 合成 Int-71
Figure 02_image1806
步驟 a.
Figure 02_image1712
向2-(2-Boc-胺基乙氧基)乙醇(6.15 g，30 mmol)於無水DCM (60 ml)中之溶液中添加DIPEA (7.8 g，60 mmol)及DMAP (366.6 mg，3 mmol)。接著經30分鐘分成數份添加對甲苯磺醯氯(6.86 g，36 mmol)。在所得混合物經攪拌持續3天之後，其藉由旋轉蒸發經濃縮且藉由RPLC (20%至70%乙腈/水)經純化。產量3.71 g，34.4%。藉由LCMS發現之離子：[M -Boc + H]+ = 260。步驟 b.
Figure 02_image1809
向步驟-a產物(2.1 g，5.83 mmol)於無水THF (10 ml)中之溶液中添加碳酸鈉(1.24 g，11.7 mmol)及N-Boc-1,4-二胺基丁烷(1.32 g，7 mmol)。所得混合物在60℃下加熱持續1天。接著濾出鹽，且濾液藉由旋轉蒸發經濃縮。殘餘物藉由RPLC (100 g，5至50%乙腈及水)經純化。產量1.94 g，88.6%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 376.0。步驟 c.
Figure 02_image1716
向炔丙基PEG-4酸(781 mg，3 mmol)及HATU (1.14 g，3 mmol)於無水DMF (3 ml)中之溶液中添加DIPEA (390 mg，3 mmol)，隨後添加步驟-b產物(940 mg，2.5 mmol)及DIPEA (390 mg，3 mmol)於無水DMF (3 ml)中之溶液。該反應混合物經攪拌持續30分鐘，接著直接地藉由RPLC (5%至80%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量960.2 mg，65.3%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 618.3, [M - Boc + H]+ = 518.3。步驟 d.
Figure 02_image1718
步驟-c產物(960.2 mg，1.63 mmol)溶解於無水THF (6 ml)中。添加二噁烷(4 ml)中之4N HCl溶液，且該反應混合物經攪拌隔夜。其接著藉由旋轉蒸發經濃縮。殘餘物用水(3 × 3 ml)及乙酸乙酯(10 ml)萃取。經組合之水層經凍乾。產量760 mg，95.1%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 418.0。步驟 e.
Figure 02_image1813
經20分鐘分成數份向步驟-d產物(556.2 mg，1.13 mmol)及DIPEA (741 mg，5.7 mmol)於無水DMF (3 ml)中之混合物中添加紮那米韋之碳酸對硝基苯酯(1.67 g，2.26 mmol，描述於實例109中)。該反應經攪拌持續1小時，接著直接地藉由RPLC (30%至90%乙腈/水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量1.35 g，74%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 807.9。步驟 f.
Figure 02_image1815
步驟-e產物(1.35 g，0.836 mmol)溶解於TFA (5 ml)中。該反應在30℃下加熱持續1小時，其直接地藉由RPLC (0%至35%乙腈/水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量1.00 g，82.9%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 607.8。步驟 g.
Figure 02_image1817
步驟-f產物(1.00 g，0.693 mmol)溶解於MeOH (12 ml)中，接著在冰水浴中冷卻。其接著經LiOH單水合物(286 mg，6.6 mmol)於水(9 ml)中之溶液處理。所得混合物經攪拌隔夜且接著藉由二噁烷(2 ml)中之4N HCl溶液酸化。在有機溶劑藉由旋轉蒸發經移除之後，殘餘物藉由製備型HPLC (Isco ACCQ製備型，Luna 5 µm C18(2) 100 Å LC管柱100 mm × 30 mm；梯度：0%乙腈/水持續2 min，接著經12 min 0%至15%乙腈/水，接著在15%乙腈下等度持續10 min，使用0.1% TFA)經純化。產量275.9 mg，29.2%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 567.8, [(M + 3H)/3]+ = 378.9。實例 111. 合成結合物 31
向15-ml無菌離心管中饋入抗壞血酸鈉(68.1 mg，0.344 mmol)、THPTA (14.9 mg，0.0344 mmol)、炔衍生之小分子(17.5 mg，0.00953 mmol，描述於實例110中)及緩衝液PBS 7.4 (1 ml)。在藉由渦旋經攪拌以溶解所有物質之後，相繼添加Peg 4疊氮基Fc (50 mg，0.0008588 mmol，描述於實例7中 SEQ ID No. 18)、CuSO4 (2.05 mg，0.0129 mmol)於PBS (0.5 ml)中之溶液。該混合物輕柔地經旋轉持續20小時，接著相繼藉由蛋白-A管柱上之親和力層析法、尺寸排阻層析法經純化。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出63586 Da之平均質量(DAR = 3.8)。產量32.8 mg，66%產率。實例 112. 合成 Int-72
Figure 02_image1819
步驟 a.
Figure 02_image1821
向N-Boc-1,4-二胺基丁烷(1.56 g，8.28 mmol)於無水DMF (7 ml)中之溶液中添加碳酸鈉(742 mg，7 mmol)及5-(Boc-胺基)-1-戊基溴(1.73 g，6.5 mmol)。所得混合物在50℃下加熱持續24小時。接著濾出鹽，且濾液藉由旋轉蒸發經濃縮。殘餘物藉由RPLC (5%至50%乙腈/水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量2 g，63.2%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 374.4。步驟 b.
Figure 02_image1823
向炔丙基PEG-4酸(1.3 g，5 mmol)及HATU (2.1 g，5.5 mmol)於無水DMF (6 ml)中之溶液中添加DIPEA (1.3 g，10 mmol)。5分鐘之後，該反應混合物添加至步驟-a產物(2 g，4.1 mmol)中且經攪拌持續1小時。其接著直接地藉由RPLC (5%至80%乙腈/水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量2.34 g，95%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 616.4, [M – Boc + H]+ = 516.4。步驟 c.
Figure 02_image1825
步驟-b產物(2.34 g，3.8 mmol)溶解於無水THF (12 ml)中。添加二噁烷(10 ml)中之4N HCl溶液，且該反應混合物經攪拌隔夜。其接著藉由旋轉蒸發經濃縮。殘餘物再溶解於乙腈/水(1:1，約16 ml)中，且該溶液經凍乾。粗產物無需進一步純化繼續用於後續步驟。產量1.91 g，定量產率。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 416.4。步驟 d.
Figure 02_image1827
經20分鐘分成數份向紮那米韋之碳酸對硝基苯酯(2.25 g，3.05 mmol，描述於實例109中)於無水DCM (3 ml)中之溶液中添加步驟-c產物(610 mg，1.249 mmol)及DIPEA (1.05 g，8.1 mmol)於無水DMF (4 ml)中之混合物。在攪拌持續1小時之後，該反應混合物經濃縮且藉由RPLC (30%至80%乙腈/水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量1.73 g，85.9%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 806.8, [(M - Boc + 2H)/2]+ = 756.8。步驟 e.
Figure 02_image1829
步驟-d產物(1.73 g，1.073 mmol)溶解於TFA (5 ml)中。在該溶液在30℃下加熱持續3小時之後，其直接地藉由RPLC (0%至35%乙腈/水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量1.176 g，76.1%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 606.8, [(M + 3H)/3]+ = 405。步驟 f.
Figure 02_image1831
步驟-e產物(1.176 g，0.817 mmol)溶解於MeOH (12 ml)中，且該溶液在冰水浴中冷卻。其逐滴經LiOH單水合物(344.4 mg，8.2 mmol)於水(9 ml)中之溶液處理。所得混合物經攪拌隔夜且接著藉由二噁烷(2 ml)中之4N HCl溶液酸化。在有機溶劑藉由旋轉蒸發經移除之後，殘餘物藉由製備型HPLC (Isco ACCQ製備型，Luna 5 µm C18(2) 100 Å LC管柱100 mm × 30 mm；梯度：0%乙腈/水持續2 min，接著經12 min 0%至15%乙腈/水，接著在15%乙腈下等度持續10 min，使用0.1% TFA)經純化。產量108 mg，9.7%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 566.8, [(M + 3H)/3]+ = 378.2。實例 113. 合成結合物 32
向15-ml無菌離心管中饋入抗壞血酸鈉(68.1 mg，0.344 mmol)、THPTA (14.9 mg，0.0344 mmol)、實例112之產物Int-72 (17.5 mg，0.00953 mmol)及PBS 7.4 (1 ml)。在藉由渦旋經攪拌以溶解所有物質之後，相繼添加疊氮基Fc (50 mg，0.0008588 mmol，描述於實例7中，SEQ ID NO: 4)、CuSO4 (2.05 mg，0.0129 mmol)於PBS (0.5 ml)中之溶液。該混合物經旋轉持續20小時。其相繼藉由在蛋白A管柱上之親和力層析法、尺寸排阻層析法經純化。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出63588. Da之平均質量(DAR = 3.8)。產量30.9 mg，62%產率。實例 114. 合成 Int-73
Figure 02_image1833
步驟 a.
Figure 02_image1835
經10分鐘分成數份向紮那米韋之碳酸對硝基苯酯(698.4 mg，0.95 mmol，描述於實例109中)於無水DCM (2 ml)中之溶液中添加炔丙基二胺中央連接體(209 mg，0.426 mmol，描述於實例110中)及DIPEA (330.8 mg，2.56 mmol)於無水DMF (2 ml)中之混合物。該反應在室溫下攪拌持續1小時。其接著經濃縮且藉由RPLC (30%至85%乙腈/水，不使用TFA修飾劑)經純化。產量531 mg，69.2%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 807.8, [(M - Boc + 2H)/2]+ = 757.8。步驟 b.
Figure 02_image1837
步驟-b產物(531 mg，0.329 mmol)溶解於DCM (1.5 ml)及TFA (1.5 ml)中，接著在35℃下經攪拌持續3小時。其經濃縮且藉由RPLC (5%至30%乙腈/水，不使用TFA修飾劑)經純化。產量387 mg，97.1%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 607.6, [(M + 3H)/3]+ = 405.4。步驟 c.
Figure 02_image1839
步驟-b產物(121.4 mg，0.1 mmol)溶解於1.0 M NaCl溶液(3 ml)及乙腈(1 ml)中。在該溶液經冷卻至-8℃(鹽/冰浴)之後，逐滴添加1.0 M NaOH (0.4 mL，0.4 mmol)且該反應在-14℃至-8℃下經攪拌持續6小時。其接著用二噁烷溶液(100 µl)中之4N HCl中和且直接地藉由製備型HPLC (Isco ACCQ製備型，Luna 5 µm C18(2) 100 Å LC管柱100 mm × 30 mm；梯度：0%乙腈/水持續2 min，接著經12 min 0%至17.8%乙腈/水，接著在17.8%乙腈下等度持續10 min，使用0.1% TFA)經純化。產量85.5 mg，62.8%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 567.8, [(M + 3H)/3]+ = 378.9。實例 115. 合成 Int-74
Figure 02_image1841
步驟 a.
Figure 02_image1843
向N-Boc-2-(2-胺基-乙氧基)乙胺(1.2 g，5 mmol)於無水DMF (5 ml)中之溶液中添加碳酸鈉(691 mg，5 mmol)及N-Boc-6-溴-己胺(1.4 g，5 mmol)。所得混合物在70℃下加熱持續24小時。接著濾出鹽，且濾液藉由旋轉蒸發經濃縮。殘餘物藉由RPLC (5%至50%乙腈/水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量444 mg，22%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 404.3。步驟 b.
Figure 02_image1845
向炔丙基PEG-4酸(342.6 mg，1.32 mmol)及HATU (601.5 mg，1.58 mmol)於無水DMF (2 ml)中之溶液中添加DIPEA (258 mg，2 mmol)。5分鐘之後，該反應混合物添加至步驟-a產物(444.3 mg，0.858 mmol)中且經攪拌持續1小時。其接著直接地藉由RPLC (5%至80%乙腈/水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量297.1 mg，53.6%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 646.2, [M – Boc + H]+ = 546.2。步驟 c.
Figure 02_image1847
步驟-b產物(297.1 mg，0.46 mmol)溶解於無水THF (2 ml)中。添加二噁烷(4 ml)中之4N HCl溶液，且該反應混合物經攪拌隔夜。其接著藉由旋轉蒸發經濃縮且藉由製備型HPLC (5%至50%乙腈/水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量239.6 mg，77.3%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 446.2。步驟 d.
Figure 02_image1849
經10分鐘分成數份向紮那米韋之碳酸對硝基苯酯(523.8 mg，0.71 mmol，描述於實例2中)於無水DCM (2 ml)中之溶液中添加步驟-c產物(239.6 mg，0.356 mmol)及DIPEA (245.5 mg，1.9 mmol)於無水DMF (2 ml)中之混合物。該反應在室溫下攪拌持續1小時。其接著經濃縮且藉由RPLC (30%至85%乙腈/水，不使用TFA修飾劑)經純化。產量553 mg，96.5%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 821.8, [(M - Boc + 2H)/2]+ = 771.8。步驟 e.
Figure 02_image1851
步驟-d產物(553 mg，0.343 mmol)溶解於DCM (1.5 ml)及TFA (1.5 ml)中，接著在35℃下經攪拌持續3小時。其經濃縮且藉由RPLC (5%至30%乙腈/水，不使用TFA修飾劑)經純化。產量424.6 mg，99.6%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 621.6, [(M + 3H)/3]+ = 415.0。步驟 f.
Figure 02_image1853
步驟-e產物(424.6 mg，0342 mmol)溶解於1.0 M NaCl溶液(4 ml)及乙腈(4 ml)中。在該溶液經冷卻至-11℃(鹽/冰浴)之後，逐滴添加1.0 M NaOH (1.53 mL，1.53 mmol)且該反應在-14℃至-8℃下經攪拌持續6小時。其接著用二噁烷溶液(375 µl)中之4N HCl淬滅且直接地藉由製備型HPLC (Isco ACCQ製備型，Luna 5 µm C18(2) 100 Å LC管柱100 mm × 30 mm；梯度：0%乙腈/水持續2 min，接著經13.6 min 0%至20.9%乙腈/水，接著在20.9%乙腈下等度持續10 min，使用0.1% TFA)經純化。產量439 mg，92.3%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 581.8, [(M + 3H)/3]+ = 388.2。實例 116. 合成 Int-75
Figure 02_image1855
步驟 a.
Figure 02_image1857
(4-側氧基丁基)胺基甲酸第三丁酯(850 mg，4.54 mg)及N-{2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙基}胺基甲酸第三丁酯(1.99 g，8 mmol)之混合物溶解於DCM (30 ml)中且經Na2 SO4 乾燥。在過濾且濃縮之後，殘餘物再溶解於無水DCM (20 ml)中。經1小時分成數份相繼添加乙酸(641 mg，11 mmol)、三乙醯氧基硼氫化鈉(3.4 g，16 mmol)。該反應混合物經攪拌隔夜，接著用AcOH (3 ml)及MeOH (10 ml)淬滅。過濾該混合物，且濾液藉由旋轉蒸發經濃縮且藉由RPLC (5%至45%乙腈及水)經純化。產量618 mg，32.5%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 420.4。步驟 b.
Figure 02_image1859
類似於實例115之步驟-b產物製備此化合物。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 662.4 , [M – Boc + H]+ = 562.4。步驟 c.
Figure 02_image1861
類似於實例115之步驟-c產物製備此化合物。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 462.4。步驟 d.
Figure 02_image1863
類似於實例115之步驟-d產物製備此化合物。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 829.8, [(M - Boc + 2H)/2]+ = 779.8。步驟 e.
Figure 02_image1865
類似於實例115之步驟-e產物製備此化合物。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 629.8, [(M  + 3H)/3]+ = 420.2。步驟 f.
Figure 02_image1867
類似於實例115之步驟-f產物製備此化合物。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 598.8, [(M + 3H)/3]+ = 393.6。實例 117. 合成 Int-76
Figure 02_image1869
步驟 a.
Figure 02_image1871
向N-Boc-peg-1甲苯磺酸鹽(1.54 g，4.28 mmol，描述於實例110中)於無水THF (8 ml)中之溶液中添加N-2{2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙基}胺基甲酸第三丁酯(1.59 g，6.42 mmol)及碳酸鈉(453.7 mg，4.28 mmol)。所得混合物在50℃下加熱持續24小時。過濾該固體且用乙腈洗滌。濾液經濃縮且藉由RPLC (100 g，5至90%乙腈及水)經純化。產量1.15 g，61.7%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 436.4。步驟 b.
Figure 02_image1873
類似於實例115之步驟-b產物製備此化合物。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 678.2, [M – Boc + H]+ = 578.2。步驟 c.
Figure 02_image1875
類似於實例115之步驟-c產物製備此化合物。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 478.2。步驟 d.
Figure 02_image1877
類似於實例115之步驟-d產物製備此化合物。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 837.6, [(M - Boc + 2H)/2]+ = 767.8。步驟 e.
Figure 02_image1879
類似於實例115之步驟-e產物製備此化合物。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 637.5, [(M + 3H)/3]+ = 425.6。步驟 f.
Figure 02_image1881
類似於實例115之步驟-f產物製備此化合物。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 597.8, [(M + 3H)/3]+ = 399.0。實例 118 合成 Int-67
Figure 02_image1883
步驟 a.
Figure 02_image1885
先前製備之醚紮那米韋酸起始材料(0.90 g，1.43 mmol，描述於實例22中)及N-甲基嗎啉(0.23 mL，2.14 mmol)溶解於THF (35 mL)中且在氮氣氛圍下冷卻至0℃(冰水浴)。經5分鐘時期藉助於注射器逐滴添加氯甲酸異丁酯(0.24 mL，1.85 mmol，於2 mL DCM中)。該混合物在0℃下經攪拌持續30分鐘，接著在環境溫度下經攪拌持續15 min，且接著冷卻至0℃，經5分鐘向其中逐滴添加硼氫化鈉(540 mg，14.3 mmol，溶解於5 mL甲醇中)。該反應經攪拌持續15分鐘，此時所有起始材料均已經消耗(藉由LC/MS)。添加數滴(約1 mL)冰乙酸以酸化該混合物(pH~5)。該混合物用乙酸乙酯及水稀釋且經萃取至乙酸乙酯中(3次)。有機層用鹽水洗滌，且有機萃取物經硫酸鈉乾燥，且在旋轉蒸發儀上經濃縮。粗材料藉由矽膠層析法經純化，首先經乾燥於矽藻土上，且接著經30 min用DCM中之0%-10%甲醇溶離。產量0.66 g，75%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 617.2。步驟 b.
Figure 02_image1887
向前一步驟之產物(0.66 g，1.10 mmol)於20 mL DCM中之攪拌混合物中添加三乙胺(0.30 mL，1.3 mmol)。該混合物在氮氣氛圍下冷卻至0℃(冰水浴)，接著經5分鐘藉助於注射器逐滴用甲磺醯氯(0.15 g，1.3 mmol)處理。移除冰浴且該反應經攪拌持續45分鐘。該反應用飽和碳酸氫鈉水溶液淬滅，接著經萃取至DCM中(3次)。經組合之有機萃取物用鹽水洗滌，經硫酸鈉乾燥且在旋轉蒸發儀上經濃縮。產量0.74 g，99%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 695.2。該中間物無需純化即用於下一步驟。步驟 c.
Figure 02_image1889
來自前一步驟之甲磺酸鹽(0.74 g，1.1 mmol)在80℃下與3 eq疊氮化鈉(0.21 g，3.3 mmol)一起在DMF (5 mL)中經攪拌持續5小時。該混合物用水稀釋，經萃取至DCM中(3次)。經組合之有機萃取物用鹽水洗滌，經硫酸鈉乾燥且濃縮。產量0.67 g，95%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 642.4。該疊氮化物無需純化即用於下一步驟。步驟 d.
Figure 02_image1891
來自前一步驟之疊氮化物(0.67 g，1.04 mmol)在1個大氣壓之氫氣下在Lindlar催化劑(300 mg)存在下在甲醇(20 mL)中經攪拌持續12小時。該混合物經矽藻土過濾且濃縮以提供呈澄清油狀物之標題化合物。該胺無需純化即用於下一步驟。產量0.37 g，54%產率，3個步驟。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 616.2。步驟 e.
Figure 02_image1893
EDC (150 mg，0.78 mmol)添加至來自前一步驟之胺(370 mg，0.60 mmol)、炔丙基-peg4-甲酸(188 mg，0.72 mmol)及三乙胺(0.100 mL，0.72 mmoL)溶解於DMF (4 mL)中之攪拌溶液中。該反應在環境溫度下經攪拌持續2小時，接著直接地藉由RPLC (10%-95%乙腈/水，無修飾劑，30分鐘梯度)經純化。彙集純溶離份且凍乾且直接地用於下一步驟。產量490 mg，80%。藉由LC/MS發現之離子：[M+H]+ = 858.2步驟 f.
Figure 02_image1895
前一步驟之產物(490 mg，0.57 mmol)在TFA (4 mL)中經攪拌持續45分鐘，接著濃縮且在旋轉蒸發儀上與甲醇共沸(3次)。藉由LC/MS發現之離子：[M+H]+ = 658.2。殘餘物在含有LiOH (43 mg，1.8 mmol)之1/1甲醇/水中經攪拌持續30分鐘。該反應用數滴冰乙酸中和且體積在旋轉蒸發儀上減半。粗產物藉由半製備型HPLC (0%-75%乙腈/水，0.1% TFA，30分鐘梯度)經純化。彙集純溶離份且凍乾以提供標題化合物。產量105 mg，29%產率，3個步驟。藉由LC/MS發現之離子：[M+H]+ = 618.2。實例 119. 合成 Int-68
Figure 02_image1897
步驟 a.
Figure 02_image1899
氯甲酸對硝基苯酯(0.23 g，1.14 mmol)添加至一級醇(0.47 g，0.76 mmol 描述於實例118中)及三乙胺(0.21 mL，1.52 mmol)溶解於DCM (15 mL，無水)中之攪拌混合物中。該反應經攪拌持續1小時，接著添加額外三甲胺(0.21 mL)及氯甲酸對硝基苯酯(230 mg)，且再繼續攪拌1小時，此時該混合物用水稀釋，且經萃取至DCM中(3次)。經組合之有機萃取物用鹽水洗滌且經硫酸鈉乾燥。藉由旋轉蒸發移除溶劑。粗殘餘物溶解於DCM (3 mL)中，經裝載於矽藻土上且藉由矽膠層析法(0%至70%乙酸乙酯/己烷，30分鐘梯度)經純化。彙集純溶離份且濃縮以提供呈白色固體狀之標題化合物。產量525 mg，88%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 782.2。步驟 b.
Figure 02_image1901
三乙胺(0.14 mL，0.97 mmol)添加至炔丙基-peg4-胺(181 mg，0.78 mmol)於1 mL乙腈中之攪拌溶液中。該三乙胺/炔丙基-peg4-胺混合物添加至前一步驟之產物(510 mg，0.65 mmol，於2 mL乙腈)中且經攪拌持續1小時，此時所有起始材料均已經消耗。在旋轉蒸發儀上移除溶劑。粗殘餘物藉由RPLC (20-95%乙腈/水，30 min梯度，無修飾劑)經純化。產量475 mg，83%。藉由LC/MS發現之離子：[M+H]+ = 874.2。步驟 c.
Figure 02_image1903
前一步驟之產物(475 mg，0.54 mmol)在TFA (5 mL)中經攪拌持續2小時且接著濃縮且在旋轉蒸發儀上與甲醇共沸(3次)。藉由LC/MS發現之離子：[M+H]+ = 674.2。殘餘物在含有LiOH (49 mg，1.6 mmol)之1/1甲醇/水混合物中經攪拌持續30分鐘。該反應用冰乙酸中和且接著藉由旋轉蒸發經濃縮。產物藉由半製備型HPLC (0%-75%乙腈/水，0.1% TFA，30分鐘梯度)經純化。彙集純溶離份且凍乾。產量204 mg，59%。藉由LCMS發現之離子：[M+H]+ = 634.2。實例 120 合成 Int-77
Figure 02_image1905
步驟 a.
Figure 02_image1907
HATU (0.44 g，1.16 mmol，於1.5 mL DMF中)逐滴添加至炔丙基-peg4-胺(0.24 g，1.05 mmol)、雙-Boc-D-鳥胺酸(0.35 g，1.05 mmol)及三乙胺(0.59 mL，4.21 mmol)於DMF (2 mL)中之攪拌溶液中。該反應在環境溫度下經攪拌持續1小時，接著直接地藉由RPLC (5%-90%乙腈/水，0.1% TFA，35分鐘梯度)經純化。彙集純溶離份且凍乾以提供呈黏性澄清油狀物之產物。藉由LC/MS發現之離子：[M+H]+ = 546.2
該經Boc保護之中間物在環境溫度下在二噁烷(10 mL)中之4N HCL中經攪拌持續45分鐘。藉由旋轉蒸發移除溶劑，接著所得殘餘物溶解於DI水(20 mL)中，經冷凍，且凍乾以提供呈澄清油狀物之產物。產量310 mg，70%產率，2個步驟。藉由LCMS發現之離子：[M+H]+ = 346.2步驟 b .
Figure 02_image1909
乙腈(2 mL)中之前一步驟之產物(96 mg，0.28 mmol)及三乙胺(0.15 mL，1.11 mmol)添加至紮那米韋之碳酸對硝基苯酯(435 mg，0.56 mmol，描述於實例118中，於6 mL乙腈中)之攪拌溶液中，且在環境溫度下經攪拌持續12小時，接著在80℃下經攪拌持續2小時。移除溶劑且粗殘餘物藉由RPLC (10-95%乙腈/水，無修飾劑，35分鐘梯度)經純化。彙集純溶離份且在旋轉蒸發儀上經濃縮。藉由LC/MS發現之離子：[(M+2H)/2]+ = 815.8
此中間物在TFA (5 mL)中經攪拌持續45分鐘，接著濃縮且在高真空下乾燥。藉由LCMS發現之離子，[(M+2H)/2]+ = 615.8。
此TFA鹽在0℃下在含有LiOH (27 mg，1.11 mmol)之(1/1) MeOH/DI水(5 mL)中經攪拌持續30分鐘。該混合物用冰乙酸酸化(約pH~5)。藉由旋轉蒸發移除甲醇且所得殘餘物藉由半製備型HPLC (5%-70%乙腈/水，0.1% TFA，35分鐘梯度)經純化。彙集純溶離份且凍乾。產量35 mg，11%產率，3個步驟。藉由LC/MS發現之離子：[(M+2H)/2]+ = 575.8。實例 121. 合成 Int-78
Figure 02_image1911
步驟 a.
Figure 02_image1913
炔丙基-Peg4-酸(640 mg，2.46 mmol)、二醇-HCl鹽(350 mg，2.46 mmol)、EDC (471 mg，2.46 mmol)、HOBt (377 mg，2.46 mmol)及三乙胺(249 mg，2.46 mmol)在環境溫度下在DMF (3 mL)中經攪拌持續4小時。該混合物直接地藉由RPLC (0%-80%乙腈/水，無修飾劑，35分鐘梯度)經純化。彙集純溶離份且濃縮以提供呈澄清油狀物之產物。產量580 mg，68%。藉由LCMS發現之離子：[M+H]+ = 348.4。步驟 b.
Figure 02_image1915
氯甲酸對硝基苯酯(1.23 g，1.25 mmol)添加至前一步驟之產物(530 mg，6.10 mmol)及三乙胺(925 mg，9.15 mmol)於DCM (25 mL)中之攪拌溶液中，接著在氮氣氛圍下冷卻至0℃。該混合物在0℃下經攪拌持續15分鐘且接著在室溫下經攪拌持續2小時。該反應用DI水稀釋且經萃取至DCM (3 × 20 mL)中。經組合之有機萃取物用鹽水洗滌且經硫酸鈉乾燥。粗殘餘物藉由矽膠層析法(10%-100%乙酸乙酯/己烷，25分鐘梯度)經純化以提供呈白色固體狀之產物。產量250 mg，24%。藉由LCMS發現之離子：[M+H]+ = 678.2。步驟 c.
Figure 02_image1917
乙腈(2 mL)中之經胺官能化之紮那米韋(505 mg，0.82 mmol，描述於實例118中)及三乙胺(0.15 mL，1.11 mmol)添加至前一步驟之產物(220 mg，0.37 mmol)於乙腈(10 mL)中之攪拌溶液中，且在環境溫度下經攪拌持續4小時。該反應在旋轉蒸發儀上經濃縮。所得殘餘物藉由RPLC (15%-95%乙腈/水，無修飾劑，35分鐘梯度)經純化。彙集純溶離份且在旋轉蒸發儀上經濃縮。藉由LC/MS發現之離子：[(M+2H)/2]+ = 815.2。
此中間物在TFA (5 mL)中經攪拌持續45分鐘，接著濃縮且在高真空下乾燥。藉由LC/MS發現之離子：[(M+2H)/2]+ = 615.2。
所得TFA鹽在0℃下在含有LiOH (71 mg，2.98 mmol)之(1/1) MeOH/DI水(5 mL)中經攪拌持續30分鐘。該混合物用冰乙酸酸化(約pH~5)。甲醇藉由旋轉蒸發儀經移除且藉由半製備型HPLC (5%-70%乙腈/水，0.1% TFA，35分鐘梯度)經純化。彙集純溶離份且凍乾。產量125 mg，29%，3個步驟。藉由LC/MS發現之離子：[(M+2H)/2]+ = 575.8。實例 122. 合成 Int-4a
Figure 02_image1919
步驟 a.
Figure 02_image1921
炔丙基-Peg 4-胺(165 mg，0.71 mmol)添加至紮那米韋之碳酸對硝基苯酯(350 mg，0.47 mmol，描述於實例109中)於乙腈(20 mL)中之攪拌溶液中。該反應在環境溫度下經攪拌持續1小時，接著藉由旋轉蒸發移除溶劑。該殘餘物藉由RPLC (10%-95%乙腈/水，無修飾劑，30分鐘梯度)經純化。彙集純溶離份且凍乾以提供呈白色固體狀之經boc保護中間物。藉由LCMS發現之離子：[M+H]+ = 830.2。
此中間物在環境溫度下在TFA (5 mL)中經攪拌持續30分鐘。藉由旋轉蒸發儀移除溶劑且殘餘物藉由RPLC (10%-95%乙腈/水，0.1% TFA，35分鐘梯度)經純化。彙集純溶離份且凍乾以提供呈白色固體狀之產物。產量155 mg，52%產率，2個步驟。藉由LCMS發現之離子：[M+H]+ = 630.2。步驟 b.
Figure 02_image1923
前一步驟之產物(140 mg，0.22 mmol)在0℃下在含有LiOH (21 mg，0.89 mmol)之1:3 甲醇:水混合物(8 mL)中經攪拌持續20分鐘。該混合物用數滴冰乙酸酸化且在旋轉蒸發儀上濃縮。粗材料藉由半製備型HPLC (5%-95%乙腈/水，0.1% TFA，30分鐘梯度)經純化。彙集純溶離份且凍乾以提供呈白色固體狀之產物。產量60 mg，45%。藉由LCMS發現之離子：[M+H]+ = 590.2。
1 H NMR (500 MHz, 甲醇-d 4 ) δ 5.86 (d,J = 2.6 Hz, 1H), 4.99 (dd,J = 9.0, 2.7 Hz, 1H), 4.55 (dd,J = 9.7, 2.7 Hz, 1H), 4.38 (dd,J = 8.6, 2.6 Hz, 1H), 4.24 – 4.14 (m, 1H), 4.19 (d, J=2.6 Hz, 2H), 4.02-3.98 (m, 1H), 3.74 – 3.59 (m, 13H), 3.54 (t,J = 5.6 Hz, 2H), 3.52-3.48 (m, 1H), 3.29-3.22 (m, 2H), 2.84 (t,J = 2.4 Hz, 1H), 1.96 (s, 3H)。
13 C NMR (126 MHz, MeOD) δ 172.33, 163.68, 157.54, 156.58, 106.80, 79.23, 75.91, 74.56, 70.18, 70.13, 69.96, 69.87, 69.59, 69.51, 69.14, 68.74, 62.98, 57.67, 51.11, 40.54, 21.37。實例 123. 合成 Int-4b
Figure 02_image1925
經Peg官能化之中間物(100 mg，0.13 mmol，描述於實例122中)在環境溫度下在含有LiOH (12 mg，0.52 mmol)之1:3 甲醇:水混合物(5 mL)中經攪拌持續2小時。該混合物用冰乙酸酸化且藉由旋轉蒸發經濃縮。粗材料藉由RPLC (DI水中之5-95%乙腈，0.1% TFA, 30分鐘梯度)經純化。彙集純溶離份且凍乾以提供呈白色固體狀之產物。產量21 mg，31%。藉由LCMS發現之離子：[M+H]+ = 590.2。
1 H NMR (甲醇-d 4 ) δ: 5.86 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 4.48 (dd, J = 8.6, 2.7 Hz, 1H), 4.42 (dd, J = 9.6, 1.4 Hz, 1H), 4.38 (d, J=12 Hz, 1H), 4.22 – 4.19 (m, 1H), 4.19 (d, J =2.4 Hz, 2H), 4.16-4.12 (dd, J = 11.5, 6 Hz, 1H),  4.09 – 4.02 (m, 1H), 3.75 – 3.58 (m, 13H), 3.55 (t, J = 5.5 Hz, 2H), 3.33-3.29 (m, 2H),  2.84 (t, J = 2.4 Hz, 1H), 2.02 (s, 3H)。
13 C NMR (126 MHz, MeOD) δ 172.94, 163.82, 157.90, 157.53, 106.80, 79.23, 76.18, 74.55, 70.19, 70.13, 69.96, 69.90, 69.61, 68.96, 68.74, 68.17, 66.69, 57.67, 50.11, 40.43, 21.33。實例 124. 用於合成疊氮基 Fc 之一般程序
製備DMF/PBS中之PEG4-疊氮基NHS酯溶液(0.050 M)：16.75 mg PEG4-疊氮基NHS酯在0℃下溶解於0.100 mL DMF中且在0℃下藉由添加PBS 1x緩衝液經稀釋至0.837 mL。使用此溶液，藉由調節此PEG4-疊氮基NHS酯PBS溶液之當量數來製備具有多種DAR值之其他PEG4-疊氮基Fc。
預處理h-lgG1 Fc，SEQ ID NO: 48 (107.2 mg於8.800 mL pH 7.4 PBS中，MW~57891 Da，1.852 μmol)：該Fc溶液經轉移至四個離心濃縮機(30,000 MWCO，15 mL)中且用PBS x1緩衝液稀釋至15 mL且經濃縮至約1.5 mL之體積。殘餘物1:10稀釋於PBS pH 7.4中，且再次經濃縮。重複此洗滌程序，共計四次，隨後稀釋至8.80 mL。
製備PEG4-疊氮基Fc：0.050M PEG4-疊氮基NHS酯PBS緩衝溶液(0.593 mL，29.6 μmol，16當量)添加至上述h-IgG1 Fc (SEQ ID NO: 48)溶液中且該混合物在環境溫度下經震盪旋轉持續2小時。該溶液藉由使用四個離心濃縮機(30,000 MWCO，15 mL) 經濃縮至約1.5 mL之體積。粗混合物1:10稀釋於PBS pH 7.4中，且再次經濃縮。重複此洗滌程序，共計三次。經濃縮Fc-PEG4-疊氮化物用pH 7.4 PBS緩衝液稀釋至8.80 mL且準備用於點擊結合。經純化材料使用NANODROP™ UV可見光光譜儀(使用基於h-IgG1之胺基酸序列計算的消光係數)經定量。產率係在純化之後定量的。實例 125. 合成結合物 34
經疊氮基官能化之Fc (40 mg，2.5 mL，0.69 µmol，描述於疊氮基Fc之一般製備中，實例124，SEQ ID No. 18)之溶液添加至含有炔衍生之小分子(6.0 mg，8.23 µmol，Int-67實例118)之15 mL離心管中。在輕柔地攪拌以溶解所有固體之後，向該混合物中添加L-抗壞血酸鈉鹽(54 mg，0.27 mmol)、硫酸銅(II) (0.88 mg，5.5 µmol)及BTTA (9.4 mg，22 µmol)於PBS 7.4緩衝液(1.09 mL)中之溶液。所得混合物輕柔地經旋轉隔夜。其接著相繼藉由在蛋白A管柱上之親和力層析法、尺寸排阻層析法(參見一般結合物純化方案)經純化。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出64,678 Da之平均質量(DAR = 7.2)。產量24 mg，54%產率。實例 126. 合成結合物 35
經疊氮基官能化之Fc (40 mg，2.5 mL，0.69 µmol，描述於疊氮基Fc之一般製備中，實例124，SEQ ID No. 18)之溶液添加至含有炔衍生之小分子(6.1 mg，8.23 µmol，Int-68 實例119)之15 mL離心管中。在輕柔地攪拌以溶解所有固體之後，向該混合物中添加L-抗壞血酸鈉鹽(54 mg，0.27 mmol)、硫酸銅(II) (0.88 mg，5.5 µmol)及BTTA (9.4 mg，22 µmol)於PBS 7.4緩衝液(1.09 mL)中之溶液。所得溶液輕柔地經旋轉隔夜。其接著相繼藉由在蛋白A管柱上之親和力層析法、尺寸排阻層析法(參見一般結合物純化方案)經純化。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出64,830 Da之平均質量(DAR = 7.3)。產量23 mg，52%產率。實例 127. 合成結合物 36
經疊氮基官能化之Fc (50 mg，2.5 mL，0.86 µmol，描述於疊氮基Fc之一般製備中，實例124，SEQ ID No. 18)之溶液添加至含有炔衍生之小分子(7.1 mg，5.2 µmol，Int-77，實例120)之15 mL離心管中。在輕柔地攪拌以溶解所有固體之後，向該混合物中添加L-抗壞血酸鈉鹽(68 mg，0.34 mmol)、硫酸銅(II) (1.1 mg，6.9 µmol)及BTTA (12 mg，27 µmol)於PBS 7.4緩衝液(1.37 mL)中之溶液。所得混合物輕柔地經旋轉隔夜。其接著相繼藉由在蛋白A管柱上之親和力層析法、尺寸排阻層析法(參見一般結合物純化方案)經純化。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出63,300 Da之平均質量(DAR = 3.6)。產量37 mg，73%產率。實例 128. 合成結合物 37
經疊氮基官能化之Fc (70 mg，2.5 mL，1.2 µmol，描述於疊氮基Fc之一般製備中，實例124，SEQ ID No. 18)之溶液添加至含有炔衍生之小分子(13.3 mg，9.6 µmol，Int 78，實例121)之15 mL離心管中。在輕柔地攪拌以溶解所有固體之後，向該混合物中添加L-抗壞血酸鈉鹽(96 mg，0.48 mmol)、硫酸銅(II) (1.6 mg，10 µmol)及BTTA (17 mg，38 µmol)於PBS 7.4緩衝液(1.92 mL)中之溶液。所得混合物輕柔地震盪隔夜。其接著相繼藉由在蛋白A管柱上之親和力層析法、尺寸排阻層析法(參見一般結合物純化方案)經純化。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出63,574 Da之平均質量(DAR = 3.6)。產量42 mg，61%產率。實例 129. 合成結合物 33
製備點擊試劑溶液：PBS緩衝溶液中之0.0050M CuSO4 ：10.0 mg CuSO4 溶解於12.53 mL PBS中，接著採用5.00 mL此CuSO4 溶液且添加43.1 mg BTTAA (CAS# 1334179-85-9)及247.5 mg抗壞血酸鈉以生成點擊試劑溶液(0.0050M CuSO4、0.020M BTTAA及0.25M抗壞血酸鈉)。
向15 mL離心管中之經疊氮基官能化之Fc (104.9 mg，8.60 mL，18.1 µmol；實例124，SEQ ID NO: 64)之溶液中添加炔衍生之小分子(29.7 mg，19.9 μmol，描述於實例100中，Fc上2.5當量各疊氮基)。在輕柔地攪拌以溶解所有固體之後，該混合物用點擊試劑溶液(4.34 mL) (L-抗壞血酸鈉，0.25 M，1086 μmol，硫酸銅(II) 0.0050M，21.7 μmol，及BTTAA 0.020M，86.9 μmol)處理。所得混合物在環境溫度下輕柔地經旋轉持續6小時。其相繼藉由在蛋白A管柱上之親和力層析法、尺寸排阻層析法(參見一般結合物純化方案)經純化。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出64550 Da之平均質量(DAR = 4.6)。產量90.7 mg，具有98%純度。實例 130. 結合物 33 在致死性小鼠模型中針對流感 B/Brisbane/60/2008 之功效
在雌性BALB/c小鼠(Jackson Laboratories，6-8週齡)中針對致死性流感B流感感染評估測試物件。攻擊病毒(B/Brisbane/60/2008)係能夠在小鼠中引起致死性感染之小鼠適應性分離株。該實驗包含10組，每組5只小鼠。在第0天，所有小鼠均在經異氟烷麻醉之後藉由鼻內接種經50 µl體積(每只小鼠大約1E5個病毒)之病毒(3x LD95)攻擊。
所有組均在病毒攻擊後兩小時接受結合物33 (實例129)、媒劑(PBS)或單獨Fc對照物(hIgG1 Fc)之單一IV治療。另一組在病毒攻擊之後8小時開始用奧司他韋(20 mg/kg，bid，持續5天)經口治療。
該研究評估結合物33之7種不同劑量濃度(10、3、1、0.3、0.1、0.03及0.01 mg/kg)。監測小鼠持續2週且超過20%體重損失或被發現垂死之動物經評分為死亡。亦記錄體重以監測該等動物之一般健康狀況。
如所預期，經媒劑或單獨Fc對照物治療之所有小鼠截至第8天均達到死亡。相比之下，接受結合物33之所有小鼠在接受自10降至0.3 mg/kg之單一IV劑量之後在該研究之持續時間內完全經保護(表48)。相比之下，經奧司他韋治療之組僅引起40%生存，儘管此等小鼠在該實驗的過程中所接受之累積劑量為200 mg/kg。結合物33之效能進一步藉由每天體重量測值(表49；僅示出組內之第一例死亡之前的數據)支持。經0.3 mg/kg之結合物33治療的小鼠僅證明一天達到7%最大值之短暫體重損失。總之，此研究證明了結合物33之效能，如藉由指示針對Yamagata譜系之流感菌株的流感B感染之兩個參數(生存及體重)所量測。 表48：%生存
感染後天數 PBS Fc 結合物33 奧司他韋
      (10 mg/kg) (10至0.3 mg/kg) (0.1 mg/kg) (0.03 mg/kg) (0.01 mg/kg)   
0 100 100 100 100 100 100 100
1 100 100 100 100 100 100 100
2 100 100 100 100 100 100 100
3 100 100 100 100 100 100 100
4 60 100 100 100 100 100 100
5 40 40 100 100 60 80 40
6 0 0 100 60 60 40 0
7 0 0 100 60 60 0 0
8 0 0 100 60 60 0 0
9 0 0 100 60 60 0 0
10 0 0 100 60 60 0 0
11 0 0 100 60 60 0 0
12 0 0 100 60 60 0 0
13 0 0 100 60 60 0 0
14 0 0 100 60 60 0 0
表49：體重(gm)
感染後 天數 PBS Fc 結合物33 奧司他韋
      (10 mg/kg) (10 mg/kg) (3 mg/kg) (1 mg/kg) (0.3 mg/kg) (0.1 mg/kg) (0.03 mg/kg) (0.01 mg/kg)   
0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
1 99 101 103 98 98 98 98 99 98 98
2 95 97 100 99 97 101 97 97 97 97
3 87 90 101 98 96 97 93 95 92 89
4 82 84 104 99 99 97 93 93 88 85
5 78 79 102 99 99 97 92    84 79
6       98 96 98 93       79   
7       102 98 100 96            
8       101 98 98 97            
9       104 101 102 101            
10       103 100 101 101            
11       104 102 101 101            
12       104 101 102 102            
13       103 102 102 102            
14       103 102 102 101            
實例 131. 區域異構體之表徵
單體及二聚體中間物可呈特定區域異構體或區域異構體之混合物形式產生。實例100-102顯示如何製備Int-7區域異構體(C7-C7，實例100；C7-C9，實例101；C9-C9，實例102；C7-C7最佳化，實例103)。其中所述之方法可用於分離本文所述之任何中間物的區域異構體之混合物。表50提供先前所述之預結合中間物合成中之C7及C9連接單體及C7-C7、C7-C9及C9-C9連接二聚體之相對百分比(%)量的表徵。 表50：區域異構體分析
Int 實例 單體(M) 或二聚體(D) %C7 %C7-C9 %C9
Int-2 實例6 D 95 5   
Int-3 實例11 D 70 30   
Int-4 實例13 M 58    42
Int-4a 實例122 M       97
Int-7 實例19 D 3 2 95
Int-7a 實例100 D 100      
Int-7b 實例101 D 5 95   
Int-7c 實例102 D       100
Int-25 N/A D    5 95
Int-26 N/A D 25 50 25
Int-27 N/A D 29 35 36
Int-28 N/A D 5 28 67
Int-31 N/A D 90      
Int-34 N/A D 12 6 82
Int-37 N/A M       95
Int-71 實例110 D 3 97   
Int-72 實例112 D    100   
實例 132. 經皮下給予之結合物 33 在致死性小鼠模型中針對流感 A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) 之功效
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8週)中針對致死性IAV H1N1流感感染評估結合物33。攻擊病毒(A/Puerto Rico/8/1934)係能夠在小鼠中引起致死性感染之小鼠適應性分離株。該實驗包含6組，每組5只小鼠。在第0天，所有小鼠均在經氯胺酮/甲苯噻嗪之混合物(分別為150及10 mg/kg)麻醉之後藉由鼻內接種經30 µl體積之病毒(3x LD95 )攻擊。每天記錄死亡率及體重且具有20%體重損失之任何動物均評分為死亡。
測試組在病毒攻擊後2小時接受結合物33、hIgG1 Fc對照物或媒劑(PBS)之單一皮下(SC)治療。研究設計概述於表51中。 表51：針對流感A/PR/8/34 (H1N1)研究之研究設計
組 測試物件 途徑/ 時程 劑量(mg/kg) 劑量體積(ml/kg) 小鼠#
1 媒劑 SC，T+2 h。 na 10 5
2 hIgG1 Fc SC，T+2 h。 1 10 5
3 結合物33 SC，T+2 h。 1 10 5
4 結合物33 SC，T+2 h。 0.3 10 5
5 結合物33 SC，T+2 h。 0.1 10 5
6 結合物33 SC，T+2 h。 0.03 10 5
如所預期，接受媒劑或hIgG1 Fc對照物之小鼠在第6-7天屈服於感染(表52)。然而，經結合物33治療之小鼠在1、0.3及0.1 mg/kg劑量水準下完全經保護。使用結合物33時之死亡率僅在最低劑量濃度0.03 mg/kg下可見。 表52：截至研究日之百分比生存(n=5)
感染後天數 媒劑 hIgG1 Fc 結合物33
      (1.0 mg/kg) (1.0 mg/kg) (0.3 mg/kg) (0.1 mg/kg) (0.03 mg/kg)
0 100 100 100 100 100 100
1 100 100 100 100 100 100
2 100 100 100 100 100 100
3 100 100 100 100 100 100
4 100 100 100 100 100 100
5 100 100 100 100 100 100
6 40 60 100 100 100 100
7 0 0 100 100 100 60
8 0 0 100 100 100 0
9 0 0 100 100 100 0
10 0 0 100 100 100 0
11 0 0 100 100 100 0
12 0 0 100 100 100 0
13 0 0 100 100 100 0
14 0 0 100 100 100 0
結合物33之效能進一步藉由每天體重量測值支持。如所預期，經媒劑或hIgG1 Fc治療之小鼠證明體重平穩下降，直至其超過20%，此時其經評分為死亡(表53)。
與對照小鼠形成對比，接受1、0.3及0.1 mg/kg之結合物33之彼等組在該研究中維持健康體重且僅證明少於8%之短暫體重下降(0.1 mk/kg劑量組，第8天；表53)。結合物33之生存及體重量測值均證明使用低達0.1 mg/kg之單一SC劑量時的穩固保護以抵禦流感A/Puerto Rico/8/1934之致死性攻擊。 表53：體重數據(gm)
感染後天數 媒劑 hIgG1 Fc 結合物33
      (1.0 mg/kg) (1.0 mg/kg) (0.3 mg/kg) (0.1 mg/kg) (0.03 mg/kg)  
0 100 100 100 100 100 100  
1 98.1 97.6 98 98.6 98.7 98.5  
2 100.9 99 100.3 101.3 101.6 99.9  
3 94.1 92.6 98.4 100.5 96.5 93.9  
4 86 85.7 102.6 99.2 93.5 88.6  
5 79.8 79.1 98.2 97.7 94.9 86.5  
6 75.3 75.2 102.2 102.3 99.4 84.6  
7       103.5 102.9 95.2 78.4  
8       101.8 103.2 92.4     
9       101.2 102.9 95.4     
10       101.3 102.5 98.8     
11       102.8 102.6 98.7     
12       102.4 100.7 98.6     
13       102.2 101.1 98.3     
14       100.2 102 99.6     
實例 133. 結合物 33 針對 A/PR/8/1934 (H1N1) 之功效、肺 PFU 負荷及細胞因子水準
在鼻內經3E2 PFU/小鼠(3x LD95 )之小鼠適應性流感A/PR /8/1934 (H1N1)攻擊之6-8週雌性BALB/c小鼠(Charles River)中進行結合物33之功效研究。結合物33或人類IgG1 Fc對照物在攻擊後2 h以0.1 – 3 mg/kg之單一皮下(SC)劑量經投與。奧司他韋經口給藥，每天兩次，持續4天，在感染後2 h以5或50 mg/kg開始。巴洛沙韋再懸浮於0.5%甲基纖維素中且經口給藥，每天兩次，持續4天，在感染後2 h以30 mg/kg開始(表54)。記錄體重(BW)持續4天(圖圖62A-62B。在感染後4天，藉由CO2 處死小鼠且收集肺葉。肺使用MagNA Lyser (Roche)用1 mL PBS中之1 mm矽石珠粒均質化。在6,000 rpm下進行均質化持續60 s且在運行之間在冰上冷凍持續5 min。在肺均質化之後，管在600 x g下經離心持續10 min且上清液經轉移至新管中。 表54：研究設計
測試物件(DAR) 途徑/時程 劑量[mg/kg]
        
hIgG1 Fc IV，T+2 h 3
奧司他韋 PO，BID × 4 5
奧司他韋 PO，BID × 4 50
巴洛沙韋 SC，BID × 4 30
結合物33 (4.7) SC，T+2 h 0.1
結合物33 (4.7) SC，T+2 h 0.3
結合物33 (4.7) SC，T+2 h 1
結合物33 (4.7) SC，T+2 h 3
未受感染 N/A N/A
關於PFU測定，肺均質液之上清液在感染緩衝液中經稀釋，介於10-1 至10-6 範圍內。100 μL病毒稀釋液添加至24孔板中之MDCK細胞之匯合單層中且在室溫下經培育持續1 h，其中每15 min搖動。在移除病毒之後，含有Avicel之液體覆蓋培養基添加至MDCK細胞中。細胞在37℃、5% CO2 下經培育持續40 h。在培育之後，移除培養基且細胞用結晶紫染色以對斑塊計數且相對於肺重量計算斑塊形成單元(PFU) (PFU/g肺)。
關於細胞因子分析，肺均質液之上清液連續2倍稀釋於96孔板中。INF-γ、TNF-α、IL-6、MIP-1α及MCP-1之細胞因子水準藉由ELISA根據製造商之說明書(R&D Systems)測定。在小鼠模型中用流感進行致死性攻擊之後，在感染後第4天測定肺PFU負荷(圖63A-63B)及肺細胞因子水準(分別地，表55及表56)。結合物33證明了病毒負荷之劑量依賴性log減少，在0.1 mg/kg下為0.7，在0.3 mg/kg下為1.88，在1 mg/kg下為3且在3 mg/kg下為3.8。5 mg/kg及50 mg/kg之奧司他韋對病毒負荷具有適度影響，分別導致0.86及2 log減少。巴洛沙韋減少病毒負荷至低於偵測極限1e2 PFU/mL，由此如與PBS對照物相比減少病毒負荷達＞ 5.99 log。
如所預期，在陰性對照物PBS與hIgG1 Fc之間未觀察到生物相關差異。
結合物33在小鼠模型中在經流感A攻擊之感染後第4天以劑量依賴性方式減少病毒負荷(表55，圖64A-64B)。同樣，結合物33在小鼠模型中在經流感A攻擊之感染後第4天證明與未受感染對照物相比，TNF-α、IL-6、INF-γ、MCP-1及MIP-1α (分別地，圖65A-65E)之細胞因子水準的劑量依賴性倍數減少(表56)。 表55：PFU負荷
測試物件[mg/kg] PFU/g Log 減少
PBS [0]PBS 3.26E+07 0.0
hIgG1 Fc [3] 1.74E+07 0.364
奧司他韋[5] 4.78E+06 0.86
奧司他韋[50] 3.81E+05 2
巴洛沙韋[30] ＜1.00E+02* ＞5.99*
AVC-076-5B [0.1] 6.85E+06 0.715
AVC-076-5B [0.3] 5.31E+05 1.88
AVC-076-5B [1] 3.69E+04 2.99
AVC-076-5B [3] 5.84E+03 3.77
* 巴洛沙韋減少病毒負荷至低於偵測極限。 表56：肺細胞因子水準
測試物件[mg/kg] INF- γ TNF- α IL-6 MCP-1 MIP-1 α
PBS [0] 1.6 1.4 4.2 38.6 18.1
hIgG1 Fc [3] 1.7 1.2 3.3 36.3 15.9
奧司他韋[5] 1.0 0.8 1.8 24.0 6.3
奧司他韋[50] 0.8 0.8 1.4 16.2 4.0
巴洛沙韋[30] 1.2 1.0 1.0 1.0 0.8
結合物33 [0.1] 1.1 0.7 0.8 19.1 5.6
結合物33 [0.3] 1.1 0.9 0.8 9.6 3.9
結合物33 [1] 0.9 0.7 1.1 5.7 1.7
結合物33 [3] 0.8 0.7 1.1 1.8 1.0
未受感染 1 1 1 1 1
結合物33之最高測試濃度3 mg/kg證明了在感染過程中無重量損失，與未受感染對照小鼠相似(表57)。 表57：體重數據(%減少)
測試物件[mg/kg] 第0 天 第1 天 第2 天 第3 天 第4 天
PBS [0] 0 -3.5 -2.86 -10.96 -17.32
hIgG1 Fc [3] 0 -2.6 -1.3 -9.58 -15.6
奧司他韋[5] 0 -2.86 -2.42 -8.16 -13.88
奧司他韋[50] 0 -3.78 -2.12 -3.22 -5.74
巴洛沙韋[30] 0 -2.38 -2.82 -2.6 -0.18
結合物33 [0.1] 0 -3.24 -2.32 -10.12 -11.46
結合物33 [0.3] 0 -2.16 1.34 -3.4 -4.36
結合物33 [1] 0 -1.5 -0.9 -1.98 -0.9
結合物33 [3] 0 -1.7 -1.6 -1.9 0.52
未受感染 0 1.02 -0.14 -0.16 2.8
實例 134. 結合物 33 在致死性嚴重複合型免疫缺乏 (SCID) 小鼠模型中針對流感 A (H1N1) 之功效
在雌性BALB/c scid小鼠(Jackson Laboratories，6-8週齡)中針對致死性流感A流感感染評估測試物件。攻擊病毒(A/Puerto Rico/8/1934)係能夠在小鼠中引起致死性感染之小鼠適應性分離株。該實驗包含11組，每組5只小鼠。在第0天，所有小鼠均在經氯胺酮/甲苯噻嗪之混合物(分別為150及10 mg/kg)麻醉之後藉由鼻內接種經30 µl (大約每只小鼠1E3個病毒)體積之病毒(3x LD95)攻擊。
各組在病毒攻擊後兩小時接受媒劑(PBS)、hIgG1 Fc對照物或結合物33 (3、1、0.3、0.1、0.03 mg/kg)之單一SC治療。該研究之一個獨立研究組由3組經巴洛沙韋酯(baloxavir marboxil) (DC Chemicals, Shanghai, China)經口治療之小鼠組成，每天兩次，持續1天；亦在病毒攻擊後2小時開始。監測小鼠持續2週且超過20%體重損失或被發現垂死之動物經評分為死亡。
在研究結束時(第14天)，接受結合物33之小鼠在3與0.1 mg/kg之間的所有劑量濃度下均完全經保護(表58)。結合物33僅在最低測試濃度0.03 mg/kg下無法提供保護以抵禦致死性病毒攻擊。如所預期，接受媒劑或hIgG1 Fc之組未受到保護。經巴洛沙韋治療之小鼠亦受到保護，但在60及20 mg/kg之顯著較高累積劑量下，在6 mg/kg之總劑量下，僅40%小鼠生存至第14天。 表58：第14天之%生存。
媒劑 hIgG1 Fc 巴洛沙韋 結合物33
(PBS) (3.0 mg/kg) (30 mg/kg) (10 mg/kg) (3.0 mg/kg) (3.0 mg/kg) (1.0 mg/kg) (0.3 mg/kg) (0.1 mg/kg) (0.03 mg/kg)
0 0 100 100 40 100 100 100 100 0
結合物33在此嚴重免疫缺乏模型中之效能基於體重亦為顯而易見的(表59)。基於死亡率讀出提供完全保護之結合物最低濃度為0.1 mg/kg。在此劑量水準下，該組之最大平均重量損失為短暫的，且導致少於5%減少(發生於第2天)。此外，與未受感染小鼠相比，在1及3 mg/kg劑量水準下之組的體重差異在第14天顯示少於2%差異。
總之，此數據藉由用低達0.1 mg/kg之結合物之單一SC劑量保護經致死性攻擊之小鼠證明了結合物33之效能。此在完全缺乏清除流感感染所必需的T及B免疫細胞之小鼠的嚴重免疫缺乏模型中實現。此數據支持使用結合物33來治療免疫缺乏患者群體。 表59：截止日之%平均體重。(mg/kg)。僅示出組內之第一例死亡之前的數據。
Figure 02_image1927
實例 135. 經皮下給予之結合物 33 在致死性小鼠模型中針對流感 A/California/07/2009 (H1N1)pdm 之功效
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8週)中針對致死性IAV H1N1流感感染評估結合物33。攻擊病毒(A/California/07/2009 (H1N1)pdm)係能夠在小鼠中引起致死性感染之大流行分離株。該實驗包含6組，每組5只小鼠。在第0天，所有小鼠均在經氯胺酮/甲苯噻嗪之混合物(分別為150及10 mg/kg)麻醉之後藉由鼻內接種經30 µl體積之病毒(3x LD95)攻擊。每天記錄死亡率及體重且具有20%體重損失之任何動物均評分為死亡。
測試組在病毒攻擊後2小時接受結合物33、hIgG1 Fc對照物或媒劑(PBS)之單一皮下(SC)治療。研究設計及劑量水準概述於表60中。 表60：針對流感A/California/07/2009 (H1N1)pdm研究之研究設計
組 測試物件 途徑/ 時程 劑量(mg/kg) 劑量體積(ml/kg) 小鼠#
1 媒劑 SC，T+2 h。 na 10 5
2 hIgG1 Fc SC，T+2 h。 1 10 5
3 結合物33 SC，T+2 h。 1 10 5
4 結合物33 SC，T+2 h。 0.3 10 5
5 結合物33 SC，T+2 h。 0.1 10 5
6 結合物33 SC，T+2 h。 0.03 10 5
如所預期，接受媒劑或hIgG1 Fc對照物之小鼠在第6-7天屈服於感染(表61)。然而，經結合物33治療之小鼠在1 mg/kg下完全經保護，且在0.3下幾乎如此(80%生存)。使用結合物33時之顯著死亡率僅在較低劑量濃度0.1及0.03 mg/kg下可見。 表61：截止日之百分比生存。(mg/kg)
天 媒劑 hIgG1 Fc 結合物33
      (1.0 mg/kg) (1.0 mg/kg) (0.3 mg/kg) (0.1 mg/kg) (0.03 mg/kg)
0 100 100 100 100 100 100
1 100 100 100 100 100 100
2 100 100 100 100 100 100
3 100 100 100 100 100 100
4 100 100 100 100 100 100
5 40 20 100 100 60 80
6 0 20 100 80 20 20
7 0 0 100 80 0 0
8 0 0 100 80 0 0
9 0 0 100 80 0 0
10 0 0 100 80 0 0
11 0 0 100 80 0 0
12 0 0 100 80 0 0
13 0 0 100 80 0 0
14 0 0 100 80 0 0
結合物33之效能進一步藉由每天體重量測值支持。如所預期，經媒劑或hIgG1 Fc治療之小鼠證明體重平穩下降，直至其超過20%，此時其經評分為死亡(表62)。
與對照小鼠形成對比，接受1 mg/kg之結合物33之小鼠僅證明大約10%之短暫體重下降，在第3天達到峰值(表62)。結合物33之生存及體重量測值均證明使用經SC投與之單一1 mg/kg劑量時的穩固保護以抵禦流感A/California/07/2009 (H1N1)pdm之致死性攻擊。針對此研究中所用之臨床相關大流行菌株之活性支持結合物33在治療嚴重流感感染時的效用。 表62：截止日之%平均體重。(mg/kg)。僅示出組內之第一例死亡之前的數據。
感染後天數 媒劑 hIgG1 Fc 結合物33
      (1.0 mg/kg) (1.0 mg/kg) (0.3 mg/kg) (0.1 mg/kg) (0.03 mg/kg)
0 100 100 100 100 100 100
1 99.5 97.9 96.8 96.7 98 98.7
2 97.1 97.2 99.5 99.2 98 98.4
3 86.5 86.0 89.7 89.6 87.6 88.8
4 80.3 80.3 91.6 88.5 81.3 81.9
5 76.2 76.6 92.9 91.0 76.8 77.9
6       94.7 90.5      
7       94.2         
8       95.4         
9       98.0         
10       96.8         
11       98.8         
12       97.7         
13       100.1         
14       100.5         
實例 136. 經靜脈內 (IV) 給予之結合物 33 在延遲治療之致死性小鼠模型中針對流感 A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1) 之功效。
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8週)中針對致死性流感A (H1N1)感染評估結合物33。攻擊病毒(A/Puerto Rico/8/1934)係能夠在小鼠中引起致死性感染之小鼠適應性分離株。在第0天，所有小鼠均在經氯胺酮/甲苯噻嗪之混合物(分別為150及10 mg/kg)麻醉之後藉由鼻內接種經30 µl體積之病毒(3x LD95)攻擊。每天記錄死亡率及體重且具有20%體重損失之任何動物均評分為死亡。
研究設計詳述於表63中，且由多個研究組組成。對照研究組包含媒劑(PBS)及單獨hIgG1 Fc組，在病毒攻擊之後24小時給藥(未受感染組亦為此研究組之一部分)。第二研究組由以其人類化劑量之4倍給予之奧司他韋組成，其中治療之起始經延遲持續24、48或72小時。最後3個研究組由以10、3或1 mg/kg之單一IV劑量投與之結合物33組成；各研究組以與上述奧司他韋研究組相同的時程給藥。
如所預期，媒劑及hIgG1 Fc當在病毒攻擊之後24小時給予時不具保護性且截至第7天導致完全死亡。確定的是，當給藥經延遲24小時時，即使人類化劑量之4倍的奧司他韋(200 mg/kg累積劑量)亦僅為部分有效的(表64；40%生存)。然而，結合物33在相同24小時給藥時程時在所有濃度(10、3及1 mg/kg)下均為完全保護性的。
當給藥經延遲達病毒攻擊之後完整48小時時，奧司他韋不再有效(0%生存)，而結合物33在10及3 mg/kg下為80%保護性的。當給藥經延遲直至72小時時，僅10 mg/kg劑量之結合物33證明部分保護作用(40%)。結合物33之功效基於每天體重量測值亦為顯而易見的(表65)。這在T+24小時組中尤其顯著，其中針對任何結合物33組均觀察到少於3%減少，其為短暫的且發生於第1天。在此研究中，結合物33比用於流感之獲批治療奧司他韋更有效。 表63：研究設計
組 流感A 菌株 測試物件 途徑，時程 第一劑量( 小時) 劑量(mg/kg) 劑量體積(ml/kg) N (balb/c)
1 A/PR/8/34 (H1N1) 3E2 PFU/小鼠 PBS IV，單一 T+24 --- 5 5
2 hIgG1 Fc IV，單一 T+24 10 5 5
3 奧司他韋 PO，bid × 5天 T+24 20 10 5
4 T+48
5 T+72
6 AVC-076 IV，單一 T+24 10 5 5
7 T+48
8 T+72
9 AVC-076 IV，單一 T+24 3 5 5
10 T+48
11 T+72
12 AVC-076 IV，單一 T+24 1 5 5
13 T+48
14 T+72
15 未受感染BW對照物
表64：截止日之%生存。測試物件/劑量/治療起始時間
Figure 02_image1929
表65：體重數據(gm)。mpk = mg/kg。僅示出組內之第一例死亡之前的數據。測試物件/劑量/治療起始時間
Figure 02_image1931
實例 137. 合成結合物 38 (Int-73) 、結合物 39 (Int-74) 、結合物 40 (Int-75) 及結合物 41 (Int-76)
向15-ml無菌離心管中饋入抗壞血酸鈉(68.3 mg，0.345 mmol)、BTTAA (11.9 mg，0.0276 mmol)、實例114之產物(Int-73)、實例115之產物(Int-74)、實例116之產物(Int-75)或實例117之產物(Int-76) (0.00953 mmol)及PBS 7.4 (1 ml)。該等試劑經渦旋直至均質，接著相繼與疊氮基Fc (50 mg，0.0008624 mmol，描述於實例124中，SEQ ID NO: 64)、CuSO4 (1.1 mg，0.0069 mmol)於水(0.5 ml)中之溶液混合。該混合物經旋轉持續12小時，接著相繼藉由蛋白A管柱上之親和力層析法、尺寸排阻層析法經純化。結合物藉由Maldi TOF分析經表徵(典型地，DAR = 4.5)。產率典型地為50%。實例 138. 合成 Int-79
Figure 02_image1933
步驟 a.
Figure 02_image1935
紮那米韋-醚-酸(0.90 g，1.43 mmol，實例31)及N-甲基嗎啉(0.23 mL，2.14 mmol)溶解於THF (35 mL)中且在氮氣氛圍下冷卻至0℃(冰水浴)。經5分鐘時期藉助於注射器逐滴添加氯甲酸異丁酯(0.24 mL，1.85 mmol，於2 mL DCM中)。該混合物在0℃下經攪拌持續30分鐘，接著在環境溫度下經攪拌持續15 min，且接著冷卻至0℃。經5分鐘逐滴添加硼氫化鈉(540 mg，14.3 mmol，溶解於5 mL甲醇中)。該反應經攪拌持續15分鐘，此時所有起始材料均已經消耗(藉由LC/MS)。添加數滴(約1 mL)冰乙酸以酸化該混合物(pH~5)。用乙酸乙酯及水稀釋且經萃取至乙酸乙酯中(3次)。有機層用鹽水洗滌，且有機萃取物經硫酸鈉乾燥，且在旋轉蒸發儀上經濃縮。粗材料藉由矽膠層析法(首先裝載於矽藻土上) (DCM中之0-10%甲醇，30 min)經純化。產量0.66 g，75%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 617.2。步驟 b.
Figure 02_image1937
向醇(0.66, 1.1 mol，於20 mL CH2 Cl2 中)之攪拌混合物中添加三乙胺(0.30 mL，1.3 mmol)。該混合物在1大氣壓之氮氣下冷卻至0℃(冰水浴)且經5分鐘藉助於注射器逐滴添加甲磺醯氯(150 mg，1.3 mmol)。移除冰浴且該反應經攪拌持續45分鐘。該混合物用飽和碳酸氫鈉水溶液稀釋，經萃取至DCM中(3次)。經組合之有機萃取物用鹽水洗滌，經硫酸鈉乾燥且在旋轉蒸發儀上經濃縮。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 695.2。該中間物無需純化即用於下一步驟。
該紮那米韋甲磺酸鹽在80℃下在DMF中與3 eq疊氮化鈉一起經攪拌持續5小時。該混合物用水稀釋，經萃取至DCM中(3次)。經組合之有機萃取物用鹽水洗滌，經硫酸鈉乾燥且濃縮。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 695.2。該疊氮化物無需純化即用於下一步驟。
該紮那米韋疊氮化物(670 mg，1.04 mmol)在1個大氣壓之氫氣下在Lindlar催化劑(300 mg)存在下在甲醇(20 mL)中經攪拌持續12小時。該混合物經矽藻土過濾且濃縮以提供呈澄清油狀物之標題化合物。該胺無需純化即用於下一步驟。產量0.37 g，54%產率，3個步驟。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 616.2。步驟 c.
Figure 02_image1939
3-(苯甲基胺基)丙酸甲酯(1 g，5.2 mmol)、4-溴丁酸甲酯(1.2 g，6.2 mmol)及二異丙基乙胺(1.34 mL，7.8 mmol)在65℃下在DMF (5 mL)中經攪拌持續4小時。藉由旋轉蒸發儀移除大部分溶劑且粗材料藉由矽膠層析法(Isco，DCM中之0至9%甲醇，30分鐘梯度)經純化以提供呈澄清油狀物之經苯甲基保護中間物。該經苯甲基保護中間物在1個大氣壓之氫氣下在20%氫氧化鈀/碳(300 mg)存在下在甲醇(20 mL)中經攪拌持續12小時。該混合物經矽藻土過濾且濃縮以提供呈澄清油狀物之標題化合物。產量0.72 g，69%。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 204.2。步驟 d.
Figure 02_image1941
DMF (2 mL)中之步驟-c產物(0.70 g，2.16 mmol)、炔丙基PEG-4酸(0.63 mg，2.38 mmol) HATU (1.26 g，3.24 mmol)在室溫下經攪拌，隨後添加DIEA (1.15 mL，6.49 mmol)。該反應混合物經攪拌持續2小時，接著藉由逆相液體層析法(Isco，5至50%乙腈及水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量840 mg，87%。藉由LCMS發現之離子，[M+H]+ = 446.2。步驟 e.
Figure 02_image1943
步驟-d產物(840 mg，1.85 mmol)及LiOH (113.1 mg，4.72 mmol)於H2 O:MeOH (1:2，9 mL)中之溶液在室溫下經攪拌持續2小時。接著，該溶液用TFA酸化。所得溶液經濃縮，接著藉由逆相液體層析法(Isco，0%至20%乙腈及水)經純化。產量454.5 mg，59%。藉由LCMS發現之離子，[M+H]+ = 418.2。步驟 f.
Figure 02_image1945
在室溫下向步驟-b產物(334.7 mg，0.52 mmol)、步驟-e產物(102 mg，0.24 mmol)及HATU (273.25 mg，0.704 mmol)於無水DMF (3 mL)中之溶液中添加DIEA (217 mg，16.4 mmol)。所得混合物經攪拌持續1小時，接著藉由RPLC (20%至100%甲醇及水，不具有修飾劑)經純化。產量206.5 mg，55%。藉由LCMS發現之離子，[(M+2H)/2]+ = 806.8。步驟 g.
Figure 02_image1947
CH2 Cl2 (5 mL)中之步驟-f產物(206.5 mg，0.128 mmol)及TFA (3 mL)在室溫下經攪拌隔夜，接著在減壓下濃縮。所得殘餘物藉由半製備型HPLC (0%至30%乙腈/水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量144.5 mg，69%。藉由LCMS發現之離子，[(M+2H)/2]+ = 606.8。步驟 h.
Figure 02_image1948
向步驟-g產物(144.5 mg，0.119 mmol)於MeOH (9 mL)及水(3 mL)中之溶液中添加LiOH (18 mg，0.75 mmol)。所得溶液在室溫下經攪拌持續1小時，接著用TFA酸化且在減壓下濃縮。殘餘物藉由半製備型HPLC (0%至25%乙腈/水，使用0.1% TFA作為修飾劑)經純化。產量45 mg，28%。藉由LCMS發現之離子，[(M+2H)/2]+ = 566.8。實例 139. 合成結合物 42
經疊氮基官能化之Fc (50 mg，5.4 mL，0.859 µmol，實例124，SEQ ID NO: 18)之溶液添加至含有炔衍生之小分子(7.87 mg，0.057 mmol，實例138)之10 mL離心管中。在輕柔地震盪以溶解所有固體之後，該混合物添加至3 mL L-抗壞血酸鈉(0.68 mg，0.34 mmol，0.25 M)、硫酸銅(II) (1.1 mg，0.0069 mmol，0.005 M)及BTTAA (11.8 mg，0.027 mmol，0.02 M)於PBS 7.4緩衝液中之預混合溶液中。所得溶液輕柔地經旋轉隔夜。其相繼藉由在蛋白A管柱上之親和力層析法、尺寸排阻層析法(參見一般結合物純化方案)經純化。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出63623 Da之平均質量(DAR 3.8)。產量36.01 mg，72%。實例 140. 合成 Int-80
Figure 02_image1949
步驟 a.
Figure 02_image1951
向紮那米韋之碳酸對硝基苯酯(0.3 g，0.4 mmol，實例103)於無水二氯甲烷(5 ml)中之溶液中添加無水DMF (5 ml)中之炔丙基-PEG4-甲胺(0.11 g，0.44 mmol)及DIPEA (0.14 mL，1.0 mmol)。該反應在室溫下經攪拌隔夜，接著濃縮且藉由用0 %至10%甲醇/二氯甲烷溶離之急驟層析法經純化。產量0.28 g，81%。藉由LCMS發現之離子：(M + H)+ = 858.4, (M - Boc)+H+ = 758.4。步驟 b.
Figure 02_image1953
前一步驟之產物(280 mg，0.2 mmol)溶解於2 ml MeOH及2 ml THF中，接著用氫氧化鋰(24 mg，1 mmol)溶解於2 ml水中之溶液處理。該反應在室溫下經攪拌持續10 min，此時HPLC顯示反應完成。反應之pH藉由使用Amberlite IRN-77離子交換樹脂經調節至5至6之值，接著過濾以移除該樹脂。粗濾液在真空下蒸發至乾且無需純化即用於下一步驟，且產率為定量的。藉由LCMS發現之離子：(M + H)+ = 844.4, (M - Boc + H)+ = 744.4。步驟 c.
Figure 02_image1955
步驟-b產物溶解於2 ml二氯甲烷及2 ml TFA中，且在室溫下經攪拌。藉由LCMS監測反應之進展。在反應完成之後(6 h)，該溶液經汽提至乾且接著溶解於2 ml水及2 ml乙腈中。所得溶液在室溫下再攪拌持續2小時，此時LCMS顯示丙酮化合物保護基之完全保護基脫除。此混合物經濃縮且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以5%至40%乙腈/水溶離之Isco CombiFlash液體層析儀使用0.1% TFA作為修飾劑經純化。產量180 mg，78.0 %。藉由LCMS發現之離子：(M + H)+ = 604.2。實例 141. 與 Int-4 相比關於 Int-80 之穩定性數據
Int-80 (實例140)及Int-4 (實例13)以10 mg/mL溶解於去離子水中且接著1:10稀釋於1X PBS中至1 mg/mL之最終濃度。樣品在37℃或60℃下經培育持續1週。25 uL等分試樣經稀釋於75 uL水中以用於HPLC分析。使用具有Phenomenex Biozen PS-C18管柱(150×2.1 mm，1.6 um)之Waters Acquity H-Class UPLC，如下運行水中之0.1%甲酸至乙腈中之0.1%甲酸的梯度：5% B持續0-1 min，1-20 min 5-20% B。使用二極體陣列偵測器在240 nm下進行偵測。Int-80在60℃下歷經1週具有少於1%降解，而Int-4在相同時期內顯示15%降解(圖66)實例 142. 合成結合物 43
製備點擊試劑溶液：PBS x1緩衝溶液中之0.0050M CuSO4：10.0 mg CuSO4溶解於12.53 mL PBS x1中，接著採用10.00 mL此CuSO4溶液且添加86.1 mg BTTAA及495.3 mg抗壞血酸鈉以生成點擊試劑溶液(0.0050M CuSO4、0.020M BTTAA及0.25M抗壞血酸鈉)。
經疊氮基官能化之Fc (78.0 mg，4.535 mL，1.35 µmol，實例124，SEQ ID NO: 64)之溶液添加至含有炔衍生之小分子(13.2 mg，8.88 umol，Int-80, 實例140)之15 mL離心管中。在輕柔地震盪以溶解所有固體之後，向該混合物中添加2.153 mL上述點擊試劑溶液(L-抗壞血酸鈉，0.25 M, 106.6 mg，0.538 mmol，硫酸銅(II) 0.0050M，1.72 mg，0.0107 mmol，及BTTAA 0.020M，18.5 mg，0.0431 mmol)。所得混合物在環境溫度下輕柔地經旋轉持續6小時。其相繼藉由在蛋白A管柱上之親和力層析法、尺寸排阻層析法(參見結合物純化方案)經純化。經純化最終產物之Maldi TOF分析給出64,012 Da之平均質量(DAR = 7.0)。產量50.3 mg，62%產率。實例 143. 合成 Int-81
Figure 02_image1957
步驟 a.
Figure 02_image1959
經15分鐘向用冰水浴冷卻之N-Boc-N-Me-甘油醇(3.5 g，20 mmol)於DMSO (20 mL)中之充分攪拌溶液中相繼添加烯丙基溴(3.6 g，30.0 mmol)、經精細研磨KOH粉末(3.5 g，30.0 mmol)。所得溶液在室溫下經攪拌隔夜。所得混合物分配於5% HOAc水溶液(50 mL)與乙酸乙酯(200 ml)之間。分離有機層，用鹽水洗滌，經硫酸鈉乾燥，過濾，且濃縮，接著藉由用10%至80%乙酸乙酯/己烷溶離之急驟層析法經純化。產物之產量4.1 g，95%。藉由LCMS發現之離子：M+H =216.3。步驟 b.
Figure 02_image1961
臭氧在-78℃下鼓泡通過來自步驟a之化合物(8.0 g，37 mmol)於MeOH (50 mL)及DCM (50 ml)中之溶液，直至出現淡藍色。未反應之臭氧藉由用氧氣鼓泡持續10分鐘經移除，接著經10分鐘分成小份添加NaBH4 (1.6 g，40 mmol)。在所有NaBH4 經添加之後，該混合物逐漸地加溫至室溫。所得溶液分配於乙酸乙酯(100 ml)與鹽水(50 ml)之間。分離有機層，用鹽水洗滌，經硫酸鈉乾燥，過濾，濃縮為油狀物，且接著藉由用10%至80%乙酸乙酯/二氯甲烷溶離之急驟層析法經純化。產物之產量5.0 g，62%。藉由LCMS發現之離子：M+H =220.2。步驟 c.
Figure 02_image1963
在0℃下經15分鐘緩慢地向前一步驟之產物(4.4 g，20 mmol)及CBr4 (10.0 g，30.0 mmol)於DCM (50 mL)中之溶液中添加PPh3 (8.0 g，30 mmol)(放熱)。在添加過程中，內部溫度保持低於30℃。在添加PPh3 之後，該反應在室溫下經攪拌隔夜。粗反應物經濃縮為油狀物，接著藉由正相層析法用10%乙酸乙酯/己烷至80%乙酸乙酯/己烷溶離經純化。收集管內部含有油小液滴之溶離份經組合且濃縮為無色油狀物。4.0 g，70.5%。藉由LCMS發現之離子：M+H =282.1。步驟 d.
Figure 02_image1965
步驟c產物(4 g，14 mmol)、苯甲胺(0.60 g，5.7 mmol)及K2 CO3 (2.35 g，17 mmol)於DMF (20 mL)中之溶液在75℃油浴中加熱持續8 h。過濾該混合物，濃縮，且藉由RPLC (5% ACN/水至100% ACN)經純化。產量2.1 g，72.7 %。步驟 e.
Figure 02_image1967
向步驟-d產物(1.3 g，2.0 mmol)溶解於CHCl3 /EtOH (1:20，20 mL)中之溶液中添加20% Pd(OH)2 /C (0.50 g)。該反應在環境溫度下在來自氣球之氫氣下經攪拌隔夜。該反應混合物經矽藻土墊過濾，接著藉助於旋轉蒸發儀經濃縮且無需進一步純化繼續用於後續步驟。步驟 f.
Figure 02_image1969
步驟-e產物溶解於10 mL DMF中，接著在室溫下用炔丙基PEG4酸(0.52 g，2.0 mmol)、EDCI (0.6 g，3.0 mmol)、HOAt (0.45 g，3 mol)及胡尼西氏鹼(0.7 mL，5.0 mmol)處理。該反應混合物經過濾持續四小時，接著濃縮且藉由RPLC (10% ACN/水至60% ACN/水)經純化。經兩個步驟，產量0.43 g，65%。藉由LCMS發現之離子：[M – Boc + H]+ = 562.4, [M + H]+ = 662.4。步驟 g.
Figure 02_image1971
步驟-d產物(70 mg，0.1 mmol)在室溫下用TFA (2 mL)處理持續2小時。TFA藉由旋轉蒸發經移除，且剩餘油狀物進一步在高真空下乾燥持續12 h以生成呈雙-TFA鹽形式之所需產物。產率為定量的。藉由LCMS發現之離子：[M + H]+ = 462.4。步驟 h.
Figure 02_image1973
向描述於實例109中之碳酸硝基苯酯(0.72 g. 0.95 mmol)於無水DMF (5 ml)中之溶液中添加步驟g二胺(0.3 g，0.43 mmol，經30分鐘分成數份添加)及DIPEA (0.28 mL，2 mmol)於無水DMF (20 ml)中之混合物。該反應在室溫下經攪拌隔夜，接著濃縮且藉由用0 %至10%甲醇/二氯甲烷溶離之急驟層析法經純化。產量0.63 g，86%。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 844.4, [(M - Boc + 2H)/2]+ = 794.4, [(M - 2Boc + 2H)/2]+ = 744.4。步驟 i.
Figure 02_image1975
前一步驟之產物(600 mg，0.35 mmol)溶解於5 ml MeOH及5 ml THF中，接著用氫氧化鋰(48 mg，2 mmol)溶解於2 ml水中之溶液處理。該反應在室溫下經攪拌持續10 min，此時HPLC顯示反應完成。該反應溶液之pH藉由使用Amberlite IRN-77離子交換樹脂經調節至5至6之值，接著過濾以移除該樹脂。粗產物藉由旋轉蒸發經蒸發至乾且無需純化即用於下一步驟。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 829.9, [(M - Boc + 2H)/2]+ = 779.4, [(M - 2Boc + 2H)/2]+ = 729.4。步驟 j.
Figure 02_image1977
步驟-i產物溶解於5 ml二氯甲烷及5 ml TFA中，且在室溫下經攪拌。藉由LCMS監測反應之進展。在反應完成之後(6 h)，該溶液經汽提至乾且接著溶解於4 ml水及4 ml甲醇中。所得溶液在室溫下再攪拌持續2小時，此時LCMS顯示丙酮化合物保護基之完全保護基脫除。此混合物經濃縮且藉由逆相液體層析法(RPLC)使用以5%至40%乙腈/水溶離之Isco CombiFlash液體層析儀使用0.1% TFA作為修飾劑經純化。產量380 mg，71.0 %。藉由LCMS發現之離子：[(M + 2H)/2]+ = 589.8, [(M + 3H)/3]+ = 392.5。實例 144. 合成 Int-82
Figure 02_image1979
類似於實例143 Int-81製備標題化合物，其中步驟a中之N-Boc-N-Me-甘油醇經N-Boc-N-乙基-甘油醇取代。藉由LCMS發現之離子：[M/2]+1 = 603.8, [M/3]+1 = 402.9。實例 145. 合成 Int-83
Figure 02_image1981
步驟 a.
Figure 02_image1983
經CBZ保護之胺基-peg1-溴化物(7.6 g，25.2 mmol)、苯甲胺(1.1 g，10.1 mmol)及碳酸鉀(2.8 g，2.8 mmol)在60℃下在DMF (10 mL)中經攪拌持續12小時。該溶液在旋轉蒸發儀上經濃縮且藉由矽膠層析法(DCM中之0-10%甲醇，30分鐘梯度)經純化以提供呈澄清黏性油狀物之產物。產量3.2公克，57%。藉由LC/MS發現之離子，[M+H]+ =550.2。步驟 b.
Figure 02_image1985
步驟a產物(1.9 g，3.5 mmol)溶解於THF (20 mL)中且在氮氣氛圍下藉助於冰/水浴冷卻至0℃。經10分鐘時期藉助於注射器逐滴添加LAH (6.9 ml，13.8 mmol，2M於THF中)。該混合物在回流下經攪拌持續2小時，接著藉助於冰/水浴冷卻至0℃。逐滴添加1 mL水，隨後逐滴添加1 mL NaOH水溶液(15重量%)。添加3 mL水且該混合物經攪拌持續15分鐘，此時添加2 g硫酸鎂。該混合物經攪拌持續10分鐘，接著經矽藻土過濾，用額外2個10 ml THF部分洗滌且經組合之濾液藉由旋轉蒸發儀經濃縮。殘餘物溶解於乙腈(20 mL)中，添加三乙胺(1.4g, 13.8 mmol)及boc酐(3.0 g，13.8 mmol)。該混合物經攪拌持續45分鐘，濃縮且藉由逆相HPLC (5-95%乙腈/去離子水，0.1% TFA修飾劑，30分鐘梯度)經純化。產量1.4 g，79%。藉由LC/MS發現之離子，[M+H]+ = 510.2。步驟 c.
Figure 02_image1987
此實例之步驟b.產物(1 g，1.9 mmol)在1個大氣壓之氫氣下在氫氧化鈀(200 mg)存在下在甲醇(25 mL)中經攪拌持續2小時。該混合物經矽藻土過濾且濃縮以提供呈澄清油狀物之產物，其無需進一步純化即使用。產量0.73 g，89%。藉由LC/MS發現之離子，[M+H]+ = 420.4。步驟 d.
Figure 02_image1989
步驟c產物(0.73 g，1.7 mmol)、炔丙基-peg4-甲苯磺酸鹽(0.91 g，2.4 mmol)及二異丙基乙胺(0.76 g，5.9 mmol)在85℃下在DMF (5 mL)中經攪拌持續4小時。該混合物在旋轉蒸發儀上經濃縮，接著藉由逆相HPLC (5-95%乙腈/DI水，0.1% TFA修飾劑，30分鐘梯度)經純化以提供呈澄清黏性油狀物之產物。產量0.89 g，82%。藉由LC/MS發現之離子，[M+H]+= 634.4。步驟 e.
Figure 02_image1991
步驟d.產物(0.89 g，1.4 mml)在環境溫度下在4N HCl (於二噁烷中)中經攪拌持續45分鐘。該混合物在旋轉蒸發儀上經濃縮且與苯共沸(3次)。所得殘餘物溶解於DI水(15 mL)中，經冷凍且凍乾以提供呈澄清油狀物之產物雙-HCl鹽。產量0.65 g，91%。藉由LC/MS發現之離子，[M+H}+ = 434.4。步驟 f.
Figure 02_image1993
此化合物之合成中的剩餘四個步驟類似於實例143 Int-81之合成中所用之彼等步驟。藉由LCMS發現之離子：(M+2H)/2 =575.8實例 146. 替代合成 Int-83
Figure 02_image1995
描述於實例145中之產物Int-83可替代地使用本專利中所述之方法由熟習此項技術者使用上述反應流程來製備。實例 147. 用於選擇抗性流感病毒之連續繼代實驗
為了評估在病毒抑制劑之選擇性壓力下開發耐藥性突變型病毒菌株之潛力，相對奧司他韋及巴洛沙韋比較物，用結合物6及33進行連續繼代研究。連續繼代研究使用A549或MDCK細胞來進行。如下進行繼代：每孔(12-孔) 150,000個A549或MDCK細胞接種於500 µl DMEM 10% FBS、1% PS、1% NaPyr及1% HEPES中且經培育持續大約24小時。一旦細胞達到大約80%匯合，其用PBS洗滌一次且在正常培養條件下在化合物或單獨PBS存在下經培育持續2小時。如最大病毒抑制所需最佳化測試物件濃度，同時維持充足病毒產生以用於後續繼代。連續繼代實驗中所用之測試物件濃度顯示於圖67及68中。細胞接著在室溫下在含有PBS、牛白蛋白35%及Ca2+ /Mg2+ 之緩衝液中以MOI 0.01或0.05 (分別地，MDCK及A549細胞；150 ul稀釋於感染緩衝液中)受感染，隨後移除接種物且用DMEM 1% PS、1% NaPyr及1% HEPES (無FBS)洗滌細胞一次。細胞接著在稀釋於DMEM 1% PS、1% NaPyr、1% HEPES及1 µg/ml經TPCK處理之胰蛋白酶中之測試物件存在下經培育持續24小時。在培育之後，收集病毒上清液，且藉由離心(5 min，4℃，1,400xg)移除細胞及碎片。上清液接著用於： i 藉由斑塊分析定量病毒效價 ii 進行血細胞凝集分析以確定該病毒是否逃逸化合物抑制 iii 在化合物存在下再感染新鮮接種之A549或MDCK細胞。
重複該過程持續10個繼代，或直至關於奧司他韋及巴洛沙韋對照物觀察到抗性。一旦在兩個連續繼代中偵測到在藥物存在下增加之效價，該等病毒即可經斑塊純化。在斑塊純化之後，所有8個基因組區段可經測序且與經PBS治療之對照病毒相比以偵測逃逸突變。兩個不同連續繼代實驗之概述顯示於圖67及68中。在圖67中概述之實驗中，使用經A/California/04/09/ H1N1 pdm感染之A549細胞比較結合物6與奧司他韋及巴洛沙韋。結合物6、巴洛沙韋及奧司他韋分別以0.5 nM、0.5 nM及200 nM使用。在11次繼代之過程中，關於結合物6未觀察到病毒效價之增加(表明未出現抗性突變體)，而巴洛沙韋及奧司他韋效價分別在第5次及第11次繼代之後增加至類似於PBS對照物中所觀察到之彼等水準的水準。在圖68中概述之實驗中，使用經A/WSN/1933 H1N1感染之MDCK細胞比較結合物6及33與奧司他韋及巴洛沙韋。結合物6、結合物33、巴洛沙韋及奧司他韋分別以4 nM、2 nM、4 nM及50 nM使用。在10次繼代之過程中，關於結合物6或33未觀察到病毒效價之增加(表明未出現抗性突變體)，而巴洛沙韋及奧司他韋效價分別在第5次及第10次繼代之後增加至類似於PBS對照物中所觀察到之彼等水準的水準。
圖1係描繪例如藉助於連接體使神經胺糖酸酶抑制劑單體或二聚體結合於Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽之例示性方法之圖像。
圖2顯示由具有SEQ ID NO: 1之序列的Fc域單體形成之Fc域之非還原及還原SDS-PAGE及示意圖。
圖3顯示由具有SEQ ID NO: 3之序列的Fc域單體形成之Fc域之非還原及還原SDS-PAGE及示意圖。
圖4顯示由具有SEQ ID NO: 5之序列的Fc域單體形成之Fc域之非還原及還原SDS-PAGE及示意圖。
圖5顯示由具有SEQ ID NO: 7之序列的Fc域單體形成之Fc域之非還原及還原SDS-PAGE及示意圖。
圖6顯示由具有SEQ ID NO: 9之序列的Fc域單體形成之Fc域之非還原及還原SDS-PAGE及示意圖。
圖7顯示由具有SEQ ID NO: 12之序列的Fc域單體形成之Fc域之非還原及還原SDS-PAGE及示意圖。
圖8顯示由具有SEQ ID NO: 14之序列的Fc域單體形成之Fc域之非還原及還原SDS-PAGE及示意圖。
圖9顯示結合物1之非還原SDS-PAGE。
圖10顯示結合物2之非還原SDS-PAGE。
圖11顯示結合物3之非還原SDS-PAGE。
圖12顯示結合物4之非還原SDS-PAGE。
圖13顯示結合物5之非還原SDS-PAGE。
圖14顯示結合物6之非還原SDS-PAGE。
圖15係顯示H1N1神經胺糖酸酶抑制分析中針對Int-2及結合物1之IC50值的圖。
圖16係顯示H1N1神經胺糖酸酶抑制分析中針對結合物1-6之IC50值的圖。
圖17係顯示H3N2神經胺糖酸酶抑制分析中針對結合物1-6之IC50值的圖。
圖18A-18C係一系列圖，其顯示經結合物3 (圖18A)、結合物4 (圖18B)或結合物6 (圖18C)治療之A549細胞的細胞性能。
圖19A-19E係一系列圖，其顯示結合物3抑制人類上皮細胞中之致病性流感病毒菌株A/WSN/33 H1N1 (圖19A)、A/Wyoming/3/03 H3N2 (圖19B)、A/California/04/09 H1N1 pdm (圖19C)、A/Vietnam/1203/04 H5N1 HALo (圖19D)或B/Lee/40 Victoria (圖19E)之生長的能力。
圖20A-20E係一系列圖，其顯示結合物4抑制人類上皮細胞中之致病性流感病毒菌株A/WSN/33 H1N1 (圖20A)、A/Wyoming/3/03 H3N2 (圖20B)、A/California/04/09 H1N1 pdm (圖20C)、A/Vietnam/1203/04 H5N1 HALo (圖20D)或B/Lee/40 Victoria (圖20E)之生長的能力。
圖21A-21E係一系列圖，其顯示結合物6抑制人類上皮細胞中之致病性流感病毒菌株A/WSN/33 H1N1 (圖21A)、A/Wyoming/3/03 H3N2 (圖21B)、A/California/04/09 H1N1 pdm (圖21C)、A/Vietnam/1203/04 H5N1 HALo (圖21D)或B/Lee/40 Victoria (圖21E)之生長的能力。
圖22A-22E係一系列圖，其顯示與奧司他韋相比，結合物6抑制人類上皮細胞中之致病性流感病毒菌株A/WSN/33 H1N1 (圖22A)、A/Wyoming/3/03 H3N2 (圖22B)、A/California/04/09 H1N1 pdm (圖22C)、B/Lee/40 Victoria (圖22D)或A/Vietnam/1203/04 (圖22E)之生長的能力。
圖23係顯示與單獨Fc (hIgG1)相比結合物6之相對小鼠血清濃度的圖。
圖24係顯示在致死性小鼠流感模型中結合物6對小鼠重量之影響的圖。該研究如實例29所述來執行。
圖25係顯示在致死性小鼠流感模型中結合物6對生存之影響的圖。該研究如實例29所述來執行。
圖26係顯示顯示在致死性小鼠流感模型中結合物6對小鼠重量之影響的圖。該研究如實例30所述來執行。
圖27係顯示在致死性小鼠流感模型中結合物6對生存之影響的圖。該研究如實例30所述來執行。
圖28係描繪例如藉助於連接體使神經胺糖酸酶抑制劑單體或二聚體結合於Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽，藉由肟結合於胺基酸殘基(例如，表面暴露離胺酸之氮原子)之方法之圖像。
圖29係描繪例如藉助於連接體使神經胺糖酸酶抑制劑單體或二聚體結合於Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽，藉由硫醚結合於胺基酸殘基(例如，表面暴露離胺酸之氮原子)之方法之圖像。
圖30係描繪例如藉助於連接體使神經胺糖酸酶抑制劑單體或二聚體結合於Fc域單體、Fc域、Fc結合肽、白蛋白或白蛋白結合肽，藉由再橋接半胱胺酸結合，例如再橋接半胱胺酸結合於Fc域單體或Fc域中之兩個鉸鏈半胱胺酸的一對硫原子之方法之圖像。
圖31A-31F係一系列圖，其顯示在致死性小鼠流感模型中經結合物6治療之小鼠之生存。小鼠經奧司他韋(TamifluTM )對照物，20 mg/kg，每天2次，感染後8小時開始(圖31A)；結合物6，50 mg/kg，在感染之前28天1劑(圖31B)；結合物6，10 mg/kg，在感染之前28天1劑(圖31C)；結合物6，5 mg/kg，在感染之前28天1劑(圖31D)；結合物6，2.5 mg/kg，在感染之前28天1劑(圖31E)；或結合物6，1.25 mg/kg，在感染之前28天1劑(圖31F)治療。此研究如實例33所述來執行。
圖32A-32F係一系列圖，其顯示顯示如與奧司他韋(TamifluTM )相比，結合物6延伸治療窗，如藉由致死性小鼠流感模型中之生存所測定。小鼠經媒劑(PBS)，單獨Fc 10 mpk，或結合物6，在感染之前4小時(圖32A)；結合物6或奧司他韋(TamifluTM )，感染後8小時(圖32B)；結合物6或奧司他韋(TamifluTM )，感染後24小時(圖32C)；結合物6或奧司他韋(TamifluTM )，感染後48小時(圖32D)；結合物6或奧司他韋(TamifluTM )，感染後72小時(圖32E)；或結合物6或奧司他韋(TamifluTM )，感染後96小時(圖32F)治療。該研究如實例34所述來執行。
圖33係顯示在14天大鼠劑量範圍測量儀毒性研究中在投與結合物6之後未觀察到體重增加之顯著效應的圖。該研究如實例35所述來執行。
圖34A-34D係一系列圖，其顯示顯示如與奧司他韋(TamifluTM )相比，結合物6延伸治療窗，如藉由致死性小鼠流感模型中之生存所測定。小鼠經奧司他韋(TamifluTM )對照物，20 mg/kg，每天2次，感染後8小時開始(圖34A)；結合物6，10 mg/kg，在感染之前4小時1劑(圖34B)；結合物6，2 mg/kg，在感染之前4小時1劑(圖34C)；或結合物6，0.4 mg/kg，在感染之前4天1劑(圖34D)治療。該研究如實例37所述來執行。
圖35係顯示在致死性小鼠流感模型中結合物6對小鼠重量之影響的圖。該研究如實例37所述來執行。
圖36係顯示在IV投與結合物6之後之7天大鼠藥物動力學研究的圖。該研究如實例38所述來執行。
圖37係顯示在IV投與結合物6之後之14天大鼠藥物動力學研究的圖。該研究如實例39所述來執行。
圖38係顯示比較IV與SC投與結合物6之28天大鼠藥物動力學研究的圖。該研究如實例40所述來執行。
圖39係顯示在IV投與結合物6之後之28天非人類靈長類動物藥物動力學研究的圖。該研究如實例41所述來執行。
圖40係顯示在IV投與結合物6之後之小鼠肺分佈藥物動力學研究的圖。該研究如實例42所述來執行。
圖41係顯示比較IV、SC及IM投與結合物6之5天小鼠藥物動力學研究的圖。該研究如實例43所述來執行。
圖42顯示結合物8之非還原SDS-PAGE。
圖43顯示結合物6之結構。
圖44係顯示24小時活體外小鼠血漿穩定性研究之圖，該研究比較與對照物及純化合物相比在37℃下培育持續24 h之結合物6。
圖45係顯示24小時活體外人類血漿穩定性研究之圖，該研究比較與對照物及純化合物相比在37℃下培育持續24 h之結合物6。
圖46係顯示24小時小鼠肝微粒體穩定性研究之圖，該研究比較在37℃下在小鼠肝微粒體細胞及作為對照物之經熱滅活小鼠肝微粒體細胞中培育持續24 h之結合物6。
圖47係顯示24小時人類肝微粒體穩定性研究之圖，該研究比較在37℃下在人類肝微粒體細胞及作為對照物之經熱滅活小鼠肝微粒體細胞中培育持續24 h之結合物6。
圖48係顯示病毒攻擊後經15天小鼠之%體重改變的圖。該研究如實例66所述來執行。
圖49係顯示病毒攻擊後經15天小鼠之%生存的圖。該研究如實例66所述來執行。
圖50係顯示與hIgG1 Fc (WT)及hIgG1 Fc (N297A)相比結合物6及結合物12與Fcγ受體IIIA的結合之圖。該研究如實例67所述來執行。
圖51係顯示結合物6及結合物與Fcγ受體IIIA的結合之圖。該研究如實例67所述來執行。
圖52係顯示在IV投與結合物6之後之7天非人類靈長類動物毒物動力學研究的圖。該研究如實例68所述來執行。
圖53係顯示比較IV與SC投與結合物6之28天非人類靈長類動物藥物動力學研究的圖。該研究如實例68所述來執行。
圖54顯示結合物12之非還原SDS-PAGE。
圖55顯示具有不同藥物:抗體(DAR)比率值之結合物13 (結合物13a、結合物13b、結合物13c、結合物13d、結合物13e、結合物13f及結合物13g)之非還原SDS-PAGE。
圖56係顯示病毒攻擊後經35天免疫受損小鼠之%生存的圖。0.3 mg/kg結合物6治療組保持100%生存，但在該圖中為清晰起見略有偏移。該研究如實例95所述來執行
圖57係顯示病毒攻擊後經35天免疫受損小鼠之%體重改變的圖。該研究如實例95所述來執行。
圖58係顯示結合物6之投與在經流感A (H1N1)感染之小鼠模型的肺中引起劑量依賴性病毒清除且此病毒清除大於PBS對照物、單獨Fc對照物或奧司他韋對照物之圖。此研究如實例96所述來執行。
圖59係顯示結合物6之投與在經流感A (H1N1)感染之小鼠模型的肺中引起發炎細胞因子之劑量依賴性減少的圖。此研究如實例97所述來執行。
圖60係顯示結合物6在BALB/c SCID (免疫受損)小鼠及CD-1小鼠(免疫勝任)中之藥物動力學的圖。此研究如實例98所述來執行。
圖61係描繪結合物33之圖像。
圖62A-62B係顯示鼻內經小鼠適應性流感A.PR/8/1934 (H1N1)攻擊(3x LD95 )之BALB/c小鼠之體重改變(%)的圖。此研究如實例133所述來執行。
圖63A係顯示感染後第4天之病毒負荷之圖。此研究如實例133所述來執行。
圖63B係顯示感染後第4天之病毒負荷之log減少的圖。此研究如實例133所述來執行。
圖64A係顯示與PBS對照物或單獨Fc對照物相比，結合物33之投與在經流感A (H1N1)感染之小鼠模型中引起病毒負荷之劑量依賴性減少的圖。此研究如實例133所述來執行。
圖64B係顯示感染後第4天之病毒負荷之log減少的圖。此研究如實例133所述來執行。
圖65A-65E係一系列條形圖，其顯示結合物33之投與引起TNF-α (圖65A)、IL-6 (圖65B)、INF-γ (圖65C)、MCP-1 (圖65D)及MIP-1α (圖65E)之細胞因子水準的劑量依賴性倍數減少。此研究如實例133所述來執行。
圖66係層析圖，其顯示在37℃及60℃下培育第7天與Int-4相比Int-80之穩定性。此研究如實例142所述來執行。
圖67係顯示在結合物6、奧司他韋、巴洛沙韋或PBS對照物存在下A549細胞中之A/CA/09 pdm之連續繼代的圖，以評估在病毒抑制劑之選擇性壓力下開發耐藥性突變型病毒菌株之潛力。此研究如實例147所述來執行。
圖68係顯示在結合物6、結合物33、奧司他韋、巴洛沙韋或PBS對照物存在下MDCK細胞中之A/WSN/1933之連續繼代的圖，以評估在病毒抑制劑之選擇性壓力下開發耐藥性突變型病毒菌株之潛力。此研究如實例147所述來執行。
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Claims (307)

  1. 一種由式(1)描述之結合物：
    Figure 03_image002
    (1) 其中各A1 及各A2 係獨立地選自式(A-I)-(A-XII)中任一者：
    Figure 03_image005
    、
    Figure 03_image007
    、
    Figure 03_image009
    、
    Figure 03_image011
    、
    Figure 03_image013
    、 (A-I)                (A-II)           (A-III)                      (A-IV)              (A-V)
    Figure 03_image015
    、
    Figure 03_image017
    、
    Figure 03_image019
    、
    Figure 03_image021
    、 (A-VI)                (A-VII)              (A-VIII)              (A-IX)
    Figure 03_image023
    、
    Figure 03_image025
    、
    Figure 03_image027
    ； (A-X)                  (A-XI)                      (A-XII) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ； R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br； R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H； R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ； X係選自-O-及-S-； Y係選自-O-、-S-、-NR7 -、-O(C=O)NR7 -、-O(C=S)NR7 -、-O(C=O)O-、-O(C=O)-、-NH(C=O)O-、-NH(C=O)-、-NH(C=NH)-、-NH(C=O)NR7 -、-NH(C=NH)NR7 -、-NH(C=S)NR7 -、-NH(C=S)-、-OCH2 (C=O)NR7 -、-NH(SO2 )-、-NH(SO2 )NR7 -、-OR8 -、-NHR8 -及-SR8 -； R6 係選自
    Figure 03_image031
    、
    Figure 03_image033
    、
    Figure 03_image035
    、
    Figure 03_image037
    、
    Figure 03_image039
    、
    Figure 03_image041
    、
    Figure 03_image043
    、
    Figure 03_image045
    、
    Figure 03_image047
    、
    Figure 03_image049
    、
    Figure 03_image051
    、
    Figure 03_image053
    、
    Figure 03_image055
    、
    Figure 03_image057
    、
    Figure 03_image059
    、
    Figure 03_image061
    、
    Figure 03_image063
    、
    Figure 03_image065
    、
    Figure 03_image067
    、
    Figure 03_image069
    、
    Figure 03_image071
    、
    Figure 03_image073
    、
    Figure 03_image075
    、
    Figure 03_image077
    、
    Figure 03_image079
    、
    Figure 03_image081
    、
    Figure 03_image083
    、
    Figure 03_image085
    、
    Figure 03_image087
    、
    Figure 03_image089
    、
    Figure 03_image091
    及
    Figure 03_image093
    ； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； 各E包含Fc域單體； 各A1 -L-A2 中之L係共價附接至各E中之鉸鏈半胱胺酸的硫原子且附接至A1 及A2 中每一者之連接體； T為1至20之整數，且 連接至兩個E之兩條波浪線指示各A1 -L-A2 共價附接至該兩個E中之兩個鉸鏈半胱胺酸的一對硫原子， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  2. 一種由式(1)描述之結合物：
    Figure 03_image002
    (1) 其中各A1 及各A2 係獨立地選自式(A-I)-(A-V)中任一者：
    Figure 03_image005
    、
    Figure 03_image007
    、
    Figure 03_image009
    、
    Figure 03_image011
    、
    Figure 03_image013
    ； (A-I)                  (A-II)                      (A-III)                         (A-IV)                (A-V) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ； R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br； R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H； R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ； X係選自-O-及-S-； Y係選自-O-、-S-、-NR7 -、-O(C=O)NR7 -、-O(C=S)NR7 -、-O(C=O)O-、-O(C=O)-、-NH(C=O)O-、-NH(C=O)-、-NH(C=NH)-、-NH(C=O)NR7 -、-NH(C=NH)NR7 -、-NH(C=S)NR7 -、-NH(C=S)-、-OCH2 (C=O)NR7 -、-NH(SO2 )-、-NH(SO2 )NR7 -、-OR8 -、-NHR8 -及-SR8 -； R6 係選自
    Figure 03_image031
    、
    Figure 03_image033
    、
    Figure 03_image035
    、
    Figure 03_image037
    、
    Figure 03_image039
    、
    Figure 03_image041
    、
    Figure 03_image043
    、
    Figure 03_image045
    、
    Figure 03_image047
    、
    Figure 03_image049
    、
    Figure 03_image051
    、
    Figure 03_image053
    、
    Figure 03_image055
    、
    Figure 03_image057
    、
    Figure 03_image059
    、
    Figure 03_image061
    、
    Figure 03_image063
    、
    Figure 03_image065
    、
    Figure 03_image067
    、
    Figure 03_image069
    、
    Figure 03_image071
    、
    Figure 03_image073
    、
    Figure 03_image075
    、
    Figure 03_image077
    、
    Figure 03_image079
    、
    Figure 03_image081
    、
    Figure 03_image083
    、
    Figure 03_image085
    、
    Figure 03_image087
    、
    Figure 03_image089
    、
    Figure 03_image091
    及
    Figure 03_image093
    ； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； 各E包含Fc域單體； 各A1 -L-A2 中之L係共價附接至各E中之鉸鏈半胱胺酸的硫原子且附接至A1 及A2 中每一者之連接體； T為1至20之整數，且 連接至兩個E之兩條波浪線指示各A1 -L-A2 共價附接至該兩個E中之兩個鉸鏈半胱胺酸的一對硫原子， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  3. 一種由式(1)描述之結合物：
    Figure 03_image002
    (1) 其中各A1 及各A2 係獨立地選自式(A-VI)-(A-IX)中任一者：
    Figure 03_image015
    、
    Figure 03_image017
    、
    Figure 03_image019
    、
    Figure 03_image021
    ； (A-VI)                    (A-VII)                    (A-VIII)                     (A-IX) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ； R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br； R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H； R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ； X係選自-O-及-S-； Y係選自-O-、-S-、-NR7 -、-O(C=O)NR7 -、-O(C=S)NR7 -、-O(C=O)O-、-O(C=O)-、-NH(C=O)O-、-NH(C=O)-、-NH(C=NH)-、-NH(C=O)NR7 -、-NH(C=NH)NR7 -、-NH(C=S)NR7 -、-NH(C=S)-、-OCH2 (C=O)NR7 -、-NH(SO2 )-、-NH(SO2 )NR7 -、-OR8 -、-NHR8 -及-SR8 -； R6 係選自
    Figure 03_image031
    、
    Figure 03_image033
    、
    Figure 03_image035
    、
    Figure 03_image037
    、
    Figure 03_image039
    、
    Figure 03_image041
    、
    Figure 03_image043
    、
    Figure 03_image045
    、
    Figure 03_image047
    、
    Figure 03_image049
    、
    Figure 03_image051
    、
    Figure 03_image053
    、
    Figure 03_image055
    、
    Figure 03_image057
    、
    Figure 03_image059
    、
    Figure 03_image061
    、
    Figure 03_image063
    、
    Figure 03_image065
    、
    Figure 03_image067
    、
    Figure 03_image069
    、
    Figure 03_image071
    、
    Figure 03_image073
    、
    Figure 03_image075
    、
    Figure 03_image077
    、
    Figure 03_image079
    、
    Figure 03_image081
    、
    Figure 03_image083
    、
    Figure 03_image085
    、
    Figure 03_image087
    、
    Figure 03_image089
    、
    Figure 03_image091
    及
    Figure 03_image093
    ； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； 各E包含Fc域單體； 各A1 -L-A2 中之L係共價附接至各E中之鉸鏈半胱胺酸的硫原子且附接至A1 及A2 中每一者之連接體； T為1至20之整數，且 連接至兩個E之兩條波浪線指示各A1 -L-A2 共價附接至該兩個E中之兩個鉸鏈半胱胺酸的一對硫原子， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  4. 一種由式(2)描述之結合物：
    Figure 03_image2013
    (2) 其中各A1 係獨立地選自式(A-I)-(A-XII)中任一者：
    Figure 03_image005
    、
    Figure 03_image007
    、
    Figure 03_image009
    、
    Figure 03_image011
    、
    Figure 03_image013
    、 (A-I)              (A-II)                   (A-III)                 (A-IV)             (A-V)
    Figure 03_image015
    、
    Figure 03_image017
    、
    Figure 03_image019
    、
    Figure 03_image021
    、 (A-VI)                    (A-VII)               (A-VIII)                (A-IX)
    Figure 03_image023
    、
    Figure 03_image025
    、
    Figure 03_image027
    ； (A-X)                  (A-XI)                          (A-XII) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ； R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br； R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H； R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ； X係選自-O-及-S-； Y係選自-O-、-S-、-NR7 -、-O(C=O)NR7 -、-O(C=S)NR7 -、-O(C=O)O-、-O(C=O)-、-NH(C=O)O-、-NH(C=O)-、-NH(C=NH)-、-NH(C=O)NR7 -、-NH(C=NH)NR7 -、-NH(C=S)NR7 -、-NH(C=S)-、-OCH2 (C=O)NR7 -、-NH(SO2 )-、-NH(SO2 )NR7 -、-OR8 -、-NHR8 -及-SR8 -； R6 係選自
    Figure 03_image031
    、
    Figure 03_image033
    、
    Figure 03_image035
    、
    Figure 03_image037
    、
    Figure 03_image039
    、
    Figure 03_image041
    、
    Figure 03_image043
    、
    Figure 03_image045
    、
    Figure 03_image047
    、
    Figure 03_image049
    、
    Figure 03_image051
    、
    Figure 03_image053
    、
    Figure 03_image055
    、
    Figure 03_image057
    、
    Figure 03_image059
    、
    Figure 03_image061
    、
    Figure 03_image063
    、
    Figure 03_image065
    、
    Figure 03_image067
    、
    Figure 03_image069
    、
    Figure 03_image071
    、
    Figure 03_image073
    、
    Figure 03_image075
    、
    Figure 03_image077
    、
    Figure 03_image079
    、
    Figure 03_image081
    、
    Figure 03_image083
    、
    Figure 03_image085
    、
    Figure 03_image087
    、
    Figure 03_image089
    、
    Figure 03_image091
    及
    Figure 03_image093
    ； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； 各E包含Fc域單體； 各L-A中之L係共價附接至E中之鉸鏈半胱胺酸的硫原子且附接至A之連接體； T為1至20之整數，且 連接至兩個硫原子之兩條波浪線指示各L-A共價附接至該兩個E中之兩個鉸鏈半胱胺酸的一對硫原子， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  5. 一種由式(2)描述之結合物：
    Figure 03_image2013
    (2) 其中各A1 係獨立地選自式(A-I)-(A-V)中任一者：
    Figure 03_image005
    、
    Figure 03_image007
    、
    Figure 03_image009
    、
    Figure 03_image011
    、
    Figure 03_image013
    ； (A-I)                (A-II)           (A-III)               (A-IV)                (A-V) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ； R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br； R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H； R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ； X係選自-O-及-S-； Y係選自-O-、-S-、-NR7 -、-O(C=O)NR7 -、-O(C=S)NR7 -、-O(C=O)O-、-O(C=O)-、-NH(C=O)O-、-NH(C=O)-、-NH(C=NH)-、-NH(C=O)NR7 -、-NH(C=NH)NR7 -、-NH(C=S)NR7 -、-NH(C=S)-、-OCH2 (C=O)NR7 -、-NH(SO2 )-、-NH(SO2 )NR7 -、-OR8 -、-NHR8 -及-SR8 -； R6 係選自
    Figure 03_image031
    、
    Figure 03_image033
    、
    Figure 03_image035
    、
    Figure 03_image037
    、
    Figure 03_image039
    、
    Figure 03_image041
    、
    Figure 03_image043
    、
    Figure 03_image045
    、
    Figure 03_image047
    、
    Figure 03_image049
    、
    Figure 03_image051
    、
    Figure 03_image053
    、
    Figure 03_image055
    、
    Figure 03_image057
    、
    Figure 03_image059
    、
    Figure 03_image061
    、
    Figure 03_image063
    、
    Figure 03_image065
    、
    Figure 03_image067
    、
    Figure 03_image069
    、
    Figure 03_image071
    、
    Figure 03_image073
    、
    Figure 03_image075
    、
    Figure 03_image077
    、
    Figure 03_image079
    、
    Figure 03_image081
    、
    Figure 03_image083
    、
    Figure 03_image085
    、
    Figure 03_image087
    、
    Figure 03_image089
    、
    Figure 03_image091
    及
    Figure 03_image093
    ； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； 各E包含Fc域單體； 各L-A中之L係共價附接至E中之鉸鏈半胱胺酸的硫原子且附接至A之連接體； T為1至20之整數，且 連接至兩個硫原子之兩條波浪線指示各L-A共價附接至該兩個E中之兩個鉸鏈半胱胺酸的一對硫原子， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  6. 一種由式(2)描述之結合物：
    Figure 03_image2013
    (2) 其中各A1 係獨立地選自式(A-VI)-(A-IX)中任一者：
    Figure 03_image015
    、
    Figure 03_image017
    、
    Figure 03_image019
    、
    Figure 03_image021
    ； (A-VI)               (A-VII)              (A-VIII)             (A-IX) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ； R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br； R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H； R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ； X係選自-O-及-S-； Y係選自-O-、-S-、-NR7 -、-O(C=O)NR7 -、-O(C=S)NR7 -、-O(C=O)O-、-O(C=O)-、-NH(C=O)O-、-NH(C=O)-、-NH(C=NH)-、-NH(C=O)NR7 -、-NH(C=NH)NR7 -、-NH(C=S)NR7 -、-NH(C=S)-、-OCH2 (C=O)NR7 -、-NH(SO2 )-、-NH(SO2 )NR7 -、-OR8 -、-NHR8 -及-SR8 -； R6 係選自
    Figure 03_image031
    、
    Figure 03_image033
    、
    Figure 03_image035
    、
    Figure 03_image037
    、
    Figure 03_image039
    、
    Figure 03_image041
    、
    Figure 03_image043
    、
    Figure 03_image045
    、
    Figure 03_image047
    、
    Figure 03_image049
    、
    Figure 03_image051
    、
    Figure 03_image053
    、
    Figure 03_image055
    、
    Figure 03_image057
    、
    Figure 03_image059
    、
    Figure 03_image061
    、
    Figure 03_image063
    、
    Figure 03_image065
    、
    Figure 03_image067
    、
    Figure 03_image069
    、
    Figure 03_image071
    、
    Figure 03_image073
    、
    Figure 03_image075
    、
    Figure 03_image077
    、
    Figure 03_image079
    、
    Figure 03_image081
    、
    Figure 03_image083
    、
    Figure 03_image085
    、
    Figure 03_image087
    、
    Figure 03_image089
    、
    Figure 03_image091
    及
    Figure 03_image093
    ； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； 各E包含Fc域單體； 各L-A中之L係共價附接至E中之鉸鏈半胱胺酸的硫原子且附接至A之連接體； T為1至20之整數，且 連接至兩個硫原子之兩條波浪線指示各L-A共價附接至該兩個E中之兩個鉸鏈半胱胺酸的一對硫原子， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  7. 如申請專利範圍第1項至第6項中任一項之結合物，其中各E包含具有SEQ ID NO: 1-68中任一者之序列的Fc域單體。
  8. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之結合物，其中各Fc域單體包含SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之序列。
  9. 如申請專利範圍第8項之結合物，其中該硫原子對中之至少一者係SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys10、Cys13、Cys16或Cys18的硫原子。
  10. 如申請專利範圍第8項之結合物，其中該硫原子對係該兩個E中之Cys10及Cys13、Cys10及Cys16、Cys 10及Cys18、Cys13及Cys 16、Cys13及Cys 18或Cys 16及Cys 18的硫原子。
  11. 如申請專利範圍第1項至第10項中任一項之結合物，其中T為1、2、3、4或5。
  12. 一種如申請專利範圍第1項至第6項中任一項之結合物之群體，其中T之平均值為1至5。
  13. 一種由式(3)描述之結合物：
    Figure 03_image150
    (3) 其中各A1 及各A2 係獨立地選自式(A-I)-(A-XII)中任一者：
    Figure 03_image005
    、
    Figure 03_image007
    、
    Figure 03_image009
    、
    Figure 03_image011
    、
    Figure 03_image013
    、 (A-I)                 (A-II)           (A-III)               (A-IV)                (A-V)
    Figure 03_image015
    、
    Figure 03_image017
    、
    Figure 03_image019
    、
    Figure 03_image021
    、 (A-VI)                    (A-VII)              (A-VIII)                (A-IX)
    Figure 03_image023
    、
    Figure 03_image025
    、
    Figure 03_image027
    ； (A-X)                  (A-XI)                          (A-XII) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ； R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br； R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H； R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ； X係選自-O-及-S-； Y係選自-O-、-S-、-NR7 -、-O(C=O)NR7 -、-O(C=S)NR7 -、-O(C=O)O-、-O(C=O)-、-NH(C=O)O-、-NH(C=O)-、-NH(C=NH)-、-NH(C=O)NR7 -、-NH(C=NH)NR7 -、-NH(C=S)NR7 -、-NH(C=S)-、-OCH2 (C=O)NR7 -、-NH(SO2 )-、-NH(SO2 )NR7 -、-OR8 -、-NHR8 -及-SR8 -； R6 係選自
    Figure 03_image031
    、
    Figure 03_image033
    、
    Figure 03_image035
    、
    Figure 03_image037
    、
    Figure 03_image039
    、
    Figure 03_image041
    、
    Figure 03_image043
    、
    Figure 03_image045
    、
    Figure 03_image047
    、
    Figure 03_image049
    、
    Figure 03_image051
    、
    Figure 03_image053
    、
    Figure 03_image055
    、
    Figure 03_image057
    、
    Figure 03_image059
    、
    Figure 03_image061
    、
    Figure 03_image063
    、
    Figure 03_image065
    、
    Figure 03_image067
    、
    Figure 03_image069
    、
    Figure 03_image071
    、
    Figure 03_image073
    、
    Figure 03_image075
    、
    Figure 03_image077
    、
    Figure 03_image079
    、
    Figure 03_image081
    、
    Figure 03_image083
    、
    Figure 03_image085
    、
    Figure 03_image087
    、
    Figure 03_image089
    、
    Figure 03_image091
    及
    Figure 03_image093
    ； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； E包含Fc域單體或Fc域； 各A1 -L-A2 中之L係共價附接至E中之鉸鏈半胱胺酸的硫原子且附接至A1 及A2 中每一者之連接體； T為1至20之整數，且 連接至E之波浪線指示各A1 -L-A2 共價附接至E中之鉸鏈半胱胺酸的硫原子， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  14. 一種由式(3)描述之結合物：
    Figure 03_image150
    (3) 其中各A1 及各A2 係獨立地選自式(A-I)-(A-V)中任一者：
    Figure 03_image005
    、
    Figure 03_image007
    、
    Figure 03_image009
    、
    Figure 03_image011
    、
    Figure 03_image013
    ； (A-I)                    (A-II)           (A-III)             (A-IV)                  (A-V) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ； R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br； R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H； R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ； X係選自-O-及-S-； Y係選自-O-、-S-、-NR7 -、-O(C=O)NR7 -、-O(C=S)NR7 -、-O(C=O)O-、-O(C=O)-、-NH(C=O)O-、-NH(C=O)-、-NH(C=NH)-、-NH(C=O)NR7 -、-NH(C=NH)NR7 -、-NH(C=S)NR7 -、-NH(C=S)-、-OCH2 (C=O)NR7 -、-NH(SO2 )-、-NH(SO2 )NR7 -、-OR8 -、-NHR8 -及-SR8 -； R6 係選自
    Figure 03_image031
    、
    Figure 03_image033
    、
    Figure 03_image035
    、
    Figure 03_image037
    、
    Figure 03_image039
    、
    Figure 03_image041
    、
    Figure 03_image043
    、
    Figure 03_image045
    、
    Figure 03_image047
    、
    Figure 03_image049
    、
    Figure 03_image051
    、
    Figure 03_image053
    、
    Figure 03_image055
    、
    Figure 03_image057
    、
    Figure 03_image059
    、
    Figure 03_image061
    、
    Figure 03_image063
    、
    Figure 03_image065
    、
    Figure 03_image067
    、
    Figure 03_image069
    、
    Figure 03_image071
    、
    Figure 03_image073
    、
    Figure 03_image075
    、
    Figure 03_image077
    、
    Figure 03_image079
    、
    Figure 03_image081
    、
    Figure 03_image083
    、
    Figure 03_image085
    、
    Figure 03_image087
    、
    Figure 03_image089
    、
    Figure 03_image091
    及
    Figure 03_image093
    ； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； E包含Fc域單體或Fc域； 各A1 -L-A2 中之L係共價附接至E中之鉸鏈半胱胺酸的硫原子且附接至A1 及A2 中每一者之連接體； T為1至20之整數，且 連接至E之波浪線指示各A1 -L-A2 共價附接至E中之鉸鏈半胱胺酸的硫原子， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  15. 一種由式(3)描述之結合物：
    Figure 03_image150
    (3) 其中各A1 及各A2 係獨立地選自式(A-VI)-(A-IX)中任一者：
    Figure 03_image015
    、
    Figure 03_image017
    、
    Figure 03_image019
    、
    Figure 03_image021
    ； (A-VI)                    (A-VII)              (A-VIII)                 (A-IX) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ； R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br； R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H； R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ； X係選自-O-及-S-； Y係選自-O-、-S-、-NR7 -、-O(C=O)NR7 -、-O(C=S)NR7 -、-O(C=O)O-、-O(C=O)-、-NH(C=O)O-、-NH(C=O)-、-NH(C=NH)-、-NH(C=O)NR7 -、-NH(C=NH)NR7 -、-NH(C=S)NR7 -、-NH(C=S)-、-OCH2 (C=O)NR7 -、-NH(SO2 )-、-NH(SO2 )NR7 -、-OR8 -、-NHR8 -及-SR8 -； R6 係選自
    Figure 03_image031
    、
    Figure 03_image033
    、
    Figure 03_image035
    、
    Figure 03_image037
    、
    Figure 03_image039
    、
    Figure 03_image041
    、
    Figure 03_image043
    、
    Figure 03_image045
    、
    Figure 03_image047
    、
    Figure 03_image049
    、
    Figure 03_image051
    、
    Figure 03_image053
    、
    Figure 03_image055
    、
    Figure 03_image057
    、
    Figure 03_image059
    、
    Figure 03_image061
    、
    Figure 03_image063
    、
    Figure 03_image065
    、
    Figure 03_image067
    、
    Figure 03_image069
    、
    Figure 03_image071
    、
    Figure 03_image073
    、
    Figure 03_image075
    、
    Figure 03_image077
    、
    Figure 03_image079
    、
    Figure 03_image081
    、
    Figure 03_image083
    、
    Figure 03_image085
    、
    Figure 03_image087
    、
    Figure 03_image089
    、
    Figure 03_image091
    及
    Figure 03_image093
    ； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； E包含Fc域單體或Fc域； 各A1 -L-A2 中之L係共價附接至E中之鉸鏈半胱胺酸的硫原子且附接至A1 及A2 中每一者之連接體； T為1至20之整數，且 連接至E之波浪線指示各A1 -L-A2 共價附接至E中之鉸鏈半胱胺酸的硫原子， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  16. 如申請專利範圍第13項至第15項中任一項之結合物，其中E包含Fc域單體或Fc域，各Fc域單體獨立地具有SEQ ID NO: 1-68中任一者之序列。
  17. 一種由式(4)描述之結合物：
    Figure 03_image2033
    (4) 其中各A1 係獨立地選自式(A-I)-(A-XII)中任一者：
    Figure 03_image005
    、
    Figure 03_image007
    、
    Figure 03_image009
    、
    Figure 03_image011
    、
    Figure 03_image013
    、 (A-I)                 (A-II)           (A-III)               (A-IV)                (A-V)
    Figure 03_image015
    、
    Figure 03_image017
    、
    Figure 03_image019
    、
    Figure 03_image021
    、 (A-VI)                    (A-VII)              (A-VIII)            (A-IX)
    Figure 03_image023
    、
    Figure 03_image025
    、
    Figure 03_image027
    ； (A-X)                   (A-XI)                         (A-XII) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ； R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br； R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H； R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ； X係選自-O-及-S-； Y係選自-O-、-S-、-NR7 -、-O(C=O)NR7 -、-O(C=S)NR7 -、-O(C=O)O-、-O(C=O)-、-NH(C=O)O-、-NH(C=O)-、-NH(C=NH)-、-NH(C=O)NR7 -、-NH(C=NH)NR7 -、-NH(C=S)NR7 -、-NH(C=S)-、-OCH2 (C=O)NR7 -、-NH(SO2 )-、-NH(SO2 )NR7 -、-OR8 -、-NHR8 -及-SR8 -； R6 係選自
    Figure 03_image031
    、
    Figure 03_image033
    、
    Figure 03_image035
    、
    Figure 03_image037
    、
    Figure 03_image039
    、
    Figure 03_image041
    、
    Figure 03_image043
    、
    Figure 03_image045
    、
    Figure 03_image047
    、
    Figure 03_image049
    、
    Figure 03_image051
    、
    Figure 03_image053
    、
    Figure 03_image055
    、
    Figure 03_image057
    、
    Figure 03_image059
    、
    Figure 03_image061
    、
    Figure 03_image063
    、
    Figure 03_image065
    、
    Figure 03_image067
    、
    Figure 03_image069
    、
    Figure 03_image071
    、
    Figure 03_image073
    、
    Figure 03_image075
    、
    Figure 03_image077
    、
    Figure 03_image079
    、
    Figure 03_image081
    、
    Figure 03_image083
    、
    Figure 03_image085
    、
    Figure 03_image087
    、
    Figure 03_image089
    、
    Figure 03_image091
    及
    Figure 03_image093
    ； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； E包含Fc域單體或Fc域； 各L-A中之L係共價附接至E中之鉸鏈半胱胺酸的硫原子且附接至A之連接體； T為1至20之整數；且 連接至E之波浪線指示各L-A共價附接至E中之該鉸鏈半胱胺酸的該硫原子， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  18. 一種由式(4)描述之結合物：
    Figure 03_image2033
    (4) 其中各A1 係獨立地選自式(A-I)-(A-V)中任一者：
    Figure 03_image005
    、
    Figure 03_image007
    、
    Figure 03_image009
    、
    Figure 03_image011
    、
    Figure 03_image013
    ； (A-I)               (A-II)                  (A-III)               (A-IV)                  (A-V) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ； R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br； R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H； R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ； X係選自-O-及-S-； Y係選自-O-、-S-、-NR7 -、-O(C=O)NR7 -、-O(C=S)NR7 -、-O(C=O)O-、-O(C=O)-、-NH(C=O)O-、-NH(C=O)-、-NH(C=NH)-、-NH(C=O)NR7 -、-NH(C=NH)NR7 -、-NH(C=S)NR7 -、-NH(C=S)-、-OCH2 (C=O)NR7 -、-NH(SO2 )-、-NH(SO2 )NR7 -、-OR8 -、-NHR8 -及-SR8 -； R6 係選自
    Figure 03_image031
    、
    Figure 03_image033
    、
    Figure 03_image035
    、
    Figure 03_image037
    、
    Figure 03_image039
    、
    Figure 03_image041
    、
    Figure 03_image043
    、
    Figure 03_image045
    、
    Figure 03_image047
    、
    Figure 03_image049
    、
    Figure 03_image051
    、
    Figure 03_image053
    、
    Figure 03_image055
    、
    Figure 03_image057
    、
    Figure 03_image059
    、
    Figure 03_image061
    、
    Figure 03_image063
    、
    Figure 03_image065
    、
    Figure 03_image067
    、
    Figure 03_image069
    、
    Figure 03_image071
    、
    Figure 03_image073
    、
    Figure 03_image075
    、
    Figure 03_image077
    、
    Figure 03_image079
    、
    Figure 03_image081
    、
    Figure 03_image083
    、
    Figure 03_image085
    、
    Figure 03_image087
    、
    Figure 03_image089
    、
    Figure 03_image091
    及
    Figure 03_image093
    ； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； E包含Fc域單體或Fc域； 各L-A中之L係共價附接至E中之鉸鏈半胱胺酸的硫原子且附接至A之連接體； T為1至20之整數；且 連接至E之波浪線指示各L-A共價附接至E中之該鉸鏈半胱胺酸的該硫原子， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  19. 一種由式(4)描述之結合物：
    Figure 03_image2033
    (4) 其中各A1 係獨立地選自式(A-VI)-(A-IX)中任一者：
    Figure 03_image015
    、
    Figure 03_image017
    、
    Figure 03_image019
    、
    Figure 03_image021
    ； (A-VI)                     (A-VII)                    (A-VIII)              (A-IX) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ； R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br； R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H； R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ； X係選自-O-及-S-； Y係選自-O-、-S-、-NR7 -、-O(C=O)NR7 -、-O(C=S)NR7 -、-O(C=O)O-、-O(C=O)-、-NH(C=O)O-、-NH(C=O)-、-NH(C=NH)-、-NH(C=O)NR7 -、-NH(C=NH)NR7 -、-NH(C=S)NR7 -、-NH(C=S)-、-OCH2 (C=O)NR7 -、-NH(SO2 )-、-NH(SO2 )NR7 -、-OR8 -、-NHR8 -及-SR8 -； R6 係選自
    Figure 03_image031
    、
    Figure 03_image033
    、
    Figure 03_image035
    、
    Figure 03_image037
    、
    Figure 03_image039
    、
    Figure 03_image041
    、
    Figure 03_image043
    、
    Figure 03_image045
    、
    Figure 03_image047
    、
    Figure 03_image049
    、
    Figure 03_image051
    、
    Figure 03_image053
    、
    Figure 03_image055
    、
    Figure 03_image057
    、
    Figure 03_image059
    、
    Figure 03_image061
    、
    Figure 03_image063
    、
    Figure 03_image065
    、
    Figure 03_image067
    、
    Figure 03_image069
    、
    Figure 03_image071
    、
    Figure 03_image073
    、
    Figure 03_image075
    、
    Figure 03_image077
    、
    Figure 03_image079
    、
    Figure 03_image081
    、
    Figure 03_image083
    、
    Figure 03_image085
    、
    Figure 03_image087
    、
    Figure 03_image089
    、
    Figure 03_image091
    及
    Figure 03_image093
    ； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； E包含Fc域單體或Fc域； 各L-A中之L係共價附接至E中之鉸鏈半胱胺酸的硫原子且附接至A之連接體； T為1至20之整數；且 連接至E之波浪線指示各L-A共價附接至E中之該鉸鏈半胱胺酸的該硫原子， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  20. 如申請專利範圍第17項至第19項中任一項之結合物，其中各E包含Fc域單體或Fc域，各Fc域單體獨立地具有SEQ ID NO: 1-68中任一者之序列。
  21. 如申請專利範圍第13項至第20項中任一項之結合物，其中E包含SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之序列。
  22. 如申請專利範圍第21項之結合物，其中該硫原子係在SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Cys10、Cys13、Cys16或Cys18中。
  23. 如申請專利範圍第13項至第20項中任一項之結合物，其中T為1、2、3、4或5。
  24. 一種如申請專利範圍第13項至第15項或第17項至第19項中任一項之結合物之群體，其中T之平均值為1至5。
  25. 一種如申請專利範圍第13項至第15項或第17項至第19項中任一項之結合物之群體，其中T之平均值為1至2。
  26. 一種由式(3)描述之結合物：
    Figure 03_image150
    (3) 其中各A1 及各A2 係獨立地選自式(A-I)-(A-XII)中任一者：
    Figure 03_image005
    、
    Figure 03_image007
    、
    Figure 03_image009
    、
    Figure 03_image011
    、
    Figure 03_image013
    、 (A-I)                  (A-II)                  (A-III)                (A-IV)                 (A-V)
    Figure 03_image015
    、
    Figure 03_image017
    、
    Figure 03_image019
    、
    Figure 03_image021
    、 (A-VI)           (A-VII)                      (A-VIII)              (A-IX)
    Figure 03_image023
    、
    Figure 03_image025
    、
    Figure 03_image027
    ； (A-X)                 (A-XI)                          (A-XII) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ； R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br； R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H； R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ； X係選自-O-及-S-； Y係選自-O-、-S-、-NR7 -、-O(C=O)NR7 -、-O(C=S)NR7 -、-O(C=O)O-、-O(C=O)-、-NH(C=O)O-、-NH(C=O)-、-NH(C=NH)-、-NH(C=O)NR7 -、-NH(C=NH)NR7 -、-NH(C=S)NR7 -、-NH(C=S)-、-OCH2 (C=O)NR7 -、-NH(SO2 )-、-NH(SO2 )NR7 -、-OR8 -、-NHR8 -及-SR8 -； R6 係選自
    Figure 03_image031
    、
    Figure 03_image033
    、
    Figure 03_image035
    、
    Figure 03_image037
    、
    Figure 03_image039
    、
    Figure 03_image041
    、
    Figure 03_image043
    、
    Figure 03_image045
    、
    Figure 03_image047
    、
    Figure 03_image049
    、
    Figure 03_image051
    、
    Figure 03_image053
    、
    Figure 03_image055
    、
    Figure 03_image057
    、
    Figure 03_image059
    、
    Figure 03_image061
    、
    Figure 03_image063
    、
    Figure 03_image065
    、
    Figure 03_image067
    、
    Figure 03_image069
    、
    Figure 03_image071
    、
    Figure 03_image073
    、
    Figure 03_image075
    、
    Figure 03_image077
    、
    Figure 03_image079
    、
    Figure 03_image081
    、
    Figure 03_image083
    、
    Figure 03_image085
    、
    Figure 03_image087
    、
    Figure 03_image089
    、
    Figure 03_image091
    及
    Figure 03_image093
    ； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； E包含Fc域單體或Fc域； 各A1 -L-A2 中之L係共價附接至E中之表面暴露離胺酸的氮原子且附接至A1 及A2 中每一者之連接體； T為1至20之整數，且 連接至E之波浪線指示各A1 -L-A2 共價附接至E中之表面暴露離胺酸的氮原子， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  27. 一種由式(3)描述之結合物：
    Figure 03_image150
    (3) 其中各A1 及各A2 係獨立地選自式(A-I)-(A-V)中任一者：
    Figure 03_image005
    、
    Figure 03_image007
    、
    Figure 03_image009
    、
    Figure 03_image011
    、
    Figure 03_image013
    ； (A-I)                    (A-II)           (A-III)               (A-IV)                (A-V) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ； R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br； R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H； R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ； X係選自-O-及-S-； Y係選自-O-、-S-、-NR7 -、-O(C=O)NR7 -、-O(C=S)NR7 -、-O(C=O)O-、-O(C=O)-、-NH(C=O)O-、-NH(C=O)-、-NH(C=NH)-、-NH(C=O)NR7 -、-NH(C=NH)NR7 -、-NH(C=S)NR7 -、-NH(C=S)-、-OCH2 (C=O)NR7 -、-NH(SO2 )-、-NH(SO2 )NR7 -、-OR8 -、-NHR8 -及-SR8 -； R6 係選自
    Figure 03_image031
    、
    Figure 03_image033
    、
    Figure 03_image035
    、
    Figure 03_image037
    、
    Figure 03_image039
    、
    Figure 03_image041
    、
    Figure 03_image043
    、
    Figure 03_image045
    、
    Figure 03_image047
    、
    Figure 03_image049
    、
    Figure 03_image051
    、
    Figure 03_image053
    、
    Figure 03_image055
    、
    Figure 03_image057
    、
    Figure 03_image059
    、
    Figure 03_image061
    、
    Figure 03_image063
    、
    Figure 03_image065
    、
    Figure 03_image067
    、
    Figure 03_image069
    、
    Figure 03_image071
    、
    Figure 03_image073
    、
    Figure 03_image075
    、
    Figure 03_image077
    、
    Figure 03_image079
    、
    Figure 03_image081
    、
    Figure 03_image083
    、
    Figure 03_image085
    、
    Figure 03_image087
    、
    Figure 03_image089
    、
    Figure 03_image091
    及
    Figure 03_image093
    ； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； E包含Fc域單體或Fc域； 各A1 -L-A2 中之L係共價附接至E中之表面暴露離胺酸的氮原子且附接至A1 及A2 中每一者之連接體； T為1至20之整數，且 連接至E之波浪線指示各A1 -L-A2 共價附接至E中之表面暴露離胺酸的氮原子， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  28. 一種由式(3)描述之結合物：
    Figure 03_image150
    (3) 其中各A1 及各A2 係獨立地選自式(A-VI)-(A-IX)中任一者：
    Figure 03_image015
    、
    Figure 03_image017
    、
    Figure 03_image019
    、
    Figure 03_image021
    ； (A-VI)                        (A-VII)                 (A-VIII)             (A-IX) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ； R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br； R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H； R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ； X係選自-O-及-S-； Y係選自-O-、-S-、-NR7 -、-O(C=O)NR7 -、-O(C=S)NR7 -、-O(C=O)O-、-O(C=O)-、-NH(C=O)O-、-NH(C=O)-、-NH(C=NH)-、-NH(C=O)NR7 -、-NH(C=NH)NR7 -、-NH(C=S)NR7 -、-NH(C=S)-、-OCH2 (C=O)NR7 -、-NH(SO2 )-、-NH(SO2 )NR7 -、-OR8 -、-NHR8 -及-SR8 -； R6 係選自
    Figure 03_image031
    、
    Figure 03_image033
    、
    Figure 03_image035
    、
    Figure 03_image037
    、
    Figure 03_image039
    、
    Figure 03_image041
    、
    Figure 03_image043
    、
    Figure 03_image045
    、
    Figure 03_image047
    、
    Figure 03_image049
    、
    Figure 03_image051
    、
    Figure 03_image053
    、
    Figure 03_image055
    、
    Figure 03_image057
    、
    Figure 03_image059
    、
    Figure 03_image061
    、
    Figure 03_image063
    、
    Figure 03_image065
    、
    Figure 03_image067
    、
    Figure 03_image069
    、
    Figure 03_image071
    、
    Figure 03_image073
    、
    Figure 03_image075
    、
    Figure 03_image077
    、
    Figure 03_image079
    、
    Figure 03_image081
    、
    Figure 03_image083
    、
    Figure 03_image085
    、
    Figure 03_image087
    、
    Figure 03_image089
    、
    Figure 03_image091
    及
    Figure 03_image093
    ； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； E包含Fc域單體或Fc域； 各A1 -L-A2 中之L係共價附接至E中之表面暴露離胺酸的氮原子且附接至A1 及A2 中每一者之連接體； T為1至20之整數，且 連接至E之波浪線指示各A1 -L-A2 共價附接至E中之表面暴露離胺酸的氮原子， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  29. 如申請專利範圍第26項至第28項中任一項之結合物，其中各E包含Fc域單體或Fc域，各Fc域單體獨立地具有SEQ ID NO: 1-68中任一者之序列。
  30. 一種由式(4)描述之結合物：
    Figure 03_image2046
    (4) 其中各A1 係獨立地選自式(A-I)-(A-XII)中任一者：
    Figure 03_image005
    、
    Figure 03_image007
    、
    Figure 03_image009
    、
    Figure 03_image011
    、
    Figure 03_image013
    、 (A-I)                  (A-II)                    (A-III)                (A-IV)                (A-V)
    Figure 03_image015
    、
    Figure 03_image017
    、
    Figure 03_image019
    、
    Figure 03_image021
    、 (A-VI)                    (A-VII)               (A-VIII)                 (A-IX)
    Figure 03_image023
    、
    Figure 03_image025
    、
    Figure 03_image027
    ； (A-X)                  (A-XI)                          (A-XII) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ； R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br； R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H； R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ； X係選自-O-及-S-； Y係選自-O-、-S-、-NR7 -、-O(C=O)NR7 -、-O(C=S)NR7 -、-O(C=O)O-、-O(C=O)-、-NH(C=O)O-、-NH(C=O)-、-NH(C=NH)-、-NH(C=O)NR7 -、-NH(C=NH)NR7 -、-NH(C=S)NR7 -、-NH(C=S)-、-OCH2 (C=O)NR7 -、-NH(SO2 )-、-NH(SO2 )NR7 -、-OR8 -、-NHR8 -及-SR8 -； R6 係選自
    Figure 03_image031
    、
    Figure 03_image033
    、
    Figure 03_image035
    、
    Figure 03_image037
    、
    Figure 03_image039
    、
    Figure 03_image041
    、
    Figure 03_image043
    、
    Figure 03_image045
    、
    Figure 03_image047
    、
    Figure 03_image049
    、
    Figure 03_image051
    、
    Figure 03_image053
    、
    Figure 03_image055
    、
    Figure 03_image057
    、
    Figure 03_image059
    、
    Figure 03_image061
    、
    Figure 03_image063
    、
    Figure 03_image065
    、
    Figure 03_image067
    、
    Figure 03_image069
    、
    Figure 03_image071
    、
    Figure 03_image073
    、
    Figure 03_image075
    、
    Figure 03_image077
    、
    Figure 03_image079
    、
    Figure 03_image081
    、
    Figure 03_image083
    、
    Figure 03_image085
    、
    Figure 03_image087
    、
    Figure 03_image089
    、
    Figure 03_image091
    及
    Figure 03_image093
    ； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； E包含Fc域單體或Fc域； 各L-A中之L係共價附接至E中之表面暴露離胺酸的氮原子且附接至A之連接體； T為1至20之整數， 連接至E之波浪線指示各L-A共價附接至E中之表面暴露離胺酸的氮原子， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  31. 一種由式(4)描述之結合物：
    Figure 03_image2046
    (4) 其中各A1 係獨立地選自式(A-I)-(A-V)中任一者：
    Figure 03_image005
    、
    Figure 03_image007
    、
    Figure 03_image009
    、
    Figure 03_image011
    、
    Figure 03_image013
    ； (A-I)               (A-II)              (A-III)              (A-IV)               (A-V) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ； R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br； R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H； R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ； X係選自-O-及-S-； Y係選自-O-、-S-、-NR7 -、-O(C=O)NR7 -、-O(C=S)NR7 -、-O(C=O)O-、-O(C=O)-、-NH(C=O)O-、-NH(C=O)-、-NH(C=NH)-、-NH(C=O)NR7 -、-NH(C=NH)NR7 -、-NH(C=S)NR7 -、-NH(C=S)-、-OCH2 (C=O)NR7 -、-NH(SO2 )-、-NH(SO2 )NR7 -、-OR8 -、-NHR8 -及-SR8 -； R6 係選自
    Figure 03_image031
    、
    Figure 03_image033
    、
    Figure 03_image035
    、
    Figure 03_image037
    、
    Figure 03_image039
    、
    Figure 03_image041
    、
    Figure 03_image043
    、
    Figure 03_image045
    、
    Figure 03_image047
    、
    Figure 03_image049
    、
    Figure 03_image051
    、
    Figure 03_image053
    、
    Figure 03_image055
    、
    Figure 03_image057
    、
    Figure 03_image059
    、
    Figure 03_image061
    、
    Figure 03_image063
    、
    Figure 03_image065
    、
    Figure 03_image067
    、
    Figure 03_image069
    、
    Figure 03_image071
    、
    Figure 03_image073
    、
    Figure 03_image075
    、
    Figure 03_image077
    、
    Figure 03_image079
    、
    Figure 03_image081
    、
    Figure 03_image083
    、
    Figure 03_image085
    、
    Figure 03_image087
    、
    Figure 03_image089
    、
    Figure 03_image091
    及
    Figure 03_image093
    ； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； E包含Fc域單體或Fc域； 各L-A中之L係共價附接至E中之表面暴露離胺酸的氮原子且附接至A之連接體； T為1至20之整數， 連接至E之波浪線指示各L-A共價附接至E中之表面暴露離胺酸的氮原子， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  32. 一種由式(4)描述之結合物：
    Figure 03_image2046
    (4) 其中各A1 係獨立地選自式(A-VI)-(A-IX)中任一者：
    Figure 03_image015
    、
    Figure 03_image017
    、
    Figure 03_image019
    、
    Figure 03_image021
    ； (A-VI)                    (A-VII)               (A-VIII)               (A-IX) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ； R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br； R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H； R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ； X係選自-O-及-S-； Y係選自-O-、-S-、-NR7 -、-O(C=O)NR7 -、-O(C=S)NR7 -、-O(C=O)O-、-O(C=O)-、-NH(C=O)O-、-NH(C=O)-、-NH(C=NH)-、-NH(C=O)NR7 -、-NH(C=NH)NR7 -、-NH(C=S)NR7 -、-NH(C=S)-、-OCH2 (C=O)NR7 -、-NH(SO2 )-、-NH(SO2 )NR7 -、-OR8 -、-NHR8 -及-SR8 -； R6 係選自
    Figure 03_image031
    、
    Figure 03_image033
    、
    Figure 03_image035
    、
    Figure 03_image037
    、
    Figure 03_image039
    、
    Figure 03_image041
    、
    Figure 03_image043
    、
    Figure 03_image045
    、
    Figure 03_image047
    、
    Figure 03_image049
    、
    Figure 03_image051
    、
    Figure 03_image053
    、
    Figure 03_image055
    、
    Figure 03_image057
    、
    Figure 03_image059
    、
    Figure 03_image061
    、
    Figure 03_image063
    、
    Figure 03_image065
    、
    Figure 03_image067
    、
    Figure 03_image069
    、
    Figure 03_image071
    、
    Figure 03_image073
    、
    Figure 03_image075
    、
    Figure 03_image077
    、
    Figure 03_image079
    、
    Figure 03_image081
    、
    Figure 03_image083
    、
    Figure 03_image085
    、
    Figure 03_image087
    、
    Figure 03_image089
    、
    Figure 03_image091
    及
    Figure 03_image093
    ； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； E包含Fc域單體或Fc域； 各L-A中之L係共價附接至E中之表面暴露離胺酸的氮原子且附接至A之連接體； T為1至20之整數， 連接至E之波浪線指示各L-A共價附接至E中之表面暴露離胺酸的氮原子， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  33. 如申請專利範圍第30項至第32項中任一項之結合物，其中各E包含Fc域單體或Fc域，各Fc域單體獨立地具有SEQ ID NO: 1-68中任一者之序列。
  34. 如申請專利範圍第26項至第33項中任一項之結合物，其中E包含SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之序列。
  35. 如申請專利範圍第34項之結合物，其中各氮原子係獨立地選自SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之Lys35、Lys63、Lys77、Lys79、Lys106、Lys123、Lys129、Lys181、Lys203、Lys228及Lys236。
  36. 一種如申請專利範圍第26項至第28項或第30項至第32項中任一項之結合物之群體，其中T之平均值為1至5。
  37. 一種如申請專利範圍第26項至第28項或第30項至第32項中任一項之結合物之群體，其中T之平均值為1至2。
  38. 如申請專利範圍第1項至第37項中任一項之結合物，其中該結合物形成包含Fc域之均二聚體。
  39. 如申請專利範圍第1項至第38項中任一項之結合物，其中E與另一E均二聚以形成Fc域。
  40. 一種由式(3)描述之結合物：
    Figure 03_image150
    (3) 其中各A1 及各A2 係獨立地選自式(A-I)-(A-XII)中任一者：
    Figure 03_image005
    、
    Figure 03_image007
    、
    Figure 03_image009
    、
    Figure 03_image011
    、
    Figure 03_image013
    、 (A-I)               (A-II)                    (A-III)                (A-IV)                (A-V)
    Figure 03_image015
    、
    Figure 03_image017
    、
    Figure 03_image019
    、
    Figure 03_image021
    、 (A-VI)                       (A-VII)               (A-VIII)             (A-IX)
    Figure 03_image023
    、
    Figure 03_image025
    、
    Figure 03_image027
    ； (A-X)                      (A-XI)                      (A-XII) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ； R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br； R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H； R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ； X係選自-O-及-S-； Y係選自-O-、-S-、-NR7 -、-O(C=O)NR7 -、-O(C=S)NR7 -、-O(C=O)O-、-O(C=O)-、-NH(C=O)O-、-NH(C=O)-、-NH(C=NH)-、-NH(C=O)NR7 -、-NH(C=NH)NR7 -、-NH(C=S)NR7 -、-NH(C=S)-、-OCH2 (C=O)NR7 -、-NH(SO2 )-、-NH(SO2 )NR7 -、-OR8 -、-NHR8 -及-SR8 -； R6 係選自
    Figure 03_image031
    、
    Figure 03_image033
    、
    Figure 03_image035
    、
    Figure 03_image037
    、
    Figure 03_image039
    、
    Figure 03_image041
    、
    Figure 03_image043
    、
    Figure 03_image045
    、
    Figure 03_image047
    、
    Figure 03_image049
    、
    Figure 03_image051
    、
    Figure 03_image053
    、
    Figure 03_image055
    、
    Figure 03_image057
    、
    Figure 03_image059
    、
    Figure 03_image061
    、
    Figure 03_image063
    、
    Figure 03_image065
    、
    Figure 03_image067
    、
    Figure 03_image069
    、
    Figure 03_image071
    、
    Figure 03_image073
    、
    Figure 03_image075
    、
    Figure 03_image077
    、
    Figure 03_image079
    、
    Figure 03_image081
    、
    Figure 03_image083
    、
    Figure 03_image085
    、
    Figure 03_image087
    、
    Figure 03_image089
    、
    Figure 03_image091
    及
    Figure 03_image093
    ； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； E包含白蛋白、白蛋白結合肽或Fc結合肽； 各A1 -L-A2 中之L係獨立地共價附接至E中之表面暴露半胱胺酸的硫原子或表面暴露離胺酸的氮原子且附接至A1 及A2 中每一者之連接體； T為1至20之整數，且 連接至E之波浪線指示各A1 -L-A2 獨立地共價附接至E中之溶劑暴露半胱胺酸的硫原子或溶劑暴露離胺酸的氮原子， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  41. 一種由式(3)描述之結合物：
    Figure 03_image150
    (3) 其中各A1 及各A2 係獨立地選自式(A-I)-(A-V)中任一者：
    Figure 03_image005
    、
    Figure 03_image007
    、
    Figure 03_image009
    、
    Figure 03_image011
    、
    Figure 03_image013
    ； (A-I)                   (A-II)                (A-III)            (A-IV)              (A-V) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ； R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br； R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H； R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ； X係選自-O-及-S-； Y係選自-O-、-S-、-NR7 -、-O(C=O)NR7 -、-O(C=S)NR7 -、-O(C=O)O-、-O(C=O)-、-NH(C=O)O-、-NH(C=O)-、-NH(C=NH)-、-NH(C=O)NR7 -、-NH(C=NH)NR7 -、-NH(C=S)NR7 -、-NH(C=S)-、-OCH2 (C=O)NR7 -、-NH(SO2 )-、-NH(SO2 )NR7 -、-OR8 -、-NHR8 -及-SR8 -； R6 係選自
    Figure 03_image031
    、
    Figure 03_image033
    、
    Figure 03_image035
    、
    Figure 03_image037
    、
    Figure 03_image039
    、
    Figure 03_image041
    、
    Figure 03_image043
    、
    Figure 03_image045
    、
    Figure 03_image047
    、
    Figure 03_image049
    、
    Figure 03_image051
    、
    Figure 03_image053
    、
    Figure 03_image055
    、
    Figure 03_image057
    、
    Figure 03_image059
    、
    Figure 03_image061
    、
    Figure 03_image063
    、
    Figure 03_image065
    、
    Figure 03_image067
    、
    Figure 03_image069
    、
    Figure 03_image071
    、
    Figure 03_image073
    、
    Figure 03_image075
    、
    Figure 03_image077
    、
    Figure 03_image079
    、
    Figure 03_image081
    、
    Figure 03_image083
    、
    Figure 03_image085
    、
    Figure 03_image087
    、
    Figure 03_image089
    、
    Figure 03_image091
    及
    Figure 03_image093
    ； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； E包含白蛋白、白蛋白結合肽或Fc結合肽； 各A1 -L-A2 中之L係獨立地共價附接至E中之表面暴露半胱胺酸的硫原子或表面暴露離胺酸的氮原子且附接至A1 及A2 中每一者之連接體； T為1至20之整數，且 連接至E之波浪線指示各A1 -L-A2 獨立地共價附接至E中之溶劑暴露半胱胺酸的硫原子或溶劑暴露離胺酸的氮原子， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  42. 一種由式(3)描述之結合物：
    Figure 03_image150
    (3) 其中各A1 及各A2 係獨立地選自式(A-VI)-(A-IX)中任一者：
    Figure 03_image015
    、
    Figure 03_image017
    、
    Figure 03_image019
    、
    Figure 03_image021
    ； (A-VI)                    (A-VII)                (A-VIII)               (A-IX) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ； R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br； R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H； R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ； X係選自-O-及-S-； Y係選自-O-、-S-、-NR7 -、-O(C=O)NR7 -、-O(C=S)NR7 -、-O(C=O)O-、-O(C=O)-、-NH(C=O)O-、-NH(C=O)-、-NH(C=NH)-、-NH(C=O)NR7 -、-NH(C=NH)NR7 -、-NH(C=S)NR7 -、-NH(C=S)-、-OCH2 (C=O)NR7 -、-NH(SO2 )-、-NH(SO2 )NR7 -、-OR8 -、-NHR8 -及-SR8 -； R6 係選自
    Figure 03_image031
    、
    Figure 03_image033
    、
    Figure 03_image035
    、
    Figure 03_image037
    、
    Figure 03_image039
    、
    Figure 03_image041
    、
    Figure 03_image043
    、
    Figure 03_image045
    、
    Figure 03_image047
    、
    Figure 03_image049
    、
    Figure 03_image051
    、
    Figure 03_image053
    、
    Figure 03_image055
    、
    Figure 03_image057
    、
    Figure 03_image059
    、
    Figure 03_image061
    、
    Figure 03_image063
    、
    Figure 03_image065
    、
    Figure 03_image067
    、
    Figure 03_image069
    、
    Figure 03_image071
    、
    Figure 03_image073
    、
    Figure 03_image075
    、
    Figure 03_image077
    、
    Figure 03_image079
    、
    Figure 03_image081
    、
    Figure 03_image083
    、
    Figure 03_image085
    、
    Figure 03_image087
    、
    Figure 03_image089
    、
    Figure 03_image091
    及
    Figure 03_image093
    ； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； E包含白蛋白、白蛋白結合肽或Fc結合肽； 各A1 -L-A2 中之L係獨立地共價附接至E中之表面暴露半胱胺酸的硫原子或表面暴露離胺酸的氮原子且附接至A1 及A2 中每一者之連接體； T為1至20之整數，且 連接至E之波浪線指示各A1 -L-A2 獨立地共價附接至E中之溶劑暴露半胱胺酸的硫原子或溶劑暴露離胺酸的氮原子， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  43. 一種由式(4)描述之結合物：
    Figure 03_image2071
    (4) 其中各A1 係獨立地選自式(A-I)-(A-XII)中任一者：
    Figure 03_image005
    、
    Figure 03_image007
    、
    Figure 03_image009
    、
    Figure 03_image011
    、
    Figure 03_image013
    、 (A-I)                    (A-II)               (A-III)            (A-IV)                (A-V)
    Figure 03_image015
    、
    Figure 03_image017
    、
    Figure 03_image019
    、
    Figure 03_image021
    、 (A-VI)                    (A-VII)                (A-VIII)              (A-IX)
    Figure 03_image023
    、
    Figure 03_image025
    、
    Figure 03_image027
    ； (A-X)                  (A-XI)                      (A-XII) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ； R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br； R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H； R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ； X係選自-O-及-S-； Y係選自-O-、-S-、-NR7 -、-O(C=O)NR7 -、-O(C=S)NR7 -、-O(C=O)O-、-O(C=O)-、-NH(C=O)O-、-NH(C=O)-、-NH(C=NH)-、-NH(C=O)NR7 -、-NH(C=NH)NR7 -、-NH(C=S)NR7 -、-NH(C=S)-、-OCH2 (C=O)NR7 -、-NH(SO2 )-、-NH(SO2 )NR7 -、-OR8 -、-NHR8 -及-SR8 -； R6 係選自
    Figure 03_image031
    、
    Figure 03_image033
    、
    Figure 03_image035
    、
    Figure 03_image037
    、
    Figure 03_image039
    、
    Figure 03_image041
    、
    Figure 03_image043
    、
    Figure 03_image045
    、
    Figure 03_image047
    、
    Figure 03_image049
    、
    Figure 03_image051
    、
    Figure 03_image053
    、
    Figure 03_image055
    、
    Figure 03_image057
    、
    Figure 03_image059
    、
    Figure 03_image061
    、
    Figure 03_image063
    、
    Figure 03_image065
    、
    Figure 03_image067
    、
    Figure 03_image069
    、
    Figure 03_image071
    、
    Figure 03_image073
    、
    Figure 03_image075
    、
    Figure 03_image077
    、
    Figure 03_image079
    、
    Figure 03_image081
    、
    Figure 03_image083
    、
    Figure 03_image085
    、
    Figure 03_image087
    、
    Figure 03_image089
    、
    Figure 03_image091
    及
    Figure 03_image093
    ； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； E包含白蛋白、白蛋白結合肽或Fc結合肽； 各L-A中之L係獨立地共價附接至E中之表面暴露半胱胺酸的硫原子或表面暴露離胺酸的氮原子且附接至A之連接體； T為1至20之整數；且 連接至E之波浪線指示各L-A獨立地共價附接至E中之溶劑暴露半胱胺酸的該硫原子或溶劑暴露離胺酸的該氮原子， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  44. 一種由式(4)描述之結合物：
    Figure 03_image2071
    (4) 其中各A1 係獨立地選自式(A-I)-(A-V)中任一者：
    Figure 03_image005
    、
    Figure 03_image007
    、
    Figure 03_image009
    、
    Figure 03_image011
    、
    Figure 03_image013
    ； (A-I)                    (A-II)               (A-III)            (A-IV)              (A-V) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ； R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br； R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H； R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ； X係選自-O-及-S-； Y係選自-O-、-S-、-NR7 -、-O(C=O)NR7 -、-O(C=S)NR7 -、-O(C=O)O-、-O(C=O)-、-NH(C=O)O-、-NH(C=O)-、-NH(C=NH)-、-NH(C=O)NR7 -、-NH(C=NH)NR7 -、-NH(C=S)NR7 -、-NH(C=S)-、-OCH2 (C=O)NR7 -、-NH(SO2 )-、-NH(SO2 )NR7 -、-OR8 -、-NHR8 -及-SR8 -； R6 係選自
    Figure 03_image031
    、
    Figure 03_image033
    、
    Figure 03_image035
    、
    Figure 03_image037
    、
    Figure 03_image039
    、
    Figure 03_image041
    、
    Figure 03_image043
    、
    Figure 03_image045
    、
    Figure 03_image047
    、
    Figure 03_image049
    、
    Figure 03_image051
    、
    Figure 03_image053
    、
    Figure 03_image055
    、
    Figure 03_image057
    、
    Figure 03_image059
    、
    Figure 03_image061
    、
    Figure 03_image063
    、
    Figure 03_image065
    、
    Figure 03_image067
    、
    Figure 03_image069
    、
    Figure 03_image071
    、
    Figure 03_image073
    、
    Figure 03_image075
    、
    Figure 03_image077
    、
    Figure 03_image079
    、
    Figure 03_image081
    、
    Figure 03_image083
    、
    Figure 03_image085
    、
    Figure 03_image087
    、
    Figure 03_image089
    、
    Figure 03_image091
    及
    Figure 03_image093
    ； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； E包含白蛋白、白蛋白結合肽或Fc結合肽； 各L-A中之L係獨立地共價附接至E中之表面暴露半胱胺酸的硫原子或表面暴露離胺酸的氮原子且附接至A之連接體； T為1至20之整數；且 連接至E之波浪線指示各L-A獨立地共價附接至E中之溶劑暴露半胱胺酸的該硫原子或溶劑暴露離胺酸的該氮原子， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  45. 一種由式(4)描述之結合物：
    Figure 03_image2071
    (4) 其中各A1 係獨立地選自式(A-VI)-(A-IX)中任一者：
    Figure 03_image015
    、
    Figure 03_image017
    、
    Figure 03_image019
    、
    Figure 03_image021
    ； (A-VI)                   (A-VII)                 (A-VIII)           (A-IX) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ； R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br； R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H； R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ； X係選自-O-及-S-； Y係選自-O-、-S-、-NR7 -、-O(C=O)NR7 -、-O(C=S)NR7 -、-O(C=O)O-、-O(C=O)-、-NH(C=O)O-、-NH(C=O)-、-NH(C=NH)-、-NH(C=O)NR7 -、-NH(C=NH)NR7 -、-NH(C=S)NR7 -、-NH(C=S)-、-OCH2 (C=O)NR7 -、-NH(SO2 )-、-NH(SO2 )NR7 -、-OR8 -、-NHR8 -及-SR8 -； R6 係選自
    Figure 03_image031
    、
    Figure 03_image033
    、
    Figure 03_image035
    、
    Figure 03_image037
    、
    Figure 03_image039
    、
    Figure 03_image041
    、
    Figure 03_image043
    、
    Figure 03_image045
    、
    Figure 03_image047
    、
    Figure 03_image049
    、
    Figure 03_image051
    、
    Figure 03_image053
    、
    Figure 03_image055
    、
    Figure 03_image057
    、
    Figure 03_image059
    、
    Figure 03_image061
    、
    Figure 03_image063
    、
    Figure 03_image065
    、
    Figure 03_image067
    、
    Figure 03_image069
    、
    Figure 03_image071
    、
    Figure 03_image073
    、
    Figure 03_image075
    、
    Figure 03_image077
    、
    Figure 03_image079
    、
    Figure 03_image081
    、
    Figure 03_image083
    、
    Figure 03_image085
    、
    Figure 03_image087
    、
    Figure 03_image089
    、
    Figure 03_image091
    及
    Figure 03_image093
    ； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； E包含白蛋白、白蛋白結合肽或Fc結合肽； 各L-A中之L係獨立地共價附接至E中之表面暴露半胱胺酸的硫原子或表面暴露離胺酸的氮原子且附接至A之連接體； T為1至20之整數；且 連接至E之波浪線指示各L-A獨立地共價附接至E中之溶劑暴露半胱胺酸的該硫原子或溶劑暴露離胺酸的該氮原子， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  46. 如申請專利範圍第40項至第45項中任一項之結合物，其中E包含SEQ ID NO: 69-71中任一者之序列。
  47. 如申請專利範圍第46項之結合物，其中T為1，且L-A共價附接至對應於SEQ ID NO: 69之Cys34之硫原子。
  48. 如申請專利範圍第40項至第47項中任一項之結合物，其中T為1、2、3、4或5。
  49. 一種如申請專利範圍第40項至第45項中任一項之結合物之群體，其中T之平均值為1至5。
  50. 一種如申請專利範圍第40項至第45項中任一項之結合物之群體，其中T之平均值為1至2。
  51. 一種結合物，其包含 (i) 第一部分A1 ； (ii) 第二部分A2 ； (iii) Fc域單體或Fc域；及 (iv)共價附接至A1 及A2 且附接至該Fc域單體或該Fc域之連接體； 其中各A1 及各A2 係獨立地選自式(A-I)-(A-XII)中任一者：
    Figure 03_image005
    、
    Figure 03_image007
    、
    Figure 03_image009
    、
    Figure 03_image011
    、
    Figure 03_image013
    、 (A-I)                    (A-II)             (A-III)                (A-IV)            (A-V)
    Figure 03_image015
    、
    Figure 03_image017
    、
    Figure 03_image019
    、
    Figure 03_image021
    、 (A-VI)                    (A-VII)                 (A-VIII)                 (A-IX)
    Figure 03_image023
    、
    Figure 03_image025
    、
    Figure 03_image027
    ； (A-X)                  (A-XI)                       (A-XII) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ； R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br； R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H； R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ； X係選自-O-及-S-； Y係選自-O-、-S-、-NR7 -、-O(C=O)NR7 -、-O(C=S)NR7 -、-O(C=O)O-、-O(C=O)-、-NH(C=O)O-、-NH(C=O)-、-NH(C=NH)-、-NH(C=O)NR7 -、-NH(C=NH)NR7 -、-NH(C=S)NR7 -、-NH(C=S)-、-OCH2 (C=O)NR7 -、-NH(SO2 )-、-NH(SO2 )NR7 -、-OR8 -、-NHR8 -及-SR8 -； R6 係選自
    Figure 03_image031
    、
    Figure 03_image033
    、
    Figure 03_image035
    、
    Figure 03_image037
    、
    Figure 03_image039
    、
    Figure 03_image041
    、
    Figure 03_image043
    、
    Figure 03_image045
    、
    Figure 03_image047
    、
    Figure 03_image049
    、
    Figure 03_image051
    、
    Figure 03_image053
    、
    Figure 03_image055
    、
    Figure 03_image057
    、
    Figure 03_image059
    、
    Figure 03_image061
    、
    Figure 03_image063
    、
    Figure 03_image065
    、
    Figure 03_image067
    、
    Figure 03_image069
    、
    Figure 03_image071
    、
    Figure 03_image073
    、
    Figure 03_image075
    、
    Figure 03_image077
    、
    Figure 03_image079
    、
    Figure 03_image081
    、
    Figure 03_image083
    、
    Figure 03_image085
    、
    Figure 03_image087
    、
    Figure 03_image089
    、
    Figure 03_image091
    及
    Figure 03_image093
    ； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  52. 一種結合物，其包含 (i) 第一部分A1 ； (ii) 第二部分A2 ； (iii) Fc域單體或Fc域；及 (iv) 共價附接至A1 及A2 且附接至該Fc域單體或該Fc域之連接體； 其中各A1 及各A2 係獨立地選自式(A-I)-(A-V)中任一者：
    Figure 03_image005
    、
    Figure 03_image007
    、
    Figure 03_image009
    、
    Figure 03_image011
    、
    Figure 03_image013
    ； (A-I)              (A-II)                      (A-III)                       (A-IV)               (A-V) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ； R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br； R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H； R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ； X係選自-O-及-S-； Y係選自-O-、-S-、-NR7 -、-O(C=O)NR7 -、-O(C=S)NR7 -、-O(C=O)O-、-O(C=O)-、-NH(C=O)O-、-NH(C=O)-、-NH(C=NH)-、-NH(C=O)NR7 -、-NH(C=NH)NR7 -、-NH(C=S)NR7 -、-NH(C=S)-、-OCH2 (C=O)NR7 -、-NH(SO2 )-、-NH(SO2 )NR7 -、-OR8 -、-NHR8 -及-SR8 -； R6 係選自
    Figure 03_image031
    、
    Figure 03_image033
    、
    Figure 03_image035
    、
    Figure 03_image037
    、
    Figure 03_image039
    、
    Figure 03_image041
    、
    Figure 03_image043
    、
    Figure 03_image045
    、
    Figure 03_image047
    、
    Figure 03_image049
    、
    Figure 03_image051
    、
    Figure 03_image053
    、
    Figure 03_image055
    、
    Figure 03_image057
    、
    Figure 03_image059
    、
    Figure 03_image061
    、
    Figure 03_image063
    、
    Figure 03_image065
    、
    Figure 03_image067
    、
    Figure 03_image069
    、
    Figure 03_image071
    、
    Figure 03_image073
    、
    Figure 03_image075
    、
    Figure 03_image077
    、
    Figure 03_image079
    、
    Figure 03_image081
    、
    Figure 03_image083
    、
    Figure 03_image085
    、
    Figure 03_image087
    、
    Figure 03_image089
    、
    Figure 03_image091
    及
    Figure 03_image093
    ； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  53. 一種結合物，其包含 (i) 第一部分A1 ； (ii) 第二部分A2 ； (iii) Fc域單體或Fc域；及 (iv) 共價附接至A1 及A2 且附接至該Fc域單體或該Fc域之連接體； 其中各A1 及各A2 係獨立地選自式(A-VI)-(A-IX)中任一者：
    Figure 03_image015
    、
    Figure 03_image017
    、
    Figure 03_image019
    、
    Figure 03_image021
    ； (A-VI)                    (A-VII)               (A-VIII)                (A-IX) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ； R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br； R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H； R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ； X係選自-O-及-S-； Y係選自-O-、-S-、-NR7 -、-O(C=O)NR7 -、-O(C=S)NR7 -、-O(C=O)O-、-O(C=O)-、-NH(C=O)O-、-NH(C=O)-、-NH(C=NH)-、-NH(C=O)NR7 -、-NH(C=NH)NR7 -、-NH(C=S)NR7 -、-NH(C=S)-、-OCH2 (C=O)NR7 -、-NH(SO2 )-、-NH(SO2 )NR7 -、-OR8 -、-NHR8 -及-SR8 -； R6 係選自
    Figure 03_image031
    、
    Figure 03_image033
    、
    Figure 03_image035
    、
    Figure 03_image037
    、
    Figure 03_image039
    、
    Figure 03_image041
    、
    Figure 03_image043
    、
    Figure 03_image045
    、
    Figure 03_image047
    、
    Figure 03_image049
    、
    Figure 03_image051
    、
    Figure 03_image053
    、
    Figure 03_image055
    、
    Figure 03_image057
    、
    Figure 03_image059
    、
    Figure 03_image061
    、
    Figure 03_image063
    、
    Figure 03_image065
    、
    Figure 03_image067
    、
    Figure 03_image069
    、
    Figure 03_image071
    、
    Figure 03_image073
    、
    Figure 03_image075
    、
    Figure 03_image077
    、
    Figure 03_image079
    、
    Figure 03_image081
    、
    Figure 03_image083
    、
    Figure 03_image085
    、
    Figure 03_image087
    、
    Figure 03_image089
    、
    Figure 03_image091
    及
    Figure 03_image093
    ； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  54. 一種結合物，其包含 (i) 第一部分A1 ； (ii) 第二部分A2 ； (iii)白蛋白、白蛋白結合肽或Fc結合肽；及 (iv) 共價附接至A1 及A2 且附接至該白蛋白、該白蛋白結合肽或該Fc結合肽之連接體； 其中各A1 及各A2 係獨立地選自式(A-I)-(A-XII)中任一者：
    Figure 03_image005
    、
    Figure 03_image007
    、
    Figure 03_image009
    、
    Figure 03_image011
    、
    Figure 03_image013
    、 (A-I)               (A-II)                    (A-III)                  (A-IV)             (A-V)
    Figure 03_image015
    、
    Figure 03_image017
    、
    Figure 03_image019
    、
    Figure 03_image021
    、 (A-VI)                     (A-VII)                   (A-VIII)                 (A-IX)
    Figure 03_image023
    、
    Figure 03_image025
    、
    Figure 03_image027
    ； (A-X)                  (A-XI)                      (A-XII) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ； R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br； R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H； R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ； X係選自-O-及-S-； Y係選自-O-、-S-、-NR7 -、-O(C=O)NR7 -、-O(C=S)NR7 -、-O(C=O)O-、-O(C=O)-、-NH(C=O)O-、-NH(C=O)-、-NH(C=NH)-、-NH(C=O)NR7 -、-NH(C=NH)NR7 -、-NH(C=S)NR7 -、-NH(C=S)-、-OCH2 (C=O)NR7 -、-NH(SO2 )-、-NH(SO2 )NR7 -、-OR8 -、-NHR8 -及-SR8 -； R6 係選自
    Figure 03_image031
    、
    Figure 03_image033
    、
    Figure 03_image035
    、
    Figure 03_image037
    、
    Figure 03_image039
    、
    Figure 03_image041
    、
    Figure 03_image043
    、
    Figure 03_image045
    、
    Figure 03_image047
    、
    Figure 03_image049
    、
    Figure 03_image051
    、
    Figure 03_image053
    、
    Figure 03_image055
    、
    Figure 03_image057
    、
    Figure 03_image059
    、
    Figure 03_image061
    、
    Figure 03_image063
    、
    Figure 03_image065
    、
    Figure 03_image067
    、
    Figure 03_image069
    、
    Figure 03_image071
    、
    Figure 03_image073
    、
    Figure 03_image075
    、
    Figure 03_image077
    、
    Figure 03_image079
    、
    Figure 03_image081
    、
    Figure 03_image083
    、
    Figure 03_image085
    、
    Figure 03_image087
    、
    Figure 03_image089
    、
    Figure 03_image091
    及
    Figure 03_image093
    ； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  55. 一種結合物，其包含 (i) 第一部分A1 ； (ii) 第二部分A2 ； (iii) 白蛋白、白蛋白結合肽或Fc結合肽；及 (iv) 共價附接至A1 及A2 且附接至該白蛋白、該白蛋白結合肽或該Fc結合肽之連接體； 其中各A1 及各A2 係獨立地選自式(A-I)-(A-V)中任一者：
    Figure 03_image005
    、
    Figure 03_image007
    、
    Figure 03_image009
    、
    Figure 03_image011
    、
    Figure 03_image013
    ； (A-I)               (A-II)                    (A-III)                (A-IV)                (A-V) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ； R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br； R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H； R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ； X係選自-O-及-S-； Y係選自-O-、-S-、-NR7 -、-O(C=O)NR7 -、-O(C=S)NR7 -、-O(C=O)O-、-O(C=O)-、-NH(C=O)O-、-NH(C=O)-、-NH(C=NH)-、-NH(C=O)NR7 -、-NH(C=NH)NR7 -、-NH(C=S)NR7 -、-NH(C=S)-、-OCH2 (C=O)NR7 -、-NH(SO2 )-、-NH(SO2 )NR7 -、-OR8 -、-NHR8 -及-SR8 -； R6 係選自
    Figure 03_image031
    、
    Figure 03_image033
    、
    Figure 03_image035
    、
    Figure 03_image037
    、
    Figure 03_image039
    、
    Figure 03_image041
    、
    Figure 03_image043
    、
    Figure 03_image045
    、
    Figure 03_image047
    、
    Figure 03_image049
    、
    Figure 03_image051
    、
    Figure 03_image053
    、
    Figure 03_image055
    、
    Figure 03_image057
    、
    Figure 03_image059
    、
    Figure 03_image061
    、
    Figure 03_image063
    、
    Figure 03_image065
    、
    Figure 03_image067
    、
    Figure 03_image069
    、
    Figure 03_image071
    、
    Figure 03_image073
    、
    Figure 03_image075
    、
    Figure 03_image077
    、
    Figure 03_image079
    、
    Figure 03_image081
    、
    Figure 03_image083
    、
    Figure 03_image085
    、
    Figure 03_image087
    、
    Figure 03_image089
    、
    Figure 03_image091
    及
    Figure 03_image093
    ； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  56. 一種結合物，其包含 (i) 第一部分A1 ； (ii) 第二部分A2 ； (iii) 白蛋白、白蛋白結合肽或Fc結合肽；及 (iv) 共價附接至A1 及A2 且附接至該白蛋白、該白蛋白結合肽或該Fc結合肽之連接體； 其中各A1 及各A2 係獨立地選自式(A-VI)-(A-IX)中任一者：
    Figure 03_image015
    、
    Figure 03_image017
    、
    Figure 03_image019
    、
    Figure 03_image021
    ； (A-VI)                 (A-VII)              (A-VIII)             (A-IX) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ； R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br； R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H； R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ； X係選自-O-及-S-； Y係選自-O-、-S-、-NR7 -、-O(C=O)NR7 -、-O(C=S)NR7 -、-O(C=O)O-、-O(C=O)-、-NH(C=O)O-、-NH(C=O)-、-NH(C=NH)-、-NH(C=O)NR7 -、-NH(C=NH)NR7 -、-NH(C=S)NR7 -、-NH(C=S)-、-OCH2 (C=O)NR7 -、-NH(SO2 )-、-NH(SO2 )NR7 -、-OR8 -、-NHR8 -及-SR8 -； R6 係選自
    Figure 03_image031
    、
    Figure 03_image033
    、
    Figure 03_image035
    、
    Figure 03_image037
    、
    Figure 03_image039
    、
    Figure 03_image041
    、
    Figure 03_image043
    、
    Figure 03_image045
    、
    Figure 03_image047
    、
    Figure 03_image049
    、
    Figure 03_image051
    、
    Figure 03_image053
    、
    Figure 03_image055
    、
    Figure 03_image057
    、
    Figure 03_image059
    、
    Figure 03_image061
    、
    Figure 03_image063
    、
    Figure 03_image065
    、
    Figure 03_image067
    、
    Figure 03_image069
    、
    Figure 03_image071
    、
    Figure 03_image073
    、
    Figure 03_image075
    、
    Figure 03_image077
    、
    Figure 03_image079
    、
    Figure 03_image081
    、
    Figure 03_image083
    、
    Figure 03_image085
    、
    Figure 03_image087
    、
    Figure 03_image089
    、
    Figure 03_image091
    及
    Figure 03_image093
    ； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  57. 一種由式(D-I)描述之結合物：
    Figure 03_image366
    (D-I) 其中各A1 及各A2 係獨立地選自式(A-I)-(A-XII)中任一者：
    Figure 03_image005
    、
    Figure 03_image007
    、
    Figure 03_image009
    、
    Figure 03_image011
    、
    Figure 03_image013
    、 (A-I)                 (A-II)                (A-III)              (A-IV)               (A-V)
    Figure 03_image015
    、
    Figure 03_image017
    、
    Figure 03_image019
    、
    Figure 03_image021
    、 (A-VI)                    (A-VII)              (A-VIII)             (A-IX)
    Figure 03_image023
    、
    Figure 03_image025
    、
    Figure 03_image027
    ； (A-X)                    (A-XI)                        (A-XII) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ； R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br； R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H； R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ； X係選自-O-及-S-； Y係選自-O-、-S-、-NR7 -、-O(C=O)NR7 -、-O(C=S)NR7 -、-O(C=O)O-、-O(C=O)-、-NH(C=O)O-、-NH(C=O)-、-NH(C=NH)-、-NH(C=O)NR7 -、-NH(C=NH)NR7 -、-NH(C=S)NR7 -、-NH(C=S)-、-OCH2 (C=O)NR7 -、-NH(SO2 )-、-NH(SO2 )NR7 -、-OR8 -、-NHR8 -及-SR8 -； R6 係選自
    Figure 03_image031
    、
    Figure 03_image033
    、
    Figure 03_image035
    、
    Figure 03_image037
    、
    Figure 03_image039
    、
    Figure 03_image041
    、
    Figure 03_image043
    、
    Figure 03_image045
    、
    Figure 03_image047
    、
    Figure 03_image049
    、
    Figure 03_image051
    、
    Figure 03_image053
    、
    Figure 03_image055
    、
    Figure 03_image057
    、
    Figure 03_image059
    、
    Figure 03_image061
    、
    Figure 03_image063
    、
    Figure 03_image065
    、
    Figure 03_image067
    、
    Figure 03_image069
    、
    Figure 03_image071
    、
    Figure 03_image073
    、
    Figure 03_image075
    、
    Figure 03_image077
    、
    Figure 03_image079
    、
    Figure 03_image081
    、
    Figure 03_image083
    、
    Figure 03_image085
    、
    Figure 03_image087
    、
    Figure 03_image089
    、
    Figure 03_image091
    及
    Figure 03_image093
    ； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； 各E包含Fc域單體、白蛋白、白蛋白結合肽或Fc結合肽； n為1或2； T為1至20之整數；且 L係共價附接至E、A1 及A2 中每一者之連接體， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  58. 一種由式(D-I)描述之結合物：
    Figure 03_image366
    (D-I) 其中各A1 及各A2 係獨立地選自式(A-I)-(A-V)中任一者：
    Figure 03_image005
    、
    Figure 03_image007
    、
    Figure 03_image009
    、
    Figure 03_image011
    、
    Figure 03_image013
    ； (A-I)              (A-II)                      (A-III)                       (A-IV)                (A-V) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ； R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br； R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H； R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ； X係選自-O-及-S-； Y係選自-O-、-S-、-NR7 -、-O(C=O)NR7 -、-O(C=S)NR7 -、-O(C=O)O-、-O(C=O)-、-NH(C=O)O-、-NH(C=O)-、-NH(C=NH)-、-NH(C=O)NR7 -、-NH(C=NH)NR7 -、-NH(C=S)NR7 -、-NH(C=S)-、-OCH2 (C=O)NR7 -、-NH(SO2 )-、-NH(SO2 )NR7 -、-OR8 -、-NHR8 -及-SR8 -； R6 係選自
    Figure 03_image031
    、
    Figure 03_image033
    、
    Figure 03_image035
    、
    Figure 03_image037
    、
    Figure 03_image039
    、
    Figure 03_image041
    、
    Figure 03_image043
    、
    Figure 03_image045
    、
    Figure 03_image047
    、
    Figure 03_image049
    、
    Figure 03_image051
    、
    Figure 03_image053
    、
    Figure 03_image055
    、
    Figure 03_image057
    、
    Figure 03_image059
    、
    Figure 03_image061
    、
    Figure 03_image063
    、
    Figure 03_image065
    、
    Figure 03_image067
    、
    Figure 03_image069
    、
    Figure 03_image071
    、
    Figure 03_image073
    、
    Figure 03_image075
    、
    Figure 03_image077
    、
    Figure 03_image079
    、
    Figure 03_image081
    、
    Figure 03_image083
    、
    Figure 03_image085
    、
    Figure 03_image087
    、
    Figure 03_image089
    、
    Figure 03_image091
    及
    Figure 03_image093
    ； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； 各E包含Fc域單體、白蛋白、白蛋白結合肽或Fc結合肽； n為1或2； T為1至20之整數；且 L係共價附接至E、A1 及A2 中每一者之連接體， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  59. 一種由式(D-I)描述之結合物：
    Figure 03_image366
    (D-I) 其中各A1 及各A2 係獨立地選自式(A-VI)-(A-IX)中任一者：
    Figure 03_image015
    、
    Figure 03_image017
    、
    Figure 03_image019
    、
    Figure 03_image021
    ； (A-VI)                      (A-VII)                    (A-VIII)            (A-IX) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ； R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br； R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H； R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ； X係選自-O-及-S-； Y係選自-O-、-S-、-NR7 -、-O(C=O)NR7 -、-O(C=S)NR7 -、-O(C=O)O-、-O(C=O)-、-NH(C=O)O-、-NH(C=O)-、-NH(C=NH)-、-NH(C=O)NR7 -、-NH(C=NH)NR7 -、-NH(C=S)NR7 -、-NH(C=S)-、-OCH2 (C=O)NR7 -、-NH(SO2 )-、-NH(SO2 )NR7 -、-OR8 -、-NHR8 -及-SR8 -； R6 係選自
    Figure 03_image031
    、
    Figure 03_image033
    、
    Figure 03_image035
    、
    Figure 03_image037
    、
    Figure 03_image039
    、
    Figure 03_image041
    、
    Figure 03_image043
    、
    Figure 03_image045
    、
    Figure 03_image047
    、
    Figure 03_image049
    、
    Figure 03_image051
    、
    Figure 03_image053
    、
    Figure 03_image055
    、
    Figure 03_image057
    、
    Figure 03_image059
    、
    Figure 03_image061
    、
    Figure 03_image063
    、
    Figure 03_image065
    、
    Figure 03_image067
    、
    Figure 03_image069
    、
    Figure 03_image071
    、
    Figure 03_image073
    、
    Figure 03_image075
    、
    Figure 03_image077
    、
    Figure 03_image079
    、
    Figure 03_image081
    、
    Figure 03_image083
    、
    Figure 03_image085
    、
    Figure 03_image087
    、
    Figure 03_image089
    、
    Figure 03_image091
    及
    Figure 03_image093
    ； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； 各E包含Fc域單體、白蛋白、白蛋白結合肽或Fc結合肽； n為1或2； T為1至20之整數；且 L係共價附接至E、A1 及A2 中每一者之連接體， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  60. 如申請專利範圍第57項至第59項中任一項之結合物，其中T為2至20之整數， 其中E結合於一或多個第一A1 -L-A2 部分，其中各A1 及各A2 係獨立地選自式(A-III)-(A-V)中任一者：
    Figure 03_image009
    、
    Figure 03_image011
    、
    Figure 03_image013
    ； (A-III)                 (A-IV)                            (A-V) 且其中E結合於一或多個第二A1 -L-A2 部分，其中各A1 及各A2 係獨立地選自式(A-I)、(A-II)、(A-VI)、(A-VII)、(A-VIII)及(A-IX)中任一者：
    Figure 03_image005
    、
    Figure 03_image007
    、
    Figure 03_image015
    、
    Figure 03_image017
    、
    Figure 03_image019
    、 (A-I)                    (A-II)                  (A-VI)             (A-VII)               (A-VIII)
    Figure 03_image021
    。 (A-IX)
  61. 如申請專利範圍第60項之結合物，其中該等第一A1 -L-A2 部分各自特異性地結合於E之表面暴露離胺酸殘基的氮原子，且該等第二A1 -L-A2 部分各自特異性地結合於E之表面暴露半胱胺酸殘基的硫原子。
  62. 如申請專利範圍第60項之結合物，其中該等第一A1 -L-A2 部分各自特異性地結合於E之表面暴露半胱胺酸殘基的硫原子，且該等第二A1 -L-A2 部分各自特異性地結合於E之表面暴露離胺酸殘基的氮原子。
  63. 如申請專利範圍第60項至第62項中任一項之結合物，其中結合於E之第一A1 -L-A2 部分的數目為1至10之整數。
  64. 如申請專利範圍第60項至第63項中任一項之結合物，其中結合於E之第二A1 -L-A2 部分的數目為1至10之整數。
  65. 如申請專利範圍第57項或第58項之結合物，其中該結合物係由式(D-II)描述：
    Figure 03_image401
    (D-II) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  66. 如申請專利範圍第65項之結合物，其中該結合物係由式(D-II-1)描述：
    Figure 03_image403
    (D-II-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  67. 如申請專利範圍第66項之結合物，其中該結合物係由式(D-II-2)描述：
    Figure 03_image405
    (D-II-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  68. 如申請專利範圍第67項之結合物，其中該結合物係由式(D-II-3)描述：
    Figure 03_image407
    (D-II-3) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  69. 如申請專利範圍第68項之結合物，其中L’為氮原子。
  70. 如申請專利範圍第69項之結合物，其中該結合物具有選自以下之結構：
    Figure 03_image409
    、
    Figure 03_image2099
    或
    Figure 03_image2101
    。
  71. 如申請專利範圍第66項之結合物，其中該結合物係由式(D-II-4)描述：
    Figure 03_image415
    (D-II-4) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  72. 如申請專利範圍第71項之結合物，其中該結合物係由式(D-II-5)描述：
    Figure 03_image417
    (D-II-5) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  73. 如申請專利範圍第72項之結合物，其中L’為氮原子。
  74. 如申請專利範圍第73項之結合物，其中該結合物具有選自以下之結構：
    Figure 03_image419
    、
    Figure 03_image2106
    或
    Figure 03_image2108
    。
  75. 如申請專利範圍第71項之結合物，其中該結合物具有結構
    Figure 03_image2110
    或其醫藥學上可接受之鹽。
  76. 如申請專利範圍第66項之結合物，其中該結合物係由式(D-II-6)描述：
    Figure 03_image433
    (D-II-6) 其中R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； 或其醫藥學上可接受之鹽。
  77. 如申請專利範圍第76項之結合物，其中該結合物係由式(D-II-7)描述：
    Figure 03_image435
    (D-II-7) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  78. 如申請專利範圍第77項之結合物，其中該結合物係由式(D-II-8)描述：
    Figure 03_image437
    (D-II-8) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  79. 如申請專利範圍第78項之結合物，其中該結合物具有結構
    Figure 03_image2114
    或
    Figure 03_image441
    。
  80. 如申請專利範圍第76項之結合物，其中該結合物係由式(D-II-9)描述：
    Figure 03_image2117
    (D-II-9) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  81. 如申請專利範圍第80項之結合物，其中該結合物係由式(D-II-10)描述：
    Figure 03_image461
    (D-II-10) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  82. 如申請專利範圍第81項之結合物，其中該結合物具有結構
    Figure 03_image2120
    或其醫藥學上可接受之鹽。
  83. 如申請專利範圍第57項或第59項之結合物，其中該結合物係由式(D-III)描述：
    Figure 03_image467
    (D-III) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  84. 如申請專利範圍第83項之結合物，其中該結合物係由式(D-III-1)描述：
    Figure 03_image469
    (D-III-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  85. 如申請專利範圍第84項之結合物，其中該結合物係由式(D-III-2)描述：
    Figure 03_image471
    (D-III-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  86. 如申請專利範圍第85項之結合物，其中該結合物係由式(D-III-3)描述：
    Figure 03_image473
    (D-III-3) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  87. 如申請專利範圍第84項之結合物，其中該結合物係由式(D-III-4)描述：
    Figure 03_image475
    (D-III-4) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  88. 如申請專利範圍第87項之結合物，其中該結合物係由式(D-III-5)描述：
    Figure 03_image477
    (D-III-5) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  89. 如申請專利範圍第84項之結合物，其中該結合物係由式(D-III-6)描述：
    Figure 03_image479
    (D-III-6) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  90. 如申請專利範圍第89項之結合物，其中該結合物係由式(D-III-7)描述：
    Figure 03_image481
    (D-III-7) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  91. 如申請專利範圍第84項之結合物，其中該結合物係由式(D-III-8)描述：
    Figure 03_image483
    (D-III-8) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  92. 如申請專利範圍第91項之結合物，其中該結合物係由式(D-III-9)描述：
    Figure 03_image485
    (D-III-9) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  93. 如申請專利範圍第57項或第59項之結合物，其中該結合物係由式(D-IV)描述：
    Figure 03_image487
    (D-IV) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  94. 如申請專利範圍第93項之結合物，其中該結合物係由式(D-IV-1)描述：
    Figure 03_image489
    (D-IV-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  95. 如申請專利範圍第94項之結合物，其中該結合物係由式(D-IV-2)描述：
    Figure 03_image491
    (D-IV-2) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  96. 如申請專利範圍第57項或第58項之結合物，其中該結合物係由式(D-V)描述：
    Figure 03_image493
    (D-V) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  97. 如申請專利範圍第96項之結合物，其中該結合物係由式(D-V-1)描述：
    Figure 03_image495
    (D-V-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  98. 如申請專利範圍第97項之結合物，其中該結合物係由式(D-V-2)描述：
    Figure 03_image497
    (D-V-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  99. 如申請專利範圍第98項之結合物，其中該結合物係由式(D-V-3)描述：
    Figure 03_image499
    (D-V-3) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  100. 如申請專利範圍第99項之結合物，其中L’為氮原子。
  101. 如申請專利範圍第99項之結合物，其中y1 及y2 各自為1，y1 及y2 各自為2，或y1 及y2 各自為3。
  102. 如申請專利範圍第97項之結合物，其中該結合物係由式(D-V-4)描述：
    Figure 03_image501
    (D-III-4) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  103. 如申請專利範圍第102項之結合物，其中該結合物係由式(D-V-5)描述：
    Figure 03_image503
    (D-V-5) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  104. 如申請專利範圍第103項之結合物，其中L’為氮原子。
  105. 如申請專利範圍第103項之結合物，其中y1 及y2 各自為1，y1 及y2 各自為2，或y1 及y2 各自為3。
  106. 如申請專利範圍第96項之結合物，其中該結合物係由式(D-V-6)描述：
    Figure 03_image505
    (D-V-6) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  107. 如申請專利範圍第106項之結合物，其中該結合物係由式(D-V-7)描述：
    Figure 03_image507
    (D-V-7) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  108. 如申請專利範圍第107項之結合物，其中該結合物係由式(D-V-8)描述：
    Figure 03_image509
    (D-V-8) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  109. 如申請專利範圍第108項之結合物，其中L’為氮原子。
  110. 如申請專利範圍第108項之結合物，其中y1 及y2 各自為1，y1 及y2 各自為2，或y1 及y2 各自為3。
  111. 如申請專利範圍第106項之結合物，其中該結合物係由式(D-V-9)描述：
    Figure 03_image511
    (D-V-9) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  112. 如申請專利範圍第108項之結合物，其中該結合物係由式(D-V-10)描述：
    Figure 03_image513
    (D-V-10) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  113. 如申請專利範圍第112項之結合物，其中L’為氮原子。
  114. 如申請專利範圍第113項之結合物，其中y1 及y2 各自為1，y1 及y2 各自為2，或y1 及y2 各自為3。
  115. 如申請專利範圍第57項或第59項之結合物，其中該結合物係由式(D-VI)描述：
    Figure 03_image515
    (D-VI) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  116. 如申請專利範圍第115項之結合物，其中該結合物係由式(D-VI-1)描述：
    Figure 03_image517
    (D-VI-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  117. 如申請專利範圍第116項之結合物，其中該結合物係由式(D-VI-2)描述：
    Figure 03_image519
    (D-VI-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  118. 如申請專利範圍第117項之結合物，其中該結合物係由式(D-VI-3)描述：
    Figure 03_image521
    (D-VI-3) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  119. 如申請專利範圍第116項之結合物，其中該結合物係由式(D-VI-4)描述：
    Figure 03_image523
    (D-VI-4) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  120. 如申請專利範圍第119項之結合物，其中該結合物係由式(D-VI-5)描述：
    Figure 03_image525
    (D-VI-5) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  121. 如申請專利範圍第116項之結合物，其中該結合物係由式(D-VI-6)描述：
    Figure 03_image527
    (D-VI-6) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  122. 如申請專利範圍第121項之結合物，其中該結合物係由式(D-VI-7)描述：
    Figure 03_image529
    (D-VI-7) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  123. 如申請專利範圍第116項之結合物，其中該結合物係由式(D-VI-8)描述：
    Figure 03_image531
    (D-VI-8) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  124. 如申請專利範圍第123項之結合物，其中該結合物係由式(D-VI-9)描述：
    Figure 03_image533
    (D-VI-9) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  125. 如申請專利範圍第57項或第59項之結合物，其中該結合物係由式(D-VII)描述：
    Figure 03_image535
    (D-VII) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  126. 如申請專利範圍第96項至第125項中任一項之結合物，其中R1 為-OH。
  127. 如申請專利範圍第96項至第125項中任一項之結合物，其中R1 為-NH2 。
  128. 如申請專利範圍第96項至第125項中任一項之結合物，其中R1 為-NHC(=NH)NH2 。
  129. 如申請專利範圍第57項或第58項之結合物，其中該結合物係由式(D-VIII)描述：
    Figure 03_image537
    (D-VIII) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  130. 如申請專利範圍第129項之結合物，其中該結合物係由式(D-VIII-1)描述：
    Figure 03_image539
    (D-VIII-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  131. 如申請專利範圍第130項之結合物，其中該結合物係由式(D-VIII-2)描述：
    Figure 03_image541
    (D-VIII-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  132. 如申請專利範圍第131項之結合物，其中該結合物係由式(D-VIII-3)描述：
    Figure 03_image543
    (D-VIII-3) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  133. 如申請專利範圍第132項之結合物，其中L’為氮原子。
  134. 如申請專利範圍第132項之結合物，其中該結合物具有選自以下之結構：
    Figure 03_image545
    、
    Figure 03_image547
    或
    Figure 03_image549
    。
  135. 如申請專利範圍第130項之結合物，其中該結合物係由式(D-VIII-4)描述：
    Figure 03_image551
    (D-VIII-4) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  136. 如申請專利範圍第135項之結合物，其中該結合物係由式(D-VIII-5)描述：
    Figure 03_image553
    (D-VIII-5) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  137. 如申請專利範圍第136項之結合物，其中L’為氮原子。
  138. 如申請專利範圍第136項之結合物，其中該結合物具有選自以下之結構：
    Figure 03_image2159
    、
    Figure 03_image2161
    或
    Figure 03_image2163
    。
  139. 如申請專利範圍第135項之結合物，其中該結合物係由以下結構描述：
    Figure 03_image2165
    。
  140. 如申請專利範圍第130項之結合物，其中該結合物係由式(D-VIII-6)描述：
    Figure 03_image563
    (D-VIII-6) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  141. 如申請專利範圍第140項之結合物，其中該結合物係由式(D-VIII-7)描述：
    Figure 03_image565
    (D-VIII-7) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  142. 如申請專利範圍第130項之結合物，其中該結合物係由式(D-VIII-8)描述：
    Figure 03_image567
    (D-VIII-8) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  143. 如申請專利範圍第142項之結合物，其中該結合物係由式(D-VIII-9)描述：
    Figure 03_image569
    (D-VIII-9) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  144. 如申請專利範圍第130項之結合物，其中該結合物係由式(D-VIII-10)描述：
    Figure 03_image571
    (D-VIII-10) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  145. 如申請專利範圍第144項之結合物，其中該結合物係由式(D-VIII-11)描述：
    Figure 03_image573
    (D-VIII-11) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  146. 如申請專利範圍第57項或第58項之結合物，其中該結合物係由式(D-IX)描述：
    Figure 03_image575
    (D-IX) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  147. 如申請專利範圍第146項之結合物，其中該結合物係由式(D-IX-1)描述：
    Figure 03_image577
    (D-IX-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  148. 如申請專利範圍第147項之結合物，其中該結合物係由式(D-IX-2)描述：
    Figure 03_image579
    (D-IX-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  149. 如申請專利範圍第147項之結合物，其中該結合物係由式(D-IX-3)描述：
    Figure 03_image581
    (D-IX-3) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  150. 如申請專利範圍第147項之結合物，其中該結合物係由式(D-IX-4)描述：
    Figure 03_image583
    (D-IX-4) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  151. 如申請專利範圍第147項之結合物，其中該結合物係由式(D-IX-5)描述：
    Figure 03_image585
    (D-IX-5) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  152. 如申請專利範圍第147項之結合物，其中該結合物係由式(D-IX-6)描述：
    Figure 03_image587
    (D-IX-6) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  153. 如申請專利範圍第57項或第58項之結合物，其中該結合物係由式(D-X)描述：
    Figure 03_image2179
    (D-X) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  154. 如申請專利範圍第153項之結合物，其中該結合物係由式(D-X-1)描述：
    Figure 03_image2181
    (D-X-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  155. 如申請專利範圍第154項之結合物，其中該結合物係由式(D-X-2)描述：
    Figure 03_image2183
    (D-X-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  156. 如申請專利範圍第154項之結合物，其中該結合物係由式(D-X-3)描述：
    Figure 03_image2185
    (D-X-3) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  157. 一種由式(D’-I)描述之結合物：
    Figure 03_image1113
    (D’-I) 其中各A1 係獨立地選自式(A-III)-(A-V)中任一者：
    Figure 03_image009
    、
    Figure 03_image011
    、
    Figure 03_image013
    ； (A-III)                    (A-IV)                     (A-V) 各A2 係獨立地選自式(A-I)、(A-II)、(A-VI)、(A-VII)、(A-VIII)及(A-IX)中任一者：
    Figure 03_image005
    、
    Figure 03_image007
    、
    Figure 03_image015
    、
    Figure 03_image017
    、
    Figure 03_image019
    、 (A-I)                  (A-II)                  (A-VI)             (A-VII)                (A-VIII)
    Figure 03_image021
    ； (A-IX) R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ； R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br； R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H； R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ； X係選自-O-及-S-； Y係選自
    Figure 03_image2187
    Figure 03_image2189
    Figure 03_image2191
    R6 係選自
    Figure 03_image031
    、
    Figure 03_image033
    、
    Figure 03_image035
    、
    Figure 03_image037
    、
    Figure 03_image039
    、
    Figure 03_image041
    、
    Figure 03_image043
    、
    Figure 03_image045
    、
    Figure 03_image047
    、
    Figure 03_image049
    、
    Figure 03_image051
    、
    Figure 03_image053
    、
    Figure 03_image055
    、
    Figure 03_image057
    、
    Figure 03_image059
    、
    Figure 03_image061
    、
    Figure 03_image063
    、
    Figure 03_image065
    、
    Figure 03_image067
    、
    Figure 03_image069
    、
    Figure 03_image071
    、
    Figure 03_image073
    、
    Figure 03_image075
    、
    Figure 03_image077
    、
    Figure 03_image079
    、
    Figure 03_image081
    、
    Figure 03_image083
    、
    Figure 03_image085
    、
    Figure 03_image087
    、
    Figure 03_image089
    、
    Figure 03_image091
    及
    Figure 03_image093
    ； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； 各E包含Fc域單體、白蛋白、白蛋白結合肽或Fc結合肽； n為1或2； T1 及T2 各自獨立地為1至10之整數； L1 係共價結合於E且結合於各A1 之連接體； L2 係共價附接結合於E及各A2 之連接體， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  158. 如申請專利範圍第157項之結合物，其中各A1 -L-A1 特異性地結合於E之表面暴露離胺酸殘基的氮原子，且各A2 -L-A2 特異性地結合於E之表面暴露半胱胺酸殘基的硫原子。
  159. 如申請專利範圍第157項之結合物，其中各A1 -L-A1 部分特異性地結合於E之表面暴露半胱胺酸殘基的硫原子，且各A2 -L-A2 部分特異性地結合於E之表面暴露離胺酸殘基的氮原子。
  160. 如申請專利範圍第1項至第159項中任一項之結合物，其中L或L’包含一或多個視情況經取代C1-C20伸烷基、視情況經取代C1-C20伸雜烷基、視情況經取代C2-C20伸烯基、視情況經取代C2-C20伸雜烯基、視情況經取代C2-C20伸炔基、視情況經取代C2-C20伸雜炔基、視情況經取代C3-C20伸環烷基、視情況經取代C3-C20伸雜環烷基、視情況經取代C4-C20伸環烯基、視情況經取代C4-C20伸雜環烯基、視情況經取代C8-C20伸環炔基、視情況經取代C8-C20伸雜環炔基、視情況經取代C5-C15伸芳基、視情況經取代C2-C15伸雜芳基、O、S、NRi 、P、羰基、硫羰基、磺醯基、磷酸酯基、磷醯基或亞胺基， 其中Ri 為H、視情況經取代C1-C20烷基、視情況經取代C1-C20雜烷基、視情況經取代C2-C20烯基、視情況經取代C2-C20雜烯基、視情況經取代C2-C20炔基、視情況經取代C2-C20雜炔基、視情況經取代C3-C20環烷基、視情況經取代C3-C20雜環烷基、視情況經取代C4-C20環烯基、視情況經取代C4-C20雜環烯基、視情況經取代C8-C20環炔基、視情況經取代C8-C20雜環炔基、視情況經取代C5-C15芳基或視情況經取代C2-C15雜芳基。
  161. 如申請專利範圍第160項之結合物，其中L或L’之骨架係由一或多個視情況經取代C1-C20伸烷基、視情況經取代C1-C20伸雜烷基、視情況經取代C2-C20伸烯基、視情況經取代C2-C20伸雜烯基、視情況經取代C2-C20伸炔基、視情況經取代C2-C20伸雜炔基、視情況經取代C3-C20伸環烷基、視情況經取代C3-C20伸雜環烷基、視情況經取代C4-C20伸環烯基、視情況經取代C4-C20伸雜環烯基、視情況經取代C8-C20伸環炔基、視情況經取代C8-C20伸雜環炔基、視情況經取代C5-C15伸芳基、視情況經取代C2-C15伸雜芳基、O、S、NRi 、P、羰基、硫羰基、磺醯基、磷酸酯基、磷醯基或亞胺基組成， 其中Ri 為H、視情況經取代C1-C20烷基、視情況經取代C1-C20雜烷基、視情況經取代C2-C20烯基、視情況經取代C2-C20雜烯基、視情況經取代C2-C20炔基、視情況經取代C2-C20雜炔基、視情況經取代C3-C20環烷基、視情況經取代C3-C20雜環烷基、視情況經取代C4-C20環烯基、視情況經取代C4-C20雜環烯基、視情況經取代C8-C20環炔基、視情況經取代C8-C20雜環炔基、視情況經取代C5-C15芳基或視情況經取代C2-C15雜芳基。
  162. 如申請專利範圍第160項或第161項之結合物，其中L或L’係經側氧基取代。
  163. 如申請專利範圍第1項至第162項中任一項之結合物，其中L或L’之骨架包含不超過250個原子。
  164. 如申請專利範圍第1項至第163項中任一項之結合物，其中L或L’能夠形成醯胺、胺基甲酸酯、磺醯基或脲連接。
  165. 如申請專利範圍第1項至第159項中任一項之結合物，其中L或L’為鍵。
  166. 如申請專利範圍第1項至第159項中任一項之結合物，其中L或L’為原子。
  167. 如申請專利範圍第1項至第166項中任一項之結合物，其中各L係由式(D-L-I)描述：
    Figure 03_image597
    (D-L-I) 其中LA 係由式GA1 -(ZA1 )g1 -(YA1 )h1 -(ZA2 )i1 -(YA2 )j1 -(ZA3 )k1 -(YA3 )l1 -(ZA4 )m1 -(YA4 )n1 -(ZA5 )o1 -GA2 描述； LB 係由式GB1 -(ZB1 )g2 -(YB1 )h2 -(ZB2 )i2 -(YB2 )j2 -(ZB3 )k2 -(YB3 )l2 -(ZB4 )m2 -(YB4 )n2 -(ZB5 )o2 -GB2 描述； LC 係由式GC1 -(ZC1 )g3 -(YC1 )h3 -(ZC2 )i3 -(YC2 )j3 -(ZC3 )k3 -(YC3 )l3 -(ZC4 )m3 -(YC4 )n3 -(ZC5 )o3 -GC2 描述； GA1 係附接至Q之鍵； GA2 係附接至A1之鍵； GB1 係附接至Q之鍵； GB2 係附接至A2之鍵； GC1 係附接至Q之鍵； GC2 係附接至E之鍵或能夠與結合於E之官能基反應的官能基(例如，順丁烯二醯亞胺及半胱胺酸、胺及經活化羧酸、硫醇及順丁烯二醯亞胺、經活化磺酸及胺、異氰酸酯及胺、疊氮化物及炔以及烯烴及四嗪)； ZA1 、ZA2 、ZA3 、ZA4 、ZA5 、ZB1 、ZB2 、ZB3 、ZB4 、ZB5 、ZC1 、ZC2 、ZC3 、ZC4 及ZC5 各自獨立地為視情況經取代C1-C20伸烷基、視情況經取代C1-C20伸雜烷基、視情況經取代C2-C20伸烯基、視情況經取代C2-C20伸雜烯基、視情況經取代C2-C20伸炔基、視情況經取代C2-C20伸雜炔基、視情況經取代C3-C20伸環烷基、視情況經取代C3-C20伸雜環烷基、視情況經取代C4-C20伸環烯基、視情況經取代C4-C20伸雜環烯基、視情況經取代C8-C20伸環炔基、視情況經取代C8-C20伸雜環炔基、視情況經取代C5-C15伸芳基或視情況經取代C2-C15伸雜芳基； YA1 、YA2 、YA3 、YA4 、YB1 、YB2 、YB3 、YB4 、YC1 、YC2 、YC3 及YC4 各自獨立地為O、S、NRi 、P、羰基、硫羰基、磺醯基、磷酸酯基、磷醯基或亞胺基； Ri 為H、視情況經取代C1-C20烷基、視情況經取代C1-C20雜烷基、視情況經取代C2-C20烯基、視情況經取代C2-C20雜烯基、視情況經取代C2-C20炔基、視情況經取代C2-C20雜炔基、視情況經取代C3-C20環烷基、視情況經取代C3-C20雜環烷基、視情況經取代C4-C20環烯基、視情況經取代C4-C20雜環烯基、視情況經取代C8-C20環炔基、視情況經取代C8-C20雜環炔基、視情況經取代C5-C15芳基或視情況經取代C2-C15雜芳基； g1、h1、i1、j1、k1、l1、m1、n1、o1、g2、h2、i2、j2、k2、l2、m2、n2、o2、g3、h3、i3、j3、k3、l3、m3、n3及o3各自獨立地為0或1； Q為氮原子、視情況經取代C1-C20伸烷基、視情況經取代C1-C20伸雜烷基、視情況經取代C2-C20伸烯基、視情況經取代C2-C20伸雜烯基、視情況經取代C2-C20伸炔基、視情況經取代C2-C20伸雜炔基、視情況經取代C3-C20伸環烷基、視情況經取代C3-C20伸雜環烷基、視情況經取代C4-C20伸環烯基、視情況經取代C4-C20伸雜環烯基、視情況經取代C8-C20伸環炔基、視情況經取代C8-C20伸雜環炔基、視情況經取代C5-C15伸芳基或視情況經取代C2-C15伸雜芳基。
  168. 如申請專利範圍第167項之結合物，其中L係選自
    Figure 03_image599
    、
    Figure 03_image601
    、
    Figure 03_image603
    、
    Figure 03_image605
    、
    Figure 03_image607
    、
    Figure 03_image609
    、
    Figure 03_image611
    、
    Figure 03_image613
    、
    Figure 03_image615
    、
    Figure 03_image617
    、
    Figure 03_image619
    、
    Figure 03_image621
    、
    Figure 03_image623
    、
    Figure 03_image625
    、
    Figure 03_image627
    、
    Figure 03_image629
    、
    Figure 03_image631
    、
    Figure 03_image633
    、
    Figure 03_image635
    、
    Figure 03_image637
    、
    Figure 03_image639
    、
    Figure 03_image641
    、
    Figure 03_image643
    、
    Figure 03_image645
    、
    Figure 03_image647
    、
    Figure 03_image649
    、
    Figure 03_image651
    、
    Figure 03_image653
    、
    Figure 03_image655
    、
    Figure 03_image657
    、
    Figure 03_image659
    、
    Figure 03_image661
    、
    Figure 03_image663
    、
    Figure 03_image665
    、
    Figure 03_image667
    、
    Figure 03_image669
    、
    Figure 03_image671
    、
    Figure 03_image673
    、
    Figure 03_image675
    、
    Figure 03_image677
    、
    Figure 03_image679
    、
    Figure 03_image681
    、
    Figure 03_image683
    、
    Figure 03_image685
    、
    Figure 03_image687
    、
    Figure 03_image689
    、
    Figure 03_image691
    、
    Figure 03_image693
    、
    Figure 03_image695
    、
    Figure 03_image697
    、
    Figure 03_image699
    、
    Figure 03_image701
    、
    Figure 03_image703
    、
    Figure 03_image705
    、
    Figure 03_image707
    、
    Figure 03_image709
    、
    Figure 03_image711
    、
    Figure 03_image713
    、
    Figure 03_image715
    、
    Figure 03_image717
    、
    Figure 03_image719
    、
    Figure 03_image721
    、
    Figure 03_image723
    、
    Figure 03_image725
    、
    Figure 03_image727
    、
    Figure 03_image729
    、
    Figure 03_image731
    、
    Figure 03_image733
    、
    Figure 03_image735
    、
    Figure 03_image737
    、
    Figure 03_image739
    、
    Figure 03_image741
    、
    Figure 03_image743
    、
    Figure 03_image745
    、
    Figure 03_image747
    、
    Figure 03_image749
    、
    Figure 03_image751
    、
    Figure 03_image753
    、
    Figure 03_image755
    、
    Figure 03_image757
    、
    Figure 03_image759
    、
    Figure 03_image761
    、
    Figure 03_image763
    、
    Figure 03_image765
    、
    Figure 03_image767
    、
    Figure 03_image769
    、
    Figure 03_image771
    ；
    Figure 03_image773
    ；
    Figure 03_image775
    ；
    Figure 03_image777
    ；
    Figure 03_image779
    ；
    Figure 03_image781
    ；
    Figure 03_image783
    ；
    Figure 03_image785
    ；或
    Figure 03_image787
    ， 其中z1 及z2 各自獨立地為1至20之整數；且 R9 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基。
  169. 如申請專利範圍第168項之結合物，其中Y為：
    Figure 03_image889
    (-NH(C=O)O-)且L為：
    Figure 03_image753
    。
  170. 如申請專利範圍第168項之結合物，其中Y為：
    Figure 03_image889
    (-NH(C=O)O-)且L為：
    Figure 03_image757
    。
  171. 如申請專利範圍第168項之結合物，其中Y為：
    Figure 03_image889
    (-NH(C=O)O-)且L為：
    Figure 03_image761
    。
  172. 如申請專利範圍第168項之結合物，其中Y為：
    Figure 03_image894
    (-O-)且L為：
    Figure 03_image767
    。
  173. 一種由式(M-I)描述之結合物：
    Figure 03_image897
    (M-I) 其中各A1 係獨立地選自式(A-I)-(A-XII)中任一者：
    Figure 03_image005
    、
    Figure 03_image007
    、
    Figure 03_image009
    、
    Figure 03_image011
    、
    Figure 03_image013
    、 (A-I)               (A-II)                (A-III)              (A-IV)               (A-V)
    Figure 03_image015
    、
    Figure 03_image017
    、
    Figure 03_image019
    、
    Figure 03_image021
    、 (A-VI)                (A-VII)                       (A-VIII)              (A-IX)
    Figure 03_image023
    、
    Figure 03_image025
    、
    Figure 03_image027
    ； (A-X)                    (A-XI)                         (A-XII) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ； R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br； R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H； R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ； X係選自-O-及-S-； Y係選自-O-、-S-、-NR7 -、-O(C=O)NR7 -、-O(C=S)NR7 -、-O(C=O)O-、-O(C=O)-、-NH(C=O)O-、-NH(C=O)-、-NH(C=NH)-、-NH(C=O)NR7 -、-NH(C=NH)NR7 -、-NH(C=S)NR7 -、-NH(C=S)-、-OCH2 (C=O)NR7 -、-NH(SO2 )-、-NH(SO2 )NR7 -、-OR8 -、-NHR8 -及-SR8 -； R6 係選自
    Figure 03_image031
    、
    Figure 03_image033
    、
    Figure 03_image035
    、
    Figure 03_image037
    、
    Figure 03_image039
    、
    Figure 03_image041
    、
    Figure 03_image043
    、
    Figure 03_image045
    、
    Figure 03_image047
    、
    Figure 03_image049
    、
    Figure 03_image051
    、
    Figure 03_image053
    、
    Figure 03_image055
    、
    Figure 03_image057
    、
    Figure 03_image059
    、
    Figure 03_image061
    、
    Figure 03_image063
    、
    Figure 03_image065
    、
    Figure 03_image067
    、
    Figure 03_image069
    、
    Figure 03_image071
    、
    Figure 03_image073
    、
    Figure 03_image075
    、
    Figure 03_image077
    、
    Figure 03_image079
    、
    Figure 03_image081
    、
    Figure 03_image083
    、
    Figure 03_image085
    、
    Figure 03_image087
    、
    Figure 03_image089
    、
    Figure 03_image091
    及
    Figure 03_image093
    ； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； 各E包含Fc域單體、白蛋白、白蛋白結合肽或Fc結合肽； n為1或2； T為1至20之整數；且 L係共價附接至E及A1 中每一者之連接體， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  174. 一種由式(M-I)描述之結合物：
    Figure 03_image897
    (M-I) 其中各A1 係獨立地選自式(A-I)-(A-V)中任一者：
    Figure 03_image005
    、
    Figure 03_image007
    、
    Figure 03_image009
    、
    Figure 03_image011
    、
    Figure 03_image013
    ； (A-I)                  (A-II)               (A-III)              (A-IV)                (A-V) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ； R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br； R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H； R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ； X係選自-O-及-S-； Y係選自-O-、-S-、-NR7 -、-O(C=O)NR7 -、-O(C=S)NR7 -、-O(C=O)O-、-O(C=O)-、-NH(C=O)O-、-NH(C=O)-、-NH(C=NH)-、-NH(C=O)NR7 -、-NH(C=NH)NR7 -、-NH(C=S)NR7 -、-NH(C=S)-、-OCH2 (C=O)NR7 -、-NH(SO2 )-、-NH(SO2 )NR7 -、-OR8 -、-NHR8 -及-SR8 -； R6 係選自
    Figure 03_image031
    、
    Figure 03_image033
    、
    Figure 03_image035
    、
    Figure 03_image037
    、
    Figure 03_image039
    、
    Figure 03_image041
    、
    Figure 03_image043
    、
    Figure 03_image045
    、
    Figure 03_image047
    、
    Figure 03_image049
    、
    Figure 03_image051
    、
    Figure 03_image053
    、
    Figure 03_image055
    、
    Figure 03_image057
    、
    Figure 03_image059
    、
    Figure 03_image061
    、
    Figure 03_image063
    、
    Figure 03_image065
    、
    Figure 03_image067
    、
    Figure 03_image069
    、
    Figure 03_image071
    、
    Figure 03_image073
    、
    Figure 03_image075
    、
    Figure 03_image077
    、
    Figure 03_image079
    、
    Figure 03_image081
    、
    Figure 03_image083
    、
    Figure 03_image085
    、
    Figure 03_image087
    、
    Figure 03_image089
    、
    Figure 03_image091
    及
    Figure 03_image093
    ； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； 各E包含Fc域單體、白蛋白、白蛋白結合肽或Fc結合肽； n為1或2； T為1至20之整數；且 L係共價附接至E及A1 中每一者之連接體， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  175. 一種由式(M-I)描述之結合物：
    Figure 03_image897
    (M-I) 其中各A1 係獨立地選自式(A-VI)-(A-IX)中任一者：
    Figure 03_image015
    、
    Figure 03_image017
    、
    Figure 03_image019
    、
    Figure 03_image021
    ； (A-VI)                       (A-VII)            (A-VIII)             (A-IX) 其中R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ； R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br； R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H； R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ； X係選自-O-及-S-； Y係選自-O-、-S-、-NR7 -、-O(C=O)NR7 -、-O(C=S)NR7 -、-O(C=O)O-、-O(C=O)-、-NH(C=O)O-、-NH(C=O)-、-NH(C=NH)-、-NH(C=O)NR7 -、-NH(C=NH)NR7 -、-NH(C=S)NR7 -、-NH(C=S)-、-OCH2 (C=O)NR7 -、-NH(SO2 )-、-NH(SO2 )NR7 -、-OR8 -、-NHR8 -及-SR8 -； R6 係選自
    Figure 03_image031
    、
    Figure 03_image033
    、
    Figure 03_image035
    、
    Figure 03_image037
    、
    Figure 03_image039
    、
    Figure 03_image041
    、
    Figure 03_image043
    、
    Figure 03_image045
    、
    Figure 03_image047
    、
    Figure 03_image049
    、
    Figure 03_image051
    、
    Figure 03_image053
    、
    Figure 03_image055
    、
    Figure 03_image057
    、
    Figure 03_image059
    、
    Figure 03_image061
    、
    Figure 03_image063
    、
    Figure 03_image065
    、
    Figure 03_image067
    、
    Figure 03_image069
    、
    Figure 03_image071
    、
    Figure 03_image073
    、
    Figure 03_image075
    、
    Figure 03_image077
    、
    Figure 03_image079
    、
    Figure 03_image081
    、
    Figure 03_image083
    、
    Figure 03_image085
    、
    Figure 03_image087
    、
    Figure 03_image089
    、
    Figure 03_image091
    及
    Figure 03_image093
    ； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； 各E包含Fc域單體、白蛋白、白蛋白結合肽或Fc結合肽； n為1或2； T為1至20之整數；且 L係共價附接至E及A1 中每一者之連接體， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  176. 如申請專利範圍第173項至第175項中任一項之結合物，其中T為2至20之整數， 其中E結合於一或多個第一A1 -L部分，其中各A1 係獨立地選自式(A-III)-(A-V)中任一者：
    Figure 03_image009
    、
    Figure 03_image011
    、
    Figure 03_image013
    ； (A-III)     ··· ·    (A-IV)                    (A-V) 且其中E結合於一或多個第二A1 -L-A2 部分，其中各A1 係獨立地選自式(A-I)、(A-II)、(A-VI)、(A-VII)、(A-VIII)及(A-IX)中任一者：
    Figure 03_image005
    、
    Figure 03_image007
    、
    Figure 03_image015
    、
    Figure 03_image017
    、
    Figure 03_image019
    、 (A-I)                   (A-II)                 (A-VI)             (A-VII)           (A-VIII)
    Figure 03_image021
    。 (A-IX)
  177. 如申請專利範圍第176項之結合物，其中該等第一A1 -L部分各自特異性地結合於E之表面暴露離胺酸殘基的氮原子，且該等第二A1 -L部分各自特異性地結合於E之表面暴露半胱胺酸殘基的硫原子。
  178. 如申請專利範圍第176項之結合物，其中該等第一A1 -L部分各自特異性地結合於E之表面暴露半胱胺酸殘基的硫原子，且該等第二A1 -L部分各自特異性地結合於E之表面暴露離胺酸殘基的氮原子。
  179. 如申請專利範圍第176項至第178項中任一項之結合物，其中結合於E之第一A1 -L部分的數目為1至10之整數。
  180. 如申請專利範圍第176項至第179項中任一項之結合物，其中結合於E之第二A1 -L部分的數目為1至10之整數。
  181. 如申請專利範圍第173項或第174項之結合物，其中該結合物係由式(M-II)描述：
    Figure 03_image915
    (M-II) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  182. 如申請專利範圍第181項之結合物，其中該結合物係由式(M-II-1)描述：
    Figure 03_image917
    (M-II-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  183. 如申請專利範圍第182項之結合物，其中該結合物係由式(M-II-2)描述：
    Figure 03_image919
    (M-II-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  184. 如申請專利範圍第183項之結合物，其中該結合物係由式(M-II-3)描述：
    Figure 03_image921
    (M-II-3) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 為1至20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  185. 如申請專利範圍第182項之結合物，其中該結合物係由式(M-II-4)描述：
    Figure 03_image923
    (M-II-4) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  186. 如申請專利範圍第185項之結合物，其中該結合物係由式(M-II-5)描述：
    Figure 03_image925
    (M-II-5) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 為1至20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  187. 如申請專利範圍第186項之結合物，其中該結合物具有結構
    Figure 03_image927
    或其醫藥學上可接受之鹽。
  188. 如申請專利範圍第181項之結合物，其中該結合物係由式(M-II-6)描述：
    Figure 03_image929
    ， (M-II-6) 其中R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； 或其醫藥學上可接受之鹽。
  189. 如申請專利範圍第188項之結合物，其中該結合物係由式(M-II-7)描述：
    Figure 03_image2298
    ， (M-II-7) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  190. 如申請專利範圍第188項之結合物，其中該結合物係由式(M-II-8)描述：
    Figure 03_image933
    (M-II-8) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 為1至20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  191. 如申請專利範圍第190項之結合物，其中該結合物具有結構
    Figure 03_image935
    或其醫藥學上可接受之鹽。
  192. 如申請專利範圍第188項之結合物，其中該結合物係由式(M-II-9)描述：
    Figure 03_image937
    (M-II-9) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  193. 如申請專利範圍第192項之結合物，其中該結合物係由式(M-II-10)描述：
    Figure 03_image939
    (M-II-10) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 為1至20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  194. 如申請專利範圍第193項之結合物，其中該結合物具有結構
    Figure 03_image941
    或其醫藥學上可接受之鹽。
  195. 如申請專利範圍第174項或第175項之結合物，其中該結合物係由式(M-III)描述：
    Figure 03_image943
    (M-III) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  196. 如申請專利範圍第195項之結合物，其中該結合物係由式(M-III-1)描述：
    Figure 03_image945
    (M-III-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  197. 如申請專利範圍第196項之結合物，其中該結合物係由式(M-III-2)描述：
    Figure 03_image947
    (M-III-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  198. 如申請專利範圍第197項之結合物，其中該結合物係由式(M-III-3)描述：
    Figure 03_image949
    (M-III-3) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  199. 如申請專利範圍第196項之結合物，其中該結合物係由式(M-III-4)描述：
    Figure 03_image951
    (M-III-4) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  200. 如申請專利範圍第199項之結合物，其中該結合物係由式(M-III-5)描述：
    Figure 03_image953
    (M-III-5) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  201. 如申請專利範圍第196項之結合物，其中該結合物係由式(M-III-6)描述：
    Figure 03_image955
    (M-III-6) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  202. 如申請專利範圍第201項之結合物，其中該結合物係由式(M-III-7)描述：
    Figure 03_image957
    (M-III-7) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  203. 如申請專利範圍第196項之結合物，其中該結合物係由式(M-III-8)描述：
    Figure 03_image959
    (M-III-8) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  204. 如申請專利範圍第203項之結合物，其中該結合物係由式(M-III-9)描述：
    Figure 03_image961
    (M-III-9) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  205. 如申請專利範圍第173項或第174項之結合物，其中該結合物係由式(M-IV)描述：
    Figure 03_image963
    (M-IV) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  206. 如申請專利範圍第205項之結合物，其中該結合物係由式(M-IV-1)描述：
    Figure 03_image965
    (M-IV-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  207. 如申請專利範圍第206項之結合物，其中該結合物係由式(M-IV-2)描述：
    Figure 03_image967
    (M-IV-2) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  208. 如申請專利範圍第173項或第174項之結合物，其中該結合物係由式(M-V)描述：
    Figure 03_image969
    (M-V) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  209. 如申請專利範圍第208項之結合物，其中該結合物係由式(M-V-1)描述：
    Figure 03_image971
    (M-V-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  210. 如申請專利範圍第209項之結合物，其中該結合物係由式(M-V-2)描述：
    Figure 03_image973
    (M-V-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  211. 如申請專利範圍第210項之結合物，其中該結合物係由式(M-V-3)描述：
    Figure 03_image975
    (M-V-3) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 為1至20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  212. 如申請專利範圍第209項之結合物，其中該結合物係由式(M-V-4)描述：
    Figure 03_image977
    (M-V-4) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  213. 如申請專利範圍第212項之結合物，其中該結合物係由式(M-V-5)描述：
    Figure 03_image979
    (M-V-5) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 為1至20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  214. 如申請專利範圍第208項之結合物，其中該結合物係由式(M-V-6)描述：
    Figure 03_image981
    (M-V-6) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  215. 如申請專利範圍第214項之結合物，其中該結合物係由式(M-V-7)描述：
    Figure 03_image983
    (M-V-7) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  216. 如申請專利範圍第215項之結合物，其中該結合物係由式(M-V-8)描述：
    Figure 03_image985
    (M-V-8) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 為1至20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  217. 如申請專利範圍第214項之結合物，其中該結合物係由式(M-V-9)描述：
    Figure 03_image987
    (M-V-9) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  218. 如申請專利範圍第217項之結合物，其中該結合物係由式(M-V-10)描述：
    Figure 03_image989
    (M-V-10) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 為1至20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  219. 如申請專利範圍第173項或第174項之結合物，其中該結合物係由式(M-VI)描述：
    Figure 03_image991
    (M-VI) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  220. 如申請專利範圍第219項之結合物，其中該結合物係由式(M-VI-1)描述：
    Figure 03_image993
    (M-VI-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  221. 如申請專利範圍第220項之結合物，其中該結合物係由式(M-VI-2)描述：
    Figure 03_image995
    (M-VI-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  222. 如申請專利範圍第221項之結合物，其中該結合物係由式(M-VI-3)描述：
    Figure 03_image997
    (M-VI-3) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  223. 如申請專利範圍第220項之結合物，其中該結合物係由式(M-VI-4)描述：
    Figure 03_image999
    (M-VI-4) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  224. 如申請專利範圍第223項之結合物，其中該結合物係由式(M-VI-5)描述：
    Figure 03_image1001
    (M-VI-5) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  225. 如申請專利範圍第220項之結合物，其中該結合物係由式(M-VI-6)描述：
    Figure 03_image1003
    (M-VI-6) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  226. 如申請專利範圍第225項之結合物，其中該結合物係由式(M-VI-7)描述：
    Figure 03_image1005
    (M-VI-7) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  227. 如申請專利範圍第220項之結合物，其中該結合物係由式(M-VI-8)描述：
    Figure 03_image1007
    (M-VI-8) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  228. 如申請專利範圍第227項之結合物，其中該結合物係由式(M-VI-9)描述：
    Figure 03_image1009
    (M-VI-9) 其中L’係L之剩餘部分，且3 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  229. 如申請專利範圍第173項或第174項之結合物，其中該結合物係由式(M-VII)描述：
    Figure 03_image1011
    (M-VII) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  230. 如申請專利範圍第173項至第229項中任一項之結合物，其中R1 為OH。
  231. 如申請專利範圍第173項至第229項中任一項之結合物，其中R1 為NH2 。
  232. 如申請專利範圍第173項至第229項中任一項之結合物，其中R1 為-NHC(=NH)NH2 。
  233. 如申請專利範圍第173項或第174項之結合物，其中該結合物係由式(M-VIII)描述：
    Figure 03_image1013
    (M-VIII) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  234. 如申請專利範圍第233項之結合物，其中該結合物係由式(M-VIII-1)描述：
    Figure 03_image1015
    (M-VIII-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  235. 如申請專利範圍第234項之結合物，其中該結合物係由式(M-VIII-2)描述：
    Figure 03_image1017
    (M-VIII-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  236. 如申請專利範圍第235項之結合物，其中該結合物係由式(M-VIII-3)描述：
    Figure 03_image1019
    (M-VIII-3) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 為1至20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  237. 如申請專利範圍第234項之結合物，其中該結合物係由式(M-VIII-4)描述：
    Figure 03_image1021
    (M-VIII-4) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  238. 如申請專利範圍第237項之結合物，其中該結合物係由式(M-VIII-5)描述：
    Figure 03_image1023
    (M-VIII-5) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 為1至20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  239. 如申請專利範圍第238項之結合物，其中該結合物具有結構
    Figure 03_image1025
    或其醫藥學上可接受之鹽。
  240. 如申請專利範圍第234項之結合物，其中該結合物係由式(M-VIII-6)描述：
    Figure 03_image1027
    (M-VIII-6) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  241. 如申請專利範圍第240項之結合物，其中該結合物係由式(M-VIII-7)描述：
    Figure 03_image1029
    (M-VIII-7) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  242. 如申請專利範圍第234項之結合物，其中該結合物係由式(M-VIII-8)描述：
    Figure 03_image1031
    (M-VIII-8) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  243. 如申請專利範圍第242項之結合物，其中該結合物係由式(M-VIII-9)描述：
    Figure 03_image1033
    (M-VIII-9) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  244. 如申請專利範圍第234項之結合物，其中該結合物係由式(M-VIII-10)描述：
    Figure 03_image1035
    (M-VIII-10) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  245. 如申請專利範圍第244項之結合物，其中該結合物係由式(M-VIII-11)描述：
    Figure 03_image1037
    (M-VIII-11) 其中L’係L之剩餘部分，且 y1 及y2 各自獨立地為1-20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  246. 如申請專利範圍第173項或第174項之結合物，其中該結合物係由式(M-IX)描述：
    Figure 03_image1039
    (M-IX) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  247. 如申請專利範圍第246項之結合物，其中該結合物係由式(M-IX-1)描述：
    Figure 03_image1041
    (M-IX-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  248. 如申請專利範圍第247項之結合物，其中該結合物係由式(M-IX-2)描述：
    Figure 03_image1043
    (M-IX-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  249. 如申請專利範圍第247項之結合物，其中該結合物係由式(M-IX-3)描述：
    Figure 03_image1045
    (M-IX-3) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  250. 如申請專利範圍第247項之結合物，其中該結合物係由式(M-IX-4)描述：
    Figure 03_image1047
    (M-IX-4) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  251. 如申請專利範圍第247項之結合物，其中該結合物係由式(M-IX-5)描述：
    Figure 03_image1049
    (M-IX-5) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  252. 如申請專利範圍第247項之結合物，其中該結合物係由式(M-IX-6)描述：
    Figure 03_image1051
    (M-IX-6) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  253. 如申請專利範圍第173項或第174項之結合物，其中該結合物係由式(M-X)描述：
    Figure 03_image2350
    (M-X) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  254. 如申請專利範圍第253項之結合物，其中該結合物係由式(M-X-1)描述：
    Figure 03_image2352
    (M-X-1) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  255. 如申請專利範圍第254項之結合物，其中該結合物係由式(M-X-2)描述：
    Figure 03_image2354
    (M-X-2) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  256. 如申請專利範圍第254項之結合物，其中該結合物係由式(M-X-3)描述：
    Figure 03_image1334
    (M-X-3) 或其醫藥學上可接受之鹽。
  257. 一種由式(M’-I)描述之結合物：
    Figure 03_image1125
    (M’-I) 其中各A1 係獨立地選自式(A-III)-(A-V)中任一者：
    Figure 03_image009
    、
    Figure 03_image011
    、
    Figure 03_image013
    ； (A-III)                (A-IV)                    (A-V) 各A2 係獨立地選自式(A-I)、(A-II)、(A-VI)、(A-VII)、(A-VIII)及(A-IX)中任一者：
    Figure 03_image005
    、
    Figure 03_image007
    、
    Figure 03_image015
    、
    Figure 03_image017
    、
    Figure 03_image019
    、 (A-I)                   (A-II)              (A-VI)              (A-VII)           (A-VIII)
    Figure 03_image021
    ； (A-IX) R1 係選自-OH、-NH2 、-NHC(=NH)NH2 及-NHC(=NH)NHR6 ； R2 及R3 各自獨立地選自-H、-OH、-F、-Cl及-Br； R4 係選自-CO2 H、-P(=O)(OH)2 、-SO3 H； R5 係選自-COCH3 、-COCF3 、-SO2 CH3 ； X係選自-O-及-S-； Y係選自
    Figure 03_image2357
    Figure 03_image2359
    R6 係選自
    Figure 03_image031
    、
    Figure 03_image033
    、
    Figure 03_image035
    、
    Figure 03_image037
    、
    Figure 03_image039
    、
    Figure 03_image041
    、
    Figure 03_image043
    、
    Figure 03_image045
    、
    Figure 03_image047
    、
    Figure 03_image049
    、
    Figure 03_image051
    、
    Figure 03_image053
    、
    Figure 03_image055
    、
    Figure 03_image057
    、
    Figure 03_image059
    、
    Figure 03_image061
    、
    Figure 03_image063
    、
    Figure 03_image065
    、
    Figure 03_image067
    、
    Figure 03_image069
    、
    Figure 03_image071
    、
    Figure 03_image073
    、
    Figure 03_image075
    、
    Figure 03_image077
    、
    Figure 03_image079
    、
    Figure 03_image081
    、
    Figure 03_image083
    、
    Figure 03_image085
    、
    Figure 03_image087
    、
    Figure 03_image089
    、
    Figure 03_image091
    及
    Figure 03_image093
    ； R7 係選自H、C1-C20烷基、C3-C20環烷基、C3-C20雜環烷基；C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； R8 係選自C3-C20雜環烷基、C5-C15芳基及C2-C15雜芳基； 各E包含Fc域單體、白蛋白、白蛋白結合肽或Fc結合肽； n為1或2； T1 及T2 各自獨立地為1至10之整數； L1 係共價附接至E及A1 之連接體； L2 係共價附接至E及A2 之連接體， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  258. 如申請專利範圍第257項之結合物，其中各A1 -L特異性地結合於E之表面暴露離胺酸殘基的氮原子，且各A2 -L特異性地結合於E之表面暴露半胱胺酸殘基的硫原子。
  259. 如申請專利範圍第257項之結合物，其中各A1 -L特異性地結合於E之表面暴露半胱胺酸殘基的硫原子，且各A2 -L特異性地結合於E之表面暴露離胺酸殘基的氮原子。
  260. 如申請專利範圍第173項至第259項中任一項之結合物，其中L或L’包含一或多個視情況經取代C1-C20伸烷基、視情況經取代C1-C20伸雜烷基、視情況經取代C2-C20伸烯基、視情況經取代C2-C20伸雜烯基、視情況經取代C2-C20伸炔基、視情況經取代C2-C20伸雜炔基、視情況經取代C3-C20伸環烷基、視情況經取代C3-C20伸雜環烷基、視情況經取代C4-C20伸環烯基、視情況經取代C4-C20伸雜環烯基、視情況經取代C8-C20伸環炔基、視情況經取代C8-C20伸雜環炔基、視情況經取代C5-C15伸芳基、視情況經取代C2-C15伸雜芳基、O、S、NRi 、P、羰基、硫羰基、磺醯基、磷酸酯基、磷醯基或亞胺基， 其中Ri 為H、視情況經取代C1-C20烷基、視情況經取代C1-C20雜烷基、視情況經取代C2-C20烯基、視情況經取代C2-C20雜烯基、視情況經取代C2-C20炔基、視情況經取代C2-C20雜炔基、視情況經取代C3-C20環烷基、視情況經取代C3-C20雜環烷基、視情況經取代C4-C20環烯基、視情況經取代C4-C20雜環烯基、視情況經取代C8-C20環炔基、視情況經取代C8-C20雜環炔基、視情況經取代C5-C15芳基或視情況經取代C2-C15雜芳基。
  261. 如申請專利範圍第260項之結合物，其中L或L’之骨架係由一或多個視情況經取代C1-C20伸烷基、視情況經取代C1-C20伸雜烷基、視情況經取代C2-C20伸烯基、視情況經取代C2-C20伸雜烯基、視情況經取代C2-C20伸炔基、視情況經取代C2-C20伸雜炔基、視情況經取代C3-C20伸環烷基、視情況經取代C3-C20伸雜環烷基、視情況經取代C4-C20伸環烯基、視情況經取代C4-C20伸雜環烯基、視情況經取代C8-C20伸環炔基、視情況經取代C8-C20伸雜環炔基、視情況經取代C5-C15伸芳基、視情況經取代C2-C15伸雜芳基、O、S、NRi 、P、羰基、硫羰基、磺醯基、磷酸酯基、磷醯基或亞胺基組成， 其中Ri 為H、視情況經取代C1-C20烷基、視情況經取代C1-C20雜烷基、視情況經取代C2-C20烯基、視情況經取代C2-C20雜烯基、視情況經取代C2-C20炔基、視情況經取代C2-C20雜炔基、視情況經取代C3-C20環烷基、視情況經取代C3-C20雜環烷基、視情況經取代C4-C20環烯基、視情況經取代C4-C20雜環烯基、視情況經取代C8-C20環炔基、視情況經取代C8-C20雜環炔基、視情況經取代C5-C15芳基或視情況經取代C2-C15雜芳基。
  262. 如申請專利範圍第260項或第261項之結合物，其中L或L’係經側氧基取代。
  263. 如申請專利範圍第173項至第262項中任一項之結合物，其中L或L’之骨架包含不超過250個原子。
  264. 如申請專利範圍第173項至第263項中任一項之結合物，其中L或L’能夠形成醯胺、胺基甲酸酯、磺醯基或脲連接。
  265. 如申請專利範圍第173項至第259項中任一項之結合物，其中L或L’為鍵。
  266. 如申請專利範圍第173項至第259項中任一項之結合物，其中L或L’為原子。
  267. 如申請專利範圍第173項至第266項中任一項之結合物，其中各L係由式(M-L-I)描述： J1 -(Q1 )g -(T1 )h -(Q2 )i -(T2 )j -(Q3 )k -(T3 )l -(Q4 )m -(T4 )n -(Q5 )o -J2 其中J1 係附接A1 之鍵； J2 係附接至E之鍵或能夠與結合於E之官能基反應的官能基(例如，順丁烯二醯亞胺及半胱胺酸、胺及經活化羧酸、硫醇及順丁烯二醯亞胺、經活化磺酸及胺、異氰酸酯及胺、疊氮化物及炔以及烯烴及四嗪)； Q1 、Q2 、Q3 、Q4 及Q5 各自獨立地為視情況經取代C1-C20伸烷基、視情況經取代C1-C20伸雜烷基、視情況經取代C2-C20伸烯基、視情況經取代C2-C20伸雜烯基、視情況經取代C2-C20伸炔基、視情況經取代C2-C20伸雜炔基、視情況經取代C3-C20伸環烷基、視情況經取代C3-C20伸雜環烷基、視情況經取代C4-C20伸環烯基、視情況經取代C4-C20伸雜環烯基、視情況經取代C8-C20伸環炔基、視情況經取代C8-C20伸雜環炔基、視情況經取代C5-C15伸芳基或視情況經取代C2-C15伸雜芳基； T1 、T2 、T3 、T4 各自獨立地為O、S、NRi 、P、羰基、硫羰基、磺醯基、磷酸酯基、磷醯基或亞胺基； Ri 為H、視情況經取代C1-C20烷基、視情況經取代C1-C20雜烷基、視情況經取代C2-C20烯基、視情況經取代C2-C20雜烯基、視情況經取代C2-C20炔基、視情況經取代C2-C20雜炔基、視情況經取代C3-C20環烷基、視情況經取代C3-C20雜環烷基、視情況經取代C4-C20環烯基、視情況經取代C4-C20雜環烯基、視情況經取代C8-C20環炔基、視情況經取代C8-C20雜環炔基、視情況經取代C5-C15芳基或視情況經取代C2-C15雜芳基；且g、h、i、j、k、l、m、n及o各自獨立地為0或1。
  268. 如申請專利範圍第1項至第267項中任一項之結合物，其中R1 為-NHC(=NH)NH2 。
  269. 如申請專利範圍第1項至第268項中任一項之結合物，其中R2 為-F。
  270. 如申請專利範圍第1項至第269項中任一項之結合物，其中R3 為-F。
  271. 如申請專利範圍第1項至第270項中任一項之結合物，其中R4 為–CO2 H。
  272. 如申請專利範圍第1項至第271項中任一項之結合物，其中R5 為–COCH3 。
  273. 如申請專利範圍第57項至第272項中任一項之結合物，其中L共價附接至E之表面暴露離胺酸的氮原子。
  274. 如申請專利範圍第57項至第272項中任一項之結合物，其中L共價附接至E之表面暴露半胱胺酸的硫原子。
  275. 如申請專利範圍第57項至第274項中任一項之結合物，其中各E為Fc域單體。
  276. 如申請專利範圍第275項之結合物，其中n為2，且各E二聚以形成Fc域。
  277. 如申請專利範圍第57項至第59項中任一項之結合物，其中n為2，各E為Fc域單體，各E二聚以形成Fc域，且該結合物係由式(D-I-1)描述：
    Figure 03_image1105
    (D-I-1) 其中J為Fc域；且 T為1至20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  278. 如申請專利範圍第173項至第175項中任一項之結合物，其中n為2，各E為Fc域單體，各E二聚以形成Fc域，且該結合物係由式(M-I-1)描述：
    Figure 03_image1107
    (M-I-1) 其中J為Fc域；且 T為1至20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  279. 如申請專利範圍第275項至第278項中任一項之結合物，其中各E具有SEQ ID NO: 1-68中任一者之序列。
  280. 如申請專利範圍第275項至第279項中任一項之結合物，其中T為1、2、3、4或5。
  281. 一種如申請專利範圍第275項至第280項中任一項之結合物之群體，其中T之平均值為1至5。
  282. 如申請專利範圍第57項至第274項中任一項之結合物，其中各E為白蛋白、白蛋白結合肽或Fc結合肽。
  283. 如申請專利範圍第252項之結合物，其中n為1。
  284. 如申請專利範圍第57項至第59項中任一項之結合物，其中n為1，E為白蛋白、白蛋白結合肽或Fc結合肽且該結合物係由式(D-I-2)描述：
    Figure 03_image1109
    (D-I-2) 其中E為白蛋白、白蛋白結合肽或Fc結合肽；且 T為1至20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  285. 如申請專利範圍第173項至第175項中任一項之結合物，其中n為1，E為白蛋白、白蛋白結合肽或Fc結合肽，且該結合物係由式(M-I-2)描述：
    Figure 03_image1111
    (M-I-2) 其中E為白蛋白、白蛋白結合肽或Fc結合肽；且 T為1至20之整數， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  286. 如申請專利範圍第282項至第285項中任一項之結合物，其中E為具有SEQ ID NO: 69-71中任一者之序列的白蛋白。
  287. 如申請專利範圍第282項至第285項中任一項之結合物，其中T為1、2、3、4或5。
  288. 一種如申請專利範圍第282項至第287項中任一項之結合物之群體，其中T之平均值為1至5。
  289. 一種醫藥組合物，其包含如申請專利範圍第1項至第288項中任一項之結合物或其醫藥學上可接受之鹽，及醫藥學上可接受之賦形劑。
  290. 一種用於治療具有病毒感染或據推測具有病毒感染之個體之方法，該方法包括向該個體投與有效量的如申請專利範圍第1項至第289項中任一項之結合物或組合物。
  291. 一種用於預防性治療有需要之個體的病毒感染之方法，該方法包括向該個體投與有效量的如申請專利範圍第1項至第289項中任一項之結合物或組合物。
  292. 如申請專利範圍第290項或第291項之方法，其中該病毒感染係由流感病毒或副流感病毒引起。
  293. 如申請專利範圍第290項至第292項中任一項之方法，其中該病毒感染為A型、B型或C型流感病毒或副流感病毒。
  294. 如申請專利範圍第290項至第293項中任一項之方法，其中該個體係免疫受損的。
  295. 如申請專利範圍第290項至第294項中任一項之方法，其中該個體已經診斷患有體液免疫缺乏、T細胞缺乏、嗜中性白血球減少症、無脾或補體缺乏。
  296. 如申請專利範圍第290項至第295項中任一項之方法，其中該個體正在經免疫抑制性療法治療或即將經免疫抑制性療法治療。
  297. 如申請專利範圍第290項至第296項中任一項之方法，其中該個體已經診斷患有引起免疫抑制之疾病。
  298. 如申請專利範圍第297項之方法，其中該疾病為癌症或獲得性免疫缺乏症候群。
  299. 如申請專利範圍第298項之方法，其中該癌症為白血病、淋巴瘤或多發性骨髓瘤。
  300. 如申請專利範圍第290項至第299項中任一項之方法，其中該個體已經受或即將經受造血幹細胞移植。
  301. 如申請專利範圍第290項至第300項中任一項之方法，其中該個體已經受或即將經受器官移植。
  302. 如申請專利範圍第290項至第301項中任一項之方法，其中該結合物或組合物係肌肉內、靜脈內、皮內、動脈內、腹膜內、病變內、顱內、關節內、前列腺內、胸膜內、氣管內、鼻內、玻璃體內、陰道內、直腸內、經表面、腫瘤內、經腹膜、皮下、結膜下、囊內、經黏膜、心包內、臍內、眼內、經口、經局部、藉由吸入、藉由注射或藉由輸注投與。
  303. 如申請專利範圍第290項至第302項中任一項之方法，其中該個體經第二治療劑治療。
  304. 如申請專利範圍第303項之方法，其中該第二治療劑為抗病毒劑。
  305. 如申請專利範圍第304項之方法，其中該抗病毒劑係選自奧司他韋(oseltamivir)、紮那米韋(zanamivir)、帕拉米韋(peramivir)、拉尼米韋(laninamivir)、金剛烷胺或金剛乙胺。
  306. 如申請專利範圍第303項之方法，其中該第二治療劑為抗病毒疫苗。
  307. 如申請專利範圍第306項之方法，其中該抗病毒疫苗在該個體中引起針對A型、B型或C型流感病毒或副流感病毒之免疫反應。
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