CN114980933A - 用于治疗病毒感染的组合物和方法 - Google Patents

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J·科尔
Q-Q·T·杜
S·德尔曼
江万龙
林成
A·农科维奇
L·W·塔里
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Abstract

用于治疗病毒感染的组合物和方法包括含有连接于Fc单体、Fc结构域、Fc结合肽、白蛋白蛋白或白蛋白结合肽的病毒神经氨酸酶抑制剂(例如，扎那米韦、帕拉米韦或其类似物)的缀合物。具体地说，缀合物可用于治疗病毒感染(例如，流感病毒感染)。

Description

用于治疗病毒感染的组合物和方法
背景技术
对于用于流感的新颖抗病毒治疗的需求很显著且在医学领域中尤其至关重要。流感病毒(流感的病原体)或流感每年造成三百万至五百万例严重疾患，且在全世界造成大约500,000例死亡。尽管大多数人在约一周至两周内完全地自流感恢复，但其他人会发展危及生命的并发症，诸如肺炎。因此，流感可以是致命的，尤其对于年轻人、老人或慢性病患。具有虚弱或受损免疫系统的人诸如具有晚期HIV感染的人或移植患者(其免疫系统在医学上受到抑制以预防移植器官排斥)处于与流感相关的并发症的较大风险中。怀孕妇女及幼儿也处于并发症的高风险中。
用于流感的抗病毒治疗的开发已是一项持续挑战。数种流感抗病毒剂已经批准用于临床，且当制备疫苗时，这些剂在调节疾病严重程度及控制流行病方面发挥重要作用。然而，已出现针对最常用的抑制剂的耐药性菌株。
流感抗病毒剂主要靶向在流感病毒粒子的表面上呈现的蛋白质。流感病毒的包膜含有两种免疫显性糖蛋白，即血球凝集素及神经氨酸酶，其在病毒感染和扩散中发挥关键作用。血球凝集素经由其与表面唾液酸的相互作用实现所述病毒对宿主细胞的附着，从而开始进入。神经氨酸酶是外切糖苷酶，其在受感染宿主细胞的表面上裂解聚糖结构中的唾液酸(末端神经胺糖酸残基)，从而释放后代病毒且允许所述病毒自所述宿主细胞扩散至未受感染的周围细胞。神经氨酸酶的抑制因此充当抗病毒药物的药理学靶标。已经确定了用于减少病毒扩散的病毒神经氨酸酶抑制剂，包括奥司他韦(oseltamivir)(TamifluTM)、扎那米韦(zanamivir)(RelenzaTM)和帕拉米韦(peramivir)(RapivabTM)。
然而，移植接受者的流感的特征仍在于延长的病毒遮蔽，从而增加发展耐药性菌株的可能性。需要用于治疗流感的新的更有效疗法。
发明内容
本公开涉及用于抑制病毒生长的缀合物、组合物及方法，及用于治疗病毒感染的方法。具体地说，所述缀合物含有抑制流感病毒神经氨酸酶的部分(例如，扎那米韦、帕拉米韦或其类似物)的单体或二聚体，其缀合于Fc单体、Fc结构域、Fc结合肽、白蛋白或白蛋白结合肽。所述缀合物中的神经氨酸酶抑制剂(例如，扎那米韦、帕拉米韦或其类似物)靶向在病毒粒子的表面上的神经氨酸酶。所述缀合物中的Fc单体或Fc结构域结合于免疫细胞(例如，嗜中性粒细胞)上的FcγR(例如，FcRn、FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIc、FcγRIIIa及FcγRIIIb)以活化吞噬作用及效应子功能，诸如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，因此导致免疫细胞吞没及破坏病毒粒子且进一步增强所述缀合物的抗病毒活性。所述白蛋白或白蛋白结合肽可延长缀合物的半衰期，例如通过使白蛋白结合于再循环新生儿Fc受体。所述组合物可用于抑制病毒生长的方法及治疗病毒感染(诸如由流感病毒A、流感病毒B及流感病毒C引起的病毒感染)的方法。
在第一方面中，本发明提供一种由以下中任一者来描述的缀合物：式(D-I)、(M-I)、(1)或(2)
Figure BDA0003630331990000021
其中每个A1及每个A2独立地选自式(A-I)-(A-XII)中任一者：
Figure BDA0003630331990000031
其中R1选自-OH、-NH2、-NHC(＝NH)NH2及-NHC(＝NH)NHR6；R2及R3各自独立地选自-H、-OH、-F、-Cl及-Br；R4选自-CO2H、-P(＝O)(OH)2、-SO3H；R5选自-COCH3、-COCF3、-SO2CH3；X选自-O-及-S-；Y选自
Figure BDA0003630331990000041
R6选自
Figure BDA0003630331990000042
Figure BDA0003630331990000043
R7选自H、C1-C20烷基、C3-C20环烷基、C3-C20杂环烷基；C5-C15芳基及C2-C15杂芳基；R8选自C3-C20杂环烷基、C5-C15芳基及C2-C15杂芳基；
n为1或2；
每个E包含Fc结构域单体、白蛋白、白蛋白结合肽或Fc结合肽；
L为共价附接于E且附接于每个A1或每个A1及A2的每个Y的接头；
T为1至20的整数，且
式(D-I)、(M-I)、(1)或(2)中的每条波浪线指示L共价附接于每个E；
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，n为1且每个E包含Fc结构域单体(例如，具有SEQ ID NO:1-138中任一者的序列的Fc结构域单体)、白蛋白(例如，具有SEQ ID NO:139-141中任一者的序列的白蛋白)、白蛋白结合肽或Fc结合肽；
在一些实施方案中，n为2且每个E包含Fc结构域单体(例如，具有SEQ ID NO:1-138中任一者的序列的Fc结构域单体)，其中Fc结构域单体二聚以形成Fc结构域；
L是共价附接于每个E且附接于每个Y或每个A1及/或A2的接头；
T为1至20的整数(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，且式(D-I)、(M-I)、(1)或(2)中的每条波浪线指示L共价附接(例如，借助于共价键或接头)至每个E；或其药学上可接受的盐。当T大于1(例如，T为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)时，每个A1-L或每个A1-L-A2可以独立地经选择(例如，独立地选自本文所述的A1-L或A1-L-A2结构中任一者)。
在本文所述的任何方面的优选实施方案中，n为2且每个E包含Fc结构域单体(例如，具有SEQ ID NO:1-138中任一者的序列的Fc结构域单体)。在具有两个Fc结构域单体的缀合物(例如，式(1)、式(2)、式(D-I)(其中n等于2)或(M-I)(其中n等于2)缀合物)中，Fc结构域单体二聚以形成Fc结构域。
在另一个方面中，本发明提供一种由以下来描述的缀合物：式(D-I)
Figure BDA0003630331990000061
其中每个E包含Fc结构域单体(例如，具有SEQ ID NO:1-138中任一者的序列的Fc结构域单体)；每个A1-L-A2中的L是共价附接于E中铰链半胱氨酸的硫原子且附接于A1及A2中每一者的接头；n为1或2(例如，当n为2时，两个Fc结构域单体二聚以形成Fc结构域)；T为1至20的整数(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，且连接于E的波浪线指示每个A1-L-A2共价附接(例如，借助于共价键或接头)至E中铰链半胱氨酸的硫原子，或其药学上可接受的盐。当T大于1(例如，T为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)时，每个A1-L-A2可独立地经选择(例如，独立地选自本文所述的A1-L-A2结构中任一者)。
在另一个方面中，本发明提供一种由以下来描述的缀合物：式(D-I)
Figure BDA0003630331990000071
其中每个E包含Fc结构域单体(例如，具有SEQ ID NO:1-138中任一者的序列的Fc结构域单体)；每个A1-L-A2中的L是共价附接于E中表面暴露赖氨酸的氮原子且附接于A1及A2中每一者的接头；n为1或2(例如，当n为2时，两个Fc结构域单体二聚以形成Fc结构域)；T为1至20的整数(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，且连接于E的波浪线指示每个A1-L-A2共价附接(例如，借助于共价键或接头)至E中表面暴露赖氨酸的氮原子，或其药学上可接受的盐。当T大于1(例如，T为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)时，每个A1-L-A2可独立地经选择(例如，独立地选自本文所述的A1-L-A2结构中任一者)。在一些实施方案中，A1及A2中的每一者可独立地选自式(A-I)、(A-II)、(A-VI)或(A-VII)中任一者。在其他实施方案中，A1及A2中的每一者可独立地选自式(A-I)。
在另一个方面中，本发明提供一种由以下来描述的缀合物：式(M-I)
Figure BDA0003630331990000072
其中每个E包含Fc结构域单体(例如，具有SEQ ID NO:1-138中任一者的序列的Fc结构域单体)；每个L-A1中的L是共价附接于E中铰链半胱氨酸的硫原子且附接于A1的接头；n为1或2(例如，当n为2时，两个Fc结构域单体二聚以形成Fc结构域)；T为1至20的整数(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)；且连接于E的波浪线指示每个L-A1共价附接(例如，借助于共价键或接头)至E中铰链半胱氨酸的硫原子，或其药学上可接受的盐。当T大于1(例如，T为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)时，每个A1可独立地选自由式(A-I)-(A-XII)描述的任何结构。在一些实施方案中，每个A1可独立地选自式(A-I)、(A-II)、(A-VI)或(A-VII)中任一者。在其他实施方案中，每个A1可独立地选自式(A-I)。
在另一个方面中，本发明提供一种由以下来描述的缀合物：式(M-I)
Figure BDA0003630331990000081
其中每个E包含Fc结构域单体(例如，具有SEQ ID NO:1-138中任一者的序列的Fc结构域单体)；每个L-A1中的L是共价附接于E中表面暴露赖氨酸的氮原子且附接于A1的接头；n为1或2(例如，当n为2时，两个Fc结构域单体二聚以形成Fc结构域)；T为1至20的整数(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，连接于E的波浪线指示每个L-A1共价附接(例如，借助于共价键或接头)至E中表面暴露赖氨酸的氮原子，或其药学上可接受的盐。当T大于1(例如，T为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)时，每个A1可独立地选自由式(A-I)-(A-XII)描述的任何结构。在一些实施方案中，每个A1可独立地选自式(A-I)、(A-II)、(A-VI)或(A-VII)中任一者。在其他实施方案中，每个A1可独立地选自式(A-I)。
在一个方面中，本公开提供一种由以下来描述的缀合物：式(1)
Figure BDA0003630331990000091
其中每个A1及每个A2独立地选自式(A-I)-(A-XII)中任一者；
每个E包含Fc结构域单体(例如，具有SEQ ID NO:1-138中任一者的序列的Fc结构域单体)；每个A1-L-A2中的L是共价附接于每个E中铰链半胱氨酸的硫原子且附接于A1及A2中每一者的接头；T为1至20的整数(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，且连接于两个E的两条波浪线指示每个A1-L-A2共价附接(例如，借助于共价键或接头)至两个E中两个铰链半胱氨酸的一对硫原子，或其药学上可接受的盐。当T大于1(例如，T为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)时，每个A1-L-A2可独立地经选择(例如，独立地选自本文所述的A1-L-A2结构中任一者)。在一些实施方案中，A1及A2中的每一者可独立地选自式(A-I)、(A-II)、(A-VI)或(A-VII)中任一者。在其他实施方案中，A1、A2中每一者可独立地选自式(A-I)。
在另一个方面中，本公开提供一种由以下来描述的缀合物：式(1)
Figure BDA0003630331990000092
其中每个A1及每个A2独立地选自式(A-I)-(A-V)中任一者；每个E包含Fc结构域单体(例如，具有SEQ ID NO:1-138中任一者的序列的Fc结构域单体)；每个A1-L-A2中的L是共价附接于每个E中铰链半胱氨酸的硫原子且附接于A1及A2中每一者的接头；T为1至20的整数(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，且连接于两个E的两条波浪线指示每个A1-L-A2共价附接(例如，借助于共价键或接头)至两个E中两个铰链半胱氨酸的一对硫原子，或其药学上可接受的盐。当T大于1(例如，T为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)时，每个A1-L-A2可独立地经选择(例如，独立地选自本文所述的A1-L-A2结构中任一者)。
在另一个方面中，本公开提供一种由以下来描述的缀合物：式(1)
Figure BDA0003630331990000101
其中每个A1及每个A2独立地选自式(A-VI)-(A-IX)中任一者；
每个E包含Fc结构域单体(例如，具有SEQ ID NO:1-138中任一者的序列的Fc结构域单体)；每个A1-L-A2中的L是共价附接于每个E中铰链半胱氨酸的硫原子且附接于A1及A2中每一者的接头；T为1至20的整数(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，且连接于两个E的两条波浪线指示每个A1-L-A2共价附接(例如，借助于共价键或接头)至两个E中两个铰链半胱氨酸的一对硫原子，或其药学上可接受的盐。当T大于1(例如，T为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)时，每个A1-L-A2可独立地经选择(例如，独立地选自本文所述的A1-L-A2结构中任一者)。
在另一个方面中，本发明提供一种由以下来描述的缀合物：式(2)
Figure BDA0003630331990000102
其中每个A1独立地选自式(A-I)-(A-XII)中任一者；每个E包含Fc结构域单体(例如，具有SEQ ID NO:1-138中任一者的序列的Fc结构域单体)；每个L-A1中的L是共价附接于E中铰链半胱氨酸中的硫原子且附接于A1的接头；T为1至20的整数(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，且连接于两个硫原子的两条波浪线指示每个L-A1共价(例如，借助于共价键或接头)附接于两个E中两个铰链半胱氨酸的一对硫原子，或其药学上可接受的盐。当T大于1(例如，T为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)时，每个A1可独立地选自式(A-I)-(A-XII)中任一者。在一些实施方案中，A1及A2中的每一者可独立地选自式(A-I)、(A-II)、(A-VI)或(A-VII)中任一者。在其他实施方案中，A1、A2中每一者可独立地选自式(A-I)。
在另一个方面中，本发明提供一种由以下来描述的缀合物：式(2)
Figure BDA0003630331990000111
其中每个A1独立地选自式(A-I)-(A-V)中任一者；每个E包含Fc结构域单体(例如，具有SEQ ID NO:1-138中任一者的序列的Fc结构域单体)；每个L-A1中的L是共价附接于E中铰链半胱氨酸中的硫原子且附接于A1的接头；T为1至20的整数(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，且连接于两个硫原子的两条波浪线指示每个L-A1共价附接(例如，借助于共价键或接头)至两个E中两个铰链半胱氨酸的一对硫原子，或其药学上可接受的盐。当T大于1(例如，T为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)时，每个A1可独立地选自式(A-I)-(A-V)中任一者。
在另一个方面中，本发明提供一种由以下来描述的缀合物：式(2)
Figure BDA0003630331990000121
其中每个A1独立地选自式(A-VI)-(A-IX)中任一者；每个E包含Fc结构域单体(例如，具有SEQ ID NO:1-138中任一者的序列的Fc结构域单体)；每个L-A1中的L是共价附接于E中铰链半胱氨酸中的硫原子且附接于A1的接头；T为1至20的整数(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，且连接于两个硫原子的两条波浪线指示每个L-A1共价附接(例如，借助于共价键或接头)至两个E中两个铰链半胱氨酸的一对硫原子，或其药学上可接受的盐。当T大于1(例如，T为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)时，每个A1可独立地选自式(A-VI)-(A-IX)中任一者。
在前述实施方案中任一者的一些实施方案中，每个E包含具有SEQ ID NO:1-138中任一者的序列的Fc结构域单体。
在一些实施方案中，所述硫原子对中的至少一者是对应于SEQ ID NO:10或SEQ IDNO:11的铰链半胱氨酸(即，SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys10、Cys13、Cys16或Cys18)(例如，其硫原子)的硫原子。在一些实施方案中，所述硫原子对是对应于SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11中的Cys10及Cys13、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11中的Cys10及Cys16、SEQID NO:10或SEQ ID NO:11中的Cys30及Cys18、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11中的Cys13及Cys36、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11中的Cys13及Cys38以及/或者SEQ ID NO:10或SEQ IDNO:11中的Cys36及Cys38(例如，其硫原子)的硫原子。
在一些实施方案中，当T为2时，所述硫原子对是SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11中的Cys10及Cys13或者SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11中的Cys36及Cys38(例如，对应其的硫原子)。
在一些实施方案中，所述硫原子对包含来自各E的半胱氨酸的一个硫原子，即，L-A连同其所附接的硫原子形成两个Fc结构域(例如，包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的序列的两个Fc结构域)之间的桥。在一些实施方案中，所述硫原子对是对应于来自一个E的SEQID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys10(例如，其硫原子)的硫原子及对应于来自另一个E的SEQID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys10(例如，其硫原子)的硫原子。在一些实施方案中，所述硫原子对是对应于来自一个E的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys13(例如，其硫原子)的硫原子及对应于来自另一个E的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys13(例如，其硫原子)的硫原子。在一些实施方案中，所述硫原子对是对应于来自一个E的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys16(例如，其硫原子)的硫原子及对应于来自另一个E的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys16(例如，其硫原子)的硫原子。在一些实施方案中，所述硫原子对是对应于来自一个E的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys18(例如，其硫原子)的硫原子及对应于来自另一个E的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys18(例如，其硫原子)的硫原子。
在一些实施方案中，当T为2时，所述硫原子对是对应于来自一个E的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys10(例如，其硫原子)的硫原子及对应于来自另一个E的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys10(例如，其硫原子)的硫原子以及对应于来自一个E的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys13(例如，其硫原子)的硫原子及对应于来自另一个E的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys13(例如，其硫原子)的硫原子。在一些实施方案中，当T为2时，所述硫原子对是对应于来自一个E的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys10(例如，其硫原子)的硫原子及对应于来自另一个E的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys10(例如，其硫原子)的硫原子以及对应于来自一个E的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys16(例如，其硫原子)的硫原子及对应于来自另一个E的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys16(例如，其硫原子)的硫原子。在一些实施方案中，当T为2时，所述硫原子对是对应于来自一个E的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys10(例如，其硫原子)的硫原子及对应于来自另一个E的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys10(例如，其硫原子)的硫原子以及对应于来自一个E的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys18(例如，其硫原子)的硫原子及对应于来自另一个E的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys18(例如，其硫原子)的硫原子。
在一些实施方案中，当T为2时，所述硫原子对是对应于来自一个E的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys13(例如，其硫原子)的硫原子及对应于来自另一个E的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys13(例如，其硫原子)的硫原子以及对应于来自一个E的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys16(例如，其硫原子)的硫原子及对应于来自另一个E的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys16(例如，其硫原子)的硫原子。在一些实施方案中，当T为2时，所述硫原子对是对应于来自一个E的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys13(例如，其硫原子)的硫原子及对应于来自另一个E的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys13(例如，其硫原子)的硫原子以及对应于来自一个E的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys18(例如，其硫原子)的硫原子及对应于来自另一个E的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys18(例如，其硫原子)的硫原子。
在一些实施方案中，当T为2时，所述硫原子对是对应于来自一个E的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys16(例如，其硫原子)的硫原子及对应于来自另一个E的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys16(例如，其硫原子)的硫原子以及对应于来自一个E的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys18(例如，其硫原子)的硫原子及对应于来自另一个E的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys18(例如，其硫原子)的硫原子。
在一些实施方案中，当T为3时，所述硫原子对是对应于来自一个E的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys10(例如，其硫原子)的硫原子及对应于来自另一个E的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys10(例如，其硫原子)的硫原子；对应于来自一个E的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys13(例如，其硫原子)的硫原子及对应于来自另一个E的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys13(例如，其硫原子)的硫原子；以及对应于来自一个E的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys16(例如，其硫原子)的硫原子及对应于来自另一个E的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys16(例如，其硫原子)的硫原子。在一些实施方案中，当T为3时，所述硫原子对是对应于来自一个E的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys10(例如，其硫原子)的硫原子及对应于来自另一个E的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys10(例如，其硫原子)的硫原子；对应于来自一个E的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys13(例如，其硫原子)的硫原子及对应于来自另一个E的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys13(例如，其硫原子)的硫原子；以及对应于来自一个E的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys18(例如，其硫原子)的硫原子及对应于来自另一个E的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys18(例如，其硫原子)的硫原子。在一些实施方案中，当T为3时，所述硫原子对是对应于来自一个E的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys10(例如，其硫原子)的硫原子及对应于来自另一个E的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys10(例如，其硫原子)的硫原子；对应于来自一个E的SEQ ID NO:10或SEQID NO:11的Cys18(例如，其硫原子)的硫原子及对应于来自另一个E的SEQ ID NO:10或SEQID NO:11的Cys18(例如，其硫原子)的硫原子；以及对应于来自一个E的SEQ ID NO:10或SEQID NO:11的Cys16(例如，其硫原子)的硫原子及对应于来自另一个E的SEQ ID NO:10或SEQID NO:11的Cys16(例如，其硫原子)的硫原子。在一些实施方案中，当T为3时，所述硫原子对是对应于来自一个E的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys13(例如，其硫原子)的硫原子及对应于来自另一个E的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys13(例如，其硫原子)的硫原子；对应于来自一个E的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys18(例如，其硫原子)的硫原子及对应于来自另一个E的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys18(例如，其硫原子)的硫原子；以及对应于来自一个E的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys16(例如，其硫原子)的硫原子及对应于来自另一个E的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys16(例如，其硫原子)的硫原子。
在一些实施方案中，当T为3时，所述硫原子对是对应于来自一个E的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys10(例如，其硫原子)的硫原子及对应于来自另一个E的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys10(例如，其硫原子)的硫原子；对应于来自一个E的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys13(例如，其硫原子)的硫原子及对应于来自另一个E的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Cys13(例如，其硫原子)的硫原子；对应于来自一个E的SEQ ID NO:10或SEQID NO:11的Cys16(例如，其硫原子)的硫原子及对应于来自另一个E的SEQ ID NO:10或SEQID NO:11的Cys16(例如，其硫原子)的硫原子；以及对应于来自一个E的SEQ ID NO:10或SEQID NO:11的Cys18(例如，其硫原子)的硫原子及对应于来自另一个E的SEQ ID NO:10或SEQID NO:11的Cys18(例如，其硫原子)的硫原子。
在一些实施方案中，所述缀合物具有以下结构：
Figure BDA0003630331990000161
其中a、b、c及d各自独立地为0或1且其中当a、b、c或d为0时，两个硫原子形成二硫键。
在一些实施方案中，a为1且b、c及d为0。在一些实施方案中，a及b为1且c及d为0。在一些实施方案中，a及c为1且b及d为0。在一些实施方案中，a及d为1且b及c为0。在一些实施方案中，a、b及c为1且d为0。在一些实施方案中，a、b及d为1且c为0。在一些实施方案中，a、c及d为1且b为0。在一些实施方案中，b及c为1且a及d为0。在一些实施方案中，b及d为1且a及c为0。在一些实施方案中，b、c及d为1且a为0。在一些实施方案中，c及d为1且a及b为0。在一些实施方案中，a、b、c及d为1。
在一些实施方案中，每个E包含序列
MVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:4)。
在一些实施方案中，每个E包含序列
MVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:33)。
在一些实施方案中，所述硫原子对中的至少一者是对应于SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:33的铰链半胱氨酸(即，Cys10及/或Cys13)(例如，其硫原子)的硫原子。在一些实施方案中，所述硫原子对是对应于SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:33中的Cys10及Cys13(例如，其硫原子)的硫原子。
在一些实施方案中，所述硫原子对包含来自各E的半胱氨酸的一个硫原子，即，L-A连同其所附接的硫原子形成两个Fc结构域(例如，包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:33的序列的两个Fc结构域)之间的桥。在一些实施方案中，所述硫原子对是对应于来自一个E的SEQID NO:4或SEQ ID NO:33的Cys10(例如，其硫原子)的硫原子及对应于来自另一个E的SEQID NO:4或SEQ ID NO:33的Cys10(例如，其硫原子)的硫原子。在一些实施方案中，所述硫原子对是对应于来自一个E的SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:33的Cys13(例如，其硫原子)的硫原子及对应于来自另一个E的SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:33的Cys13(例如，其硫原子)的硫原子。在一些实施方案中，当T为2时，所述硫原子对是对应于来自一个E的SEQ ID NO:4或SEQID NO:33的Cys10(例如，其硫原子)的硫原子及对应于来自另一个E的SEQ ID NO:4或SEQID NO:33的Cys10(例如，其硫原子)的硫原子以及对应于来自一个E的SEQ ID NO:4或SEQID NO:33的Cys13(例如，其硫原子)的硫原子及对应于来自另一个E的SEQ ID NO:4或SEQID NO:33的Cys13(例如，其硫原子)的硫原子。
在一些实施方案中，所述缀合物具有以下结构：
Figure BDA0003630331990000181
其中a及b各自独立地为0或1且其中当a或b为0时，两个硫原子形成二硫键。在一些实施方案中，a为1且b为0。在一些实施方案中，a为0且b为1。在一些实施方案中，a及b为1。
在一些实施方案中，所述硫原子对中的至少一者是对应于SEQ ID NO:8的铰链半胱氨酸(即，Cys10及/或Cys13)(例如，其硫原子)的硫原子。在一些实施方案中，所述硫原子对是对应于SEQ ID NO:8中的Cys10及Cys13(例如，其硫原子)的硫原子。
在一些实施方案中，所述硫原子对包含来自各E的半胱氨酸的一个硫原子，即，L-A连同其所附接的硫原子形成两个Fc结构域(例如，包含SEQ ID NO:8的序列的两个Fc结构域)之间的桥。在一些实施方案中，所述硫原子对是对应于来自一个E的SEQ ID NO:8的Cys10(例如，其硫原子)的硫原子及对应于来自另一个E的SEQ ID NO:8的Cys10(例如，其硫原子)的硫原子。在一些实施方案中，所述硫原子对是对应于来自一个E的SEQ ID NO:8的Cys13(例如，其硫原子)的硫原子及对应于来自另一个E的SEQ ID NO:8的Cys13(例如，其硫原子)的硫原子。在一些实施方案中，当T为2时，所述硫原子对是对应于来自一个E的SEQ IDNO:8的Cys10(例如，其硫原子)的硫原子及对应于来自另一个E的SEQ ID NO:8的Cys10(例如，其硫原子)的硫原子以及对应于来自一个E的SEQ ID NO:8的Cys13(例如，其硫原子)的硫原子及对应于来自另一个E的SEQ ID NO:8的Cys13(例如，其硫原子)的硫原子。
在一些实施方案中，所述缀合物具有以下结构：
Figure BDA0003630331990000191
其中a及b各自独立地为0或1且其中当a或b为0时，两个硫原子形成二硫键。在一些实施方案中，a为1且b为0。在一些实施方案中，a为0且b为1。在一些实施方案中，a及b为1。
在一些实施方案中，所述缀合物具有以下结构：
Figure BDA0003630331990000201
其中a及b各自独立地为0或1且其中当a或b为0时，两个硫原子形成二硫键。在一些实施方案中，a为1且b为0。在一些实施方案中，a为0且b为1。在一些实施方案中，a及b为1。
在一些实施方案中，所述缀合物具有以下结构：
Figure BDA0003630331990000202
其中a及b各自独立地为0或1且其中当a或b为0时，两个硫原子形成二硫键。在一些实施方案中，a为1且b为0。在一些实施方案中，a为0且b为1。在一些实施方案中，a及b为1。
在一些实施方案中，所述缀合物具有以下结构：
Figure BDA0003630331990000211
其中a及b各自独立地为0或1且其中当a或b为0时，所述硫原子为硫醇。在一些实施方案中，a为1且b为0。在一些实施方案中，a为0且b为1。在一些实施方案中，a及b为1。
在先前三个方面的一些实施方案中，所述氮原子为表面暴露赖氨酸的氮，例如对应于SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Lys35、Lys63、Lys77、Lys79、Lys106、Lys123、Lys129、Lys181、Lys203、Lys228或Lys236(例如，其氮原子)的氮原子。在一些实施方案中，所述氮原子是对应于SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的Lys65、Lys79、Lys108、Lys230及/或Lys238(例如，其氮原子)的氮原子。
在一些实施方案中，所述缀合物具有以下结构：
Figure BDA0003630331990000212
其中a、b、c、d及e各自独立地为0或1且其中当a、b、c、d或e为0时，两个氮原子为NH2。在一些实施方案中，a为1且b、c、d及e为0。在一些实施方案中，b为1且a、c、d及e为0。在一些实施方案中，c为1且a、b、d及e为0。在一些实施方案中，d为1且a、b、c及e为0。在一些实施方案中，e为1且a、b、c及d为0。在一些实施方案中，a及b为1且c、d及e为0。在一些实施方案中，a及c为1且b、d及e为0。在一些实施方案中，a及d为1且b、c及e为0。在一些实施方案中，a及e为1且b、c及d为0。在一些实施方案中，b及c为1且a、d及e为0。在一些实施方案中，b及d为1且a、c及e为0。在一些实施方案中，b及e为1且a、c及d为0。在一些实施方案中，c及d为1且a、b及e为0。在一些实施方案中，c及e为1且a、b及d为0。在一些实施方案中，d及e为1且a、b及c为0。在一些实施方案中，a、b及c为1且d及e为0。在一些实施方案中，a、b及d为1且c及e为0。在一些实施方案中，a、b及e为1且c及d为0。在一些实施方案中，a、c及d为1且b及e为0。在一些实施方案中，a、c及e为1且b及d为0。在一些实施方案中，a、d及e为1且b及c为0。在一些实施方案中，b、c及d为1且a及e为0。在一些实施方案中，b、d及e为1且a及c为0。在一些实施方案中，c、d及e为1且a及b为0。
在本文所述的缀合物中任一者的一些实施方案中，所述缀合物形成包括Fc结构域的均二聚体。在本文所述的缀合物的一些实施方案中，E与另一个E均二聚以形成Fc结构域。
在另一个方面中，本发明提供一种由以下来描述的缀合物：(D-I)
Figure BDA0003630331990000221
其中E包含白蛋白(例如，具有SEQ ID NO:139-141中任一者的序列的白蛋白)、白蛋白结合肽或Fc结合肽；每个A1-L-A2中的L是独立地共价附接于E中的表面暴露半胱氨酸的硫原子或表面暴露赖氨酸的氮原子且附接于A1及A2中每一者的接头；n为1；T为1至20的整数(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，且连接于E的波浪线指示每个A1-L-A2独立地共价附接于E中的溶剂暴露半胱氨酸的硫原子或溶剂暴露赖氨酸的氮原子，或其药学上可接受的盐。当T大于1(例如，T为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)时，每个A1-L-A2可独立地经选择(例如，独立地选自本文所述的A1-L-A2结构中任一者)。在一些实施方案中，A1、A2中的每一者可独立地选自式(A-I)、(A-II)、(A-VI)或(A-VII)中任一者。在其他实施方案中，A1、A2中每一者可独立地选自式(A-I)。
在以上的优选实施方案中，x为2。
在另一个方面中，本发明提供一种由以下来描述的缀合物：式(M-I)
Figure BDA0003630331990000231
其中E包含白蛋白(例如，具有SEQ ID NO:139-141中任一者的序列的白蛋白)、白蛋白结合肽或Fc结合肽；每个L-A1中的L是独立地共价附接于E中的表面暴露半胱氨酸的硫原子或表面暴露赖氨酸的氮原子且附接于A1的接头；n为1；T为1至20的整数(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)；且连接于E的波浪线指示每个L-A1独立地共价附接于E中的溶剂暴露半胱氨酸的硫原子或溶剂暴露赖氨酸的氮原子，或其药学上可接受的盐。当T大于1(例如，T为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)时，每个A1可独立地选自由式(A-I)-(A-XII)描述的任何结构。在一些实施方案中，每个A1可独立地选自式(A-I)、(A-II)、(A-VI)或(A-VII)中任一者。在其他实施方案中，每个A1可独立地选自式(A-I)。在以上的优选实施方案中，x为2。
在一些实施方案中，每个E包含具有SEQ ID NO:139-141中任一者的序列的白蛋白。
在一些实施方案中，T为1且L-A1共价附接于对应于SEQ ID NO:139的Cys34的硫原子。
表1a的中间体可通过本领域技术人员已知的任何合适方法，包括本文所述或例示的任何方法缀合于Fc结构域或Fc结构域单体(例如，借助于接头)。在一些实施方案中，所述缀合物(例如，由式(1)、(2)、(D-I)-(D-XI)或(M-I)-(M-XI)中任一者描述的缀合物)包括E，其中E为Fc结构域单体或Fc结构域(例如，Fc结构域单体或Fc结构域，每个Fc结构域单体独立地具有SEQ ID NO:1-138中任一者的序列)。在优选实施方案中，E的一个或多个表面暴露赖氨酸残基的一个或多个氮原子或E中的一个或多个表面暴露半胱氨酸的一个或多个硫原子共价缀合于接头(例如，PEG2-PEG20接头)。缀合于E的接头可被官能化，以致其可反应以与本文所述的Int中任一者(例如，表1a的Int)形成共价键。在优选实施方案中，E缀合于经叠氮基官能化的接头且Int(例如，表1a的Int)经炔基官能化。E的接头-叠氮基及Int的接头-炔缀合(例如，通过点击化学)形成本发明缀合物，例如由式(5)描述的缀合物。在又其他实施方案中，E缀合于经炔基官能化的接头且Int(例如，表1a的Int)经叠氮基官能化。E的接头-炔及Int的接头-叠氮基缀合(例如，通过点击化学；参见例如，图103)形成本发明缀合物，例如由式(1)、(2)、(D-I)-(D-XI)或(M-I)-(M-XI)中任一者描述的缀合物。
表1a：中间体
Figure BDA0003630331990000241
Figure BDA0003630331990000251
Figure BDA0003630331990000261
Figure BDA0003630331990000271
Figure BDA0003630331990000281
Figure BDA0003630331990000291
Figure BDA0003630331990000301
Figure BDA0003630331990000311
Figure BDA0003630331990000321
Figure BDA0003630331990000331
Figure BDA0003630331990000341
Figure BDA0003630331990000351
Figure BDA0003630331990000361
Figure BDA0003630331990000371
在另一个方面中，本发明提供表1b的缀合物。如所示，表1b的每个缀合物对应于式(M-I)或式(D-I)的缀合物。表1b的缀合物包括通过表1a的Int与接头的共价反应形成的缀合物，所述接头转而缀合于E(例如，Fc结构域单体、白蛋白、白蛋白结合肽或Fc结合肽)。在一些实施方案中，Int的反应性部分(例如，炔或叠氮基)与共价附接于E的接头(由L’表示)的对应反应性基团(例如，炔或叠氮基)反应，使得表1a的Int共价附接于E。如表1b中所示，L’对应于如(M-I)或(D-I)中定义的L的剩余部分(例如，L’是共价接合Int及E的接头)。例如，L’可包括三唑(通过Int与缀合于E的接头之间的点击化学反应形成)及接头(例如，PEG2-PEG20接头)，所述接头转而缀合于E的氨基酸侧链(参见例如，图103)。
在表1b的缀合物的一些实施方案中，n为1或2。当n为1时，每个E包含Fc结构域单体(例如，具有SEQ ID NO:1-138中任一者的序列的Fc结构域单体)、白蛋白(例如，具有SEQ IDNO:139-141中任一者的序列的白蛋白)、白蛋白结合肽或Fc结合肽。当n为2时，每个E包含Fc结构域单体(例如，具有SEQ ID NO:1-138中任一者的序列的Fc结构域单体)，且Fc结构域单体二聚以形成Fc结构域。
在表1b的任何缀合物的一些实施方案中，T为1至20的整数(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)。本公开还提供了表2的任何缀合物的群体，其中T的平均值为1至20(例如，T的平均值为1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5)。在一些实施方案中，T的平均值为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在某些实施方案中，平均的T为1至10(例如，1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10)。在某些实施方案中，平均的T为1至5(例如，1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5)。在一些实施方案中，平均的T为5至10(例如，5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10)。在一些实施方案中，平均的T为2.5至7.5(例如，2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5)。
表1b的缀合物中的波浪线指示每个L’-Int共价附接于E中的氨基酸侧链(例如，E中表面暴露赖氨酸的氮原子或表面暴露半胱氨酸的硫原子)，或其药学上可接受的盐。
表1b：对应于表1a的中间体的缀合物
Figure BDA0003630331990000391
Figure BDA0003630331990000401
Figure BDA0003630331990000411
Figure BDA0003630331990000421
Figure BDA0003630331990000431
Figure BDA0003630331990000441
Figure BDA0003630331990000451
Figure BDA0003630331990000461
Figure BDA0003630331990000471
Figure BDA0003630331990000481
Figure BDA0003630331990000491
Figure BDA0003630331990000501
Figure BDA0003630331990000511
Figure BDA0003630331990000521
Figure BDA0003630331990000531
Figure BDA0003630331990000541
Figure BDA0003630331990000551
Figure BDA0003630331990000561
Figure BDA0003630331990000571
Figure BDA0003630331990000581
Figure BDA0003630331990000591
Figure BDA0003630331990000601
在一些实施方案中，每个E包含具有SEQ ID NO:1-138中任一者的序列的Fc结构域单体。在其他实施方案中，每个E包含具有与SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:64的氨基酸序列至少95％相同的序列的Fc结构域单体。在其他实施方案中，每个E包含具有SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:64的氨基酸序列的Fc结构域单体。在其他实施方案中，每个E包含具有与SEQ IDNO:67或SEQ ID NO:68的氨基酸序列至少95％相同的序列的Fc结构域单体。在其他实施方案中，每个E包含具有SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:68的氨基酸序列的Fc结构域单体。在其他实施方案中，每个E包含具有与SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:73的氨基酸序列至少95％相同的序列的Fc结构域单体。在其他实施方案中，每个E包含具有SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:73的氨基酸序列的Fc结构域单体。在其他实施方案中，每个E包含具有与SEQ ID NO:76或SEQID NO:77的氨基酸序列至少95％相同的序列的Fc结构域单体。在其他实施方案中，每个E包含具有SEQ ID NO:76或SEQ ID NO:77的氨基酸序列的Fc结构域单体。在其他实施方案中，每个E包含具有与SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:82的氨基酸序列至少95％相同的序列的Fc结构域单体。在其他实施方案中，每个E包含具有SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:82的氨基酸序列的Fc结构域单体。在其他实施方案中，每个E包含具有与SEQ ID NO:85或SEQ ID NO:86的氨基酸序列至少95％相同的序列的Fc结构域单体。在其他实施方案中，每个E包含具有SEQ IDNO:85或SEQ ID NO:86的氨基酸序列的Fc结构域单体。
在另一个方面中，本发明提供一种缀合物，其包含(i)第一部分A1；(ii)第二部分A2；(iii)Fc结构域单体或Fc结构域；及(iv)共价附接于A1及A2且附接于所述Fc结构域单体或所述Fc结构域的接头；其中每个A1及每个A2独立地选自式(A-I)-(A-XII)中任一者。在一些实施方案中，A1及A2中的每一者可独立地选自式(A-I)、(A-II)、(A-VI)或(A-VII)中任一者。在其他实施方案中，A1及A2中的每一者可独立地选自式(A-I)。在以上的优选实施方案中，x为2。
在另一个方面中，本发明提供一种缀合物，其包括(i)第一部分Int；(ii)Fc结构域单体或Fc结构域；及(iv)共价附接于Int且附接于所述Fc结构域单体或所述Fc结构域的接头；其中每个Int独立地选自表1a的中间体中任一者。
在另一个方面中，本发明提供一种缀合物，其包括(i)第一部分A1；(ii)第二部分A2；(iii)白蛋白、白蛋白结合肽或Fc结合肽；及(iv)共价附接于A1及A2且附接于所述白蛋白、所述白蛋白结合肽或所述Fc结合肽的接头；其中每个A1及每个A2独立地选自式(A-I)-(A-XII)中任一者。在一些实施方案中，A1及A2中的每一者可独立地选自式(A-I)、(A-II)、(A-VI)或(A-VII)中任一者。在其他实施方案中，A1及A2中的每一者可独立地选自式(A-I)。在以上的优选实施方案中，x为2。
在另一个方面中，本发明提供一种由以下来描述的缀合物：式(D-I)
Figure BDA0003630331990000611
其中每个A1及每个A2独立地选自式(A-I)-(A-XII)中任一者；每个E包含Fc结构域单体(例如，具有SEQ ID NO:1-138中任一者的序列的Fc结构域单体)、白蛋白(例如，具有SEQ ID NO:139-141中任一者的序列的白蛋白)、白蛋白结合肽或Fc结合肽；n为1或2；T为1至20的整数(例如，T为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)；且L是共价附接于E、A1及A2中每一者的接头，或其药学上可接受的盐。当T大于1(例如，T为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)时，每个A1-L-A2可独立地经选择(例如，独立地选自本文所述的A1-L-A2结构中任一者)。在一些实施方案中，A1及A2中的每一者可独立地选自式(A-I)、(A-II)、(A-VI)或(A-VII)中任一者。在其他实施方案中，A1及A2中的每一者可独立地选自式(A-I)。
在另一个方面中，本发明提供一种由以下来描述的缀合物：式(D-I)
Figure BDA0003630331990000621
其中每个A1及每个A2独立地选自式(A-I)-(A-V)中任一者；每个E包含Fc结构域单体(例如，具有SEQ ID NO:1-138中任一者的序列的Fc结构域单体)、白蛋白(例如，具有SEQID NO:139-141中任一者的序列的白蛋白)、白蛋白结合肽或Fc结合肽；n为1或2；T为1至20的整数(例如，T为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)；且L是共价附接于E、A1及A2中每一者的接头，或其药学上可接受的盐。当T大于1(例如，T为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)时，每个A1-L-A2可独立地经选择(例如，独立地选自本文所述的A1-L-A2结构中任一者)。
在另一个方面中，本发明提供一种由以下来描述的缀合物：式(D-I)
Figure BDA0003630331990000631
其中每个A1及每个A2独立地选自式(A-VI)-(A-IX)中任一者；每个E包含Fc结构域单体(例如，具有SEQ ID NO:1-138中任一者的序列的Fc结构域单体)、白蛋白(例如，具有SEQ ID NO:139-141中任一者的序列的白蛋白)、白蛋白结合肽或Fc结合肽；n为1或2；T为1至20的整数(例如，T为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)；且L是共价附接于E、A1及A2中每一者的接头，或其药学上可接受的盐。当T大于1(例如，T为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)时，每个A1-L-A2可独立地经选择(例如，独立地选自本文所述的A1-L-A2结构中任一者)。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-II)
Figure BDA0003630331990000632
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-II-1)
Figure BDA0003630331990000641
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-II-2)
Figure BDA0003630331990000642
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-II-3)
Figure BDA0003630331990000651
其中L’是L的剩余部分，且y1及y2各自独立地为1至20的整数(例如，y1及y2各自独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，L’为氮原子。
在一些实施方案中，所述缀合物具有选自以下的结构：
Figure BDA0003630331990000652
Figure BDA0003630331990000661
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-II-4)
Figure BDA0003630331990000662
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-II-5)
Figure BDA0003630331990000663
Figure BDA0003630331990000671
其中L’是L的剩余部分，且y1及y2各自独立地为1至20的整数(例如，y1及y2各自独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，L’为氮原子。
在一些实施方案中，所述缀合物具有选自以下的结构：
Figure BDA0003630331990000672
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物具有选自以下的结构：
Figure BDA0003630331990000681
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-II-6)
Figure BDA0003630331990000691
其中R7选自H、C1-C20烷基、C3-C20环烷基、C3-C20杂环烷基；C5-C15芳基及C2-C15杂芳基；或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，R7选自C1-C20烷基(例如，甲基、乙基、丙基或丁基)。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-II-7)
Figure BDA0003630331990000692
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-II-8)
Figure BDA0003630331990000701
其中L’是L的剩余部分，且y1及y2各自独立地为1至20的整数(例如，y1及y2各自独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，L’为氮原子。
在一些实施方案中，所述缀合物具有结构
Figure BDA0003630331990000702
Figure BDA0003630331990000711
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物具有结构
Figure BDA0003630331990000712
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物具有结构
Figure BDA0003630331990000721
Figure BDA0003630331990000731
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物具有结构
Figure BDA0003630331990000732
Figure BDA0003630331990000741
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-II-9)
Figure BDA0003630331990000742
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-II-10)
Figure BDA0003630331990000751
其中L’是L的剩余部分，且y1及y2各自独立地为1至20的整数(例如，y1及y2各自独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，L’为氮原子。
在一些实施方案中，所述缀合物具有结构
Figure BDA0003630331990000752
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物具有以下的结构：
Figure BDA0003630331990000761
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-III)
Figure BDA0003630331990000762
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-III-1)
Figure BDA0003630331990000771
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-III-2)
Figure BDA0003630331990000772
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-III-3)
Figure BDA0003630331990000781
其中L’是L的剩余部分，且y1及y2各自独立地为1至20的整数(例如，y1及y2各自独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，L’为氮原子。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-III-4)
Figure BDA0003630331990000782
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-III-5)
Figure BDA0003630331990000791
其中L’是L的剩余部分，且y1及y2各自独立地为1至20的整数(例如，y1及y2各自独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，L’为氮原子。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-III-6)
Figure BDA0003630331990000792
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-III-7)
Figure BDA0003630331990000801
其中L’是L的剩余部分，且y1及y2各自独立地为1至20的整数(例如，y1及y2各自独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，L’为氮原子。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-III-8)
Figure BDA0003630331990000802
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-III-9)
Figure BDA0003630331990000811
其中L’是L的剩余部分，且y1及y2各自独立地为1至20的整数(例如，y1及y2各自独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，L’为氮原子。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-IV)
Figure BDA0003630331990000812
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-IV-1)
Figure BDA0003630331990000821
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-IV-2)
Figure BDA0003630331990000822
其中L’是L的剩余部分，且y1及y2各自独立地为1至20的整数(例如，y1及y2各自独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，L’为氮原子。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-V)
Figure BDA0003630331990000831
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-V-1)
Figure BDA0003630331990000832
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-V-2)
Figure BDA0003630331990000841
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-V-3)
Figure BDA0003630331990000842
其中L’是L的剩余部分，且y1及y2各自独立地为1至20的整数(例如，y1及y2各自独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，L’为氮原子。在一些实施方案中，y1及y2各自为1，y1及y2各自为2，或y1及y2各自为3。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-V-4)
Figure BDA0003630331990000851
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-V-5)
Figure BDA0003630331990000852
其中L’是L的剩余部分，且y1及y2各自独立地为1至20的整数(例如，y1及y2各自独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，L’为氮原子。在一些实施方案中，y1及y2各自为1，y1及y2各自为2，或y1及y2各自为3。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-V-6)
Figure BDA0003630331990000861
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-V-7)
Figure BDA0003630331990000862
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-V-8)
Figure BDA0003630331990000871
其中L’是L的剩余部分，且y1及y2各自独立地为1至20的整数(例如，y1及y2各自独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，L’为氮原子。在一些实施方案中，y1及y2各自为1，y1及y2各自为2，或y1及y2各自为3。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-V-9)
Figure BDA0003630331990000872
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-V-10)
Figure BDA0003630331990000881
其中L’是L的剩余部分，且y1及y2各自独立地为1至20的整数(例如，y1及y2各自独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，L’为氮原子。在一些实施方案中，y1及y2各自为1，y1及y2各自为2，或y1及y2各自为3。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-VI)
Figure BDA0003630331990000882
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-VI-1)
Figure BDA0003630331990000891
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-VI-2)
Figure BDA0003630331990000892
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-VI-3)
Figure BDA0003630331990000901
其中L’是L的剩余部分，且y1及y2各自独立地为1至20的整数(例如，y1及y2各自独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，L’为氮原子。在一些实施方案中，y1及y2各自为1，y1及y2各自为2，或y1及y2各自为3。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-VI-4)
Figure BDA0003630331990000902
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-VI-5)
Figure BDA0003630331990000911
其中L’是L的剩余部分，且y1及y2各自独立地为1至20的整数(例如，y1及y2各自独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，L’为氮原子。在一些实施方案中，y1及y2各自为1，y1及y2各自为2，或y1及y2各自为3。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-VI-6)
Figure BDA0003630331990000921
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-VI-7)
Figure BDA0003630331990000922
其中L’是L的剩余部分，且y1及y2各自独立地为1至20的整数(例如，y1及y2各自独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，L’为氮原子。在一些实施方案中，y1及y2各自为1，y1及y2各自为2，或y1及y2各自为3。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-VI-8)
Figure BDA0003630331990000931
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-VI-9)
Figure BDA0003630331990000932
其中L’是L的剩余部分，且y1及y2各自独立地为1至20的整数(例如，y1及y2各自独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，L’为氮原子。在一些实施方案中，y1及y2各自为1，y1及y2各自为2，或y1及y2各自为3。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-VII)
Figure BDA0003630331990000941
或其药学上可接受的盐。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，R1为OH。在本文所述的任何方面的一些实施方案中，R1为NH2。在本文所述的任何方面的一些实施方案中，R1为-NHC(＝NH)NH2。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-VIII)
Figure BDA0003630331990000951
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-VIII-1)
Figure BDA0003630331990000952
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-VIII-2)
Figure BDA0003630331990000961
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-VIII-3)
Figure BDA0003630331990000962
其中L’是L的剩余部分，且y1及y2各自独立地为1至20的整数(例如，y1及y2各自独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，L’为氮原子。
在一些实施方案中，所述缀合物具有选自以下的结构：
Figure BDA0003630331990000971
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-VIII-4)
Figure BDA0003630331990000981
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-VIII-5)
Figure BDA0003630331990000982
其中L’是L的剩余部分，且y1及y2各自独立地为1至20的整数(例如，y1及y2各自独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，L’为氮原子。
在一些实施方案中，所述缀合物具有选自以下的结构：
Figure BDA0003630331990000991
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：结构
Figure BDA0003630331990001001
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-VIII-6)
Figure BDA0003630331990001002
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-VIII-7)
Figure BDA0003630331990001011
其中L’是L的剩余部分，且y1及y2各自独立地为1至20的整数(例如，y1及y2各自独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，L’为氮原子。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-VIII-8)
Figure BDA0003630331990001012
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-VIII-9)
Figure BDA0003630331990001021
其中L’是L的剩余部分，且y1及y2各自独立地为1至20的整数(例如，y1及y2各自独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，L’为氮原子。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-VIII-10)
Figure BDA0003630331990001022
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-VIII-11)
Figure BDA0003630331990001031
其中L’是L的剩余部分，且y1及y2各自独立地为1至20的整数(例如，y1及y2各自独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，L’为氮原子。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-IX)
Figure BDA0003630331990001032
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-IX-1)
Figure BDA0003630331990001041
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-IX-2)
Figure BDA0003630331990001042
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-IX-3)
Figure BDA0003630331990001051
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-IX-4)
Figure BDA0003630331990001052
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-IX-5)
Figure BDA0003630331990001061
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-IX-6)
Figure BDA0003630331990001062
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-X)
Figure BDA0003630331990001071
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-X-1)
Figure BDA0003630331990001072
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-X-2)
Figure BDA0003630331990001081
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-X-3)
Figure BDA0003630331990001082
或其药学上可接受的盐。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，L或L’包含一个或多个任选取代的C1-C20亚烷基、任选取代的C1-C20亚杂烷基、任选取代的C2-C20亚烯基、任选取代的C2-C20亚杂烯基、任选取代的C2-C20亚炔基、任选取代的C2-C20亚杂炔基、任选取代的C3-C20亚环烷基、任选取代的C3-C20亚杂环烷基、任选取代的C4-C20亚环烯基、任选取代的C4-C20亚杂环烯基、任选取代的C8-C20亚环炔基、任选取代的C8-C20亚杂环炔基、任选取代的C5-C15亚芳基、任选取代的C2-C15亚杂芳基、O、S、NRi、P、羰基、硫羰基、磺酰基、磷酸酯基、磷酰基或亚氨基，其中Ri为H、任选取代的C1-C20烷基、任选取代的C1-C20杂烷基、任选取代的C2-C20烯基、任选取代的C2-C20杂烯基、任选取代的C2-C20炔基、任选取代的C2-C20杂炔基、任选取代的C3-C20环烷基、任选取代的C3-C20杂环烷基、任选取代的C4-C20环烯基、任选取代的C4-C20杂环烯基、任选取代的C8-C20环炔基、任选取代的C8-C20杂环炔基、任选取代的C5-C15芳基或任选取代的C2-C15杂芳基。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，L或L’的骨架由一个或多个任选取代的C1-C20亚烷基、任选取代的C1-C20亚杂烷基、任选取代的C2-C20亚烯基、任选取代的C2-C20亚杂烯基、任选取代的C2-C20亚炔基、任选取代的C2-C20亚杂炔基、任选取代的C3-C20亚环烷基、任选取代的C3-C20亚杂环烷基、任选取代的C4-C20亚环烯基、任选取代的C4-C20亚杂环烯基、任选取代的C8-C20亚环炔基、任选取代的C8-C20亚杂环炔基、任选取代的C5-C15亚芳基、任选取代的C2-C15亚杂芳基、O、S、NRi、P、羰基、硫羰基、磺酰基、磷酸酯基、磷酰基或亚氨基组成，其中Ri为H、任选取代的C1-C20烷基、任选取代的C1-C20杂烷基、任选取代的C2-C20烯基、任选取代的C2-C20杂烯基、任选取代的C2-C20炔基、任选取代的C2-C20杂炔基、任选取代的C3-C20环烷基、任选取代的C3-C20杂环烷基、任选取代的C4-C20环烯基、任选取代的C4-C20杂环烯基、任选取代的C8-C20环炔基、任选取代的C8-C20杂环炔基、任选取代的C5-C15芳基或任选取代的C2-C15杂芳基。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，L或L’经氧代取代。在一些实施方案中，L或L’的骨架包含不超过250个原子。在一些实施方案中，L或L’能够形成酰胺、氨基甲酸酯、磺酰基或脲连接。在一些实施方案中，
L或L’为键。在一些实施方案中，L或L’为原子。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，每个L由以下来描述：式(D-L-I)
Figure BDA0003630331990001101
其中LA由式GA1-(ZA1)g1-(YA1)h1-(ZA2)i1-(YA2)j1-(ZA3)k1-(YA3)l1-(ZA4)m1-(YA4)n1-(ZA5)o1-GA2描述；LB由式GB1-(ZB1)g2-(YB1)h2-(ZB2)i2-(YB2)j2-(ZB3)k2-(YB3)l2-(ZB4)m2-(YB4)n2-(ZB5)o2-GB2描述；LC由式GC1-(ZC1)g3-(YC1)h3-(ZC2)i3-(YC2)j3-(ZC3)k3-(YC3)l3-(ZC4)m3-(YC4)n3-(ZC5)o3-GC2描述；GA1是附接于Q的键；GA2是附接于A1的键；GB1是附接于Q)的键；GB2是附接于A2的键；GC1是附接于Q的键；GC2是附接于E的键或能够与缀合于E的官能团反应的官能团(例如，马来酰亚胺及半胱氨酸、胺及经活化羧酸、硫醇及马来酰亚胺、经活化磺酸及胺、异氰酸酯及胺、叠氮化物及炔以及烯烃及四嗪)；ZA1、ZA2、ZA3、ZA4、ZA5、ZB1、ZB2、ZB3、ZB4、ZB5、ZC1、ZC2、ZC3、ZC4及ZC5中的每一者独立地为任选取代的C1-C20亚烷基、任选取代的C1-C20亚杂烷基、任选取代的C2-C20亚烯基、任选取代的C2-C20亚杂烯基、任选取代的C2-C20亚炔基、任选取代的C2-C20亚杂炔基、任选取代的C3-C20亚环烷基、任选取代的C3-C20亚杂环烷基、任选取代的C4-C20亚环烯基、任选取代的C4-C20亚杂环烯基、任选取代的C8-C20亚环炔基、任选取代的C8-C20亚杂环炔基、任选取代的C5-C15亚芳基或任选取代的C2-C15亚杂芳基；YA1、YA2、YA3、YA4、YB1、YB2、YB3、YB4、YC1、YC2、YC3及YC4中的每一者独立地为O、S、NRi、P、羰基、硫羰基、磺酰基、磷酸酯基、磷酰基或亚氨基；Ri为H、任选取代的C1-C20烷基、任选取代的C1-C20杂烷基、任选取代的C2-C20烯基、任选取代的C2-C20杂烯基、任选取代的C2-C20炔基、任选取代的C2-C20杂炔基、任选取代的C3-C20环烷基、任选取代的C3-C20杂环烷基、任选取代的C4-C20环烯基、任选取代的C4-C20杂环烯基、任选取代的C8-C20环炔基、任选取代的C8-C20杂环炔基、任选取代的C5-C15芳基或任选取代的C2-C15杂芳基；g1、h1、i1、j1、k1、l1、m1、n1、o1、g2、h2、i2、j2、k2、l2、m2、n2、o2、g3、h3、i3、j3、k3、l3、m3、n3及o3中的每一者独立地为0或1；Q为氮原子、任选取代的C1-C20亚烷基、任选取代的C1-C20亚杂烷基、任选取代的C2-C20亚烯基、任选取代的C2-C20亚杂烯基、任选取代的C2-C20亚炔基、任选取代的C2-C20亚杂炔基、任选取代的C3-C20亚环烷基、任选取代的C3-C20亚杂环烷基、任选取代的C4-C20亚环烯基、任选取代的C4-C20亚杂环烯基、任选取代的C8-C20亚环炔基、任选取代的C8-C20亚杂环炔基、任选取代的C5-C15亚芳基或任选取代的C2-C15亚杂芳基。
在一些实施方案中，LC可具有两个附接于Fc结构域、Fc结合肽、白蛋白或白蛋白结合肽的点(例如，两个GC2)。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，L包括聚乙二醇(PEG)接头。PEG接头包括具有重复单元结构(-CH2CH2O-)n的接头，其中n为2至100的整数。聚乙二醇接头可共价接合神经氨酸酶抑制剂及E(例如，在式(M-I)-(M-XI)中任一者的缀合物中)。聚乙二醇接头可共价接合第一神经氨酸酶抑制剂及第二神经氨酸酶抑制剂(例如，在式(D-I)-(D-XI)中任一者的缀合物中)。聚乙二醇接头可共价接合神经氨酸酶抑制剂二聚体及E(例如，在式(D-I)-(D-XI)中任一者的缀合物中)。聚乙二醇接头可选自PEG2至PEG100中任一者(例如，PEG2、PEG3、PEG4、PEG5、PEG5-PEG10、PEG10-PEG20、PEG20-PEG30、PEG30-PEG40、PEG50-PEG60、PEG60-PEG70、PEG70-PEG80、PEG80-PEG90、PEG90-PEG100)。在一些实施方案中，Lc包括PEG接头，其中LC共价附接于Q及E中每一者。
在一些实施方案中，L为
Figure BDA0003630331990001121
Figure BDA0003630331990001131
Figure BDA0003630331990001141
Figure BDA0003630331990001151
Figure BDA0003630331990001161
Figure BDA0003630331990001171
Figure BDA0003630331990001181
Figure BDA0003630331990001191
Figure BDA0003630331990001201
Figure BDA0003630331990001211
Figure BDA0003630331990001221
其中z1及z2各自独立地为1至20的整数；且R9选自H、C1-C20烷基、C3-C20环烷基、C3-C20杂环烷基；C5-C15芳基及C2-C15杂芳基。
在一些实施方案中，L为
Figure BDA0003630331990001222
Figure BDA0003630331990001231
Figure BDA0003630331990001241
Figure BDA0003630331990001251
Figure BDA0003630331990001261
其中R*为键或包含任选取代的C1-C20亚烷基、任选取代的C1-C20亚杂烷基、任选取代的C2-C20亚烯基、任选取代的C2-C20亚杂烯基、任选取代的C2-C20亚炔基、任选取代的C2-C20亚杂炔基、任选取代的C3-C20亚环烷基、任选取代的C3-C20亚杂环烷基、任选取代的C4-C20亚环烯基、任选取代的C4-C20亚杂环烯基、任选取代的C8-C20亚环炔基、任选取代的C8-C20亚杂环炔基、任选取代的C5-C15亚芳基、任选取代的C2-C15亚杂芳基、O、S、NRi、P、羰基、硫羰基、磺酰基、磷酸酯基及亚氨基中的一者或多者，且其中Ri为H、任选取代的C1-C20烷基、任选取代的C1-C20杂烷基、任选取代的C2-C20烯基、任选取代的C2-C20杂烯基、任选取代的C2-C20炔基、任选取代的C2-C20杂炔基、任选取代的C3-C20环烷基、任选取代的C3-C20杂环烷基、任选取代的C4-C20环烯基、任选取代的C4-C20杂环烯基、任选取代的C8-C20环炔基、任选取代的C8-C20杂环炔基、任选取代的C5-C15芳基或任选取代的C2-C15杂芳基。
在一些实施方案中，Y为：
Figure BDA0003630331990001262
(-NH(C＝O)O-)且L为：
Figure BDA0003630331990001263
在一些实施方案中，Y为：
Figure BDA0003630331990001271
(-NH(C＝O)O-)且L为：
Figure BDA0003630331990001272
在一些实施方案中，Y为：
Figure BDA0003630331990001273
(-NH(C＝O)O-)且L为：
Figure BDA0003630331990001274
在一些实施方案中，Y为：
Figure BDA0003630331990001275
(-O-)且L为：
Figure BDA0003630331990001276
在另一个方面中，本发明提供一种由以下来描述的缀合物：式(M-I)
Figure BDA0003630331990001277
其中每个A1独立地选自式(A-I)-(A-XII)中任一者；
每个E包含Fc结构域单体(例如，具有SEQ ID NO:1-138中任一者的序列的Fc结构域单体)、白蛋白(例如，具有SEQ ID NO:139-141中任一者的序列的白蛋白)、白蛋白结合肽或Fc结合肽；n为1或2；T为1至20的整数(例如，T为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)；且L为共价附接于E及A1中每一者的接头，或其药学上可接受的盐。当T大于1(例如，T为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)时，每个A1可独立地选自式(A-I)-(A-XII)中任一者。在一些实施方案中，每个A1可独立地选自式(A-I)、(A-II)、(A-VI)或(A-VII)中任一者。在其他实施方案中，每个A1可独立地选自式(A-I)。
在另一个方面中，本发明提供一种由以下来描述的缀合物：式(M-I)
Figure BDA0003630331990001281
其中每个A1独立地选自式(A-I)-(A-V)中任一者；每个E包含Fc结构域单体(例如，具有SEQ ID NO:1-138中任一者的序列的Fc结构域单体)、白蛋白(例如，具有SEQ ID NO:139-141中任一者的序列的白蛋白)、白蛋白结合肽或Fc结合肽；n为1或2；T为1至20的整数(例如，T为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)；且L为共价附接于E及A1中每一者的接头，或其药学上可接受的盐。当T大于1(例如，T为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)时，每个A1可独立地选自式(A-I)-(A-V)中任一者。
在另一个方面中，本发明提供一种由以下来描述的缀合物：式(M-I)
Figure BDA0003630331990001282
其中每个A1独立地选自式(A-VI)-(A-IX)中任一者；每个E包含Fc结构域单体(例如，具有SEQ ID NO:1-138中任一者的序列的Fc结构域单体)、白蛋白(例如，具有SEQ IDNO:139-141中任一者的序列的白蛋白)、白蛋白结合肽或Fc结合肽；n为1或2；T为1至20的整数(例如，T为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)；且L为共价附接于E及A1中每一者的接头，或其药学上可接受的盐。当T大于1(例如，T为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)时，每个A1可独立地选自式(A-VI)-(A-IX)中任一者。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-II)
Figure BDA0003630331990001291
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-II-1)
Figure BDA0003630331990001301
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-II-2)
Figure BDA0003630331990001302
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-II-3)
Figure BDA0003630331990001311
其中L’是L的剩余部分，且y1为1至20的整数(例如，y1为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-II-4)
Figure BDA0003630331990001312
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-II-5)
Figure BDA0003630331990001321
其中L’是L的剩余部分，且y1为1至20的整数(例如，y1为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物具有结构
Figure BDA0003630331990001322
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-II-6)
Figure BDA0003630331990001331
其中R7选自H、C1-C20烷基、C3-C20环烷基、C3-C20杂环烷基；C5-C15芳基及C2-C15杂芳基；或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，R7选自C1-C20烷基(例如，甲基、乙基、丙基或丁基)。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-II-7)
Figure BDA0003630331990001332
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-II-8)
Figure BDA0003630331990001341
其中L’是L的剩余部分，且y1为1至20的整数(例如，y1为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物具有以下结构：
Figure BDA0003630331990001342
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-II-9)
Figure BDA0003630331990001351
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-II-10)
Figure BDA0003630331990001352
其中L’是L的剩余部分，且y1为1至20的整数(例如，y1为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物具有结构
Figure BDA0003630331990001361
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-III)
Figure BDA0003630331990001362
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-III-1)
Figure BDA0003630331990001371
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-III-2)
Figure BDA0003630331990001372
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-III-3)
Figure BDA0003630331990001381
其中L’是L的剩余部分，且y1为1至20的整数(例如，y1为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-III-4)
Figure BDA0003630331990001382
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-III-5)
Figure BDA0003630331990001391
其中L’是L的剩余部分，且y1为1至20的整数(例如，y1为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-III-6)
Figure BDA0003630331990001392
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-III-7)
Figure BDA0003630331990001401
其中L’是L的剩余部分，且y1为1至20的整数(例如，y1为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-III-8)
Figure BDA0003630331990001402
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-III-9)
Figure BDA0003630331990001411
其中L’是L的剩余部分，且y1为1至20的整数(例如，y1为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-IV)
Figure BDA0003630331990001412
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-IV-1)
Figure BDA0003630331990001421
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-IV-2)
Figure BDA0003630331990001422
其中L’是L的剩余部分，且y1为1至20的整数(例如，y1为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-V)
Figure BDA0003630331990001431
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-V-1)
Figure BDA0003630331990001432
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-V-2)
Figure BDA0003630331990001441
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-V-3)
Figure BDA0003630331990001442
其中L’是L的剩余部分，且y1为1至20的整数(例如，y1为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-V-4)
Figure BDA0003630331990001451
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-V-5)
Figure BDA0003630331990001452
其中L’是L的剩余部分，且y1为1至20的整数(例如，y1为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-V-6)
Figure BDA0003630331990001461
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-V-7)
Figure BDA0003630331990001462
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-V-8)
Figure BDA0003630331990001471
其中L’是L的剩余部分，且y1为1至20的整数(例如，y1为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-V-9)
Figure BDA0003630331990001472
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-V-10)
Figure BDA0003630331990001481
其中L’是L的剩余部分，且y1为1至20的整数(例如，y1为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-VI)
Figure BDA0003630331990001482
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-VI-1)
Figure BDA0003630331990001491
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-VI-2)
Figure BDA0003630331990001492
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-VI-3)
Figure BDA0003630331990001501
其中L’是L的剩余部分，且y1为1至20的整数(例如，y1为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-VI-4)
Figure BDA0003630331990001502
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-VI-5)
Figure BDA0003630331990001511
其中L’是L的剩余部分，且y1为1至20的整数(例如，y1为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-VI-6)
Figure BDA0003630331990001512
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-VI-7)
Figure BDA0003630331990001521
其中L’是L的剩余部分，且y1为1至20的整数(例如，y1为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-VI-8)
Figure BDA0003630331990001522
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-VI-9)
Figure BDA0003630331990001531
其中L’是L的剩余部分，且y1为1至20的整数(例如，y1为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-VII)
Figure BDA0003630331990001532
或其药学上可接受的盐。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，R1为OH。在本文所述的任何方面的一些实施方案中，R1为NH2。在本文所述的任何方面的一些实施方案中，R1为-NHC(＝NH)NH2。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-VIII)
Figure BDA0003630331990001541
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-VIII-1)
Figure BDA0003630331990001542
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：(M-VIII-2)
Figure BDA0003630331990001551
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-VIII-3)
Figure BDA0003630331990001552
其中L’是L的剩余部分，且y1为1至20的整数(例如，y1为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-VIII-4)
Figure BDA0003630331990001561
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-VIII-5)
Figure BDA0003630331990001562
其中L’是L的剩余部分，且y1为1至20的整数，或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物具有以下的结构：
Figure BDA0003630331990001571
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-VIII-6)
Figure BDA0003630331990001572
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-VIII-7)
Figure BDA0003630331990001581
其中L’是L的剩余部分，且y1为1至20的整数(例如，y1为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-VIII-8)
Figure BDA0003630331990001582
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-VIII-9)
Figure BDA0003630331990001591
其中L’是L的剩余部分，且y1为1至20的整数(例如，y1为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-VIII-10)
Figure BDA0003630331990001601
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-VIII-11)
Figure BDA0003630331990001602
其中L’是L的剩余部分，且y1为1至20的整数(例如，y1为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-IX)
Figure BDA0003630331990001611
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-IX-1)
Figure BDA0003630331990001612
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-IX-2)
Figure BDA0003630331990001621
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-IX-3)
Figure BDA0003630331990001622
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-IX-4)
Figure BDA0003630331990001631
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-IX-5)
Figure BDA0003630331990001632
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-IX-6)
Figure BDA0003630331990001641
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-X)
Figure BDA0003630331990001642
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-X-1)
Figure BDA0003630331990001651
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-X-2)
Figure BDA0003630331990001652
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-X-3)
Figure BDA0003630331990001661
或其药学上可接受的盐。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，L或L’包含一个或多个任选取代的C1-C20亚烷基、任选取代的C1-C20亚杂烷基、任选取代的C2-C20亚烯基、任选取代的C2-C20亚杂烯基、任选取代的C2-C20亚炔基、任选取代的C2-C20亚杂炔基、任选取代的C3-C20亚环烷基、任选取代的C3-C20亚杂环烷基、任选取代的C4-C20亚环烯基、任选取代的C4-C20亚杂环烯基、任选取代的C8-C20亚环炔基、任选取代的C8-C20亚杂环炔基、任选取代的C5-C15亚芳基、任选取代的C2-C15亚杂芳基、O、S、NRi、P、羰基、硫羰基、磺酰基、磷酸酯基、磷酰基或亚氨基，其中Ri为H、任选取代的C1-C20烷基、任选取代的C1-C20杂烷基、任选取代的C2-C20烯基、任选取代的C2-C20杂烯基、任选取代的C2-C20炔基、任选取代的C2-C20杂炔基、任选取代的C3-C20环烷基、任选取代的C3-C20杂环烷基、任选取代的C4-C20环烯基、任选取代的C4-C20杂环烯基、任选取代的C8-C20环炔基、任选取代的C8-C20杂环炔基、任选取代的C5-C15芳基或任选取代的C2-C15杂芳基。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，L或L’的骨架由一个或多个任选取代的C1-C20亚烷基、任选取代的C1-C20亚杂烷基、任选取代的C2-C20亚烯基、任选取代的C2-C20亚杂烯基、任选取代的C2-C20亚炔基、任选取代的C2-C20亚杂炔基、任选取代的C3-C20亚环烷基、任选取代的C3-C20亚杂环烷基、任选取代的C4-C20亚环烯基、任选取代的C4-C20亚杂环烯基、任选取代的C8-C20亚环炔基、任选取代的C8-C20亚杂环炔基、任选取代的C5-C15亚芳基、任选取代的C2-C15亚杂芳基、O、S、NRi、P、羰基、硫羰基、磺酰基、磷酸酯基、磷酰基或亚氨基组成，其中Ri为H、任选取代的C1-C20烷基、任选取代的C1-C20杂烷基、任选取代的C2-C20烯基、任选取代的C2-C20杂烯基、任选取代的C2-C20炔基、任选取代的C2-C20杂炔基、任选取代的C3-C20环烷基、任选取代的C3-C20杂环烷基、任选取代的C4-C20环烯基、任选取代的C4-C20杂环烯基、任选取代的C8-C20环炔基、任选取代的C8-C20杂环炔基、任选取代的C5-C15芳基或任选取代的C2-C15杂芳基。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，L或L’经氧代取代。在一些实施方案中，L或L’的骨架包含不超过250个原子。在一些实施方案中，L或L’能够形成酰胺、氨基甲酸酯、磺酰基或脲连接。在一些实施方案中，L或L’为键。在一些实施方案中，L或L’为原子。在一些实施方案中，L’为氮原子。
在一些实施方案中，每个L由以下来描述：式(M-L-1)
J1-(Q1)g-(T1)h-(Q2)i-(T2)j-(Q3)k-(T3)l-(Q4)m-(T4)n-(Q5)o-J2
其中：J1是附接于A1的键；J2是附接于E的键或能够与缀合于E的官能团反应的官能团(例如，马来酰亚胺及半胱氨酸、胺及经活化羧酸、硫醇及马来酰亚胺、经活化磺酸及胺、异氰酸酯及胺、叠氮化物及炔以及烯烃及四嗪)；Q1、Q2、Q3、Q4及Q5中的每一者独立地为任选取代的C1-C20亚烷基、任选取代的C1-C20亚杂烷基、任选取代的C2-C20亚烯基、任选取代的C2-C20亚杂烯基、任选取代的C2-C20亚炔基、任选取代的C2-C20亚杂炔基、任选取代的C3-C20亚环烷基、任选取代的C3-C20亚杂环烷基、任选取代的C4-C20亚环烯基、任选取代的C4-C20亚杂环烯基、任选取代的C8-C20亚环炔基、任选取代的C8-C20亚杂环炔基、任选取代的C5-C15亚芳基或任选取代的C2-C15亚杂芳基；T1、T2、T3、T4中的每一者独立地为O、S、NRi、P、羰基、硫羰基、磺酰基、磷酸酯基、磷酰基或亚氨基；Ri为H、任选取代的C1-C20烷基、任选取代的C1-C20杂烷基、任选取代的C2-C20烯基、任选取代的C2-C20杂烯基、任选取代的C2-C20炔基、任选取代的C2-C20杂炔基、任选取代的C3-C20环烷基、任选取代的C3-C20杂环烷基、任选取代的C4-C20环烯基、任选取代的C4-C20杂环烯基、任选取代的C8-C20环炔基、任选取代的C8-C20杂环炔基、任选取代的C5-C15芳基或任选取代的C2-C15杂芳基；且g、h、i、j、k、l、m、n及o各自独立地为0或1；或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，J2可具有两个附接于Fc结构域、Fc结合肽、白蛋白或白蛋白结合肽的点(例如，两个J2)。
在一些实施方案中，L为
Figure BDA0003630331990001681
其中d为1至20的整数(例如，d为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)。
在一些实施方案中，L为
Figure BDA0003630331990001682
Figure BDA0003630331990001691
其中d及e各自独立地为1至26的整数；或其药学上可接受的盐。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，L包括聚乙二醇(PEG)接头。PEG接头包括具有重复单元结构(-CH2CH2O-)n的接头，其中n为2至100的整数。聚乙二醇接头可共价接合神经氨酸酶抑制剂及E(例如，在式(M-I)-(M-XI)中任一者的缀合物中)。聚乙二醇接头可共价接合第一神经氨酸酶抑制剂及第二神经氨酸酶抑制剂(例如，在式(D-I)-(D-XI)中任一者的缀合物中)。聚乙二醇接头可共价接合神经氨酸酶抑制剂二聚体及E(例如，在式(D-I)-(D-XI)中任一者的缀合物中)。聚乙二醇接头可选自PEG2至PEG100中任一者(例如，PEG2、PEG3、PEG4、PEG5、PEG5-PEG10、PEG10-PEG20、PEG20-PEG30、PEG30-PEG40、PEG50-PEG60、PEG60-PEG70、PEG70-PEG80、PEG80-PEG90、PEG90-PEG100)。在一些实施方案中，Lc包括PEG接头，其中LC共价附接于Q及E中每一者。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，R1为-NHC(＝NH)NH2。在本文所述的任何方面的一些实施方案中，R2为-F。在本文所述的任何方面的一些实施方案中，R3为-F。在本文所述的任何方面的一些实施方案中，R4为–CO2H。在本文所述的任何方面的一些实施方案中，R5为–COCH3。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，L共价附接于E的表面暴露赖氨酸的氮原子或L共价附接于E的表面暴露半胱氨酸的硫原子。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E为Fc结构域单体。在一些实施方案中，n为2且每个E二聚以形成Fc结构域。
在一些实施方案中，n为2，每个E为Fc结构域单体，每个E二聚以形成Fc结构域，且所述缀合物由以下来描述：式(D-I-1)
Figure BDA0003630331990001701
其中J为Fc结构域；且T为1至20的整数(例如，T为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物具有以下的结构：
Figure BDA0003630331990001711
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，n为2，每个E为Fc结构域单体，每个E二聚以形成Fc结构域，且所述缀合物由以下来描述：式(M-I-1)
Figure BDA0003630331990001712
其中J为Fc结构域；且T为1至20的整数(例如，T为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，或其药学上可接受的盐。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E具有SEQ ID NO:1-138中任一者的序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E为白蛋白、白蛋白结合肽或Fc结合肽。在其中E为白蛋白、白蛋白结合肽或Fc结合肽的一些实施方案中，n为1。
在一些实施方案中，n为1，E为白蛋白、白蛋白结合肽或Fc结合肽且所述缀合物由以下来描述：式(D-I-2)
Figure BDA0003630331990001721
其中E为白蛋白、白蛋白结合肽或Fc结合肽；且T为1至20的整数，或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，n为1，E为白蛋白、白蛋白结合肽或Fc结合肽且所述缀合物由以下来描述：式(M-I-2)
Figure BDA0003630331990001722
其中E为白蛋白、白蛋白结合肽或Fc结合肽；且T为1至20的整数，或其药学上可接受的盐。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E为具有SEQ ID NO:139-141中任一者的序列的白蛋白。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，T为1、2、3、4或5。
在另一个方面中，本发明提供具有本文所述的任何缀合物的结构的缀合物的群体(例如，具有式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一式的缀合物的群体)，其中T的平均值为1至20(例如，T的平均值为1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5)。在一些实施方案中，T的平均值为约1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5或20。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，当T大于1(例如，T为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)时，每个A1-L-A2可独立地经选择(例如，独立地选自本文所述的A1-L-A2结构中任一者)。在一些实施方案中，E可缀合于2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个不同的A1-L-A2部分。在一些实施方案中，E缀合于第一A1-L-A2部分及第二A1-L-A2部分。在一些实施方案中，第一A1-L-A2部分的A1及A2独立地选自式(A-III)-(A-V)中任一者，且第二A1-L-A2部分的A1及A2独立地选自式(A-I)、(A-II)、(A-VI)、(A-VII)、(A-VIII)及(A-IX)中任一者。
在一些实施方案中，第一A1-L-A2部分中的每一者特异性地缀合于E的赖氨酸残基(例如，E的表面暴露赖氨酸残基的氮原子)，且第二A1-L-A2部分中的每一者特异性地缀合于E的半胱氨酸残基(例如，E的表面暴露半胱氨酸残基的硫原子)。在一些实施方案中，第一A1-L-A2部分中的每一者特异性地缀合于E的半胱氨酸残基(例如，E的表面暴露半胱氨酸残基的硫原子)，且第二A1-L-A2部分中的每一者特异性地缀合于E的赖氨酸残基(例如，E的表面暴露赖氨酸残基的氮原子)。
在一些实施方案中，缀合于E的第一A1-L-A2部分的数目为1至10的整数(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。在一些实施方案中，缀合于E的第二A1-L-A2部分的数目为1至10的整数(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，当T大于1(例如，T为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)时，每个A1-L可独立地经选择(例如，独立地选自本文所述的A1-L结构中任一者)。在一些实施方案中，E可缀合于2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个不同的A1-L部分。在一些实施方案中，E缀合于第一A1-L部分及第二A1-L部分。在一些实施方案中，第一A1-L部分的A1选自式(A-III)-(A-V)中任一者，
且第二A1-L部分的A1选自式(A-I)、(A-II)、(A-VI)、(A-VII)、(A-VIII)或(A-IX)中任一者。
在一些实施方案中，第一A1-L部分中的每一者特异性地缀合于E的赖氨酸残基(例如，E的表面暴露赖氨酸残基的氮原子)，且第二A1-L部分中的每一者特异性地缀合于E的半胱氨酸残基(例如，E的表面暴露半胱氨酸残基的硫原子)。在一些实施方案中，第一A1-L部分中的每一者特异性地缀合于E的半胱氨酸残基(例如，E的表面暴露半胱氨酸残基的硫原子)，且第二A1-L部分中的每一者特异性地缀合于E的赖氨酸残基(例如，E的表面暴露赖氨酸残基的氮原子)。
在一些实施方案中，缀合于E的第一A1-L部分的数目为1至10的整数(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。在一些实施方案中，缀合于E的第二A1-L部分的数目为1至10的整数(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)。
在另一个方面中，本发明提供一种由以下来描述的缀合物：式(D’-I)
Figure BDA0003630331990001741
其中每个A1独立地选自式(A-III)-(A-V)中任一者；其中每个A2独立地选自式(A-I)、(A-II)、(A-VI)、(A-VII)、(A-VIII)及(A-IX)中任一者；每个E包含Fc结构域单体(例如，具有SEQ ID NO:1-138中任一者的序列的Fc结构域单体)、白蛋白(例如，具有SEQ ID NO:139-141中任一者的序列的白蛋白)、白蛋白结合肽或Fc结合肽；n为1或2；T1为1至10的整数(例如，T1为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)；L1是共价缀合于E且缀合于每个A1的接头；T1为1至10的整数(例如，T1为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)；L2是共价缀合于E及每个A2的接头；T2为1至10的整数(例如，T2为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)，或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，每个A1-L-A1特异性地缀合于E的赖氨酸残基(例如，E的表面暴露赖氨酸残基的氮原子)，且每个A2-L-A2特异性地缀合于E的半胱氨酸残基(例如，E的表面暴露半胱氨酸残基的硫原子)。在一些实施方案中，每个A1-L-A1部分特异性地缀合于E的半胱氨酸残基(例如，E的表面暴露半胱氨酸残基的硫原子)，且每个A2-L-A2部分特异性地缀合于E的赖氨酸残基(例如，E的表面暴露赖氨酸残基的氮原子)。
在另一个方面中，本发明提供一种由以下来描述的缀合物：式(M’-I)
Figure BDA0003630331990001751
其中每个A1独立地选自式(A-III)-(A-V)中(M-IX)任一者；其中每个A2独立地选自式(A-I)、(A-II)、(A-VI)、(A-VII)、(A-VIII)及(A-IX)中任一者；每个E包含Fc结构域单体(例如，具有SEQ ID NO:1-138中任一者的序列的Fc结构域单体)、白蛋白(例如，具有SEQ IDNO:139-141中任一者的序列的白蛋白)、白蛋白结合肽或Fc结合肽；n为1或2；T1为1至10的整数(例如，T1为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)；L1是共价缀合于E及A1的接头；T1为1至10的整数(例如，T1为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)；L2是共价缀合于E及A2的接头；T2为1至10的整数(例如，T2为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)，或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，每个A1-L特异性地缀合于E的赖氨酸残基(例如，E的表面暴露赖氨酸残基的氮原子)，且每个A2-L特异性地缀合于E的半胱氨酸残基(例如，E的表面暴露半胱氨酸残基的硫原子)。在一些实施方案中，每个A1-L部分特异性地缀合于E的半胱氨酸残基(例如，E的表面暴露半胱氨酸残基的硫原子)，且每个A2-L部分特异性地缀合于E的赖氨酸残基(例如，E的表面暴露赖氨酸残基的氮原子)。
在另一个方面中，本发明提供一种药物组合物，其包含本文所述的缀合物中任一者(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者的缀合物)或其药学上可接受的盐，及药学上可接受的赋形剂。
在另一个方面中，本发明提供一种用于治疗具有病毒感染或据推测具有病毒感染的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的缀合物或组合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者的缀合物)中任一者。
在另一个方面中，本发明提供一种用于预防性治疗有需要的受试者的病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的缀合物或组合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者的缀合物)中任一者。
在一些实施方案中，所述病毒感染是由流感病毒或副流感病毒引起的。在一些实施方案中，所述病毒感染为流感病毒A、B或C或副流感病毒。
在一些实施方案中，所述受试者是免疫受损的。
在一些实施方案中，所述受试者已经诊断患有体液免疫缺陷、T细胞缺陷、嗜中性粒细胞减少症、无脾或补体缺陷。
在一些实施方案中，所述受试者正在经免疫抑制性疗法治疗或即将经免疫抑制性疗法治疗。
在一些实施方案中，所述受试者已经诊断患有引起免疫抑制的疾病。在一些实施方案中，所述疾病为癌症或获得性免疫缺陷综合征。在一些实施方案中，所述癌症为白血病、淋巴瘤或多发性骨髓瘤。
在一些实施方案中，所述受试者已经受或即将经受造血干细胞移植。
在一些实施方案中，所述受试者已经受或即将经受器官移植。
在一些实施方案中，所述受试者患有继发感染或处于发生继发感染的风险中。在一些实施方案中，所述继发感染是细菌感染(例如，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(MRSA)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和/或流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae))、病毒感染或真菌感染。在特定实施方案中，所述继发感染为MRSA。在某些实施方案中，所述继发感染是肺炎链球菌。在一些实施方案中，所述继发感染是呼吸道感染(例如，呼吸道的感染)。在一些实施方案中，所述继发感染与(例如，引起)肺炎(例如，细菌性或病毒性肺炎)相关联。在一些实施方案中，所述受试者患有肺炎或处于发生肺炎的风险中。
在另一个方面中，本公开提供一种预防诊断患有流感感染的受试者的继发感染的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用本文所述的缀合物或组合物。在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用缀合物45或包含缀合物45的药物组合物。
在一些实施方案中，向诊断患有流感感染的受试者施用本发明的缀合物或组合物降低了例如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％或更多(例如，与未用缀合物或组合物治疗的经受流感的受试者相比)的发生继发感染的可能性。例如，向诊断患有流感感染的受试者施用本发明的缀合物或组合物降低了例如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％或更多的发生继发细菌感染(例如，MRSA、肺炎链球菌、铜绿假单胞菌和/或流感嗜血杆菌)的可能性。在一些实施方案中，所述缀合物或组合物肌肉内、静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病变内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、经表面、肿瘤内、经腹膜、皮下、结膜下、囊内、经粘膜、心包内、脐内、眼内、经口、经局部、通过吸入、通过注射或通过输注经施用。
在一些实施方案中，所述受试者经第二治疗剂治疗。在一些实施方案中，所述第二治疗剂为抗病毒剂。在一些实施方案中，所述抗病毒剂选自吡莫地韦(pimovidir)、奥司他韦、扎那米韦、帕拉米韦、拉尼米韦(laninamivir)、金刚烷胺或金刚乙胺。在特定实施方案中，所述第二治疗剂为吡莫地韦。在一些实施方案中，所述第二治疗剂为病毒疫苗。在一些实施方案中，所述病毒疫苗在所述受试者中引起针对流感病毒A、B或C或副流感病毒的免疫反应。
在一些实施方案中，所述缀合物与抗病毒剂组合施用，其中抗病毒剂是巴洛沙韦(baloxavir)。在某些实施方案中，所述缀合物由式(D-II-6)描述。在其他实施方案中，所述缀合物由式(D-II-7)描述。在某些实施方案中，每个E包含具有与SEQ ID NO:63-138中任一者的序列至少95％相同的氨基酸序列的Fc结构域。在某些实施方案中，每个E包含具有与SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:85或SEQ IDNO:86中任一者的序列至少95％相同的氨基酸序列的Fc结构域。在特定实施方案中，每个E包含具有SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:72、SEQID NO:73、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:85或SEQ ID NO:86中任一者的氨基酸序列的Fc结构域。在优选实施方案中，所述缀合物是缀合物45(例如，缀合物45a或缀合物45b)或缀合物46。
在某些实施方案中，缀合物及巴洛沙韦依序施用。在其他实施方案中，缀合物及巴洛沙韦同时施用。
在一个方面中，本公开提供一种用于治疗或预防受试者的病毒感染的方法，所述方法通过向所述受试者施用：a)有效量的如权利要求1-215中任一项所述的缀合物或组合物；及b)第二治疗剂。在某些实施方案中，在受试者具有病毒感染、据推测具有病毒感染或已暴露于病毒之后，向受试者施用缀合物。在一些实施方案中，向受试者预防性地施用缀合物。在某些实施方案中，在受试者具有病毒感染、据推测具有病毒感染或已暴露于病毒之后，向受试者施用第二治疗剂。在一些实施方案中，向受试者预防性地施用第二治疗剂。在一些实施方案中，所述第二治疗剂在缀合物的30天内、14天内、7天内、2天内或24小时内施用。在特定实施方案中，所述第二治疗剂在缀合物的2天内施用。在某些实施方案中，所述第二治疗剂是抗病毒剂(例如，吡莫地韦、奥司他韦、扎那米韦、帕拉米韦、拉尼米韦、金刚烷胺、巴洛沙韦玛波西酯(baloxavir marboxil)、巴洛沙韦酸、金刚乙胺或其药学上可接受的盐)。在特定实施方案中，所述抗病毒剂是巴洛沙韦玛波西酯、巴洛沙韦酸或其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，所述巴洛沙韦玛波西酯以20mg与90mg之间(例如，25mg与50mg之间、45mg与70mg之间或65与90mg之间)的量施用。在一些实施方案中，所述巴洛沙韦玛波西酯经口施用。在某些实施方案中，所述巴洛沙韦玛波西酯以单一剂量形式施用。在其他实施方案中，所述巴洛沙韦玛波西酯以超过一次剂量形式施用。在特定实施方案中，所述巴洛沙韦玛波西酯以20mg与40mg之间的量施用。在其他实施方案中，所述巴洛沙韦玛波西酯以30与80mg之间的量施用。在某些实施方案中，缀合物由式(D-II-6)描述。在其他实施方案中，所述缀合物由式(D-II-7)描述。在某些实施方案中，每个E具有与SEQ ID NO:63-138中任一者的序列至少95％相同的序列。在特定实施方案中，每个E包含具有与SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:85或SEQ ID NO:86中任一者的序列至少95％相同的氨基酸序列的Fc结构域。在特定实施方案中，每个E包含具有SEQ IDNO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ IDNO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:85或SEQ ID NO:86中任一者的氨基酸序列的Fc结构域。在某些实施方案中，所述缀合物是缀合物45(例如，缀合物45a或缀合物45b)或缀合物46。在特定实施方案中，所述缀合物肌肉内、静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病变内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、经表面、肿瘤内、经腹膜、皮下、结膜下、囊内、经粘膜、心包内、脐内、眼内、经口、经局部、通过吸入、通过注射或通过输注经施用。在一些实施方案中，所述缀合物静脉内经施用。在一些实施方案中，所述缀合物肌肉内经施用。在一些实施方案中，所述病毒感染是由流感病毒或副流感病毒引起的。在某些实施方案中，所述病毒为流感病毒A、B或C或副流感病毒。
在一些实施方案中，在式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者(例如，式(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(D-I)、(D-II)、(D-II-1)、(D-II-2)、(D-II-3)、(D-II-4)、(D-II-5)、(D-II-6)、(D-II-7)、(D-II-8)、(D-II-9)、(D-II-10)、(D-III)、(D-III-1)、(D-III-2)、(D-III-3)、(D-III-4)、(D-III-5)、(D-III-6)、(D-III-7)、(D-III-8)、(D-III-9)、(D-IV)、(D-IV-1)、(D-IV-2)、(D-V)、(D-V-1)、(D-V-2)、(D-V-3)、(D-V-4)、(D-V-5)、(D-V-6)、(D-V-7)、(D-V-8)、(D-V-9)、(D-V-10)、(D-VI)、(D-VI-1)、(D-VI-2)、(D-VI-3)、(D-VI-4)、(D-VI-5)、(D-VI-6)、(D-VI-7)、(D-VI-8)、(D-VI-9)、(D-VII)、(D-VIII)、(D-VIII-1)、(D-VIII-2)、(D-VIII-3)、(D-VIII-4)、(D-VIII-5)、(D-VIII-6)、(D-VIII-7)、(D-VIII-8)、(D-VIII-9)、(D-VIII-10)、(D-VIII-11)、(D-IX)、(D-IX-1)、(D-IX-2)、(D-IX-3)、(D-IX-4)、(D-IX-5)、(D-IX-6)、(D-X)、(D-X-1)、(D-X-2)、(D-X-3)、(D-XI)、(D-XI-1)、(D’-I)、(M-I)、(M-II)、(M-II-1)、(M-II-2)、(M-II-3)、(M-II-4)、(M-II-5)、(M-II-6)、(M-II-7)、(M-II-8)、(M-II-9)、(M-II-10)、(M-III)、(M-III-1)、(M-III-2)、(M-III-3)、(M-III-4)、(M-III-5)、(M-III-6)、(M-III-7)、(M-III-8)、(M-III-9)、(M-IV)、(M-IV-1)、(M-IV-2)、(M-V)、(M-V-1)、(M-V-2)、(M-V-3)、(M-V-4)、(M-V-5)、(M-V-6)、(M-V-7)、(M-V-8)、(M-V-9)、(M-V-10)、(M-VI)、(M-VI-1)、(M-VI-2)、(M-VI-3)、(M-VI-4)、(M-VI-5)、(M-VI-6)、(M-VI-7)、(M-VI-8)、(M-VI-9)、(M-VII)、(M-VIII)、(M-VIII-1)、(M-VIII-2)、(M-VIII-3)、(M-VIII-4)、(M-VIII-5)、(M-VIII-6)、(M-VIII-7)、(M-VIII-8)、(M-VIII-9)、(M-VIII-10)、(M-VIII-11)、(M-IX)、(M-IX-1)、(M-IX-2)、(M-IX-3)、(M-IX-4)、(M-IX-5)、(M-IX-6)、(M-X)、(M-X-1)、(M-X-2)、(M-X-3)、(M-XI)、(M-XI-1)或(M’-I)中任一者)中，含Fc结构域组合物可取代Fc结构域且含Fc结构域-单体组合物可取代Fc结构域单体。在本文所述的式中任一者(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者)中，当n为1时，E为含Fc结构域-单体组合物。在本文所述的式中任一者(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者)中，当n为2时，E为含Fc结构域组合物。
在某些实施方案中，所述含Fc结构域组合物为抗体或抗体片段。抗体可包括任何形式的免疫球蛋白、重链抗体、轻链抗体、基于LRR的抗体或具有抗体样特性的其他蛋白骨架，以及本领域中已知的任何其他免疫结合部分，包括抗体片段(例如，Fab、Fab’、Fab’2、F(ab’)2、Fd、Fv、Feb、scFv或SMIP)。不同类别的抗体的亚单元结构及三维组态为本领域中已知的。抗体片段可包含如下结合部分，其包含源于抗体或与抗体具有显著同源性的部分，诸如抗体的抗原决定区。例示性抗体片段包括Fab、Fab’、Fab’2、F(ab’)2、Fd、Fv、Feb、scFv及SMIP。
在特定实施方案中，所述抗体或抗体片段为人、小鼠、骆驼科动物(例如，美洲驼、羊驼或骆驼)、山羊、绵羊、兔、鸡、豚鼠、仓鼠、马或大鼠抗体或抗体片段。在特定实施方案中，所述抗体为IgG、IgA、IgD、IgE、IgM或内体。在某些实施方案中，所述抗体片段包括scFv、sdAb、dAb、Fab、Fab’、Fab’2、F(ab’)2、Fd、Fv、Feb或SMIP。
在一些实施方案中，所述含Fc结构域组合物(例如，抗体或抗体片段)对一种或多种靶标(例如，抗原)赋予结合特异性。
在一些实施方案中，由所述含Fc结构域组合物(例如，抗体或抗体片段)结合的所述一种或多种靶标(例如，抗原)为病毒(例如，流感)蛋白，诸如神经氨酸酶或血球凝集素。在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段识别病毒表面抗原。在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段靶向血球凝集素。血球凝集素靶向抗体包括单克隆抗体，诸如CR6261、CR8020、MEDI8852、MHAA4549A及VIS410。在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段是靶向流感血球凝集素的广泛中和抗体或抗体片段(例如，描述于Wu等人,J.Mol.Biol.429:2694–2709(2017)中的抗体或抗体片段)。在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段靶向病毒基质蛋白(例如，基质2蛋白)。TCN032为基质2蛋白靶向单克隆抗体。
在一些实施方案中，所述含Fc结构域组合物(例如，抗体或抗体片段)包含一种或多种单结构域抗体(sdAb)。在一些实施方案中，所述含Fc结构域组合物为如下抗体或抗体片段，其包含具有流感A反应性的sdAb，诸如结合于流感A的血球凝集素的sdAb(例如，SD36或SD38，描述于Laursen等人Science.362:598-602(2018)中)。在一些实施方案中，所述含Fc结构域组合物为如下抗体或抗体片段，其包含具有流感B反应性的sdAb，诸如结合于流感B的血球凝集素的sdAb(例如，SD83或SD84，描述于Laursen等人Science.362:598-602(2018)中)。
在一些实施方案中，所述含Fc结构域组合物是包含2种或更多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10种或更多种)sdAb的多结构域抗体(MDAb)或多结构域抗体片段。在一些实施方案中，所述MDAb或其片段包含一种或多种结合于流感A的血球凝集素的sdAB及一种或多种结合于流感B的血球凝集素的sdAb。在一些实施方案中，所述MDAb是JNJ-7445(也称为MD3606)，这描述于Laursen等人Science.362:598-602(2018)中。简单来说，JNJ-7445是一种MDAb，其包含结合于流感A的血球凝集素的两种sdAb(SD36及SD38)和结合于流感B的血球凝集素的两种sdAb(SD83及SD84)，它们连接至Fc结构域(IgG1)。所述sdAb通过用流感疫苗以及H7和H2重组血球凝集素使美洲驼免疫而产生。
在另一个方面中，本发明包括由式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者(例如，式(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(D-I)、(D-II)、(D-II-1)、(D-II-2)、(D-II-3)、(D-II-4)、(D-II-5)、(D-II-6)、(D-II-7)、(D-II-8)、(D-II-9)、(D-II-10)、(D-III)、(D-III-1)、(D-III-2)、(D-III-3)、(D-III-4)、(D-III-5)、(D-III-6)、(D-III-7)、(D-III-8)、(D-III-9)、(D-IV)、(D-IV-1)、(D-IV-2)、(D-V)、(D-V-1)、(D-V-2)、(D-V-3)、(D-V-4)、(D-V-5)、(D-V-6)、(D-V-7)、(D-V-8)、(D-V-9)、(D-V-10)、(D-VI)、(D-VI-1)、(D-VI-2)、(D-VI-3)、(D-VI-4)、(D-VI-5)、(D-VI-6)、(D-VI-7)、(D-VI-8)、(D-VI-9)、(D-VII)、(D-VIII)、(D-VIII-1)、(D-VIII-2)、(D-VIII-3)、(D-VIII-4)、(D-VIII-5)、(D-VIII-6)、(D-VIII-7)、(D-VIII-8)、(D-VIII-9)、(D-VIII-10)、(D-VIII-11)、(D-IX)、(D-IX-1)、(D-IX-2)、(D-IX-3)、(D-IX-4)、(D-IX-5)、(D-IX-6)、(D-X)、(D-X-1)、(D-X-2)、(D-X-3)、(D-XI)、(D-XI-1)、(D’-I)、(M-I)、(M-II)、(M-II-1)、(M-II-2)、(M-II-3)、(M-II-4)、(M-II-5)、(M-II-6)、(M-II-7)、(M-II-8)、(M-II-9)、(M-II-10)、(M-III)、(M-III-1)、(M-III-2)、(M-III-3)、(M-III-4)、(M-III-5)、(M-III-6)、(M-III-7)、(M-III-8)、(M-III-9)、(M-IV)、(M-IV-1)、(M-IV-2)、(M-V)、(M-V-1)、(M-V-2)、(M-V-3)、(M-V-4)、(M-V-5)、(M-V-6)、(M-V-7)、(M-V-8)、(M-V-9)、(M-V-10)、(M-VI)、(M-VI-1)、(M-VI-2)、(M-VI-3)、(M-VI-4)、(M-VI-5)、(M-VI-6)、(M-VI-7)、(M-VI-8)、(M-VI-9)、(M-VII)、(M-VIII)、(M-VIII-1)、(M-VIII-2)、(M-VIII-3)、(M-VIII-4)、(M-VIII-5)、(M-VIII-6)、(M-VIII-7)、(M-VIII-8)、(M-VIII-9)、(M-VIII-10)、(M-VIII-11)、(M-IX)、(M-IX-1)、(M-IX-2)、(M-IX-3)、(M-IX-4)、(M-IX-5)、(M-IX-6)、(M-X)、(M-X-1)、(M-X-2)、(M-X-3)或(M’-I)中任一者)描述的缀合物，其中E为抗体或抗体片段。在其中E为抗体或抗体片段的优选实施方案中，n为1。在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段包括本文所述的任何抗体或抗体片段，诸如结合于病毒血球凝集素的单克隆抗体(例如，CR6261、CR8020、MEDI8852、MHAA4549A或VIS410)；靶向病毒血球凝集素的广泛中和抗体或抗体片段(例如，描述于Wu等人,J.Mol.Biol.429:2694–2709(2017)中的抗体或抗体片段)；靶向病毒血球凝集素的sdAb(例如，SD36、SD38、SD83或SD84)；或靶向病毒血球凝集素的MDAb或其片段(例如，JNJ-7445)。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:6的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:9的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:12的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:13的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:14的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:15的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:16的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:17的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:18的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:19的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:20的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:22的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:24的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:26的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:27的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:28的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:29的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:30的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:31的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:32的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:33的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:34的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:35的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:36的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:37的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:38的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:39的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:40的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:41的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:42的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:43的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:45的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:46的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:47的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:48的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:49的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:50的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:51的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:52的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:53的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:54的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:55的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:56的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:57的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:58的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:59的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:60的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:61的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:62的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:63的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:64的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:65的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:66的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:67的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:68的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:69的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:70的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:71的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:72的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:73的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:74的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:75的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:76的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:77的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:78的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:79的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:80的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:81的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:82的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:83的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:84的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:85的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:86的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:87的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:88的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:89的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:90的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:91的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:92的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:93的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:94的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:95的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:96的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:97的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:98的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:99的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:100的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:101的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:102的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:103的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:104的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:105的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:106的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:107的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:108的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:109的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:110的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:111的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:112的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:113的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:114的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:115的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:116的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:117的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:118的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:119的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:120的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:121的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:122的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:123的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:123的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:124的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:124的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:125的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:126的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:127的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:128的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:129的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:130的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:131的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:132的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:133的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:134的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:135的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:136的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:137的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:138的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:139的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:140的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，E(例如，每个E)包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列。在一些实施方案中，E包含与SEQ ID NO:141的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在其中E包含Fc结构域单体的本文所述的任何方面的一些实施方案中，所述Fc结构域单体(例如，具有SEQ ID NO:1-138中任一者的序列的Fc结构域单体)包含对应于M252Y/S254T/T256E(YTE)的三重突变。如本文所用，应理解“对应于”(例如，特定SEQ IDNO.的)特定氨基酸残基的氨基酸包含本领域技术人员将理解与(例如，所述特定序列的)所述特定残基比对的任何氨基酸残基。例如，SEQ ID NO:1-138中任一者可发生突变以包含YTE突变。
在其中E包含Fc结构域单体的本文所述的任何方面的一些实施方案中，所述Fc结构域单体(例如，具有SEQ ID NO:1-138中任一者的序列的Fc结构域单体)包含对应于M428L/N434S(LS)的双重突变型。如本文所用，应理解“对应于”(例如，特定SEQ ID NO.的)特定氨基酸残基的氨基酸包含本领域技术人员将理解与(例如，所述特定序列的)所述特定残基比对的任何氨基酸残基。例如，SEQ ID NO:1-138中任一者可发生突变以包含LS突变。
在其中E包含Fc结构域单体的本文所述的任何方面的一些实施方案中，所述Fc结构域单体(例如，具有SEQ ID NO:1-138中任一者的序列的Fc结构域单体)包含对应于N434H的突变型。如本文所用，应理解“对应于”(例如，特定SEQ ID NO.的)特定氨基酸残基的氨基酸包含本领域技术人员将理解与(例如，所述特定序列的)所述特定残基比对的任何氨基酸残基。例如，SEQ ID NO:1-138中任一者可发生突变以包含N434H突变。
在其中E包含Fc结构域单体的本文所述的任何方面的一些实施方案中，所述Fc结构域单体(例如，具有SEQ ID NO:1-138中任一者的序列的Fc结构域单体)包含对应于C220S的突变型。如本文所用，应理解“对应于”(例如，特定SEQ ID NO.的)特定氨基酸残基的氨基酸包含本领域技术人员将理解与(例如，所述特定序列的)所述特定残基比对的任何氨基酸残基。例如，SEQ ID NO:1-138中任一者可发生突变以包含C220S突变。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，所述Fc结构域单体(例如，具有SEQ IDNO:1-95中任一者的序列的Fc结构域单体)包含对应于V309D/Q311H/N434S(DHS)的三重突变。如本文所用，应理解“对应于”(例如，特定SEQ ID NO.的)特定氨基酸残基的氨基酸包含本领域技术人员将理解与(例如，所述特定序列的)所述特定残基比对的任何氨基酸残基。例如，SEQ ID NO:1-95中任一者可发生突变以包含DHS突变。
在其中E包含Fc结构域单体的本文所述的任何方面的一些实施方案中，所述Fc结构域单体(例如，具有SEQ ID NO:1-138中任一者的序列的Fc结构域单体)是所述Fc结构域单体的片段(例如，来自SEQ ID NO:1-138的至少25个(例如，20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个或更多个)、至少50个(例如，51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75个或更多个)、至少75个(例如，75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100个或更多个)连续氨基酸长度的片段)。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者的缀合物)，E的一个或多个表面暴露赖氨酸残基的一个或多个氮原子或E中的一个或多个表面暴露半胱氨酸的一个或多个硫原子共价缀合于接头(例如，PEG2-PEG20接头)。缀合于E的接头可被官能化，以致其可反应以与本文所述的任何A1-L或任何A2-L-A1的L形成共价键。在优选实施方案中，E缀合于经叠氮基官能化的接头且A1-L或任何A2-L-A1的L经炔基官能化。E的接头-叠氮基及A1-L或A2-L-A1的接头-炔缀合(例如，通过点击化学)形成本发明缀合物，例如由式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者描述的缀合物。在又其他实施方案中，E缀合于经炔基官能化的接头且任何A1-L或任何A2-L-A1的L经叠氮基官能化。E的接头-炔及A1-L或A2-L-A1的接头-叠氮基缀合(例如，通过点击化学，参见例如，图103)形成本发明缀合物，例如由式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)描述的缀合物。在本文所述的任何方面的一些实施方案中，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者的波浪线可表示E与A1-L或A2-L-A1的L之间的共价键。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者的波浪线可表示E的一个或多个氨基酸侧链(例如，E的一个或多个表面暴露赖氨酸残基的一个或多个氮原子或E中的一个或多个表面暴露半胱氨酸的一个或多个硫原子)已缀合于接头(例如，PEG2-PEG20接头)，其中所述接头已经反应性部分官能化，以致所述反应性部分与本文所述的任何A1-L或任何A2-L-A1的L形成共价键(例如，通过经叠氮基官能化的接头与经炔官能化的接头之间的点击化学，如上文所述；参见例如，图103)。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，A1及/或A2具有由(A-I)描述的结构：
Figure BDA0003630331990002091
在优选实施方案中，其中A1及/或A2具有由(A-I)描述的结构：R1是-NHC(＝NH)NH2，R4是-CO2H，R5是-COCH3及/或X是-O-。在优选实施方案中，A1及/或A2具有由以下来描述的扎那米韦结构：
Figure BDA0003630331990002092
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，A1及/或A2具有由(A-II)描述的结构：
Figure BDA0003630331990002093
在优选实施方案中，其中A1及/或A2具有由(A-II)描述的结构：R1是-NHC(＝NH)NH2，R2是H或F，R3是H或F，R4是-CO2H，R5是-COCH3及/或X是-O-。在优选实施方案中，A1及/或A2具有由以下来描述的结构：
Figure BDA0003630331990002101
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，A1及/或A2具有由(A-III)描述的结构：
Figure BDA0003630331990002102
在优选实施方案中，其中A1及/或A2具有由(A-III)描述的结构：R1是-NHC(＝NH)NH2，R4是-CO2H及/或R5是-COCH3。在优选实施方案中，A1及/或A2具有由以下来描述的帕拉米韦结构：
Figure BDA0003630331990002103
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，A1及/或A2具有由(A-IV)描述的结构：
Figure BDA0003630331990002104
Figure BDA0003630331990002111
在优选实施方案中，其中A1及/或A2具有由(A-IV)描述的结构：R1是-NHC(＝NH)NH2，R4是-CO2H及/或R5是-COCH3。在优选实施方案中，A1及/或A2具有由以下来描述的结构：
Figure BDA0003630331990002112
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，A1及/或A2具有由(A-V)描述的结构：
Figure BDA0003630331990002113
在优选实施方案中，其中A1及/或A2具有由(A-V)描述的结构：R1是-NHC(＝NH)NH2，R4是-CO2H及/或R5是-COCH3。在优选实施方案中，A1及/或A2具有由以下来描述的结构：
Figure BDA0003630331990002114
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，A1及/或A2具有由(A-VI)描述的结构：
Figure BDA0003630331990002121
在优选实施方案中，其中A1及/或A2具有由(A-VI)描述的结构：R1是-NHC(＝NH)NH2，R4是-CO2H，R5是-COCH3及/或X是-O-。在优选实施方案中，A1及/或A2具有由以下来描述的扎那米韦结构：
Figure BDA0003630331990002122
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，A1及/或A2具有由(A-VII)描述的结构：
Figure BDA0003630331990002123
在优选实施方案中，其中A1及/或A2具有由(A-VII)描述的结构：R1是-NHC(＝NH)NH2，R2是H或F，R3是H或F，R4是-CO2H，R5是-COCH3及/或X是-O-。在优选实施方案中，A1及/或A2具有由以下来描述的结构：
Figure BDA0003630331990002131
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，A1及/或A2具有由(A-VIII)描述的结构：
Figure BDA0003630331990002132
在优选实施方案中，其中A1及/或A2具有由(A-VIII)描述的结构：R1是-NHC(＝NH)NH2，R5是-COCH3及/或X是-O-。在优选实施方案中，A1及/或A2具有由以下来描述的结构：
Figure BDA0003630331990002133
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，A1及/或A2具有由(A-IX)描述的结构：
Figure BDA0003630331990002141
在优选实施方案中，其中A1及/或A2具有由(A-IX)描述的结构：R1是-NHC(＝NH)NH2，R2是H或F，R3是H或F，R5是-COCH3及/或X是-O-。在优选实施方案中，A1及/或A2具有由以下来描述的结构：
Figure BDA0003630331990002142
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，A1及/或A2具有由(A-X)描述的结构：
Figure BDA0003630331990002143
在优选实施方案中，其中A1及/或A2具有由(A-X)描述的结构：R1是-NHC(＝NH)NH2，R3是H，R5是-COCH3及/或X是-O-。在优选实施方案中，A1及/或A2具有由以下来描述的磺基扎那米韦结构：
Figure BDA0003630331990002151
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，A1及/或A2具有由(A-XI)描述的结构：
Figure BDA0003630331990002152
在优选实施方案中，其中A1及/或A2具有由(A-XI)描述的结构：R4是-CO2H及/或R5是-COCH3。在优选实施方案中，所述烯烃为(E)、(Z)或(E)/(Z)的外消旋混合物。在优选实施方案中，A1及/或A2具有由以下来描述的A-315675(Abbott)结构：
Figure BDA0003630331990002153
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，A1及/或A2具有由(A-XII)描述的结构：
Figure BDA0003630331990002161
在优选实施方案中，其中A1及/或A2具有由(A-XII)描述的结构：R4是-CO2H。在优选实施方案中，A1及/或A2具有由以下来描述的A-315675(Abbott)结构：
Figure BDA0003630331990002162
在一些实施方案中，所述缀合物为缀合物1或其任何区域异构体，且药物:抗体比率(DAR)(例如，T)是在0.5与10.0之间，例如约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些实施方案中，DAR是在0.5与2.0之间、在2.0与4.0之间、在4.0与6.0之间、在6.0与8.0之间或在8.0与10.0之间。在另一个方面中，本发明提供缀合物的群体，每种缀合物具有缀合物1结构，其中缀合物的群体的平均DAR(例如，T)为1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些实施方案中，所述缀合物为缀合物2或其任何区域异构体，且DAR(例如，T)是在0.5与10.0之间，例如约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些实施方案中，DAR是在0.5与2.0之间、在2.0与4.0之间、在4.0与6.0之间、在6.0与8.0之间或在8.0与10.0之间。在另一个方面中，本发明提供缀合物的群体，每种缀合物具有缀合物2结构，其中缀合物的群体的平均DAR(例如，T)为1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些实施方案中，所述缀合物为缀合物3或其任何区域异构体，且DAR(例如，T)是在0.5与10.0之间，例如约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些实施方案中，DAR是在0.5与2.0之间、在2.0与4.0之间、在4.0与6.0之间、在6.0与8.0之间或在8.0与10.0之间。在另一个方面中，本发明提供缀合物的群体，每种缀合物具有缀合物3结构，其中缀合物的群体的平均DAR(例如，T)为1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些实施方案中，所述缀合物为缀合物4或其任何区域异构体，且DAR(例如，T)是在0.5与10.0之间，例如约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些实施方案中，DAR是在0.5与2.0之间、在2.0与4.0之间、在4.0与6.0之间、在6.0与8.0之间或在8.0与10.0之间。在另一个方面中，本发明提供缀合物的群体，每种缀合物具有缀合物4结构，其中缀合物的群体的平均DAR(例如，T)为1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些实施方案中，所述缀合物为缀合物5或其任何区域异构体，且DAR(例如，T)是在0.5与10.0之间，例如约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些实施方案中，DAR是在0.5与2.0之间、在2.0与4.0之间、在4.0与6.0之间、在6.0与8.0之间或在8.0与10.0之间。在另一个方面中，本发明提供缀合物的群体，每种缀合物具有缀合物5结构，其中缀合物的群体的平均DAR(例如，T)为1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些实施方案中，所述缀合物为缀合物6或其任何区域异构体，且DAR(例如，T)是在0.5与10.0之间，例如约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些实施方案中，DAR是在0.5与2.0之间、在2.0与4.0之间、在4.0与6.0之间、在6.0与8.0之间或在8.0与10.0之间。在另一个方面中，本发明提供缀合物的群体，每种缀合物具有缀合物6结构，其中缀合物的群体的平均DAR(例如，T)为1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些实施方案中，所述缀合物为缀合物7或其任何区域异构体，且DAR(例如，T)是在0.5与10.0之间，例如约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些实施方案中，DAR是在0.5与2.0之间、在2.0与4.0之间、在4.0与6.0之间、在6.0与8.0之间或在8.0与10.0之间。在另一个方面中，本发明提供缀合物的群体，每种缀合物具有缀合物7结构，其中缀合物的群体的平均DAR(例如，T)为1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些实施方案中，所述缀合物为缀合物8或其任何区域异构体，且DAR(例如，T)是在0.5与10.0之间，例如约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些实施方案中，DAR是在0.5与2.0之间、在2.0与4.0之间、在4.0与6.0之间、在6.0与8.0之间或在8.0与10.0之间。在另一个方面中，本发明提供缀合物的群体，每种缀合物具有缀合物8结构，其中缀合物的群体的平均DAR(例如，T)为1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些实施方案中，所述缀合物为缀合物9或其任何区域异构体，且DAR(例如，T)是在0.5与10.0之间，例如约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些实施方案中，DAR是在0.5与2.0之间、在2.0与4.0之间、在4.0与6.0之间、在6.0与8.0之间或在8.0与10.0之间。在另一个方面中，本发明提供缀合物的群体，每种缀合物具有缀合物9结构，其中缀合物的群体的平均DAR(例如，T)为1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些实施方案中，所述缀合物为缀合物10或其任何区域异构体，且DAR(例如，T)是在0.5与10.0之间，例如约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些实施方案中，DAR是在0.5与2.0之间、在2.0与4.0之间、在4.0与6.0之间、在6.0与8.0之间或在8.0与10.0之间。在另一个方面中，本发明提供缀合物的群体，每种缀合物具有缀合物10结构，其中缀合物的群体的平均DAR(例如，T)为1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些实施方案中，所述缀合物为缀合物11或其任何区域异构体，且DAR(例如，T)是在0.5与10.0之间，例如约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些实施方案中，DAR是在0.5与2.0之间、在2.0与4.0之间、在4.0与6.0之间、在6.0与8.0之间或在8.0与10.0之间。在另一个方面中，本发明提供缀合物的群体，每种缀合物具有缀合物11结构，其中缀合物的群体的平均DAR(例如，T)为1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些实施方案中，所述缀合物为缀合物12或其任何区域异构体，且DAR(例如，T)是在0.5与10.0之间，例如约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些实施方案中，DAR是在0.5与2.0之间、在2.0与4.0之间、在4.0与6.0之间、在6.0与8.0之间或在8.0与10.0之间。在另一个方面中，本发明提供缀合物的群体，每种缀合物具有缀合物12结构，其中缀合物的群体的平均DAR(例如，T)为1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些实施方案中，所述缀合物为缀合物13或其任何区域异构体，且DAR(例如，T)是在0.5与10.0之间，例如约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些实施方案中，DAR是在0.5与2.0之间、在2.0与4.0之间、在4.0与6.0之间、在6.0与8.0之间或在8.0与10.0之间。在另一个方面中，本发明提供缀合物的群体，每种缀合物具有缀合物13结构，其中缀合物的群体的平均DAR(例如，T)为1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些实施方案中，所述缀合物为缀合物14或其任何区域异构体，且DAR(例如，T)是在0.5与10.0之间，例如约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些实施方案中，DAR是在0.5与2.0之间、在2.0与4.0之间、在4.0与6.0之间、在6.0与8.0之间或在8.0与10.0之间。在另一个方面中，本发明提供缀合物的群体，每种缀合物具有缀合物14结构，其中缀合物的群体的平均DAR(例如，T)为1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些实施方案中，所述缀合物为缀合物15或其任何区域异构体，且DAR(例如，T)是在0.5与10.0之间，例如约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些实施方案中，DAR是在0.5与2.0之间、在2.0与4.0之间、在4.0与6.0之间、在6.0与8.0之间或在8.0与10.0之间。在另一个方面中，本发明提供缀合物的群体，每种缀合物具有缀合物15结构，其中缀合物的群体的平均DAR(例如，T)为1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些实施方案中，所述缀合物为缀合物16或其任何区域异构体，且DAR(例如，T)是在0.5与10.0之间，例如约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些实施方案中，DAR是在0.5与2.0之间、在2.0与4.0之间、在4.0与6.0之间、在6.0与8.0之间或在8.0与10.0之间。在另一个方面中，本发明提供缀合物的群体，每种缀合物具有缀合物16结构，其中缀合物的群体的平均DAR(例如，T)为1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些实施方案中，所述缀合物为缀合物17或其任何区域异构体，且DAR(例如，T)是在0.5与10.0之间，例如约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些实施方案中，DAR是在0.5与2.0之间、在2.0与4.0之间、在4.0与6.0之间、在6.0与8.0之间或在8.0与10.0之间。在另一个方面中，本发明提供缀合物的群体，每种缀合物具有缀合物17结构，其中缀合物的群体的平均DAR(例如，T)为1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些实施方案中，所述缀合物为缀合物18或其任何区域异构体，且DAR(例如，T)是在0.5与10.0之间，例如约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些实施方案中，DAR是在0.5与2.0之间、在2.0与4.0之间、在4.0与6.0之间、在6.0与8.0之间或在8.0与10.0之间。在另一个方面中，本发明提供缀合物的群体，每种缀合物具有缀合物18结构，其中缀合物的群体的平均DAR(例如，T)为1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些实施方案中，所述缀合物为缀合物19或其任何区域异构体，且DAR(例如，T)是在0.5与10.0之间，例如约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些实施方案中，DAR是在0.5与2.0之间、在2.0与4.0之间、在4.0与6.0之间、在6.0与8.0之间或在8.0与10.0之间。在另一个方面中，本发明提供缀合物的群体，每种缀合物具有缀合物19结构，其中缀合物的群体的平均DAR(例如，T)为1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些实施方案中，所述缀合物为缀合物20或其任何区域异构体，且DAR(例如，T)是在0.5与10.0之间，例如约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些实施方案中，DAR是在0.5与2.0之间、在2.0与4.0之间、在4.0与6.0之间、在6.0与8.0之间或在8.0与10.0之间。在另一个方面中，本发明提供缀合物的群体，每种缀合物具有缀合物20结构，其中缀合物的群体的平均DAR(例如，T)为1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些实施方案中，所述缀合物为缀合物21或其任何区域异构体，且DAR(例如，T)是在0.5与10.0之间，例如约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些实施方案中，DAR是在0.5与2.0之间、在2.0与4.0之间、在4.0与6.0之间、在6.0与8.0之间或在8.0与10.0之间。在另一个方面中，本发明提供缀合物的群体，每种缀合物具有缀合物21结构，其中缀合物的群体的平均DAR(例如，T)为1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些实施方案中，所述缀合物为缀合物22或其任何区域异构体，且DAR(例如，T)是在0.5与10.0之间，例如约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些实施方案中，DAR是在0.5与2.0之间、在2.0与4.0之间、在4.0与6.0之间、在6.0与8.0之间或在8.0与10.0之间。在另一个方面中，本发明提供缀合物的群体，每种缀合物具有缀合物22结构，其中缀合物的群体的平均DAR(例如，T)为1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些实施方案中，所述缀合物为缀合物23或其任何区域异构体，且DAR(例如，T)是在0.5与10.0之间，例如约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些实施方案中，DAR是在0.5与2.0之间、在2.0与4.0之间、在4.0与6.0之间、在6.0与8.0之间或在8.0与10.0之间。在另一个方面中，本发明提供缀合物的群体，每种缀合物具有缀合物23结构，其中缀合物的群体的平均DAR(例如，T)为1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些实施方案中，所述缀合物为缀合物24或其任何区域异构体，且DAR(例如，T)是在0.5与10.0之间，例如约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些实施方案中，DAR是在0.5与2.0之间、在2.0与4.0之间、在4.0与6.0之间、在6.0与8.0之间或在8.0与10.0之间。在另一个方面中，本发明提供缀合物的群体，每种缀合物具有缀合物24结构，其中缀合物的群体的平均DAR(例如，T)为1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些实施方案中，所述缀合物为缀合物25或其任何区域异构体，且DAR(例如，T)是在0.5与10.0之间，例如约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些实施方案中，DAR是在0.5与2.0之间、在2.0与4.0之间、在4.0与6.0之间、在6.0与8.0之间或在8.0与10.0之间。在另一个方面中，本发明提供缀合物的群体，每种缀合物具有缀合物25结构，其中缀合物的群体的平均DAR(例如，T)为1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些实施方案中，所述缀合物为缀合物26或其任何区域异构体，且DAR(例如，T)是在0.5与10.0之间，例如约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些实施方案中，DAR是在0.5与2.0之间、在2.0与4.0之间、在4.0与6.0之间、在6.0与8.0之间或在8.0与10.0之间。在另一个方面中，本发明提供缀合物的群体，每种缀合物具有缀合物26结构，其中缀合物的群体的平均DAR(例如，T)为1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些实施方案中，所述缀合物为缀合物27或其任何区域异构体，且DAR(例如，T)是在0.5与10.0之间，例如约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些实施方案中，DAR是在0.5与2.0之间、在2.0与4.0之间、在4.0与6.0之间、在6.0与8.0之间或在8.0与10.0之间。在另一个方面中，本发明提供缀合物的群体，每种缀合物具有缀合物27结构，其中缀合物的群体的平均DAR(例如，T)为1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些实施方案中，所述缀合物为缀合物28或其任何区域异构体，且DAR(例如，T)是在0.5与10.0之间，例如约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些实施方案中，DAR是在0.5与2.0之间、在2.0与4.0之间、在4.0与6.0之间、在6.0与8.0之间或在8.0与10.0之间。在另一个方面中，本发明提供缀合物的群体，每种缀合物具有缀合物28结构，其中缀合物的群体的平均DAR(例如，T)为1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些实施方案中，所述缀合物为缀合物29或其任何区域异构体，且DAR(例如，T)是在0.5与10.0之间，例如约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些实施方案中，DAR是在0.5与2.0之间、在2.0与4.0之间、在4.0与6.0之间、在6.0与8.0之间或在8.0与10.0之间。在另一个方面中，本发明提供缀合物的群体，每种缀合物具有缀合物29结构，其中缀合物的群体的平均DAR(例如，T)为1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些实施方案中，所述缀合物为缀合物30或其任何区域异构体，且DAR(例如，T)是在0.5与10.0之间，例如约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些实施方案中，DAR是在0.5与2.0之间、在2.0与4.0之间、在4.0与6.0之间、在6.0与8.0之间或在8.0与10.0之间。在另一个方面中，本发明提供缀合物的群体，每种缀合物具有缀合物30结构，其中缀合物的群体的平均DAR(例如，T)为1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些实施方案中，所述缀合物为缀合物31或其任何区域异构体，且DAR(例如，T)是在0.5与10.0之间，例如约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些实施方案中，DAR是在0.5与2.0之间、在2.0与4.0之间、在4.0与6.0之间、在6.0与8.0之间或在8.0与10.0之间。在另一个方面中，本发明提供缀合物的群体，每种缀合物具有缀合物31结构，其中缀合物的群体的平均DAR(例如，T)为1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些实施方案中，所述缀合物为缀合物32或其任何区域异构体，且DAR(例如，T)是在0.5与10.0之间，例如约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些实施方案中，DAR是在0.5与2.0之间、在2.0与4.0之间、在4.0与6.0之间、在6.0与8.0之间或在8.0与10.0之间。在另一个方面中，本发明提供缀合物的群体，每种缀合物具有缀合物32结构，其中缀合物的群体的平均DAR(例如，T)为1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些实施方案中，所述缀合物为缀合物33或其任何区域异构体，且DAR(例如，T)是在0.5与10.0之间，例如约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些实施方案中，DAR是在0.5与2.0之间、在2.0与4.0之间、在4.0与6.0之间、在6.0与8.0之间或在8.0与10.0之间。在另一个方面中，本发明提供缀合物的群体，每种缀合物具有缀合物33结构，其中缀合物的群体的平均DAR(例如，T)为1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些实施方案中，所述缀合物为缀合物34或其任何区域异构体，且DAR(例如，T)是在0.5与10.0之间，例如约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些实施方案中，DAR是在0.5与2.0之间、在2.0与4.0之间、在4.0与6.0之间、在6.0与8.0之间或在8.0与10.0之间。在另一个方面中，本发明提供缀合物的群体，每种缀合物具有缀合物34结构，其中缀合物的群体的平均DAR(例如，T)为1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些实施方案中，所述缀合物为缀合物35或其任何区域异构体，且DAR(例如，T)是在0.5与10.0之间，例如约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些实施方案中，DAR是在0.5与2.0之间、在2.0与4.0之间、在4.0与6.0之间、在6.0与8.0之间或在8.0与10.0之间。在另一个方面中，本发明提供缀合物的群体，每种缀合物具有缀合物35结构，其中缀合物的群体的平均DAR(例如，T)为1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些实施方案中，所述缀合物为缀合物36或其任何区域异构体，且DAR(例如，T)是在0.5与10.0之间，例如约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些实施方案中，DAR是在0.5与2.0之间、在2.0与4.0之间、在4.0与6.0之间、在6.0与8.0之间或在8.0与10.0之间。在另一个方面中，本发明提供缀合物的群体，每种缀合物具有缀合物36结构，其中缀合物的群体的平均DAR(例如，T)为1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些实施方案中，所述缀合物为缀合物37或其任何区域异构体，且DAR(例如，T)是在0.5与10.0之间，例如约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些实施方案中，DAR是在0.5与2.0之间、在2.0与4.0之间、在4.0与6.0之间、在6.0与8.0之间或在8.0与10.0之间。在另一个方面中，本发明提供缀合物的群体，每种缀合物具有缀合物37结构，其中缀合物的群体的平均DAR(例如，T)为1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些实施方案中，所述缀合物为缀合物38或其任何区域异构体，且DAR(例如，T)是在0.5与10.0之间，例如约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些实施方案中，DAR是在0.5与2.0之间、在2.0与4.0之间、在4.0与6.0之间、在6.0与8.0之间或在8.0与10.0之间。在另一个方面中，本发明提供缀合物的群体，每种缀合物具有缀合物38结构，其中缀合物的群体的平均DAR(例如，T)为1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些实施方案中，所述缀合物为缀合物39或其任何区域异构体，且DAR(例如，T)是在0.5与10.0之间，例如约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些实施方案中，DAR是在0.5与2.0之间、在2.0与4.0之间、在4.0与6.0之间、在6.0与8.0之间或在8.0与10.0之间。在另一个方面中，本发明提供缀合物的群体，每种缀合物具有缀合物39结构，其中缀合物的群体的平均DAR(例如，T)为1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些实施方案中，所述缀合物为缀合物40或其任何区域异构体，且DAR(例如，T)是在0.5与10.0之间，例如约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些实施方案中，DAR是在0.5与2.0之间、在2.0与4.0之间、在4.0与6.0之间、在6.0与8.0之间或在8.0与10.0之间。在另一个方面中，本发明提供缀合物的群体，每种缀合物具有缀合物40结构，其中缀合物的群体的平均DAR(例如，T)为1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些实施方案中，所述缀合物为缀合物41或其任何区域异构体，且DAR(例如，T)是在0.5与10.0之间，例如约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些实施方案中，DAR是在0.5与2.0之间、在2.0与4.0之间、在4.0与6.0之间、在6.0与8.0之间或在8.0与10.0之间。在另一个方面中，本发明提供缀合物的群体，每种缀合物具有缀合物41结构，其中缀合物的群体的平均DAR(例如，T)为1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些实施方案中，所述缀合物为缀合物42或其任何区域异构体，且DAR(例如，T)是在0.5与10.0之间，例如约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些实施方案中，DAR是在0.5与2.0之间、在2.0与4.0之间、在4.0与6.0之间、在6.0与8.0之间或在8.0与10.0之间。在另一个方面中，本发明提供缀合物的群体，每种缀合物具有缀合物42结构，其中缀合物的群体的平均DAR(例如，T)为1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些实施方案中，所述缀合物为缀合物43或其任何区域异构体，且DAR(例如，T)是在0.5与10.0之间，例如约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些实施方案中，DAR是在0.5与2.0之间、在2.0与4.0之间、在4.0与6.0之间、在6.0与8.0之间或在8.0与10.0之间。在另一个方面中，本发明提供缀合物的群体，每种缀合物具有缀合物43结构，其中缀合物的群体的平均DAR(例如，T)为1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些实施方案中，所述缀合物为缀合物44或其任何区域异构体，且DAR(例如，T)是在0.5与10.0之间，例如约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些实施方案中，DAR是在0.5与2.0之间、在2.0与4.0之间、在4.0与6.0之间、在6.0与8.0之间或在8.0与10.0之间。在另一个方面中，本发明提供缀合物的群体，每种缀合物具有缀合物44结构，其中缀合物的群体的平均DAR(例如，T)为1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些实施方案中，所述缀合物为缀合物45(例如，缀合物45a或缀合物45b)或其任何区域异构体，且DAR(例如，T)是在0.5与10.0之间，例如约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些实施方案中，DAR是在0.5与2.0之间、在2.0与4.0之间、在4.0与6.0之间、在6.0与8.0之间或在8.0与10.0之间。在另一个方面中，本发明提供缀合物的群体，每种缀合物具有缀合物45(例如，缀合物45a或缀合物45b)结构，其中缀合物的群体的平均DAR(例如，T)为1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些实施方案中，所述缀合物为缀合物46或其任何区域异构体，且DAR(例如，T)是在0.5与10.0之间，例如约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些实施方案中，DAR是在0.5与2.0之间、在2.0与4.0之间、在4.0与6.0之间、在6.0与8.0之间或在8.0与10.0之间。在另一个方面中，本发明提供缀合物的群体，每种缀合物具有缀合物46结构，其中缀合物的群体的平均DAR(例如，T)为1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些实施方案中，所述缀合物为缀合物47或其任何区域异构体，且DAR(例如，T)是在0.5与10.0之间，例如约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些实施方案中，DAR是在0.5与2.0之间、在2.0与4.0之间、在4.0与6.0之间、在6.0与8.0之间或在8.0与10.0之间。在另一个方面中，本发明提供缀合物的群体，每种缀合物具有缀合物47结构，其中缀合物的群体的平均DAR(例如，T)为1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在一些实施方案中，所述缀合物为缀合物48或其任何区域异构体，且DAR(例如，T)是在0.5与10.0之间，例如约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在一些实施方案中，DAR是在0.5与2.0之间、在2.0与4.0之间、在4.0与6.0之间、在6.0与8.0之间或在8.0与10.0之间。在另一个方面中，本发明提供缀合物的群体，每种缀合物具有缀合物48结构，其中缀合物的群体的平均DAR(例如，T)为1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，本发明提供一种由以下来描述的缀合物：式(D-I)、(M-I)、(1)或(2)中任一者；其中每个A1及每个A2独立地选自式(A-XIII)中任一者：
Figure BDA0003630331990002411
其中R1选自-OH、-NH2、-NHC(＝NH)NH2及-NHC(＝NH)NHR6；R4选自-CO2H、-P(＝O)(OH)2、-SO3H；R5选自-COCH3、-COCF3、-SO2CH3；X选自-O-及-S-；Y选自
Figure BDA0003630331990002412
Figure BDA0003630331990002421
R6选自
Figure BDA0003630331990002422
Figure BDA0003630331990002423
R7选自H、C1-C20烷基、C3-C20环烷基、C3-C20杂环烷基；C5-C15芳基及C2-C15杂芳基；
R8选自C3-C20杂环烷基、C5-C15芳基及C2-C15杂芳基；
R9选自-H、卤素(例如，Cl或F)、-OR10、-NHC(＝O)R7、任选取代的C1-C20烷基、C3-C20环烷基、C3-C20杂环烷基；C5-C15芳基及C2-C15杂芳基；
R10选自C1-C20烷基、C3-C20环烷基、C3-C20杂环烷基；C5-C15芳基及C2-C15杂芳基；
n为1或2；
每个E包含Fc结构域单体、白蛋白、白蛋白结合肽或Fc结合肽；
L为共价附接于E且附接于每个A1或每个A1及A2的每个Y的接头；
T为1至20的整数，且
式(D-I)、(M-I)、(1)或(2)中的每条波浪线指示L共价附接于每个E；
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，每个A1及每个A2由式(A-XIII-1)描述：
Figure BDA0003630331990002431
在一些实施方案中，每个A1及每个A2独立地选自以下中任一者：式(A-XIII-1a)-(A-XIII-1d)
Figure BDA0003630331990002441
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-XI)
Figure BDA0003630331990002442
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(D-XI-1)
Figure BDA0003630331990002443
Figure BDA0003630331990002451
其中R7选自H、C1-C20烷基、C3-C20环烷基、C3-C20杂环烷基；C5-C15芳基及C2-C15杂芳基；或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-XI)
Figure BDA0003630331990002452
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述缀合物由以下来描述：式(M-XI-1)
Figure BDA0003630331990002453
其中R7选自H、C1-C20烷基、C3-C20环烷基、C3-C20杂环烷基；C5-C15芳基及C2-C15杂芳基；或其药学上可接受的盐。
定义
为了促进理解本发明，下文定义多个术语。本文所定义的术语具有如本发明相关领域中的一般技术者通常所理解的含义。诸如“一(a)”、“一(an)”及“所述(the)”的术语不旨在仅指单一实体，而包括可用于说明的具体实例所属的一般类别。所述术语在本文中用于描述本发明的具体实施方案，但其使用不会限定本发明，除非如权利要求书中所概括。
如本文所用，术语“神经氨酸酶抑制剂”或“病毒神经氨酸酶抑制剂”是指减少酶流感病毒神经氨酸酶(例如，来自流感病毒A、B或C)的活性的化合物。神经氨酸酶抑制剂可通过本领域技术人员已知的方法，例如通过流感病毒斑块减少分析中病毒复制的减少，例如低于20μM(例如，低于10μM、5μM、2μM、1μM、500nM或100nM)的浓度来鉴别。本领域技术人员已知的病毒神经氨酸酶抑制剂包括扎那米韦、磺基扎那米韦、帕拉米韦及A-315675(Abbott)(参见例如，Hadházi等人A sulfozanamivir analogue has potent anti-influenzavirus activity.ChemMedChem Comm.13:785-789(2018)及In vitro characterizationof A-315675,a highly potent inhibitor of A and B strain of influenza virusneuraminidases and influenza virus replication.Antimicrobial Agents andChemotherapy 46(4):1014-1021(2002))。本发明的病毒神经氨酸酶抑制剂包括扎那米韦、磺基扎那米韦、帕拉米韦、A-315675及其类似物，诸如式(A-I)-(A-XIII)的病毒神经氨酸酶抑制剂：
Figure BDA0003630331990002471
其中R1选自-OH、-NH2、-NHC(＝NH)NH2及-NHC(＝NH)NHR6；R2及R3各自独立地选自-H、-OH、-F、-Cl及-Br；R4选自-CO2H、-P(＝O)(OH)2、-SO3H；R5选自-COCH3、-COCF3、-SO2CH3；X选自-O-及-S-；Y选自
Figure BDA0003630331990002472
Figure BDA0003630331990002481
R6选自
Figure BDA0003630331990002482
Figure BDA0003630331990002483
R7选自H、C1-C20烷基、C3-C20环烷基、C3-C20杂环烷基；C5-C15芳基及C2-C15杂芳基；且R8选自C3-C20杂环烷基、C5-C15芳基及C2-C15杂芳基；R9选自-H、卤素(例如，Cl、F或Br)、-OR10、-NHC(＝O)R7、任选取代的C1-C20烷基、C3-C20环烷基、C3-C20杂环烷基；C5-C15芳基及C2-C15杂芳基；且R10选自C1-C20烷基、C3-C20环烷基、C3-C20杂环烷基；C5-C15芳基及C2-C15杂芳基。
如本文所用，术语“抑制神经氨酸酶活性”是指小于或等于1,000nM的IC50，例如，如根据本文实施例2中的神经氨酸酶抑制分析所测量。具体而言，IC50表示体外50％抑制所需的流感病毒神经氨酸酶抑制剂的浓度。在一些方面中，根据神经氨酸酶抑制分析小于或等于100nM或者小于或等于10nM的IC50指示抑制神经氨酸酶活性的化合物。
“病毒感染”意指病毒(例如，流感病毒)在宿主生物体(例如，人受试者)中的致病性生长。病毒感染可为其中病毒群体的存在正在损害宿主身体的任何情形。因此，当受试者的身体中或身体上存在过量病毒群体时，或当病毒群体的存在正在损害所述受试者的细胞或其他组织时，所述受试者“正在经受”病毒感染。
如本文所用，术语“Fc结构域单体”是指如下多肽链，其包括至少一个铰链结构域及第二及第三抗体恒定结构域(CH2及CH3)或其功能片段(例如，能够(i)与另一Fc结构域单体二聚以形成Fc结构域，及(ii)结合于Fc受体的片段)。所述Fc结构域单体可为任何免疫球蛋白抗体同种型，包括IgG、IgE、IgM、IgA或IgD(例如，IgG)。另外，所述Fc结构域单体可为IgG亚型(例如，IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgG4)(例如，IgG1)。Fc结构域单体不包括免疫球蛋白中能够充当抗原-识别区的任何部分，例如可变结构域或互补决定区(CDR)。如本文所述的缀合物中的Fc结构域单体可含有相对于野生型Fc结构域单体序列的一种或多种改变(例如，1-10、1-8、1-6、1-4种氨基酸取代、添加或缺失)，其改变Fc结构域与Fc受体之间的相互作用。合适改变的实例为本领域中已知的。在某些实施方案中，人Fc结构域单体(例如，IgG重链，诸如IgG1)包含自Asn208、Glu216、Asp221、Lys222或Cys226中任一者延伸至Lys447处的重链羧基端的区。所述Fc区的C端Lys447可或可不存在，不影响所述Fc区的结构或稳定性。在表达多肽后，C端Lys 447可被蛋白水解切割。在本文所述的任何Fc结构域单体的一些实施方案中，C端Lys 447任选存在或不存在。本公开特别考虑了不包括对应于Lys447的C端Lys的SEQ ID NO:1-4、11、16、19、20、32-37、48-53及60-68中任一者。(例如，SEQ ID NO:60-77中任一者的)Fc区的N端N(Asn)可或可不存在，不影响所述Fc区的结构或稳定性。在表达多肽后，N端Asn可脱酰胺。在本文所述的任何Fc结构域单体的一些实施方案中，N端Asn任选存在或不存在。本公开特别考虑了不包括N端Asn的SEQ ID NO:60-77中任一者。除非本文中另外规定，否则所述IgG或Fc结构域单体中氨基酸残基的编号是根据针对抗体的EU编号系统，所述系统也称为Kabat EU指数，如例如Kabat等人,Sequences ofProteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述。
如本文所用，术语“Fc结构域”是指两种Fc结构域单体的二聚体，其能够结合Fc受体。在野生型Fc结构域中，两种Fc结构域单体通过两个CH3抗体恒定结构域之间的相互作用二聚化，在一些实施方案中，两种二聚化Fc结构域单体的铰链结构域之间形成一个或多个二硫键。
术语“共价附接”是指缀合物中通过共价键彼此连接的两个部分，所述共价键形成于所述缀合物的所述两个部分中的两个原子之间。
如本文所用，术语“Fc结合肽”是指是指具有5至50个(例如，5至40个、5至30个、5至20个、5至15个、5至10个、10至50个、10至30个或10至20个)氨基酸残基的氨基酸序列的多肽，其对Fc结构域(诸如本文所述的任何Fc结构域)具有亲和力且具有结合所述Fc结构域的功能。Fc结合肽可具有不同起源，例如合成、人、小鼠或大鼠。本发明的Fc结合肽包括已被工程改造以包括一个或多个(例如，两个、三个、四个或五个)溶剂暴露半胱氨酸或赖氨酸残基的Fc结合肽，其可提供用于缀合于本发明化合物(例如，缀合于神经氨酸酶抑制剂单体或二聚体，包括借助于接头)的位点。最优选地，所述Fc结合肽将含有单一溶剂暴露半胱氨酸或赖氨酸，因此使得本发明化合物能够位点特异性缀合。Fc结合肽可仅包括天然存在的氨基酸残基，或可包括一个或多个非天然存在的氨基酸残基。在包括时，非天然存在的氨基酸残基(例如，非天然存在的氨基酸残基的侧链)可用作用于本发明化合物(例如，神经氨酸酶抑制剂单体或二聚体，包括借助于接头)的附接点。本发明的Fc结合肽可为线性或环状的。本发明的Fc结合肽包括本领域技术人员已知的任何Fc结合肽。
如此处所用，术语“白蛋白”是指包含对应于天然存在的白蛋白(例如，人血清白蛋白)或其变体(诸如天然存在的白蛋白的经工程改造变体)的氨基酸序列的多肽。白蛋白的变体包括多态物(polymorphism)、诸如结构域及子结构域的片段及融合蛋白(例如，具有诸如多肽接头的C端或N端融合的白蛋白)。优选地，白蛋白具有人血清白蛋白(HSA)的氨基酸序列或者其变体或片段，最优选地其功能变体或片段。本发明的白蛋白包括与SEQ ID NO:139-141中任一者具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的蛋白质。本发明的白蛋白包括已被工程改造以包括一个或多个(例如，两个、三个、四个或五个)溶剂暴露半胱氨酸或赖氨酸残基的白蛋白，其可提供用于缀合于本发明化合物(例如，缀合于神经氨酸酶抑制剂单体或二聚体，包括借助于接头)的位点。最优选地，所述白蛋白将含有单一溶剂暴露半胱氨酸或赖氨酸，因此使得本发明化合物能够位点特异性缀合。白蛋白可仅包含天然存在的氨基酸残基，或可包含一种或多种非天然存在的氨基酸残基。在包括时，非天然存在的氨基酸残基(例如，非天然存在的氨基酸残基的侧链)可用作用于本发明化合物(例如，神经氨酸酶抑制剂单体或二聚体，包括借助于接头)的附接点。
如本文所用，术语“白蛋白结合肽”是指具有5至50个(例如，5至40个、5至30个、5至20个、5至15个、5至10个、10至50个、10至30个或10至20个)氨基酸残基的氨基酸序列的多肽，其对白蛋白(诸如本文所述的任何白蛋白)具有亲和力且具有结合所述白蛋白的功能。优选地，白蛋白结合肽结合于天然存在的血清白蛋白，最优选地人血清白蛋白。白蛋白结合肽可具有不同起源，例如合成、人、小鼠或大鼠。本发明的白蛋白结合肽包括已被工程改造以包括一个或多个(例如，两个、三个、四个或五个)溶剂暴露半胱氨酸或赖氨酸残基的白蛋白结合肽，其可提供用于缀合于本发明化合物(例如，缀合于神经氨酸酶抑制剂单体或二聚体，包括借助于接头)的位点。最优选地，所述白蛋白结合肽将含有单一溶剂暴露半胱氨酸或赖氨酸，因此使得本发明化合物能够位点特异性缀合。白蛋白结合肽可仅包含天然存在的氨基酸残基，或可包含一种或多种非天然存在的氨基酸残基。在包括时，非天然存在的氨基酸残基(例如，非天然存在的氨基酸残基的侧链)可用作用于本发明化合物(例如，神经氨酸酶抑制剂单体或二聚体，包括借助于接头)的附接点。本发明的白蛋白结合肽可为线性或环状的。本发明的白蛋白结合肽包括本领域技术人员已知的任何白蛋白结合肽，其实例提供于本文中。进一步例示性白蛋白结合肽提供于美国专利申请号2005/0287153中，所述申请以引用的方式整体并入本文中。
如本文所用，诸如表面暴露半胱氨酸或表面暴露赖氨酸的“表面暴露氨基酸”或“溶剂暴露氨基酸”是指如下氨基酸，其易接近围绕所述蛋白质的溶剂。表面暴露氨基酸可为天然存在的，或所述蛋白质的经工程改造变体(例如，取代或插入)。在一些实施方案中，表面暴露氨基酸是如下氨基酸，其在被取代时未实质上改变所述蛋白质的三维结构。
如本文所用，术语“接头”、“L”及“L’”是指缀合物中的两种或更多种组分之间(例如，本文所述的缀合物中的两种神经氨酸酶抑制剂之间、本文所述的缀合物中的神经氨酸酶抑制剂与Fc结构域或白蛋白之间及本文所述的缀合物中的两种神经氨酸酶抑制剂的二聚体与Fc结构域或白蛋白之间)的共价连接。在一些实施方案中，本文所述的缀合物可含有具有三价结构的接头(例如，三价接头)。三价接头具有三个臂，其中每个臂共价连接至所述缀合物的组分(例如，缀合于第一神经氨酸酶抑制剂的第一臂、缀合于第二神经氨酸酶抑制剂的第二臂及缀合于Fc结构域或白蛋白的第三臂)。
可用作接头的分子包含至少两个官能团，所述官能团可为相同或不同的，例如两个羧酸基、两个氨基、两个磺酸基、羧酸基及马来酰亚胺基、羧酸基及炔基、羧酸基及氨基、羧酸基及磺酸基、氨基及马来酰亚胺基、氨基及炔基或氨基及磺酸基。第一官能团可与所述缀合物中的第一组分形成共价连接且第二官能团可与所述缀合物中的第二组分形成共价连接。在三价接头的一些实施方案中，接头的两个臂可含有两种二羧酸，其中第一羧酸可与所述缀合物中的第一神经氨酸酶抑制剂形成共价连接且第二羧酸可与所述缀合物中的第二神经氨酸酶抑制剂形成共价连接且所述接头的第三臂可与所述缀合物中的Fc结构域或白蛋白形成共价连接。二羧酸的实例进一步描述于本文中。在一些实施方案中，含有一个或多个马来酰亚胺基的分子可用作接头，其中所述马来酰亚胺基可与所述缀合物中的组分(例如，Fc结构域或白蛋白)的半胱氨酸形成碳-硫连接。在一些实施方案中，含有一个或多个炔基的分子可用作接头，其中所述炔基可与所述缀合物中的组分(例如，Fc结构域或白蛋白)的叠氮化物形成1,2,3-三唑连接。在一些实施方案中，含有一个或多个叠氮基的分子可用作接头，其中所述叠氮基可与所述缀合物中的组分(例如，Fc结构域或白蛋白)的炔形成1,2,3-三唑连接。在一些实施方案中，含有一个或多个双砜基的分子可用作接头，其中所述双砜基可与所述缀合物中的组分(例如，Fc结构域或白蛋白)的氨基形成连接。在一些实施方案中，含有一个或多个磺酸基的分子可用作接头，其中所述磺酸基可与所述缀合物中的组分形成磺酰胺连接。在一些实施方案中，含有一个或多个异氰酸酯基的分子可用作接头，其中所述异氰酸酯基可与所述缀合物中的组分形成脲连接。在一些实施方案中，含有一个或多个卤烷基的分子可用作接头，其中所述卤烷基可与所述缀合物中的组分形成共价连接，例如C-N及C-O连接。
在一些实施方案中，接头提供两种或更多种组分之间的空间、刚性及/或柔性。在一些实施方案中，接头可为键，例如共价键。术语“键”是指化学键，例如酰胺键、二硫键、C-O键、C-N键、N-N键、C-S键或由化学反应(例如，化学缀合)产生的任何种类的键。在一些实施方案中，接头包含不超过250个原子。在一些实施方案中，接头包含不超过250个非氢原子。在一些实施方案中，接头的骨架包含不超过250个原子。接头的“骨架”是指接头中的原子，其合起来形成自缀合物的一部分至所述缀合物的另一部分的最短路径(例如，连接第一神经氨酸酶抑制剂及第二神经氨酸酶抑制剂的最短路径)。接头的骨架中的原子直接地参与连接缀合物的一部分至所述缀合物的另一部分(例如，连接第一神经氨酸酶抑制剂及第二神经氨酸酶抑制剂)。例如，附接于接头的骨架中的碳的氢原子未被视为直接地参与连接所述缀合物的一部分至所述缀合物的另一部分。
在一些实施方案中，接头可包含源于例如合成聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)聚合物)的合成基团。在一些实施方案中，接头可包含一种或多种氨基酸残基，诸如D-或L-氨基酸残基。在一些实施方案中，接头可为氨基酸序列(例如，1-25个氨基酸、1-10个氨基酸、1-9个氨基酸、1-8个氨基酸、1-7个氨基酸、1-6个氨基酸、1-5个氨基酸、1-4个氨基酸、1-3个氨基酸、1-2个氨基酸或1个氨基酸序列)的残基。在一些实施方案中，接头可包含一个或多个(例如，1-100个、1-50个、1-25个、1-10个、1-5个或1-3个)任选取代的亚烷基、任选取代的亚杂烷基(例如，PEG单元)、任选取代的亚烯基、任选取代的亚杂烯基、任选取代的亚炔基、任选取代的亚杂炔基、任选取代的亚环烷基、任选取代的亚杂环烷基、任选取代的亚环烯基、任选取代的亚杂环烯基、任选取代的亚环炔基、任选取代的亚杂环炔基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚杂芳基(例如，吡啶)、O、S、NRi(Ri为H、任选取代的烷基、任选取代的杂烷基、任选取代的烯基、任选取代的杂烯基、任选取代的炔基、任选取代的杂炔基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的环烯基、任选取代的杂环烯基、任选取代的环炔基、任选取代的杂环炔基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基)、P、羰基、硫羰基、磺酰基、磷酸酯基、磷酰基或亚氨基。例如，接头可包含一个或多个任选取代的C1-C20亚烷基、任选取代的C1-C20亚杂烷基(例如，PEG单元)、任选取代的C2-C20亚烯基(例如，C2亚烯基)、任选取代的C2-C20亚杂烯基、任选取代的C2-C20亚炔基、任选取代的C2-C20亚杂炔基、任选取代的C3-C20亚环烷基(例如，亚环丙基、亚环丁基)、任选取代的C3-C20亚杂环烷基、任选取代的C4-C20亚环烯基、任选取代的C4-C20亚杂环烯基、任选取代的C8-C20亚环炔基、任选取代的C8-C20亚杂环炔基、任选取代的C5-C15亚芳基(例如，C6亚芳基)、任选取代的C2-C15亚杂芳基(例如，咪唑、吡啶)、O、S、NRi(Ri为H、任选取代的C1-C20烷基、任选取代的C1-C20杂烷基、任选取代的C2-C20烯基、任选取代的C2-C20杂烯基、任选取代的C2-C20炔基、任选取代的C2-C20杂炔基、任选取代的C3-C20环烷基、任选取代的C3-C20杂环烷基、任选取代的C4-C20环烯基、任选取代的C4-C20杂环烯基、任选取代的C8-C20环炔基、任选取代的C8-C20杂环炔基、任选取代的C5-C15芳基或任选取代的C2-C15杂芳基)、P、羰基、硫羰基、磺酰基、磷酸酯基、磷酰基或亚氨基。
如本文所用，术语“烷基”、“烯基”及“炔基”包括直链及分支链单价取代基，以及其组合，当未被取代时仅含有C及H。当烷基包含至少一个碳-碳双键或碳-碳三键时，所述烷基可分别称作“烯基”或“炔基”。烷基、烯基或炔基的单价不包括所述烷基、烯基或炔基上的任选取代基。例如，若烷基、烯基或炔基附接于化合物，则所述烷基、烯基或炔基的单价是指其附接于所述化合物且不包括可存在于所述烷基、烯基或炔基上的任何额外取代基。在一些实施方案中，烷基或杂烷基可含有例如1-20、1-18、1-16、1-14、1-12、1-10、1-8、1-6、1-4或1-2个碳原子(例如，C1-C20、C1-C18、C1-C16、C1-C14、C1-C12、C1-C10、C1-C8、C1-C6、C1-C4或C1-C2)。在一些实施方案中，烯基、杂烯基、炔基或杂炔基可含有例如2-20、2-18、2-16、2-14、2-12、2-10、2-8、2-6或2-4个碳原子(例如，C2-C20、C2-C18、C2-C16、C2-C14、C2-C12、C2-C10、C2-C8、C2-C6或C2-C4)。实例包括但不限于甲基、乙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、2-丙烯基及3-丁炔基。
如本文所用，术语“环烷基”表示单价饱和或不饱和非芳族环状烷基。环烷基可具有例如三个至二十个碳(例如，C3-C7、C3-C8、C3-C9、C3-C10、C3-C11、C3-C12、C3-C14、C3-C16、C3-C18或C3-C20环烷基)。环烷基的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基及环庚基。当环烷基包含至少一个碳-碳双键时，所述环烷基可称作“环烯基”。环烯基可具有例如四个至二十个碳(例如，C4-C7、C4-C8、C4-C9、C4-C10、C4-C11、C4-C12、C4-C14、C4-C16、C4-C18或C4-C20环烯基)。例示性环烯基包括但不限于环戊烯基、环己烯基及环庚烯基。当环烷基包含至少一个碳-碳三键时，所述环烷基可称作“环炔基”。环炔基可具有例如八个至二十个碳(例如，C8-C9、C8-C10、C8-C11、C8-C12、C8-C14、C8-C16、C8-C18或C8-C20环炔基)。术语“环烷基”也包括具有桥接多环结构的环状化合物(例如，双环[2.2.1.]庚基及金刚烷)，其中一个或多个碳桥接单环的两个不相邻成员。术语“环烷基”也包括二环、三环及四环稠环结构，例如十氢化萘及螺环化合物。
如本文所用，术语“芳基”是指就电子分布而言在环系统中具有芳香性特征的任何单环或稠环二环或三环系统，例如苯基、萘基或菲。在一些实施方案中，环系统含有5-15个环成员原子或5-10个环成员原子。芳基可具有例如五个至十五个碳(例如，C5-C6、C5-C7、C5-C8、C5-C9、C5-C10、C5-C11、C5-C12、C5-C13、C5-C14或C5-C15芳基)。术语“杂芳基”也指含有一个或多个(例如，1-4、1-3、1、2、3或4个)选自O、S及N的杂原子的所述单环或稠合二环系统。杂芳基可具有例如两个至十五个碳(例如，C2-C3、C2-C4、C2-C5、C2-C6、C2-C7、C2-C8、C2-C9、C2-C10、C2-C11、C2-C12、C2-C13、C2-C14或C2-C15杂芳基)。杂原子的包括允许包括将被视为芳族的5-元环以及6-元环。因此，典型杂芳基系统包括例如吡啶基、嘧啶基、吲哚基、苯并咪唑基、苯并三唑基、异喹啉基、喹啉基、苯并噻唑基、苯并呋喃基、噻吩基、呋喃基、吡咯基、噻唑基、恶唑基、异恶唑基、苯并恶唑基、苯并异恶唑基及咪唑基。因为互变异构体为可能的，故诸如邻苯二甲酰亚胺基的基团也被视为杂芳基。在一些实施方案中，芳基或杂芳基为任选含有1-2个氮原子的5或6元芳环系统。在一些实施方案中，芳基或杂芳基为任选取代的苯基、吡啶基、吲哚基、嘧啶基、哒嗪基、苯并噻唑基、苯并咪唑基、吡唑基、咪唑基、异恶唑基、噻唑基或咪唑并吡啶基。在一些实施方案中，芳基为苯基。在一些实施方案中，芳基可任选被诸如芳基取代基(例如，联苯基)的取代基取代。
术语“烷芳基”是指连接于亚烷基、亚烯基或亚炔基的芳基。一般而言，若化合物附接于烷芳基，则所述烷芳基的亚烷基、亚烯基或亚炔基部分附接于所述化合物。在一些实施方案中，烷芳基为C6-C35烷芳基(例如，C6-C16、C6-C14、C6-C12、C6-C10、C6-C9、C6-C8、C7或C6烷芳基)，其中碳数目指示所述烷芳基的芳基部分及亚烷基、亚烯基或亚炔基部分中的碳的总数。烷芳基的实例包括但不限于(C1-C8)亚烷基(C6-C12)芳基、(C2-C8)亚烯基(C6-C12)芳基或(C2-C8)亚炔基(C6-C12)芳基。在一些实施方案中，烷芳基为苯甲基或苯乙基。在杂烷芳基中，一个或多个选自N、O及S的杂原子可存在于所述烷芳基的亚烷基、亚烯基或亚炔基部分中及/或可存在于所述烷芳基的芳基部分中。在任选取代的烷芳基中，取代基可存在于所述烷芳基的亚烷基、亚烯基或亚炔基部分上及/或可存在于所述烷芳基的芳基部分上。
如本文所用，术语“氨基”表示–N(Rx)2或–N+(Rx)3，其中Rx各自独立地为H、烷基、烯基、炔基、芳基、烷芳基、环烷基，或两个Rx组合形成杂环烷基。在一些实施方案中，氨基为-NH2。
如本文所用，术语“烷氨基”是指本文所述的氨基，其附接于亚烷基(例如，C1-C5亚烷基)、亚烯基(例如，C2-C5亚烯基)或亚炔基(例如，C2-C5亚烯基)。一般而言，若化合物附接于烷氨基，则所述烷氨基的亚烷基、亚烯基或亚炔基部分附接于所述化合物。烷氨基的氨基部分是指–N(Rx)2或–N+(Rx)3，其中Rx各自独立地为H、烷基、烯基、炔基、芳基、烷芳基、环烷基，或两个Rx组合形成杂环烷基。在一些实施方案中，烷氨基的氨基部分为-NH2。烷氨基的实例为C1-C5烷氨基，例如C2烷氨基(例如，CH2CH2NH2或CH2CH2N(CH3)2)。在杂烷氨基中，一个或多个(例如，1-4、1-3、1、2、3或4个)选自N、O及S的杂原子可存在于所述杂烷氨基的亚烷基、亚烯基或亚炔基部分中。在一些实施方案中，烷氨基可任选被取代。在取代的烷氨基中，取代基可存在于所述烷氨基的亚烷基、亚烯基或亚炔基部分上及/或可存在于所述烷氨基的氨基部分上。
如本文所用，术语“烷酰胺”是指如下酰胺基，其附接于亚烷基(例如，C1-C5亚烷基)、亚烯基(例如，C2-C5亚烯基)或亚炔基(例如，C2-C5亚烯基)。一般而言，若化合物附接于烷酰胺基，则所述烷酰胺的亚烷基、亚烯基或亚炔基部分附接于所述化合物。烷酰胺的酰胺部分是指–C(O)-N(Rx)2，其中Rx各自独立地为H、烷基、烯基、炔基、芳基、烷芳基、环烷基，或两个Rx组合形成杂环烷基。在一些实施方案中，烷酰胺的酰胺部分为-C(O)NH2。烷酰胺基可为-(CH2)2-C(O)NH2或-CH2-C(O)NH2。在杂烷酰胺基中，一个或多个(例如，1-4、1-3、1、2、3或4个)选自N、O及S的杂原子可存在于所述杂烷酰胺基的亚烷基、亚烯基或亚炔基部分中。在一些实施方案中，烷酰胺基可任选被取代。在取代的烷酰胺基中，取代基可存在于所述烷酰胺基的亚烷基、亚烯基或亚炔基部分上及/或可存在于所述烷酰胺基的酰胺部分上。
如本文所用，术语“亚烷基”、“亚烯基”及“亚炔基”是指具有规定大小的二价基团。在一些实施方案中，亚烷基可含有例如1-20、1-18、1-16、1-14、1-12、1-10、1-8、1-6、1-4或1-2个碳原子(例如，C1-C20、C1-C18、C1-C16、C1-C14、C1-C12、C1-C10、C1-C8、C1-C6、C1-C4或C1-C2)。在一些实施方案中，亚烯基或亚炔基可含有例如2-20、2-18、2-16、2-14、2-12、2-10、2-8、2-6或2-4个碳原子(例如，C2-C20、C2-C18、C2-C16、C2-C14、C2-C12、C2-C10、C2-C8、C2-C6或C2-C4)。亚烷基、亚烯基及/或亚炔基包括直链及分支链形式，以及其组合。亚烷基、亚烯基或亚炔基的二价不包括所述亚烷基、亚烯基或亚炔基上的任选取代基。例如，两种神经氨酸酶抑制剂可借助于包括亚烷基、亚烯基及/或亚炔基或其组合的接头彼此附接。所述接头中的亚烷基、亚烯基及/或亚炔基中每一者关于亚烷基、亚烯基及/或亚炔基的任一末端上的两个附接被视为二价。例如，若接头包括-(任选取代的亚烷基)-(任选取代的亚烯基)-(任选取代的亚烷基)-，则所述亚烯基关于其与所述接头的末端处的两个亚烷基的附接被视为二价。亚烯基上的任选取代基未包括于所述亚烯基的二价中。亚烷基、亚烯基或亚炔基(例如，接头中的亚烷基、亚烯基或亚炔基)的二价性质是指所述基团的两个末端且不包括可存在于亚烷基、亚烯基或亚炔基中的任选取代基。因为其为二价，故其可使缀合物的多个(例如，两个)部分(例如，第一神经氨酸酶抑制剂及第二神经氨酸酶抑制剂)连接在一起。亚烷基、亚烯基及/或亚炔基可由典型地适用作如本文所陈述的烷基、烯基及炔基的取代基的基团取代。例如，C＝O是由氧代(＝O)取代的C1亚烷基。例如，-HCR-C≡C-可被视为任选取代的亚炔基且被视为二价基团，即使其具有任选取代基R。亚杂烷基、亚杂烯基及/或亚杂炔基是指包括一个或多个(例如，1-4、1-3、1、2、3或4个)杂原子(例如，N、O及S)的亚烷基、亚烯基及/或亚炔基。例如，聚乙二醇(PEG)聚合物或PEG聚合物中的PEG单元-(CH2)2-O-被视为含有一个或多个氧原子的亚杂烷基。
如本文所用，“组合疗法”或“组合施用”意指向受试者施用作为用于病毒感染的确定治疗方案的一部分的本文所述的缀合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者的缀合物)及一种(或多种)不同的剂或治疗。治疗方案确定了每种剂的施用剂量及周期，以使不同剂对受试者的影响重叠。在一些实施方案中，所述缀合物及一种或多种剂的递送是同步或同时的且缀合物及一种或多种剂可共同配制。在一些实施方案中，所述缀合物及一种或多种剂未共同配制且作为规定方案的一部分以依序方式施用。在一些实施方案中，组合施用缀合物及一种或多种剂或治疗使得与病毒感染相关的症状或其他参数的减少大于在仅递送的一种剂或治疗或在仅存在一者的情况下将观察到的。所述缀合物及一种或多种剂的作用可以是部分相加的、完全相加的或大于相加的(例如，协同的)。依序或实质上同时施用各治疗剂可通过包括但不限于经口途径、静脉内途径、肌肉内途径及直接经由粘膜组织吸收的任何适当途径达成。治疗剂可通过相同途径或通过不同途径施用。例如，本文所述的缀合物可通过静脉内注射施用，而组合的第二治疗剂可口服施用。
如本文所用，术语“亚环烷基”是指使化合物的两个部分连接在一起的二价环状基团。例如，亚环烷基内的一个碳可连接于化合物的一部分，而亚环烷基内的另一个碳可连接于化合物的另一部分。亚环烷基可包括饱和或不饱和非芳族环状基团。亚环烷基可在所述亚环烷基的环状部分中具有例如三个至二十个碳(例如，C3-C7、C3-C8、C3-C9、C3-C10、C3-C11、C3-C12、C3-C14、C3-C16、C3-C18或C3-C20亚环烷基)。当亚环烷基包含至少一个碳-碳双键时，所述亚环烷基可称作“亚环烯基”。亚环烯基可在所述亚环烯基的环状部分中具有例如四个至二十个碳(例如，C4-C7、C4-C8、C4-C9、C4-C10、C4-C11、C4-C12、C4-C14、C4-C16、C4-C18或C4-C20亚环烯基)。当亚环烷基包含至少一个碳-碳三键时，所述亚环烷基可称作“亚环炔基”。亚环炔基可在所述亚环炔基的环状部分中具有例如四个至二十个碳(例如，C4-C7、C4-C8、C4-C9、C4-C10、C4-C11、C4-C12、C4-C14、C4-C16、C4-C18或C8-C20亚环炔基)。亚环烷基可由典型地适用作如本文所陈述的烷基、烯基及炔基的取代基的基团取代。亚杂环烷基是指包含一个或多个(例如，1-4、1-3、1、2、3或4个)杂原子(例如，N、O及S)的亚环烷基。亚环烷基的实例包括但不限于亚环丙基及亚环丁基。四氢呋喃可被视为亚杂环烷基。
如本文所用，术语“亚芳基”是指使化合物的多个(例如，两个或三个)部分连接在一起的多价(例如，二价或三价)芳基。例如，亚芳基内的一个碳可连接于所述化合物的一部分，而所述亚芳基内的另一碳可连接于所述化合物的另一部分。亚芳基可在所述亚芳基的芳基部分中具有例如五个至十五个碳(例如，C5-C6、C5-C7、C5-C8、C5-C9、C5-C10、C5-C11、C5-C12、C5-C13、C5-C14或C5-C15亚芳基)。亚芳基可由典型地适用作如本文所陈述的烷基、烯基及炔基的取代基的基团取代。亚杂芳基是指包含一个或多个(例如，1-4、1-3、1、2、3或4个)杂原子(例如，N、O及S)的芳族基团。亚杂芳基可具有例如两个至十五个碳(例如，C2-C3、C2-C4、C2-C5、C2-C6、C2-C7、C2-C8、C2-C9、C2-C10、C2-C11、C2-C12、C2-C13、C2-C14或C2-C15亚杂芳基)。
如本文所用，术语“任选取代”是指具有0、1或多个取代基，诸如0-25、0-20、0-10或0-5个取代基。取代基包括但不限于烷基、烯基、炔基、芳基、烷芳基、酰基、杂芳基、杂烷基、杂烯基、杂炔基、杂烷芳基、卤素、氧代、氰基、硝基、氨基、烷氨基、羟基、烷氧基、烷酰基、羰基、氨甲酰基、胍基(guanidinyl)、脲基、脒基(amidinyl)、上述基团或部分中任一者及上述基团或部分中任一者的杂形式。取代基包括但不限于F、Cl、甲基、苯基、苯甲基、OR、NR2、SR、SOR、SO2R、OCOR、NRCOR、NRCONR2、NRCOOR、OCONR2、RCO、COOR、烷基-OOCR、SO3R、CONR2、SO2NR2、NRSO2NR2、CN、CF3、OCF3、SiR3及NO2，其中R各自独立地为H、烷基、烯基、芳基、杂烷基、杂烯基或杂芳基，且其中同一或相邻原子上的两个任选取代基可接合以形成含有3–8个成员的稠合、任选取代的芳族或非芳族、饱和或不饱和环，或同一原子上的两个任选取代基可接合以形成含有3–8个成员的任选取代的芳族或非芳族、饱和或不饱和环。
任选取代的基团或部分是指其中一个原子(例如，氢原子)任选被另一取代基置换的基团或部分(例如，上述基团或部分中任一者)。例如，任选取代的烷基可为任选取代的甲基，其中所述甲基的氢原子由例如OH置换。作为另一实例，杂烷基或其二价配对物亚杂烷基上的取代基可置换碳上的氢或诸如N的杂原子上的氢。例如，基团-R-NH-R-中的氢原子可被烷酰胺取代基取代，例如-R-N[(CH2C(O)N(CH3)2]-R。一般而言，任选取代基为非干扰取代基。“非干扰取代基”是指如下取代基，其保留本文所述的缀合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-X)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者的缀合物)结合于病毒神经氨酸酶或抑制流感病毒的增殖的能力。因此，在一些实施方案中，所述取代基可改变所述活性的程度。然而，只要所述缀合物保留结合于病毒神经氨酸酶或抑制病毒增殖的能力，所述取代基就将归类为“非干扰”。例如，非干扰取代基将保留所述化合物基于病毒斑块减少分析中10μM或更低的IC50值(诸如在实施例2中基于小于500nM的针对流感病毒神经氨酸酶的IC50值)提供抗病毒功效的能力。因此，基于斑块减少或流感病毒神经氨酸酶抑制，所述取代基可改变抑制的程度。然而，只要本文中的所述化合物(诸如式(A-I)、(A-II)、(A-III)、(A-IV)、(A-V)、(A-VI)、(A-VII)、(A-VIII)、(A-IX)、(A-X)、(A-XI)、(A-XII)及(A-XIII)化合物)保留抑制流感病毒神经氨酸酶活性的能力，所述取代基就将归类为“非干扰”。用于测定病毒斑块减少或任何化合物抑制流感病毒神经氨酸酶的能力的多种分析在本领域中可获得且一些例示于下文实施例中。
术语“杂”当用于描述化学基团或部分时是指具有至少一个非碳或氢的杂原子，例如N、O及S。若上述基团或部分中任一者含有至少一个杂原子，则其可称为杂。例如，杂环烷基、杂环烯基或杂环炔基是指具有一个或多个独立地选自例如N、O及S的杂原子的环烷基、环烯基或环炔基。杂环烯基的实例为马来酰亚胺基。例如，杂芳基是指具有一个或多个独立地选自例如N、O及S的杂原子的芳族基团。一个或多个杂原子也可包括于置换如本文所述的基团或部分中的氢原子的取代基中。例如，在任选取代的杂芳基中，若所述杂芳基中的氢原子中的一个被取代基(例如，甲基)置换，则所述取代基也可含有一个或多个杂原子(例如，甲醇)。
如本文所用，术语“酰基”是指具有以下结构的基团：
Figure BDA0003630331990002631
其中Rz为任选取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、烷芳基、烷氨基、杂烷基、杂烯基、杂炔基、杂环烷基、杂环烯基、杂环炔基、杂芳基、杂烷芳基或杂烷氨基。
如本文所用，术语“卤基”或“卤素”是指任何卤素原子，例如F、Cl、Br或I。若本文所述的基团或部分中任一者含有至少一个卤素原子，则其可称为“卤基部分”，诸如卤烷基。
如本文所用，术语“羟基”表示-OH基团。
如本文所用，术语“氧代”是指具有结构＝O的取代基，其中在原子与氧原子之间存在双键。
如本文所用，术语“羰基”是指具有以下结构的基团：
Figure BDA0003630331990002632
如本文所用，术语“硫羰基”是指具有以下结构的基团：
Figure BDA0003630331990002633
如本文所用，术语“磷酸酯基”表示具有以下结构的基团：
Figure BDA0003630331990002634
如本文所用，术语“磷酰基”表示具有以下结构的基团：
Figure BDA0003630331990002635
或
Figure BDA0003630331990002636
如本文所用，术语“磺酰基”表示具有以下结构的基团：
Figure BDA0003630331990002637
如本文所用，术语“亚氨基”表示具有以下结构的基团：
Figure BDA0003630331990002638
其中R为任选取代基。
如本文所用，术语“N-保护基”表示旨在保护氨基免受合成程序期间不希望的反应的那些基团。通常使用的N-保护基公开于Greene,“Protective Groups in OrganicSynthesis,”第5版(John Wiley&Sons,New York,2014)中，其以引用的方式并入本文中。N-保护基包括例如酰基、芳酰基及氨甲酰基，诸如甲酰基、乙酰基、丙酰基、特戊酰基、叔丁基乙酰基、2-氯乙酰基、2-溴乙酰基、三氟乙酰基、三氯乙酰基、邻苯二甲酰基、邻硝基苯氧基乙酰基、α-氯丁酰基、苯甲酰基、羧基苯甲基(CBz)、4-氯苯甲酰基、4-溴苯甲酰基、4-硝基苯甲酰基，及手性助剂，诸如经保护或未经保护D、L或D,L-氨基酸残基，诸如丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸；含磺酰基的基团，诸如苯磺酰基及对甲苯磺酰基；氨基甲酸酯形成基团，诸如苯甲氧基羰基、对氯苯甲氧基羰基、对甲氧基苯甲氧基羰基、对硝基苯甲氧基羰基、2-硝基苯甲氧基羰基、对溴苯甲氧基羰基、3,4-二甲氧基苯甲氧基羰基、3,5-二甲氧基苯甲氧基羰基、2,4-二甲氧基苯甲氧基羰基、4-甲氧基苯甲氧基羰基、2-硝基-4,5-二甲氧基苯甲氧基羰基、3,4,5-三甲氧基苯甲氧基羰基、1-(对联苯基)-1-甲基乙氧基羰基、α,α-二甲基-3,5-二甲氧基苯甲氧基羰基、二苯甲基氧基羰基、叔丁基氧基羰基(BOC)、二异丙基甲氧基羰基、异丙氧基羰基、乙氧基羰基、甲氧基羰基、烯丙氧基羰基、2,2,2,-三氯乙氧基羰基、苯氧基羰基、4-硝基苯氧基羰基、芴基-9-甲氧基羰基(Fmoc)、环戊基氧基羰基、金刚烷基氧基羰基、环己基氧基羰基及苯基硫羰基；烷芳基，诸如苯甲基、三苯基甲基及苯甲氧基甲基；及甲硅烷基，诸如三甲基甲硅烷基。
如本文所用，术语“氨基酸”意指天然存在的氨基酸及非天然存在的氨基酸。
如本文所用，术语“天然存在的氨基酸”意指包括Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr及Val的氨基酸。
如本文所用，术语“非天然存在的氨基酸”意指非天然产生或发现于哺乳动物中的α氨基酸。非天然存在的氨基酸的实例包括D-氨基酸；具有附接于半胱氨酸的硫原子的乙酰基氨基甲基的氨基酸；聚乙二醇化氨基酸；式NH2(CH2)nCOOH的ω氨基酸，其中n为2-6，中性非极性氨基酸，诸如肌氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸及正亮氨酸；氧基蛋氨酸；苯基甘氨酸；瓜氨酸；蛋氨酸亚砜；磺基丙氨酸；鸟氨酸；二氨基丁酸；3-氨基丙氨酸；3-羟基-D-脯氨酸；2,4-二氨基丁酸；2-氨基戊酸；2-氨基辛酸、2-羧基哌嗪；哌嗪-2-羧酸、2-氨基-4苯基丁酸；3-(2-萘基)丙氨酸，及羟基脯氨酸。其他氨基酸为α-氨基丁酸、α-氨基-α-甲基丁酸盐、氨基环丙烷-羧酸酯、氨基异丁酸、氨基降冰片基-羧酸盐、L-环己基丙氨酸、环戊基丙氨酸、L-N-甲基亮氨酸、L-N-甲基蛋氨酸、L-N-甲基正缬氨酸、L-N-甲基苯基丙氨酸、L-N-甲基脯氨酸、L-N-甲基丝氨酸、L-N-甲基色氨酸、D-鸟氨酸、L-N-甲基乙基甘氨酸、L-正亮氨酸、α-甲基-氨基异丁酸盐、α-甲基环己基丙氨酸、D-α-甲基丙氨酸、D-α-甲基精氨酸、D-α-甲基天冬酰胺、D-α-甲基天冬氨酸盐、D-α-甲基半胱氨酸、D-α-甲基谷氨酰胺、D-α-甲基组氨酸、D-α-甲基异亮氨酸、D-α-甲基亮氨酸、D-α-甲基赖氨酸、D-α-甲基蛋氨酸、D-α-甲基鸟氨酸、D-α-甲基苯丙氨酸、D-α-甲基脯氨酸、D-α-甲基丝氨酸、D-N-甲基丝氨酸、D-α-甲基苏氨酸、D-α-甲基色氨酸、D-α-甲基酪氨酸、D-α-甲基缬氨酸、D-N-甲基丙氨酸、D-N-甲基精氨酸、D-N-甲基天冬酰胺、D-N-甲基天冬氨酸盐、D-N-甲基半胱氨酸、D-N-甲基谷氨酰胺、D-N-甲基谷氨酸盐、D-N-甲基组氨酸、D-N-甲基异亮氨酸、D-N-甲基亮氨酸、D-N-甲基赖氨酸、N-甲基环己基丙氨酸、D-N-甲基鸟氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基氨基异丁酸盐、N-(1-甲基丙基)甘氨酸、N-(2-甲基丙基)甘氨酸、D-N-甲基色氨酸、D-N-甲基酪氨酸、D-N-甲基缬氨酸、γ-氨基丁酸、L-叔丁基甘氨酸、L-乙基甘氨酸、L-高苯丙氨酸、L-α-甲基精氨酸、L-α-甲基天冬氨酸盐、L-α-甲基半胱氨酸、L-α-甲基谷氨酰胺、L-α-甲基组氨酸、L-α-甲基异亮氨酸、L-α-甲基亮氨酸、L-α-甲基蛋氨酸、L-α-甲基正缬氨酸、L-α-甲基苯丙氨酸、L-α-甲基丝氨酸、L-α-甲基色氨酸、L-α-甲基缬氨酸、N-(N-(2,2-二苯基乙基)氨甲酰基甲基甘氨酸、1-羧基-1-(2,2-二苯基-乙基氨基)环丙烷、4-羟基脯氨酸、鸟氨酸、2-氨基苯甲酰基(邻氨基苯甲酰基)、D-环己基丙氨酸、4-苯基-苯丙氨酸、L-瓜氨酸、α-环己基甘氨酸、L-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸、L-噻唑烷-4-甲酸、L-高酪氨酸、L-2-呋喃基丙氨酸、L-组氨酸(3-甲基)、N-(3-胍基丙基)甘氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、O-聚糖-丝氨酸、间-酪氨酸、正-酪氨酸、L-N,N′,N″-三甲基赖氨酸、高赖氨酸、正赖氨酸、N-聚糖天冬酰胺、7-羟基-1,2,3,4-四氢-4-氟苯丙氨酸、4-甲基苯丙氨酸、双-(2-吡啶甲基)胺、五氟苯丙氨酸、吲哚啉-2-甲酸、2-氨基苯甲酸、3-氨基-2-萘甲酸、不对称二甲基精氨酸、L-四氢异喹啉-1-甲酸、D-四氢异喹啉-1-甲酸、1-氨基-环己烷乙酸、D/L-烯丙基甘氨酸、4-氨基苯甲酸、1-氨基-环丁烷甲酸、2或3或4-氨基环己烷甲酸、1-氨基-1-环戊烷甲酸、1-氨基茚满-1-甲酸、4-氨基-吡咯烷-2-甲酸、2-氨基萘满-2-甲酸、氮杂环丁烷-3-甲酸、4-苯甲基-吡咯烷-2-甲酸、叔丁基甘氨酸、b-(苯并噻唑基-2-基)-丙氨酸、b-环丙基丙氨酸、5,5-二甲基-1,3-噻唑烷-4-甲酸、(2R,4S)4-羟基哌啶-2-甲酸、(2S,4S)及(2S,4R)-4-(2-萘基甲氧基)-吡咯烷-2-甲酸、(2S,4S)及(2S,4R)4-苯氧基-吡咯烷-2-甲酸、(2R,5S)及(2S,5R)-5-苯基-吡咯烷-2-甲酸、(2S,4S)-4-氨基-1-苯甲酰基-吡咯烷-2-甲酸、叔丁基丙氨酸、(2S,5R)-5-苯基-吡咯烷-2-甲酸、1-氨基甲基-环己烷-乙酸、3,5-双-(2-氨基)乙氧基-苯甲酸、3,5-二氨基-苯甲酸、2-甲基氨基-苯甲酸、N-甲基邻氨基苯甲酸、L-N-甲基丙氨酸、L-N-甲基精氨酸、L-N-甲基天冬酰胺、L-N-甲基天冬氨酸、L-N-甲基半胱氨酸、L-N-甲基谷氨酰胺、L-N-甲基谷氨酸、L-N-甲基组氨酸、L-N-甲基异亮氨酸、L-N-甲基赖氨酸、L-N-甲基正亮氨酸、L-N-甲基鸟氨酸、L-N-甲基苏氨酸、L-N-甲基酪氨酸、L-N-甲基缬氨酸、L-N-甲基-叔丁基甘氨酸、L-正缬氨酸、α-甲基-γ-氨基丁酸盐、4,4'-二苯基丙氨酸、α-甲基环戊基丙氨酸、α-甲基-α-萘基丙氨酸、α-甲基青霉胺、N-(4-氨基丁基)甘氨酸、N-(2-氨基乙基)甘氨酸、N-(3-氨基丙基)甘氨酸、N-氨基-α-甲基丁酸盐、α-萘基丙氨酸、N-苯甲基甘氨酸、N-(2-氨甲酰基乙基)甘氨酸、N-(氨甲酰基甲基)甘氨酸、N-(2-羧基乙基)甘氨酸、N-(羧基甲基)甘氨酸、N-环丁基甘氨酸、N-环癸基甘氨酸、N-环庚基甘氨酸、N-环己基甘氨酸、N-环癸基甘氨酸、N-环十二烷基甘氨酸、N-环辛基甘氨酸、N-环丙基甘氨酸、N-环十一烷基甘氨酸、N-(2,2-二苯基乙基)甘氨酸、N-(3,3-二苯基丙基)甘氨酸、N-(3-胍基丙基)甘氨酸、N-(1-羟基乙基)甘氨酸、N-(羟基乙基))甘氨酸、N-(咪唑基乙基))甘氨酸、N-(3-吲哚基乙基)甘氨酸、N-甲基-γ-氨基丁酸盐、D-N-甲基蛋氨酸、N-甲基环戊基丙氨酸、D-N-甲基苯丙氨酸、D-N-甲基脯氨酸、D-N-甲基苏氨酸、N-(1-甲基乙基)甘氨酸、N-甲基-萘基丙氨酸、N-甲基青霉胺、N-(p-羟基苯基)甘氨酸、N-(硫甲基)甘氨酸、青霉胺、L-α-甲基丙氨酸、L-α-甲基天冬酰胺、L-α-甲基-叔丁基甘氨酸、L-甲基乙基甘氨酸、L-α-甲基谷氨酸盐、L-α-甲基高苯丙氨酸、N-(2-甲基硫乙基)甘氨酸、L-α-甲基赖氨酸、L-α-甲基正亮氨酸、L-α-甲基鸟氨酸、L-α-甲基脯氨酸、L-α-甲基苏氨酸、L-α-甲基酪氨酸、L-N-甲基-高苯丙氨酸、N-(N-(3,3-二苯基丙基)氨甲酰基甲基甘氨酸、L-焦谷氨酸、D-焦谷氨酸、O-甲基-L-丝氨酸、O-甲基-L-高丝氨酸、5-羟基赖氨酸、α-羧基谷氨酸盐、苯基甘氨酸、L-哌可酸(高脯氨酸)、L-高亮氨酸、L-赖氨酸(二甲基)、L-2-萘基丙氨酸、L-二甲基多巴或L-二甲氧基-苯丙氨酸、L-3-吡啶基丙氨酸、L-组氨酸(苯甲酰基氧基甲基)、N-环庚基甘氨酸、L-二苯丙氨酸、O-甲基-L-高酪氨酸、L-β-高赖氨酸、O-聚糖-苏氨酸、邻-酪氨酸、L-N,N'-二甲基赖氨酸、L-高精氨酸、新色氨酸、3-苯并噻吩基丙氨酸、异喹啉-3-甲酸、二氨基丙酸、高半胱氨酸、3,4-二甲氧基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、L-1,2,3,4-四氢去甲哈尔满-3-甲酸、金刚烷基丙氨酸、对称二甲基精氨酸、3-羧基硫代吗啉、D-1,2,3,4-四氢去甲哈尔满-3-甲酸、3-氨基苯甲酸、3-氨基-1-羧基甲基-吡啶-2-酮、1-氨基-1-环己烷甲酸、2-氨基环戊烷甲酸、1-氨基-1-环丙烷甲酸、2-氨基茚满-2-甲酸、4-氨基-四氢噻喃-4-甲酸、氮杂环丁烷-2-甲酸、b-(苯并噻唑-2-基)-丙氨酸、新戊基甘氨酸、2-羧基甲基哌啶、b-环丁基丙氨酸、烯丙基甘氨酸、二氨基丙酸、高-环己基丙氨酸、(2S,4R)-4-羟基哌啶-2-甲酸、八氢吲哚-2-甲酸、(2S,4R)及(2S,4R)-4-(2-萘基)、吡咯烷-2-甲酸、哌啶甲酸、(2S,4R)及(2S,4S)-4-(4-苯基苯甲基)吡咯烷-2-甲酸、(3S)-1-吡咯烷-3-甲酸、(2S,4S)-4-三苯甲基巯基-吡咯烷-2-甲酸、(2S,4S)-4-巯基脯氨酸、叔丁基甘氨酸、N,N-双(3-氨基丙基)甘氨酸、1-氨基-环己烷-1-甲酸、N-巯基乙基甘氨酸及硒代半胱氨酸。在一些实施方案中，氨基酸残基可为带电或极性的。带电氨基酸包括丙氨酸、赖氨酸、天冬氨酸或谷氨酸，或其非天然存在的类似物。极性氨基酸包括谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、蛋氨酸或色氨酸，或其非天然存在的类似物。具体而言，预期在一些实施方案中，氨基酸中的末端氨基可为酰胺基或氨基甲酸酯基。
如本文所用，术语“百分比(％)同一性”是指候选序列(例如，Fc-IgG或其片段)中的氨基酸残基的百分率，所述氨基酸残基在比对所述序列且必要时引入间隙以实现最大百分比同一性之后与参考序列的氨基酸残基相同(即，可在所述候选及参考序列中的一或两者中引入间隙以进行最佳比对且出于比较目的可忽略非同源序列)。出于测定百分比同一性的目的的比对可以本领域的技能内的多种方式实现，例如使用公开可得的计算机软件，诸如BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括在所比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。在一些实施方案中，既定候选序列相对、与或针对既定参考序列的百分比氨基酸序列同一性(其或者可表述为具有或包括相对、与或针对既定参考序列的某一百分比氨基酸序列同一性的既定候选序列)计算如下：
100×(A/B的分数)
其中A是在候选序列与参考序列的比对中经评分为相同的氨基酸残基的数目，且其中B是参考序列中的氨基酸残基的总数。在其中候选序列的长度不等于参考序列的长度的一些实施方案中，候选序列与参考序列的百分比氨基酸序列同一性将不等于参考序列与候选序列的百分比氨基酸序列同一性。
当如上文所述针对最大对应进行比对时，若两个聚核苷酸或多肽序列中的核苷酸或氨基酸的序列相同，则所述两个序列被称为“相同”。两个序列之间的比较典型地通过在比较窗中比较所述序列来执行以鉴别且比较具有序列相似性的局部区。如本文所用，“比较窗”是指至少约15个邻近位置、约20个邻近位置、约25个邻近位置或更多(例如，约30个至约75个邻近位置或约40个至约50个邻近位置)的区段，其中在序列及相同数目的邻近位置的参考序列经最佳比对之后，所述两个序列可进行比较。
如本文所用，术语“治疗(treating)”或“以治疗(to treat)”是指受试者的病毒感染(例如，病毒感染诸如流感感染)的治疗性治疗。在一些实施方案中，治疗性治疗可减慢病毒感染的进展、改善受试者的预后及/或消除所述感染。在一些实施方案中，受试者的病毒感染的治疗性治疗可缓解或改善与所述病毒感染相关的一种或多种症状或病状，削弱病毒程度，稳定(即，不恶化)病毒感染的状态，预防病毒感染的扩散，及/或延迟或减慢病毒感染的进展，如与所述治疗性治疗不存在下所述病毒感染的状态及/或病状相比。
如本文所用，术语“T的平均值”是指缀合于缀合物群体内的Fc结构域或白蛋白的神经氨酸酶抑制剂单体或神经氨酸酶抑制剂二聚体的平均数。在一些实施方案中，在缀合物群体内，缀合于Fc结构域单体的神经氨酸酶抑制剂单体或神经氨酸酶抑制剂二聚体的平均数可为1至20(例如，T的平均值为1至2、1至3、1至4、1至5、5至10、10至15、15至20、1.5至3.5、2.5至4.5、3.5至5.5、4.5至6.5、5.5至7.5、6.5至8.5、7.5至9.5或8.5至10.5)。在一些实施方案中，T的平均值为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。
如本文所用，术语“受试者”可为人、非人类灵长类动物或其他哺乳动物，诸如但不限于犬、猫、马、牛、猪、火鸡、山羊、鱼、猴、鸡、大鼠、小鼠及绵羊。
如本文所用，术语“治疗有效量”是指有效诱导受试者的所需效应或治疗患有本文所述的病状或病症(例如，病毒感染，诸如流感感染)的受试者的量，例如药物剂量。本文中也应了解，“治疗有效量”可解释为给出所需治疗及/或预防效应，以一个或多个剂量或以任何剂量或途径服用，及/或单独或与其他治疗剂(例如，本文所述的抗病毒剂)组合服用的量。例如，在施用用于治疗病毒感染的本文所述的缀合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者的缀合物)的情况下，缀合物的治疗有效量为例如以下量，如与不施用所述缀合物时获得的反应相比，所述量足以预防、减慢或逆转病毒感染的进展。
如本文所用，术语“药物组合物”是指含有至少一种活性成分(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者的缀合物)以及使所述活性成分能够适用于施用方法的一种或多种赋形剂及稀释剂的药用或药物制剂。本公开的药物组合物包含与本文所述的缀合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者的缀合物)相容的药学上可接受的组分。
如本文所用，术语“药学上可接受的载剂”是指药物组合物中的赋形剂或稀释剂。例如，药学上可接受的载剂可为能够悬浮或溶解活性缀合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)或(M-I)-(M-VI)中任一者的缀合物)的媒介物。药学上可接受的载剂必须与所述制剂的其他成分相容且对接受者无害。在本公开中，药学上可接受的载剂必须对本文所述的缀合物提供足够的药物稳定性。载剂的性质随施用方式变化。例如，对于经口施用，固体载剂为优选的；对于静脉内施用，一般使用水溶液载剂(例如，WFI及/或缓冲溶液)。
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”表示本文所述的缀合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者的缀合物)的盐，其在合理医学判断的范围内适用于本文所述的方法而无不当毒性、刺激及/或过敏性反应。药学上可接受的盐在本领域中是熟知的。例如，药学上可接受的盐描述于以下中：Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use(编辑P.H.Stahl及C.G.Wermuth),Wiley-VCH,2008。所述盐可在本文所述的缀合物的最终分离及纯化期间当场制备，或通过使游离碱基与合适有机酸反应而单独制备。
术语“药物:抗体比率”或“DAR”是指缀合于本文所述的抗体、Fc结构域或白蛋白的小分子药物部分的平均数(例如，小分子药物单体或二聚体的平均数)。在本文所述的一些实施方案中，DAR是由“T”表示(例如，在式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中)。如本文所用，缀合于Fc结构域、抗体或白蛋白的各单体部分(例如，各扎那米韦或帕拉米韦单体)或各二聚体部分(例如，各扎那米韦二聚体或帕拉米韦二聚体)对应于DAR值1.0(例如，“T”值为1.0)。例如，缀合于4个扎那米韦单体的Fc结构域将具有DAR4.0(例如，“T”为4.0)。缀合于4个扎那米韦二聚体(例如，总计8个扎那米韦分子)的Fc结构域也将具有DAR4.0(例如，“T”为4.0)。DAR也可被计算为分子群体(诸如Fc结构域、抗体或白蛋白的群体)的平均DAR。DAR值可影响药物的功效、效能、药代动力学或毒性。
如本文所用，术语“继发感染”是指在受试者的另一(称为原发性)感染期间或之后(例如，在原发性流感感染期间或之后)，在所述受试者中发生的感染。继发感染可由原发感染引起或可由原发感染的治疗引起。在一些情况下，原发感染改变免疫系统，使受试者更容易经受继发感染。在一些情况下，原发感染的治疗使受试者更容易经受继发感染。例如，流感病毒与继发感染相关(例如，发生继发感染的风险增加)，诸如(例如呼吸道的)细菌继发感染。与流感感染相关的继发感染会增加流感的发病率和死亡率。继发感染包括共同感染。术语“继发感染”及“共同感染”在本文中可互换使用。
如本文所用，术语“约”指示多至±5％的偏差。例如，约10％是指9.5％至10.5％。
以值的范围提供的任何值均包括上限及下限，及含于所述上限及下限内的任何值。
如本文所用，术语“(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)”表示(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(D-I)、(D-II)、(D-II-1)、(D-II-2)、(D-II-3)、(D-II-4)、(D-II-5)、(D-II-6)、(D-II-7)、(D-II-8)、(D-II-9)、(D-II-10)、(D-III)、(D-III-1)、(D-III-2)、(D-III-3)、(D-III-4)、(D-III-5)、(D-III-6)、(D-III-7)、(D-III-8)、(D-III-9)、(D-IV)、(D-IV-1)、(D-IV-2)、(D-V)、(D-V-1)、(D-V-2)、(D-V-3)、(D-V-4)、(D-V-5)、(D-V-6)、(D-V-7)、(D-V-8)、(D-V-9)、(D-V-10)、(D-VI)、(D-VI-1)、(D-VI-2)、(D-VI-3)、(D-VI-4)、(D-VI-5)、(D-VI-6)、(D-VI-7)、(D-VI-8)、(D-VI-9)、(D-VII)、(D-VIII)、(D-VIII-1)、(D-VIII-2)、(D-VIII-3)、(D-VIII-4)、(D-VIII-5)、(D-VIII-6)、(D-VIII-7)、(D-VIII-8)、(D-VIII-9)、(D-VIII-10)、(D-VIII-11)、(D-IX)、(D-IX-1)、(D-IX-2)、(D-IX-3)、(D-IX-4)、(D-IX-5)、(D-IX-6)、(D-X)、(D-X-1)、(D-X-2)、(D-X-3)、(D-XI)、(D-XI-1)、(D’-I)、(M-I)、(M-II)、(M-II-1)、(M-II-2)、(M-II-3)、(M-II-4)、(M-II-5)、(M-II-6)、(M-II-7)、(M-II-8)、(M-II-9)、(M-II-10)、(M-III)、(M-III-1)、(M-III-2)、(M-III-3)、(M-III-4)、(M-III-5)、(M-III-6)、(M-III-7)、(M-III-8)、(M-III-9)、(M-IV)、(M-IV-1)、(M-IV-2)、(M-V)、(M-V-1)、(M-V-2)、(M-V-3)、(M-V-4)、(M-V-5)、(M-V-6)、(M-V-7)、(M-V-8)、(M-V-9)、(M-V-10)、(M-VI)、(M-VI-1)、(M-VI-2)、(M-VI-3)、(M-VI-4)、(M-VI-5)、(M-VI-6)、(M-VI-7)、(M-VI-8)、(M-VI-9)、(M-VII)、(M-VIII)、(M-VIII-1)、(M-VIII-2)、(M-VIII-3)、(M-VIII-4)、(M-VIII-5)、(M-VIII-6)、(M-VIII-7)、(M-VIII-8)、(M-VIII-9)、(M-VIII-10)、(M-VIII-11)、(M-IX)、(M-IX-1)、(M-IX-2)、(M-IX-3)、(M-IX-4)、(M-IX-5)、(M-IX-6)、(M-X)、(M-X-1)、(M-X-2)、(M-X-3)、(M-XI)、(M-XI-1)或(M’-I)中任一式。
本文所述的缀合物的其他特征及优势将由具体实施方式及权利要求书显而易见。
附图说明
图1是描绘例如借助于接头使神经氨酸酶抑制剂单体或二聚体缀合于Fc结构域单体、Fc结构域、Fc结合肽、白蛋白或白蛋白结合肽的例示性方法的图像。
图2显示由具有SEQ ID NO:1的序列的Fc结构域单体形成的Fc结构域的非还原及还原SDS-PAGE及示意图。
图3显示由具有SEQ ID NO:3的序列的Fc结构域单体形成的Fc结构域的非还原及还原SDS-PAGE及示意图。
图4显示由具有SEQ ID NO:5的序列的Fc结构域单体形成的Fc结构域的非还原及还原SDS-PAGE及示意图。
图5显示由具有SEQ ID NO:7的序列的Fc结构域单体形成的Fc结构域的非还原及还原SDS-PAGE及示意图。
图6显示由具有SEQ ID NO:9的序列的Fc结构域单体形成的Fc结构域的非还原及还原SDS-PAGE及示意图。
图7显示由具有SEQ ID NO:12的序列的Fc结构域单体形成的Fc结构域的非还原及还原SDS-PAGE及示意图。
图8显示由具有SEQ ID NO:14的序列的Fc结构域单体形成的Fc结构域的非还原及还原SDS-PAGE及示意图。
图9显示缀合物1的非还原SDS-PAGE。
图10显示缀合物2的非还原SDS-PAGE。
图11显示缀合物3的非还原SDS-PAGE。
图12显示缀合物4的非还原SDS-PAGE。
图13显示缀合物5的非还原SDS-PAGE。
图14显示缀合物6的非还原SDS-PAGE。
图15是显示H1N1神经氨酸酶抑制分析中针对Int-2及缀合物1的IC50值的图。
图16是显示H1N1神经氨酸酶抑制分析中针对缀合物1-6的IC50值的图。
图17是显示H3N2神经氨酸酶抑制分析中针对缀合物1-6的IC50值的图。
图18A-18C是一系列图，其显示经缀合物3(图18A)、缀合物4(图18B)或缀合物6(图18C)治疗的A549细胞的细胞性能。
图19A-19E是一系列图，其显示缀合物3抑制人上皮细胞中的致病性流感病毒菌株A/WSN/33H1N1(图19A)、A/Wyoming/3/03H3N2(图19B)、A/California/04/09H1N1 pdm(图19C)、A/Vietnam/1203/04H5N1 HALo(图19D)或B/Lee/40Victoria(图19E)的生长的能力。
图20A-20E是一系列图，其显示缀合物4抑制人上皮细胞中的致病性流感病毒菌株A/WSN/33H1N1(图20A)、A/Wyoming/3/03H3N2(图20B)、A/California/04/09H1N1 pdm(图20C)、A/Vietnam/1203/04H5N1 HALo(图20D)或B/Lee/40Victoria(图20E)的生长的能力。
图21A-21E是一系列图，其显示缀合物6抑制人上皮细胞中的致病性流感病毒菌株A/WSN/33H1N1(图21A)、A/Wyoming/3/03H3N2(图21B)、A/California/04/09H1N1 pdm(图21C)、A/Vietnam/1203/04H5N1 HALo(图21D)或B/Lee/40Victoria(图21E)的生长的能力。
图22A-22E是一系列图，其显示与奥司他韦相比，缀合物6抑制人上皮细胞中的致病性流感病毒菌株A/WSN/33H1N1(图22A)、A/Wyoming/3/03H3N2(图22B)、A/California/04/09H1N1 pdm(图22C)、B/Lee/40Victoria(图22D)或A/Vietnam/1203/04(图22E)的生长的能力。
图23是显示与单独Fc(hIgG1)相比缀合物6的相对小鼠血清浓度的图。
图24是显示在致死性小鼠流感模型中缀合物6对小鼠重量的影响的图。所述研究如实施例29所述来执行。
图25是显示在致死性小鼠流感模型中缀合物6对生存的影响的图。所述研究如实施例29所述来执行。
图26是显示在致死性小鼠流感模型中缀合物6对小鼠重量的影响的图。所述研究如实施例30所述来执行。
图27是显示在致死性小鼠流感模型中缀合物6对生存的影响的图。所述研究如实施例30所述来执行。
图28是描绘例如借助于接头通过肟缀合于氨基酸残基(例如，表面暴露赖氨酸的氮原子)使神经氨酸酶抑制剂单体或二聚体缀合于Fc结构域单体、Fc结构域、Fc结合肽、白蛋白或白蛋白结合肽的方法的图像。
图29是描绘例如借助于接头通过硫醚缀合于氨基酸残基(例如，表面暴露赖氨酸的氮原子)使神经氨酸酶抑制剂单体或二聚体缀合于Fc结构域单体、Fc结构域、Fc结合肽、白蛋白或白蛋白结合肽的方法的图像。
图30是描绘例如借助于接头通过再桥接半胱氨酸缀合，例如再桥接半胱氨酸缀合于Fc结构域单体或Fc结构域中的两个铰链半胱氨酸的一对硫原子使神经氨酸酶抑制剂单体或二聚体缀合于Fc结构域单体、Fc结构域、Fc结合肽、白蛋白或白蛋白结合肽的方法的图像。
图31A-31F是一系列图，其显示在致死性小鼠流感模型中经缀合物6治疗的小鼠的生存。小鼠经奥司他韦(TamifluTM)对照，20mg/kg，每天2次，感染后8小时开始(图31A)；缀合物6，50mg/kg，在感染之前28天1剂(图31B)；缀合物6，10mg/kg，在感染之前28天1剂(图31C)；缀合物6，5mg/kg，在感染之前28天1剂(图31D)；缀合物6，2.5mg/kg，在感染之前28天1剂(图31E)；或缀合物6，1.25mg/kg，在感染之前28天1剂(图31F)治疗。此研究如实施例33所述来执行。
图32A-32F是一系列图，其显示如与奥司他韦(TamifluTM)相比，缀合物6延伸治疗窗，如通过致死性小鼠流感模型中的生存所测定。小鼠经媒介物(PBS)，单独Fc 10mpk，或缀合物6，在感染之前4小时(图32A)；缀合物6或奥司他韦(TamifluTM)，感染后8小时(图32B)；缀合物6或奥司他韦(TamifluTM)，感染后24小时(图32C)；缀合物6或奥司他韦(TamifluTM)，感染后48小时(图32D)；缀合物6或奥司他韦(TamifluTM)，感染后72小时(图32E)；或缀合物6或奥司他韦(TamifluTM)，感染后96小时(图32F)治疗。所述研究如实施例34所述来执行。
图33是显示在14天大鼠剂量范围发现毒性研究中在施用缀合物6之后未观察到体重增加的显著效应的图。所述研究如实施例35所述来执行。
图34A-34D是一系列图，其显示如与奥司他韦(TamifluTM)相比，缀合物6延伸治疗窗，如通过致死性小鼠流感模型中的生存所测定。小鼠经奥司他韦(TamifluTM)对照，20mg/kg，每天2次，感染后8小时开始(图34A)；缀合物6，10mg/kg，在感染之前4小时1剂(图34B)；缀合物6，2mg/kg，在感染之前4小时1剂(图34C)；或缀合物6，0.4mg/kg，在感染之前4天1剂(图34D)治疗。所述研究如实施例37所述来执行。
图35是显示在致死性小鼠流感模型中缀合物6对小鼠重量的影响的图。所述研究如实施例37所述来执行。
图36是显示在IV施用缀合物6之后的7天大鼠药代动力学研究的图。所述研究如实施例38所述来执行。
图37是显示在IV施用缀合物6之后的14天大鼠药代动力学研究的图。所述研究如实施例39所述来执行。
图38是显示比较IV与SC施用缀合物6的28天大鼠药代动力学研究的图。所述研究如实施例40所述来执行。
图39是显示在IV施用缀合物6之后的28天非人类灵长类动物药代动力学研究的图。所述研究如实施例41所述来执行。
图40是显示在IV施用缀合物6之后的小鼠肺分布药代动力学研究的图。所述研究如实施例42所述来执行。
图41是显示比较IV、SC及IM施用缀合物6的5天小鼠药代动力学研究的图。所述研究如实施例43所述来执行。
图42显示缀合物8的非还原SDS-PAGE。
图43显示缀合物6的结构。
图44是显示24小时体外小鼠血浆稳定性研究的图，所述研究比较与对照及纯化合物相比在37℃下培育持续24h的缀合物6。
图45是显示24小时体外人血浆稳定性研究的图，所述研究比较与对照及纯化合物相比在37℃下培育持续24h的缀合物6。
图46是显示24小时小鼠肝微粒体稳定性研究的图，所述研究比较在37℃下在小鼠肝微粒体细胞及作为对照的经热灭活小鼠肝微粒体细胞中培育持续24h的缀合物6。
图47是显示24小时人肝微粒体稳定性研究的图，所述研究比较在37℃下在人肝微粒体细胞及作为对照的经热灭活小鼠肝微粒体细胞中培育持续24h的缀合物6。
图48是显示病毒攻击后经15天小鼠的％体重变化的图。所述研究如实施例66所述来执行。
图49是显示病毒攻击后经15天小鼠的％生存的图。所述研究如实施例66所述来执行。
图50是显示与hIgG1 Fc(WT)及hIgG1 Fc(N297A)相比缀合物6及缀合物12与Fcγ受体IIIA的结合的图。所述研究如实施例67所述来执行。
图51是显示缀合物6及缀合物与Fcγ受体IIIA结合的图。所述研究如实施例67所述来执行。
图52是显示在IV施用缀合物6之后的7天非人类灵长类动物毒代动力学研究的图。所述研究如实施例68所述来执行。
图53是显示比较IV及SC施用缀合物6的28天非人类灵长类动物药代动力学研究的图。所述研究如实施例68所述来执行。
图54显示缀合物12的非还原SDS-PAGE。
图55显示具有不同药物:抗体(DAR)比率值的缀合物13(缀合物13a、缀合物13b、缀合物13c、缀合物13d、缀合物13e、缀合物13f及缀合物13g)的非还原SDS-PAGE。
图56是显示病毒攻击后经35天免疫受损小鼠的％生存的图。0.3mg/kg缀合物6治疗组保持100％生存，但在所述图中为清晰起见略有偏移。所述研究如实施例95所述来执行
图57是显示病毒攻击后经35天免疫受损小鼠的％体重变化的图。所述研究如实施例95所述来执行。
图58是显示缀合物6的施用在经流感A(H1N1)感染的小鼠模型的肺中引起剂量依赖性病毒清除且此病毒清除大于PBS对照、单独Fc对照或奥司他韦对照的图。此研究如实施例96所述来执行。
图59是显示缀合物6的施用在经流感A(H1N1)感染的小鼠模型的肺中引起炎性细胞因子的剂量依赖性减少的图。此研究如实施例97所述来执行。
图60是显示缀合物6在BALB/c SCID(免疫受损)小鼠及CD-1小鼠(免疫胜任)中的药代动力学的图。此研究如实施例98所述来执行。
图61是描绘缀合物33的图像。
图62A-62B是显示鼻内经小鼠适应性流感A.PR/8/1934(H1N1)攻击(3x LD95)的BALB/c小鼠的体重变化(％)的图。此研究如实施例133所述来执行。
图63A是显示感染后第4天的病毒负荷的图。此研究如实施例133所述来执行。
图63B是显示感染后第4天的病毒负荷的log减少的图。此研究如实施例133所述来执行。
图64A是显示与PBS对照或单独Fc对照相比，缀合物33的施用在经流感A(H1N1)感染的小鼠模型中引起病毒负荷的剂量依赖性减少的图。此研究如实施例133所述来执行。
图64B是显示感染后第4天的病毒负荷的log减少的图。此研究如实施例133所述来执行。
图65A-65E是一系列条形图，其显示缀合物33的施用引起TNF-α(图65A)、IL-6(图65B)、INF-γ(图65C)、MCP-1(图65D)及MIP-1α(图65E)的细胞因子水平的剂量依赖性倍数减少。此研究如实施例133所述来执行。
图66是色谱图，其显示在37℃及60℃下培育第7天与Int-4相比Int-80的稳定性。此研究如实施例142所述来执行。
图67是显示在缀合物6、奥司他韦、巴洛沙韦或PBS对照存在下A549细胞中的A/CA/09pdm的连续传代的图，以评估在病毒抑制剂的选择性压力下开发耐药性突变型病毒菌株的潜力。此研究如实施例147所述来执行。
图68是显示在缀合物6、缀合物33、奥司他韦、巴洛沙韦或PBS对照存在下MDCK细胞中的A/WSN/1933的连续传代的图，以评估在病毒抑制剂的选择性压力下开发耐药性突变型病毒菌株的潜力。此研究如实施例147所述来执行。
图69是显示缀合物6针对流感A H1N1的ADCC的MOI依赖性增加的图。此研究如实施例152所述来执行。
图70是显示在MOI为1时缀合物6针对流感A/PR/8/1934(H1N1)的ADCC的剂量依赖性增加的图。此研究如实施例152所述来执行。
图71A-71C是显示缀合物33针对流感A/PR/8/1934(H1N1，图71A)、流感A/CA/07/2009(H1N1)pdm(图71B)及流感A/HK/1/1968(H3N2，图71C)的MOI依赖性增加的图。此研究如实施例152所述来执行。
图72是显示缀合物33针对流感B/Malaysia/2506/2004(Victoria)的ADCC的MOI依赖性增加的图。此研究如实施例152所述来执行。
图73A-73B是显示在MOI为1(图73A)及MOI为10(图73B)时缀合物33针对流感A/PR/8/1934的ADCC的剂量依赖性增加的图。此研究如实施例152所述来执行。
图74是显示对照全长单克隆抗体格迪伏单抗(Gedivumab)(Genentech)针对流感A/PR/8/1934(H1N1)的ADCC的MOI依赖性增加的图。此研究如实施例152所述来执行。
图75A-75B是显示在MOI为1(图75A)及MOI为10(图75B)时对照全长单克隆抗体格迪伏单抗(Genentech)针对流感A/PR/8/1934的ADCC的剂量依赖性增加的图。此研究如实施例152所述来执行。
图76是显示缀合物6针对流感AH1N1的ADCP的MOI依赖性增加的图。此研究如实施例153所述来执行。
图77A-77B是显示在MOI为1(图77A)及MOI为10(图77B)时缀合物6针对流感A/PR/8/1934(H1N1)的ADCP的剂量依赖性增加的图。此研究如实施例153所述来执行。
图78A-78C是显示缀合物33针对流感A/PR/8/1934(H1N1，图78A)、流感A/CA/07/2009(H1N1)pdm(图78B)及流感A/HK/1/1968(H3N2，图78C)的MOI依赖性增加的图。此研究如实施例153所述来执行。
图79是显示缀合物33针对流感B/Malaysia/2506/2004(Victoria)的ADCP的MOI依赖性增加的图。此研究如实施例153所述来执行。
图80A-80B是显示在MOI为1(图80A)及MOI为10(图80B)时缀合物33针对流感A/PR/8/1934的ADCP的剂量依赖性增加的图。此研究如实施例153所述来执行。
图81是显示对照全长单克隆抗体格迪伏单抗(Genentech)针对流感A/PR/8/1934(H1N1)的ADCP的MOI依赖性增加的图。此研究如实施例153所述来执行。
图82A-82B是显示在MOI为1(图82A)及MOI为10(图82B)时对照全长单克隆抗体格迪伏单抗(Genentech)针对流感A/PR/8/1934的ADCP的剂量依赖性增加的图。此研究如实施例153所述来执行。
图83是显示在缀合物45b、奥司他韦、巴洛沙韦或PBS对照存在下MDCK细胞中的A/Ca/07/2009(H1N1)pdm的连续传代的图，以评估在病毒抑制剂的选择性压力下开发耐药性突变型病毒菌株的潜力。此研究如实施例165所述来执行。
图84是显示在比较IV、SC及IM施用的小鼠PK研究中缀合物45b的血浆水平的图。通过NA捕获测定血浆浓度水平。此研究如实施例173所述来执行。
图85是显示在比较IV、SV及IM施用的小鼠PK研究中缀合物45b的血浆水平的图。通过hIgG Fc捕获测定血浆浓度水平。此研究如实施例173所述来执行。
图86是显示通过NA捕获的缀合物45b的血浆水平的剂量线性的图。此研究如实施例174所述来执行。
图87是显示通过hIgG捕获的缀合物45b的血浆水平的剂量线性的图。此研究如实施例174所述来执行。
图88是显示在大鼠PK研究中以50mg/kg及5mg/kg SC给药时缀合物45b的血浆浓度的图。使用经神经氨酸酶包被的板通过ELISA测定血浆浓度。此研究如实施例175所述来执行。
图89是显示缀合物45b的血浆浓度的图，比较了以5mg/kg IV及SV施用缀合物45b。使用经神经氨酸酶包被的板通过ELISA测定血浆浓度。此研究如实施例175所述来执行。
图90是显示在非人类灵长类动物食蟹猕猴中缀合物45b的血浆浓度的图。使用经神经氨酸酶包被的板通过ELISA测定血浆浓度。此研究如实施例176所述来执行。
图91是显示在非人类灵长类动物食蟹猕猴中缀合物45b的血浆浓度的图。通过hIgGFc捕获测定血浆浓度。此研究如实施例176所述来执行。
图92是显示在非人类灵长类动物食蟹猕猴中第1天至第14天缀合物45b的血浆浓度的图。通过神经氨酸酶(NA)捕获及Fc捕获测定血浆浓度。此研究如实施例176所述来执行。
图93是显示在雪貂PK研究中通过神经氨酸酶(NA)捕获及Fc捕获测定的缀合物45b(3mpkIV)的血浆水平的图。此研究如实施例183所述来执行。
图94是显示在雪貂PK研究中通过H1N1神经氨酸酶(NA)捕获测定的缀合物45b的鼻洗液水平的图。此研究如实施例186所述来执行。
图95是显示在雪貂PK研究中通过hIgG Fc捕获测定的缀合物45b的鼻洗液水平的图。此研究如实施例186所述来执行。
图96是显示如与奥司他韦(10mg/kg，bid x5)或媒介物相比，施用缀合物45b(0.3mg/kg，单次)后的临床观察结果的比较的图。此研究如实施例182所述来执行。
图97是显示在非人类灵长类动物PK研究中通过Fc捕获测定的与缀合物46(2mpkIV)相比缀合物45b(2mpk IV)的血浆水平的图。此研究如实施例189所述来执行。
图98是显示小鼠中与缀合物45b的上皮衬液(ELF)水平相比缀合物45b的血浆浓度水平的图。此研究如实施例191所述来执行。
图99是显示在SCID小鼠PK研究中通过H1N1 Fc捕获测定的缀合物45b的血浆水平的图。此研究如实施例192所述来执行。
图100是显示在SCID小鼠PK研究中通过神经氨酸酶(NA)捕获测定的缀合物45b的血浆水平的图。此研究如实施例192所述来执行。
图101是显示在小鼠PK研究中通过神经氨酸酶(NA)捕获测定的与缀合物46相比缀合物45b的血浆水平的图。此研究如实施例193所述来执行。
图102是描绘缀合物45及缀合物46的图像。
图103是描绘叠氮基官能化的Fc结构域单体或Fc结构域与预缀合中间体(Int)的例示性点击化学缀合的图像。
图104是描绘如实施例200所述的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的继发细菌感染模型的实验程序的图像。
图105A-105B是显示用缀合物45b治疗之后继发感染小鼠模型的百分比生存(图105A)及CFU/g肺(图105B)的图。此研究如实施例200所述来执行。
图106是描绘如实施例200所述的肺炎链球菌的继发细菌感染模型的实验程序的图像。
图107是描绘用缀合物45b治疗之后肺炎链球菌的继发感染模型中小鼠百分比生存的图。此研究如实施例200所述来执行。
图108A-108B是显示在流感A/Vietnam/1203/2004(H5N1)的病毒攻击之前7天用缀合物45a单次治疗之后小鼠的生存(图108A)及平均体重(图108B)的图。在攻击感染及用缀合物45a治疗之后，观察到10mg/kg剂量的100％保护、0.3及3.0mg/kg剂量的80％保护及1mg/kg剂量的70％保护(图108A)。安慰剂组的30％生存是不寻常的，因此1mg/kg剂量未提供显著保护。此外，所有剂量均提供了重量损失的显著保护(图108B)。(*P<0.05，**P<0.01，****P<0.0001)。此研究如实施例201所述来执行。
图109A-109B是显示在流感A/Vietnam/1203/2004(H5N1)的病毒攻击后4小时用缀合物45a单次治疗之后小鼠的生存(图109A)及平均体重(图109B)的图。在攻击感染及用缀合物45a治疗之后，观察到1、3及10mg/kg剂量的100％保护及0.3mg/kg剂量的70％保护(图109A)。安慰剂组的30％生存是不寻常的，因此0.3mg/kg剂量未提供显著保护。此外，所有剂量均提供了重量损失的显著保护(图109B)。(*P<0.05，**P<0.01，****P<0.0001)。此研究如实施例201所述来执行。
图110A是描绘与A/California/04/2009H1N1神经氨酸酶(NA)(PDB代码3TI5)络合的四聚扎那米韦(以球棒模型显示)的晶体结构呈现的图像。显示了四聚体内相邻NA活性位点之间的直线距离。突出显示了被选择用于附接于Fc载剂(通过NHS酯)的扎那米韦上的C7位置。扎那米韦上的C7是溶剂暴露的且在空间上不受阻碍，从而允许与对结合亲和力的影响最小的C7缀合。此研究如实施例203所述来执行。
图110B是全长hIgG1(PDB代码1HZH)结构的半透明分子表面呈现的图像，其被编辑以仅显示在缀合物45b中使用的Fc构建体边界。在缀合物45b中优先缀合的赖氨酸的位置以绿色显示。缀合物45b是扎那米韦二聚体的多价缀合物(Int-83，结构如右图)，与N端延伸的hIgG1 Fc上的赖氨酸稳定缀合，平均药物:抗体比率(DAR)为4.5:1。Fc结构域表面的缀合的赖氨酸的空间分布及PEG接头的长度和柔性导致缀合物45b上的Int.83二聚体星群，其中扎那米韦二聚体之间存在足够的间距(>90A)以允许NA四聚体内、同一病毒粒子上相邻的NA四聚体之间或单个缀合物45b分子的不同病毒粒子上的NA四聚体之间的多个活性-位点的同时衔接。此研究如实施例203所述来执行。
图111A-111J是显示缀合物45b与Fcγ受体结合并触发ADCC的图。图111A-111D显示缀合物45b结合人FcγRI(图111A)、RIIa(图111B)、RIIb(图111C)及RIIIa(图111D)，如通过ELISA所测定。图111E-111H显示缀合物45b结合鼠科动物FcγRI(图111E)、RIII(图111F)、RIIb(图111G)及RIV(图111H)，如通过ELISA所测定。图111I-111J显示使用报告细胞，缀合物45b以剂量依赖性(图111I)和MOI依赖性(图111J)诱导抗体依赖性细胞毒性。此研究如实施例203所述来执行。
图112A-112M是显示Balb/C小鼠中缀合物45b针对流感的致死性攻击的功效的图。图112A是显示感染后2h SC给药的0.01-1mg/kg范围内的缀合物45b针对流感A/PR/8/1934(H1N1)的致死性攻击在生存方面的剂量反应的图。图112B-112H是显示SC施用的最小保护性剂量的缀合物45b针对以下的功效的图：流感A/CA/07/2009(H1N1)pdm(图112B)、A/WSN/1933(H1N1)(图112C)、A/CA/12/2012(H1N1)pdm09(图112D)、A/Texas/23/2012(H1N1)pdm09H275Y(图112E)、A/Hong Kong/1/1968(H3N2)(图112F)、B/Florida/4/2006(Yamagata)(图112G)及B/Malaysia/2506/2004(Victoria)(图112H)。图112I是显示缀合物45针对BSL-3菌株A/Vietnam/1203/2005(H5N1)的功效的图。图112J是显示感染后第4天肺中病毒负荷的条形图。图112K-112L是描绘IL-6(图112K)及MCP-1(图112L)的肺细胞因子水平的图。图112M是显示SC施用的缀合物45b针对流感A/PR/8/1934(H1N1)的最小保护性剂量的图。此研究如实施例203所述来执行。
图113A-113J是通过百分比体重变化显示Balb/C小鼠中缀合物45b针对流感的致死性攻击的功效的图。图113A是显示在感染后2hSC给药的0.01-1mg/kg范围内的缀合物45b针对流感A/PR/8/1934(H1N1)的致死性攻击的剂量反应的图。图113B-113H显示针对以下SC施用最小保护性剂量的缀合物45b之后的百分比体重变化：流感A/CA/07/2009(H1N1)pdm(图113B)、A/WSN/1933(H1N1)(图113C)、A/CA/12/2012(H1N1)pdm09(图113D)、A/Texas/23/2012(H1N1)pdm09 H275Y(图113E)、A/Hong Kong/1/1968(H3N2)(图113F)、B/Florida/4/2006(Yamagata)(图113G)及B/Malaysia/2506/2004(Victoria)(图113H)。图113I是显示缀合物45b针对BSL-3菌株A/Vietnam/1203/2005(H5N1)的功效的图。图113J是显示当针对流感A/PR/8/1934(H1N1)SC施用最小保护性剂量的缀合物45b时体重变化的图。此研究如实施例203所述来执行。
图114A-114B是一对图，显示A/PR/8/1934(H1N1)的致死性小鼠模型中5mg/kg(BIDx 5天)的人等效剂量或50mg/kg(BID x 5天)的10倍人等效剂量的奥司他韦在生存(图114A)及体重变化(图114B)方面的功效。
图115A-115C是显示用A/PR/8/1934(H1N1)的致死性攻击感染后第4天NF-α(图115A)、KC(图115B)、MIP-1α(图115C)的肺细胞因子水平的条形图。
图116A-116B是描绘SC、IM或IV施用单一剂量之后的缀合物45b针对流感A/CA/07/2009(H1N1)pdm在百分比生存(图111A)及百分比体重变化(图116B)方面的功效的图。
图116C-116D是描绘在小鼠中SC、IM或IV施用单一剂量之后168小时内通过NA捕获(图116C)或Fc捕获(图116D)测定的缀合物45b的血浆水平的图。
图117A-117C是显示在pH 5.8下结合更强且在pH 7.4下结合降低的、与人(图117A)、食蟹猕猴(图117B)及小鼠(图117C)的hIgG1 Fc或全长IgG1同种型对照相当的FcRn结合模式的图。
图118A-118F是描绘缀合物45b的长持续时间作用的图。图118A是显示在小鼠中SC施用之后1-100mg/kg的缀合物45b剂量反应的血浆水平的图。图118B是描绘SC给药之后小鼠血浆、ELF及肺中缀合物45b的水平的图。图118C-118F显示在致死性攻击之前28天给药的缀合物45b所提供的针对流感A/CA/07/2009(H1N1)pdm(图118C)、A/HK/1/1968(H3N2)(图118D)、B/Malaysia/2506/2004(Victoria)(图118E)及B/Florida/4/2006(Yamagata)(图118F)在百分比生存方面的保护。
图119是描绘较低缀合物45a剂量组的生存曲线的图。此研究如实施例209所述来执行。
图120是描绘对照及缀合物45a在0.3及0.03mg/kg下的Kaplan-Meier生存曲线的图。此研究如实施例210所述来执行。
图121是描绘(蛋白A柱纯化的)对照及缀合物45a以及(蛋白A柱流通的(flow-through))*缀合物45a在0.1mg/kg下的Kaplan-Meier生存曲线的图。此研究如实施例215所述来执行。
图122是描绘对照及缀合物45a及缀合物46在0.1mg/kg下的Kaplan-Meier生存曲线的图。此研究如实施例216所述来执行。
具体实施方式
本公开提供用于治疗病毒感染(例如，流感病毒感染)的缀合物、组合物及方法。本文所公开的缀合物包括病毒神经氨酸酶抑制剂(例如，扎那米韦、帕拉米韦或其类似物)的单体或二聚体，其缀合于Fc单体、Fc结构域、Fc结合肽、白蛋白或白蛋白结合肽。所述缀合物中的神经氨酸酶抑制剂(例如，扎那米韦、帕拉米韦或其类似物)靶向在病毒粒子的表面上的神经氨酸酶。所述缀合物中的Fc单体或Fc结构域结合于免疫细胞(例如，嗜中性粒细胞)上的FcγR(例如，FcRn、FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIc、FcγRIIIa及FcγRIIIb)以活化吞噬作用及效应子功能，诸如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，因此导致免疫细胞吞没及破坏病毒粒子且进一步增强所述缀合物的抗病毒活性。所述白蛋白或白蛋白结合肽可延长缀合物的半衰期，例如通过使白蛋白结合于再循环新生儿Fc受体。所述组合物可用于抑制病毒生长的方法及治疗病毒感染(诸如由流感病毒A、流感病毒B及流感病毒C引起的病毒感染)的方法。
I.病毒感染
本文所述的化合物及药物组合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者的缀合物)可用于治疗病毒感染(例如，流感病毒感染，诸如流感A、B、C或副流感)。
病毒感染是指病毒(例如，流感病毒)在宿主生物体(例如，人受试者)中的致病性生长。病毒感染可为其中病毒群体的存在正在损害宿主身体的任何情形。因此，当受试者的身体中或身体上存在过量病毒群体时，或当病毒群体的存在正在损害所述受试者的细胞或其他组织时，所述受试者正在经受病毒感染。
流感(通常称作“流感(flu)”)是由流感病毒引起的传染病。症状可为轻微至严重。最常见症状包括：高烧、流鼻涕、喉咙痛、肌肉疼痛、头痛、咳嗽及感觉疲倦。这些症状典型地在暴露于病毒之后两天开始且大多数情况下持续少于一周。然而，咳嗽可持续超过两周。在儿童中，可存在恶心及呕吐，但其在成人中不常见。流感并发症可包括病毒性肺炎、继发性细菌性肺炎、鼻窦感染及诸如哮喘或心脏衰竭的先前健康问题恶化。严重并发症可出现于具有经削弱免疫系统的受试者中，诸如年轻人、老年人、具有削弱免疫系统的疾病的那些受试者及经历导致免疫系统削弱的疗法治疗的那些受试者。
感染流感的受试者还处于增加的发生继发感染(例如，继发细菌、病毒或真菌感染)，特别是细菌感染诸如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、肺炎链球菌、铜绿假单胞菌及/或流感嗜血杆菌的风险中。细菌继发感染进一步增加了流感感染的发病率和死亡率。
三种类型的流感病毒影响人受试者，即A型、B型及C型。通常，所述病毒经由来自咳嗽或喷嚏的气体扩散。据信这主要在相对较短距离内发生。其也可通过接触由所述病毒污染的表面且接着接触嘴或眼睛来扩散。人在其显示症状时之前及期间可传染其他人。感染可通过针对所述病毒测试喉咙、痰液或鼻子经确认。可获得多种快速测试；然而，即使结果为阴性，人们仍可具有感染。检测病毒的RNA的一种类型的聚合酶链反应可用于诊断流感感染。
II.本公开的缀合物
本文提供可用于治疗病毒感染(例如，流感感染)的合成缀合物。本文所公开的缀合物包括缀合于一种或多种神经氨酸酶抑制剂单体或两种神经氨酸酶抑制剂(例如，选自扎那米韦、磺基扎那米韦、帕拉米韦、A-315675或其类似物的神经氨酸酶抑制剂)的一种或多种二聚体的Fc结构域或白蛋白。两种神经氨酸酶抑制剂的二聚体包括一种神经氨酸酶抑制剂(例如，式(A-I)、(A-II)、(A-III)、(A-IV)、(A-V)、(A-VI)、(A-VII)、(A-VIII)、(A-IX)、(A-X)、(A-XI)、(A-XII)或(A-XIII)的第一神经氨酸酶抑制剂)及第二神经氨酸酶抑制剂(例如，式(A-I)、(A-II)、(A-III)、(A-IV)、(A-V)、(A-VI)、(A-VII)、(A-VIII)、(A-IX)、(A-X)、(A-XI)、(A-XII)或(A-XIII)的第二神经氨酸酶抑制剂)。所述第一及第二神经氨酸酶抑制剂借助于接头彼此连接。不受理论束缚，在一些方面中，本文所述的缀合物经由所述缀合物中的神经氨酸酶抑制剂部分与病毒粒子的表面上的蛋白质之间的相互作用结合于所述病毒粒子的表面(例如，结合于流感病毒粒子上的表面上的病毒神经氨酸酶)。神经氨酸酶抑制剂破坏神经氨酸酶，神经氨酸酶为包膜糖蛋白，其在受感染宿主细胞的表面上裂解聚糖结构中的唾液酸(即，末端神经胺糖酸残基)，从而释放后代病毒且允许所述病毒自所述宿主细胞扩散至未受感染周围细胞。
本发明缀合物包括缀合于Fc结构域、Fc单体或Fc结合肽的神经氨酸酶抑制剂单体及二聚体。本文所述的缀合物中的Fc结构域结合于免疫细胞上的FcγR(例如，FcRn、FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIc、FcγRIIIa及FcγRIIIb)。本文所述的缀合物中的Fc结构域结合于免疫细胞上的FcγR会活化吞噬作用及效应子功能，诸如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，因此导致免疫细胞吞没及破坏病毒粒子且进一步增强所述缀合物的抗病毒活性。
本发明缀合物包含缀合于白蛋白或白蛋白结合肽的神经氨酸酶抑制剂单体及二聚体。所述白蛋白或白蛋白结合肽可例如通过使白蛋白结合于再循环的新生儿Fc受体而延长所述缀合物的半衰期。
本文所提供的缀合物由式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者描述。在一些实施方案中，本文所述的缀合物包含缀合于Fc结构域或白蛋白的神经氨酸酶抑制剂的一种或多种单体。在一些实施方案中，本文所述的缀合物包含缀合于Fc结构域或白蛋白的神经氨酸酶抑制剂的一种或多种二聚体。在一些实施方案中，当n为2时，E(Fc结构域单体)二聚以形成Fc结构域。
本文所述的缀合物可使用本领域中可获得的化学合成技术来合成。在无法获得用于缀合的官能团的情况下，分子可使用本领域中熟知的常规化学合成技术衍生化。在一些实施方案中，本文所述的缀合物含有一个或多个手性中心。所述缀合物包括经分离立体异构体形式中每一者，以及不同手性纯度程度的立体异构体的混合物，包括外消旋混合物。其也涵盖可形成的各种非对映异构体、对映异构体及互变异构体。
神经氨酸酶抑制剂
本文所述的缀合物的组分为流感病毒神经氨酸酶抑制剂部分。流感病毒神经氨酸酶抑制剂破坏神经氨酸酶，神经氨酸酶为包膜糖蛋白，其在受感染宿主细胞的表面上裂解聚糖结构中的唾液酸(即，末端神经胺糖酸残基)，从而释放后代病毒且允许所述病毒自所述宿主细胞扩散至未受感染周围细胞。流感病毒神经氨酸酶抑制剂的实例包括扎那米韦(Relenza)、磺基扎那米韦、A-315675及帕拉米韦。此外，扎那米韦、磺基扎那米韦、A-315675及帕拉米韦的衍生物(诸如文献中发现的那些)具有神经氨酸酶抑制剂活性且可用作本文化合物的神经氨酸酶抑制剂部分(参见，例如，Hadházi等人A sulfozanamivir analoguehas potent anti-influenza virus activity.ChemMedChem Comm.13:785-789(2018)及In vitro characterization of A-315675,a highly potent inhibitor of A and Bstrain of influenza virus neuraminidases and influenza virusreplication.Antimicrobial Agents and Chemotherapy 46(4):1014-1021(2002))。
本文所述的缀合物分为两种类型：(1)缀合于Fc结构域或白蛋白的神经氨酸酶抑制剂的一种或多种二聚体及(2)缀合于Fc结构域或白蛋白的神经氨酸酶抑制剂的一种或多种单体。神经氨酸酶抑制剂的二聚体借助于接头(诸如本文所述的接头)彼此连接。
本发明的病毒神经氨酸酶抑制剂包括扎那米韦、磺基扎那米韦、A-315675、帕拉米韦及其类似物，诸如式(A-I)-(A-XIII)的病毒神经氨酸酶抑制剂：
Figure BDA0003630331990002921
Figure BDA0003630331990002931
其中R1选自-OH、-NH2、-NHC(＝NH)NH2及-NHC(＝NH)NHR6；R2及R3各自独立地选自-H、-OH、-F、-Cl及-Br；R4选自-CO2H、-P(＝O)(OH)2、-SO3H；R5选自-COCH3、-COCF3、-SO2CH3；X选自-O-及-S-；Y选自
Figure BDA0003630331990002941
R6选自
Figure BDA0003630331990002942
Figure BDA0003630331990002943
R7选自H、C1-C20烷基、C3-C20环烷基、C3-C20杂环烷基；C5-C15芳基及C2-C15杂芳基；R8选自C3-C20杂环烷基、C5-C15芳基及C2-C15杂芳基；R9选自-H、卤素(例如，Cl、F或Br)、-OR10、-NHC(＝O)R7、任选取代的C1-C20烷基、C3-C20环烷基、C3-C20杂环烷基；C5-C15芳基及C2-C15杂芳基；且R10选自C1-C20烷基、C3-C20环烷基、C3-C20杂环烷基；C5-C15芳基及C2-C15杂芳基。最优选地，式(A-I)、(A-II)、(A-III)、(A-IV)、(A-V)、(A-VI)、(A-VII)、(A-VIII)、(A-IX)、(A-X)、(A-XI)、(A-XII)或(A-XIII)的病毒神经氨酸酶抑制剂经由Y共价附接于所述缀合物。
优选地，所述病毒神经氨酸酶抑制剂选自扎那米韦、磺基扎那米韦、帕拉米韦或A-315675：
Figure BDA0003630331990002951
连接于Fc结构域或白蛋白的神经氨酸酶抑制剂的二聚体的缀合物
本文所述的缀合物包括共价连接于神经氨酸酶抑制剂的一种或多种二聚体的Fc结构域、Fc单体、Fc结合肽、白蛋白或白蛋白结合肽。两种神经氨酸酶抑制剂的二聚体包含第一神经氨酸酶抑制剂(例如，式(A-I)-(A-XIII)的第一病毒神经氨酸酶抑制剂)及第二神经氨酸酶抑制剂(例如，式(A-I)-(A-XIII)的第二病毒神经氨酸酶抑制剂)。所述第一及第二神经氨酸酶抑制剂借助于接头(诸如本文所述的接头)彼此连接。在神经氨酸酶抑制剂的二聚体的一些实施方案中，所述第一及第二神经氨酸酶抑制剂为相同的。在一些实施方案中，所述第一及第二神经氨酸酶抑制剂为不同的。
神经氨酸酶抑制剂的二聚体包括扎那米韦或其类似物(例如，(A-I)、(A-II)、(A-VI)、(A-VII)、(A-VIII)、(A-IX)、(A-X)或(A-XIII))的均二聚体。例如，本发明的神经氨酸酶抑制剂二聚体包括具有结构A1-L-A2的二聚体，其中每个A1及每个A2选自(A-I)、(A-II)、(A-VI)、(A-VII)、(A-VIII)、(A-IX)、(A-X)及(A-XIII)。
神经氨酸酶抑制剂的二聚体包括帕拉米韦或其类似物(例如，(A-III)、(A-IV)或(A-V))的均二聚体。例如，本发明的神经氨酸酶抑制剂二聚体包括具有结构A1-L-A2的二聚体，其中每个A1及每个A2选自(A-III)、(A-IV)及(A-V)。
神经氨酸酶抑制剂的二聚体包括包含扎那米韦或其类似物及帕拉米韦或其类似物(例如，(A-I)-(A-XIII))的杂二聚体。例如，本发明的神经氨酸酶抑制剂二聚体包括具有结构A1-L-A2的二聚体，其中每个A1选自(A-I)、(A-II)、(A-VI)、(A-VII)、(A-VIII)、(A-IX)、(A-X)及(A-XIII)，且每个A2选自(A-III)、(A-IV)及(A-V)。
在一些实施方案中，当T大于1(例如，T为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)时，每个A1-L-A2可独立地经选择(例如，独立地选自本文所述的A1-L-A2结构中任一者)。在一些实施方案中，E可缀合于2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个不同的A1-L-A2部分。在一些实施方案中，E缀合于第一A1-L-A2部分及第二A1-L-A2部分。在一些实施方案中，第一A1-L-A2部分的A1及A2独立地选自式(A-III)-(A-V)中任一者：
Figure BDA0003630331990002961
且第二A1-L-A2部分的A1及A2独立地选自式(A-I)、(A-II)、(A-VI)、(A-VII)、(A-VIII)、(A-IX)、(A-X)或(A-XIII)中任一者：
Figure BDA0003630331990002971
在一些实施方案中，第一A1-L-A2部分特异性地缀合于E的赖氨酸残基(例如，E的表面暴露赖氨酸残基的氮原子)，且第二A1-L-A2部分特异性地缀合于E的半胱氨酸残基(例如，E的表面暴露半胱氨酸残基的硫原子)。在一些实施方案中，第一A1-L-A2部分特异性地缀合于E的半胱氨酸残基(例如，E的表面暴露半胱氨酸残基的硫原子)，且第二A1-L-A2部分特异性地缀合于E的赖氨酸残基(例如，E的表面暴露赖氨酸残基的氮原子)。
在一些实施方案中，本公开提供由以下各式描述的缀合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0003630331990002972
Figure BDA0003630331990002981
Figure BDA0003630331990002991
Figure BDA0003630331990003001
Figure BDA0003630331990003011
Figure BDA0003630331990003021
Figure BDA0003630331990003031
Figure BDA0003630331990003041
Figure BDA0003630331990003051
Figure BDA0003630331990003061
Figure BDA0003630331990003071
Figure BDA0003630331990003081
Figure BDA0003630331990003091
Figure BDA0003630331990003101
Figure BDA0003630331990003111
Figure BDA0003630331990003121
Figure BDA0003630331990003131
Figure BDA0003630331990003141
Figure BDA0003630331990003151
Figure BDA0003630331990003161
Figure BDA0003630331990003171
Figure BDA0003630331990003181
Figure BDA0003630331990003191
Figure BDA0003630331990003201
Figure BDA0003630331990003211
Figure BDA0003630331990003221
Figure BDA0003630331990003231
Figure BDA0003630331990003241
Figure BDA0003630331990003251
或其药学上可接受的盐。
在本文所述的缀合物中，连接至E的波浪线指示神经氨酸酶抑制剂的一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种)二聚体可附接于Fc结构域单体、Fc结构域、Fc结合肽、白蛋白或白蛋白结合肽。在一些实施方案中，当n为1时，神经氨酸酶抑制剂的一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)二聚体可附接于Fc结构域单体、Fc结构域、Fc结合肽、白蛋白或白蛋白结合肽。在一些实施方案中，当n为2时，神经氨酸酶抑制剂的一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种)二聚体可附接于Fc结构域。本文所述的缀合物中的波浪线不应解释为神经氨酸酶抑制剂的一种或多种二聚体与Fc结构域或白蛋白中的原子之间的单键。在一些实施方案中，当T为1时，神经氨酸酶抑制剂的一种二聚体可附接于Fc结构域单体、Fc结构域、Fc结合肽、白蛋白或白蛋白结合肽中的原子。在一些实施方案中，当T为2时，神经氨酸酶抑制剂的两种二聚体可附接于Fc结构域单体、Fc结构域、Fc结合肽、白蛋白或白蛋白结合肽中的原子。
如本文进一步描述，本文所述的缀合物中的接头(例如，L或L’)可为分支链结构。如本文进一步描述，本文所述的缀合物中的接头(例如，L或L’)可为多价结构，例如分别具有两个或三个臂的二价或三价结构。在一些实施方案中，当所述接头具有三个臂时，所述臂中的两者可附接于第一及第二神经氨酸酶抑制剂且第三个臂可附接于Fc结构域单体、Fc结构域、Fc结合肽、白蛋白或白蛋白结合肽。
在如由以上各式表示的具有共价连接于神经氨酸酶抑制剂的一种或多种二聚体的Fc结构域的缀合物中，当n为2时，两个Fc结构域单体(每个Fc结构域单体由E表示)二聚以形成Fc结构域。
连接于Fc结构域或白蛋白的神经氨酸酶抑制剂的单体的缀合物
在一些实施方案中，本文所述的缀合物包括共价连接于神经氨酸酶抑制剂的一种或多种单体的Fc结构域单体、Fc结构域、Fc结合肽、白蛋白或白蛋白结合肽。Fc结构域单体或白蛋白及神经氨酸酶抑制剂的一种或多种单体的缀合物可通过经由接头(诸如本文所述的任何接头)使所述Fc结构域或白蛋白连接于神经氨酸酶抑制剂的各单体来形成。
在本文所述的具有共价连接于神经氨酸酶抑制剂的一种或多种单体的Fc结构域或白蛋白的缀合物中，连接于E的波浪线指示神经氨酸酶抑制剂的一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种)单体可附接于Fc结构域单体、Fc结构域、Fc结合肽、白蛋白或白蛋白结合肽。在一些实施方案中，当n为1时，神经氨酸酶抑制剂的一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)单体可附接于Fc结构域单体或白蛋白。在一些实施方案中，当n为2时，神经氨酸酶抑制剂的一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种)单体可附接于Fc结构域。本文所述的缀合物中的波浪线不应解释为神经氨酸酶抑制剂的一种或多种单体与Fc结构域单体、Fc结构域、Fc结合肽、白蛋白或白蛋白结合肽中的原子之间的单键。在一些实施方案中，当T为1时，神经氨酸酶抑制剂的一种单体可附接于Fc结构域单体、Fc结构域、Fc结合肽、白蛋白或白蛋白结合肽中的原子。在一些实施方案中，当T为2时，神经氨酸酶抑制剂的两种单体可附接于Fc结构域单体、Fc结构域、Fc结合肽、白蛋白或白蛋白结合肽中的原子。
在一些实施方案中，当T大于1(例如，T为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)时，每个A1-L可独立地经选择(例如，独立地选自本文所述的A1-L结构中任一者)。在一些实施方案中，E可缀合于2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个不同的A1-L部分。在一些实施方案中，E缀合于第一A1-L部分及第二A1-L部分。在一些实施方案中，第一A1-L部分的A1选自式(A-III)-(A-V)中任一者：
Figure BDA0003630331990003281
且第二A1-L部分的A1选自式(A-I)、(A-II)、(A-VI)、(A-VII)、(A-VIII)、(A-IX)、(A-X)或(A-XIII)中任一者：
Figure BDA0003630331990003282
在一些实施方案中，第一A1-L部分特异性地缀合于E的赖氨酸残基(例如，E的表面暴露赖氨酸残基的氮原子)，且第二A1-L部分特异性地缀合于E的半胱氨酸残基(例如，E的表面暴露半胱氨酸残基的硫原子)。在一些实施方案中，第一A1-L部分特异性地缀合于E的半胱氨酸残基(例如，E的表面暴露半胱氨酸残基的硫原子)，且第二A1-L部分特异性地缀合于E的赖氨酸残基(例如，E的表面暴露赖氨酸残基的氮原子)。
如本文进一步描述，本文所述的具有共价连接于神经氨酸酶抑制剂的一种或多种单体的Fc结构域单体、Fc结构域、Fc结合肽、白蛋白或白蛋白结合肽的缀合物中的接头(例如，L或L’)可为具有两个臂的二价结构。二价接头中的一个臂可附接于神经氨酸酶抑制剂的单体且另一臂可附接于Fc结构域单体、Fc结构域、Fc结合肽、白蛋白或白蛋白结合肽。
在一些实施方案中，本文所提供的含有共价连接于神经氨酸酶抑制剂的一种或多种单体的Fc结构域单体、Fc结构域、Fc结合肽、白蛋白或白蛋白结合肽的缀合物由以下各式中任一者描述：
Figure BDA0003630331990003291
Figure BDA0003630331990003301
Figure BDA0003630331990003311
Figure BDA0003630331990003321
Figure BDA0003630331990003331
Figure BDA0003630331990003341
Figure BDA0003630331990003351
Figure BDA0003630331990003361
Figure BDA0003630331990003371
Figure BDA0003630331990003381
Figure BDA0003630331990003391
Figure BDA0003630331990003401
Figure BDA0003630331990003411
Figure BDA0003630331990003421
Figure BDA0003630331990003431
Figure BDA0003630331990003441
Figure BDA0003630331990003451
Figure BDA0003630331990003461
Figure BDA0003630331990003471
Figure BDA0003630331990003481
Figure BDA0003630331990003491
Figure BDA0003630331990003501
Figure BDA0003630331990003511
Figure BDA0003630331990003521
Figure BDA0003630331990003531
Figure BDA0003630331990003541
Figure BDA0003630331990003551
Figure BDA0003630331990003561
Figure BDA0003630331990003571
Figure BDA0003630331990003581
或其药学上可接受的盐。
在如由以上各式表示的具有共价连接于神经氨酸酶抑制剂的一种或多种单体的Fc结构域的缀合物中，当n为2时，两个Fc结构域单体(每个Fc结构域单体由E表示)二聚以形成Fc结构域。
包含扎那米韦或其类似物的缀合物的区域异构体
缀合物(例如，如本文中详细描述的单体或二聚体缀合物)可以混合物或区域异构体形式产生。出于诸如容易合成、热稳定性、氧化稳定性、药代动力学(例如，代谢稳定性或生物可用性)、效应子结合或治疗功效的原因，特定区域异构体或区域异构体的混合物可为优选的。
在一些实施方案中，本发明缀合物包含扎那米韦或其类似物(例如，(A-I)、(A-II)、(A-VI)、(A-VII)、(A-VIII)、(A-IX)、(A-X)或(A-XIII)中任一者)。扎那米韦或其类似物可经由例如C7位置(参见例如，(A-I)、(A-II)、(A-X)或(A-XIII))或经由C9位置(参见例如，(A-VI)或(A-VII))缀合于Fc结构域或白蛋白(例如，借助于接头)：
Figure BDA0003630331990003591
Figure BDA0003630331990003601
本公开包括单体缀合物群体(例如，式(M-I)缀合物群体)，其中所述缀合物群体包括本文所述的单体缀合物中任一者及一种或多种其相应区域异构体。例如，缀合物群体可包括(1)在C7位置缀合(例如，借助于接头)于Fc结构域或白蛋白的扎那米韦或其类似物，及(2)在C9位置缀合(例如，借助于接头)于Fc结构域或白蛋白的扎那米韦或其类似物。单体缀合物群体可具有规定的C7连接缀合物:C9连接缀合物比率。例如，缀合物群体可具有实质上100％C-7连接缀合物及实质上0％C-9连接缀合物。缀合物群体可具有约95％C-7连接缀合物及约5％C-9连接缀合物。缀合物群体可具有约90％C-7连接缀合物及约10％C-9连接缀合物。缀合物群体可具有约85％C-7连接缀合物及约15％C-9连接缀合物。缀合物群体可具有约80％C-7连接缀合物及约20％C-9连接缀合物。缀合物群体可具有约75％C-7连接缀合物及约25％C-9连接缀合物。缀合物群体可具有约70％C-7连接缀合物及约30％C-9连接缀合物。缀合物群体可具有约65％C-7连接缀合物及约35％C-9连接缀合物。缀合物群体可具有约60％C-7连接缀合物及约40％C-9连接缀合物。缀合物群体可具有约55％C-7连接缀合物及约45％C-9连接缀合物。缀合物群体可具有约50％C-7连接缀合物及约50％C-9连接缀合物。缀合物群体可具有约45％C-7连接缀合物及约55％C-9连接缀合物。缀合物群体可具有约40％C-7连接缀合物及约60％C-9连接缀合物。缀合物群体可具有约35％C-7连接缀合物及约65％C-9连接缀合物。缀合物群体可具有约30％C-7连接缀合物及约70％C-9连接缀合物。缀合物群体可具有约25％C-7连接缀合物及约75％C-9连接缀合物。缀合物群体可具有约20％C-7连接缀合物及约80％C-9连接缀合物。缀合物群体可具有约15％C-7连接缀合物及约85％C-9连接缀合物。缀合物群体可具有约10％C-7连接缀合物及约90％C-9连接缀合物。缀合物群体可具有实质上0％C-7连接缀合物及实质上100％C-9连接缀合物。缀合物群体可具有大于99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、60％、65％、60％、55％或50％C7连接缀合物。
缀合物群体可具有少于50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％C9连接缀合物。
本公开也包括二聚体缀合物群体(例如，式(D-I)缀合物群体)，其中所述缀合物群体包括本文所述的二聚体缀合物中任一者及一种或多种其相应区域异构体。例如，缀合物群体可包括(1)C7-C7二聚体(例如，所述二聚体的扎那米韦或其类似物部分在其各自C7位置缀合(例如，借助于接头)于Fc结构域或白蛋白)，(2)C9-C9二聚体(例如，所述二聚体的扎那米韦或其类似物部分在其各自C9位置缀合(例如，借助于接头)于Fc结构域或白蛋白)，及/或(3)C7-C7二聚体(例如，一个扎那米韦或其类似物部分经由其C7位置缀合(例如，借助于接头)于Fc结构域或白蛋白且另一扎那米韦或其类似物部分经由其C9位置缀合(例如，借助于接头)于Fc结构域或白蛋白)。
二聚体缀合物群体可具有规定的C7-C7连接缀合物:C7-C9连接缀合物:C9-C9连接缀合物比率。例如，缀合物群体可具有实质上100％C7-C7连接缀合物及实质上0％C7-C9或C9-C9连接缀合物。缀合物群体可具有实质上100％C9-C9连接缀合物及实质上0％C7-C7或C7-C9连接缀合物。缀合物群体可具有实质上100％C7-C9连接缀合物及实质上0％C7-C7或C9-C9连接缀合物。
缀合物群体可具有大于99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、60％、65％、60％、55％或50％C7-C7连接缀合物。
缀合物群体可具有少于50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％C9-C9连接缀合物。
缀合物群体可具有少于50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％C7-C9连接缀合物。
关于上述区域异构体群体中任一者，(例如，(M-I)或(D-I)中的)A1及/或A2可选自扎那米韦或本文所述的扎那米韦类似物中任一者(例如，(A-I)、(A-II)、(A-VI)、(A-VII)、(A-VIII)、(A-IX)、(A-X)或(A-XIII)中任一者)。具体地说，C7连接扎那米韦或其类似物是由(A-I)、(A-II)、(A-X)及(A-XIII)描述，且C9连接扎那米韦或其类似物是由(A-VI)或(A-VII)描述。用于制备区域异构体(例如，C7、C9、C7-C7、C7-C9及C9-C9连接区域异构体)的例示性方法描述于实施例100-103、123及124中。在一些情况下，具有95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多或实质上100％C7连接单体缀合物或C7-C7连接二聚体缀合物可为优选的。在这些情况下，用实质上形成C7连接单体或C7-C7连接二聚体中间体的方法(诸如描述于例如实施例103及123中的方法)制备所述中间体可为优选的。实施例103的方法是主要用于获得C7或C7-C7连接中间体且可用于制备本文所述的任何中间体的例示性方法。在C9位置具有修饰(例如，除OH之外的取代基)的扎那米韦类似物(例如，由(A-XIII)描述的扎那米韦类似物)可以通过阻止自C7连接扎那米韦向C9连接扎那米韦的迁移来增加C7连接扎那米韦:C9连接扎那米韦的比率。例示性C9修饰扎那米韦类似物在本文中进行了描述(参见例如，由D-XI或M-XI描述的缀合物，例如缀合物47(Int-91)或缀合物48(Int-92))。
在优选实施方案中，所述缀合物为式(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者的缀合物，其中A1及/或A2由式(A-I)、(A-II)、(A-X)或(A-XIII)描述且Y为
Figure BDA0003630331990003621
其中R7选自H、C1-C20烷基、C3-C20环烷基、C3-C20杂环烷基；C5-C15芳基及C2-C15杂芳基。在优选实施方案中，A1及/或A2由式(A-I)描述(例如，扎那米韦)。在优选实施方案中，R7为C1-C20烷基(例如，-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3)。此类缀合物已显示出展现C7连接的稳定性增加，导致较少C7向C9迁移(参见例如，由D-II-6或D-II-7描述的缀合物，诸如缀合物45(Int-83)或缀合物46(Int-83))。因此，预期所得产物更加均质且展现增加的功效。优选缀合物更均质，具有增加比例的(例如，实质上纯的，诸如大于95％、96％、97％、98％或99％纯的)C7连接扎那米韦，且保留针对流感的功效。
III.Fc结构域单体及Fc结构域
Fc结构域单体包含铰链结构域、CH2抗体恒定结构域及CH3抗体恒定结构域。所述Fc结构域单体可具有免疫球蛋白抗体同种型IgG、IgE、IgM、IgA或IgD。所述Fc结构域单体也可具有任何免疫球蛋白抗体同种型(例如，IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgG4)。所述Fc结构域单体可具有任何免疫球蛋白抗体同种异型(例如，IGHG1*01(即，G1m(za))、IGHG1*07(即，G1m(zax))、IGHG1*04(即，G1m(zav))、IGHG1*03(G1m(f))、IGHG1*08(即，G1m(fa))、IGHG2*01、IGHG2*06、IGHG2*02、IGHG3*01、IGHG3*05、IGHG3*10、IGHG3*04、IGHG3*09、IGHG3*11、IGHG3*12、IGHG3*06、IGHG3*07、IGHG3*08、IGHG3*13、IGHG3*03、IGHG3*14、IGHG3*15、IGHG3*16、IGHG3*17、IGHG3*18、IGHG3*19、IGHG2*04、IGHG4*01、IGHG4*03或IGHG4*02)(如描述于例如Vidarsson等人IgG subclasses and allotypes:from structure toeffector function.Frontiers in Immunology.5(520):1-17(2014)中)。所述Fc结构域单体也可属任何物种，例如人、鼠科动物或小鼠。Fc结构域单体的二聚体是可结合于Fc受体的Fc结构域，所述Fc受体是位于白细胞表面上的受体。在一些实施方案中，本文所述的缀合物中的Fc结构域单体可相对于具有SEQ ID NO:1-138中任一者的序列的Fc结构域单体含有一种或多种氨基酸取代、添加及/或缺失。在一些实施方案中，如本文所述的缀合物中的Fc结构域单体中的Asn可由Ala置换以便预防N连接的糖基化(参见例如，SEQ ID NO:12-15，其中Asn至Ala取代用*标记)。在一些实施方案中，本文所述的缀合物中的Fc结构域单体也可含有额外Cys添加(参见例如，SEQ ID NO:9、10及11，其中Cys添加用*标记)。
在一些实施方案中，如本文所述的缀合物中的Fc结构域单体包含附接于Fc结构域单体的N端或C端的额外部分，例如白蛋白结合肽、纯化肽(例如，六组氨酸肽HHHHHH(SEQ IDNO:146))或信号序列(例如，IL2信号序列MYRMQLLSCIALSLALVTNS(SEQ ID NO:147))。在一些实施方案中，所述缀合物中的Fc结构域单体不含任何类型的抗体可变区，例如VH、VL、互补决定区(CDR)或高变区(HVR)。
在一些实施方案中，如本文所述的缀合物中的Fc结构域单体可具有与下文所示的SEQ ID NO:1-138中任一者的序列至少95％相同(例如，97％、99％或99.5％相同)的序列。在一些实施方案中，如本文所述的缀合物中的Fc结构域单体可具有下文所示的SEQ ID NO:1-138中任一者的序列。
SEQ ID NO:1：N端(粗体)具有IL2信号序列的鼠科动物Fc-IgG2a
Figure BDA0003630331990003641
SEQ ID NO:2：成熟鼠科动物Fc-IgG2a
PRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
SEQ ID NO:3：N端(粗体)具有IL2信号序列且添加有N端MVRS氨基酸残基(加下划线)的人Fc-IgG1
Figure BDA0003630331990003651
SEQ ID NO:4：添加有N端MVRS氨基酸残基(加下划线)的成熟人Fc-IgG1
MVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:5：N端具有IL2信号序列(粗体)且C端具有六组氨酸肽(斜体)的鼠科动物Fc-IgG2a
Figure BDA0003630331990003652
SEQ ID NO:6：C端具有六组氨酸肽(斜体)的成熟鼠科动物Fc-IgG2a
Figure BDA0003630331990003661
SEQ ID NO:7：N端具有IL2信号序列(粗体)、添加有N端MVRS氨基酸残基(加下划线)且C端具有六组氨酸肽(斜体)的人Fc-IgG1
Figure BDA0003630331990003662
SEQ ID NO:8：C端具有六组氨酸肽(斜体)且添加有N端MVRS氨基酸残基(加下划线)的成熟人Fc-IgG1
Figure BDA0003630331990003663
SEQ ID NO:9：N端具有IL2信号序列(粗体)、添加有N端MVRS氨基酸残基(加下划线)、铰链区中具有两个额外半胱氨酸(*)且C端具有六组氨酸肽(斜体)的人Fc-IgG1
Figure BDA0003630331990003664
Figure BDA0003630331990003671
SEQ ID NO:10：添加有N端MVRS氨基酸残基(加下划线)、铰链区中具有两个额外半胱氨酸(*)且C端具有六组氨酸肽(斜体)的成熟人Fc-IgG1
Figure BDA0003630331990003672
SEQ ID NO:11：添加有N端MVRS氨基酸残基(加下划线)且铰链区中具有两个额外半胱氨酸(*)的成熟人Fc-IgG1
MVRSDKTHTCPPCPPC*KC*PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:12：N端具有IL2信号序列(粗体)、具有Asn至Ala取代(*)且C端具有六组氨酸肽(斜体)的鼠科动物Fc-IgG2a
Figure BDA0003630331990003673
Figure BDA0003630331990003681
SEQ ID NO:13：具有Asn至Ala取代(*)且C端具有六组氨酸肽(斜体)的成熟鼠科动物Fc-IgG2a
Figure BDA0003630331990003682
SEQ ID NO:14：N端具有IL2信号序列(粗体)、添加有N端MVRS氨基酸残基(加下划线)、具有Asn至Ala取代(*)且C端具有六组氨酸肽(斜体)的人Fc-IgG1
Figure BDA0003630331990003683
SEQ ID NO:15：具有Asn至Ala取代(*)、添加有N端MVRS氨基酸残基(加下划线)且C端具有六组氨酸肽(斜体)的成熟人Fc-IgG1
Figure BDA0003630331990003684
Figure BDA0003630331990003691
SEQ ID NO:16：N端具有人血清白蛋白信号序列(粗体)且添加有N端ISAMVRS氨基酸残基(加下划线)的人IgG1 Fc
Figure BDA0003630331990003692
SEQ ID NO:17：N端具有人血清白蛋白信号序列(粗体)、添加有N端ISAMVRS氨基酸残基(加下划线)、具有C端G4S接头(斜体)且具有C端c-Myc标签(加下划线、斜体)的人IgG1Fc
Figure BDA0003630331990003693
SEQ ID NO:18：添加有N端ISAMVRS氨基酸残基(加下划线)、具有C端G4S接头(斜体)且具有C端c-Myc标签(加下划线、斜体)的成熟人IgG1 Fc
Figure BDA0003630331990003694
Figure BDA0003630331990003701
SEQ ID NO:19：具有人血清白蛋白信号序列(粗体)、添加有N端ISAMVRS氨基酸残基(加下划线)且具有赖氨酸至丝氨酸修饰(*)以预防此位点处的赖氨酸缀合的人IgG1 Fc
Figure BDA0003630331990003702
SEQ ID NO:20：添加有N端ISAMVRS氨基酸残基(加下划线)且具有赖氨酸至丝氨酸修饰(*)以预防此位点处的赖氨酸缀合的成熟人IgG1 Fc
ISAMVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPS*DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:21：N端具有人血清白蛋白信号序列(粗体)、添加有N端ISAMVRS氨基酸残基(加下划线)、具有赖氨酸至丝氨酸修饰(*)以预防此位点处的赖氨酸缀合、具有C端G4S接头(斜体)且具有C端C-Myc标签(加下划线、斜体)的人IgG1 Fc
Figure BDA0003630331990003711
SEQ ID NO:22：添加有N端ISAMVRS氨基酸残基(加下划线)、具有赖氨酸至丝氨酸修饰(*)以预防此位点处的赖氨酸缀合、具有C端G4S接头(斜体)且具有C端C-Myc标签(加下划线、斜体)的成熟人IgG1 Fc
Figure BDA0003630331990003712
SEQ ID NO:23：N端具有人血清白蛋白信号序列(粗体)、添加有N端ISAMVRS氨基酸残基(加下划线)、具有Asn至Ala取代(*)、具有C端G4S接头(斜体)且具有C端C-myc标签(加下划线、斜体)的人IgG1 Fc
Figure BDA0003630331990003713
Figure BDA0003630331990003721
SEQ ID NO:24：添加有N端ISAMVRS氨基酸残基(加下划线)、具有Asn至Ala取代(*)、具有C端G4S接头(斜体)且具有C端C-myc标签(加下划线、斜体)的成熟人IgG1 Fc
Figure BDA0003630331990003722
SEQ ID NO:25：N端具有人血清白蛋白信号序列(粗体)、添加有N端ISAMVRS氨基酸残基(加下划线)、具有H310A(*)及H435A(*)突变以妨碍FcRn结合、具有C端G4S(斜体)且具有C端C-myc标签(加下划线、斜体)的人IgG1 Fc
Figure BDA0003630331990003723
SEQ ID NO:26：N端具有人血清白蛋白信号序列(粗体)、添加有N端ISAMVRS氨基酸残基(加下划线)、具有H310A(*)及H435A(*)突变以妨碍FcRn结合、具有C端G4S(斜体)且具有C端C-myc标签(加下划线、斜体)的成熟人IgG1 Fc
Figure BDA0003630331990003724
Figure BDA0003630331990003731
SEQ ID NO:27：N端具有人血清白蛋白信号序列(粗体)、添加有N端ISAMVRS氨基酸残基(加下划线)、具有C端G4S接头(斜体)且具有C端突变型(赖氨酸至苯丙氨酸，粗体)C-myc标签(加下划线、斜体)的人IgG1 Fc
Figure BDA0003630331990003732
SEQ ID NO:28：添加有N端ISAMVRS氨基酸残基(加下划线)、具有C端G4S接头(斜体)且具有C端突变型(赖氨酸至苯丙氨酸，粗体)C-myc标签(加下划线、斜体)的成熟人IgG1Fc
Figure BDA0003630331990003733
SEQ ID NO:29：N端具有人血清白蛋白信号序列(粗体)、添加有N端ISAMVRS氨基酸残基(加下划线)、具有Asn至Ala取代(*)、具有C端G4S接头(斜体)且具有C端突变型(赖氨酸至苯丙氨酸，粗体)C-myc标签(加下划线、斜体)的人IgG1 Fc
Figure BDA0003630331990003741
SEQ ID NO:30：添加有N端MVRS氨基酸残基(加下划线)、具有Asn至Ala取代(*)、具有C端G4S接头(斜体)且具有C端突变型(赖氨酸至苯丙氨酸，粗体)C-myc标签(加下划线、斜体)的成熟人IgG1 Fc
Figure BDA0003630331990003742
SEQ ID NO:31：N端具有人血清白蛋白信号序列(粗体)、具有同种异型G1m(fa)(粗斜体)、具有C端G4S接头(斜体)且具有C端突变型(赖氨酸至苯丙氨酸，粗体)C-myc标签(加下划线)的人IgG1 Fc
Figure BDA0003630331990003743
SEQ ID NO:32：N端具有人血清白蛋白信号序列(粗体)、具有同种异型G1m(fa)(粗斜体)的人IgG1 Fc
Figure BDA0003630331990003751
SEQ ID NO:33：具有YTE三重突变(粗体及加下划线)且添加有N端MVRS氨基酸残基(加下划线)的成熟人IgG1 Fc
Figure BDA0003630331990003752
SEQ ID NO:34：N端具有人血清白蛋白信号序列(粗体)、含有在成熟人IgG1 Fc的N端构成全铰链区的残基EPKSS(加下划线)、具有Cys至Ser取代(#)、具有同种异型G1m(fa)(粗斜体)的人IgG1 Fc
Figure BDA0003630331990003753
SEQ ID NO:35：N端具有鼠科动物IgG信号序列(粗体)、自成熟人IgG1 Fc的N端移除EPKSSD铰链残基、具有同种异型G1m(fa)(粗斜体)的人IgG1 Fc
Figure BDA0003630331990003761
SEQ ID NO:36：具有YTE三重突变(粗体及加下划线)、自成熟人IgG1 Fc的N端移除EPKSSD铰链残基、具有同种异型G1m(fa)(粗斜体)的成熟人IgG1 Fc
Figure BDA0003630331990003762
SEQ ID NO:37：具有LS双重突变(粗体及加下划线)、自成熟人IgG1 Fc的N端移除EPKSSD铰链残基、具有同种异型G1m(fa)(粗斜体)的成熟人IgG1 Fc
Figure BDA0003630331990003763
Figure BDA0003630331990003771
SEQ ID NO:38：N端具有人血清白蛋白信号序列(粗体)、具有YTE三重突变(粗体及加下划线)、具有同种异型G1m(fa)(粗斜体)、具有C端G4S接头(斜体)且具有C端C-myc标签(加下划线)的成熟人IgG1 Fc
Figure BDA0003630331990003772
SEQ ID NO:39：成熟人Fc IgG1，其中X1为Met或Tyr，X2为Ser或Thr，X3为Thr或Glu，X4为Asp或Glu，且X5为Leu或Met，X6为Met或Leu，且X7为Asn或Ser
Figure BDA0003630331990003773
SEQ ID NO:40：成熟人Fc IgG1，其中X4为Asp或Glu，且X5为Leu或Met
Figure BDA0003630331990003774
Figure BDA0003630331990003781
SEQ ID NO:41：具有YTE三重突变(粗体及加下划线)的成熟人Fc IgG1，且其中X4为Asp或Glu，且X5为Leu或Met
Figure BDA0003630331990003782
SEQ ID NO:42：具有YTE三重突变(粗体及加下划线)、具有同种异型G1m(fa)(粗斜体)的成熟人Fc IgG1
Figure BDA0003630331990003783
SEQ ID NO:43：具有YTE三重突变(粗体及加下划线)、具有同种异型G1m(f)(粗斜体)的成熟人Fc IgG1
Figure BDA0003630331990003784
Figure BDA0003630331990003791
SEQ ID NO:44：具有LS双重突变(粗体及加下划线)的成熟人Fc IgG1，且其中X4为Asp或Glu，且X5为Leu或Met
Figure BDA0003630331990003792
SEQ ID NO:45：具有LS双重突变(粗体及加下划线)、具有同种异型G1m(fa)(粗斜体)的成熟人Fc IgG1
Figure BDA0003630331990003793
SEQ ID NO:46：具有LS双重突变(粗体及加下划线)、具有同种异型G1m(f)(粗斜体)的成熟人Fc IgG1
Figure BDA0003630331990003794
SEQ ID NO:47：具有小鼠重链MIgG Vh信号序列(粗体)、具有Cys至Ser取代(#)的成熟人Fc IgG1，且其中X1为Met或Tyr，X2为Ser或Thr，X3为Thr或Glu，X4为Asp或Glu，且X5为Leu或Met，X6为Met或Leu，且X7为Asn或Ser
Figure BDA0003630331990003801
SEQ ID NO:48：具有小鼠重链MIgG Vh信号序列(粗体)、具有Cys至Ser取代(#)、具有同种异型G1m(fa)(粗斜体)的成熟人IgG1 Fc
Figure BDA0003630331990003802
SEQ ID NO:49：具有小鼠重链MIgG Vh信号序列(粗体)、具有Cys至Ser取代(#)、具有同种异型G1m(f)(粗斜体)的成熟人IgG1 Fc
Figure BDA0003630331990003803
Figure BDA0003630331990003811
SEQ ID NO:50：具有小鼠重链MIgG Vh信号序列(粗体)、具有Cys至Ser取代(#)、具有M428L、N434S突变(粗体/加下划线)、具有同种异型G1m(fa)(粗斜体)的成熟人IgG1 Fc
Figure BDA0003630331990003812
SEQ ID NO:51：具有小鼠重链MIgG Vh信号序列(粗体)、具有Cys至Ser取代(#)、具有M428L、N434S突变(粗体/加下划线)、具有同种异型G1m(f)(粗斜体)的成熟人IgG1 Fc
Figure BDA0003630331990003813
SEQ ID NO:52：具有小鼠重链MIgG Vh信号序列(粗体)、具有Cys至Ser取代(#)、具有YTE三重突变(粗体及加下划线)、具有同种异型G1m(fa)(粗斜体)的成熟人IgG1 Fc
Figure BDA0003630331990003814
Figure BDA0003630331990003821
SEQ ID NO:53：具有小鼠重链MIgG Vh信号序列(粗体)、具有Cys至Ser取代(#)、具有YTE三重突变(粗体及加下划线)、具有同种异型G1m(f)(粗斜体)的成熟人IgG1 Fc
Figure BDA0003630331990003822
SEQ ID NO:54：具有小鼠重链MIgG Vh信号序列(粗体)、添加有N端ISAMVRS氨基酸残基(斜体)、具有M428L、N434S突变(粗体/加下划线)、具有G4S接头(斜体)且具有C端C-myc-标签(加下划线)、具有同种异型G1m(f)(粗斜体)的成熟人IgG1 Fc
Figure BDA0003630331990003823
SEQ ID NO:55：具有小鼠重链MIgG Vh信号序列(粗体)、添加有N端ISAMVRS氨基酸残基(斜体)、具有M428L、N434S突变(粗体/加下划线)、具有G4S接头(斜体)、具有C端C-myc-标签(加下划线)、具有同种异型G1m(fa)(粗斜体)的成熟人IgG1 Fc
Figure BDA0003630331990003831
SEQ ID NO:56：具有小鼠重链MIgG Vh信号序列(粗体)、添加有N端ISAMVRS氨基酸残基(斜体)、具有YTE三重突变(粗体/加下划线)、具有G4S接头(斜体)且具有C端C-myc-标签(加下划线)、具有同种异型G1m(f)(粗斜体)的成熟人IgG1 Fc
Figure BDA0003630331990003832
SEQ ID NO:57：具有小鼠重链MIgG Vh信号序列(粗体)、添加有N端ISAMVRS氨基酸残基(斜体)、具有YTE三重突变体(粗体/加下划线)、具有G4S接头(斜体)、具有C端C-myc-标签(加下划线)、具有同种异型G1m(fa)(粗斜体)的成熟人IgG1 Fc
Figure BDA0003630331990003833
Figure BDA0003630331990003841
SEQ ID NO:58：具有小鼠重链MIgG1信号序列(粗体)、具有Cys至Ser取代(#)、具有C端G4S(斜体)且具有C端IgA肽(加下划线)、具有同种异型G1m(fa)(粗斜体)的成熟人IgG1
Figure BDA0003630331990003842
SEQ ID NO:59：具有小鼠重链MIgG1信号序列(粗体)、具有Cys至Ser取代(#)、具有M428L、N434S突变(粗体/加下划线)、具有C端G4S(斜体)且具有C端IgA肽(加下划线)、具有同种异型G1m(fa)(粗斜体)的成熟人IgG1
Figure BDA0003630331990003843
SEQ ID NO:60：成熟人Fc IgG1，Z1为Cys或Ser，且其中X1为Met或Tyr，X2为Ser或Thr，X3为Thr或Glu，X4为Asp或Glu，且X5为Leu或Met，X6为Met或Leu，且X7为Asn或Ser
Figure BDA0003630331990003851
SEQ ID NO:61：成熟人Fc IgG1，Cys至Ser取代(#)，且其中X1为Met或Tyr，X2为Ser或Thr，X3为Thr或Glu，X4为Asp或Glu，且X5为Leu或Met，X6为Met或Leu，且X7为Asn或Ser
Figure BDA0003630331990003852
SEQ ID NO:62：成熟人IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)，X4为Asp或Glu，且X5为Leu或Met
Figure BDA0003630331990003853
SEQ ID NO:63：成熟人IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)、同种异型G1m(f)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990003861
SEQ ID NO:64：成熟人IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)、同种异型G1m(fa)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990003862
SEQ ID NO:65：成熟人IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)、M428L、N434S突变(粗体/加下划线)、同种异型G1m(fa)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990003863
SEQ ID NO:66：成熟人IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)、M428L、N434S突变(粗体/加下划线)、同种异型G1m(f)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990003864
Figure BDA0003630331990003871
SEQ ID NO:67：成熟人IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)、YTE三重突变(粗体及加下划线)、同种异型G1m(fa)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990003872
SEQ ID NO:68：成熟人IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)、YTE三重突变(粗体及加下划线)、同种异型G1m(f)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990003873
SEQ ID NO:69：成熟人Fc IgG1，Z1为Cys或Ser，且其中X1为Met或Tyr，X2为Ser或Thr，X3为Thr或Glu，X4为Asp或Glu，且X5为Leu或Met，X6为Met或Leu，且X7为Asn或Ser
Figure BDA0003630331990003874
Figure BDA0003630331990003881
SEQ ID NO:70：成熟人Fc IgG1，Cys至Ser取代(#)，且其中X1为Met或Tyr，X2为Ser或Thr，X3为Thr或Glu，X4为Asp或Glu，且X5为Leu或Met，X6为Met或Leu，且X7为Asn或Ser
Figure BDA0003630331990003882
SEQ ID NO:71：成熟人IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)，X4为Asp或Glu，且X5为Leu或Met
Figure BDA0003630331990003883
SEQ ID NO:72：成熟人IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)、同种异型G1m(f)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990003884
Figure BDA0003630331990003891
SEQ ID NO:73：成熟人IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)、同种异型G1m(fa)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990003892
SEQ ID NO:74：成熟人IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)、M428L、N434S突变(粗体/加下划线)、同种异型G1m(fa)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990003893
SEQ ID NO:75：成熟人IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)、M428L、N434S突变(粗体/加下划线)、同种异型G1m(f)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990003894
Figure BDA0003630331990003901
SEQ ID NO:76：成熟人IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)、YTE三重突变(粗体及加下划线)、同种异型G1m(fa)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990003902
SEQ ID NO:77：成熟人IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)、YTE三重突变(粗体及加下划线)、同种异型G1m(f)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990003903
SEQ ID NO:78：成熟人Fc IgG1，Z1为Cys或Ser，且其中X1为Met或Tyr，X2为Ser或Thr，X3为Thr或Glu，X4为Asp或Glu，且X5为Leu或Met，X6为Met或Leu，且X7为Asn或Ser
Figure BDA0003630331990003904
SEQ ID NO:79：成熟人Fc IgG1，Cys至Ser取代(#)，且其中X1为Met或Tyr，X2为Ser或Thr，X3为Thr或Glu，X4为Asp或Glu，且X5为Leu或Met，X6为Met或Leu，且X7为Asn或Ser
Figure BDA0003630331990003911
SEQ ID NO:80：成熟人IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)，X4为Asp或Glu，且X5为Leu或Met
Figure BDA0003630331990003912
SEQ ID NO:81：成熟人IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)、同种异型G1m(f)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990003913
SEQ ID NO:82：成熟人IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)、同种异型G1m(fa)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990003921
SEQ ID NO:83：成熟人IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)、M428L、N434S突变(粗体/加下划线)、同种异型G1m(fa)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990003922
SEQ ID NO:84：成熟人IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)、M428L、N434S突变(粗体/加下划线)、同种异型G1m(f)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990003923
SEQ ID NO:85：成熟人IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)、YTE三重突变(粗体及加下划线)、同种异型G1m(fa)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990003924
Figure BDA0003630331990003931
SEQ ID NO:86：成熟人IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)、YTE三重突变(粗体及加下划线)、同种异型G1m(f)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990003932
SEQ ID NO:87：成熟人Fc IgG1，Z1为Cys或Ser，且其中X1为Met或Tyr，X2为Ser或Thr，X3为Thr或Glu，X4为Asp或Glu，且X5为Leu或Met，X6为Met或Leu，且X7为Asn或Ser
Figure BDA0003630331990003933
SEQ ID NO:88：成熟人Fc IgG1，Cys至Ser取代(#)，且其中X1为Met或Tyr，X2为Ser或Thr，X3为Thr或Glu，X4为Asp或Glu，且X5为Leu或Met，X6为Met或Leu，且X7为Asn或Ser
Figure BDA0003630331990003934
Figure BDA0003630331990003941
SEQ ID NO:89：成熟人IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)，X4为Asp或Glu，且X5为Leu或Met
Figure BDA0003630331990003942
SEQ ID NO:90：成熟人IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)、同种异型G1m(f)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990003943
SEQ ID NO:91：成熟人IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)、同种异型G1m(fa)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990003944
Figure BDA0003630331990003951
SEQ ID NO:92：成熟人IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)、M428L、N434S突变(粗体/加下划线)、同种异型G1m(fa)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990003952
SEQ ID NO:93：成熟人IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)、M428L、N434S突变(粗体/加下划线)、同种异型G1m(f)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990003953
SEQ ID NO:94：成熟人IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)、YTE三重突变(粗体及加下划线)、同种异型G1m(fa)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990003954
Figure BDA0003630331990003961
SEQ ID NO:95：成熟人IgG1 Fc，Cys至Ser取代(#)、YTE三重突变(粗体及加下划线)、同种异型G1m(f)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990003962
SEQ ID NO:96：成熟人Fc IgG1，J1为Asn或不存在，J2为Lys或不存在，Z1为Cys或Ser，且其中X1为Met或Tyr，X2为Ser或Thr，X3为Thr或Glu，X4为Asn或Ala，X5为Leu或Asp，X6为Gln或His，X7为Asp或Glu，且X8为Leu或Met，X9为Met或Leu，且X10为Asn或Ser
Figure BDA0003630331990003963
SEQ ID NO:97：成熟人Fc IgG1，Cys至Ser取代(#)，J1为Asn或不存在，J2为Lys或不存在，且其中X4为Asn或Ala，X5为Leu或Asp，X6为Gln或His，X7为Asp或Glu，且X8为Leu或Met，且X10为Asn或Ser
Figure BDA0003630331990003964
Figure BDA0003630331990003971
SEQ ID NO:98：成熟人Fc IgG1，Cys至Ser取代(#)，DHS三重突变(粗体及加下划线)，J1为Asn或不存在，J2为Lys或不存在，其中X4为Asn或Ala，X7为Asp或Glu，且X8为Leu或Met
Figure BDA0003630331990003972
SEQ ID NO:99：成熟人Fc IgG1，Cys至Ser取代(#)，DHS三重突变(粗体及加下划线)，其中X4为Asn或Ala，X7为Asp或Glu，且X8为Leu或Met
Figure BDA0003630331990003973
SEQ ID NO:100：成熟人Fc IgG1，Cys至Ser取代(#)，DHS三重突变(粗体及加下划线)，其中X7为Asp或Glu，且X8为Leu或Met
Figure BDA0003630331990003974
Figure BDA0003630331990003981
SEQ ID NO:101：成熟人Fc IgG1，Cys至Ser取代(#)、DHS三重突变(粗体及加下划线)、同种异型G1m(fa)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990003982
SEQ ID NO:102：成熟人Fc IgG1，Cys至Ser取代(#)、DHS三重突变(粗体及加下划线)、同种异型G1m(f)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990003983
SEQ ID NO:103：成熟人Fc IgG1，Cys至Ser取代(#)、DHS三重突变(粗体及加下划线)、同种异型G1m(fa)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990003984
Figure BDA0003630331990003991
SEQ ID NO:104：成熟人Fc IgG1，Cys至Ser取代(#)、DHS三重突变(粗体及加下划线)、同种异型G1m(f)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990003992
SEQ ID NO:105：成熟人Fc IgG1，Cys至Ser取代(#)、DHS三重突变(粗体及加下划线)、同种异型G1m(fa)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990003993
SEQ ID NO:106：成熟人Fc IgG1，Cys至Ser取代(#)、DHS三重突变(粗体及加下划线)、同种异型G1m(f)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990003994
SEQ ID NO:107：成熟人Fc IgG1，Cys至Ser取代(#)、DHS三重突变(粗体及加下划线)、同种异型G1m(fa)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990004001
SEQ ID NO:108：成熟人Fc IgG1，Cys至Ser取代(#)、DHS三重突变(粗体及加下划线)、同种异型G1m(f)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990004002
SEQ ID NO:109：成熟人Fc IgG1，Cys至Ser取代(#)，Asn至Ala取代(*)，DHS三重突变(粗体及加下划线)，其中X7为Asp或Glu且X8为Leu或Met
Figure BDA0003630331990004003
SEQ ID NO:110：成熟人Fc IgG1，Cys至Ser取代(#)，Asn至Ala取代(*)，DHS三重突变(粗体及加下划线)，同种异型G1m(fa)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990004011
SEQ ID NO:111：成熟人Fc IgG1，Cys至Ser取代(#)，Asn至Ala取代(*)，DHS三重突变(粗体及加下划线)，同种异型G1m(f)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990004012
SEQ ID NO:112：成熟人Fc IgG1，Cys至Ser取代(#)，Asn至Ala取代(*)，DHS三重突变(粗体及加下划线)，同种异型G1m(fa)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990004013
SEQ ID NO:113：成熟人Fc IgG1，Cys至Ser取代(#)，Asn至Ala取代(*)，DHS三重突变(粗体及加下划线)，同种异型G1m(f)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990004021
SEQ ID NO:114：成熟人Fc IgG1，Cys至Ser取代(#)，Asn至Ala取代(*)，DHS三重突变(粗体及加下划线)，同种异型G1m(fa)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990004022
SEQ ID NO:115：成熟人Fc IgG1，Cys至Ser取代(#)，Asn至Ala取代(*)，DHS三重突变(粗体及加下划线)，同种异型G1m(f)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990004023
SEQ ID NO:116：成熟人Fc IgG1，Cys至Ser取代(#)，Asn至Ala取代(*)，DHS三重突变(粗体及加下划线)，同种异型G1m(fa)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990004031
SEQ ID NO:117：成熟人Fc IgG1，Cys至Ser取代(#)，Asn至Ala取代(*)，DHS三重突变(粗体及加下划线)，同种异型G1m(f)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990004032
SEQ ID NO:118：成熟人Fc IgG1，J1为Asn或不存在，J2为Lys或不存在，且其中X4为Asn或Ala，X5为Leu或Asp，X6为Gln或His，X7为Asp或Glu，且X8为Leu或Met，且X10为Asn或Ser
Figure BDA0003630331990004033
SEQ ID NO:119：成熟人Fc IgG1，DHS三重突变(粗体及加下划线)，J1为Asn或不存在，J2为Lys或不存在，且其中X4为Asn或Ala，X7为Asp或Glu，且X8为Leu或Met
Figure BDA0003630331990004041
SEQ ID NO:120：成熟人Fc IgG1，DHS三重突变(粗体及加下划线)，其中X4为Asn或Ala，且X7为Asp或Glu，且X8为Leu或Met
Figure BDA0003630331990004042
SEQ ID NO:121：成熟人Fc IgG1，DHS三重突变(粗体及加下划线)，其中X7为Asp或Glu，且X8为Leu或Met
Figure BDA0003630331990004043
SEQ ID NO:122：成熟人Fc IgG1，DHS三重突变(粗体及加下划线)、同种异型G1m(fa)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990004051
SEQ ID NO:123：成熟人Fc IgG1，DHS三重突变(粗体及加下划线)、同种异型G1m(f)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990004052
SEQ ID NO:124：成熟人Fc IgG1，DHS三重突变(粗体及加下划线)、同种异型G1m(fa)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990004053
SEQ ID NO:125：成熟人Fc IgG1，DHS三重突变(粗体及加下划线)、同种异型G1m(f)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990004054
Figure BDA0003630331990004061
SEQ ID NO:126：成熟人Fc IgG1，DHS三重突变(粗体及加下划线)、同种异型G1m(fa)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990004062
SEQ ID NO:127：成熟人Fc IgG1，DHS三重突变(粗体及加下划线)、同种异型G1m(f)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990004063
SEQ ID NO:128：成熟人Fc IgG1，DHS三重突变(粗体及加下划线)、同种异型G1m(fa)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990004064
Figure BDA0003630331990004071
SEQ ID NO:129：成熟人Fc IgG1，DHS三重突变(粗体及加下划线)、同种异型G1m(f)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990004072
SEQ ID NO:130：成熟人Fc IgG1，Asn至Ala取代(*)，DHS三重突变(粗体及加下划线)，其中X7为Asp或Glu，且X8为Leu或Met
Figure BDA0003630331990004073
SEQ ID NO:131：成熟人Fc IgG1，Asn至Ala取代(*)、DHS三重突变(粗体及加下划线)、同种异型G1m(fa)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990004074
Figure BDA0003630331990004081
SEQ ID NO:132：成熟人Fc IgG1，Asn至Ala取代(*)、DHS三重突变(粗体及加下划线)、同种异型G1m(f)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990004082
SEQ ID NO:133：成熟人Fc IgG1，Asn至Ala取代(*)、DHS三重突变(粗体及加下划线)、同种异型G1m(fa)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990004083
SEQ ID NO:134：成熟人Fc IgG1，Asn至Ala取代(*)、DHS三重突变(粗体及加下划线)、同种异型G1m(f)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990004084
SEQ ID NO:135：成熟人Fc IgG1，Asn至Ala取代(*)、DHS三重突变(粗体及加下划线)、同种异型G1m(fa)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990004091
SEQ ID NO:136：成熟人Fc IgG1，Asn至Ala取代(*)、DHS三重突变(粗体及加下划线)、同种异型G1m(f)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990004092
SEQ ID NO:137：成熟人Fc IgG1，Asn至Ala取代(*)、DHS三重突变(粗体及加下划线)、同种异型G1m(fa)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990004093
SEQ ID NO:138：成熟人Fc IgG1，Asn至Ala取代(*)、DHS三重突变(粗体及加下划线)、同种异型G1m(f)(粗斜体)
Figure BDA0003630331990004094
Figure BDA0003630331990004101
如本文所定义，Fc结构域包含通过CH3抗体恒定结构域之间的相互作用以及在两个二聚化Fc结构域单体的铰链结构域之间形成的一个或多个二硫键来二聚化的两个Fc结构域单体。Fc结构域形成结合于Fc受体，例如Fc-γ受体(即，Fcγ受体(FcγR))、Fc-α受体(即，Fcα受体(FcαR))、Fc-ε受体(即，Fcε受体(FcεR))及/或新生儿Fc受体(FcRn)的最小结构。在一些实施方案中，本发明的Fc结构域结合于Fcγ受体(例如，FcRn、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)、FcγRIIb(CD32)、FcγRIIIa(CD16a)、FcγRIIIb(CD16b))及/或FcγRIV及/或新生儿Fc受体(FcRn)。
在一些实施方案中，本发明的Fc结构域单体或Fc结构域为无糖基化Fc结构域单体或Fc结构域(例如，维持衔接于Fc受体(例如，FcRn)的Fc结构域单体或Fc结构域)。例如，所述Fc结构域是维持衔接于Fc受体的无糖基化IgG1变体(例如，在糖基化基序的N297及/或T299处具有氨基酸取代的IgG1)。例示性无糖基化Fc结构域及用于制备无糖基化Fc结构域的方法为本领域中已知的，例如，如描述于Sazinsky S.L.等人,Aglycosylatedimmunoglobulin G1 variants pr oductively engage activating Fc receptors,PNAS,2008,105(51):20167-20172中，所述文献以其整体并入本文中。
在一些实施方案中，本发明的Fc结构域或Fc结构域单体经工程改造以增强与新生儿Fc受体(FcRn)的结合。例如，所述Fc结构域可包括对应于M252Y/S254T/T256E(YTE)的三重突变(例如IgG1，诸如具有YTE突变的人或人化IgG1，例如SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:56或SEQ ID NO:57)。所述Fc结构域可包括对应于M428L/N434S(LS)的双重突变体(例如IgG1，诸如具有LS突变的人或人化IgG1，诸如SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:59)。所述Fc结构域可包括对应于N434H的单一突变体(例如IgG1，诸如具有N434H突变的人或人化IgG1)。所述Fc结构域可包括对应于C220S的单一突变体(例如IgG1，诸如具有C220S突变的人或人化IgG1，诸如SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ IDNO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ IDNO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ IDNO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ IDNO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ IDNO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ IDNO:93、SEQ ID NO:94及SEQ ID NO:95)。所述Fc结构域可包括对应于C220S/L309D/Q311H/N434S(CDHS)的四重突变体(例如IgG1，诸如具有DHS突变的人或人化IgG1，诸如SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ IDNO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112、SEQ IDNO:113、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116及SEQ ID NO:117)。所述Fc结构域可包括对应于L309D/Q311H/N434S(DHS)的三重突变体(例如IgG1，诸如具有DHS突变的人或人化IgG1，诸如SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121、SEQ IDNO:122、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132、SEQ IDNO:133、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137及SEQ ID NO:138)。所述Fc结构域可包括增强与FcRn的结合的上述突变中的一种或多种的组合。增强的与FcRn的结合可增加含Fc结构域的缀合物的半衰期。例如，相对于具有不含增强FcRn结合的突变的相应Fc结构域的缀合物，增加与FcRn的结合的一种或多种氨基酸突变(例如，YTE突变、LS突变或N434H突变)的掺入可增加所述缀合物的半衰期达5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％或更高。具有增强的与FcRN的结合的例示性Fc结构域及用于制备具有增强的与FcRN的结合的Fc结构域的方法为本领域中已知的，例如，如描述于Maeda,A.等人,Identification of human IgG1variant with enhanced FcRn binding and without increased binding torheumatoid factor autoantibody,MABS,2017,9(5):844-853中，所述文献以其整体并入本文中。
如本文所用，应理解“对应于”(例如，特定SEQ ID NO.的)特定氨基酸残基的氨基酸包含本领域技术人员将理解与(例如，所述特定序列的)所述特定残基比对的任何氨基酸残基。例如，SEQ ID NO:1-138中任一者可通过使所述氨基酸序列的“对应残基”突变而发生突变以包括YTE突变、LS突变及/或N434H突变。
如本文所用，应理解“对应于”特定SEQ ID NO.的特定半胱氨酸残基的硫原子包括本领域技术人员将理解与所述特定序列的特定半胱氨酸比对的任何半胱氨酸残基的硫原子。人IgG1(UniProtKB:P01857；SEQ ID NO:142)、人IgG2(UniProtKB:P01859；SEQ ID NO:143)、人IgG3(UniProtKB:P01860；SEQ ID NO:144)及人IgG4(UniProtKB:P01861；SEQ IDNO:145)的蛋白质序列比对提供如下(用Clustal Omega多对比对对齐)。所述比对指示彼此“对应”的半胱氨酸残基(例如，半胱氨酸残基的硫原子)(在盒中且由·符号指示)。本领域技术人员将能够容易地执行与本发明的任何IgG变体的此种比对以确定半胱氨酸中对应于本文所述的特定SEQ ID NO.(例如，SEQ ID NO:1-138中任一者)的特定半胱氨酸的硫原子的硫原子。例如，本领域技术人员将能够容易地确定SEQ ID NO:10的Cys10(Fc结构域铰链区保守CPPC基序的第一半胱氨酸)对应于例如IgG1的Cys109、IgG2的Cys106、IgG3的Cys156、SEQ ID NO:1的Cys29、SEQ ID NO:2的Cys9、SEQ ID NO:3的Cys30或SEQ ID NO:10的Cys10。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:39-138中任一者的序列的本发明的Fc结构域或Fc结构域单体可进一步包括N端额外氨基酸(Xaa)x及/或C端额外氨基酸(Xaa)z，其中Xaa为任何氨基酸且x及z为大于或等于零的整数，一般地小于100，优选地小于10且更优选地为0、1、2、3、4或5。在一些实施方案中，所述额外氨基酸与SEQ ID NO:81的一个或多个连续氨基酸至少70％(例如，70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同。例如，所述额外氨基酸可为C端对应于IgG1(SEQ ID NO:119)的Lys330的单一氨基酸。
如本文所用，应理解“对应于”特定SEQ ID NO.的特定赖氨酸残基的氮原子包括本领域技术人员将理解与所述特定序列的特定赖氨酸比对的任何赖氨酸残基的氮原子。人IgG1(UniProtKB:P01857；SEQ ID NO:142)、人IgG2(UniProtKB:P01859；SEQ ID NO:143)、人IgG3(UniProtKB:P01860；SEQ ID NO:144)及人IgG4(UniProtKB:P01861；SEQ ID NO:145)的蛋白质序列比对提供如下(用Clustal Omega多对比对对齐)。所述比对指示彼此“对应”的赖氨酸残基(例如，赖氨酸残基的氮原子)(在盒中且由*符号指示)。本领域技术人员将能够容易地执行与本发明的任何IgG变体的此种比对以确定赖氨酸中对应于本文所述的特定SEQ ID NO.(例如，SEQ ID NO:1-138中任一者)的特定赖氨酸的任何氮原子的氮原子。例如，本领域技术人员将能够容易地确定SEQ ID NO:10的Lys35对应于例如IgG1的Lys129、IgG2的Lys126、IgG3的Lys176、SEQ ID NO:1的Lys51、SEQ ID NO:2的Lys31、SEQ ID NO:3的Lys50或SEQ ID NO:10的Lys30。
IgG1(SEQ ID NO:142)、IgG2(SEQ ID NO:143)、IgG3(SEQ ID NO:144)及IgG4(SEQID NO:145)的蛋白质序列比对
Figure BDA0003630331990004141
免疫细胞的活化
Fc-γ受体(FcγR)结合免疫球蛋白G(IgG)的Fc部分且在免疫活化及调节中发挥重要作用。例如，免疫复合物(IC)中的IgGFc结构域以高亲合力衔接FcγR，因此触发调节免疫细胞活化的信号传导级联。人FcγR家族含有数种活化受体(FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIc、FcγRIIIa及FcγRIIIb)及一种抑制受体(FcγRIIb)。FcγR信号传导通过细胞内结构域介导，所述细胞内结构域含有用于活化FcγR的免疫酪氨酸活化基序(ITAM)及用于抑制受体FcγRIIb的免疫酪氨酸抑制基序(ITIM)。在一些实施方案中，Fc结构域与FcγR的结合使Src家族激酶进行ITAM磷酸化；此活化Syk家族激酶且诱导包括PI3K及Ras路径的下游信号传导网路。
在本文所述的缀合物中，缀合物中包括神经氨酸酶抑制剂的单体或二聚体的部分结合于且抑制病毒神经氨酸酶，导致抑制病毒复制，而所述缀合物的Fc结构域部分结合于免疫细胞上的FcγR(例如，FcRn、FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIc、FcγRIIIa及FcγRIIIb)且活化吞噬作用及效应子功能，诸如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，因此导致由免疫细胞吞没及破坏病毒粒子且进一步增强所述缀合物的抗病毒活性。可通过本文所述的缀合物活化的免疫细胞的实例包括但不限于巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞、嗜碱细胞、淋巴细胞、滤泡性树突状细胞、自然杀伤细胞及肥大细胞。
组织分布
在进入体循环之后，治疗剂被分配到身体的组织。由于血液灌注、组织结合、区域pH值及细胞膜通透性的不同，分布通常不均匀。药物进入组织的速率取决于血液流向组织的速度、组织质量及血液与组织之间的分配特征。在血管丰富的区域，血液与组织之间的分布平衡(当进入及退出速率相同时)会更快地达到，除非跨细胞膜扩散是限速步骤。大小、形状、电荷、靶标结合、FcRn及靶标结合机制、施用途径以及配方都会影响组织分布。
在一些情况下，可优化本文所述的缀合物以分布至肺组织。在一些情况下，缀合物在施用之后2小时内在上皮衬液中的分布浓度比率为血浆中缀合物浓度的至少30％。在某些实施方案中，施用之后2小时内的浓度比率为至少45％。在一些实施方案中，施用之后2小时内的浓度比率为至少55％。特别地，施用之后2小时内的浓度比率为至少60％。如实施例190及图98所示，到注射后2小时，如在其余时间过程中通过AUC所测量，具有Fc结构域(SEQID NO:73)的缀合物ELF水平令人惊讶地为血浆暴露水平的约60％，表明缀合物几乎立即从血浆分配到肺中的ELF。这表明含有Fc的缀合物迅速分布到肺中，且相对于血浆中的水平在肺中保持高浓度。
IV.白蛋白及白蛋白结合肽
白蛋白
本发明的白蛋白可为天然存在的白蛋白或其变体，诸如天然存在的白蛋白的经工程改造变体。变体包括多态物、诸如结构域及子结构域的片段及融合蛋白。白蛋白可包括自任何来源获得的白蛋白的序列。优选地，所述来源为哺乳动物，诸如人或牛。最优选地，所述白蛋白为人血清白蛋白(HSA)或其变体。人血清白蛋白包括具有天然存在于人中的氨基酸序列的任何白蛋白及其变体。白蛋白编码序列可通过本领域技术人员已知用于分离对应于人基因的cDNA且对所述cDNA进行测序的方法获得。本发明的白蛋白可包括SEQ ID NO:139或SEQ ID NO:140中提供的人血清白蛋白(HSA)的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:141中提供的小鼠血清白蛋白(MSA)的氨基酸序列，或者其变体或片段(优选其功能变体或片段)。片段或变体可或可不为功能性的，或可在某种程度上保持白蛋白的功能。例如，片段或变体可保持与白蛋白受体(诸如HSA或MSA)结合的能力，达亲本白蛋白(例如，产生所述片段或变体的亲本白蛋白)的所述能力的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或105％。相对结合能力可通过本领域中已知的方法，诸如通过表面等离子体共振来测定。
所述白蛋白可为白蛋白诸如人血清白蛋白的天然存在的多态变体。一般而言，人血清白蛋白的变体或片段将具有人血清白蛋白或小鼠血清白蛋白的配体结合活性的至少5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，并且优选地80％、90％、95％、100％或105％或更高。
所述白蛋白可包括牛血清白蛋白的氨基酸序列。牛血清白蛋白包括具有天然存在于牛中的氨基酸序列的任何白蛋白(例如，如通过Swissprot登录号P02769所描述)及如本文所定义的其变体。牛血清白蛋白也包括如本文所定义的全长牛血清白蛋白或其变体的片段。
所述白蛋白可包含源自来自以下的血清白蛋白中的一者的白蛋白的序列：狗(例如，Swissprot登录号P49822-1)、猪(例如，Swissprot登录号P08835-1)、山羊(例如，Sigma产品号A2514或A4164)、猫(例如，Swissprot登录号P49064-1)、鸡(例如，Swissprot登录号P19121-1)、卵清蛋白(例如，鸡卵清蛋白)(例如，Swissprot登录号P01012-1)、火鸡卵清蛋白(例如，Swissprot登录号O73860-1)、驴(例如，Swissprot登录号Q5XLE4-1)、豚鼠(例如，Swissprot登录号Q6WDN9-1)、仓鼠(例如，如DeMarco等人International Journal forParasitology 37(11):1201-1208(2007)中所描述)、马(例如，Swissprot登录号P35747-1)、恒河猴(例如，Swissprot登录号Q28522-1)、小鼠(例如，Swissprot登录号P07724-1)、鸽子(例如，如由Khan等人Int.J.Biol.Macromol.30(3-4),171-8(2002)所定义)、兔(例如，Swissprot登录号P49065-1)、大鼠(例如，Swissprot登录号P02770-1)或绵羊(例如，Swissprot登录号P14639-1)，且包括如本文定义的其变体及片段。本领域技术人员已知白蛋白的多种天然存在的突变体形式。白蛋白的天然存在的突变体形式在例如Peters等人All About Albumin:Biochemistry,Genetics and Medical Applications,AcademicPress,Inc.,San Diego,Calif.,第170页-181页(1996)中描述。
本发明的白蛋白包括天然存在的白蛋白的变体。变异型白蛋白是指具有至少一种氨基酸突变，诸如通过插入、缺失或取代生成的氨基酸突变(保守或非保守)的白蛋白，其限制条件在于所述改变产生尚未显著改变至少一种基础特性(例如，尚未改变超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％或40％)的白蛋白。可定义白蛋白的活性的例示性特性包括结合活性(例如，包括对胆红素或诸如长链脂肪酸的脂肪酸的结合特异性或亲和力)、容积渗透浓度或在某个pH范围内的行为。
典型地，白蛋白变体将与天然存在的白蛋白(诸如SEQ ID NO:139-141中任一者的白蛋白)具有至少40％、至少50％、至少60％，且优选至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％氨基酸序列同一性。
用于生产及纯化重组人白蛋白的方法为充分确立的(Sleep等人Biotechnology,8(1):42-6(1990))，且包括用于制药应用的重组人白蛋白的生产(Bosse等人J ClinPharmacol 45(1):57-67(2005))。HSA的三维结构已由X射线晶体学阐明(Carter等人Science.244(4909):1195-8(1998)；Sugio等人Protein Eng.12(6):439-46(1999))。HSA多肽链具有35个半胱氨酸残基，所述残基形成17个二硫键；及在成熟蛋白质的位置34处的一个未配对(例如，游离)半胱氨酸。HSA的Cys-34已被用于将分子缀合于白蛋白(Leger等人Bioorg Med Chem Lett 14(17):4395-8(2004)；Thibaudeau等人Bioconjug Chem16(4):1000-8(2005))，且为位点特异性缀合提供位点。
SEQ ID NO:139(人血清白蛋白(HSA)，变体1)
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHClAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
SEQ ID NO:140(人血清白蛋白(HSA)，变体2)
RGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHClAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
SEQ ID NO:141(小鼠血清白蛋白(MSA))
RGVFRREAHKSEIAHRYNDLGEQHFKGLVLIAFSQYLQKCSYDEHAKLVQEVTDFAKTCVADESAANCDKSLHTLFGDKLCAIPNLRENYGELADCCTKQEPERNECFLQHKDDNPSLPPFERPEAEAMCTSFKENPTTFMGHYLHEVARRHPYFYAPELLYYAEQYNEILTQCCAEADKESCLTPKLDGVKEKALVSSVRQRMKCSSMQKFGERAFKAWAVARLSQTFPNADFAEITKLATDLTKVNKECCHGDLLECADDRAELAKYMCENQATISSKLQTCCDKPLLKKAHCLSEVEHDTMPADLPAIAADFVEDQEVCKNYAEAKDVFLGTFLYEYSRRHPDYSVSLLLRLAKKYEATLEKCCAEANPPACYGTVLAEFQPLVEEPKNLVKTNCDLYEKLGEYGFQNAILVRYTQKAPQVSTPTLVEAARNLGRVGTKCCTLPEDQRLPCVEDYLSAILNRVCLLHEKTPVSEHVTKCCSGSLVERRPCFSALTVDETYVPKEFKAETFTFHSDICTLPEKEKQIKKQTALAELVKHKPKATAEQLKTVMDDFAQFLDTCCKAADKDTCFSTEGPNLVTRCKDALA
白蛋白的缀合
本发明的白蛋白可缀合于(例如，借助于共价键)任何本发明化合物(例如，借助于神经氨酸酶抑制剂单体或二聚体的接头部分)。所述白蛋白可通过本领域技术人员熟知用于产生小分子-蛋白缀合物的任何方法缀合于任何本发明化合物。此可包括共价缀合于溶剂暴露氨基酸，诸如溶剂暴露半胱氨酸或赖氨酸。例如，人血清白蛋白可通过共价连接于对应于SEQ ID NO:139的Cys34或SEQ ID NO:140的Cys40的硫原子缀合于本发明化合物。
本发明的白蛋白可借助于位于所述白蛋白的C端或N端的10个氨基酸残基内的氨基酸缀合于任何本发明化合物。白蛋白可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个或更多个氨基酸的C端或N端多肽融合。所述C端或N端多肽融合可包括一个或多个溶剂暴露半胱氨酸或赖氨酸残基，所述残基可用于共价缀合本发明化合物(例如，缀合于神经氨酸酶抑制剂单体或二聚体，包括借助于接头)。
本发明的白蛋白包括已被工程改造以包括一个或多个溶剂暴露半胱氨酸或赖氨酸残基的任何白蛋白，所述残基可提供用于缀合于本发明化合物(例如，缀合于神经氨酸酶抑制剂单体或二聚体，包括借助于接头)的位点。最优选地，所述白蛋白将含有单一溶剂暴露半胱氨酸或赖氨酸，因此使得本发明化合物能够位点特异性缀合。用于产生包含一个或多个缀合胜任半胱氨酸残基的经工程改造白蛋白变体的例示性方法提供于美国专利申请号2017/0081389中，所述申请以引用的方式整体并入本文中。简单来说，优选白蛋白变体是包含单一、溶剂暴露、未配对(例如，游离)半胱氨酸残基，因此使得接头能够位点特异性缀合于所述半胱氨酸残基的那些变体。
已被工程改造以使得能够化学缀合于溶剂暴露、未配对半胱氨酸残基的白蛋白包括以下白蛋白变体：
(a)在对应于SEQ ID NO:139的L585、D1、A2、D562、A364、A504、E505、T79、E86、D129、D549、A581、D121、E82、S270、Q397及A578中任一者的氨基酸处具有半胱氨酸对非半胱氨酸氨基酸残基的取代的白蛋白；
(b)在邻近对应于SEQ ID NO:139的L585、D1、A2、D562、A364、A504、E505、T79、E86、D129、D549、A581、D121、E82、S270、Q397及A578中任一者的氨基酸残基的N端或C端侧的位置处具有半胱氨酸插入的白蛋白；
(c)经工程改造以具有未配对半胱氨酸的白蛋白，其在对应于SEQ ID NO:96的C369、C361、C91、C177、C567、C316、C75、C169、C124或C558中任一者的残基处具有游离硫醇基团，且所述白蛋白可由或不由对应于SEQ ID NO:139的C360、C316、C75、C168、C558、C361、C91、C124、C169或C567的残基的缺失或取代而生成；及/或
(d)添加半胱氨酸至白蛋白的N端或C端。
在本发明的一些实施方案中，(a)、(b)、(c)及/或(d)的取代、缺失、添加或插入事件的净结果是所述多肽序列的缀合胜任半胱氨酸残基的数目相对于亲本白蛋白序列有所增加。在本发明的一些实施方案中，(a)、(b)、(c)及/或(d)的取代、缺失、添加或插入事件的净结果是所述多肽序列的缀合胜任半胱氨酸残基的数目为一，因此使得能够位点特异性缀合。
优选白蛋白变体也包括具有单一溶剂暴露赖氨酸残基，因此使得接头能够位点特异性缀合于所述赖氨酸残基的白蛋白。所述变体可通过工程改造白蛋白，包括任何前述方法(例如，插入、缺失、取代或C端或N端融合)来产生。
白蛋白结合肽
生物活性化合物与白蛋白结合肽的缀合可改变所述生物活性化合物的药效，包括组织摄取、渗透及扩散的改变。在一优选实施方案中，如与单独本发明化合物(例如，神经氨酸酶抑制剂单体或二聚体，借助于接头)相比，白蛋白结合肽与所述化合物的缀合会增加所述化合物的功效或减少其毒性。
本发明的白蛋白结合肽包括具有5至50个(例如，5至40个、5至30个、5至20个、5至15个、5至10个、10至50个、10至30个或10至20个)氨基酸残基的氨基酸序列的任何多肽，其对白蛋白(诸如本文所述的任何白蛋白)具有亲和力且具有结合所述白蛋白的功能。优选地，白蛋白结合肽结合于天然存在的血清白蛋白，最优选地人血清白蛋白。白蛋白结合肽可具有不同起源，例如合成、人、小鼠或大鼠。本发明的白蛋白结合肽包括已被工程改造以包括一个或多个(例如，两个、三个、四个或五个)溶剂暴露半胱氨酸或赖氨酸残基的白蛋白结合肽，其可提供用于缀合于本发明化合物(例如，缀合于神经氨酸酶抑制剂单体或二聚体，包括借助于接头)的位点。最优选地，所述白蛋白结合肽将含有单一溶剂暴露半胱氨酸或赖氨酸，因此使得本发明化合物能够位点特异性缀合。白蛋白结合肽可仅包含天然存在的氨基酸残基，或可包含一种或多种非天然存在的氨基酸残基。在包括时，非天然存在的氨基酸残基(例如，非天然存在的氨基酸残基的侧链)可用作用于本发明化合物(例如，神经氨酸酶抑制剂单体或二聚体，包括借助于接头)的附接点。本发明的白蛋白结合肽可为线性或环状的。本发明的白蛋白结合肽包括本领域技术人员已知的任何白蛋白结合肽，其实例提供于本文中。
白蛋白结合肽及包含白蛋白结合肽的缀合物优选地以如下亲和力结合白蛋白(例如，人血清白蛋白)，所述亲和力的特征在于小于约100μM，优选地小于约100nM，且最优选地不会实质上结合其他血浆蛋白质的解离常数Kd。此类化合物的特定实例为线性或环状肽，其长度优选地在约10个与20个氨基酸残基之间，任选在N端或C端或所述两端处经修饰。
白蛋白结合肽包括包含以下通式的线性及环状肽，其中Xaa为任何氨基酸：
SEQ ID NO:148
Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Phe-Cys-Xaa-Asp-Trp-Pro-Xaa-Xaa-Xaa-Ser-Cys
SEQ ID NO:149
Val-Cys-Tyr-Xaa-Xaa-Xaa-Ile-Cys-Phe
SEQ ID NO:150
Cys-Tyr-Xaa-Pro-Gly-Xaa-Cys
SEQ ID NO:151
Asp-Xaa-Cys-Leu-Pro-Xaa-Trp-Gly-Cys-Leu-Trp
SEQ ID NO:152
Trp-Cys-Asp-Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Ala-Xaa-Asp-Leu-Cys
SEQ ID NO:153
Asp-Leu-Val-Xaa-Leu-Gly-Leu-Glu-Cys-Trp
本发明的白蛋白结合肽进一步包括以下肽序列中任一者，其可为线性或环状的：
Figure BDA0003630331990004241
SEQ ID NO:154-167的白蛋白结合肽可进一步包含N端处的额外氨基酸(Xaa)x及/或C端处的额外氨基酸(Xaa)z，其中Xaa为任何氨基酸且x及z为大于或等于零的整数，一般地小于100，优选地小于10且更优选地为0、1、2、3、4或5。
进一步例示性白蛋白结合肽提供于美国专利申请号2005/0287153中，所述申请以引用的方式整体并入本文中。
白蛋白结合肽的缀合
本发明的白蛋白结合肽可缀合于(例如，借助于共价键)任何本发明化合物(例如，借助于神经氨酸酶抑制剂单体或二聚体的接头部分)。所述白蛋白结合肽可通过本领域技术人员已知用于产生肽-小分子缀合物的任何方法缀合于任何本发明化合物。此可包括共价缀合于氨基酸残基(诸如半胱氨酸、赖氨酸或非天然氨基酸)的侧链基团。或者，共价缀合可出现于C端(例如，缀合于C端羧酸，或缀合于C端残基的侧链基团)或N端(例如，缀合于N端氨基，或缀合于N端氨基酸的侧链基团)。
V.接头
接头是指本文所述的缀合物中的两种或更多种组分之间(例如，本文所述的缀合物中的两种神经氨酸酶抑制剂之间、本文所述的缀合物中的神经氨酸酶抑制剂与Fc结构域或白蛋白之间及本文所述的缀合物中的两种神经氨酸酶抑制剂的二聚体与Fc结构域或白蛋白之间)的连接。
具有共价连接于神经氨酸酶抑制剂的二聚体的Fc结构域或白蛋白的缀合物中的接头
在如本文所述的含有共价连接于神经氨酸酶抑制剂的一种或多种二聚体的Fc结构域单体、Fc结构域、Fc结合肽、白蛋白或白蛋白结合肽的缀合物中，所述缀合物中的接头(例如，L或L’)可为分支链结构。如本文进一步描述，本文所述的缀合物中的接头(例如，L或L’)可为多价结构，例如分别具有两个或三个臂的二价或三价结构。在一些实施方案中，当所述接头具有三个臂时，所述臂中的两者可附接于第一及第二神经氨酸酶抑制剂且第三个臂可附接于Fc结构域单体、Fc结构域、Fc结合肽、白蛋白或白蛋白结合肽。在一些实施方案中，当所述接头具有两个臂时，一个臂可附接于Fc结构域或白蛋白且另一臂可附接于两种神经氨酸酶抑制剂中的一者。在其他实施方案中，具有两个臂的接头可用于附接含有共价连接于神经氨酸酶抑制剂的一种或多种二聚体的Fc结构域或白蛋白的缀合物上的两种神经氨酸酶抑制剂。
在一些实施方案中，具有共价连接于神经氨酸酶抑制剂的一种或多种二聚体的Fc结构域或白蛋白的缀合物中的接头由式(D-L-I)描述：
Figure BDA0003630331990004261
其中LA由式GA1-(ZA1)g1-(YA1)h1-(ZA2)i1-(YA2)j1-(ZA3)k1-(YA3)l1-(ZA4)m1-(YA4)n1-(ZA5)o1-GA2描述；LB由式GB1-(ZB1)g2-(YB1)h2-(ZB2)i2-(YB2)j2-(ZB3)k2-(YB3)l2-(ZB4)m2-(YB4)n2-(ZB5)o2-GB2描述；LC由式GC1-(ZC1)g3-(YC1)h3-(ZC2)i3-(YC2)j3-(ZC3)k3-(YC3)l3-(ZC4)m3-(YC4)n3-(ZC5)o3-GC2描述；GA1是附接于式(D-L-I)中的Q的键；GA2是附接于第一神经氨酸酶抑制剂(例如，A1)的键；GB1是附接于式(D-L-I)中的Q的键；GB2是附接于第二神经氨酸酶抑制剂(例如，A2)的键；GC1是附接于式(D-L-I)中的Q的键；GC2是附接于Fc结构域单体、Fc结构域、Fc结合肽、白蛋白或白蛋白结合肽的键或能够与缀合于Fc结构域单体、Fc结构域、Fc结合肽、白蛋白或白蛋白结合肽的官能团反应的官能团(例如，马来酰亚胺及半胱氨酸、胺及经活化羧酸、硫醇及马来酰亚胺、经活化磺酸及胺、异氰酸酯及胺、叠氮化物及炔以及烯烃及四嗪)；ZA1、ZA2、ZA3、ZA4、ZA5、ZB1、ZB2、ZB3、ZB4、ZB5、ZC1、ZC2、ZC3、ZC4及ZC5中的每一者独立地为任选取代的C1-C20亚烷基、任选取代的C1-C20亚杂烷基、任选取代的C2-C20亚烯基、任选取代的C2-C20亚杂烯基、任选取代的C2-C20亚炔基、任选取代的C2-C20亚杂炔基、任选取代的C3-C20亚环烷基、任选取代的C3-C20亚杂环烷基、任选取代的C4-C20亚环烯基、任选取代的C4-C20亚杂环烯基、任选取代的C8-C20亚环炔基、任选取代的C8-C20亚杂环炔基、任选取代的C5-C15亚芳基或任选取代的C2-C15亚杂芳基；YA1、YA2、YA3、YA4、YB1、YB2、YB3、YB4、YC1、YC2、YC3及YC4中的每一者独立地为O、S、NRi、P、羰基、硫羰基、磺酰基、磷酸酯基、磷酰基或亚氨基；Ri为H、任选取代的C1-C20烷基、任选取代的C1-C20杂烷基、任选取代的C2-C20烯基、任选取代的C2-C20杂烯基、任选取代的C2-C20炔基、任选取代的C2-C20杂炔基、任选取代的C3-C20环烷基、任选取代的C3-C20杂环烷基、任选取代的C4-C20环烯基、任选取代的C4-C20杂环烯基、任选取代的C8-C20环炔基、任选取代的C8-C20杂环炔基、任选取代的C5-C15芳基或任选取代的C2-C15杂芳基；g1、h1、i1、j1、k1、l1、m1、n1、o1、g2、h2、i2、j2、k2、l2、m2、n2、o2、g3、h3、i3、j3、k3、l3、m3、n3及o3中的每一者独立地为0或1；Q为氮原子、任选取代的C1-C20亚烷基、任选取代的C1-C20亚杂烷基、任选取代的C2-C20亚烯基、任选取代的C2-C20亚杂烯基、任选取代的C2-C20亚炔基、任选取代的C2-C20亚杂炔基、任选取代的C3-C20亚环烷基、任选取代的C3-C20亚杂环烷基、任选取代的C4-C20亚环烯基、任选取代的C4-C20亚杂环烯基、任选取代的C8-C20亚环炔基、任选取代的C8-C20亚杂环炔基、任选取代的C5-C15亚芳基或任选取代的C2-C15亚杂芳基。
在一些实施方案中，LC可具有两个附接于Fc结构域的点(例如，两个GC2)。在一些实施方案中，L包括聚乙二醇(PEG)接头。PEG接头包括具有重复单元结构(-CH2CH2O-)n的接头，其中n为2至100的整数。聚乙二醇接头可共价接合神经氨酸酶抑制剂及E(例如，在式(M-I)-(M-XI)中任一者的缀合物中)。聚乙二醇接头可共价接合第一神经氨酸酶抑制剂及第二神经氨酸酶抑制剂(例如，在式(D-I)-(D-XI)中任一者的缀合物中)。聚乙二醇接头可共价接合神经氨酸酶抑制剂二聚体及E(例如，在式(D-I)-(D-XI)中任一者的缀合物中)。聚乙二醇接头可选自PEG2至PEG100中任一者(例如，PEG2、PEG3、PEG4、PEG5、PEG5-PEG10、PEG10-PEG20、PEG20-PEG30、PEG30-PEG40、PEG50-PEG60、PEG60-PEG70、PEG70-PEG80、PEG80-PEG90、PEG90-PEG100)。在一些实施方案中，Lc包括PEG接头，其中LC共价附接于Q及E中每一者。
可用于本文所述的缀合物的式(D-L-I)接头包括但不限于
Figure BDA0003630331990004281
Figure BDA0003630331990004291
Figure BDA0003630331990004301
Figure BDA0003630331990004311
Figure BDA0003630331990004321
Figure BDA0003630331990004331
Figure BDA0003630331990004341
Figure BDA0003630331990004351
Figure BDA0003630331990004361
Figure BDA0003630331990004371
其中z1及z2各自独立地为1至20的整数；且R9选自H、C1-C20烷基、C3-C20环烷基、C3-C20杂环烷基；C5-C15芳基及C2-C15杂芳基。
式(D-L-I)接头也可包括以下中任一者：
Figure BDA0003630331990004372
Figure BDA0003630331990004381
Figure BDA0003630331990004391
Figure BDA0003630331990004401
Figure BDA0003630331990004411
具有共价连接于神经氨酸酶抑制剂的单体的Fc结构域或白蛋白的缀合物中的接头
在如本文所述的含有共价连接于神经氨酸酶抑制剂的一种或多种单体的Fc结构域单体、Fc结构域、Fc结合肽、白蛋白或白蛋白结合肽的缀合物中，所述缀合物中的接头(例如，L或L’)可为具有两个臂的二价结构。二价接头中的一个臂可附接于神经氨酸酶抑制剂的单体且另一臂可附接于Fc结构域单体、Fc结构域、Fc结合肽、白蛋白或白蛋白结合肽。在一些实施方案中，本文所述的缀合物中的神经氨酸酶抑制剂的一种或多种单体可各自独立地连接于Fc结构域单体、Fc结构域、Fc结合肽、白蛋白或白蛋白结合肽中的原子。
在一些实施方案中，接头由式(M-L-I)描述：
J1-(Q1)g-(T1)h-(Q2)i-(T2)j-(Q3)k-(T3)l-(Q4)m-(T4)n-(Q5)o-J2
其中J1是附接于神经氨酸酶抑制剂的键；J2是附接于Fc结构域单体、Fc结构域、Fc结合肽、白蛋白或白蛋白结合肽的键或能够与缀合于Fc结构域单体、Fc结构域、Fc结合肽、白蛋白或白蛋白结合肽的官能团反应的官能团(例如，马来酰亚胺及半胱氨酸、胺及经活化羧酸、硫醇及马来酰亚胺、经活化磺酸及胺、异氰酸酯及胺、叠氮化物及炔以及烯烃及四嗪)；Q1、Q2、Q3、Q4及Q5中的每一者独立地为任选取代的C1-C20亚烷基、任选取代的C1-C20亚杂烷基、任选取代的C2-C20亚烯基、任选取代的C2-C20亚杂烯基、任选取代的C2-C20亚炔基、任选取代的C2-C20亚杂炔基、任选取代的C3-C20亚环烷基、任选取代的C3-C20亚杂环烷基、任选取代的C4-C20亚环烯基、任选取代的C4-C20亚杂环烯基、任选取代的C8-C20亚环炔基、任选取代的C8-C20亚杂环炔基、任选取代的C5-C15亚芳基或任选取代的C2-C15亚杂芳基；T1、T2、T3、T4中的每一者独立地为O、S、NRi、P、羰基、硫羰基、磺酰基、磷酸酯基、磷酰基或亚氨基；Ri为H、任选取代的C1-C20烷基、任选取代的C1-C20杂烷基、任选取代的C2-C20烯基、任选取代的C2-C20杂烯基、任选取代的C2-C20炔基、任选取代的C2-C20杂炔基、任选取代的C3-C20环烷基、任选取代的C3-C20杂环烷基、任选取代的C4-C20环烯基、任选取代的C4-C20杂环烯基、任选取代的C8-C20环炔基、任选取代的C8-C20杂环炔基、任选取代的C5-C15芳基或任选取代的C2-C15杂芳基；且g、h、i、j、k、l、m、n及o各自独立地为0或1。
在一些实施方案中，J2可具有两个附接于Fc结构域单体、Fc结构域、Fc结合肽、白蛋白或白蛋白结合肽的点(例如，两个J2)。
可用于本文所述的缀合物的式(M-L-I)接头包括但不限于
Figure BDA0003630331990004421
Figure BDA0003630331990004431
其中d为1至20的整数(例如，d为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)。
可用于本文所述的缀合物的式(M-L-I)的接头包括但不限于
Figure BDA0003630331990004432
Figure BDA0003630331990004441
其中d及e各自独立地为1至26的整数。
连接基团
在一些实施方案中，接头提供此处所述的缀合物中的神经氨酸酶抑制剂与Fc结构域单体、Fc结构域、Fc结合肽、白蛋白或白蛋白结合肽之间或本文所述的缀合物中的两种神经氨酸酶抑制剂之间的空间、刚性及/或柔性。在一些实施方案中，接头可为键，例如共价键，例如酰胺键、二硫键、C-O键、C-N键、N-N键、C-S键或由化学反应(例如，化学缀合)产生的任何种类的键。在一些实施方案中，接头(如式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者所示的L或L’)包括不超过250个原子(例如，1-2、1-4、1-6、1-8、1-10、1-12、1-14、1-16、1-18、1-20、1-25、1-30、1-35、1-40、1-45、1-50、1-55、1-60、1-65、1-70、1-75、1-80、1-85、1-90、1-95、1-100、1-110、1-120、1-130、1-140、1-150、1-160、1-170、1-180、1-190、1-200、1-210、1-220、1-230、1-240或1-250个原子；250、240、230、220、210、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、28、26、24、22、20、18、16、14、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个原子)。在一些实施方案中，接头(L或L)包括不超过250个非氢原子(例如，1-2、1-4、1-6、1-8、1-10、1-12、1-14、1-16、1-18、1-20、1-25、1-30、1-35、1-40、1-45、1-50、1-55、1-60、1-65、1-70、1-75、1-80、1-85、1-90、1-95、1-100、1-110、1-120、1-130、1-140、1-150、1-160、1-170、1-180、1-190、1-200、1-210、1-220、1-230、1-240或1-250个非氢原子；250、240、230、220、210、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、28、26、24、22、20、18、16、14、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个非氢原子)。在一些实施方案中，接头(L或L)的骨架包括不超过250个原子(例如，1-2、1-4、1-6、1-8、1-10、1-12、1-14、1-16、1-18、1-20、1-25、1-30、1-35、1-40、1-45、1-50、1-55、1-60、1-65、1-70、1-75、1-80、1-85、1-90、1-95、1-100、1-110、1-120、1-130、1-140、1-150、1-160、1-170、1-180、1-190、1-200、1-210、1-220、1-230、1-240或1-250个原子；250、240、230、220、210、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、28、26、24、22、20、18、16、14、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个原子)。接头的“骨架”是指接头中的原子，其合起来形成自缀合物的一部分至所述缀合物的另一部分的最短路径。接头的骨架中的原子直接地参与连接所述缀合物的一部分至所述缀合物的另一部分。例如，附接于接头的骨架中的碳的氢原子未被视为直接地参与连接所述缀合物的一部分至所述缀合物的另一部分。
可用于制备接头(L或L’)的分子包括至少两个官能团，例如两个羧酸基。在三价接头的一些实施方案中，接头的两个臂可含有两种二羧酸，其中第一羧酸可与所述缀合物中的第一神经氨酸酶抑制剂形成共价连接且第二羧酸可与所述缀合物中的第二神经氨酸酶抑制剂形成共价连接且所述接头的第三臂可与所述缀合物中的Fc结构域单体、Fc结构域、Fc结合肽、白蛋白或白蛋白结合肽形成共价连接(例如，C-O键)。在二价接头的一些实施方案中，所述二价接头可含有两种羧酸，其中第一羧酸可与所述缀合物中的一种组分(例如，神经氨酸酶抑制剂)形成共价连接且第二羧酸可与所述缀合物中的另一组分(例如，Fc结构域单体、Fc结构域、Fc结合肽、白蛋白或白蛋白结合肽)形成共价连接(例如，C-S键或C-N键)。
在一些实施方案中，二羧酸分子可用作接头(例如，二羧酸接头)。例如，在含有共价连接于神经氨酸酶抑制剂的一种或多种二聚体的Fc结构域单体、Fc结构域、Fc结合肽、白蛋白或白蛋白结合肽的缀合物中，二羧酸分子中的第一羧酸可与第一神经氨酸酶抑制剂的羟基或氨基形成共价连接且第二羧酸可与第二神经氨酸酶抑制剂的羟基或氨基形成共价连接。
可用于形成接头的二羧酸分子的实例包括但不限于：
Figure BDA0003630331990004461
Figure BDA0003630331990004471
其中n为1至20的整数(例如，n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)。
可用于形成接头的二羧酸分子的其他实例包括但不限于：
Figure BDA0003630331990004472
Figure BDA0003630331990004481
Figure BDA0003630331990004491
在一些实施方案中，二羧酸分子(诸如本文所述者)可进一步官能化以含有一个或多个额外官能团。二羧酸可进一步官能化，例如以提供与Fc结构域单体、Fc结构域、Fc结合肽、白蛋白或白蛋白结合肽的附接点(例如，借助于接头，诸如PEG接头)。
在一些实施方案中，当所述神经氨酸酶抑制剂附接于Fc结构域单体、Fc结构域、Fc结合肽、白蛋白或白蛋白结合肽时，连接基团可包含包含由1至25个原子间隔的羧酸部分及氨基部分的部分。此类连接基团的实例包括但不限于：
Figure BDA0003630331990004492
Figure BDA0003630331990004501
其中n为1至20的整数(例如，n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)。
在一些实施方案中，可包含包含羧酸部分及氨基部分的部分的连接基团(诸如本文所述者)可进一步官能化以含有一个或多个额外官能团。所述连接基团可进一步官能化，例如以提供与Fc结构域单体、Fc结构域、Fc结合肽、白蛋白或白蛋白结合肽的附接点(例如，借助于接头，诸如PEG接头)。
在一些实施方案中，当所述神经氨酸酶抑制剂附接于Fc结构域单体、Fc结构域、Fc结合肽、白蛋白或白蛋白结合肽时，连接基团可包含包含由1至25个原子间隔的两个或更多个氨基部分(例如，二氨基部分)的部分。此类连接基团的实例包括但不限于：
Figure BDA0003630331990004502
Figure BDA0003630331990004511
其中n为1至20的整数(例如，n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)。
在一些实施方案中，可包含二氨基部分的连接基团(诸如本文所述者)可进一步官能化以含有一个或多个额外官能团。此类二氨基连接基团可进一步官能化，例如以提供与Fc结构域单体、Fc结构域、Fc结合肽、白蛋白或白蛋白结合肽的附接点(例如，借助于接头，诸如PEG接头)。
在一些实施方案中，含有叠氮基的分子可用于形成接头，其中所述叠氮基可与炔进行环加成以形成1,2,3-三唑连接。在一些实施方案中，含有炔基的分子可用于形成接头，其中所述炔基可与叠氮化物进行环加成以形成1,2,3-三唑连接。在一些实施方案中，含有马来酰亚胺基的分子可用于形成接头，其中所述马来酰亚胺基可与半胱氨酸反应以形成C-S连接。在一些实施方案中，含有一个或多个磺酸基的分子可用于形成接头，其中所述磺酸基可与神经氨酸酶抑制剂中的连接氮形成磺酰胺连接。在一些实施方案中，含有一个或多个异氰酸酯基的分子可用于形成接头，其中所述异氰酸酯基可与神经氨酸酶抑制剂中的连接氮形成脲连接。在一些实施方案中，含有一个或多个卤烷基的分子可用于形成接头，其中所述卤烷基可与神经氨酸酶抑制剂形成共价连接，例如C-N及C-O连接。
在一些实施方案中，接头(L或L’)可包含源于例如合成聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)聚合物)的合成基团。在一些实施方案中，接头可包含一个或多个氨基酸残基。在一些实施方案中，接头可为氨基酸序列(例如，1-25个氨基酸、1-10个氨基酸、1-9个氨基酸、1-8个氨基酸、1-7个氨基酸、1-6个氨基酸、1-5个氨基酸、1-4个氨基酸、1-3个氨基酸、1-2个氨基酸或1个氨基酸的序列)。在一些实施方案中，接头(L或L’)可包括一个或多个任选取代的C1-C20亚烷基、任选取代的C1-C20亚杂烷基(例如，PEG单元)、任选取代的C2-C20亚烯基(例如，C2亚烯基)、任选取代的C2-C20亚杂烯基、任选取代的C2-C20亚炔基、任选取代的C2-C20亚杂炔基、任选取代的C3-C20亚环烷基(例如，亚环丙基、亚环丁基)、任选取代的C3-C20亚杂环烷基、任选取代的C4-C20亚环烯基、任选取代的C4-C20亚杂环烯基、任选取代的C8-C20亚环炔基、任选取代的C8-C20亚杂环炔基、任选取代的C5-C15亚芳基(例如，C6亚芳基)、任选取代的C2-C15亚杂芳基(例如，咪唑、吡啶)、O、S、NRi(Ri为H、任选取代的C1-C20烷基、任选取代的C1-C20杂烷基、任选取代的C2-C20烯基、任选取代的C2-C20杂烯基、任选取代的C2-C20炔基、任选取代的C2-C20杂炔基、任选取代的C3-C20环烷基、任选取代的C3-C20杂环烷基、任选取代的C4-C20环烯基、任选取代的C4-C20杂环烯基、任选取代的C8-C20环炔基、任选取代的C8-C20杂环炔基、任选取代的C5-C15芳基或任选取代的C2-C15杂芳基)、P、羰基、硫羰基、磺酰基、磷酸酯基、磷酰基或亚氨基。
缀合化学
神经氨酸酶抑制剂单体或二聚体(例如，在式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者的缀合物中)可例如借助于接头，通过本领域技术人员已知的任何标准缀合化学缀合于Fc结构域单体、Fc结构域、Fc结合肽、白蛋白或白蛋白结合肽。特定地涵盖以下缀合化学，例如关于使PEG接头(例如，官能化PEG接头)缀合于Fc结构域单体、Fc结构域、Fc结合肽、白蛋白或白蛋白结合肽。
使用接头使缀合物中的两种或更多种组分共价缀合可使用熟知有机化学合成技术及方法来实现。两种组分上的互补官能团可彼此反应以形成共价键。互补反应性官能团的实例包括但不限于例如马来酰亚胺及半胱氨酸、胺及经活化羧酸、硫醇及马来酰亚胺、经活化磺酸及胺、异氰酸酯及胺、叠氮化物及炔以及烯烃及四嗪。与多肽(例如，Fc结构域单体、Fc结构域、Fc结合肽、白蛋白或白蛋白结合肽)的位点特异性缀合可使用本领域中已知的技术来实现。用于使小分子位点特异性缀合于Fc结构域的例示性技术提供于Agarwall.P.,等人Bioconjugate Chem.26:176-192(2015)中。
能够与氨基反应的官能团的其他实例包括例如烷基化剂及酰化剂。代表性的烷基化剂包括：(i)α-卤基乙酰基，例如XCH2CO-(其中X＝Br、Cl或I)；(ii)N-马来酰亚胺基，其可经由Michael类型反应或经由通过与环羰基加成进行酰化而与氨基反应；(iii)芳基卤化物，例如硝基卤基芳族基团；(iv)烷基卤化物；(v)能够与氨基形成席夫氏碱(Schiff’sbase)的醛或酮；(vi)可与氨基、巯基或酚式羟基反应的环氧化物，例如表氯醇及双环氧乙烷；(vii)含氯s-三嗪，其可对诸如氨基、巯基及羟基的亲核试剂具反应性；(viii)氮丙啶，其可通过开环对诸如氨基的亲核试剂具反应性；(ix)方酸二乙酯；及(x)α-卤基烷基醚。
氨基反应性酰化基团的实例包括例如(i)异氰酸酯及异硫氰酸酯；(ii)磺酰氯；(iii)酰基卤；(iv)活性酯，例如硝基苯酯或N-羟基丁二酰亚胺酯或其衍生物(例如，叠氮基-PEG2-PEG40-NHS酯)；(v)酸酐，例如混合、对称或N-羧基酐；(vi)酰基叠氮化物；及(vii)酰亚胺酯。醛及酮可与胺反应以形成席夫氏碱，席夫氏碱可经由还原胺化稳定化。
应理解，某些官能团可在反应之前转化为其他官能团，例如以赋予额外反应性或选择性。可用于所述目的的方法的实例包括使用诸如二羧酸酐的试剂将胺转化为羧基；使用诸如N-乙酰基同型半胱氨酸硫代内酯、S-乙酰基巯基丁二酸酐、2-亚氨基硫烷或含硫醇的丁二酰亚胺基衍生物的试剂将胺转化为硫醇；使用诸如α-卤代乙酸酯的试剂将硫醇转化为羧基；使用诸如乙烯亚胺或2-溴乙胺的试剂将硫醇转化为胺；使用诸如碳二亚胺的试剂将羧基转化为胺，接着再转化为二胺；以及使用诸如甲苯磺酰氯的试剂将醇转化为硫醇，接着用硫代乙酸酯进行酯交换反应，并且用乙酸钠水解为硫醇。
在一些实施方案中，本发明的接头(例如L或L’，诸如D-L-I的LC)缀合(例如，通过本文所述的任何方法)于E(例如，Fc结构域或白蛋白)。在本发明的优选实施方案中，所述接头借助于以下进行缀合：(a)硫脲连接(即，-NH(C＝S)NH-)于E的赖氨酸；(b)氨基甲酸酯连接(即，-NH(C＝O)-O)于E的赖氨酸；(c)在赖氨酸与E之间通过还原胺化实现的胺连接(即，-NHCH2)；(d)酰胺(即，-NH-(C＝O)CH2)于E的赖氨酸；(e)接头的马来酰亚胺至E的半胱氨酸之间的半胱氨酸-马来酰亚胺缀合；(f)在接头与E的碳水化合物(例如，Fc结构域单体或Fc结构域的糖基)之间通过还原胺化实现的胺连接(即，-NHCH2)；(g)再桥接半胱氨酸缀合，其中所述接头缀合于E的两个半胱氨酸；(h)在接头与E的碳水化合物(例如，Fc结构域单体或Fc结构域的糖基)之间的肟连接；(i)在接头与E的氨基酸残基之间的肟连接；(j)在接头与E之间的叠氮基连接；(k)接头直接酰化为E；或(l)在接头与E之间的硫醚连接。
在一些实施方案中，接头缀合于E，其中所述连接包括结构-NH(C＝NH)X-，其中X为O、HN或键。在一些实施方案中，接头缀合于E，其中在接头的剩余部分与E之间的连接包括结构-NH(C＝O)NH-。在一些实施方案中，接头(例如活性酯，例如硝基苯酯或N-羟基丁二酰亚胺酯或其衍生物(例如，官能化PEG接头(例如，叠氮基-PEG2-PEG40-NHS酯))缀合于E，其中T(例如，DAR)在0.5与10.0之间，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在这些情况下，E-(PEG2-PEG40)-叠氮化物可经由点击缀合与具有末端炔接头(例如L或L’，诸如D-L-I的LC)的Int反应。在点击缀合期间，铜催化的叠氮化物(例如，Fc-(PEG2-PEG40)-叠氮化物)与炔(例如，具有末端炔接头(例如L或L’，诸如D-L-I的LC)的Int)的反应形成5元杂原子环。在一些实施方案中，缀合于E的接头为末端炔且缀合于具有末端叠氮化物的Int。E-(PEG2-PEG40)-叠氮化物的制备的例示性制备描述于实施例7、8、61、84、88及124中。经由点击缀合制备的例示性缀合物描绘于图43、61及102中。点击化学缀合程序在图103中描绘。本领域技术人员应容易了解来自点击化学缀合的最终产物。
例示性连接策略(例如，用于使神经氨酸酶抑制剂的单体或二聚体连接于E的方法，诸如借助于接头)进一步描绘于图1、28、29、30、43及61中。
VI.组合疗法
抗病毒剂
在一些实施方案中，一种或多种抗病毒剂可与本文所述的缀合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者的缀合物)组合施用(例如，实质上同时施用(例如，在同一药物组合物中或在独立药物组合物中)或在不同时间独立地施用)。所述抗病毒剂可与所述缀合物实质上同时施用(例如，在同一药物组合物中或在独立药物组合物中)，或可在所述缀合物之前或之后(例如，在1天、2天、5天、1周、2周、3周、1个月、2个月、6个月或12个月或更久时期内)经施用。在一些实施方案中，缀合物通过注射(例如，肌肉内、皮内、鼻内或皮下)施用，且抗病毒剂口服施用。最优选地，缀合物静脉内施用，且抗病毒剂口服施用。
在一些实施方案中，缀合物是预防性施用的(例如，在受试者与病毒接触之前)且抗病毒剂是在受试者具有病毒感染、据推测具有病毒感染或已经暴露于病毒之后经施用。在一些实施方案中，缀合物及抗病毒剂两者均是在受试者具有病毒感染、据推测具有病毒感染或已暴露于病毒之后经施用。在一些实施方案中，缀合物及抗病毒剂均是预防性施用的。
缀合物及抗病毒剂可配制成同一药物组合物或独立的药物组合物。在优选的实施方案中，缀合物及抗病毒剂被配制在独立的药物组合物(例如，配制用于不同的施用途径)中。在一些实施方案中，缀合物及抗病毒剂同时(例如，实质上同时，诸如在5分钟、30分钟、1-6小时、1-12小时或1天内)或依序(例如，在不同的时间，诸如相隔超过1天)经施用。如果抗病毒剂及缀合物依序经施用，则抗病毒剂在施用缀合物之后经施用(例如，在缀合物之后1天、2天、5天、1周、2周、3周、1个月、2个月、6个月或12个月或更长时间施用)1-50(例如，1-15、10-25、20-35、30-45或35-50)次。
在一些情况下，在施用本文描述的缀合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D'-I)、(M-I)-(M-XI)或(M'-I))之后，每天、每周、每月、每半年、每年一次或多次(例如，1-10次或更多次；1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次)或在医学上必要时向有需要的受试者施用抗病毒剂。
在一些实施方案中，所述抗病毒剂是用于治疗流感病毒的抗病毒剂。例如，所述抗病毒剂可为M2离子通道阻断剂、神经氨酸酶抑制剂(例如，长效神经氨酸酶抑制剂)、聚合酶抑制剂、血球凝集素抑制剂、融合蛋白抑制剂、COX-2抑制剂或PPAR激动剂。所述抗病毒剂可靶向病毒或宿主受试者。与本文所述的缀合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者的缀合物)组合使用的用于治疗流感病毒的抗病毒剂可选自吡莫地韦、奥司他韦、扎那米韦、帕拉米韦、拉尼米韦、CS-8958、金刚烷胺、金刚乙胺、蓝藻抗病毒蛋白-N、帽依赖性核酸内切酶抑制剂(例如，巴洛沙韦玛波西酯)、聚合酶抑制剂(例如，T-705)、PB2抑制剂(例如，JNJ-63623872)、缀合的唾液酸酶(例如，DAS181)、噻唑化物(thiazolide)(例如，硝唑尼特)、COX抑制剂、PPAR激动剂、靶向血球凝集素的抗体(例如单克隆抗体，诸如CR6261、CR8020、MEDI8852、MHAA4549A或VIS410)或靶向宿主或病毒基因的siRNA或其前药，或其药学上可接受的盐。
优选地，抗病毒剂针对与缀合物不同的治疗靶标，所述抗病毒剂例如M2离子通道阻断剂、聚合酶抑制剂、血球凝集素抑制剂、病毒复制抑制剂(例如，帽依赖性核酸内切酶抑制剂)、融合蛋白抑制剂、COX-2抑制剂或PPAR激动剂。最优选地，所述抗病毒剂是帽依赖性核酸内切酶抑制剂(例如，巴洛沙韦玛波西酯)。在一些实施方案中，所述抗病毒剂与由式(D-II-6)描述的缀合物组合施用。在一些实施方案中，所述抗病毒剂与由式(D-II-7)描述的缀合物组合施用。在优选的实施方案中，抗病毒剂(例如，巴洛沙韦玛波西酯)与由式(D-II-6)描述的缀合物组合施用。最优选地，抗病毒剂(例如，巴洛沙韦玛波西酯)与由式(D-II-7)描述的缀合物组合施用。更优选地，所述缀合物是缀合物45或缀合物46。
巴洛沙韦
在一些实施方案中，巴洛沙韦玛波西酯(BXM，前药形式)或巴洛沙韦酸(BXA，活性形式)或其任何盐(Omoto等人Scientific Reports.8:9633,2018；Japic CTI-153090；Japic CTI-163417；所述文献各自以引用的方式整天并入本文中)可以与本文所述的缀合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者的缀合物)组合施用(例如，实质上同时施用(例如，在同一药物组合物中或在独立药物组合物中)或在不同时间独立地施用)。
Figure BDA0003630331990004571
(巴洛沙韦玛波西酯)(巴洛沙韦酸)
在一些实施方案中，巴洛沙韦玛波西酯、巴洛沙韦酸或其盐以每位成人每天约0.1mg至约3000mg、优选约0.1mg至约1000mg、最优选约10mg至约100mg(例如，约10mg、约20mg、约30mg、约40mg、约50mg、约60mg、约70mg、约80mg、约90mg或约100mg)范围内的剂量经施用(如有必要，分开施用)。在一些实施方案中，当与缀合物组合施用时，巴洛沙韦玛波西酯、巴洛沙韦酸或其盐以与护理标准相比降低的剂量或频率经施用。缀合物可以本文所述的剂量经施用。
在一些实施方案中，巴洛沙韦玛波西酯、巴洛沙韦酸或其盐比缀合物更频繁地经施用。例如，缀合物可以每12个月、每6个月、每3个月、每2个月、每1个月、每3周、每2周或每周施用一次。巴洛沙韦玛波西酯、巴洛沙韦酸或其盐可以每天三次、每天两次、每天一次、每2-6天一次、每周一次或每两周一次经施用。在一些实施方案中，巴洛沙韦玛波西酯、巴洛沙韦酸或其盐在施用本文所述的缀合物之后(例如，6个月、3个月、2个月、1个月、3周、2周或1周内)经施用一次或多次(例如，1-10次或更多次；1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次)。
在一些实施方案中，巴洛沙韦玛波西酯、巴洛沙韦酸或其盐经口服施用。
在一些实施方案中，巴洛沙韦玛波西酯、巴洛沙韦酸或其盐以每天约0.01mg至约1000mg、优选约0.05mg至约500mg范围内的剂量经施用，例如口服。巴洛沙韦玛波西酯(XOFLUZATM)的剂型及强度是众所周知的，40至<80kg的成人单次口服剂量为40mg，且≥80kg的成人单次口服剂量为80mg。巴洛沙韦玛波西酯(XOFLUZATM)用于儿科受试者(例如，≥12岁且≥40kg的受试者)的剂型及强度是众所周知的，40至<80kg的儿科受试者单次口服剂量为40mg，且≥80kg的儿科受试者单次口服剂量为80mg。
当与本发明的缀合物组合施用时，巴洛沙韦(例如，巴洛沙韦玛波西酯、巴洛沙韦酸或其盐)的功效可以例如通过巴洛沙韦及缀合物的协同相互作用来增强。这可以允许以减少的剂量(例如，相对于目前的临床护理标准)施用巴洛沙韦，而没有任何功效损失。这具有减少与施用巴洛沙韦相关的不良事件的优势。在一些实施方案中，巴洛沙韦玛波西酯、巴洛沙韦酸或其盐以减少的或亚临床剂量施用(例如，以低于没有本文所述的缀合物及/或低于目前的临床护理标准的剂量施用(例如，低于40mg口服剂量的剂量(例如，0.01mg至40mg范围内的剂量(例如，0.5mg、1.0mg、1.5mg、2.0mg、2.5mg、5.0mg、7.5mg、10mg、15mg、18mg、20mg、23mg、25mg、30mg、35mg或38mg的口服剂量))))。巴洛沙韦玛波西酯(XOFLUZATM)可以以足以治疗先前已施用本文所述的任何缀合物的受试者的流感病毒感染的任何量提供。
抗病毒疫苗
在一些实施方案中，本文所述的缀合物中任一者(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者的缀合物)与抗病毒疫苗(例如，在受试者中引起针对病毒的免疫反应的组合物)组合施用。所述抗病毒疫苗可与所述缀合物实质上同时施用(例如，在同一药物组合物中或在独立药物组合物中)，或可在所述缀合物之前或之后(例如，在1天、2天、5天、1周、2周、3周、1个月、2个月、6个月或12个月或更久时期内)经施用。
在一些实施方案中，所述病毒疫苗包含在所述受试者中引起针对流感病毒A、B、C或副流感病毒的免疫反应的免疫原。在一些实施方案中，所述免疫原为不活化病毒(例如，所述疫苗是含有经纯化且不活化材料流感病毒A、B、C或副流感病毒或其任何组合的三价流感疫苗)。在一些实施方案中，所述疫苗呈肌肉内注射剂形式给予。在一些实施方案中，所述疫苗是含有已经减弱(削弱)的活病毒的活病毒疫苗。在一些实施方案中，所述疫苗呈鼻喷雾剂形式经施用。
VII.方法
本文所述的方法包括例如进行保护以抵御或治疗受试者的病毒感染(例如，流感病毒感染)的方法及预防、稳定化或抑制病毒粒子的生长的方法。治疗受试者的病毒感染(例如，流感病毒感染)的方法包括向所述受试者施用本文所述的缀合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者的缀合物)或其药物组合物。在一些实施方案中，所述病毒感染是由流感病毒(例如，流感病毒A、B、C或副流感病毒)引起。在一些实施方案中，所述病毒感染是由抗性病毒株引起。预防、稳定化或抑制病毒粒子的生长或预防病毒的复制及扩散的方法包括使所述病毒或易经受病毒生长的位点与本文所述的缀合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者的缀合物)或其药物组合物接触。
本公开还提供一种在患有继发感染(例如，继发细菌感染、继发病毒感染或继发真菌感染)或处于发展继发感染的风险中的受试者中进行保护以抵御或治疗病毒感染(例如，流感病毒感染)的方法，其中所述方法包括向受试者施用本文所述的缀合物或组合物。本公开进一步提供一种在诊断患有流感感染的受试者中预防继发感染的方法，其中所述方法包括向受试者施用本文所述的缀合物或组合物。在一些实施方案中，所述继发感染是细菌感染(例如，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、肺炎链球菌、铜绿假单胞菌及/或流感嗜血杆菌)、病毒感染或真菌感染。在特定实施方案中，所述继发感染为MRSA。在某些实施方案中，所述继发感染是肺炎链球菌。在一些实施方案中，所述继发感染是呼吸道感染(例如，呼吸道的感染)。在一些实施方案中，所述继发感染与(例如，引起)肺炎(例如，细菌性或病毒性肺炎)相关联。在一些实施方案中，所述受试者患有肺炎或处于发生肺炎的风险中。
此外，本文所述的方法也包括通过向受试者施用本文所述的缀合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者的缀合物)来进行保护以抵御或治疗受试者的病毒感染的方法。在一些实施方案中，所述方法进一步包括向所述受试者施用抗病毒剂或抗病毒疫苗。
本文所述的方法也包括通过向受试者施用(1)本文所述的缀合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者的缀合物)及(2)抗病毒剂或抗病毒疫苗来进行保护以抵御或治疗所述受试者的病毒感染的方法。本文所述的方法也包括通过使病毒或易经受病毒生长的位点与(1)本文所述的缀合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者的缀合物)及(2)抗病毒剂或抗病毒疫苗接触来预防、稳定化或抑制病毒粒子的生长或预防病毒的复制或扩散的方法。
在一些实施方案中，首先施用本文所述的缀合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者的缀合物)，随后单独施用抗病毒剂或抗病毒疫苗。在一些实施方案中，首先施用抗病毒剂或抗病毒疫苗，随后单独施用本文所述的缀合物。在一些实施方案中，实质上同时施用本文所述的缀合物及抗病毒剂或抗病毒疫苗(例如，在同一药物组合物中或在独立药物组合物中)。在一些实施方案中，首先施用本文所述的缀合物或抗病毒剂或抗病毒疫苗，随后实质上同时施用本文所述的缀合物及抗病毒剂或抗病毒疫苗(例如，在同一药物组合物中或在独立药物组合物中)。在一些实施方案中，首先实质上同时施用本文所述的缀合物及抗病毒剂或抗病毒疫苗(例如，在同一药物组合物中或在独立药物组合物中)，随后单独施用本文所述的缀合物或抗病毒剂或抗病毒疫苗。在一些实施方案中，当本文所述的缀合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者的缀合物)及抗病毒剂或抗病毒疫苗合起来(例如，在同一或独立药物组合物中实质上同时，或在同一治疗方案中独立地)经施用时，所述缀合物及所述抗病毒剂或抗病毒疫苗中每一者对病毒复制的抑制可大于(例如，在较低浓度下出现)当在治疗方案中单独使用每一者时所述缀合物及所述抗病毒剂或抗病毒疫苗中每一者对病毒复制的抑制。
VIII.药物组合物及制剂
本文所述的缀合物可被配制于用于本文所述的方法的药物组合物中。在一些实施方案中，本文所述的缀合物可单独被配制于药物组合物中。在一些实施方案中，本文所述的缀合物可与抗病毒剂或抗病毒疫苗组合被配制于药物组合物中。在一些实施方案中，所述药物组合物包含本文所述的缀合物(例如，由式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者描述的缀合物)及药学上可接受的载剂及赋形剂。
所述药物组合物中可接受的载剂及赋形剂在所采用的剂量及浓度下对接受者无毒。可接受的载剂及赋形剂可包括缓冲液，诸如磷酸盐、柠檬酸盐、HEPES及TAE；抗氧化剂，诸如抗坏血酸及蛋氨酸；防腐剂，诸如氯化六烃季铵、十八烷基二甲基苯甲基氯化铵、间苯二酚及苯扎氯铵；蛋白质，诸如人血清白蛋白、明胶、葡聚糖及免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸残基，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、组氨酸及赖氨酸；及碳水化合物，诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖及山梨糖醇。
其他赋形剂的实例包括但不限于抗粘剂、粘合剂、包衣、压缩助剂、崩解剂、染料、滑润剂、乳化剂、填充剂(稀释剂)、成膜剂或包衣、调味剂、芳香剂、助流剂(流动增强剂)、润滑剂、吸附剂、悬浮或分散剂或甜味剂。例示性赋形剂包括但不限于：丁基化羟基甲苯(BHT)、碳酸钙、磷酸钙(一氢)、硬脂酸钙、交联羧甲纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、柠檬酸、交联聚维酮、半胱氨酸、乙基纤维素、明胶、羟基丙基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、乳糖、硬脂酸镁、麦芽糖醇、甘露糖醇、蛋氨酸、甲基纤维素、对羟基苯甲酸甲酯、微晶纤维素、聚乙二醇、聚维酮、预胶化淀粉、对羟基苯甲酸丙酯、视黄醇棕榈酸酯、虫胶、二氧化硅、羧基甲基纤维素钠、柠檬酸钠、乙醇酸淀粉钠、山梨糖醇、淀粉(玉米)、硬脂酸、硬脂酸、蔗糖、滑石、二氧化钛、维他命A、维他命E、维他命C及木糖醇。
本文中的缀合物可具有可离子化基团以便能够呈药学上可接受的盐形式制备。这些盐可为涉及无机或有机酸的酸加成盐，或所述盐在本文中的缀合物的酸性形式的情况下可由无机或有机碱制备。所述缀合物经常地呈药学上可接受的盐形式经制备或使用，所述药学上可接受的盐呈药学上可接受的酸或碱的加成产物形式经制备。合适的药学上可接受的酸及碱在本领域中是熟知的，诸如盐酸、硫酸、氢溴酸、乙酸、乳酸、柠檬酸或酒石酸，用于形成酸加成盐，以及氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化铵、咖啡因、各种胺等，用于形成碱性盐。用于制备适当的盐的方法在本领域中是充分确立的。
代表性酸加成盐包括但不限于乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙烷磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙烷磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟碱酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一烷酸盐及戊酸盐。代表性碱金属或碱土金属盐包括但不限于钠、锂、钾、钙及镁；以及无毒铵、季铵及胺阳离子，包括但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺及乙胺。
视施用途径及剂量而定，用于本文所述的方法中的本文中的缀合物或其药物组合物将被配制成合适药物组合物以允许容易递送。缀合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者的缀合物)或其药物组合物可被配制以肌肉内、静脉内(例如，呈无菌溶液形式且在适用于静脉内使用的溶剂系统中)、皮内、动脉内、腹膜内、病变内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、经表面、肿瘤内、经腹膜、皮下、结膜下、囊内、经粘膜、心包内、脐内、眼内、经口(例如，片剂、胶囊、囊片、囊形片或糖浆)、经表面(例如，呈乳膏、凝胶、洗剂或软膏形式)、经局部、通过吸入、通过注射或通过输注(例如，以乳膏或脂质组合物形式连续输注、直接地浸泡靶标细胞的局部灌注、置管、灌洗)经施用。视施用途径而定，本文中的缀合物或其药物组合物可呈例如片剂、胶囊、丸剂、粉剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、凝胶剂(包括水凝胶剂)、糊剂、软膏剂、乳膏剂、膏药、灌药、渗透递送器件、栓剂、灌肠剂、可注射剂、植入物、喷雾剂、适用于离子导入递送的制剂或气雾剂的形式。可以根据常规医药实践来配制组合物。
本文所述的缀合物可以本领域中已知的多种方式进行配制。关于用作人及动物受试者的治疗，本文所述的缀合物可被配制为药物或兽医学组合物。视待治疗的受试者(例如，人)、施用方式及所需治疗类型(例如，预防或疗法)而定，本文所述的缀合物以与这些参数一致的方式进行配制。所述技术的概述发现于Remington:The Science and PracticeofPharmacy,第22版,Lippincott Williams&Wilkins(2012)；及EncyclopediaofPharmaceutical Technology,第4版,J.Swarbrick及J.C.Boylan,Marcel Dekker,NewYork(2013)中，所述文献各自以引用的方式并入本文中。
可以适合全身施用或局部(topical)或局部(local)施用的方式制备制剂。全身性制剂包括设计用于注射(例如，肌肉内、静脉内或皮下注射)的那些制剂，或者可以制备成用于透皮、透粘膜或口服施用。所述制剂一般将包含稀释剂以及在一些情况下佐剂、缓冲液及防腐剂。所述缀合物也可呈脂质体组合物形式或呈微乳液形式经施用。全身性施用也可以包括相对无创的方法，诸如使用栓剂、透皮贴剂、透粘膜递送及鼻内施用。经口施用也适用于本文中的缀合物。如本领域所理解的，合适的形式包括糖浆、胶囊及片剂。
所述药物组合物可呈可注射制剂形式非经肠施用。用于注射的药物组合物可使用无菌溶液或任何药学上可接受的液体作为媒介物进行配制。制剂可被制备为适用于在注射之前溶解或悬浮于液体中的固体形式或制备为乳液。药学上可接受的媒介物包括但不限于无菌水、生理盐水及细胞培养基(例如，杜氏改良伊格尔培养基(Dulbecco’s ModifiedEagle Medium)(DMEM)、α改良伊格尔培养基(α-Modified Eagles Medium)(α-MEM)、F-12培养基)。所述可注射组合物也可含有一定量的无毒辅助物质，诸如湿润或乳化剂、pH缓冲剂，诸如乙酸钠及山梨醇酐单月桂酸酯。配制方法为本领域中已知的，参见例如Pharmaceutical Preformulation and Formulation,第2版,M.Gibson,Taylor&FrancisGroup,CRC Press(2009)。
所述药物组合物可呈口服制剂形式经制备。用于口服使用的制剂包括含有与无毒的药学上可接受的赋形剂混合的活性成分的片剂。这些赋形剂可以是例如惰性稀释剂或填充剂(例如，蔗糖、山梨糖醇、糖、甘露糖醇、微晶纤维素、包括马铃薯淀粉的淀粉、碳酸钙、氯化钠、乳糖、磷酸钙、硫酸钙或磷酸钠)；制粒剂及崩解剂(例如，包括微晶纤维素的纤维素衍生物、包括马铃薯淀粉的淀粉、交联羧甲纤维素钠、藻酸盐或藻酸)；粘合剂(例如，蔗糖、葡萄糖、山梨糖醇、阿拉伯胶、藻酸、藻酸钠、明胶、淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、硅酸镁铝、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇)；以及润滑剂、助流剂及抗粘剂(例如，硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸、二氧化硅、氢化植物油或滑石)。用于口服使用的制剂也可呈可咀嚼片剂形式，或呈硬明胶胶囊形式，其中活性成分与惰性固体稀释剂(例如，马铃薯淀粉、乳糖、微晶纤维素、碳酸钙、磷酸钙或高岭土)混合，或呈软明胶胶囊形式，其中活性成分与水或油介质(例如，花生油、液体石蜡或橄榄油)混合。粉剂、颗粒剂及丸剂可以使用上文在片剂或胶囊下提到的成分以常规方式使用例如混合器、流化床设备或喷雾干燥设备来制备。
用于口服制剂的其他药学上可接受的赋形剂包括但不限于着色剂、调味剂、增塑剂、保湿剂及缓冲剂。用于口服使用的制剂也可呈可咀嚼片剂形式，或呈硬明胶胶囊形式，其中活性成分与惰性固体稀释剂(例如，马铃薯淀粉、乳糖、微晶纤维素、碳酸钙、磷酸钙或高岭土)混合，或呈软明胶胶囊形式，其中活性成分与水或油介质(例如，花生油、液体石蜡或橄榄油)混合。粉剂、颗粒剂及丸剂可以使用上文在片剂或胶囊下提到的成分以常规方式使用例如混合器、流化床设备或喷雾干燥设备来制备。
本文所述的缀合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者的缀合物)或其药物组合物的溶解或扩散受控释放可通过所述缀合物的片剂、胶囊、集结粒或颗粒剂制剂的适当包衣，或通过将所述缀合物并入至适当基质中来实现。受控释放包衣可以包含一种或多种以上提到的包衣物质及/或例如虫胶、蜂蜡、糖蜡、蓖麻蜡、巴西棕榈蜡、硬脂醇、单硬脂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、棕榈硬脂酸甘油酯、乙基纤维素、丙烯酸树脂、dl-聚乳酸、乙酸丁酸纤维素、聚氯乙烯、聚乙酸乙烯酯、乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯、聚甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸甲酯、2-羟基甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯水凝胶、1,3-丁二醇、乙二醇甲基丙烯酸酯及/或聚乙二醇。在受控释放基质制剂中，基质材料还可以包括例如水合的甲基纤维素、巴西棕榈蜡和硬脂醇、卡波姆934(carbopol 934)、硅酮、三硬脂酸甘油酯、丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯、聚乙烯及/或卤代碳氟化合物。
所述药物组合物可如所需呈单位剂型形成。包括于所述药物组合物中的活性组分(例如，本文所述的缀合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)))的量使得提供在指定范围内的合适剂量(例如，在每千克体重0.01-100mg的范围内的剂量)。
IX.施用途径及剂量
在本文所述的任何方法中，本文中的缀合物可通过用于治疗或进行保护以抵御病毒感染(例如，流感感染)，或用于预防、稳定化或抑制病毒(例如，流感病毒)的增殖或扩散的任何适当途径经施用。本文所述的缀合物可与药学上可接受的稀释剂、载剂或赋形剂施用于人、家养宠物、家畜或其他动物。在一些实施方案中，施用包括经肌肉内、静脉内(例如，呈无菌溶液形式且在适用于静脉内使用的溶剂系统中)、皮内、动脉内、腹膜内、病变内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、经表面、肿瘤内、经腹膜、皮下、结膜下、囊内、经粘膜、心包内、脐内、眼内、经口(例如，片剂、胶囊、囊片、囊形片或糖浆)、经表面(例如，呈乳膏、凝胶、洗剂或软膏形式)、经局部、通过吸入、通过注射或通过输注(例如，以乳膏或脂质组合物形式连续输注、直接地浸泡靶标细胞的局部灌注、置管、灌洗)施用本文所述的缀合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者的缀合物)或组合物中任一者。在一些实施方案中，若除了本文所述的缀合物以外也施用抗病毒剂，则所述抗病毒剂或其药物组合物也可以本文所述的施用途径中任一者经施用。
本文所述的缀合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I))或其药物组合物的剂量取决于如下因素，包括施用途径、待治疗的疾病(例如，病毒感染的程度及/或病状)及物理特征，例如受试者的年龄、重量、一般健康状况。典型地，含于单一剂量内的所述缀合物或其药物组合物的量可为有效地预防、延迟或治疗病毒感染而不诱导显著毒性的量。药物组合物可包含介于0.01至500mg/kg范围内(例如，0.01、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、150、200、250、300、350、400、450或500mg/kg)且在一更特定实施方案中介于约0.1至约30mg/kg范围内且在一更特定实施方案中介于约1至约30mg/kg范围内的剂量的本文所述的缀合物。在一些实施方案中，当本文所述的缀合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者的缀合物)及抗病毒剂或抗病毒疫苗组合(例如，在同一或独立药物组合物中实质上同时，或在同一治疗方案中独立地)经施用时，本文所述的缀合物的所需剂量可低于若治疗方案中单独使用所述缀合物时所述缀合物的所需剂量。
本文所述的缀合物(例如，式(1)-(5)、(D-I)-(D-XI)、(D’-I)、(M-I)-(M-XI)或(M’-I)中任一者的缀合物)或其药物组合物可例如每天、每周、每月、每半年、每年一次或多次(例如，1-10次或更多次；1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次)，或当医学上必要时向有需要的受试者施用。剂量可以单一或多剂量方案经提供。施用之间的时间安排可在医学病状改善时减少，或在患者的健康状况下降时增加。施用的剂量及频率可由医师根据诸如感染程度及受试者的不同参数的常规因素来调适。
实施例
提出以下实施例以便向本领域一般技术者提供可如何使用、制备及评估本文所述的组合物及方法的描述，且旨在仅例示本发明而不旨在限制被本发明者视为其发明的发明的范围。
实施例1：制备Fc构建体
构成蛋白构建体的氨基酸(SEQ ID NO:1、3、5、7、9、12及14)的逆翻译通过固相合成来合成。寡核苷酸模板经克隆至pcDNA3.1(Life Technologies,Carlsbad,CA,USA)中的克隆位点BamHI及XhoI(New England Biolabs,Ipswich,MA,USA)处且包括源于人白介素-2或人白蛋白的信号序列。所述pcDNA3.1质粒被转化至Top10大肠杆菌细胞(LifeTech)中。使用
Figure BDA0003630331990004681
HiPure Plasmid Filter Maxiprep试剂盒(LifeTech)对DNA进行扩增，萃取，且纯化。所述质粒DNA使用ExpiFectamineTM 293转染试剂盒(LifeTech)根据制造商的方案被递送至HEK-293细胞中。细胞经离心，过滤，且使用MabSelect Sure Resin(GEHealthcare,Chicago,IL,USA)纯化上清液。经纯化分子使用4-12％Bis Tris SDS PAGE凝胶通过将1-2μg每种分子装载至所述凝胶中且使用instant Blue染色进行染色而经分析。每种凝胶包括具有经指示分子量标准的分子量梯(图2-8)。还原及非还原泳道由“R”及“NR”表示。图2-8显示由分别具有SEQ ID NO:1、3、5、7、9、12及14的序列的Fc结构域单体形成的Fc结构域的非还原及还原SDS-PAGE。
实施例2.扎那米韦中间体的合成
Figure BDA0003630331990004691
步骤a.
Figure BDA0003630331990004692
5-乙酰氨基-7,8,9-O-三乙酰基-2,6-脱水-4-叠氮基-3,4,5-三脱氧-D-甘油-D-半乳糖-壬-2-烯酸甲酯(4.56g,10.0mmol)溶解于无水THF(15mL)中，且溶液冷却至大约13℃。经20分钟分成数份添加三苯基膦(2.89g，11mmol)。所得混合物在大约13℃至室温下经搅拌持续2小时，接着逐滴添加LiOH(24mg，1mmol)于水(1.5mL)中的溶液。在搅拌持续28小时之后，向反应混合物中添加N,N’-双-boc-1-脒基吡唑(3.26g，10.5mmol)及4-二甲基氨基吡啶(244.4mg，2mmol)。所述反应搅拌持续1.5天。其接着用乙酸乙酯:己烷的1:1混合物(100mL)稀释且用水(30mL)萃取。水层用乙酸乙酯(30mL)反萃取。通过旋转蒸发浓缩所合并的有机层。残余物经由C18反相柱色谱法(150g，25至70％乙腈及水)经纯化。所收集的洗脱份在室温下通过旋转蒸发经浓缩。产生浑浊水溶液且大部分产物呈凝胶形式沉积于烧瓶上。所述溶液接着用乙酸乙酯(150mL)萃取。使用有机层再溶解凝胶材料。其接着经Na2SO4干燥，通过旋转蒸发经浓缩，且进一步在高真空下干燥以提供呈白色泡沫状的标题化合物。产量6.24g，产率92.8％。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝673.2。
步骤b.
Figure BDA0003630331990004701
来自步骤-a的产物(6.24g，9.28mmol)于无水MeOH(20mL)中的溶液在冰水浴中冷却且缓慢地添加甲醇钠于MeOH中的0.5M溶液(26mL，13mmol)。所述反应搅拌持续1小时，接着通过逐滴添加HCl于二恶烷(3mL)中的4N溶液小心地将其pH调节至7至7.5。在不高于室温的温度下通过旋转蒸发移除溶剂。残余物用乙酸乙酯及己烷的2:1混合物(150mL)稀释，且所得溶液用水(20mL)萃取。水层用乙酸乙酯(30mL)反萃取。经组合的有机层经Na2SO4干燥，通过旋转蒸发经浓缩，且进一步在高真空下干燥。产物无需进一步纯化继续用于后续步骤。产量5.03g，产率99.2％。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝547.2。
步骤c.
Figure BDA0003630331990004711
无水DCM(6mL)中的步骤-b产物(713mg，1.3mmol)在冰水浴中冷却且添加4-二甲基氨基吡啶(159.8mg，1.3mmol)及DIPEA(520mg，4mmol)。接着向所述混合物中逐滴添加氯甲酸4-硝基苯酯(356.6mg，2.2mmol)于无水DCM(2mL)中的溶液。接着移除冰水浴，且所述反应混合物搅拌持续3小时且通过LCMS进行监测(需要时可添加额外氯甲酸4-硝基苯酯)。在所述反应完成之后，其用水(10mL)淬灭，且有机层经萃取且通过旋转蒸发经浓缩。残余物通过C18反相柱色谱法(100g，20至70％乙腈及水)经纯化。所收集的洗脱份中的乙腈在室温下通过旋转蒸发经移除。水层接着用乙酸乙酯及己烷的1:1混合物(120mL)萃取。水层用乙酸乙酯(30mL)反萃取。经组合的有机层经Na2SO4干燥，通过旋转蒸发经浓缩，且进一步在高真空下干燥以提供呈白色固体状的标题化合物。产量520mg，产率70％。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝573.2。
实施例3.接头-1的合成
Figure BDA0003630331990004712
步骤a.
Figure BDA0003630331990004721
经25分钟分成数份向Z-D-谷氨酸γ-甲酯(2.0g，6.77mmol)及甘氨酸甲酯HCl(1.282g，10.2mmol)于无水DMF(7mL)中的混合物中相继添加DIPEA(2.02g，15.57mmol)、HATU(2.66g，7.0mmol)。在HATU溶解之后，添加额外量的DIPEA(1.15g，8.8mmol)。所述反应混合物搅拌持续1.5小时，接着用5％HCl水溶液(100mL)及EtOAc(100mL×2)萃取。有机层通过旋转蒸发经浓缩。残余物用水(100mL)及EtOAc/己烷(2:1，150mL)再萃取。有机层经Na2SO4干燥，通过旋转蒸发经浓缩且进一步在高真空下干燥为白色固体。粗产物无需进一步纯化继续用于后续步骤。产量2.3g，产率93％。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝367。
步骤b.
Figure BDA0003630331990004722
步骤-a产物(2.3g，6.29mmol)溶解于MeOH及THF的1:1混合物(10mL)中。在所述溶液在冰水浴中冷却之后，经1.5小时分成数份添加水(9mL)中的LiOH单水合物(630mg，15mmol)溶液。再搅拌持续2小时之后，所述反应混合物用二恶烷(3.7mL)中的4NHCl中和。有机溶剂在室温下通过旋转蒸发部分地经移除。剩余材料直接地通过RPLC(150g，0至39％乙腈及水)经纯化。经两个步骤，产量2.03g，产率88.7％。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝339.2。
步骤c.
Figure BDA0003630331990004723
借助于注射泵以11mL/h的速率向步骤-b产物(1.41g，4.17mmol)及N-Boc-1,6-二氨基己烷(1.99g，9.2mmol)于无水DMF(6mL)及DIPEA(1.3g，10mmol)中的混合物中添加HATU(3.5g，9.2mmol)于DMF(10mL)中的溶液。在HATU完成添加时，所述反应再搅拌持续30分钟且直接地通过RPLC(150g，10至50％乙腈及水，使用0.1％TFA作为修饰剂)经纯化。产量1.3g，产率42.4％。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝735,[M–Boc+H]+＝635.4。
步骤d.
Figure BDA0003630331990004731
步骤-c产物(1.3g，1.77mmol)溶解于MeOH(20mL)中，且Pd/C添加至所述溶液中。所述混合物在氢气下搅拌持续4小时。滤出Pd/C，且滤液通过旋转蒸发经浓缩且进一步在高真空下干燥。产量1.03g，产率96.9％。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝601。
步骤e.
Figure BDA0003630331990004732
经火焰干燥的反应烧瓶用氮气冲洗且馈入4-叠氮基丁酸(77mg，0.6mmol)、N-羟基丁二酰亚胺(92mg，0.8mmol)及无水DMF(0.5mL)。所述混合物经搅拌以溶解固体，且接着添加DCC(125.5mg，0.608mmol)。在搅拌持续一小时之后，添加步骤-d产物(300mg，0.5mmol)至所述反应混合物中。所述反应经搅拌持续6小时且直接地使用RPLC(150g，10至70％乙腈及水，使用01.％TFA作为修饰剂)经纯化。所收集的洗脱份经冻干成白色固体(LCMS：[M+H]+＝712,[M–Boc+H]+＝612)。所述材料再溶解于DCM(约2mL)及TFA(约1mL)中且搅拌持续15分钟。其接着通过旋转蒸发经浓缩，且残余物通过RPLC(50g，0至40％乙腈及水)经纯化。产量255mg，产率68.9％。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝512,[(M+2H)/2]+＝256。
实施例4.合成Int-1
Figure BDA0003630331990004741
步骤a.
Figure BDA0003630331990004742
向扎那米韦中间体(实施例2)(532.5mg，0.93mmol)于无水THF(2mL)中的溶液中相继添加DMAP(490mg，4mmol)、碳酸双(五氟苯基)酯(385mg，0.911mmol)。在搅拌过夜之后，接头-1(实施例3)(245.6mg，0.332mmol)于无水DMF(1mL)及DIPEA(91mg，0.3mmol)中的溶液添加至所述反应混合物中。所述反应继续进行2小时，接着通过RPLC(100g，5至67％乙腈及水)经纯化。产量135mg，产率23.8％。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝845.9。
步骤b.
Figure BDA0003630331990004751
步骤-a产物(135mg，0.079mmol)溶解于TFA(0.5mL)中，且所述溶液在室温下搅拌持续20分钟。其接着直接地通过RPLC(50g，5至32％乙腈及水)经纯化。产量88mg，产率85.1％。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝654.8。
步骤c.
Figure BDA0003630331990004752
步骤-b产物(88mg，0.0673mmol)于MeOH(1.5mL)中的溶液在冰水浴中冷却且添加水(0.5mL)中的LiOH(5mg，0.2mmol)。在所述混合物搅拌持续5小时之后，其用二恶烷(0.1mL)中的4N HCl溶液酸化且通过HPLC(5至20％乙腈及水，使用0.1％TFA作为修饰剂)经纯化。产量76.4mg，产率78％。通过LCM发现的离子：[(M+2H)/2]+＝614.8。
实施例5.接头-2的合成
Figure BDA0003630331990004761
步骤a.
Figure BDA0003630331990004762
向炔丙基-PEG4-酸(364.4mg，1.4mmol)于无水DMF(2mL)中的溶液中添加HATU(558.9mg，1.47mmol)。在搅拌以溶解所有偶合试剂之后，添加DIPEA(390mg，3mmol)且搅拌持续10分钟。添加接头-1步骤-d产物(实施例3，步骤d)(701.1mg，1.167mmol)于无水DMF(1mL)中的溶液。所得混合物经搅拌持续30分钟且直接地通过RPLC(100g，5至60％乙腈及水)经纯化。产量830mg，产率84.4％。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝843。
步骤b.
Figure BDA0003630331990004763
步骤-a产物溶解于THF(5mL)中且用二恶烷(2.5mL)中的4NHCl溶液处理。在室温下搅拌过夜之后，所述反应混合物通过旋转蒸发经浓缩。残余物再溶解于乙腈/水(1:1，16mL)中，且所述溶液经冻干。粗产物无需进一步纯化继续用于后续步骤。产量761.8mg，产率100％。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝643.8。
实施例6.合成Int-2
Figure BDA0003630331990004771
步骤a.
Figure BDA0003630331990004772
经火焰干燥的反应烧瓶用氮气冲洗且馈入扎那米韦中间体(实施例2)(533.6mg，0.812mmol)、DMAP(99.8mg，0.81mmol)及无水DCM(1mL)。在搅拌以溶解起始材料之后，所述溶液在冰水浴中冷却且添加氯甲酸4-硝基苯酯(242mg，1.2mmol)。所得混合物经搅拌持续5小时，接着添加至接头-2(实施例5)(228.4mg，0.319mmol)于无水DMF(1mL)及DIPEA(130mg，1mmol)中的溶液中。所述反应经搅拌过夜且通过RPLC(150g，20至65％乙腈及水，使用0.1％TFA作为修饰剂)经纯化。所收集的洗脱份经冻干。产量178.3mg，产率30.4％。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝920.5,[(M+3H)/3]+＝614.2。
步骤b.
Figure BDA0003630331990004781
步骤-a产物(178.3mg，0.0969mmol)溶解于TFA(0.5mL)中。所述反应经搅拌持续20分钟，接着直接地通过HPLC(0至25％乙腈及水，使用0.1％TFA作为修饰剂)经纯化。产量91.8mg，产率56.8％。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝720.4,[(M+3H)/3]+＝480.6。
步骤c.
Figure BDA0003630331990004782
步骤-b产物(91.8mg，0.055mmol)溶解于MeOH(1mL)中，且所述溶液在冰水浴中冷却。经1小时分成数份添加水(1mL)中的LiOH单水合物(21mg，0.5mmol)。再搅拌持续2小时之后，所述反应混合物用二恶烷(0.3mL)中的4N HCl溶液酸化且通过HPLC(0至20％乙腈及水，使用0.1％TFA作为修饰剂)经纯化。产量36.2mg，产率59.4％。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝680.3,[(M+3H)/3]+＝454.0。
实施例7.合成h-IgG1 Fc-PEG4-叠氮化物
PEG4-叠氮基NHS酯(98％，180μmol，4.5当量，71.4mg在0.5mL的DMF中且用pH7.4PBS 1x缓冲溶液稀释至3.60mL)经添加到h-IgG1 Fc(SEQ ID NO:4)溶液(1103mg在70.0mL的pH 7.4PBS中，MW约58,000Da，19.0μmol)中且混合物在环境温度下轻柔地经振荡持续12小时。所述溶液使用离心浓缩机(30,000MWCO)经浓缩至约1.5mL的体积。粗混合物1:10稀释于PBS pH 7.4中，且再次经浓缩。重复此洗涤程序，共计三次。用此洗涤程序移除小分子试剂。经浓缩Fc-PEG4-叠氮化物用pH 7.4PBS 1x缓冲液稀释至70.0mL且准备用于点击缀合。经纯化材料使用NanodropTM UV可见光光谱仪(使用基于h-IgG1的氨基酸序列计算的消光系数)来量化。产率是在纯化之后定量的。通过MALDI测定，DAR＝4.3。DAR值可通过以接近线性关系改变PEG4-叠氮基NHS酯的当量数经调节。例如，当使用7.0当量的PEG4-叠氮化物NHS酯时，DAR值将为3.0。
编码本文所述的任何缀合物的Fc的核酸构建体可包含编码包含氨基酸Lys447(例如，C端赖氨酸残基)的Fc的核酸序列。在表达后，Fc的C端赖氨酸被蛋白水解切割，导致Fc具有缺少Lys447(例如，缺少C端赖氨酸残基)的序列。C端赖氨酸的存在与否不会改变Fc或对应缀合物的特性。
实施例8.合成重组小鼠血清白蛋白(MSA)-PEG4-叠氮化物
PEG4-叠氮基NHS酯(98％，81.7μmol，4.5当量，32.4mg在0.3mL的DMF中且用pH7.4PBS 1x缓冲溶液稀释至1.63mL)经添加到重组小鼠血清白蛋白(SEQ ID NO:80)溶液(1200mg在75.0mL的pH 7.4PBS中，MW约66,000Da，18.2μmol)中且混合物在环境温度下轻柔地经振荡持续12小时。所述溶液使用离心浓缩机(30,000MWCO)经浓缩至约1.5mL的体积。粗混合物1:10稀释于PBS pH 7.4中，且再次经浓缩。重复此洗涤程序，共计三次。用此洗涤程序移除小分子试剂。经浓缩MSA-PEG4-叠氮化物用pH 7.4PBS 1x缓冲液稀释至75.0mL且准备用于点击缀合。经纯化材料使用NanodropTM UV可见光光谱仪(使用基于h-IgG1的氨基酸序列计算的消光系数)来量化。产率是在纯化之后定量的。通过MALDI测定，DAR＝3.5。DAR值可类似于h-IgG1 Fc(实施例7)通过改变PEG4-叠氮基NHS酯的当量数经调节。
实施例9.合成缀合物1
h-IgG1 Fc-PEG4-叠氮化物(实施例7)(50mg，2.815mL，0.8591μmol)的PBS溶液添加至含有Int-2(实施例6)(35.2mg，0.02217mmol)的15mL离心管中。在轻柔地振荡所述混合物以溶解所有Int-2之后，添加344μl L-抗坏血酸钠(59.4mg，0.3mmol)、硫酸铜(II)(10mg，0.05mmol)及THPTA(23mg，0.05mmol)于PBS 7.4缓冲液(1mL)中的溶液。所得混合物轻柔地振荡过夜。其相继通过在蛋白A柱上的亲和力色谱法、如实施例8所述的尺寸排阻色谱法经纯化。经纯化最终产物的Maldi TOF分析给出63797Da的平均质量(DAR＝3.4)。产量27.39mg，55％产率。图9显示缀合物1的非还原SDS-PAGE。
实施例10.缀合物的纯化
粗混合物1:10稀释于PBS pH 7.4中，且相继使用MabSelect Sure Resin(GEHealthcare,Chicago,IL,USA)、尺寸排阻色谱法经纯化。(HiLoad 26/600Superdex200 pg,GEHealthcare,Chicago,IL,USA)。汇集含有经纯化缀合物的洗脱份且使用离心浓缩机(30,000MWCO)经浓缩至大约20mg/mL。经纯化材料使用NanodropTM UV可见光光谱仪使用基于hIgG1 Fc(myc)的氨基酸序列计算的消光系数来量化。经纯化分子使用4-12％Bis TrisSDS PAGE凝胶通过将1μg每种分子装载至所述凝胶中且使用Instant Blue(Expedeon,SanDiego,CA,USA)进行染色而经分析。每种凝胶包括具有经指示分子量标准的分子量梯。通过AgilentAnalytical HPLC计算产量且测定纯度。通过Maldi MS发现产物峰及MW且计算最终DAR。
实施例11.合成Int-3
Figure BDA0003630331990004811
步骤a.
Figure BDA0003630331990004812
向炔丙基-PEG4-酸(260mg，1mmol)及HATU(380.2mg，1mmol)于无水DMF(1mL)中的溶液中添加DIPEA(130mg)。在搅拌5分钟之后，添加NH-双(PEG3-Boc)(500mg，0.881mmol)且在室温下继续搅拌过夜。其接着直接地通过RPLC(9100g，5至50％乙腈及水，使用0.1％TFA作为修饰剂)经纯化。产量683mg，产率95.8％。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝810.4,[M-Boc+H]+＝710.4,[(M-2Boc+2H)/2]+＝305.8。
步骤b.
Figure BDA0003630331990004821
步骤-a产物溶解于TFA(1mL)中。所述溶液经搅拌持续2小时且接着直接地经由RPLC(100g，0至30％乙腈及水)经纯化。产量589mg，产率98.7％。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝305.8。
步骤c.
Figure BDA0003630331990004822
经火焰干燥的反应烧瓶用氮气冲洗且馈入扎那米韦中间体(实施例2)(572mg，1mmol)及无水DCM(1mL)。在搅拌以溶解起始材料之后，所述溶液在冰水浴中冷却且相继添加氯甲酸4-硝基苯酯(302.4mg，1.5mmol)、DMAP(22.4mg，0.2mmol)。所得混合物经搅拌持续5小时，接着添加淬灭水(0.2mL)。在搅拌持续10分钟之后，添加无水DMF(1mL)及DIPEA(163.8mg，1.26mmol)中的步骤-b产物(256.7mg，0.355mmol)。继续搅拌持续2小时且接着所述反应直接地通过RPLC(150g，20至65％乙腈及水，使用0.1％TFA作为修饰剂)经纯化。所收集的洗脱份经冻干。所需产物的产量422.8mg，其受到一些杂质污染，<69％产率。所述材料无需进一步纯化继续用于后续步骤。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝903.9,[(M+3H)/3]+＝603.2。
步骤d.
Figure BDA0003630331990004831
步骤-c产物(422.8mg，<0.245mmol)溶解于TFA(1mL)中。所述反应经搅拌持续20分钟，接着直接地通过HPLC(5至25％乙腈及水，使用0.1％TFA作为修饰剂)经纯化。经两个步骤，产量169.7mg，产率29.2％。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝704.0,[(M+3H)/3]+＝469.6。
步骤e.
Figure BDA0003630331990004832
步骤-d产物(169.7mg，0.0923mmol)溶解于MeOH(1.5mL)中，且所述溶液在冰水浴中冷却。经1小时分成数份添加水(1mL)中的LiOH单水合物(21mg，0.5mmol)。在搅拌过夜之后，所述反应混合物用Dowex 50W x 8氢型酸化且经由RPLC(0至30％乙腈及水，使用0.1％TFA作为修饰剂)经纯化。产量107.9mg，产率66.9％。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝663.8,[(M+3H)/3]+＝442.9。
实施例12.合成缀合物2
类似于缀合物1(实施例9)使用Int-3(实施例11)制备标题缀合物。经纯化最终产物的Maldi TOF分析给出63561Da的平均质量(DAR＝3.3)。产量43.4mg，43％产率。图10显示缀合物2的非还原SDS-PAGE。
实施例13.合成Int-4
Figure BDA0003630331990004841
步骤a.
Figure BDA0003630331990004842
经火焰干燥的反应烧瓶用氮气冲洗且馈入扎那米韦中间体(实施例2)(343.2mg，0.6mmol)及无水DCM(1.5mL)。所述溶液在冰水浴中冷却且相继添加DIPEA(234mg，1.8mmol)、氯甲酸4-硝基苯酯(121mg，0.6mmol)及DMAP(67.4mg，0.6mmol)。所得混合物经搅拌持续15分钟，接着添加额外量的氯甲酸4-硝基苯酯(121mg，0.6mmol)。在搅拌持续2小时之后，添加水(0.2mL)以淬灭未反应的氯甲酸酯。在搅拌持续10分钟之后，向所述反应混合物中添加炔丙基-PEG4-胺(185mg，0.8mmol)于无水DMF(0.5mL)中的溶液。所述反应继续进行1小时且接着直接地经由RPLC(100g，5至60％乙腈及水，使用0.1％TFA作为修饰剂)经纯化。所收集的洗脱份经冻干。产量355mg，产率71.3％。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝830.2。
步骤b.
Figure BDA0003630331990004851
步骤-a产物(355mg，0.428mmol)溶解于TFA(1mL)中。所述溶液经搅拌过夜，接着直接地通过RPLC(5至25％乙腈及水，使用0.1％TFA作为修饰剂)经纯化。经两个步骤，产量260.2mg，产率70.9％。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝630.2。
步骤c.
Figure BDA0003630331990004852
步骤-b产物(260.2mg，0.303mmol)溶解于MeOH(1.5mL)中。在所述溶液在冰水浴中冷却之后，经1小时分成数份添加LiOH单水合物(42mg，1mmol)于水(1mL)中的溶液。所述反应经搅拌过夜，接着用Dowex 50W x 8氢型酸化且通过RPLC(0至50％乙腈及水，使用0.1％TFA作为修饰剂)经纯化。产量78.1mg，产率99％。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝590.2。
实施例14.合成缀合物3
类似于缀合物1(实施例9)使用Int-4(实施例13)制备标题缀合物。经纯化最终产物的Maldi TOF分析给出61182Da的平均质量(DAR＝3.4)。产量50.89mg，51％产率。图11显示缀合物3的非还原SDS-PAGE。
实施例15.合成Int-5
Figure BDA0003630331990004861
步骤a.
Figure BDA0003630331990004862
经火焰干燥的反应烧瓶用氮气冲洗且馈入3-((S)-1-乙酰胺基-2-乙基丁基)-4-(叔丁氧羰基氨基)-2-羟基环戊烷甲酸(1S,2S,3R,4R)-甲酯(320.4mg，0.8mmol)及无水DCM(2mL)。所述溶液在冰水浴中冷却且相继添加DIPEA(312mg，2.4mmol)、氯甲酸4-硝基苯酯(161.3mg，0.8mmol)及DMAP(98mg，0.8mmol)。所得混合物经搅拌持续15分钟，接着添加额外量的氯甲酸4-硝基苯酯(161.3mg，0.8mmol)。所述反应经搅拌持续2小时，接着添加水(0.2mL)以淬灭未反应的氯甲酸酯。在搅拌持续10分钟之后，添加炔丙基-PEG4-胺(259mg，1.12mmol)于无水DMF(0.5mL)中的溶液。所述反应经搅拌持续1小时且接着直接地通过RPLC(100g，5至60％乙腈及水，使用0.1％TFA作为修饰剂)经纯化。所收集的洗脱份经冻干。产量391.2mg，产率74.4％。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝658.3,[M–Boc+H]+＝558.3。
步骤b.
Figure BDA0003630331990004871
步骤-a产物(391.2mg，0.595mmol)溶解于TFA(0.8mL)中，且所述溶液在室温下搅拌持续20分钟。其接着直接地通过RPLC(100g，5至60％乙腈及水)经纯化。产量323.2mg，产率81％。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝558.3。
步骤c.
Figure BDA0003630331990004872
向步骤-b产物(323.2mg，0.482mmol)于THF(2mL)中的溶液中添加N,N’-双-Boc-1-脒基吡唑(224.4mg，0.723mmol)及PIPEA(260mg，2mmol)。所述反应混合物经搅拌持续1天且接着用水(3mL)及EtOAc/己烷(1:1，8mL)萃取。有机层经Na2SO4干燥且通过旋转蒸发经浓缩。残余物再溶解于TFA(约1mL)中，且所述溶液经搅拌过夜。其接着直接地通过RPLC(100g，0至30％乙腈及水，使用0.1％TFA作为修饰剂)经纯化。所收集的洗脱份经冻干。产量254.2mg，产率83.2％。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝600.3,[M–Boc+H]+＝300.6。
步骤d.
Figure BDA0003630331990004881
步骤-c产物(254.2mg，0.356mmol)溶解于THF(1.5mL)中，且所述溶液在冰水浴中冷却。添加CaCl2二水合物(419mg，2.85mmol)，接着经1小时分成数份添加1.8mL水(2mL)中的KOH(112mg，2mmol)。再搅拌持续3小时之后，所述反应混合物通过Dowex 50Wx8氢型酸化且通过RPLC(0至30％乙腈及水，使用0.1％TFA作为修饰剂)经纯化。产量102mg，产率49.8％。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝586.4,[(M+2H)/2]+＝293.8。
实施例16.合成缀合物4
类似于缀合物1(实施例9)使用Int-5(实施例15)制备标题缀合物。经纯化最终产物的Maldi TOF分析给出63002Da的平均质量(DAR＝3.4)。产量49.315mg，49％产率。图12显示缀合物4的非还原SDS-PAGE。
实施例17.合成Int-6
Figure BDA0003630331990004891
步骤a.
Figure BDA0003630331990004892
经火焰干燥的反应烧瓶用氮气冲洗且馈入3-((S)-1-乙酰胺基-2-乙基丁基)-4-(叔丁氧羰基氨基)-2-羟基环戊烷甲酸(1S,2S,3R,4R)-甲酯(280.4mg，0.7mmol)及无水DCM(1mL)。在搅拌以溶解起始材料之后，DMAP(85.7mg，0.7mmol)、碳酸双(五氟苯基)酯(295.6mg，0.75mmol)相继添加至所述溶液中。所得混合物经搅拌持续1小时，接着添加至接头-2(实施例5)(157.5mg，0.22mmol)于无水DMF(1mL)及DIPEA(130mg，1mmol)中的溶液中。所述反应经搅拌过夜且通过RPLC(50g，5至90％乙腈及水)经纯化。所收集的洗脱份经冻干。产量134.1mg，产率40.7％。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝748.6。
步骤b.
Figure BDA0003630331990004901
步骤-a产物(134.1mg，0.0896mmol)溶解于TFA(0.5mL)中。所述溶液经搅拌持续20分钟，接着直接地通过RPLC(50g，5至60％乙腈及水)经纯化。产量108.4mg，产率93.4％。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝648.3,[(M+3H)/3]+＝432.8。
步骤c.
Figure BDA0003630331990004902
向步骤-b产物(108.4mg，0.0837mmol)于无水THF(1mL)中的溶液中添加N,N’-双-Boc-1-脒基吡唑(81.3mg，0.285mmol)及DIPEA(65mg，0.5mmol)。所述反应在室温下经搅拌持续2.5天，接着直接地通过RPLC(100g，40至75％乙腈及水)经纯化。产量73.6mg，产率49.4％。通过LCMS发现的离子：[(M+3H)/3]+＝594.2。
步骤d.
Figure BDA0003630331990004911
步骤-c产物(73.6mg，0.041mmol)溶解于TFA(0.5mL)中。所述溶液经搅拌持续20分钟，接着直接地通过RPLC(50g，5至60％乙腈及水)经纯化。产量62.1mg，产率94.1％。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝690.4,[(M+3H)/3]+＝460.8。
步骤e.
Figure BDA0003630331990004912
THF(3mL)中的步骤-d产物(62.1mg，0.0386mmol)在冰水浴中冷却且经1小时分成数份添加45％w/w KOH溶液(0.2mL)。所述反应再搅拌持续2小时，接着用二恶烷(0.8mL)中的4N HCl溶液酸化且用己烷(10mL)及水(1.5mL)萃取。水层通过HPLC(0至20％乙腈及水，使用0.1％TFA作为修饰剂)经纯化。产量36.2mg，产率59.4％。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝676.5,[(M+3H)/3]+＝451.4。
实施例18.合成缀合物5
类似于缀合物1(实施例9)使用Int-6(实施例17)制备标题缀合物。经纯化最终产物的Maldi TOF分析给出63561Da的平均质量(DAR＝3.3)。产量43.4mg，43％产率。图13显示缀合物5的非还原SDS-PAGE。
实施例19.合成Int-7
Figure BDA0003630331990004921
步骤a.
Figure BDA0003630331990004931
经5分钟分成数份向炔丙基-PEG4-酸(609mg，2.34mmol)及NH-双(PEG1-叠氮化物)(500mg，2.055mmol)于无水DMF(2mL)中的溶液中添加HATU(889.7mg，2.34mmol)。在搅拌以溶解所有偶合试剂之后，添加DIPEA(390mg，3mmol)且继续搅拌持续1小时。其接着直接地通过RPLC(100g，5至40％乙腈及水)经纯化。产量918mg，产率92％。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝486.2。
步骤b.
Figure BDA0003630331990004932
步骤-a产物(918mg，1.89mmol)溶解于THF中，且所述溶液冷却至约13℃。经10分钟分成数份添加三苯基膦(1.141g，4.35mmol)。所得混合物在约13℃至室温下经搅拌持续2小时。添加LiOH单水合物(42mg，1mmol)于水(2mL)及MeOH(1mL)中的溶液。在继续搅拌持续20小时之后，所述反应通过RPLC(100g，0至30％乙腈及水，使用0.1％TFA作为修饰剂)经纯化。产量825mg，产率65.9％。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝434.4。
步骤c.
Figure BDA0003630331990004941
经火焰干燥的反应烧瓶用氮气冲洗且馈入扎那米韦中间体(实施例2)(865mg，1.51mmol)及无水DCM(5mL)。在搅拌以溶解起始材料之后，所述溶液在冰水浴中冷却且相继添加氯甲酸4-硝基苯酯(365.3mg，1.81mmol)、DMAP(152.2mg，0.755mmol)。移除冰水浴，且所述混合物经搅拌持续3小时。添加额外量的氯甲酸4-硝基苯酯(304.4mg，1.51mmol)，且继续搅拌持续1小时。所述反应接着用水(1mL)淬灭。在剧烈搅拌持续1小时之后，所述反应混合物用水(20mL×2)及DCM(20mL)萃取。有机层经搅拌过夜，经Na2SO4干燥且通过旋转蒸发经浓缩。所述材料无需进一步纯化继续用于后续步骤。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝738.2。
步骤d.
Figure BDA0003630331990004942
步骤-b产物(429.7mg，0.65mmol)及DIPEA(260mg，2mmol)的混合物于无水THF(1mL)中的溶液逐滴添加至步骤-c产物中。所得混合物经搅拌持续2小时，接着直接地通过RPLC(100g，10至65％乙腈及水)经纯化。所收集的洗脱份中的乙腈在室温下通过旋转蒸发经移除。异质水层用EtOAc(200mL)萃取，接着用EtOAc(50mL)反萃取。经组合的有机层经Na2SO4干燥且通过旋转蒸发经浓缩至干。产量442mg，产率41.7％。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝815.8,[(M-Boc+2H)/2]+＝765.8,[(M-2Boc+2H)/2]+＝716。
步骤e.
Figure BDA0003630331990004951
步骤-d产物(441mg，0.271mmol)溶解于TFA(1mL)中。所述反应经搅拌持续20分钟，接着直接地通过HPLC(5至20％乙腈及水，使用0.1％TFA作为修饰剂)经纯化。产量308mg，产率77.9％。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝615.8,[(M+3H)/3]+＝411。
步骤f.
Figure BDA0003630331990004952
步骤-e产物(308mg，0.211mmol)溶解于MeOH(1mL)及水(0.5mL)中，且所述溶液在冰水浴中冷却。经1小时分成数份添加LiOH单水合物(42mg，1mmol)于水(1mL)中的溶液。所述反应经搅拌过夜，通过二恶烷(0.25mL)中的4NHCl溶液酸化，且通过RPLC(0至20％乙腈及水，使用0.1％TFA作为修饰剂)经纯化。产量198mg，产率64％。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝575.8,[(M+3H)/3]+＝384.2。
实施例20.合成缀合物6
类似于缀合物1(实施例9)使用Int-7(实施例19)(SEQ ID NO:18)制备标题缀合物。经纯化最终产物的Maldi TOF分析给出62854.Da的平均质量(DAR＝3.1)。产量175.4mg，50％产率。图14显示缀合物6的非还原SDS-PAGE。所得缀合物在图43中描绘。
实施例21.合成Int-8
Figure BDA0003630331990004961
步骤a.
Figure BDA0003630331990004962
5-乙酰胺基-7,8,9-O-三乙酰基-2,6-脱水-4-叠氮基-3,4,5-三脱氧-D-甘油-D-半乳-壬-2-烯酸甲酯(1.8g，4.0mmol)溶解于40mL甲醇中且接着用400mg 5％Pd/C及1.1gBoc酐(5.0mmol)处理，接着所述反应混合物在室温下在氢气气氛下经搅拌持续1小时。通过过滤移除钯-木炭。滤液经浓缩且无需纯化即用于下一步骤。
步骤b.
Figure BDA0003630331990004971
来自前一步骤的产物溶解于20mL无水甲醇中且接着在冰水浴中冷却下用2mL甲醇中的甲醇钠(0.5M)逐滴处理。2小时之后，通过LCMS测定反应的进展。所述反应用1N HCl淬灭至pH 5-6。所得溶液经浓缩且通过反相液体色谱法(RPLC)使用以5％至100％乙腈及水洗脱的Isco
Figure BDA0003630331990004974
液体色谱仪使用0.1％TFA作为修饰剂经纯化。通过LCMS发现的离子：(M+H)+＝405
步骤c.
Figure BDA0003630331990004972
5-乙酰胺基-2,6-脱水-4-[(叔丁氧羰基)氨基]-3,4,5-三脱氧-D-赤式-壬-2-烯酸甲酯(0.4g，1mmol)溶解于10mL丙酮、4mL 2,2-二甲氧基丙烷及20mg对甲苯磺酸水合物(0.1mmol)中。所得溶液在室温下搅拌过夜，接着用1mL饱和NaHCO3淬灭。所述混合物经浓缩且通过反相液体色谱法(RPLC)使用以5％至100％乙腈及水洗脱的Isco
Figure BDA0003630331990004975
液体色谱仪不使用修饰剂经纯化。通过LCMS发现的离子：(M+H)+＝445。
步骤d.
Figure BDA0003630331990004973
氢化钠(40mg，60％于油中，1.0mmol)在冰水浴冷却下添加至5mL无水THF中的5-乙酰胺基-2,6-脱水-4-[(叔丁氧羰基)氨基]-3,4,5-三脱氧-8,9-O-(1-甲基亚乙基)-D-赤式-壬-2-烯酸甲酯(0.25g，0.50mmol)中。所得溶液经搅拌持续0.5小时，接着添加溴乙酸苯甲酯(0.23g，1.0mmol)。所得溶液经搅拌持续2小时且用5mL水中的10％氯化铵淬灭。接着，所述溶液用50mL乙酸乙酯稀释。分离有机层且经硫酸钠干燥。经干燥的有机溶液经浓缩且通过反相液体色谱法(RPLC)使用以5％至100％乙腈及水洗脱的Isco
Figure BDA0003630331990004983
液体色谱仪不使用修饰剂经纯化。通过LCMS发现的离子：(M+H)+＝593。
实施例22.合成Int-9
Figure BDA0003630331990004981
步骤a.
Figure BDA0003630331990004982
5-乙酰胺基-7,8,9-O-三乙酰基-2,6-脱水-4-叠氮基-3,4,5-三脱氧-D-甘油-D-半乳-壬-2-烯酸甲酯(10g，22mmol)溶解于100ml甲醇中且接着用油浴加热至60℃，SnCl2(5.7g，20mmol)分成3份添加至所述溶液中(小心，气体释出)。所述反应混合物经搅拌持续10min，此时通过HPLC发现反应完成。所述反应溶液在剧烈搅拌下缓慢地添加至50ml饱和NaHCO3溶液及50g硅藻土的溶液中。过滤所得浆液。滤液经Boc2O(6.6g，30mmol，1.5eq)处理。在室温下2小时之后，所述溶液经浓缩以移除大部分甲醇，溶解于200ml DCM中，且用100mlDCM萃取两次。经组合的萃取物经硫酸钠干燥，过滤且无需进一步纯化即用于下一步骤。粗物质产量12g，100％。通过LCMS发现的离子：M+H＝531。
步骤b.
Figure BDA0003630331990004991
来自前一步骤的材料溶解于60ml无水甲醇中，接着在冰水浴中冷却下用10ml甲醇中的甲醇钠(0.5M)处理。通过LCMS监测反应的进展，其在2h之后完成。所述反应用1N HCl淬灭至pH 5-6。所得溶液经浓缩且通过反相液体色谱法(RPLC)使用以0％至30％乙腈及水洗脱的Isco
Figure BDA0003630331990004993
液体色谱仪使用0.1％TFA作为修饰剂经纯化。产物的产量7.2g，产率80％。通过LCMS发现的离子：M+H＝405。
步骤c.
Figure BDA0003630331990004992
前一步骤的产物(3.5g，8.5mmol)、CDI(2.8g，2eq)、三甲胺(4.2ml，30mmol)及DMAP(240mg，2mmol)的溶液在乙腈(50ml)中加热过夜，接着浓缩且通过反相液体色谱法(RPLC)使用以0％至30％乙腈及水洗脱的Isco
Figure BDA0003630331990005003
液体色谱仪不使用修饰剂经纯化。所需产物的产量2.3g，60％。通过LCMS发现的离子：M+H＝431。
步骤d.
Figure BDA0003630331990005001
氢化钠(400mg，60％于油中，10mmol)在冰水浴下添加至50ml无水THF(湿度敏感性反应)中的前一步骤的产物(1.45g，3.3mmol)中。所得溶液经搅拌持续0.5小时，接着溴-乙酸叔丁酯(2g，10mmol)添加至上述溶液中，所得溶液加热至60℃过夜且用乙酸淬灭。所得溶液经浓缩且通过反相液体色谱法(RPLC)使用以0％至50％乙腈及水洗脱的Isco
Figure BDA0003630331990005004
液体色谱仪使用TFA作为修饰剂经纯化。产量1g，产率57％。通过LCMS发现的离子：M+H＝593。
步骤e.
Figure BDA0003630331990005002
前一步骤的产物(1.2g，2.2mmol)在室温下与10ml TFA一起搅拌过夜，且通过LCMS监测保护基脱除的进展。所得溶液经浓缩且无需纯化即用于下一步骤。残余物再溶解于20ml THF中，接着N,N’-双-boc-1-脒基吡唑(1g，3.3mmol)、4-二甲基氨基吡啶(120mg，1mmol)及三乙胺(0.7ml，5mmol)添加至所述溶液中，且所得溶液加热至60℃持续2小时。所得溶液经浓缩且通过反相液体色谱法(RPLC)使用以0％至50％乙腈及水洗脱的Isco
Figure BDA0003630331990005012
液体色谱仪不使用修饰剂经纯化。产量700mg，产率84％。通过LCMS发现的离子：M+H＝631。
步骤f.
Figure BDA0003630331990005011
在室温下向接头-3(如实施例19中所述经制备)(73mg，0.14mmol)及前一步骤的产物(200mg，0.32mmol，2.2eq)于DMF(30ml)中的溶液中添加EDC(100mg，0.5mmol)、HOAt(65mg，3mmol)及DIEA(0.14ml，1mmol)。所述溶液经搅拌过夜。所得溶液经浓缩且通过反相液体色谱法(RPLC)使用以0％至50％乙腈及水洗脱的Isco
Figure BDA0003630331990005013
液体色谱仪不使用修饰剂经纯化。产量120mg，产率52％。通过LCMS发现的离子：M/2+H＝830。
步骤g.
Figure BDA0003630331990005021
2ml H2O中的氢氧化锂(24mg，1mmol)添加至前一步骤的产物(120mg，0.07mmol)于2ml THF及1ml MeOH中的溶液中，LCMS监测反应的进展。在完成之后，向所述溶液中添加
Figure BDA0003630331990005022
IRN-77离子交换树脂以调节至pH 1，接着过滤所得溶液且滤液经浓缩且无需纯化即用于下一步骤。所得化合物在室温下经2ml TFA处理，所述溶液在40℃下搅拌过夜，接着浓缩且通过以0％至20％乙腈及水洗脱的HPLC使用TFA作为修饰剂经纯化。产量60mg，74％产率。通过LCMS发现的离子：[M/2]+1＝589.8。
实施例23.神经氨酸酶抑制分析
如下文所述执行使用2’-(4-甲基伞形酮基)-α-D-N-乙酰基神经胺糖酸(MUNANA)底物的神经氨酸酶抑制分析。简单来说，50μL经纯化、重组流感病毒神经氨酸酶(0.1ng/μL，50mM Tris、5mM CaCl2、200mM NaCl，pH 7.5)与50μL抑制剂混合且在室温下培育持续30min。在适当范围内的至少5种浓度的各抑制剂用于各重复。在培育之后，50μL于50mMTris、5mM CaCl2、200mM NaCl(pH 7.5)中的400μM MUNANA添加至所述溶液中以使用12-尖端移液管(Eppendorf)开始反应。阳性及阴性对照包括于各12-孔泳道中。在板上针对各泳道开始反应之后，反应混合物立即装载于SpectraMax M5(Molecular Devices)上，其中在365nm的激发波长及445nm的发射波长下经25min过程对萤光定量。选择其中阳性对照产生大约1,000的萤光信号的单一时间点。所有分析均一式三份进行且使用GraphPad Prism以log[抑制剂]对抑制百分率的S型拟合计算各抑制剂的IC50值。图15显示在缀合物1及Int-2的线性范围内以RFU/min计的动力学数据的曲线，其显示作为神经氨酸酶抑制剂的缀合物1的较大功效。图16及图17分别显示缀合物1-6针对rH1N1神经氨酸酶及rH3N2神经氨酸酶的分析结果(表2)。
表2：缀合物针对H1N1及H3N2神经氨酸酶的IC50值
缀合物编号 H1N1IC50(nM) H3N2IC50(nM)
缀合物1 3.9 32.5
缀合物2 3.7 17.6
缀合物3 3.6 38
缀合物4 1.9 17.2
缀合物5 1.1 14.3
缀合物6 4.1 29.8
实施例24：细胞毒性分析
测试缀合物1、2、3及6的细胞毒性。一式三份制备以10μM开始的各缀合物的十种两倍连续稀释液，用于接种96-孔培养板中的MDCK细胞。在处理四天后使用CellTiter-Glo试剂盒测定细胞活力。使用XLfit剂量反应模型计算50％细胞毒性浓度(CC50)(表3)。关于所测试的所有化合物，未观察到高达10μM的细胞毒性，例外为缀合物3。在缀合物3的情况下，细胞病变效应(CPE)分析(参见实施例23)中的EC50比此分析中的CC50低725倍。
表3：细胞毒性测试
缀合物编号 CC50(μM)
缀合物1 >10
缀合物2 >10
缀合物3 7.98
缀合物6 >10
PBS >10
扎那米韦 >10
实施例25.细胞病变效应分析
基于CPE的微量中和分析#1
为了测量神经氨酸酶缀合物保护哺乳动物细胞以抵御流感病毒的感染及破坏的能力，进行基于细胞病变效应(CPE)的微量中和分析。简单来说，一式两份制备以0.25μM开始的各缀合物的二十种两倍连续稀释液，用于一小时接种96-孔板中接种的MDCK细胞。INFVCA/09病毒以感染复数(MOI)0.001添加至细胞中用于一小时培育。在培育后第四天，细胞用结晶紫染色且读取光学密度以使用XLfit剂量反应模型计算各TA的50百分比有效浓度(EC50)。扎那米韦用作比较物及阳性对照。人Fc作为阴性对照包括在内。缀合物1、2、3及6均证明了优于扎那米韦对照的效能，证明EC50比扎那米韦低42至227倍(表4)。
表4：基于CPE的微量中和分析#1
Figure BDA0003630331990005041
N/C：不可计算
Figure BDA0003630331990005042
开始浓度10000nM
基于CPE的微量中和分析#2
进行额外基于CPE的微量中和分析以进一步评估缀合物6及缀合物7的体外活性。简单来说，以160nM的开始浓度制备测试物件，且制备总计十种2倍稀释液。所述测试物件稀释液接着与相对于单层感染复数为0.001的流感A病毒(INFV CA/09)预混合。一小时之后，所述测试物件+病毒混合物添加至在96-孔板中在标准条件下生长至70-80％汇合的Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞中。同样处理扎那米韦对照，除了开始浓度为9600nM，因为预期其不如正在测试的缀合物有效。在培育四天之后，单层用结晶紫染色且测定光学密度(反映单层健康)以使用XLfit剂量反应模型(idbs；https://www.idbs.com)计算50％有效浓度(EC50)。
如表5所示，浓度为496nM的扎那米韦使病毒介导的细胞病变效应减半。相比的下，缀合物6是大约100倍更具活性，其中EC50仅为4.64nM。缀合物7进一步改进活性达大约15倍，从而使EC50减至亚nM水平。
表5：基于CPE的微量中和分析#2
缀合物编号 EC50(nM)
6 4.64
7 0.31
扎那米韦 496
实施例26.细胞活力分析
A549细胞在化合物处理的前一天接种于96-孔板中。细胞用浓度为1μM–10nM的缀合物3(图18A)、缀合物4(图18B)或缀合物6(图18C)处理持续24小时。接着使用Cell TiterGlow(Promega)测量细胞活力。结果表示三个生物重复样品的平均值及SD。在用于病毒生长分析(实施例27)的任何浓度下，针对任何浓度的任何缀合物均未观察到对细胞活力的影响。
实施例27.病毒生长分析
为了测量神经氨酸酶缀合物抑制人上皮细胞中的所关注的致病性流感病毒菌株的生长的能力，进行病毒斑块减少分析。简单来说，A549细胞在化合物处理的前一天接种于24-孔板中。细胞用浓度为1μM–10nM的化合物处理持续2小时且经MOI为0.01的所指示病毒菌株感染以用于一小时培育。移除病毒，洗涤细胞且以浓度1μM–10nM再应用化合物。在所指示的时间点收集上清液且在MDCK细胞中使用斑块分析方法进行滴定。结果表示三个生物重复样品的平均值及SD。奥司他韦用作比较物及阳性对照。缀合物3(图19A-19E)、缀合物4(图20A-E)或缀合物6(图21A-21E及图22A-22E)均证明了优于奥司他韦对照的效能，显示在低100倍浓度下类似或(通常)优于奥司他韦的斑块减少。使用细胞活力分析(实施例26)针对各测试物件评估所述化合物(以评估测试物件的潜在细胞毒性)对A549细胞的影响。简单来说，A549细胞在化合物处理的前一天接种于96-孔板中。用浓度为1μM–10nM的化合物处理细胞持续24小时。接着使用Cell Titer Glow(Promega)测量细胞活力。结果表示三个生物重复样品的平均值及SD。
实施例28.小鼠血清半衰期
药代动力学(PK)研究使用在20与22克之间的雌性CD-1小鼠(Charles RiverLaboratories)。小鼠借助于尾静脉经IV注射50mg/kg的测试物件(10ml/kg的剂量体积)。动物经圈养于标准IACUC批准的圈养条件下。在适当时间，对动物进行非末端放血(眶后、颊或通过尾静脉)，其中血液经收集于EDTA管中以预防凝血。所收集的血液经离心(2,000x g，持续10分钟)且抽出血浆以随时间分析测试物件浓度。
通过夹心ELISA测量缀合物6或hIgG1 Fc在各时间点的血浆浓度如下：缀合物6分子捕获在神经氨酸酶包被的板上或抗hIgG1抗体包被的板上，且接着使用HRP缀合的抗人IgG-Fc抗体进行检测。使用抗hIgG1 Fc抗体捕获hIgG1。在GraphPadPrism中使用缀合物6(或hIgG1 Fc)标准曲线的4PL非线性回归计算蛋白质浓度。更详细方法描述提供于下文中。
Qiagen Ni-NTA HisSorb板(目录号35061,Qiagen)经来自A/California/04/2009(H1N1)(11058-VNAHC,Sino Bio)的神经氨酸酶或在1X KPL包被缓冲液中的抗IgG1 Fc抗体(5150-0041,SeraCare)包被。在其中所述抗IgG1 Fc抗体用于捕获测试物件的情况下，选择捕获及检测结合不同抗原决定基的抗IgG1 Fc抗体。板在室温下经培育持续1小时。将血浆样品的系列稀释液铺板并在室温下培育持续2h(样品稀释剂：0.5％脱脂奶粉+3％山羊血清于PBS 0.05％Tween20中；初试小鼠血浆最终浓度为1:900)。在各板上一式两份进行介于500–0.230ng/mL范围内的缀合物6或hIgG1 Fc标准曲线。
在2h培育之后，板在具有0.05％Tween20的300uL PBS中洗涤5次。结合于板上的神经氨酸酶(或抗hIgG1 Fc抗体)的缀合物6接着在室温下用1:2000稀释于样品稀释剂中的HRP缀合的抗人IgG Fc F(ab’)2(Jackson 709-036-098)探测持续1小时。板接着在具有0.05％Tween20的300uL PBS中洗涤8次且用TMB底物显影持续7分钟。所述反应用1N H2SO4停止。在450nm下读取吸光度。相似方案用于hIgG1 Fc，其中仅抗hIgG1 Fc抗体用于捕获。使用神经氨酸酶或抗hIgG1 Fc抗体捕获在不同时间点处测量的缀合物6的量在实验误差内为相似的，表明完整缀合物体内稳定。
使用Graphpad Prism Version 6，根据缀合物6(或hIgG1 Fc)标准曲线的非线性回归分析(S型，4PL分析)内推测试样品中的总缀合物6(或hIgG1 Fc)。使用WinNonlin软件计算PK参数。比较缀合物6及hIgG1 Fc的曲线显示于图23中且关键PK参数的概述提供于表6中。意外地，缀合物6的血浆暴露及终末半衰期显著优于野生型hIgG1 Fc。缀合物6在8天内的AUC比hIgG1 Fc高3倍，且缀合物6的终末半衰期为214小时，相对于人IgG1 Fc的52小时。
表6：与hIgG1 Fc相比缀合物6的小鼠PK
半衰期(小时) AUClast(hr*mg/mL)
缀合物6 214 33100
hIgG1 51.8 10600
实施例29.缀合物6在致死性小鼠流感模型中的功效：研究#1
在雌性BALB/c小鼠中针对致死性INFV A H1N1流感感染评估缀合物6。所述实验包含7组，每组5只小鼠。在第0天，所有小鼠均用1xLD90 H1N1 A/Texas/36/91攻击。第1-6组在攻击之前4小时接受IV治疗(表7)。人IgG1(单独Fc)作为额外阴性对照包括在内。第7组借助于经口递送接受磷酸奥司他韦，在感染后8小时开始，每天两次，持续5天。在攻击之后监测所有小鼠的重量损失(图24，表8)及生存(图25，表9)，持续15天。
经缀合物6治疗的小鼠在所测试的所有浓度下在使用单一剂量时均显示100％生存，分别与媒介物对照组及hIgG1对照组的20％及0％生存相比。当与媒介物组(p＝0.0135)相比时，结果为统计学显著的，尽管具有小的组大小(n＝5)。当与磷酸奥司他韦组相比时，缀合物6在低500倍的累积剂量(mg/kg)下证明相似功效。小鼠在所有缀合物6剂量下在所述实验的整个过程中维持其重量，优于奥司他韦对照组。
表7：研究设计
Figure BDA0003630331990005081
表8：每天体重平均值
Figure BDA0003630331990005091
表9：小鼠生存
Figure BDA0003630331990005092
实施例30.缀合物6在致死性小鼠流感模型中的功效：研究#2
在雌性BALB/c小鼠中针对致死性INFV A H3N2流感感染评估缀合物6。所述实验包含11组，每组5只小鼠。在第0天，所有小鼠均用1xLD90 H3N2 A/Hong Kong/1/68攻击。第1-10组在攻击之前4小时接受IV治疗(表10)。人IgG1(单独Fc)作为额外阴性对照包括在内。第11组借助于经口递送接受磷酸奥司他韦，在感染后8小时开始，每天两次，持续5天。在攻击之后监测所有小鼠的重量损失(图26)及生存(图27，表11)，持续15天。
经缀合物6治疗的小鼠在使用低至0.4mg/kg的单一剂量时显示100％生存，且在使用0.2mg/kg的单一剂量时显示80％生存，分别与媒介物对照组及hIgG1对照组的0％生存相比。80％小鼠在奥司他韦对照组中生存。当与媒介物组(p＝0.0128)相比时，结果为统计学显著的，尽管具有小的组大小(n＝5)。当与磷酸奥司他韦组相比时，缀合物6在低1000倍的累积剂量(mg/kg)下证明相似功效。小鼠在所有缀合物6剂量下在低至0.4mg/kg下维持其重量在5％内，优于奥司他韦对照组。
表10：研究设计
Figure BDA0003630331990005101
表11：小鼠生存
Figure BDA0003630331990005102
Figure BDA0003630331990005111
实施例31.合成Int-10
Figure BDA0003630331990005112
步骤a.
Figure BDA0003630331990005113
5-乙酰胺基-7,8,9-O-三乙酰基-2,6-脱水-4-叠氮基-3,4,5-三脱氧-D-甘油-D-半乳-壬-2-烯酸甲酯(SM-1，10g，22mmol)溶解于100ml甲醇中且接着用油浴加热至60℃，SnCl2(5.7g，20mmol)分成3份添加至所述溶液中(小心，气体释出)。所述反应混合物经搅拌持续10min，此时通过HPLC发现反应完成。所述反应溶液在剧烈搅拌下缓慢地添加至50ml饱和NaHCO3溶液及50g硅藻土的溶液中。过滤所得浆液。滤液经Boc2O(6.6g，30mmol，1.5eq)处理。在室温下2小时之后，所述溶液经浓缩以移除大部分甲醇，溶解于200ml DCM中，且用100ml DCM萃取两次。经组合的萃取物经硫酸钠干燥，过滤且无需进一步纯化即用于下一步骤。粗物质产量12g，100％。通过LCMS发现的离子：M+H＝531。
步骤b.
Figure BDA0003630331990005121
来自前一步骤的材料溶解于60ml无水甲醇中，接着在冰水浴中冷却下用10ml甲醇中的甲醇钠(0.5M)处理。通过LCMS监测反应进展，其在2h之后完成。所述反应用1N HCl淬灭至pH 5-6。所得溶液经浓缩且通过反相液体色谱法(RPLC)使用以0％至30％乙腈及水洗脱的Isco
Figure BDA0003630331990005123
液体色谱仪使用0.1％TFA作为修饰剂经纯化。产物的产量7.2g，产率80％。通过LCMS发现的离子：M+H＝405。
步骤c.
Figure BDA0003630331990005122
前一步骤的中间体(3.5g，8.5mmol)、CDI(2.8g，2eq)、三甲胺(4.2ml，30mmol)及DMAP(240mg，2mmol)的溶液在DMF(50ml)中在60℃下加热过夜，接着浓缩且通过反相液体色谱法(RPLC)使用以0％至30％乙腈及所生成物洗脱的Isco
Figure BDA0003630331990005124
液体色谱仪不使用修饰剂经纯化。所需产物的产量2.3g，产率60％。通过LCMS发现的离子：M+H＝431。
步骤d.
Figure BDA0003630331990005131
氢化钠(400mg，60％于油中，10mmol)在冰水浴下添加至50ml无水THF(湿度敏感性反应)中的Int-4(1.45g，3.3mmol)中。所得溶液经搅拌持续0.5小时，接着溴乙酸叔丁酯(2g，10mmol)添加至上述溶液中。所得溶液加热至60℃过夜且用乙酸淬灭，经浓缩且通过反相液体色谱法(RPLC)使用以0％至50％乙腈及水洗脱的Isco
Figure BDA0003630331990005133
液体色谱仪使用TFA作为修饰剂经纯化。产量1g，产率57％。通过LCMS发现的离子：M+H＝593。(通过HPLC发现反应相当完全，但分离产率低)
步骤f.
Figure BDA0003630331990005132
前一步骤的中间体(1.2g，2.2mmol)在室温下与10ml TFA一起搅拌过夜。通过LCMS监测保护基脱除的进展。所得溶液经浓缩且无需纯化即用于下一步骤。
前一反应的残余物溶解于20ml THF中，接着N,N’-双-boc-1-脒基吡唑(1g，3.3mmol)、4-二甲基氨基吡啶(120mg，1mmol)及三乙胺(0.7ml，5mmol)添加至所述溶液中，且所得溶液加热至60℃持续2小时。所得溶液经浓缩且通过反相液体色谱法(RPLC)使用以0％至50％乙腈及水洗脱的Isco
Figure BDA0003630331990005143
液体色谱仪不使用修饰剂经纯化。产量700mg，产率84％。通过LCMS发现的离子：M+H＝631。
步骤g.
Figure BDA0003630331990005141
在室温下向接头-3(如实施例19所述制备)(73mg，0.14mmol)及前一步骤的中间体(200mg，0.32mmol，2.2eq)于DMF(30ml)中的溶液中添加EDC(100mg，0.5mmol)、HOAt(65mg，3mmol)及DIEA(0.14ml，1mmol)。所述溶液经搅拌过夜。所得溶液经浓缩且通过反相液体色谱法(RPLC)使用以0％至50％乙腈及水洗脱的Isco
Figure BDA0003630331990005144
液体色谱仪不使用修饰剂经纯化。产量120mg，产率52％。通过LCMS发现的离子：M/2+H＝830。
步骤h.
Figure BDA0003630331990005142
2ml水中的氢氧化锂(24mg，1mmol)添加至前一步骤的中间体(120mg，0.07mmol)于2ml THF及1ml MeOH中的溶液中。在通过LCMS发现所述反应完成之后，用
Figure BDA0003630331990005145
IRN-77离子交换树脂淬灭所述溶液以调节至pH＝1，接着过滤所述溶液且滤液经浓缩且无需进一步纯化即用于下一步骤。前一步骤的中间体在室温下在40℃下在2ml TFA中经处理过夜。粗反应物经浓缩且通过使用0％至20％乙腈及水的HPLC使用TFA作为修饰剂经纯化。产量60mg，74％产率。通过LCMS发现的离子：[M/2]+1＝589.8。
实施例32.合成缀合物7
Fc-PEG4-叠氮化物(具有SEQ ID NO:38的序列的每个Fc结构域单体)于PBSx1缓冲溶液中的溶液(100mg，1.28μmol，6.1mL，MW＝57260Da，DAR＝3.6)添加至Int-10(如实施例31中所述经制备)(TFA盐，44mg，0.031mmol)及新鲜制备的CuSO4(0.7mL 50.0mM，20eq)、三(3-羟基丙基三唑基甲基)-胺(THPTA，0.7mL 50.0mM，20eq)及抗坏血酸钠(1.05mL 50.0mM，30eq)的pH 7.4PBS溶液中。所得均质溶液通过摇杆台搅拌持续12h。粗溶液用pH 7.4PBS稀释至1mg/mL的最终浓度，且经超滤(10,000MWCO)两次至1mL体积。粗混合物接着1:10稀释于PBS pH 7.4中，且相继使用MabSelect Sure Resin(GEHealthcare,Chicago,IL,USA)、尺寸排阻色谱法经纯化。经纯化材料使用NANODROPTM UV可见光光谱仪(使用基于缀合中所用的Fc的氨基酸序列计算的消光系数)经定量，且使用离心浓缩机(10,000MWCO)经浓缩至大约10mg/mL。经纯化分子使用4-12％Bis Tris SDS PAGE凝胶通过将1-2μg每种分子装载至所述凝胶中且使用instantBlue染色进行染色而经分析。每种凝胶包括具有经指示分子量标准的分子量梯。产率典型地为40-60％。MALDI MS分析显示质量范围(60000-90000)，其中质量的平均值为63633。平均DAR＝4.5。
实施例33.缀合物6在致死性小鼠流感模型中的功效：研究#3
在雌性BALB/c小鼠中针对致死性INFV A H1N1流感感染评估缀合物6。所述实验包含7组，每组5只小鼠。在第0天，所有小鼠均用1xLD90 H1N1 A/Texas/36/91攻击。第1-6组在攻击之前28天接受IV治疗(表12)。媒介物(PBS)作为额外阴性对照包括在内。第7组借助于经口递送接受磷酸奥司他韦，在感染后8小时开始，每天两次，持续5天。在攻击之后监测所有小鼠的生存(图31A-31F)，持续15天。
经缀合物6治疗的小鼠在低至2.5mg/kg的所有浓度下在使用单一剂量时均显示100％生存，且在1.25mg/kg下显示80％生存，与媒介物对照组的0％生存相比。磷酸奥司他韦对照组中的所有小鼠均生存。当与磷酸奥司他韦组相比时，缀合物6在低20倍的累积剂量(mg/kg)下证明与奥司他韦相似的功效，不过事实上，所有缀合物6组均在感染之前28天给药一次。
表12：研究设计
Figure BDA0003630331990005161
实施例34.缀合物6在致死性小鼠流感模型中的功效：研究#4
在雌性BALB/c小鼠中针对致死性INFV A H1N1流感感染评估缀合物6。所述实验包含13组，每组5只小鼠。在第0天，所有小鼠均用1xLD90 H1N1 A/Texas/36/91攻击。所有缀合物6组(8-13)在感染前及后不同时间接受单一10mg/kg IV剂量，如表13所概括。媒介物(PBS)及单独Fc作为阴性对照包括在内。第3-7组借助于经口递送接受磷酸奥司他韦(20mg/kg)，在感染后不同时间点开始，每天两次，持续5天，如表13所概括。在攻击之后监测所有小鼠的生存(图32A-32F)，持续15天。
当经治疗直至感染后24h时，经缀合物6治疗的小鼠在使用单一10mg/kg剂量时显示100％生存，且在感染后48及72h分别显示60及80％生存。在磷酸奥司他韦组中，在其中感染后48及72h起始治疗的组中，生存分别急剧地降至0％及20％。这些结果表明关于治疗流感A感染，缀合物6潜在地具有相对奥司他韦更优的治疗窗。
表13：研究设计
Figure BDA0003630331990005171
实施例35.缀合物6毒性研究
在14天大鼠剂量范围发现毒性研究中评估缀合物6的安全性。大鼠在所述研究的第0及7天通过静脉内施用经施用5mpk、20mpk或50mpk的缀合物6。与媒介物对照相比，在所测试的任何剂量下均未观察到对体重增加(图33)、器官重量、食物消耗的显著影响。血浆暴露(通过AUC测量)随剂量按比例增加。这些临床前安全性结果与高治疗指数一致。观察结果的概述提供于表14中。
表14.14天大鼠剂量范围发现毒性研究的概述
参数 与媒介物相比最高剂量(50mpk)下的发现结果
临床观察结果 无发现结果
血液学 媒介物无变化
临床化学 媒介物无变化
凝血 媒介物无变化
尿分析 媒介物无变化
组织病理学 无观察结果
实施例36.通过三种不同途径发现缀合物6在致死性小鼠流感模型中针对剂量的功效：研究#5
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8周)中针对致死性IAVH1N1流感感染评估缀合物6。攻击病毒(A/Texas/36/91)是能够在小鼠中引起致死性感染的小鼠适应性分离株。所述实验包含15组，每组5只小鼠。在第0天，所有小鼠均在经异氟烷轻微麻醉之后通过鼻内接种经50μl体积的病毒(1x LD90)攻击。第1-14组在攻击之前4小时接受单一治疗(表15)。为了通过不同给药途径测定缀合物6的效能，匹配浓度的缀合物(10、2、0.4及0.1mg/kg)经IV、IM或SC给药。除了单独媒介物(PBS)组以外，人IgG1(单独Fc)也作为额外阴性对照(第2组)包括在内。第15组借助于经口递送接受磷酸奥司他韦，在感染后8小时开始，每天两次，持续5天。监测所有小鼠的生存(表15)，持续14天。
经缀合物6治疗的小鼠在第14天针对具有10、2或0.4mg/kg的单一剂量的流感(H1N1)的攻击显示100％生存，与给药途径无关。仅在最低测试物件浓度下，在IV、IM及SC给药(表16：分别为60、80及100％生存)之间可见单一小鼠差异。这些结果强烈地表明，缀合物6的保护性肺浓度可通过多种给药途径达成。
表15：研究设计
Figure BDA0003630331990005191
表16：小鼠生存
Figure BDA0003630331990005192
Figure BDA0003630331990005201
实施例37.缀合物6在致死性小鼠流感模型中针对奥司他韦抗性分离株的功效：研究#6
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8周)中针对致死性IAVH1N1流感感染评估缀合物6。攻击病毒(A/Perth/261/2009)是小鼠适应性分离株，其携带H275Y突变，从而导致抵抗神经氨酸酶抑制剂奥司他韦。所述实验包含10组，每组5只小鼠。在第0天，所有小鼠均通过鼻内接种至经异氟烷轻微麻醉的小鼠经50μl体积的A/Perth/261/2009(H1N1)(1x LD90)攻击。第1-9组在攻击之前4小时通过IV接受单一治疗(表17)。除了单独媒介物(PBS)组以外，人IgG1(单独Fc)也作为额外阴性对照包括在内。第10组借助于经口递送接受磷酸奥司他韦，在感染后8小时开始，每天两次，持续5天。在攻击之后监测所有小鼠的生存(图34A-34D，表18)及重量损失(图35，表19)，持续15天。
经缀合物6治疗的小鼠针对具有50、10及2mg/kg的单一剂量的流感(A/Perth/261/2009)的攻击显示100％生存。此外，尽管具有小的组大小(n＝5)，这些结果相对于媒介物对照为统计学上显著的(表18)。
在0.4、0.2或0.1mg/kg的缀合物6浓度下，生存为60％，而若以单独媒介物(PBS)或hIgG1(单独Fc)给药，则无小鼠生存至所述研究结束。奥司他韦组仅具有单一动物生存(20％功效)，即使使用先前显示出具有保护性以抵御奥司他韦敏感性分离株的剂量进行治疗(20mg/kg，bid×5天)。这些结果确认所述攻击病毒抵抗奥司他韦，且对缀合物6敏感。
缀合物6针对含有H275Y突变的突变体的效能进一步由体重数据支持(图35，表19)。接受单一剂量的2mg/kg或更高浓度的缀合物6的组证明了5％或更低短暂重量损失。
表17：研究设计
Figure BDA0003630331990005211
表18：小鼠生存
Figure BDA0003630331990005212
表19：每天体重平均值
Figure BDA0003630331990005221
实施例38.IV施用测试物件之后的7天大鼠PK研究
由Seventh Wave实验室(Maryland Heights,MO)使用46-49日龄的雄性SpragueDawley大鼠执行大鼠药代动力学(PK)研究。大鼠借助于尾静脉经IV注射75mg/kg的测试物件(5ml/kg的剂量体积)。动物经圈养于标准IACUC批准的圈养条件下。在适当时间，对动物进行非末端放血(眶后、颊或通过尾静脉)，其中血液经收集于K2EDTA管中以预防凝血。所收集的血液经离心(2,000xg，持续10分钟)且抽出血浆以随时间分析测试物件浓度。
通过夹心ELISA测量缀合物6或hIgG1 Fc在各时间点的血浆浓度如下：缀合物6分子捕获在神经氨酸酶包被的板上或抗hIgG1抗体包被的板上，且接着使用HRP缀合的抗人IgG-Fc抗体进行检测。使用抗hIgG1 Fc抗体捕获hIgG1。在GraphPad Prism中使用缀合物6(或hIgG1 Fc)标准曲线的4PL非线性回归计算蛋白质浓度。更详细方法描述提供于下文中。
Nunc Maxisorp 96-孔板(目录号12-565-136,ThermoFisher)经1XKPL包被缓冲液(5150-0041,SeraCare)中来自A/California/04/2009(H1N1)(11058-VNAHC,SinoBiological)的神经氨酸酶或抗IgG1 Fc抗体包被。在其中所述抗IgG1 Fc抗体用于捕获测试物件的情况下，选择捕获及检测结合不同抗原决定基的抗IgG1 Fc抗体。板在室温下在轨道板式振荡器上(500rpm)经培育持续1h。将血浆样品的系列稀释液铺板并在室温下培育持续2h(样品稀释剂：PBS中的1％BSA0.05％Tween 20+初试大鼠血浆最终浓度1:900)。在各板上一式两份进行介于500–0.230ng/mL范围内的缀合物6或hIgG1 Fc标准曲线。
在2h培育之后，板在具有0.05％Tween 20的300μL PBS中洗涤5次。结合于板上的神经氨酸酶(或抗hIgG1 Fc抗体)的缀合物6接着在室温下用1:1,000稀释于样品稀释剂中的HRP缀合的抗人IgG Fc F(ab’)2(709-036-098,Jackson)探测持续1h。板接着在具有0.05％Tween 20的300μL PBS中洗涤8次且用TMB底物显影持续7-8分钟。所述反应用1NH2SO4停止。在450nm下读取吸光度。相似方案用于hIgG1 Fc，其中仅抗hIgG1 Fc抗体用于捕获。使用神经氨酸酶或抗hIgG1 Fc抗体捕获在不同时间点处测量的缀合物6的量在实验误差内为相似的，表明完整缀合物体内稳定。
使用Graphpad Prism Version 6，根据缀合物6(或hIgG1 Fc)标准曲线的非线性回归分析(S型，4PL分析)内推测试样品中的总缀合物6(或hIgG1 Fc)。比较缀合物6及hIgG1Fc的曲线显示于图36中。使用神经氨酸酶或抗hIgG1 Fc抗体捕获在不同时间点处测量的缀合物6的量在实验误差内为相似的，表明完整缀合物体内稳定。
实施例39.IV施用测试物件之后的14天大鼠PK研究
由Seventh Wave实验室(Maryland Heights,MO)使用46-49日龄的雄性SpragueDawley大鼠执行大鼠PK研究。大鼠在第1及8天借助于尾静脉经IV注射5、20或50mg/kg的测试物件(5ml/kg的剂量体积)。动物经圈养于标准IACUC批准的圈养条件下。在适当时间，对动物进行非末端放血(眶后、颊或通过尾静脉)，其中血液经收集于K2EDTA管中以预防凝血。所收集的血液经离心(2,000x g，持续10分钟)且抽出血浆以随时间分析测试物件浓度。
通过夹心ELISA测量缀合物6在各时间点的血浆浓度如下：缀合物6分子捕获在神经氨酸酶包被的板上，且接着使用HRP缀合的抗人IgG-Fc抗体进行检测。使用抗hIgG1 Fc抗体捕获hIgG1。在GraphPadPrism中使用缀合物6标准曲线的4PL非线性回归计算蛋白质浓度。更详细方法描述提供于下文中。
Nunc Maxisorp 96-孔板(目录号12-565-136,ThermoFisher)经1X KPL包被缓冲液(5150-0041,SeraCare)中来自A/California/04/2009(H1N1)(11058-VNAHC,SinoBiological)的任一种神经氨酸酶包被。板在室温下在轨道板式振荡器上(500rpm)经培育持续1h。将血浆样品的系列稀释液铺板并在室温下培育持续2h(样品稀释剂：PBS中的1％BSA 0.05％Tween 20+初试大鼠血浆最终浓度1:900)。在各板上一式两份进行介于500–0.230ng/mL范围内的缀合物6标准曲线。
在2h培育之后，板在具有0.05％Tween 20的300μL PBS中洗涤5次。结合于板上的神经氨酸酶的缀合物6接着在室温下用1:1,000稀释于样品稀释剂中的HRP缀合的抗人IgGFc F(ab’)2(709-036-098,Jackson)探测持续1h。板接着在具有0.05％Tween 20的300μLPBS中洗涤8次且用TMB底物显影持续7-8分钟。所述反应用1N H2SO4停止。在450nm下读取吸光度。
使用GraphpadPrismVersion 6，根据缀合物6标准曲线的非线性回归分析(S型，4PL分析)内推测试样品中的总缀合物6(或hIgG1 Fc)。图37中所示的比较缀合物6的曲线证明了线性剂量比例性。
实施例40.比较测试物件的IV及SC施用的28天大鼠PK研究
由SeventhWave实验室(MarylandHeights,MO)使用46-49日龄的雄性SpragueDawley大鼠执行大鼠PK研究。大鼠经IV或SC注射5mg/kg的测试物件(5ml/kg的剂量体积)。动物经圈养于标准IACUC批准的圈养条件下。在适当时间，对动物进行非末端放血(眶后、颊或通过尾静脉)，其中血液经收集于K2EDTA管中以预防凝血。所收集的血液经离心(2,000xg，持续10分钟)且抽出血浆以随时间分析测试物件浓度。
通过夹心ELISA测量缀合物6或hIgG1 Fc在各时间点的血浆浓度如下：缀合物6分子捕获在神经氨酸酶包被的板上且接着使用HRP缀合的抗人IgG-Fc抗体进行检测。在GraphPad Prism中使用缀合物6标准曲线的4PL非线性回归计算蛋白质浓度。更详细方法描述提供于下文中。
Nunc Maxisorp 96-孔板(目录号12-565-136,ThermoFisher)经1X KPL包被缓冲液(5150-0041,SeraCare)中来自A/California/04/2009(H1N1)(11058-VNAHC,SinoBiological)的任一种神经氨酸酶包被。板在室温下在轨道板式振荡器上(500rpm)经培育持续1h。将血浆样品的系列稀释液铺板并在室温下培育持续2h(样品稀释剂：PBS中的1％BSA 0.05％Tween 20+初试大鼠血浆最终浓度1:900)。在各板上一式两份进行介于500–0.230ng/mL范围内的缀合物6标准曲线。
在2h培育之后，板在具有0.05％Tween 20的300μL PBS中洗涤5次。结合于板上的神经氨酸酶的缀合物6接着在室温下用1:1,000稀释于样品稀释剂中的HRP缀合的抗人IgGFc F(ab’)2(709-036-098,Jackson)探测持续1h。板接着在具有0.05％Tween 20的300μL PBS中洗涤8次且用TMB底物显影持续7-8分钟。所述反应用1NH2SO4停止。在450nm下读取吸光度。
使用GraphpadPrismVersion 6，根据缀合物6标准曲线的非线性回归分析(S型，4PL分析)内推测试样品中的总缀合物6(或hIgG1 Fc)。图38中比较缀合物6的曲线显示，SC及IV血浆水平在24h时会聚且直至336h时在实验误差内相似。
实施例41.在IV施用测试物件之后的28天非人类灵长类动物PK研究
由BTS Research(San Diego,CA)使用体重介于2.5-6.5kg范围内的4.5-8岁雄性及雌性食蟹猕猴执行非人类灵长类动物(NHP)PK研究。NHP借助于隐静脉或头静脉经IV注射5或20mg/kg的测试物件(5ml/kg的剂量体积)。动物经圈养于标准IACUC批准的圈养条件下。在适当时间，对动物进行非末端放血(借助于股静脉或头静脉)，其中血液经收集于K2EDTA管中以预防凝血。所收集的血液经离心(2,000xg，持续10分钟)且抽出血浆以随时间分析测试物件浓度。
通过夹心ELISA测量缀合物6在各时间点的血浆浓度如下：缀合物6分子捕获在神经氨酸酶包被的板上且接着使用HRP缀合的抗人IgG-Fc抗体进行检测。在GraphPad Prism中使用缀合物6标准曲线的4PL非线性回归计算蛋白质浓度。更详细方法描述提供于下文中。
Nunc Maxisorp 96-孔板(目录号12-565-136,ThermoFisher)经1XKPL包被缓冲液(5150-0041,SeraCare)中来自A/California/04/2009(H1N1)(11058-VNAHC,SinoBiological)的神经氨酸酶包被。板在室温下在轨道板式振荡器上(500rpm)经培育持续1h。将血浆样品的系列稀释液铺板并在室温下培育持续2h(样品稀释剂：PBS中的1％BSA0.05％Tween 20+初试食蟹猕猴血浆最终浓度1:2,500)。在各板上一式两份进行介于500–0.230ng/mL范围内的缀合物6标准曲线。
在2h培育之后，板在具有0.05％Tween 20的300μL PBS中洗涤5次。结合于板上的神经氨酸酶的缀合物6接着在室温下用1:1,000稀释于样品稀释剂中的HRP缀合的抗人IgGFc F(ab’)2(709-036-098,Jackson)探测持续1h。板接着在具有0.05％Tween 20的300μLPBS中洗涤8次且用TMB底物显影持续7-8分钟。所述反应用1N H2SO4停止。在450nm下读取吸光度。
使用Graphpad Prism Version 6，根据缀合物6(或hIgG1 Fc)标准曲线的非线性回归分析(S型，4PL分析)内推测试样品中的总缀合物6。使用WinNonlin软件计算PK参数。比较缀合物6的曲线显示于图39中且关键PK参数的概述提供于表20中。剂量反应在5与20mg/kg IV之间呈线性，导致在两种剂量中大约9天的半衰期(可与小鼠/大鼠相当)。
表20：缀合物6的食蟹猕猴PK
缀合物6 半衰期(小时) AUClast(hr*mg/mL)
5mg/kgIV 230 6240
20mg/kgIV 197 25400
实施例42.在IV施用测试物件之后的小鼠肺分布PK研究
使用6周龄雄性CD-1小鼠执行小鼠PK研究。小鼠借助于尾静脉经IV注射10mg/kg的测试物件(5ml/kg的剂量体积)。动物经圈养于标准IACUC批准的圈养条件下。在所指示的时间点，对所述动物实施安乐死以在K2EDTA管中收集血液(借助于心脏穿刺)且收集肺。血液经离心(2,000xg，持续10分钟)以获得血浆。对肺称重，且在具有无菌一次性杵的1.5ml管(Z359947,Sigma)中在包含11.64mL组织蛋白萃取试剂(78510,Thermo Scientific)、0.24ml蛋白酶抑制剂混合液(78410,Thermo Scientific)及0.12ml EDTA的100μL均质化缓冲液中均质化。在1-2min均质化之后，用均质化缓冲液将体积调节至1mL且所述样品在冰上经培育持续20min，其中通过轻柔涡旋进行周期性混合。均质液以8,000x g离心持续10min且保留上清液以随时间分析测试物件浓度。
通过夹心ELISA测量缀合物6在各时间点的血浆及肺浓度如下：缀合物6分子捕获在神经氨酸酶包被的板上且使用HRP缀合的抗人IgG-Fc抗体进行检测。在GraphPad Prism中使用缀合物6标准曲线的4PL非线性回归计算蛋白质浓度。更详细方法描述提供于下文中。
Nunc Maxisorp 96-孔板(目录号12-565-136,ThermoFisher)经1X KPL包被缓冲液(5150-0041,SeraCare)中来自A/California/04/2009(H1N1)(11058-VNAHC,SinoBiological)的神经氨酸酶包被。板在室温下在轨道板式振荡器上(500rpm)经培育持续1h。将血浆样品的系列稀释液铺板并在室温下培育持续2h(样品稀释剂：PBS中的1％BSA0.05％Tween 20+初试小鼠血浆最终浓度1:100)。在各板上一式两份进行介于500–0.230ng/mL范围内的缀合物6标准曲线。
在2h培育之后，板在具有0.05％Tween 20的300μL PBS中洗涤5次。结合于板上的神经氨酸酶的缀合物6接着在室温下用1:1,000稀释于样品稀释剂中的HRP缀合的抗人IgGFc F(ab’)2(709-036-098,Jackson)探测持续1h。板接着在具有0.05％Tween 20的300μLPBS中洗涤8次且用TMB底物显影持续7-8分钟。所述反应用1N H2SO4停止。在450nm下读取吸光度。
使用Graphpad Prism Version 6，根据缀合物6标准曲线的非线性回归分析(S型，4PL分析)内推测试样品中的总缀合物6。比较缀合物6血浆及肺浓度的曲线显示于图40中。意外地，肺Cmax在t＝1h时实现(19.5μg/g肺组织，约310nM)。相对于血浆，存在缀合物6的大约10％肺暴露
实施例43.比较测试物件的IV、SC及IM施用的5天小鼠PK研究
使用6周龄雄性CD-1小鼠执行小鼠PK研究。小鼠借助于尾静脉经IV注射5mg/kg的测试物件(5ml/kg的剂量体积)。动物经圈养于标准IACUC批准的圈养条件下。在适当时间，对动物进行非末端放血(眶后、颊或通过尾静脉)，其中血液经收集于K2EDTA管中以预防凝血。所收集的血液经离心(2,000xg，持续10分钟)且抽出血浆以随时间分析测试物件浓度。
通过夹心ELISA测量缀合物6在各时间点的血浆浓度如下：缀合物6分子捕获在神经氨酸酶包被的板上且接着使用HRP缀合的抗人IgG-Fc抗体进行检测。在GraphPad Prism中使用缀合物6(或hIgG1Fc)标准曲线的4PL非线性回归计算蛋白质浓度。更详细方法描述提供于下文中。
Nunc Maxisorp 96-孔板(目录号12-565-136,ThermoFisher)经1X KPL包被缓冲液(5150-0041,SeraCare)中来自A/California/04/2009(H1N1)(11058-VNAHC,SinoBiological)的神经氨酸酶包被。板在室温下在轨道板式振荡器上(500rpm)经培育持续1h。将血浆样品的系列稀释液铺板并在室温下培育持续2h(样品稀释剂：PBS中的1％BSA0.05％Tween 20+初试小鼠血浆最终浓度1:100)。在各板上一式两份进行介于500–0.230ng/mL范围内的缀合物6标准曲线。
在2h培育之后，板在具有0.05％Tween 20的300μL PBS中洗涤5次。结合于板上的神经氨酸酶的缀合物6接着在室温下用1:1,000稀释于样品稀释剂中的HRP缀合的抗人IgGFc F(ab’)2(709-036-098,Jackson)探测持续1h。板接着在具有0.05％Tween 20的300μLPBS中洗涤8次且用TMB底物显影持续7-8分钟。所述反应用1N H2SO4停止。在450nm下读取吸光度。
使用Graphpad Prism Version 6，根据缀合物6标准曲线的非线性回归分析(S型，4PL分析)内推测试样品中的总缀合物6。比较缀合物6的曲线显示于图41中。针对IV、IM及SC的暴露水平为相似的，其中AUC分别为2082、1944及2500。
实施例44.小鼠功效及多物种PK支持人受试者中的罕见预防性给药
使用基于小鼠、大鼠及灵长类动物PK研究的小鼠功效给药的异速生长定标来预测人受试者中的给药及PK参数。在28天小鼠预防研究(参见实施例33)中，异速生长定标是基于2.5mg/kg有效剂量下的曲线下面积(AUC)。
对于仅食蟹猕猴的异速生长定标，仅使用简单的异速生长方程基于食蟹猕猴PK数据(实施例41)计算人清除率(CL)：CL(人)＝CL(猕猴)·[BW(人)/BW(猕猴)]w，其中BW＝体重，且w是固定为0.85的定标指数。单独食蟹猕猴定标的结果提供于表21中。
对于小鼠-大鼠-食蟹猕猴异速生长定标，根据以下异速生长方程，将根据动物物种的人清除率(CL)针对动物体重(BW)按对数-对数比例绘制：CL＝a·BWx，其中a是系数，且x是异速生长方程的指数。系数a及指数x分别自线性回归线的截距及斜率计算。小鼠-大鼠-食蟹猕猴定标的结果提供于表22中。
通过以上各自算法计算的人清除值接着用于使用以下等式计算实现3700ug-h/mL的功效AUC目标所需的相应人剂量(根据小鼠2.5mg/kg剂量，实施例33)：剂量＝CL·AUC。
表21：单独食蟹猕猴异速生长定标(β＝0.85)
功效曲线下面积(AUC) 3700μg-hr/mL
人清除率(CL) 0.43mL/min
人剂量 95.46mg，1.4mg/kg
表22.小鼠-大鼠-食蟹猕猴异速生长定标(β＝0.97)
功效曲线下面积(AUC) 3700μg-hr/mL
人清除率(CL) 0.59mL/min
人剂量 130.98mg，1.9mg/kg
实施例45.合成Int-11
Figure BDA0003630331990005311
步骤a.
Figure BDA0003630331990005312
(4-溴丁基)氨基甲酸叔丁酯(11.2g，60mmol)及(4-氨基丁基)氨基甲酸叔丁酯(10g，40mmol)溶解于DMF(150mL)中的溶液用碳酸钾(16.4g，120mmol)处理，接着在80℃下搅拌持续6h。所述反应混合物分配于DCM(500ml)与盐水(100ml)之间。分离有机层且用盐水洗涤，接着经硫酸钠干燥。过滤所述溶液，浓缩，且通过反相液体色谱法(RPLC)使用以10％至100％乙腈及水洗脱的Isco
Figure BDA0003630331990005314
液体色谱仪使用0.1％TFA作为修饰剂经纯化。产物的产量11.0g，产率77％。通过LCMS发现的离子：M+H＝360.4
步骤b.
Figure BDA0003630331990005313
前一步骤的产物(0.4g，1.11mmol)及Fmoc-OSu(0.45mg，1.3mmol)溶解于DCM(10mL)中，接着用N-甲基吗啉(0.22ml，2mmol)处理，且在室温下搅拌持续1h。所述反应经浓缩且通过反相液体色谱法(RPLC)使用以10％至100％乙腈及水洗脱的Isco
Figure BDA0003630331990005323
液体色谱仪不使用0.1％TFA作为修饰剂经纯化。产物的产量450mg，产率69％。通过LCMS发现的离子：M/2+H＝582.4。
步骤c.
Figure BDA0003630331990005321
前一步骤的产物(0.4g，0.7mmol)在室温下用TFA(5mL)处理持续0.5小时，接着浓缩至干且无需进一步纯化即用于下一步骤。此步骤的产率为定量的。通过LCMS发现的离子：M/2+H＝382.3。
步骤d.
Figure BDA0003630331990005322
来自前一步骤的Fmoc二胺(24mg，0.063mmol)添加至羧酸(80mg，0.126mmol，描述于合成Int-10步骤f中)于DMF(5mL)中的溶液中，接着相继用HATU(50mg，0.13mmol)、N-甲基吗啉(0.06ml，0.50mmol)处理。在搅拌持续1h之后，所得溶液经浓缩且通过反相液体色谱法(RPLC)使用以10％至100％乙腈及水洗脱的Isco
Figure BDA0003630331990005324
液体色谱仪不使用TFA作为修饰剂经纯化。产物的产量80mg，产率79％。通过LCMS发现的离子：M/2+H＝803.9。
步骤e.
Figure BDA0003630331990005331
前一步骤的产物(80mg，0.050mmol)用DMF(2mL)中的1％DBU(1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一-7-烯)处理且在室温下经搅拌。当通过LCMS发现所述反应完成时(15min)，其经浓缩，接着用TFA(2mL)处理且在室温下经搅拌持续30min。反应溶液经浓缩且通过反相液体色谱法(RPLC)使用以10％至100％乙腈及水洗脱的Isco
Figure BDA0003630331990005333
液体色谱仪使用0.1％TFA作为修饰剂经纯化。产物的产量为52mg，呈TFA盐形式。通过LCMS发现的离子：M/2+H＝492.7。
步骤f.
Figure BDA0003630331990005332
前一步骤的产物溶解于水(2mL)中，接着用氢氧化锂(12mg，0.50mmol，于1mL水中)溶液处理。通过LCMS监测所得反应。在搅拌持续10min之后，所述反应用0.1ml乙酸淬灭。所得溶液经浓缩且通过反相液体色谱法(RPLC)使用以0％至30％乙腈及水洗脱的Isco
Figure BDA0003630331990005334
液体色谱仪使用0.1％TFA作为修饰剂经纯化。产物的产量：30mg，呈TFA盐形式，产率66％。通过LCMS发现的离子：M/2+H＝452.7。M/3+H＝302.1。
实施例46.合成Int-12
Figure BDA0003630331990005341
步骤a.
Figure BDA0003630331990005342
向(4-溴丁基)氨基甲酸叔丁酯(4.8g，19mmol)及炔丙基-PEG4胺(2g，8.6mmol)于DMF(50mL)中的溶液中添加碳酸钾(3.6g，26mmol)。所述溶液在80℃下搅拌持续6h，接着分配于DCM(200ml)与盐水(50ml)之间。分离有机层，用盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤，且浓缩，接着通过反相液体色谱法(RPLC)使用以10％至100％乙腈及水洗脱的Isco
Figure BDA0003630331990005344
液体色谱仪使用0.1％TFA作为修饰剂经纯化。产物的产量3.5g，产率70％。通过LCMS发现的离子：M/2+H＝574.4。
步骤b.
Figure BDA0003630331990005343
前一步骤的产物(3.5g，8.6mmol)在室温下用TFA(20ml)处理持续0.5小时，接着浓缩至干，溶解于水中，经冷冻，经冻干，且无需进一步纯化即用于下一步骤。此步骤的产率为定量的。通过LCMS发现的离子：M/2+H＝374.3。
步骤c.
Figure BDA0003630331990005351
前一步骤的二胺TFA盐(37mg，0.1mmol)添加至羧酸(130mg，0.2mmol，描述于合成Int-10步骤f中)于10ml DMF中的溶液中，接着用HATU(80mg，0.2mmol)及N-甲基吗啉(0.25ml，2mmol)处理。所得溶液经搅拌持续1h，接着经浓缩且通过反相液体色谱法(RPLC)使用以10％至100％乙腈及水洗脱的Isco
Figure BDA0003630331990005353
液体色谱仪不使用0.1％TFA作为修饰剂经纯化。产物的产量120mg，产率75％。通过LCMS发现的离子：M/2+H＝799.9。
步骤d.
Figure BDA0003630331990005352
前一步骤的产物(120mg，0.075mmol)用2ml三氟乙酸处理且在室温下经搅拌持续30min。所得溶液经浓缩，溶解于水(2mL)中，接着用氢氧化锂(12mg，0.5mmol)溶解于水(1mL)中的溶液处理。所得溶液经搅拌10min，接着用0.1ml乙酸制成略微具酸性，经浓缩且通过反相液体色谱法(RPLC)使用以0％至30％乙腈及水洗脱的Isco
Figure BDA0003630331990005361
液体色谱仪使用0.1％TFA作为修饰剂经纯化。产物的产量48mg，呈TFA盐形式，产率57％。通过LCMS发现的离子：M/2+H＝559.757。M/3+H＝373.5。
实施例47.合成缀合物8
h-IgG1 Fc-PEG4-叠氮化物于PBSx1缓冲溶液中的溶液(100mg，1.71μmol，7.011mL，MW＝58200Da，DAR＝3.7)添加至炔衍生的小分子(Int-12 TFA盐，45mg，0.031mmol)及新鲜制备的CuSO4(0.7mL 50.0mM，20eq)、三(3-羟基丙基三唑基甲基)-胺(THPTA，0.7mL 50.0mM，20eq)及抗坏血酸钠(1.05mL 50.0mM，30eq)的pH 7.4PBS溶液中。所得均质溶液通过摇杆台搅拌持续12h。粗溶液用pH 7.4PBS稀释至1mg/mL的最终浓度，且经超滤(10,000MWCO)两次至1mL体积。粗混合物接着1:10稀释于PBS pH 7.4中，且相继使用MabSelect Sure Resin(GE Healthcare,Chicago,IL,USA)、尺寸排阻色谱法经纯化。经纯化材料使用NANODROPTM UV可见光光谱仪(使用基于缀合中所用的Fc的氨基酸序列计算的消光系数)经定量，且使用离心浓缩机(10,000MWCO)经浓缩至大约10mg/mL。经纯化分子使用4-12％Bis Tris SDS PAGE凝胶通过将1-2μg每种分子装载至所述凝胶中且使用instantBlue染色进行染色而经分析。每种凝胶包括具有经指示分子量标准的分子量梯(图42)。产率典型地为40-60％。MALDI MS分析显示质量范围(60000-90000)，其中质量的平均值为62358。平均DAR＝3。
实施例48.在CPE分析中且在致死性小鼠流感模型中比较所选择的抑制剂与其Fc-缀合物的体外及体内效能
为了证明本文所述的神经氨酸酶抑制剂与Fc的缀合在病毒复制分析中且在体内功效模型中增强其活性，我们在细胞病变效应(CPE)分析中且在致死性小鼠流感感染模型中比较所选择的未缀合抑制剂与其Fc缀合物的活性。关于CPE微量中和分析，一式两份制备以160nM或400nM(关于扎那米韦及奥司他韦对照，9600nM)开始的各测试物件(TA)的十种两倍连续稀释液，用于一小时接种感染复数(MOI)为0.001的INFV A(A/CA/09H1N1)及MOI为0.01的INFV B，以用于一小时培育。所述TA-病毒混合物接着添加至接种于96-孔板中的MDCK细胞中，且培育持续一小时。在INFV A感染后第3天及INFV B(B/Brisbane)感染后第5天，细胞经固定且用结晶紫染色且读取光学密度以使用XLfit剂量反应模型计算各TA的50百分比有效浓度(EC50)。也使用以160nM或400nM开始的各TA的十种两倍连续稀释液评估各TA的固有细胞毒性，所述稀释液一式两份经制备以用于接种96-孔培养板中的MDCK细胞。在治疗之后3及5天使用CellTiter-Glo试剂盒测定细胞活力。使用XLfit剂量反应模型计算50％细胞毒性浓度(CC50)。直至所测试的最高浓度，关于任何TA均未观察到细胞毒性。基于CPE的微量中和分析的概述显示于表23中。
表23.基于CPE的微量中和分析
Figure BDA0003630331990005371
概述于表23中的数据证明所述神经氨酸酶二聚体的Fc缀合形式在CPE微量中和分析中具有优于其未缀合配对物的活性。当比较缀合物6与Int-7时，分别观察到对INFVA及INFV B的166倍及2倍增强。当比较缀合物8与Int-12时，分别观察到对INFVA及INFV B的26倍及2倍增强。
使用雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8周)在致死性IAV H1N1流感感染模型中比较缀合物6与表23中所概述的所述研究的最有效神经氨酸酶抑制剂二聚体(Int-11，对应于Int-12但不具有允许缀合于Fc的三聚体接头的单独二聚体)。攻击病毒(A/Puerto Rico/08/1934,aka PR8)是小鼠适应性分离株，具有每只小鼠大约30个斑块形成单元(pfu)的LD90。
所述实验包含8组，每组5只小鼠。在第0天，所有小鼠均通过鼻内接种至经氯胺酮/甲苯噻嗪的混合物(分别为150及10mg/kg)麻醉的小鼠经50μl体积的PR8(10x LD90)攻击。在攻击之后2小时，各组通过IV接受媒介物、单独hIgG1 Fc、缀合物6或Int-11的单一治疗(表24；第1-6组)。第7组也通过IV接受Int-11(15mg/kg)，每天两次(bid)，持续5天。第8组经口(PO)接受奥司他韦(15mg/kg)，bid，持续5天。在病毒攻击之后监测所有小鼠的生存(表25)及重量损失(数据未示)，持续10天。
如所预期，经媒介物或单独hIgG1 Fc治疗的小鼠截至第7天死于感染(表25)。经10个剂量(总计150mg/小鼠)的奥司他韦治疗的小鼠证明统计学上显著的死亡延迟，但直至第10天仅有单一动物生存。接受0.3或3mg/kg的单一剂量的缀合物6的所有小鼠均生存至所述研究结束且在所述实验的过程中显示净重量增加。重要的是，接受0.3或3mg/kg的Int-11的所有小鼠均在所述研究的过程中死亡，相对于媒介物及单独hIgG1 Fc对照仅具有最短(2天或更短)死亡延迟。由于hIgG1 Fc不具有固有抗病毒活性(第2组)，这表明缀合物6的经极大改进活性是由Fc上的多价呈现引起的经改进亲合力的结果，如概述于表23中的结果以及Fc介导的免疫衔接的经改进药代动力学及作用所表明。单独抑制剂二聚体与缀合物6之间的活性差异在两种剂量浓度下均为统计学上显著的(比较第3组及第6组，及第4组及第5组；表25)。以质量计，要观察到与缀合物6相等的功效，需要高500倍的累积剂量的Int-11。
表24：研究设计
Figure BDA0003630331990005391
表25：小鼠生存
Figure BDA0003630331990005392
实施例49.合成Int-13((5R)-((1R)-乙酰胺基-(2S)-甲氧基-(2S)-甲基戊基)-(4S)-E/Z-[3-(炔丙基-PEG4)-丙烯基]-吡咯烷-(2R)-甲酸)
Figure BDA0003630331990005401
步骤a.(2R)-((1R)-乙酰胺基-(2S)-甲氧基-(2S)-甲基戊基)-(5R)-羧基-(3S)-Z-丙烯基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。
向(5R)-((1R)-乙酰胺基-(2S)-甲氧基-(2S)-甲基戊基)-(4S)-Z-丙烯基吡咯烷-(2R)-甲酸,HCl盐(根据参考文献JACS,2002,124,4716-4721经制备；1.0mmol)于乙腈(10mL)中的搅拌混合物中添加三甲基氢氧化铵(1.5mmol)。在室温下搅拌持续3h之后，添加二碳酸二-叔丁酯(4eqmol)。在反应完成时，所有挥发物均根据真空技术经蒸发。残余物用水(10ml)稀释。添加乙酸乙酯(10ml)，且添加1M硫酸水溶液直至水层达到pH约为3。用乙酸乙酯的额外两个等分试样(10mL)洗涤水层。经组合的有机物经硫酸钠干燥，过滤且浓缩。残余物通过色谱技术经纯化以提供所需产物。
步骤b.(2R)-((1R)-乙酰胺基-(2S)-甲氧基-(2S)-甲基戊基)-(5R)-羧基甲基-(3S)-Z-丙烯基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。
向(2R)-((1R)-乙酰胺基-(2S)-甲氧基-(2S)-甲基戊基)-(5R)-羧基-(3S)-Z-丙烯基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(1.0mmol)于二氯甲烷(5.0mL)及甲醇(1.0mL)中的0℃搅拌混合物中缓慢地添加(三甲基硅烷基)重氮甲烷(1.1mmol)。所述混合物经搅拌直至完成，同时轻柔地使温度达到环境温度。所有挥发物均根据真空技术经蒸发。必要时，残余物通过色谱技术经纯化以提供所需产物。
步骤c.(2R)-((1R)-乙酰胺基-(2S)-甲氧基-(2S)-甲基戊基)-(5R)-羧基甲基-(3S)-甲酰基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。
(2R)-((1R)-乙酰胺基-(2S)-甲氧基-(2S)-甲基戊基)-(5R)-羧基甲基-(3S)-Z-丙烯基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(1mmol)于二氯甲烷(15mL)中的室温混合物经冷却至-78℃。臭氧鼓泡通过所述溶液，直至溶解的臭氧的淡蓝色持续。氮气鼓泡通过所述溶液，直至蓝色消失，接着添加二甲硫醚(4.0mmol)，烧瓶经转移至冷冻器(-20℃)中且静置持续1小时。浓缩所述溶液且残余物通过色谱技术经纯化以提供所需产物。
步骤d.(2R)-((1R)-乙酰胺基-(2S)-甲氧基-(2S)-甲基戊基)-(5R)-羧基甲基-(3S)-E/Z-[3-(炔丙基-PEG4)-丙烯基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。
向炔丙基-PEG4-溴化鏻(1.0mmol)于DMF(5.0mL)中的0℃搅拌混合物中添加氢化钠(1.1mmol)，且10分钟之后，温度升至环境温度。继续搅拌持续1h，接着添加DMF(1.0mL)中的(2R)-((1R)-乙酰胺基-(2S)-甲氧基-(2S)-甲基戊基)-(5R)-羧基甲基-(3S)-甲酰基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(1.0mmol)。在完成时，所述反应通过饱和氯化铵溶液淬灭。用乙酸乙酯萃取所述水溶液数次，且经组合的有机相用盐水洗涤，干燥，且蒸发。残余物通过色谱技术经纯化以提供所需产物。
步骤e.(2R)-((1R)-乙酰胺基-(2S)-甲氧基-(2S)-甲基戊基)-(5R)-羧基-(3S)E/Z-[3-(炔丙基-PEG4)-丙烯基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。
向(2R)-((1R)-乙酰胺基-(2S)-甲氧基-(2S)-甲基戊基)-(5R)-羧基甲基-(3S)-E/Z-[3-(炔丙基-PEG4)-丙烯基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(1.0mmol)于四氢呋喃(12.0mL)及水(3.0mL)中的0℃搅拌混合物中添加氢氧化锂(1.1mmol)。继续搅拌且温度在15分钟之后升至环境温度。在完成时，借助于过量添加
Figure BDA0003630331990005421
IRN-77树脂使所述溶液达到酸性pH。过滤所述混合物且滤液根据真空技术经浓缩，生成标题化合物。必要时，残余物通过色谱技术经纯化以提供所需产物。
步骤f.(5R)-((1R)-乙酰胺基-(2S)-甲氧基-(2S)-甲基戊基)-(4S)-E/Z-[3-(炔丙基-PEG4)-丙烯基]-吡咯烷-(2R)-甲酸。
向(2R)-((1R)-乙酰胺基-(2S)-甲氧基-(2S)-甲基戊基)-(5R)-羧基-(3S)E/Z-[3-(炔丙基-PEG4)-丙烯基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(1.0mmol)及2-甲基-2-丁烯(0.5mL)于二氯甲烷(8.0mL)中的0℃搅拌混合物中添加三氟乙酸(4.0mL)。10分钟之后，温度升至环境温度。在完成时，所有挥发物均根据真空技术经蒸发。残余物通过色谱技术经纯化以提供所需产物。
实施例50.合成缀合物9
hIgG1 Fc-PEG4-叠氮化物于pH 7.4PBS x 1缓冲溶液中的溶液(100mg，1.71μmol，7.011mL，MW＝58,200Da，DAR＝3.7)添加至Int-13((5R)-((1R)-乙酰胺基-(2S)-甲氧基-(2S)-甲基戊基)-(4S)-E/Z-[3-(炔丙基-PEG4)-丙烯基]-吡咯烷-(2R)-甲酸)(0.031mmol)、硫酸铜(0.62mmol)、三(3-羟基丙基三唑基甲基)-胺(0.62mmol)及抗坏血酸钠(0.93mmol)的pH 7.4PBS x 1缓冲溶液(2.45mL)中。所得均质溶液用摇杆台轻柔地经振荡持续12h。粗溶液用pH 7.4PBS稀释至1mg/mL的最终浓度，且经超滤(10,000MWCO)两次至1mL体积。粗混合物接着1:10稀释于PBS pH 7.4中，且相继使用MabSelect Sure Resin(GEHealthcare,Chicago,IL,USA)、尺寸排阻色谱法经纯化。经纯化材料使用NANODROPTM UV可见光光谱仪(使用基于缀合中所用的Fc的氨基酸序列计算的消光系数)经定量，且使用离心浓缩机(10,000MWCO)经浓缩至大约10mg/mL。经纯化分子使用4-12％Bis Tris SDS PAGE凝胶通过将1-2ug每种分子装载至所述凝胶中且使用instant Blue染色进行染色而经分析。每种凝胶包括具有经指示分子量标准的分子量梯。使用MALDI MS分析来测定平均DAR。
实施例51.合成炔丙基-PEG4-溴化鏻。
Figure BDA0003630331990005431
炔丙基-PEG4-溴化物(1.0mmol)及三苯膦(1.2mmol)于甲苯(10mL)中的混合物经回流。在完成时，所述混合物冷却至环境温度。过滤固体且无需任何额外纯化即用于下一步骤。
实施例52.合成Int-14((5R)-[(1R)-(炔丙基-PEG4-羧酰胺)-(2S)-甲氧基-(2S)-甲基戊基]-(4S)-Z-丙烯基吡咯烷-(2R)-甲酸,HCl盐)
Figure BDA0003630331990005432
步骤a.N-{(2.S)-甲氧基-((1R)-[1-(4-甲氧基苯甲基)-5-氧代-(3S)-Z-丙烯基吡咯烷-(2R)-基]-(2S)-甲基戊基}-(炔丙基-PEG4)-甲酰胺。
向{(2S)-甲氧基-(1R)-[1-(4-甲氧基苯甲基)-5-氧代-(3S)-Z-丙烯基吡咯烷-(2R)-基]-(2S)-甲基戊基}-氨基甲酸叔丁酯(其根据参考文献JACS,2002,124,4716-4721经制备；1.0mmol)于无水二氯甲烷(5mL)中的0℃搅拌混合物中添加三氟乙酸(10mmol)，且温度升至环境温度。在完成时，在减压下移除溶剂。所得残余物溶解于二氯甲烷(20mL)中且用饱和碳酸氢钠水溶液萃取。分离有机层，干燥(硫酸钠)，过滤且蒸发。粗胺溶解于DMF(5mL)中且在0℃下在搅拌下用炔丙基-PEG4-酸(1.1mmol)、二异丙基乙胺(3.0mmol)及HATU(1.1mmol)处理。在反应完成时，所有挥发物均根据真空技术经蒸发。残余物溶解于乙酸乙酯(15ml)中，且相继用饱和碳酸氢钠水溶液(10mL)、1M硫酸水溶液(10mL)洗涤。经组合的有机物经硫酸钠干燥，过滤且浓缩。残余物通过色谱技术经纯化以提供所需产物。
步骤b.(2R)-((1R)-(炔丙基-PEG4-羧酰胺)-(2S)-甲氧基-(2S)-甲基戊基)-(5R)-氧代-(3S)-Z-丙烯基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。
在45℃下在1h期间分成小份向N-{(2.S)-甲氧基-(1R)-[1-(4-甲氧基苯甲基)-5-氧代-(3S)-Z-丙烯基吡咯烷-(2R)-基]-(2S)-甲基戊基}-(炔丙基-PEG4)-甲酰胺(1.0mmol)于乙腈及水的混合物(10:1，5mL)中的搅拌溶液中添加硝酸铈铵(2.0mmol)，且继续搅拌直至完成。所述反应用饱和碳酸氢钠水溶液(5mL)淬灭。水层用EtOAc(3×10mL)萃取，经组合的有机层经干燥(硫酸钠)且蒸发以生成粗物质，其无需进一步纯化即用于下一步骤。所述材料溶解于乙腈(5mL)中，相继添加碳酸二-叔丁酯(1.5mmol)、三乙胺(2.0mmol)及DMAP(催化量)。在完成时，所述反应用饱和氯化铵溶液(5mL)淬灭。水层用EtOAc(3×10mL)萃取，且经组合的有机层经干燥(硫酸钠)。所有挥发物均根据真空技术经移除。必要时，残余物通过色谱技术经纯化以提供所需产物。
步骤c.(2R)-((1R)-(炔丙基-PEG4-羧酰胺)-(2S)-甲氧基-(2S)-甲基戊基)-(5R/S)-甲氧基-(3S)-Z-丙烯基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。
向(2R)-((1R)-(炔丙基-PEG4-羧酰胺)-(2S)-甲氧基-(2S)-甲基戊基)-(5R)-氧代-(3S)-Z-丙烯基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(1.0mmol)于THF(8mL)中的-78℃搅拌溶液中添加
Figure BDA0003630331990005441
(1M于THF中，2.2mmol)。30min之后，所述反应混合物用饱和碳酸氢钠水溶液(4mL)及30％过氧化氢(5滴)淬灭。所述混合物加温至rt且再搅拌持续30min且水层用EtOAc(3×10mL)萃取。经组合的有机层经干燥(硫酸钠)且蒸发溶剂以生成半胺醛，其无需进一步纯化即使用。在rt下向上述产物于甲醇(16mL)中的溶液中添加对甲苯磺酸水合物(0.1mmol)。所述反应混合物经搅拌过夜且用饱和碳酸氢钠水溶液(10mL)淬灭。在减压下移除甲醇，水(10mL)添加至所得残余物中且用EtOAc(3×10mL)萃取。分离有机物且经盐水及硫酸钠干燥，过滤且浓缩。必要时，残余物通过色谱技术经纯化以提供所需产物。
步骤d.(2R)-((1R)-(炔丙基-PEG4-羧酰胺)-(2S)-甲氧基-(2S)-甲基戊基)-(5R)-氰基-(3S)-Z-丙烯基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。
向(2R)-((1R)-(炔丙基-PEG4-羧酰胺)-(2S)-甲氧基-(2S)-甲基戊基)-(5R/S)-甲氧基-(3S)-Z-丙烯基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(1.0mmol)于二氯甲烷(20mL)中的-78℃搅拌溶液中相继添加氰化三甲基硅烷(2.0mmol)、三氟化硼乙醚(1.2mmol)。所述反应混合物经3h时期自-78℃经搅拌至-50℃。添加饱和碳酸氢钠水溶液(40mL)且水层用EtOAc(3×15mL)萃取。经组合的有机层经干燥(硫酸钠)，过滤且在减压下浓缩。由差向异构氰基衍生物的混合物组成的所得残余物通过色谱技术经纯化以提供所需产物。
步骤e.(5R)-[(1R)-(炔丙基-PEG4-羧酰胺)-(2S)-甲氧基-(2S)-甲基戊基]-(4S)-Z-丙烯基吡咯烷-(2R)-甲酸,HCl盐。
在rt下向(2R)-((1R)-(炔丙基-PEG4-羧酰胺)-(2S)-甲氧基-(2S)-甲基戊基)-(5R)-氰基-(3S)-Z-丙烯基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(1.0mmol)于AcOH(10mL)中的溶液中添加12N HCl(10mL)。所述溶液在rt下经搅拌直至完成，在减压下蒸发溶剂。必要时，残余物通过色谱技术经纯化以提供所需产物。
实施例53.合成缀合物10
hIgG1 Fc-PEG4-叠氮化物于pH 7.4PBS x 1缓冲溶液中的溶液(100mg，1.71μmol，7.011mL，MW＝58,200Da，DAR＝3.7)添加至Int-14((5R)-[(1R)-(炔丙基-PEG4-羧酰胺)-(2S)-甲氧基-(2S)-甲基戊基]-(4S)-Z-丙烯基吡咯烷-(2R)-甲酸,HCl盐)(0.031mmol)、硫酸铜(0.62mmol)、三(3-羟基丙基三唑基甲基)-胺(0.62mmol)及抗坏血酸钠(0.93mmol)的pH 7.4PBS x 1缓冲溶液(2.45mL)中。所得均质溶液用摇杆台轻柔地经振荡持续12h。粗溶液用pH 7.4PBS稀释至1mg/mL的最终浓度，且经超滤(10,000MWCO)两次至1mL体积。粗混合物接着1:10稀释于PBS pH 7.4中，且相继使用MabSelect Sure Resin(GE Healthcare,Chicago,IL,USA)、尺寸排阻色谱法经纯化。经纯化材料使用NANODROPTM UV可见光光谱仪(使用基于缀合中所用的Fc的氨基酸序列计算的消光系数)经定量，且使用离心浓缩机(10,000MWCO)经浓缩至大约10mg/mL。经纯化分子使用4-12％Bis Tris SDS PAGE凝胶通过将1-2μg每种分子装载至所述凝胶中且使用instantBlue染色进行染色而经分析。每种凝胶包括具有经指示分子量标准的分子量梯。使用MALDI MS分析来测定平均DAR。
实施例54.Int-15，HCl盐的合成
Figure BDA0003630331990005471
步骤a.N-{(2.S)-甲氧基-((1R)-[1-(4-甲氧基苯甲基)-5-氧代-(3S)-Z-丙烯基吡咯烷-(2R)-基]-(2S)-甲基戊基}-(3-丁炔基)-甲酰胺。
向{(2S)-甲氧基-(1R)-[1-(4-甲氧基苯甲基)-5-氧代-(3S)-Z-丙烯基吡咯烷-(2R)-基]-(2S)-甲基戊基}-氨基甲酸叔丁酯(其根据参考文献JACS,2002,124,4716-4721经制备；1.0mmol)于无水二氯甲烷(5mL)中的0℃搅拌混合物中添加三氟乙酸(10mmol)，且温度升至环境温度。在完成时，在减压下移除溶剂。所得残余物溶解于二氯甲烷(20mL)中且用饱和碳酸氢钠水溶液萃取。分离有机层，干燥(硫酸钠)，过滤且蒸发。粗胺溶解于DMF(5mL)中且在0℃下在搅拌下用4-戊炔酸(1.1mmol)、二异丙基乙胺(3.0mmol)及HATU(1.1mmol)处理。在反应完成时，所有挥发物均根据真空技术经蒸发。残余物溶解于乙酸乙酯(15ml)中，且相继用饱和碳酸氢钠水溶液(10mL)、1M硫酸水溶液(10mL)洗涤。经组合的有机物经硫酸钠干燥，过滤且浓缩。残余物通过色谱技术经纯化以提供所需产物。
步骤b.(2R)-((1R)-(4-戊炔酰基)-(2S)-甲氧基-(2S)-甲基戊基)-(5R)-氧代-(3S)-Z-丙烯基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。
在45℃下在1h期间分成小份向N-{(2.S)-甲氧基-(1R)-[1-(4-甲氧基苯甲基)-5-氧代-(3S)-Z-丙烯基吡咯烷-(2R)-基]-(2S)-甲基戊基}-(3-丁炔基)-甲酰胺(1.0mmol)于乙腈及水的混合物(10:1，5mL)中的搅拌溶液中添加硝酸铈铵(2.0mmol)，且继续搅拌直至完成。所述反应用饱和碳酸氢钠水溶液(5mL)淬灭。水层用EtOAc(3×10mL)萃取，经组合的有机层经干燥(硫酸钠)且蒸发以生成粗物质，其无需进一步纯化即用于下一步骤。所述材料溶解于乙腈(5mL)中，相继添加碳酸二-叔丁酯(1.5mmol)、三乙胺(2.0mmol)及DMAP(催化量)。在完成时，所述反应用饱和氯化铵溶液(5mL)淬灭。水层用EtOAc(3×10mL)萃取，且经组合的有机层经干燥(硫酸钠)。所有挥发物均根据真空技术经移除。必要时，残余物通过色谱技术经纯化以提供所需产物。
步骤c.(2R)-((1R)-(4-戊炔酰基)-(2S)-甲氧基-(2S)-甲基戊基)-(5R/S)-甲氧基-(3S)-Z-丙烯基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。
向(2R)-(1R)-(2R)-((1R)-(4-戊炔酰基)-(2S)-甲氧基-(2S)-甲基戊基)-(5R)-氧代-(3S)-Z-丙烯基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(1.0mmol)于THF(8mL)中的-78℃搅拌溶液中添加
Figure BDA0003630331990005481
(1M于THF中，2.2mmol)。30min之后，所述反应混合物用饱和碳酸氢钠水溶液(4mL)及30％过氧化氢(5滴)淬灭。所述混合物加温至rt且再搅拌持续30min且水层用EtOAc(3×10mL)萃取。经组合的有机层经干燥(硫酸钠)且蒸发溶剂以生成半胺醛，其无需进一步纯化即使用。在rt下向上述产物于甲醇(16mL)中的溶液中添加对甲苯磺酸水合物(0.1mmol)。所述反应混合物经搅拌过夜且用饱和碳酸氢钠水溶液(10mL)淬灭。在减压下移除甲醇，水(10mL)添加至所得残余物中且用EtOAc(3×10mL)萃取。分离有机物且经盐水及硫酸钠干燥，过滤且浓缩。必要时，残余物通过色谱技术经纯化以提供所需产物。
步骤d.(2R)-((1R)-(4-戊炔酰基)-(2S)-甲氧基-(2S)-甲基戊基)-(5R)-氰基-(3S)-Z-丙烯基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。
向(2R)-((1R)-(4-戊炔酰基)-(2S)-甲氧基-(2S)-甲基戊基)-(5R/S)-甲氧基-(3S)-Z-丙烯基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(1.0mmol)于二氯甲烷(20mL)中的-78℃搅拌溶液中相继添加氰化三甲基硅烷(2.0mmol)、三氟化硼乙醚(1.2mmol)。所述反应混合物经3h时期自-78℃经搅拌至-50℃。添加饱和碳酸氢钠水溶液(40mL)且水层用EtOAc(3×15mL)萃取。经组合的有机层经干燥(硫酸钠)，过滤且在减压下浓缩。由差向异构氰基衍生物的混合物组成的所得残余物通过色谱技术经纯化以提供所需产物。
步骤e.
向N-{(2.S)-甲氧基-(1R)-[1-(4-甲氧基苯甲基)-5-氧代-(3S)-Z-丙烯基吡咯烷-(2R)-基]-(2S)-甲基戊基}-(3-丁炔基)-甲酰胺(1.0mmol)、双-[N’-(2-叠氮基乙基)]-亚氨基二乙酰胺(0.5mmol)、1H-1,2,3-三唑-4-甲胺,1-(苯基甲基)-N,N-双[1-(苯基甲基)-1H-1,2,3-三唑-4-基]甲基]-(0.1mmol)及抗坏血酸钠(1.0mmol)于乙醇(5mL)及水(5mL)中的搅拌混合物中添加硫酸铜(0.1mmol)。在完成时，所述反应用SiliaMetS TAAcONa(0.3mmol)处理持续30分钟。过滤所述反应且所有挥发物均根据真空技术经蒸发。残余物通过色谱技术经纯化以提供所需产物。
步骤f.
向步骤e.的中间体(1.0mmol)、炔丙基-PEG4-酸(1.05mmol)及DIPEA(3.0mmol)于DMF(10mL)中的0℃搅拌溶液中添加HATU(2.0mmol)。所有挥发物均根据真空技术经蒸发且残余物通过色谱技术经纯化以提供所需产物。
步骤g.Int-15,HCl盐
在rt下向步骤f.的中间体(1.0mmol)于AcOH(10mL)中的溶液中添加12N HCl(10mL)。所述溶液在rt下经搅拌直至完成，在减压下蒸发溶剂。必要时，残余物通过色谱技术经纯化以提供所需产物。
实施例55.合成缀合物11
hIgG1 Fc-PEG4-叠氮化物于pH 7.4PBS x 1缓冲溶液中的溶液(100mg，1.71μmol，7.011mL，MW＝58,200Da，DAR＝3.7)添加至Int-15 HCl盐(0.031mmol)、硫酸铜(0.62mmol)、三(3-羟基丙基三唑基甲基)-胺(0.62mmol)及抗坏血酸钠(0.93mmol)的pH 7.4PBS x 1缓冲溶液(2.45mL)中。所得均质溶液用摇杆台轻柔地振荡持续12h。粗溶液用pH 7.4PBS稀释至1mg/mL的最终浓度，且经超滤(10,000MWCO)两次至1mL体积。粗混合物接着1:10稀释于PBS pH 7.4中，且相继使用MabSelect Sure Resin(GE Healthcare,Chicago,IL,USA)、尺寸排阻色谱法经纯化。经纯化材料使用NANODROPTM UV可见光光谱仪(使用基于缀合中所用的Fc的氨基酸序列计算的消光系数)经定量，且使用离心浓缩机(10,000MWCO)经浓缩至大约10mg/mL。经纯化分子使用4-12％Bis Tris SDS PAGE凝胶通过将1-2μg每种分子装载至所述凝胶中且使用instant Blue染色进行染色而经分析。每种凝胶包括具有经指示分子量标准的分子量梯。使用MALDI MS分析来测定平均DAR。
实施例56.合成双-[N’-(2-叠氮基乙基)]-亚氨基二乙酰胺。
Figure BDA0003630331990005511
步骤a.双-[N’-(2-叠氮基乙基)]-N-Boc-亚氨基二乙酰胺。
向N-Boc-亚氨基二乙酸(1.0mmol)、2-叠氮基乙-1-胺盐酸盐(2.0mmol)及DIPEA(6.0mmol)于DMF(10mL)中的0℃搅拌溶液中添加HATU(2.0mmol)。所有挥发物均根据真空技术经蒸发且残余物通过色谱技术经纯化以提供所需产物。
步骤b.双-[N’-(2-叠氮基乙基)]-亚氨基二乙酰胺。
向双-[N’-(2-叠氮基乙基)]-N-Boc-亚氨基二乙酰胺(1.0mmol)及2-甲基-2-丁烯(0.5mL)于二氯甲烷(8.0mL)中的0℃搅拌混合物中添加三氟乙酸(4.0mL)。10分钟之后，温度升至环境温度。在完成时，所有挥发物均根据真空技术经蒸发。残余物通过色谱技术经纯化以提供所需产物。
实施例57.合成Int-16
缀合于PEG4-炔接头且可进一步缀合于Fc结构域或白蛋白的磺基扎那米韦单体是根据以下合成方案产生。磺基扎那米韦起始材料根据以下产生：Hadházi等人Asulfozanamivir analogue has potent anti-influenza virus activity.ChemMedChemComm.13:785-789(2018)。
Figure BDA0003630331990005521
实施例58.合成Int-17
缀合于PEG4-炔接头且可进一步缀合于Fc结构域或白蛋白的磺基扎那米韦二聚体根据以下合成方案产生。磺基扎那米韦起始材料根据以下产生：Hadházi等人Asulfozanamivir analogue has potent anti-influenza virus activity.ChemMedChemComm.13:785-789(2018)。
Figure BDA0003630331990005522
Figure BDA0003630331990005531
实施例59.合成缀合物12
经叠氮基官能化的无糖基化Fc的溶液(70mg，4.7mL，1.3709μmol)添加至含有炔衍生的小分子(29.8mg，0.0216mmol，Int-7)的15mL离心管中。在轻柔地振荡以溶解所有固体之后，向所述混合物中添加206μl L-抗坏血酸钠(59.4mg，0.3mmol)、硫酸铜(II)(15.9mg，0.1mmol)及THPTA(43.5mg，0.1mmol)于PBS 7.4缓冲液(1ml)中的混合溶液。所得混合物轻柔地振荡过夜。其相继通过在蛋白A柱上的亲和力色谱法、如实施例8所述的尺寸排阻色谱法经纯化。经纯化最终产物的Maldi TOF分析给出56,177Da的平均质量(DAR＝3.6)。产量10.1mg，14％产率。缀合物12的非还原SDS-PAGE提供于图54中。
实施例60.合成Int-18
Figure BDA0003630331990005541
步骤a.合成(17-{4-[(叔丁氧羰基)氨基]丁基}-16-氧代-4,7,10,13-四氧杂-17-氮杂二十一-1-炔-21-基)氨基甲酸叔丁酯
Figure BDA0003630331990005542
在室温下向[氮烷二基二(丁烷-4,1-二基)]双氨基甲酸二-叔丁酯(1.5g，4.17mmol，来自实施例45步骤a)及炔丙基-PEG4-酸(1.08g，4.17mmol)于DCM(40mL)中的溶液中添加EDC(1.0g，5mmol)、HOBt(650mg，5mmol)及DIEA(1.4ml，10mmol)，接着在室温下搅拌过夜。所得溶液经浓缩且通过反相液体色谱法(RPLC)使用以10％至100％乙腈及水洗脱的Isco
Figure BDA0003630331990005543
液体色谱仪不使用修饰剂经纯化。产量1.9g，产率76％。通过LCMS发现的离子：M+H＝602.4。
步骤b.合成N,N-双(4-氨基丁基)-4,7,10,13-四氧杂十六-15-炔-1-酰胺
Figure BDA0003630331990005551
(17-{4-[(叔丁氧羰基)氨基]丁基}-16-氧代-4,7,10,13-四氧杂-17-氮杂二十一-1-炔-21-基)氨基甲酸叔丁酯(1.90，3.1mmol)在室温下用20ml TFA处理持续0.5小时，接着浓缩至干且无需进一步纯化即用于下一步骤。此步骤的产率为定量的。通过LCMS发现的离子：M/2+H＝402.3。
步骤c.合成经完全保护的Int-18
Figure BDA0003630331990005552
N,N-双(4-氨基丁基)-4,7,10,13-四氧杂十六-15-炔-1-酰胺(0.150g，0.32mmol)添加至醚连接的扎那米韦酸(0.400g，0.63mmol，描述于实施例31步骤f中)于DCM(10mL)中的溶液中，接着在室温下用EDC(0.200g，1.0mmol)、HOBt(0.135g，1.00mmol)及DIEA(0.14ml，1.00mmol)处理过夜。所得溶液经浓缩且通过反相液体色谱法(RPLC)使用以10％至100％乙腈及水洗脱的Isco
Figure BDA0003630331990005553
液体色谱仪不使用0.1％TFA作为修饰剂经纯化。产物的产量310mg，产率60.3％。通过LCMS发现的离子：M/2+H＝813.9。
步骤d.合成Int-18
Figure BDA0003630331990005561
前一步骤的产物(300mg，0.18mmol)用三氟乙酸(2mL)处理且在室温下经搅拌持续30min。所得溶液经浓缩，再溶解于水(2mL)中，接着用氢氧化锂(24mg，1mmol)溶解于水(1mL)中的溶液处理。所述反应经搅拌10min，接着用0.1ml乙酸淬灭，经浓缩且通过反相液体色谱法(RPLC)使用以0％至50％乙腈及水洗脱的Isco
Figure BDA0003630331990005562
液体色谱仪使用0.1％TFA作为修饰剂经纯化。产物的产量140mg，产率52％。通过LCMS发现的离子：M/2+H＝573.8,M/3+H＝382.9。
实施例61.合成用于缀合物13a的PEG4-叠氮基Fc
制备DMF/PBS中的0.05M PEG4-叠氮基NHS酯溶液
PEG4-叠氮基NHS酯(80.5mg)在0℃下溶解于DMF(0.50mL)中且在0℃下通过添加3.50mL PBS 1x缓冲液经稀释至4.063mL。使用此溶液，通过调节此PEG4-叠氮基NHS酯PBSx1溶液的当量数来制备具有多种药物-抗体比率(DAR)值的其他PEG4-叠氮基Fc。
制备PEG4-叠氮基Fc
0.05M PEG4-叠氮基NHS酯PBS x1缓冲溶液(0.0984mL，4.92μmol，2.5当量)添加至h-IgG1 Fc溶液(105mg于5.031mL pH 7.4PBS中，MW约53,360Da，1.968μmol)中且所述混合物在环境温度下轻柔地振荡持续12小时。所述溶液使用离心浓缩机(30,000MWCO)经浓缩至约1.5mL的体积。粗混合物1:10稀释于PBS pH 7.4中，且再次经浓缩。重复此洗涤程序，共计三次。用此程序移除未反应的叠氮基试剂。经浓缩Fc-PEG4-叠氮化物用pH 7.4PBS 1x缓冲液稀释至5.03mL且准备用于点击缀合。经纯化材料使用NANODROPTM UV可见光光谱仪(使用基于h-IgG1的氨基酸序列计算的消光系数)经定量。在缓冲液交换/纯化之后，产率为定量的。
编码本文所述的任何缀合物的Fc的核酸构建体可包含编码Fc的氨基酸序列的核酸序列，所述Fc的氨基酸序列包含Lys447(例如，C端赖氨酸残基)及/或N端鼠科动物IgG信号序列。在表达后，Fc的C端赖氨酸及(当存在时)N端鼠科动物IgG信号序列被蛋白水解切割，导致Fc具有缺少Lys447(例如，缺少C端赖氨酸残基)及(当存在于表达构建体中时)N端鼠科动物IgG信号序列的氨基酸序列。C端赖氨酸的存在与否不会改变Fc或对应缀合物的特性。
实施例62.合成缀合物13a
点击试剂溶液的制备：PBS缓冲溶液中的0.0050M CuSO4：20.0mg CuSO4溶解于25.0mL PBS x1中，接着取22.0mL上述CuSO4溶液且添加189.4mg BTTAA及1090mg抗坏血酸Na以生成澄清溶液(0.0050M CuSO4、0.020M BTTAA及0.25M抗坏血酸钠)。
叠氮基官能化Fc溶液(100mg，4.79mL，1.87μmol，SEQ ID NO:35)添加至含有炔衍生的小分子Int-18(11.2mg，0.00750mmol，制备于实施例60中)的15mL离心管中。在轻柔地振荡以溶解所有固体之后，所述溶液用3.00mL上述点击试剂溶液处理。所得无色均质溶液轻柔地振荡过夜。其相继通过在蛋白A柱上的亲和力色谱法、尺寸排阻色谱法(参见实施例10中的一般缀合物纯化方案)经纯化。经纯化最终产物的Maldi TOF分析给出55,913Da的平均质量(DAR＝1.7)。产量54.0mg，54％产率。
编码缀合物13a的Fc的核酸构建体包含编码SEQ ID NO:35的氨基酸序列的核酸，所述Fc包含C端赖氨酸残基及N端鼠科动物IgG信号序列。在表达后，缀合物13a的Fc的C端赖氨酸及N端鼠科动物IgG信号序列被蛋白水解切割，导致Fc具有缺少Lys447(例如，缺少C端赖氨酸残基)及N端鼠科动物IgG信号序列的序列。C端赖氨酸的存在与否不会改变Fc或对应缀合物的特性。
实施例63.合成缀合物13b、缀合物13c、缀合物13d、缀合物13e、缀合物13f及缀合物13g
用于缀合物13b、缀合物13c、缀合物13d、缀合物13e、缀合物13f及缀合物13g的PEG4-叠氮基Fc类似于缀合物13a的PEG4-叠氮基Fc经制备(实施例61)，如下表中所述调节PEG4-叠氮基NHS酯的当量数。缀合物13b、缀合物13c、缀合物13d、缀合物13e、缀合物13f及缀合物13g类似于实施例62中的缀合物13a经制备，其中靶向部分(Int-18)的当量数基于所需的DAR值(表26)经调节，且所用的点击试剂溶液的体积与实施例62的程序中所采用的相同。DAR值、分子量及产率列于下表中。产物缀合物相继通过在蛋白A柱上的亲和力色谱法、如实施例8所述的尺寸排阻色谱法经纯化。缀合物13a-13g的非还原SDS-PAGE提供于图55中。
表26：缀合物13a-13g的产率
Figure BDA0003630331990005581
实施例64.缀合物6的体外稳定性
为了证明缀合物6的体外稳定性，使用小鼠及人新鲜经K2EDTA处理的血浆及肝微粒体两者。体外小鼠及人血浆稳定性通过MALDI-TOF质谱检测来比较在37℃下在血浆中24h培育之后的药物:抗体比率(DAR)包膜经测定。也在37℃下在培育24h之后用MALDI-TOF质谱检测来执行使用小鼠及人微粒体的肝微粒体稳定性。这是为了鉴别Fc蛋白、接头或靶标部分上的潜在代谢不稳定位点。
64.1血浆稳定性样品制备
首先，60μL 3mg/ml的缀合物6与120μL血浆混合。各血浆类型等分至2个管中。来自各血浆类型的一个等分试样立即经冷冻。剩余等分试样置于水浴(37℃)中持续24小时。
Figure BDA0003630331990005591
蛋白A珠粒(Promega)通过轻柔涡旋所述珠粒至悬浮液中经平衡。针对两种血浆类型一式两份，50μL珠粒浆液添加至1.5mL微离心管中且置于磁性台架上持续10秒。10秒之后，移出且弃去所述储存缓冲液。500μL结合/洗涤缓冲液(0.1％BSA于1X PBS pH 7.4中)添加至含有所述珠粒的1.5mL微离心管中。所述珠粒经混合(涡旋)且置于磁性台架上持续10秒。10秒之后，移出且弃去所述结合/洗涤缓冲液。50μL缓冲液(1x PBS，pH 7.4)添加至含有所述珠粒的微离心管中。50μL血浆混合物添加至所述珠粒中且轻柔涡旋以混合。使用管式振荡器，使所述样品在室温下混合持续60分钟，确保所述珠粒保持呈悬浮状态。在混合之后，所述管置于磁性台架上持续10秒且移除上清液。添加500μL缓冲液(1x PBS，pH 7.4)且轻柔涡旋以混合。在混合之后，所述管置于磁性台架上持续10秒，随后移出且弃去洗涤缓冲液。重复所述洗涤步骤，共计2次洗涤。在用500μL缓冲液(1x PBS，pH 7.4)进行2次洗涤之后，分别用500μL、200μL及100μL水执行3次洗涤。适当体积的水添加至所述管中且轻柔涡旋以充分混合，且接着置于磁性台架上持续10秒，随后移出且弃去水。在用水进行第三次洗涤之后，30μL洗脱缓冲液(90:10:0.4水:乙腈:TFA)添加至所述珠粒中。使用管式振荡器，使所述洗脱缓冲液及样品在室温下混合持续30分钟。在混合之后，所述管置于磁性台架上持续10秒，移出且保留含有所述样品的洗脱缓冲液。2μL样品与2μL MALDI基质(20mg/mL芥子酸于70:30:0.1水:乙腈:TFA中)混合且滴于使用双层技术的MALDI靶标板上。接着通过MALDI-TOF质谱法分析所述样品。
64.2肝微粒体样品制备
用500mM Tris-HCl(pH 7.5)及50mM氯化镁六水合物制备10x缓冲液。ACV-006在1xPBS(pH 7.4)中经稀释至50μM。解冻且涡旋肝微粒体。各物种的肝微粒体(人和小鼠)的等分试样在70℃下经热灭活持续15分钟，以用作对照。根据表27制备用于两个物种的反应混合物。管在水浴(37℃)中经培育持续24小时。萃取样品以使用
Figure BDA0003630331990005602
蛋白A珠粒(Promega)根据来自59.1的方案进行分析。
表27：0.5mg/mL最终微粒体浓度，使用5μM缀合物6
热灭活的 活的
总计 400μL 400μL
水 286μL 286μL
10x缓冲液 40μL 40μL
微粒体(20mg/mL) 10μL 10μL
化合物(50μM) 40μL 40μL
NADPH再生溶液A 20μL 20μL
NADPH再生溶液B 4μL 4μL
64.3样品及数据分析
使用Bruker Compass Flex Control 3.4版采集样品以获得全扫描MALDI-TOF质谱(表28)。BSA用作针对采集质量范围的内部校准物。进一步用Bruker Compass FlexAnalysis 3.4版软件分析数据。另外，比较对照的DAR模式与测试样品的DAR模式。
表28：质谱仪(MS)参数
Figure BDA0003630331990005601
Figure BDA0003630331990005611
64.4结果
在小鼠及人新鲜经K2EDTA处理的血浆及肝微粒体两者中测试测试化合物缀合物6(图43)的体外稳定性。
缀合物6以1mg/mL的最终浓度经掺加至新鲜K2EDTA小鼠及人血浆中。血浆分成2个等分试样，一个立即经冷冻，且另一个在37℃水浴下经培育持续24小时。在培育结束时，通过
Figure BDA0003630331990005612
蛋白A磁性珠粒自血浆基质萃取样品。在血浆培育之后，通过MALDI-TOF质谱法分析样品的DAR改变。在小鼠(图44)或人(图45)血浆培育中未发现缀合物6产生任何DAR改变。
在50mM pH 7.5Tris-HCl缓冲溶液中以5μM的最终浓度测试缀合物6肝微粒体稳定性，所述缓冲溶液含有最终浓度为0.5mg/mL的活性或经热灭活肝微粒体及最终浓度为5mM的MgCl2。所有样品均在37℃恒定温度下经培育，且在培育期间使用磷酸烟碱酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)再生溶液来提供连续辅因子可用性。进行培育持续24小时。在培育结束时，通过蛋白A磁性珠粒自微粒体基质萃取样品。在肝微粒体培育之后，通过MALDI-TOF质谱法分析样品的DAR改变。在小鼠(图46)或人(图47)肝微粒体培育中未发现缀合物6产生任何DAR改变。
在37℃下培育持续24h之后的体外血浆稳定性表明，小鼠或人中缺乏缀合物6Fc、接头或靶向部分的降解。同样，在小鼠及人肝微粒体两者中培育之后观察到缺乏降解，表明代谢物不存在。这些体外稳定性研究的结果支持存在如下稳定化合物，其具有可能具有生物易感性的降解剂。
实施例65.缀合物13在致死性小鼠模型中在不同药物:抗体比率(DAR)下针对流感A(H1N1)的功效
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8周)中针对致死性IAVH1N1流感感染评估缀合物13。攻击病毒(A/Puerto Rico/8/1934)是能够在小鼠中引起致死性感染的小鼠适应性分离株。所述实验包含13组，每组5只小鼠。在第0天，所有小鼠均在经氯胺酮/甲苯噻嗪的混合物(分别为150及10mg/kg)麻醉之后通过鼻内接种经30μl体积的病毒(3x LD95)攻击。
第1-13组在测试物件或媒介物(PBS)的病毒攻击之后2小时接受单一IV治疗。所述研究评估了对应于缀合物13a、缀合物13c、缀合物13d及缀合物13g(DAR分别为1.7、3.8、5.8及10.3)的4种不同DAR的缀合物13构建体。缀合物13a、缀合物13c、缀合物13d及缀合物13g的合成描述于实施例61-实施例63中。各构建体在0.03、0.1及0.3mg/kg下经评估。针对各缀合物的一般研究设计概述于表29中。
表29：DAR扫描的一般研究设计
Figure BDA0003630331990005631
所有构建体在0.3mg/kg下均为完全保护性的，相比的下，构建体在0.03mg/kg下均不具活性(针对所有组，0％生存)，指示所述低剂量低于阈值有效剂量。然而，接受0.1mg/kg的缀合物的组可能有区别(表30)。在此剂量水平下，DAR为1.7、3.8及5.8的缀合物比经单独媒介物治疗的小鼠显著更具保护性(p＝0.0027)。然而，高DAR构建体(10.3)未比经单独媒介物治疗的小鼠显著更具保护性(p＝0.091)。使高DAR构建体丧失活性的潜在机制目前尚未可知，但可能由数种因素引起，包括抗体再循环的干扰，导致较短半衰期。
表30：DAR范围研究(0.1mg/kg剂量组)
Figure BDA0003630331990005632
Figure BDA0003630331990005641
实施例66.缀合物6及缀合物12的体内功效
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8周)中针对致死性IAVH1N1流感感染评估缀合物6及缀合物12(模拟N297A处的Fc突变)。攻击病毒(A/PuertoRico/8/34)是小鼠适应性分离株。所述实验包含每组5只小鼠。小鼠经氯胺酮/甲苯噻嗪(150/10mg/kg)麻醉且通过鼻内接种经30μL体积的流感病毒(3-5x LD95)攻击。在感染后2h通过IV施用单一1个剂量的治疗。PBS作为阴性对照给予。在攻击之后监测所有小鼠的％体重损失(图48)及生存(图49)，持续15天。
实施例67.缀合物6及缀合物12的体外Fcγ受体IIIA结合
通过ELISA针对FcyRIIIA评估缀合物6及缀合物12(模拟N297A处的Fc突变)的结合。板经1μg/mL的重组人FcγRIIIA包被过夜。次日，板用1％BSA溶液封闭持续1h。缀合物以介于0.01-1000nM范围内的剂量反应添加至板中且培育持续2h。通过用过氧化酶缀合的抗人Fc培育持续1h且后续用TMB底物试剂培育持续10-15min来检测结合。
通过读取450nm下的吸光度来测定结合(图50及图51)。
实施例68.体内缀合物6血浆样品分析
通过神经氨酸酶捕获检测ELISA来定量血浆样品中的缀合物6。简单来说，分子经捕获于神经氨酸酶包被的板上且接着使用HRP缀合的抗人IgG-Fc抗体进行检测。在GraphPad Prism中使用缀合物6标准曲线的4PL非线性回归计算蛋白质浓度。更详细方法描述提供于下文中。
Nunc Maxisorp 96-孔板(目录号12-565-136,ThermoFisher)经1X KPL包被缓冲液(5150-0041,SeraCare)中来自A/California/04/2009(H1N1)(11058-VNAHC,SinoBiological)的0.1U/孔的神经氨酸酶包被。板在室温下在轨道板式振荡器上(500rpm)经培育持续1h。血浆样品的连续稀释液经铺板且在室温下培育持续2小时(样品稀释剂：PBS中的0.5％BSA 0.025％Tween 20+初试食蟹猕猴血浆最终浓度1:2,500)。在各板上一式两份进行介于0.230至500ng/mL范围内的缀合物6标准曲线。在2h培育之后，板在具有0.05％Tween20的300μL PBS中洗涤5次。结合于板上的神经氨酸酶的缀合物接着在室温下用1:1,000稀释于样品稀释剂中的HRP缀合的抗人IgG Fc F(ab’)2(709-036-098,Jackson)探测持续1h。板接着在具有0.05％Tween 20的300μL PBS中洗涤8次且用TMB底物显影持续7-8分钟。所述反应用1N H2SO4停止。在450nm下读取吸光度。使用GraphPad Prism Version 6，根据标准曲线的非线性回归分析(S型，4PL分析)内推血浆样品中的缀合物6。
接着使用所得平均血浆浓度，使用Phoenix WinNonlin 7.0通过非房室分析来计算药代动力学参数。
毒代动力学(TK)、第2组(IV，5mg/kg)及第3组(IV，20mg/kg)
在施用之后第1天(表31)及第8天(表32)，浓度在相同剂量组内的雄性与雌性动物之间可相当。平均血浆暴露看来在这两天内大约与剂量成比例地增加。在第2剂量施用之后，在不同剂量组中注意到约30％的轻微积聚。不同剂量组中第1天及第8天平均血浆浓度的曲线显示于图52中。
表31：毒代动力学第1天
Figure BDA0003630331990005651
Figure BDA0003630331990005661
表32：毒代动力学第8天
Figure BDA0003630331990005662
药代动力学(PK)、第4组(IV，10mg/kg)及第5组(SC，10mg/kg)
在IV施用之后，雄性及雌性动物的血浆浓度可相当。在IV施用之后观察到极低清除，导致长的终末半衰期(表33A及表33B)。
表33A：雄性及雌性动物的血浆浓度
Figure BDA0003630331990005671
表33B：雄性及雌性动物的PK参数
Figure BDA0003630331990005672
在SC施用之后，在给药之后72小时达到实现最大浓度的时间，但浓度在给药后672小时内可测量(表34A及表34B)。SC给药之后的生物可用性高达大约139％。在10mg/kg IV与SC施用之间随时间的血浆浓度的比较显示于图53中。
表34A：雄性及雌性动物的血浆浓度
Figure BDA0003630331990005673
表34B：雄性及雌性动物的PK参数
Figure BDA0003630331990005674
Figure BDA0003630331990005681
实施例69.缀合物6在致死性小鼠模型中针对流感A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)的功效
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8周)中针对致死性IAVH1N1流感感染评估缀合物6。攻击病毒(A/Puerto Rico/8/1934)是能够在小鼠中引起致死性感染的小鼠适应性分离株。所述实验包含7组，每组5只小鼠。在第0天，所有小鼠均在经氯胺酮/甲苯噻嗪的混合物(分别为150及10mg/kg)麻醉之后通过鼻内接种经30μl体积的病毒(3x LD95)攻击。每天记录死亡率及体重且具有20％体重损失的任何动物均评分为死亡。
测试组在病毒攻击之后2小时接受缀合物6、hIgG1 Fc对照或媒介物(PBS)的单一IV治疗。接受奥司他韦的动物经口给药，每天两次，持续5天，在病毒攻击之后2小时开始。研究设计概述于表35中。
表35：针对流感A/PR/8/34(h1N1)研究的研究设计
Figure BDA0003630331990005682
如所预期，接受媒介物或单独hIgG1 Fc的小鼠截至第6天死于感染。同样，经低剂量(5mg/kg；bid，持续5天)的奥司他韦治疗的小鼠截至第8天达到死亡(表36)。然而，以相同给药时程接受20mg/kg的奥司他韦的小鼠完全经保护(p＝0.0027)。与使用奥司他韦所见形成对比，经缀合物6治疗的小鼠在来自单一IV剂量的所有剂量水平(10、2及0.4mg/kg)下均完全经保护(p＝0.0027)。
表36：针对流感A/PR/8/34(H1N1)的生存研究(第14天)
Figure BDA0003630331990005691
缀合物6的效能进一步通过每天体重测量值支持。如所预期，经媒介物或hIgG1 Fc治疗的小鼠证明体重平稳下降，直至体重下降超过20％，此时小鼠经评分为死亡(表37)。经5mg/kg的奥司他韦治疗的组也呈现一致的重量损失，直至第8天达到死亡。经高剂量(20mg/kg)的奥司他韦治疗的小鼠显示平稳但降低的体重损失，其在第8天达到14％，接着恢复。
与经对照及奥司他韦治疗的小鼠形成对比，接受缀合物6的那些组在所述研究中维持健康体重，即使在最低剂量浓度(0.4mg/kg)下(表37)。在2mg/kg剂量组中，经缀合物6治疗的小鼠中的最大短暂重量损失在第14天仅为2％。生存及体重测量值两者均证明在低达0.4mg/kg的单一IV剂量下缀合物6的稳固保护以抵御流感A/Puerto Rico/8/1934。
表37：小鼠体重数据(相对于第0天的％BW)。5只小鼠的平均值；*一旦组内出现首例动物达到死亡，数据即不包括在内
Figure BDA0003630331990005692
Figure BDA0003630331990005701
实施例70.合成缀合物14
类似于缀合物13a(实施例62)使用PEG-叠氮基-Fc(SEQ ID NO:35)及Int-7(实施例19)制备标题缀合物。经纯化最终产物的Maldi TOF分析给出56,502.Da的平均质量(DAR＝2.1)。产量43.4mg，产率43.4％。
实施例71.合成缀合物15
类似于实施例62(缀合物13a)通过PEG4-叠氮基-Fc(SEQ ID NO:35，实施例61)及Int-12(实施例46)制备此缀合物。经纯化最终产物的Maldi TOF分析给出56,528.Da的平均质量(DAR＝2.2)。产量40.0mg，产率40.0％。
实施例72.合成缀合物16
类似于实施例62(缀合物13a)通过PEG4-叠氮基-Fc(SEQ ID NO:35，实施例61)及Int-10(实施例31)制备此缀合物。经纯化最终产物的Maldi TOF分析给出56,507.Da的平均质量(DAR＝2.1)。产量41.7mg，产率42％。
实施例73.合成Int-19
Figure BDA0003630331990005711
步骤a.
Figure BDA0003630331990005712
向[2-(2-溴乙氧基)乙基]氨基甲酸叔丁酯(1.8g，6.6mmol)及炔丙基-PEG4胺(0.7g，3.0mmol)于30ml DMF中的溶液中添加碳酸钾(1.2g，9mmol)。所述反应在80℃下搅拌持续6h，且接着分配于DCM(200mL)与盐水(50mL)之间。分离有机层且用盐水洗涤，且经无水硫酸钠干燥。在过滤时，所得滤液经浓缩且通过反相液体色谱法(RPLC)使用以10％至100％乙腈及水洗脱的Isco
Figure BDA0003630331990005714
液体色谱仪使用0.1％TFA作为修饰剂经纯化。产物的产量1.0g，产率65％。通过LCMS发现的离子：M/2+H＝606.4。
步骤b.
Figure BDA0003630331990005713
前一步骤的产物(1.0g，1.6mmol)在室温下用TFA(10mL)处理持续0.5小时，接着浓缩至干且无需进一步纯化即用于下一步骤。此步骤的产率为定量的。通过LCMS发现的离子：M/2+H＝406.3。
步骤c.
Figure BDA0003630331990005721
前一步骤的产物(120mg，0.17mmol)用醚扎那米韦酸(230mg，0.38mmol，实施例31)于10ml DMF中的溶液处理。向此溶液中添加EDC(100mg，0.5mmol)、HOBt(65mg，0.5mmol)及DIEA(0.14ml，1mmol)。所得溶液在室温下经搅拌过夜，接着通过反相液体色谱法(RPLC)使用以10％至100％乙腈及水洗脱的Isco
Figure BDA0003630331990005722
液体色谱仪不使用TFA作为修饰剂经纯化。产物的产量180mg，产率60.2％。通过LCMS发现的离子：M/2+H＝816.9。
步骤d.
Figure BDA0003630331990005731
前一步骤的产物(180mg，0.11mmol)在室温下用三氟乙酸(2mL)处理持续30min。所得溶液经浓缩，且溶解于水(2mL)中，接着用氢氧化锂(24mg，1mmol)溶解于H2O(1mL)中的溶液处理。所得反应经搅拌10min，接着用0.1ml乙酸淬灭。所述溶液经浓缩且通过反相液体色谱法(RPLC)使用以0％至50％乙腈及水洗脱的Isco
Figure BDA0003630331990005732
液体色谱仪使用0.1％TFA作为修饰剂经纯化。产物的产量140mg，产率52％。通过LCMS发现的离子：M/2+H＝575.8,M/3+H＝384.2。
实施例74.合成缀合物17
类似于实施例62(缀合物13a)通过PEG4-叠氮基-Fc(SEQ ID NO:35，实施例61)及Int-19(实施例73)制备此缀合物。经纯化最终产物的Maldi TOF分析给出56,672.Da的平均质量(DAR＝2.2)。产量36.7mg，产率36.7％。
实施例75.合成Int-20
Figure BDA0003630331990005741
步骤a.
Figure BDA0003630331990005742
向亚氨基二乙酸二乙酯(3.1g，16.06mmol)于无水DMF(36mL)中的溶液中添加苯甲基溴(2.38mL，19.64mmol)及碳酸钾(6.44g，46.46mmol)。所得混合物在70℃下加热持续16小时。在冷却至室温之后，所述反应混合物用水稀释且用叔丁基甲醚(3×100mL)萃取。有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥且过滤，接着浓缩。残余物通过正相硅胶色谱法(Isco，0至10％乙酸乙酯及己烷)经纯化。产量3.13g，产率69.8％。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝280.2。
步骤b.
Figure BDA0003630331990005751
步骤-a的二乙酯(3.2g，11.2mmol)于无水THF(5mL)中的溶液在0℃下在氮气下缓慢地添加至含有THF(2mL)中的LiALH4(425mg，14.2mmol)的圆底烧瓶中。注射器用THF(2x5mL)冲洗。所得混合物缓慢地加温至室温过夜。缓慢地添加甲醇(2mL)以淬灭所述反应，随后添加NaOH水溶液(1mL)。所得混合物经搅拌持续1小时，接着在真空下过滤。滤液经浓缩且无需纯化即用于下一步骤。产量2.4g，产率109％。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝196.2。
步骤c.
Figure BDA0003630331990005752
无水THF(4mL)中的前一步骤的产物(1.02g，5.24mmol)在0℃下在氮气下缓慢地添加至含有NaH(60％纯度，2.09g，52.4mmol)及THF(5mL)的烧瓶中。所得混合物经搅拌持续1小时，随后逐滴添加THF(20mL)中的3-(Boc-氨基)丙基溴(3.8g，15.7mmol)。所述反应混合物缓慢地加温至室温且搅拌持续3天。所述反应冷却至0℃，接着用水(6mL)淬灭且搅拌持续1小时。其用乙酸乙酯(2×100mL)萃取。经组合的有机层用1N HCl水溶液及盐水洗涤。其经Na2SO4干燥，过滤且浓缩。残余物通过正相色谱法(Isco，0至5％甲醇及二氯甲烷)经纯化。产量984mg，产率37％。通过LCMS发现的离子，[M+H]+＝510.0。
步骤d.
Figure BDA0003630331990005761
氢氧化钯(543mg，0.77mmol)在H2气氛下添加至含有无水甲醇(19.5mL)中的步骤-c产物(985.3mg，1.93mmol)的烧瓶中。所得混合物在室温下搅拌持续16小时。其接着经由硅藻土垫过滤且用甲醇洗涤，且浓缩。残余物无需纯化继续用于下一步骤。产量828.6mg，产率102％。通过LCMS发现的离子，[M+H]+＝420.0。
步骤e.
Figure BDA0003630331990005762
H2O:THF(1:1，16mL)中的步骤-d产物(829mg，1.97mmol)冷却至0℃。向此溶液中相继添加Na2CO3(314mg，2.96mmol)、Fmoc N-羟基丁二酰亚胺酯(826mg，2.37mmol)。所得混合物加温至室温且搅拌直至通过LCMS显示完成，接着用乙酸乙酯萃取。有机层用盐水洗涤且经Na2SO4干燥，过滤且浓缩。残余物通过正相色谱法(Isco，0至60％乙酸乙酯及己烷)经纯化。产量784mg，产率62％。通过LCMS发现的离子，[M+H-Boc]+＝542.0。
步骤f.
Figure BDA0003630331990005763
步骤-e产物(1.01g，1.57mmol)在室温下在TFA(5mL)及CH2Cl2(9mL)中经搅拌持续1小时，接着在减压下浓缩。残余物通过RPLP(Isco，5至100％甲醇及水，不使用修饰剂)经纯化。产量903mg，产率86％。通过LCMS发现的离子，[M+H]+＝442.2。
步骤g.
Figure BDA0003630331990005771
向醚扎那米韦酸(340mg，0.49mmol)、步骤-f产物(111mg，0.25mmol，实施例31)及HATU(206mg，0.53mmol)于无水DMF(3mL)中的混合物中添加DIEA(162mg，1.23mmol)。所得混合物在室温下经搅拌持续1小时，接着直接地通过RPLC(Isco，30至100％甲醇及水，不使用修饰剂)经纯化。产量249mg，产率61％。通过LCMS发现的离子，[(M+2H)/2]+＝833.8。
步骤h.
Figure BDA0003630331990005772
向步骤-g产物(249mg，0.15mmol)于无水DMF(0.5mL)中的溶液中添加SilaMetSThiol(1.2g，1.47mmol)及1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一-7-烯(12mg，0.07mmol)。所得混合物经搅拌持续1.5小时，接着直接地经过滤至含有HATU(69mg，0.18mmol)、炔丙基PEG-4酸(43mg，0.16mmol)及DIEA(43mg，0.33mmol)的小瓶中。所述反应混合物经搅拌持续1小时，接着直接地通过RPLC(Isco，30至100％甲醇及水，不使用修饰剂)经纯化。产量298mg，产率118％。通过LCMS发现的离子，[(M+2H-Boc)/2]+＝843.9。
步骤i.
Figure BDA0003630331990005781
步骤-h产物(298mg，0.18mmol)溶解于TFA(3mL)及CH2Cl2(3mL)中，且所述溶液在室温下经搅拌持续16小时。其接着在减压下浓缩且通过HPLC(ACCQ Isco，0至25％乙腈及水，使用0.1％TFA作为修饰剂)经纯化。产量112mg，产率44％。通过LCMS发现的离子，[(M+2H)/2]+＝643.8及[(M+3H)/3]+＝429.6。
步骤j.
Figure BDA0003630331990005782
向步骤-i产物(112mg，0.072mmol)于MeOH(4mL)及水(2mL)中的溶液中添加LiOH(10.6mg，0.43mmol)。所得溶液在室温下经搅拌持续1小时，接着用TFA酸化且在减压下浓缩。残余物通过HPLC(ACCQ Isco，0至25％乙腈及水，使用0.1％TFA作为修饰剂)经纯化。产量37mg，产率36％。通过LCMS发现的离子，[(M+2H)/2]+＝603.8,[(M+3H)/3]+＝402.9。
实施例76.合成缀合物18
经叠氮基官能化的无糖基化Fc的溶液(100mg，5.4mL，1.87μmol，SEQ ID NO:35)添加至含有炔衍生的小分子(16.1mg，0.011mmol，Int-20)的15mL离心管中。在轻柔地振荡以溶解所有固体之后，所述混合物添加至3mL L-抗坏血酸钠(149mg，0.75mmol，0.25M)、硫酸铜(II)(2.4mg，0.015mmol，0.005M)及BTTAA(25.8mg，0.6mmol，0.02M)于PBS 7.4缓冲液中的预混合溶液中。所得溶液轻柔地振荡过夜。其相继通过在蛋白A柱上的亲和力色谱法、尺寸排阻色谱法(参见实施例10中的一般缀合物纯化方案)经纯化。经纯化最终产物的MaldiTOF分析给出56826Da的平均质量(DAR 2.2)。产量36.64mg，产率37％。
编码缀合物18的Fc的核酸构建体包含编码SEQ ID NO:35的氨基酸序列的核酸，所述Fc包含C端赖氨酸残基及N端鼠科动物IgG信号序列。在表达后，缀合物18的Fc的C端赖氨酸及N端鼠科动物IgG信号序列被蛋白水解切割，导致Fc具有缺少Lys447(例如，缺少C端赖氨酸残基)及N端鼠科动物IgG信号序列的序列。C端赖氨酸的存在与否不会改变Fc或对应缀合物的特性。
实施例77.合成Int-21
Figure BDA0003630331990005801
步骤a.
Figure BDA0003630331990005802
向2-(2-Boc-氨基乙氧基)乙醇(6.15g，30mmol)于无水DCM(60ml)中的溶液中添加DIPEA(7.8g，60mmol)及DMAP(366.6mg，3mmol)。接着经30分钟分成数份添加对甲苯磺酰氯(6.86g，36mmol)。在所得混合物经搅拌持续3天之后，其通过旋转蒸发经浓缩且通过RPLC(20％至70％乙腈/水，不使用修饰剂)经纯化。产量3.71g，产率34.4％。通过LCMS发现的离子：[M-Boc+H]+＝260。
步骤b.
Figure BDA0003630331990005811
向步骤-a产物(2.1g，5.83mmol)于无水THF(10ml)中的溶液中添加碳酸钠(1.24g，11.7mmol)及单-N-Boc-1,4-二氨基丁烷(1.32g，7mmol)。所得混合物在60℃下加热持续1天。接着滤出盐，且滤液通过旋转蒸发经浓缩。残余物经由RPLC(100g，5至50％乙腈及水，使用0.1％TFA作为修饰剂)经纯化。产量1.94g，产率88.6％。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝376.0。
步骤c.
Figure BDA0003630331990005812
向炔丙基PEG-4酸(781mg，3mmol)及HATU(1.14g，3mmol)于无水DMF(3ml)中的溶液中添加DIPEA(390mg，3mmol)，随后添加步骤-b产物(940mg，2.5mmol)及DIPEA(390mg，3mmol)于无水DMF(3ml)中的溶液。所述反应混合物经搅拌持续30分钟，接着直接地经由RPLC(100g，5至80％乙腈及水，使用0.1％TFA作为修饰剂)经纯化。产量960.2mg，产率65.3％。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝618.3,[M-Boc+H]+＝518.3。
步骤d.
Figure BDA0003630331990005813
步骤-c产物(960.2mg，1.63mmol)溶解于无水THF(6ml)中。添加二恶烷(4ml)中的4N HCl溶液，且所述反应混合物经搅拌过夜。其接着通过旋转蒸发经浓缩。残余物用水(3ml×3)及乙酸乙酯(10ml)萃取。经组合的水层经冻干。产量760mg，产率95.1％。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝418.0。
步骤e.
Figure BDA0003630331990005821
经20分钟分成数份向醚扎那米韦酸(315mg，0.5mmol)及HATU(190mg，0.5mmol)于无水DMF(1ml)中的混合物中添加步骤-d二胺产物(148mg，0.3mmol)及DIPEA(165mg，1.5mmol)于无水DMF(1ml)中的溶液。在添加之后，所述反应再搅拌持续30分钟且直接地通过RPLC(50g，30至90％乙腈及水，使用0.1％TFA作为修饰剂)经纯化。产量233mg，产率56.7％。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝821.3。
步骤f.
Figure BDA0003630331990005831
步骤-e产物(233mg，0.142mmol)溶解于TFA(1.5ml)中，且所述溶液在30℃下加热持续30分钟。其接着经浓缩且直接地通过RPLC(0％至30％乙腈及水，使用0.1％TFA作为修饰剂)经纯化。产量120mg，产率57.4％。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝621.4,[(M+3H)/3]+＝414.7。
步骤g.
Figure BDA0003630331990005832
向步骤-f产物(120mg，0.0816mmol)于MeOH(2ml)中的溶液中添加水(2ml)中的LiOH单水合物(63mg，1.5mmol)溶液。所得混合物经搅拌持续1.5小时且接着通过旋转蒸发经浓缩。残余物通过二恶烷(0.5ml)中的4NHCl溶液酸化且通过HPLC(0至15％乙腈及水，使用0.1％TFA作为修饰剂)经纯化。产量98.2mg，产率86.6％。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝581.8,[(M+3H)/3]+＝388.2。
实施例78.合成缀合物19
类似于实施例62(缀合物13a)通过PEG4-叠氮基-Fc(SEQ ID NO:35，实施例61)及Int-21(实施例78)制备此缀合物。经纯化最终产物的Maldi TOF分析给出56,548.Da的平均质量(DAR＝2.1)。产量39.7mg，产率39.7％。
实施例79.合成Int-22
Figure BDA0003630331990005841
步骤a.
Figure BDA0003630331990005842
向醚扎那米韦酸(1.8g，2.8mmol，实施例31)及炔丙基-PEG4-胺(0.82g，3.5mmol，1.2eq)于二氯甲烷(50mL)中的混合物中添加EDC(1.0g，5mmol)、HOBt(0.65g，5mmol)及DIEA(1.4ml，10mmol)。所得溶液在室温下经搅拌过夜，浓缩，且通过反相液体色谱法(RPLC)使用以10％至100％乙腈及水洗脱的Isco
Figure BDA0003630331990005843
液体色谱仪不使用0.1％TFA作为修饰剂经纯化。产物的产量1.35g，产率50.2％。通过LCMS发现的离子：M+H＝830.4。
步骤b.
Figure BDA0003630331990005851
前一步骤的产物(1.35g，1.6mmol)在室温下用三氟乙酸(20mL)处理持续30min。所得溶液经浓缩，溶解于水(10mL)及MeOH(10mL)中，接着用水(10mL)中的氢氧化锂(120mg，5mmol)溶液处理。所述反应经搅拌10min，接着用0.5ml乙酸淬灭。所述反应经浓缩且通过反相液体色谱法(RPLC)使用以0％至50％乙腈及水洗脱的Isco
Figure BDA0003630331990005852
液体色谱仪使用0.1％TFA作为修饰剂经纯化。产物的产量510mg，产率52.8％。通过LCMS发现的离子：M+H＝604.3。
实施例80.合成缀合物20
类似于实施例62(缀合物13a)通过PEG4-叠氮基-Fc(SEQ ID NO:35，实施例61)及Int-22(实施例79)制备此缀合物。经纯化最终产物的Maldi TOF分析给出55,508.Da的平均质量(DAR＝2.3)。产量37.0mg，产率37.0％。
实施例81.合成Int-23
Figure BDA0003630331990005861
步骤a.
Figure BDA0003630331990005862
向N-Boc-1,4-二氨基丁烷(941.5mg，5mmol)于无水THF(10ml)中的溶液中添加碳酸钠(1.06g，10mmol)及3-(Boc-氨基)丙基溴(1.43g，6mmol)。所得混合物在50℃下加热持续1天。接着滤出盐，且通过旋转蒸发经浓缩。残余物通过RPLC(100g，5至50％乙腈及水，使用0.1％TFA作为修饰剂)经纯化。产量1.35g，产率58.8％。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝346.0。
步骤b.
Figure BDA0003630331990005871
向炔丙基PEG-4酸(781mg，3mmol)及HATU(1.14g，3mmol)于无水DMF(3ml)中的溶液中添加DIPEA(390mg，3mmol)，随后添加步骤-a产物(863.8mg，2.5mmol)及DIPEA(390mg，3mmol)于无水DMF(3ml)中的溶液。所述反应混合物经搅拌持续30分钟，接着直接地通过RPLC(100g，5至80％乙腈及水，使用0.1％TFA作为修饰剂)经纯化。产量1.19g，产率81％。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝588.3。
步骤c.
Figure BDA0003630331990005872
步骤-b产物(1.19g，2.02mmol)溶解于无水THF(6ml)中。添加二恶烷(4.5ml)中的4N HCl溶液，且所述反应混合物经搅拌持续1天。其接着通过旋转蒸发经浓缩。残余物用水(3ml×3)及乙酸乙酯(15ml)萃取。经组合的水层经冻干。产量940mg，定量产率。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝388.3。
步骤d.
Figure BDA0003630331990005873
向醚扎那米韦酸(315mg，0.5mmol，实施例31)及HATU(209.1mg，0.55mmol)于无水DMF(1ml)中的混合物中添加DIPEA(65mg，0.5mmol)。5分钟之后，经20分钟分成数份添加步骤-c产物(170mg，0.439mmol)及DIPEA(130mg，1mmol)于无水DMF(1ml)中的溶液。所述反应再搅拌持续30分钟，接着直接地通过RPLC(50g，30至90％乙腈及水，使用0.1％TFA作为修饰剂)经纯化。产量208mg，产率51.6％。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝806.7。
步骤e.
Figure BDA0003630331990005881
步骤-d产物(208mg，0.129mmol)溶解于TFA(1.5ml)中，且所述溶液在30℃下加热持续30分钟。其接着直接地通过RPLC(100g，0至30％乙腈及水，使用0.1％TFA作为修饰剂)经纯化。产量134mg，产率72％。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝606.8,[(M+3H)/3]+＝405.0。
步骤f.
Figure BDA0003630331990005882
向步骤-e产物(134mg，0.093mmol)于MeOH(2ml)中的溶液中添加LiOH单水合物(63mg，1.5mmol)于水(2ml)中的溶液。所得混合物经搅拌持续1.5小时且接着通过旋转蒸发经浓缩。残余物通过二恶烷(0.5ml)中的4NHCl溶液酸化且通过HPLC(0至15％乙腈及水，使用0.1％TFA作为修饰剂)经纯化。产量78.4mg，产率62％。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝566.4,[(M+3H)/3]+＝378.4。
实施例82.合成缀合物21
类似于实施例62(缀合物13a)通过PEG4-叠氮基-Fc(SEQ ID NO:35，实施例61)及Int-23(实施例81)制备此缀合物。经纯化最终产物的Maldi TOF分析给出56,503.Da的平均质量(DAR＝2.2)。产量34.4mg，产率34％。
实施例83.在细胞病变效应(CPE)分析中缀合物13至21针对高致病性H7N9流感A及两种流感B分离株的活性
在CPE分析中以100、10、1及0.1nM的浓度运作总计9种缀合物(表38)且与利巴韦林(ribavirin)比较。所述CPE分析遵循标准方法，但简单来说，利用96-孔板中的MDCK细胞的80-100％汇合单层。一式三份向其中添加测试物件且使其在37℃(+5％CO2)下培育，直至CPE效应在视觉上显而易见。一旦注意到CPE，细胞层即用0.011％中性红染色持续大约2小时。其后，添加Sorensen柠檬酸盐缓冲液/乙醇的50:50混合物且使其培育持续30min，接着在分光光度计上读取A540且通过回归分析计算EC50/CC50值。
所有缀合物均针对流感B/Florida/4/2006分离株具有显著活性，其中EC50值介于3.05至33.5nm范围内(表39)。平均而言，缀合物证明了相比利巴韦林(EC503,250nM)的275倍效能优势。缀合物针对流感B/Brisbane/60/2008的活性极其类似于针对B/Florida所见，例外为缀合物14，其具有大于100nM的EC50
重要的是，所有缀合物也针对高致病性流感A/Anhui/1/2013(H7N9)分离株极具活性。与利巴韦林的14,000nM相比，所有缀合物针对此分离株的平均EC50为21.2nM(介于12至28.5nM范围内)。最后，在所测试的浓度下未检测到所述缀合物对MDCK单层的直接细胞毒性效应。
表38：缀合物及特性
缀合物 Int Fc结构域 DAR 接头 注意
13 18 SEQ ID NO:35 2.2 15个原子 醚，二聚体
14 7 SEQ ID NO:35 2.1 15个原子 氨基甲酸酯，二聚体
15 12 SEQ ID NO:35 2.2 15个原子 醚，二聚体
16 9 SEQ ID NO:35 2.1 17个原子 醚，二聚体
17 19 SEQ ID NO:35 2.2 17个原子 醚，二聚体
18 20 SEQ ID NO:35 2.2 19个原子 醚，二聚体
19 21 SEQ ID NO:35 2.1 16个原子 醚，二聚体
20 22 SEQ ID NO:35 2.3 na 醚，单体
21 23 SEQ ID NO:35 2.2 14个原子 醚，二聚体
表39：在CPE分析中缀合物针对流感亚型的活性
Figure BDA0003630331990005901
实施例84.合成缀合物22
步骤a.合成PEG4-叠氮基IVIG
制备DMF/PBS中的0.05M PEG4-叠氮基NHS酯溶液：6.05mg PEG4-叠氮基NHS酯在0℃下溶解于0.050mL DMF中且在0℃下通过添加0.250mL PBS 1x缓冲液经稀释至0.305mL。使用此溶液，通过调节此PEG4-叠氮基NHS酯PBS溶液的当量数来制备具有多种DAR值的其他PEG4-叠氮基IVIG。
制备PEG4-叠氮基IVIG：0.05M PEG4-叠氮基NHS酯PBS缓冲溶液(0.301mL，15.0μmol，5.5当量)添加至IVIG(Intravenous Immune Globulin,Baxter)溶液(407mg于9.25mLpH 7.4PBS中，MW约148863Da，1.968μmol)中且所述混合物在环境温度下轻柔地振荡持续12小时。所述溶液使用离心浓缩机(100,000MWCO)经浓缩至约1.5mL的体积。粗混合物1:10稀释于PBS pH 7.4中，且再次经浓缩。重复此洗涤程序，共计三次。用此洗涤程序移除小分子试剂。经浓缩IVIG-PEG4-叠氮化物用pH 7.4PBS 1x缓冲液稀释至9.25mL且准备用于点击缀合。经纯化材料使用NANODROPTM UV可见光光谱仪(使用基于IVIG的氨基酸序列计算的消光系数)经定量。产率是在纯化之后定量的。
步骤b.合成缀合物
制备点击试剂溶液：PBS缓冲溶液中的0.0050M CuSO4：10.0mg CuSO4溶解于12.53mL PBS x1中，接着采用6.00mL 0.0050M CuSO4溶液且添加57.7mg BTTAA(CAS编号1334179-85-9)及297.6mg抗坏血酸Na以生成点击试剂溶液(0.0050M CuSO4、0.020M BTTAA及0.25M抗坏血酸钠)。
经叠氮基官能化的IVIG(140mg，3.17mL，0.936μmol，IVIG-接头-1-叠氮化物)的溶液添加至含有炔衍生的小分子(8.4mg，0.00618mmol，6.6eq，描述于实施例60中)的15mL离心管中。在轻柔地振荡以溶解所有固体之后，1.50mL上述点击试剂溶液(L-抗坏血酸钠，0.25M，74.2mg，0.374mmol，硫酸铜(II)0.0050M，1.2mg，0.0075mmol及BTTAA 0.020M，12.9mg，0.0300mmol)。所得混合物轻柔地振荡过夜。其相继通过在蛋白A柱上的亲和力色谱法、尺寸排阻色谱法(参见实施例10中的缀合物纯化方案)经纯化。经纯化最终产物的MaldiTOF分析给出151873Da的平均质量(DAR＝2.7)。产量51.0mg，36％产率。
实施例85.合成缀合物23
类似于缀合物22，取代点击缀合步骤中的适当炔官能化的小分子(描述于实施例81中的Int-23)来制备缀合物23。
实施例86.合成缀合物24
类似于缀合物22，取代点击缀合步骤中的适当炔官能化的小分子(描述于实施例19中)来制备缀合物24。
实施例87.缀合物13、14及21在致死性小鼠模型中针对流感B的功效
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8周)中针对致死性流感B流感感染评估缀合物。攻击病毒(B/Malaysia/2506/04)是能够在小鼠中引起致死性感染的小鼠适应性分离株。所述实验包含11组，每组5只小鼠。在第0天，所有小鼠均在经氯胺酮/甲苯噻嗪的混合物(分别为150及10mg/kg)麻醉之后通过鼻内接种经30μl(大约每只小鼠1E4)体积的病毒(3x LD95)攻击。
所有组均在病毒攻击之后2小时接受测试物件、媒介物(PBS)或单独Fc对照(hIgG1Fc)的单一IV治疗。所述研究评估缀合于一致Fc单体的Int-18、Int-7及Int-23(分别为缀合物13、14及21)，在3.0、1.0及0.3mg/kg下进行测试。监测小鼠持续2周且超过20％体重损失或被发现垂死的动物经评分为死亡。
经媒介物或单独Fc对照治疗的所有小鼠截至第7天均达到死亡。相比的下，接受缀合物13、14及21的小鼠在接受0.3mg/kg的单一IV剂量之后完全经保护(表40)。如所预期，接受1.0或3.0mg/kg的缀合物的组也完全经保护。所有缀合物针对流感B的效能进一步通过每天体重测量值(表41)支持，所述每天体重测量值显示任何缀合物治疗的组在整个研究中少于5％的短暂下降。缀合物13、14及21的活性以剂量计可与缀合物6针对流感AH1N1及H3N2亚型的活性相当。由于缀合物6及14具有一致靶向部分(对应于Int-7)，单一缀合物可针对显性季节性流感类型(流感A(H1N1)、流感A(H3N2)及流感B)具活性。
表40.在研究结束时(第14天)的死亡率数据。5只小鼠的平均值；通过对数秩(Mantel-Cox)测试计算的p-值
Figure BDA0003630331990005931
表41：小鼠体重数据(相对于第0天的％BW)。5只小鼠的平均值；*一旦组内出现首例动物达到死亡，数据即不包括在内
Figure BDA0003630331990005932
Figure BDA0003630331990005941
实施例88.合成用于缀合物25、缀合物26、缀合物27及缀合物28的PEG4-叠氮基Fc
制备DMF/PBS x1中的0.05M PEG4-叠氮基NHS酯溶液27.40mg PEG4-叠氮基NHS酯在0℃下溶解于0.155mL DMF中且在0℃下通过添加1.200mL PBS 1x缓冲液经稀释。使用此溶液，通过调节此PEG4-叠氮基NHS酯PBS x1溶液的当量数来制备具有多种DAR值的其他PEG4-叠氮基Fc。
制备PEG4-叠氮基Fc(SEQ ID NO:48)：0.05M PEG4-叠氮基NHS酯PBS x1缓冲溶液(0.0984mL，4.92μmol，2.5当量)经添加至h-IgG1Fc(SEQ ID NO:48)溶液(234mg于13.605mLpH 7.4PBS中，MW约57,976Da，4.036μmol)中且所述混合物在环境温度下轻柔地振荡持续2小时。所述溶液使用离心浓缩机(30,000MWCO)经浓缩至约2mL的体积。粗混合物1:7稀释于PBS pH 7.4中，且再次经浓缩。重复此洗涤程序，共计三次。用此洗涤程序移除小分子试剂。经浓缩的Fc(SEQ ID NO:48)-PEG4-叠氮化物用pH 7.4PBS 1x缓冲液稀释至13.60mL且准备用于点击缀合。经纯化材料使用NANODROPTM UV可见光光谱仪(使用基于h-IgG1的氨基酸序列计算的消光系数)经定量。
PEG4-叠氮基Fc(SEQ ID NO:50)的制备类似于以上PEG4-叠氮基Fc(SEQ ID NO:48)。
实施例89.合成缀合物25
制备点击试剂溶液：PBS x1缓冲溶液中的0.0050M CuSO4：10.0mg CuSO4溶解于12.53mL PBS x1中，接着采用10.00mL此CuSO4溶液且添加86.1mg BTTAA及495.3mg抗坏血酸Na以生成点击试剂溶液(0.0050M CuSO4、0.020M BTTAA及0.25M抗坏血酸钠)。此点击试剂溶液将用于缀合物25及缀合物26。
叠氮基官能化Fc(78.0mg，4.535mL，1.35μmol，SEQ ID NO:48-PEG4-叠氮化物)溶液经添加至含有炔衍生的小分子(13.2mg，8.88μmol，Int-23)的15mL离心管中。在轻柔地振荡以溶解所有固体之后，向所述混合物中添加2.153mL上述点击试剂溶液(L-抗坏血酸钠，0.25M，106.6mg，0.538mmol，硫酸铜(II)0.0050M，1.72mg，0.0107mmol及BTTAA 0.020M，18.5mg，0.0431mmol)。所得混合物在环境温度下轻柔地振荡持续6小时。其相继通过在蛋白A柱上的亲和力色谱法、尺寸排阻色谱法(参见实施例10中的缀合物纯化方案)经纯化。经纯化最终产物的Maldi TOF分析给出60973Da的平均质量(DAR＝2.1)。产量50.3mg，64％产率。
编码缀合物25的Fc的核酸构建体包含编码SEQ ID NO:48的氨基酸序列的核酸，所述Fc包含C端赖氨酸残基及N端鼠科动物IgG信号序列。在表达后，缀合物25的Fc的C端赖氨酸及N端鼠科动物IgG信号序列被蛋白水解切割，导致Fc具有缺少Lys447(例如，缺少C端赖氨酸残基)及N端鼠科动物IgG信号序列的序列。C端赖氨酸的存在与否不会改变Fc或对应缀合物的特性。
实施例90.合成缀合物26
缀合物26的制备类似于缀合物25，通过使用相同批次的PEG4-叠氮基Fc(SEQ IDNO:48)及炔衍生的小分子(Int-7)。经纯化最终产物的Maldi TOF分析给出61068Da的平均质量(DAR＝2.2)。产量49.5mg，63％产率。
实施例91.合成缀合物27
制备点击试剂溶液：PBS x1缓冲溶液中的0.0050M CuSO4：10.0mg CuSO4溶解于12.53mL PBS x1中，接着采用12.00mL此CuSO4溶液且添加103.3mg BTTAA及594.3mg抗坏血酸Na以生成点击试剂溶液(0.0050M CuSO4、0.020M BTTAA及0.25M抗坏血酸钠)。此点击试剂溶液将用于缀合物28。
叠氮基官能化Fc(80.0mg，4.535mL，1.38μmol，SEQ ID NO:50-PEG4-叠氮化物)溶液经添加至含有炔衍生的小分子(13.5mg，9.10μmol，Int-23)的15mL离心管中。在轻柔地振荡以溶解所有固体之后，向所述混合物中添加2.21mL上述点击试剂溶液(L-抗坏血酸钠，0.25M，109.3mg，0.552mmol，硫酸铜(II)0.0050M，1.76mg，0.0110mmol及BTTAA 0.020M，19.0mg，0.0441mmol)。所得混合物在环境温度下轻柔地振荡持续6小时。其相继通过在蛋白A柱上的亲和力色谱法、尺寸排阻色谱法(参见实施例10中的缀合物纯化方案)经纯化。经纯化最终产物的Maldi TOF分析给出61447Da的平均质量(DAR＝2.5)。产量37.1mg，46％产率。
编码缀合物27的Fc的核酸构建体包含编码SEQ ID NO:50的氨基酸序列的核酸，所述Fc包含C端赖氨酸残基及N端鼠科动物IgG信号序列。在表达后，缀合物27的Fc的C端赖氨酸及N端鼠科动物IgG信号序列被蛋白水解切割，导致Fc具有缺少Lys447(例如，缺少C端赖氨酸残基)及N端鼠科动物IgG信号序列的序列。C端赖氨酸的存在与否不会改变Fc或对应缀合物的特性。
实施例92.合成缀合物28
缀合物28的制备类似于缀合物27，通过使用相同批次的PEG4-叠氮基Fc(SEQ IDNO:50)及炔衍生的小分子(Int-7)。经纯化最终产物的Maldi TOF分析给出61388Da的平均质量(DAR＝2.4)。产量44.6mg，56％产率。
实施例93.在细胞病变效应(CPE)分析中缀合物6及缀合物21针对高致病性流感A(H5N1、H7N9)的活性
针对BSL-3(高致病性)流感A进行体外分析以测定本发明缀合物的效能，且一般地遵循标准程序。简单来说，不同浓度的缀合物与病毒(大约250TCID50)混合且使其在35℃下培育持续一小时。在培育之后，所述混合物添加至MDCK细胞的80-90％汇合单层中。在90分钟培育之后，洗涤细胞且再应用缀合物。所述单层随后用羧甲基纤维素覆盖以使病毒扩散降至最低且使其培育持续两天。在两天培养之后，细胞用PBS洗涤且用10％福马林固定。在固定之后，所述MDCK单层用Triton X-100渗透且用针对流感核蛋白的小鼠mAb免疫染色。单层经读取，且计算每个孔的经染色面积以测定EC50/100值。
研究结果概述于表42中且证明了缀合物6及缀合物21针对具有大流行潜力的高致病性菌株的效能。重要的是，两种缀合物针对四种H5N1及一种H7N9分离株均产生为或低于15nM的EC100值。相比的下，奥司他韦仅针对一种分离株(A/Vietnam/1194/2004)具有大约15nM的EC100且针对其他高致病性菌株具有介于125至>1000nM范围内的值。这些结果表明，缀合物6及缀合物21治疗由强毒流感引起的大流行病的潜力优于奥司他韦的潜力。
表42：缀合物6及缀合物21针对高致病性流感分离株的体外活性
Figure BDA0003630331990005971
Figure BDA0003630331990005981
实施例94.在细胞病变效应(CPE)分析中缀合物6及缀合物21针对在不同感染复数(MOI)下的流感A(H1N1)的活性
MDCK细胞以4×104个细胞/孔接种于96孔板(经TC处理)中的MEM培养基中且在37℃、5％CO2下经培育持续18-24h。在1.93-10000nM之间剂量范围内的测试物件(扎那米韦、奥司他韦、巴洛沙韦、缀合物6及缀合物21)在室温(RT)下用病毒:细胞感染复数(MOI)在0.001-1之间的流感A/WSN/1933培育持续1h。1h之后，经预培育的病毒及测试物件添加至MDCK细胞的90-100％汇合单层中且在RT下经培育持续1h。
1h之后，补充有L-谷氨酰胺及青霉素/链霉素的MEM培养基添加至孔中。经感染细胞在37℃、5％CO2下经培育持续72h。在固定细胞且用结晶紫染色之后测定CPE。使用GraphpadPrism 6软件用非线性回归分析计算EC50。表43中提供的所述CPE分析的结果指示，缀合物6及缀合物21体外胜过护理标准剂，尤其在高MOI下。
表43：缀合物6及缀合物12针对在不同感染复数下的流感A(H1N1)的体外活性
Figure BDA0003630331990005982
实施例95.缀合物6在致死性严重复合型免疫缺陷小鼠模型中针对流感A(H1N1)的功效
在雄性BALB/c严重复合型免疫缺陷(SCID)小鼠(Stock#001803；JacksonLaboratories，6-8周龄)中针对致死性流感A感染评估缀合物。攻击病毒(A/Puerto Rico/08/1934)是能够在小鼠中引起致死性感染的小鼠适应性分离株。所述实验包含5组，每组5只小鼠。在第0天，所有小鼠均在经氯胺酮及甲苯噻嗪的混合物(分别为150及10mg/kg)麻醉之后通过鼻内接种经30μl(大约每只小鼠1E3)体积的病毒(3xLD95)攻击。所有组均在病毒攻击后2小时接受测试物件缀合物6、媒介物(PBS)或单独Fc对照(hIgG1 Fc)的单一IV治疗。所述研究评估缀合物6的3种不同剂量浓度(0.3、1.0或3.0mg/kg)。监测小鼠持续5周且超过20％体重损失或被发现垂死的动物经评分为死亡。也记录体重以监测所述动物的一般健康状况。
经媒介物或单独Fc对照治疗的所有小鼠截至第2周均达到死亡。相比的下，接受缀合物6的小鼠在接受1或3mg/kg的单一IV剂量之后在所述研究的持续时间内完全经保护(图56，表44)。当缀合物6的剂量降低至0.3mg/kg时，生存截至研究结束下降至20％。0.3mg/kg剂量完全经保护持续3周。缀合物6在此严重免疫缺陷模型中的效能进一步由体重数据支持(图57，表45)。接受1或3mg/kg剂量浓度的缀合物6的组在所述研究的整个过程中仅证明了少于3％的短暂体重损失。此外，在研究结束时，两个剂量组均显示净重量增加(分别为7.5及2.2％)。用最低浓度的缀合物6(0.3mg/kg)给药的组在所述研究之前3周内具有少于4％的短暂体重损失，接着在第4周显示感染病征，其最终导致五只动物中的四只死亡。
总之，这些数据通过用低至1mg/kg的缀合物的单一IV剂量保护经致死性攻击的小鼠证明了缀合物6的效能。另外，此保护作用是长期持续的，超过所述研究的5周持续时间。此在完全缺乏清除流感感染所必需的T及B免疫细胞的小鼠的极端免疫缺陷模型中实现。此数据支持使用缀合物6来治疗免疫胜任及缺乏患者群体两者。
表44：每周研究剂量组的死亡率
Figure BDA0003630331990006001
表45：研究动物在35天内或直至组内第一例死亡时的平均组体重
Figure BDA0003630331990006002
实施例96.缀合物6在肺中的剂量依赖性病毒清除
在鼻内经3×102PFU/小鼠(3x LD95)的小鼠适应性流感A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)攻击的6-8周雌性BALB/c小鼠(Charles River)中进行功效研究。缀合物6或人IgG1Fc对照在攻击后2h以0.1–3mg/kg的单一静脉内(IV)剂量经施用。奥司他韦经口给药，每天两次，持续4天，在感染后2h以5或15mg/kg开始。记录体重(BW)持续4天。在感染后4天，通过CO2处死小鼠且收集两片肺叶。肺使用MagNA Lyser(Roche)用1mLPBS中的1mm二氧化硅珠粒均质化。在6,000rpm下进行均质化持续60s且在运行之间在冰上冷冻持续5min。在肺均质化之后，管在600x g下经离心持续10min且上清液经转移至新管中。
为了测定肺中的病毒负荷(以斑块形成单元(PFU)量度)，将肺均质液的上清液稀释于感染缓冲液中，介于10-1至10-6范围内。100μL病毒稀释液添加至24孔板中的MDCK细胞的汇合单层中且在室温下经培育持续1h，其中每15min摇动。在移除病毒之后，含有Avicel的液体覆盖培养基添加至MDCK细胞中。细胞在37℃、5％CO2下经培育持续40h。在培育之后，移除所述培养基且细胞用结晶紫染色以对斑块计数。相对于肺重量计算PFU(PFU/g肺)。
所述研究的结果证明低剂量的缀合物6快速地降低病毒负荷数量级，优于奥司他韦
Figure BDA0003630331990006012
(图58，表46)。此观察结果具有临床显著性，因为严重流感感染是由病毒自初始上呼吸道感染移动至肺引起的。
表46：感染后第4天的病毒负荷
Figure BDA0003630331990006011
Figure BDA0003630331990006021
实施例97.缀合物6剂量依赖性减少肺中的炎性细胞因子
在鼻内经3×102PFU/小鼠(3x LD95)的小鼠适应性流感A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)攻击的6-8周雌性BALB/c小鼠(Charles River)中进行功效研究。缀合物6或人IgG1Fc对照在攻击后2h以0.1–3mg/kg的单一静脉内(IV)剂量经施用。奥司他韦经口给药，每天两次，持续4天，在感染后2h以5或15mg/kg开始。记录体重(BW)持续4天。在感染后4天，通过CO2处死小鼠且收集两片肺叶。肺使用MagNA Lyser(Roche)用1mLPBS中的1mm二氧化硅珠粒均质化。在6,000rpm下进行均质化持续60s且在运行之间在冰上冷冻持续5min。在肺均质化之后，管在600x g下经离心持续10min且上清液经转移至新管中。
关于细胞因子分析，肺均质液的上清液连续2倍稀释于96孔板中。INF-γ、TNF-α、IL-6、MIP-1α及MCP-1的细胞因子水平通过ELISA根据制造商的说明书(R&D Systems)测定。
严重流感的发病及死亡最终是由肺中由病毒诱导的促炎性细胞因子的流入引起的。使用Fc-缀合物治疗流感的一种潜在考虑是Fc片段是否将恶化细胞因子诱导的发炎。H1N1致死性感染模型的结果显示刚好相反：缀合物6剂量依赖性减少受感染肺组织中的促炎性细胞因子(例如，TNFα及IL-6)(图59，表47)。
表47：感染后第4天的细胞因子反应
Figure BDA0003630331990006022
Figure BDA0003630331990006031
实施例98.体内缀合物6血浆样品分析。CD-1及BALB/c严重复合型免疫缺陷小鼠中的PK比较。
通过神经氨酸酶捕获检测ELISA来定量血浆样品中的缀合物6。简单来说，分子经捕获于神经氨酸酶包被的板上且接着使用HRP缀合的抗人IgG-Fc抗体进行检测。在GraphPad Prism中使用缀合物6标准曲线的4PL非线性回归计算蛋白质浓度。更详细方法描述提供于下文中。
Nunc Maxisorp 96-孔板(目录号12-565-136,ThermoFisher)经1XKPL包被缓冲液(5150-0041,SeraCare)中来自A/California/04/2009(H1N1)(11058-VNAHC,SinoBiological)的0.1U/孔的神经氨酸酶包被。板在室温下在轨道板式振荡器上(500rpm)经培育持续1h。血浆样品的连续稀释液经铺板且在室温下培育持续2小时(样品稀释剂：PBS中的0.5％BSA 0.025％Tween 20+初试小鼠血浆最终浓度1:2,500)。在各板上一式两份进行介于0.230至500ng/mL范围内的缀合物6标准曲线。在2h培育之后，板在具有0.05％Tween 20的300μL PBS中洗涤5次。结合于板上的神经氨酸酶的缀合物接着在室温下用1:1,000稀释于样品稀释剂中的HRP缀合的抗人IgG Fc F(ab’)2(709-036-098,Jackson)探测持续1h。板接着在具有0.05％Tween 20的300μL PBS中洗涤8次且用TMB底物显影持续7-8分钟。所述反应用1N H2SO4停止。在450nm下读取吸光度。使用GraphPad Prism Version 6，根据标准曲线的非线性回归分析(S型，4PL分析)内推血浆样品中的缀合物6。
PK概况，CD-1对BALB/c SCID小鼠
缀合物6以5mg/kg经静脉内施用至SCID及CD-1(免疫胜任)小鼠，证明了相似PK概况(图60)。浓度在取样时间点处为可相当的。两相PK概况相继包含24小时分布相、狭窄消除相。缀合物6血浆水平在所述研究的一周过程中相对于Cmax水平保持较高(约10μg/ml)。
实施例99.合成炔丙基二胺中央接头
Figure BDA0003630331990006041
步骤a.
Figure BDA0003630331990006042
2-(2-Boc-氨基乙氧基)乙醇(16.0g，78.0mmol)及CBr4(31.0g，93.5mmol)于DCM(100mL)中的溶液在0℃下经15分钟用PPh3(24.5g，93.5mmol)缓慢地处理(放热)。在添加过程期间，内部温度保持在30℃以下。添加PPh3之后，所述反应在室温下经搅拌过夜。粗反应物经浓缩为油状物，接着通过正相色谱法用10％乙酸乙酯/己烷至80％乙酸乙酯/己烷洗脱经纯化。收集管内部含有油小液滴的洗脱份经组合且浓缩为无色油状物。产量18.1g，产率86％。
步骤b.
Figure BDA0003630331990006043
步骤-a产物(10g，37.3mmol)、苯甲胺(1.60g，14.9mmol)及K2CO3(6.19g，44.8mmol)于DMF(20mL)中的溶液在75℃油浴中加热持续8h。过滤所述混合物，浓缩且通过RPLC(5％ACN/水至100％ACN)经纯化。产量6.8g，产率95％。
步骤c.
Figure BDA0003630331990006051
向步骤-b产物(5.35g，8.98mmol)于CHCl3/EtOH(1:20，100mL)中的溶液中添加20％Pd(OH)2/C(1.26g，1/80mmol)。所述反应在环境温度下在氢气球下经搅拌过夜。所述反应混合物经由硅藻土垫过滤。移除溶剂且无需纯化继续用于后续步骤。
步骤d.
Figure BDA0003630331990006052
步骤-c产物再溶解于20mL DMF/二氯甲烷(1:5)中。向此游离胺溶液中添加炔丙基PEG4酸(2.36g，8.98mmol)、EDCI(2.57g，13.5mmol)、HOAt(1.83g，13.5mmol)及胡尼西氏碱(Hunig’s base)(3.13mL，18.0mmol)。所述反应混合物经搅拌持续四小时，接着浓缩且通过RPLC(10％ACN/水至60％ACN/水)经纯化。经两个步骤，产量4.00g，产率70％。通过LCMS发现的离子：[M–Boc+H]+＝534.2,[M+H]+＝634.2。
步骤e.
Figure BDA0003630331990006053
步骤-d产物(4.00g，6.31mmol)用二恶烷(30mL)中的4N HCl处理持续2小时。通过旋转蒸发移除过多HCl及二恶烷，且剩余物进一步在高真空下干燥以生成呈2HCl盐形式的Int-10。产量3.15g，产率99％。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝434.2。
实施例100.合成Int-7a(C7-C7异构体)
Figure BDA0003630331990006061
步骤a.
Figure BDA0003630331990006062
5-乙酰胺基-7,8,9-O-三乙酰基-2,6-脱水-4-叠氮基-3,4,5-三脱氧-D-甘油-D-半乳-壬-2-烯酸甲酯(30g，65.7mmol)溶解于甲醇(100mL)中且与Lindlar催化剂(15g)组合。所得混合物用氢气冲洗且搅拌持续5小时，每30分钟用氢气冲洗通过顶部空间的氢气。在如通过HPLC所测定完成反应之后，所述催化剂经由硅藻土过滤。滤液用于下一步骤。
来自前一步骤的粗胺(18.9g，43.8mmol)用甲醇(100mL)中的N,N’-双-boc-1-脒基吡唑(14.3g，46.0mmol)及DIEA(9.9ml，57.0mmol)处理。所得溶液在室温下经搅拌，直至所有起始材料均经消耗，如通过LCMS所测定(约30min)。所述溶液经浓缩为泡沫且在高真空下储存过夜，接着无需进一步纯化即用于下一步骤。
来自前一步骤的粗三-乙酸酯(43.8mmol)溶解于100ml无水甲醇中，接着在室温下用甲醇中的甲醇钠(1.9mL，甲醇中的25％溶液，8.76mmol)处理。通过LCMS监测反应的进展，其在10分钟之后完成。所述反应用1NHCl淬灭至pH为约7。所得溶液经浓缩且通过反相液体色谱法(RPLC)使用以10％至100％乙腈及水洗脱的Isco
Figure BDA0003630331990006072
液体色谱仪经纯化。无TFA修饰剂用于此纯化。产物的产量15.6g，产率65％。
步骤b.
Figure BDA0003630331990006071
步骤-a产物(5.47g，10mmol)及DMAP(1.222g，10mmol)的混合物溶解于无水THF(30ml)中。在冰水浴中冷却之后，所述溶液缓慢地用1,1’-羰基二咪唑(2.6g，16mmol)处理，接着在0℃下经搅拌持续30分钟，随后在60℃下加热持续2小时。其接着冷却至室温且用水(50ml)及EtOAc/己烷(1:1，100ml)萃取。有机层用水(50ml×3)洗涤，经Na2SO4干燥且通过旋转蒸发经浓缩。白色泡沫状产物进一步在高真空下干燥且无需进一步纯化继续用于后续步骤。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝573.2。
步骤c.
Figure BDA0003630331990006081
含有步骤-b产物的反应烧瓶用氮气真空冲洗且溶解于无水DCM(50ml)中，接着在冰水浴中冷却。经20分钟分成数份向所述经冷却溶液中相继添加DMAP(4.89g，40mmol)、氯甲酸4-硝基苯酯(6.05g，30mmol)。所述溶液在0℃下经搅拌，接着加温至室温持续1小时。LCMS显示起始材料1h，因此添加额外DMAP(1.22g，10mmol)及氯甲酸4-硝基苯酯(1g，5mmol)。继续所述反应持续4小时，接着用两个硅胶柱(220g，通过20％EtOAc及己烷预湿润)纯化且用20％至80％EtOAc及己烷洗脱。两个步骤的产量4.42g，产率59.9％。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝738.2。
步骤d.
Figure BDA0003630331990006082
经30分钟分成数份向步骤-c产物(3.2g，4.34mmol)于无水DCM(3ml)中的溶液中添加炔丙基二胺中央接头(1.26g，2.5mmol，描述于实施例99中)及DIPEA(1.68g，13mmol)于无水DMF(5ml)中的混合物。所述反应在室温下搅拌持续2小时。其接着经浓缩且通过RPLC(30％至90％乙腈及水，不使用TFA修饰剂)经纯化。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝815.8,[(M-Boc+2H)/2]+＝765.8,[(M-2Boc+2H)/2]+＝716。产量3.33g，产率94.2％。
步骤e.
Figure BDA0003630331990006091
步骤-d产物(3.33g，2.04mmol)溶解于DCM(5ml)及TFA(5ml)中，接着在35℃下经搅拌持续约6小时。由LCMS监测反应。当完成时，所述溶液经浓缩且通过RPLC(5至30％乙腈及水，不使用TFA)经纯化。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝615.8,[(M+3H)/3]+＝411。产量2.29g，产率91.3％。
步骤f.
Figure BDA0003630331990006092
步骤-e产物(61.5mg，0.05mmol)溶解于MeOH/水(1:1，0.6ml)中。在所述溶液经冷却至-6℃(盐/冰浴)之后，逐滴添加1.0M LiOH(0.3ml，0.3mmol)且所述反应经搅拌持续30分钟。其接着用二恶烷中的4NHCl溶液(75μl)淬灭至pH约7.0，且直接地通过制备型HPLC(Isco ACCQ制备型，Luna 5μm C18(2)
Figure BDA0003630331990006093
LC柱100mmx30mm；梯度：0％乙腈/水持续2min，接着0％至15％乙腈/水经12min，接着在15％乙腈下等度持续10min，使用0.1％TFA)经纯化。产量45mg，产率65.3％。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝575.8,[(M+3H)/3]+＝384.2。分析保留时间：6.013min。条件：Phenomemex Gemini HPLC柱，3μm WX-C18
Figure BDA0003630331990006103
100mm×3mm，经25分钟用5-95％乙腈及水梯度洗脱，使用0.1％TFA。
实施例101.合成Int-7b(C7-C9异构体)
Figure BDA0003630331990006101
类似于Int-7a(C7-C7异构体，实施例100)制备C7-C9异二聚体(Int-7b)，例外为所述反应在0℃下进行且通过HPLC(保留时间：6.112min。条件：参见实施例100，Int-7a的合成且当C7-C9异构体占优势时停止(约3h))监测。此异构体使用用于分离Int-7a的相同条件经分离。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝575.8,[(M+3H)/3]+＝384.2。
实施例102.合成Int-7c(C9-C9异构体)
Figure BDA0003630331990006102
类似于Int-7a(C7-C7异构体，实施例100)制备Int-7c(C9-C9异构体)，例外为所述反应在0℃下进行且通过HPLC(保留时间：6.232min。条件：参见实施例100，Int-7a的合成且当C9-C9异构体占优势时停止(约6h))监测。此异构体使用用于分离Int-7a的相同条件经分离。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝575.8,[(M+3H)/3]+＝384.2。
实施例103.合成Int-7(丙酮化合物途径)
Figure BDA0003630331990006111
步骤a.
Figure BDA0003630331990006112
5-乙酰胺基-7,8,9-O-三乙酰基-2,6-脱水-4-叠氮基-3,4,5-三脱氧-D-甘油-D-半乳-壬-2-烯酸甲酯(10.0g，22mmol)溶解于60ml无水甲醇中，接着在冰水浴中冷却下用20ml甲醇中的甲醇钠(0.5M于甲醇中，10mmol)处理。通过LCMS监测反应的进展，其在2小时之后完成。反应溶液的pH接着通过使用Amberlite IRN-77离子交换树脂经调节至5至6的值。过滤所述混合物以移除所述树脂且在真空下蒸发至干。所得油状物无需进一步纯化即用于下一步骤。通过LCMS发现的离子：M+H＝331.1。
步骤b.
Figure BDA0003630331990006121
向前一步骤的产物于70ml丙酮中的溶液中添加30ml 2,2-二甲氧基丙烷及对甲苯磺酸1水合物(400mg，2.0mmol)，所得溶液在室温下经搅拌过夜。在此时间结束时，添加碳酸氢钠(170mg，2.0mmol)，且所述混合物浓缩至干。所得残余物无需纯化即用于下一步骤。通过LCMS发现的离子：M+H＝371.2。
步骤c.
Figure BDA0003630331990006122
向来自前一步骤的材料于60ml甲醇中的溶液中添加5.0gLindlar催化剂。所得混合物每30分钟用氢气冲洗且经搅拌持续5小时。在如通过HPLC所测定完成反应之后，所述催化剂经由硅藻土滤出。滤液经浓缩且无需纯化即用于下一步骤。
60ml THF中的前一步骤的粗产物用N,N’-双-boc-1-脒基吡唑(9.3g，30.0mmol)及DIEA(9.9ml，57.0mmol)处理。所得溶液在室温下经搅拌，直至所有起始材料均经消耗，如通过LCMS所测定(4h)。所述溶液经浓缩且通过用20％至80％乙酸乙酯/二氯甲烷洗脱的快速色谱法经纯化。四个步骤的产量8.8g，产率59.0％。通过LCMS发现的离子：M+H 587.3。
步骤d.
Figure BDA0003630331990006131
含有前一步骤的产物(6.5g，11mmol)的反应烧瓶用氮气真空冲洗且溶解于无水二氯甲烷(100ml)中。在所述溶液在冰水浴中冷却之后，添加DMAP(4.89g，40mmol)且搅拌以溶解，接着分成数份添加氯甲酸4-硝基苯酯(5.58g，28mmol)，同时在0℃至室温下搅拌持续1小时。LCMS显示起始材料1h，因此添加额外DMAP(1.22g，10mmol)及氯甲酸4-硝基苯酯(1.0g，5mmol)。再继续所述反应持续4小时，接着浓缩且通过用20％至80％乙酸乙酯/二氯甲烷洗脱的快速色谱法经纯化。产量5.1g，产率59.9％。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝752.2。
步骤e.
Figure BDA0003630331990006132
向来自前一步骤的碳酸硝基苯酯(1.8g，2.3mmol)于无水二氯甲烷(20ml)中的溶液中添加中央接头(0.51g，1.0mmol，经30分钟分成数份添加)及DIPEA(1.4ml，10mmol)于无水DMF(20ml)中的混合物。所述反应在室温下经搅拌过夜，接着浓缩且通过用0％至10％甲醇/二氯甲烷洗脱的快速色谱法经纯化。产量1.35g，产率80％。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝830.4,[(M-Boc+2H)/2]+＝780.4,[(M-2Boc+2H)/2]+＝730.4。
步骤f.
Figure BDA0003630331990006141
前一步骤的产物(200mg，0.2mmol)溶解于2ml MeOH及2ml THF中，接着用氢氧化锂(24mg，1mmol)溶解于2ml水中的溶液处理。所述反应在室温下经搅拌持续10min，此时HPLC显示反应完成。反应溶液的pH通过使用Amberlite IRN-77离子交换树脂经调节至5至6的值，接着过滤以移除所述树脂。粗产物在真空下蒸发至干且无需纯化即用于下一步骤。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝815.4,[(M-Boc+2H)/2]+＝765.4,[(M-2Boc+2H)/2]+＝715.4。
步骤g.
Figure BDA0003630331990006142
步骤g的产物(400mg，0.25mmol)溶解于5ml二氯甲烷及5ml TFA中，且所得反应溶液在室温下经搅拌。通过LCMS监测反应的进展。在反应完成之后(6h)，所述溶液经汽提至干且接着溶解于4ml水及4ml乙腈中。所得溶液在室温下再搅拌持续2小时，此时LCMS显示丙酮化合物保护基的完全保护基脱除。此混合物经浓缩且通过反相液体色谱法(RPLC)使用以5％至40％乙腈/水洗脱的Isco
Figure BDA0003630331990006152
液体色谱仪使用0.1％TFA作为修饰剂经纯化。产量270mg，产率68.0％。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝575.8,[(M+3H)/3]+＝384.2。
实施例104.Int-7a、Int-7b及Int-7c的NMR结果
Int-7a的NMR
Figure BDA0003630331990006151
1H NMR(500MHz,甲醇-d4)δ5.91-5.89(m,2H),5.00-4.96(m,2H),4.58-4.53(m,2H),4.42-4.37(m,2H),4.20–4.17(m,6H),4.02-3.97(m,2H),3.78–3.49(m,28H),3.29-3.18(m,4H),2.86(t,J＝2.6Hz,1H),2.85-2.72(m,2H),1.96(s,3H),1.95(s,3H)。
13C NMR(125MHz,MeOD)δ171.73,170.80,170.29,161.95,156.06,155.08,154.99,144.07,143.93,116.41,114.10,106.03,105.86,77.71,74.46,73.22,68.62,68.54,68.50,68.38,68.12,68.00,67.94,67.67,67.64,67.53,67.20,66.96,65.44,61.53,56.17,49.74,49.64,47.37,45.17,39.16,39.06,31.73,19.96,19.92。
Int-7b的NMR
Figure BDA0003630331990006161
1H NMR(500MHz,甲醇-d4)δ5.91-5.87(m,2H),5.04-4.95(m,1H),4.58-4.48(m,2H),4.45-4.37(m,3H),4.20–4.10(m,5H),4.08–3.98(m,2H),3.79-3.44(m,29H),3.29–3.18(m,4H),2.88-2.70(m,3H),2.02(s,3H),1.96-1.94(m,3H)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:8.28(d,J＝8.4Hz,2H,-NH),7.98(d,J＝11.5Hz,2H,-NH),7.78(d,J＝8.7Hz,2H,-NH),7.60(t,J＝8.5Hz,2H,-NH),7.20(bs,2H,-NH),7.06(bs,2H,-NH),5.69(bs,1H),5.67(d,J＝2.4Hz,1H),4.83(dd,J＝9.2,2.2Hz,1H),4.45(dt,J＝9,2.5Hz,1H),4.37(d,J＝2.2Hz,1H),4.33-4.24(m,2H),4.13(d,J＝2.5Hz,2H),4.05-4.32(m,41H),3.23(m,1H),3.15-3.09(m,2H),3.06-3.02(m,2H),2.59(t,J＝6.7Hz,2H),1.91(s,3H),1.78(s,3H)。
13C NMR(125MHz,MeOD)δ:173.19,172.98,172.25,171.75,164.26,163.82,157.88,157.55,156.51,146.09,107.21,106.93,106.59,79.22,76.19,75.92,74.72,74.68,70.12,70.08,70.03,69.99,69.92,69.88,69.66,69.48,69.12,69.01,68.94,68.73,68.69,68.50,68.19,67.08,66.93,66.79,63.04,57.68,51.24,51.15,50.13,48.87,48.72,46.72,46.58,46.23,40.64,40.41,33.21,21.49,21.45,21.40。
Int-7c的NMR
Figure BDA0003630331990006171
1H NMR(500MHz,甲醇-d4)δ:5.88(d,J＝2.6Hz,2H),4.50(dt,J＝8.5,2.7Hz,2H),4.43(ddd,J＝9.7,3.9,1.5Hz,2H),4.39(dd,J＝11.5,2.4Hz,2H),4.25-4.16(m,2H),4.19(d,J＝2.4Hz,2H),4.13(dt,J＝11.5,5.9Hz,2H),4.05(m,2H),3.77(t,J＝6.2Hz,2H),3.72-3.55(m,22H),3.51(m,4H),3.35-3.23(m,4H),2.86(t,J＝2.4Hz,1H),2.74(t,J＝6.2Hz,2H),2.02(s,6H)。
13C NMR(125MHz,MeOD)δ:173.03,163.76,157.89,157.54,145.60,107.21,79.28,76.29,74.70,70.11,70.07,70.03,69.92,69.70,69.47,68.96,68.89,68.72,68.54,68.19,67.05,66.75,57.69,50.09,48.69,48.08,46.10,40.44,40.38,33.23,21.42。
实施例105.合成Int-60
Figure BDA0003630331990006181
步骤a.
向先前制备的醚-扎那米韦酸(1.00g，1.586mmol，实施例31)、2-叠氮基乙胺盐酸盐(213mg，1.744mmol)及DIPEA(1.105mL，6.343mmol)于DMF(8.0mL)中的0℃搅拌溶液中添加HATU(615mg，1.618mmol)。温度升至环境温度且继续搅拌直至完成。所有挥发物均根据真空技术经移除。残余物溶解于乙酸乙酯中，相继用1M硫酸水溶液(1×50mL)、饱和碳酸氢钠水溶液(3×20mL)及盐水(1×50mL)洗涤。所得有机层经硫酸镁干燥，过滤，且所有挥发物均根据真空技术经移除。以此方式，以高纯度获得816mg所需中间体叠氮化物且无需任何进一步纯化即用于下一步骤。(通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝699.2)。向所述粗材料(816mg，1.168mmol)、二炔丙基胺(54mg，0.584mmol)、三((1-苯甲基-4-三唑基)甲基)胺(31mg，0.058mmol)及抗坏血酸钠(58mg，0.292mmol)于乙醇(10mL)及水(5mL)中的搅拌溶液中添加硫酸铜(10mg，0.061mmol)。在完成时，添加铜净化剂SiliaMetS TAAcONa(300mg，装载0.45mmol/g)且继续搅拌持续1h。借助于二氯甲烷过滤所述混合物。用饱和碳酸氢钠溶液洗涤滤液。水层另外用二氯甲烷洗涤(3次)。经组合的有机物经硫酸镁干燥，过滤且浓缩。残余物通过二氧化硅柱使用相继以0％至100％己烷及乙酸乙酯、0％至30％二氯甲烷及洗脱的Isco
Figure BDA0003630331990006191
液体色谱法经纯化。产量817mg，94％产率。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝745.8,[(M+3H)/3]+＝497.5。
步骤b.
向步骤a产物(817mg，0.548mmol)、炔丙基-PEG4-酸(185mg，0.712mmol)及DIPEA(286μL，1.644mmol)于DMF(7.0mL)中的0℃搅拌溶液中添加HATU(212mg，0.544mmol)。温度升至环境温度且继续搅拌直至完成。所有挥发物均根据真空技术经移除。残余物通过HPLC(0至90％甲醇及水)经纯化。产量520mg，产率56％。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝866.8,[(M+3H)/3]+＝578.4。
步骤c.
搅拌步骤b化合物(520mg，0.300mmol)于2-甲基-2-丁烯(0.25mL)、二氯甲烷(4.0mL)及TFA(2.0mL)中的搅拌溶液，直至气体释出停止。所有挥发物均根据真空技术经移除。残余物通过HPLC(0至30％甲醇及水，使用0.1％TFA作为修饰剂)经纯化。产量221mg，产率47％。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝666.8,[(M+3H)/3]+＝444.8。
步骤d.
向步骤c产物(221mg，0.142mmol)于水(3.0mL)中的0℃搅拌溶液中添加氢氧化锂(20mg，0.850mmol)。所述反应用乙酸(120μL)淬灭，且所有挥发物均根据真空技术经移除。残余物通过HPLC(0至20％甲醇及水，使用0.1％TFA作为修饰剂)经纯化。产量130mg，产率62％。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝626.8,[(M+3H)/3]+＝418.2。
实施例106.合成缀合物29
经叠氮基官能化的无糖基化Fc(SEQ ID NO:35)于pH 7.4PBS x1缓冲溶液(100mg，10mL，1.874μmol)中的溶液添加至含有炔衍生的小分子(17mg，0.0112mmol；实施例105，Int-60)、硫酸铜(4mg，0.0225mmol)、三(3-羟基丙基三唑基甲基)-胺(39mg，0.0900mmol)及抗坏血酸钠(7.4mg，0.375mmol)的pH 7.4PBS x 1缓冲溶液(10.50mL)的离心管中。所得混合物轻柔地振荡过夜。其相继通过在蛋白A柱上的亲和力色谱法、尺寸排阻色谱法(参见实施例10)经纯化。经纯化最终产物的Maldi TOF分析给出56938Da的平均质量(DAR＝2.3)。产量49.9mg，49％产率。
编码缀合物29的Fc的核酸构建体包含编码SEQ ID NO:35的氨基酸序列的核酸，所述Fc包含C端赖氨酸残基及N端鼠科动物IgG信号序列。在表达后，缀合物29的Fc的C端赖氨酸及N端鼠科动物IgG信号序列被蛋白水解切割，导致Fc具有缺少Lys447(例如，缺少C端赖氨酸残基)及N端鼠科动物IgG信号序列的序列。C端赖氨酸的存在与否不会改变Fc或对应缀合物的特性。
实施例107.合成Int-65
Figure BDA0003630331990006211
步骤a.
向先前制备的醚-扎那米韦酸(2.00g，3.172mmol，实施例31)及4-甲基吗啉(0.628mL，5.709mmol)于四氢呋喃(30mL)中的0℃搅拌溶液中添加氯甲酸异丁酯(0.617mL，4.7574mmol)。10分钟之后，温度增加至环境温度且继续搅拌持续20分钟。温度减回0℃，且一次性添加硼氢化钠(360mg，9.515mmol)，随后经5分钟逐滴添加(10mL)。在完成时，所述反应用乙酸(2.860mL，50mmol)淬灭，且5分钟之后，温度升至环境温度，同时继续搅拌直至气体释出停止。所有挥发物均经蒸发且残余物悬浮于二氯甲烷中且经过滤。滤液经浓缩且残余物通过二氧化硅柱使用以20％至100％己烷及乙酸乙酯洗脱的Isco
Figure BDA0003630331990006212
液体色谱法使用3％甲醇作为修饰剂经纯化。产量1.302g，66％产率。通过LCMS发现的离子：[(M+H)]+＝617.2。
步骤b.
向步骤a产物(1.25g，2.027mmol)及DIPEA(1.095mL，6.284mmol)于二氯甲烷(15mL)中的0℃搅拌溶液中添加甲烷磺酰氯(0.314mmol，4.054mmol)。在完成时，所述反应用水(15mL)处理。分离各层，且二氯甲烷层相继经盐水、硫酸镁干燥，且过滤。所述溶液经浓缩且残余物溶解于DMF(10mL)中，且添加叠氮化钠(264mg，4.054mmol)，同时温度升至50℃。18h之后观察到完成，且所有挥发物均根据真空技术经蒸发。残余物通过二氧化硅柱使用以20％至100％己烷及乙酸乙酯洗脱的Isco
Figure BDA0003630331990006221
液体色谱法使用3％甲醇作为修饰剂经纯化。产量767mg，59％产率。通过LCMS发现的离子：[(M+H)]+＝642.2。
步骤c.
向步骤b产物(496mg，0.773mmol)、二炔丙基胺(36mg，0.386mmol)、三((1-苯甲基-4-三唑基)甲基)胺(41mg，0.077mmol)及抗坏血酸钠(115mg，0.580mmol)于乙醇(16mL)及水(8mL)中的搅拌溶液中添加硫酸铜(13mg，0.081mmol)。在完成时，添加铜净化剂SiliaMetSTAAcONa(600mg，装载0.45mmol/g)且继续搅拌持续1h。借助于二氯甲烷过滤所述混合物。用饱和碳酸氢钠溶液洗涤滤液。水层另外用二氯甲烷洗涤(3次)。经组合的有机物经硫酸镁干燥，过滤且所有挥发物均根据真空技术经蒸发。向残余物、炔丙基-PEG4-酸(151mg，0.580mmol)及DIPEA(337μL，1.933mmol)于DMF(10.0mL)中的0℃搅拌溶液中添加HATU(220mg，0.580mmol)。温度升至环境温度且继续搅拌直至完成。所有挥发物均根据真空技术经移除。残余物通过HPLC(0至90％甲醇及水)经纯化。产量457mg，产率73％。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝809.8,[(M+2H-Boc)/2]+＝759.8。
步骤d.
搅拌步骤c化合物(451mg，0.279mmol)于2-甲基-2-丁烯(0.25mL)、二氯甲烷(4.0mL)及TFA(2.0mL)中的搅拌溶液，直至气体释出停止。所有挥发物均根据真空技术经移除。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝609.8,[(M+3H)/3]+＝407.0。向残余物于四氢呋喃(6mL)及水(6mL)中的0℃搅拌溶液中添加氢氧化锂(240mg，10.03mmol)。在完成时，所述反应用乙酸(0.638mL，11.14mmol)淬灭，且所有挥发物均根据真空技术经移除。残余物通过HPLC(0至90％甲醇及水，使用0.1％TFA作为修饰剂)经纯化。产量209mg，产率67％。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝569.8,[(M+2H-Boc)/2]+＝380.3。
实施例108.合成缀合物30
经叠氮基官能化的无糖基化Fc(实施例7，SEQ ID NO:35)于pH7.4PBS x 1缓冲溶液(50mg，5mL，1.874μmol)中的溶液添加至含有炔衍生的小分子(8.7mg，0.0064mmol，Int-65)、硫酸铜(2mg，0.013mmol)、三(3-羟基丙基三唑基甲基)-胺(22mg，0.0508mmol)及抗坏血酸钠(25mg，0.127mmol)的pH 7.4PBS x 1缓冲溶液(9.50mL)的离心管中。所得混合物轻柔地振荡过夜。其相继通过在蛋白A柱上的亲和力色谱法、尺寸排阻色谱法(参见实施例10)经纯化。经纯化最终产物的Maldi TOF分析给出61548Da的平均质量(DAR＝2.4)。产量32.33mg，67％产率。
编码缀合物30的Fc的核酸构建体包含编码SEQ ID NO:35的氨基酸序列的核酸，所述Fc包含C端赖氨酸残基及N端鼠科动物IgG信号序列。在表达后，缀合物30的Fc的C端赖氨酸及N端鼠科动物IgG信号序列被蛋白水解切割，导致Fc具有缺少Lys447(例如，缺少C端赖氨酸残基)及N端鼠科动物IgG信号序列的序列。C端赖氨酸的存在与否不会改变Fc或对应缀合物的特性。
实施例109：合成碳酸对硝基苯酯扎那米韦中间体
Figure BDA0003630331990006241
步骤a.
Figure BDA0003630331990006242
三乙酰氧基-叠氮基扎那米韦中间体(10.0g，22mmol)溶解于60ml无水甲醇中，接着在冰水浴中冷却下用20ml甲醇中的甲醇钠(0.5M于甲醇中，10mmol)处理。通过LCMS监测反应的进展，其在2小时之后完成。反应溶液的pH接着通过使用Amberlite IRN-77离子交换树脂经调节至5至6的值。过滤所述混合物以移除所述树脂且在真空下蒸发至干。所得油状物无需进一步纯化即用于下一步骤。通过LCMS发现的离子：M+H＝331.1。
步骤b.
Figure BDA0003630331990006251
向前一步骤的产物于70ml丙酮中的溶液中添加30ml 2,2-二甲氧基丙烷及对甲苯磺酸1水合物(400mg，2.0mmol)，所得溶液在室温下经搅拌过夜。在此时间结束时，添加碳酸氢钠(170mg，2.0mmol)，且所述混合物浓缩至干。所得残余物无需纯化即用于下一步骤。通过LCMS发现的离子：M+H＝371.2。
步骤c及d.
Figure BDA0003630331990006252
向来自前一步骤的材料于60ml甲醇中的溶液中添加5.0gLindlar催化剂。所得混合物每30分钟用氢气冲洗且经搅拌持续5小时。在如通过HPLC所测定完成反应之后，所述催化剂经由硅藻土滤出。滤液经浓缩且无需纯化即用于下一步骤。
60ml THF中的前一步骤的粗产物用N,N’-双-boc-1-脒基吡唑(9.3g，30.0mmol)及DIEA(9.9ml，57.0mmol)处理。所得溶液在室温下经搅拌，直至所有起始材料均经消耗，如通过LCMS所测定(4h)。所述溶液经浓缩且通过用20％至80％乙酸乙酯/二氯甲烷洗脱的快速色谱法经纯化。四个步骤的产量8.8g，产率59.0％。通过LCMS发现的离子：M+H 587.3。
步骤e.
Figure BDA0003630331990006261
含有前一步骤的产物(6.5g，11mmol)的反应烧瓶用氮气真空冲洗且溶解于无水二氯甲烷(100ml)中。在所述溶液在冰水浴中冷却之后，添加DMAP(4.89g，40mmol)且搅拌以溶解，接着分成数份添加氯甲酸4-硝基苯酯(5.58g，28mmol)，同时在0℃至室温下搅拌持续1小时。LCMS显示起始材料1h，因此添加额外DMAP(1.22g，10mmol)及氯甲酸4-硝基苯酯(1.0g，5mmol)。再继续所述反应持续4小时，接着浓缩且通过用20％至80％乙酸乙酯/二氯甲烷洗脱的快速色谱法经纯化。产量5.1g，产率59.9％。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝752.2。
实施例110.合成Int-71
Figure BDA0003630331990006271
步骤a.
Figure BDA0003630331990006272
向2-(2-Boc-氨基乙氧基)乙醇(6.15g，30mmol)于无水DCM(60ml)中的溶液中添加DIPEA(7.8g，60mmol)及DMAP(366.6mg，3mmol)。接着经30分钟分成数份添加对甲苯磺酰氯(6.86g，36mmol)。在所得混合物经搅拌持续3天之后，其通过旋转蒸发经浓缩且通过RPLC(20％至70％乙腈/水)经纯化。产量3.71g，产率34.4％。通过LCMS发现的离子：[M-Boc+H]+＝260。
步骤b.
Figure BDA0003630331990006281
向步骤-a产物(2.1g，5.83mmol)于无水THF(10ml)中的溶液中添加碳酸钠(1.24g，11.7mmol)及N-Boc-1,4-二氨基丁烷(1.32g，7mmol)。所得混合物在60℃下加热持续1天。接着滤出盐，且滤液通过旋转蒸发经浓缩。残余物通过RPLC(100g，5至50％乙腈及水)经纯化。产量1.94g，产率88.6％。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝376.0。
步骤c.
Figure BDA0003630331990006282
向炔丙基PEG-4酸(781mg，3mmol)及HATU(1.14g，3mmol)于无水DMF(3ml)中的溶液中添加DIPEA(390mg，3mmol)，随后添加步骤-b产物(940mg，2.5mmol)及DIPEA(390mg，3mmol)于无水DMF(3ml)中的溶液。所述反应混合物经搅拌持续30分钟，接着直接地通过RPLC(5％至80％乙腈及水，使用0.1％TFA作为修饰剂)经纯化。产量960.2mg，产率65.3％。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝618.3,[M-Boc+H]+＝518.3。
步骤d.
Figure BDA0003630331990006283
步骤-c产物(960.2mg，1.63mmol)溶解于无水THF(6ml)中。添加二恶烷(4ml)中的4N HCl溶液，且所述反应混合物经搅拌过夜。其接着通过旋转蒸发经浓缩。残余物用水(3×3ml)及乙酸乙酯(10ml)萃取。经组合的水层经冻干。产量760mg，产率95.1％。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝418.0。
步骤e.
Figure BDA0003630331990006291
经20分钟分成数份向步骤-d产物(556.2mg，1.13mmol)及DIPEA(741mg，5.7mmol)于无水DMF(3ml)中的混合物中添加扎那米韦的碳酸对硝基苯酯(1.67g，2.26mmol，描述于实施例109中)。所述反应经搅拌持续1小时，接着直接地通过RPLC(30％至90％乙腈/水，使用0.1％TFA作为修饰剂)经纯化。产量1.35g，产率74％。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝807.9。
步骤f.
Figure BDA0003630331990006292
步骤-e产物(1.35g，0.836mmol)溶解于TFA(5ml)中。所述反应在30℃下加热持续1小时，其直接地通过RPLC(0％至35％乙腈/水，使用0.1％TFA作为修饰剂)经纯化。产量1.00g，产率82.9％。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝607.8。
步骤g.
Figure BDA0003630331990006301
步骤-f产物(1.00g，0.693mmol)溶解于MeOH(12ml)中，接着在冰水浴中冷却。其接着经LiOH单水合物(286mg，6.6mmol)于水(9ml)中的溶液处理。所得混合物经搅拌过夜且接着通过二恶烷(2ml)中的4N HCl溶液酸化。在通过旋转蒸发移除有机溶剂之后，所述残余物通过制备型HPLC(Isco ACCQ制备型，Luna 5μm C18(2)
Figure BDA0003630331990006302
LC柱100mm x 30mm；梯度：0％乙腈/水持续2min，接着0％至15％乙腈/水经12min，接着在15％乙腈下等度持续10min，使用0.1％TFA)经纯化。产量275.9mg，产率29.2％。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝567.8,[(M+3H)/3]+＝378.9。
实施例111.合成缀合物31
向15-ml无菌离心管中馈入抗坏血酸钠(68.1mg，0.344mmol)、THPTA(14.9mg，0.0344mmol)、炔衍生的小分子(17.5mg，0.00953mmol，描述于实施例110中)及缓冲液PBS7.4(1ml)。在通过涡旋经搅拌以溶解所有物质之后，相继添加Peg 4叠氮基Fc(50mg，0.0008588mmol，描述于实施例7中SEQ ID No.18)、CuSO4(2.05mg，0.0129mmol)于PBS(0.5ml)中的溶液。所述混合物轻柔地经旋转持续20小时，接着相继通过蛋白-A柱上的亲和力色谱法、尺寸排阻色谱法经纯化。经纯化最终产物的Maldi TOF分析给出63586Da的平均质量(DAR＝3.8)。产量32.8mg，66％产率。
实施例112.合成Int-72
Figure BDA0003630331990006311
步骤a.
Figure BDA0003630331990006312
向N-Boc-1,4-二氨基丁烷(1.56g，8.28mmol)于无水DMF(7ml)中的溶液中添加碳酸钠(742mg，7mmol)及5-(Boc-氨基)-1-戊基溴(1.73g，6.5mmol)。所得混合物在50℃下加热持续24小时。接着滤出盐，且滤液通过旋转蒸发经浓缩。残余物通过RPLC(5％至50％乙腈/水，使用0.1％TFA作为修饰剂)经纯化。产量2g，产率63.2％。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝374.4。
步骤b.
Figure BDA0003630331990006321
向炔丙基PEG-4酸(1.3g，5mmol)及HATU(2.1g，5.5mmol)于无水DMF(6ml)中的溶液中添加DIPEA(1.3g，10mmol)。5分钟之后，所述反应混合物添加至步骤-a产物(2g，4.1mmol)中且经搅拌持续1小时。其接着直接地通过RPLC(5％至80％乙腈/水，使用0.1％TFA作为修饰剂)经纯化。产量2.34g，产率95％。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝616.4,[M-Boc+H]+＝516.4。
步骤c.
Figure BDA0003630331990006322
步骤-b产物(2.34g，3.8mmol)溶解于无水THF(12ml)中。添加二恶烷(10ml)中的4NHCl溶液，且所述反应混合物经搅拌过夜。其接着通过旋转蒸发经浓缩。残余物再溶解于乙腈/水(1:1，约16ml)中，且所述溶液经冻干。粗产物无需进一步纯化继续用于后续步骤。产量1.91g，定量产率。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝416.4。
步骤d.
Figure BDA0003630331990006323
经20分钟分成数份向扎那米韦的碳酸对硝基苯酯(2.25g，3.05mmol，描述于实施例109中)于无水DCM(3ml)中的溶液中添加步骤-c产物(610mg，1.249mmol)及DIPEA(1.05g，8.1mmol)于无水DMF(4ml)中的混合物。在搅拌持续1小时之后，所述反应混合物经浓缩且通过RPLC(30％至80％乙腈/水，使用0.1％TFA作为修饰剂)经纯化。产量1.73g，产率85.9％。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝806.8,[(M-Boc+2H)/2]+＝756.8。
步骤e.
Figure BDA0003630331990006331
步骤-d产物(1.73g，1.073mmol)溶解于TFA(5ml)中。在所述溶液在30℃下加热持续3小时之后，其直接地通过RPLC(0％至35％乙腈/水，使用0.1％TFA作为修饰剂)经纯化。产量1.176g，产率76.1％。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝606.8,[(M+3H)/3]+＝405。
步骤f.
Figure BDA0003630331990006332
步骤-e产物(1.176g，0.817mmol)溶解于MeOH(12ml)中，且所述溶液在冰水浴中冷却。其逐滴经LiOH单水合物(344.4mg，8.2mmol)于水(9ml)中的溶液处理。所得混合物经搅拌过夜且接着通过二恶烷(2ml)中的4N HCl溶液酸化。在通过旋转蒸发移除有机溶剂之后，所述残余物通过制备型HPLC(Isco ACCQ制备型，Luna 5μm C18(2)
Figure BDA0003630331990006333
Figure BDA0003630331990006341
LC柱100mm x30mm；梯度：0％乙腈/水持续2min，接着0％至15％乙腈/水经12min，接着在15％乙腈下等度持续10min，使用0.1％TFA)经纯化。产量108mg，产率9.7％。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝566.8,[(M+3H)/3]+＝378.2。
实施例113.合成缀合物32
向15-ml无菌离心管中馈入抗坏血酸钠(68.1mg，0.344mmol)、THPTA(14.9mg，0.0344mmol)、实施例112的产物Int-72(17.5mg，0.00953mmol)及PBS 7.4(1ml)。在通过涡旋搅拌以溶解所有物质之后，相继添加叠氮基Fc(50mg，0.0008588mmol，描述于实施例7中，SEQ ID NO:4)、CuSO4(2.05mg，0.0129mmol)于PBS(0.5ml)中的溶液。所述混合物经旋转持续20小时。其相继通过在蛋白A柱上的亲和力色谱法、尺寸排阻色谱法经纯化。经纯化最终产物的Maldi TOF分析给出63588.Da的平均质量(DAR＝3.8)。产量30.9mg，62％产率。
编码缀合物32的Fc的核酸构建体包含编码SEQ ID NO:4的氨基酸序列(其包含C端赖氨酸残基)的核酸。在表达后，缀合物32的Fc的C端赖氨酸被蛋白水解切割，导致Fc具有缺少Lys447(例如，缺少C端赖氨酸残基)的序列。C端赖氨酸的存在与否不会改变Fc或对应缀合物的特性。
实施例114.合成Int-73
Figure BDA0003630331990006351
步骤a.
Figure BDA0003630331990006352
经10分钟分成数份向扎那米韦的碳酸对硝基苯酯(698.4mg，0.95mmol，描述于实施例109中)于无水DCM(2ml)中的溶液中添加炔丙基二胺中央接头(209mg，0.426mmol，描述于实施例110中)及DIPEA(330.8mg，2.56mmol)于无水DMF(2ml)中的混合物。所述反应在室温下搅拌持续1小时。其接着经浓缩且通过RPLC(30％至85％乙腈/水，不使用TFA修饰剂)经纯化。产量531mg，产率69.2％。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝807.8,[(M-Boc+2H)/2]+＝757.8。
步骤b.
Figure BDA0003630331990006361
步骤-b产物(531mg，0.329mmol)溶解于DCM(1.5ml)及TFA(1.5ml)中，接着在35℃下经搅拌持续3小时。其经浓缩且通过RPLC(5％至30％乙腈/水，不使用TFA修饰剂)经纯化。产量387mg，产率97.1％。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝607.6,[(M+3H)/3]+＝405.4。
步骤c.
Figure BDA0003630331990006362
步骤-b产物(121.4mg，0.1mmol)溶解于1.0M NaCl溶液(3ml)及乙腈(1ml)中。在所述溶液经冷却至-8℃(盐/冰浴)之后，逐滴添加1.0M NaOH(0.4mL，0.4mmol)且所述反应在-14℃至-8℃下经搅拌持续6小时。其接着用二恶烷中的4N HCl溶液(100μl)中和且直接地通过制备型HPLC(Isco ACCQ制备型，Luna 5μm C18(2)
Figure BDA0003630331990006363
LC柱100mm x 30mm；梯度：0％乙腈/水持续2min，接着0％至17.8％乙腈/水经12min，接着在17.8％乙腈下等度持续10min，使用0.1％TFA)经纯化。产量85.5mg，产率62.8％。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝567.8,[(M+3H)/3]+＝378.9。
实施例115.合成Int-74
Figure BDA0003630331990006371
步骤a.
Figure BDA0003630331990006372
向N-Boc-2-(2-氨基-乙氧基)乙胺(1.2g，5mmol)于无水DMF(5ml)中的溶液中添加碳酸钠(691mg，5mmol)及N-Boc-6-溴-己胺(1.4g，5mmol)。所得混合物在70℃下加热持续24小时。接着滤出盐，且滤液通过旋转蒸发经浓缩。残余物通过RPLC(5％至50％乙腈/水，使用0.1％TFA作为修饰剂)经纯化。产量444mg，产率22％。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝404.3。
步骤b.
Figure BDA0003630331990006381
向炔丙基PEG-4酸(342.6mg，1.32mmol)及HATU(601.5mg，1.58mmol)于无水DMF(2ml)中的溶液中添加DIPEA(258mg，2mmol)。5分钟之后，所述反应混合物添加至步骤-a产物(444.3mg，0.858mmol)中且经搅拌持续1小时。其接着直接地通过RPLC(5％至80％乙腈/水，使用0.1％TFA作为修饰剂)经纯化。产量297.1mg，产率53.6％。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝646.2,[M-Boc+H]+＝546.2。
步骤c.
Figure BDA0003630331990006382
步骤-b产物(297.1mg，0.46mmol)溶解于无水THF(2ml)中。添加二恶烷(4ml)中的4N HCl溶液，且所述反应混合物经搅拌过夜。其接着通过旋转蒸发经浓缩且通过制备型HPLC(5％至50％乙腈/水，使用0.1％TFA作为修饰剂)经纯化。产量239.6mg，产率77.3％。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝446.2。
步骤d.
Figure BDA0003630331990006391
经10分钟分成数份向扎那米韦的碳酸对硝基苯酯(523.8mg，0.71mmol，描述于实施例109中)于无水DCM(2ml)中的溶液中添加步骤-c产物(239.6mg，0.356mmol)及DIPEA(245.5mg，1.9mmol)于无水DMF(2ml)中的混合物。所述反应在室温下搅拌持续1小时。其接着经浓缩且通过RPLC(30％至85％乙腈/水，不使用TFA修饰剂)经纯化。产量553mg，产率96.5％。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝821.8,[(M-Boc+2H)/2]+＝771.8。
步骤e.
Figure BDA0003630331990006392
步骤-d产物(553mg，0.343mmol)溶解于DCM(1.5ml)及TFA(1.5ml)中，接着在35℃下经搅拌持续3小时。其经浓缩且通过RPLC(5％至30％乙腈/水，不使用TFA修饰剂)经纯化。产量424.6mg，产率99.6％。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝621.6,[(M+3H)/3]+＝415.0。
步骤f.
Figure BDA0003630331990006401
步骤-e产物(424.6mg，0.342mmol)溶解于1.0MNaCl溶液(4ml)及乙腈(4ml)中。在所述溶液经冷却至-11℃(盐/冰浴)之后，逐滴添加1.0MNaOH(1.53ml，1.53mmol)且所述反应在-14℃至-8℃下经搅拌持续6小时。其接着用二恶烷中的4NHCl溶液(375μl)淬灭，且直接地通过制备型HPLC(Isco ACCQ制备型，Luna 5μm C18(2)
Figure BDA0003630331990006402
LC柱100mm x 30mm；梯度：0％乙腈/水持续2min，接着0％至20.9％乙腈/水经13.6min，接着在20.9％乙腈下等度持续10min，使用0.1％TFA)经纯化。产量439mg，产率92.3％。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝581.8,[(M+3H)/3]+＝388.2。
实施例116.合成Int-75
Figure BDA0003630331990006411
步骤a.
Figure BDA0003630331990006412
(4-氧代丁基)氨基甲酸叔丁酯(850mg，4.54mmol)及N-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酸叔丁酯(1.99g，8mmol)的混合物溶解于DCM(30ml)中且经Na2SO4干燥。在过滤且浓缩之后，残余物再溶解于无水DCM(20ml)中。经1小时分成数份相继添加乙酸(641mg，11mmol)、三乙酰氧基硼氢化钠(3.4g，16mmol)。所述反应混合物经搅拌过夜，接着用AcOH(3ml)及MeOH(10ml)淬灭。过滤所述混合物，且滤液通过旋转蒸发经浓缩且通过RPLC(5％至45％乙腈及水)经纯化。产量618mg，产率32.5％。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝420.4。
步骤b.
Figure BDA0003630331990006421
类似于实施例115的步骤-b产物制备此化合物。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝662.4,[M-Boc+H]+＝562.4。
步骤c.
Figure BDA0003630331990006422
类似于实施例115的步骤-c产物制备此化合物。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝462.4。
步骤d.
Figure BDA0003630331990006423
类似于实施例115的步骤-d产物制备此化合物。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝829.8,[(M-Boc+2H)/2]+＝779.8。
步骤e.
Figure BDA0003630331990006424
类似于实施例115的步骤-e产物制备此化合物。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝629.8,[(M+3H)/3]+＝420.2。
步骤f.
Figure BDA0003630331990006431
类似于实施例115的步骤-f产物制备此化合物。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝598.8,[(M+3H)/3]+＝393.6。
实施例117.合成Int-76
Figure BDA0003630331990006432
步骤a.
Figure BDA0003630331990006433
向N-Boc-peg-1甲苯磺酸盐(1.54g，4.28mmol，描述于实施例110中)于无水THF(8ml)中的溶液中添加N-2{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酸叔丁酯(1.59g，6.42mmol)及碳酸钠(453.7mg，4.28mmol)。所得混合物在50℃下加热持续24小时。过滤所述固体且用乙腈洗涤。滤液经浓缩且通过RPLC(100g，5至90％乙腈及水)经纯化。产量1.15g，产率61.7％。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝436.4。
步骤b.
Figure BDA0003630331990006441
类似于实施例115的步骤-b产物制备此化合物。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝678.2,[M-Boc+H]+＝578.2。
步骤c.
Figure BDA0003630331990006442
类似于实施例115的步骤-c产物制备此化合物。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝478.2。
步骤d.
Figure BDA0003630331990006443
类似于实施例115的步骤-d产物制备此化合物。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝837.6,[(M-Boc+2H)/2]+＝767.8。
步骤e.
Figure BDA0003630331990006451
类似于实施例115的步骤-e产物制备此化合物。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝637.5,[(M+3H)/3]+＝425.6。
步骤f.
Figure BDA0003630331990006452
类似于实施例115的步骤-f产物制备此化合物。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝597.8,[(M+3H)/3]+＝399.0。
实施例118合成Int-67
Figure BDA0003630331990006453
步骤a.
Figure BDA0003630331990006461
先前制备的醚扎那米韦酸起始材料(0.90g，1.43mmol，描述于实施例22中)及N-甲基吗啉(0.23mL，2.14mmol)溶解于THF(35mL)中且在氮气气氛下冷却至0℃(冰水浴)。经5分钟时期借助于注射器逐滴添加氯甲酸异丁酯(0.24mL，1.85mmol，于2mL DCM中)。所述混合物在0℃下经搅拌持续30分钟，接着在环境温度下经搅拌持续15min，且接着冷却至0℃，经5分钟向其中逐滴添加硼氢化钠(540mg，14.3mmol，溶解于5mL甲醇中)。所述反应经搅拌持续15分钟，此时所有起始材料均已经消耗(通过LC/MS)。添加数滴(约1mL)冰乙酸以酸化所述混合物(pH约5)。所述混合物用乙酸乙酯及水稀释且经萃取至乙酸乙酯中(3次)。有机层用盐水洗涤，且有机萃取物经硫酸钠干燥，且在旋转蒸发仪上经浓缩。粗材料通过硅胶色谱法经纯化，首先经干燥于硅藻土上，且接着经30min用DCM中的0％-10％甲醇洗脱。产量0.66g，产率75％。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝617.2。
步骤b.
Figure BDA0003630331990006462
向前一步骤的产物(0.66g，1.10mmol)于20mL DCM中的搅拌混合物中添加三乙胺(0.30mL，1.3mmol)。所述混合物在氮气气氛下冷却至0℃(冰水浴)，接着经5分钟借助于注射器逐滴用甲磺酰氯(0.15g，1.3mmol)处理。移除冰浴且所述反应经搅拌持续45分钟。所述反应用饱和碳酸氢钠水溶液淬灭，接着经萃取至DCM中(3次)。经组合的有机萃取物用盐水洗涤，经硫酸钠干燥且在旋转蒸发仪上经浓缩。产量0.74g，产率99％。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝695.2。所述中间体无需纯化即用于下一步骤。
步骤c.
Figure BDA0003630331990006471
前一步骤的甲磺酸盐(0.74g，1.1mmol)在80℃下与3eq叠氮化钠(0.21g，3.3mmol)一起在DMF(5mL)中经搅拌持续5小时。所述混合物用水稀释，经萃取至DCM中(3次)。经组合的有机萃取物用盐水洗涤，经硫酸钠干燥且浓缩。产量0.67g，产率95％。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝642.4。所述叠氮化物无需纯化即用于下一步骤。
步骤d.
Figure BDA0003630331990006472
前一步骤的叠氮化物(0.67g，1.04mmol)在1个大气压的氢气下在Lindlar催化剂(300mg)存在下在甲醇(20mL)中经搅拌持续12小时。所述混合物经由硅藻土过滤且浓缩以提供呈澄清油状物的标题化合物。所述胺无需纯化即用于下一步骤。产量0.37g，产率54％，3个步骤。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝616.2。
步骤e.
Figure BDA0003630331990006481
EDC(150mg，0.78mmol)添加至前一步骤的胺(370mg，0.60mmol)、炔丙基-peg4-甲酸(188mg，0.72mmol)及三乙胺(0.100mL，0.72mmoL)溶解于DMF(4mL)中的搅拌溶液中。所述反应在环境温度下经搅拌持续2小时，接着直接地通过RPLC(10％-95％乙腈/水，无修饰剂，30分钟梯度)经纯化。汇集纯洗脱份且冻干且直接地用于下一步骤。产量490mg，产率80％。通过LC/MS发现的离子：[M+H]+＝858.2。
步骤f.
Figure BDA0003630331990006482
前一步骤的产物(490mg，0.57mmol)在TFA(4mL)中经搅拌持续45分钟，接着浓缩且在旋转蒸发仪上与甲醇共沸(3次)。通过LC/MS发现的离子：[M+H]+＝658.2。残余物在含有LiOH(43mg，1.8mmol)的1/1甲醇/水中经搅拌持续30分钟。所述反应用数滴冰乙酸中和且体积在旋转蒸发仪上减半。粗产物通过半制备型HPLC(0％-75％乙腈/水，0.1％TFA，30分钟梯度)经纯化。汇集纯洗脱份且冻干以提供标题化合物。产量105mg，产率29％，3个步骤。通过LC/MS发现的离子：[M+H]+＝618.2。
实施例119.合成Int-68
Figure BDA0003630331990006491
步骤a.
Figure BDA0003630331990006492
氯甲酸对硝基苯酯(0.23g，1.14mmol)添加至一级醇(0.47g，0.76mmol描述于实施例118中)及三乙胺(0.21mL，1.52mmol)溶解于DCM(15mL，无水)中的搅拌混合物中。所述反应经搅拌持续1小时，接着添加额外三甲胺(0.21mL)及氯甲酸对硝基苯酯(230mg)，且再继续搅拌1小时，此时所述混合物用水稀释，且经萃取至DCM中(3次)。经合并的有机萃取物用盐水洗涤且经硫酸钠干燥。通过旋转蒸发移除溶剂。粗残余物溶解于DCM(3mL)中，经装载于硅藻土上且通过硅胶色谱法(0％至70％乙酸乙酯/己烷，30分钟梯度)经纯化。汇集纯洗脱份且浓缩以提供呈白色固体状的标题化合物。产量525mg，产率88％。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝782.2。
步骤b.
Figure BDA0003630331990006501
三乙胺(0.14mL，0.97mmol)添加至炔丙基-peg4-胺(181mg，0.78mmol)于1mL乙腈中的搅拌溶液中。所述三乙胺/炔丙基-peg4-胺混合物添加至前一步骤的产物(510mg，0.65mmol，于2mL乙腈中)中且经搅拌持续1小时，此时所有起始材料均已经消耗。在旋转蒸发仪上移除溶剂。粗残余物通过RPLC(20-95％乙腈/水，30min梯度，无修饰剂)经纯化。产量475mg，产率83％。通过LC/MS发现的离子：[M+H]+＝874.2。
步骤c.
Figure BDA0003630331990006502
前一步骤的产物(475mg，0.54mmol)在TFA(5mL)中经搅拌持续2小时且接着浓缩且在旋转蒸发仪上与甲醇共沸(3次)。通过LC/MS发现的离子：[M+H]+＝674.2。残余物在含有LiOH(49mg，1.6mmol)的1/1甲醇/水混合物中经搅拌持续30分钟。所述反应用冰乙酸中和且接着通过旋转蒸发经浓缩。产物通过半制备型HPLC(0％-75％乙腈/水，0.1％TFA，30分钟梯度)经纯化。汇集纯洗脱份且冻干。产量204mg，产率59％。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝634.2。
实施例120合成Int-77
Figure BDA0003630331990006511
步骤a.
Figure BDA0003630331990006512
HATU(0.44g，1.16mmol，于1.5mL DMF中)逐滴添加至炔丙基-peg4-胺(0.24g，1.05mmol)、双-Boc-D-鸟氨酸(0.35g，1.05mmol)及三乙胺(0.59mL，4.21mmol)于DMF(2mL)中的搅拌溶液中。所述反应在环境温度下经搅拌持续1小时，接着直接地通过RPLC(5％-90％乙腈/水，0.1％TFA，35分钟梯度)经纯化。汇集纯洗脱份且冻干以提供呈粘性澄清油状物的产物。通过LC/MS发现的离子：[M+H]+＝546.2。
所述经Boc保护的中间体在环境温度下在二恶烷(10mL)中的4NHCL中经搅拌持续45分钟。通过旋转蒸发移除溶剂，接着所得残余物溶解于DI水(20mL)中，经冷冻，且冻干以提供呈澄清油状物的产物。产量310mg，产率70％，2个步骤。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝346.2。
步骤b.
Figure BDA0003630331990006521
乙腈(2mL)中的前一步骤的产物(96mg，0.28mmol)及三乙胺(0.15mL，1.11mmol)添加至扎那米韦的碳酸对硝基苯酯(435mg，0.56mmol，描述于实施例118中，于6mL乙腈中)的搅拌溶液中，且在环境温度下经搅拌持续12小时，接着在80℃下经搅拌持续2小时。移除溶剂且粗残余物通过RPLC(10-95％乙腈/水，无修饰剂，35分钟梯度)经纯化。汇集纯洗脱份且在旋转蒸发仪上经浓缩。通过LC/MS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝815.8。
此中间体在TFA(5mL)中经搅拌持续45分钟，接着浓缩且在高真空下干燥。通过LC/MS发现的离子，[(M+2H)/2]+＝615.8。
此TFA盐在0℃下在含有LiOH(27mg，1.11mmol)的(1/1)MeOH/DI水(5mL)中经搅拌持续30分钟。所述混合物用冰乙酸酸化(约pH约5)。通过旋转蒸发移除甲醇且所得残余物通过半制备型HPLC(5％-70％乙腈/水，0.1％TFA，35分钟梯度)经纯化。汇集纯洗脱份且冻干。产量35mg，产率11％，3个步骤。通过LC/MS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝575.8。
实施例121.合成Int-78
Figure BDA0003630331990006531
步骤a.
Figure BDA0003630331990006532
炔丙基-Peg4-酸(640mg，2.46mmol)、二醇-HCl盐(350mg，2.46mmol)、EDC(471mg，2.46mmol)、HOBt(377mg，2.46mmol)及三乙胺(249mg，2.46mmol)在环境温度下在DMF(3mL)中经搅拌持续4小时。所述混合物直接地通过RPLC(0％-80％乙腈/水，无修饰剂，35分钟梯度)经纯化。汇集纯洗脱份且浓缩以提供呈澄清油状物的产物。产量580mg，产率68％。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝348.4。
步骤b.
Figure BDA0003630331990006541
氯甲酸对硝基苯酯(1.23g，1.25mmol)添加至前一步骤的产物(530mg，6.10mmol)及三乙胺(925mg，9.15mmol)于DCM(25mL)中的搅拌溶液中，接着在氮气气氛下冷却至0℃。所述混合物在0℃下经搅拌持续15分钟且接着在室温下经搅拌持续2小时。所述反应用DI水稀释且经萃取至DCM(3×20mL)中。经合并的有机萃取物用盐水洗涤且经硫酸钠干燥。粗残余物通过硅胶色谱法(10％-100％乙酸乙酯/己烷，25分钟梯度)经纯化以提供呈白色固体状的产物。产量250mg，产率24％。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝678.2。
步骤c.
Figure BDA0003630331990006542
乙腈(2mL)中的经胺官能化的扎那米韦(505mg，0.82mmol，描述于实施例118中)及三乙胺(0.15mL，1.11mmol)添加至前一步骤的产物(220mg，0.37mmol)于乙腈(10mL)中的搅拌溶液中，且在环境温度下经搅拌持续4小时。所述反应在旋转蒸发仪上经浓缩。所得残余物通过RPLC(15％-95％乙腈/水，无修饰剂，35分钟梯度)经纯化。汇集纯洗脱份且在旋转蒸发仪上经浓缩。通过LC/MS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝815.2。
此中间体在TFA(5mL)中经搅拌持续45分钟，接着浓缩且在高真空下干燥。通过LC/MS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝615.2。
所得TFA盐在0℃下在含有LiOH(71mg，2.98mmol)的(1/1)MeOH/DI水(5mL)中经搅拌持续30分钟。所述混合物用冰乙酸酸化(约pH约5)。甲醇通过旋转蒸发仪经移除且通过半制备型HPLC(5％-70％乙腈/水，0.1％TFA，35分钟梯度)经纯化。汇集纯洗脱份且冻干。产量125mg，产率29％，3个步骤。通过LC/MS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝575.8。
实施例122.合成Int-4a
Figure BDA0003630331990006551
步骤a.
Figure BDA0003630331990006552
炔丙基-Peg 4-胺(165mg，0.71mmol)添加至扎那米韦的碳酸对硝基苯酯(350mg，0.47mmol，描述于实施例109中)于乙腈(20mL)中的搅拌溶液中。所述反应在环境温度下经搅拌持续1小时，接着通过旋转蒸发仪移除溶剂。所述残余物通过RPLC(10％-95％乙腈/水，无修饰剂，30分钟梯度)经纯化。汇集纯洗脱份且冻干以提供呈白色固体状的经boc保护中间体。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝830.2。
此中间体在环境温度下在TFA(5mL)中经搅拌持续30分钟。通过旋转蒸发仪移除溶剂且残余物通过RPLC(10％-95％乙腈/水，0.1％TFA，30分钟梯度)经纯化。汇集纯洗脱份且冻干以提供呈白色固体状的产物。产量155mg，产率52％，2个步骤。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝630.2。
步骤b.
Figure BDA0003630331990006561
前一步骤的产物(140mg，0.22mmol)在0℃下在含有LiOH(21mg，0.89mmol)的1:3甲醇:水混合物(8mL)中经搅拌持续20分钟。所述混合物用数滴冰乙酸酸化且在旋转蒸发仪上浓缩。粗材料通过半制备型HPLC(5％-95％乙腈/水，0.1％TFA，30分钟梯度)经纯化。汇集纯洗脱份且冻干以提供呈白色固体状的产物。产量60mg，产率45％。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝590.2。
1HNMR(500MHz,甲醇-d4)δ5.86(d,J＝2.6Hz,1H),4.99(dd,J＝9.0,2.7Hz,1H),4.55(dd,J＝9.7,2.7Hz,1H),4.38(dd,J＝8.6,2.6Hz,1H),4.24-4.14(m,1H),4.19(d,J＝2.6Hz,2H),4.02-3.98(m,1H),3.74-3.59(m,13H),3.54(t,J＝5.6Hz,2H),3.52-3.48(m,1H),3.29-3.22(m,2H),2.84(t,J＝2.4Hz,1H),1.96(s,3H)。
13C NMR(126MHz,MeOD)δ172.33,163.68,157.54,156.58,106.80,79.23,75.91,74.56,70.18,70.13,69.96,69.87,69.59,69.51,69.14,68.74,62.98,57.67,51.11,40.54,21.37。
实施例123.合成Int-4b
Figure BDA0003630331990006571
经Peg官能化的中间体(100mg，0.13mmol，描述于实施例122中)在环境温度下在含有LiOH(12mg，0.52mmol)的1:3甲醇:水混合物(5mL)中经搅拌持续2小时。所述混合物用冰乙酸酸化且通过旋转蒸发仪经浓缩。粗材料通过RPLC(5-95％乙腈于DI水中，0.1％TFA，30分钟梯度)经纯化。汇集纯洗脱份且冻干以提供呈白色固体状的产物。产量21mg，产率31％。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝590.2。
1H NMR(甲醇-d4)δ:5.86(d,J＝2.6Hz,1H),4.48(dd,J＝8.6,2.7Hz,1H),4.42(dd,J＝9.6,1.4Hz,1H),4.38(d,J＝12Hz,1H),4.22-4.19(m,1H),4.19(d,J＝2.4Hz,2H),4.16-4.12(dd,J＝11.5,6Hz,1H),4.09-4.02(m,1H),3.75-3.58(m,13H),3.55(t,J＝5.5Hz,2H),3.33-3.29(m,2H),2.84(t,J＝2.4Hz,1H),2.02(s,3H)。
13C NMR(126MHz,MeOD)δ172.94,163.82,157.90,157.53,106.80,79.23,76.18,74.55,70.19,70.13,69.96,69.90,69.61,68.96,68.74,68.17,66.69,57.67,50.11,40.43,21.33。
实施例124.用于合成叠氮基Fc的一般程序
制备DMF/PBS中的PEG4-叠氮基NHS酯溶液(0.050M)：16.75mg的PEG4-叠氮基NHS酯在0℃下溶解于0.100mL DMF中且在0℃下通过添加PBS 1x缓冲液经稀释至0.837mL。使用此溶液，通过调节此PEG4-叠氮基NHS酯PBS溶液的当量数来制备具有多种DAR值的其他PEG4-叠氮基Fc。
编码本文所述的任何缀合物的Fc的核酸构建体可包含编码Fc的氨基酸序列的核酸，所述Fc的氨基酸序列包含C端赖氨酸残基及/或N端鼠科动物IgG信号序列(例如，SEQ IDNO:48-53中任一者)。在表达后，缀合物的Fc的C端赖氨酸及N端鼠科动物IgG信号序列被蛋白水解切割，导致Fc具有缺少Lys447(例如，缺少C端赖氨酸残基)及N端鼠科动物IgG信号序列的序列。C端赖氨酸的存在与否不会改变Fc或对应缀合物的特性。
预处理h-lgG1 Fc，SEQ ID NO:48(107.2mg在8.800mL的pH 7.4PBS中，MW约57891Da，1.852μmol)：所述Fc溶液经转移至四个离心浓缩机(30,000MWCO，15mL)中且用PBSx1缓冲液稀释至15mL且经浓缩至约1.5mL的体积。残余物1:10稀释于PBS pH 7.4中，且再次经浓缩。重复此洗涤程序，共计四次，随后稀释至8.80mL。
制备PEG4-叠氮基Fc：0.050M PEG4-叠氮基NHS酯PBS缓冲溶液(0.593mL，29.6μmol，16当量)经添加到以上的h-IgG1 Fc(SEQ ID NO:48)的溶液中且混合物在环境温度下经振荡旋转持续2小时。所述溶液通过使用四个离心浓缩机(30,000MWCO，15mL)经浓缩至约1.5mL的体积。粗混合物1:10稀释于PBS pH 7.4中，且再次经浓缩。重复此洗涤程序，共计三次。经浓缩Fc-PEG4-叠氮化物用pH 7.4PBS缓冲液稀释至8.80mL且准备用于点击缀合。经纯化材料使用NANODROPTM UV可见光光谱仪(使用基于h-IgG1的氨基酸序列计算的消光系数)经定量。产率是在纯化之后定量的。
实施例125.合成缀合物34
经叠氮基官能化的Fc(40mg，2.5mL，0.69μmol，描述于叠氮基Fc的一般制备中，实施例124，SEQ ID No.18)的溶液添加至含有炔衍生的小分子(6.0mg，8.23μmol，Int-67实施例118)的15mL离心管中。在轻柔地搅拌以溶解所有固体之后，所述混合物添加至L-抗坏血酸钠盐(54mg，0.27mmol)、硫酸铜(II)(0.88mg，5.5μmol)及BTTA(9.4mg，22μmol)于PBS 7.4缓冲液(1.09mL)中的溶液中。所得混合物轻柔地经旋转过夜。其接着相继通过在蛋白A柱上的亲和力色谱法、尺寸排阻色谱法(参见一般缀合物纯化方案)经纯化。经纯化最终产物的Maldi TOF分析给出64,678Da的平均质量(DAR＝7.2)。产量24mg，54％产率。
实施例126.合成缀合物35
经叠氮基官能化的Fc(40mg，2.5mL，0.69μmol，描述于叠氮基Fc的一般制备中，实施例124，SEQ ID No.18)的溶液添加至含有炔衍生的小分子(6.1mg，8.23μmol，Int-68实施例119)的15mL离心管中。在轻柔地搅拌以溶解所有固体之后，所述混合物添加至L-抗坏血酸钠盐(54mg，0.27mmol)、硫酸铜(II)(0.88mg，5.5μmol)及BTTA(9.4mg，22μmol)于PBS 7.4缓冲液(1.09mL)中的溶液中。所得溶液轻柔地经旋转过夜。其接着相继通过在蛋白A柱上的亲和力色谱法、尺寸排阻色谱法(参见一般缀合物纯化方案)经纯化。经纯化最终产物的Maldi TOF分析给出64,830Da的平均质量(DAR＝7.3)。产量23mg，52％产率。
实施例127.合成缀合物36
经叠氮基官能化的Fc(50mg，2.5mL，0.86μmol，描述于叠氮基Fc的一般制备中，实施例124，SEQ ID No.18)的溶液添加至含有炔衍生的小分子(7.1mg，5.2μmol，Int-77，实施例120)的15mL离心管中。在轻柔地搅拌以溶解所有固体之后，所述混合物添加至L-抗坏血酸钠盐(68mg，0.34mmol)、硫酸铜(II)(1.1mg，6.9μmol)及BTTA(12mg，27μmol)于PBS 7.4缓冲液(1.37mL)中的溶液中。所得混合物轻柔地经旋转过夜。其接着相继通过在蛋白A柱上的亲和力色谱法、尺寸排阻色谱法(参见一般缀合物纯化方案)经纯化。经纯化最终产物的Maldi TOF分析给出63,300Da的平均质量(DAR＝3.6)。产量37mg，73％产率。
实施例128.合成缀合物37
经叠氮基官能化的Fc(70mg，2.5mL，1.2μmol，描述于叠氮基Fc的一般制备中，实施例124，SEQ ID No.18)的溶液添加至含有炔衍生的小分子(13.3mg，9.6μmol，Int 78，实施例121)的15mL离心管中。在轻柔地搅拌以溶解所有固体之后，所述混合物添加至L-抗坏血酸钠盐(96mg，0.48mmol)、硫酸铜(II)(1.6mg，10μmol)及BTTA(17mg，38μmol)于PBS 7.4缓冲液(1.92mL)中的溶液中。所得混合物轻柔地振荡过夜。其接着相继通过在蛋白A柱上的亲和力色谱法、尺寸排阻色谱法(参见一般缀合物纯化方案)经纯化。经纯化最终产物的MaldiTOF分析给出63,574Da的平均质量(DAR＝3.6)。产量42mg，61％产率。
实施例129.合成缀合物33
制备点击试剂溶液：PBS缓冲溶液中的0.0050M CuSO4：10.0mg CuSO4溶解在12.53mL PBS中，接着采用5.00mL此CuSO4溶液且添加43.1mg BTTAA(CAS#1334179-85-9)及247.5mg抗坏血酸钠以得到点击试剂溶液(0.0050M CuSO4、0.020M BTTAA及0.25M抗坏血酸钠)。
向叠氮基官能化Fc(104.9mg，8.60mL，18.1μmol，实施例124，SEQ ID NO:73)于15mL离心管中的溶液中添加炔衍生的小分子(29.7mg，19.9μmol，描述于实施例100中，Fc上的每个叠氮基2.5当量)。在轻柔地搅拌以溶解所有固体之后，所述混合物用点击试剂溶液(4.34mL)(L-抗坏血酸钠，0.25M，1086μmol，硫酸铜(II)0.0050M，21.7μmol，及BTTAA0.020M，86.9μmol)处理。所得混合物在环境温度下轻柔地经旋转持续6小时。其相继通过在蛋白A柱上的亲和力色谱法、尺寸排阻色谱法(参见一般缀合物纯化方案)经纯化。经纯化最终产物的Maldi TOF分析给出64550Da的平均质量(DAR＝4.6)。产量90.7mg，具有98％纯度。所得缀合物描绘于图61中。
编码缀合物33的Fc的核酸构建体包含编码SEQ ID NO:64的氨基酸序列(其包含C端赖氨酸残基)的核酸。在表达后，缀合物33的Fc的C端赖氨酸被蛋白水解切割，产生具有SEQ ID NO:73的序列的Fc。C端赖氨酸的存在与否不会改变Fc或对应缀合物的特性。
实施例130.缀合物33在致死性小鼠模型中针对流感B/Brisbane/60/2008的功效
在雌性BALB/c小鼠(Jackson Laboratories，6-8周龄)中针对致死性流感B流感感染评估测试物件。攻击病毒(B/Brisbane/60/2008)是能够在小鼠中引起致死性感染的小鼠适应性分离株。所述实验包含10组，每组5只小鼠。在第0天，所有小鼠均在经异氟烷麻醉之后通过鼻内接种经50μl体积(每只小鼠大约1E5个病毒)的病毒(3x LD95)攻击。
所有组均在病毒攻击后两小时接受缀合物33(实施例129)、媒介物(PBS)或单独Fc对照(hIgG1 Fc)的单一IV治疗。另一组在病毒攻击之后8小时开始用奥司他韦(20mg/kg，bid，持续5天)经口治疗。
所述研究评估缀合物33的7种不同剂量浓度(10、3、1、0.3、0.1、0.03及0.01mg/kg)。监测小鼠持续2周且超过20％体重损失或被发现垂死的动物经评分为死亡。也记录体重以监测所述动物的一般健康状况。
如所预期，经媒介物或单独Fc对照治疗的所有小鼠截至第8天均达到死亡。相比的下，接受缀合物33的所有小鼠在接受自10降至0.3mg/kg的单一IV剂量之后在所述研究的持续时间内完全经保护(表48)。相比的下，经奥司他韦治疗的组仅引起40％生存，尽管这些小鼠在所述实验的过程中所接受的累积剂量为200mg/kg。缀合物33的效能进一步通过每天体重测量值(表49；仅示出组内的第一例死亡之前的数据)支持。经0.3mg/kg的缀合物33治疗的小鼠仅证明单一一天达到7％最大值的短暂体重损失。总之，此研究证明了缀合物33的效能，如通过指示针对Yamagata谱系的流感菌株的流感B感染的两个参数(生存及体重)所测量。
表48：％生存
Figure BDA0003630331990006621
表49：体重(gm)
Figure BDA0003630331990006622
Figure BDA0003630331990006631
实施例131.区域异构体的表征
单体及二聚体中间体可呈特定区域异构体或区域异构体的混合物形式产生。实施例100-102显示如何制备Int-7区域异构体(C7-C7，实施例100；C7-C9，实施例101；C9-C9，实施例102；C7-C7最佳化，实施例103)。其中所述的方法可用于分离本文所述的任何中间体的区域异构体的混合物。表50提供先前所述的预缀合中间体合成中的C7及C9连接单体及C7-C7、C7-C9及C9-C9连接二聚体的相对百分比(％)量的表征。
表50：区域异构体分析
Figure BDA0003630331990006632
实施例132.经皮下给予的缀合物33在致死性小鼠模型中针对流感A/PuertoRico/8/34(H1N1)的功效
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8周)中针对致死性IAVH1N1流感感染评估缀合物33。攻击病毒(A/Puerto Rico/8/1934)是能够在小鼠中引起致死性感染的小鼠适应性分离株。所述实验包含6组，每组5只小鼠。在第0天，所有小鼠均在经氯胺酮/甲苯噻嗪的混合物(分别为150及10mg/kg)麻醉之后通过鼻内接种经30μl体积的病毒(3x LD95)攻击。每天记录死亡率及体重且具有20％体重损失的任何动物均评分为死亡。
测试组在病毒攻击后2小时接受缀合物33、hIgG1 Fc对照或媒介物(PBS)的单一皮下(SC)治疗。研究设计概述于表51中。
表51：针对流感A/PR/8/34(H1N1)研究的研究设计
Figure BDA0003630331990006641
如所预期，接受媒介物或hIgG1 Fc对照的小鼠在第6-7天死于感染(表52)。然而，经1、0.3及0.1mg/kg剂量水平下的缀合物33治疗的小鼠完全经保护。使用缀合物33时的死亡率仅在最低剂量浓度0.03mg/kg下可见。
表52：截至研究日的百分比生存(n＝5)
Figure BDA0003630331990006642
Figure BDA0003630331990006651
缀合物33的效能进一步通过每天体重测量值支持。如所预期，经媒介物或hIgG1Fc治疗的小鼠证明体重持续下降，直至其超过20％，此时其经评分为死亡(表53)。
与对照小鼠形成对比，接受1、0.3及0.1mg/kg的缀合物33的那些组在所述研究中维持健康体重且仅证明少于8％的短暂体重下降(0.1mk/kg剂量组，第8天；表53)。缀合物33的生存及体重测量值两者均证明使用低至0.1mg/kg的单一SC剂量时的稳固保护以抵御流感A/Puerto Rico/8/1934的致死性攻击。
表53：体重数据(gm)
Figure BDA0003630331990006652
Figure BDA0003630331990006661
实施例133.缀合物33针对A/PR/8/1934(H1N1)的功效、肺PFU负荷及细胞因子水平
在鼻内经3E2 PFU/小鼠(3x LD95)的小鼠适应性流感A/PR/8/1934(H1N1)攻击的6-8周雌性BALB/c小鼠(Charles River)中进行缀合物33的功效研究。缀合物33或人IgG1 Fc对照在攻击后2h以0.1-3mg/kg的单一皮下(SC)剂量经施用。奥司他韦经口给药，每天两次，持续4天，在感染后2h以5或50mg/kg开始。巴洛沙韦再悬浮于0.5％甲基纤维素中且经口给药，每天两次，持续4天，在感染后2h以30mg/kg开始(表54)。记录体重(BW)持续4天(图62A-62B)。在感染后4天，通过CO2处死小鼠且收集两片肺叶。肺使用MagNA Lyser(Roche)用1mLPBS中的1mm二氧化硅珠粒均质化。在6,000rpm下进行均质化持续60s且在运行之间在冰上冷冻持续5min。在肺均质化之后，管在600x g下经离心持续10min且上清液经转移至新管中。
表54：研究设计
测试物件(DAR) 途径/时程 剂量[mg/kg]
PBS IV，T+2h N/A
hIgG1Fc IV，T+2h 3
奥司他韦 PO，BIDx4 5
奥司他韦 PO，BIDx4 50
巴洛沙韦 SC，BIDx4 30
缀合物33(4.7) SC，T+2h 0.1
缀合物33(4.7) SC，T+2h 0.3
缀合物33(4.7) SC，T+2h 1
缀合物33(4.7) SC，T+2h 3
未感染 N/A N/A
关于PFU测定，肺均质液的上清液在感染缓冲液中经稀释，介于10-1至10-6范围内。100μL病毒稀释液添加至24孔板中的MDCK细胞的汇合单层中且在室温下经培育持续1h，其中每15min摇动。在移除病毒之后，含有Avicel的液体覆盖培养基添加至MDCK细胞中。细胞在37℃、5％CO2下经培育持续40h。在培育之后，移除培养基且细胞用结晶紫染色以对斑块计数且相对于肺重量计算斑块形成单元(PFU)(PFU/g肺)。
关于细胞因子分析，肺均质液的上清液连续2倍稀释于96孔板中。INF-γ、TNF-α、IL-6、MIP-1α及MCP-1的细胞因子水平通过ELISA根据制造商的说明书(R&D Systems)测定。在小鼠模型中用流感进行致死性攻击之后，在感染后第4天测定肺PFU负荷(图63A-63B)及肺细胞因子水平(分别地，表55及表56)。缀合物33证明了病毒负荷的剂量依赖性log减少，导致在0.1mg/kg下为0.7，在0.3mg/kg下为1.88，在1mg/kg下为3且在3mg/kg下为3.8。5mg/kg及50mg/kg的奥司他韦对病毒负荷具有适度影响，分别导致0.86及2log减少。巴洛沙韦减少病毒负荷至低于检测极限1e2 PFU/mL，由此如与PBS对照相比减少病毒负荷达>5.99对数。
如所预期，在阴性对照PBS与hIgG1 Fc之间未观察到生物相关差异。
缀合物33在小鼠模型中在经流感A攻击的感染后第4天以剂量依赖性方式减少病毒负荷(表55，图64A-64B)。同样，缀合物33在小鼠模型中在经流感A攻击的感染后第4天证明与未受感染对照相比，TNF-α、IL-6、INF-γ、MCP-1及MIP-1α(分别地，图65A-65E)的细胞因子水平的剂量依赖性倍数减少(表56)。
表55：PFU负荷
Figure BDA0003630331990006671
Figure BDA0003630331990006681
*巴洛沙韦减少病毒负荷至低于检测极限。
表56：肺细胞因子水平
Figure BDA0003630331990006682
缀合物33的最高测试浓度3mg/kg证明了在整个感染过程中无重量损失，与未受感染对照小鼠相似(表57)。
表57：体重数据(％减少)
测试物件[mg/kg] 第0天 第1天 第2天 第3天 第4天
PBS[0] 0 -3.5 -2.86 -10.96 -17.32
hIgG1Fc[3] 0 -2.6 -1.3 -9.58 -15.6
奥司他韦[5] 0 -2.86 -2.42 -8.16 -13.88
奥司他韦[50] 0 -3.78 -2.12 -3.22 -5.74
巴洛沙韦[30] 0 -2.38 -2.82 -2.6 -0.18
缀合物33[0.1] 0 -3.24 -2.32 -10.12 -11.46
缀合物33[0.3] 0 -2.16 1.34 -3.4 -4.36
缀合物33[1] 0 -1.5 -0.9 -1.98 -0.9
缀合物33[3] 0 -1.7 -1.6 -1.9 0.52
未感染 0 1.02 -0.14 -0.16 2.8
实施例134.缀合物33在致死性严重复合型免疫缺陷(SCID)小鼠模型中针对流感A(H1N1)的功效。
在雌性BALB/c scid小鼠(Jackson Laboratories，6-8周龄)中针对致死性流感A流感感染评估测试物件。攻击病毒(A/Puerto Rico/8/1934)是能够在小鼠中引起致死性感染的小鼠适应性分离株。所述实验包含11组，每组5只小鼠。在第0天，所有小鼠均在经氯胺酮/甲苯噻嗪的混合物(分别为150及10mg/kg)麻醉之后通过鼻内接种经30μl(大约每只小鼠1E3个病毒)体积的病毒(3x LD95)攻击。
各组在病毒攻击后两小时接受媒介物(PBS)、hIgG1 Fc对照或缀合物33(3、1、0.3、0.1、0.03mg/kg)的单一SC治疗。所述研究的一个独立研究组由3组经巴洛沙韦玛波西酯(DCChemicals,Shanghai,China)经口治疗的小鼠组成，每天两次，持续1天；也在病毒攻击后2小时开始。监测小鼠持续2周且超过20％体重损失或被发现垂死的动物经评分为死亡。
在研究结束时(第14天)，接受缀合物33的小鼠在3与0.1mg/kg之间的所有剂量浓度下均完全经保护(表58)。缀合物33仅在最低测试浓度0.03mg/kg下无法提供保护以抵御致死性病毒攻击。如所预期，接受媒介物或hIgG1 Fc的组未受到保护。经巴洛沙韦治疗的小鼠也受到保护，但在60及20mg/kg的显著较高累积剂量下，在6mg/kg的总剂量下，仅40％小鼠生存至第14天。
表58：第14天的％生存。
Figure BDA0003630331990006691
缀合物33在此严重免疫缺陷模型中的效能基于体重也为显而易见的(表59)。基于死亡率读出提供完全保护的缀合物最低浓度为0.1mg/kg。在此剂量水平下，所述组的最大平均重量损失为短暂的，且导致少于5％减少(发生于第2天)。此外，与未受感染小鼠相比，在1及3mg/kg剂量水平下的组的体重差异在第14天显示少于2％差异。
总之，此数据通过用低至0.1mg/kg的缀合物的单一SC剂量保护经致死性攻击的小鼠证明了缀合物33的效能。此在完全缺乏清除流感感染所必需的T及B免疫细胞的小鼠的严重免疫缺陷模型中实现。此数据支持使用缀合物33来治疗免疫缺陷患者群体。
Figure BDA0003630331990006711
实施例135.经皮下给予的缀合物33在致死性小鼠模型中针对流感A/California/07/2009(H1N1)pdm的功效
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8周)中针对致死性IAVH1N1流感感染评估缀合物33。攻击病毒(A/California/07/2009(H1N1)pdm)是能够在小鼠中引起致死性感染的大流行分离株。所述实验包含6组，每组5只小鼠。在第0天，所有小鼠均在经氯胺酮/甲苯噻嗪的混合物(分别为150及10mg/kg)麻醉之后通过鼻内接种经30μl体积的病毒(3x LD95)攻击。每天记录死亡率及体重且具有20％体重损失的任何动物均评分为死亡。
测试组在病毒攻击后2小时接受缀合物33、hIgG1 Fc对照或媒介物(PBS)的单一皮下(SC)治疗。研究设计及剂量水平概述于表60中。
表60：针对流感A/California/07/2009(H1N1)pdm研究的研究设计
Figure BDA0003630331990006721
如所预期，接受媒介物或hIgG1 Fc对照的小鼠在第6-7天死于感染(表61)。然而，经缀合物33治疗的小鼠在1mg/kg下完全经保护，且在0.3下几乎如此(80％生存)。使用缀合物33时的显著死亡率仅在较低剂量浓度0.1及0.03mg/kg下可见。
表61：截至天数百分比生存。(mg/kg)
Figure BDA0003630331990006731
缀合物33的效能进一步通过每天体重测量值支持。如所预期，经媒介物或hIgG1Fc治疗的小鼠证明体重持续下降，直至其超过20％，此时其经评分为死亡(表62)。
与对照小鼠形成对比，接受1mg/kg的缀合物33的小鼠仅证明大约10％的短暂体重下降，在第3天达到峰值(表62)。缀合物33的生存及体重测量值两者均证明使用经SC施用的单一1mg/kg剂量时的稳固保护以抵御流感A/California/07/2009(H1N1)pdm的致死性攻击。针对此研究中所用的临床相关大流行菌株的活性支持缀合物33在治疗严重流感感染时的效用。
表62：截至天数％平均体重。(mg/kg)。仅示出组内的第一例死亡之前的数据。
Figure BDA0003630331990006732
Figure BDA0003630331990006741
实施例136.经静脉内(IV)给予的缀合物33在延迟治疗的致死性小鼠模型中针对流感A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)的功效。
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8周)中针对致死性流感A(H1N1)感染评估缀合物33。攻击病毒(A/Puerto Rico/8/1934)是能够在小鼠中引起致死性感染的小鼠适应性分离株。在第0天，所有小鼠均在经氯胺酮/甲苯噻嗪的混合物(分别为150及10mg/kg)麻醉之后通过鼻内接种经30μl体积的病毒(3x LD95)攻击。每天记录死亡率及体重且具有20％体重损失的任何动物均评分为死亡。
研究设计详述于表63中，且由多个研究组组成。对照研究组包含媒介物(PBS)及单独hIgG1 Fc组，在病毒攻击之后24小时给药(未受感染组也为此研究组的一部分)。第二研究组由以其人化剂量的4倍给予的奥司他韦组成，其中治疗的起始经延迟持续24、48或72小时。最后3个研究组由以10、3或1mg/kg的单一IV剂量施用的缀合物33组成；各研究组以与以上奥司他韦研究组相同的时程给药。
如所预期，媒介物及hIgG1 Fc当在病毒攻击之后24小时给予时不具保护性且截至第7天导致完全死亡。确定的是，当给药经延迟24小时时，即使人化剂量的4倍的奥司他韦(200mg/kg累积剂量)也仅为部分有效的(表64；40％生存)。然而，缀合物33在相同24小时给药时程时在所有浓度(10、3及1mg/kg)下均为完全保护性的。
当给药经延迟达病毒攻击之后完整48小时时，奥司他韦不再有效(0％生存)，而缀合物33在10及3mg/kg剂量下为80％保护性的。当给药经延迟直至72小时时，仅10mg/kg剂量的缀合物33证明部分保护作用(40％)。缀合物33的功效基于每天体重测量值也为显而易见的(表65)。这在T+24小时组中尤其显著，其中针对任何缀合物33组均观察到少于3％减少，其为短暂的且发生于第1天。在此研究中，缀合物33比用于流感的获批治疗奥司他韦更有效。
表63：研究设计
Figure BDA0003630331990006751
Figure BDA0003630331990006761
实施例137.合成缀合物38(Int-73)、缀合物39(Int-74)、缀合物40(Int-75)及缀合物41(Int-76)
向15-ml无菌离心管中馈入抗坏血酸钠(68.3mg，0.345mmol)、BTTAA(11.9mg，0.0276mmol)、实施例114的产物(Int-73)、实施例115的产物(Int-74)、实施例116的产物(Int-75)或实施例117的产物(Int-76)(0.00953mmol)及PBS 7.4(1ml)。试剂涡旋直至均匀，接着相继与叠氮基Fc(50mg，0.0008624mmol，描述于实施例124中，SEQ ID NO:73)、CuSO4(1.1mg，0.0069mmol)于水(0.5ml)中的溶液混合。所述混合物经旋转持续12小时，接着相继通过蛋白A柱上的亲和力色谱法、尺寸排阻色谱法经纯化。缀合物通过Maldi TOF分析经表征(典型地，DAR＝4.5)。产率典型地为50％。
编码缀合物38-41的Fc的核酸构建体包含编码SEQ ID NO:64的氨基酸序列(其包含C端赖氨酸残基)的核酸。在表达后，缀合物38-41的Fc的C端赖氨酸被蛋白水解切割，产生具有SEQ ID NO:73的序列的Fc。C端赖氨酸的存在与否不会改变Fc或对应缀合物的特性。
实施例138.合成Int-79
Figure BDA0003630331990006781
步骤a.
Figure BDA0003630331990006782
扎那米韦-醚-酸(0.90g，1.43mmol，实施例31)及N-甲基吗啉(0.23mL，2.14mmol)溶解于THF(35mL)中且在氮气气氛下冷却至0℃(冰水浴)。经5分钟时期借助于注射器逐滴添加氯甲酸异丁酯(0.24mL，1.85mmol，于2mL DCM中)。所述混合物在0℃下经搅拌持续30分钟，接着在环境温度下经搅拌持续15min，且接着冷却至0℃。经5分钟逐滴添加硼氢化钠(540mg，14.3mmol，溶解于5mL甲醇中)。所述反应经搅拌持续15分钟，此时所有起始材料均已经消耗(通过LC/MS)。添加数滴(约1mL)冰乙酸以酸化所述混合物(pH约5)。用乙酸乙酯及水稀释且经萃取至乙酸乙酯中(3次)。有机层用盐水洗涤，且有机萃取物经硫酸钠干燥，且在旋转蒸发仪上经浓缩。粗材料通过硅胶色谱法(首先装载于硅藻土上)(DCM中的0-10％甲醇，30min)经纯化。产量0.66g，产率75％。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝617.2。
步骤b.
Figure BDA0003630331990006791
向醇(0.66，1.1mol，于20mL CH2Cl2中)的搅拌混合物中添加三乙胺(0.30mL，1.3mmol)。所述混合物在1大气压的氮气下冷却至0℃(冰水浴)且经5分钟借助于注射器逐滴添加甲磺酰氯(150mg，1.3mmol)。移除冰浴且所述反应经搅拌持续45分钟。所述混合物用饱和碳酸氢钠水溶液稀释，经萃取至DCM中(3次)。经组合的有机萃取物用盐水洗涤，经硫酸钠干燥且在旋转蒸发仪上经浓缩。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝695.2。所述中间体无需纯化即用于下一步骤。
所述扎那米韦甲磺酸盐在80℃下在DMF中与3eq叠氮化钠一起经搅拌持续5小时。所述混合物用水稀释，经萃取至DCM中(3次)。经组合的有机萃取物用盐水洗涤，经硫酸钠干燥且浓缩。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝695.2。所述叠氮化物无需纯化即用于下一步骤。
所述扎那米韦叠氮化物(670mg，1.04mmol)在1个大气压的氢气下在Lindlar催化剂(300mg)存在下在甲醇(20mL)中经搅拌持续12小时。所述混合物经由硅藻土过滤且浓缩以提供呈澄清油状物的标题化合物。所述胺无需纯化即用于下一步骤。产量0.37g，产率54％，3个步骤。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝616.2。
步骤c.
Figure BDA0003630331990006801
3-(苯甲基氨基)丙酸甲酯(1g，5.2mmol)、4-溴丁酸甲酯(1.2g，6.2mmol)及二异丙基乙胺(1.34mL，7.8mmol)在65℃下在DMF(5mL)中经搅拌持续4小时。通过旋转蒸发仪移除大部分溶剂且粗材料通过硅胶色谱法(Isco，DCM中的0至9％甲醇，30分钟梯度)经纯化以提供呈澄清油状物的经苯甲基保护中间体。所述经苯甲基保护中间体在1个大气压的氢气下在20％氢氧化钯/碳(300mg)存在下在甲醇(20mL)中经搅拌持续12小时。所述混合物经由硅藻土过滤且浓缩以提供呈澄清油状物的标题化合物。产量0.72g，产率69％。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝204.2。
步骤d.
Figure BDA0003630331990006802
DMF(2mL)中的步骤-c产物(0.70g，2.16mmol)、炔丙基PEG-4酸(0.63mg，2.38mmol)HATU(1.26g，3.24mmol)在室温下经搅拌，随后添加DIEA(1.15mL，6.49mmol)。所述反应混合物经搅拌持续2小时，接着通过反相液体色谱法(Isco，5至50％乙腈及水，使用0.1％TFA作为修饰剂)经纯化。产量840mg，产率87％。通过LCMS发现的离子，[M+H]+＝446.2。
步骤e.
Figure BDA0003630331990006811
步骤-d产物(840mg，1.85mmol)及LiOH(113.1mg，4.72mmol)于H2O:MeOH(1:2，9mL)中的溶液在室温下经搅拌持续2小时。接着，所述溶液用TFA酸化。所得溶液经浓缩，接着通过反相液体色谱法(Isco，0％至20％乙腈及水)经纯化。产量454.5mg，产率59％。通过LCMS发现的离子，[M+H]+＝418.2。
步骤f.
Figure BDA0003630331990006812
在室温下向步骤-b产物(334.7mg，0.52mmol)、步骤-e产物(102mg，0.24mmol)及HATU(273.25mg，0.704mmol)于无水DMF(3mL)中的溶液中添加DIEA(217mg，16.4mmol)。所得混合物经搅拌持续1小时，接着通过RPLC(20％至100％甲醇及水，不使用修饰剂)经纯化。产量206.5mg，产率55％。通过LCMS发现的离子，[(M+2H)/2]+＝806.8。
步骤g.
Figure BDA0003630331990006821
CH2Cl2(5mL)中的步骤-f产物(206.5mg，0.128mmol)及TFA(3mL)在室温下经搅拌过夜，接着在减压下浓缩。所得残余物通过半制备型HPLC(0％至30％乙腈/水，使用0.1％TFA作为修饰剂)经纯化。产量144.5mg，产率69％。通过LCMS发现的离子，[(M+2H)/2]+＝606.8。
步骤h.
Figure BDA0003630331990006822
向步骤-g产物(144.5mg，0.119mmol)于MeOH(9mL)及水(3mL)中的溶液中添加LiOH(18mg，0.75mmol)。所得溶液在室温下经搅拌持续1小时，接着用TFA酸化且在减压下浓缩。残余物通过半制备型HPLC(0％至25％乙腈及水，使用0.1％TFA作为修饰剂)经纯化。产量45mg，产率28％。通过LCMS发现的离子，[(M+2H)/2]+＝566.8。
实施例139.合成缀合物42
叠氮基官能化Fc(50mg，5.4mL，0.859μmol，实施例124，SEQ ID NO:18)的溶液添加至含有炔衍生的小分子(7.87mg，0.057mmol，实施例138)的10mL离心管中。在轻柔地振荡以溶解所有固体之后，所述混合物添加至3mL L-抗坏血酸钠(0.68mg，0.34mmol，0.25M)、硫酸铜(II)(1.1mg，0.0069mmol，0.005M)及BTTAA(11.8mg，0.027mmol，0.02M)于PBS 7.4缓冲液中的预混合溶液中。所得溶液轻柔地经旋转过夜。其相继通过在蛋白A柱上的亲和力色谱法、尺寸排阻色谱法(参见一般缀合物纯化方案)经纯化。经纯化最终产物的Maldi TOF分析给出63623Da的平均质量(DAR 3.8)。产量36.01mg，产率72％。
实施例140.合成Int-80
Figure BDA0003630331990006831
步骤a.
Figure BDA0003630331990006832
向扎那米韦的碳酸对硝基苯酯(0.3g，0.4mmol，实施例103)于无水二氯甲烷(5ml)中的溶液中添加无水DMF(5ml)中的炔丙基-PEG4-甲胺(0.11g，0.44mmol)及DIPEA(0.14ml，1.0mmol)。所述反应在室温下经搅拌过夜，接着浓缩且通过用0％至10％甲醇/二氯甲烷洗脱的快速色谱法经纯化。产量0.28g，产率81％。通过LCMS发现的离子：(M+H)+＝858.4,(M-Boc)+H+＝758.4。
步骤b.
Figure BDA0003630331990006841
前一步骤的产物(280mg，0.2mmol)溶解于2ml MeOH及2ml THF中，接着用氢氧化锂(24mg，1mmol)溶解于2ml水中的溶液处理。所述反应在室温下经搅拌持续10min，此时HPLC显示反应完成。反应的pH通过使用Amberlite IRN-77离子交换树脂经调节至5至6的值，接着过滤以移除所述树脂。粗滤液在真空下蒸发至干且无需纯化即用于下一步骤，且产率为定量的。通过LCMS发现的离子：(M+H)+＝844.4,(M-Boc+H)+＝744.4。
步骤c.
Figure BDA0003630331990006842
步骤-b产物溶解于2ml二氯甲烷及2ml TFA中，且在室温下经搅拌。通过LCMS监测反应的进展。在反应完成之后(6h)，所述溶液经汽提至干且接着溶解于2ml水及2ml乙腈中。所得溶液在室温下再搅拌持续2小时，此时LCMS显示丙酮化合物保护基的完全保护基脱除。此混合物经浓缩且通过反相液体色谱法(RPLC)使用以5％至40％乙腈/水洗脱的Isco
Figure BDA0003630331990006843
液体色谱仪使用0.1％TFA作为修饰剂经纯化。产量180mg，产率78.0％。通过LCMS发现的离子：(M+H)+＝604.2。
实施例141.与Int-4相比关于Int-80的稳定性数据
Int-80(实施例140)及Int-4(实施例13)以10mg/mL溶解于去离子水中且接着1:10稀释于1X PBS中至1mg/mL的最终浓度。样品在37℃或60℃下经培育持续1周。25μL等分试样经稀释于75μL水中以用于HPLC分析。使用具有Phenomenex Biozen PS-C18柱(150x2.1mm，1.6um)的Waters Acquity H-Class UPLC，按如下方式运行水中的0.1％甲酸至乙腈中的0.1％甲酸的梯度：5％B持续0-1min，5-20％B持续1-20min。使用二极管阵列检测器在240nm下进行检测。Int-80在60℃下在一周内具有少于1％降解，而Int-4在相同时间段内显示15％降解(图66)。
实施例142.合成缀合物43
制备点击试剂溶液：PBS x1缓冲溶液中的0.0050M CuSO4：10.0mg CuSO4溶解于12.53mL PBS x1中，接着采用10.00mL此CuSO4溶液且添加86.1mg BTTAA及495.3mg抗坏血酸Na以生成点击试剂溶液(0.0050M CuSO4、0.020M BTTAA及0.25M抗坏血酸钠)。
叠氮基官能化Fc(78.0mg，4.535mL，1.35μmol，实施例124，SEQ ID NO:73)的溶液添加至含有炔衍生的小分子(13.2mg，8.88μmol，Int-80，实施例140)的15mL离心管中。在轻柔地振荡以溶解所有固体之后，向所述混合物中添加2.153mL上述点击试剂溶液(L-抗坏血酸钠，0.25M，106.6mg，0.538mmol，硫酸铜(II)0.0050M，1.72mg，0.0107mmol及BTTAA0.020M，18.5mg，0.0431mmol)。所得混合物在环境温度下轻柔地经旋转持续6小时。其相继通过在蛋白A柱上的亲和力色谱法、尺寸排阻色谱法(参见缀合物纯化方案)经纯化。经纯化最终产物的Maldi TOF分析给出64,012Da的平均质量(DAR＝7.0)。产量50.3mg，62％产率。
编码缀合物43的Fc的核酸构建体包含编码SEQ ID NO:64的氨基酸序列(其包含C端赖氨酸残基)的核酸。在表达后，缀合物43的Fc的C端赖氨酸被蛋白水解切割，产生具有SEQ ID NO:73的序列的Fc。C端赖氨酸的存在与否不会改变Fc或对应缀合物的特性。
实施例143.合成Int-81
Figure BDA0003630331990006861
步骤a.
Figure BDA0003630331990006862
经15分钟向用冰水浴冷却的N-Boc-N-Me-甘氨醇(glycinol)(3.5g，20mmol)于DMSO(20mL)中的充分搅拌溶液中相继添加烯丙基溴(3.6g，30.0mmol)、经精细研磨KOH粉末(3.5g，30.0mmol)。所得溶液在室温下经搅拌过夜。所得混合物分配于5％aq.HOAc(50mL)与乙酸乙酯(200ml)之间。分离有机层，用盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤，且浓缩，接着通过用10％至80％乙酸乙酯/己烷洗脱的快速色谱法经纯化。产物的产量4.1g，产率95％。通过LCMS发现的离子：M+H＝216.3。
步骤b.
Figure BDA0003630331990006863
臭氧在-78℃下鼓泡通过步骤a的化合物(8.0g，37mmol)于MeOH(50mL)及DCM(50ml)中的溶液，直至出现淡蓝色。未反应的臭氧通过用氧气鼓泡持续10分钟经移除，接着经10分钟分成小份添加NaBH4(1.6g，40mmol)。在所有NaBH4经添加之后，所述混合物逐渐地加温至室温。所得溶液分配于乙酸乙酯(100ml)与盐水(50ml)之间。分离有机层，用盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤，浓缩为油状物，且接着通过用10％至80％乙酸乙酯/二氯甲烷洗脱的快速色谱法经纯化。产物的产量5.0g，产率62％。通过LCMS发现的离子：M+H＝220.2。
步骤c.
Figure BDA0003630331990006871
在0℃下经15分钟缓慢地向前一步骤的产物(4.4g，20mmol)及CBr4(10.0g，30.0mmol)于DCM(50mL)中的溶液中添加PPh3(8.0g，30mmol)(放热)。在添加过程期间，内部温度保持在30℃以下。添加PPh3之后，所述反应在室温下经搅拌过夜。粗反应物经浓缩为油状物，接着通过正相色谱法用10％乙酸乙酯/己烷至80％乙酸乙酯/己烷洗脱经纯化。收集管内部含有油小液滴的洗脱份经组合且浓缩为无色油状物。4.0g，70.5％。通过LCMS发现的离子：M+H＝282.1。
步骤d.
Figure BDA0003630331990006872
步骤c产物(4g，14mmol)、苯甲胺(0.60g，5.7mmol)及K2CO3(2.35g，17mmol)于DMF(20mL)中的溶液在75℃油浴中加热持续8h。过滤所述混合物，浓缩，且通过RPLC(5％ACN/水至100％ACN)经纯化。产量2.1g，产率72.7％。
步骤e.
Figure BDA0003630331990006881
向步骤-d产物(1.3g，2.0mmol)溶解于CHCl3/EtOH(1:20，20mL)中的溶液中添加20％Pd(OH)2/C(0.50g)。所述反应在环境温度下在来自气球的氢气下经搅拌过夜。所述反应混合物经由硅藻土垫过滤，接着借助于旋转蒸发仪经浓缩且无需进一步纯化继续用于后续步骤。
步骤f.
Figure BDA0003630331990006882
步骤-e产物溶解于10mL DMF中，接着在室温下用炔丙基PEG4酸(0.52g，2.0mmol)、EDCI(0.6g，3.0mmol)、HOAt(0.45g，3mol)及胡尼西氏碱(0.7mL，5.0mmol)处理。所述反应混合物经过滤持续四小时，接着浓缩且通过RPLC(10％ACN/水至60％ACN/水)经纯化。两个步骤的产量0.43g，产率65％。通过LCMS发现的离子：[M-Boc+H]+＝562.4,[M+H]+＝662.4。
步骤g.
Figure BDA0003630331990006883
步骤-d产物(70mg，0.1mmol)在室温下用TFA(2mL)处理持续2小时。TFA通过旋转蒸发经移除，且剩余油状物进一步在高真空下干燥持续12h以生成呈双-TFA盐形式的所需产物。产率为定量的。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝462.4。
步骤h.
Figure BDA0003630331990006891
向描述于实施例109中的碳酸硝基苯酯(0.72g，0.95mmol)于无水DMF(5ml)中的溶液中添加步骤g二胺(0.3g，0.43mmol，经30分钟分成数份添加)及DIPEA(0.28ml，2mmol)于无水DMF(20ml)中的混合物。所述反应在室温下经搅拌过夜，接着浓缩且通过用0％至10％甲醇/二氯甲烷洗脱的快速色谱法经纯化。产量0.63g，产率86％。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝844.4,[(M-Boc+2H)/2]+＝794.4,[(M-2Boc+2H)/2]+＝744.4。
步骤i.
Figure BDA0003630331990006892
前一步骤的产物(600mg，0.35mmol)溶解于5ml MeOH及5ml THF中，接着用氢氧化锂(48mg，2mmol)溶解于2ml水中的溶液处理。所述反应在室温下经搅拌持续10min，此时HPLC显示反应完成。所述反应溶液的pH通过使用Amberlite IRN-77离子交换树脂经调节至5至6的值，接着过滤以移除所述树脂。粗产物通过旋转蒸发经蒸发至干且无需纯化即用于下一步骤。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝829.9,[(M-Boc+2H)/2]+＝779.4,[(M-2Boc+2H)/2]+＝729.4。
步骤j.
Figure BDA0003630331990006901
步骤-i产物溶解于5ml二氯甲烷及5ml TFA中，且在室温下经搅拌。通过LCMS监测反应的进展。在反应完成之后(6h)，所述溶液经汽提至干且接着溶解于4ml水及4ml甲醇中。所得溶液在室温下再搅拌持续2小时，此时LCMS显示丙酮化合物保护基的完全保护基脱除。此混合物经浓缩且通过反相液体色谱法(RPLC)使用以5％至40％乙腈/水洗脱的IscoCombiFlash液体色谱仪使用0.1％TFA作为修饰剂经纯化。产量380mg，产率71.0％。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝589.8,[(M+3H)/3]+＝392.5。
实施例144.合成Int-82
Figure BDA0003630331990006911
类似于实施例143Int-81制备标题化合物，其中步骤a中的N-Boc-N-Me-甘氨醇经N-Boc-N-乙基-甘氨醇取代。通过LCMS发现的离子：[M/2]+1＝603.8,[M/3]+1＝402.9。
实施例145.合成Int-83
Figure BDA0003630331990006912
步骤a.
Figure BDA0003630331990006913
经CBZ保护的氨基-peg1-溴化物(7.6g，25.2mmol)、苯甲胺(1.1g，10.1mmol)及碳酸钾(2.8g，2.8mmol)在60℃下在DMF(10mL)中经搅拌持续12小时。所述溶液在旋转蒸发仪上经浓缩且通过硅胶色谱法(DCM中的0-10％甲醇，30分钟梯度)经纯化以提供呈澄清粘性油状物的产物。产量3.2克，产率57％。通过LC/MS发现的离子，[M+H]+＝550.2。
步骤b.
Figure BDA0003630331990006921
步骤a产物(1.9g，3.5mmol)溶解于THF(20mL)中且在氮气气氛下借助于冰/水浴冷却至0℃。经10分钟时期借助于注射器逐滴添加LAH(6.9ml，13.8mmol，2M于THF中)。所述混合物在回流下经搅拌持续2小时，接着借助于冰/水浴冷却至0℃。逐滴添加1mL水，随后逐滴添加1mL NaOH水溶液(15重量％)。添加3mL水且所述混合物经搅拌持续15分钟，此时添加2g硫酸镁。所述混合物经搅拌持续10分钟，接着经由硅藻土过滤，用额外2个10ml THF部分洗涤且经组合的滤液通过旋转蒸发仪经浓缩。残余物溶解于乙腈(20mL)中，添加三乙胺(1.4g，13.8mmol)及boc酐(3.0g，13.8mmol)。所述混合物经搅拌持续45分钟，浓缩且通过反相HPLC(5-95％乙腈/去离子水，0.1％TFA修饰剂，30分钟梯度)经纯化。产量1.4g，产率79％。通过LC/MS发现的离子，[M+H]+＝510.2。
步骤c.
Figure BDA0003630331990006922
此实施例的步骤b.产物(1g，1.9mmol)在1个大气压的氢气下在氢氧化钯(200mg)存在下在甲醇(25mL)中经搅拌持续2小时。所述混合物经由硅藻土过滤且浓缩以提供呈澄清油状物的产物，其无需进一步纯化即使用。产量0.73g，产率89％。通过LC/MS发现的离子，[M+H]+＝420.4。
步骤d.
Figure BDA0003630331990006931
步骤c产物(0.73g，1.7mmol)、炔丙基-peg4-甲苯磺酸盐(0.91g，2.4mmol)及二异丙基乙胺(0.76g，5.9mmol)在85℃下在DMF(5mL)中经搅拌持续4小时。所述混合物在旋转蒸发仪上经浓缩，接着通过反相HPLC(5-95％乙腈/DI水，0.1％TFA修饰剂，30分钟梯度)经纯化以提供呈澄清粘性油状物的产物。产量0.89g，产率82％。通过LC/MS发现的离子，[M+H]+＝634.4。
步骤e.
Figure BDA0003630331990006932
步骤d.产物(0.89g，1.4mmol)在环境温度下在4N HCl(于二恶烷中)中经搅拌持续45分钟。所述混合物在旋转蒸发仪上经浓缩且与苯共沸(3次)。所得残余物溶解于DI水(15mL)中，经冷冻且冻干以提供呈澄清油状物的产物双-HCl盐。产量0.65g，产率91％。通过LC/MS发现的离子，[M+H}+＝434.4。
步骤f.
Figure BDA0003630331990006941
此化合物的合成中的剩余四个步骤类似于实施例143Int-81的合成中所用的那些步骤。通过LCMS发现的离子：(M+2H)/2＝575.8。
实施例146a.Int-83的替代合成I
Figure BDA0003630331990006942
描述于实施例145中的产物Int-83可替代地使用本专利中所述的方法由本领域技术人员使用以上反应流程来制备。
实施例146b.Int-83的替代合成II
描述于实施例145中的产物Int-83可替代地使用本专利中所述的方法由本领域技术人员使用以下述反应流程来制备。
Figure BDA0003630331990006951
合成a.
Figure BDA0003630331990006952
经15分钟向用冰水浴冷却的N-Boc-N-Me-甘氨醇(3.5g，20mmol)于DMSO(20mL)中的充分搅拌溶液中相继添加烯丙基溴(3.6g，30.0mmol)、经精细研磨KOH粉末(3.5g，30.0mmol)。将所得溶液在室温下搅拌过夜。所得混合物分配于5％aq.HOAc(50mL)与乙酸乙酯(200ml)之间。分离有机层，用盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤，且浓缩，接着通过用10％至80％乙酸乙酯/己烷洗脱的快速色谱法经纯化。产物的产量4.1g，产率95％。通过LCMS发现的离子：M+H＝216.3。
合成b.
Figure BDA0003630331990006961
臭氧在-78℃下鼓泡通过a(8.0g，37mmol)于MeOH(50mL)及DCM(50ml)中的溶液，直至出现淡蓝色。未反应的臭氧通过用氧气鼓泡持续10分钟经移除，接着经10分钟分成小份添加NaBH4(1.6g，40mmol)。在所有NaBH4经添加之后，所述混合物逐渐地加温至室温。所得溶液分配于乙酸乙酯(100ml)与盐水(50ml)之间。分离有机层，用盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤，浓缩为油状物，且接着通过用10％至80％乙酸乙酯/二氯甲烷洗脱的快速色谱法经纯化。产物的产量5.0g，产率62％。通过LCMS发现的离子：M+H＝220.2。
合成c.
Figure BDA0003630331990006962
经15分钟缓慢地向在冰浴中冷却的b(4.4g，20mmol)及CBr4(10.0g，30.0mmol)于DCM(50mL)中的溶液中添加PPh3(8.0g，30mmol)(放热)。在添加过程期间，内部温度保持在30℃以下。添加PPh3之后，所述反应在室温下经搅拌过夜。粗反应物经浓缩为油状物，接着通过正相色谱法用10％乙酸乙酯/己烷至80％乙酸乙酯/己烷洗脱经纯化。收集管内部含有油小液滴的洗脱份通过LCMS核查，接着经组合且浓缩为无色油状物。4.0g，70.5％。通过LCMS发现的离子：M+H＝282.1。
合成d.
Figure BDA0003630331990006971
c(4.4g，15.5mmol)、炔丙基-PEG4-胺(1.5g，6.4mmol)及DIPEA(3.3g，25.8mmol)于DMF(20mL)中的溶液在75℃油浴中加热持续18h。过滤所述混合物，浓缩，且通过RPLC(5％ACN/水至100％ACN)经纯化。产量3.85g，产率92％。LC/MS：[M+H]＝634.2。
合成e.
Figure BDA0003630331990006972
产物d(3.85，6.1mmol)在室温下用HCl(4N于二恶烷中，15mL)处理持续2小时。通过旋转蒸发移除溶剂，且剩余油状物溶解于去离子水(20mL)中，经冷冻，且冻干以提供呈浅黄色清油状物的产物。产率为定量的。通过LCMS发现的离子：[M+H]+＝434.2。
合成f.
Figure BDA0003630331990006973
经1小时分成数份向f(0.68g，1.34mmol)及DIPEA(0.87g，6.7mmol)溶解于无水DMF(5ml)中的溶液中添加f(2.1g，2.8mmol)。所述反应在室温下经搅拌过夜，接着浓缩且通过用0％至10％甲醇/二氯甲烷洗脱的快速色谱法经纯化。产量1.45g，产率67％。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝829.8。
合成g.
Figure BDA0003630331990006981
产物f(1.45g，0.87mmol)溶解于在3ml MeOH中，接着用氢氧化锂(90mg，3.8mmol)溶解于去离子水(6mL)中的溶液处理。所述反应在室温下经搅拌持续15分钟，此时LCMS显示反应完成。所述反应溶液的pH通过使用Amberlite IRN-77离子交换树脂经调节至5至6的值，接着过滤以移除所述树脂。滤液通过旋转蒸发经浓缩至干，且无需进一步纯化即用于下一步骤。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝815.9。
水解产物溶解于二氯甲烷(5mL)及TFA(10mL)中，且在室温下经搅拌。通过LCMS监测反应的进展。完全移除Boc之后(约4小时)，所述溶液用旋转蒸发仪浓缩至干，且接着溶解于8ml水中。所得溶液在室温下再搅拌持续2小时，此时LCMS显示丙酮化合物保护基的完全移除。此混合物经浓缩且通过反相液体色谱法(RPLC)使用以5％至40％乙腈/水洗脱的Isco
Figure BDA0003630331990006982
液体色谱仪使用0.1％TFA作为修饰剂经纯化。三个步骤的产量780mg，产率65.0％。通过LCMS发现的离子：[(M+2H)/2]+＝575.8,[(M+3H)/3]+＝384.8。
实施例147.用于选择抗性流感病毒的连续传代实验
为了评估在病毒抑制剂的选择性压力下开发耐药性突变型病毒菌株的潜力，相对奥司他韦及巴洛沙韦比较物，用缀合物6及33进行连续传代研究。连续传代研究使用A549或MDCK细胞来进行。如下进行传代：每孔(12-孔)150,000个A549或MDCK细胞接种于500μlDMEM 10％FBS、1％PS、1％NaPyr及1％HEPES中且经培育持续大约24小时。一旦细胞达到大约80％汇合，其用PBS洗涤一次且在正常培养条件下在化合物或单独PBS存在下经培育持续2小时。如最大病毒抑制所需最佳化测试物件浓度，同时维持充足病毒产生以用于后续传代。连续传代实验中所用的测试物件浓度显示于图67及68中。细胞接着在室温下在含有PBS、牛白蛋白35％及Ca2+/Mg2+的缓冲液中以MOI 0.01或0.05(分别地，MDCK及A549细胞；150μl稀释于感染缓冲液中)受感染1小时，随后移除接种物且用DMEM 1％PS、1％NaPyr及1％HEPES(无FBS)洗涤细胞一次。细胞接着在稀释于DMEM 1％PS、1％NaPyr、1％HEPES及1μg/ml经TPCK处理的胰蛋白酶中的测试物件存在下经培育持续24小时。在培育之后，收集病毒上清液，且通过离心(5min，4℃，1,400xg)移除细胞及碎片。接着上清液用于：
i通过斑块分析定量病毒滴定
ii进行血细胞凝集分析以确定所述病毒是否逃逸化合物抑制
iii在化合物存在下再感染新鲜接种的A549或MDCK细胞。
重复所述过程持续10个传代，或直至关于奥司他韦及巴洛沙韦对照观察到抗性。一旦在两个连续传代中检测到在药物存在下增加的滴定，所述病毒即可被斑块纯化。在斑块纯化之后，所有8个基因组区段可被测序且与经PBS治疗的对照病毒相比以检测逃逸突变。两个不同连续传代实验的概述显示于图67及68中。在图67中概述的实验中，使用经A/California/04/09/H1N1 pdm感染的A549细胞比较缀合物6与奥司他韦及巴洛沙韦。缀合物6、巴洛沙韦及奥司他韦分别以0.5nM、0.5nM及200nM使用。在11次传代的过程中，关于缀合物6未观察到病毒滴定的增加(表明未出现抗性突变体)，而巴洛沙韦及奥司他韦滴定分别在第5次及第11次传代之后增加至类似于PBS对照中所观察到的那些水平的水平。在图68中概述的实验中，使用经A/WSN/1933H1N1感染的MDCK细胞比较缀合物6及33与奥司他韦及巴洛沙韦。缀合物6、缀合物33、巴洛沙韦及奥司他韦分别以4nM、2nM、4nM及50nM使用。在10次传代的过程中，关于缀合物6或33未观察到病毒滴定的增加(表明未出现抗性突变体)，而巴洛沙韦及奥司他韦滴定分别在第5次及第10次传代之后增加至类似于PBS对照中所观察到的那些水平的水平。
实施例148.合成缀合物6a
类似于缀合物6(实施例20)使用Int-7a(实施例100)制备标题缀合物。经纯化最终产物的Maldi TOF分析给出62063.Da的平均质量(DAR＝2.7)。产量175.4mg，50％产率。
实施例149.合成缀合物6b
类似于缀合物6(实施例20)使用Int-7b(实施例101)制备标题缀合物。经纯化最终产物的Maldi TOF分析给出62063.Da的平均质量(DAR＝2.8)。产量175.4mg，50％产率。
实施例150.合成缀合物6c
类似于缀合物6(实施例20)使用Int-7c(实施例102)制备标题缀合物。经纯化最终产物的Maldi TOF分析给出62782.Da的平均质量(DAR＝3.2)。产量175.4mg，50％产率。
实施例151.合成缀合物44
类似于实施例80(缀合物20)通过PEG4-叠氮基-Fc(SEQ ID NO:73，如实施例124中所制备)及Int-22(实施例79)制备此缀合物。经纯化最终产物的Maldi TOF分析给出62,882Da的平均质量(DAR＝5.6)。
编码缀合物44的Fc的核酸构建体包含编码SEQ ID NO:64的氨基酸序列(其包含C端赖氨酸残基)的核酸。在表达后，缀合物44的Fc的C端赖氨酸被蛋白水解切割，产生具有SEQ ID NO:73的序列的Fc。C端赖氨酸的存在与否不会改变Fc或对应缀合物的特性。
实施例152.抗体依赖性细胞毒性分析
测试了缀合物6及缀合物33的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。单层MDCK细胞以MOI0.001-10经流感A或流感B菌株感染，且在37℃下于5％CO2中经培育持续18-24h。ADCC根据制造商的说明用商业报告细胞系(PROMEGA)测定。简而言之，测试物件以介于1至10,000nM范围内的浓度添加至适当的孔中，且在37℃下于5％CO2中经培育持续15m。ADCC通过读取发光经定量。针对流感A/PR/8/1934(H1N1)测试缀合物6，显示ADCC的MOI依赖性增加(图69)，且MOI为1时ADCC的剂量依赖性增加(图70)。针对流感A/PR/8/1934(H1N1)、流感A/CA/07/2009(H1N1)及流感A/HK/1/1968(H3N2)(图71A-71C)以及流感B/Malaysia/2506/2004(Victoria，图72)测试缀合物33，显示缀合物33的ADCC的MOI依赖性增加。缀合物33在MOI为1(图73A)及MOI为10(图73B)时也显示针对流感A/PR/8/1934(H1N1)的ADCC的剂量依赖性增加。单克隆抗体格迪伏单抗(Genentech)用作阳性对照，以比较全长抗体的受体结合与Fc缀合物的受体结合。格迪伏单抗还显示当针对流感A/PR/8/1934(H1N1，图74)进行测试时ADCC的MOI依赖性增加，及在MOI为1(图75A)及MOI为10(图75B)时针对流感A/PR/8/1934(H1N1)的ADCC的剂量依赖性增加。
实施例153.抗体依赖性细胞吞噬作用分析
测试缀合物6及缀合物33的细胞吞噬作用。单层MDCK细胞以MOI 0.001-10经流感A或流感B菌株感染，且在37℃下于5％CO2中经培育持续18-24h。ADCP根据制造商的说明用商业报告细胞系(PROMEGA)测定。简而言之，测试物件以介于1至10,000nM范围内的浓度添加至适当的孔中，且在37℃下于5％CO2中经培育持续15m。ADCP通过读取发光经定量。针对流感A/PR/8/1934(H1N1)测试缀合物6，显示ADCP的MOI依赖性增加(图76)，及在MOI为1(图77A)及MOI为10(图77B)时ADCP的剂量依赖性增加。针对流感A/PR/8/1934(H1N1)、流感A/CA/07/2009(H1N1)及流感A/HK/1/1968(H3N2)(分别地，图78A-78C)以及流感B/Malaysia/2506/2004(Victoria，图79)测试缀合物33，显示缀合物33的ADCP的MOI依赖性增加。缀合物33在MOI为1(图80A)及MOI为10(图80B)时也显示针对流感A/PR/8/1934(H1N1)的ADCP的剂量依赖性增加。格迪伏单抗(Genentech)用作阳性对照，以比较全长抗体的受体结合与Fc缀合物的受体结合。格迪伏单抗还显示当针对流感A/PR/8/1934(H1N1，图81)进行测试时ADCP的MOI依赖性增加，及在MOI为1(图82A)及MOI为10(图82B)时针对流感A/PR/8/1934(H1N1)的ADCP的剂量依赖性增加。
实施例154.对于活流感A病毒或神经氨酸酶抗性突变体的裂解物的神经氨酸酶抑制
神经氨酸酶抑制(NAI)。测试物件在37℃下于5％CO2中用神经氨酸酶(SinoBiological)或用活病毒培育持续20min。2'-(4-甲基伞形酮基)-α-D-N乙酰神经氨酸底物添加至适当的孔中且在37℃、5％CO2下经培育持续1h。NAI通过读取355nm处激发/460nm处发射荧光来测定。测定了神经氨酸酶抗性突变体及活流感病毒的神经氨酸酶抑制(表66、表67、表68及表69)。
Figure BDA0003630331990007031
Figure BDA0003630331990007041
表68：针对H3N2 WT、E119V突变体或活流感A/Ca/07/2009的神经氨酸酶抑制
Figure BDA0003630331990007051
表69：NA裂解物反应的神经氨酸酶抑制分析[nM]
Figure BDA0003630331990007052
实施例155.细胞病变效应分析
为了测量缀合物6及缀合物33保护哺乳动物细胞以抵御流感病毒感染及破坏的能力，如实施例25中所讨论进行基于细胞病变效应(CPE)的微量中和分析，稍作改变。简而言之，单层MDCK细胞以0.001-1之间变化的适当MOI经流感A或B菌株感染。测试物件以介于0.1-10,000nM之间范围的浓度添加且在37℃、5％CO2下经培育3天(流感A)或5天(流感B)。CPE通过结晶紫染色通过读取595nm处的吸光度来测定。结果显示于下表70、表71、表72及表73中。
表70：针对流感A/PR/8/1934(H1N1)的CPE
Figure BDA0003630331990007061
表71：针对流感A/Ca/07/2009(H1N1)pdm的CPE
Figure BDA0003630331990007062
表72：针对流感A/WSN/1933的CPE(t＝-1h)
Figure BDA0003630331990007071
表73.针对流感B的CPE(t＝-1h)
Figure BDA0003630331990007072
实施例156.合成缀合物45
缀合物45类似于缀合物33(实施例129)使用PEG4-叠氮基-Fc(SEQ ID NO:72(缀合物45a)或SEQ ID NO:73(缀合物45b)，如实施例124中所制备)及Int-83(实施例145)来制备。经纯化缀合物45b制剂的Maldi TOF分析给出62,927Da的平均质量(DAR＝4.2)。本文还描述了具有不同DAR的缀合物45a的制剂(实施例199)。在使用术语缀合物45时，不应认为其限于任何特定DAR。所得缀合物描绘于图102中。
如本文所用，术语缀合物45意在涵盖缀合物45a及缀合物45b两者。申请人指出SEQID NO:72(缀合物45a)及SEQ ID NO:73(缀合物45b)仅分别在Fc同种异型、G1m(f)及G1m(fa)中有所不同。预期不同的同种异型在本文描述的特性方面表现相同。
编码缀合物45a的Fc的核酸构建体包含编码SEQ ID NO:63的氨基酸序列(其包含C端赖氨酸残基)的核酸。在表达后，缀合物45a的Fc的C端赖氨酸被蛋白水解切割，产生具有SEQ ID NO:72的序列的Fc。同样地，编码缀合物45b的Fc的核酸构建体包含编码SEQ ID NO:64的氨基酸序列的核酸，然而所得Fc具有SEQ ID NO：73的序列。C端赖氨酸的存在与否不会改变Fc或对应缀合物的特性。
实施例157.缀合物45b在致死性严重复合型免疫缺陷(SCID)小鼠模型中针对流感A(H1N1)的功效。
在雌性BALB/c scid小鼠(Jackson Laboratories，6-8周龄)中针对致死性流感A流感感染评估测试物件。攻击病毒(A/Puerto Rico/8/1934)是能够在小鼠中引起致死性感染的小鼠适应性分离株。所述实验包含10组，每组5只小鼠。在第0天，所有小鼠均在经氯胺酮/甲苯噻嗪的混合物(分别为150及10mg/kg)麻醉之后通过鼻内接种经30μl(大约每只小鼠1E3个病毒)体积的病毒(3x LD95)攻击。
各组在病毒攻击后两小时接受媒介物(PBS)、hIgG1 Fc对照或缀合物45b的单一SC治疗。所述研究的一个独立研究组由3组经巴洛沙韦玛波西酯(DC Chemicals,Shanghai,China)经口治疗的小鼠组成，每天两次，持续1天；也在病毒攻击后2小时开始。研究设计概括于表74中。监测小鼠持续4周且超过20％体重损失或被发现垂死的动物经评分为死亡。
表74：SCID研究的研究设计
Figure BDA0003630331990007091
在研究结束时(第28天)，接受缀合物45b的小鼠在10与0.3mg/kg之间的所有剂量浓度下均完全经保护(表75)。缀合物45b仅在最低测试浓度0.1mg/kg下无法提供保护以抵御致死性病毒攻击。如所预期，接受媒介物或hIgG1 Fc的组未受到保护。经巴洛沙韦治疗的小鼠也受到保护，但在20mg/kg(80％生存)的显著较高累积剂量下，在6mg/kg的总剂量下，仅60％小鼠生存至第28天。
表75：百分比生存
Figure BDA0003630331990007092
Figure BDA0003630331990007101
对照＝未感染
缀合物45b在此严重免疫缺陷模型中的效能基于体重也为显而易见的(表76)。基于死亡率读出提供完全保护的缀合物最低浓度为0.3mg/kg。在此剂量水平下，所述组的最大平均重量损失为短暂的，且导致少于3％减少(发生于第4天)。此外，与未感染的小鼠相比，所有完全保护组的体重差异可以忽略不计。
表76：百分比体重
Figure BDA0003630331990007102
Figure BDA0003630331990007111
对照＝未感染
总之，这些数据通过用低至0.3mg/kg的缀合物的单一SC剂量保护经致死性攻击的小鼠证明了缀合物45b的效能。此在完全缺乏清除流感感染所必需的T及B免疫细胞的小鼠的严重免疫缺陷模型中实现。这些数据支持使用缀合物45b来治疗免疫缺陷患者群体。
实施例158.经皮下给予的缀合物45b在致死性小鼠模型中针对流感A/PuertoRico/8/34(H1N1)的功效
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8周)中针对致死性IAVH1N1流感感染评估缀合物45b。攻击病毒(A/Puerto Rico/8/1934)是能够在小鼠中引起致死性感染的小鼠适应性分离株。所述实验包含7组，每组5只小鼠。在第0天，所有小鼠均在经氯胺酮/甲苯噻嗪的混合物(分别为150及10mg/kg)麻醉之后通过鼻内接种经30μl体积的病毒(3x LD95)攻击。每天记录死亡率及体重，持续14天且具有20％体重损失的任何动物均评分为死亡。
测试组在病毒攻击后2小时接受缀合物45b(1、0.3、0.1、0.03或0.01mg/kg)、hIgG1Fc对照或媒介物(PBS)的单一皮下(SC)治疗。研究设计概述于表77中。
表77：针对流感A/PR/8/34(H1N1)研究的研究设计
Figure BDA0003630331990007121
如所预期，接受媒介物或hIgG1 Fc对照的小鼠在第6天死于感染(表78)。然而，经缀合物45b治疗的小鼠在1、0.3及0.1mg/kg剂量水平下完全经保护。使用缀合物45b时的死亡率仅在最低剂量浓度0.03及0.01mg/kg下可见。
表78：百分比生存
Figure BDA0003630331990007122
缀合物45b的效能进一步通过每天体重测量值支持。如所预期，经媒介物或hIgG1Fc治疗的小鼠证明体重持续下降，直至其超过20％，此时其经评分为死亡(表78)。
与对照小鼠形成对比，接受1、0.3及0.1mg/kg的缀合物45b的那些组在所述研究中维持健康体重且仅证明少于7％的短暂体重下降(0.1mk/kg剂量组，第7天；表79)。缀合物45b的生存及体重测量值两者均证明使用低至0.1mg/kg的单一SC剂量时的稳固保护以抵御流感A/Puerto Rico/8/1934的致死性攻击。
表79：百分比体重
Figure BDA0003630331990007131
实施例159.经皮下给予的缀合物45b在致死性小鼠模型中针对流感A/California/07/2009(H1N1)pdm的功效。
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8周)中针对致死性IAVH1N1流感感染评估缀合物45b。攻击病毒(A/California/07/2009(H1N1)pdm)是能够在小鼠中引起致死性感染的大流行分离株。所述实验包含5组，每组5只小鼠。在第0天，所有小鼠均在经氯胺酮/甲苯噻嗪的混合物(分别为150及10mg/kg)麻醉之后通过鼻内接种经30μl体积的病毒(3x LD95)攻击。每天记录死亡率及体重且具有20％体重损失的任何动物均评分为死亡。
测试组在病毒攻击后2小时接受缀合物45b或媒介物(PBS)的单一皮下(SC)治疗。研究设计及剂量水平概述于表80中。
表80：针对流感A/California/07/2009(H1N1)pdm研究的研究设计
Figure BDA0003630331990007141
如所预期，接受媒介物的小鼠截至第7天死于感染(表81)。然而，经缀合物45b治疗的小鼠在低至0.3mg/kg的浓度下完全经保护，且在0.1mg/kg下部分经保护(60％生存)。以少于1mg/kg的单一剂量实现针对强毒大流行菌株的完全保护证明了缀合物45b针对临床相关流感A的效能。
表81：百分比生存
Figure BDA0003630331990007142
Figure BDA0003630331990007151
缀合物45b的效能进一步通过每天体重测量值支持。如所预期，经媒介物治疗的小鼠证明体重持续下降，直至其超过20％，此时小鼠经评分为死亡(表82)。
与对照小鼠形成对比，接受3、1或0.3mg/kg的缀合物45b的小鼠仅证明大约10％的短暂体重下降，在第3-5天达到峰值(表82)。在研究结束时(第14天)，这些小鼠基本恢复(或超过)它们的起始重量。缀合物45b的生存及体重测量值两者均证明使用经SC施用的单一0.3mg/kg剂量时的稳固保护以抵御流感A/California/07/2009(H1N1)pdm的致死性攻击。针对此研究中所用的临床相关大流行菌株的活性支持缀合物45b在治疗严重流感感染时的效用。
表82：百分比体重
Figure BDA0003630331990007152
实施例160.经皮下给予的缀合物45b在致死性小鼠模型中针对流感A/Hong Kong/1/1968(H3N2)的功效。
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8周)中针对致死性IAVH3N2流感感染评估缀合物45b。攻击病毒(A/Hong Kong/1/1968)是能够在小鼠中引起致死性感染的小鼠适应性分离株。所述实验包含3组，每组5只小鼠。在第0天，所有小鼠均在经氯胺酮/甲苯噻嗪的混合物(分别为150及10mg/kg)麻醉之后通过鼻内接种经30μl体积的病毒(3x LD95)攻击。每天记录死亡率及体重且具有20％体重损失的任何动物均评分为死亡。
测试组在病毒攻击后2小时接受缀合物45b或媒介物(PBS)的单一皮下(SC)治疗。研究设计概述于表83中。
表83：流感A/Hong Kong/1/1968(H3N2)研究的研究设计
Figure BDA0003630331990007161
如所预期，接受媒介物的小鼠截至第7天死于感染(表84)。然而，经缀合物45b治疗的小鼠在1及0.3mg/kg剂量水平下完全经保护。在此研究中，缀合物45b以不低于0.3mg/kg给予。
表84：百分比生存
Figure BDA0003630331990007162
Figure BDA0003630331990007171
缀合物45b的效能进一步通过每天体重测量值支持。如所预期，经媒介物治疗的小鼠证明体重持续下降，直至其超过20％，此时小鼠经评分为死亡(表85)。
与对照小鼠形成对比，接受1及0.3mg/kg的缀合物45b的那些组在所述研究中维持近乎健康体重，且仅证明在研究结束时重获近乎其起始体重之前少于11％的短暂体重下降(表85)。缀合物45b的生存及体重测量值两者均证明使用低至0.3mg/kg的单一SC剂量时的稳固保护以抵御流感A(H3N2)的致死性攻击。
表85：百分比体重
Figure BDA0003630331990007172
实施例161.缀合物45b在致死性小鼠模型中针对流感B(Victoria谱系)的功效
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8周)中针对致死性流感B流感感染评估缀合物45b。攻击病毒(B/Malaysia/8/1934)是能够在小鼠中引起致死性感染的小鼠适应性分离株。所述实验包含6组，每组5只小鼠。在第0天，所有小鼠均在经氯胺酮/甲苯噻嗪的混合物(分别为150及10mg/kg)麻醉之后通过鼻内接种经30μl(大约每只小鼠1E4)体积的病毒(3x LD95)攻击。
所有组均在病毒攻击之后2小时接受测试物件、媒介物(PBS)或单独Fc对照(hIgG1Fc)的单一SC治疗。所述研究评估了在1、0.3、0.1及0.03mg/kg浓度下的缀合物45b。监测小鼠持续2周且超过20％体重损失或被发现垂死的动物经评分为死亡。
经媒介物或单独Fc对照治疗的所有小鼠截至第7天均达到死亡。相比之下，接受1、0.3或0.1mg/kg缀合物45b的小鼠在接受单一SC剂量之后完全经保护(表86)。缀合物45b针对流感B的效能进一步通过每天身体测量值支持(表87)，其显示在0.3mg/kg下少于5％的短暂下降。
表86：百分比生存
Figure BDA0003630331990007181
表87：百分比体重
Figure BDA0003630331990007191
实施例162.缀合物45b在致死性小鼠模型中针对流感B(Yamagata谱系)的功效
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8周)中针对致死性流感B流感感染评估缀合物45b。攻击病毒(B/Florida/4/2006)是能够在小鼠中引起致死性感染的小鼠适应性分离株。所述实验包含7组，每组5只小鼠。在第0天，所有小鼠均在经氯胺酮/甲苯噻嗪的混合物(分别为150及10mg/kg)麻醉之后通过鼻内接种经30μl(大约每只小鼠3E4)体积的病毒(3x LD95)攻击。
所有组均在病毒攻击之后2小时接受测试物件、媒介物(PBS)或单独Fc对照(hIgG1Fc)的单一SC治疗。所述研究评估了3至0.03mg/kg浓度的缀合物45b。监测小鼠持续2周且超过20％体重损失或被发现垂死的动物经评分为死亡。
经媒介物治疗的所有小鼠截至第8天达到死亡，而hIgG1 Fc对照具有80％死亡。相比之下，接受缀合物45b的小鼠在所有测试浓度下在接受单一SC剂量之后完全经保护(表88)。
表88：百分比生存
Figure BDA0003630331990007201
缀合物45b针对流感B(Yamagata)的效能进一步通过每天身体测量值支持(表89)，其显示在0.03mg/kg最低测试浓度下少于4％的短暂下降。
表89：百分比体重
Figure BDA0003630331990007202
Figure BDA0003630331990007211
实施例163.缀合物45b在28天小鼠预防模型中针对流感H1N1、H3N2及B(Victoria)的功效
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8周)中针对季节性流感亚型(H1N1、H3N2及B(Victoria谱系))的致命性攻击评估缀合物45b。所述实验包含13组，每组5只小鼠，第6组(媒介物，A/HK/1/68攻击)除外，该组由4只动物组成。在第0天，小鼠以3、1或0.3mg/kg的单一剂量经皮下(SC)施用缀合物45b。对照小鼠也通过相同途径单独用媒介物(PBS)或hIgG1 Fc治疗。在施用测试物件之后28天，小鼠经鼻内经以下季节性流感亚型中任一者(3x LD95)攻击：
A/California/07/2009 (H1N1)
A/Hong Kong/1/1968 (H3N2)
B/Malaysia/8/1934 (B；Victoria谱系)
关于病毒攻击，小鼠经氯胺酮/甲苯噻嗪的混合物(分别为150及10mg/kg)麻醉，且病毒以30μl体积给予。每天记录死亡率及体重且具有20％体重损失的任何动物均评分为死亡。
关于所述研究的H1N1研究组，单独经媒介物治疗的所有小鼠截至第7天均死于感染。单独Fc对照也不具有保护性，在研究结束时(第42天，病毒攻击之后14天)仅有20％生存。然而，缀合物45b在1mg/kg单一SC剂量之后针对此大流行分离株具有持续一个月的完全保护性(P＝0.0020；表90)。即使在最低测试浓度(0.3mg/kg)下，80％小鼠也生存至研究结束。每天体重(BW)百分比测量值进一步支持缀合物45b在此模型中的功效(表91)，在1mg/kg时，小鼠具有12.1％的短暂损失，这针对此高致病性菌株而言是典型的，所述短暂损失截至研究结束基本恢复(起始值的96.5％)。
表90：H1N1百分比生存
Figure BDA0003630331990007221
表91：H1N1百分比体重*
Figure BDA0003630331990007222
*注意，仅给出组内发生第一例死亡之前的BW
关于所述研究的H3N2研究组(A/Hong Kong/1/1968)，经单独媒介物治疗的所有小鼠截至第8天死于感染。与单独媒介物治疗形成对比，所有缀合物45b浓度均具有完全保护性，即使在0.3mg/kg的剂量水平下(P＝0.0007；表92)。如所述研究的H1N1研究组所见，每天BW测量值进一步支持缀合物45b针对H3N2亚型的功效(表93)，在0.3mg/kg时，小鼠具有少于11％的短暂损失，BW截至研究结束基本恢复(起始值的98.4％)。
表92：H3N2百分比生存
Figure BDA0003630331990007231
表93：H3N2百分比体重
Figure BDA0003630331990007232
Figure BDA0003630331990007241
所述研究的最后一个研究组测定了缀合物45b针对流感B的Victoria谱系的功效。对于此研究其他研究组中所见而言典型的是，单独媒介物治疗的小鼠截至第7天死于感染。与针对H1N1亚型的结果类似，在施用缀合物45b之后一个月，1mg/kg的单一SC剂量针对流感B的致死性攻击(表94；P＝0.0031)具有完全保护性。在最低测试浓度(0.1mg/kg)下，60％小鼠生存。如所述研究的其他研究组一样，BW数据支持缀合物45b的效能。针对B/Malaysia菌株以1mg/kg治疗的动物显示出少于6％短暂BW损失，此损失在研究结束时已恢复(表95；100.2％)。
表94：流感B百分比生存
Figure BDA0003630331990007242
表95：流感B百分比体重
Figure BDA0003630331990007243
Figure BDA0003630331990007251
实施例164.体外斑块减少分析
在接种于24孔板中的Madin Darby Canine Kidney(MDCK)细胞中执行斑块减少分析。500,000个MDCK细胞接种于0.5mL含有10％FBS的培养基(DMEM)中且培育大约24小时。测试物件及所用病毒H1N1 WT(A/California/12/2012)及H275Y(A/Texas/23/2012)、H3N2WT(A/Washington/12/2007)及E119V(A/Texas/12/2007)以及B(B/Malaysia/2506/2004)的稀释在含有PBS、牛白蛋白35％及Ca2+/Mg2+的缓冲液中执行。缀合物45b及巴洛沙韦、扎那米韦、奥司他韦比较物在室温下用病毒预培育持续30分钟，接着在移除培养基且用PBS洗涤一次之后添加其至MDCK细胞单层中。选择每种药物-病毒组合的MOI以靶向PBS对照孔中的30个斑块。进行吸附持续1h，移除病毒-测试物件混合物，且受感染的细胞在稀释于1.25％Avicel、DMEM、0.01％DEAE-葡聚糖及2μg/mL TPCK胰蛋白酶的混合物中的测试物件的存在下培育持续48h。在48小时之后，移除Avicel混合物，且细胞用多聚甲醛固定且用1％结晶紫染色以对斑块计数。所有药物均以介于0.3至100nM范围内的六种浓度进行测试。EC50值(nM)使用GraphPadPrism软件计算。结果汇总于表96中。
表96：针对WT及NA突变型流感菌株的缀合物45b斑块减少分析EC50值的概述
Figure BDA0003630331990007261
缀合物45b在针对所有测试的H1N1、H3N2及B菌株的斑块减少分析中证明了其有效活性，产生的EC50值低于所有三种比较剂的EC50值(表96)。此外，缀合物45b的活性受奥司他韦抗性赋予NA突变E119V及H275Y的存在影响最小
实施例165.用于选择抗性流感病毒的连续传代实验
为了评估在病毒抑制剂的选择性压力下开发耐药性突变型病毒菌株的潜力，相对奥司他韦及巴洛沙韦比较物，用缀合物45b进行连续传代研究。使用MDCK细胞进行连续传代研究。如下进行传代：每孔(24-孔)500,000个MDCK细胞接种于500μl DMEM 10％FBS、1％PS、1％NaPyr及1％HEPES中且经培育持续大约24小时。一旦细胞达到大约80％汇合，其用PBS洗涤一次且在正常培养条件下在化合物或单独PBS存在下经培育持续2小时。如最大病毒抑制所需最佳化选择剂浓度，同时维持充足病毒产生以用于后续传代。连续传代实验中使用的缀合物45b、巴洛沙韦及奥司他韦的浓度分别为4nM、4nM及200nM。细胞在含有PBS、牛白蛋白35％及Ca2+/Mg2+的缓冲液中在室温下用A/California/07/2009H1N1 pdm以0.01MOI感染持续1小时，随后移除接种物且用DMEM 1％PS、1％NaPyr及1％HEPES(无FBS)洗涤细胞一次。细胞接着在稀释于DMEM 1％PS、1％NaPyr、1％HEPES及2μg/ml经TPCK处理的胰蛋白酶中的选择剂存在下经培育持续24小时。在培育之后，收集病毒上清液，且通过离心(5min，4℃，1,400xg)移除细胞及碎片。上清液接着用于：
i通过斑块分析定量病毒滴定ii进行血细胞凝集分析以确定病毒是否逃逸化合物抑制
iii在化合物存在下再感染新鲜接种的MDCK细胞
重复此过程10次传代。一旦在药物存在下检测到增加的滴定，病毒即经斑块纯化的。在斑块纯化之后，所有8个基因组区段可被测序且与经PBS治疗的对照病毒相比以检测逃逸突变。连续传代的概述显示于图83中。在10次传代的过程中，关于缀合物45b未观察到病毒滴定的增加(表明未出现抗性突变体)，而巴洛沙韦及奥司他韦滴定分别在第6次及第8次传代之后增加至类似于PBS对照中所观察到的那些水平的水平。
实施例166.细胞病变效应分析
为了测量缀合物45b保护哺乳动物细胞以抵御流感病毒感染及破坏的能力，如实施例25中所讨论进行基于细胞病变效应(CPE)的微量中和分析，稍作改变。简而言之，单层MDCK细胞以0.001-1之间变化的适当MOI经流感A或B菌株感染。测试物件以介于0.1-10,000nM之间范围的浓度添加且在37℃、5％CO2下经培育3天(流感A)或5天(流感B)。CPE通过结晶紫染色通过读取595nm处的吸光度来测定。结果显示于下表97及表98中。
表97：在MOI 0.01或MOI 0.001时缀合物45b针对流感A H1N1的CPE(CPE[nM])
Figure BDA0003630331990007281
表98：在MOI 0.01或MOI 0.001时缀合物45b针对流感A H3N2的CPE(CPE[nM])
Figure BDA0003630331990007282
实施例167.对于活流感A病毒或神经氨酸酶抗性突变体的裂解物的神经氨酸酶抑制
神经氨酸酶抑制(NAI)。测试物件在37℃下于5％CO2中用神经氨酸酶(SinoBiological)或用活病毒培育持续20min。2'-(4-甲基伞形酮基)-α-D-N乙酰神经氨酸底物添加至适当的孔中且在37℃、5％CO2下经培育持续1h。NAI通过读取355nm处激发/460nm处发射荧光来测定。确定神经氨酸酶抗性突变体及活流感病毒的神经氨酸酶抑制(表99、表100、表101、表102及表103)。
表99：NAI针对活流感A(H1N1)病毒
Figure BDA0003630331990007291
*所有活病毒均以1e6 PFU进行测试。
表100：NAI针对活流感A(H3N2)病毒
Figure BDA0003630331990007301
*所有活病毒均以1e6 PFU进行测试(除了以1e5 PFU进行测试的R292K)
表101：NAI针对活流感A(H1N1)pdm09病毒
Figure BDA0003630331990007302
Figure BDA0003630331990007311
*所有活病毒均以1e7 PFU进行测试。
表102：NAI针对活流感A(H3N2)病毒
Figure BDA0003630331990007312
*所有活病毒均以1e7 PFU进行测试。
表103：NAI针对流感B病毒
Figure BDA0003630331990007313
Figure BDA0003630331990007321
*所有活病毒均以1e6 PFU进行测试。
实施例168.抗体依赖性细胞吞噬作用分析
测试缀合物45b的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。单层MDCK细胞以MOI 0.001-10经流感A或流感B菌株感染，且在37℃下于5％CO2中经培育持续18-24h。ADCP根据制造商的说明用商业报告细胞系(PROMEGA)测定。简而言之，测试物件以介于1至10,000nM范围内的浓度添加至适当的孔中，且在37℃下于5％CO2中经培育持续15m。ADCP通过读取发光经定量。缀合物45b及单独Fc(SEQ ID NO:73，类似于实施例124制备)针对流感A/PR/8/1934(H1N1)、流感A/CA/07/2009(H1N1)及流感A/HK/1/1968(H3N2)(分别地，表104-106)及流感B/Malaysia/2506/2004(Victoria，表107)进行测试，显示缀合物45b的ADCP的MOI依赖性增加。缀合物45b还显示在10MOI时针对流感A/PR/8/1934(H1N1)、流感A/CA/07/2009(H1N1)及流感A/HK/1/1968(H3N2)(分别地，表108-110)以及针对流感B/Malaysia/2506/2004(Victoria，表111)的ADCP的剂量依赖性增加。
表104：缀合物45b针对流感A的ADCP的MOI依赖性增加(倍数诱导)
Figure BDA0003630331990007322
表105：缀合物45b针对流感A的ADCP的MOI依赖性增加(倍数诱导)
Figure BDA0003630331990007331
表106：缀合物45b针对流感A的ADCP的MOI依赖性增加(倍数诱导)
Figure BDA0003630331990007332
表107：缀合物45b针对流感B的ADCP的MOI依赖性增加(倍数诱导)
Figure BDA0003630331990007333
表108：在MOI 10时缀合物45b针对流感A的ADCP的剂量依赖性增加(诱导倍数)
Figure BDA0003630331990007334
Figure BDA0003630331990007341
表109：在MOI 10时缀合物45b针对流感A的ADCP的剂量依赖性增加(诱导倍数)
Figure BDA0003630331990007342
表110：在MOI 10时缀合物45b针对流感A的ADCP的剂量依赖性增加(诱导倍数)
Figure BDA0003630331990007343
表111：在MOI 10时缀合物45b针对流感B/Malaysia/2506/2004的ADCP的剂量依赖性增加(诱导倍数)
Figure BDA0003630331990007344
实施例169.抗体依赖性细胞毒性分析
测试缀合物45b的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。单层MDCK细胞以MOI 0.001-10经流感A或流感B菌株感染，且在37℃下于5％CO2中经培育持续18-24h。ADCC根据制造商的说明用商业报告细胞系(PROMEGA)测定。简而言之，测试物件以介于1至10,000nM范围内的浓度添加至适当的孔中，且在37℃下于5％CO2中经培育持续15m。ADCC通过读取发光经定量。缀合物45b及单独Fc(SEQ ID NO:73，类似于实施例124制备)针对流感A/PR/8/1934(H1N1)、流感A/CA/07/2009(H1N1)及流感A/HK/1/1968(H3N2)(分别地，表112-114)及流感B/Malaysia/2506/2004(Victoria，表115)进行测试，显示缀合物45b的ADCC的MOI依赖性增加。缀合物45b还显示在10MOI时针对流感A/PR/8/1934(H1N1)、流感A/CA/07/2009(H1N1)及流感A/HK/1/1968(H3N2)(分别地，表116-118)以及针对流感B/Malaysia/2506/2004(Victoria，表119)的ADCC的剂量依赖性增加。
表112：缀合物45b针对流感A的ADCC的MOI依赖性增加(倍数诱导)
Figure BDA0003630331990007351
表113：缀合物45b针对流感A的ADCC的MOI依赖性增加
Figure BDA0003630331990007352
表114：缀合物45b针对流感A的ADCC的MOI依赖性增加(倍数诱导)
Figure BDA0003630331990007361
表115：缀合物45b针对流感B的ADCC的MOI依赖性增加(倍数诱导)
Figure BDA0003630331990007362
表116：在MOI 10时缀合物45b针对流感A的ADCC的剂量依赖性增加(诱导倍数)
Figure BDA0003630331990007363
表117：在MOI 10时缀合物45b针对流感A的ADCC的剂量依赖性增加(诱导倍数)
Figure BDA0003630331990007364
Figure BDA0003630331990007371
表118：在MOI 10时缀合物45b针对流感A的ADCC的剂量依赖性增加(诱导倍数)
Figure BDA0003630331990007372
表119：在MOI 10时缀合物45b针对流感B/Malaysia/2506/2004的ADCC的剂量依赖性增加(诱导倍数)
Figure BDA0003630331990007373
实施例170.缀合物45b在致死性小鼠流感模型中的功效：研究#58
在雌性BALB/c小鼠(6-8周龄，n＝5/组)中针对致死性流感A/PR/8/1934(3E2 PFU)评估缀合物45b。研究设计在表120中示出。在感染后t＝+2h用测试物件治疗(SC)小鼠，使用单一剂量的缀合物45b或每天两次持续4天的对照剂。每天监测所有小鼠的体重。在感染后第4天处死小鼠且收集两片肺叶。肺经均质化以确定病毒负荷及免疫反应。数据显示于表121-123中。
表120：功效研究#58设计
组 测试物件(DAR) 途径/时程 剂量[mg/kg] 剂量/天[mg/kg]
1 PBS SC，T+2h N/A N/A
2 hIgG1Fc SC，T+2h 3 3
3 奥司他韦 PO，BIDx4 5 10
4 奥司他韦 PO，BIDx4 50 100
5 巴洛沙韦 PO，BIDx4 15 30
6 缀合物45b(4.8) SC，T+2h 0.1 0.1
7 缀合物45b(4.8) SC，T+2h 0.3 0.3
8 缀合物45b(4.8) SC，T+2h 1 1
9 缀合物45b(4.8) SC，T+2h 3 3
10 未感染 N/A N/A N/A
表121：感染后第4天的病毒负荷(PFU/g)
Figure BDA0003630331990007381
表122：感染后第4天的细胞因子水平
Figure BDA0003630331990007382
Figure BDA0003630331990007391
表123：与未感染对照相比，感染后第4天的细胞因子水平的差异倍数
测试物件[mg/kg] TNF-α IL-6 MCP-1 MIP-1α KC
PBS[0] 2.21 4.63 50.06 21.10 18.20
hIgG1Fc[3] 1.96 3.61 48.44 19.94 17.39
奥司他韦[5] 1.77 2.28 12.51 8.10 7.80
奥司他韦[50] 1.03 1.49 10.79 5.33 6.09
巴洛沙韦[15] 1.07 0.99 0.80 1.04 0.88
缀合物45b[0.1] 1.06 1.51 16.06 8.48 6.65
缀合物45b[0.3] 1.07 1.36 6.98 4.61 4.02
缀合物45b[1] 0.94 1.05 4.73 2.54 2.84
缀合物45b[3] 0.95 0.99 1.74 1.39 1.53
未感染 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
实施例171.缀合物45b在致死性小鼠流感模型中的功效：研究#55
在雌性BALB/c小鼠(6-8周龄，n＝5/组)中针对致死性流感A/CA/07/2009(3E4PFU)评估缀合物45b。研究设计在表124中示出。在感染后t＝+2h用测试物件治疗(SC)小鼠，使用单一剂量的缀合物45b或每天两次持续4天的对照剂。每天监测所有小鼠的体重。在感染后第4天处死小鼠且收集两片肺叶。肺经均质化以确定病毒负荷及免疫反应。数据显示于表125及126A-126B中。
表124：功效研究#58：研究设计
Figure BDA0003630331990007392
Figure BDA0003630331990007401
表125：感染后第4天的病毒负荷(PFU/g)
Figure BDA0003630331990007402
表126A：感染后第4天的细胞因子水平
Figure BDA0003630331990007403
表126B：与未感染对照相比，感染后第4天的细胞因子水平的差异倍数
Figure BDA0003630331990007411
实施例172.缀合物45b的体外跨物种Fc受体结合
使用下文描述的ELISA方法执行缀合物45b与来自多个物种的Fcγ受体的结合。Nunc Maxisorp 96孔板在4℃下用碳酸盐缓冲液中的1μg(100μL/孔)缀合物45b包被过夜。未缀合的人IgG1 Fc及同种型对照抗体也在相同条件下包被过夜。第二天，板用补充有0.05％Tween 20(PBST)的300μL/孔1X PBS pH 7.4洗涤5次，接着在轨道板振荡器上在室温下用200μL/孔PBST中的1％BSA封闭持续1h。板用300μL/孔PBST洗涤5次，接着在振荡下在室温下用重组His标签的Fcγ受体(0.5-1,000ng；100μL/孔)于稀释剂(0.5％BSA于PBS0.025％Tween 20中)中的2倍连续稀释液培育(一式两份)持续2h。人及食蟹猕猴FcγR1/CD64以25ng/100μL/孔的起始浓度进行筛选。板用300μL/孔PBST洗涤5次，接着在振荡下在室温下用100μL/孔的1:1,000稀释于稀释剂中的小鼠抗His HRP抗体(目录号MAB050H，R&D Systems)培育持续1h。板用300μL/孔PBST洗涤8次，洗涤之间经培育1min，且用100μL/孔TMB底物试剂显影持续5-10min。使用100μL/孔1N H2SO4停止反应且吸光度用EnSpire多模式读板器(PerkinElmer)在450nm处读取。使用结合曲线的非线性回归分析(S型，4PL)以GraphPad Prism版本8计算半数最大有效浓度(EC50)。缀合物45b与来自多个物种的FcRn受体的结合基本上如对Fcγ结合ELISA所述进行，具有以下修改。在封闭步骤之后，在pH 5.8(FcRn结合的最佳pH)及pH 7.4下执行结合分析，一式两份。
缀合物45b以与人IgG1 Fc相当的亲和力与来自小鼠、人、大鼠及食蟹猕猴的Fcγ受体结合(表127)。与免疫抑制性Fcγ受体相比，缀合物45b以更高的亲和力结合免疫活化Fcγ受体。在pH 5.8时，缀合物45b以与人IgG1 Fc相等的亲和力结合来自所有物种的FcRn受体。如所预期，缀合物45b FcRn结合在pH 7.4时降低(表127)。
表127：缀合物45b的跨物种Fc受体结合
Figure BDA0003630331990007421
Figure BDA0003630331990007431
实施例173.比较IV、SC及IM施用缀合物45b的7天小鼠PK研究
使用6周龄雄性CD-1小鼠执行小鼠PK研究。小鼠经IV、SC及IM注射5mg/kg的测试物件(5ml/kg的剂量体积)。动物经圈养于标准IACUC批准的圈养条件下。在适当时间，对动物进行非末端放血(眶后、颊或通过尾静脉)，其中血液经收集于K2EDTA管中以预防凝血。所收集的血液经离心(2,000xg，持续10分钟)且抽出血浆以随时间分析测试物件浓度。通过夹心ELISA测量各时间点的缀合物45b的血浆浓度，如下：缀合物45b分子经捕获于经神经氨酸酶包被的板上且接着使用HRP缀合的抗人IgG-Fc抗体进行检测。在GraphPad Prism中使用缀合物45b(或hIgG1 Fc)标准曲线的4PL非线性回归计算蛋白质浓度。更详细的方法描述提供于上文。比较缀合物45b的曲线显示于图84中，且比较hIgG1 Fc(SEQ ID NO:73)的曲线显示于图85中。经SC及IM的缀合物45b的血浆暴露水平是相当的，且与IV施用相比，SC或IM途径的所得生物利用度大约为77％(表128-130)。
在注射后大约24h，所有途径的缀合物45b的血浆浓度是相等的。
Figure BDA0003630331990007441
实施例174.比较缀合物45b的剂量线性的7天小鼠PK研究
使用6周龄雄性CD-1小鼠执行小鼠PK研究。小鼠经SC注射1、3、10、30或100mg/kg的测试物件(5ml/kg剂量体积)。动物经圈养于标准IACUC批准的圈养条件下。在适当时间，对动物进行非末端放血(眶后、颊或通过尾静脉)，其中血液经收集于K2EDTA管中以预防凝血。所收集的血液经离心(2,000xg，持续10分钟)且抽出血浆以随时间分析测试物件浓度。通过夹心ELISA测量各时间点的缀合物45b的血浆浓度，如下：缀合物45b分子经捕获于经神经氨酸酶包被的板上且接着使用HRP缀合的抗人IgG-Fc抗体进行检测。在GraphPadPrism中使用缀合物45b(或hIgG1 Fc)标准曲线的4PL非线性回归计算蛋白质浓度。更详细的方法描述提供于上文。比较通过NA及Fc捕获检测的缀合物45b的曲线分别显示于图86及87中。在小鼠中，观察到1至100mg/kg SC施用缀合物45b的合理线性剂量比例性(表131)。
Figure BDA0003630331990007461
实施例175.IV或SC施用缀合物45b之后的14天大鼠PK研究
由SeventhWave实验室(MarylandHeights,MO)使用46-49日龄的雄性SpragueDawley大鼠执行大鼠PK研究。大鼠经尾静脉IV注射5mg/kg缀合物45b或经SC注射5或50mg/kg的测试物件(5ml/kg剂量体积)(图88-89)。动物经圈养于标准IACUC批准的圈养条件下。在适当时间，对动物进行非末端放血(眶后、颊或通过尾静脉)，其中血液经收集于K2EDTA管中以预防凝血。所收集的血液经离心(2,000x g，持续10分钟)且抽出血浆以随时间分析测试物件浓度(表132)。通过夹心ELISA测量各时间点的缀合物45b的血浆浓度，如下：缀合物45b分子经捕获于经神经氨酸酶包被的板上且接着使用HRP缀合的抗人IgG-Fc抗体进行检测(表133-134)。使用抗hIgG1 Fc抗体捕获hIgG1。在GraphPadPrism中使用缀合物45b标准曲线的4PL非线性回归计算蛋白质浓度。更详细的方法描述提供于上文。图88中显示的比较缀合物45b的曲线证明了线性剂量比例性。IV及SC施用的缀合物45b的血浆水平在注射后24h会聚(图89)。数据显示于表135及136中。
表132：大鼠PK研究设计
Figure BDA0003630331990007471
表133：H1N1(A/CA/04/2009)NA捕获
Figure BDA0003630331990007472
Figure BDA0003630331990007481
表134：hIgG Fc捕获
Figure BDA0003630331990007482
Figure BDA0003630331990007491
Figure BDA0003630331990007501
实施例176.SC施用缀合物45b之后的14天非人类灵长类动物PK研究
由Charles River使用体重介于2.5-6.5kg范围内的4.5-8岁雄性及雌性食蟹猕猴执行非人类灵长类动物(NHP)PK研究。NHP在第1天及第8天经SC注射5或20mg/kg的测试物件(5ml/kg剂量体积)。动物经圈养于标准IACUC批准的圈养条件下。在适当时间，对动物进行非末端放血(通过股静脉或头静脉)，其中血液经收集于K2EDTA管中以预防凝血。所收集的血液经离心(2,000xg，持续10分钟)且抽出血浆以随时间分析测试物件浓度(表137)。通过夹心ELISA测量各时间点的缀合物45b的血浆浓度，如下：缀合物45b分子经捕获于经神经氨酸酶包被的板上且接着使用HRP缀合的抗人IgG-Fc抗体进行检测(图90-91)。在GraphPadPrism中使用缀合物45b标准曲线的4PL非线性回归计算蛋白质浓度。更详细的方法描述提供于上文。比较缀合物45b的曲线显示于图92中。剂量反应在5与20mg/kg SC之间呈线性。在第二次施用缀合物45b之后第8天观察到缀合物45b的积聚。
Figure BDA0003630331990007521
实施例177.缀合物45b在致死性小鼠流感模型中针对奥司他韦抗性分离株的功效
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8周)中针对致死性IAVH1N1流感感染评估缀合物45b。攻击病毒(A/Perth/261/2009)是小鼠适应性分离株，其携带H275Y突变，从而导致抵抗神经氨酸酶抑制剂奥司他韦。
所述实验包含9组，每组5只小鼠。在第0天，所有小鼠均通过鼻内接种至经异氟烷轻微麻醉的小鼠经50μl体积的A/Perth/261/2009(H1N1)(2x LD90)攻击。第1-8组在攻击之后2小时通过SC接受单一治疗。除了单独媒介物(PBS)组之外，人IgG1(单独Fc)也作为额外阴性对照包括在内。第9组通过口服递送接受磷酸奥司他韦，在感染后8小时开始，每天两次，持续5天(表138)。在攻击之后监测所有小鼠的生存(表139)及重量损失(表140)，持续14天。
经缀合物45b治疗的小鼠针对以10、3、1及0.3mg/kg的单一剂量流感(A/Perth/261/2009)的攻击显示100％生存。此外，尽管具有小的组大小(n＝5)，这些结果相对于媒介物对照为统计学上显著的(表139)。若以媒介物(PBS)给药，则没有小鼠生存至所述研究结束，且若单独用hIgG1 Fc治疗，则只有20％生存。奥司他韦组无生存者，尽管用先前显示针对奥司他韦敏感分离株具有保护性的剂量(20mg/kg，bidx 5天)治疗。这些结果确认所述攻击病毒抵抗奥司他韦，且对缀合物45b敏感。
缀合物45b针对含有H275Y突变的流感的效能进一步由体重数据支持(表140)。以1mg/kg或更高的浓度接受单一剂量的缀合物45b的组证明了在研究结束时恢复的3％或更少的短暂重量损失。
表138：研究设计
Figure BDA0003630331990007541
表139：百分比生存
Figure BDA0003630331990007542
表140：百分比体重(克)
Figure BDA0003630331990007551
实施例178.缀合物45b在致死性小鼠流感模型中针对第二奥司他韦抗性分离株的功效
在与实施例177中所示类似的研究中，测试了缀合物45b针对携带赋予对奥司他韦抗性的H275Y突变的第二流感A(H1N1)分离株的活性。关于此研究，所述突变携带于A/Texas/23/2012中。如前，使用BALB/c小鼠(Charles River；6-8周)且经鼻内攻击(2X LD95)(5E4pfu/小鼠)。奥司他韦以20mg/kg口服给药，在病毒攻击之后2小时开始，bid，持续5天。如表141中所列，所有其他测试物件均经SC给药。监测动物持续14天，且每天记录体重(BW)。若动物达到20％BW损失，则其记录为死亡。
表141：研究设计
Figure BDA0003630331990007552
Figure BDA0003630331990007561
与先前的研究类似，媒介物及单独hIgG1 Fc(SEQ ID NO:73)对照均提供保护以抵御致死性攻击(分别为20及0％生存；表142)。相比之下，用浓度介于0.3至3.0mg/kg范围内的缀合物45b治疗的组完全经保护以抵御致死性攻击。此外，0.1mg/kg的缀合物45b证明了部分保护，在所述研究的14天中具有60％生存。然而，200mg总剂量的奥司他韦未能如预期保护小鼠以抵御病毒攻击。BW数据(表143；记录直至组内出现第一例死亡)反映了生存结果，其中在经保护组中仅可见短暂重量损失(缀合物45，0.3至3.0mg/kg)。此研究中测试的奥司他韦突变(H275Y)是临床相关突变，其由此研究显示对缀合物45b高度敏感。
表142：百分比生存
Figure BDA0003630331990007562
表143：百分比体重(克)
Figure BDA0003630331990007571
实施例179.经皮下给予的缀合物45b在致死性小鼠模型中针对流感A/WSN/1933(H1N1)的功效
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8周)中针对致死性IAVH1N1流感感染评估缀合物45b。攻击病毒(A/WSN/1933)是能够在小鼠中引起致死性感染的小鼠适应性分离株。所述实验包含7组，每组5只小鼠。在第0天，所有小鼠均在经氯胺酮/甲苯噻嗪的混合物(分别为150及10mg/kg)麻醉之后通过鼻内接种经30μl(2E3个病毒/小鼠)体积的病毒(3x LD95)攻击。每天记录死亡率及体重，持续21天且具有20％体重损失的任何动物均评分为死亡。
测试组在病毒攻击后2小时以10ml/kg的剂量体积接受缀合物45b(3、1、0.3、0.1或0.03mg/kg)、或hIgG1 Fc对照或媒介物(PBS)的单一皮下(SC)治疗。研究设计概述于表144中。
表144：研究设计
Figure BDA0003630331990007581
如所预期，接受媒介物或hIgG1 Fc对照的小鼠分别在第7天或第8天死于感染(表145)。然而，用低至0.3mg/kg浓度的缀合物45b治疗的小鼠完全经保护，且在0.1时为80％保护。仅在0.03mg/kg的最低剂量浓度下可见缀合物45b的保护作用完全丧失。
表145：百分比生存
Figure BDA0003630331990007582
Figure BDA0003630331990007591
每日体重测量值与生存观察结果一致。如所预期，经媒介物或hIgG1 Fc治疗的小鼠证明体重持续下降，直至其超过20％，此时其经评分为死亡(表146)。
与对照小鼠形成对比，接受3、1及0.3mg/kg的缀合物45b的那些组在所述研究中维持健康体重且仅证明少于3％的短暂体重下降(1mk/kg剂量组，第18天；表146)。缀合物45b的生存及体重测量值两者均证明使用低至0.3mg/kg的单一SC剂量时的稳固保护以抵御流感A/WSN/1933的致死性攻击。
表146：百分比体重
Figure BDA0003630331990007592
实施例180.经皮下给予的缀合物45b在延迟治疗的致死性小鼠模型中针对流感A/Texas/36/91(H1N1)的功效
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8周)中针对致死性流感A(H1N1)感染评估缀合物45b。攻击病毒(A/Texas/36/91)是能够在小鼠中引起致死性感染的小鼠适应性分离株。在第0天，所有小鼠均在经氯胺酮/甲苯噻嗪的混合物(分别为150及10mg/kg)麻醉之后通过鼻内接种经50μl(约75个病毒/小鼠)体积的病毒(2x LD95)攻击。每天记录死亡率、临床体征及体重持续15天且具有20％体重损失的任何动物均评分为死亡。
研究设计详述于表147中，且由多个研究组组成。对照研究组包含媒介物(PBS)及单独hIgG1 Fc组，在病毒攻击之后24小时给药(未受感染组也为此研究组的一部分)。第二研究组由以其人化剂量的4倍给予的奥司他韦组成，其中治疗的起始经延迟24、48、72或96小时。最后研究组由以1或3mg/kg的单一IV剂量施用的缀合物45b组成；各自均按照与上述奥司他韦研究组相同的时程给药。
如所预期，媒介物及hIgG1 Fc当在病毒攻击之后24小时给予时不具保护性且截至第6天导致完全死亡。在此研究中，当给药经延迟24小时时，人化剂量的4倍的奥司他韦(200mg/kg累积剂量)仅为部分有效的(表148；80％生存)。在攻击后48小时，奥司他韦的功效下降甚至更低，仅具有40％小鼠生存至研究结束。若奥司他韦治疗延迟直至72或96小时，则没有保护作用。
相比之下，当给药延迟24小时时，缀合物45b在1及3mg/kg时具有完全保护性。在攻击后48小时，3mg/kg组仍然经完全保护，且1mg/kg几乎如此，具有80％生存。在72小时，1mg/kg也显示出80％保护作用，然而，3mg/kg仅证明了20％保护作用。总之，在此延迟治疗模型中，1及3mg/kg缀合物45b剂量组两者均显示出优于奥司他韦的效能，如通过生存所测量。同样值得注意的是，缀合物45b的总剂量为1或3mg/kg，而奥司他韦以200mg/kg给予。
如所预期，体重数据支持生存发现结果(表149)且总体上显示经缀合物45b治疗的小鼠具有更优的体重保持。尽管没有统计学意义，但在缀合物45b治疗的小鼠中重量经更好地保持，即使奥司他韦治疗组接受了高得多的剂量。
表147：研究设计
Figure BDA0003630331990007611
Figure BDA0003630331990007621
Figure BDA0003630331990007631
实施例181.在14天食蟹猕猴剂量范围发现毒性研究中评估缀合物45b的安全性
食蟹猕猴在所述研究的第0天及第7天通过皮下注射经施用5mpk或20mpk或50mpk的缀合物45b。与媒介物对照相比，在所测试的任何剂量下均未观察到对体重增加、器官重量、食物消耗的显著影响。血浆暴露(通过AUC测量)随剂量按比例增加。基于毒理学研究中最高剂量的AUC与致死性小鼠流感模型中28天保护以抵御流感感染所需的AUC的比率，这些临床前安全性结果与高治疗指数(54X)一致。在测试的任何剂量下均未观察到测试物件相关的不良反应。观察结果的概述提供于表150中。
表150：14天剂量范围发现毒性研究的概述
Figure BDA0003630331990007641
实施例182.经皮下给予的缀合物45b在非致死性雪貂模型中针对流感A/California/07/2009(H1N1)pdm的功效
雪貂中的流感A感染通常被认为具有与人类中所见相似的发病机制。因此，在用流感A/CA/07/09及临床相关H1N1大流行菌株攻击的非致死性雪貂模型中测试了缀合物45b。简而言之，雄性雪貂(3-5月龄)从Tripe F农场获得且经证实缺乏针对流感AH1N1的抗体。每只雪貂在攻击之前24±2.0小时经单一静脉内(IV)注射接受缀合物45b、媒介物(PBS)或hIgG1 Fc，或在流感病毒接种之前4±0.5小时开始通过口服管饲法接受磷酸奥司他韦(20mg/kg)。在病毒接种之后，继续施用奥司他韦，每天两次(间隔12±1.5小时)，持续5天。测试浓度及实验设计详述于表151中。
雪貂在经氯胺酮(25mg/kg)及甲苯噻嗪(2mg/kg)麻醉之后经鼻内用0.5mL体积的1E6个流感A/California/07/2009(H1N1)感染颗粒攻击。还如上述麻醉动物以施用测试物件。所述研究持续时间为14天，且读出由以下组成：每日体重(BW)、临床体征、温度及在表151中所列时间下的鼻洗液(0.5mL)或咽拭子。使用MDCK细胞的标准斑块分析测定鼻洗液中的病毒负荷。使用标准qPCR方法执行咽拭子的病毒负荷。也在5分钟、2、24、72及120小时时从第6组动物(以3mg/kg缀合物45b给药)获得血浆样品。如表152中所详述，用媒介物(PBS)或单独Fc治疗的对照动物开始损失BW，起始于第1天，在第6天达到峰值(分别为10.8％及10.1％)。在最低缀合物45b剂量(0.3mg/kg)下也可见类似BW下降。相比之下，经以1与30mg/kg之间的缀合物治疗的雪貂显示大约50％的BW损失的降低。
如基于BW所预测的，缀合物45b还证明了来自鼻洗液的病毒负荷降低，鼻部是雪貂中流感感染的主要部位(表153及表154)。缀合物45b的功效在第2天负荷中经最显著地证明，其中在最高剂量下相对于经媒介物治疗的动物实现了接近2对数的降低。此外，缀合物45b降低病毒滴定在30与1mg/kg之间是剂量反应性的。此趋势在第4天滴定中基本重复，尽管因为免疫系统在非致死性雪貂模型中发挥更大的作用而略有减弱(如第2天与第4天之间经媒介物治疗的滴定的降低而明显)。
基于两个主要研究读出(鼻滴定及BW)，总之，这些数据证明了缀合物45b在反映人类疾病的重要模型中以治疗浓度到达上呼吸道的能力。
表151：研究设计及给药时程
Figure BDA0003630331990007661
表152中示出：截至天数平均体重变化(％初始)
Figure BDA0003630331990007662
表153：鼻洗液中病毒负荷(对数10)
第2天 第4天 第6天 第8天
G1 6.12 4.36 低于LOD 低于LOD
G2 6.31 4.42 低于LOD 低于LOD
G3 5.80 ---- 低于LOD 低于LOD
G4 4.26 3.12 低于LOD 低于LOD
G5 4.34 3.37 低于LOD 低于LOD
G6 5.11 3.44 低于LOD 低于LOD
G7 5.62 3.84 低于LOD 低于LOD
G8 6.07 3.56 低于LOD 低于LOD
表154：病毒负荷相对于媒介物的变化(G1)(对数10)
第2天 第4天 第6天 第8天
G1 0.00 0.00 na na
G2 0.19 0.06 na na
G3 -0.32 ---- na na
G4 -1.86 -1.24 na na
G5 -1.79 -0.99 na na
G6 -1.01 -0.92 na na
G7 -0.50 -0.52 na na
G8 -0.06 -0.80 na na
温度变化也经记录(AM&PM)且列于表155中。研究过程中的温度变化基本支持缀合物45b在鼻负荷及体重方面所见的功效。最值得注意的是，相对于经媒介物治疗理的雪貂，动物在用缀合物45b或奥司他韦治疗后表现出升高的温度的时间总体减少。
在此研究中，每天观察动物且对流感的临床症状及其严重程度进行评分。在此非致死性模型中，打喷嚏是技术人员记录的主要疾病迹象(表156)。相对于经媒介物治疗的雪貂，用缀合物45b治疗的动物或阳性对照表现出较少的打喷嚏情况，这相对于第1组解决得更快。为清楚起见，0.3mg/kg治疗组连同媒介物及奥司他韦组绘制于图96中。
在此研究中，结合物45b通过所有读出(鼻负荷、体重、温度及临床评分)相对于媒介物治疗的动物证明了有效活性。重要的是，缀合物45b在降低鼻洗液中病毒负荷(此研究的主要读出)方面比显著更高剂量的奥司他韦更有效。在被认为是模拟人类疾病的重要模型中观察到的缀合物45b的功效支持此候选的治疗潜力。
Figure BDA0003630331990007691
Figure BDA0003630331990007701
实施例183.单一IV注射3mg/kg之后雪貂中缀合物45b的5天PK分析
雪貂PK研究由IIT研究所(IITRI)使用3-5月龄的雄性雪貂执行。雪貂(n＝5)在用1x 106斑块形成单元(PFU)的A/California/07/2009(H1N1)流感病毒鼻内攻击之前24h通过单一静脉内(IV)注射施用3mg/kg(2mL剂量体积)的缀合物45b。在给药及病毒攻击之前使用氯胺酮(25mg/kg)及甲苯噻嗪(2mg/kg)混合物对雪貂进行麻醉。在给药后5min、2、24、72及120h收集血液(约0.5-1mL)且进行处理以得到血浆。在第2、4、6及8天收集鼻洗液(0.5mL于PBS中)。缀合物45b分子经捕获于经神经氨酸酶(NA)或Fc包被的板上且接着使用HRP缀合的抗人IgG-Fc抗体进行检测。在GraphPad Prism中使用缀合物45b标准曲线的4PL非线性回归计算蛋白质浓度。平均血浆浓度用于使用Phoenix WinNonlin 7.0来计算药代动力学参数。更详细方法描述提供于下文中。
在NA捕获ELISA中，Nunc Maxisorp 96孔板(目录号12-565-136，ThermoFisher)以0.1U/孔用来自1X KPL包被缓冲液(目录号5150-0041，SeraCare)中的A/California/04/2009(H1N1)(目录号11058-VNAHC，Sino Biological)的NA包被。板在室温下在轨道板式振荡器上(500rpm)经培育持续1h。血浆样品的连续稀释液经铺板且在振荡下在室温下经培育持续2h(样品稀释剂：PBS中的0.5％BSA0.025％Tween 20+初试雪貂血浆最终浓度1:100；血浆从鼻洗液样品中去除)。在每个板上运行介于0.230至500ng/mL范围内的缀合物45b标准曲线，一式两份。在2h培育之后，板在具有0.05％Tween 20的300μL PBS中洗涤5次。结合于板上的NA的缀合物接着在室温下用1:2,000稀释于样品稀释剂中的HRP缀合的抗人IgG FcF(ab’)2(目录号709-036-098，Jackson)探测持续1h。板接着在具有0.05％Tween 20的300μL PBS中洗涤8次且用TMB底物显影持续7-8分钟。所述反应用1N H2SO4停止。吸光度用EnSpire多模式读板器(PerkinElmer)在450nm处读取。使用GraphPad Prism Version 8，根据标准曲线的非线性回归分析(S型，4PL分析)内推血浆样品中的缀合物45b。接着使用所得平均血浆浓度，使用Phoenix WinNonlin 7.0通过非房室分析来计算药代动力学参数。
在Fc捕获ELISA中，Nunc Maxisorp 96孔板(目录号12-565-136，ThermoFisher)在4℃下用0.1μg/100μL/孔的碳酸盐缓冲液(目录号C3041，MilliporeSigma)中的小鼠抗人IgG(CH2结构域)克隆R10Z8E9(目录号MCA5748G，BioRad)包被过夜。板用300μL/孔PBST洗涤5次，且在轨道板振荡器上振荡(500rpm)下在室温下用200μL/孔PBST中的5％脱脂奶粉(目录号9999S，Cell Signaling Technology)封闭持续1h。血浆样品的连续稀释液经铺板且在振荡下在室温下经培育持续2h(样品稀释剂：PBS中的2.5％脱脂奶粉0.025％Tween 20+初试雪貂血浆最终浓度1:100；血浆从鼻洗液样品中去除)。在每个板上运行介于0.03至55ng/mL范围内的缀合物45b标准曲线，一式两份。培育2h之后，板用300μL/孔PBST洗涤5次。结合于板上的Fc的缀合物接着在振荡下在室温下用1:2,000稀释于样品稀释剂中的HRP缀合的抗人IgG Fc F(ab’)2(目录号709-036-098，Jackson Immunoresearch)探测持续1h。板接着用300μL/孔PBST洗涤8次，且用100μL/孔TMB底物试剂(目录号555214，BD)显影持续7-8分钟。所述反应用100μL/孔1N H2SO4停止，且吸光度用EnSpire多模式读板器(PerkinElmer)在450nm处读取。使用非线性回归分析及如上所述计算的PK参数内推血浆样品中的缀合物45b。
比较血浆及鼻洗液中缀合物45b水平的PK曲线分别显示于图93及94中。关于NA及Fc捕获ELISA，观察到类似的缀合物45b血浆暴露水平。在以3mg/kg单一IV给药之后第5天，平均缀合物45b雪貂血浆浓度为约10μg/mL。在匹配的时间点，鼻洗液中的水平为血浆中水平的大约3-5％。
实施例184.经皮下给予的缀合物45b在高病毒攻击致死性小鼠模型中针对流感A/PR/8/34(H1N1)的功效
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8周)中针对致死性IAVH1N1流感感染评估缀合物45b。攻击病毒(A/PR/8/34)是能够在小鼠中引起致死性感染的小鼠适应性分离株。所述实验包括2个实验研究组中的10组，每组5只小鼠。在第0天，小鼠在经氯胺酮/甲苯噻嗪的混合物(分别为150及10mg/kg)麻醉之后通过鼻内接种经30μl(2xLd95)体积病毒(1x；第1-5组)或经(50x LD95)病毒(25x；第6-10组)攻击。每天记录死亡率及体重，持续14天且具有20％体重损失的任何动物均评分为死亡。测试组在病毒攻击后2小时以10ml/kg的剂量体积接受缀合物45b(3、1、0.3或0.1mg/kg)的单一皮下(SC)治疗。研究设计概述于表157中。
在1x研究组中，经媒介物治疗的小鼠在第6天死于攻击病毒。相比之下，缀合物45b证明了非凡效能且在最低剂量下完全保护1x病毒攻击的小鼠(表158A)。体重数据(表159A)显示了所有经缀合物45b治疗的小鼠在研究结束时基本恢复的短暂重量损失。
在用超过25x病毒(50x LD95)攻击的组中，小鼠更快地死于感染，截至第5天达到80％死亡，截至第6天达到100％死亡(表158B)。经缀合物45b治疗的小鼠在1或3mg/kg时完全经保护，而0.3mg/kg组具有60％生存率。令人惊讶的是，即使在更大的病毒攻击下，1及3mg/kg治疗仅显示不太多的体重下降，且以净重量增加结束研究(表159B)。
此研究证明了缀合物45b即使在受到非常高的病毒滴定攻击下的非凡效能。
表157：一般研究设计
Figure BDA0003630331990007731
Figure BDA0003630331990007741
表158A：百分比生存(1x攻击)
Figure BDA0003630331990007742
表158B：百分比生存(25x攻击)
Figure BDA0003630331990007743
表159A：百分比体重(1x攻击)
Figure BDA0003630331990007751
nd＝未进行
表159B：百分比体重(25x攻击)
Figure BDA0003630331990007752
nd＝未进行
实施例185.缀合物45b在细胞病变效应(CPE)分析中针对高致病性流感A(H5N1，H7N9)的活性
针对BSL-3(高致病性)流感A进行体外分析以测定缀合物45b的效能，且一般地遵循标准程序。简而言之，不同浓度的测试物件与病毒(大约250TCID50)混合且使其在35℃下培育持续一小时。在培育之后，所述混合物添加至MDCK细胞的80-90％汇合单层中。在培育90分钟之后，洗涤细胞且再应用测试物件。所述单层随后用羧甲基纤维素覆盖以使病毒扩散降至最低且使其培育持续两天。在两天培养之后，细胞用PBS洗涤且用10％福马林固定。在固定之后，所述MDCK单层用Triton X-100渗透且用针对流感核蛋白的小鼠mAb免疫染色。单层经读取，且计算每个孔的经染色面积以测定EC50/100值。
所述研究的结果概述于表160中且证明缀合物45b针对具有大流行潜力的高致病性菌株的效能。重要的是，缀合物45b针对四种H5N1及一种H7N9分离株产生的IC50值在或低于17nM。相比之下，奥司他韦及扎那米韦在此小组中证明了对高致病性菌株的不完全覆盖。最值得注意的是其缺乏针对重要H7N9分离株的活性。然而，缀合物45b针对此分离株高度有效(0.5nM)。这些结果表明，缀合物45b治疗由高毒性流感引起的大流行病的潜力优于奥司他韦及扎那米韦的潜力，且大致等于巴洛沙韦。
表160：缀合物45b针对高致病性流感分离株的体外活性。
Figure BDA0003630331990007761
Figure BDA0003630331990007771
实施例186.在以30、10、3、1或0.3mg/kg单一IV注射之后，雪貂鼻洗液中的缀合物45b的8天PK分析
雪貂PK研究由IIT研究所(IITRI)使用3-5月龄的雄性雪貂执行。雪貂(n＝5)在用1x 106斑块形成单元(PFU)的A/California/07/2009(H1N1)流感病毒鼻内攻击之前24h通过单一静脉内(IV)注射施用30、10、3、1或0.3mg/kg(2mL剂量体积)的缀合物45b。在给药及病毒攻击之前使用氯胺酮(25mg/kg)及甲苯噻嗪(2mg/kg)混合物对雪貂进行麻醉。在攻击后第2、4、6及8天通过用氯胺酮(25mg/kg)及甲苯噻嗪(2mg/kg)麻醉动物，注射0.5mL补充有青霉素(100U/mL)、链霉素(100μg/mL)及庆大霉素(50μg/mL)的无菌PBS至每个鼻孔内，且收集排出的流体至标本杯中收集鼻洗液。记录回收的鼻洗液的体积且通过Fc捕获ELISA测定缀合物45b的浓度。缀合物45b分子经捕获在经神经氨酸酶包被的板上或经抗hIgG1抗体包被的板上，且接着使用HRP缀合的抗人IgG-Fc抗体进行检测。使用抗hIgG1 Fc抗体捕获hIgG1。
简而言之，Nunc Maxisorp 96孔板(目录号12-565-136，ThermoFisher)在4℃下用0.1μg/100μL/孔的碳酸盐缓冲液(目录号C3041，MilliporeSigma)中的小鼠抗人IgG(CH2结构域)克隆R10Z8E9(目录号MCA5748G，BioRad)包被过夜。板用300μL/孔PBST洗涤5次，且在轨道板振荡器上振荡(500rpm)下在室温下用200μL/孔PBST中的5％脱脂奶粉(目录号9999S，Cell Signaling Technology)封闭持续1h。鼻洗液样品开始1:10稀释于基质匹配的稀释剂中(来自初试动物的鼻洗液1:10稀释于具有0.5％BSA的PBS及0.025％Tween 20中)，接着3倍连续稀释且添加100μL/孔至板中，且在振荡下在室温下培育持续2h。在每个板上运行介于0.03至55ng/mL范围内的缀合物45b标准曲线，一式两份。培育2h之后，板用300μL/孔PBST洗涤5次。结合于板上的Fc的缀合物45b接着在振荡下在室温下用1:2,000稀释于样品稀释剂中的100μL/孔HRP缀合的抗人IgGFc F(ab’)2(目录号709-036-098，JacksonImmunoresearch)探测持续1h。板接着用300μL/孔PBST洗涤8次，且用100μL/孔TMB底物试剂(目录号555214，BD)显影持续7-8分钟。所述反应用100μL/孔1N H2SO4停止，且吸光度用
Figure BDA0003630331990007781
多模式读板器(PerkinElmer)在450nm处读取。使用GraphPadPrismVersion8，根据标准曲线的非线性回归分析(S型，4PL分析)内推雪貂鼻洗液样品中的缀合物45b。比较雪貂鼻洗液中缀合物45b的PK曲线显示于图94及图95中。在0.3与30mg/kg IV之间观察到缀合物45b雪貂鼻洗液水平的剂量成比例增加。0.3mg/kg队列的8天时间点低于Fc捕获检测限(1ng/mL)。
实施例187.缀合物45b在通过三种不同途径给药的致死性小鼠流感模型中针对流感A(H1N1)的功效
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8周)中针对致死性IAVH1N1流感感染评估缀合物45b。攻击病毒(A/California/07/2009)是能够在小鼠中引起致死性感染的大流行分离株。所述实验包含10组，每组5只小鼠。在第0天，所有小鼠均在经氯胺酮/甲苯噻嗪(分别为100及10mg/kg)轻微麻醉之后通过鼻内接种经30μl(约3E4个病毒/小鼠)体积的病毒(3x LD95)攻击。各组在攻击之后2小时经静脉内(IV)、肌内(IM)或皮下(SC)接受缀合物45b或媒介物(PBS)的单一治疗(表160)。每天监测死亡及体重(BW)，持续14天。损失超过20％BW的任何小鼠均评分为死亡。
表160：一般研究设计
Figure BDA0003630331990007791
为了通过不同给药途径测定缀合物45b的效能，匹配浓度的缀合物(1、0.3及0.1mg/kg)经IV、IM或SC给药。如通过生存所测量，所有给药途径在0.1mg/kg的任何给药途径下均为100％有效的，0.1mg/kg先前被确定为当经SC给予缀合物45b时的最低有效剂量(表161)。然而，经媒介物治疗的小鼠截至第6天达到80％死亡。当通过生存测量时，这些数据证明了缀合物45b的等效效能，无论给药途径如何。
表161：百分比生存
Figure BDA0003630331990007792
Figure BDA0003630331990007801
体重数据强烈支持证明通过任一给药途径的缀合物45b的高度有效性的生存数据(表162)。如对于此强毒大流行分离株而言典型的是，小鼠在第3天或第4天左右显示大约10％的BW损失。引人注目的是，相同剂量浓度之间的BW差异仅因给药途径而变化很小(参见斜体字，表162)。此研究的BW数据进一步支持这样的结论，即缀合物45b是有效的，无论给药途径如何。
表162：百分比体重*
Figure BDA0003630331990007802
*数据是组中第一例死亡之前的组平均值
通过两种不同的读出，发现若通过IV、SC或IM给药途径给药，缀合物45b是同等有效的。缀合物45b的给药途径灵活性是显著优势，必要时允许针对医院及门诊环境的不同制剂及给药途径。
实施例188合成缀合物46
制备点击试剂溶液：PBS缓冲溶液中的0.0050M CuSO4：10.0mg CuSO4溶解在12.53mL PBS中，接着采用5.00mL此CuSO4溶液且添加43.1mg BTTAA(CAS#1334179-85-9)及247.5mg抗坏血酸钠以得到点击试剂溶液(0.0050M CuSO4、0.020M BTTAA及0.25M抗坏血酸钠)。
向叠氮基官能化Fc(65.5mg，10.0mL，1.13μmol，叠氮基DAR约5.9，SEQ ID NO:76)于15mL离心管中的溶液中添加炔衍生的小分子(22.7mg，15.2μmol，描述于Int-83.实施例145中，Fc的每个叠氮基3.0当量)。在轻柔地搅拌以溶解所有固体之后，混合物用点击试剂溶液(1.80mL)处理。所得混合物在环境温度下轻柔地经旋转持续12小时。其相继通过在蛋白A柱上的亲和力色谱法、尺寸排阻色谱法(参见一般缀合物纯化方案)经纯化。经纯化最终产物的Maldi TOF分析给出66,420Da的平均质量(DAR＝5.8)。产量57mg，具有98％纯度。所得缀合物描绘于图102中。
申请人指出，缀合物46可替代地使用具有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的Fc结构域来制备，对应于Fc同种异型的差异。预期不同的同种异型在本文描述的特性方面表现相同。
申请人进一步指出，编码缀合物46的Fc的核酸构建体包含编码SEQ ID NO:67的氨基酸序列(其包含C端赖氨酸残基)的核酸。在表达后，缀合物46的Fc的C端赖氨酸被蛋白水解切割，产生具有SEQ ID NO:76的序列的Fc。C端赖氨酸的存在与否不会改变Fc或对应缀合物的特性。
实施例189.IV施用缀合物45b及缀合物46之后的30天比较非人类灵长类动物PK研究
由BTS Research(San Diego,CA)使用体重介于3.5-8.5kg范围内的5-9岁雄性及雌性食蟹猕猴执行非人类灵长类动物(NHP)PK研究。NHP经IV注射2mg/kg的测试物件(0.4mL/kg的剂量体积)。动物经圈养于标准IACUC批准的圈养条件下。在适当时间，对动物进行非末端放血(通过股静脉或头静脉)，其中血液经收集于K2EDTA管中以预防凝血。所收集的血液经离心(2,000xg，持续10分钟)且抽出血浆以随时间分析测试物件浓度(表163)。通过夹心ELISA测量缀合物45b及缀合物46在每个时间点的血浆浓度。简而言之，测试物件经捕获于Fc包被的板上且接着使用HRP缀合的抗人IgG-Fc抗体进行检测。在GraphPadPrism中使用缀合物45b或缀合物46标准曲线的4PL非线性回归计算蛋白质浓度。更详细的方法描述提供于上文。比较缀合物45b及缀合物46的曲线显示于图97中。与缀合物45b的约10天相比，缀合物46证明了显著改善的约45天的终末半衰期。缀合物46的AUC比缀合物45b的AUC大2倍(表163)。
Figure BDA0003630331990007831
实施例190.缀合物45b及护理标准比较物在细胞病变效应(CPE)分析中针对流感A季节性、大流行及耐药菌株的活性
进行体外分析定以测定与奥司他韦、扎那米韦及巴洛沙韦对照相比缀合物45b的效能，如实施例166中所执行，且一般地遵循标准程序。数据显示于表164-167中。
表164：MDCK SIAT1细胞中针对流感A/CA/07/2009(H1N1)pdm的CPE
Figure BDA0003630331990007841
表165：MDCK SIAT1细胞中针对流感A WT及H275Y突变体(H1N1)的CPE
Figure BDA0003630331990007842
表166：MDCK SIAT1细胞中针对流感A WT及E119V突变体(H3N2)的CPE
Figure BDA0003630331990007843
Figure BDA0003630331990007851
表167：针对MOI 0.01的流感B的CPE[nM]
Figure BDA0003630331990007852
实施例191.比较缀合物45b的血浆及上皮衬液(ELF)浓度的14天小鼠PK研究
在研究开始之前，让来自Charles River Laboratories的雌性BALB/c小鼠适应5天。每笼圈养3-6只动物，自由进食及饮水。所有程序均按照NeoSome IACUC政策及指南执行。小鼠经皮下(SC)注射20mg/kg的测试物件(10mL/kg的剂量体积)。在选定的时间点，通过吸入CO2对3只小鼠实施安乐死。血液经由心脏穿刺经收集到K2EDTA管中用于血浆保留。血液收集之后，通过暴露气管、插入23G管连接物且用无菌1X PBS pH 7.4执行2x 0.5mL冲洗来执行支气管肺泡灌洗(BAL)。记录回收的流体体积且保留。BAL程序完成之后，移除肺，称重且储存在-80℃下。倾倒出血浆及BAL液(BALF)的等分试样，之后在-80℃下储存样品，用于尿素定量分析。经收集的BALF在室温下以12,000RPM离心持续5分钟以沉淀肺泡巨噬细胞，沉淀及上清液两者均储存在-80℃下直至发货给赞助商。如上所详述通过间接ELISA测量缀合物45b在每个时间点的血浆浓度。简而言之，缀合物45b分子经捕获在经神经氨酸酶(NA)包被的板上，且接着使用HRP缀合的抗人IgG Fcγ特异性F(ab')2进行检测。对如上所述收集的BALF执行相同的ELISA。缀合物45b血浆浓度在GraphPad Prism中使用缀合物45b标准曲线的4PL非线性回归来计算。ELF体积及ELF中的缀合物45b浓度使用尿素作为稀释标记物进行测定，如前所述(Rennard等人，1986J Appl Physiol 60:532-538)。比较缀合物45b与ELF水平的曲线显示于图98中。到注射后2h，缀合物45b上皮衬液(ELF)水平在剩余的时间过程中为血浆暴露水平(AUC)的约60％，这表明缀合物45b在肺中几乎立即从血浆分配到ELF(图98，表168)。
表168：在2周内小鼠中缀合物45b血浆及ELF水平。
Figure BDA0003630331990007861
实施例192.在SCID小鼠中比较IV、SC及IM施用缀合物45b的7天小鼠PK研究
使用缺乏适应性免疫系统的6周龄雄性严重复合型免疫缺陷(SCID)小鼠执行小鼠PK研究。小鼠经IV、SC或IM注射5mg/kg的测试物件(10mL/kg的剂量体积)。动物经圈养于标准IACUC批准的圈养条件下。在适当时间，对动物进行非末端放血(眶后、颊或通过尾静脉)，其中血液经收集于K2EDTA管中以预防凝血。所收集的血液经离心(2,000xg，持续10分钟)且抽出血浆以随时间分析测试物件浓度。如上所详述通过ELISA测量缀合物45b在每个时间点的血浆浓度。简而言之，缀合物45b分子经捕获在经神经氨酸酶(NA)包被的板上，且接着使用HRP缀合的抗人IgG Fcγ特异性F(ab')2进行检测。关于Fc捕获ELISA，使用抗hIgG1 Fc抗体捕获hIgG1且接着使用HRP缀合的抗人IgG Fcγ特异性F(ab')2进行检测。在GraphPadPrism中使用缀合物45b标准曲线的4PL非线性回归计算蛋白质浓度。比较7天内SCID小鼠的缀合物45b PK曲线的曲线显示于图99-100中。经SC及IM的缀合物45b的血浆暴露水平是相当的，且与IV施用相比，SC或IM途径的所得生物利用度大约为77％。在注射后大约24h，所有给药途径的缀合物45b的血浆浓度是相等的。
实施例193.比较SC施用缀合物45b与缀合物46的7天小鼠PK研究
使用6周龄雄性CD-1小鼠执行小鼠PK研究。小鼠经SC注射10mg/kg的测试物件(10mL/kg的剂量体积)。动物经圈养于标准IACUC批准的圈养条件下。在适当时间，对动物进行非末端放血(眶后、颊或通过尾静脉)，其中血液经收集于K2EDTA管中以预防凝血。所收集的血液经离心(2,000x g，持续10分钟)且抽出血浆以随时间分析测试物件浓度。如上所详述通过间接ELISA测量缀合物45b在每个时间点的血浆浓度。简而言之，缀合物45b分子经捕获在经神经氨酸酶(NA)包被的板上，且接着使用HRP缀合的抗人IgG Fcγ特异性F(ab')2进行检测。在GraphPad Prism中使用缀合物45b标准曲线的4PL非线性回归计算蛋白质浓度。比较缀合物45b及缀合物46的7天PK曲线的曲线显示于图101中。缀合物45b的血浆暴露水平比缀合物46高大约50％。与WT人IgG1相比，已知人IgG1 YTE Fc变体在小鼠中的半衰期缩短，这是由于在中性pH下小鼠FcRn结合增强，这否定了在酸性pH下与小鼠FcRn结合的改善(Dall'Acqua等人2002J Immunol 169:5171-5180)。
实施例194.缀合物45b及巴洛沙韦的组合治疗
细胞病变效应(CPE)。单层MDCK Siat1细胞用流感A亚型以适当的在0.01-1之间变化的MOI感染。缀合物45b单独或与护理标准剂(例如巴洛沙韦)组合进行测试，浓度范围在1-1,000nM之间，且在37℃、5％CO2下用流感A培育持续3天。CPE通过结晶紫染色通过读取595nm处的吸光度来测定。数据显示于表169-172中。当与巴洛沙韦组合使用时，缀合物45b在显著低于当单独使用时的浓度下有效抑制病毒复制(EC50降低>10倍)，即使当巴洛沙韦以低于其EC50的浓度存在时也是如此。
表169：在MOI 0.01时MDCK SIAT细胞中针对流感A/CA/07/2009(H1N1)pdm的CPE中存在固定浓度的巴洛沙韦时缀合物45b EC50的变化
Figure BDA0003630331990007881
单独巴洛沙韦的EC50＝2.41nM
表170：在MOI 0.1时MDCK SIAT细胞中针对流感A/CA/07/2009(H1N1)pdm的CPE分析中存在固定浓度的巴洛沙韦时缀合物45b EC50的变化
Figure BDA0003630331990007882
Figure BDA0003630331990007891
单独巴洛沙韦的EC50＝7.95nM
表171：在MOI 0.01时MDCK SIAT细胞中针对流感A/Texas/71/2017(H3N2)pdm的CPE分析中存在固定浓度的巴洛沙韦时缀合物45b EC50的变化
Figure BDA0003630331990007892
单独巴洛沙韦的EC50＝8.238nM
表172：在MOI 0.1时MDCK SIAT细胞中针对流感A/Texas/71/2017(H3N2)pdm的CPE分析中存在固定浓度的巴洛沙韦时缀合物45b EC50的变化
Figure BDA0003630331990007893
单独巴洛沙韦的EC50＝17.31nM
实施例195.合成Int-91
Figure BDA0003630331990007901
步骤a.
Figure BDA0003630331990007902
向先前制备的扎那米韦衍生物(1.993g，2.362mmol，描述于实施例79中的Int-22)于甲醇(30mL)中的0℃搅拌溶液中添加DBU(2.4mL)。温度升至环境温度，且在1h之后，所述反应完全演变为所需产物。通过旋转蒸发移除所有挥发物。残余物通过硅胶柱使用以0％至30％甲醇及二氯甲烷洗脱的Isco CombiFlash液体色谱仪经纯化。产量1.584g，产率82％。通过LCMS发现的离子：[(M+H+Na)]+＝840.0,[(M+H)]+＝818.2。
步骤b.
Figure BDA0003630331990007911
借助于注射泵在1小时内向步骤a产物(500mg，0.611mmol)于吡啶(15.0mL)中的0℃搅拌溶液中添加甲苯磺酰氯(146mg，0.764mmol)、5.0mL二氯甲烷)。在完全消耗甲苯磺酰氯后(HPLC监测)，以相同方式添加等分的甲苯磺酰氯，且此添加再重复两次(反应结束时甲苯磺酰氯的总当量为5)。所述反应用甲醇(0.5mL)淬灭且通过旋转蒸发移除所有挥发物。残余物通过硅胶柱使用以0％至30％甲醇及二氯甲烷洗脱的Isco
Figure BDA0003630331990007912
液体色谱仪经纯化。产量0.429g，产率72％。通过LCMS发现的离子：[(M+H)]+＝972.2。
步骤c.
Figure BDA0003630331990007921
向步骤b产物(547mg，0.563mmol)于DMF(5.0mL)中的搅拌溶液中添加18-冠-6(59mg，0.225mmol)及叠氮化钠(183mg，2.814mmol)，接着温度升至50℃。通过LCMS显示反应完成后，通过旋转蒸发移除所有挥发物。残余物通过硅胶柱使用以0％至30％甲醇及二氯甲烷洗脱的Isco
Figure BDA0003630331990007923
液体色谱仪经纯化。产量0.333g，产率70％。通过LCMS发现的离子：[(M+H)]+＝843.2。
步骤d.
Figure BDA0003630331990007922
向步骤c产物(548mg，0.650mmol)于THF(8.0mL)中的搅拌溶液中添加环丙烷酸N-羟基丁二酰亚胺酯(237mg，1.300mmol)及三甲基膦(133μL，1.300mmol)。通过LCMS显示完成后，通过旋转蒸发移除所有挥发物。残余物通过硅胶柱使用以0％至50％甲醇及二氯甲烷洗脱的Isco
Figure BDA0003630331990007924
液体色谱仪经纯化。产量0.488g，产率85％。通过LCMS发现的离子：[(M+H)]+＝885.2。
步骤e.
Figure BDA0003630331990007931
向步骤d产物(488mg，0.551mmol)于四氢呋喃及水(2.0mL)中的0℃搅拌溶液中添加氢氧化锂(14mg，0.606mmol)。通过LCMS显示完成后，添加amberlite IRN-77直至发现pH为酸性。所述混合物借助于乙酸乙酯过滤，且弃去所述树脂。通过旋转蒸发移除所有挥发物且所述粗材料溶解于二氯甲烷(4.0mL)及TFA(2.0mL)中。完成后，通过旋转蒸发蒸发所有挥发物。残余物通过HPLC(0至40％甲醇及水，使用0.1％TFA作为修饰剂)经纯化。产量370mg，产率86％。通过LCMS发现的离子：[(M+H)]+＝671.2。
实施例196.合成缀合物47
叠氮基官能化Fc(50mg，5.0mL，0.862μmol，SEQ ID NO:73，DAR-7.0)的溶液添加至含有炔官能化小分子(6.1mg，7.760μmol，Int-91，如实施例195中所述制备)的40mL离心管中。在轻柔地振荡以溶解所有固体之后，向其中添加L-抗坏血酸钠(12.3mg，62.08μmol)、硫酸铜(II)(2.5mg，15.52μmol)及BTTAA(26.7mg，62.08μmol)于PBS 7.4缓冲液(6.984mL)中的溶液。所得混合物轻柔地振荡过夜。其相继通过在蛋白A柱上的亲和力色谱法、尺寸排阻色谱法(参见本文提供的一般缀合物纯化方案)经纯化。经纯化最终产物的Maldi TOF分析给出64,423Da的平均质量(DAR＝6.9)。产量35.3mg，70％产率。
编码缀合物47的Fc的核酸构建体包含编码SEQ ID NO:64的氨基酸序列(其包含C端赖氨酸残基)的核酸。在表达后，缀合物47的Fc的C端赖氨酸被蛋白水解切割，产生具有SEQ ID NO:73的序列的Fc。C端赖氨酸的存在与否不会改变Fc或对应缀合物的特性。
实施例197.合成氨基甲酸酯Int-92
Figure BDA0003630331990007941
步骤a.
Figure BDA0003630331990007942
如实施例21所述制备的中间体(5.15g，12.74mmol)溶解于丙酮(100mL)中。添加Amberlite IRN-77酸性树脂，使pH达到约4(当用pH试纸测量时)。加热所述反应直至所有起始材料经消耗。冷却后，所述反应经过滤且滤液通过旋转蒸发经浓缩。残余物通过硅胶柱使用以0％至30％甲醇及二氯甲烷洗脱的Isco
Figure BDA0003630331990007952
液体色谱仪经纯化。产量3.535g，产率62％。通过LCMS发现的离子：[(M+H+Na)]+＝467.2,[(M+H-t-Bu)]+＝389.2,[(M+H-Boc)]+＝345.2。
步骤b.
Figure BDA0003630331990007951
向步骤a产物(3.258g，7.391mmol)及对硝基苯酚氯甲酸酯(2.979g，14.78mmol)于吡啶(80mL)中的搅拌溶液中添加DMAP(1.806g，14.78mmol)。18h之后，添加额外的对硝基苯酚氯甲酸酯(1.490g，7.391mmol)及DMAP(0.903g，7.391mmol)。反应完成后，通过旋转蒸发移除所有挥发物。残余物溶解于DCM(250mL)中且过滤。滤液相继用2N硫酸溶液(3x 100mL)、饱和碳酸氢钠溶液(3x 100mL)洗涤。有机物相继用盐水(200mL)、硫酸镁干燥，经过滤且浓缩。残余物通过硅胶柱使用以0％至100％丙酮及己烷洗脱的Isco
Figure BDA0003630331990007953
液体色谱仪经纯化。产量4.122g，产率91％。通过LCMS发现的离子：[(M+H+Na)]+＝632.1,[(M+H)]+＝554.0,[(M+H-Boc)]+＝510.2。
步骤c.
Figure BDA0003630331990007961
向步骤b产物(4.00g，6.562mmol)及DIPEA(2.400mL，13.78mmol)于DCM(40mL)中的0℃搅拌溶液中添加炔丙基-PEG4-胺。温度升至环境温度且继续搅拌直至通过LCMS显示完成。通过旋转蒸发移除所有挥发物。残余物通过硅胶柱使用以0％至50％甲醇及二氯甲烷洗脱的Isco
Figure BDA0003630331990007963
液体色谱仪经纯化。产量4.130g，产率90％。通过LCMS发现的离子：[(M+H+Na)]+＝724.1,[(M+H-Boc)]+＝602.2。
步骤d.
Figure BDA0003630331990007962
步骤c的产物(4.13g，5.885mmol)溶解于乙酸(24mL)及水(12mL)中，接着搅拌直至通过LCMS观察到完全转化。所述反应通过旋转蒸发经浓缩。通过注射泵缓慢地向此残余物(4.60g，5.340mmol)于吡啶(150mL)中的搅拌溶液中添加甲苯磺酰-Cl(1.392g，7.299mmol)于DCM(10mL)中的溶液。在消耗Tos-Cl后，且添加额外的量(1.392g，7.299mmol)。在起始材料完全转化后，通过旋转蒸发移除所有挥发物。残余物通过硅胶柱使用以0％至50％甲醇及二氯甲烷洗脱的Isco
Figure BDA0003630331990007964
液体色谱仪经纯化。产量3.380g，产率71％。通过LCMS发现的离子：[(M+H+Na)]+＝838.0,[(M+H-Boc)]+＝716.2。
步骤e.
Figure BDA0003630331990007971
向步骤d甲苯磺酸盐(3.280g，4.020mmol)于DMF(30mL)中的搅拌溶液中添加18-冠-6(425mg，1.608mmol)及叠氮化钠(1.307g，20.10mmol)，接着温度升至50℃。通过LCMS显示完成后，通过旋转蒸发蒸发所有挥发物。残余物通过硅胶柱使用以0％至50％甲醇及二氯甲烷洗脱的Isco
Figure BDA0003630331990007973
液体色谱仪经纯化。产量2.651g，产率96％。通过LCMS发现的离子：[(M+H+Na)]+＝709.2,[(M+H-Boc)]+＝587.2。
步骤f.
Figure BDA0003630331990007972
向步骤e产物(2.649mg，3.858mmol)于THF(20mL)中的搅拌溶液中添加环丙烷酸N-羟基丁二酰亚胺酯(1.413g，7.715mmol)及三甲基膦(795μL，7.715mmol)。在通过LCMS显示反应完成后，通过旋转蒸发蒸发所有挥发物。残余物通过硅胶柱使用以0％至50％甲醇及二氯甲烷洗脱的Isco
Figure BDA0003630331990007974
液体色谱仪经纯化。产量1.744g，产率62％。通过LCMS发现的离子：[(M+H)]+＝729.2。
步骤g.
Figure BDA0003630331990007981
向步骤f产物(1.744g，2.393mmol)于在DCM(15mL)中的0℃搅拌溶液中添加TFA(15mL)，接着温度升至环境温度。在消耗所有起始材料后，通过旋转蒸发移除挥发物。此粗物质的LCMS分析显示[(M+H)]+＝629.2。此材料溶解于DIPEA(7.502mL，43.07mmol)于DCM(15mL)中的0℃搅拌溶液中，且用双-Boc-对硝基苯酚氯甲酸酯(817mg，2.632mmol)处理。在消耗起始材料后，通过旋转蒸发移除所有挥发物。残余物通过硅胶柱使用以0％至50％甲醇及二氯甲烷洗脱的Isco
Figure BDA0003630331990007983
液体色谱仪经纯化。产量631mg，产率30％。通过LCMS发现的离子：[(M+H)]+＝871.2。
步骤h.
Figure BDA0003630331990007982
向步骤g产物(315mg，0.362mmol)于乙腈(4.0mL)及1.0M NaCl于水中的溶液(8mL)中的0℃搅拌溶液中添加1.0M NaOH于水中的溶液(15mg，380μL，0.380mmol)。继续搅拌过夜，同时使温度温和地达到环境温度。所述反应用乙酸(100μL)淬灭，且通过旋转蒸发移除所有挥发物。所述残余物悬浮于DCM:MeOH＝9:1中且过滤。通过旋转蒸发移除所有挥发物。此粗材料的LCMS分析显示具有所需[(M+H)]+＝857.2的主峰。残余物溶解于DCM(3.0mL)及TFA(3.0mL)中以移除boc基团。通过LCMS显示完成后，通过旋转蒸发移除所有挥发物。残余物通过HPLC(0至40％甲醇及水，使用0.1％TFA作为修饰剂)经纯化。产量370mg，产率86％。通过LCMS发现的离子：[(M+H)]+＝657.2。
实施例198.合成缀合物48
叠氮基官能化Fc(33.3mg，3.33mL，0.576μmol，SEQ ID NO:73；DAR-7.0)的溶液添加至含有炔官能化小分子(6.1mg，7.760μmol，Int-92，如实施例197中所述制备)的50mL离心管中。在轻柔地振荡以溶解所有固体之后，向此溶液中添加L-抗坏血酸钠(8.6mg，11.21μmol)、硫酸铜(II)(2.5mg，15.52μmol)及BTTAA(26.7mg，62.08μmol)于PBS 7.4缓冲液(6.984mL)中的溶液。所得溶液轻柔地经旋转过夜。其相继通过在蛋白A柱上的亲和力色谱法、尺寸排阻色谱法(参见本文提供的一般缀合物纯化方案)经纯化。经纯化最终产物的Maldi TOF分析给出63,734Da的平均质量(DAR＝6.2)。产量35.3mg，63％产率。
编码缀合物48的Fc的核酸构建体包含编码SEQ ID NO:64的氨基酸序列(其包含C端赖氨酸残基)的核酸。在表达后，缀合物48的Fc的C端赖氨酸被蛋白水解切割，产生具有SEQ ID NO:73的序列的Fc。C端赖氨酸的存在与否不会改变Fc或对应缀合物的特性。
实施例199.DAR对神经氨酸酶抑制的影响
神经氨酸酶抑制(NAI)
测试物件在37℃、5％CO2下用活病毒以指定的PFU/mL培育持续20min。NA-Fluor底物添加至适当的孔中，且在37℃、5％CO2下培育持续1h。NAI通过读取355nm处激发/460nm处发射荧光来测定。使用下式计算％NAI：％NAI＝(1-(FI病毒与TA-FI无病毒))/(FI单独病毒-FI无病毒)x100。使用GraphPadPrism中的非线性回归分析软件计算IC50。
缀合物45a证明了针对流感A/PR/8/1934(H1N1)的DAR依赖性增加的活性，在DAR3.3或更高时达到最大活性(表173)。
A/Bethesda/956/2006(H3N2)R292K突变体显示对奥司他韦的抗性且显示针对扎那米韦的敏感性降低。缀合物45a未改变针对此突变体且证明了针对流感的DAR依赖性增加的活性，在DAR 3.3或更高时达到最大活性(表173)。
表173：缀合物110针对流感A(H1N1)及(H3N2)亚型的IC50概述
Figure BDA0003630331990008001
实施例200.继发感染小鼠模型
MRSA继发细菌感染模型。
在经3E3 PFU/小鼠(亚致死性)的A/CA/07/2009(H1N1)pdm(Virapur,Lot#E1020A1)鼻内攻击的6-8周龄雌性BALB/c小鼠(Charles River)中进行功效研究。缀合物45b或人IgG1 Fc对照在攻击后2h以0.3-3mg/kg作为单一皮下(SC)剂量经施用。在感染后第6天，小鼠经5E7菌落形成单元(CFU)的亚致死性剂量的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)TCH1516经鼻内攻击(图104)。
关于细菌肺负荷测定，小鼠用CO2处死且收集两片肺叶以测定MRSA感染后24h的细菌负荷。肺使用MagNA Lyser(Roche)用1mL PBS中的1mm二氧化硅珠粒均质化。在6,000rpm下进行均质化持续60s且在运行之间在冰上冷冻持续5min。关于CFU测定，肺匀浆连续10倍稀释于PBS中且铺板在LA板上。CFU相对于肺的重量进行计算(CFU/g肺)。关于生存研究，监测动物的一般健康状况且每天记录体重(BW)，持续14天。垂死或表现出>20％体重(BW)损失的动物经记录为死亡。使用GraphPad Prism(版本6.07)执行生存、BW曲线及统计分析。
缀合物45b证明了针对相继经流感A/CA/07/2009(H1N1)pdm的亚致死性攻击、MRSA的亚致死性感染的细菌重复感染小鼠模型的保护作用。在用hIgG1 Fc治疗的小鼠中，所述两种亚致死性感染累积导致100％死亡(图105A)。以0.3或3mg/kg的缀合物45b治疗——以预防流感疾病——导致小鼠100％生存。在用MRSA攻击之后24h，与hIgG1 Fc相比，缀合物45b证明了肺中细菌负荷的减少(图105B)。缀合物45b治疗后的细菌负荷与仅用MRSA攻击的小鼠中观察到的负荷相当。
这些数据证明了缀合物45b在减轻流感感染并发症(诸如导致与流感感染相关联的死亡的金黄色葡萄球菌重复感染)方面的潜力。
肺炎链球菌继发细菌感染模型
在经3E1 PFU/小鼠(亚致死性)的A/CA/07/2009(H1N1)pdm(Virapur,Lot#1512B4)鼻内攻击的6-8周龄雌性BALB/c小鼠(Charles River)中进行功效研究(图106)。缀合物45b或人IgG1 Fc对照在攻击后2h以0.3mg/kg作为单一皮下(SC)剂量经施用。在感染后第6天，小鼠经1E5 CFU的亚致死性剂量的肺炎链球菌(SPN)菌株6301经鼻内攻击。监测动物的一般健康状况且每天记录BW，持续14天。垂死或表现出>20％或更多BW损失的动物经记录为死亡。使用GraphPadPrism(版本6.07)执行生存、BW曲线及统计分析。
缀合物45b证明了针对相继经流感A/CA/07/2009(H1N1)pdm的亚致死性攻击、SPN的亚致死性感染的细菌重复感染小鼠模型的保护作用。在用hIgG1 Fc治疗的小鼠中，所述两种亚致死性感染累积导致100％死亡。以0.3mg/kg的缀合物45b治疗——以预防流感疾病——导致小鼠100％生存，证明缀合物45b针对细菌重复感染的最常见原因肺炎链球菌在减轻流感感染并发症方面的潜力(图107)。细菌重复感染显著导致与流感相关联的死亡。
实施例201.缀合物45a治疗BALB/c小鼠中A/Vietnam/1203/2004(H5N1)病毒感染的给药优化研究
用于此实验的雌性18-20g BALB/c小鼠从Charles River Laboratories(Wilmington,MA)获得。小鼠在使用之前隔离6天且在Laboratory Animal ResearchCenter of Utah State University以Teklad RodentDiet(Harlan Teklad)及自来水维持。
高致病性禽流感A/Vietnam/1203/2004(H5N1)从Centers for Disease Control(Atlanta,GA)获得。病毒扩增在Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞(American Type CultureCollection,Manassas,VA)中进行。亲本病毒传代一次以制备攻击池。接着在使用之前在MDCK细胞中滴定所述攻击池。
动物数量及研究组描述于表174中。在病毒感染之前7天或病毒感染之后4小时，各组小鼠通过皮下(sc)注射0.3、1、3及10mg/kg剂量的缀合物45a经单次治疗。用作病毒攻击剂量的阳性对照的奥司他韦(10mg/kg)通过口服管饲法施用，每天两次，感染后4小时开始。用作安慰剂的未缀合Fc以与缀合物45a相似的方式施用。此外，维持三只未治疗对照小鼠用于重量比较。
关于流感病毒攻击，小鼠通过ip注射氯胺酮/甲苯噻嗪(50mg/kg//5mg/kg)经麻醉，之后通过鼻内途径以90μl接种物体积每只小鼠大约5个斑块形成单元(1x LD90)的病毒经攻击。
小鼠在治疗之前称重且接着此后每隔一天称重，以评估治疗对改善病毒感染引起的体重损失的影响。观察所有小鼠的发病及死亡直至第21天。
生成Kaplan-Meier生存曲线且通过对数秩(Mantel-Cox)检验进行比较，接着使用Prism 8.3(GraphPad Software Inc.)中的Gehan-Breslow-Wilcoxon检验进行成对比较。通过单因素方差分析(ANOVA)分析平均体重，接着使用Prism 8.3进行Tukey多重比较检验。
表174：功效的给药优化研究
Figure BDA0003630331990008031
在病毒感染之前7天用缀合物45a治疗后，观察到10mg/kg剂量的保护作用为100％，0.3及3mg/kg剂量的保护作用为80％，且1mg/kg剂量的保护作用为70％(图108A)。安慰剂组的30％生存是不寻常的，因此1mg/kg剂量未提供显著保护。此外，所有剂量均提供了显著保护以抵御重量损失(图108B)。
在病毒感染之后4小时用缀合物45a治疗后，观察到1、3及10mg/kg剂量的保护作用为100％，且0.3mg/kg剂量的保护作用为70％(图109A)。由于在安慰剂组中观察到30％生存，0.3mg/kg剂量不提供显著保护。此外，所有剂量均提供了显著保护以抵御重量损失(图109B)。
实施例202.酶联凝集素分析(ELLA)。
ELLA分析按照Gao等人(J.Vis.Exp.Doi:10.3791/54573,2016)中所报道进行，稍作修改。简而言之，Nunc Maxisorp 96孔板(ThermoFisher)在4℃下用1x KPL包被缓冲液(SeraCare)中的2.5μg胎球蛋白(Sigma-Aldrich)包被过夜。第二天，板用补充有0.05％Tween20(PBST)的pH 7.4PBS洗涤。测试物件在0.001-1000nM下进行测试且以50μL/孔添加。流感病毒以50μL/孔以1e5-1e6 PFU/孔添加。板在37℃、5％CO2下培育持续16-18h。洗涤板之后，缀合于HRP(PNA-HRP)的花生凝集素(0.13μg)持续2h，再次洗涤且用100μL/孔TMB底物(BD)显影持续3-5min。所述反应用100μL/孔1N H2SO4停止。吸光度用EnSpire多模式读板器在450nm处读取。IC50用GraphPad Prism版本8使用非线性回归分析(剂量-反应(抑制))来计算。
缀合物45b在ELLA中证明了与奥司他韦或扎那米韦相比增加的效能，其中IC50在针对代表性流感A与B菌株之间(表175)。
表175：酶联凝集素分析(ELLA)中缀合物45b针对流感A及B的活性(IC50)
Figure BDA0003630331990008051
实施例203.允许与流感病毒神经氨酸酶潜在多价结合的缀合物45b属性
缀合物45b包含化学及生物稳定的Int-83缀合物，其具有N端延伸的hIgG1 Fc结构域(SEQ ID NO:73)。如图110B所示，Int-83包含扎那米韦二聚体，所述二聚体经由扎那米韦C7羟基上的氨基甲酸甲酯部分对称地融合到柔性
Figure BDA0003630331990008052
中央接头上，所述中央接头将扎那米韦单体间隔大约
Figure BDA0003630331990008053
Int-83的多个拷贝经由基于32原子柔性聚乙二醇(PEG)的交联剂缀合于Fc结构域上的表面暴露赖氨酸残基，所述交联剂当接头完全延伸时使所述多个拷贝从Fc表面突出35-
Figure BDA0003630331990008054
(图110B)。特定溶剂暴露赖氨酸残基是缀合位点(图110B)。用于缀合物45b的Int-83与Fc的平均比率为4.5:1。缀合物45b的合成描述于实施例156中。结合的优选位点的空间分布(图110B)加上交联剂的长度及柔性，原则上允许缀合物45b同时与四聚体内的多个NA活性位点相互作用(分别为大约45或
Figure BDA0003630331990008055
图110A)。此外，缀合物45b中Int-83的间距允许在同一病毒体
Figure BDA0003630331990008056
上的相邻NA四聚体或两个病毒体
Figure BDA0003630331990008057
的NA活性位点桥接。
缀合物45b在体外的普遍活性及低耐药潜力
我们使用采用小分子底物的标准神经氨酸酶抑制(NAI)分析研究了在没有免疫参与的情况下缀合物45b的内在抗病毒活性。缀合物45b证明了针对流感A及B的有效活性，针对流感A H1N1菌株的中值IC50为1.7nM(n＝7，介于1.1nM至4.8nM范围内)，针对流感AH3N2菌株为4.2nM(n＝6，介于0.3nM至14.9nM范围内)且针对流感B菌株为4.4nM(n＝6，介于1.0nM至20.7nM范围内)(表176)。一般而言，缀合物45b的表现与扎那米韦及奥司他韦相似，但对流感B菌株比奥司他韦更有效(表176)。重要的是，缀合物45b IC50未改变针对临床相关变体，所述变体对已批准的神经氨酸酶抑制剂的敏感性降低。缀合物45b在H1N1亚型中针对H275Y的活性为1.7nM，在H3N2亚型中针对E119V为2.6nM、针对R292K为1.2nM，或在B型中针对R152K为6.7nM。奥司他韦或扎那米韦针对这些变体的效能分别损失高达>100倍或>10倍(表177)。缀合物45b保留了针对H5N1及H7N9病毒的细胞裂解物的有效活性，其中IC50分别为1.9nM及1.2nM(表178)。奥司他韦及扎那米韦对H5N1具有相当的活性，但奥司他韦及扎那米韦针对H7N9的活性损失了，其中IC50分别为>1μM或>100nM(表178)。
表176：缀合物45b在神经氨酸酶抑制(中值IC50)及基于细胞的细胞病变效应分析(中值EC50)中针对流感A(H1N1)、(H3N2)及流感B(Yamagata及Victoria谱系)的普遍广谱活性。
Figure BDA0003630331990008061
表177：缀合物45b针对神经氨酸酶抑制敏感性降低的变体的活性(IC50)
Figure BDA0003630331990008062
Figure BDA0003630331990008071
表178：缀合物45b在神经氨酸酶抑制中针对来自流感A H5N1及H7N9的细胞裂解物的活性(IC50)
Figure BDA0003630331990008072
接下来，我们在酶联凝集素分析(ELLA)中测试了缀合物45b的活性，其中使用大糖蛋白作为底物。ELLA分析中唾液酸(Sia)的呈递更类似于细胞表面上的NA底物呈递。因此，对底物的接近受到更多限制，且ELLA分析中的NA活性已显示受到阻碍接近NA活性位点的因素的影响(Chen Y.Q.,等人,J.Virol.93:doi.10.1128/JVI.01526-18,2019)。有趣的是，与使用如上所述的小分子底物的NA抑制结果相比，缀合物45b针对流感A/PR/8/1934(H1N1)的活性相对于扎那米韦及奥司他韦增强了(>10x)(表179)。对于缀合物45b，Fc结构域对相邻NA四聚体之内或之间NA活性位点的空间位阻，或导致病毒聚集的多价靶标参与可促成ELLA分析中观察到的效能增强。
表179：缀合物45b在CPE中针对流感A及B的广谱活性(EC50)。
Figure BDA0003630331990008073
Figure BDA0003630331990008081
在基于细胞的细胞病变效应(CPE)分析中观察到缀合物45b与扎那米韦及奥司他韦之间的甚至更大区别。缀合物45b证明了针对流感A及B型(其中对于流感A H1N1菌株的中值EC50为1.3nM(n＝6，介于0.43nM至32.4nM范围内)，对于流感A H3N2菌株为0.9nM(n＝4，介于0.04nM至36.6nM范围内)，且对于流感B菌株为7.4nM(n＝4，介于1.5nM至12.8nM范围内)(分别在MDCK SIAT1中))或对于MDCK细胞中的小鼠适应性流感菌株的有效活性(表179)。值得注意的是，缀合物45b针对所测试的流感菌株中的一些的活性比奥司他韦及扎那米韦高3对数(表176)。当在基于细胞的微量中和分析中针对高致病性菌株测试缀合物45b时，缀合物45b的EC50对于H5N1菌株为1.7nM(n＝4)且对于H7N9菌株为5.3nM(n＝1)(表180)。MDCK-SIAT1或MDCK细胞中缀合物45b的CC50>10,000nM(数据未显示)。因此，在基于细胞的分析中计算的缀合物45b针对流感A及B型的选择性指数(SI)>1,000x。
表180：缀合物45b在微量中和中针对高致病性流感A(H5N1)及(H7N9)的广谱活性(IC50)。
Figure BDA0003630331990008091
*大流行对照流感A菌株
除了CPE分析外，还使用经流感A/CA/07/2009(H1N1)pdm感染的MDCK细胞进行连续传代实验，以比较缀合物45b对两种商业上占主导地位的流感抗病毒药物奥司他韦及巴洛沙韦的耐药潜力。缀合物45b具有比两种比较物更优的耐药曲线，且在整个10次传代实验中证明了抗病毒活性未降低。巴洛沙韦及奥司他韦抗病毒活性分别在6及8代之后降低到无药物对照的活性水平。对后期奥司他韦传代中耐药病毒斑块的病毒基因组进行的测序表明，耐药性是由临床中(REF)观察到的NA活性位点突变(E119K)赋予的。
缀合物45b与免疫细胞衔接
选择人IgG1 Fc结构域作为缀合物45b的蛋白载剂，因为其是最活化的人抗体IgG同种型，具有最长的循环半衰期。尽管使用了缀合物45b的异质赖氨酸缀合策略，我们观察到与未缀合Fc对照及人IgG1相比，用缀合物45b测试的所有人及鼠科动物Fcγ受体的相似Fcγ受体结合(图111A-111H)。在功能分析中，缀合物45b针对流感A/PR/8/1934(H1N1)感染的MDCK SIat1细胞以MOI依赖性(图111I)及剂量依赖性(图111J)诱导有效抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。因此，缀合物45b可与Fcγ受体结合且在功能上衔接免疫细胞。
缀合物45b在多种致死性流感攻击模型中高度有效
在体外观察到的缀合物45b的效能及抗病毒谱转化为在动物感染模型中的功效。单一、0.3mg/kg或更低皮下(SC)剂量的缀合物45b在致死性小鼠攻击模型中针对A/CA/07/2009(H1N1)pdm、A/WSN/1933(H1N1)、A/CA/12/2012(H1N1)pdm09、A/Texas/23/2012(H1N1)pdm09 H275Y变体、A/Hong Kong/1/1968(H3N2)、B/Florida/4/2006(Yamagata)及B/Malaysia/2506/2004(Victoria)具有完全保护性(图112A-112H)。用缀合物45b治疗通常仅导致在最小保护性剂量之后有限、短暂体重损失(图113A-113H)。当在小鼠中针对禽类大流行菌株A/Vietnam/1203/2004(H5N1)进行测试时，缀合物45b证明了在0.3mg/kg时的70％保护作用及在1mg/kg或更高时的100％保护作用(图112I)。在小鼠中6倍人化剂量的奥司他韦仅具有90％保护性(图112I)。
为了更好定量缀合物45b的功效，且为了比较其与奥司他韦的效能，按照致死性攻击模型用小鼠适应性流感A/PR/8/1934(H1N1)感染后4天测量肺中的病毒载荷及细胞因子水平。在此模型中，缀合物45b的最小保护性剂量为0.1mg/kg(SC)(图112A)，且伴有大约5％的短暂体重(BW)损失(图113A)。缀合物45b证明了肺病毒负荷(PFU/g，肺组织中)的剂量依赖性降低，在0.1mg/kg时为1.06对数，在0.3mg/kg时为2.12对数且在1mg/kg时为3.17对数且在3mg/kg时为3.63对数，如通过斑块分析所测定。比较之下，以人等效剂量(5mg/kg)(BIDx 4天)或以10倍人等效剂量(50mg/kg)(BID x 4天)给药的奥司他韦未显示剂量反应，且导致不太多的大约0.8对数的病毒载荷减少。有趣的是，所测试的两种奥司他韦剂量导致了不同的生存结果。以5mg/kg或50mg/kg给药BID持续5天的奥司他韦分别导致0％或80％生存(图114A-114B)。
为了了解缀合物45b在减少可能导致肺损伤的潜在有害免疫反应方面的有效性，在同一时间点测量了特定炎症及肺损伤细胞因子的水平。缀合物45b以剂量依赖性方式有效降低水平，在3mg/kg剂量下测量的所有细胞因子接近与未感染对照相似的水平(图112K-112L及图115A-115C)。总体而言，对于所有测试的细胞因子而言，缀合物45b诱导的细胞因子减少幅度比用人等效剂量的奥司他韦治疗所提供的更为明显，且当与以10倍人等效剂量的奥司他韦治疗的小鼠相比，KC、MIP-1a、MCP-1更优(图112K-112L及图115A-115C)。这些数据证明了缀合物45b诱导病毒负荷的有效、剂量依赖性降低，这与缀合物45b降低肺中细胞因子水平相关，所述降低在使用奥司他韦时未观察到。
评估缀合物45b给药途径对功效的影响。在使用小鼠的致死性攻击模型中，缀合物45b以0.1mg/kg静脉内(IV)、肌肉内(IM)或SC施用之后针对A/CA/07/2009(H1N1)pdm具有完全保护性(图116A-116B)。当比较IV、IM或SC给药之后小鼠的血浆水平时，24h之后缀合物45b的血浆水平为相当的，如通过酶联免疫吸附(ELISA)分析所测定。值得注意的是，两种不同的ELISA捕获方法用于测量血浆中缀合物45b水平——一种利用抗人Fc捕获抗体来测量Fc水平，而另一种利用病毒NA捕获来检测完整缀合物(图116C-116D)。通过两种方法测量的缀合物45b的血浆水平在实验误差内是相同的，证明缀合物45b作为完整缀合物在体内是稳定的。
缀合物45b在免疫受损宿主中是高度有效的
流感严重感染及流感感染并发症的高危群体包括老年人及免疫受损者。为了确定缀合物45b在免疫受损背景中的有效性，我们确定了缀合物45b在严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠中的功效，所述小鼠缺乏成熟T细胞及B细胞且为补体缺陷的。缀合物45b在感染A/CA/07/2009(H1N1)pdm的SCID小鼠中在单一0.3mg/kg剂量下证明了完全保护(图112M)，所述剂量与用于免疫胜任小鼠的保护性剂量相同。
总之，这些结果突出了缀合物45b在健康及高危人群中提供普遍流感保护的潜力。
缀合物45b在预防模型中证明了长期作用
药代动力学(PK)分析、预防功效及临床前毒理学研究进一步突出了缀合物45b用作一种持久、长效的通用流感预防剂的潜力。缀合物45b的半衰期在小鼠及食蟹猕猴中单一IV施用之后经测定，且在1周及4周PK研究中分别介于5-10天范围内。这些结果对mAB是典型的，且得到缀合物45b、hIgG1 Fc及全长人IgG1同种型对照抗体对鼠科动物、食蟹猕猴及人FcRn在pH依赖性方面的可比结合曲线的支持(图117A-117C)。缀合物45b在小鼠中在1-100mg/kg的宽剂量范围内的表现出剂量线性PK(图118A)。在小鼠模型中，缀合物45b在血浆及肺之间建立快速平衡，允许对治疗适应症的快速起效，且以高水平分布到上皮衬液(ELF)中(图118B)。ELF中的高水平缀合物45b迅速出现，且维持在血浆水平的大约60％(图118B)。
为了评估缀合物45b在预防情况下的功效且测定在致死性流感攻击模型中保护所需的目标血浆水平，小鼠在感染之前28天经给药。单一1mg/kg的SC剂量赋予针对流感A/CA/07/2009(H1N1)pdm、A/HK/1/1968(H3N2)、B/Malaysia/2506/2004(Victoria)及B/Florida/4/2006(Yamagata)的完全保护作用(图118C-118F)。在感染时测量的保护所必需的对应缀合物45b血浆水平为0.5μg/mL(8nM，数据未显示)。多物种PK及保护所需的缀合物45b的目标血浆水平将用于估计人类长期预防所需的人剂量，且用于估计临床前毒理学研究中缀合物45b的治疗边界。在食蟹猕猴中进行的两周剂量范围发现毒性研究中，在所测试的最高剂量(20mg/kg)下未观察到不良事件。在20mg/kg给药的猴及1mg/kg给药的小鼠中，基于血浆暴露比率的治疗指数(TI)为>50(表181及182)。此安全边界，再加上包含缀合物45b的高效能及持续暴露的异速生长定标(数据未显示)，表明用一至两个剂量的缀合物45b保护整个流感季节在人类中是可实现的。
表181：缀合物45b在小鼠中的剂量比例性
Figure BDA0003630331990008131
表182：缀合物45b在食蟹猕猴中的剂量比例性
Figure BDA0003630331990008132
在食蟹猕猴毒理学研究中，以5或20mg/kg每周2次SC剂量之后，未观察到BW、临床化学、血液学、凝血、细胞因子或尿液分析的不良反应(数据未显示)。
实施例204.在致死性小鼠流感模型中测定缀合物45a针对流感A(H1N1)的最佳药物:抗体比率(DAR)。
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8周)的致死性H1N1流感感染模型中评估缀合物45a的DAR变体。攻击病毒(A/Puerto Rico/8/1934)是能够在小鼠中引起致死性感染的小鼠适应性分离株。所述实验包含2个研究组，总计25组，每组5只小鼠。在第0天，所有小鼠均在经氯胺酮/甲苯噻嗪(分别为100及10mg/kg)轻微麻醉之后通过鼻内接种经30μl(约2E4个病毒/小鼠)体积的病毒(3x LD95)攻击。在通过肌肉内(IM)施用进行病毒攻击之后2小时，各组接受缀合物45a、缀合物45a的DAR变体、单独Fc或媒介物(PBS)的单一治疗。缀合物45a变体以0.4、1.0、3.3、4.7、5.1或7.3的平均DAR进行测试。每天监测死亡及体重(BW)，持续14天。损失超过20％BW的任何小鼠均评分为死亡。每个研究组的实验大纲概述于表183及184中。
Figure BDA0003630331990008151
Figure BDA0003630331990008161
在第一研究组中，平均DAR为0.4、1.0、3.3或4.7的变体以0.03、0.1及0.3mg/kg的浓度运行(在相对于病毒攻击T+2h单一IM施用)。在此研究中，媒介物(PBS)治疗的小鼠截至第7天死于感染，且那些用单独Fc(SEQ ID NO:72)治疗的小鼠在第6天达到死亡(表185)。相比之下，平均DAR为1.0、3.3及4.7的缀合物45a变体在最高剂量浓度(0.3mg/kg)下为完全保护的。仅0.4平均DAR缀合物未能提供保护，小鼠截至第9天达到死亡，表明其具有所测试缀合物的最低效能平均DAR。在下一最低缀合物剂量(0.1mg/kg)下，仅用具有3.3或4.7的平均DAR的缀合物治疗的小鼠完全经保护。在此剂量下，两种较低平均DAR缀合物(0.4及1.0)分别在第7天及第9天达到死亡。在最终剂量组(0.03mg/kg)中，仅平均DAR为4.7的缀合物45a变体证明了一些效能(80％生存)。基于死亡数据，此研究组中的清楚趋势是明显的，平均DAR增加导致效能增加。
研究组1研究组的BW数据支持死亡率数据中所见的趋势(表186)。例如，在0.3mg/kg剂量组中，平均DAR为1.0、3.3及4.7的缀合物45a变体基于死亡率均具有保护性，但接受1.0平均DAR变体的小鼠的BW损失比接受更高平均DAR构建体的小鼠更大。这导致当剂量降低至0.1mg/kg时1.0平均DAR变体失去保护作用。同样地，在0.1mg/kg时，接受3.3平均DAR变体的小鼠基于死亡率经保护以抵御致死性攻击，但具有比用4.7平均DAR变体治疗的动物更大的BW损失。通过两项研究读出(死亡率及BW)，增加平均DAR可见更大的效能。
Figure BDA0003630331990008181
Figure BDA0003630331990008191
在所述研究的研究组2中，以与研究组1相同的剂量水平(0.3、0.1及0.03mg/kg)评估平均DAR为4.7、5.1及7.3的缀合物45a变体。与在研究组1中所见结果相比，增加平均DAR到4.7以上未增加缀合物45a的效能。基于死亡率及BW，所有三种DAR变体具有大致相等的效能(分别地，表187及188)。在这些较高DAR构建体中仅可见轻微差异，所述差异在功效模型中在所见正常实验误差范围内(注意，研究组2中媒介物治疗的动物的死亡时间稍快)。后一点包括观察到4.7平均DAR缀合物在0.03mg/kg的第一研究组中具有保护性，但在研究组2中没有。总之，两个研究组的结果显示随着平均DAR增加至4.7，效能明显增加，但接着进一步增加平均DAR不转化为更大的效能。因此，4.7的平均DAR是实现缀合物45a的最大效能的最小平均DAR。
Figure BDA0003630331990008211
Figure BDA0003630331990008221
实施例205.在致死性小鼠模型中测定缀合物45a针对流感A大流行菌株(A/California/12/2012；H1N1)的效能。
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8周)的致死性H1N1流感感染模型中评估缀合物45a。攻击病毒(A/CA/12/2012)是能够在小鼠中引起致死性感染的大流行分离株。所述实验由7组组成，每组5只小鼠。在第0天，所有小鼠均在经氯胺酮/甲苯噻嗪(分别为100及10mg/kg)轻微麻醉之后通过鼻内接种经30μl(3E4个病毒/小鼠)体积的病毒(3x LD95)攻击。在病毒攻击之后2小时，各组通过肌肉内(IM)施用(右侧)接受缀合物45a、hIgG1 Fc或媒介物(PBS)的单一治疗。缀合物45a在3、1、0.3、0.1及0.03mg/kg的浓度下进行测试。每天监测死亡及体重(BW)，持续21天。损失超过20％BW的任何小鼠均评分为死亡。实验大纲概述于表189中。
表189：研究大纲
Figure BDA0003630331990008231
在此研究中，单一IM施用0.3、1及3mg/kg的缀合物45a完全保护小鼠以抵御大流行季节性(H1N1)流感分离株的致死性攻击(表190)。此外，在两个最低剂量组(0.1及0.03mg/kg)中可见部分保护(相对于媒介物)，生存分别为60％及20％。相比之下，媒介物治疗的动物截至第8天死于感染，而单独hIgG1 Fc治疗的动物达到80％死亡率。BW数据也支持缀合物45a的效能。用完全保护性剂量(3、1及0.3mg/kg)治疗的小鼠在第3-5天左右表现出短暂BW损失，接着稳定地恢复BW直至研究结束(第21天)(表191)。总之，此研究通过死亡率及BW读出两者证明了缀合物45a针对重要大流行流感分离株的效能。
Figure BDA0003630331990008251
Figure BDA0003630331990008261
实施例206.在致死性小鼠流感模型中缀合物45b与巴洛沙韦组合针对流感A(H1N1)的功效
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8周)中针对致死性IAVH1N1流感感染评估缀合物45b。攻击病毒(A/California/07/2009)是能够在小鼠中引起致死性感染的大流行分离株。所述实验包含11组，每组5只小鼠。在第0天，所有小鼠均在经氯胺酮/甲苯噻嗪(分别为100及10mg/kg)轻微麻醉之后通过鼻内接种经30μl(约3E4个病毒/小鼠)体积的病毒(3x LD95)攻击。各组接受媒介物、缀合物45b、巴洛沙韦玛波西酯(DCChemicals，目录号DC11056；悬浮于0.5％甲基纤维素中)或组合的治疗(攻击之后2小时)。巴洛沙韦口服给药(PO)，每天两次，持续3天，且缀合物45b作为单一剂量经皮下(SC)施用(表192)。每天监测死亡及体重(BW)，持续14天。损失超过20％BW的任何小鼠均评分为死亡。
表192：研究设计
Figure BDA0003630331990008271
为了分别测定缀合物45b及巴洛沙韦的效能，测定了每种分子的剂量范围。关于缀合物45b，基于生存，0.1及0.3mg/kg的剂量为保护性的，而0.01及0.03mg/kg的剂量不为保护性的(表193)。关于巴洛沙韦，截至第14天，1及3mg/kg的剂量能够延迟但不能阻止死亡。相比之下，10mg/kg剂量的巴洛沙韦具有80％保护性。
关于组合研究，巴洛沙韦的中等范围剂量(3mg/kg)与0.01、0.03及0.1mg/kg的缀合物45b结合起来给药(第9-11组)。如表193中所示，单独0.03mg/kg的缀合物45b或3mg/kg的巴洛沙韦均不具有保护性。然而，值得注意的是，在研究过程中，它们组合起来证明了80％保护作用(第10组)。
Figure BDA0003630331990008291
体重数据进一步说明组合施用的两种分子的活性增强(表194)。当以0.1/3mg/kg(缀合物45b/巴洛沙韦)给药时，观察到BW损失急剧减少。缀合物45b本身以0.1mg/kg给药具有保护性，但动物在第4天表现出BW下降18.8％。然而，此剂量与非保护性剂量的巴洛沙韦(3mg/kg)一起施用，可减少最大BW损失至4.5％(第11组)。
Figure BDA0003630331990008311
在此重要的研究中，两个不同的组证明了缀合物45b与巴洛沙韦共施用的增强的效能。此外，不可忽视的是所述两种化合物不会抑制彼此的活性这一关键观察结果。观察到相反的情况且组合更有效，是可能转化到临床的益处。
实施例207.缀合物45a的替代合成
Figure BDA0003630331990008321
步骤a.
Figure BDA0003630331990008322
叠氮基-PEG4-TFP酯(0.1g，0.067mmol)及炔官能化二聚体(0.0383g，0.0871mmol)于DMF(2.0mL)中的溶液在室温下用硫酸铜(II)(0.0027g，0.0168mmol)、抗坏血酸钠(0.0133g，0.067mmol)及THPTA(0.0116g，0.027mmol)于水(1.5mL)中的溶液处理。接着所述反应用氮气真空冲洗3次且在氮气气氛下经搅拌。30min之后LCMS显示起始材料完全消耗。所述反应用400μL乙酸酸化，接着直接地通过反相色谱法以5％至100％乙腈/水的梯度洗脱使用0.1％TFA经纯化。含有洗脱份的产物经合并、冷冻且冻干过夜。三重TFA盐的产率为69％。通过LCMS发现的离子：(M+2H)+2＝795.4,(M+3H)+3＝530.8,(M+4H)+4＝398.4。
步骤b.
Figure BDA0003630331990008331
Fc(0.100g于5.2mL中，1.717μmol，MW＝58,218，SEQ ID NO:72)于pH＝7.4PBS缓冲液中的溶液用来自前一步骤的固体TFP酯(0.0273g，17.17μmol)处理。pH用硼酸盐缓冲液(120μL，1M，pH 8.5)经调节至约7.0，接着在室温下轻轻地经摇动。1.5h之后的Maldi TOF显示平均DAR为3.3，在进一步混合后没有变化。24h之后，添加额外的TFP酯(0.0073g，4.6μmol)且再继续摇动3h。粗缀合物根据一般纯化方法经蛋白A及SEC纯化。蛋白A之后的总产率为约83％，且SEC之后为约77％。经纯化缀合物的Maldi TOF显示平均质量为63,574，其相当于4.0的平均DAR。
实施例207中描述的替代合成的有利之处在于其避免暴露Fc于铜+2及抗坏血酸钠，从而导致更清洁的粗缀合物，其在单独蛋白A纯化之后根据分析SEC纯度为98.9％。在此纯度水平下，可能可以剔除非常耗时且成本高的SEC纯化。最初使用叠氮基-PEG4-NHS酯的尝试仅部分成功，因为NHS酯反应性太强而无法纯化，且粗点击反应混合物必须与Fc混合，因此需要移除铜且移除高分子量聚集体(以免暴露于抗坏血酸钠)。此外，此方法不会产生大于2的DAR。随后尝试使用足够稳定以经受反相纯化及冻干的反应性较低的活性酯(TFP四氟苯酚)，使与叠氮基TFP酯的点击反应能够与Fc分开进行，经纯化且接着与Fc混合。在实施例207中，实现了4.0的平均DAR且通过添加更多的TFP酯可能实现更高的DAR。
编码缀合物45a的Fc的核酸构建体包含编码SEQ ID NO:63的氨基酸序列(其包含C端赖氨酸残基)的核酸。在表达后，缀合物45a的Fc的C端赖氨酸被蛋白水解切割，产生具有SEQ ID NO:72的序列的Fc。C端赖氨酸的存在与否不会改变Fc或对应缀合物的特性。
实施例208.在致死性小鼠流感模型中缀合物45a与巴洛沙韦组合针对流感A(H1N1)的功效(确认研究)
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8周)中评估缀合物45a与巴洛沙韦玛波西酯(BXM)组合针对致死性IAVH1N1流感感染。此为实施例206的后续，其在初始实验中测试了相同的组合，但对缀合物45a使用皮下给药途径而不是在本研究中使用的肌肉内(IM)。攻击病毒(A/California/07/2009)是能够在小鼠中引起致死性感染的大流行分离株。所述实验包含8组，每组5只小鼠。在第0天，所有小鼠均在经氯胺酮/甲苯噻嗪(分别为100及10mg/kg)轻微麻醉之后通过鼻内接种经30μl(3E4个病毒/小鼠)体积的病毒(3x LD95)攻击。各组接受媒介物、单独hIgG1 Fc、缀合物45a、BXM(DC Chemicals，目录号DC11056；悬浮于0.5％甲基纤维素中)或组合的治疗(攻击之后2小时)。BXM口服给药(PO)，每天两次，持续3天，且缀合物45a作为单一剂量通过IM施用(表195)。每天监测死亡及体重(BW)，持续21天。在连续2天损失超过20％BW的任何小鼠均评分为死亡。
表195：缀合物45a及BXM组合研究的研究设计
Figure BDA0003630331990008351
为了分别测定缀合物45a及BXM的效能，测定了每种分子的剂量范围。关于缀合物45a，基于生存，0.1mg/kg的剂量是保护性的，而0.03mg/kg的剂量不是(表196)。关于BXM，接受10mg/kg(bidx 3天)的组经保护，而接受相同给药时程的3mg/kg的那些组则没有。经施用媒介物或单独hIgG1 Fc的组未经保护。基于以上结果，如所预期，缀合物45a(0.1mg/kg)与BXM(3mg/kg)的组合也为完全保护的。
第7组动物接受亚有效水平的缀合物45a(0.03mg/kg)及BXM(3mg/kg)两者的组合。尽管当单独施用时，两种测试物件均不具有显著保护性，但其组合起来具有完全保护性(表196)。第7组中的动物也仅表现出不超过5.2％(第3天)的短暂BW损失(表197)。到研究结束时，此组已超过其起始BW，在第21天达到初始BW的106.3％。除了缀合物45a与BXM之间没有表现出任何拮抗作用之外，还发现了相反的情况，表明用这两种治疗剂共同治疗的额外益处。
Figure BDA0003630331990008361
Figure BDA0003630331990008371
实施例209.在致死性小鼠模型中测定缀合物45a针对2020-2021北半球四价疫苗(A/Hawaii/70/2019pdm；H1N1)的组分的效能。
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8周)的致死性H1N1流感感染模型中评估缀合物45a。攻击病毒(A/Hawaii/70/2019)是能够在小鼠中引起致死性感染的大流行H1N1分离株。其也是2020-2021北半球四价疫苗的推荐组分。
所述实验由9组组成，每组5只小鼠。在第0天，所有小鼠均在经氯胺酮/甲苯噻嗪(分别为100及10mg/kg)麻醉之后通过鼻内接种经30μl(2E3个病毒/小鼠)体积的病毒(2xLD95)攻击。在病毒攻击之后2小时，各组通过肌肉内(IM，5ml/kg剂量体积)施用(右侧)接受缀合物45a、hIgG1 Fc或媒介物(PBS)的单一治疗。缀合物45a在3、1、0.3、0.1、0.03及0.01mg/kg的浓度下进行测试。未感染组也包括在本研究中作为对照。每天监测死亡及体重(BW)，持续21天。在连续两天保持20％BW损失的任何小鼠均评分为死亡。实验大纲概述于表198中。
在此研究中，单一IM施用0.3、1及3mg/kg的缀合物45a完全保护小鼠以抵御A/HA/70/2019(H1N1)的致死性攻击(表199)。这些剂量水平的缀合物45a的效能与媒介物治疗的动物相比是显著的(P＝0.0031)。相比之下，媒介物及hIgG1 Fc治疗的动物在第5天达到100％死亡率。在0.1及0.03mg/kg剂量组(分别为60％及20％生存)中也可见部分保护作用，但与媒介物治疗的动物相比不具有统计学意义。总之，生存数据证明缀合物45a针对此种重要的流感分离株为有效的，且在较低剂量组中清楚的剂量反应是明显的(图119)。
BW数据也支持缀合物45a的效能。用完全保护性剂量(3、1及0.3mg/kg)治疗的小鼠在第3天表现出短暂BW损失(在0.3mg/kg的缀合物45a剂量下最大12％BW损失)，接着稳定地恢复BW直至研究结束(第21天)(表200)。BW趋势反映了所述研究的生存结果，且支持了缀合物针对此种H1N1分离株的功效。
总之，此研究通过死亡率及BW读出两者证明了缀合物45a针对重要大流行流感分离株的效能。因为A/HA/70/2019被认为是临床相关分离株且对公众健康构成威胁，所以其已被选入2020北半球疫苗。0.3mg/kg的单一IM剂量的缀合物45a针对此种大流行菌株的效能支持其作为针对流感的治疗剂而继续发展。
Figure BDA0003630331990008391
Figure BDA0003630331990008401
Figure BDA0003630331990008411
实施例210.缀合物45a在4周致死性小鼠模型中针对流感A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)的功效
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8周)中针对致死性IAVH1N1流感感染评估缀合物45a。攻击病毒(A/Puerto Rico/8/1934)是能够在小鼠中引起致死性感染的小鼠适应性分离株。所述实验包含7组，每组5只小鼠。在第0天，所有小鼠均在经氯胺酮/甲苯噻嗪的混合物(分别为150及10mg/kg)麻醉之后通过鼻内(IN)接种经30μl体积的病毒(3x LD95)攻击。唯一的例外是第1组，其由用作体重(BW)对照的未感染小鼠组成。每天记录死亡率及BW，持续28天，且连续2天累计重量损失20％的任何动物均评分为死亡。
测试组在病毒攻击后2小时接受缀合物45a(0.01至0.3mg/kg)、单独hIgG1 Fc(0.3mg/kg，SEQ ID NO:72)或媒介物(PBS)的单一肌肉内(IM)注射。以5ml/kg的剂量体积在右后肢的大腿肌肉中进行注射。
表201：研究大纲
Figure BDA0003630331990008421
用媒介物治疗的动物在第5天才开始达到死亡，截至第7天死亡率为100％。类似地，用单独hIgG1 Fc(其缺乏缀合物的抗病毒部分)治疗的小鼠在第7天完全死于感染(图120及表202)。相比之下，接受0.1及0.3mg/kg的缀合物45a的组完全经保护直至第28天研究结束。相对于经单独媒介物治疗的小鼠，此生存差异是统计学上显著的(通过对数秩(Mantel-Cox)检验，两组的P＝0.0020)。然而，以0.01及0.03mg/kg的剂量水平施用的缀合物45a为亚有效的，其中小鼠分别在第8天及第7天达到100％死亡率(图120及表202)。
表202：截至天数研究组的％生存
Figure BDA0003630331990008431
除了生存，还在整个研究中每天监测BW。未感染小鼠(第1组)的BW稳定增加，截至研究结束达到其起始BW的108.7％，表明测试动物的总体健康状况良好(表203)。相比之下，阴性对照组(2及3)在第1天开始损失BW，直至各组中的首例动物死亡分别在第5天及第6天达到。在组内首例死亡之后，由于所述组成为有偏群体，因此不记录BW值。
用保护性剂量的缀合物45a(第4组及第5组)治疗的小鼠仅表现出少于5％的短暂BW损失。截至研究结束，这两个组均超过了其起始BW(分别为105.9％及108.7％)。如所预期，接受亚保护性剂量的缀合物45a(第6组及第7组)的小鼠显示稳定的重量损失直至动物开始达到死亡。
总之，此数据显示缀合物45a针对流感A(H1N1)的致死性攻击的效能。值得注意的是，单一IM注射少于1mg/kg即实现保护。最后，在病毒攻击之后对动物进行了整整4周的跟踪，表明经保护的动物很可能已经完全清除了感染。
表203：截至天数的％平均体重(组平均值；组内第一例死亡之前)
Figure BDA0003630331990008441
Figure BDA0003630331990008451
实施例211.在致死性小鼠模型中缀合物45a及奥司他韦针对流感H1N1 A/CA/12/2012及A/PR/8/1934的功效。
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8周)中评估了缀合物45a及奥司他韦针对两种流感H1N1亚型(A/PR/8/34及A/CA12/12)的致死性攻击。所述实验包括10组，每组5只小鼠，分成两个实验研究组(表204)。在T+2h，小鼠以0.3mg/kg单一剂量肌肉内(IM)施用缀合物45a。同样在T+2h时，小鼠以5或50mg/kg口服施用奥司他韦，每天两次，持续5天。对照小鼠经IM用媒介物(PBS)或单独hIgG1 Fc治疗。在化合物施用之前两小时，小鼠经鼻内用3xLD95的A/PR/8/34(3E2 pfu)或A/CA/12/12(3E4 pfu)攻击。关于病毒攻击，小鼠经氯胺酮/甲苯噻嗪的混合物(分别为150及10mg/kg)麻醉，且病毒以30μl体积给予。每天记录死亡率及体重(BW)且具有20％BW损失的任何动物均评分为死亡。
针对A/PR/8/34攻击，用媒介物或单独Fc(SEQ ID NO:72)治疗的小鼠截至第7天死于感染，而以0.3mg/kg施用缀合物45a的那些小鼠完全经保护(表205)。对于经奥司他韦治疗的动物，50mg/kg剂量具有80％保护性，而5mg/kg剂量仅延迟死亡直至第10天。针对A/CA/12/12，媒介物及Fc对照动物截至第6天达到100％死亡率，且再一次，0.3mg/kg剂量的缀合物45a具有完全保护性。相比之下，奥司他韦在5mg/kg时不具有保护性，且即使50mg/kg剂量组也仅具有40％生存。两个研究组的BW数据支持死亡率发现结果(表205-208)。
总之，此数据证明单一0.3mg/kg剂量的缀合物的更优活性优于奥司他韦，即使是当后者以5或50mg/kg每天两次给药持续5天时。
Figure BDA0003630331990008471
表205：A/PR/8/34的％生存
Figure BDA0003630331990008481
表206：经A/CA/12/2012攻击的小鼠的％生存。
Figure BDA0003630331990008482
Figure BDA0003630331990008491
表207：经A/PR/8/34攻击的小鼠的平均％BW，组内第一例死亡之前
Figure BDA0003630331990008492
表208：经A/CA/12/2012攻击的小鼠的平均％BW，组内第一例死亡之前
Figure BDA0003630331990008493
Figure BDA0003630331990008501
实施例212.在28天小鼠预防模型中缀合物45a针对流感B/Florida/4/2006(Yamagata)的功效。
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8周)中评估缀合物45a针对流感B季节性流感亚型(B/Florida/4/2006)的致死性攻击。所述实验包含7组，每组5只小鼠。在第0天，小鼠以3、1、0.3、0.01或0.3mg/kg的单一剂量经皮下(SC)施用缀合物45a。对照小鼠也通过相同途径单独用媒介物(PBS)或hIgG1 Fc治疗。施用测试物件之后二十八天，小鼠经鼻内用3x LD95的B/Florida攻击。实验设计的概述提供于表209中。关于病毒攻击，小鼠经氯胺酮/甲苯噻嗪的混合物(分别为150及10mg/kg)麻醉，且病毒以30μl体积给予。每天记录死亡率及体重(BW)，持续21天且具有20％体重损失的任何动物均评分为死亡。
用媒介物治疗的小鼠仅截至第7天达到死亡，而用单独Fc阴性对照治疗的那些小鼠截至第8天死于感染(表210)。相比之下，接受1或3mg/kg的缀合物45a的那些小鼠在研究过程中完全经保护。以0.3mg/kg治疗的第4组动物也证明了80％生存。在0.1mg/kg的剂量浓度下，生存下降至40％，而在0.03mg/kg时，缀合物45a未提供保护作用。BW数据(表211)反映了死亡率结果，且接受完全保护性剂量(1及3mg/kg)的小鼠显示在第4天少于5％的BW短暂下降，接着恢复其起始BW。
总之，这些数据支持缀合物45a针对重要季节性流感亚型的稳固效能。其还证明缀合物45a作为针对流感的长期预防剂的效用。
Figure BDA0003630331990008511
Figure BDA0003630331990008521
Figure BDA0003630331990008531
实施例213.缀合物45a的Fc介导的免疫贡献
在经鼻内用3E2 PFU/小鼠(3x LD95)的小鼠适应性流感A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)或用3e4 PFU/小鼠的流感A/CA/07/2009(H1N1)pdm攻击的6-8周雌性BALB/c小鼠(Charles River)或Fcer1g-/-模型583(Taconic)中进行功效研究。在攻击后2h，AVC或对照-人IgG1 Fc或PBS-以0.03-3mg/kg作为单一剂量如所示经皮下(SC)或肌肉内(IM)施用经施用。每天记录体重(BW)。死亡经定义为连续两天体重损失超过20％或当动物垂死时。
关于病毒负荷及细胞因子分析，在感染后4天，用CO2处死小鼠且收集两片肺叶。肺使用MagNA Lyser(Roche)用1mL PBS中的1mm二氧化硅珠粒均质化。在6,000rpm下进行均质化持续60s且在运行之间在冰上冷冻持续5min。在肺均质化之后，管在600x g下经离心持续10min且上清液经转移至新管中。关于PFU测定，肺均质液的上清液在感染缓冲液中经稀释，介于10-1至10-6范围内。100μL病毒稀释液添加至24孔板中的MDCK细胞的汇合单层中且在室温下经培育持续1h，其中每15min摇动。在移除病毒之后，含有Avicel的液体覆盖培养基添加至MDCK细胞中。细胞在37℃、5％CO2下经培育持续40h。在培育之后，移除培养基且细胞用结晶紫染色以对斑块计数且相对于肺重量计算斑块形成单元(PFU)(PFU/g肺)。关于细胞因子分析，肺均质液的上清液连续2倍稀释于96孔板中。IL-6、MIP-1α及MCP-1的细胞因子水平通过ELISA根据制造商的说明书(R&D Systems)进行测定。
在Balb/C(WT)及Fcer1g-/-(KO)小鼠中，0.03mg/kg或更高剂量的缀合物45a针对流感A/CA/07/2009(H1N1)pdm的致死性攻击具有完全保护性(参见表212)，表明缀合物45a的保护作用独立于Fc介导的免疫贡献。
表212：缀合物45a在Balb/C小鼠(WT)或Fcer1g-/-(KO)小鼠中针对流感A/CA/07/2009(H1N1)pdm的功效。
测试物件[mg/kg] 给药途径 小鼠背景 ％生存
hIgG1Fc[1] IM WT 0
缀合物45a[0.03] IM WT 100
缀合物45a[0.1] IM WT 100
缀合物45a[0.3] IM WT 100
缀合物45a[1] IM WT 100
hIgG1Fc[1] IM KO 0
缀合物45a[0.03] IM KO 100
缀合物45a[0.1] IM KO 100
缀合物45a[0.3] IM KO 100
缀合物45a[1] IM KO 100
0.1mg/kg或更高剂量的缀合物45a在Balb/C小鼠中针对流感A/PR/8/1934(H1N1)的致死性攻击具有完全保护性(参见表213)。为了测定WT Balb/c小鼠中的免疫贡献，制备了缀合物45a在非糖基化Fc突变体(N297A)上的形式缀合物49(例如，包含SEQ ID NO:72且进一步包含N297A突变的Fc)。已知此种Fc突变体会导致免疫效应子功能的基本消失。缀合物49在0.1mg/kg时也具有保护性，表明缀合物45a赋予的保护作用独立于Fc介导的免疫贡献。为了确定缀合物45a的功效是否可以通过增加的Fc介导的免疫效应子功能来增强，使缀合物45a形式与包含DE(S239D/I332E)突变的Fc(例如，包含SEQ ID NO:72且进一步包含S239D/I332E突变的Fc)缀合，得到缀合物50。缀合物50在0.1mg/kg或更高剂量时具有完全保护性，这与缀合物45a的活性相当。然而，在用0.03mg/kg的缀合物50治疗后，一只小鼠生存。因此，缀合物45a在DAR 4.5时的活性独立于Fc介导的免疫贡献。
表213：AVC在Balb/C小鼠(WT)中针对流感A/PR/8/1934(H1N1)的功效。
Figure BDA0003630331990008551
Figure BDA0003630331990008561
在小鼠模型中用流感进行致死性攻击之后，在感染后第4天测定肺PFU负荷及肺细胞因子水平。缀合物45a及缀合物49证明了病毒负荷的剂量依赖性对数降低至可比较的水平(参见表214)。缀合物50在0.1mg/kg时证明了更高的病毒负荷降低，分别比缀合物45a或缀合物49高0.96或0.83对数。如所预期，在阴性对照PBS与hIgG1 Fc之间未观察到生物相关差异。
表214：在小鼠模型中，用流感A/PR/8/1934(H1N1)进行攻击，感染后第4天缀合物引起的病毒负荷降低。
测试物件[mg/kg] 给药途径 PFU/g 对数减少
PBS SC 2.19E+07 0.00
hIgG1Fc[3] SC 2.85E+07 -0.11
缀合物45a[0.03] SC 1.84E+07 0.07
缀合物45a[0.1] SC 6.34E+06 0.54
缀合物45a[0.3] SC 2.63E+05 1.92
缀合物45a[1] SC 9.99E+03 3.34
缀合物45a[3] SC 1.53E+03 4.16
缀合物49[0.03] SC 9.06E+06 0.38
缀合物49[0.1] SC 4.68E+06 0.67
缀合物49[0.3] SC 1.36E+05 2.21
缀合物49[1] SC 4.57E+04 2.68
缀合物49[3] SC 5.89E+03 3.57
缀合物50[0.1] SC 6.40E+05 1.53
类似地，缀合物45a及缀合物49以剂量依赖性降低细胞因子、IL-6、MIP-1a、MCP-1至类似水平(参见表215)。至于0.1mg/kg的缀合物50，IL-6及MIP-1a的水平略低，但观察到相当的水平。与缀合物45a及缀合物49相比，0.1mg/kg的缀合物50显示出明显增加的MCP-1水平。如所预期，在阴性对照PBS与hIgG1 Fc之间未观察到生物相关差异。
表215：在小鼠模型中，用流感A进行攻击，在感染后第4天相对于未感染对照的IL-6、MIP-1α及MCP-1的差异倍数的细胞因子水平。
测试物件[mg/kg] IL-6 MCP-1 MIP-1α
PBS 4.4 30.0 13.7
hIgG1Fc[3] 4.6 31.9 15.4
缀合物45a[0.03] 3.1 14.8 14.3
缀合物45a[0.1] 2.5 10.2 7.1
缀合物45a[0.3] 2.1 3.2 3.7
缀合物45a[1] 2.0 1.2 2.2
缀合物45a[3] 2.0 1.2 2.1
缀合物49[0.03] 2.3 19.4 10.6
缀合物49[0.1] 2.4 11.1 5.7
缀合物49[0.3] 2.9 10.7 5.0
缀合物49[1] 2.5 4.7 2.4
缀合物49[3] 2.3 4.5 2.2
缀合物50[0.1] 1.9 25.6 4.9
未感染 1.0 1.0 1.0
实施例214.缀合物45a针对流感2020-2021疫苗菌株的功效
神经氨酸酶抑制(NAI)。
使用商业NA-Fluor试剂盒测定NAI活性。简而言之，活病毒经调整至1e5 PFU/mL且添加至96孔板(黑色)中的适当孔中。测试物件以介于0.001至1,000nM范围内的浓度经添加至适当的孔中。病毒及测试物件在37℃、5％CO2下经培育持续20-30min。下一步，NA底物经添加至每个孔中且在37℃、5％CO2下经培育持续1h。NAI通过读取355nm处激发/460nm处发射荧光来测定。IC50用GraphPad Prism版本8使用非线性回归分析(剂量-反应(抑制))来计算。
缀合物45a通过IC50证明了针对北半球流感疫苗菌株2020-21与奥司他韦或扎那米韦相比在NAI方面相当的效能(表216)。
表216：缀合物45a在神经氨酸酶抑制(NAI)分析中针对北半球流感疫苗菌株2020-21的活性(IC50)
Figure BDA0003630331990008581
酶联凝集素分析(ELLA)。
Nunc Maxisorp 96孔板(ThermoFisher)在4℃下用1x KPL包被缓冲液(SeraCare)中的2.5μg胎球蛋白(Sigma-Aldrich)包被过夜。第二天，板用补充有0.05％Tween 20(PBST)的pH 7.4PBS洗涤。测试物件在0.001-1000nM下进行测试且以50μL/孔添加。流感病毒以50μL/孔以5e4-5e5 PFU/mL添加。板在37℃、5％CO2下培育持续16-18h。洗涤板之后，缀合于HRP(PNA-HRP)的花生凝集素(0.13μg)经添加至100uL缓冲液中持续2h，再次洗涤且用100μL/孔TMB底物(BD)显影持续3-5min。所述反应用100μL/孔1N H2SO4停止。吸光度用EnSpire多模式读板器在450nm处读取。IC50用GraphPad Prism版本8使用非线性回归分析(剂量-反应(抑制))来计算。
缀合物45a通过IC50证明了针对北半球流感疫苗菌株2020-21与奥司他韦或扎那米韦相比在NAI方面增加的效能(表217)。
表217：缀合物45a在酶联凝集素分析(ELLA)中针对北半球流感疫苗菌株2020-21的活性(IC50)
Figure BDA0003630331990008591
斑块减少分析(PRA)。
用病毒培育的介于0.3至100nM范围内的测试物件在室温(RT)下在含有PBS中的0.28％牛血清白蛋白及Ca2+/Mg2+的缓冲液中预培育持续30min。24孔板中的Madin DarbyCanine Kidney(MDCK)细胞的汇合单层用PBS洗涤一次。在测试物件及病毒培育之后，两者均经添加至MDCK细胞中。选择每种药物-病毒组合的MOI以靶向PBS对照孔中的30个斑块。1h之后移除病毒及测试物件，且受感染的细胞在35℃下在稀释于1.25％Avicel、DMEM、0.01％DEAE-葡聚糖及2μg/mL TPCK胰蛋白酶的混合物中的测试物件的存在下经培育持续48h。48h之后移除Avicel混合物，细胞用多聚甲醛固定且用1％结晶紫染色以对斑块计数。EC50用GraphPadPrism版本8使用非线性回归分析(剂量-反应(抑制))来计算。
缀合物45a通过EC50证明了针对北半球流感疫苗菌株2020-21与奥司他韦、扎那米韦或巴洛沙韦相比在PRA方面增加的效能(表218)。
表218：缀合物45a在斑块减少分析(PRA)中针对北半球流感疫苗菌株2020-21的活性(EC50)
Figure BDA0003630331990008601
细胞病变效应(CPE)。
96孔板中的汇合单层MDCK Siat1细胞用介于0.01-10,000nM范围内浓度的测试物件培育。在RT下培育1h之后，以MOI 0.01添加流感病毒。在RT下再培育1h之后，板在37℃、5％CO2下培育持续3天(流感A)或持续5天(流感B)。CPE通过结晶紫染色通过读取595nm处的吸光度来测定。EC50用GraphPadPrism版本8使用非线性回归分析(剂量-反应(抑制))来计算。
缀合物45a通过EC50证明了针对北半球流感疫苗菌株2020-21与奥司他韦、扎那米韦或巴洛沙韦相比在PRA方面增加的效能(表219)。
表219：缀合物45a在细胞病变效应(CPE)分析中针对北半球流感疫苗菌株2020-21的活性(EC50)
Figure BDA0003630331990008602
实施例215.在致死性小鼠模型中缀合物45a(*经蛋白A柱纯化及*蛋白A柱流通)针对流感A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)的功效
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8周)中针对致死性IAVH1N1流感感染评估了缀合物45a(经蛋白A纯化)及*缀合物45a(蛋白A柱流通)。攻击病毒(A/Puerto Rico/8/1934)是能够在小鼠中引起致死性感染的小鼠适应性分离株。所述实验包括13组，每组5只小鼠，且目的是评估三种测试剂之间的相对效能。在第0天，所有小鼠均在经氯胺酮/甲苯噻嗪的混合物(分别为150及10mg/kg)麻醉之后通过鼻内(IN)接种经30μl(5E2 pfu)体积的病毒(3x LD95)攻击。第1组由经单独媒介物治疗的对照小鼠组成，剩余组接受介于0.01至0.3mg/kg范围内剂量的所述缀合物中的一种。每天记录死亡率及体重(BW)，持续14天，且连续2天累计重量损失20％的任何动物均评分为死亡。
测试组在病毒攻击后2小时接受测试物件的单一肌肉内(IM)注射(研究大纲详述于表220中)。以5ml/kg的剂量体积在右后肢的大腿肌肉中进行注射。
表220.缀合物45a工艺开发研究的研究大纲
Figure BDA0003630331990008611
Figure BDA0003630331990008621
用媒介物治疗的动物在第6天才开始达到死亡，截至第8天死亡率为100％(图121及表221)。相比之下，两种缀合物(例如，经蛋白A柱纯化的缀合物45a及蛋白A柱流通*缀合物45a)在0.1及0.3mg/kg时直至研究结束(第14天)具有完全保护性。在两个最低测试浓度(0.03及0.01mg/kg)下，未可见保护作用或可见部分保护作用(对于缀合物45a，分别为40％及0％；对于*缀合物45a，分别为80％及40％)。然而，在0.03与0.01mg/kg时缀合物之间的差异在统计学上不显著(对数秩Mantel-Cox检验)，且可能代表非常低测试浓度的正常实验变化。
Figure BDA0003630331990008631
还评估了所有剂量组的体重(BW)数据(表222)。如所预期，BW数据在很大程度上反映了任何缀合物的所有完全保护性剂量的生存数据，证明截至研究结束恢复之前的短暂损失。在这些剂量组中，第14天的平均BW为100％或更高。总之，此数据证明了所有3种缀合物针对流感A(H1N1)的致死性攻击的效能。值得注意的是，单一IM注射0.1mg/kg即实现保护。根据此研究中评估的条件，缀合物45a及*缀合物45a(例如，未结合蛋白A柱的缀合物)证明了相当的效能。
Figure BDA0003630331990008651
实施例216.在致死性感染研究中在人化小鼠模型(FcRn)中针对流感A/California/07/2009pdm(H1N1)比较缀合物45a及46
在雌性B6.Cg-Fcgrttm1Dcr Tg(FCGRT)32Dcr/DcrJ小鼠(6-8周龄；Jackson Labs#014565)中针对致死性IAV H1N1流感感染评估了缀合物45a及46。这些小鼠表达人类新生儿受体(FcRn)，所述受体是延长抗体或含Fc治疗剂的半衰期的必要因素。缀合物46含有YTEFc突变，所述突变已显示可延长缀合物在人类及食蟹猕猴中的半衰期。尽管YTE突变在野生型小鼠中是沉默的，但其在表达FcRn的转基因鼠科动物物种中是允许的。因此，我们在7天预防模型中评估了缀合物45a及46(除了后者中存在YTE突变外，所述两种缀合物是相同的)的相对功效以确定延长的半衰期是否提供效能优势。
攻击病毒(A/California/07/2009)是能够在小鼠中引起致死性感染的H1N1大流行分离株。所述实验包括10组，每组5只小鼠(表223)。在病毒攻击之前七天，小鼠通过肌肉内(IM)注射至右后肢的大腿肌肉中经施用5ml/kg剂量体积的单一剂量的测试物件。在第0天，所有小鼠均在经氯胺酮/甲苯噻嗪的混合物(分别为150及10mg/kg)麻醉之后通过鼻内(IN)接种经30μl(3E4 pfu)体积的病毒(3x LD95)攻击。第1组由用单独媒介物治疗的对照小鼠组成，且第2组动物以单独Fc(hIgG1 Fc)给药，剩余组接受介于1至0.03mg/kg范围内剂量的所述缀合物中的一种。每天记录死亡率及体重(BW)，持续14天，且连续2天累计重量损失20％的任何动物均评分为死亡。
生存数据呈现于表224中且显示对照动物(第1组及第2组)在第6天达到完全死亡，如所预期。相比之下，接受1.0或0.3mg/kg缀合物的小鼠直至研究结束(第21天)完全经保护。在最低剂量浓度(0.03mg/kg)下，任一种缀合物的显著保护作用均不明显。然而，在0.1mg/kg时，缀合物45a与46之间的效能相对差异是明显的。含有野生型Fc序列的缀合物45a不比媒介物或单独Fc给药的动物显著更有效，而缀合物46治疗的动物是这样的(80％生存；相对于媒介物P＝0.0016)(图122)。这些数据表明缀合物46的YTE突变提供优于缀合物45a的效能优势，这可能是由于延长的半衰期。所有研究组的BW数据列于表225中且支持生存数据。
总之，此研究证明了缀合物46相对于缀合物45a的效能增加。由于两种缀合物具有相同的靶向部分，因此缀合物46的功效改进是由于YTE突变。此结论得到了病毒攻击前一天从研究动物(0.1mg/kg剂量组)收集的两种缀合物的血浆水平(缀合物45a，0.09μg/ml；缀合物46，0.48μg/ml)的支持。在病毒攻击时缀合物46的较高血浆水平导致相对于缀合物45a更优的保护作用。
表223.FcRn小鼠研究的一般方案大纲
Figure BDA0003630331990008671
Figure BDA0003630331990008681
Figure BDA0003630331990008691
实施例217.在设计以模拟人类感染早期病原体的流感A(H1N1)小鼠模型中缀合物45a的功效
本专利中提供的先前的实施例利用了这样的模型，其中小鼠在病毒攻击期间经氯胺酮/甲苯噻嗪(分别为150及10mg/kg)重度镇静。在鼻内(IN)病毒攻击(3x LD95于30μl中)之后，小鼠保持仰卧直至恢复(大约30min)。这增强了病毒向肺(下呼吸道或LRT)的引流，为抗流感治疗剂产生了稳固且非常可重复的筛选模型。然而，其未复制自然感染过程，其中通常较少的病毒粒子经接种至人类上呼吸道(URT)。此研究经设计以通过接种病毒至URT中并研究两种不同的攻击接种物来更接近地模拟自然感染过程。
本研究利用了雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8周)，所述小鼠经3E4(3x LD95)及3E3 pfu/小鼠的流感A/California/07/2009(H1N1)(能够在小鼠中引起致死性感染的大流行分离株)攻击。通过IN接种30μl体积对经异氟醚(3％)麻醉的小鼠进行病毒攻击。所述实验包括13组，每组5只小鼠，且一般研究设计显示于表226中。在病毒攻击之前三天，小鼠经施用单一IM(大腿肌肉)剂量的0.001与0.3mg/kg之间的缀合物45a。阴性对照动物经单独PBS治疗。一个组也使用PBS而非病毒经“假感染”。每天记录死亡率及BW，持续14天，且连续2天累计重量损失20％的任何动物均评分为死亡。
所述研究的生存结果概述于表227中。在两种病毒浓度(3E3及3E4 pfu/小鼠)下，经媒介物治疗的小鼠未完全经保护以抵御死亡，如所预期。与3E4组的60％死亡率相比，3E3PBS组达到100％死亡率。尽管违反直觉，但这可能是URT模型中正常实验变化的结果。重要的是，低至0.03mg/kg的单一IM剂量的缀合物45a针对3E4 pfu的攻击具有完全保护性。在3E3研究组中，缀合物45a以0.01mg/kg的单一剂量提供完全保护作用(相对于媒介物P＝0.0031)。基于生存终点的缀合物45a提供的非凡保护表明在小鼠的URT中的更优PK及活性。
研究动物的BW数据列于表228中且反映了生存数据的结果。与假(PBS)感染的小鼠相比，最低完全保护性剂量(0.03mg/kg)组仅表现出短暂重量损失且在3E4攻击研究组中，终末BW(第14天)彼此相差在1.5％以内。关于3E3研究组，在研究结束时最低保护性剂量(0.01mg/kg)为假感染动物的约5％内。
总之，此研究表明缀合物45a在小鼠的URT中具有特殊的暴露，且在防止病毒扩散至可发生致死性感染的LRT方面非常有效。此外，经治疗小鼠的BW的保持及缺乏明显的临床症状表明缀合物45a具有充当针对流感A的优良预防剂的潜力。
Figure BDA0003630331990008721
Figure BDA0003630331990008731
Figure BDA0003630331990008741
实施例218.在延迟治疗小鼠模型中缀合物45a通过给药途径针对流感A/California/07/2009(H1N1)的功效
在雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，6-8周)中针对致死性流感A(H1N1)感染评估缀合物45a。攻击病毒(A/California/07/2009)是能够在小鼠中引起致死性感染的大流行分离株。所述实验包含7组，每组5只小鼠。一般研究设计显示于表229中，简言之：在第0天，所有小鼠均在经氯胺酮/甲苯噻嗪的混合物(分别为150及10mg/kg)麻醉之后通过鼻内(IN)接种经30μl体积的病毒(2-3x LD95)攻击。测试组在病毒攻击后24小时接受单一肌肉内(IM)或静脉内(IV)注射缀合物45a(0.03至0.3mg/kg)或媒介物(PBS)。以10ml/kg的剂量体积在右后肢的大腿肌肉中进行IM注射。以相同的剂量体积经IV注射施用至尾静脉中。每天记录死亡率及BW，持续14天，且连续2天累计重量损失20％的任何动物均评分为死亡。
所述研究的生存结果概述于表230中。用媒介物(PBS)治疗的小鼠在攻击之后迅速开始损失BW，在第5天达到100％死亡率。通过IV(第2组)或IM(第5组)以0.3mg/kg的剂量接受缀合物45a的动物直至研究结束(第14天)完全经保护。两组也表现出相似的BW趋势，在恢复之前重量短暂损失，且最终截至研究结束超过其初始BW(表231)。
在所测试的最低缀合物45a剂量(0.03mg/kg)下，无论给药途径如何，所有小鼠截至第6天均死于感染。中间剂量组(0.1mg/kg)当通过IV给药时证明了40％生存，而当通过IM给药时则不具有保护性(0％生存)。然而，此差异在统计学上不显著(P＝0.0993)。总之，此研究证明了少于1mg/kg的单一IV或IM剂量的缀合物45a针对重要流感A(H1N1)大流行分离株的效能。重要的是，两种给药途径之间相当的功效表明缀合物45a用于门诊环境的能力(IM给药)。最后，即使给药经延迟24小时，缀合物45a也具有完全保护性，从而使最初病毒接种物有时间建立/繁殖。这表明缀合物45a可具有作为预防剂及治疗剂两者的治疗用途。
表229：一般研究大纲
Figure BDA0003630331990008761
Figure BDA0003630331990008771
Figure BDA0003630331990008781
实施例219.Sprague-Dawley大鼠中缀合物45a的单一剂量皮下范围发现研究及单一剂量毒性及毒代动力学(2周暴露)研究
此研究的目的是评估在雄性及雌性大鼠中的耐受性，接着评估当作为单一皮下(SC)剂量经施用至雄性Sprague Dawley大鼠时缀合物45a的毒性及毒代动力学(TK)。
此研究由两个时期组成；1期耐受性(第1-3组)及2期毒理学(第4-7组)及卫星TK(第8-10组)。1期中每个治疗组由一只雌性及一只雄性Sprague Dawley大鼠构成。1期大鼠在单一一天通过SC注射以5mL/kg的剂量体积经施用100mg/kg缀合物45a(第1组)、200mg/kg缀合物45a(第2组)或400mg/kg缀合物45a(第3组)(对于第3组，5mL X 2个部位，肩胛中部及背侧腰部)。每个2期毒理学组(第4-7组)由五只雄性Sprague Dawley大鼠构成。每个2期卫星TK组(第8-10组)由四只雄性Sprague Dawley大鼠构成。基于1期耐受性，2期大鼠在单一一天通过SC注射以5mL/kg的剂量体积经施用PBS(第4组)、50mg/kg缀合物45a(第5组及第8组)、150mg/kg缀合物45a(第6组及第9组)或400mg/kg缀合物45a(第7组及第10组)(对于第3组，5mL X 2个部位，对于第7组及第10组，肩胛中部及背侧腰部)。
在第1-3天每天两次记录1期临床观察结果，且随机记录详细观察结果。在第1-15天每天两次记录2期临床观察结果，且在第1天(给药之前)及第14天记录详细观察结果。随机及在1期给药前记录体重测量值。在尸检之前第1天、第3天、第7天、第14天及第15天随机记录2期体重测量值。在第1、4、7、10、12及14天记录2期食物消耗测量值。在给药后0.5、1、2、4、8、24、72、120、168、240及336小时从卫星TK大鼠(第8-10组)收集血浆样品，用于分析对缀合物45a的全身暴露。从第14天至第15天，从毒理学大鼠(第4-7组)收集24小时的尿液样品。在第15天从毒理学大鼠(第4-7组)收集用于评估血液学、化学及凝血终点的血液样品。收集血液样品之后，对毒理学大鼠(第4-7组)进行尸检。收集方案指定的组织且对其进行大致评估，对选定的器官进行称重，且固定组织用于显微镜评估。随后对组织进行处理及显微镜评估。
耐受性：
基于没有与测试物件相关的异常观察结果，在雄性及雌性Sprague Dawley大鼠中以<400mg/kg作为单一皮下注射(在每个给药日的一个或两个部位)施用缀合物45a经良好耐受持续长达3天。
毒代动力学：
缀合物45a血浆水平在2周暴露时期内保持不变，且在神经氨酸酶(NA)捕获与Fc捕获分析之间具有可比性。此观察结果表明，在体内剂量施用之后，完整分子(含有至少1个与Fc基团连接的靶标部分)保持稳定。平均血浆暴露似乎从50至400mg/kg大致与剂量成比例地增加。
毒理学：
基于在体重、食物消耗、临床观察结果、器官重量、血液学参数、临床化学、肉眼发现结果及显微镜发现结果方面不存在与测试物件相关的变化，在雄性Sprague Dawley大鼠中以<400mg/kg作为单一皮下注射(在两个部位施用高剂量)施用缀合物45a经良好耐受持续长达14天。此剂量分别对应于NA捕获及Fc捕获测定的平均AUC0-inf值(312,000及319,000μg·hr/mL)及平均Cmax值(1150及974μg/mL)。
实施例220.Sprague-Dawley大鼠中缀合物45a的单一剂量皮下范围发现研究及单一剂量毒性及毒代动力学(2周暴露)研究
本研究的目的是评估雄性及雌性大鼠的耐受性，接着评估当作为单一皮下(SC)剂量经施用至雄性Sprague Dawley大鼠时缀合物45a的毒性及毒代动力学。2期中雄性动物经施用50、150或400mg/kg/剂量缀合物45a。
所有研究动物均生存至预定处死。在器官重量、血液学参数、临床化学、肉眼发现结果及显微镜发现结果方面没有与测试物件相关的变化。记录的显微镜发现结果在对照动物及测试物件暴露组中的发生率相似，或者被认为代表了在此品系及年龄的大鼠中常见的偶然“背景”观察结果。
编号的实施方案
1.一种由以下中任一者来描述的缀合物：式(D-I)、(M-I)、(1)或(2)
Figure BDA0003630331990008811
其中每个A1及每个A2独立地由式(A-I)-(A-XII)来描述：
Figure BDA0003630331990008821
其中R1选自-OH、-NH2、-NHC(＝NH)NH2及-NHC(＝NH)NHR6；
R2及R3各自独立地选自-H、-OH、-F、-Cl及-Br；
R4选自-CO2H、-P(＝O)(OH)2、-SO3H；
R5选自-COCH3、-COCF3、-SO2CH3；
X选自-O-及-S-；
Y选自：
Figure BDA0003630331990008831
R6选自
Figure BDA0003630331990008832
Figure BDA0003630331990008833
R7选自H、C1-C20烷基、C3-C20环烷基、C3-C20杂环烷基；C5-C15芳基及C2-C15杂芳基；
R8选自C3-C20杂环烷基、C5-C15芳基及C2-C15杂芳基；
n为1或2；
每个E包含Fc结构域单体、白蛋白、白蛋白结合肽或Fc结合肽；
L为共价附接于E且附接于每个A1或每个A1及A2的每个Y的接头；
T为1至20的整数，且
式(D-I)、(M-I)、(1)或(2)中的每条波浪线指示L共价附接于每个E；
或其药学上可接受的盐。
2.如实施方案1所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-I)
Figure BDA0003630331990008841
其中每个A1及每个A2独立地选自式(A-I)-(A-XII)中任一者；
每个E包含Fc结构域单体、白蛋白、白蛋白
结合肽或Fc结合肽；
n为1或2；
T为1至20的整数；且
连接至E的波浪线指示每个A1-L-A2共价附接于E，
或其药学上可接受的盐。
3.如实施方案2所述的缀合物，其中每个A1及每个A2独立地选自以下中任一者：式(A-I)、(A-II)、(A-VI)或(A-VII)；
每个E包含Fc结构域单体、白蛋白、白蛋白
结合肽或Fc结合肽；
n为1或2；
T为1至20的整数；且
连接至E的波浪线指示每个A1-L-A2共价附接于E，
或其药学上可接受的盐。
4.如实施方案3所述的缀合物，其中每个A1及每个A2由式(A-I)或其药学上可接受的盐来描述。
5.如实施方案1-4中任一项所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-II)
Figure BDA0003630331990008851
或其药学上可接受的盐。
6.如实施方案5所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-II-1)
Figure BDA0003630331990008861
或其药学上可接受的盐。
7.如实施方案6所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-II-2)
Figure BDA0003630331990008862
Figure BDA0003630331990008871
或其药学上可接受的盐。
8.如实施方案7所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-II-3)
Figure BDA0003630331990008872
其中L’是L的剩余部分，且
y1及y2各自独立地为1至20的整数，
或其药学上可接受的盐。
9.如实施方案8所述的缀合物，其中L’为氮原子。
10.如实施方案9所述的缀合物，其中所述缀合物具有选自以下的结构：
Figure BDA0003630331990008881
11.如实施方案6所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-II-4)
Figure BDA0003630331990008891
或其药学上可接受的盐。
12.如实施方案11所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-II-5)
Figure BDA0003630331990008892
其中L’是L的剩余部分，且
y1及y2各自独立地为1至20的整数，
或其药学上可接受的盐。
13.如实施方案12所述的缀合物，其中L’为氮原子。
14.如实施方案13所述的缀合物，其中所述缀合物具有选自以下的结构：
Figure BDA0003630331990008901
15.如实施方案11所述的缀合物，其中所述缀合物具有以下的结构：
Figure BDA0003630331990008911
或其药学上可接受的盐。
16.如实施方案6所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-II-6)
Figure BDA0003630331990008912
其中R7选自H、C1-C20烷基、C3-C20环烷基、C3-C20杂环烷基；C5-C15芳基及C2-C15杂芳基；
或其药学上可接受的盐。
17.如实施方案16所述的缀合物，其中R7选自C1-C20烷基、C3-C20环烷基、C3-C20杂环烷基；C5-C15芳基及C2-C15杂芳基。
18.如实施方案16或17所述的缀合物，其中R7选自甲基、乙基、丙基或丁基。
19.如实施方案16-18中任一项所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-II-7)
Figure BDA0003630331990008921
或其药学上可接受的盐。
20.如实施方案19所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-II-8)
Figure BDA0003630331990008922
其中L’是L的剩余部分，且
y1及y2各自独立地为1至20的整数，
或其药学上可接受的盐。
21.如实施方案20所述的缀合物，其中所述缀合物具有以下的结构：
Figure BDA0003630331990008931
或其药学上可接受的盐。
22.如实施方案21所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：
Figure BDA0003630331990008941
或其药学上可接受的盐。
23.如实施方案16-18中任一项所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-II-9)
Figure BDA0003630331990008942
或其药学上可接受的盐。
24.如实施方案23所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-II-10)
Figure BDA0003630331990008951
其中L’是L的剩余部分，且
y1及y2各自独立地为1至20的整数，
或其药学上可接受的盐。
25.如实施方案24所述的缀合物，其中所述缀合物具有以下的结构：
Figure BDA0003630331990008952
或其药学上可接受的盐。
26.如实施方案2或3所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-III)
Figure BDA0003630331990008961
或其药学上可接受的盐。
27.如实施方案26所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-III-1)
Figure BDA0003630331990008962
或其药学上可接受的盐。
28.如实施方案27所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-III-2)
Figure BDA0003630331990008971
或其药学上可接受的盐。
29.如实施方案28所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-III-3)
Figure BDA0003630331990008972
其中L’是L的剩余部分，且
y1及y2各自独立地为1至20的整数，
或其药学上可接受的盐。
30.如实施方案27所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-III-4)
Figure BDA0003630331990008981
或其药学上可接受的盐。
31.如实施方案30所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-III-5)
Figure BDA0003630331990008991
其中L’是L的剩余部分，且
y1及y2各自独立地为1至20的整数，
或其药学上可接受的盐。
32.如实施方案27所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-III-6)
Figure BDA0003630331990008992
或其药学上可接受的盐。
33.如实施方案32所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-III-7)
Figure BDA0003630331990009001
其中L’是L的剩余部分，且
y1及y2各自独立地为1至20的整数，
或其药学上可接受的盐。
34.如实施方案27所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-III-8)
Figure BDA0003630331990009011
或其药学上可接受的盐。
35.如实施方案34所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-III-9)
Figure BDA0003630331990009012
其中L’是L的剩余部分，且3
y1及y2各自独立地为1至20的整数，
或其药学上可接受的盐。
36.如实施方案2所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-IV)
Figure BDA0003630331990009021
或其药学上可接受的盐。
37.如实施方案36所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-IV-1)
Figure BDA0003630331990009022
Figure BDA0003630331990009031
或其药学上可接受的盐。
38.如实施方案37所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-IV-2)
Figure BDA0003630331990009032
其中L’是L的剩余部分，且
y1及y2各自独立地为1至20的整数，
或其药学上可接受的盐。
39.如实施方案2或3所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-V)
Figure BDA0003630331990009041
或其药学上可接受的盐。
40.如实施方案39所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-V-1)
Figure BDA0003630331990009042
或其药学上可接受的盐。
41.如实施方案40所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-V-2)
Figure BDA0003630331990009051
或其药学上可接受的盐。
42.如实施方案41所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-V-3)
Figure BDA0003630331990009052
其中L’是L的剩余部分，且
y1及y2各自独立地为1至20的整数，
或其药学上可接受的盐。
43.如实施方案42所述的缀合物，其中L’为氮原子。
44.如实施方案42所述的缀合物，其中y1及y2各自为1，y1及y2各自为2，或y1及y2各自为3。
45.如实施方案40所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-V-4)
Figure BDA0003630331990009061
或其药学上可接受的盐。
46.如实施方案45所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-V-5)
Figure BDA0003630331990009062
其中L’是L的剩余部分，且
y1及y2各自独立地为1至20的整数，
或其药学上可接受的盐。
47.如实施方案46所述的缀合物，其中L’为氮原子。
48.如实施方案46所述的缀合物，其中y1及y2各自为1，y1及y2各自为2，或y1及y2各自为3。
49.如实施方案39所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-V-6)
Figure BDA0003630331990009071
或其药学上可接受的盐。
50.如实施方案49所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-V-7)
Figure BDA0003630331990009081
或其药学上可接受的盐。
51.如实施方案50所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-V-8)
Figure BDA0003630331990009082
其中L’是L的剩余部分，且
y1及y2各自独立地为1至20的整数，
或其药学上可接受的盐。
52.如实施方案51所述的缀合物，其中L’为氮原子。
53.如实施方案51所述的缀合物，其中y1及y2各自为1，y1及y2各自为2，或y1及y2各自为3。
54.如实施方案49所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-V-9)
Figure BDA0003630331990009091
或其药学上可接受的盐。
55.如实施方案51所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-V-10)
Figure BDA0003630331990009092
其中L’是L的剩余部分，且
y1及y2各自独立地为1至20的整数，
或其药学上可接受的盐。
56.如实施方案55所述的缀合物，其中L’为氮原子。
57.如实施方案56所述的缀合物，其中y1及y2各自为1，y1及y2各自为2，或y1及y2各自为3。
58.如实施方案2或3所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-VI)
Figure BDA0003630331990009101
或其药学上可接受的盐。
59.如实施方案58所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-VI-1)
Figure BDA0003630331990009111
或其药学上可接受的盐。
60.如实施方案59所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-VI-2)
Figure BDA0003630331990009112
或其药学上可接受的盐。
61.如实施方案60所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-VI-3)
Figure BDA0003630331990009121
其中L’是L的剩余部分，且
y1及y2各自独立地为1至20的整数，
或其药学上可接受的盐。
62.如实施方案59所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-VI-4)
Figure BDA0003630331990009122
或其药学上可接受的盐。
63.如实施方案62所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-VI-5)
Figure BDA0003630331990009131
其中L’是L的剩余部分，且
y1及y2各自独立地为1至20的整数，
或其药学上可接受的盐。
64.如实施方案59所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-VI-6)
Figure BDA0003630331990009141
或其药学上可接受的盐。
65.如实施方案64所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-VI-7)
Figure BDA0003630331990009142
其中L’是L的剩余部分，且
y1及y2各自独立地为1至20的整数，
或其药学上可接受的盐。
66.如实施方案59所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-VI-8)
Figure BDA0003630331990009151
或其药学上可接受的盐。
67.如实施方案66所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-VI-9)
Figure BDA0003630331990009152
Figure BDA0003630331990009161
其中L’是L的剩余部分，且3
y1及y2各自独立地为1至20的整数，
或其药学上可接受的盐。
68.如实施方案2或3所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-VII)
Figure BDA0003630331990009162
或其药学上可接受的盐。
69.如实施方案39-68中任一项所述的缀合物，其中R1为OH。
70.如实施方案39-68中任一项所述的缀合物，其中R1为-NH2。
71.如实施方案39-68中任一项所述的缀合物，其中R1为-NHC(＝NH)NH2。
72.如实施方案2所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-VIII)
Figure BDA0003630331990009171
或其药学上可接受的盐。
73.如实施方案72所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-VIII-1)
Figure BDA0003630331990009172
或其药学上可接受的盐。
74.如实施方案73所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-VIII-2)
Figure BDA0003630331990009181
或其药学上可接受的盐。
75.如实施方案74所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-VIII-3)
Figure BDA0003630331990009182
其中L’是L的剩余部分，且
y1及y2各自独立地为1至20的整数，
或其药学上可接受的盐。
76.如实施方案75所述的缀合物，其中L’为氮原子。
77.如实施方案75所述的缀合物，其中所述缀合物具有选自以下的结构：
Figure BDA0003630331990009191
78.如实施方案73所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-VIII-4)
Figure BDA0003630331990009201
或其药学上可接受的盐。
79.如实施方案78所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-VIII-5)
Figure BDA0003630331990009202
其中L’是L的剩余部分，且
y1及y2各自独立地为1至20的整数，
或其药学上可接受的盐。
80.如实施方案79所述的缀合物，其中L’为氮原子。
81.如实施方案79所述的缀合物，其中所述缀合物具有选自以下的结构：
Figure BDA0003630331990009211
82.如实施方案78所述的缀合物，其中所述缀合物由以下的结构来描述：
Figure BDA0003630331990009221
83.如实施方案73所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-VIII-6)
Figure BDA0003630331990009222
或其药学上可接受的盐。
84.如实施方案83所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-VIII-7)
Figure BDA0003630331990009231
其中L’是L的剩余部分，且
y1及y2各自独立地为1至20的整数，
或其药学上可接受的盐。
85.如实施方案73所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-VIII-8)
Figure BDA0003630331990009232
或其药学上可接受的盐。
86.如实施方案85所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-VIII-9)
Figure BDA0003630331990009241
其中L’是L的剩余部分，且
y1及y2各自独立地为1至20的整数，
或其药学上可接受的盐。
87.如实施方案72所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-VIII-10)
Figure BDA0003630331990009251
或其药学上可接受的盐。
88.如实施方案87所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-VIII-11)
Figure BDA0003630331990009252
其中L’是L的剩余部分，且
y1及y2各自独立地为1至20的整数，
或其药学上可接受的盐。
89.如实施方案2所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-IX)
Figure BDA0003630331990009261
或其药学上可接受的盐。
90.如实施方案89所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-IX-1)
Figure BDA0003630331990009262
或其药学上可接受的盐。
91.如实施方案90所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-IX-2)
Figure BDA0003630331990009271
或其药学上可接受的盐。
92.如实施方案90所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-IX-3)
Figure BDA0003630331990009272
或其药学上可接受的盐。
93.如实施方案90所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-IX-4)
Figure BDA0003630331990009281
或其药学上可接受的盐。
94.如实施方案90所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-IX-5)
Figure BDA0003630331990009282
或其药学上可接受的盐。
95.如实施方案90所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-IX-6)
Figure BDA0003630331990009291
或其药学上可接受的盐。
96.如实施方案2所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-X)
Figure BDA0003630331990009292
或其药学上可接受的盐。
97.如实施方案96所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-X-1)
Figure BDA0003630331990009301
或其药学上可接受的盐。
98.如实施方案97所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-X-2)
Figure BDA0003630331990009302
或其药学上可接受的盐。
99.如实施方案97所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-X-3)
Figure BDA0003630331990009311
或其药学上可接受的盐。
100.如实施方案1-99中任一项所述的缀合物，其中L或L’包含一个或多个任选取代的C1-C20亚烷基、任选取代的C1-C20亚杂烷基、任选取代的C2-C20亚烯基、任选取代的C2-C20亚杂烯基、任选取代的C2-C20亚炔基、任选取代的C2-C20亚杂炔基、任选取代的C3-C20亚环烷基、任选取代的C3-C20亚杂环烷基、任选取代的C4-C20亚环烯基、任选取代的C4-C20亚杂环烯基、任选取代的C8-C20亚环炔基、任选取代的C8-C20亚杂环炔基、任选取代的C5-C15亚芳基、任选取代的C2-C15亚杂芳基、O、S、NRi、P、羰基、硫羰基、磺酰基、磷酸酯基、磷酰基或亚氨基，其中Ri为H、任选取代的C1-C20烷基、任选取代的C1-C20杂烷基、任选取代的C2-C20烯基、任选取代的C2-C20杂烯基、任选取代的C2-C20炔基、任选取代的C2-C20杂炔基、任选取代的C3-C20环烷基、任选取代的C3-C20杂环烷基、任选取代的C4-C20环烯基、任选取代的C4-C20杂环烯基、任选取代的C8-C20环炔基、任选取代的C8-C20杂环炔基、任选取代的C5-C15芳基或任选取代的C2-C15杂芳基。
101.如实施方案100所述的缀合物，其中L或L’的骨架是由一个或多个任选取代的C1-C20亚烷基、任选取代的C1-C20亚杂烷基、任选取代的C2-C20亚烯基、任选取代的C2-C20亚杂烯基、任选取代的C2-C20亚炔基、任选取代的C2-C20亚杂炔基、任选取代的C3-C20亚环烷基、任选取代的C3-C20亚杂环烷基、任选取代的C4-C20亚环烯基、任选取代的C4-C20亚杂环烯基、任选取代的C8-C20亚环炔基、任选取代的C8-C20亚杂环炔基、任选取代的C5-C15亚芳基、任选取代的C2-C15亚杂芳基、O、S、NRi、P、羰基、硫羰基、磺酰基、磷酸酯基、磷酰基或亚氨基组成，
其中Ri为H、任选取代的C1-C20烷基、任选取代的C1-C20杂烷基、任选取代的C2-C20烯基、任选取代的C2-C20杂烯基、任选取代的C2-C20炔基、任选取代的C2-C20杂炔基、任选取代的C3-C20环烷基、任选取代的C3-C20杂环烷基、任选取代的C4-C20环烯基、任选取代的C4-C20杂环烯基、任选取代的C8-C20环炔基、任选取代的C8-C20杂环炔基、任选取代的C5-C15芳基或任选取代的C2-C15杂芳基。
102.如实施方案100或101所述的缀合物，其中L或L’经氧代取代。
103.如实施方案1-102中任一项所述的缀合物，其中L或L’的骨架包含不超过250个原子。
104.如实施方案1-103中任一项所述的缀合物，其中L或L’能够形成酰胺、氨基甲酸酯、磺酰基或脲连接。
105.如实施方案1-99中任一项所述的缀合物，其中L或L’为键。
106.如实施方案1-99中任一项所述的缀合物，其中L或L’为原子。
107.如实施方案1-106中任一项所述的缀合物，其中每个L由以下来描述：式(D-L-I)
Figure BDA0003630331990009331
其中LA由式GA1-(ZA1)g1-(YA1)h1-(ZA2)i1-(YA2)j1-(ZA3)k1-(YA3)l1-(ZA4)m1-(YA4)n1-(ZA5)o1-GA2描述；
LB由式GB1-(ZB1)g2-(YB1)h2-(ZB2)i2-(YB2)j2-(ZB3)k2-(YB3)l2-(ZB4)m2-(YB4)n2-(ZB5)o2-GB2描述；
LC由式GC1-(ZC1)g3-(YC1)h3-(ZC2)i3-(YC2)j3-(ZC3)k3-(YC3)l3-(ZC4)m3-(YC4)n3-(ZC5)o3-GC2描述；
GA1是附接于Q的键；
GA2是附接于A1的键；
GB1是附接于Q的键；
GB2是附接于A2的键；
GC1是附接于Q的键；
GC2是附接于E的键或能够与缀合于E的官能团反应的官能团(例如，马来酰亚胺及半胱氨酸、胺及经活化羧酸、硫醇及马来酰亚胺、经活化磺酸及胺、异氰酸酯及胺、叠氮化物及炔以及烯烃及四嗪)；
ZA1、ZA2、ZA3、ZA4、ZA5、ZB1、ZB2、ZB3、ZB4、ZB5、ZC1、ZC2、ZC3、ZC4及ZC5中的每一者独立地为任选取代的C1-C20亚烷基、任选取代的C1-C20亚杂烷基、任选取代的C2-C20亚烯基、任选取代的C2-C20亚杂烯基、任选取代的C2-C20亚炔基、任选取代的C2-C20亚杂炔基、任选取代的C3-C20亚环烷基、任选取代的C3-C20亚杂环烷基、任选取代的C4-C20亚环烯基、任选取代的C4-C20亚杂环烯基、任选取代的C8-C20亚环炔基、任选取代的C8-C20亚杂环炔基、任选取代的C5-C15亚芳基或任选取代的C2-C15亚杂芳基；
YA1、YA2、YA3、YA4、YB1、YB2、YB3、YB4、YC1、YC2、YC3及YC4中的每一者独立地为O、S、NRi、P、羰基、硫羰基、磺酰基、磷酸酯基、磷酰基或亚氨基；
Ri为H、任选取代的C1-C20烷基、任选取代的C1-C20杂烷基、任选取代的C2-C20烯基、任选取代的C2-C20杂烯基、任选取代的C2-C20炔基、任选取代的C2-C20杂炔基、任选取代的C3-C20环烷基、任选取代的C3-C20杂环烷基、任选取代的C4-C20环烯基、任选取代的C4-C20杂环烯基、任选取代的C8-C20环炔基、任选取代的C8-C20杂环炔基、任选取代的C5-C15芳基或任选取代的C2-C15杂芳基；
g1、h1、i1、j1、k1、l1、m1、n1、o1、g2、h2、i2、j2、k2、l2、m2、n2、o2、g3、h3、i3、j3、k3、l3、m3、n3及o3中的每一者独立地为0或1；
Q为氮原子、任选取代的C1-C20亚烷基、任选取代的C1-C20亚杂烷基、任选取代的C2-C20亚烯基、任选取代的C2-C20亚杂烯基、任选取代的C2-C20亚炔基、任选取代的C2-C20亚杂炔基、任选取代的C3-C20亚环烷基、任选取代的C3-C20亚杂环烷基、任选取代的C4-C20亚环烯基、任选取代的C4-C20亚杂环烯基、任选取代的C8-C20亚环炔基、任选取代的C8-C20亚杂环炔基、任选取代的C5-C15亚芳基或任选取代的C2-C15亚杂芳基。
108.如实施方案107所述的缀合物，其中L选自
Figure BDA0003630331990009341
Figure BDA0003630331990009351
Figure BDA0003630331990009361
Figure BDA0003630331990009371
Figure BDA0003630331990009381
Figure BDA0003630331990009391
Figure BDA0003630331990009401
Figure BDA0003630331990009411
Figure BDA0003630331990009421
Figure BDA0003630331990009431
Figure BDA0003630331990009441
其中z1及z2各自独立地为1至20的整数；且
R9选自H、C1-C20烷基、C3-C20环烷基、C3-C20杂环烷基；C5-C15芳基及C2-C15杂芳基。
109.如实施方案108所述的缀合物，其中Y为：
Figure BDA0003630331990009451
(-NH(C＝O)O-)且L为：
Figure BDA0003630331990009452
110.如实施方案108所述的缀合物，其中Y为：
Figure BDA0003630331990009453
(-NH(C＝O)O-)且L为：
Figure BDA0003630331990009454
111.如实施方案108所述的缀合物，其中Y为：
Figure BDA0003630331990009455
(-NH(C＝O)O-)且L为：
Figure BDA0003630331990009456
112.如实施方案108所述的缀合物，其中Y为：
Figure BDA0003630331990009457
(-O-)且L为：
Figure BDA0003630331990009458
113.如实施方案1所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-I)
Figure BDA0003630331990009459
Figure BDA0003630331990009461
其中每个A1独立地选自式(A-I)-(A-XII)中任一者；
每个E包含Fc结构域单体、白蛋白、白蛋白
结合肽或Fc结合肽；
n为1或2；
T为1至20的整数；且
L是共价附接于E及A1中的每一者的接头，
连接至E的波浪线指示每个A1-L共价附接于E；
或其药学上可接受的盐。
114.如实施方案113所述的缀合物，其中每个A1独立地选自以下中任一者：式(A-I)、(A-II)、(A-VI)或(A-VII)；
每个E包含Fc结构域单体、白蛋白、白蛋白
结合肽或Fc结合肽，且
连接至E的波浪线指示每个A1-L共价附接于E；
或其药学上可接受的盐。
115.如实施方案114所述的缀合物，其中每个A1独立地选自式(A-I)。
116.如实施方案115所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-II)
Figure BDA0003630331990009471
或其药学上可接受的盐。
117.如实施方案116所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-II-1)
Figure BDA0003630331990009472
或其药学上可接受的盐。
118.如实施方案117所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-II-2)
Figure BDA0003630331990009481
或其药学上可接受的盐。
119.如实施方案118所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-II-3)
Figure BDA0003630331990009482
其中L’是L的剩余部分，且
y1为1至20的整数，
或其药学上可接受的盐。
120.如实施方案119所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-II-4)
Figure BDA0003630331990009491
或其药学上可接受的盐。
121.如实施方案120所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-II-5)
Figure BDA0003630331990009492
其中L’是L的剩余部分，且
y1为1至20的整数，
或其药学上可接受的盐。
122.如实施方案121所述的缀合物，其中所述缀合物具有以下的结构：
Figure BDA0003630331990009501
或其药学上可接受的盐。
123.如实施方案116所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-II-6)
Figure BDA0003630331990009502
其中R7选自H、C1-C20烷基、C3-C20环烷基、C3-C20杂环烷基；C5-C15芳基及C2-C15杂芳基；
或其药学上可接受的盐。
124.如实施方案123所述的缀合物，其中R7选自C1-C20烷基、C3-C20环烷基、C3-C20杂环烷基；C5-C15芳基及C2-C15杂芳基。
125.如实施方案123或124所述的缀合物，其中R7选自甲基、乙基、丙基或丁基。
126.如实施方案123-125中任一项所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-II-7)
Figure BDA0003630331990009511
或其药学上可接受的盐。
127.如实施方案126所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-II-8)
Figure BDA0003630331990009512
其中L’是L的剩余部分，且
y1为1至20的整数，
或其药学上可接受的盐。
128.如实施方案127所述的缀合物，其中所述缀合物具有以下的结构：
Figure BDA0003630331990009521
或其药学上可接受的盐。
129.如实施方案127所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-II-9)
Figure BDA0003630331990009522
或其药学上可接受的盐。
130.如实施方案129所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-II-10)
Figure BDA0003630331990009531
其中L’是L的剩余部分，且
y1为1至20的整数，
或其药学上可接受的盐。
131.如实施方案130所述的缀合物，其中所述缀合物具有以下结构：
Figure BDA0003630331990009532
或其药学上可接受的盐。
132.如实施方案113或114所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-III)
Figure BDA0003630331990009541
或其药学上可接受的盐。
133.如实施方案132所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-III-1)
Figure BDA0003630331990009542
Figure BDA0003630331990009551
或其药学上可接受的盐。
134.如实施方案133所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-III-2)
Figure BDA0003630331990009552
或其药学上可接受的盐。
135.如实施方案134所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-III-3)
Figure BDA0003630331990009561
其中L’是L的剩余部分，且
y1及y2各自独立地为1至20的整数，
或其药学上可接受的盐。
136.如实施方案133所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-III-4)
Figure BDA0003630331990009562
或其药学上可接受的盐。
137.如实施方案136所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-III-5)
Figure BDA0003630331990009571
其中L’是L的剩余部分，且
y1及y2各自独立地为1至20的整数，
或其药学上可接受的盐。
138.如实施方案133所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-III-6)
Figure BDA0003630331990009581
或其药学上可接受的盐。
139.如实施方案138所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-III-7)
Figure BDA0003630331990009582
其中L’是L的剩余部分，且
y1及y2各自独立地为1至20的整数，
或其药学上可接受的盐。
140.如实施方案133所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-III-8)
Figure BDA0003630331990009591
或其药学上可接受的盐。
141.如实施方案140所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-III-9)
Figure BDA0003630331990009592
Figure BDA0003630331990009601
其中L’是L的剩余部分，且3
y1及y2各自独立地为1至20的整数，
或其药学上可接受的盐。
142.如实施方案113所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-IV)
Figure BDA0003630331990009602
或其药学上可接受的盐。
143.如实施方案142所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-IV-1)
Figure BDA0003630331990009611
或其药学上可接受的盐。
144.如实施方案143所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-IV-2)
Figure BDA0003630331990009612
其中L’是L的剩余部分，且
y1及y2各自独立地为1至20的整数，
或其药学上可接受的盐。
145.如实施方案113或114所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-V)
Figure BDA0003630331990009621
或其药学上可接受的盐。
146.如实施方案145所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-V-1)
Figure BDA0003630331990009622
或其药学上可接受的盐。
147.如实施方案146所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-V-2)
Figure BDA0003630331990009631
或其药学上可接受的盐。
148.如实施方案147所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-V-3)
Figure BDA0003630331990009632
其中L’是L的剩余部分，且
y1为1至20的整数，
或其药学上可接受的盐。
149.如实施方案148所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-V-4)
Figure BDA0003630331990009641
或其药学上可接受的盐。
150.如实施方案149所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-V-5)
Figure BDA0003630331990009642
其中L’是L的剩余部分，且
y1为1至20的整数，
或其药学上可接受的盐。
151.如实施方案145所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-V-6)
Figure BDA0003630331990009651
或其药学上可接受的盐。
152.如实施方案151所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-V-7)
Figure BDA0003630331990009652
或其药学上可接受的盐。
153.如实施方案152所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-V-8)
Figure BDA0003630331990009661
其中L’是L的剩余部分，且
y1为1至20的整数，
或其药学上可接受的盐。
154.如实施方案151所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-V-9)
Figure BDA0003630331990009662
或其药学上可接受的盐。
155.如实施方案154所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-V-10)
Figure BDA0003630331990009671
其中L’是L的剩余部分，且
y1为1至20的整数，
或其药学上可接受的盐。
156.如实施方案113或114所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-VI)
Figure BDA0003630331990009672
或其药学上可接受的盐。
157.如实施方案156所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-VI-1)
Figure BDA0003630331990009681
或其药学上可接受的盐。
158.如实施方案157所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-VI-2)
Figure BDA0003630331990009682
或其药学上可接受的盐。
159.如实施方案158所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-VI-3)
Figure BDA0003630331990009691
其中L’是L的剩余部分，且
y1及y2各自独立地为1至20的整数，
或其药学上可接受的盐。
160.如实施方案157所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-VI-4)
Figure BDA0003630331990009701
或其药学上可接受的盐。
161.如实施方案160所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-VI-5)
Figure BDA0003630331990009702
其中L’是L的剩余部分，且
y1及y2各自独立地为1至20的整数，
或其药学上可接受的盐。
162.如实施方案157所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-VI-6)
Figure BDA0003630331990009711
或其药学上可接受的盐。
163.如实施方案162所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-VI-7)
Figure BDA0003630331990009721
其中L’是L的剩余部分，且
y1及y2各自独立地为1至20的整数，
或其药学上可接受的盐。
164.如实施方案157所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-VI-8)
Figure BDA0003630331990009722
或其药学上可接受的盐。
165.如实施方案164所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-VI-9)
Figure BDA0003630331990009731
其中L’是L的剩余部分，且3
y1及y2各自独立地为1至20的整数，
或其药学上可接受的盐。
166.如实施方案113所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-VII)
Figure BDA0003630331990009741
或其药学上可接受的盐。
167.如实施方案113-166中任一项所述的缀合物，其中R1为OH。
168.如实施方案113-166中任一项所述的缀合物，其中R1为NH2。
169.如实施方案113-166中任一项所述的缀合物，其中R1为-NHC(＝NH)NH2。
170.如实施方案113所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-VIII)
Figure BDA0003630331990009742
Figure BDA0003630331990009751
或其药学上可接受的盐。
171.如实施方案170所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-VIII-1)
Figure BDA0003630331990009752
或其药学上可接受的盐。
172.如实施方案171所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-VIII-2)
Figure BDA0003630331990009753
或其药学上可接受的盐。
173.如实施方案172所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-VIII-3)
Figure BDA0003630331990009761
其中L’是L的剩余部分，且
y1为1至20的整数，
或其药学上可接受的盐。
174.如实施方案173所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-VIII-4)
Figure BDA0003630331990009762
Figure BDA0003630331990009771
或其药学上可接受的盐。
175.如实施方案174所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-VIII-5)
Figure BDA0003630331990009772
其中L’是L的剩余部分，且
y1为1至20的整数，
或其药学上可接受的盐。
176.如实施方案175所述的缀合物，其中所述缀合物具有以下的结构：
Figure BDA0003630331990009773
或其药学上可接受的盐。
177.如实施方案171所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-VIII-6)
Figure BDA0003630331990009781
或其药学上可接受的盐。
178.如实施方案177所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-VIII-7)
Figure BDA0003630331990009791
其中L’是L的剩余部分，且
y1及y2各自独立地为1至20的整数，
或其药学上可接受的盐。
179.如实施方案171所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-VIII-8)
Figure BDA0003630331990009792
Figure BDA0003630331990009801
或其药学上可接受的盐。
180.如实施方案179所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-VIII-9)
Figure BDA0003630331990009802
其中L’是L的剩余部分，且
y1及y2各自独立地为1至20的整数，
或其药学上可接受的盐。
181.如实施方案180所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-VIII-10)
Figure BDA0003630331990009811
或其药学上可接受的盐。
182.如实施方案181所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-VIII-11)
Figure BDA0003630331990009812
其中L’是L的剩余部分，且
y1及y2各自独立地为1至20的整数，
或其药学上可接受的盐。
183.如实施方案113所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-IX)
Figure BDA0003630331990009821
或其药学上可接受的盐。
184.如实施方案183所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-IX-1)
Figure BDA0003630331990009822
或其药学上可接受的盐。
185.如实施方案184所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-IX-2)
Figure BDA0003630331990009831
或其药学上可接受的盐。
186.如实施方案184所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-IX-3)
Figure BDA0003630331990009832
或其药学上可接受的盐。
187.如实施方案184所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-IX-4)
Figure BDA0003630331990009841
或其药学上可接受的盐。
188.如实施方案184所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-IX-5)
Figure BDA0003630331990009842
或其药学上可接受的盐。
189.如实施方案184所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-IX-6)
Figure BDA0003630331990009851
或其药学上可接受的盐。
190.如实施方案113所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-X)
Figure BDA0003630331990009852
或其药学上可接受的盐。
191.如实施方案190所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-X-1)
Figure BDA0003630331990009861
或其药学上可接受的盐。
192.如实施方案191所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-X-2)
Figure BDA0003630331990009862
或其药学上可接受的盐。
193.如实施方案190所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-X-3)
Figure BDA0003630331990009871
或其药学上可接受的盐。
194.如实施方案113-193中任一项所述的缀合物，其中L或L’包含一个或多个任选取代的C1-C20亚烷基、任选取代的C1-C20亚杂烷基、任选取代的C2-C20亚烯基、任选取代的C2-C20亚杂烯基、任选取代的C2-C20亚炔基、任选取代的C2-C20亚杂炔基、任选取代的C3-C20亚环烷基、任选取代的C3-C20亚杂环烷基、任选取代的C4-C20亚环烯基、任选取代的C4-C20亚杂环烯基、任选取代的C8-C20亚环炔基、任选取代的C8-C20亚杂环炔基、任选取代的C5-C15亚芳基、任选取代的C2-C15亚杂芳基、O、S、NRi、P、羰基、硫羰基、磺酰基、磷酸酯基、磷酰基或亚氨基，
其中Ri为H、任选取代的C1-C20烷基、任选取代的C1-C20杂烷基、任选取代的C2-C20烯基、任选取代的C2-C20杂烯基、任选取代的C2-C20炔基、任选取代的C2-C20杂炔基、任选取代的C3-C20环烷基、任选取代的C3-C20杂环烷基、任选取代的C4-C20环烯基、任选取代的C4-C20杂环烯基、任选取代的C8-C20环炔基、任选取代的C8-C20杂环炔基、任选取代的C5-C15芳基或任选取代的C2-C15杂芳基。
195.如实施方案194所述的缀合物，其中L或L’的骨架是由一个或多个任选取代的C1-C20亚烷基、任选取代的C1-C20亚杂烷基、任选取代的C2-C20亚烯基、任选取代的C2-C20亚杂烯基、任选取代的C2-C20亚炔基、任选取代的C2-C20亚杂炔基、任选取代的C3-C20亚环烷基、任选取代的C3-C20亚杂环烷基、任选取代的C4-C20亚环烯基、任选取代的C4-C20亚杂环烯基、任选取代的C8-C20亚环炔基、任选取代的C8-C20亚杂环炔基、任选取代的C5-C15亚芳基、任选取代的C2-C15亚杂芳基、O、S、NRi、P、羰基、硫羰基、磺酰基、磷酸酯基、磷酰基或亚氨基组成，
其中Ri为H、任选取代的C1-C20烷基、任选取代的C1-C20杂烷基、任选取代的C2-C20烯基、任选取代的C2-C20杂烯基、任选取代的C2-C20炔基、任选取代的C2-C20杂炔基、任选取代的C3-C20环烷基、任选取代的C3-C20杂环烷基、任选取代的C4-C20环烯基、任选取代的C4-C20杂环烯基、任选取代的C8-C20环炔基、任选取代的C8-C20杂环炔基、任选取代的C5-C15芳基或任选取代的C2-C15杂芳基。
196.如实施方案194或195所述的缀合物，其中L或L’经氧代取代。
197.如实施方案113-196中任一项所述的缀合物，其中L或L’的骨架包含不超过250个原子。
198.如实施方案113-197中任一项所述的缀合物，其中L或L’能够形成酰胺、氨基甲酸酯、磺酰基或脲连接。
199.如实施方案113-193中任一项所述的缀合物，其中L或L’为键。
200.如实施方案113-193中任一项所述的缀合物，其中L或L’为原子。
201.如实施方案113-200中任一项所述的缀合物，其中每个L由以下来描述：式(M-L-I)
J1-(Q1)g-(T1)h-(Q2)i-(T2)j-(Q3)k-(T3)l-(Q4)m-(T4)n-(Q5)o-J2
其中J1是附接A1的键；
J2是附接于E的键或能够与缀合于E的官能团反应的官能团(例如，马来酰亚胺及半胱氨酸、胺及经活化羧酸、硫醇及马来酰亚胺、经活化磺酸及胺、异氰酸酯及胺、叠氮化物及炔以及烯烃及四嗪)；
Q1、Q2、Q3、Q4及Q5中的每一者独立地为任选取代的C1-C20亚烷基、任选取代的C1-C20亚杂烷基、任选取代的C2-C20亚烯基、任选取代的C2-C20亚杂烯基、任选取代的C2-C20亚炔基、任选取代的C2-C20亚杂炔基、任选取代的C3-C20亚环烷基、任选取代的C3-C20亚杂环烷基、任选取代的C4-C20亚环烯基、任选取代的C4-C20亚杂环烯基、任选取代的C8-C20亚环炔基、任选取代的C8-C20亚杂环炔基、任选取代的C5-C15亚芳基或任选取代的C2-C15亚杂芳基；
T1、T2、T3、T4中的每一者独立地为O、S、NRi、P、羰基、硫羰基、磺酰基、磷酸酯基、磷酰基或亚氨基；
Ri为H、任选取代的C1-C20烷基、任选取代的C1-C20杂烷基、任选取代的C2-C20烯基、任选取代的C2-C20杂烯基、任选取代的C2-C20炔基、任选取代的C2-C20杂炔基、任选取代的C3-C20环烷基、任选取代的C3-C20杂环烷基、任选取代的C4-C20环烯基、任选取代的C4-C20杂环烯基、任选取代的C8-C20环炔基、任选取代的C8-C20杂环炔基、任选取代的C5-C15芳基或任选取代的C2-C15杂芳基；且g、h、i、j、k、l、m、n及o各自独立地为0或1。
202.如实施方案1-201中任一项所述的缀合物，其中R1为-NHC(＝NH)NH2。
203.如实施方案1-202中任一项所述的缀合物，其中R2为-F。
204.如实施方案1-203中任一项所述的缀合物，其中R3为-F。
205.如实施方案1-204中任一项所述的缀合物，其中R4为–CO2H。
206.如实施方案1-205中任一项所述的缀合物，其中R5为–COCH3。
207.如实施方案1-206中任一项所述的缀合物，其中连接至E的波浪线指示每个A1-L或每个A1-L-A2的L共价附接于E的溶剂暴露赖氨酸的氮原子。
208.如实施方案1-206中任一项所述的缀合物，其中连接至E的波浪线指示每个A1-L或每个A1-L-A2 L的L共价附接于E的溶剂暴露半胱氨酸的硫原子。
209.如实施方案1-208中任一项所述的缀合物，其中每个E为Fc结构域单体。
210.如实施方案209所述的缀合物，其中n为2，且每个E二聚以形成Fc结构域。
211.如实施方案2-4中任一项所述的缀合物，其中n为2，每个E为Fc结构域单体，每个E二聚以形成Fc结构域，且所述缀合物由以下来描述：式(D-I-1)
Figure BDA0003630331990009901
其中J为Fc结构域；且
T为1至20的整数，
或其药学上可接受的盐。
212.如实施方案211所述的缀合物，其中所述缀合物具有以下的结构：
Figure BDA0003630331990009911
或其药学上可接受的盐。
213.如实施方案113-115中任一项所述的缀合物，其中n为2，每个E为Fc结构域单体，每个E二聚以形成Fc结构域，且所述缀合物由以下来描述：式(M-I-1)
Figure BDA0003630331990009912
其中J为Fc结构域；且
T为1至20的整数，
或其药学上可接受的盐。
214.如实施方案209-213中任一项所述的缀合物，其中每个E包含与SEQ ID NO:1-138中任一者的序列至少95％相同的氨基酸序列。
215.如实施方案214所述的缀合物，其中每个E包含与以下中任一者的序列至少95％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:67、SEQID NO:68、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:80、SEQID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQID NO:94、SEQ ID NO:95。
216.如实施方案215所述的缀合物，其中每个E包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列。
217.如实施方案215所述的缀合物，其中每个E包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列。
218.如实施方案215所述的缀合物，其中每个E包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列。
219.如实施方案215所述的缀合物，其中每个E包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。
220.如实施方案215所述的缀合物，其中每个E包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列。
221.如实施方案215所述的缀合物，其中每个E包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列。
222.如实施方案215所述的缀合物，其中每个E包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列。
223.如实施方案215所述的缀合物，其中每个E包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列。
224.如实施方案215所述的缀合物，其中每个E包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列。
225.如实施方案215所述的缀合物，其中每个E包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列。
226.如实施方案215所述的缀合物，其中每个E包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列。
227.如实施方案215所述的缀合物，其中每个E包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列。
228.如实施方案215所述的缀合物，其中每个E包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列。
229.如实施方案215所述的缀合物，其中每个E包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列。
230.如实施方案215所述的缀合物，其中每个E包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列。
231.如实施方案215所述的缀合物，其中每个E包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列。
232.如实施方案215所述的缀合物，其中每个E包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列。
233.如实施方案215所述的缀合物，其中每个E包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列。
234.如实施方案209-233中任一项所述的缀合物，其中T为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
235.一种如实施方案209-233中任一项所述的缀合物的群体，其中T的平均值为1至10。
236.如实施方案235所述的缀合物的群体，其中T的平均值为1至5。
237.如实施方案235所述的缀合物的群体，其中T的平均值为3至7。
238.如实施方案236或237所述的缀合物的群体，其中T的平均值为3.5至5.5。
239.如实施方案236或237所述的缀合物的群体，其中T的平均值为约4.5。
240.如实施方案235所述的缀合物的群体，其中T的平均值为5至10。
241.一种药物组合物，其包含如实施方案1-234中任一项所述的缀合物或如实施方案235-240所述的缀合物的群体或者其药学上可接受的盐，及药学上可接受的赋形剂。
242.一种用于治疗具有病毒感染或据推测具有病毒感染的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如实施方案1-241中任一项所述的缀合物或组合物。
243.一种用于预防性治疗有需要的受试者的病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如实施方案1-241中任一项所述的缀合物或组合物。
244.如实施方案242或243所述的方法，其中所述病毒感染是由流感病毒或副流感病毒引起的。
245.如实施方案242-244中任一项所述的方法，其中所述病毒感染为流感病毒A、B或C或者副流感病毒。
246.如实施方案242-245中任一项所述的方法，其中所述受试者是免疫受损的。
247.如实施方案242-246中任一项所述的方法，其中所述受试者已经诊断患有体液免疫缺陷、T细胞缺陷、嗜中性粒细胞减少症、无脾或补体缺陷。
248.如实施方案242-247中任一项所述的方法，其中所述受试者正在经免疫抑制性疗法治疗或即将经免疫抑制性疗法治疗。
249.如实施方案242-248中任一项所述的方法，其中所述受试者已经诊断患有引起免疫抑制的疾病。
250.如实施方案249所述的方法，其中所述疾病是癌症或获得性免疫缺陷综合征。
251.如实施方案250所述的方法，其中所述癌症为白血病、淋巴瘤或多发性骨髓瘤。
252.如实施方案242-251中任一项所述的方法，其中所述受试者已经受或即将经受造血干细胞移植。
253.如实施方案242-252中任一项所述的方法，其中所述受试者已经受或即将经受器官移植。
254.如实施方案242-253中任一项所述的方法，其中所述受试者患有继发感染或处于发生继发感染的风险中。
255.一种预防诊断患有流感感染的受试者的继发感染的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用如实施方案1-241中任一项所述的缀合物或组合物。
256.如实施方案254或255所述的方法，其中所述继发感染是呼吸道感染。
257.如实施方案254-256中任一项所述的方法，其中所述继发感染与肺炎相关联。
258.如实施方案254-257中任一项所述的方法，其中所述继发感染是细菌感染、病毒感染或真菌感染。
259.如实施方案258所述的方法，其中所述继发感染是细菌感染。
260.如实施方案259所述的方法，其中所述细菌感染是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、肺炎链球菌、铜绿假单胞菌或流感嗜血杆菌感染。
261.如实施方案260所述的方法，其中所述细菌感染是MRSA。
262.如实施方案260所述的方法，其中所述细菌感染是肺炎链球菌。
263.如实施方案242-262中任一项所述的方法，其中所述缀合物或组合物是肌肉内、静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病变内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、经表面、肿瘤内、经腹膜、皮下、结膜下、囊内、经粘膜、心包内、脐内、眼内、经口、经局部、通过吸入、通过注射或通过输注施用。
264.如实施方案242-263中任一项所述的方法，其中所述受试者用第二治疗剂治疗。
265.如实施方案264所述的方法，其中所述第二治疗剂为抗病毒剂。
266.如实施方案264所述的方法，其中所述抗病毒剂选自吡莫地韦、奥司他韦、扎那米韦、帕拉米韦、拉尼米韦、金刚烷胺或金刚乙胺。
267.如实施方案266所述的方法，其中所述第二治疗剂为抗病毒疫苗。
268.如实施方案267所述的方法，其中所述抗病毒疫苗在所述受试者中引起针对流感病毒A、B或C或者副流感病毒的免疫反应。
269.如实施方案265所述的方法，其中所述抗病毒剂为巴洛沙韦。
270.如实施方案265所述的方法，其中所述缀合物及巴洛沙韦依序施用。
271.如实施方案265所述的方法，其中所述缀合物及巴洛沙韦同时施用。
272.如实施方案242-271中任一项所述的方法，其中缀合物由式(D-II-6)描述。
273.如实施方案272所述的方法，其中R7选自C1-C20烷基、C3-C20环烷基、C3-C20杂环烷基；C5-C15芳基及C2-C15杂芳基。
274.如实施方案272或273所述的方法，其中R7选自甲基、乙基、丙基或丁基。
275.如实施方案272-274所述的方法，其中所述缀合物由式(D-II-7)描述。
276.如实施方案242-275中任一项所述的方法，其中每个E具有与SEQ ID NO:63-68中任一者的序列至少95％相同的序列。
277.如实施方案242-275中任一项所述的方法，其中每个E具有与以下的序列至少95％相同的序列：SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:73。
278.如实施方案242-275中任一项所述的方法，其中每个E具有与以下的序列至少95％相同的序列：SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:76或SEQ ID NO:77。
279.如实施方案242-275中任一项所述的方法，其中所述缀合物是缀合物45或缀合物46。
280.一种用于治疗或预防受试者的病毒感染的方法，所述方法包括施用以下于所述受试者：
a)如实施方案1-241中任一项所述的缀合物或组合物；及
b)第二治疗剂。
281.如实施方案280所述的方法，其中在所述受试者具有病毒感染、据推测具有病毒感染或已暴露于病毒之后，向所述受试者施用缀合物。
282.如实施方案280所述的方法，其中向所述受试者预防性地施用所述缀合物。
283.如实施方案278-282中任一项所述的方法，其中在所述受试者具有病毒感染、据推测具有病毒感染或已暴露于病毒之后向所述受试者施用所述第二治疗剂。
284.如实施方案278-283中任一项所述的方法，其中向所述受试者预防性地施用所述第二治疗剂。
285.如实施方案278-284中任一项所述的方法，其中所述第二治疗剂在所述缀合物的2天内经施用。
286.如实施方案278-285中任一项所述的方法，其中所述第二治疗剂为抗病毒剂。
287.如实施方案286所述的方法，其中所述抗病毒剂是吡莫地韦、奥司他韦、扎那米韦、帕拉米韦、拉尼米韦、金刚烷胺、巴洛沙韦玛波西酯、巴洛沙韦酸、金刚乙胺或其药学上可接受的盐。
288.如实施方案287所述的方法，其中所述抗病毒剂是巴洛沙韦玛波西酯、巴洛沙韦酸或其药学上可接受的盐。
289.如实施方案288中任一项所述的方法，其中所述巴洛沙韦玛波西酯、巴洛沙韦酸或其药学上可接受的盐以20mg与90mg之间的量经施用。
290.如实施方案286所述的方法，其中所述巴洛沙韦玛波西酯、巴洛沙韦酸或其药学上可接受的盐经口施用。
291.如实施方案289或290所述的方法，其中所述巴洛沙韦玛波西酯、巴洛沙韦酸或其药学上可接受的盐作为单一剂量施用。
292.如实施方案289或290所述的方法，其中所述巴洛沙韦玛波西酯、巴洛沙韦酸或其药学上可接受的盐作为多于一个剂量施用。
293.如实施方案289-292中任一项所述的方法，其中所述巴洛沙韦玛波西酯、巴洛沙韦酸或其药学上可接受的盐以20mg与40mg之间的量经施用。
294.如实施方案289-292中任一项所述的方法，其中所述巴洛沙韦玛波西酯、巴洛沙韦酸或其药学上可接受的盐以30与80mg之间的量经施用。
295.如实施方案278-294中任一项所述的方法，其中所述缀合物由式(D-II-6)描述。
296.如实施方案295所述的方法，其中R7选自C1-C20烷基、C3-C20环烷基、C3-C20杂环烷基；C5-C15芳基及C2-C15杂芳基。
297.如实施方案295或296所述的方法，其中R7选自甲基、乙基、丙基或丁基。
298.如实施方案295-297中任一项所述的方法，其中所述缀合物由式(D-II-7)描述。
299.如实施方案280-298中任一项所述的方法，其中每个E具有与SEQ ID NO:63-68中任一者的序列至少95％相同的序列。
300.如实施方案299所述的方法，其中每个E具有与以下的序列至少95％相同的序列：SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:73。
301.如实施方案300所述的方法，其中每个E具有与以下的序列至少95％相同的序列：SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:76或SEQ ID NO:77。
302.如实施方案280-298中任一项所述的方法，其中所述缀合物是缀合物45或缀合物46。
303.如实施方案280-302中任一项所述的方法，其中所述缀合物是肌肉内、静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病变内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、经表面、肿瘤内、经腹膜、皮下、结膜下、囊内、经粘膜、心包内、脐内、眼内、经口、经局部、通过吸入、通过注射或通过输注施用。
304.如实施方案303所述的方法，其中所述缀合物经静脉内施用。
305.如实施方案303所述的方法，其中所述缀合物经皮下施用。
306.如实施方案303所述的方法，其中所述缀合物经肌肉内施用。
307.如实施方案280-306中任一项所述的方法，其中所述病毒感染是由流感病毒或副流感病毒引起的。
308.如实施方案307所述的方法，其中所述病毒是流感病毒A、B或C或者副流感病毒。
其他实施方案
尽管本发明已经结合其具体的实施方案进行了描述，但应当了解能够对它进行进一步的修改并且本申请旨在涵盖任何基本根据本发明的原理而对本发明进行的变动、使用或适应性调整，并且包括虽然不属于本发明但属于本发明所属领域的已知或习用实施手段的和属于上文所述的实质特征的以及符合权利要求范围之内的变更。在以上说明书中提及的所有公布、专利和专利申请均以引用方式并入本文，其程度就如同每个单独的公布、专利或专利申请被具体和单独地指出以引用方式整体并入一般。
本文提供一个或多个优选实施方案的详细描述。然而，应理解，本发明可以不同形式来体现。因此，本文公开的具体细节不应被解释为是限制性的，而是应被用作权利要求书的基础以及用作教导本领域中的技术人员以任何适当的方式采用本发明的代表性基础。

Claims (46)

1.一种由以下中任一者来描述的缀合物：式(D-I)、(M-I)、(1)或(2)
Figure FDA0003630331980000011
其中每个A1和每个A2独立地由式(A-I)-(A-XII)来描述：
Figure FDA0003630331980000012
其中R1选自-OH、-NH2、-NHC(＝NH)NH2和-NHC(＝NH)NHR6；
R2和R3各自独立地选自-H、-OH、-F、-Cl和-Br；
R4选自-CO2H、-P(＝O)(OH)2、-SO3H；
R5选自-COCH3、-COCF3、-SO2CH3；
X选自-O-和-S-；
Y选自：
Figure FDA0003630331980000021
Figure FDA0003630331980000022
及
Figure FDA0003630331980000023
R6选自
Figure FDA0003630331980000024
Figure FDA0003630331980000025
Figure FDA0003630331980000031
R7选自H、C1-C20烷基、C3-C20环烷基、C3-C20杂环烷基；C5-C15芳基和C2-C15杂芳基；
R8选自C3-C20杂环烷基、C5-C15芳基和C2-C15杂芳基；
n为1或2；
每个E包含Fc结构域单体、白蛋白蛋白、白蛋白蛋白结合肽或Fc结合肽；
L为共价附接于E且附接于每个A1或每个A1和A2的每个Y的接头；
T为1至20的整数，且
式(D-I)、(M-I)、(1)或(2)中的每条波浪线指示L共价附接于每个E；
或其药学上可接受的盐。
2.如权利要求1所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-I)
Figure FDA0003630331980000032
Figure FDA0003630331980000041
其中每个A1和每个A2独立地选自式(A-I)-(A-XII)中任一者；
每个E包含Fc结构域单体、白蛋白蛋白、白蛋白蛋白结合肽或Fc结合肽；
n为1或2；
T为1至20的整数；且
连接至所述E的波浪线指示每个A1-L-A2的L共价附接于E，
或其药学上可接受的盐。
3.如权利要求1或2中任一项所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-II)
Figure FDA0003630331980000042
或其药学上可接受的盐。
4.如权利要求3所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-II-1)
Figure FDA0003630331980000051
或其药学上可接受的盐。
5.如权利要求4所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-II-6)
Figure FDA0003630331980000052
其中R7选自H、C1-C20烷基、C3-C20环烷基、C3-C20杂环烷基；C5-C15芳基和C2-C15杂芳基；
或其药学上可接受的盐。
6.如权利要求5所述的缀合物，其中R7选自C1-C20烷基、C3-C20环烷基、C3-C20杂环烷基；C5-C15芳基和C2-C15杂芳基。
7.如权利要求5或6所述的缀合物，其中R7选自甲基、乙基、丙基或丁基。
8.如权利要求5-7中任一项所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-II-7)
Figure FDA0003630331980000061
或其药学上可接受的盐。
9.如权利要求8所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(D-II-8)
Figure FDA0003630331980000062
其中L’是L的剩余部分，且
y1和y2各自独立地为1至20的整数，
或其药学上可接受的盐。
10.如权利要求9所述的缀合物，其中所述缀合物具有以下的结构：
Figure FDA0003630331980000071
或其药学上可接受的盐。
11.如权利要求10所述的缀合物，其中所述缀合物具有以下的结构：
Figure FDA0003630331980000081
或其药学上可接受的盐。
12.如权利要求1所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-I)
Figure FDA0003630331980000082
其中每个A1独立地选自式(A-I)-(A-XII)中任一者；
每个E包含Fc结构域单体、白蛋白蛋白、白蛋白蛋白结合肽或Fc结合肽；
n为1或2；
T为1至20的整数；且
L是共价附接于E和A1中的每一者的接头，
连接至所述E的波浪线指示每个A1-L的L共价附接于E；
或其药学上可接受的盐。
13.如权利要求12所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-II)
Figure FDA0003630331980000091
或其药学上可接受的盐。
14.如权利要求13所述的缀合物，其中所述缀合物由以下来描述：式(M-II-6)
Figure FDA0003630331980000092
其中R7选自H、C1-C20烷基、C3-C20环烷基、C3-C20杂环烷基；C5-C15芳基和C2-C15杂芳基；
或其药学上可接受的盐。
15.如权利要求14所述的缀合物，其中R7选自C1-C20烷基、C3-C20环烷基、C3-C20杂环烷基；C5-C15芳基和C2-C15杂芳基。
16.如权利要求14或15所述的缀合物，其中R7选自甲基、乙基、丙基或丁基。
17.如权利要求1-16中任一项所述的缀合物，其中连接至E的波浪线指示每个A1-L或每个A1-L-A2的L共价附接于E的溶剂暴露赖氨酸的氮原子。
18.如权利要求1-16中任一项所述的缀合物，其中连接至E的波浪线指示每个A1-L或每个A1-L-A2 L的L共价附接于E的溶剂暴露半胱氨酸的硫原子。
19.如权利要求1-18中任一项所述的缀合物，其中每个E为Fc结构域单体。
20.如权利要求19所述的缀合物，其中n为2，且每个E二聚以形成Fc结构域。
21.如权利要求2所述的缀合物，其中n为2，每个E为Fc结构域单体，每个E二聚以形成Fc结构域，且所述缀合物由以下来描述：式(D-I-1)
Figure FDA0003630331980000101
其中J为Fc结构域；且
T为1至20的整数，
或其药学上可接受的盐。
22.如权利要求21所述的缀合物，其中所述缀合物具有以下的结构：
Figure FDA0003630331980000111
或其药学上可接受的盐。
23.如权利要求12所述的缀合物，其中n为2，每个E为Fc结构域单体，每个E二聚以形成Fc结构域，且所述缀合物由以下来描述：式(M-I-1)
Figure FDA0003630331980000112
其中J为Fc结构域；且
T为1至20的整数，
或其药学上可接受的盐。
24.如权利要求19-23中任一项所述的缀合物，其中每个E包含与SEQ ID NO:1-138中任一者的序列至少95％同一的氨基酸序列。
25.如权利要求24所述的缀合物，其中每个E包含与以下中任一者的序列至少95％同一的氨基酸序列：SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:80、SEQ IDNO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ IDNO:94、SEQ ID NO:95。
26.如权利要求25所述的缀合物，其中每个E包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列。
27.如权利要求25所述的缀合物，其中每个E包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列。
28.如权利要求25所述的缀合物，其中每个E包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列。
29.如权利要求25所述的缀合物，其中每个E包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列。
30.如权利要求19-29中任一项所述的缀合物，其中T为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
31.一种如权利要求19-29中任一项所述的缀合物的群体，其中T的平均值为1至10、5至10、1至5、3至7或3.5至5.5。
32.一种如权利要求19-29中任一项所述的缀合物的群体，其中T的平均值为约4.5。
33.一种药物组合物，其包含如权利要求1-32中任一项所述的缀合物或缀合物的群体或者其药学上可接受的盐，和药学上可接受的赋形剂。
34.一种用于治疗患有病毒感染或据推测患有病毒感染的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如权利要求1-33中任一项所述的缀合物、缀合物的群体或药物组合物。
35.一种用于预防性治疗有需要的受试者的病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如权利要求1-33中任一项所述的缀合物、缀合物的群体或药物组合物。
36.如权利要求34或35所述的方法，其中所述病毒感染是由流感病毒或副流感病毒引起的。
37.一种预防诊断患有流感感染的受试者的继发感染的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用如权利要求1-33中任一项所述的缀合物、缀合物的群体或药物组合物。
38.如权利要求34-37中任一项所述的方法，其中所述受试者用第二治疗剂治疗。
39.一种用于治疗或预防受试者的病毒感染的方法，所述方法包括施用以下于所述受试者：
a)如权利要求1-33中任一项所述的缀合物、缀合物的群体或组合物；以及
b)第二治疗剂。
40.如权利要求38或39中任一项所述的方法，其中所述第二治疗剂为抗病毒剂。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述抗病毒剂是吡莫地韦、奥司他韦、扎那米韦、帕拉米韦、拉尼米韦、金刚烷胺、巴洛沙韦玛波西酯、巴洛沙韦酸、金刚乙胺或其药学上可接受的盐。
42.如权利要求39-41中任一项所述的方法，其中所述病毒感染是由流感病毒或副流感病毒引起的。
43.如权利要求34-42中任一项所述的方法，其中缀合物由式(D-II-6)来描述。
44.如权利要求34-43所述的方法，其中所述缀合物由式(D-II-7)来描述。
45.如权利要求34-44中任一项所述的方法，其中每个E具有与以下的序列至少95％同一的序列：SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:76或SEQ ID NO:77。
46.如权利要求34-45中任一项所述的方法，其中所述缀合物是缀合物45或缀合物46。
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CR20210166A (es) 2018-09-06 2021-07-27 Cidara Therapeutics Inc Composiciones y métodos para el tratamiento de infecciones virales
US20240024497A1 (en) 2020-08-06 2024-01-25 Cidara Therapeutics, Inc. Methods for the synthesis of protein-drug conjugates
US20230364251A1 (en) 2020-08-06 2023-11-16 Cidara Therapeutics, Inc. Methods for the synthesis of protein-drug conjugates
CA3211494A1 (en) 2021-03-11 2022-09-15 Leslie W. Tari Protein-drug conjugates for antiviral therapy
WO2023125806A1 (zh) * 2021-12-30 2023-07-06 苏州爱科百发生物医药技术有限公司 用于预防和治疗病毒感染的偶联物及其用途

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050054718A1 (en) * 2001-11-09 2005-03-10 Demaine Derek A. Dimeric compounds and their use as anti-viral agents

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2271249C (en) 1996-11-14 2010-07-20 Biota Scientific Management Pty. Ltd. Macromolecular neuraminidase-binding compounds
AUPP913999A0 (en) 1999-03-12 1999-04-01 Biota Scientific Management Pty Ltd Novel chemical compounds and their use
NZ581395A (en) 2007-05-14 2012-08-31 Biogen Idec Inc Single-chain fc (scfc) regions, binding polypeptides comprising same, and methods related thereto
WO2010093706A2 (en) 2009-02-10 2010-08-19 The Scripps Research Institute Chemically programmed vaccination
CA2835489C (en) 2010-05-10 2018-03-06 Chi-Huey Wong Zanamivir phosphonate congeners with anti-influenza activity and determining oseltamivir susceptibility of influenza viruses
TW201817745A (zh) 2011-09-30 2018-05-16 日商中外製藥股份有限公司 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子
TR201809571T4 (tr) 2013-03-15 2018-07-23 Hoffmann La Roche Ll-22 polipeptidleri ile ıl-22 fc füzyon proteinleri ve kullanım yöntemleri.
WO2017046625A1 (en) 2015-06-25 2017-03-23 Cube Biotech Gmbh New chelators for affinity purification of recombinant proteins
US20230190950A1 (en) * 2017-01-06 2023-06-22 Cidara Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of bacterial infections
CR20210166A (es) * 2018-09-06 2021-07-27 Cidara Therapeutics Inc Composiciones y métodos para el tratamiento de infecciones virales

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050054718A1 (en) * 2001-11-09 2005-03-10 Demaine Derek A. Dimeric compounds and their use as anti-viral agents

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Publication number Publication date
WO2021046549A1 (en) 2021-03-11
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