JP2011087594A - 非同種スイッチ領域を介して、ヒト抗体の特定のアイソタイプを産生するためのトランスジェニック動物 - Google Patents

非同種スイッチ領域を介して、ヒト抗体の特定のアイソタイプを産生するためのトランスジェニック動物 Download PDF

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Abstract

【課題】実質的に任意の所望の抗原での免疫化に応答して所望のアイソタイプのトランスジェニック動物における完全ヒト抗体の提供。
【解決手段】動物中のヒト免疫グロブリン重鎖導入遺伝子は所望の重鎖アイソタイプをコードするエキソンを含むヒト定常領域遺伝子セグメントを含み、異なる重鎖アイソタイプの定常領域由来のスイッチ領域に作動可能に連結される。このさらなる定常領域セグメントはスイッチ領域およびヒト定常領域コードセグメントを含み、この定常領域コードセグメントは、スイッチ領域に作動可能に連結され、このスイッチ領域は、通常会合してしない。該導入遺伝子において、非同種スイッチ領域は、定常領域コードセグメントとは異なる種由来のスイッチ領域であり、該スイッチ領域および膜エキソンは、ヒトγ−２定常領域を含み得、そして分泌定常領域エキソンは、ヒトγ−１またはヒトγ−４定常領域由来である。
【選択図】なし

Description

（発明の背景）
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の発見［Ｇ．ＫｏｈｌｅｒおよびＣ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７（１９７５）］の四半世紀後、それらの治療有用性は、最終的に現実化されつつある。モノクローナル抗体は、いまや、移植、癌、感染性疾患、心血管疾患および炎症における治療薬として認可されている。多くのモノクローナル抗体は、広い範囲の疾患徴候を処置するための後期段階の臨床試験中にある。結果として、ｍＡｂは、現在開発中の薬物の最も大きなクラスのうちの１つを代表する。
ｍＡｂの有用性は、それらの複合体標的の特異的認識、続いてその標的への高親和性結合から生じる。異なるＣHアイソタイプは異なるエフェクター機能を有するので、ｍＡｂアイソタイプを所望のエフェクター機能に合わせることが望ましい。例えば、エフェクター機能を有する定常領域を有するｍＡｂ（例えば、ヒトＩｇＧ1）が、標的細胞に対して補体依存性細胞傷害性または抗体依存性細胞傷害性を指向させるために使用され得る。あるいは、エフェクター機能を本質的に欠損する定常領域を有するｍＡｂ（例えば、ヒトＩｇＧ2またはＩｇＧ4）が、リガンドに結合し、そしてこのリガンドを中和することによるか、またはレセプター結合部位をブロックすることによるかのいずれかにより、シグナル伝達をブロックするために使用され得る。
モノクローナル抗体についての多くの治療適用は、慢性疾患（例えば、自己免疫もしくは癌）については特に、繰り返し投与を必要とする。マウスは免疫化のために好都合であり、そしてほとんどのヒト抗原を異物として認識するので、治療能を有するヒト標的に対するｍＡｂは、代表的には、マウス起源であった。しかし、マウスｍＡｂは、ヒト治療薬として固有の欠点を有する。それらは、ｍＡｂの治療レベルを維持するためにより頻繁な投薬を必要とする。なぜなら、これは、ヒトにおいてヒト抗体よりも短い循環半減期であるからである。より批判的には、マウス免疫グロブリンの繰り返し投与により、ヒト免疫系がマウスタンパク質を異物として認識し、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答を生じる可能性が生まれる。よくても、ＨＡＭＡ応答は、繰り返し投与の際にマウス抗体の迅速なクリアランスを生じ、治療薬を無用のものとする。ＨＡＭＡ応答は、重篤なアレルギー性反応を引き起こし得るとも、より考えられる。効力および安全性を減じるこの可能性により、マウスｍＡｂの免疫原性を減少させるための多数の技術の開発に至った。
マウスで生成された抗体の免疫原性を減少させるために、ヒト化として今や公知であるプロセスにおいてマウスタンパク質配列をヒトタンパク質と置換する種々の試みがなされた。第一のヒト化試みは、組換え抗体を構築するために分子生物学技術を利用した。例えば、ハプテンに特異的なマウス抗体由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）が、ヒト抗体フレームワークに移植されて、ＣＤＲ置換物を生じた。新規な抗体は、ＣＤＲ配列により運搬される結合特異性を保持した。［Ｐ．Ｔ．Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５（１９８６）を参照のこと］。ヒト化の次のレベルは、ヒト定常領域（例えば、γ１）とマウスＶＨ領域全体（ＨｕＶｎｐ）とを組み合わせることを包含した。［Ｓ．Ｌ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８１，ｐｐ．６８５１−６８５５（１９８４）を参照のこと］。このようなキメラ抗体は、３０％より多くの異種配列をなお含むが、これは、時には、全体的に異種の抗体と比べて、わずかに免疫原性が低いだけである。［Ｍ．Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７０，ｐｐ．２１５３−２１５７（１９８９）］。
続いて、ヒト免疫グロブリン遺伝子をマウスに導入し、これによりヒト配列を有する抗体を用いて抗原に対して応答し得るトランスジェニックマウスを作出する試みが行われた。［Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：６７０９−６７１３（１９８９）を参照のこと］。これらの試みは、利用可能なクローニングビヒクルによって安定に維持され得るＤＮＡの量によって制限されると考えられた。結果として、多くの研究者らは、限定数のＶ領域遺伝子を含むミニ遺伝子座を生成すること、および天然または生殖細胞の配置に対して比較されるように遺伝子間で空間的間隔を変化させることに集中した。［米国特許第５，５６９，８２５号（Ｌｏｎｂｅｒｇら）（１９９６）を参照のこと］。これらの研究は、マウスにおいてヒト配列抗体を生成することが可能であるが、しかし抗体治療薬についての要求の増大を満たすために、これらのトランスジェニック動物から結合特異性およびエフェクター機能（アイソタイプ）の十分な多様性を得ることに関して重大な障害が残ることを示した。
さらなる多様性を提供するために、ヒトＩｇ遺伝子座の大きな生殖細胞フラグメントをトランスジェニック哺乳動物に付加する研究が、実施されている。例えば、ヒトゲノムの再配置されていない生殖細胞ならびにヒトＣμおよびＣδ定常領域において見出される同じ間隔で配置されるヒトＶ、Ｄ、およびＪ領域遺伝子の大部分が、酵母人工染色体（ＹＡＣ）クローニングベクターを用いてマウスに導入された。［ＰＣＴ特許出願ＷＯ９４／０２６０２（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉら）を参照のこと］。ヒトγ−２定常領域をコードする配列およびクラススイッチ組換えに必要な上流配列を含む２２ｋｂのＤＮＡフラグメントが、前述の導入遺伝子に対して後の方に付加された。さらに、ヒトゲノムの再配置されていない生殖細胞で見出される続けて同じ間隔でまた配置されるＶκ、Ｊκ、およびＣκ領域遺伝子を含むヒトκ遺伝子座の一部が、ＹＡＣを用いてマウスに導入された。遺伝子標的化が、マウスＩｇＨおよびκ軽鎖免疫グロブリン遺伝子座を不活性化するために使用され、そしてこのようなノックアウト株が上記トランスジェニック株と交配され、ヒトＶ、Ｄ、Ｊ、Ｃμ、Ｃδ、およびＣγ２定常領域、ならびに全てが不活性化マウス免疫グロブリンバックグラウンド上にあるヒトＶκ、Ｊκ、およびＣκ領域遺伝子を有するマウスの系統を生成した。［ＰＣＴ特許出願ＷＯ９４／０２６０２（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉら）を参照のこと；Ｍｅｎｄｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６−１５６（１９９７）もまた参照のこと］。
内因性遺伝子座の遺伝子標的化およびトランスジェニック株の交配と組み合わせたクローニングベクターとしての酵母人工染色体は、抗体多様性の問題に対する１つの解決を提供した。いくつかの利点が、このアプローチによって得られた。１つの利点は、ＹＡＣが数百キロ塩基のＤＮＡを宿主細胞に移入するために使用され得ることであった。従って、ＹＡＣクローニングビヒクルの使用は、ヒトＩｇ重鎖領域および軽鎖領域全体の実質的な部分をトランスジェニック動物に含ませ、これにより、ヒトにおいて利用可能な潜在的多様性のレベルを達成することを可能にする。このアプローチの別の利点は、多数のＶ遺伝子が、マウス免疫グロブリン産生が不足したマウスにおいて全Ｂ細胞発達を回復することを示したことである。このことは、これらの再構成マウスが、任意の所定の免疫原に対するげっ歯類ヒト抗体応答を惹起させるために必須の細胞を提供されることを確実にする。［ＰＣＴ特許出願ＷＯ９４／０２６０２（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉら）；Ｌ．ＧｒｅｅｎおよびＡ．Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３−４９５（１９９８）を参照のこと］。さらなる利点は、配列が、酵母において高頻度の相同組換えを利用することにより欠失され得るか、またはＹＡＣに挿入され得ることである。これは、ＹＡＣ導入遺伝子の容易な操作を提供する。
上述のように、ヒト抗体を生成する哺乳動物の生成のために存在するいくつかのストラテジーがある。特に、「ミニ遺伝子座」アプローチ（ＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．およびＭｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌの研究によって代表される）、Ｉｇ遺伝子座の大きくかつ実質的に生殖細胞のフラグメントのＹＡＣ導入（Ａｂｇｅｎｉｘ， Ｉｎｃ．（旧Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｓｙｓ）の研究によって代表される）、ならびに微細胞（ｍｉｃｒｏｃｅｌｌ）融合の使用を介する全体または実質的に全体の遺伝子座の導入（キリンビール株式会社の研究によって代表されるような）がある。
最少座（ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ）アプローチにおいて、内因性Ｉｇ座が、そのＩｇ座由来の断片（個々の遺伝子）の封入（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）を介して模倣される。従って、１つ以上のＶH遺伝子、１つ以上のＤH、１つ以上のＪH遺伝子、ｍｕ定常領域、および第２の定常領域（好ましくはγ定常領域）が、動物への挿入のための構築物に形成される。このアプローチは、以下において記載され、以下の研究に関連される：米国特許第５，５４５，８０７号（Ｓｕｒａｎｉら）、ならびに米国特許第５，５４５，８０６５号、同第５，６２５，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，６６１，０１６号、同第５，７７０，４２９号、同第５，７８９，６５０号、および同第５，８１４，３１８号（ＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙの各々）、米国特許第５，５９１，６６９号（ＫｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔおよびＢｅｒｎｓ）、米国特許第５，６１２，２０５号、同第５，７２１，３６７号、同第５，７８９，２１５号（Ｂｅｒｎｓら）、ならびに米国特許第５，６４３，７６３号（ＣｈｏｉおよびＤｕｎｎ）、ならびにＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ米国特許出願番号０７／５７４，７４８（１９９０年、８月２９日出願）、同０７／５７５，９６２（１９９０年８月３１日出願）、同０７／８１０，２７９（１９９１年１２月１７日出願）、同０７／８５３，４０８（１９９２年３月１８日出願）、同０７／９０４，０６８（１９９２年６月２３日出願）、同０７／９９０，８６０（１９９２年１２月１６日出願）、同０８／０５３，１３１（１９９３年４月２６日出願）、０８／０９６，７６２（１９９３年７月２２日出願）、０８／１５５，３０１（１９９３年１１月１８日出願）、０８／１６１，７３９（１９９３年１２月３日出願）、０８／１６５，６９９（１９９３年１２月１０日出願）、０８／２０９，７４１（１９９４年３月９日出願）（これらの開示が本明細書中により参考として援用される）。また、欧州特許第０ ５４６ ０７３ Ｂ１、国際特許出願番号ＷＯ ９２／０３９１８、同ＷＯ ９２／２２６４５、同ＷＯ ９２／２２６４７、同ＷＯ ９２／２２６７０、同ＷＯ ９３／１２２２７、同ＷＯ ９４／００５６９、同ＷＯ ９４／２５５８５、ＷＯ ９６／１４４３６、同ＷＯ ９７／１３８５２、および同ＷＯ ９８／２４８８４を参照のこと（これらの開示は、その全体が本明細書により参考として援用される）。さらに、Ｔａｙｌｏｒら、「Ａ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｏｕｓｅ ｔｈａｔ ｅｘｐｒｅｓｓｅｓ ａ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｈｅａｖｙ ａｎｄ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０：６２８７−６２９５（１９９２）、Ｃｈｅｎら、「Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｇｅｎｅ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ ｉｎ Ｂ−ｃｅｌｌ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＪH ｌｏｃｕｓ」Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５：６４７−６５６（１９９３）、Ｔｕａｉｌｌｏｎら、「Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｄｉｒｅｃｔ ａｎｄ ｉｎｖｅｒｔｅｄ ＤＪH ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ａ ｈｕｍａｎ Ｉｇ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ」Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：６４５３−６４６５（１９９５）、Ｃｈｏｉら、「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａ ｈｕｍａｎ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｇｅｎｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎ ａ ｙｅａｓｔ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ」Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４：１１７−１２３（１９９３）、Ｌｏｎｂｅｒｇら、「Ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｍｉｃｅ ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｆｏｕｒ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ」Ｎａｔｕｒｅ ３６８： ８５６−８５９（１９９４）、Ｔａｙｌｏｒら、「Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ ｕｎｄｅｒｇｏ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ，ｓｏｍａｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌａｓｓ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ ｉｎ ｍｉｃｅ ｔｈａｔ ｌａｃｋ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ＩｇＭ」Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６： ５７９−５９１（１９９４）、Ｔｕａｉｌｌｏｎら、「Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｄｉｒｅｃｔ ａｎｄ ｉｎｖｅｒｔｅｄ ＤＪF ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ａ ｈｕｍａｎ Ｉｇ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ」Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：６４５３−６４６５（１９９５）、およびＦｉｓｈｗｉｌｄら、「Ｈｉｇｈ−ａｖｉｄｉｔｙ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ａ ｎｏｖｅｌ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ」Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：８４５−８５１（１９９６）を参照のこと（これらの開示は、それらの全体が本明細書により参考として援用される）。
ＹＡＣ導入と関連して、Ｇｒｅｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３−２１（１９９４）は、ヒト重鎖遺伝子座およびκ軽鎖遺伝子座の、それぞれの２４５ｋｂおよび１９０ｋｂのサイズの生殖系列構造（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）フラグメントを含むＹＡＣの生成（これはコア可変領域配列およびコア定常領域配列を含んでいた）を記載する（同上）。Ｇｒｅｅｎらの研究は、メガべースの大きさの、ヒト重鎖遺伝子座およびκ軽鎖遺伝子座のそれぞれの生殖系列構造ＹＡＣフラグメントの導入を介して、およそ８０％を越えるヒト抗体レパートリーの導入に及び、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅTMマウスを産生した。Ｍｅｎｄｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６−１５６（１９９７）ら、ＧｒｅｅｎおよびＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３−４９５（１９９８）、および米国特許出願番号０８／７５９，６２０（１９９６年１２月３日出願）を参照のこと（この開示が参考として本明細書に参考として援用される）。このようなアプローチは、さらに以下で議論され、そして描写される（ｄｅｌｉｎｅａｔｅｄ）：米国特許出願番号０７／４６６，００８（１９９０年１月１２日出願）、同０７／６１０，５１５（１９９０年１１月８日出願）、同０７／９１９，２９７（１９９２年７月２４日出願）、同０７／９２２，６４９（１９９２年７月３０日出願）、同０８／０３１，８０１（１９９３年３月１５日出願）、同０８／１１２，８４８（１９９３年８月２７日出願）、同０８／２３４，１４５（１９９４年４月２８日出願）、同０８／３７６，２７９（１９９５年１月２０日出願）、同０８／４３０，９３８（１９９５年４月２７日出願）、同０８／４６４，５８４（１９９５年６月５日出願）、同０８／４６４，５８２（１９９５年６月５日出願）、同０８／４６３，１９１（１９９５年６月５日出願）、同０８／４６２，８３７（１９９５年６月５日出願）、０８／４８６，８５３（１９９５年６月５日出願）、同０８／４８６，８５７（１９９５年６月５日出願）、同０８／４８６，８５９（１９９５年６月５日出願）、同０８／４６２，５１３（１９９５年６月５日出願）、同０８／７２４，７５２（１９９６年１０月２日出願）、および同０８／７５９，６２０（１９９６年１２月３日出願）。また、Ｍｅｎｄｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６−１５６（１９９７）ならびにＧｒｅｅｎおよびＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３−４９５（１９９８）を参照のこと。また、欧州特許第ＥＰ ０ ４６３ １５１ Ｂ１（１９９６年６月１２日特許公報公開）、国際特許出願番号ＷＯ ９４／０２６０２（１９９４年２月３日公開）、国際特許出願番号ＷＯ ９６／３４０９６（１９９６年１０月３１日公開）、およびＷＯ ９８／２４８９３（１９９８年６月１１日公開）も参照のこと。上記引用される特許、出願、および参考文献の各々の開示は、それらの全体が本明細書に参考として援用される。
微小核体融合アプローチと関連して、ヒト染色体の一部または全体が、欧州特許出願番号ＥＰ ０ ８４３ ９６１ Ａ１（この開示が本明細書に参考として援用される）に記載されるように、マウスに導入され得る。このアプローチを使用して、かつヒトＩｇ重鎖遺伝子座を含むマウスは、一般に、１つより多く、かつ潜在的に全てのヒト定常領域遺伝子を保有する。従って、このようなマウスは、多数の異なる定常領域を有する特定の抗原に結合する抗体を産生する。従って、特定のエフェクター機能について所望の定常領域を予め選択する方法は存在しない。
また、トランス染色体（ｔｒａｎｓｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）は、有糸分裂および無糸分裂で不安定である。結果として、ヒトＩｇＨ、ヒトＩｇΚまたは両方のトランス染色体のいずれかは、８０％に近い頻度で失われる。これは、マウスＩｇλ ｍＡｂおよびハイブリドーマ不安定性の異常に高い回復を生じる。
抗体の、インビトロでのアイソタイプスイッチについての技術が存在する。ＩｇＧ１アイソタイプのみを産生するトランスジェニックマウスから産生される抗体、複数のＩｇＧアイソタイプを産生するトランスジェニックマウスから産生される抗体、またはファージディスプレイ技術から産生される抗体が、所望の抗原特異性および親和性を有し得るが、所望のエフェクター機能を有し得ない。この場合において、少なくとも、重鎖の可変領域、および最もあり得るのが抗体の軽鎖全体が、クローン化されなければならない。
クローニングのための方法は、ライブラリーからのゲノムＤＮＡの回復、ライブラリーからのｃＤＮＡの回復、特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用したゲノムＤＮＡの回復、ならびに特異的なオリゴヌクレオチドプライマーおよび鋳型としてｃＤＮＡ（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用するＰＣＲを含む。各方法（特に、ＰＣＲに基づく方法）は、クローンが、抗体コード配列の信頼できる複製を確認するために配列決定されることを要する。次いで、重鎖の可変領域は、ＤＮＡ連結を介して、所望の定常領域遺伝子に作動可能に連結されなければならない。
次いで、操作されたＶＨ−ＣＨ遺伝子は、発現制御領域（例えば、プロモーターエンハンサーおよびポリアデニル化部位）に作動可能に連結されなければならない。このような発現構築物はまた、抗体のＩｇ軽鎖のために必要とされ得る。
発現構築物は、操作されたｍＡｂの分泌形態を産生するために、転写および翻訳のために適切な宿主細胞中に安定にトランスフェクトされなければならない。
代表的に、少なくとも、広範なスクリーニングが、さらなる実験および後の製造のために、十分なレベルのｍＡｂを発現する細胞株のクローンを見出すために、実施されなければならない。おそらく、ＤＮＡ増幅のような方法論は、上昇された、抗体発現構築物のコピー数、およびその結果の、ｍＡｂの発現レベルに対して使用されなければならない。
最終的に、再操作されたｍＡｂは、それが、所望の質を保持し、そして所望の機能（特異性、親和性、およびエフェクター機能の存在または非存在を含む）を有することを確認するために試験されなければならない。アイソタイプの切り換えのための他の技術が存在するが、ｍＡｂアイソタイプを再操作するためのこのような全てのプログラムは、分子生物学および組織培養における実験法および専門知識を必要とし、そして労働集約型で、遅く、高価であり、そして発行され、係属する知的所有権により包含され、たとえライセンスが利用可能でも、追加の費用を必要とする。従って、あるアイソタイプから別のアイソタイプへのｍＡｂの再操作は、専門知識、過度の金銭の出費を必要とし、そして前臨床および臨床試験のためのモノクローナル抗体の開発を遅らせる。
所望のＣγアイソタイプを有するｍＡｂを産生する技術を有することは、抗体を再操作するための必要性を経験的に取り除く。３つの異なるＸｅｎｏＭｏｕｓｅ系統（各々は、Ｃγ２、Ｃγ４、またはＣγ１のみを作製し得る）を有することによって、トランスジェニックマウスは、棚（ｓｈｅｌｆ）から引き抜かれ得、次いで、所望の親和性、抗原特異性および所望のアイソタイプを有するｍＡｂならびに所望のエフェクター機能を先験的に有するｍＡｂを産生するために免疫化され得る。これは、モノクローナル抗体ベースの治療の開発のための効率およびユーザー親睦を増加させる。分子生物学または抗体操作における専門知識は必要とされない。抗原特異的ｍＡｂは、莫大なお金と時間の出費を伴わずに、予備臨床研究に直接必要とされ得、これは、開発コストを減少させ、そして治療ｍＡｂの開発のためのタイムライン（ｔｉｍｅ ｌｉｎｅ）を加速させる。
本発明は、所望の特異性に加えて、抗体を使用する治療目的に適合するトランスジェニックマウスから、予め選択されたヒト抗体アイソタイプを入手する問題を解決することに関する。
（発明の要旨）
本発明は、本発明の１つの局面において、任意の実質的に所望される抗原を用いる免疫化に応じて所望のアイソタイプの高い親和性の完全なヒト抗体を産生し得るトランスジェニック非ヒト動物を提供することによって、上記に言及される問題を解決する。上述のトランスジェニック非ヒト動物は、それらの体細胞および生殖細胞系列において、再配列の際に、所望のアイソタイプの完全なヒト免疫グロブリン重鎖をコードする再配列されていないヒト免疫グロブリン重鎖導入遺伝子を有する。
上述の動物におけるヒト免疫グロブリン重鎖導入遺伝子は、所望の重鎖アイソタイプをコードするエキソンを含むヒト定常領域遺伝子セグメントを含み、異なる重鎖アイソタイプ（すなわち、非同種スイッチ領域）の定常領域に由来するスイッチセグメントに作動可能に連結される。
上述のトランスジェニック非ヒト動物はまた、その体細胞および生殖細胞系列において、ヒト免疫グロブリン軽鎖導入遺伝子を有する。好ましい実施形態において、トランスジェニック非ヒト動物の内因性免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子座は、非活性化され、その結果、その動物は、内因性の重鎖または軽鎖を産生し得ない。特に好ましい実施形態において、非ヒトトランスジェニック動物はマウスである。
別の局面において、本発明は、再配列の際に、所望のアイソタイプのヒト重鎖をコードする、再配列されていないヒト免疫グロブリン重鎖導入遺伝子を提供する。本発明の導入遺伝子は、少なくとも、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座の第１のＤセグメント遺伝子から始まり、Ｊセグメント遺伝子およびその遺伝子座のＣμを通って定常領域遺伝子までずっと続くヒト第１４染色体のＤＮＡ配列と同一であるＤＮＡ配列を含む。本発明の導入遺伝子において、上述のＤＮＡフラグメントは、さらなる定常領域セグメントに作動可能に連結されて、そしてさらなる定常領域セグメントへのアイソタイプスイッチを可能にする。このさらなる定常領域セグメントは、スイッチ領域コードセグメントおよびヒト定常領域コードセグメントを含み、ここで、この定常領域コードセグメントは、それが正常に結合されないスイッチ領域（すなわち、非同種スイッチ領域）に作動可能に連結される。本発明の導入遺伝子において、上述のＤＮＡフラグメントおよび定常領域セグメントは、少なくとも１つのヒトＶセグメント遺伝子と作動可能に連結される。本発明の１つの実施形態において、導入遺伝子は、酵母人工染色体（ＹＡＣ）である。
本発明の導入遺伝子において、非同種スイッチ領域は、その定常領域コードセグメントとは異なる種に由来するスイッチ領域であり得る。１つの実施形態において、非同種スイッチ領域は、ヒトγ、αまたはε定常領域をコードするヒト定常領域コードセグメントに作動可能に連結されたマウススイッチ領域である。好ましい実施形態において、このスイッチ領域は、マウスγ−１スイッチ領域である。より好ましい実施形態において、このスイッチ領域は、マウスγ−１スイッチ領域であり、そしてヒト定常領域コードセグメントは、γ−１またはγ−４定常領域をコードする。特に好ましい実施形態において、この導入遺伝子は、ｙＨ２Ｂｍ酵母人工染色体（ＹＡＣ）またはｙＨ２ＣｍＹＡＣである。
別の実施形態において、その非同種スイッチ領域および定常領域コードセグメントの両方は、ヒト配列であり、非同種スイッチ領域は、定常領域コードセグメントとは異なるアイソタイプのヒト定常領域に由来する。好ましい実施形態において、スイッチ領域は、ヒトγ−２スイッチ領域および定常領域コードセグメントは、γ−２以外のアイソタイプである。より好ましい実施形態において、本発明の導入遺伝子は、ヒトγ−２スイッチ領域およびヒトγ−１またはヒトγ−４定常領域コードセグメントを含む。特に好ましい実施形態において、その導入遺伝子は、ｙＨＧ１ ＹＡＣまたはｙＨＧ４ ＹＡＣである。
さらなる別の実施形態において、本発明の導入遺伝子は、ヒト非同種スイッチ領域およびヒト定常領域コードセグメントを含み、ここで、そのスイッチ領域および定常領域コードセグメントの膜エキソンは、同じヒト定常領域アイソタイプに由来し、そして分泌された定常領域エキソンは、異なるアイソタイプに由来する。本発明の導入遺伝子はまた、ヒト非同種スイッチ領域およびヒト定常領域コードセグメントを含み得、ここでそのスイッチ領域は、１つのアイソタイプに由来し、分泌された定常領域エキソンは、第２のアイソタイプに由来し、そして膜定常領域エキソンは、さらに第３のアイソタイプに由来する。
好ましい実施形態において、このスイッチ領域および膜エキソンは、ヒトγ−２定常領域に由来する。特に好ましい実施形態において、スイッチ領域および膜エキソンは、ヒトγ−２定常領域に由来し、そして分泌された定常領域エキソンは、ヒトγ−１またはヒトγー４定常領域に由来する。好ましい実施形態において、この導入遺伝子は、ｙＨＧ１／２ＹＡＣまたはｙＨＧ４／２ＹＡＣである。
別の実施形態において、本発明の任意の前述の導入遺伝子は、複数の異なるヒトＶＨ遺伝子を含む。好ましい実施形態において、導入遺伝子は、少なくとも５０％のヒト生殖系列ＶＨ遺伝子を含む。別の実施形態において、この導入遺伝子は、少なくとも４０の異なるヒトＶＨ遺伝子を含む。好ましくは、この導入遺伝子は、少なくとも６６の異なるヒトＶＨ遺伝子を含む。最も好ましくは、この導入遺伝子は、ヒト重鎖遺伝子座のヒトＶＨ領域全体を含む。別の実施形態において、導入遺伝子は、十分な数の異なるヒトＶＨ遺伝子を含み、その結果、その導入遺伝子は、接合部の多様性または体細胞変異事象を考慮せずに、少なくとも１×１０5の異なる機能的ヒト免疫グロブリン重鎖配列の組み合わせをコードし得る。さらなる別の実施形態において、その導入遺伝子におけるヒトＶＨ遺伝子の数は、この導入遺伝子を含むトランスジェニックマウスにおける野生型マウスのＢ細胞集団の少なくとも５０％を産生するのに十分である。
本発明の導入遺伝子は、マウス３’エンハンサー（非同種スイッチ領域を含む定常領域の３’に位置する）をさらに含む。１つの実施形態において、このマウス３’エンハンサーは、およそ０．９ｋｂコア領域のネイティブエンハンサーである。代替的実施形態において、その３’エンハンサーは、そのコア領域を含むおよそ４ｋｂ領域のマウスエンハンサーである。さらなる別の実施形態において、その導入遺伝子は、マウス主要エンハンサー遺伝子座を含む。
別の局面において、本発明は、本発明のトランスジェニック非ヒト動物を作製するための方法を提供する。その方法に従って、再配列されていないヒト免疫グロブリン重鎖導入遺伝子は、その体細胞および生殖細胞系列に導入遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト動物を作製するために、非ヒト動物の生殖系列に導入される。ヒト重鎖トランスジェニック動物をヒト免疫グロブリン軽鎖導入遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト動物と交配することは、本発明のヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト動物を産生する。上述のトランスジェニック非ヒト動物のいずれかが、完全なヒト抗体を産生し、そして内因性抗体を産生し得ないトランスジェニック非ヒト動物を作製するために、不活性化された重鎖遺伝子座および／または軽鎖遺伝子座を有する動物と交配され得る。
１つの実施形態において、本発明の導入遺伝子が、胚性幹（ＥＳ）細胞内に導入され、次いで胚盤胞に挿入される。次いで、本発明の導入遺伝子を含むＥＳ細胞を有する胚盤胞が、キメラ非ヒト動物を作製するために非ヒト動物の子宮内に外科的に挿入される。キメラ動物を交配させて、本発明の導入遺伝子の生殖系列伝達を達成させ、本発明の導入遺伝子を含む体細胞および生殖細胞系列を有するトランスジェニック、非ヒト動物を作製する。従って、本発明のさらなる局面は、本発明の導入遺伝子を含むＥＳ細胞およびその細胞のいくつかまたは全てにおいて導入遺伝子を有する非ヒト動物である。
さらなる別の局面において、本発明は、本発明のトランスジェニック非ヒト動物における目的の抗原に特異的な高い親和性の完全なヒト抗体の所望のアイソタイプを産生するための方法を提供する。本発明に従って、本発明のトランスジェニック非ヒト動物を、その動物のＢ細胞による抗体の産生を誘導する条件下において、目的の抗原と接触させる。所望のアイソタイプの高い親和性の完全なヒト抗原特異的抗体は、トランスジェニック非ヒト動物の血流から収集され得る。
あるいは、本発明の方法に従って、抗体産生Ｂ細胞が、動物から収集され得、そして抗体の連続的産生のために当該分野で公知の任意の手段によって不死化され得る。１つの実施形態において、Ｂ細胞をマウス骨髄腫細胞株と融合して、抗体分泌ハイブリドーマを作製する。そのようなハイブリドーマをスクリーニングし、高い親和性の完全なヒト抗原特異的抗体を分泌するハイブリドーマを選択し得る。
さらなる局面において、本発明は、本発明のトランスジェニック動物から収集された抗体産生Ｂ細胞に由来するハイブリドーマを提供する。
本発明の抗体はまた、所望の抗体を発現するＢ細胞の発現によるもの、クローン化されたヒト免疫グロブリン遺伝子によるもの、ファージディスプレイによるもの、または当該分野において公知の任意の他の方法によるものであり得る。
図１は、ｙＨ１ＣおよびｙＨ２Ｂｍ（またはｙＨ２Ｃｍ）酵母人工染色体（ＹＡＣ）の概略図である。 図２は、ｙＨ１ＣおよびｙＨＧ１酵母人工染色体（ＹＡＣ）の概略図である。 図３は、ｙＨ１ＣおよびｙＨＧ１／２酵母人工染色体（ＹＡＣ）の概略図である。 図４は、ｙＨ１ＣおよびｙＨＧ４／２酵母人工染色体（ＹＡＣ）の概略図である。 図５は、ｙＨ１Ｃ ＹＡＣをｙＨＧ１ ＹＡＣおよびｙＨＧ４ ＹＡＣに更新（ｒｅｔｒｏｆｉｔｔｉｎｇ）するための標的化ベクター（ＴＶ１およびＴＶ４）の概略図である。 図６は、ｙＨ１Ｃ ＹＡＣをｙＨＧ１／２ＹＡＣおよびｙＨＧ４／２ＹＡＣに更新するための標的化ベクターの構築物を例示する。 図７は、ｙＨ１Ｃ ＹＡＣをｙＨＧ１／２ＹＡＣおよびｙＨＧ４／２ＹＡＣに更新するための標的化ベクター（ＴＶ Ｇ１／２およびＴＶ Ｇ４／２）の概略図である。 図８は、ｙＨ３Ｂ ＹＡＣ（クローン Ｚ ７０．１７．１）と融合されたＥＳクローンのサザンブロット分析を示す。
（発明の詳細な説明）
本発明は、所望のアイソタイプのヒト免疫グロブリン重鎖の産生のための新規な導入遺伝子、および胚性幹（ＥＳ）細胞ならびに導入遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト動物に関する。本発明はまた、そのようなトランスジェニック非ヒト動物を作製するための方法および本発明のトランスジェニック動物において目的の抗原に応じて所望のアイソタイプの完全ヒト抗原を産生するための方法に関する。
本発明の導入遺伝子およびトランスジェニック非ヒト動物は、種々のアイソタイプまたはクラスの完全ヒト抗体の産生の際に有用である。そのような抗体の治療的使用のために、個々の抗体アイソタイプの異なるエフェクター機能は、特定のアイソタイプの使用が所望の治療効果を達成することを可能にする。従って、目的の抗原で免疫化した後に、単一アイソタイプの抗体を産生するトランスジェニック非ヒト動物の系統を作製することが所望される。
本明細書中に記載される本発明がより完全に理解され得るために、以下の詳細な説明が示される。その説明において、以下の用語が使用される：
（遺伝子領域）−特定のポリペプチド鎖を産生するか、または選択する際に関与するＤＮＡ；プロモーター、エンハンサー、定常遺伝子の前にある任意のスイッチ領域ならびに前述のコード領域および後述のコード領域の上流および下流、および介在配列（例えば、コードセグメントまたはエキソン間のイントロン）を含む。
（遺伝子セグメント）−多エキソン遺伝子（例えば、免疫グロブリン重鎖定常領域）におけるコードセグメント。例えば、ヒト免疫グロブリン重鎖γ定常領域の分泌化形態についての遺伝子は、４遺伝子セグメント：ＣＨ１、Ｈ、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。
（生殖系列構造）−任意の体細胞遺伝子再配置が生じる前の、免疫グロブリン遺伝子セグメントの配列および間隔。
（クレノウフラグメント）−酵素ポリメラーゼＩの大きなフラグメント（通常、Ｅ．ｃｏｌｉに由来する）。このフラグメントは、いずれの５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性も含まず、そしてポリメラーゼ活性のみを有する。それは、平滑末端を生成するために、ＤＮＡ分子の末端充填のために使用され得る。
（ライブラリー）−ＤＮＡベースのベクター（例えば、細菌におけるプラスミド、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるλバクテリオファージ、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＰ１バクテリオファージ、Ｅ．ｃｏｌｉにおける細菌人工染色体、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける酵母人工染色体、培養細胞における哺乳動物人工染色体、体細胞ハイブリッドにおける哺乳動物染色体フラグメント）上で通常に増殖されるクローン化されたＤＮＡフラグメントの混合物。
（リンカー）−制限部位およびより大きなＤＮＡ分子に付加され得る他の特性（例えば、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡフラグメントのクローニングを促進させることおよび／または所望のポリペプチドをコードするＤＮＡフラグメントの部分の戻し組込み（ｂｕｉｌｄ ｂａｃｋ）をすること）を含むように設計される合成ＤＮＡフラグメント。
（ライブラリーのスクリーニング）−ライブラリーにおいて、クローン化されたＤＮＡの特定の配列について検索するプロセス。
（無菌（ｓｔｅｒｉｌｅ）の転写物）−必要とされる体細胞遺伝子セグメント再配置またはクラススイッチ組換えに翻訳されないと考えられるＩｇ遺伝子座から産生される転写物。ＩｇＭを産生するＢ細胞またはプレＢ細胞において、例えば、細胞がどのアイソタイプにスイッチ、そして産生するかを潜在的に示唆するＣＨ遺伝子に対応する生殖系列ｍＲＮＡ転写物が存在し得る。
（ベクター）−外来ＤＮＡを宿主に輸送するために使用されるＤＮＡ分子およびその宿主内で複製されるＤＮＡ分子、その宿主を形質転換するために使用されるＤＮＡ分子。入手可能なベクターとしては、ウイルス（原核生物および真核生物）、細菌プラスミドまたは人工染色体が挙げられるが、これらに限定されない。
（酵母人工染色体（ＹＡＣＳ））−酵母染色体のエレメントから構成されるクローニングビヒクルであり、これは、ベクターがインビボで酵母細胞において複製されて、そして維持されることを可能にする。酵母エレメントとしては、動原体、自律増殖（ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）配列、一対の末端小粒、酵母選択マーカー、および通常の細菌複製起点ならびに細菌におけるＹＡＣベクターアームの複製および選択のための選択マーカーが挙げられる。少なくとも２０００ｋｂまでのＤＮＡインサートが、ＹＡＣを使用して、クローン化され、そして維持され得る。
（ＸＥＮＯＭＯＵＳＥの発生）
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅは、マウスＩｇＨ遺伝子座およびＩｇκ遺伝子座を不活性化しており、そして機能的メガベースサイズのヒトＩｇＨおよびＩｇκ導入遺伝子について遺伝子組換えされたマウスである。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅの作製および特徴付けが記載されている［Ｍｅｎｄｅｚら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２６：２９４−３０７（１９９５）；Ｍｅｎｄｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１５、１４６−１５６頁（１９９７）；Ｇｒｅｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３−２１（１９９４）；国際特許出願ＷＯ９４／０２６０２、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉら、１９９４年２月３日公開を参照のこと］。より詳細には、マウス胚性幹細胞における相同組換え、次に、変異の生殖系列伝達そして引続く両方の不活性化された遺伝子座についてホモ接合性であるマウス（ＤＩマウス）を作製するための交配によって、マウスＩｇＨおよびＩｇκ遺伝子座の重要なエレメントの欠失が存在している。そのようなマウスは、マウスＩｇＨ鎖およびＩｇκ鎖を作製し得ず、そして骨髄におけるＢ細胞発生をｐｒｏＢ／ｐｒｅＢ−Ｉ段階にて停止させることを示す。[Ｇｒｅｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、７、１３−２１頁（１９９４）；ＧｒｅｅｎおよびＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８８：４８３（１９８８）]。ヒトＩｇＨおよびＩｇκ遺伝子座（酵母人工染色体上にクローン化されている）を、酵母スフェロプラスト−ＥＳ細胞融合を介してＥＳ細胞内に導入した[Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５−２５８（１９９３）]。生殖系列伝達そして引続くＤＩバックグランドへの交配後、ヒトＩｇＨおよびＩｇκ ＹＡＣ導入遺伝子（ｙＨ１ＣおよびｙＫ２）は、それらのマウス対応物の代わりに機能的に用いられ得、そしてＢ細胞発生を支持し得た。さらに、これらのマウスは、完全なヒトＩｇＭκ抗体およびＩｇＧ２κ抗体を産生し、そして最終的には、治療的可能性を有する抗原特異的な、高い親和性である、完全ヒトＩｇＧ２κモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを生成した。
（ｙＨ１Ｃ導入遺伝子）
ヒトＩｇＨ導入遺伝子、ｙＨ１Ｃは、６６ＶＨ、全てのＤエレメント、全てのＪエレメント、ＣμおよびＣδ、全ての調節エレメントから、全てが生殖細胞系列の構成で、構成される。酵母における相同組換えを使用することによって、ｙＨ１Ｃの３’末端は、ヒトγ２遺伝子（そのスイッチ調節エレメントを含む）およびマウス３’エンハンサーエレメントを含む４ｋｂのフラグメントを含む２２ｋｂのフラグメントを添付されている（Ｍｅｎｄｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｉｔｉｃｓ １５：１４６−１５６（１９９７）（この開示は、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。ＹＡＣの左側のアームは、酵母選択マーカー（ＡＤＥ２）、哺乳動物選択マーカーについての発現カセットを保有し、そしてＹＡＣの右側のアームは、薬剤（Ｇ４１８）に対する耐性をコードする、酵母選択マーカー（ＬＹＳ２）および哺乳動物選択マーカー（Ｎｅｏ）についての発現カセットを保有する。後者は、そのポリモーター（ＭＭＴ（マウスメタロチオニン））が、おそらく、ＥＳ細胞において非機能的であるので、ＥＳ細胞において非機能的である。他の細胞型において、まれではあるが、通常の生理学的条件下で、ＭＭＴプロモーターは、非常に低レベルでのみ転写を駆動し、そしてより高いレベルの転写のために重金属（例えば、Ｃｄ）を必要とする。実際、この構築物でトランスフェクトされたＥＳ細胞は、低レベルのＧ４１８にでさえ、決して、耐性とはならなかった。
（Ｂ細胞発生）
Ｂ細胞の発生は、骨髄において、Ｄ遺伝子とＪ遺伝子との間の欠失組換えとともに、開始する。その結果、Ｖ遺伝子は、スプライスされたＶＤＪＣμ転写物を産生するＶＤＪ（これは、転写された）を作製するために、ＤＪと再結合する。その転写物が、インフレームである場合、μ鎖は、翻訳の際に合成される。同様に、かつ一般に、ＶHＤＪHの組換えおよびμ鎖と代理軽鎖との成功した対形成の後、Ｉｇ軽鎖遺伝子座は、それらのＶ遺伝子セグメントおよびＪ遺伝子セグメントを再編成する。骨髄における成功したＢ細胞の発生は、細胞表面上に、ＩｇＭκまたはＩｇＭλを発現するＢ細胞を生じる。マウスにおいて、Ｂ細胞の９５％は、ＩｇＭκを発現し；ヒトにおいて、Ｂ細胞の約６０％がＩｇＭκを発現する。
Ｂ細胞を産生するこれらのＩｇＭは、初期免疫レパートリーを形成し、そして外来抗原の認識についての免疫監視機構を機能させる。マウスまたはヒトにおいて、Ｂ細胞を生成するこれらのＩｇＭは、結果的に、ＩｇＭからＩｇＧまたはＩｇＡ、あるいはＩｇＥアイソタイプへのアイソタイプクラススイッチを受け得る。クラススイッチの頻度は、免疫応答の間に増加する。マウスおよびヒトは、各々、ＩｇＧの４つの異なるアイソタイプに対する遺伝子を有する。それらは、マウスにおける、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、およびＩｇＧ３であり、そしてヒトにおけるＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４である。ヒトは、２つのＩｇＡアイソタイプ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）および１つのＩｇＥアイソタイプを有する。マウスにおいて、平均して、それぞれ、６５００、４２００および１２００μｇ／ｍｌのＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２Ｂ、ならびに２６０μｇ／ｍｌのＩｇＡが存在する。ヒトにおいて、全ＩｇＧの中で、約７０％はＩｇＧ１であり、１８％はＩｇＧ２であり、８％はＩｇＧ３であり、そして３％はＩｇＧ４である。ヒトにおける全ＩｇＡにおいて、約８０％はＩｇＡ１であり、そして２０％はＩｇＡ２である。
（抗体のエフェクター機能）
異なるアイソタイプは、異なるエフェクター機能を有する。機能におけるこのような差異は、種々の免疫グロブリンアイソタイプについての個別の３次元構造に反映される（Ｐ．Ｍ．Ａｌｚａｒｉら、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５５５−５８０（１９８８））。例えば、ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３アイソタイプは、補体媒介溶解または抗体依存性細胞性細胞障害（ＡＤＣＣ）に関連し、そしてＩｇＧ２およびＩｇＧ４は、既知のエフェクター機能をほとんど有さないか、または有さない。（ＳｎａｐｐｅｒおよびＦ．Ｄ．Ｆｉｎｋｅｌｍａｎ、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第３版、８３７−８６３頁）。異なるエフェクター機能は、異なるＩｇＧアイソタイプに関連するので、従って、最適な医療的利点を作り出すために、ｍＡｂのアイソタイプおよびその結合特異性を選択することが可能であることが所望される。例えば、ｍＡｂが、サイトカイン応答を中和するか、またはレセプターの活性をブロックすることが所望される場合、フェクター機能を欠如するｍＡｂ（例えば、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４）が、所望され得る。一方、ｍＡｂの細胞表面上の抗原への結合を介する細胞の死滅が、所望される場合、その特定のエフェクター機能（ＡＤＣＣまたはＣＭＬのいずれか）を有するｍＡｂ（例えば、ＩｇＧ１）が、所望される。従って、完全なヒトモノクローナル抗体の産生のために操作されたトランスジェニックマウスが、得られるモノクローナル抗体のアイソタイプを制御するために、所望される。この場合において、所望のヒト抗体アイソタイプのみを産生する特定のトランスジェニックマウス系統を免疫化することによって、特定の抗体アイソタイプを選択し得る。このようなマウスは、任意の得られた抗原特異的ＩｇＧ ｍＡｂが、所望のエフェクター機能を有することを確実にする。このことは、定常領域を変化させるために、抗体遺伝子の引く続く再操作を不可能にし、可変領域の単離（クローニング）およびＶＨ領域の所望のＣＨ遺伝子への連結を含む。
本発明の１つの実施形態において、ｙＨ１ＣヒトＩｇＨ ＹＡＣ上の単独のＣγ遺伝子（Ｃγ２）は、別のＣＨ遺伝子によって置き換えられる。例えば、完全なヒトＣγ２遺伝子を保有する２２ｋｂのグラグメントの代わりに、ヒトＣＨ遺伝子を保有する他の挿入物が、Ｍｅｎｄｅｚらの標的化ベクターにクローニングされ得る（Ｍｅｎｄｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６−１５６（１９９７）を参照のこと）。ヒトＣγ１〜４遺伝子は配列決定されており、そしてヒトゲノムＤＮＡのバクテリオファージλライブラリ−から単離され得、そしてその後、約２０〜２５ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメント上に回収され得る（Ｊ．Ｗ．Ｅｌｌｉｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３：４０７１−４０７９（１９８２）；Ｊ．Ｅｌｌｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９：１９８４−１９８５（１９８２）；Ｓ．Ｈｕｃｋら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１４：１７７９−１７８９（１９８６）；Ｊ．Ｅｌｌｉｓｏｎら、ＤＮＡ、１：１１−１８（１９８１）（これらの開示は、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。同様に、マウスＣγ１、Ｃγ２ａ、Ｃγ２ｂ、およびＣγ３についての配列は、すべて公知である（Ｈ．Ｈａｙａｓｈｉｄａら、ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ、３：２０４７−２０５３（１９８４）（この開示は、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
（クラススイッチ）
ＩｇＭからのＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＥへのクラススイッチ組換え（ＣＳＲ）は、Ｃδを除く全てのＩｇＨ定常領域遺伝子の５’を提供する、縦列の直接反復スイッチ領域の間で起こる欠失組換え事象を介して、媒介される。スイッチ領域は、Ｉプロモーター、Ｉエキソンおよび逆方向反復配列に隣接する一連の直接反復から構成されることが知られている。エンハンサーおよびサイトカイン応答配列は、Ｉプロモーターの付近の領域にあることが知られている。マウスＣγ１遺伝子における、下流の逆方向反復の３’のすぐ後に位置する、少なくとも１つの転写エンハンサーが、仮定されている（Ｊ．Ｐ．Ｍａｎｉｓら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：１４２１−１４３１（１９９８））。ｉＥｍ（ＪＨとＣｍとの間に位置するエンハンサー）もまた、必要とされる。転写は、Ｉプロモーターで開始し、そしてＩエキソンを介して、Ｃ遺伝子に末端まで進行する。この転写物は処理されて、ＣＨ遺伝子にスプライスされたＩエキソンを有する非コード無菌転写物を得る。スイッチ領域を介する転写は、クラススイッチ組換えを必要とする。ヒトおよびマウスＳμおよびＳγ領域は配列決定されており、これらの配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースから公的に利用可能である。
マウスにおいて、リンフォカインと活性化因子との異なる組み合わせは、ＩｇＭから個々のＣＨ遺伝子へのクラススイッチに対する大いに異なる効果を有する。例えば、インビトロにおけるＬＰＳおよびインターロイキン−４の組み合わせは、ＩｇＧ１およびＩｇＥへのクラススイッチを誘導し、そしてＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３へのスイッチを抑制する。ＣＳＲに影響する他のリンフォカインには、ＩＬ−５、ＴＧＦ−β、インターフェロン−γが挙げられるが、これらに限定されない。これらのリンフォカインは、例えば、二次リンパ組織の胚中心中の、抗原提示Ｔ細胞および抗原提示小胞樹状細胞のようなヘルパー細胞によって、インビボで分泌される。これらのリンフォカインは、ＣＳＲの前に、それらの対応するＣＨ遺伝子の転写を、おそらく対応するＩプロモーターの活性化を介して調節する。例えば、マウスＣγ１ ＩプロモーターにおけるＩＬ−４応答エレメントは、マッピングされている（Ｒｏｔｈｍａｎら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ２、６２１−６２７頁（１９９０））。ヒトスイッチ領域のリンフォカイン応答性は、未だ、マウスの応答性と同じ程度に、十分に特徴付けされいない。しかし、異なるヒトスイッチ（Ｓ）領域はまた、異なるリンフォカインおよび活性化因子に対する異なる応答を有し得る。このことは、部分的に、ヒト血清におけるＩｇＧサブクラスの異なるレベルの原因であり得る。
（非同種スイッチ）
リンフォカインおよび他の活性化因子に対するマウスおよびヒトのＳ領域それぞれの実際かつ可能な示差的な応答性の観点において、ヒト抗体産生トランスジェニックマウスにおけるＣＳＲを制御する異種スイッチ領域を有することが所望される。例えば、Ｉｇγ１は、マウスにおけるＩｇＧの最も豊富なクラスである。ＣＳＲは、ヒトＳμ領域からマウスＳγ１領域に起こり得ることもまた知られている（Ｔａｙｌｏｒら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，６，５７９−５９１頁）。分子生物学の標準的なツールおよび十分に特徴付けられたクローニングされたマウスＳγ１配列（ＭｏｗａｔｔおよびＤｕｎｎｉｃｋ、Ｊ．ｉｍｍｕｎｏ．，１３６；２６７４−２６８３頁（１９８６）、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号 Ｍ１２３８９）を使用して、ヒトＣＨコード配列（例えば、ヒトＣγ１）に機能的に連結された、マウスＳγ１を有するＤＮＡベクターを操作することが可能である。ヒトＣＨコード配列の下流には、マウス３’エンハンサーを包含する配列が含まれる。ｍ３’Ｅ配列は、４ｋｂのＸｂａｌフラグメントであり得るか、または９００ｂｐのＳｔｕ Ｉフラグメントであり得、これらの両方は、コアＤＮＡｓｅ Ｉ高感受性部位（ＨＳ１、２）を包含する（Ｄａｒｉａｖａｃｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１，１４９９−１５０４頁（１９９１）；Ｐｅｔｔｅｒｓｏｎら、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ．，１８９，２３６−２４８頁（１９９７））。ｙＨ１Ｃに相同性である５’および３’隣接領域および適切な選択マーカーを有することによって、このようなベクターは、酵母においてインビボで組換えられ、ｙＨ１Ｃ上のヒトＣγ２遺伝子を置き換え得る。この様式で操作されるＹＡＣは、ｙＨ１ＣのＶＨ、ＤH、ＪH、Ｃμ、およびＣδの全てをインタクトに保持するが、キメラＣＨ遺伝子を有する：マウスＳγ１エレメントは、ヒトＩｇＭから下流ヒトＣＨコード配列へのスイッチを制御する。
別の実施形態において、ヒトＣγ２コード配列（ＣH遺伝子の分泌形態および膜結合形態についてのエキソンの全てを含む）は、別のヒトＣH遺伝子によって置き換えられる。このようにして、ヒトＳγ２配列は、Ｃμから下流ＣH遺伝子へのＣＳＲを制御する。ｈＳｇ２配列は、ｙＨ１Ｃにおいて安定であるが、他のヒトＳ配列（それらのいくつかは、Ｓ反復のより長いタンデムアレイを有する）は、安定性が低くあり得ることが知られている。ヒトＣγ２遺伝子を有するトランスジェニックマウスにおけるＣＳＲは、効率的であり、そしてヒトＩｇＧ２の高い血清レベルを生成し、そして完全ヒトＩｇＧ２ｍＡｂの効率的な産生を生じることもまた知られている。従って、それらの有利な安定性および抗原チャレンジに対するインビボ応答を有するヒトＳγ２を保持するが、ＣＳＲが別のアイソタイプ（例えば、Ｃγ１またはＣγ４のいずれか）について起こるように操作することは、好ましくあり得る。このことを達成するために、以下のエレメントを有するベクターが、構築される：例えば、ヒトＳγ２とヒトＣγ２コードエキソン１との間に位置する５’側の相同性領域（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）、Ｃγ２以外のヒトＣＨ遺伝子、マウス３’エンハンサー、酵母選択マーカー、およびＹＡＣアームにおける３’標的化相同性領域。このようなベクターはｙＨ１Ｃを保有する酵母に導入され、そして標的組換え体が選択され、そしてスクリーニングされる。これらの例において、多くのバリエーションが、当業者によって作製され得、そしてこれらの例は、これらが、異種Ｓ領域によって駆動されるＣＳＲを有するトランスジェニックマウスの末端に達するためのみの手段であることを示すことを意味しないことが、理解されるべきである。
（エンハンサーの役割）
Ｓ領域に加えて、他のシス調節エレメントは、ＣＳＲに対して必要とされるか、または必要とされ得ることが知られている。ｉＥｍについての要求が、言及されている。また、ＩｇＧの通常のレベルの発現のために必要とされるエンハンサーが、マウスＳγ１の３’逆方向反復とＣH１エキソンとの間に存在すると仮定されている。このエンハンサーは、マウスおよびヒトにおける他のＣH遺伝子において保存され得、そしてこの間隔は、異種スイッチ配列を介して、ＣＳＲについて設計された任意のベクターにおいて保持されるべきである。（Ｅｌｅｎｉｃｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７，１７６−１８２（１９９６）；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０，１０２７−１０３７頁（１９９８））。マウスおよびヒトにおけるＣα遺伝子のエンハンサー３’のクラスターもま、重要である。マウスにおいて、Ｃαの下流の４０ｋｂの領域には、４つのエンハンサーエレメンが含まれ、これらの顕著な特徴は、Ｄｎａｓｅ Ｉ高感受性部位（ＨＳ）である。これらのエンハンサーは、５’から３’への順序である：ＨＳ３ａ、４ｋｂ、Ｃαの下流；ＨＳ１、２（文献および本明細書中でｍ３’Ｅとして公知）、１５ｋｂ、Ｃαの３’；ＨＳ３ｂ、２５ｋｂ、Ｃαの３’；およびＨＳ４、約３０ｋｂ、Ｃαの３’；ＨＳ１、２、ＨＳ３ａ、およびＨＳ３ｂは、活性化されたＢ細胞および形質細胞における発現を高める。ＨＳ４は、Ｂ細胞発生の過程にわたって活性であるが、ｙＨ１Ｃ ＹＡＣがＨＳ４を欠き、そしてなおマウスにおける効率的なＢ細胞発生を支持するならば、明らかに不必要である。従って、これらのエレメントは、転写を増加させるために相乗的に作用し得、そしてマウスおよびヒトにおけるＩｇＨ遺伝子座のための遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）を形成すると仮定されている。個々のＨＳユニットの機能のいくらかの重複性が存在するという仮説が立てられている。これらのエレメントの損なわれていない活性は、ＣＳＲのために必要とされ得るが、ＨＳ１、２およびＨＳ３ａは、別々に、不要なＣＳＲである（Ｊ．Ｐ．Ｍａｎｉｓら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：１４２１−１４３１（１９９８）を参照のこと）。
ＨＳ１、２（３’Ｅ）は、このセットの最初に発見されたエンハンサーであった。ＨＳ１、２部位および転写因子（例えば、ＡＰ−１）についてのコンセンサス結合ドメインに相同な配列は、９００ｂｐのＳｔｕ−Ｉフラグメント上で分離され得る。（Ｄａｒｉａｖｉｃｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２１，１４９９−１５０４頁（１９９１）；Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｘ６２７７８）。マウスにおける３’Ｅは、ラットの３’Ｅとは逆方向に配向され、このことは、他のエンハンサーと同様に、その機能は、配向非依存性であることを示唆する。しかし、３’Ｅは、プロモーターから離れて配置される場合、位置依存活性を有し、そして転写をより有効的に増加させることが示されている。Ｇｅｎｅ，１３６，３４９−３５３頁（１９９３）。ヒトＣｇ２遺伝子の３’に位置するＨＳ１、２を有する９００ｂｐのＳｔｕＩフラグメントを包含する４ｋｂのＸｂａＩフラグメントは、トランスジェニックマウスにおけるＣＳＲおよび高レベルの発現を支持しうる（Ｍｅｎｄｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６−１５６（１９９７）を参照のこと）。
強力なプロモーター（ＰＧＫ）のマウスＩｇＨ３’ＬＣＲへの挿入は、いくつかのＩｇＧアイソタイプ（ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ２ｂ）へのクラススイッチおよび他のもの（ＩｇＧ１、ＩｇＡ）のより低い発現を抑止し得る。不思議なことだが、プロモーターおよびその発現遺伝子はまた、ＬＣＲの制御下に入る：ＰＧＫ駆動発現構築物は、下方制御され、そして活性化Ｂ細胞に上方制御され得る（Ｊ．Ｐ．Ｍａｎｉｓら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：１４２１−１４３１（１９９８））。従って、構築物３’を有し、そしてマウス３’Ｅコア構築物（９００ｂｐのＳｔｕＩ）に隣接した強力な構成的プロモーター（ＰＧＫ）によって駆動されるβ−ｇａｌ発現構築物を保有するＹＡＣ遺伝子において、ＰＧＫ−β−ｇａｌ構築物の夾雑物の欠失を有するＥＳ細胞ゲノムに組み込まれているＹＡＣについてスクリーニングすることは有利であり得る。これは、β−ｇａｌについてのプライマーを使用するＰＣＲによって達成され得るか、またはβ−ｇａｌ遺伝子を用いてプローブされるサザンブロットによって達成される。
（免疫グロブリン膜エキソン）
各ＩｇＨアイソタイプおよびクラスの２つの形態、分泌形態（ｓ）および膜形態（ｍ）は、Ｂ細胞によって作製され得る。Ｉｇ（ｓ）およびＩｇ（ｍ）は、ＩｇＨ転写物の代替のスプライシングを介して合成される。２つの膜エキソンは、各ヒトＩｇＧ遺伝子のＣＨ３エキソンの２ｋｂの下流にある。膜エキソンによってコードされるものは、疎水性膜貫通配列および短い、およそ３アミノ酸の細胞質テールである。ＣＨ３からの第一の膜エキソンへの代替のスプライシングは、膜結合ＩｇＧを生じる。膜結合Ｉｇは、Ｂ細胞中の他のタンパク質（例えば、とりわけ、Ｉｇα、ＩｇβおよびＣＤ４５）と相互作用して、シグナル伝達し得るＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）と呼ばれる複合体を形成する。細胞外環境（例えば、可溶性または抗原提示細胞）中にあるＩｇＧのＶ領域による、抗原の結合は、シグナル伝達に導き得る。ＢＣＲによるこのシグナル伝達は、Ｂ細胞の活性化ならびに最終的に、二次免疫応答における効率的な親和性変異および胚中心形成に導く。
さらに、ＢＣＲのＩｇによる抗原の結合は、ヘルパー細胞への提示のための、ＭＨＣ分子による抗原フラグメントの内在化、操作、および提示に導き得る。明らかに、機能的ＢＣＲの効率的なアセンブリは、効率的な一次および二次免疫応答のために必要とされる。
ヒトＩｇＧ１膜エキソンは、ＢＣＲＰの他の成分と十分に複合体化するわけではなく、マウスのキメラＢＣＲと同程度には、シグナル伝達するわけではないキメラＢＣＲを生じる。Ｇ．Ｐｌｕｓｃｈｋｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２１５，２７−３７頁（１９９８）。ＩｇＧ１の分泌形態および膜形態をコードする全てのヒトエキソンを有するヒトＩｇＧ１構築物は、マウスＩｇＧ２ａ遺伝子座に挿入され、その結果、マウスＣγ２ａエキソンが、置き換えられ、そしてヒトコードエキソンに対するＣＳＲは、マウスＳγ２ａ領域の制御下にあった。キメラヒトＩｇＧ１（マウスＶＤＪ−ヒトＩｇＧ１）は、マウスＩｇＧ２ａよりも１００倍低いレベルで発現され、そして抗原特異的ｍＡｂは、回収されなかった。従って、マウスＳγ２ａによって駆動されるクラススイッチが生じるが、正常な免疫応答は、妥協された。あるいは、分泌ヒトＩｇＧ１をコードするエキソンは、マウスＩｇＧ１の分泌形態をコードするエキソンのみを置き換えるために、使用されてきている。この構築物は、キメラＩｇＧ１重鎖遺伝子を生成し、このキメラＩｇＧ１重鎖遺伝子は、分泌ＩｇＧ１についての全てのヒトエキソンを含むが、インタクトな下流のマウス膜エキソンを有する。クラススイッチは、マウスＳγ１領域によって駆動されている。膜結合Ｉｇは、マウスＶ−ヒトγ１ ＣＨ１−ＣＨ３−マウスＣγ１（ｍｅｍ）である。このトランスジェニックマウスにおいて、ヒトＩｇＧ１の血清レベルは、正常な未処理のマウスにおけるマウスＩｇＧ１と同じである。従って、マウスＳγ１は、効率的なクラススイッチを駆動し得、そしてマウスＩｇＧ１膜エキソンは、少なくともヒトγ１ ＣＨ１−ＣＨ３エキソンとともに機能し得る。本発明者らは、抗原特異的ｍＡｂの産生についてマウスを試験しなかった。先の構築物におけるように、得られたＩｇＧ１ ｍＡｂは、キメラである：マウスＶＤＪは、機能的に、ヒトＣγ１の分泌形態に連結された。
これらの結果が与えられると、ヒトＣγ１エキソンのインタクトなセット（これらは、Ｃγ１の分泌形態および膜形態の両方をコードし、そしてヒトＩｇＨ遺伝子座（ＶH、ＤH、ＪH、ＣδおよびＳγ領域）に機能的に連結される）は、完全に機能的なＢＣＲをもたらすわけではない膜結合ヒトＩｇＧ１の非効率的なアセンブルのために、最適以下で機能し得る。従って、ヒトＣγ１膜エキソンを、機能的ＢＣＲに効率的にアセンブルすることが知られている別のアイソタイプ由来のものと置き換えることは、好ましくあり得る。このようなエキソンは、マウスＣγ１エキソンまたは他のマウスＣ膜領エキソンを含み得る。あるいは、ヒトＣγ２膜エキソンは、マウスのＢＣＲにおいて十分に機能することが期待される。なぜなら、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ Ｇ２は、高レベルの分泌ＩｇＧ２を有し、そして高い親和性の抗原特異的ｍＡｂを効率的に産生するからである。従って、ヒトＣγ２膜エキソンは、ヒトＣγ１ ＣＨ１−ＣＨ３エキソンに機能的に連結され得る。膜エキソンについての配列は、公知である（ｈγ１については、Ｘ５２８４７；ｈγ２については、ＡＢ００６７７５）。
（ベクター構築）
１つの実施形態では、ＣＨ１−ＣＨ３エキソンのみをｙＨ１Ｃ ＹＡＣ中に導入するための標的化ベクターが生成される。ヒトＣＨ１−ＣＨ３ならびにイントロンおよび隣接するＤＮＡの全ての配列が利用可能であり［Ｊ．Ｗ．Ｅｌｌｉｓｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３：４０７１−４０７９（１９８２）；Ｊ．Ｅｌｌｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９：１９８４−１９８５（１９８２）；Ｓ．Ｈｕｃｋら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１４：１７７９−１７８９（１９８６）；Ｊ．Ｅｌｌｉｓｏｎら，ＤＮＡ，１：１１−１８（１９８１）を参照のこと（これらの開示は、本明細書中に参考として援用される）］、全ての制限部位が電子的にマッピングされることおよび標的化ベクターが構築されることを可能にする。１つのこのようなベクターは、ヒトＣγ２ ＣＨ１エキソンの上流の５’相同性、酵母におけるポジティブ／ネガティブ選択マーカー（ＵＲＡ３）についての発現構築物、５’標的化相同性の直接反復、ヒトＣγ１エキソンＣＨ１−ＣＨ３を含む配列、および３’標的化相同性を含む。このベクターは、ｙＨ１Ｃを保有する酵母中にトランスフェクトされ、そして相同な組換え体は、ウラシルを欠くプレート上でポジティブに選択され、次いで、サザンブロットハイブリダイゼーションによってスクリーニングされるかまたはＰＣＲによってヒトＣγ２ ＣＨ１−ＣＨ３エキソンの喪失およびヒトＣγ１ ＣＨ１−ＣＨ３の付随した獲得について試験される。一旦同定されると、ＵＲＡ３遺伝子の欠失は、５’−フルオロウラシルを用いて選択され得る。このような喪失は、酵母中の直接的な反復配列の間での効率的な染色体内組換えに起因して高い頻度（１０-4〜１０-5）で生じると予想される。ＵＲＡ３遺伝子の欠失は、クラススイッチ組換えについておよび抗体の発現について機能的な配置で完全にヒトＩｇＨを回復させる。このような操作を達成するための他のストラテジーが存在することが明らかである。また、他のヒトＣγ遺伝子（例えば、ヒトＣγ４）をヒトＣγ２遺伝子座中に操作する動機付けが存在し得る。
（ＣＲＥ−ＬＯＸ媒介クラススイッチ）
ＣＲＥ−ｌｏｘ系は、予め規定された部位への、ＤＮＡの標的化された挿入を可能にする。Ｐ１バクテリオファージから誘導されると、ＣＲＥレコンビナーゼは、ｌｏｘＰ部位間のＤＮＡ内またはＤＮＡ間の組換えを駆動する［Ｂ．Ｓａｕｅｒら，Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ ２：４４１−４４９（１９９０）；Ｓ．Ｆｕｋｕｓｈｉｇｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：７９０５−７９０９（１９９２）；Ｙ．−Ｒ．Ｚｏｕら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌ．，４：１０９９−１１０３（１９９４）］。ｌｏｘ Ｐ部位（配列：ＴＡ ＡＣＴ ＴＣＧ ＴＡＴ ＡＧＣ ＡＴＡ ＣＡＴ ＴＡＴ ＡＣＧ ＡＡＧ ＴＴＡ ＴＡ（配列番号１））は、ｙＨ ＹＡＣのＤＮＡ中に導入される。この配列は、Ｓ領域（例えば、Ｓｇ２）の下流の３’逆方向反復の３’側に、そして下流のＣｇ遺伝子（例えば、Ｃｇ１）のＣＨ１エキソンのスプライスアクセプター配列の５’側に配置される。ｌｏｘ Ｐ部位は、酵母中で相同組換えを介してＹＡＣ中に直接挿入され得る。またはｌｏｘ Ｐ部位は、より大きな標的化ベクター（例えば、本明細書に上記で記載される標的化ベクター）中に組み込まれ得る。この部位をこのようなＹＡＣ標的化ベクター中に組み込んだ場合、ｌｏｘＰ部位は、標的化相同性（例えば、５’標的化相同性）を増幅するために用いられるＰＣＲプライマーに導入され得るか、または連結されたオリゴヌクレオチドとしてインビトロで挿入され得る。２つのｌｏｘＰ部位の間の相同組換えは方向依存性であるので、第１のｌｏｘＰ部位をＹＡＣ中に挿入する方向に注意することが重要である。
第２の段階では、代替的Ｃγ遺伝子の挿入のためのプラスミドベクターが生成される。このベクターのコアでは、導入されるＣｇ遺伝子および導入を可能にするｌｏｘＰ部位を保有するカセットである：このカセットは、ＹＡＣ中でと同じ５’−３’方向のｌｏｘ Ｐ部位で始まり、ＹＡＣ上のＣｇの上流のｌｏｘ Ｐ挿入部位に対応するＣＨ１の上流のＤＮＡが続き、そして生殖系列配置に続き、ＣＨ１を通り（ＣＨ１エキソンスプライスアクセプターはインタクトなままである）、第２の膜エキソンの３’側のポリアデニル化部位の下流を通る。例えば、約７ｋｂ Ｈｉｎｄ ＩＩＩフラグメントは、全てのヒトＣｇ遺伝子について必要とされるＤＮＡの全てを捕捉する。あるいは、転写および翻訳（非翻訳領域、ポリアデニル化部位）について適切な３’シグナルを含むＣＨ１−ＣＨ３エキソンのみを用いて、分泌形態のｍＡｂのみを作製し得る。あり得る読み過し転写をなくすために、真核生物転写ターミネーター配列は、ベクターにおいてＣＨ遺伝子の下流に付加され得る。形質転換体の選択を容易にするために、選択マーカー（例えば、ピューロマイシンまたはハイグロマイシン）についての発現カセットが、ＣＨ遺伝子の下流に付加され得る。
一旦ハイブリドーマが、ｌｘｏＰ部位を用いて操作されたｙＨトランスジーンを保有するトランスジェニックマウスから生成されると、ＣＲＥ−ｌｏｘ媒介クラススイッチは、環化された挿入ベクターと精製されたＣＲＥレコンビナーゼまたはＣＲＥ発現ベクターのいずれかとを、例えば、エレクトロポレーションまたはリポフェクションによって、同時トランスフェクトすることによって誘導され得る。同時トランスフェクトされた細胞では、ＣＲＥは、遺伝子座への新規のＣＨ遺伝子の挿入を媒介し、ここで、ＣＲＥは、所望のｍＡｂ特異性をコードする上流のＶＨＤＪＨに対してシスで転写およびスプライシングされる。転写ターミネーターは、下流のＣＨ遺伝子へと転写し続けるのを妨げる。ベクターが選択マーカーを有するならば、トランスフェクトされたハイブリドーマは、適切な薬物を用いて選択され得、次いで、プールされ得るかまたは個々のクローンが所望の新規のアイソタイプのｍＡｂについてのＥＬＩＳＡによってスクリーニングされ得る。ベクターが選択マーカーを欠くならば、トランスフェクトされたハイブリドーマのプールは、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングされ得、そして所望のアイソタイプを産生するハイブリドーマは、プールからサブクローニングされ得る。置換ＣＨ遺伝子が膜結合型ＩｇＨをコードするならばまた、ハイブリドーマは、フローサイトメトリーによってスクリーニングおよび選別され得る。
いくつかの例では、一方のアイソタイプが１つの活性（例えば、ＡＤＣＣまたはＣＭＬ）を有し、そして他方のアイソタイプがエフェクター機能を欠くが、同一の抗原結合特徴（例えば、エピトープ特異性および親和性）を有して、単一抗原特異的ｍＡｂの２つの異なるアイソタイプを保有することが好適であり得る。
この目的は、重鎖および軽鎖の可変領域の分子クローニング、次いで、適切な定常領域に対するこれらの機能的連結、続いてｍＡｂの産生のための細胞内へのトランスフェクションによって達成され得る。しかし、このプロセスは、労力および時間がかかり得る。あるいは、上記のＣＲＥ−ｌｏｘプロセスを用いて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ中でインビボで効率的にクラススイッチされ得る。
（マウス系統）
以下のマウス系統は、本明細書中に記載および／または利用される：
（二重不活化（ＤＩ）系統）
ＤＩ系統のマウスは、機能的内因性マウスＩｇを産生しないマウスである。好ましい実施形態では、ＤＩマウスは、不活化されたマウスＪH領域および不活化されたマウスＣκ領域を保有する。この系統の構築は、他の箇所で広範囲に議論されている。例えば、ＤＩ系統の作製のために利用される技術は、１９９０年１月１２日に出願された米国特許出願第０７／４６６，００８号、１９９０年１１月８日に出願された同第０７／６１０，５１５号、１９９２年７月２４日に出願された同第０７／９１９，２９７号、１９９３年３月１５日に出願された同第０８／０３１，８０１号、１９９３年８月２７日に出願された同第０８／１１２，８４８号、１９９４年４月２８日に出願された同第０８／２３４，１４５号、１９９６年１０月２日に出願された同第０８／７２４，７５２号に詳細に記載される。１９９６年６月１２日に特許許可公開された欧州特許第ＥＰ ０ ４６３ １５１ Ｂ１号、１９９４年２月３日に公開された国際特許出願第ＷＯ ９４／０２６０２号、１９９６年１０月３１日に公開された国際特許出願第ＷＯ ９６／３４０９６号および１９９６年４月２９日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５９２８号もまた参照のこと。上記の引用された特許および特許出願の各々の開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される。ＤＩマウスは、非常に未成熟なＢ細胞発達を保有する。このマウスは、成熟Ｂ細胞を産生せず、プロＢ細胞しか産生しない［ＧｒｅｅｎおよびＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８８，４８３−４９５頁（１９９８）］。
（ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ Ｉ系統）
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ Ｉ系統の設計、構築および分析は、Ｇｒｅｅｎら，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，７：１３−２１（１９９４）において詳細に考察された。このようなマウスは、ＤＩバックグラウンドに対してヒトＩｇＭκ抗体を産生した。このマウスは、ほとんどまたは全くＢ細胞の発達を有さないＤＩ系統のマウスと比較した場合に、改善されたＢ細胞機能を示した。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ Ｉ系統のマウスは、抗原投与に対してかなり大きい免疫応答を上昇させた（ｍｏｕｎｔ）とはいえ、Ｂ細胞のそれらの産生は、野生型マウスのほんの２０％〜２５％のみであり、そしてこれらは抗原に対する制限された応答を有した。
両方の特徴は、それらの制限されたＶ遺伝子レパートリーに関連するようである。
（Ｌ６系統）
Ｌ６系統は、内因性マウスＩｇのＤＩバックグラウンドに対するヒトＩｇＭκ抗体を産生するマウスである。Ｌ６マウスは、挿入されたヒト重鎖および挿入されたヒトκ軽鎖を含む。Ｌ６系統は、二重不活化バックグラウンドに対して重鎖挿入物を含むマウス（Ｌ６Ｈ）と、二重不活化バックグラウンドに対してκ軽鎖挿入物を有するマウス（Ｌ６Ｌ）との交配を通して作製される。重鎖挿入物は、ＶH６−１で始まり、そしてＶH３−６５で終わり、そして主なＤ遺伝子クラスター（約３２）、ＪH遺伝子（６）、介在性エンハンサー（Ｅｍ）、Ｃμおよび約２５ｋｂ過ぎたＣδを通って含めて約６６個のＶHセグメントを含む、生殖系列の配置にある、ＹＡＣ由来のインタクトな約９７０ｋｂのヒトＤＮＡ挿入物を含む。軽鎖挿入物ｙＫ２は、Ｖκ-B3で始まり、そしてＶκ-Op11で終わる、約３２個のＶκ遺伝子を含む、ＹＡＣ由来のインタクトな約８００ｋｂのヒトＤＮＡ挿入物を含む。この８００ｋｂの挿入物は、Ｖκ-Lp-13で始まり、そしてＶκ-Lp-5で終わる、約１００ｋｂの欠失を含む。しかし、このＤＮＡは、Ｖκ-Lp-13から１００ｋｂの過ぎたＶκ-Op-1までの生殖系列配置にあり、そしてまたＪκ遺伝子、イントロンおよび３’エンハンサー、定常Ｃκ遺伝子およびＫｄｅを含む［Ｍｅｎｄｅｚら，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１５，１４６−１５６頁（１９９７）］。さらに、Ｌ６マウスは、ヒトκ軽鎖の優勢な発現、成熟Ｂ細胞の大きな集団および正常なレベルのＩｇＭκヒト抗体を示す［ＧｒｅｅｎおよびＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８８，４８３−４９５頁（１９９８）］。
（ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ ＩＩａ系統：）
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ ＩＩａマウスは、ＤＩバックグラウンドに対して生殖系列配置のメガ塩基サイズのヒトＩｇ遺伝子座を備え、その結果、このマウスは、機能的内因性Ｉｇを産生しない、第２世代のＸｅｎｏＭｏｕｓｅTM系統を表す。本質的に、このマウスは、Ｌ６系統に対して構築が等価であるが、そのスイッチ配列および調節配列の全体、ならびにマウス３’エンハンサーをシスにおいて有するヒトＣγ２遺伝子をさらに含む。このマウスは、約１０２０ｋｂの重鎖遺伝子座および約８００ｋｂのκ軽鎖遺伝子座を含み、これらは、重鎖遺伝子（約６６ＶH）およびκ軽鎖遺伝子（約３２Ｖκ）、ヒト重鎖定常領域遺伝子（μ、δおよびγ）およびκ定常領域遺伝子（Ｃκ）、ならびに主な同定された調節エレメントの全てを含む、大多数のヒト可変領域遺伝子を含む。これらのマウスは、そのゲノムに含まれた全ての範囲の可変遺伝子を利用し得ることが示されている。さらに、これらのマウスは、効率的なクラススイッチおよび体細胞性高変異（ｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）、ヒトκ軽鎖の優勢な発現、成熟Ｂ細胞の大きな集団、ならびに正常レベルのＩｇＭκおよびＩｇＧκヒト抗体を示す。このようなマウスは、ヒトＩＬ−８、ヒトＥＧＦレセプター（ＥＧＦＲ）およびヒト腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）を含めた複数の免疫原に対する種々のヒト抗体応答を上昇させ、最終的に、ナノモル未満の親和性を有する抗原特異的で完全にヒトのｍＡｂを生じる。この最後の結果は、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅTMを、任意の所望の特異性で広範な範囲の抗原に対する高い親和性の、完全にヒトの治療的ｍＡｂの迅速な単離のための優れた供給源として決定的に実証する。
上記の序論から理解されるように、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ ＩＩ系統は、成熟Ｂ細胞発達を受け、そして強力な成体ヒト様免疫応答を抗原投与に対して上昇させるようである。Ｌ６系統はまた、成熟Ｂ細胞発達を受けるようである。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ ＩＩ系統の場合、著しく異なったＢ細胞発達プロフィールが観察される。この相違に起因して、動物に導入される可変領域配列の量および複雑さは、Ｂ細胞成熟および発達の誘導、ならびに成体ヒト様免疫応答の生成に必須であるようである。従って、ヒト抗体を産生する系統の有用性に加えて、この系統は、正常な免疫応答におけるヒト抗体の産生および機能、ならびに自己免疫疾患および他の障害に特有な異常な応答を研究する際の貴重なツールを提供する。
（可変領域−定量的多様性）
抗体の特異性（すなわち、広範な範囲の抗原に対して、そして実際に抗原上の広範な範囲の独立したエピトープに対する抗体を産生する能力）は、重鎖（ＶH）およびκ軽鎖（Ｖκ）ゲノム上の可変領域遺伝子に依存すると予測される。ヒト重鎖ゲノムは、約９５個のＶＨ遺伝子を含み、そのうちの４１個は、免疫グロブリン分子のヒト重鎖の可変領域をコードする機能的遺伝子である。さらに、ヒト軽鎖ゲノムは、約４０個のＶκ遺伝子をその近位末端に含み、そのうちの２５個は、免疫グロブリン分子のヒトκ軽鎖の可変領域をコードする機能的なものである。本発明者らは、抗体の特異性が、可変軽鎖および可変重鎖をコードする複数の遺伝子を含めることによって増強され得ることを実証した。
本発明に従って提供されるのは、ヒトＩｇ遺伝子座のかなりの部分を有する、好ましくはヒト重鎖遺伝子座およびヒトκ軽鎖遺伝子座の両方を含む、トランスジェニックマウスである。それゆえ、好ましい実施形態では、１０％を超えるヒトＶH遺伝子およびＶκ遺伝子が利用される。より好ましくは、約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％を超える、またはさらに７０％以上のＶHおよびＶκ遺伝子が利用される。好ましい実施形態では、それぞれ、ヒトＶκ軽鎖ゲノムの近位領域由来の３２個の遺伝子および／またはヒトＩｇＨ遺伝子座のＶH部分由来の６６個の遺伝子を含む重鎖構築物および軽鎖構築物が利用される。認識されるように、遺伝子は、順序通りに、すなわち、ヒトゲノム中で見出される順序で、もしくは順序が狂って、すなわち、ヒトゲノム中に見出される順序以外の順序で、またはそれらの組み合わせでのいずれかで含まれ得る。従って、例証として、この遺伝子座のヒトＶH領域またはヒトＶκ領域のいずれかの完全に順序通りの部分が利用され得るか、またはＶHゲノムもしくはＶκゲノムのいずれかにおける種々のＶ遺伝子が、全体的な順序通りの配置は保持しながらもスキップされ得るか、またはＶHゲノムもしくはＶκゲノムのいずれかの内のＶ遺伝子が並べ換えられ得るなどである。好ましい実施形態では、ヒト遺伝子座全体は、ヒトにおいて見出されるような、実質的に生殖系列配置でマウスゲノム中に挿入される。いずれにせよ、ＶHゲノムおよびＶκゲノム由来の多様な配置の遺伝子を含むことによって、増強された抗体特異性、そして最終的には増強された抗体親和性をもたらすことが予想され、そして本明細書中に記載される結果は、そのことを実証する。
このようなマウスは好ましくは、ヒトＤH領域全体、ヒトＪH領域全体およびヒトμ定常領域をさらに含み、そしてさらなるアイソタイプの抗体のコーディングおよび生成のための他のヒト定常領域をさらに備え得る。このようなアイソタイプは、γ1、γ2、γ3、γ4、α、εおよびδをコードする遺伝子、ならびに他の定常領域コード遺伝子を適切なスイッチ配列および調節配列とともに含み得る。認識され、そして以下でより詳細に考察されるように、種々のスイッチ配列および調節配列は、任意の特定の定常領域選択に関連して利用され得る。
以下の表は、Ｎ付加、欠失または体細胞性変異事象を考慮することなく、ランダムなＶ−Ｄ−Ｊの連結およびκ軽鎖との組み合わせに厳密に基づく、ヒトにおいて可能である抗体組み合わせの多様性を示す。これらの考慮に基づいて、ヒトにおいて任意の特定のアイソタイプについての７×１０5を超える可能な抗体の組み合わせが存在する。
Figure 2011087594
本発明の好ましい実施形態に関連して、約３４個の機能的ＶH遺伝子および１８個の機能的Ｖκ遺伝子をＤH遺伝子、ＪH遺伝子およびＪκ遺伝子の完全な相補体を有するマウス中に含むことによって、抗体産生の可能な多様性は、４．２×１０5個の異なる抗体の桁である。上記のように、このような算出は、Ｎ付加も体細胞性変異事象も考慮しない。それゆえ、本発明によるマウス（例えば、Ｌ６系統およびＸｅｎｏＭｏｕｓｅ ＩＩ系統）が、かなりの抗体多様性を提供することが認識される。好ましい実施形態では、マウスは、Ｎ付加または体細胞性変異事象を計上することなく、２×１０5を超える異なる重鎖Ｖ−Ｄ−Ｊの組み合わせおよびκ軽鎖Ｖ−Ｊの組み合わせを生じる能力を有するように設計される。
（可変領域−定性的多様性）
定量的多様性に加えて、Ｖ−遺伝子の定量的選択（すなわち、多数の多様なＶ−遺伝子）および／またはＶ−遺伝子の定性的選択（すなわち、特定のＶ−遺伝子の選択）は、本明細書中で本発明者らが「定性的多様性」と呼ぶものにおいて役割を果たすようである。「定性的多様性」とは、本明細書中で使用される場合、Ｖ−Ｄ−Ｊ再編成における多様性をいい、ここで結合部の多様性および／または体細胞突然変異（ｓｏｍａｔｉｃ ｎｕｔａｔｉｏｎ）事象が導入される。重鎖再編成の間、特定の酵素（ＲＡＧ−１、ＲＡＧ−２、およびおそらく他の酵素）は、抗体遺伝子のコード領域を表すＤＮＡの切断についての原因である。末端のデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Ｔｄｔ）活性（これは、Ｖ−Ｄ遺伝子エキソンとＤ−Ｊ遺伝子エキソンとの間のヌクレオチドのＮ末端付加の原因である）は、アップレギュレートされる。類似の酵素および他の酵素（ＳＣＩＤおよび他のＤＮＡ修復酵素）は、これらのコードセグメントの結合部で起こる欠失の原因である。結合部の多様性は、Ｎ付加事象および相補性決定領域３（ＣＤＲ３）の形成の両方をいう。理解されるように、ＣＤＲ３は、Ｄ領域にわたって位置し、そしてＶ−ＤおよびＶ−Ｊ結合部事象を含む。従って、Ｄ−Ｊ再編成およびＶ−Ｄ再編成の両方の間のＮ付加および欠失は、ＣＤＲ３多様性の原因である。
Ｎ付加およびＣＤＲ３付加によって作製される結合部の多様性は、抗体の特異性を発生するという明確な役割を果たす。
本発明に従って、再編成されたＶ−Ｄ−Ｊ遺伝子配列は、予想された成人ヒトＮ付加長に匹敵するＮ付加長を示す。さらに、ＣＤＲ３配列に対応するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）にわたるアミノ酸配列は、予想された成人ヒトＣＤＲ３長に匹敵するＣＤＲ３長を示す。このようなデータは、定量的可変領域多様性および／または定性的可変領域多様性が、ヒト様結合部多様性を生じることを示す。このような結合部多様性は、よりいっそうのヒト様抗体特異性をもたらすことが予想される。
（可変領域−親和性）
本発明者らは、可変領域の包含の増大と抗体の特異性との間の直接的な因果関係を結論的に実証したわけでないが、このような多様性を提供することを通して、広範な多数の抗原に対する免疫応答を上昇させるマウスの能力が可能でありかつ増強されるということがありそうであり、そしてこのことが予想される。さらに、このようなマウスは、個々の抗原または免疫原上の広範な多数のエピトープに対する免疫応答を上昇させるために、より備えができているようである。本発明者らのデータから、本発明に従って産生される抗体はまた、増強された親和性を有するようである。このようなデータは、本発明に従うマウスとＸｅｎｏＭｏｕｓｅ Ｉ株との間の比較、ならびにＧｅｎＰｈａｒｍ ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌおよびＭＲＣの公開された結果の考慮を包含する。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ Ｉ株に関連して、上述のように、このようなマウスは、サブノーマルなＢ細胞産生および抗原に対する限られた応答のみを有する。このような結果は、部分的に、限定されたＶ−遺伝子のレパートリーに関連するようである。同様に、ＧｅｎＰｈａｒｍ ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌおよびＭＲＣによって報告された結果は、多様な抗原に対する限定された応答を示す。
特定の理論または本発明の操作の様式に束縛されることを望まないが、増強された親和性は、Ｖ−領域の多数および複雑さの供給から生じるように見えるようである。本発明者らのデータから、より多くの数の供給および／またはＶ−遺伝子配列の性質の選択は、結合部の多様性（Ｎ付加および領域３（「ＣＤＲ３」多様性）を決定する相補性の形成）を増強し、これは、成人ヒト様免疫応答に代表的であり、そして抗体の親和性の成熟において実質的な役割を果たしている。このような抗体は、親和性の増強をもたらす体細胞突然変異事象においてより有効でありかつより効率的であることもまた、可能性がある。結合部の多様性および体細胞突然変異事象の各々は、以下でさらに詳細に議論される。
親和性に関して、複数のＶH遺伝子およびＶκ遺伝子の使用（すなわち、Ｖκ軽鎖ゲノムの近位領域上の３２の遺伝子およびゲノムのＶH部分上の６６遺伝子の使用）を通して誘導された抗体親和性速度および定数は、約０．５０×１０-6よりも大きな結合速度（Ｍ-1Ｓ-1でのｋａ）、好ましくは２．００×１０-6よりも大きな結合速度、そしてより好ましくは、約４．００×１０-6よりも大きな結合速度；約１．００×１０-4より大きな解離速度（Ｓ-1でのｋｄ）、好ましくは約２．００×１０-4よりも大きく、そしてより好ましくは約４．００×１０-4よりも大きく；そして約１．００×１０-10より大きな解離定数（Ｍで）、好ましくは約２．００×１０-10よりも大きく、そしてより好ましくは約４．００×１０-10よりも大きい。
好ましくは、このようなマウスはさらに、機能的に内因性の免疫グロブリンを産生しない。このことは、内因性の重鎖および軽鎖の遺伝子座の不活化（すなわち、ノックアウト）を通して好ましい実施形態において達成される。例えば、好ましい実施形態において、マウス重鎖Ｊ領域およびマウスκ軽鎖Ｊ領域ならびにＣκ領域が、この領域を置換または欠失させる相同組換えベクターの使用を通して不活化される。
（可変領域−Ｂ細胞発生）
Ｂ細胞発生は、Ｋｌａｕｓ Ｂ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９０））およびＴ．Ｈｏｎｊｏら、Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９８））の第１章〜第３章に概説されている。一般的には、哺乳動物において、血球（Ｂ細胞およびＴ細胞を含む）発生は、共通の多能性幹細胞から生じる。次いで、リンパ球は、共通のリンパ球前駆細胞から進化する。初期の妊娠期間に続いて、Ｂ細胞の開始は、肝臓から骨髄にシフトする。Ｂ細胞の開始は、哺乳動物の生涯を通じて骨髄に残る。
Ｂ細胞のライフサイクルにおいて第１の一般的に認識可能な細胞は、プロプレＢ細胞であり、これは骨髄において見出される。このような細胞は、重鎖のＶ−Ｄ−Ｊ再編成を開始するが、まだタンパク質を作らない。次いでこの細胞は、大きく、迅速に分裂する、プレＢ細胞Ｉに進化する。この細胞は、細胞質性のμ細胞である。次いで、このプレＢＩ細胞は分裂を停止し、縮み、そして軽鎖Ｖ−Ｊ再編成を受け、プレＢ細胞ＩＩになる。この細胞は、髄を未成熟なＢ細胞のままにする表面ＩｇＭを発現する。出現する未成熟のＢ細胞の大部分は、表面のＩｇＤを発生および産生することを継続する。このことは、脾臓に主に存在する、完全に成熟した免疫応答性末梢Ｂ細胞としての分化および発生の完了を示す（ＨａｒｄｙおよびＲｏｌｉｎｋ、Ａｎｎ．ＮＹ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、７６４、１９〜２４頁（１９９５）；ＲｏｌｉｎｋおよびＭｅｌｃｈｅｒｓ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．、５４、１５７〜１６１頁、（１９９６））。しかし、デルタ定常領域を除去し、そしてなお、免疫応答性細胞を得ることが可能である。
Ｂ細胞分化および発生は、表面マーカーの使用を通してモニタリングおよび／または追跡され得る。例えば、Ｂ２２０抗原は、プレＢ細胞ＩまたはＩＩに対する比較において成熟Ｂ細胞上で比較的な量で発現され得る。従って、Ｂ２２０+でありかつ表面ＩｇＭ+（μ+）である細胞は、成熟Ｂ細胞の存在を決定するために使用され得る。さらに、細胞は、表面ＩｇＤ発現（δ+）についてスクリーニングされ得る。別の抗原である、熱安定性抗原は、プレＢ細胞Ｉによって、そして後の発生段階において発現され得る。
Figure 2011087594
＊導入遺伝子上にδ遺伝子の機能的コピーの存在を仮定している。
Ｂ細胞マーカー（例えば、上記で言及したようなマーカー）の使用を通して、Ｂ細胞の発生および分化がモニタリングおよび評価され得る。
本発明者らは、ＤＩマウス（重鎖Ｖ−Ｄ−Ｊ再編成または軽鎖Ｖ−Ｊ再編成を受けないマウス）が、成熟Ｂ細胞を産生しないことを以前に実証した。実際、このようなマウスは、プロプレＢ細胞の産生で停止しており、そしてＢ細胞は骨髄から末梢組織（脾臓を含む）に移動しない。従って、Ｂ細胞発生および抗体産生の両方は、完全に停止する。同じ結果が、重鎖のみが不活化されたマウスにおいても見られた。Ｂ細胞発生および分化が、骨髄において停止した。
本発明者らのＸｅｎｏＭｏｕｓｅＩ株は、機能的で、いくぶん成熟したＢ細胞を生成した。しかし、骨髄および末梢組織の両方におけるＢ細胞の数は、野生型マウスと比較して有意に減少した。
対照的に、本発明者らのＸｅｎｏＭｏｕｓｅＩＩ株およびＬ６株は、予想に反して、ほぼ完全なＢ細胞再構築物を保有する。従って、本発明に従って、本発明者らは、可変領域遺伝子の定量的包含および定性的包含を通して、Ｂ細胞分化および発生が非常に再構築され得ることを実証した。Ｂ細胞分化および発生の再構築は、免疫系の再構築を示す。一般的に、Ｂ細胞再構築は、野生型コントロールに対して比較される。従って、本発明の好ましい実施形態において、挿入されたヒト可変領域を有するマウスの集団は、野生型マウスの集団と比較した場合、約５０％よりも高い再構築を保有する。
（ＸｅｎｏＭｏｕｓｅによるアイソタイプスイッチ）
本明細書中で詳細に議論されるように、予想されるように、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅＩＩマウスは、ヒト導入遺伝子によってコードされるｍｕアイソタイプから、その導入遺伝子によってコードされるγ−２アイソタイプへの、効率的かつ有効なアイソタイプスイッチを受ける。上述のように、本発明に従うマウスはさらに、さらなるアイソタイプの生成のために他のヒト定常領域を備え得る。このようなアイソタイプには、γ１、γ２、γ３、γ４、α、β、ε、δ、および他の定常領域をコードする遺伝子が含まれ得る。代替的な定常領域は、同じ導入遺伝子（すなわち、ヒトｍｕ定常領域から下流）上に含まれ得るか、または代替的に、このような他の定常領域は、別の染色体上に含まれ得る。このような他の定常領域が、導入遺伝子をコードするヒトｍｕ定常領域を含む染色体と同じ染色体上に含まれる場合、他のアイソタイプ（単数および複数）へのシススイッチが達成され得ることが理解される。他方、このような他の定常領域が、導入遺伝子をコードするｍｕ定常領域を含む染色体とは異なる染色体上に含まれる場合、他のアイソタイプ（単数および複数）へのトランススイッチが達成され得る。このような再編成は、広範な多数の抗原に対する抗体の産生のためのマウスの設計および構築における途方もなく大きな可撓性を可能にする。
定常領域は、公知のスイッチおよびそれらに付随する調節配列を有することが理解される。マウスおよびヒトの定常領域遺伝子のすべては、１９８９年までに配列決定および公開された。Ｈｏｎｊｏら、「Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｒｅｇｉｏｎ Ｇｅｎｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｈｅａｖｙ Ｃｈａｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｃｌａｓｓ Ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ」、Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅｓ（Ｈｏｎｊｏら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））を参照のこと、この開示は、本明細書によって参考として援用される。例えば、米国特許出願番号０７／５７４，７４８（この開示は、本明細書によって参考として援用される）において、ヒトγ−１定常領域のクローニングは、先行技術からの既知の配列情報に基づいて予測された。再編成されていない、スイッチされていない遺伝子において、全体のスイッチ領域は、第１のγ−１定常エキソンの５’末端からの５ｋｂ未満で開始する配列中に含まれることが示された。従って、スイッチ領域はまた、Ｅｌｌｉｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：４０７１−４０７９（１９８２）において開示された５’５．３ｋｂ ＨｉｎｆＩＩＩフラグメント中に含まれた。同様に、Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｃｅｌｌ ２９：６７１−６７９（１９８２）もまた、Ｅｌｌｉｓｏｎにおいて開示されたフラグメントがスイッチ配列を含み、そしてこのフラグメントは、７．７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ〜ＢａｍＨＩフラグメントとともに、重鎖アイソタイプスイッチ導入遺伝子構築に必要であるすべての配列を含むに違いないことを報告した。
従って、選択するいかなるヒトの定常領域も、過度の実験なしに本発明に従ってマウスに容易に組込み得ることが理解され得る。このような定常領域は、ナイティブなスイッチ配列（すなわち、それぞれ、ヒトのγ1、γ2、γ3、またはγ4のスイッチを伴うヒトのγ1、γ2、γ3、またはγ4定常領域）に付随し得るか、または他のスイッチ配列（すなわち、ヒトγ2スイッチを伴うヒトγ4定常領域）に付随し得る。種々の３’エンハンサー配列（いくつか例を挙げれば、例えば、マウス、ヒト、またはラット）もまた、使用され得る。同様に、他の調節配列もまた、含まれ得る。
インビボでのアイソタイプスイッチの１つの代替として、および／またはそれに加えて、Ｂ細胞が「キメラ」抗体の分泌についてスクリーニングされ得る。例えば、Ｌ６マウスは、完全なヒトＩｇＭ抗体を産生することに加えて、マウス定常領域（例えば、種々のγ（すなわち、マウスＩｇＧ１、２、３、４）など）に結合された完全ヒト重鎖Ｖ、Ｄ、Ｊ領域を有する抗体を産生する。このような抗体は、それら自体の的確さにおいて非常に有用である。例えば、ヒト定常領域は、当該分野で周知のインビトロアイソタイプスイッチ技術を通して、抗体上に含まれ得る。あるいは、および／または、さらに、マウス定常領域をほとんど含まないかまたは全く含まない、このような抗体のフラグメント（すなわち、Ｆ（ａｂ）およびＦ（ａｂ’）2フラグメント）が調製され得る。
上記に議論したように、抗体産生に対する最も重要な因子は、所望の抗原または抗原上のエピトープに対する特異性である。その後、抗体のクラスが、治療的な必要性に従って重要になる。換言すれば、抗体の治療的指標は、特定のアイソタイプまたはクラスを提供することによって増強されるのであろうか。この疑問の考慮は、補体結合の問題などを惹起し、次いで、抗体の特定のクラスまたはアイソタイプの選択をさせる。γ定常領域は、抗体の親和性成熟を補助する。しかし、導入遺伝子上のヒトγ定常領域の包含は、このような成熟を達成するために必要ではない。むしろ、このプロセスは、ｍｕコードされた導入遺伝子上でトランススイッチされるマウスγ定常領域と共に、同様に進行するようである。
（実施例１：マウスγ１−ヒト γ４またはマウスγ１−ヒト γ１のためのＹＡＣベクター）
ヒトγ２スイッチエレメントおよびヒトＣＨ γ２エキソンを、マウスγ１スイッチエレメントおよびヒトＣγ１エキソンまたはヒトＣγ４エキソンのいずれかで置換するために、親のＹＡＣ ｙＨ１Ｃを標的化するための置換ベクターを調製した（図１）。このベクターを、ｐＭｕＳｈｕ１およびｐＭｕＳｈｕ４として設計した（図５）。このベクターを、ｐＡＣＹＣ１７７として公知の低コピー数クローニングベクターを使用して構築した。このベクターｐＡＣＹＣ１７７は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡから利用可能であり、そしてその配列は、配列登録番号Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＃Ｘ０６４０２の下で、Ｇｅｎｂａｎｋ配列データベースにおいて見出され得る。複製の低コピー数起点は、Ｅ．ｃｏｌｉ中で増殖させた場合に、プラスミドＤＮＡの望ましくない再編成または欠失を妨害するために有用である。
第１の工程は、標的化するベクターについて必要とされるエレメントを適応させるために、ｐＡＣＹＣ１７７中にリンカーを導入することであった。このリンカーは、以下の制限部位を含んだ：ＮｈｅＩ−ＳａｌＩ−ＳｍａＩ−ＮｏｔＩ−ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ−ＳａｃＩ−ＢａｍＨＩ。
このリンカーのヌクレオチド配列（配列番号２）を以下に示す：
５’−ｃｔａ ｇｔｃ ｇａｃ ａａａ ｔａｔ ｔｃｃ ｃｃｇ ｇｇｃ ｇｇｃ ｃｇｃ ｔｔａ ｃｇｔ ａｔｇ ａａｔ ｔｃａ ｇｃｇ ｃｇｃ ｔｔｃ ｔａｇ ａａｃ ｔｃｇ ａｇｔ ｇａｇ ｃｔｃ。
このリンカーの相補鎖のヌクレオチド配列（配列番号３）を以下に示す：
５’−ｇａｔ ｃｇａ ｇｃｔ ｃａｃ ｔｃｇ ａｇｔ ｔｃｔ ａｇａ ａｇｃ ｇｃｇ ｃｔｇ ａａｔ ｔｃａ ｔａｃ ｇｔａ ａｇｃ ｇｇｃ ｃｇｃ ｃｃｇ ｇｇｇ ａａｔ ａｔｔ ｔｇｔ ｃｇａ。
（制限酵素）
もし他に記述がなければ、全ての制限酵素は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から購入された。さらに、全ての制限消化条件は、以下の条件に従って、標準化された：１μｇのＤＮＡを、２０μｌの適切な制限緩衝液中で、５ユニットの制限酵素を１時間かけて使用することで消化した。制限緩衝液は、特定の酵素について製造業者によって特定化され、そしてこの組成物は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）の商品カタログで提供される。
リンカーを導入するために、ｐＡＣＹＣ１７７を、製造業者の指示に従って制限酵素ＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩで消化した。上に示されるようなリンカーは、アガロースゲルで単離され、そしてＧｅｎｅｃｌｅａｎ ｋｉｔ（Ｂｉｏ １０１） （Ｖｉｓｔａ，ＣＡ）を使用して精製したｐＡＣＹＣ１７７の２２０８ｂｐフラグメントで連結される。この工程により、ＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を含むベクターの必須でない領域のみを除去した。
次の工程は、酵母ＵＲＡ３遺伝子を、プロモータおよびＹＡＣを含む酵母細胞の選択のための標的といてコード配列を用いて導入し得る。プロモータおよびコード配列を含むＵＲＡ３遺伝子のＤＮＡ １９７１ｂｐフラグメントは、ｐＴＡＣ４から得られた。これは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）カタログ番号６７３７９（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から利用可能であり、そしてこの配列は、寄託番号＃ＵＯ１０８６を使用してＧｅｎｅｂａｎｋから得られ得る。ＵＲＡ３フラグメントはまた、標的化のために十分な３’相同体を提供する。このプラスミドｐＹＡＣ４を、製造業者の指示に従って、制限酵素（ＳａｌＩおよびＭｓｃＩ）で消化した。同様にベクターとリンカーの組合せ（ｐＡＣＹＣＩ７７／リンカー）を、製造業者の指示に従ってＳａｌＩおよびＳｍａＩで消化した。続いて、この２つの制限酵素ヌクレオチドで消化したＤＮＡ ｐＡＣＹＣ１７７およびＵＲＡ３を、共に連結しさせ、Ｉｎｔ２を生成した。
次の工程により、製造業者の指示に従って、ＸｂａＩおよびＳａｃＩでＩｎｔ２をまず消化することでβガラクトシダーゼ遺伝子（βＧａｌ）を導入し得た。
このβＧａｌ遺伝子を、Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｓｙｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から入手可能なベクターｐＧＫ β Ｇａｌからクローニングした。このＤＮＡ ｐＧＫ β Ｇａｌを、制限酵素（ＸｂａＩおよびＳａｃＩ）で消化した。ｐＧＫ β Ｇａｌ由来の線状化Ｉｎｔ２および２５５３ｋｂフラグメントを共に連結させ、Ｉｎｔ３と呼ばれる次の中間体を産生した。
上のβＧａｌ発現構築物は、不完全である。βＧａｌの欠損部位は、ｐＧＫβＧａｌプラスミドを制限酵素（ＳａｃＩおよびＮｃｏＩ）で消化することによって得られる。ｐＧＫβｇａｌ消化由来の１１６５ｋｂフラグメントを、アガロースゲル電気泳動によって単離した。ここで、このフラグメントを、エチジウムブロミド染色ゲルから切除し、そしてＧｅｎｅｃｌｅａｎ ｋｉｔ（Ｂｉｏ １０１）（Ｖｉｓｔａ，ＣＡ）を上記のように精製した。同様に、Ｉｎｔ３を、製造業者の指示に従って、制限酵素ＳａｃＩで消化した。この線状化Ｉｎｔ３を、アガロースゲル電気泳動により単離した。ｐＧＫβｇａｌ由来の１１６５ｂｐフラグメントおよびこの線状化Ｉｎｔ３を、酵素Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．から市販）を使用して共に連結させた。このＤＮＡフラグメントを再単離し、次いで、末端を平滑末端化するためにＫｌｅｎｏｗフラグメントで処理した。ＳａｃＩ平滑末端に平滑末端化連結する、線状化ＤＮＡを、酵素（ＮｃｏＩ）を使用して環状にし、Ｉｎｔ４を産生する。
（５’相同体の導入）
標的化組換えのための５’ホモログの領域を、３’末端の助けによりＡ−２８７−Ｃ１０ ＹＡＣの配列から単離し、そしてプラスミドｐｐＫＭｌｃへ優先的にクローン化した（Ｍｅｎｄｅｚら，ＮａＬｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６−１５６（１９９７）を参照のこと）。Ａ２８７−Ｃ１０ ＹＭＣを、ヒトＶＨ6遺伝子のＰＣＲプライマーを使用する、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｈｕｍａｎ ＹＡＣ ｌｉｂｒａｒｙ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）からのＤＮＡプールをスクリーニングすることによって単離した。Ａ２８７−Ｃ１０ ＹＭＣの単離および特徴付けを、１９９４年２月３日に刊行された国際特許出願ＷＯ９４／０２６０２（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉら）に詳細に記載した。この開示は、本明細書中で参考として援用されている。
Ｉｎｔ４を、制限酵素（ＮｏｔＩおよびＳｎａＢＩ）で消化し、次いで以下のようなＣａｌｆ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅホスファターゼで処理した：制限消化反応２０μｌ中のＤＮＡ１μｇ、５ユニットのＣａｌｆ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅホスファターゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）。酵素およびＤＮＡを、３０℃で３０分間インキュベートし、次いで、さらに３０分間６５℃で加熱し、ホスファターゼを変性させた。このベクターｐｐＫＭｌｃを、制限酵素（ＥｃｏＲＩ）で消化し、次いでＫｌｅｎｏｗフラグメントで処理して、ＥｃｏＲＩ部位を除去するために平滑末端を作製した。線状化ｐｐＫＭｌｃを、製造業者の指示に従って、制限酵素ＮｏｔＩで単離および消化した。約１ｋｂ５’相同体のフラグメントを、単離した。次に、１ｋｂフラグメントを、ＮｏｔＩおよびＳｎａＢＩで消化したＩｎｔ４と共に連結した。このＤＮＡ調製物を、Ｉｎｔ５と呼ぶ。
γ１およびγ４ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ２およびＣＨ３コードエキソン、膜貫通エキソンおよび下流の配列の約３ｋｂ（それぞれ約７ｋｂ）を、ｐＢＲ３２２由来の２つの中間体ＤＮＡを介して、組換えベクターに導入した。
第１に、ｐＢＲ３２２を、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、Ｃａｌｆ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅホスファターゼ（ＣＩＰ）で処理し、そしてＰ１クローン♯１７３７（Ｇ１）由来のγ１配列を含む、約７ｋｂＨｉｎｄＩＩＩフラグメントと連結した。Ｐ１ファージクローンをＧｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。この結果、中間体プラスミドｐＣＧ１２を得た。
第２中間体を、制限酵素（ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ）でｐＢＲ３２２を消化することによって構築した。この３９８６ｋｂフラグメントを、Ｃａｌｆ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅホスファターゼで処理し、そしてＧｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入したＢＡＣクローン＃１７６Ｅ１０由来のヒトγ４配列を含む約７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩフラグメントで連結した。この中間体プラスミドをｐＣＧ４３を呼ぶ。
標的化ベクターの構築物を完成させるために、新規なリンカーを、Ｉｎｔ５のＸｂａＩ制限部位にクローン化した。このリンカーは、以下の制限部位を有した：ＸｂａＩ・ｋｉｌｌ−Ｍｆｅｌ−ＳｓｐＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｎａＢＩ−ＢｃｌＩ−ＸｈｏＩ−ＭｌｕＩ−Ｘｂａ・ｋｉｌｌ。その部位にクローン化されたリンカーを有するＩｎｔ５を、Ｉｎｔ６と呼ぶ。このリンカー配列番号４を、以下に示す：
５’ｃｔａ ｇｇｃ ａａｔ ｔｇａ ｔａａ ｔａｔ ｔａａ ｇｃｔ ｔｔａ ｃｇｔ ａｔｃ ｔｇａ ｔｃａ ｔｃｃ ｔｃｇ ａｇａ ｃｇｃ ｇｔｇ相補鎖配列（配列番号５）：
５’ｃｇｔ ｔａａ ｃｔａ ｔｔａ ｔａａ ｔｔｃ ｇａａ ａｔｇ ｃａｔ ａｇａ ｃｔａ ｇｔａ ｇｇａ ｇｃｔ ｃｔｇ ｃｇｃ ａｃｇ ａｔｃ。
このリンカーは、以下のＩｎｔ６において得られた：
Ａ２８７−ＳｎａＢＩ（ｅｘ）−ＥｃｏＲＩ−ＢｓｓＨＩＩ−ＸｂａＩ（ｅｘ）−ＭｆｅＩ−ＨｉｎｇＩＩＩ−Ｂｃ１Ｉ−ＸｈｏＩ−Ｍ１ｕＩ−ｐＧＫ−β Ｇａｌ。
制限部位ＸｂａＩ・ｋｉｌｌは、特定のＸｂａＩ部位を、大きなＤＮＡへの連結の際に排除されることを示す。このリンカーは、容易に消化されるので、その結果、このリンカーは、ＸｂａＩ部位に連結し得るが、この部位は、連結を切り抜けられない。リンカーを含む特定のＸｂａＩ部位を、リンカーを第１にクローン化することによって決定し、次いで、以下の組みの制限酵素の各々でＤＮＡを消化した：ＮｏｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ；ＸｂａＩおよびＳｐｈＩ；ならびにＭｌｕｌおよびＳｐｈＩ。このリンカーの導入により、１つのＸｂａＩ部位を除去する。Ｉｎｔ６のリンカーの位置を、新しく誘導したＨｉｎｄＩＩＩ部位とＩｎｔ５に存在したＮｏｔＩ部位との間の距離によって決定した。
（マウスγ１スイッチ領域のクローン化）
プラスミドＥＨ１０は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｈｉｇａｎから得られ、そしてこれは、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩフラグメント上のマウスのγ１スイッチ領域を含む、ＢＲ３２２２ベースのプラスミドである（Ｍ．Ｒ． Ｍｏｗａｔｔら，Ｊ．Ｉｎｎｕｎｏｌ．１３６：２６４７−２６８３（１９８３））。このプラスミドを、制限酵素（ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ）で消化し、そしてマウスγ１スイッチを含む１０ｋｂのフラグメントを、上記のように単離し、そして精製した。
（ｐＭＳＬ４の構築物）
ｐＭＳＬ１の構築物は、３つの方法の連結を含む。第１のエレメントは、上記のようにＥＨ１０を消化するＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩから単離したマウスγ１スイッチを含む１０ｋｂのフラグメントであった。第２のエレメントは、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化されたｐＢＲ３２２であった。最終のエレメントは、約７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩフラグメント上のヒトγ４を含む、ｐＢＲ３２２ベースのプラスミド（ｐＣＧ４３）であった。３つの全ては、ｐＭＳＬ４を生成するために共に連結される。
（ｐＭＳＬ１の構築）
ｐＭＳＬ１の構築物はまた、３つの方法の連結を含む。第１のエレメントは、上記のようにＥＨ１０を消化するＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩから単離したマウスγ１スイッチを含む１０ｋｂのフラグメントであった。第２のエレメントは、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化されたｐＢＲ３２２であった。最終のエレメントは、ヒトγ１の約７ｋｂフラグメントを含むｐＢＲ３２２ベースのプラスミドｐＣＧ１２であり、これは、ＨｉｎｄＩＩＩ ｋｉｌｌ−ＨａｍＨＩリンカーを７ｋｂフラグメントの３’末端上のＨｉｎｄＩＩＩ部位に導入することによって改変された。このようにして、改変したプラスミドは、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩと共に２重で消化した後、７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを放出する。続いて、フラグメントを３ピースの連結に使用する。
（マウスの３’エンハンサー）
本発明者らは、ｐＩＢにクローン化したマウス３’エンハンサー（ＨＳＩｇ２）を含むｐＩＢγ２の４ｋｂ標的化ベクターのＭＩｕＩフラグメント由来のＳｔｕＩ制限消化により、エンハンサーの０．９ｋｂのコア部分を単離した（Ｍ．Ｊ．Ｍｅｎｄｅｚら，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１５：１４６−１５６（１９９７））。
本発明者らは、Ｉｎｔ６を、制限酵素ＸｈｏＩで消化し、続いて、Ｋｌｅｎｏｗフラグメントで処理し、平滑末端を作製した。本発明者らは、得られた線状化Ｉｎｔ６をマウス３’エンハンサーの０．９ｋｂのＳｔｕＩフラグメントで連結し、Ｉｎｔ７を作製した。本発明者らは、ＥｃｏＲＩを使用してサンプルクローンで制限消化を実施することによってクローン化反応を確認した。さらに、本研究者らは、ＮｃｏＩ；ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ；ならびにＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｖｕＩＩおよび０．９ｂｐ ＳｔｕＩフラグメントの公知の制限地図で消化することによるフラグメントの所望の起点を確認した。
本発明者は、別のリンカーをプラスミドＩｎｔ７に導入した。本発明者らは、ＭｆｅＩおよびＳｎａＢＩ（２重消化）でＩｎｔ７を消化し、続いて、Ｃａｌｆ Ｉｎｓｔｅｓｔｉｎｅホスファターゼで処理した。次に、本発明者らは、連結反応を実施し、そして中間体Ｉｎｔ８を作製することによって以下のリンカーを導入した。リンカーＩｎｔ７によって挿入される制限部位は、以下のようであった：ＭｆｅＩ・ｋｉｌｌ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｎａＢＩ−ＢｃｌＩ−ＢｇｌＩＩ−Ｂａｍ ＨＩ−Ｂｇ１ＩＩ−ＮｈｅＩ・ｋｉｌｌ。さらに、ＭｆｅＩ・ｋｉｌｌは、ＭｆｅＩ部位が、大きなＤＮＡへの連結で排除されたことを示した。
このリンカーのヌクレオチド配列（配列番号６）：
５’ａａｔ ｔａａ ｇｃｔ ｔｇｔ ａｃｇ ｔａｃ ｔｇａ ｔｃａ ａｇａ ｔｃｔ ｇｇａ ｔｃｃ ａｇａ ｔｃｔ。
相補鎖のヌクレオチド配列（配列番号７）：
５’ａｇａ ｔｃｔ ｇｇａ ｔｃｃ ａｇａ ｔｃｔ ｔｇａ ｔｃａ ｇｔａ ｃｇｔ ａｃａ ａｇｔｔ。
（標的化ベクター）
完全標的化ベクターを、制限酵素（ＳｃｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ）でＩｎｔ８を消化することによって構築し、続いて、Ｃａｌｆ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅホスファターゼで処理した。このプラスミドｐＭＳＬ１およびｐＭＳＬ４を、制限酵素（ＳｃｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ）で部分的に消化した。１７ｋｂのフラグメントを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により単離した。精製した１７ｋｂフラグメントを、Ｉｎｔ８で連結し、図５に示されるような最終標的化ベクターを作製した。
（実施例２）
（ｙＨ１Ｃ ＹＡＣのγ１またはγ４構築物の標的化）
ＴＶ１またはＴＶ４ベクター（５μｇＤＮＡ）を、制限酵素（ＮｏｔＩ）で消化することによって線状化した（図５）。このＤＮＡをフェノール抽出によって精製し、続いてフェノール／クロロホルム抽出によって精製した。次いで、ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、次いで、ＬｉＡｃ形質転換プロトコールを使用してｙＨＩｃ ＹＡＣを含む酵母クローンの形質転換に使用した（Ｓｃｈｉｅｓｔｌ，Ｒ．Ｈ．ら，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６，３３９−３４６（１９８９）を参照のこと）。形質転換物をＳＣ−ＵＲＡ寒天培地プレート上にプレート化し、そしてコロニーが現れてくるまで（すなわち、約５〜６日間）、２２℃でインキュベートした。ＳＣ−ＵＲＡプレートは、酵母の増殖のための培地を含み、この酵母は、ウラシルを含まないので、ウラシル自体を産生し得る酵母コロニーのために選択する。同様に、ＳＣ−ＬＹＳプレートは、酵母の増殖のための培地を含み、この酵母は、リジンを含まず、リジン自体を産生し得る酵母コロニーのために選択する。得られたコロニーをＳＣ−ＵＲＡプレートおよびＳＣ−ＬＹＳプレート上に再び収集し（遺伝子試験のため）、ＬＹＳマーカーの欠損について調べた。ＳＣ−ＵＲＡ上で増殖しそしてＳＣ−ＬＹＳ上で増殖しない唯一のクローンを、ＹＰＤＡ培地中、２２℃で４８時間かけて増殖させた。ＹＡＣ ＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって単離および分析し、所望のアイソタイプ置換が予想通りに生じるかどうかを評価した。この場合、ヒトγ１またはγ４ＣＨエキソンが、ヒトγ２ＣＨコードエキソンで置換されるべきである（図１）。ここで使用される酵母培地は、ＢＩＯ １０１（Ｖｉｓｔａ，ＣＡ）から得られる捕捉物から調製された。
このアッセイに使用するためのＰＣＲプライマーは、以下の通りであった：
ＨＧＩ：５’ｃａｃ ａｃｃ ｇｃｇ ｇｔｃ ａｃａ ｔｇｇ ｃ （配列番号８）
ＨＧ３：５’ｃｔａ ｃｔｃ ｔａｇ ｇｇｃ ａｃｃ ｔｇｔ ｃｃ （配列番号９）。
ＰＣＲ反応は、以下の３５サイクルからなる：１サイクルにおき、９４℃で１５秒間、続いて６０℃で４５秒間、次いで７２℃で９０秒間。ＨＧ１プライマーは、コンセンサスヒトＣγ１、Ｃγ２、Ｃγ４アライメント上のヌクレオチド１８１に配置された。そしてプライマーＨＧ３は、このアライメントのヌクレオチド９９４に配置された。これらのプライマーは、Ｃγ１、Ｃγ２、およびＣγ４アイソタイプ由来のＤＮＡを増幅する。
ヒトＣγ遺伝子において制限部位多型に起因して、テンプレートＤＮＡの特定のアイソタイプは、ＤＮＡフラグメントの独特のセットを得るために、ＰＣＲ産物の制限消化により決定され得る。例えば、この制限酵素ＰｖｕＩＩは、Ｃγ２ＤＮＡがＰＣＲ産物のテンプレートである場合、ＰＣＲ産物を６２１ｂｐおよび１９６ｂｐの２つのフラグメントに制限するが、Ｃγ１またはＣγ４がテンプレートである場合、この産物を切断しない。同様に、この制限酵素Ｅｃｏ４７ＩＩＩは、Ｃγ１が得られる場合、ＰＣＲ産物を４３８ｂｐおよび３７９ｂｐの２つのフラグメントへ制限する。最後に、この制限酵素Ｂｇ１ＩＩは、Ｃγ４が得られる場合、ＰＣＲ産物を６８６ｂｐおよび１２５ｂｐの２つのフラグメントへ制限する。この方法において、ＩｇＧの全３種類のイソタイプが識別され得る。
特徴付けの次のレベルにおいて、正確な遺伝子および所望のＩｇＧイソタイプを示す全ての酵母クローンを、サザンブロットアッセイによってさらにスクリーニングした（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋら Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第９章，３１−４５頁，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））。各クローンについてＤＮＡの５μｇの試料を、制限酵素（ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍ ＨＩ）で一晩消化した。置換ベクター上で起点標的として役立つｙＨＩＣ ＹＡＣ ＤＮＡをプロトコールとして使用した。この消化したＤＮＡを、０．８％のアガロースゲル上で分離し、エチジウムブロマイドで染色し、撮影し、次いでナイロン膜上で移動させた（Ｇｅｎｅ Ｓｃｒｅｅｎ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｍｅｍｂｒａｎｅ，ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）。次に、ＹＡＣ候補物を、以下のＩｇ遺伝子由来のハイブリダイゼーションプローブを使用するサザンブロットでチェックした：Ｄ，ｍｕ，Ｊ，Δ，マウス３’エンハンサー，Ｃｇｌ，４，Ｖ１−６（Ｍ．Ｊ．Ｍｅｎｄｅｚら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２６，２９４−３０７（１９９５）；Ｍ．Ｊ Ｍｅｎｄｅｚら，Ｎａｔｕｒｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ第１５巻，１４６〜１５６ （１９９７）（Ｖ３プローブ）を参照のこと）。
以下のプローブを、サザンブロットに使用した：
ＨＧ１：ＣＡＣ ＡＣＣ ＧＣＧ ＧＴＣ ＡＣＡ ＴＧＧ Ｃ （配列番号８）；
ＨＧ３：ＣＴＡ ＣＴＣ ＴＡＧ ＧＧＣ ＡＣＣ ＴＧＴ ＣＣ （配列番号９）。
これらのプライマーは、γ１，２，および４に対して約８２０ｂｐフラグメントを増幅する。いずれも、非常に相同性である場合にプローブとして使用され得る。
ＶＨ５を増幅するために、以下のプライマーを使用した：
ＶＨ５Ａ：５’ＧＴＣ ＧＡＣ ＧＧＧ ＣＴＣ ＧＧＧ ＧＣＴ ＧＧＴ ＴＴＣ ＴＣＴ（配列番号１０）
ＶＨ５Ｂ：５’ＧＧＧ ＣＣＣ ＴＧＡ ＴＴＣ ＡＡＡ ＴＴＴ ＴＧＴ ＧＴＣ ＴＣＣ（配列番号１１）。
ＨＰＲＴのために以下のプライマーを使用した：
ＲＥＰ３：５’ＣＴＧ ＧＡＧ ＴＣＣ ＴＡＴ ＴＧＡ ＣＡＴ ＣＧＣ Ｃ （配列番号１２）
ＲＥＰ４：５’ＧＧＴ ＴＣＴ ＴＴＣ ＣＧＣ ＣＴＣ ＡＧＡ ＡＧＧ （配列番号１３）。
そして最後にＣｍｕを増幅するために以下のプライマーを使用した：
Ｊｍ１：５’ＧＣＴ ＧＡＣ ＡＣＧ ＴＧＴ ＣＣＴ ＣＡＣ ＴＧＣ （配列番号１４）
Ｊｍ４：５’ＣＣＣ ＣＡＧ ＴＴＧ ＣＣＣ ＡＧＡ ＣＡＡ ＣＧＧ （配列番号１５）。
最後に、本発明者らは、ＣＨＥＦゲルパルス−フィールドゲル電気泳動を使用するＹＡＣの一般構造の完全な状態を確認した（ＣＨＥＦ ＤＲ−ＩＩ，Ｂｉｏ Ｒａｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）。
本発明者らは、ｙＨ２ＢｍとしてＹＡＣコードＣγ１およびｙＨ２ＣｍとしてＹＡＣコードヒトＣγ４を消化した。
（実施例３）
（ｙＨＩＣ ＹＡＣをγ１（ＴＶ Ｇ１）およびｙ４（ＴＶ Ｇ４）にレトロフィッティングするためのベクターの構築）
ｙＨ１Ｃ ＹＡＣをｙＨＧ１およびｙＨＧ４にレトロフィット（ｒｅｔｒｏｆｉｔ）する標的化ベクターを調製するためのベクター構築は、図６に概略的に示される。この標的化ベクターは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．（Ｖｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）から入手可能なｐＡＣＹＣ１７７（Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＃Ｘ０６４０２）の骨格上に構築した。本発明者らは、リンカーをｐＡＣＹＣ１７７に導入して、マウス３’エンハンサーのクローニングを促進した。本発明者らは、このリンカーを含むｐＡＣＹＣ１７７をＩｎｔ９と称した。このリンカー中の制限酵素クローニング部位の配置は、以下の通りである：ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ−ＭｌｕＩ−ＰａｃＩ−ＦｓｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ。リンカーヌクレオチド配列（配列番号１６）を以下に示す。
５’ａｇｃ ｔｔｇ ｔｃｇ ａｃａ ｃｇｃ ｇｔｔ ｔａａ ｔｔａ ａｇｇ ｃｃｇ ｇｃｃ ａ
相補鎖のヌクレオチド配列（配列番号１７）：
５’ ａｇｃ ｔｔｇ ｇｃｃ ｇｇｃ ｃｔｔ ａａｔ ｔａａ ａｃｇ ｃｇｔ ｇｔｃ ｇａｃ ａ
本発明者らは、ｙＨＩＣ標的化ベクターからマウス３’エンハンサーを約４ｋｂ ＭｌｕＩフラグメントとしてクローン化した。４ｋｂ エンハンサーフラグメントは、上で示されるリンカーで修飾されたｐＡＣＹＣ１７７のＭｌｕＩにクローン化され、そしてＤＮＡは、Ｉｎｔ １０と称される。マウス３’エンハンサーの適切な配置は、制限酵素ＮｇｏＭＩおよびＥａｇＩで予測クローンを消化することにより決定した。
（５’相同性領域の増幅）
５’相同性の領域は、ｐＩＢγ２標的化ベクターの関連部分のＰＣＲ増幅により得られた［Ｍ．Ｒ．Ｍｏｗａｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６：２６４７〜２６８３（１９８３）］。５’相同性領域を増幅するために使用されるプライマーのヌクレオチド配列は、以下である（Ｇｅｎｅｂａｎｋ登録番号Ｍ１２３８９を参照のこと）：
プライマー１：５’ｔｇｇ ｔｇｇ ｃｃｇ ａｇａ ａｇｇ ｃａｇ ｇｃｃ ａ（配列番号１８）
プライマー２：５’ｃｃｇ ｃｇｇ ｇｃａ ｔｇｃ ａａｃ ｔｔｃ ｇｔａ ｔａａ ｔｇｔ ａｔｇ ｃｔａ ｔａｃ ｇａａ ｇｔｔ ａｔｔ ｇｔｇ ｇｇａ ｃａｇ ａｇｃ ｔｇｇ ｇｃｃ ｃａｇ ｇ（配列番号１９）
プライマー２は、ＳａｃＩＩおよびＳｐｈＩ部位、ならびにｌｏｘ ｐエレメントを含む。５’相同性領域を、以下のＰＣＲ条件を使用して、ＰＣＲ増幅した：９４℃で３秒間、続いて５５℃で３０秒、次いで７２℃で６０秒を２０サイクル。次いで、この領域を、ＴＡ−ＴＯＰＯベクターにクローニングした後、配列決定した。ＴＡ−ＴＯＰＯは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から入手可能である。
５’相同性配列決定のためのプライマーを以下に示す：
配列１：ｇｔｃ ｔｇｇ ｃｃｃ ｃｔｃ ｔｇｃ ｔｇｃ（配列番号２０）
配列２：ｃａｃ ｃｃａ ｔａａ ａａｇ ｇｃｔ ｇｇａ（配列番号２１）
逆配列１：ａｃｇ ｇｃｔ ｃａｔ ｇｃｃ ｃａｔ ｔｇｇ（配列番号２２）
逆配列２：ｔａｇ ｔｇａ ｇｔｇ ｇｇｃ ｃｔｇ ａｃｔ（配列番号２３）。
本発明者らは、得られた配列を、ヒトスイッチγ２配列（Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＃Ｕ３９９３４）と比較して、これが同一であることを決定した。
（γ４コード領域および３’相同性領域のクローニング）
本発明者らは、制限酵素ＳａｃＩＩを使用して、プラスミドｐＣＧ４３の部分酵素消化を行うことにより、ヒトγ４コードエキソンおよび３’相同性領域を得た。次いで、本発明者らは、制限酵素ＢａｍＨＩを用いてプラスミドｐＧＳ４３を消化し、そして本発明者らは、精製した約７ｋｂのフラグメントを、５’相同性を含むＴＡベクターにクローン化した。本発明者らは、この中間体組換えＤＮＡ分子を、ＩｎｔＩ Ｇ４と称した。
ＩｎｔＩ Ｇ４を、ＢａｍＨＩで消化し、子ウシ腸ホスファターゼで処理し、次いでベクターをアガロースゲル電気泳動を使用して単離した。この単離したベクターを、前に記載されるように、ｐＩＢ γ２由来の３．４ｋｂ ＢａｍＨＩフラグメントに連結した。挿入物の配置は、二重消化物のＮｏｔＩ／ｈｉｎｄＩＩＩにより決定した。ＨｉｎｄＩＩＩ部位は、消化後のフラグメントのサイズにより決定されるように、３．４ｋｂ ＢａｍＨＩフラグメントの５’末端にあることが決定された。
次に、本発明者らは、ｐＡＣＹＣ１７７／エンハンサープラスミド中のリンカーの配向を決定する必要があった。これは、ＳｍａＩ、および以下の二次酵素、ＳａｌＩ、ＭｌｕＩ、ＰａｃＩおよびＦｓｅＩの各々のうちの１つを使用して、ｐＡＣＹＣ１７７／リンカーの二重消化のパネルを調製することにより、行った。リンカーの配向は、得られたフラグメントのサイズにより決定した。
ｐＡＣＹＣ１７７／エンハンサープラスミド中の制限部位の位置は、以下のとおりである：ＣｌａＩ／ＳｍａＩ（ｐＡＣＹＣ１７７）−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＦｓｅＩ−ＰａｃＩ−ＭｌｕＩ−（（エンハンサー：ＰｓｔＩ−ＰｖｕＩＩ−ＥｃｏＲＩ−ＮｃｏＩ−ＮｈｅＩ−ＡｐａＩ））−ＭｌｕＩ−ＳａｌＩ）−ＰｆｍｌＩ（ｐＡＣＹＣ１７７）。
次の工程は、ＵＲＡ３遺伝子をｐＡＣＹＣ１７７／エンハンサープラスミドにクローン化することであった。この目的は、標的化ベクターを、選択可能な酵母マーカー、ならびに相同組換えを誘導する３’相同性とレトロフィットすることである。ＵＲＡ３遺伝子をクローン化するために、Ｉｎｔ２（実施例１に記載される、本来のＴＶ１およびＴＶ４について構築される）を、ＳａｃＩＩ／ＳａｌＩを使用して消化した。同様に、ｐＡＣＹＣ１７７／エンハンサープラスミドを、ＳａｃＩＩ／ＳａｌＩで消化した。Ｉｎｔ２の消化による３．８ｋｂフラグメント、およびｐＡＣＹＣ１７７／エンハンサー由来の５ｋｂフラグメントを、アガロースゲル電気泳動で単離し、そして一緒に連結した。得られたプラスミドは、ｐＡＣＹＣ１７７骨格中に、エンハンサーおよびＵＲＡ３遺伝子を含む。次に工程は、２つ以上のリンカーを、クローン化された３．４ｋｂ Ｍａｂ ＨＩフラグメントを有するＩｎｔ１ Ｇ４に導入することであった。得られた中間体を、Ｉｎｔ２ Ｇ４と称した。
リンカーは、以下のとおりである：ＮｏｔＩｋｉｌｌ−ＦｓｅＩ−ＮｏｔＩｋｉｌｌ、およびリンカー配列：
ＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＧＣＣＡＴ（配列番号２４）
ＴＡＣＣＧＧＣＣＧＧＴＡＣＣＧＧ（配列番号２５）
第２のリンカーは、以下の制限部位を有した：
ＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＶ−ＭｆｅＩ−ＦｓｅＩ−ＳｆｉＩ−ＢａｍＨＩｋｉｌｌ：
Figure 2011087594
リンカー１を導入する目的は、最後のクローニング工程のためのＦｓｅＩを提供することならびにＮｏｔＩ部位の１つのを排除することであった。さらに、これは特有のＮｏｔＩ部位を有する最終標的化ベクターを残し、これは、形質転換前にこの標的化ベクターを線状化するために使用した。第２のリンカーを使用して、ｙＨ１Ｃ ＹＡＣの完全下流領域を回復するために必要な最後のフラグメント、１．５ｋｂのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントをクローン化した。
リンカー２を、Ｂａｍ ＨＩを用いる部分消化により導入した。ＩｎｔＩ Ｇ４（クローン化された３．４ｋｂ ＢａｍＨＩフラグメントを有する）を、ＢａｍＨＩで部分的に消化し、そして部分消化物を１３ｋｂフラグメントとしてアガロースゲルで単離した。この１３ｋｂフラグメントを、子ウシ腸ホスファターゼで処理し、そしてリンカーに連結した。このリンカーの位置およびその配向（これが３．４ＢａｍＨＩフラグメントの３’末端においてＢａｍＨＩを修正したか否か）は、ＭｆｅＩおよびＮｏｔＩでクローンを消化（二重消化）することにより決定した。ＭｆｅＩ部位は、リンカーと共に導入され、そしてＮｏｔＩ部位はベクター中に存在する。相対的なフラグメントのサイズにより、リンカーの位置および配向を同定し得る。リンカーとレトロフィッティングされたプラスミドは、ここでは、Ｉｎｔ３ Ｇ１およびＩｎｔ３ Ｇ４である。
次の工程は、ｐＩＢγ２プラスミドのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ二重消化により得た１．５ｋｂ フラグメントをＩｎｔ３ Ｇ４プラスミドにクローン化することである。この１．５ｋｂフラグメントを、Ｉｎｔ３ Ｇ４のＢａｍＨＩ部分消化物／ＭｆｅＩ消化物にクローン化した。これは指向性クローニングであったため、配向決定はこの工程で必要なかった。得られたプラスミドをＩｎｔ４ Ｇ４と称した。
次の工程は、制限部位ＮｏｔＩｋｉｌｌ−ＦｓｅＩ−ＮｏｔＩＫｉｌｌでリンカーを導入することであった。Ｉｎｔ４ Ｇ４をＮｏｔＩで消化し、子ウシ腸ホスファターゼで処理し、アガロースゲルで単離し、そしてリンカーと連結した。得られたプラスミドをＩｎｔ５ Ｇ４と称した。また、この工程でリンカーの配向を決定する必要はなかった。結果として、特有のＮｏｔＩ部位は排除され、そして１つのＦｓｅＩ部位が加わった。ＦｓｅＩ部位の導入の目的は、５’相同性領域から１．５ｋｂフラグメントにわたるフラグメントのｐＡＣＹＣ１７７／エンハンサー／ＵＲＡ３プラスミドへのクローニングを可能にすることである。
最終のクローニング工程は、Ｉｎｔ５ Ｇ４のＦｓｅＩでの部分消化、続いてアガロースゲルによる１３ｋｂフラグメントの単離、およびｐＡＣＹＣ１７７／エンハンサー／ＵＲＡ３の特有のＦｓｅＩ部位への連結であった。この挿入物の配向は、ＮｏｔＩ／ＦｓｅＩを用いる二重制限消化により決定した。最終の標的化ベクターをＴＶ Ｇ４と称した。
ヒトＣγ１コードエキソンおよび３’相同性領域とｙＨ１Ｃ ＹＡＣをレトロフィッティングするＴＶＧ１標的化ベクターを構築するために、本発明者らは、ＴＶ Ｇ４の構築のための上記の手順を使用した。本発明者らは、プラスミドｐＣＴ１２からＣγ１コードエキソンおよび３’相同性領域を得た。
（実施例４）
（非同種スイッチのためのｙＨ１Ｃ ＹＡＣを標的化するための標的化ベクターＴＶ Ｇ１／２およびＴＶ Ｇ４／２の構築）
次に、本発明者らはベクター、ＴＶ Ｇ１／２を構築し、これは５ｋｂのヒトスイッチγ２領域ＤＮＡの下流に結合したヒトγ１ＣＨコードエキソンのキメラ構築物を有する（図３）。さらに、このベクターは、γ１ＣＨコードエキソンの３’に位置するヒトγ２膜貫通エキソンを含む（図３）。このベクターはｐＡＣＹＣ１７７ベクターに基づき、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）から入手可能である。本発明者らは、以下の手順を使用して、このベクターを構築し、これをＴＢ Ｇ１／２と称した：
１． 第１に、５μｇのｐＩＢγ２を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、そして６．５ｋｂフラグメントをアガロースゲルで単離した。湖のベクターＰＩＢγ２は、２つのＥｃｏＲＩ制限酵素部位に隣接したγ２を有するヒトゲノムＤＮＡを含み、以前はにｙＨ１Ｃを生成するために使用された。次いで、６．５ｋｂフラグメントをｐＣＲTM２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））に連結した。ｐＣＲ２．１は、１μｇのプラスミドをＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そして子ウシ腸ホスホターゼで処理し、そしてアガロースゲルで単離することによって調製した。
２． 得られたプラスミド（６．５ｋｂフラグメント＋ｐＣＲTM２．１ベクター）を、制限酵素ＸｍｎＩを用いる部分消化に供し、次いで制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩを用いる消化に供した。ＸｍｎＩを用いる消化はγ２終止コドンの７５ｂｐ上流で起こる。従って、γ１／γ２キメラ遺伝子の４番目のエキソンは、初期に、２つの３’γ２膜エキソンに加えて、γ２の７５ｂｐを含む。γ１およびγ２のコード領域は、この７５ｂｐ領域にわたって同一であり、効果はない。
３． 次に、５μｇのｐＣＧ１２を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｍｎＩで消化し、そして１．７ｋｂフラグメントをアガロースゲル電気泳動により単離した。ベクターｐＣＧ１２（これは実施例１に記載される）は、約７ｋｂのヒトγ１を含む。
４． ｐＣＧ１２から得られるγ１のコード配列のほとんどを含む１．７ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｍｎＩフラグメントを、工程２に記載されるＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｍｎＩで部分消化したベクター（６．５ｋｂフラグメント＋ｐＣＲTM２．１ベクター）に連結した。
５． 得られるプラスミドは、膜貫通エキソンを含むγ２の下流領域に結合したγ１のコード領域のキメラ配列を含む。本発明者らは、Ｅｃｏ４７ＩＩＩを用いて制限消化することによって、プラスミドの組成を確証した。
６． 実施例３に記載されるクローン化された５’相同性を有するｐＣＲTM２．１ベクターを、ＳａｃＩＩおよびＢａｍＨＩで消化した。同様に、本発明者らは、工程５に記載されるプラスミドを、ＳａｃＩＩおよびＢａｍＨＩで消化（二重消化）し、そして約５ｋｂフラグメントをこのプラスミドから５’相同性を有するｐＣＲ２．１ベクターにクローン化した。次いで、本発明者らは、得られたベクターをＳａｃＩＩおよびＳａｃＩＩで消化し、そして実施例５に記載されるベクターから得られたこの部位のフラグメントにクローン化した。本発明者らは、ＳｐｈＩ消化物によって、このＳａｃＩＩ挿入物の配向を決定した。得られたプラスミドは、ｐＣＲ２．１ベクターの５’相同性の領域から下流にキメラγ１／γ２ＣHエキソンを含んだ。本発明者らはこのベクターをＴＡ Ｇ１／２と称し、このベクターはＴＡクローニングベクターとして公知の、ｐＣＲ２．１から誘導され、そしてキメラγ１／γ２ＣHエキソンを含むことを示す。
７． 本発明者らは、工程６に記載されるクローン化された５’相同性を有するｐＣＲＴＭ２．１ベクターを、以下のように、酵母選択性マーカー遺伝子、ＵＲＡ３にレトロフィッティングした：
ａ． 本発明者らは、Ｉｎｔ２（実施例１に記載される）をＳａｌＩで消化することによってＵＲＡ３遺伝子を得た。ＳａｌＩ消化の産物を、Ｋｌｅｎｏｗフラグメントとのさらなる反応に供し、平滑末端を作製する。これらの産物を、ＳａｃＩで連続して消化する。
ｂ． 工程６で産生したｐＣＲTM２．１ベクターを、ＢａｍＨＩで消化し、次いでＫｌｅｎｏｗフラグメントで平滑末端化し、そしてさらにＳａｃＩで消化した。
ｃ． ７（ａ）で得られたＵＲＡ３遺伝子を、７（ｂ）のように、調製されたｐＣＲＴＭ２．１ベクターに連結した。得られたベクターは、ＮｏｔＩ部位（一方はＩｎｔ２におけるリンカー由来であり、他方はｐＣＲ２．１中に本来存在する）が隣接したＵＲＡ３遺伝子の下流を有する５’相同性領域を含む。
８． 本発明者らはＮｏｔＩフラグメントを工程７で産生したプラスミドから切除し、そしてこれをＩｎｔ１（ＴＶ１および４のクローニングのためにも使用される）のＮｏｔＩ部位にクローン化した。本発明者らは、このＮｏｔＩフラグメントの正確な配向を、ＥｃｏＲＩ消化物を使用することによって決定した。得られたプラスミド（本発明者らはＩｎｔ３を消化した）は、低コピー起源バックグランド（ｐＡＣＹＣ１７７）中にＵＲＡ３遺伝子の下流を有する５’相同性領域を有する。
９． Ｇ１／２キメラＹＡＣに対する最終標的化ベクターの構築を終了するため、本発明者らは、ｐＣＲ２．１バックグラウンド（工程６で産生される）内にクローン化された５’相同性およびＧ１／２キメラＩｇＧ定常領域を有するベクターを、ＥｃｏＲＩ制限酵素で部分消化し、続いてＳａｃＩ制限酵素で再切断した。本発明者らは、５’相同性領域およびキメラｇ１／２ ＩｇＧ定常領域を含む８Ｋｂフラグメントを単離し、それをＩｎｔ３のＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩ部位にクローン化し、これによりＴＶ Ｇ１／２標的化ベクターが生じた。本発明者らは指向性クローニングによりフラグメントを導入したため、挿入物の配向を決定する必要はなかった。
あるいは、工程７の後、本発明者らは、５’相同性およびＵＲＡ３遺伝子を、ＸｂａＩで消化することによって、工程７で記載されるプラスミドから除去した。次いで、本発明者らは、５’相同性およびＵＲＡ３遺伝子を、工程６に記載されるプラスミドのＸｂａＩ部位にクローン化し、図７に示されるＴＶ Ｇ１／２ベクターを産生した。
本発明者らは、いくらか改変した上記の手順を使用してＴＶ Ｇ４／２標的化ベクターを構築し、これは、５ｋｂのヒトスイッチγ２領域ＤＮＡおよびヒトγ２ＣＨコードエキソンの上流に連結したヒトγ４コードエキソンを有するキメラ構築物を有する。
工程１で産生されたプラスミドを、制限酵素ＸｍｎＩを用いる部分消化に供し、続いて制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化した。ＸｍｎＩによる消化はγ２終止コドンの７５ｂｐ上流で起こる。従って、γ４／γ２キメラ遺伝子の４番目のエキソンは、初期に７５ｂｐのγ２を、２つの３’γ２膜エキソンに加えて含む。この領域において、γ４とγ２との間の単一の塩基対の差違が存在し、これは単一のアミノ酸の変化を生じる。これを修正するために、本発明者らはＣｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）製のＤｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを使用して、ヒトγ２遺伝子において、ＣからＴの特定部位の突然変異誘発を行う。
本発明者らは、以下の２つの合成オリゴヌクレオチドを使用して修復を行う：
一方は、配列をγ２からγ４にスイッチするために必要なヌクレオチドを置換し、そしてｐＣＲ２．１ベクター中のＮｏｔＩ部位を排除する補助的なオリゴヌクレオチドは、キメラＧ４／２ ７ｋｂフラグメントをクローン化する。
ＣをＴで置換するために、本発明者らは以下のオリゴヌクレオチドを使用する：
Figure 2011087594
太字のＴ残基は、もとのプラスミドにおいてＣを置換する。
第２のオリゴヌクレオチド（ＮｏｔＩ部位を排除する）は、以下である：
Figure 2011087594
このオリゴは、ＮｏｔＩ部位（太字で示される）を含み、ここでＧは、Ａで置換され、この部位を切断する。本発明者らは、プラスミドの対を配列決定して、正確なヌクレオチドが置換されたことを確認する。
（実施例５）
（標的化ストラテジー）
本発明者らは、上記ベクターＴＶ１、ＴＶ４、ＴＶ Ｇ１、ＴＶ Ｇ４、ＴＶＧ １／２およびＴＶ Ｇ４／２を線状化し、そしてこれらを使用して、ｙＨ１Ｃ ＹＡＣを有する酵母細胞培養物を、酢酸リチウム形質転換によって、形質転換した。本発明者らは、引き続いて、これらの線状化したベクターを使用して、上記のようにｙＨ１Ｃ上の標的化遺伝子を置換して、新たなＹＡＣであるｙＨ２Ｂｍ、ｙＨ２Ｃｍ、ｙＨＧ１、ｙＨＧ４、ｙＨＧ１／２およびｙＨＧ４／２を、それぞれ産生した（図１〜４）。本発明者らは、形質転換後に酵母細胞をＳＣ−ＵＲＡ培地上でプレートし、ＵＲＡ３マーカーの取り込みについて選択した。本発明者らは、パルスフィールドゲル電気泳動を使用して、全ての得られたクローンを、ＹＡＣ完全性について検査した。さらに、本発明者らは、サザンブロットによってクローンを分析し、構造および同一性を確認した。
ｙＨＧ１／２の場合には、得られるＹＡＣにおけるＵＲＡ３遺伝子は、５’相同配列に隣接し、本発明者らは、この遺伝子を、以下のように除去した。
本発明者らは、ｙＨＧ１／２ Ｙａｃを含む酵母培養物を、５ＦＯＡ（ＵＲＡに対するネガティブ選択）を含む寒天プレート上にプレートした。本発明者らは、得られる５ＦＯＡ耐性クローンを、上に概説するように、パルスフィールドゲルおよびサザンブロットによって、完全性について検査した。
本発明者らは、上記ストラテジーに従って、ＴＶＧ１ベクターおよびＴＶ Ｇ４／２ベクターを使用して、それぞれｙＨＧ１ ＹＡＣおよびｙＨＧ４／２ ＹＡＣを産生する。
（実施例６）
（ｙＨ２ＢＭ ＹＡＣのＥＳ細胞への導入）
本発明者らは、ＹＡＣであるｙＨ２ＢＭを、以下に詳細に記載するように、酵母スフェロプラスト融合を介して、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞に導入した。［Ｂ．Ｂｉｒｒｅｎら、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３巻、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、「Ｃｈａｐｔｅｒ ５： Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＹＡＣｓ ｉｎｔｏ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｓｐｈｅｒｏｐｌａｓｔ ｆｕｓｉｏｎ」、５４８−５５０頁、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮＹを参照のこと］。ｙＨ２ＢＭ含有酵母細胞を、０．１５ｍｇ／ｍｌのザイモリアーゼ（ｚｙｍｏｌａｓｅ） ２０Ｔを使用して、スフェロプラストした。ｙＨ２ＢＭスフェロプラストを、ＨＰＲＴ欠損Ｅ １４．ＴＧ３Ｂ１マウスＥＳ細胞と融合させ、これを以下に記載するように培養した［Ｔｓｕｄａら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４２：４１３−４２１（１９９７）を参照のこと］。ＨＡＴ選択を、融合の４８時間後に開始した。ＨＰＲＴポジティブＥＳ細胞クローンを、１クローン／１５〜２０×１０6融合細胞の頻度で選択した。２１のＨＡＴ耐性コロニーを、ゲノム分析のために増殖させ、そしてサザンブロット分析およびＣＨＥＦブロット分析によって、ＹＡＣ完全性について分析した。ＥＳ細胞単独と酵母スフェロプラスト単独とを融合させるコントロール実験においては、コロニーが検出されなかった。
詳細な手順は、以下の通りである。
（酵母スフェロプラストの産生）
過剰の酵母細胞を調製した。なぜなら、５０％までが、スフェロプラスト手順の間に失われるからである。５×１０7のＥＳ細胞を融合するためには、約５×１０9の酵母細胞が必要である。
本発明者らは、選択培地（ＳＣ−）にフリーザーストックを接種し、約５×１０6細胞／ｍｌの出発接種物を得た。本発明者らは、培養物中の細胞密度を、血球計を使用して決定した。本発明者らは、２５０ｒｐｍで振盪しながら２３℃で一晩、細胞を増殖させた。インキュベーションもまた、１４℃または１８℃で実施して、ＹＡＣの安定性を増加させ得る。３０℃での培養は、ＹＡＣにおけるいくらかのＩｇ遺伝子セグメントの欠失を生じ得る。午前中に、培養物密度は２×１０7細胞／ｍｌであった。本発明者らは、ＹＰＤＡ（リッチ）培地で１×１０7細胞／ｍｌに希釈し、そして２〜３時間インキュベートした。この段階における培養物密度は、２×１０7細胞／ｍｌを超えるべきではない。なぜなら、指数関数的に増殖する酵母が、効率的かつ完全なスフェロプラストのために必要であるからである。
本発明者らは、所望の量の培養物（５×１０9細胞を提供するため）を、滅菌した５０ｍｌ試験管に注ぎ、１０００〜１２００ｇ（Ｊｏｕａｎ ＧＲ４−２２遠心機で２３００〜２５００ｒｐｍ）で室温で５〜１０分間遠心分離し、そして上清を処分した。あるいは、大量の細胞を、大型のコニカル遠心管内でペレット化し得る。
本発明者らは、２０ｍｌの滅菌Ｈ2Ｏを、酵母細胞の各試験管に添加し、ボルテックスによって（またはピペットで）これらの細胞を再懸濁させ、上記のようの遠心分離し、そして上清を処分した。次いで、本発明者らは、２０ｍｌの１Ｍソルビトールを酵母細胞の各試験管に添加し、ボルテックスによって（またはピペットで）これらの細胞を再懸濁させ、上記のように遠心分離し、そして上清を処分した。本発明者らは、これらの細胞を、１：５００の希釈の新たに追加した２−メルカプトエタノールを含むＳＰＥ緩衝液（１Ｍソルビトール、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁させて、最終細胞濃度を５×１０8細胞／ｍｌとした。
本発明者らは、１０μｌの先の細胞懸濁物を、９０μｌの５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳと混合し、そして別の１０μｌの細胞懸濁物を、９０μｌの１Ｍソルビトールと混合した。本発明者らは、各混合物の細胞濃度を、血球計で決定した。前段落からの酵母細胞懸濁物を、３０℃に暖める。酵母細胞懸濁物の各１ｍｌに対して、１．５μｌの１００ｍｇ／ｍｌのＺｙｍｏｌｙａｓｅ−２０Ｔ（ＩＣＮ）のストックを添加する。本発明者らは、３０℃で静置してインキュベートした。５分間の間隔で、１０μｌの細胞懸濁物を、９０μｌの５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳと混合し、そして細胞濃度を血球計で決定する。本発明者らは、ＳＤＳ処理の存在下において残る細胞の数の減少をモニタリングした（ソルビトールの存在下での初期細胞濃度と比較した）。
細胞の９５％がＳＤＳに溶解するとすぐに、サンプルを２００〜３００ｇ（Ｊｏｕａｎ ＧＲ４−２２遠心機で１０００〜１２００ｒｐｍ）で室温で５分間遠心分離し、そして上清を注意深く注いで除去した（ペレットは非常に緩く、そしていくらかの細胞は失われる）。スフェロプラスト（ザイモリアーゼを添加した後の工程）のための全時間は、代表的に、５〜２０分間である。
本発明者らは、スフェロプラストを、反転または注意深いピペット採取によって、２０ｍｌのＳＴＣ緩衝液（０．９８Ｍソルビトール、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＣａＣｌ2）に穏やかに再懸濁させ、このサンプルを２００〜３００ｇ（Ｊｏｕａｎ ＧＲ４−２２遠心機で１０００〜１２００ｒｐｍ）で室温で５分間遠心分離し、そして上清を注意深く注いで除去した。本発明者らは、この手順を１回繰り返した。本発明者らは、スフェロプラストを、２．５×１０8細胞／ｍｌでＳＴＣに再懸濁させ、これを工程１４で使用するまで、室温（または氷上）で維持した。
（ＥＳ細胞との融合）
本発明者らは、２．５×１０8のスフェロプラストを含む１ｍｌのスフェロプラスト懸濁物を、１５ｍｌの試験管に移し、そして１ｍｌを２００〜３００ｇ（Ｊｏｕａｎ ＧＲ４−２２遠心機で１０００〜１２００ｒｐｍ）で室温で５分間、遠心分離した。本発明者らは、長いガラスピペットでゆっくりと吸引することによって、全ての上清を除去した。試験管を半水平位置にして、本発明者らは、１ｍｌのＥＳ細胞（５×１０6細胞／ｍｌ）を、スフェロプラストペレットを乱すことなく、穏やかに添加した。スフェロプラスト：ＥＳ細胞の比は、２５：１〜５０：１で変動し得る。
本発明者らは、以下のような手順で、ＥＳ細胞を調製した：本発明者らは、１００ｍｍのプレートあたり６×１０6ＥＳ細胞の出発密度、および標準ＥＤ培地（ＤＭＥＭ高グルコース、１００ユニット／ペニシリンのｍｌ、１００μｇ／ストレプトマイシンのｍｌ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００μｍの２−メルカプトエタノール、１０００ユニット／マウス白血病阻害因子［ＥＳＧＲＯTM］、および熱で不活化した１５％のウシ胎仔血清）を用いて、マウス一次フィーダーでコーティングしたプレートで、ＥＳの培養を開始した。４８時間の標準的な増殖条件の後に、本発明者らは、この培養物をトリプシン処理し、そして得られた細胞を使用して、１００ｍｍプレートあたり１０7ＥＳ細胞でのゼラチンコーティングしたプレート上での培養を開始した。本発明者らは、１６〜２４時間、増殖を続けさせた。融合の４時間前に、本発明者らは、ＥＳプレート上の培地を新たな培地に交換した。融合の直前に、本発明者らは、これらの細胞をトリプシン処理し、室温で無血清ＥＳ培地で３回洗浄し、そして５×１０6細胞／ｍｌで無血清ＥＳ培地中に再懸濁させた。
本発明者らは、混合したスフェロプラスト／ＥＳ細胞サンプルを、３００ｇ（Ｊｏｕａｎ ＧＲ４−２２遠心機で１２００ｒｐｍ）で室温で３分間、遠心分離し、そして長いガラスピペットで、全ての培地を注意深く吸引して除去した。
本発明者らは、試験管を穏やかに叩いて、細胞ペレットを緩め、そしてＰ１０００チップを使用して、１０ｍＭのＣａＣｌ2を含む０．５ｍｌの５０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ １５００（ｐＨ ８．０；例えば、Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ７８３６４１）（３７℃に予め暖めた）をゆっくりと添加した。この溶液を添加する間に、本発明者らは、これらの細胞を、ピペットチップで穏やかに混合した。一旦、全ての溶液を添加したら、本発明者らは、この細胞懸濁物を一回、ゆっくりとピペットで吸い上げ、そして下げた。本発明者らは、この細胞懸濁物を、室温で９０秒間インキュベートした。本発明者らは、５ｍｌの無血清ＥＳ培地を、試験管の底部からピペットで吸い上げることによって、ゆっくりと添加した。本発明者らは、細胞を室温で３０分間インキュベートし、そして３０分後に、この細胞懸濁物を、３００ｇ（Ｊｏｕａｎ ＧＲ４−２２遠心機で１２００ｒｐｍ）で室温で３分間遠心分離し、そして長いガラスピペットを用いて、全ての培地を注意深く吸引除去した。
本発明者らは、これらの細胞を、１０ｍｌの標準ＥＳ培地に再懸濁させ、そしてサンプル全体（約５×１０6ＥＳ細胞）を、１００ｍｍのマウス一次フィーダーで被覆したプレート上で、プレートした。最初の試みが、多すぎるコロニーの発生を生じる場合には、各１００ｍｍのプレートにプレートするサンプルの量を下げるよう調節する必要があり得る。
本発明者らは、これらのプレートを、標準的なＥＳ細胞増殖条件下で一晩インキュベートし、次いで培地を新たなＥＳ培地と交換した。
４８時間の培養に続いて（スフェロプラスト融合の後）、本発明者らは、適切な選択条件下（すなわち、ＹＡＣに存在する特定の哺乳動物選択マーカーにより指図される）で増殖を開始させた。本発明者らは、培地を２日ごとに交換した。
本発明者らは、標準的な手順による増殖のために、ＥＳコロニーを拾い、そしてマウス一次フィーダーでコーティングしたプレート上でプレートした。本発明者らは、代表的に、スフェロプラスト融合後１０〜１５日間、ＥＳコロニーを観察した。
ここで、ｙＨ２Ｂｍ含有酵母と融合したＥＳ細胞由来の７つのＥＳ細胞クローン（表３において１〜７と呼ばれる）は、インサート全体にまたがるプローブにより検出される、予測された全てのＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ ｙＨ２フラグメントを含むことがわかった。表３に示すように、以下のヒト遺伝子が、トランスジェニックマウス発生の前に、ＥＳ細胞ゲノムにおいて、ＥＳ細胞ＤＮＡの特徴付けの一部として、検出された：全ての異なるＶHファミリーＶH１、ＶH２、ＶH３、ＶH４、ＶH５、およびＶH６が、検出可能であった；ヒトＤH、およびＪH；ヒトＣμおよびＣδ定常領域；マウススイッチγ１（ｍＳγ１）およびヒトＣγ１ ＣHエキソン。
Figure 2011087594
（実施例７）
（ｙＨ２ＢＭ ＹＡＣを含むＥＳ細胞の、マウスへの導入）
ＹＡＣ ｙＨ２ＢＭ ＤＮＡを含むＥＳ細胞からキメラマウスを作製するために、本発明者らは、胚盤胞をミクロインジェクションし、続いて交配させた。本発明者らは、ＹＡＣ ｙＨ２ＢＭ ＤＮＡを含むＥＳ細胞を、実施例５に記載するように単離し、そしてキメラマウスの作製のために増殖させた。次いで、本発明者らは、ｙＨ２ＢＭ保有ＥＳ細胞クローンを、マウスＣ５７Ｂ１／６胚盤胞にミクロインジェクションした［Ｂ．Ｈｏｇａｎら、「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｄ、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｗ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、「Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ」１８８−１９６頁（１９８６）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）を参照のこと］。キメラの子を、皮膚の色により同定した。
Figure 2011087594
表４は、７種の異なるｙＨ２ＢＭ含有ＥＳ細胞株を使用してのトランスジェニックマウスの作製に関するデータを要約する。７のクローンのうちの５つを、マウス生殖細胞系に伝達させた。
（実施例８）
（ｙＨ２ＢＭ ＹＡＣ ＤＮＡを含むマウスとｙＫ２：ＤＩマウスとの交配）
内因性抗体の非存在下でヒト抗体を産生するマウスを作製するために、本発明者らは、ｙＫ２トランスジェニックマウスを、二重に不活化した（ＤＩ）マウス株と交配させた。ＤＩマウス株は、遺伝子標的化した不活化したマウスの重鎖およびκ軽鎖の遺伝子座に関して同型接合であり、従って、抗体産生を欠く［Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｇｒｅｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３−２１（１９９４）を参照のこと］。本発明者らは、ｙＫ２トランスジェニック株の１つであるＪ２３．１を、ＤＩマウスと交配させて、同型接合の不活化したマウスの重鎖およびκ鎖のバックグラウンドでｙＫ２ ＹＡＣに対して半接合または同種接合のマウスを作製した（ｙＫ２；ＤＩ）。ｙＨ２ＢＭ ＹＡＣに対して半接合の新たなＸｅｎｏＭｏｕｓｅを発生させるための交配スキームを、以下に示す。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅの雄性とＸｅｎｏＭｏｕｓｅの雌性との引き続く交配は、ｙＨ２ＢＭおよび／またはｙＫ２に対して半接合または同種接合のいずれかである、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ子孫を与える。これらの子孫から、いずれもｙＨ２ＢＭとｙＫ２との両方に対して同種接合である雄性および雌性を交配させて、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ ｙＨ２ＢＭの真の交配株を得る。
Figure 2011087594
本発明者らは、サザンブロット分析によって、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ Ｈ２ＢＭ株におけるヒト重鎖およびκ鎖ＹＡＣの完全性を確認した。分析した全てのＸｅｎｏＭｏｕｓｅ Ｈ２ＢＭ株において、ｙＨ２ＢＭは、複数の世代にわたって、明らかな欠失も再配列もなしに、変化せずに伝達された。
（実施例９）
（フローサイトメトリー分析）
Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ Ｈ２ＢＭトランスジェニックマウスをさらに特徴付けるために、末梢血液および脾臓リンパ球を、８〜１０週齢のマウスおよびコントロールから単離した。これらの細胞を、Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ Ｍ（Ａｃｃｕｒａｔｅ）（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で精製し、そして精製した抗マウスＣＤ３２／ＣＤ１６ Ｆｃレセプター（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、０１２４１Ｄ）（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で処理して、Ｆｃレセプターへの非特異的結合をブロックした。次いで、これらの細胞を、種々の抗体で染色し、そしてＦＡＣＳｔａｒPLUS（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＣＥＬＬＱｕｅｓｔソフトウェア）で分析した。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ Ｈ２ＢＭ細胞を染色するために使用した抗体のパネルは、以下を含んだ：シトクロム（Ｃｙｃｈｒｏｍｅ）（Ｃｙｃ）抗Ｂ２２０（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、０１１２８Ａ）；フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）抗ヒトＩｇＭ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、３４１５４Ｘ）；ＦＩＴＣ抗マウスＩｇＭ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、０２２０４Ｄ）。
３つの異なるＸｅｎｏＭｏｕｓｅ Ｈ２ＢＭ株からの４匹の動物由来のリンパ球を評価し、そして以下の表５に示すように、フローサイトメトリーを使用して野生型Ｂ６／１２９マウスと比較した。
株ＸＭ−２ＢＭ−１、ＸＭ−２ＢＭ−２およびＸＭ−２ＢＭ−６は、野生型マウスと比較して、Ｂ細胞区画において、約６０〜８０％の再構成を示した（表５）。ｙＨ２ＢＭ ＹＡＣ ＤＮＡを有するトランスジェニックマウスは、ヒト抗体および免疫系の有意な発達を示す。
Figure 2011087594
（実施例１０）
（非免疫マウスにおけるヒト抗体の血清レベル）
非免疫マウス血清中のヒト抗体の測定のためのＥＬＩＳＡを実行した。免疫アッセイにおけるより詳細な情報および手順について、Ｅ．Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第１４章，「Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ」，５５３−６１４頁，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）を参照のこと。ヒト免疫グロブリンの濃度を、以下の捕捉抗体：マウス抗ヒトＩｇＭ（ＣＧＩ／ＡＴＣＣ，ＨＢ−５７）（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を使用して、測定した。ＥＬＩＳＡ実験において使用された検出抗体は、マウス抗ヒトＩｇＧｌ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９０５０−０５）（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）、マウス抗ヒトＩＧＭ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９０２０−０５）（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）であった。ヒトＩｇの定量のために使用される標準は、ヒトＩｇＭκ（Ｃａｐｐｅｌ，１３０００）（Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ，ＣＡ）およびヒトＩｇＧ１（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ ４００１２６）（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）であった。
表６において示されるように、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ Ｈ２ＢＭマウスは、免疫の非存在下において、ヒトＩｇＭおよびヒトＩｇＧの両方の有意なベースラインレベルを生成した。
Figure 2011087594
（実施例１１）
（免疫およびハイブリドーマ生成）
６匹の８〜１０週齢のＸｅｎｏＭｉｃｅＨ２ＢＭの群を、１０μｇの組換えヒトＩＬ−８、５μｇ ＴＮＦ−αまたはＣＥＭ細胞（ＣＤ１４７について）のいずれかを用いて、尾の根元の皮下に（または他の投与の経路（腹腔内、フットパッドなど））免疫した。この抗原を、一次免疫のためにフロイント完全アジュバントにおいて、およびさらなる免疫のためにフロイント不完全アジュバントにおいて、乳化する。動物免疫に関するより詳細な情報および手順について、以下を参照のこと：Ｅ．Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第５章，「Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎｓ」５３−１３８頁，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）。免疫を、３〜４週間の間隔で、少なくとも３回のブースター免疫（ブースト）のために実施した。
モノクローナル抗体を作製する場合、マウスは、融合の４日前に、ＰＢＳ中の抗原または細胞の最終注射を受ける。モノクローナル抗体を作製する詳細な情報および手順については、以下を参照のこと：Ｅ．Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第６章，「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」，１３９−２４４頁，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）。免疫マウス由来のリンパ節のリンパ球を、非分泌骨髄腫ＮＳＯ細胞株［Ｓ．Ｒａｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：５５４８−５５５１（１９９４）］またはＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞を用いて融合し、そして以前に記載されたように［Ｇ．Ｇａｌｆｒｅら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：３−４６（１９８１）］ＨＡＴ選択に供する。
表７は、上記実施例６〜８に従って産生され、かつ組換えヒトＩＬ−８細胞、５μｇＴＮＦ−α細胞またはＣＥＭ細胞（ＣＤ１４７について）を用いて免疫されたトランスジェニックは、ヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体を生成したことを示す。
（実施例１２）
（抗体特異性およびアイソタイプの評価）
本発明者らは、トランスジェニックマウスが、抗原特異的抗体を産生しているか否かの決定のために、ＥＬＩＳＡを実施した（表７）。本発明者らは、記載されるように［Ｃｏｌｉｇａｎら，Ｕｎｉｔ ２．１，「Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙｓ」Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９４）］、抗原特異的抗体を捕捉するために組換えヒトＩＬ−８、ＣＤ１４７およびＴＮＦ−αを使用して、マウス血清およびハイブリドーマ上清から単離される抗体の、抗原特異性ならびにアイソタイプを決定した。本発明者らは、以下の捕捉抗体：ウサギ抗ヒトＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６１４５−０１）を使用して、ヒト免疫グロブリンの濃度を測定した。ＥＬＩＳＡ実験において使用される検出抗体は、マウス抗ヒトＩｇＧ１−ＨＲＰ（Ｃａｌｔａｇ，ＭＨ１０１５）（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）マウス抗ヒトＩＧＭ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９０２０−０５）、およびヤギ抗ヒトκ−ビオチン（Ｖｅｃｔｏｒ，ＢＡ−３０６０）であった。ヒトおよびマウスＩｇの定量のために使用される標準は、ヒトＩｇＧ1（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，４００１２２）、ヒトＩｇＭκ（Ｃａｐｐｅｌ，１３０００）、ヒトＩｇＧ2κ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，４００１２２）、マウスＩｇＧK（Ｃａｐｐｅｌ ５５９３９）、マウスＩｇＭκ（Ｓｉｇｍａ，Ｍ−３７９５）、およびマウスＩｇＧ4λ（Ｓｉｇｍａ，Ｍ−９０１９）である。
表７はさらに、上記実施例６〜８に従って産生され、かつ組換えヒトＩＬ−８、５μｇのＴＮＦ−αまたはＣＥＭ細胞（ＣＤ１４７について）を用いて免疫されたトランスジェニックマウスが、抗原特異的であり、かつ予測されたアイソタイプを有する、ヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体を産生した。
Figure 2011087594
（実施例１３）
（ＥＳ細胞へのｙＨ２ＣＭ ＹＡＣの導入）
本発明者らは、実施例６に詳細に記載されるような酵母スフェロプラスト融合によるマウス胚性幹（ＥＳ）細胞へ、ＹＡＣ、ｙＨ２ＣＭを導入した［Ｂ．Ｂｉｒｒｅｎら，Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第３巻，Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，第５章：「Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＹＡＣｓ ｉｎｔｏ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｓｐｈｅｒｏｐｌａｓｔ ｆｕｓｉｏｎ」，５４８−５５０頁，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹを参照のこと］。一般に、１．５ｍｇ／ｍｌのジモラーゼ（ｚｙｍｏｌａｓｅ）２０Ｔを使用して、スフェロプラスト化した。ｙＨ２ＣＭスフェロプラストを、以下に記載されるように、培養されたＨＰＲＴ欠損Ｅ１４．ＴＧ３Ｂ１マウスＥＳ細胞と融合した［Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｇｒｅｅｎら，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３−２１（１９９４）；Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ｉｎ Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，７１−１１２頁，ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８７）を参照のこと］。ＨＡＴ選択を、融合４８時間後に開始した。ＨＰＲＴ−陽性ＥＳ細胞クローンを、１クローン／１５〜２０×１０6融合細胞の頻度で選択した。ＨＡＴ耐性コロニーを、ゲノム分析のために増殖し、そしてサザンブロット分析およびＣＨＥＦブロット分析により、ＹＡＣの完全性について分析した。ＥＳ細胞および酵母スフェロプラストの偽（ｍｏｃｋ）融合によるコントロール実験において、コロニーを検出しなかった。
ｙＨ２ＣＭ含有酵母を用いたＥＳ細胞融合由来のＥＳ細胞クローン（表８においてクローン１〜１０として言及さる）は、挿入物全体にわたるプローブにより検出される全ての予測されるＥｃｏＲＩフラグメントおよびＢａｍＨＩ ｙＨ２フラグメントを含んだ。表８に示されるように、本発明者らは、トランスジェニックマウス産生の前にＥＳ細胞ＤＮＡの特徴付けの一部としてＥＳ細胞ゲノムにおいて以下のヒト遺伝子を検出した：全ての異なるＶHファミリーを検出し得る：ＶH１、ＶH２、ＶH３、ＶH４、ＶH５、およびＶH６；ヒトＤH、およびＪH；ヒトＣμ、およびＣδ定常領域；マウススイッチγ１（ｍＳγ１）エキソンおよびヒトＣγ４ ＣHエキソン。
Figure 2011087594
（実施例１４）
（マウスへのｙＨ２ＣＭ ＹＡＣを含むＥＳ細胞の導入）
ＹＡＣ ｙＨ２ＣＭ ＤＮＡを含むＥＳ細胞由来のキメラマウスを産生するために、胚盤胞の微量注入を実施し、次に交配した。ＹＡＣ ｙＨ２ＣＭ ＤＮＡを含むＥＳ細胞を、実施例１６に記載されるように単離し、そしてキメラマウスの産生のために増殖した。次に、ｙＨ２ＣＭ保有ＥＳ細胞クローンを、マウスＣ５７Ｂ１／６胚盤胞へ微量注入した［Ｂ．Ｈｏｇａｎら，「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｄ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｗ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，「Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ」１８８−１９６頁，（１９８６）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を参照のこと］。キメラの子孫を、毛色より同定した。
Figure 2011087594
表９は、９つの異なるｙＨ２ＣＭを含むＥＳ細胞株を使用して、トランスジェニックマウスを産生するためのデータを要約した。９つのクローンのうち２つを、マウスの生殖細胞系列を介して伝達した。
（実施例１５）
（ｙＫ２：ＤＩマウスを用いてｙＨ２ＣＭ ＹＡＣ ＤＮＡを含むマウスを交配する）
内因性抗体の非存在下においてヒト抗体を生成したマウスを産生するために、ｙＫ２トランスジェニックマウスを、二重不活性化（ＤＩ）マウス系統を用いて以前に交配した。ＤＩマウス系統は、遺伝子標的化−不活性化された（ｔａｒｇｅｔｅｄ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ）マウス重鎖およびκ鎖の遺伝子座がについてホモ接合性であり、従って、抗体産生において欠損があった［Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｇｒｅｅｎら，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３−２１（１９９４）を参照のこと］。ｙＫ２トランスジェニックマウス系統の１つ（Ｊ２３．１）は、ＤＩマウスを用いて交配され、ホモ接合性の不活性化マウス重鎖およびκ鎖のバックグラウンド（ｙＫ２；ＤＩ）において、ｙＫ２ ＹＡＣについてヘミ接合性またはホモ接性マウスを産生した。ｙＨ２ＣＭ ＹＡＣについてヘミ接合性である、新しいＸｅｎｏｍｏｕｓｅを産生するための交配スキームを、以下に示す。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅの雌とのＸｅｎｏＭｏｕｓｅの雄の引き続く交配は、ｙＨ２ＣＭおよび／またはｙＫ２についてのヘミ接合性またはホモ接合性のいずれかのＸｅｎｏＭｏｕｓｅの子孫を産生する。これらの子孫から、雄および雌（これらの両方が、ｙＨ２ＣＭおよびｙＫ２についてホモ接合性である）の交配は、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅのＨ２ＣＭの真の交配系統を産生する。
（ＸｅｎｏＭｏｕｓｅのＨ２ＣＭ交配スキーム）
Figure 2011087594
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅのＨ２ＣＭ系統におけるヒト重鎖およびκ鎖ＹＡＣの完全性を、サザンブロット分析により確認した。分析された全てのＸｅｎｏＭｏｕｓｅ Ｈ２ＣＭ系統において、ｙＨ２ＣＭを、明らかな欠失または再配置を有さず、複数の世代を介して変更せず伝達した。
（実施例１６）
（フローサイトメトリー分析）
ＸｅｎｏｍｏｕｓｅのＨ２ＣＭトランスジェニックマウスをさらに特徴付けるため、末梢血および脾臓リンパ球を８〜１０週齢のマウスおよびコントロールから単離した。細胞を、リンパ球Ｍ（Ａｃｃｕｒａｔｅ）（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）において精製し、そして精製された抗マウスＣＤ３２／ＣＤ１６ Ｆｃレセプター（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，０１２４１Ｄ）（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて処理して、Ｆｃレセプターに対する非特異的結合をブロックした。次に、細胞を、種々の抗体を用いて染色し、そしてＦＡＣＳｔａｒPLUS（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＣＥＬＬＱｕｅｓｔ ｓｏｆｔｗａｒｅ）において分析した。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅＨ２ＣＭ細胞を染色するために使用される抗体の表としては、以下が挙げられる：Ｃｙｃｈｒｏｍｅ（Ｃｙｃ）抗−Ｂ２２０（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，０１１２８Ａ）；蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）抗ヒトＩｇＭ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，３４１５４Ｘ）；ＦＩＴＣ抗マウスＩｇＭ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，０２２０４Ｄ）。
２つの異なるＸｅｎｏＭｏｕｓｅＨ２ＣＭ系統からの二つの動物由来のリンパ球を、以下の表１０に示されるようなフローサイトメトリーを用いて評価し、そして野生型Ｂ６／１２９マウスと比較した。
系統ＸＭ２Ｃｍ−２ホモは、Ｂ細胞画分において８０〜１００％の再構築について示した（表１０）。ｙＨ２ＣＭ ＹＡＣ ＤＮＡを有するトランスジェニックマウスは、有意なヒト抗体および免疫系の発生を示す。コントロール１２９×Ｂ６、ＤＩ、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ ２ａヘテロ接合性およびホモ接合性を、ｙＨ２ＣＭ ＹＡＣについてヘテロ接合性およびホモ接合性のマウスと比較した。
Figure 2011087594
（実施例１７）
（非免疫マウス中のヒト抗体の血清レベル）
非免疫マウス血清中のヒト抗体の測定のためにＥＬＩＳＡを行った。イムノアッセイについてのより詳細な情報および手段については、Ｅ．Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第１４章、「Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ」、５５３−６１４頁、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）を参照のこと。ヒト免疫グロブリンの濃度を、以下の捕捉抗体を使用して測定した：マウス抗ヒトＩｇＭ（ＣＧＩ／ＡＴＣＣ、ＨＢ−５７）（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）。ＥＬＩＳＡ実験において使用した検出抗体は、マウス抗ヒトＩｇＧ4−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９０５０−０５）（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）、マウス抗ヒトＩＧＭ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９０２０−０５）（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）であった。ヒトＩｇの定量のために使用したスタンダードは、以下であった：ヒトＩｇＭＫκ（Ｃａｐｐｅｌ、１３０００）（Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ、ＣＡ）およびヒトＩｇＧ１（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ ４００１２６）（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）。
表１１に示されるように、１５〜３０行のＸｅｎｏｍｏｕｓｅ Ｈ２ＣＭは、免疫不在下で有意な基線レベルのヒトＩｇＭおよびＩｇＧ４の両方を産生した。
Figure 2011087594
（実施例１８）
（免疫およびハイブリドーマ生成）
６匹の８〜１０週齢のＸｅｎｏＭｏｕｓｅ Ｈ２ＣＭのグループを、１０μｇの組換えヒトＩＬ−６またはＩＬ−８のいずれかを用いて、尾の基部で皮下的に免疫した。抗原は、一次免疫については完全フロイントアジュバント中に、そしてさらなる免疫については不完全フロイントアジュバント中に乳化する。動物免疫についてのより詳細な情報および手段については、Ｅ．Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第５章、「Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ」、５３−１３８頁、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）を参照のこと。免疫は、少なくとも３回の追加免疫（ブースト）について３〜４週間隔で行う。
モノクローナル抗体を作製する場合、これらのマウスは、融合の４日前に、ＰＢＳ中の抗原または細胞の最終注射を受ける。モノクローナル抗体の作製についてのより詳細な情報および手段については、Ｅ．Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第６章、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、１３９−２４４頁、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）を参照のこと。免疫したマウス由来のリンパ節リンパ球を、非分泌性骨髄腫ＮＳＯ細胞株［Ｓ．Ｒａｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：５５４８−５５５１（１９９４）］またはＰ３−Ｘ６３−Ｗｇ８．６５３骨髄腫細胞と融合し、そして以前の記載［Ｇ．Ｇａｌｆｒｅら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：３−４６（１９８１）］のようにＨＡＴ選択に供した。
表１２は、上記実施例１４〜１６に従って作製しそして組換えヒトＩＬ−６またはＩＬ−８で免疫したトランスジェニックマウスが、ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体を産生したことを示す。
（実施例１９）
（抗体特異性およびアイソタイプの評価）
本発明者らは、ＥＬＩＳＡを行い、トランスジェニックマウスが、抗原特異的抗体を産生しているか否かを決定した（表１２）。本発明者らはまた、産生されるヒト抗体アイソタイプを決定した（表１２）。抗原特異性およびアイソタイプの決定を、その抗原特異的抗体を捕捉するために組換えヒトＩＬ−６またはＩＬ−８を使用して、記載［Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｕｎｉｔ２．１、「Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙｓ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９４）］のようにマウス血清およびハイブリドーマ上清から単離した抗体に対して行った。ヒトおよびマウス免疫グロブリンの濃度を、以下の捕捉抗体を使用して測定した：ウサギ抗ヒトＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６１４５−０１）。ＥＬＩＳＡ実験で使用した検出抗体は、マウス抗ヒトＩｇＧ１−ＨＲＰ（Ｃａｌｔａｇ、ＭＨ１０１５）（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）、マウス抗ヒトＩＧＭ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９０２０−０５）、およびヤギ抗ヒトκビオチン（Ｖｅｃｔｏｒ、ＢＡ−３０６０）であった。ヒトＩｇおよびマウスＩｇの定量に使用したスタンダードは、以下であった：ヒトＩｇＧ1（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、４００１２２）、ヒトＩｇＭκ（Ｃａｐｐｅｌ、１３０００）、ヒトＩｇＧ2K（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、４００１２２）、マウスＩｇＧκ（Ｃａｐｐｅｌ ５５９３９）、マウスＩｇＭ（Ｓｉｇｍａ、Ｍ−３７９５）、およびマウスＩｇＧ4λ（Ｓｉｇｍａ、Ｍ−９０１９）。
表１２はさらに、上記実施例１４〜１６に従って作製しそして組換えヒトＩＬ−６またはＩＬ−８で免疫したトランスジェニックマウスが、抗原特異的かつ予測されたアイソタイプのヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体を産生したことを示す。
Figure 2011087594
（実施例２０）
（ｙＨＧ１／２ ＹＡＣのＥＳ細胞への導入）
本発明者らは、実施例６に記載のような酵母スフェロプラスト融合によって、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞にＹＡＣ、ｙＨＧ１／２を導入した［Ｂ．Ｂｉｒｒｅｎら、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３巻、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、第５章：「Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＹＡＣｓ ｉｎｔｏ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｓｐｈｅｒｏｐｌａｓｔ ｆｕｓｉｏｎ」、５４８−５５０頁、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮＹを参照のこと］。一般的に、ｙＨＧ１／２含有酵母細胞を、０．１５ｍｇ／ｍｌのザイモリアーゼ２０Ｔを使用してスフェロプラスト化した。このｙＨＧ１／２スフェロプラストを、ＨＰＲＴ欠損Ｅ１４．ＴＧ３Ｂ１マウスＥＳ細胞と融合し、この細胞を、記載のように培養した［Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｇｒｅｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３−２１（１９９４）；Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ｉｎ Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、７１−１１２頁、ＩＲＬ、Ｏｘｆｏｒｄ（１９８７）を参照のこと］。ＨＡＴ選択を、融合後４８時間で開始した。ＨＰＲＴ陽性ＥＳ細胞クローンを選択した。ＨＡＴ耐性コロニーを、ゲノム分析のために拡大し、そしてサザンブロット分析およびＣＨＥＦブロット分析によってＹＡＣ完全性について分析した。コントロール実験は、ＥＳ細胞のみおよび酵母スフェロプラストのみの「偽」融合体であった。
本発明者らは、ｙＨＧ１／２含有酵母細胞とのＥＳ細胞融合体由来の４つのＥＳ細胞コロニーを、その挿入物全体にわたるプローブを使用するサザンブロットを使用して試験し、これらのクローンが、予期されるＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ ｙＨ２フラグメントを全て含むか否かを決定した。本発明者らは、４つ全てのＥＳ細胞クローンが、インタクトなＹＡＣを含むことを見い出した。本発明者らは、トランスジェニックマウス生成前に、ＥＳ細胞ＤＮＡの特徴付けの部分としてこのＥＳ細胞ゲノム中の以下のヒト遺伝子を検出した：全ての異なるＶHファミリー（ＶH１、ＶH２、ＶH３、ＶH４、ＶH５、およびＶH６）；ヒトＤHおよびＪH；ヒトＣμおよびＣδ定常領域；ヒトスイッチγ２（ｈＳγ２）およびヒトＣγ１Ｃnエキソン（図８および表１３を参照のこと）。
Figure 2011087594
（実施例２１）
（ｙＨＧ１／２ ＹＡＣを含有するＥＳ細胞のマウスへの導入）
ＹＡＣ ｙＨＧ１／２ ＤＮＡを含有するＥＳ細胞からキメラマウスを生成するために、本発明者らは、胚盤胞マイクロインジェンクション（微量注入）を使用し、その後、育種させた。本発明者らは、実施例６に記載のようなＹＡＣ ｙＨＧ１／２ ＤＮＡを含有するＥＳ細胞を単離し、そしてキメラマウスの生成のために拡大した。次に、本発明者らは、ｙＨＧ１／２保有ＥＳ細胞クローンを、マウスＣ５７Ｂ１／６胚盤胞に微量注入した［Ｂ．Ｈｏｇａｎら、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第Ｄ節、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｗ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、「Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ」、１８８−１９６頁、（１９８６）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｏｂｏｒ、ＮＹ）を参照のこと］。
（実施例２２）
（ｙＨＧ１／２ ＹＡＣ ＤＮＡを含有するマウスのｙＫ２：ＤＩマウスとの交配（ｂｒｅｅｄｉｎｇ））
内因性抗体の非存在下でヒト抗体を産生するマウスを生成するために、ｙＫ２トランスジェニックマウスを、二重不活化（ｄｏｕｂｌｅ‐ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ）（ＤＩ）マウス系統と先ず交配させる。このＤＩマウス系統は、遺伝子標的化−不活化されたマウス重鎖およびκ鎖の遺伝子座についてホモ接合性であり、従って、抗体産生において欠損性である［Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｇｒｅｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３−２１（１９９４）を参照のこと］。ｙＫ２トランスジェニックマウス系統の１つである、Ｊ２３．１を、ＤＩマウスと交配し、ホモ接合性の不活化したマウス重鎖およびκ鎖のバックグラウンド上にｙＫ２ ＹＡＣについて半接合性またはホモ接合性のマウスを生成する（ｙＫ２：ＤＩ）。ｙＨＧ１／２ ＹＡＣについて半接合性である新しいＸｅｎｏｍｏｕｓｅを生成するための交配スキームを、以下に示す。その後の雄性ＸｅｎｏＭｏｕｓｅの雌性ＸｅｎｏＭｏｕｓｅに対する交配は、ｙＨＧ１／２および／またはｙＫ２について半接合性またはホモ接合性のいずれかである、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ子孫を産生する。これらの子孫から、ｙＨＧ１／２およびｙＫ２の両方について両方がホモ接合性である雄および雌の交配は、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ ＨＧ１／２の真の交配系統を産生する。
（ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ ｙＨＧ１／２育種スキーム）
Figure 2011087594
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ Ｈ２ＣＭ系統中のヒト重鎖およびκ鎖ＹＡＣの完全性を、サザンブロット分析によって確かめる。分析した全てのＸｅｎｏＭｏｕｓｅ ＨＧ１／２Ｍ系統において、ｙＨＧ１／２は、明らかな欠失または再編成を伴わずに、複数の世代を通して変化されずに遺伝されている。
（実施例２３）
（フローサイトメトリー分析）
Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ ＨＧ１／２トランスジェニックマウスをさらに特徴付けるために、末梢血および脾臓リンパ球を、８〜１０週齢のマウスおよびコントロールから単離する。これらの細胞は、Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ Ｍ（Ａｃｃｕｒａｔｅ）（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）上で精製し、そして精製抗マウスＣＤ３２／ＣＤ１６Ｆｃレセプター（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、０１２４１Ｄ）（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で処理し、Ｆｃレセプターへの非特異的結合をブロックする。次に、これらの細胞を種々の抗体で染色し、そしてＦＡＣＳｔａｒPLUS（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＣＥＬＬＱｕｅｓｔ ｓｏｆｔｗａｒｅ）上で分析する。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ ＨＧ１／２Ｍ細胞を染色するために使用した抗体のパネルは、以下を含む：シトクロム（Ｃｙｃ）抗Ｂ２２０（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、０１１２８Ａ）；フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）抗ヒトＩｇＭ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、２４１５４Ｘ）；ＦＩＴＣ抗マウスＩｇＭ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、０２２０４Ｄ）。
異なるＸｅｎｏＭｏｕｓｅ Ｈ２Ｇ１／２Ｍ系統由来の４匹の動物由来のリンパ球を、フローサイトメトリーを使用して、評価しそして野生型Ｂ６／１２９マウスと比較する。
ｙＨＧ１／２ ＹＡＣ ＤＮＡを有するトランスジェニックマウスは、有意なヒト抗体および免疫系の発生を示す。ヘテロ接合性およびホモ接合性のコントロール１２９×Ｂ６、ＤＩ、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ ２ａを、ｙＨＧ１／２ ＹＡＣに対してヘテロ接合性およびホモ接合性のマウスと比較する。
（実施例２４）
（非免疫マウス中のヒト抗体の血清レベル）
非免疫マウス血清中のヒト抗体の測定のためにＥＬＩＳＡを行う。イムノアッセイについてのより詳細な情報および手段については、Ｅ．Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第１４章、「Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ」、５５３−６１４頁、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）を参照のこと。ヒト免疫グロブリンの濃度を、以下の捕捉抗体を使用して測定する：マウス抗ヒトＩｇＭ（ＣＧＩ／ＡＴＣＣ、ＨＢ−５７）（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）。ＥＬＩＳＡ実験において使用した検出抗体は、マウス抗ヒトＩｇＧ１−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９０５０−０５）（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）、マウス抗ヒトＩＧＭ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９０２０−０５）（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）である。ヒトＩｇの定量のために使用したスタンダードは、以下である：ヒトＩｇＭκ（Ｃａｐｐｅｌ、１３０００）（Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ、ＣＡ）およびヒトＩｇＧ１（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ ４００１２６）（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）。
（実施例２５）
（免疫およびハイブリドーマ生成）
６匹の８〜１０週齢のＸｅｎｏＭｏｕｓｅ ｙＨＧ１／２の群を、１０μｇの選り抜きの抗原を用いて、尾の根元の皮下に（または他の投与の経路（腹腔内、フットパッドなど））免疫する。この抗原を、一次免疫のためにフロイント完全アジュバントにおいて、およびさらなる免疫のためにフロイント不完全アジュバントにおいて、乳化する。動物免疫に関するより詳細な情報および手順について、以下を参照のこと：Ｅ．Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第５章，「Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎｓ」５３−１３８頁，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）。免疫を、３〜４週間の間隔で、少なくとも３回のブースター免疫（ブースト）のために実施した。
モノクローナル抗体を作製する場合、マウスは、融合の４日前に、ＰＢＳ中の抗原または細胞の最終注射を受ける。モノクローナル抗体を作製する詳細な情報および手順については、以下を参照のこと：Ｅ．Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第６章，「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」，１３９−２４４頁，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）。免疫マウス由来のリンパ節のリンパ球を、非分泌骨髄腫ＮＳＯ細胞株［Ｓ．Ｒａｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：５５４８−５５５１（１９９４）］またはＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞を用いて融合し、そして以前に記載されたように［Ｇ．Ｇａｌｆｒｅら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：３−４６（１９８１）］ＨＡＴ選択に供する。
（実施例２６）
（抗体特異性およびアイソタイプの評価）
本発明者らは、トランスジェニックマウスが、抗原特異的抗体を産生しているか否かを決定するために、ＥＬＩＳＡを実施した。本発明者らはまた、産生されたヒト抗体アイソタイプを決定する。本発明者らは、抗原特異的抗体を捕捉するために抗原を使用して、記載されるように［Ｃｏｌｉｇａｎら，Ｕｎｉｔ ２．１，「Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙｓ」Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９４）］、マウス血清およびハイブリドーマ上清から単離される抗体における、抗原特異性ならびにアイソタイプの決定を実施した。ヒトおよびマウスの免疫グロブリンの濃度は、以下の捕捉抗体：ウサギ抗ヒトＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６１４５−０１）を使用して、測定する。ＥＬＩＳＡ実験において使用される検出抗体は、マウス抗ヒトＩｇＧ１−ＨＲＰ（Ｃａｌｔａｇ，ＭＨ１０１５）（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）、マウス抗ヒトＩＧＭ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９０２０−０５）、およびヤギ抗ヒトκ−ビオチン（Ｖｅｃｔｏｒ，ＢＡ−３０６０）である。ヒトおよびマウスＩｇの定量のために使用される標準は、ヒトＩｇＧ1（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，４００１２２）、ヒトＩｇＭK（Ｃａｐｐｅｌ，１３０００）、ヒトＩｇＧ2K（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，４００１２２）、マウスＩｇＧK（Ｃａｐｐｅｌ ５５９３９）、マウスＩｇＭK（Ｓｉｇｍａ，Ｍ−３７９５）、およびマウスＩｇＧ4λ（Ｓｉｇｍａ，Ｍ−９０１９）である。
上記実施例２０〜２２に従って産生され、かつ抗原を用いて免疫されたトランスジェニックマウスは、抗原特異的であり、かつ予測されたアイソタイプを有する、ヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体を産生する。
（実施例２７）
（ＥＳ細胞へのｙＨＧ４ ＹＡＣの導入）
本発明者らは、実施例６に詳細に記載されるような酵母スフェロプラスト融合によるマウス胚性幹（ＥＳ）細胞へ、ＹＡＣ、ｙＨＧ４を導入した［Ｂ．Ｂｉｒｒｅｎら，Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第３巻，Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，第５章：「Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＹＡＣｓ ｉｎｔｏ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｓｐｈｅｒｏｐｌａｓｔ ｆｕｓｉｏｎ」，５４８−５５０頁，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹを参照のこと］。一般に、酵母細胞を含むｙＨＧ４を、１．５ｍｇ／ｍｌのジモラーゼ（ｚｙｍｏｌａｓｅ）２０Ｔを使用して、スフェロプラスト化した。ｙＨＧ４スフェロプラストを、以下に記載されるように培養されたＨＰＲＴ欠損Ｅ１４．ＴＧ３Ｂ１マウスＥＳ細胞と融合した［Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｇｒｅｅｎら，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３−２１（１９９４）；Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ｉｎ Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，７１−１１２頁，ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８７）を参照のこと］。ＨＡＴ選択を、融合４８時間後に開始した。ＨＰＲＴ−陽性ＥＳ細胞クローンを、選択した。ＨＡＴ耐性コロニーを、ゲノム分析のために増殖し、そしてサザンブロット分析およびＣＨＥＦブロット分析により、ＹＡＣの完全性について分析した。コントロール実験は、ＥＳ細胞単独および酵母スフェロプラスト単独の偽（ｍｏｃｋ）融合を含んだ。
本発明者らは、クローンが全ての予測されたＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ ｙＨ２フラグメントを含むか否かを測定するために、挿入物全体にわたるプローブを用いたサザンブロットを使用して、ｙＨＧ４含有酵母とのＥＳ細胞融合に由来する８個のＥＳ細胞クローンを調べた。本発明者らは、ｙＨＧ４ ＹＡＣが、全ての８個のクローンにおいてインタクトであるいことを見出した。本発明者らは、トランスジェニックマウス産生の前にＥＳ細胞ＤＮＡの特徴付けの一部としてＥＳ細胞ゲノムにおいて以下のヒト遺伝子を検出した：全ての異なるＶHファミリー（ＶH１、ＶH２、ＶH３、ＶH４、ＶH５、およびＶH６）；ヒトＤH、およびＪH；ヒトＣμ、およびＣδ定常領域；ヒトスイッチγ２（ｈＳγ２）およびヒトＣγ４ ＣHエキソン。
（実施例２８）
（マウスへのｙＨＧ４ ＹＡＣを含むＥＳ細胞の導入）
ＹＡＣ ｙＨＧ４ ＤＮＡを含むＥＳ細胞由来のキメラマウスを産生するために、胚盤胞の微量注入を使用し、次に交配した。本発明らは、実施例６に記載するような、ＹＡＣ ｙＨＧ４ ＤＮＡを含むＥＳ細胞を単離し、そしてキメラマウスの産生のために増殖した。次に、本発明者らは、ｙＨＧ４保有ＥＳ細胞クローンを、マウスＣ５７Ｂ１／６胚盤胞へ微量注入した［Ｂ．Ｈｏｇａｎら，「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｄ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｗ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，「Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ」１８８−１９６頁，（１９８６）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を参照のこと］。本発明者らは、キメラの子孫を、毛色より同定した。
生殖細胞系列の伝達を得た。本発明者らは、ヒトＶ６に対して特異的なプライマーを使用したＰＣＲにより、ｙＨＧ４トランスジェニックマウスを同定した。
（実施例２９）
（ｙＫ２：ＤＩマウスを用いてｙＨＧ４ ＹＡＣ ＤＮＡを含むキメラマウスまたはトランスジェニックマウスを交配する）
内因性抗体の非存在下においてヒト抗体を生成したマウスを産生するために、ｙＫ２トランスジェニックマウスを、二重不活性化（ＤＩ）マウス系統を用いて以前に交配した。ＤＩマウス系統は、遺伝子標的化−不活性化されたマウス重鎖およびκ鎖遺伝子座についてホモ接合性であり、従って、抗体産生において欠損がある［Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｇｒｅｅｎら，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３−２１（１９９４）を参照のこと］。ｙＫ２トランスジェニックマウス系統の１つ（Ｊ２３．１）は、ＤＩマウスを用いて交配され、ホモ接合性の不活性化マウス重鎖およびκ鎖のバックグラウンド（ｙＫ２；ＤＩ）において、ｙＫ２ ＹＡＣについてヘミ接合性またはホモ接性のマウスを産生した。ｙＨＧ４ ＹＡＣについてヘミ接合性である、新しいＸｅｎｏＭｏｕｓｅを産生するために使用される交配スキームを、以下に示す。ヘミ接合性ＸｅｎｏＭｏｕｓｅの雌とのヘミ接合性ＸｅｎｏＭｏｕｓｅの雄の引き続く交配は、ｙＨＧ４および／またはｙＫ２についてホモ接合性であるＸｅｎｏＭｏｕｓｅの子孫を産生する。これらの子孫から、雄および雌（これらの両方が、ｙＨＧ４およびｙＫ２についてホモ接合性である）の交配は、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ Ｇ４の真の交配系統を産生する。
（ＸｅｎｏＭｏｕｓｅのＧ４交配スキーム）
Figure 2011087594
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅのＧ４系統におけるヒト重鎖およびκ鎖ＹＡＣの完全性を、サザンブロット分析により確認した。分析された全てのＸｅｎｏＭｏｕｓｅ Ｇ４系統において、ｙＨＧ４を、明らかな欠失または再配置を有さず、複数の世代を介して変更せず伝達した。
（実施例３０）
（フローサイトメトリー分析）
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅのＧ４トランスジェニックマウスをさらに特徴付けるため、末梢血および脾臓リンパ球を、８〜１０週齢のマウスおよびコントロールから単離する。細胞を、リンパ球Ｍ（Ａｃｃｕｒａｔｅ）（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）において精製し、そして精製された抗マウスＣＤ３２／ＣＤ１６ Ｆｃレセプター（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，０１２４１Ｄ）（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて処理して、Ｆｃレセプターに対する非特異的結合をブロックする。次に、細胞を、種々の抗体を用いて染色し、そしてＦＡＣＳｔａｒPLUS（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＣＥＬＬＱｕｅｓｔ ｓｏｆｔｗａｒｅ）において分析する。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ Ｇ４細胞を染色するために使用される抗体の表としては、以下が挙げられる：Ｃｙｃｈｒｏｍｅ（Ｃｙｃ）抗−Ｂ２２０（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，０１１２８Ａ）；蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）抗ヒトＩｇＭ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，３４１５４Ｘ）；ＦＩＴＣ抗マウスＩｇＭ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，０２２０４Ｄ）。
３つの異なるＸｅｎｏＭｏｕｓｅ Ｇ４系統からの４つの動物由来のリンパ球を、フローサイトメトリーを用いて評価し、そして野生型Ｂ６／１２９マウスと比較した。
Ｇ４ ＹＡＣ ＤＮＡを有するトランスジェニックマウスは、有意なヒト抗体および免疫系の発生を示す。コントロール１２９×Ｂ６、ＤＩ、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ ２ａヘテロ接合性およびホモ接合性を、Ｇ４ ＹＡＣについてヘテロ接合性およびホモ接合性のマウスと比較する。
（実施例３１）
（非免疫マウスにおけるヒト抗体の血清レベル）
非免疫マウス血清中のヒト抗体の測定のためのＥＬＩＳＡを実行する。免疫アッセイにおけるより詳細な情報および手順について、Ｅ．Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第１４章，「Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ」，５５３−６１４頁，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）を参照のこと。ヒト免疫グロブリンの濃度を、以下の捕捉抗体：マウス抗ヒトＩｇＭ（ＣＧＩ／ＡＴＣＣ，ＨＢ−５７）（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を使用して、測定した。ＥＬＩＳＡ実験において使用された検出抗体は、マウス抗ヒトＩｇＧｌ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９０５０−０５）（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）、マウス抗ヒトＩＧＭ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９０２０−０５）（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）である。ヒトＩｇの定量のために使用される標準は、ヒトＩｇＭκ（Ｃａｐｐｅｌ，１３０００）（Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ，ＣＡ）およびヒトＩｇＧ１（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ ４００１２６）（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）である。
（実施例３２）
（免疫およびハイブリドーマ生成）
６匹の８〜１０週齢のＸｅｎｏＭｉｃｅ ｙＨＧ４の群を、１０μｇの抗原を用いて、尾の根元の皮下に（または他の投与の経路（腹腔内、フットパッドなど））免疫した。この抗原を、一次免疫のためにフロイント完全アジュバントにおいて、およびさらなる免疫のためにフロイント不完全アジュバントにおいて、乳化する。動物免疫に関するより詳細な情報および手順について、以下を参照のこと：Ｅ．Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第５章，「Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎｓ」５３−１３８頁，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）。免疫を、３〜４週間の間隔で、少なくとも３回のブースター免疫（ブースト）のために実施した。
モノクローナル抗体を作製する場合、マウスは、融合の４日前、ＰＢＳ中の抗原または細胞の最終注射を受ける。モノクローナル抗体を作製する詳細な情報および手順については、以下を参照のこと：Ｅ．Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第６章，「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」，１３９−２４４頁，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）。免疫マウス由来のリンパ節のリンパ球を、非分泌骨髄腫ＮＳＯ株［Ｓ．Ｒａｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：５５４８−５５５１（１９９４）］またはＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３骨髄腫を用いて融合し、そして以前に記載されたように［Ｇ．Ｇａｌｆｒｅら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：３−４６（１９８１）］ＨＡＴ選択に供する。
（実施例３３）
（抗体特異性およびアイソタイプの評価）
トランスジェニックマウスが、抗原特異的抗体を産生しているか否かの決定のために、ＥＬＩＳＡを実施する。産生されたヒト抗体アイソタイプを確認することがさらに所望される。抗原特異性およびアイソタイプの決定を、抗原特異的抗体を捕捉するための組換え抗原を使用して、記載されるように［Ｃｏｌｉｇａｎら，Ｕｎｉｔ ２．１，「Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙｓ」Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９４）］、マウス血清およびハイブリドーマ上清から単離される抗体において実施した。以下の捕捉抗体：ウサギ抗ヒトＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６１４５−０１）を使用して、ヒトおよびマウスの免疫グロブリンの濃度を測定した。ＥＬＩＳＡ実験において使用される検出抗体は、マウス抗ヒトＩｇＧ１−ＨＲＰ（Ｃａｌｔａｇ，ＭＨ１０１５）（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）マウス抗ヒトＩＧＭ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９０２０−０５）、およびヤギ抗ヒトκ−ビオチン（Ｖｅｃｔｏｒ，ＢＡ−３０６０）であった。ヒトおよびマウスＩｇの定量のために使用される標準は、ヒトＩｇＧ1（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，４００１２２）、ヒトＩｇＭκ（Ｃａｐｐｅｌ，１３０００）、ヒトＩｇＧ2κ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，４００１２２）、マウスＩｇＧκ（Ｃａｐｐｅｌ ５５９３９）、マウスＩｇＭκ（Ｓｉｇｍａ，Ｍ−３７９５）、およびマウスＩｇＧ4λ（Ｓｉｇｍａ，Ｍ−９０１９）である。
上記実施例２７〜２９に従って産生され、かつ抗原を用いて免疫されるトランスジェニックマウスは、抗原特異的でかつ予測されるアイソタイプを有するヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体を産生する。
（生物学的材料）
以下の生物学的材料を、上記実施例と関連して開示および議論し、そして本発明に従って利用され得かつ調製され得る材料の例示である。
・ｐｐＫＭ１Ｃ（ｙＨ１Ｃ標的ベクター）
・ｐ１Ｂ（標的ベクター）
・ＴＶ１（ｙＨ２Ｂｍを作製する、ｙＨ１Ｃを標的化するためのｍＳｇ１−ｈＣｇ１プラスミドＤＮＡベクター）
・ＴＶ４（ｙＨ２Ｃｍを作製する、ｙＨ１Ｃを標的化するためのｍＳｇ１−ｈＣｇ４プラスミドＤＮＡベクター）
・ＴＶ Ｇ１（ｙＨＧ１を作製する、ｙＨ１Ｃを標的化するためのｈＣｇ１プラスミドＤＮＡベクター）
・ＴＶ Ｇ４（ｙＨＧ４を作製する、ｙＨ１Ｃを標的化するためのｈＣｇ１プラスミドＤＮＡベクター）
・ｙＨ２Ｃｍ（ｍＳｇ１−ｈＣｇ４ ＹＡＣ）（＿においてＡＴＣＣに寄託され、そして登録番号＿を有する）
・ｙＨ２Ｂｍ（ｍＳｇ１−ｈＣｇ１ ＹＡＣ）（＿においてＡＴＣＣに寄託され、そして登録番号＿を有する）
・ｙＨＧ１（ｈＳｇ２−ｈＣｇ１ ＹＡＣ）
・ｙＨＧ４（また、ｙＨ３Ｃとして言及される）（ｈＳｇ２−ｈＣｇ４ ＹＡＣ）（＿においてＡＴＣＣに寄託され、そして登録番号＿を有する）
・ｙＨ３Ｂ（また、ｙＨＧ１／２として言及される）（ｈＳｇ２−ｈＣｇ１−ｈＣｇ２（ＴＭ） ＹＡＣ）（＿においてＡＴＣＣに寄託され、そして登録番号＿を有する）
・ＥＳ−ｙＨ２Ｃｍクローン１
・ＥＳ−ｙＨ２Ｃｍクローン２
・ＥＳ−ｙＨ２Ｂｍクローン１
・ＥＳ−ｙＨ２Ｂｍクローン２
・ＥＳ−ｙＨ２Ｂｍクローン３
・ＥＳ−ｙＨ２Ｂｍクローン４
・ＥＳ−ｙＨ２Ｂｍクローン５
・ＥＳ−ｙＨ２Ｂｍクローン６
・ＥＳ−ｙＨ２Ｂｍクローン７
・ＥＳ−ｙＨ２Ｂｍクローン８
・ＥＳ−ｙＨ２Ｂｍクローン９
（参考としての援用）
本明細書中に列挙される全ての参考文献（特許、特許出願、学術論文、教科書など）、および本明細書中に列挙された参考文献（それらが、すでに、その全体が参考として援用されてはいない程度の）は、その全体が、参考として援用される。さらに、以下の参考文献（このような参考文献に列挙される参考文献を含む）もまた、その全体が、参考として援用される。
Figure 2011087594
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Claims (67)

  1. 導入遺伝子であって、該導入遺伝子は、Ｄセグメント遺伝子由来の、ヒト第１４染色体上の免疫グロブリン重鎖遺伝子座の近接領域のＤＮＡ配列を含むＤＮＡフラグメントを含み、Ｊセグメント遺伝子および該遺伝子座の定常領域遺伝子Ｃμを介して連続しており、ここで、該ＤＮＡフラグメントは、少なくとも１つのヒトＶセグメント遺伝子の作動可能に連結され、そしてここで、該ＤＮＡフラグメントは、さらに、さらなる定常領域遺伝子に作動可能連結され、該さらなる定常領域遺伝子は、非同種スイッチ領域に作動可能に連結されたヒト定常領域コードエキソンを含む、導入遺伝子。
  2. 請求項１に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記ヒト定常領域コードエキソンは、以下からなる群から選択されるヒト定常領域をコードする、導入遺伝子：ヒトγ定常領域、ヒトα定常領域、およびヒトε定常領域。
  3. 請求項２に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記ヒト定常領域コードエキソンは、ヒトγ定常領域をコードする、導入遺伝子。
  4. 請求項３に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記ヒトγ定常領域が、γ−１定常領域である、導入遺伝子。
  5. ｙＨ２Ｂｍ酵母人工染色体（ＹＡＣ）である、請求項４に記載の導入遺伝子。
  6. 請求項３に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記ヒトγ定常領域が、γ−２定常領域である、導入遺伝子。
  7. 請求項３に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記ヒトγ定常領域が、γ−３定常領域である、導入遺伝子。
  8. 請求項３に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記ヒトγ定常領域が、γ−４定常領域である、導入遺伝子。
  9. ｙＨ２Ｃｍ酵母人工染色体（ＹＡＣ）である、請求項８に記載の導入遺伝子。
  10. 請求項２に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記ヒト定常領域コードエキソンが、ヒトα定常領域をコードする、導入遺伝子。
  11. 請求項１０に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記ヒトα定常領域が、α−１定常領域である、導入遺伝子。
  12. 請求項１０に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記ヒトα定常領域が、α−２定常領域である、導入遺伝子。
  13. 請求項２に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記ヒト定常領域コードエキソンが、ヒトε定常領域をコードする、導入遺伝子。
  14. 請求項１に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記ＤＮＡフラグメントが、複数のヒトＶＨ遺伝子に、作動可能に連結される、導入遺伝子。
  15. 請求項１４に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記ＤＮＡフラグメントは、少なくとも５０％のヒト生殖細胞系列ＶＨ遺伝子に作動可能に連結される、導入遺伝子。
  16. 請求項１４に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記ＤＮＡフラグメントが、少なくとも４０の異なるヒトＶＨ遺伝子に作動可能に連結される、導入遺伝子。
  17. 請求項１４に記載の導入遺伝子であって、前記ＤＮＡフラグメントが、十分な数の異なるヒトＶＨ遺伝子と作動可能に連結されて、その結果、該導入遺伝子が、接合部多様性または体細胞変異事象を考慮することなく、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えを介して、少なくとも１×１０5の異なる機能的ヒト免疫グロブリン重鎖配列をコードし得る、導入遺伝子。
  18. 請求項１４に記載の導入遺伝子であって、ここで、ヒトＶＨ遺伝子の数が、該導入遺伝子を含むトランスジェニックマウスにおける野生型マウスのＢ細胞集団の少なくとも５０％を産生するのに十分である、導入遺伝子。
  19. 導入遺伝子であって、該導入遺伝子は、Ｄセグメント遺伝子由来の、ヒト第１４染色体上の免疫グロブリン重鎖遺伝子座の連続領域のＤＮＡ配列を含むＤＮＡフラグメントを含み、Ｊセグメント遺伝子および該遺伝子座の定常領域Ｃμを介して連続しており、ここで、該ＤＮＡセグメントは、少なくとも１つのヒトＶセグメント遺伝子に作動可能に連結され、そしてここで、該ＤＮＡセグメントは、さらに、さらなる定常領域遺伝子に作動可能に連結され、該さらなる定常領域遺伝子は、ヒトスイッチ領域およびヒト定常領域コードエキソンを含み、ここで、該ヒトスイッチ領域および該ヒト定常領域コードエキソンは、異なるアイソタイプ由来である、導入遺伝子。
  20. 請求項１９に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記ヒトスイッチ領域が、ヒトＣγ２スイッチ領域である、導入遺伝子。
  21. 請求項２０に記載の導入遺伝子であって、ここで、該前記ヒト定常領域コードエキソンは、以下からなる群から選択されるヒト定常領域をコードする、導入遺伝子：ヒトγ−１定常領域、ヒトγ−３定常領域、ヒトγ−４定常領域、ヒトα−１定常領域、ヒトα−２定常領域およびヒトε定常領域。
  22. 請求項２１に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記ヒト定常領域コードエキソンは、ヒトγ−１定常領域をコードする、導入遺伝子。
  23. ｙＨＧ１酵母人工染色体（ＹＡＣ）である、請求項２２に記載の導入遺伝子。
  24. 請求項２１に記載の導入遺伝子であって、ここで、該ヒト定常領域コードエキソンが、ヒトγ−４定常領域をコードする、導入遺伝子。
  25. ｙＨＧ４酵母人工染色体（ＹＡＣ）である、請求項２４に記載の導入遺伝子。
  26. 請求項１９に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記ＤＮＡフラグメントが、複数のヒトＶＨ遺伝子に、作動可能に連結される、導入遺伝子。
  27. 請求項１９に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記ＤＮＡフラグメントは、少なくとも５０％のヒト生殖細胞系列ＶＨ遺伝子に作動可能に連結される、導入遺伝子。
  28. 請求項１９に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記ＤＮＡフラグメントが、少なくとも４０の異なるヒトＶＨ遺伝子に作動可能に連結される、導入遺伝子。
  29. 請求項１９に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記ＤＮＡフラグメントが、十分な数の異なるヒトＶＨ遺伝子と作動可能に連結されて、その結果、該導入遺伝子が、接合部多様性または体細胞変異事象を考慮することなく、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えを介して、少なくとも１×１０5の異なる機能的ヒト免疫グロブリン重鎖配列をコードし得る、導入遺伝子。
  30. 請求項１９に記載の導入遺伝子であって、ここで、ヒトＶＨ遺伝子の数が、該導入遺伝子を含むトランスジェニックマウスにおける野生型マウスのＢ細胞集団の少なくとも５０％を産生するのに十分である、導入遺伝子。
  31. 導入遺伝子であって、該導入遺伝子は、Ｄセグメント遺伝子由来の、ヒト第１４染色体上の免疫グロブリン重鎖遺伝子座の連続領域のＤＮＡ配列を含むＤＮＡフラグメントを含み、Ｊセグメント遺伝子および該遺伝子座の定常領域Ｃμを介して連続しており、ここで、該ＤＮＡセグメントは、少なくとも１つのヒトＶセグメント遺伝子に作動可能に連結され、そしてここで、該ＤＮＡセグメントは、さらに、さらなる定常領域遺伝子に作動可能に連結され、該さらなる定常領域遺伝子は、ヒトスイッチ領域、ヒトＣＨ１、Ｃヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３エキソンおよびヒト膜エキソンを含み、ここで、該ヒトスイッチ領域および該ヒト膜エキソンは、同じアイソタイプ由来であり、そして該ヒトＣＨ１、Ｃヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３エキソンは、該ヒトスイッチ領域および該ヒト膜エキソンとは異なるアイソタイプである、導入遺伝子。
  32. 請求項３１の導入遺伝子であって、ここで、前記ヒトスイッチ領域および前記ヒト膜エキソンは、ヒトγ−２配列である、導入遺伝子。
  33. 請求項３２に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記ヒトＣＨ１、Ｃヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３エキソンは、以下からなる群から選択されるヒト定常領域をコードする、導入遺伝子：ヒトγ−１定常領域、ヒトγ−３定常領域、ヒトγ−４定常領域、ヒトα−１定常領域、ヒトα−２定常領域およびヒトε定常領域。
  34. 請求項３３に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記ヒトＣＨ１、Ｃヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３エキソンが、ヒトγ−１定常領域をコードする、導入遺伝子。
  35. ｙＨＧ１／２酵母人工染色体（ＹＡＣ）である、請求項３４に記載の導入遺伝子。
  36. 請求項３１に記載の導入遺伝子であて、ここで、前記ヒトＣＨ１、Ｃヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３エキソンが、ヒトγ−４定常領域をコードする、導入遺伝子。
  37. ｙＨＧ４／２酵母人工染色体（ＹＡＣ）である、請求項３６に記載の導入遺伝子。
  38. 請求項３１に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記ＤＮＡフラグメントが、複数のヒトＶＨ遺伝子に、作動可能に連結される、導入遺伝子。
  39. 請求項３１に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記ＤＮＡフラグメントは、少なくとも５０％のヒト生殖細胞系列ＶＨ遺伝子に作動可能に連結される、導入遺伝子。
  40. 請求項３１に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記ＤＮＡフラグメントが、少なくとも４０の異なるヒトＶＨ遺伝子に作動可能に連結される、導入遺伝子。
  41. 請求項３１に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記ＤＮＡフラグメントが、十分な数の異なるヒトＶＨ遺伝子と作動可能に連結されて、その結果、該導入遺伝子が、接合部多様性または体細胞変異事象を考慮することなく、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えを介して、少なくとも１×１０5の異なる機能的ヒト免疫グロブリン重鎖配列をコードし得る、導入遺伝子。
  42. 請求項３１に記載の導入遺伝子であって、ここで、ヒトＶＨ遺伝子の数が、該導入遺伝子を含むトランスジェニックマウスにおける野生型マウスのＢ細胞集団の少なくとも５０％を産生するのに十分である、導入遺伝子。
  43. 請求項１、１９および３１のいずれか１項に記載の導入遺伝子であって、さらに、マウス３’エンハンサーを含む、導入遺伝子。
  44. 請求項４３に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記３’エンハンサーが、マウス生殖細胞系列３’エンハンサーの約０．９ｋｂのコアフラグメントである、導入遺伝子。
  45. 請求項４３に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記３’エンハンサーが、マウス生殖細胞系列３’エンハンサーの約４ｋｂのフラグメントである、導入遺伝子。
  46. 請求項４３に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記３’エンハンサーが、遺伝子座制御領域である、導入遺伝子。
  47. 請求項１〜４６にいずれか１項に記載の導入遺伝子を含む、非ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞。
  48. 請求項４７に記載の胚性幹（ＥＳ）細胞であって、該胚性幹細胞が、マウスＥＳ細胞である、胚性幹細胞。
  49. トランスジェニック非ヒト動物およびその子孫であって、ここで、体細胞および生殖細胞が、請求項１〜４６のいずれか１項に記載の導入遺伝子を含む、トランスジェニック非ヒト動物およびその子孫。
  50. ヒト免疫グロブリン軽鎖導入遺伝子を、さらに含む、請求項４９に記載のトランスジェニック非ヒト動物およびその子孫。
  51. 前記動物が、マウスである、請求項４９または５０に記載のトランスジェニック非ヒト動物およびその子孫。
  52. 不活性化内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座および軽鎖遺伝子座をさらに含む、請求項４９または５０に記載のトランスジェニック非ヒト動物および子孫。
  53. 前記動物が、マウスである、請求項５２に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
  54. トランスジェニック非ヒト動物およびその子孫を作製するための方法であって、該トランスジェニック非ヒト動物およびその子孫の体細胞および生殖細胞は、請求項１〜４６のいずれか１項に記載の導入遺伝子を含み、そして該トランスジェニック非ヒト動物およびその子孫は、目的の抗原での免疫化に続いて、該目的の抗原に特異的な所望のアイソタイプの高い親和性の、完全ヒト抗体を産生する方法であり、該方法は、以下：
    （ａ）該導入遺伝子を、胚性幹細胞に導入する工程；
    （ｂ）該胚性幹細胞から、該導入遺伝子を含む生殖細胞を含む、トランスジェニック非ヒト動物を作製する工程；および
    （ｃ）トランスジェニック非ヒト動物およびその子孫を作製するために必要とされる場合に、該トランスジェニック非ヒト動物を交配する工程であって、ここで、該トランスジェニック非ヒト動物およびその子孫は、目的の抗原での免疫化の後に、該目的の抗原に特異的な所望のアイソタイプの高い親和性の、完全ヒト抗体を産生する、工程、
    を包含する、方法。
  55. 請求項５４に記載の方法であって、ここで、前記トランスジェニック非ヒト動物が、マウスである、方法。
  56. 所望のアイソタイプの高い親和性の、完全ヒト抗体を産生するための方法であって、ここで、該抗体は、目的の抗原に特異的であって、該方法は、請求項４９〜５３に記載のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物を、目的の抗体に接触させて、該動物のＢ細胞における抗体産生を誘導する工程、および該抗体を回収する工程を、包含する、方法。
  57. 目的の抗原で免疫化された、請求項４９〜５３にいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物から収集された、抗体産生Ｂ細胞。
  58. 不死化されている、請求項５７に記載のＢ細胞。
  59. 請求項５６に記載の方法であって、ここで、前記抗体は、前記トランスジェニック非ヒト動物の血流から収集される、方法。
  60. 請求項５６に記載の方法であって、ここで、前記抗体が、請求項５８に記載の不死化されたＢ細胞から収集される、方法。
  61. 請求項５６に記載の方法であって、ここで、前記抗体が、請求項５７に記載のＢ細胞から単離されたＤＮＡでトランスフェクトされた宿主細胞から収集される、方法。
  62. 導入遺伝子であって、該導入遺伝子は、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座のＤセグメント遺伝子由来の、ヒト第１４染色体のＤＮＡ配列と同一のＤＮＡ配列を含むＤＮＡフラグメントを含み、Ｊセグメント遺伝子および該遺伝子座のＣμを介する定常領域遺伝子を介して連続しており、ここで、該ＤＮＡフラグメントは、少なくとも１つのヒトＶセグメント遺伝子に作動可能に連結され、そしてここで、該ＤＮＡフラグメントは、さらに、さらなる定常領域に作動可能に連結され、該さらなる定常領域は、以下：
    （１）ヒトスイッチ領域；
    （２）ヒトＣＨ１、Ｃヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３エキソンを含む領域；および
    （３）ヒト膜エキソンを含み、ここで、該ヒトスイッチ領域、該ヒトＣＨ１、Ｃヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３エキソンを含む領域、および該ヒト膜領域エキソンは、異なるアイソタイプ由来である、導入遺伝子。
  63. 導入遺伝子であって、該導入遺伝子は、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座のＤセグメント遺伝子由来の、ヒト第１４染色体のＤＮＡ配列と同一のＤＮＡ配列を含むＤＮＡフラグメントを含み、Ｊセグメント遺伝子および該遺伝子座のＣμを介する定常領域遺伝子を介して連続しており、ここで、該ＤＮＡフラグメントは、少なくとも１つのヒトＶセグメント遺伝子に作動可能に連結され、そしてここで、該ＤＮＡフラグメントは、さらに、さらなる定常領域に作動可能に連結され、該さらなる定常領域は、ヒトスイッチ領域、ヒトＣＨ１、Ｃヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３エキソン、および非ヒト膜エキソンを含み、ここで、該ヒトスイッチ領域、該ヒトＣＨ１、Ｃヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３エキソンを含む領域、および該非ヒト膜領域エキソンは、同じアイソタイプ由来であるか、または異なるアイソタイプ由来である、導入遺伝子。
  64. 導入遺伝子であって、該導入遺伝子は、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座のＤセグメント遺伝子由来の、ヒト第１４染色体のＤＮＡ配列と同一のＤＮＡ配列を含むＤＮＡフラグメントを含み、Ｊセグメント遺伝子および該遺伝子座のＣμを介する定常領域遺伝子を介して連続しており、ここで、該ＤＮＡフラグメントは、少なくとも１つのヒトＶセグメント遺伝子に作動可能に連結され、そしてここで、該ＤＮＡフラグメントは、さらに、さらなる定常領域に作動可能に連結され、該さらなる定常領域は、非ヒトスイッチ領域、ヒトＣＨ１、Ｃヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３エキソン、および非ヒト膜エキソンを含み、ここで、該非ヒトスイッチ領域および該非ヒト膜領域エキソンは、同じ種由来である、導入遺伝子。
  65. 請求項１〜６４のいずれか１項に記載の導入遺伝子であって、ここで、ｌｏｘＰ部位が、スイッチ領域の３’およびＣＨ１エキソンの５’に挿入される、導入遺伝子。
  66. インビトロで、クラス−スイッチを受けるハイブリドーマの産生のための、ｌｏｘＰ部位および定常領域をコードするＤＮＡからなる、ＤＮＡベクター。
  67. インビトロで、クラス−スイッチを受けるハイブリドーマを産生のための方法であって、該方法は、請求項６５に記載の導入遺伝子、請求項６６に記載のベクター、およびＣＲＥリコンビナーゼをハイブリドーマに導入する工程、を包含する、方法。
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