JP2023550785A - 複数のベータコロナウイルスに結合する抗体 - Google Patents

複数のベータコロナウイルスに結合する抗体 Download PDF

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Abstract

本開示は、複数のベータコロナウイルスのＳタンパク質に結合することができる抗体及びその抗原結合断片を提供し、特定の実施形態では、複数のベータコロナウイルスによる感染を中和することができる。

Description

配列表に関する陳述書
本出願に関連する配列表は、紙コピーの代わりにテキスト形式で提供され、本明細書に参照により組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名前は、９３０５８５ ４２０ＷＯ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔである。テキストファイルは２０６ＫＢで、２０２１年１１月２２日に作成され、ＥＦＳ－Ｗｅｂ経由で電子的に提出されている。
新しいベータコロナウイルスが、２０１９年後半に中国武漢で出現した。２０２１年５月８日現在、世界中で約１億５，７００万人（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と呼ばれる）の感染が確認され、約３２７．５万人が死亡しました。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ、ＯＣ４３、及びＨＫＵ１などの他のベータコロナウイルスも、ヒト及び他の種に健康リスクをもたらす。ベータコロナウイルス感染を予防又は治療するための治療、及びベータコロナウイルス感染を診断するための診断試薬が必要である。
特許又は出願ファイルは、色彩を付して作成された少なくとも１の図面を含む。この特許又は特許出願公開の写し及び色彩図面は、請求及び必要な手数料の納付があったときは、特許商標庁により提供される。
図１Ａ及び図１Ｂは、配列番号３６のＶＨ（それぞれ、配列番号３７－３９のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３）及び配列番号４０のＶＬ（それぞれ、配列番号４１－４３のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３）（図１Ａ）及び抗体４２０ １ １（本明細書では抗体Ｓ２Ｐ６とも呼ばれる）を含むモノクローナル抗体４２０ １ ２（本明細書では抗体Ｓ２Ｓ８とも呼ばれる）の結合を示し、配列番号２６のＶＨ（それぞれ、配列番号２７～２９のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３）及び配列番号３０のＶＬ（それぞれ、配列番号３１～３３のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３）（図１Ｂ）を含み、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により測定した異なるヒトβ－コロナウイルスのスパイク（Ｓ）タンパク質である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ（Ｕｒｂａｎｉ株、ＡＡＰ１３４４１）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＢｅｔａＣｏＶ／Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１／２０１９）、ＭＥＲＳ（Ｌｏｎｄｏｎ１／２０１２）、ＯＣ４３及びＨＫＵ１からの融合前安定化Ｓタンパク質を１μｇ／ｍｌで被覆した。陰性対照としてＰＢＳのみを用いた。最大有効濃度の半分（ＥＣ５０）はｎｇ／ｍｌと報告されている。特に断らない限り、本実施例において試験された全ての抗体は、ヒトＩｇＧ１として組換え的に発現された。 図１Ａ及び図１Ｂは、配列番号３６のＶＨ（それぞれ、配列番号３７－３９のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３）及び配列番号４０のＶＬ（それぞれ、配列番号４１－４３のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３）（図１Ａ）及び抗体４２０ １ １（本明細書では抗体Ｓ２Ｐ６とも呼ばれる）を含むモノクローナル抗体４２０ １ ２（本明細書では抗体Ｓ２Ｓ８とも呼ばれる）の結合を示し、配列番号２６のＶＨ（それぞれ、配列番号２７～２９のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３）及び配列番号３０のＶＬ（それぞれ、配列番号３１～３３のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３）（図１Ｂ）を含み、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により測定した異なるヒトβ－コロナウイルスのスパイク（Ｓ）タンパク質である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ（Ｕｒｂａｎｉ株、ＡＡＰ１３４４１）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＢｅｔａＣｏＶ／Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１／２０１９）、ＭＥＲＳ（Ｌｏｎｄｏｎ１／２０１２）、ＯＣ４３及びＨＫＵ１からの融合前安定化Ｓタンパク質を１μｇ／ｍｌで被覆した。陰性対照としてＰＢＳのみを用いた。最大有効濃度の半分（ＥＣ５０）はｎｇ／ｍｌと報告されている。特に断らない限り、本実施例において試験された全ての抗体は、ヒトＩｇＧ１として組換え的に発現された。 図２Ａ～図２Ｄは、モノクローナル抗体４２０ １ ２及び抗体４２０ １ １の、Ｅｘｐｉ－ＣＨＯ細胞において発現される異なるヒトβ－コロナウイルスのＳタンパク質への結合を示す。抗体は、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ Ｆｃ突然変異（「ＭＬＮＳ」）を有する組換えＩｇＧ１として発現させた。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＢｅｔａＣｏＶ／Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１／２０１９；図２Ａ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ（Ｕｒｂａｎｉ株、ＡＡＰ１３４４１；図２Ｂ）、ＯＣ４３（図２Ｃ）及びＭＥＲＳ－ＣｏＶ（Ｌｏｎｄｏｎ１／２０１２；図２Ｄ）からのＳタンパク質への結合をフローサイトメトリーにより測定した。 図２Ａ～図２Ｄは、モノクローナル抗体４２０ １ ２及び抗体４２０ １ １の、Ｅｘｐｉ－ＣＨＯ細胞において発現される異なるヒトβ－コロナウイルスのＳタンパク質への結合を示す。 図２Ａ～図２Ｄは、モノクローナル抗体４２０ １ ２及び抗体４２０ １ １の、Ｅｘｐｉ－ＣＨＯ細胞において発現される異なるヒトβ－コロナウイルスのＳタンパク質への結合を示す。 図２Ａ～図２Ｄは、モノクローナル抗体４２０ １ ２及び抗体４２０ １ １の、Ｅｘｐｉ－ＣＨＯ細胞において発現される異なるヒトβ－コロナウイルスのＳタンパク質への結合を示す。 図３Ａ及び３Ｂは、測定されたＥＬＩＳＡとして、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＢｅｔａＣｏＶ／Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１／２０１９）Ｓからのモノクローナル抗体４２０ １ １（図３Ａ）及び抗体４２０ １ ２（図３Ｂ）のＳ１サブユニット、Ｓ２サブユニット、及び受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）への結合を示す。タンパク質を１μｇ／ｍｌでコ－ティングした。 図３Ａ及び３Ｂは、測定されたＥＬＩＳＡとして、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＢｅｔａＣｏＶ／Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１／２０１９）Ｓからのモノクローナル抗体４２０ １ １（図３Ａ）及び抗体４２０ １ ２（図３Ｂ）のＳ１サブユニット、Ｓ２サブユニット、及び受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）への結合を示す。タンパク質を１μｇ／ｍｌでコ－ティングした。 図４は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ルシフェラーゼレポーターウイルスアッセイを用いたＶｅｒｏＥ６細胞におけるｎｇ／ｍｌでのＩＣ５０として報告された生ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体４２０ １ １の中和活性を示す。抗体「Ｓ３０９」（Ｐｉｎｔｏら、ヒトモノクローナルＳＡＲＳ－ＣｏＶ抗体によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の交差中和、Ｎａｔｕｒｅ ５８３：２９０－２９５（２０２０年７月）を参照）による中和も試験した。データは３つのウェルからのものである。 図５Ａ及び５Ｂは、抗体４２０ １ １（μｇ／ｍｌとして報告されている）によるＶｅｒｏ Ｅ６細胞中のＨｕｈ７細胞中のＭＥＲＳ－ＣｏＶシュードタイプ化ウイルス感染（図５Ａ）及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードタイプ化ウイルス（図５Ｂ）のインビトロ中和を示す。比較抗体ＬＣＡ６０（抗ＭＥＲＳ；Ｃｏｒｔｉら、ＰＮＡＳ １２２（３３）：１０４７３－１０４７８（２０１５））及びＳ３０９による中和も試験した。 図５Ａ及び５Ｂは、抗体４２０ １ １（μｇ／ｍｌとして報告されている）によるＶｅｒｏ Ｅ６細胞中のＨｕｈ７細胞中のＭＥＲＳ－ＣｏＶシュードタイプ化ウイルス感染（図５Ａ）及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードタイプ化ウイルス（図５Ｂ）のインビトロ中和を示す。比較抗体ＬＣＡ６０（抗ＭＥＲＳ；Ｃｏｒｔｉら、ＰＮＡＳ １２２（３３）：１０４７３－１０４７８（２０１５））及びＳ３０９による中和も試験した。 図６Ａ及び６Ｂは、抗体４２０ １ ２によるＶｅｒｏ Ｅ６細胞におけるＨｕｈ７細胞（図６Ａ）及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードタイプ化ウイルス（図６Ｂ）におけるＭＥＲＳ－ＣｏＶシュードタイプ化ウイルス感染のインビトロ中和を示す。比較抗体ＬＣＡ６０及びＳ３０９による中和も試験した。 図６Ａ及び６Ｂは、抗体４２０ １ ２によるＶｅｒｏ Ｅ６細胞におけるＨｕｈ７細胞（図６Ａ）及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードタイプ化ウイルス（図６Ｂ）におけるＭＥＲＳ－ＣｏＶシュードタイプ化ウイルス感染のインビトロ中和を示す。比較抗体ＬＣＡ６０及びＳ３０９による中和も試験した。 図７は、ヒトベータコロナウイルススパイクタンパク質由来の部分的Ｓ２セグメントのアラインメントを示す。融合前外部ドメインのＣ末端部分のリンカー領域を赤い四角で示す。 図８Ａ～８Ｃは、ヒトベータコロナウイルススパイクタンパク質の融合前外部ドメインのＣ末端部分における部分的に保存されたリンカー領域を示す。図８Ａは、異なるヒトβ－コロナウイルス由来の部分的スパイクタンパク質アミノ酸配列のアラインメントを示す。 図８ＢはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を示し、リンカー領域（Ｎ１１５８グリカンを含む正方形の内側領域）を同定する。 図８Ｃは、図８Ｂに示されるリンカー領域の詳細な図を示し、特定のアミノ酸残基を示す（番号付けは、融合前立体配座に従っている）。 図９Ａ～９Ｃは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の構造（図９Ａ）、及び保存リンカー領域及び特定のアミノ酸残基及びＮ１１５８グリカンの詳細図（図９Ｂ）を示す。図９Ｃでは、融合前（下）及び融合後（上）の立体配座の残基が示されている。融合後の画像における残基の番号付けは、シグナルペプチドを説明しない。 図９Ａ～９Ｃは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の構造（図９Ａ）、及び保存リンカー領域及び特定のアミノ酸残基及びＮ１１５８グリカンの詳細図（図９Ｂ）を示す。図９Ｃでは、融合前（下）及び融合後（上）の立体配座の残基が示されている。融合後の画像における残基の番号付けは、シグナルペプチドを説明しない。 図９Ａ～９Ｃは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の構造（図９Ａ）、及び保存リンカー領域及び特定のアミノ酸残基及びＮ１１５８グリカンの詳細図（図９Ｂ）を示す。図９Ｃでは、融合前（下）及び融合後（上）の立体配座の残基が示されている。融合後の画像における残基の番号付けは、シグナルペプチドを説明しない。 図１０は、ＡＣＥ２を過剰発現するためにトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の感染、又はＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスによる選択されたレクチン及び受容体候補のパネルの１つの感染を示す。 図１１は、真正のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＭＯＩ０．１）に感染したＤＣ－ＳＩＧＮ、Ｌ－ＳＩＧＮ、ＳＩＧＬＥＣ１、又はＡＣＥ２を過剰発現した安定なＨＥＫ２９３Ｔ細胞株の顕微鏡写真を示し、次に、固定し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核タンパク質（赤）について２４時間免疫染色した。 図１２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｎｌｕｃ感染２４時間後に測定した、ＤＣ－ＳＩＧＮ、Ｌ－ＳＩＧＮ、ＳＩＧＬＥＣ１、又はＡＣＥ２を過剰発現する安定したＨＥＫ２９３Ｔ細胞株におけるルシフェラーゼレベルの定量化を示す。 図１３は、異なる濃度の抗ＳＩＧＬＥＣ１モノクローナル抗体（クローン７－２３９）及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｎｌｕｃ感染とインキュベートした後の、ＤＣ－ＳＩＧＮ、Ｌ－ＳＩＧＮ、ＳＩＧＬＥＣ１、又はＡＣＥ２を過剰発現する安定したＨＥＫ２９３Ｔ細胞株におけるルシフェラーゼレベルの定量化を示す。 図１４は、ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスによるＤＣ－ＳＩＧＮ、Ｌ－ＳＩＧＮ、ＳＩＧＬＥＣ１、又はＡＣＥ２を過剰発現するために一過性に形質導入された細胞の感染を示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（左図），ＨｅＬａ細胞（中央図），ＭＲＣ５細胞（右図）の結果を示した。 図１５は、ＡＣＥ２ ｓｉＲＮＡで処理した後、ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスに感染させた後の、ＤＣ－ＳＩＧＮ、Ｌ－ＳＩＧＮ、ＳＩＧＬＥＣ１、又はＡＣＥ２を過剰発現する安定したＨＥＫ２９３Ｔ細胞株の感染を示す。 図１６は、異なる濃度の抗ＡＣＥ２抗体（ポリクローナル血清）で処理した後、ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスに感染させた後の、ＤＣ－ＳＩＧＮ、Ｌ－ＳＩＧＮ、ＳＩＧＬＥＣ１、又はＡＣＥ２を過剰発現する安定したＨＥＫ２９３Ｔ細胞株の感染を示す。 図１７Ａは、ヒト肺細胞地図におけるＡＣＥ２、ＤＣ－ＳＩＧＮ（ＣＤ２０９）、Ｌ－ＳＩＧＮ（ＣＬＥＣ４Ｍ）、及びＳＩＧＬＥＣ１の分布及び発現を示す。 図１７Ｂは、重症ＣＯＶＩＤ－１９患者の気管支肺胞洗浄液又は喀痰中に検出可能なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムを有する主要な細胞型の分析を示す。単一細胞遺伝子発現プロファイルは、細胞タイプ別に色分けされ、ウイルス負荷によりサイズ決定された、ｔ－ＳＮＥ（ｔ分布確率的隣接包埋）プロットとして示される。 図１８は、重症ＣＯＶＩＤ－１９患者の気管支肺胞洗浄液又は痰中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムが検出可能な主要細胞型の分析を示す。細胞あたりのウイルスＲＮＡが検出され、対応するｌｏｇＣＰＭ（ｌｏｇ（カウント／百万）；ｘ軸）までの細胞の累積割合（ｙ軸）を、示された細胞型のそれぞれについて示す。 図１９は、ｘ軸に示した受容体遺伝子の転写産物が検出された細胞及びｙ軸に示したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２＋細胞型の細胞数のヒートマップを示す。８人の対象からの合計ｎ＝３，０８５細胞。Ｒｅｎ，Ｘ．ｅｔａｌ．ＣＯＶＩＤ－１９免疫学的特徴は、大規模単一細胞トランスクリプト－ムアトラスによって明らかにされている。細胞、ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０２１．０１．０５３（２０２１）。 図２０は、マクロファージ及び分泌細胞における受容体転写物数（各プロットのｙ軸）とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ数（各プロットのｘ軸）との相関を示す。相関は、Ｒｅｎらのｌｏｇ変換前のカウントに基づいている。 図２１は、ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によるトランス感染の結果を示す。トランス感染プロセスの概略を左の図に示す。ＤＣ－ＳＩＧＮ、Ｌ－ＳＩＧＮ、又はＳＩＧＬＥＣ１で形質導入したＨｅＬａ細胞をＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とインキュベートし、広範囲に洗浄し、Ｖｅｒｏ－Ｅ６－ＴＭＰＲＳＳ２感受性標的細胞と共培養した。標的細胞の有無の結果を右のパネルに示す。 図２２は、ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス吸着を抗ＳＩＧＬＥＣ１ブロッキング抗体の存在下又は非存在下で行ったトランス感染の結果を示す。 図２３は、フローサイトメトリーにより測定した、精製され、蛍光標識されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質又はＲＢＤの指示された細胞株への結合の定量化を示す。「Ａ」はＡＣＥ２を過剰発現する細胞株を示し、「Ｔ」はＴＭＰＲＳＳ２を過剰発現する細胞株を示す。 図２４は、ＲＴ－ｑＰＣＲによって測定した、示された細胞株における細胞性ＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２転写物の定量化を示す。「Ａ」はＡＣＥ２を過剰発現する細胞株を示し、「Ｔ」はＴＭＰＲＳＳ２を過剰発現する細胞株を示す。 図２５は、１５μｇ／ｍｌの指示された抗体によるＣＨＯ－Ｓ細胞の抗体Ｓ２Ｅ１２誘導細胞融合の阻害を示す。 図２６は、ＡＣＥ２の非存在下で蛍光標識したＳ－陰性ＣＨＯ細胞を有するＳ－陽性ＣＨＯ－Ｓ細胞の抗体Ｓ２Ｅ１２誘導単方向融合（輸血とも呼ばれる）を示す。核をＨｏｅｃｈｓｔ色素で染色し、細胞質をＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎで染色した。 図２７は、フローサイトメトリーにより測定されるように、それぞれの付着受容体を安定に過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞上のＤＣ／Ｌ－ＳＩＧＮ、ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＳＩＧＬＥＣ１、又はＡＣＥ２を標的とする抗体の結合の分析を示す。 図２８は、免疫蛍光によって測定されるように、それぞれの付着受容体を安定に過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞上のＤＣ／Ｌ－ＳＩＧＮ、ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＳＩＧＬＥＣ１、又はＡＣＥ２を標的とする抗体の結合の分析を示す。 図２９は、野生型スパイクタンパク質（灰色バー）で偽型化したＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、又はＢ１．１．７系統の突然変異を有するスパイクタンパク質で偽型化したＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による、示された付着受容体を安定に過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞の感染を示す。発光を感染１日後に分析した。 図３０は、フローサイトメトリーにより測定した、精製され、蛍光標識されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（左パネル）又はＲＢＤ（右パネル）の指示された細胞株への結合の定量化を示す。 図３１は、フローサイトメトリーにより測定した、精製され、蛍光標識されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（左パネル）又はＲＢＤ（右パネル）の指示された細胞株への結合の定量化を示す。 図３２は、ハムスター脾細胞への免疫複合体の結合を示す。Ａｌｅｘａ－４８８蛍光免疫複合体（ＩＣ）を滴定（０～２００ｎＭ範囲）し、全ナイ－ブハムスター脾細胞とインキュベートした。死細胞／アポト－シス細胞を排除し、真の単球集団を物理的にゲートすると、サイトメ－タ－で結合が明らかになった。左の図は、ハムスター又はヒトＦｃ抗体（ヒトＳ３０９は緑色、ＧＨ－Ｓ３０９は濃灰色、ＧＨ－Ｓ３０９－Ｎ２９７Ａは青色）で作製したＩＣのハムスター細胞に関連する蛍光強度を示している。２つの複製を１つ示す。右側のパネルは、単球集団全体で測定された複製の相対的Ａｌｅｘａ－４８８平均蛍光強度を示す。 図３３は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２負荷における宿主エフェクタ－機能の役割の分析を示す。シリアンハムスターに、表示量（ｍｇ／ｋｇ）のハムスターＩｇＧ２ａ Ｓ３０９を、ｗｔ又はＦｃサイレンシング（Ｓ３０９－Ｎ２９７Ａ）のいずれかで注射した。上の図は、感染４日後の肺におけるウイルスＲＮＡの定量化を示している。中央のパネルは、感染４日後の肺における複製ウイルスの定量化を示している。下の図は感染４日後の肺の組織病理学的スコアを示している。対照動物（白色記号）に４ｍｇ／ｋｇの無関係な対照アイソタイプ抗体を注射した。Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を用い、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、対照動物と比較した。 図３４は、ベータコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＯＣ４３、及びＨＫＵ１由来のスパイクタンパク質に対する抗体Ｓ２Ｓ４３の結合を示す。算出されたＥＣ５０値をグラフの右側に示す。抗体Ｓ２Ｓ４３は、配列番号４７のＶＨ（それぞれ、配列番号４８～５０のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３）及び配列番号５１のＶＬ（それぞれ、配列番号５２～５４のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３）を含む。 図３５は、抗体Ｓ２Ｓ４３及びＳ２Ｐ６についてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質でシュードタイプ化したＭＬＶによる感染の中和を示す。計算されたＩＣ５０値をグラフの右側に示す。 図３６Ａ及び３６Ｂは、ベータコロナウイルスＭＥＲＳ、ＨＫＵ１、ＯＣ４３、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の融合前スパイクタンパク質に対する抗体Ｓ２Ｐ６（図３６Ａ）及びＳ２Ｓ８（図３６Ｂ）の結合を示す。算出されたＥＣ５０値は各グラフの右側に示されている。 図３６Ａ及び３６Ｂは、ベータコロナウイルスＭＥＲＳ、ＨＫＵ１、ＯＣ４３、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の融合前スパイクタンパク質に対する抗体Ｓ２Ｐ６（図３６Ａ）及びＳ２Ｓ８（図３６Ｂ）の結合を示す。算出されたＥＣ５０値は各グラフの右側に示されている。 図３７は、アルファコロナウイルスＮＬ６３－ＣｏＶ（左パネル）及びｓｓ９Ｅ－ＣｏＶ（右パネル）のスパイクタンパク質に対する抗体Ｓ２Ｓ８及びＳ２Ｐ６の結合を示す。算出されたＳ２Ｓ８結合のＥＣ５０値を示す。 図３８Ａ～３８Ｅは、ＢＬＩにより測定したベータコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（図３７Ａ）、ＳＡＲＳ（図３７Ｂ）、ＯＣ４３（図３７Ｃ）、ＨＫＵ１（図３７Ｄ）及びＭＥＲＳ（図３７Ｅ）の融合前スパイクタンパク質に対する抗体Ｓ２Ｐ６の結合を示す。Ｓ２Ｐ６はＫＤが＜１．０Ｅ－１２Ｍ、Ｋｏｎが４．５３Ｅ＋０５ １／Ｍｓ、Ｋｄｉｓが＜１．０Ｅ－０７ １／ｓのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクに結合した。Ｓ２Ｐ６はＫＤが＜１．０Ｅ－１２ Ｍ、Ｋｏｎが２．３２Ｅ＋０５ １／Ｍｓ、Ｋｄｉｓが＜１．０Ｅ－０７ １／ｓのＳＡＲＳ－ＣｏＶスパイクに結合した。Ｓ２Ｐ６はＫＤが３．７２Ｅ－１０ Ｍ、Ｋｏｎが１．０８Ｅ＋０５ １／Ｍｓ、Ｋｄｉｓが６．７０Ｅ－０５ １／ｓのＯＣ４３スパイクに結合した。Ｓ２Ｐ６はＫＤが２．４４Ｅ－０９ Ｍ、Ｋｏｎが２．３２Ｅ＋０５ １／Ｍｓ、Ｋｄｉｓが５．６６Ｅ－０４ １／ｓのＨＫＵ１スパイクに結合した。Ｓ２Ｐ６はＫＤが１．１４Ｅ－０９ Ｍ、Ｋｏｎが３．０６Ｅ＋０５ １／Ｍｓ、Ｋｄｉｓが３．４８Ｅ－０４ １／ｓのＭＥＲＳスパイクに結合した。抗体Ｓ２Ｓ８は、ＢＬＩを用いてこれらのベータコロナウイルスの融合前スパイクタンパク質に結合することは観察されなかった（データは示さず）。 ＳＡＲＳ（図３７Ｂ）である。 ＯＣ４３（図３７Ｃ）である。 ＨＫＵ１（図３７Ｄ）である。 ＭＥＲＳ（図３７Ｅ）である。 図３９Ａ～３９Ｄは、抗体Ｓ２Ｐ６を用いた４つの異なるベータコロナウイルスによる感染の中和を示す。図３９Ａは、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルス感染の中和を示す。抗体Ｓ３０９を参照として含めた。Ｓ３０９は、配列番号８５に示されるＶＨアミノ酸配列、及び配列番号８９に示されるＶＬアミノ酸配列（それぞれ、配列番号８６－８８及び９０－９２に示されるようなＣＤＲＨ１－Ｈ３及びＬ１－Ｌ３）を含み、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１感染から回復した患者から単離された抗体であった。図３９Ｂは、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞のＳＡＲＳ－ＣｏＶ偽ウイルス感染の中和を示す。図３９Ｃは、Ｈｕｈ ７細胞のＭＥＲＳシュードイルス感染の中和を示す。抗体ＬＣＡ６０を参照として含めた。図３９Ｄは、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞のＰａｎｇＧＤ１９偽ウイルス感染の中和を示す。計算されたＩＣ５０値は、図３９Ａ、３９Ｃ、及び３９Ｄのグラフの右側に示されている。 図３９Ｂは、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞のＳＡＲＳ－ＣｏＶ偽ウイルス感染の中和を示す。 図３９Ｃは、Ｈｕｈ ７細胞のＭＥＲＳシュードイルス感染の中和を示す。 図３９Ｄは、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞のＰａｎｇＧＤ１９偽ウイルス感染の中和を示す。 図４０は、抗体Ｓ２Ｓ８を用いたＭＥＲＳ偽ウイルス（左図）及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルス（右図）による感染の中和を示す。比較抗体ＬＣＡ６０はＭＥＲＳシュードイルスの中和のために示され、比較抗体Ｓ３０９はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の中和のために示されている。 図４１Ａ及び４１Ｂは、抗体Ｓ２Ｐ６及び比較抗体Ｓ３０９を用いた真正のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによる感染の中和を示す。図４１Ａは、ＭＯＩが０．０１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ｌｕｃによるＶｅｒｏＥ６細胞の感染の２４時間での中和を示す。３つのウェルからの結果が示されている。Ｓ２Ｐ６の推定ＥＣ５０は３．４μｇ／ｍＬである。図４１Ｂは、ＭＯＩ０．０１でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によるＶｅｒｏＥ６－ＴＭＰＲＳＳ２細胞の感染の２４時間での中和を示す。Ｓ２Ｐ６の推定ＥＣ５０は１．９μｇ／ｍＬである。 図４１Ｂは、ＭＯＩ０．０１でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によるＶｅｒｏＥ６－ＴＭＰＲＳＳ２細胞の感染の２４時間での中和を示す。 図４２Ａ及び４２Ｂは、比較抗体Ｓ３０９と共に、抗体Ｓ２Ｐ６及びＳ２Ｓ８によるＦｃγＲＩＩＩａ（Ｈ１３１対立遺伝子）（図４２Ａ）及びＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８対立遺伝子）（図４２Ｂ）の活性化を示す。 図４２Ａ及び４２Ｂは、比較抗体Ｓ３０９と共に、抗体Ｓ２Ｐ６及びＳ２Ｓ８によるＦｃγＲＩＩＩａ（Ｈ１３１対立遺伝子）（図４２Ａ）及びＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８対立遺伝子）（図４２Ｂ）の活性化を示す。 図４３は、ＰＥＰｐｅｒＣＨＩＰ（登録商標）Ｐａｎ－Ｃｏｒｏｎａ Ｓｐｉｋｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙを用いて、７つのコロナウイルススパイクタンパク質の各々内の抗体Ｓ２Ｐ６（Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓ Ｆｃ突然変異を有する組換えＩｇＧ１として発現される）によって結合されたコロナウイルススパイクタンパク質モチーフを同定するためのペプチドスキャニングの結果を示す。マイクロアレイには、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｐ０ＤＴＣ２）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｐ５９５９４）、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ａ０１４Ａ０ＡＹＺ５）、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｐ３６３４）、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｕ３ＮＡＩＩ）、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｑ６Ｑ１Ｓ２）、及びＨＣｏＶ－２２９Ｅ（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｐ１５４２３）のスパイクタンパク質が含まれる。各々のスパイクタンパク質配列は、１３アミノ酸のペプチド－ペプチドオーバーラップを有する１５アミノ酸ペプチドに変換される。アレイは、４，５６４個の異なるペプチドを二重に印刷したものである。Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓ（「ＭＬＮＳ」）Ｆｃ突然変異を有する組換えＩｇＧ１として発現される抗体Ｓ２Ｐ６を、１０μｇ／ｍｌの濃度でアレイとインキュベートした。コンセンサスモチーフＦＫＥＥＬＤＫＹＦ（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＳＡＲＳ－ＣｏＶに見出される；配列番号５７）及び類似モチーフＧＩＤＦＱＤＥＬＤＥＦＦＫ（ＭＥＲＳ－ＣｏＶに見出される；配列番号５８）及びＤＦＫＥＥＬＤＱＷＦＫ（ＨＣｏＶ－ＯＣ４３に見出される；配列番号５９）を有する隣接ペプチドについて応答が観察された。これらのモチーフは、融合前外部ドメインの尾部の表面露出リンカー領域に位置する。 図４４は、上述のＰＥＰｐｅｒＣＨＩＰ（登録商標）Ｐａｎ－Ｃｏｒｏｎａ Ｓｐｉｋｅタンパク質マイクロアレイを用いて、７つのコロナウイルススパイクタンパク質の各々について、抗体Ｓ２Ｓ８（ＭＬＮＳ Ｆｃ突然変異を有する組換えＩｇＧ１として発現される）によって結合されたコロナウイルススパイクタンパク質モチーフを同定するためのペプチドスキャニングの結果を示す。コンセンサスモチーフであるＫＦＩＲＳＥＤＬＬＦＮ（配列番号６０）（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＳＡＲＳ－ＣｏＶに見出される）、ＡＲＩＥＤＬＬＦＤ（配列番号６１）（ＭＥＲＳ－ＣｏＶに見出される）、ＳＲＳＡＩＥＬＬＥＤＦＤ（配列番号６２）（ＨＣｏＶ－ＯＣ４３に見出される）、ＲＳＦＦＥＤＬＦ（配列番号６３）（ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１に見出される）、ＲＳＡＬＥＤＬＦＳＫ（配列番号６４）（ＨＣｏＶ－ＮＬ６３に見出される）、及びＧＲＩＥＤＩＬＦＳ（配列番号６５）（ＨＣｏＶ－２２９Ｅに見出される）を有する隣接ペプチドに対して応答が観察された。これらのモチーフは、融合に必要なＳ２’切断部位に位置し、アルファコロナウイルス及びベータコロナウイルスの両方において高度に保存されている。 図４５は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｗｕｈａｎ Ｈｕ－１を鼻腔内投与する前に、シリアンハムスターに抗体Ｓ２Ｐ６（ハムスターＩｇＧ２ａとして発現）を予防投与した結果を示す。感染後の肺のウイルスＲＮＡ（左のパネル）及びウイルス力価（右のパネル）を測定した。 図４６は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＨＫＵ１、ＯＣ４３、及びＭＥＲＳからのスパイクタンパク質に対する抗体Ｓ２Ｘ５２９の結合を示す。 図４７は、ＥＬＩＳＡにより測定した、前融合ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に対する抗体Ｓ２Ｐ６及び抗体Ｓ２Ｓ４３の結合活性（ＥＣ５０）を示す。 図４８は、データが図４７に要約されているアッセイにおける代表的な抗体Ｓ２Ｐ６結合を示す。 図４９は、最尤解析によって推定される代表的なα－及びβ－コロナウイルスＳ糖タンパク質アミノ酸配列の分岐図を示す。ベータコロナウイルスは赤色で強調されている。 図５０は、抗体Ｓ２Ｐ６結合（１０～０．２２μｇ／ｍｌ）のフローサイトメトリー分析の結果を、対数幾何ＭＦＩ（幾何平均蛍光強度）のヒートマップとして示される、全サルベコウイルスクレード（左）及び８つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント（右）を代表する２６のＳ糖タンパク質のパネルに示す。 図５１は、Ｓ－活性化プロテア－ゼＴＭＰＲＳＳ２（ＶｅｒｏＥ６－ＴＭＰＲＳＳ２）陽性又はＴＭＰＲＳＳ２陰性（Ｖｅｒｏ Ｅ６）のＶｅｒｏＥ６細胞を用いて測定した真正のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ２Ｐ６による中和を示す。ＲＢＤ部位ＩＶに結合するモノクローナル抗体Ｓ３０９（Ｐｉｎｔｏ ｅｔ ａｌ．２０２０）を比較のために含める。平均値±ｓ．ｄ．１つの実験から４つの重複が示されている。３つのうち１つの代表的な実験を示す。ＶｅｒｏＥ６－ＴＭＰＲＳＳ２に対する抗体Ｓ２Ｐ６のＩＣ５０は１．８７μｇ／ｍｌであった。ＶｅｒｏＥ６－ＴＭＰＲＳＳ２に対する抗体Ｓ３０９のＩＣ５０は０．０９μｇ／ｍｌであった。ＶｅｒｏＥ６に対する抗体Ｓ２Ｐ６のＩＣ５０は３．６８μｇ／ｍｌであった。ＶｅｒｏＥ６に対する抗体Ｓ３０９のＩＣ５０は０．０２μｇ／ｍｌであった。 図５２は、上図のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｂ．１．１．７ Ｓ、Ｂ．１．３５１ Ｓ及びＰ．１ Ｓ水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）シュードタイプ及び野生型（Ｄ６１４Ｇ）Ｓ ＶＳＶシュードタイプの抗体Ｓ２Ｐ６を介した中和を示す。下のグラフは、野生型（Ｄ６１４Ｇ）Ｓ ＶＳＶシュードタイプに対するＩＣ５０倍の変化として表されるＢ１．１．７、Ｂ．１．３５１及びＰ．１シュードタイプの中和を示す。赤色の上の線は、効力の低下に用いたカットオフ値を示す。 図５３は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ、ＯＣ４３ Ｓ及びＭＥＲＳ－ＣｏＶ Ｓ配列にまたがる直鎖ペプチド（１３残基重複する１５量体ペプチド）への抗体Ｓ２Ｐ６の結合を示す。 図５４は、複数のβ－コロナウイルスに対するβ－コロナウイルスステムヘリックス領域と抗体Ｓ２Ｐ６エピトープ領域との配列を示す。残基番号はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓに準じて表示し、Ｎ－結合グリコシル化セクオンは青色で強調表示する。 図５５は、ＥＬＩＳＡで分析したように、パンデミック前（Ｐ、ｎ＝８８）、ＣＯＶＩＤ－１９回復期（Ｃ、ｎ＝７２）、ワクチン免疫（ＶＩ、ｎ＝９）及びワクチン未投与（ＶＮ、ｎ＝３７）血漿希釈１：１０の種々のβ－コロナウイルスステムヘリックスペプチドへの結合を示す。－ンデミック前の試料のシグナル及び被覆されていないＥＬＩＳＡプレートへの結合に基づいて、カットオフ値０．７を決定した。 図５６は、２１のＣＯＶＩＤ－１９回復期個体由来のβ－コロナウイルス幹ヘリックスペプチドに対する記憶Ｂ細胞結合の分析を示す。各ドットは、ＥＬＩＳＡにおいて幹ヘリックスペプチドに対してスクリ－ニングされたオリゴクローナルＢ細胞を含む個々の培養物を表す（左のパネル）。カットオフ値（０．４）は点線で示す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ／－２及びＯＣ４３（中央のパネル）ならびにＳＡＲＳ－ＣｏＶ／－２及びＨＫＵ１（右のパネル）の反応性の対比較を示す。 図５７は、１６のワクチン由来のβ－コロナウイルス幹ヘリックスペプチドへの記憶Ｂ細胞結合の分析を示す。各ドットは、ＥＬＩＳＡにおいて幹ヘリックスペプチドに対してスクリ－ニングされたオリゴクローナルＢ細胞を含む個々の培養物を表す（左のパネル）。カットオフ値（０．４）は点線で示す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ／－２及びＯＣ４３（中央のパネル）ならびにＳＡＲＳ－ＣｏＶ／－２及びＨＫＵ１（右のパネル）の反応性の対比較を示す。 図５８は、β－コロナウイルスステムヘリックスペプチドに結合するワクチン血漿抗体の縦断的分析を示す。 図５９は、ステムヘリックスペプチドに対する図７６に示されるＳ２Ｐ６抗体のステムヘリックスペプチド結合を示す。（突然変異ＳＨ／ＳＫ）、完全生殖細胞系復帰変異（ＵＣＡ／ＵＣＡ）、成熟軽鎖と対合した生殖細胞系復帰重鎖（ＵＣＡ／ＳＫ）、生殖細胞系復帰軽鎖と対合した成熟重鎖（ＳＨ／ＵＣＡ）。 図５９は、ステムヘリックスペプチドに対する図７６に示されるＳ２Ｐ６抗体のステムヘリックスペプチド結合を示す。（突然変異ＳＨ／ＳＫ）、完全生殖細胞系復帰変異（ＵＣＡ／ＵＣＡ）、成熟軽鎖と対合した生殖細胞系復帰重鎖（ＵＣＡ／ＳＫ）、生殖細胞系復帰軽鎖と対合した成熟重鎖（ＳＨ／ＵＣＡ）。 図６０は、ＥＬＩＳＡにより分析した抗体Ｓ２Ｐ６の存在下でのＡＣＥ２へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓの結合を示す。Ｓ２Ｅ１２（Ｔｏｒｔｏｒｉｃｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３７０（６５１９）：９５０－９５７（２０２０））を陽性対照として含めた。 図６１は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳでトランスフェクトしたＶｅｒｏ－Ｅ６細胞を用いた抗体Ｓ２Ｐ６による細胞－細胞融合の阻害を示す。Ｓ２Ｍ１１（トルトリシら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３７０（６５１９）：９５０－９５７（２０２０）））を陽性対照として含めた。融合値の阻害は、ｍＡｂを含まない融合のパーセンテージ（１００％）及び非トランスフェクト細胞の融合のパーセンテージ（０％）に正常化された。 図６２は、ＥｘｐｉＣＨＯ標的細胞の表面で発現された完全長野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓに抗体Ｓ２Ｐ６が結合すると、ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８、左）又はＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１３１、右）を安定して発現するＪｕｒｋａｔ細胞において誘導されるＮＦＡＴ駆動ルシフェラーゼシグナルを示す。Ｓ３０９は陽性対照として含まれる。ＲＬＵは相対ルミネセンス単位を表す。 図６３は、細胞エフェクタ－機能の抗体Ｓ２Ｐ６活性化を示す。標的細胞としてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＨａｌｏＴａｇ－ＨｉＢｉｔ－ｔａｇｇｅｄを安定に発現するように遺伝子操作された）及びエフェクタ－細胞としてＰＢＭＣを用いた抗体媒介ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害性）アッセイのアッセイ結果を左のグラフに示す。ＮＫ細胞媒介性殺傷の大きさは、特異的溶解のパーセンテージで表される。食細胞（単球）の供給源としてＣｅｌｌ－Ｔｒａｃｅ－Ｖｉｏｌｅｔ標識ＰＢＭＣ及び標的細胞としてＰＫＨ６７蛍光標識Ｓ－発現ＣＨＯ細胞を用いる抗体媒介ＡＤＣＰ（抗体依存性細胞貪食）アッセイのアッセイ結果を中央のグラフに示す。ｙ軸は、抗ＣＤ１４（単球）マーカー及びＰＫＨ６７に対して二重陽性の単球のパーセンテージを示す。補体（ＣＤＣアッセイ）存在下でのｍＡｂによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の溶解に関するアッセイ結果を右のグラフに示す。抗体プロットは図６２のとおりである。 図６４は、プロトタイプＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｗｕｈａｎ－１関連）を鼻腔内投与する前に、ハムスター（Ｈｍ）又はヒト（Ｈｕ）定常領域のいずれかを有する抗体Ｓ２Ｐ６を投与したシリアンハムスターにおける試験結果を示す。 ウイルスＲＮＡ量を左のグラフに、複製中のウイルス力価を右のグラフに示す。＊Ｐ＜０．０５、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定。 図６５は、２０ｍｇ／ｋｇのヒト抗体Ｓ２Ｐ６の予防的投与後のシリアンハムスターにおける結果を示す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｂ．１．３５１ ＶＯＣを抗体投与した後、ハムスターを攻撃感染させた。ウイルスＲＮＡ量を左のグラフに、複製中のウイルス力価を右のグラフに示す。 図６６は、ＥＬＩＳＡによる融合β－コロナウイルスＳ外部ドメイン三量体への抗体Ｓ２Ｐ６（左図）及び抗体Ｓ２Ｓ４３（右図）の結合を示す。 図６７Ａ～６７Ｃは、全てのサルベコウイルスクレード及び８つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントを表す２６のＳ糖タンパク質のパネルに結合する抗体Ｓ２Ｐ６についてフローサイトメトリーで測定した場合の幾何平均蛍光強度を示す。 図６７Ａ～６７Ｃは、全てのサルベコウイルスクレード及び８つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントを表す２６のＳ糖タンパク質のパネルに結合する抗体Ｓ２Ｐ６についてフローサイトメトリーで測定した場合の幾何平均蛍光強度を示す。 図６７Ａ～６７Ｃは、全てのサルベコウイルスクレード及び８つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントを表す２６のＳ糖タンパク質のパネルに結合する抗体Ｓ２Ｐ６についてフローサイトメトリーで測定した場合の幾何平均蛍光強度を示す。 図６８は、スパイクアミノ酸配列の最尤分析を介して推定されるサルベコウイルスの系統樹を示す。 図６９は、固定化前融合β－コロナウイルスＳ三量体への抗体Ｓ２Ｐ６ Ｆａｂ結合のＳＰＲ（表面プラスモン共鳴）分析を示す。 図７０は、ｐＨ７．４及びｐＨ５．４における固定化前融合ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ外部ドメイン三量体への抗体Ｓ２Ｐ６ Ｆａｂ及びＩｇＧの結合のＳＰＲ分析を示す。 図７１は、示されたステムヘリックスペプチドアミノ酸位置における（ヒートマップの左側に沿った）各可能なアミノ酸置換を有するステムヘリックスペプチド（ヒートマップの下部のアミノ酸配列）への抗体Ｓ２Ｐ６の結合（蛍光強度）のヒートマップを示す。右側の目盛りの勾配は、交差した正方形として示されている天然残基（白と定義）と比較した場合の結合の喪失の程度を示す。緑／点線の四角は、天然残基と比較して結合を増強する置換を示す。アスタリスクは、抗体Ｓ２Ｐ６ウイルスの逃避において見出される置換を強調する。 図７２は、ＧＩＳＡＩＤから回収されたヒト及び動物宿主とβ－コロナウイルス配列間のエピトープ保存を示す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のコンセンサス配列はｘ軸に報告されており、主な置換は太字で示す。 図７３Ａ～７３Ｆは、試験された各個体について、回復期の個体由来のＩｇＧ記憶Ｂ細胞のβ－コロナウイルス幹ヘリックスペプチドへの結合を示す。カットオフ値（ＯＤ＝０．４）は点線で示し、各抗原について陽性培養の頻度を報告する。 図７３Ａ～７３Ｆは、試験された各個体について、回復期の個体由来のＩｇＧ記憶Ｂ細胞のβ－コロナウイルス幹ヘリックスペプチドへの結合を示す。カットオフ値（ＯＤ＝０．４）は点線で示し、各抗原について陽性培養の頻度を報告する。 図７３Ａ～７３Ｆは、試験された各個体について、回復期の個体由来のＩｇＧ記憶Ｂ細胞のβ－コロナウイルス幹ヘリックスペプチドへの結合を示す。カットオフ値（ＯＤ＝０．４）は点線で示し、各抗原について陽性培養の頻度を報告する。 図７３Ａ～７３Ｆは、試験された各個体について、回復期の個体由来のＩｇＧ記憶Ｂ細胞のβ－コロナウイルス幹ヘリックスペプチドへの結合を示す。カットオフ値（ＯＤ＝０．４）は点線で示し、各抗原について陽性培養の頻度を報告する。 図７３Ａ～７３Ｆは、試験された各個体について、回復期の個体由来のＩｇＧ記憶Ｂ細胞のβ－コロナウイルス幹ヘリックスペプチドへの結合を示す。カットオフ値（ＯＤ＝０．４）は点線で示し、各抗原について陽性培養の頻度を報告する。 図７３Ａ～７３Ｆは、試験された各個体について、回復期の個体由来のＩｇＧ記憶Ｂ細胞のβ－コロナウイルス幹ヘリックスペプチドへの結合を示す。カットオフ値（ＯＤ＝０．４）は点線で示し、各抗原について陽性培養の頻度を報告する。 図７４Ａ～７４Ｄは、試験された各個体に対するワクチン由来のＩｇＧ記憶Ｂ細胞のβ－コロナウイルス幹ヘリックスペプチドへの結合を示す。カットオフ値（ＯＤ＝０．４）は点線で示し、各抗原について陽性培養の頻度を報告する。 図７４Ａ～７４Ｄは、試験された各個体に対するワクチン由来のＩｇＧ記憶Ｂ細胞のβ－コロナウイルス幹ヘリックスペプチドへの結合を示す。カットオフ値（ＯＤ＝０．４）は点線で示し、各抗原について陽性培養の頻度を報告する。 図７４Ａ～７４Ｄは、試験された各個体に対するワクチン由来のＩｇＧ記憶Ｂ細胞のβ－コロナウイルス幹ヘリックスペプチドへの結合を示す。カットオフ値（ＯＤ＝０．４）は点線で示し、各抗原について陽性培養の頻度を報告する。 図７４Ａ～７４Ｄは、試験された各個体に対するワクチン由来のＩｇＧ記憶Ｂ細胞のβ－コロナウイルス幹ヘリックスペプチドへの結合を示す。カットオフ値（ＯＤ＝０．４）は点線で示し、各抗原について陽性培養の頻度を報告する。 図７５は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に対する高い反応（左上のグラフ）及びパンデミック前の２人の個人（右上と下のグラフ）を示す最初のワクチン投与後の免疫個体由来のＩｇＧ記憶Ｂ細胞のベータコロナウイルス幹ヘリックスペプチドへの結合を示している。 図７６は、抗体Ｓ２Ｐ６未突然変異共通祖先（ＵＣＡ）（上部）、Ｓ２Ｐ６野生型、及びＳ２Ｐ６完全生殖細胞系復帰バリアントの可変領域アミノ酸配列のアラインメントを示す。ＣＤＲ領域は灰色で強調表示されます。 図７７は、種々のβ－コロナウイルスのステムヘリックスペプチドに対する図７６のＳ２Ｐ６抗体の結合を示す。 図７８は、抗体Ｓ２Ｓ４３ ＵＣＡ及び野生型Ｓ２Ｓ４３のＶＨ及びＶＬアミノ酸配列のアラインメントを示す。 図７９は、抗体Ｓ２Ｐ６及びＳ２Ｓ４３の遺伝子使用及びその他の特性を示す表を提供する。
本明細書で提供される抗体及び抗原結合断片は、ベータコロナウイルス（例えば、本明細書に記載されているように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＯＣ４３、又はＨＫＵの表面糖タンパク質）に結合することができる抗体及び抗原結合断片である。ある実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、２以上（例えば、２、３、４、５又はそれ以上）のベータコロナウイルスの表面糖タンパク質に結合することができる。ある実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、ベータコロナウイルスビリオンの表面糖タンパク質及び／又はベータコロナウイルスに感染した細胞の表面上に発現される表面糖タンパク質に結合することができる。ある実施形態において、現在開示されている抗体及び抗原結合断片は、感染のインビトロモデル及び／又はヒト対象において、２、３、４、又は５種類のベータコロナウイルスによる感染を中和することができる。特定のさらなる実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、アルファコロナウイルス表面糖タンパク質に結合することができる。また、抗体及び抗原結合断片、ベクター、宿主細胞、及び関連組成物をコードするポリヌクレオチド、ならびに対象中の任意の２、３、４、又は５種類のベータコロナウイルスによる感染を治療する（例えば、減少させる、遅延させる、除去する、又は予防する）ための抗体、核酸、ベクター、宿主細胞、及び関連組成物の使用方法、及び／又は任意の２、３、４、又は５種類のベータコロナウイルスによる対象中の感染を治療するための医薬の製造においても提供される。
本開示をより詳細に記載する前に、本明細書で使用される特定の用語の定義を提供することは、その理解に役立つことがある。さらなる定義は、本開示全体を通して記載される。
本明細書中で使用される場合、「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」は、本明細書中では「武漢海産食品市場フェノミアウイルス」、又は「武漢コロナウイルス」もしくは「武漢コロナウイルス」、又は「新規ＣｏＶ」、もしくは「ｎＣｏＶ」、もしくは「２０１９ ｎＣｏＶ」、もしくは「Ｗｕｈａｎ ｎＣｏＶ」とも呼ばれ、又は「Ｗｕｈａｎ ｎＣｏＶ」は、系統Ｂ（サルベコウイルス）であると考えられるベータコロナウイルスである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、中国の湖北省武漢で２０１９年後半に初めて同定され、２０２０年初頭までに中国国内及び世界の他の地域に広がった。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の症状には、発熱、乾性咳嗽、呼吸困難などがある。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２分離株Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１のゲノム配列は配列番号１（ＧｅｎＢａｎｋ ＭＮ９０８９４７．３、２０２０年１月２３日）に提供され、ゲノムのアミノ酸翻訳は配列番号２（ＧｅｎＢａｎｋ ＱＨＤ４３４１６．１、２０２０年１月２３日）に提供される。他のコロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳＣｏＶ－１）と同様に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含む「スパイク」又は表面（「Ｓ」）Ｉ型膜貫通糖タンパク質を含む。ＲＢＤは、細胞表面受容体アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）に結合することによって、系統Ｂ型ＳＡＲＳコロナウイルスの呼吸上皮細胞への侵入を媒介すると考えられている。特に、ウイルスＲＢＤにおける受容体結合モチーフ（ＲＢＭ）はＡＣＥ２と相互作用すると考えられている。
Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１表面糖タンパク質のアミノ酸配列を配列番号３に示す。Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１ ＲＢＤのアミノ酸配列は、配列番号４に提供される。Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１ Ｓタンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ Ｓタンパク質と約７３％のアミノ酸配列同一性を有する。Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１ ＲＢＭのアミノ酸配列は、配列番号５に提供される。Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１ ＲＢＤはＳＡＲＳ－ＣｏＶ ＲＢＤと約７５～７７％のアミノ酸配列類似性を有し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭはＳＡＲＳ－ＣｏＶ ＲＢＭと約５０％のアミノ酸配列類似性を有する。本明細書中で別段の指示がない限り、「Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１」は、配列番号２、３、４、及び５のいずれか１つ以上に記載されるアミノ酸配列を、場合により配列番号１に記載されるゲノム配列と共に含むウイルスを指す。
新興のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株が多数存在する。いくつかのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントは、ヒトＡＣＥ２受容体に対する増強された結合親和性を有するＮ４３９Ｋ突然変異を含む（Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｅ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントＮ４３９Ｋは、抗体媒介性免疫を回避しながら適応性を維持する）。ｂｉｏＲｘｉｖ，２０２０．いくつかのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントは、伝播性の増加と関連するＮ５０１Ｙ変異（２０Ｉ／５０１Ｙ．Ｖ１及びＶＯＣ ２０２０１２／０１としても知られる）及びＢ．１．３５１（２０Ｈ／５０１Ｙ．Ｖ２としても知られる）（Ｌ１８Ｆ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４Ｇ、及びＡ７０１Ｖ変異としても知られる）を含み、それぞれ英国及び南アフリカで発見された（Ｔｅｇａｌｌｙ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ及び南アフリカにおける新しい重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）系統）。ｍｅｄＲｘｉｖ，２０２０：ｐ．２０２０．２１．２０２４８６４０；Ｌｅｕｎｇ，Ｋ．ら、英国におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ５０１Ｙ突然変異株の初期の経験的評価、２０２０年１０月～１１月。ｍｅｄＲｘｉｖ，２０２０：ｐ．２０２０．１２．２０．２０２４８５８１．Ｂ．１．３５１はまた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質のＲＢＤドメインにおける２つの他の突然変異、Ｋ４１７Ｎ及びＥ４８４Ｋ（Ｔｅｇａｌｌｙ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ及び南アフリカにおける複数のスパイク突然変異を伴う新しい重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）系統の急速な拡大）も含む。ｍｅｄＲｘｉｖ，２０２０：ｐ．２０２０．１２．２１．２０２４８６４０。他のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントには、ブラジルで初めて報告された系統Ｂ．１．１．２８、日本で初めて報告された系統Ｐ．１（２０Ｊ／５０１Ｙ．Ｖ３としても知られる）、米国カリフォルニア州で初めて報告された系統Ｌ４５２Ｒ（Ｐａｎ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉａ，Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｕｐｄａｔｅ：Ａｍｅｒｉｃａｓ，２０２１年１月２０日、ｒｅｌｉｅｆｗｅｂ．ｉｎｔ／ｓｉｔｅｓ／ｒｅｌｉｅｆｗｅｂ．ｉｎｔ／ｆｉｌｅｓ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／２０２１－ｊａｎ－２０－ｐｈｅ－ｅｐｉ－ｕｐｄａｔｅ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２．ｐｄｆで入手可能）がある。他のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントには、クレード１９ＡのＳＡＲＳ ＣｏＶ－２；クレード１９ＢのＳＡＲＳ ＣｏＶ－２；クレード２０ＡのＳＡＲＳ ＣｏＶ－２；クレード２０ＢのＳＡＲＳ ＣｏＶ－２；クレード２０ＣのＳＡＲＳ ＣｏＶ－２；クレード２０ＥのＳＡＲＳ ＣｏＶ－２；クレード２０ＦのＳＡＲＳ ＣｏＶ－２；クレード２０ＧのＳＡＲＳ ＣｏＶ－２；クレード２０ＧのＳＡＲＳ ＣｏＶ－２；及びクレード２０ＧのＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ Ｂ１．１．２０７；及びＲａｍｂａｕｔ，Ａら、ゲノム疫学を支援するためのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２系統の動的命名法案に記載されている他のＳＡＲＳ ＣｏＶ－２系統がある。Ｎａｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５，１４０３２－１４０７（２０２０）．Ｄ６１４Ｇ突然変異を含むバリアントは、Ａ２３．１、Ｂ．１．４２９、Ｂ．１．２５８、Ｂ．１．１．３１８、Ｒ．２、Ｂ．１．５２８、Ｂ．１．５２６、及びＢ．１．６１７を含む。前述のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント、及びそのアミノ酸及びヌクレオチド配列は、参照により本明細書に組み込まれる。従って、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、Ｗｕｈａｎ Ｈｕ－１及び現在開示されているバリアントを含むそのバリアントを含むことが理解されるであろう。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶは、感染者の呼吸器症状を引き起こす別のベータコロナウイルスである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ Ｕｒｂａｎｉ株のゲノム配列はＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＰ１３４４１．１である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ表面糖タンパク質（「Ｓタンパク質」）のアミノ酸配列は、配列番号２２に提供される。
ヒトコロナウイルスＯＣ４３もベータコロナウイルスである。ＯＣ４３表面糖タンパク質（「Ｓタンパク質」）のアミノ酸配列は、配列番号２３（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＹ５８５２２９．１も参照のこと）に提供される。
ＭＥＲＳ－ＣｏＶもまた別のベータコロナウイルスである。ＭＥＲＳ－ＣｏＶ株Ｌｏｎｄｏｎ １／２０１２表面糖タンパク質（「Ｓタンパク質」）のアミノ酸配列は、配列番号２４（ＧｅｎＢａｎｋ ＫＣ１６４５０５も参照のこと）に提供される。
ヒトコロナウイルスＨＫＵ１は別のベータコロナウイルスである。ＨＫＵ１表面糖タンパク質（「Ｓタンパク質」）のアミノ酸配列は配列番号２５に示されている（ＧｅｎＢａｎｋ ＹＰ １７３２３８も参照）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２はＡＣＥ２に結合するが、他のベータコロナウイルスは他の受容体に結合することによって細胞に侵入すると考えられている。例えば、ＭＥＲＳ－ＣｏＶはジペプチジルペプチダーゼ－４（ＤＰＰ４）に結合すると考えられており、ＯＣ４３及びＨＫＵ１は９－Ｏ－アセチル化シアル酸（９－Ｏ－Ａｃ－Ｓｉａ）受容体に結合すると考えられている。
本明細書では、特に断らない限り、任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、比率範囲、又は整数範囲は、列挙された範囲内の任意の整数の値、及び、適宜、それらの分数（整数の１０分の１及び１００分の１など）を含むと理解されるべきである。また、特に断らない限り、ポリマーサブユニット、サイズ又は厚さのような任意の物理的特徴に関して本明細書に記載される任意の数の範囲は、列挙された範囲内の任意の整数を含むと理解されるべきである。本明細書中で使用される場合、用語「約」は、特に断らない限り、示された範囲、値、又は構造の±２０％を意味する。本明細書で使用される用語「ａ」及び「ａｎ」は、列挙された成分の「１つ以上」を指すことが理解されるべきである。選択肢（例えば、「又は」）の使用は、選択肢の１つ、両方、又はそれらの任意の組み合わせのいずれかを意味するものと理解されるべきである。本明細書中で使用される場合、用語「含む」、「有する」、及び「含む」は同義的に使用され、その用語及び変種は、非限定的として解釈されることを意図される。
「任意の」又は「任意に」とは、後に説明される要素、構成要素、事象、又は状況が発生し得るか、又は発生し得ないこと、及び説明には、要素、構成要素、事象、又は状況が発生するインスタンス、及びそれらが発生しないインスタンスが含まれることを意味する。
さらに、本明細書に記載される構造及びサブユニットの種々の組み合わせから誘導される個々の構築物又は構築物のグループは、各構築物又は構築物のグループが個別に記載された場合と同じ程度に、本出願により開示されることが理解されるべきである。したがって、特定の構造又は特定のサブユニットの選択は、本開示の範囲内である。
「本質的になる」という用語は、「含む」と同等ではなく、クレームの特定の材料若しくは工程、又はクレームされた主題事項の基本的特徴に実質的な影響を及ぼさないものを指す。例えばードメイン、領域、モジュール、又はタンパク質のアミノ酸配列がードメイン、領域、モジュール、又はタンパク質の長さの最大２０％（例えば、最大１５％、１０％、８％、６％、５％、４％、３％、２％又は１％）に寄与するードメイン、領域、又はモジュールの伸長、欠失、突然変異、又はそれらの組み合わせ（例えば、アミノオ－ルカルボキシ末端又はドメイン間のアミノ酸）を含む場合、タンパク質ドメイン、領域、又はモジュール（例えば、結合ドメイン）又はモジュール（例えば、結合ドメイン）又はモジュール（例えば、結合ドメイン）は、「本質的に」特定のアミノ酸配列からなる。又はタンパク質であってードメイン、領域、モジュール、又はタンパク質（例えば結合タンパク質の標的結合親和性）の活性に実質的な影響を及ぼさず（すなわち、活性が５０％を超えないように、例えば、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％又は１％を超えないように）、実質的には低下しない。
本明細書中で使用される場合、「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によりコードされるもの、ならびに後に修飾されるアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタミン酸、及びＯ－ホスホセリンである。アミノ酸類似体とは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を有する化合物、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基に結合するα炭素、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。このような類似体は修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）又は修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学構造を保持する。「アミノ酸模倣薬」とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する化合物をいう。
本明細書中で用いる場合、「突然変異」とは、それぞれ、参照又は野生型核酸分子又はポリペプチド分子と比較した、核酸分子又はポリペプチド分子の配列の変化を指す。突然変異は、ヌクレオチド又はアミノ酸の置換、挿入又は欠失を含む、配列におけるいくつかの異なるタイプの変化をもたらすことができる。
「保存的置換」とは、特定のタンパク質の結合特性に大きな影響を与えたり、変化させたりしないアミノ酸置換を指す。一般に、保存的置換とは、置換されたアミノ酸残基を、同様の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えることである。保存的置換には、次のグループのいずれかに見られる置換が含まれます。グループ１：アラニン（ＡｌａまたはＡ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、スレオニン（ＴｈｒまたはＴ）。グループ２：アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＺ）。グループ３：アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）。グループ４：アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、リジン（ＬｙｓまたはＫ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）。グループ５：イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、バリン（ＶａｌまたはＶ）。グループ６：フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）。さらに、または代わりに、アミノ酸は、同様の機能、化学構造、または組成（例えば、酸性、塩基性、脂肪族、芳香族、または硫黄含有）によって保存的置換グループに分類することができます。例えば、脂肪族グループには、置換の目的で、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅが含まれ得る。他の保存的置換グループには以下が含まれます。硫黄含有：Ｍｅｔおよびシステイン（ＣｙｓまたはＣ）；酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ。小さな脂肪族、非極性またはわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、およびＧｌｙ。極性の負に帯電した残基とそのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ。極性、正に荷電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、およびＬｙｓ。大きな脂肪族、非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ。大きな芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ。追加情報は、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗ．Ｈ．フリーマン・アンド・カンパニーに記載されている。
本明細書中で使用される場合、「タンパク質」又は「ポリペプチド」とは、アミノ酸残基のポリマーを指す。タンパク質は、天然に存在するアミノ酸ポリマー、ならびに１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸、及び非天然に存在するアミノ酸ポリマーの人工化学的模倣物であるアミノ酸ポリマーに適用される。本開示のタンパク質、ペプチド、及びポリペプチドの変種もまた意図される。ある実施形態において、変異型タンパク質、ペプチド、及びポリペプチドは、本明細書に記載される定義又は参照アミノ酸配列のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９．９％同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
「核酸分子」又は「ポリヌクレオチド」又は「ポリ核酸」とは、天然サブユニット（例えば、プリン又はピリミジン塩基）又は非天然サブユニット（例えば、モルホリン環）から構成され得る共有結合ヌクレオチドを含むポリマー化合物を指す。プリン塩基にはアデニン、グアニン、ヒポキサンチン、及びキサンチンが含まれ、ピリミジン塩基にはウラシル、チミン、及びシトシンが含まれる。核酸分子には、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ウイルスゲノムＲＮＡ、及び合成ＲＮＡを含むポリリボ核酸、及びｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡを含むポリデオキシリボ核酸が含まれ、これらは一本鎖又は二本鎖であってもよい。一本鎖の場合、核酸分子はコード鎖又は非コード（アンチセンス）鎖であり得る。アミノ酸配列をコードする核酸分子は、同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。ヌクレオチド配列のいくつかのバージョンはまた、イントロンが転写後クーラー機構を介して除去される程度までイントロンを含み得る。言い換えると、異なるヌクレオチド配列は、遺伝暗号の重複又は縮重の結果として、又はスプライシングによって、同じアミノ酸配列をコードし得る。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオシド、ｃａｐ－１構造、ｃａｐ－２構造、又はそれらの任意の組合せを含む。ある実施形態において、ポリヌクレオチドは、プソイドウリジン、Ｎ６－メチルアデノンシン、５－メチルシチジン、２－チオウリジン、又はそれらの任意の組合せを含む。いくつかの実施形態において、プソイドウリジンは、Ｎ１－メチルプソイドウリジンを含む。これらの特徴は、当技術分野で公知であり、例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ＤＯＩ＝１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１９．００５９４ （２０１９）；Ｅｙｌｅｒ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ １１６（４６）：２３０６８－２３０７１；ＤＯＩ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１８２１７５４１１６（２０１９）；Ｎａｎｃｅ ａｎｄ Ｍｅｉｅｒ，ＡＣＳ Ｃｅｎｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０２１、７、５、７４８－７５６；ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ａｃｓｃｅｎｔｓｃｉ．１ｃ００１９７（２０２１）、及びｖａｎ Ｈｏｅｃｋｅ ａｎｄ Ｒｏｏｓｅ，Ｊ．Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄ １７：５４（２０１９）；修飾されたヌクレオシド及びｍＲＮＡ特徴を本明細書に参考として援用する。
本開示の核酸分子のバリアントもまた意図される。変異型核酸分子は、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％であり、好ましくは、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％、９９％、又は９９．９％同一であるか、又は約４２℃で０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、及び５０％ホルムアミドのストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でポリヌクレオチドにハイブリダイズする。核酸分子バリアントは、標的分子の結合など、本明細書に記載の機能性を有するその結合ドメインをコードする能力を保持する。
「パーセント配列同一性」とは、配列を比較することによって決定される、２つ以上の配列間の関係を指す。配列同一性を決定するための好ましい方法は、比較される配列間の最良の一致を与えるように設計される。例えば、配列は、最適な比較目的のためにアラインメントされる（例えば、ギャップは、最適なアラインメントのために、第１及び第２のアミノ酸又は核酸配列の一方又は両方に導入され得る）。さらに、非相同配列は、比較目的のために無視することができる。本明細書中で参照されるパーセント配列同一性は、特に断らない限り、参照配列の長さにわたって計算される。配列の同一性及び類似性を決定する方法は、公に入手可能なコンピュータ・プログラムに見出すことができる。配列アラインメント及びパーセント同一性の計算は、ＢＬＡＳＴプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ ２．０、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、又はＢＬＡＳＴＸ）を使用して行うことができる。ＢＬＡＳＴプログラムで使用される数学的アルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２５：３３８９－３４０２，１９９７にみられる。本開示の文脈において、配列分析ソフトウェアが分析に使用される場合、分析の結果は、参照されるプログラムの「デフォルト値」に基づくことが理解されるであろう。「デフォルト値」とは、最初に初期化されたときにソフトウェアに最初にロードされた値又はパラメータのセットを意味する。
用語「単離された」は、物質がその元の環境（例えば、自然に存在する場合、自然環境）から除去されることを意味する。例えば、生きている動物中に存在する天然に存在する核酸又はポリペプチドは単離されないが、天然系中の共存物質の一部又は全部から分離された同一の核酸又はポリペプチドが単離される。そのような核酸はベクターの一部であり得、及び／又はそのような核酸又はポリペプチドは組成物（例えば、細胞溶解物）の一部であり得、そのようなベクター又は組成物が核酸又はポリペプチドの天然環境の一部ではないという点で依然として単離され得る。「単離された」とは、いくつかの実施形態において、ヒトの体外にある抗体、抗原結合断片、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、又は組成物も記載することができる。
用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の生成に関与するＤＮＡ又はＲＮＡのセグメントを意味し、ある状況では、コード領域（例えば、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）及び３’ＵＴＲ）の前後の領域、ならびに個々のコードセグメント（エキソン）間の介在配列（イントロン）を含む。
「機能性バリアント」とは、本開示の親化合物又は参照化合物と構造的に類似しているか又は実質的に類似しているが、組成がわずかに異なる（例えば、１つの塩基、原子又は官能基が異なる、付加される、又は除去される）ポリペプチド又はコードされるポリペプチドが、親ポリペプチドの少なくとも５０％の効率、好ましくは少なくとも５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％、９９％、９９％、９９．９％、又は１００％の活性レベルで親ポリペプチドの少なくとも１つの機能を実施することができるようなポリペプチド又はポリヌクレオチドを指す。換言すれば、本開示のポリペプチド又はコード化されたポリペプチドの機能的バリアントは、結合親和性を測定するためのアッセイ（例えば、結合（Ｋａ）又は解離（ＫＤ）定数を測定するＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）又は四量体染色）など、選択されたアッセイにおいて、親ポリペプチド又は参照ポリペプチドと比較して性能が５０％以下である場合、「類似の結合」、「類似の親和性」又は「類似の活性」を有する。
本明細書中で用いる「機能的部分」又は「機能的断片」とは、親又は参照化合物のドメイン、部分又は断片のみを含むポリペプチド又はポリヌクレオチドを指し、ポリペプチド又はコード化されたポリペプチドは、親又は参照化合物のドメイン、部分又は断片、好ましくは親又は参照化合物の少なくとも５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％、９９％、９９％、９９％、又は１００％の活性レベルに関連する少なくとも５０％の活性を保持し、又は生物学的利益（例えば、エフェクタ－機能）を提供する。本開示のポリペプチド又はコードされたポリペプチドの「機能的部分」又は「機能的断片」は、機能的部分又は断片が、親ポリペプチド又は参照ポリペプチドと比較して選択されたアッセイにおける性能の５０％以下の低下（好ましくは親和性に関して親ポリペプチド又は参照ポリペプチドと比較して２０％以下もしくは１０％以下、又は対数以下の差）を示す場合、「類似の結合」又は「類似の活性」を有する。
本明細書中で使用される場合、用語「操作された」、「組換え体」、又は「非天然」は、少なくとも１つの遺伝子改変を含む、又は外因性又は異種性核酸分子の導入によって改変された、生物、微生物、細胞、核酸分子、又はベクターを指し、ここで、かかる改変又は改変は、遺伝子工学（すなわち、ヒト介入）によって導入される。遺伝子改変には、例えば、機能性ＲＮＡ、タンパク質、融合タンパク質もしくは酵素、又は他の核酸分子の付加、欠失、置換、又は細胞の遺伝物質の他の機能的破壊をコードする発現可能な核酸分子を導入する改変が含まれる。さらなる修飾には、例えば、修飾がポリヌクレオチド、遺伝子又はオペロンの発現を変化させる非コード調節領域が含まれる。
本明細書中で使用される場合、「異種性」又は「非内因性」又は「外因性」とは、宿主細胞又は対象に対して天然ではない任意の遺伝子、タンパク質、化合物、核酸分子、又は活性、又は改変された宿主細胞又は対象に対して天然ではない任意の遺伝子、タンパク質、化合物、核酸分子、又は活性を指す。異種性、非内因性、又は外因性には、構造、活性、又は両方が、天然の遺伝子、タンパク質、化合物、又は核酸分子と変化した遺伝子、タンパク質、化合物、又は核酸分子と同様に異なるように突然変異させられた、又は他の方法で改変された遺伝子、タンパク質、化合物、又は核酸分子が含まれる。ある実施形態において、異種性、非内因性、又は外因性の遺伝子、タンパク質、又は核酸分子（例えば、受容体、リガンドなど）は、宿主細胞又は対象に対して内因性でなくてもよく、代わりに、そのような遺伝子、タンパク質、又は核酸分子をコードする核酸を、接合、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーションなどによって宿主細胞に加えてもよく、ここで、付加された核酸分子は、宿主細胞ゲノムに組み込まれ得るか、又は染色体外遺伝物質（例えば、プラスミド又は他の自己複製ベクターとして）として存在し得る。用語「相同」又は「相同」とは、宿主細胞、種又は株において見出されるか又はそれに由来する遺伝子、タンパク質、化合物、核酸分子、又は活性を指す。例えば、ポリペプチドをコードする異種又は外因性のポリヌクレオチド又は遺伝子は、天然のポリヌクレオチド又は遺伝子と相同であり得、相同なポリペプチド又は活性をコードし得るが、ポリヌクレオチド又はポリペプチドは、改変された構造、配列、発現レベル、又はそれらの任意の組み合わせを有し得る。非内因性のポリヌクレオチド又は遺伝子、ならびにコードされたポリペプチド又は活性は、同じ種、異なる種、又はそれらの組み合わせからであり得る。
ある実施形態において、宿主細胞に固有の核酸分子又はその一部は、それが改変又は突然変異されている場合、宿主細胞に対して異種性であると考えられ、又は、宿主細胞に固有の核酸分子は、異種発現制御配列で改変されているか、又は宿主細胞に固有の核酸分子と通常は関連しない内因性発現制御配列で改変されている場合、異種性であると考えられ得る。さらに、用語「異種性」は、宿主細胞に対して異なる、改変された、又は内因性ではない生物学的活性を指すことができる。本明細書に記載されるように、複数の異種性核酸分子は、別個の核酸分子として、複数の個別に制御される遺伝子として、ポリシストロン性核酸分子として、融合タンパク質をコードする単一の核酸分子として、又はそれらの任意の組み合わせとして、宿主細胞に導入することができる。
本明細書中で使用される場合、用語「内因性」又は「天然」は、宿主細胞又は対象中に通常存在するポリヌクレオチド、遺伝子、タンパク質、化合物、分子、又は活性を指す。
用語「発現」は、本明細書中で使用される場合、遺伝子のような核酸分子のコード配列に基づいてポリペプチドが生成されるプロセスを指す。プロセスは、転写、転写後制御、転写後修飾、翻訳、翻訳後制御、翻訳後修飾、又はそれらの任意の組合せを含み得る。発現された核酸分子は、典型的には、発現制御配列（例えば、プロモーター）に機能的に連結される。
用語「機能的に連結された」は、１つの核酸断片上の２つ以上の核酸分子の結合を指し、その結果、１つの機能が他の核酸断片によって影響を受ける。例えば、プロモーターは、コード配列の発現に影響を与えることができる場合（すなわち、コード配列はプロモーターの転写制御下にある場合）、コード配列と機能的に連結される。「連結していない」とは、関連する遺伝的要素が互いに密接に関連しておらず、一方の機能が他方に影響を及ぼさないことを意味する。
本明細書に記載されるように、複数の異種性核酸分子は、別個の核酸分子として、複数の個別に制御される遺伝子として、ポリシストロン性核酸分子として、タンパク質（例えば、抗体の重鎖）をコードする単一の核酸分子として、又はそれらの任意の組み合わせとして、宿主細胞に導入することができる。２つ以上の異種性核酸分子が宿主細胞に導入される場合、２つ以上の異種性核酸分子は、単一の核酸分子（例えば、単一のベクター上）として、別々のベクター上に導入され、単一の部位もしくは複数の部位で宿主染色体に組み込まれ、又はそれらの任意の組み合わせとして導入され得ることが理解される。参照される異種核酸分子又はタンパク質活性の数は、宿主細胞に導入された別個の核酸分子の数ではなく、コードされる核酸分子の数又はタンパク質活性の数を指す。
用語「構築物」とは、組換え核酸分子を含有する任意のポリヌクレオチドを指す。（ポリヌクレオチド）構築物は、ベクター（例えば、細菌ベクター、ウイルスベクター）中に存在してもよく、又はゲノム中に組み込まれてもよい。「ベクター」は、別の核酸分子を輸送することができる核酸分子である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス、ＲＮＡベクター、又は染色体、非染色体、半合成又は合成核酸分子を含み得る線状又は環状ＤＮＡ又はＲＮＡ分子であり得る。本開示のベクターはまた、トランスポゾンシステム（例えば、睡眠美、例えば、Ｇｅｕｒｔｓ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ ８：１０８，２００３：Ｍａｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｔ．４１：７５３，２００９）。例示的なベクターは、自律的複製（エピソームベクター）が可能であり、ポリヌクレオチドを細胞ゲノム（例えば、ウイルスベクター）に送達することが可能であり、又はそれらが連結された核酸分子（発現ベクター）を発現することが可能であるベクターである。
本明細書中で用いる「発現ベクター」又は「ベクター」とは、適切な宿主中で核酸分子の発現を行うことができる適切な制御配列に機能的に連結された核酸分子を含むＤＮＡ構築物をいう。そのような制御配列には、転写を行うプロモーター、そのような転写を制御するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソ－ム結合部位をコードする配列、及び転写及び翻訳の終結を制御する配列が含まれる。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、ウイルス、又は単に潜在的なゲノム挿入物であり得る。一旦適切な宿主に形質転換されると、ベクターは、宿主ゲノムとは独立して複製し、機能し得るか、又は場合によっては、ゲノム自体に組み込まれ得るか、又はベクター配列なしで、ベクターに含まれるポリヌクレオチドをゲノムに送達し得る。本明細書では、「プラスミド」、「発現プラスミド」、「ウイルス」及び「ベクター」は、しばしば互換的に使用される。
核酸分子を細胞に挿入する文脈で「導入される」という用語は、「トランスフェクション」、「形質転換」、又は「形質導入」を意味し、核酸分子を真核細胞又は原核細胞に取り込むことへの言及を含み、ここで、核酸分子は、細胞（例えば、染色体、プラスミド、色素体、又はミトコンドリアＤＮＡ）のゲノムに取り込まれ、自律的レプリコンに変換され、又は一時的に発現され得る（例えば、トランスフェクトされたｍＲＮＡ）。
ある実施形態において、本開示のポリヌクレオチドは、ベクターの特定のエレメントに機能的に連結され得る。例えば、それらが連結されるコード配列の発現及びプロセシングを行うために必要なポリヌクレオチド配列は、機能的に連結され得る。発現制御配列には、適切な転写開始、終結、プロモーター及びエンハンサ－配列；スプライシング及びポリアデニル化シグナルのような効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を高める配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を増強する配列；及びおそらくタンパク質分泌を増強する配列が含まれ得る。発現制御配列は、それらが関心対象の遺伝子と隣接している場合、及びトランスで作用するか、又は関心対象の遺伝子を制御するための距離で作用する発現制御配列であれば、機能的に連結され得る。
ある実施形態において、ベクターは、プラスミドベクター又はウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター又はγ－レトロウイルスベクター）を含む。ウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）、コロナウイルス、オルト－ミクソウイルスのようなネガティブ鎖ＲＮＡウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病及び水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹及びセンダイ）、ピコルナウイルス及びアルファウイルスのようなプラス鎖ＲＮＡウイルス、及びアデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１型及び２型、エプスタイン－バーウイルス、サイトメガロウイルス）、及びポックスウイルス（例えば、ワクシニア、家禽痘及びカナリポックス）を含む二本鎖ＤＮＡウイルスが含まれる。他のウイルスとしては、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、及び肝炎ウイルスが挙げられる。レトロウイルスの例としては、トリ白血病－肉腫、哺乳動物Ｃ型ウイルス、Ｂ型ウイルス、Ｄ型ウイルス、ＨＴＬＶ－ＢＬＶ群、レンチウイルス、スパマウイルス（コフィン、Ｊ．Ｍ．、レトロウイルス科：ウイルス及びそれらの複製、Ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．、Ｅｄｓ．、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、１９９６）が挙げられる。
「レトロウイルス」とは、ＲＮＡゲノムを有するウイルスであって、逆転写酵素を用いてＤＮＡに逆転写された後、逆転写されたＤＮＡが宿主細胞ゲノムに取り込まれるものをいう。「ガンマレトロウイルス」とは、レトロウイルス科の属をいう。ガンマレトロウイルスの例には、マウス幹細胞ウイルス、マウス白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、及びトリ細網内皮症ウイルスが含まれる。
「レンチウイルスベクター」には、遺伝子送達のためのＨＩＶベースのレンチウイルスベクターが含まれ、これは、統合的であっても非統合的であってもよく、比較的大きなパッケ－ジング能力を有し、一連の異なる細胞型を形質導入することができる。レンチウイルスベクターは、通常、３つ（パッケ－ジング、エンベロ－プ、及び移入）又は複数のプラスミドをプロデューサー細胞に一時的にトランスフェクションした後に生成される。ＨＩＶと同様に、レンチウイルスベクターはウイルス表面の糖タンパク質と細胞表面の受容体との相互作用を介して標的細胞に入る。ウイルスＲＮＡは侵入すると逆転写され、ウイルスの逆転写酵素複合体によって媒介される。逆転写の産物は二本鎖の線状ウイルスＤＮＡであり、ウイルスが感染細胞のＤＮＡに組み込まれるための基質である。
ある実施形態において、ウイルスベクターは、ガマレトロウイルス、例えば、モロニ－マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）由来ベクターであり得る。他の実施形態において、ウイルスベクターは、より複雑なレトロウイルス由来ベクター、例えばレンチウイルス由来ベクターであり得る。ＨＩＶ－１由来ベクターはこのカテゴリ－に属する。他の例としては、ＨＩＶ－２、ＦＩＶ、馬感染性貧血ウイルス、ＳＩＶ、及びマエディ－ビスナウイルス（ヒツジレンチウイルス）に由来するレンチウイルスベクターが挙げられる。導入遺伝子を含むウイルス粒子を用いて哺乳動物宿主細胞を形質導入するためにレトロウイルス及びレンチウイルスベクター及びパッケ－ジング細胞を用いる方法は、当該分野で公知であり、例えば、米国特許第８，１１９，７７２号；Ｗａｌｃｈｌｉら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６：３２７９３０，２０１１；Ｚｈａｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌに記載されている。 １７４：４４１５，２００５；Ｅｎｇｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ １４：１１５５，２００３；Ｆｒｅｃｈａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ．１８：１７４８， ２０１０；及びＶｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ５０６：９７，２００９。レトロウイルス及びレンチウイルスベクター構築物及び発現系も市販されている。他のウイルスベクターも、例えばアデノウイルスベースのベクター及びアデノ随伴ウイルスベースのベクターを含むＤＮＡウイルスベクター；アンプリコンベクター、複製欠損ＨＳＶ及び弱毒化ＨＳＶを含む単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）由来のベクターを含む、ポリヌクレオチド送達のために使用することができる。
本開示の組成物及び方法と共に使用できる他のベクターには、バキュロウイルス及びαウイルス由来のものが含まれる。（Ｊｏｌｌｙ、Ｄ Ｊ． １９９９）新興ウイルスベクター Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ Ｔ．ｅｄ．の２０９－４０ページ ヒト遺伝子治療の開発 ニューヨーク：コールド・スプリング・ハーバー・ラボ、あるいはプラスミドベクター（睡眠の美しさや他のトランスポゾンベクターなど）。
ウイルスベクターゲノムが、別々の転写物として宿主細胞中で発現される複数のポリヌクレオチドを含む場合、ウイルスベクターは、ビシストロン性又は多シストロン性発現を可能にする２つの（又はそれ以上の）転写物間の追加の配列を含み得る。ウイルスベクターで使用されるこのような配列の例には、内部リボソ－ム侵入部位、フリン切断部位、ウイルス２Ａペプチド、又はそれらの任意の組合せが含まれる。
対象への直接投与のためのＤＮＡベースの抗体又は抗原結合断片コード化プラスミドベクターを含むプラスミドベクターが、本明細書にさらに記載される。
本明細書中で使用される場合、用語「宿主」は、対象のポリペプチド（例えば、本開示の抗体）を生成するための異種核酸分子を用いた遺伝子改変の標的とされる細胞又は微生物を指す。
宿主細胞は、ベクター、又は核酸の取り込み、又はタンパク質を発現し得る任意の個体細胞又は細胞培養を含み得る。この用語はまた、宿主細胞の子孫を包含し、これは遺伝的にも表現型的にも同じであっても異なっていてもよい。適切な宿主細胞はベクターに依存し得、哺乳動物細胞、動物細胞、ヒト細胞、サル細胞、昆虫細胞、酵母細胞、及び細菌細胞を含み得る。これらの細胞は、ウイルスベクターの使用、リン酸カルシウム沈殿による形質転換、ＤＥＡＥ－デキストラン、エレクトロポレ－ション、マイクロインジェクション、又は他の方法によって、ベクター又は他の物質を取り込むように誘導され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｄ ｅｄ（コールドスプリングハーバー研究所、１９８９年）を参照されたい。
ベータコロナウイルス感染の文脈において、「宿主」とは、ベータコロナウイルスに感染した細胞又は対象をいう。
本明細書中で使用される「抗原」又は「Ａｇ」とは、免疫応答を引き起こす免疫原性分子を指す。この免疫応答は、抗体産生、特異的免疫学的にコンピテントな細胞の活性化、補体の活性化、抗体依存性細胞毒性、又はそれらの任意の組合せを含み得る。抗原（免疫原性分子）は、例えば、ペプチド、グリコペプチド、ポリペプチド、グリコポリペプチド、ポリヌクレオチド、多糖類、脂質などであり得る。抗原が合成され、組換え的に産生され、又は生物学的試料から誘導され得ることは容易に明らかである。１以上の抗原を含有することができる例示的な生物学的試料は、組織試料、糞便試料、細胞、生物学的流体、又はそれらの組み合わせを含む。抗原は、改変された細胞によって、又は抗原を発現するように遺伝子操作された細胞によって産生され得る。抗原はまた、ビリオン中に存在するようなベータコロナウイルス（例えば、表面糖タンパク質又はその一部）中に存在し得るか、又はベータコロナウイルスに感染した細胞の表面上に発現又は提示され得る。
用語「エピトープ」又は「抗原エピトープ」は、同族結合分子、例えば免疫グロブリン、又は他の結合分子ドメイン、又はタンパク質によって認識され、特異的に結合される任意の分子、構造、アミノ酸配列、又はタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は、一般に、アミノ酸又は糖側鎖のような分子の化学的に活性な表面グル－ピングを含み、特異的な三次元構造特性ならびに特異的な電荷特性を有することができる。抗原がペプチド又はタンパク質であるか又はそれを含む場合、エピトープは、連続アミノ酸（例えば、線状エピトープ）から構成され得るか、又はタンパク質折り畳み（例えば、不連続エピトープ又はコンホメ－ションエピトープ）によって近接に導かれるタンパク質の異なる部分又は領域由来のアミノ酸、又はタンパク質折り畳みに関係なく近接している非隣接アミノ酸から構成され得る。
抗体、抗原結合断片、及び組成物
１つの実施形態において、本開示は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、ならびにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、かつベータコロナウイルスの表面糖タンパク質に結合することができる、単離された抗体又はその抗原結合断片を提供する。いくつかの実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、２以上のベータコロナウイルスの表面糖タンパク質に結合することができる。いくつかの実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、任意の２、３、４、又は５種類のベータコロナウイルスの表面糖タンパク質に結合することができる。いくつかの実施形態において、その抗体又は抗原結合断片は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＯＣ４３、及びＨＫＵの表面糖タンパク質に結合することができる。
ある実施形態において、本開示の抗体又は抗原結合断片は、エピトープを含むベータコロナウイルス表面糖タンパク質エピトープ又は抗原と会合するか、又はそれと結合するが、試料中の他の分子又は成分と有意に会合又は結合しない。ある実施形態において、エピトープは、スパイク（Ｓ）タンパク質のＳ２サブユニットに含まれる。さらなる実施形態において、エピトープは、Ｓ１サブユニット又はＳタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）に含まれない。ある実施形態において、エピトープは、立体配座エピトープ又は線状エピトープである。ある実施形態において、エピトープは、Ｓタンパク質の融合後コンホメ－ション、Ｓタンパク質の融合前コンホメ－ション、又はその両方で存在する。ある実施形態において、エピトープは、ＨＲ２領域とＳタンパク質の中心ヘリックス（ＣＨ）領域との間に配置された連結ドメイン又はリンカードメインに含まれる。ある実施形態において、エピトープは、Ｓタンパク質アミノ酸配列ＦＸ１Ｘ２ＥＬＸ３Ｘ４Ｘ５ＦＫＮＸ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４（配列番号４６）の１つ又は複数を含み、ここで、Ｘ１は、Ｋ、Ｅ、またはＱであり；Ｘ２は、Ｅ、Ｓ、またはＤであり；Ｘ３は、ＤまたはＳであり；Ｘ４は、Ｋ、Ｑ、Ｈ、またはＥであり；Ｘ５は、Ｙ、Ｗ、またはＦであり；Ｘ６は、Ｈ、Ｑ、またはＶであり；Ｘ７は、ＴまたはＳであり；Ｘ８は、Ｓ、Ｌ、またはＴであり；Ｘ９は、Ｐ、Ｖ、Ｌ、またはＳであり；Ｘ１０は、Ｄ、Ａ、Ｐ、またはＩであり；Ｘ１１は、ＶまたはＰであり；Ｘ１２は、ＤまたはＮであり；Ｘ１３は、ＬまたはＦであり；Ｘ１４は、Ｇ、Ｓ、またはＴである。特定の実施形態では、配列番号４６の１１位のＮはグリコシル化される。
ある実施形態において、本開示の抗体又は抗原結合断片は、第１のベータコロナウイルス表面糖タンパク質エピトープに関連するか、又は第１のベータコロナウイルス表面糖タンパク質エピトープに結合（例えば、結合）し、また、試料中に存在する別のベータコロナウイルス由来のエピトープと結合又は結合することができるが、試料中の任意の他の分子又は成分と有意に結合又は結合することはできない。換言すれば、ある実施形態において、本開示の抗体又は抗原結合断片は、２、３、４、又はそれ以上のベータコロナウイルスに対して交差反応性であり、かつ特異的である。ある実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、ＥＬＩＳＡ（例えば、１μｇ／ｍＬ抗原で）によって測定されるように、アルファコロナウイルスに結合しない。
ある実施形態において、本開示の抗体又は抗原結合断片は、ベータコロナウイルス表面糖タンパク質に特異的に結合する。本明細書中で使用される場合、「特異的に結合する」とは、１０５Ｍ－１（この会合反応についてのオンレ－ト［Ｋｏｎ］とオフレ－ト［Ｋｏｆｆ］の比率に等しい）以上の親和性又はＫａ（すなわち、１／Ｍの単位との特定の結合相互作用の平衡会合定数）を有する抗原に対する抗体又は抗原結合断片の会合又は結合を指し、一方、試料中の任意の他の分子又は成分と有意に会合又は融合しない。あるいは、親和性は、Ｍの単位（例えば、１０－５Ｍから１０－１３Ｍ）との特定の結合相互作用の平衡解離定数（Ｋｄ）として定義され得る。抗体は、「高親和性」抗体又は「低親和性」抗体として分類され得る。「高親和性」抗体とは、少なくとも１０７Ｍ－１、少なくとも１０８Ｍ－１、少なくとも１０９Ｍ－１、少なくとも１０１０Ｍ－１、少なくとも１０１１Ｍ－１、少なくとも１０１２Ｍ－１、又は少なくとも１０１３Ｍ－１のＫａを有する抗体をいう。「低親和性」抗体とは、１０７Ｍ－１までのＫａ、最大１０６Ｍ－１、最大１０５Ｍ－１を有する抗体を指す。あるいは、親和性は、Ｍの単位（例えば、１０－５Ｍから１０－１３Ｍ）との特定の結合相互作用の平衡解離定数（Ｋｄ）として定義され得る。
特定の標的に結合する本開示の抗体を同定するため、ならびに結合ドメイン又は結合タンパク質親和性、例えばウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ（例えば、直接、間接、又はサンドイッチ）、分析用超遠心分離、分光法、生物層干渉法、及び表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標））分析である（例えば、Scatchard et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660, 1949; Wilson, Science 295:2103, 2002; Wolff et al., Cancer Res. 53:2560, 1993; and U.S. Patent Nos. 5,283,173, 5,468,614, または同等物を参照）。親和性又は見かけの親和性又は相対的親和性を評価するためのアッセイも公知である。
ある実施形態において、本開示の抗体又は抗原結合断片は、ＭＥＲＳ、ＨＫＵ１、ＯＣ４３、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の各々からのスパイク（Ｓ）タンパク質に、約７～約７５μｇ／ｍＬの範囲のＥＣ５０で結合する。ある実施形態において、本開示の抗体又は抗原結合断片は、ＥＬＩＳＡにより決定されるように（例えば、１μｇ／ｍＬスパイクタンパク質でコ－ティングされたウェルを有する予備融合安定化スパイクタンパク質を使用する）、約５～約９μｇ／ｍＬの範囲のＥＣ５０、又は約６～約８．５μｇ／ｍＬの範囲の、又は約７、７．５、８、又は８．５μｇ／ｍＬの範囲で、ＭＥＲＳ、ＯＣ４３、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の各々に結合する。いくつかの実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、ＥＬＩＳＡにより決定されるように、約７２μｇ／ｍＬのＥＣ５０でＨＫＵ１のＳタンパク質に結合する。
ある実施形態において、本開示の抗体又は抗原結合断片は、約２００～約４３００μｇ／ｍＬの範囲のＥＣ５０でＭＥＲＳ、ＨＫＵ１、及びＯＣ４３の各々に結合する。ある実施形態において、本開示の抗体又は抗原結合断片は、ＥＬＩＳＡ（例えば、１μｇ／ｍＬのスパイクタンパク質でコ－ティングされたウェルを有する予備融合安定化スパイクタンパク質を用いる）により決定されるように、ＥＣ５０が約２００～約８００μｇ／ｍＬ、又は約２３０～約７３０μｇ／ｍＬ、又は約２３０又は約７３０μｇ／ｍＬの範囲で、ＭＥＲＳ及びＯＣ４３２の各々に結合する。
ある例では、結合は、宿主細胞中でベータコロナウイルス抗原を組換え発現させること（例えば、トランスフェクション）、及び抗体で宿主細胞を免疫染色すること、及びフローサイトメトリー（例えば、ＺＥ５ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＢｉｏＲａｄ（登録商標））及びＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を用いて結合を分析することによって決定することができる。いくつかの実施形態において、陽性結合は、対照（例えば、模擬）細胞に対するベータコロナウイルス発現細胞の抗体による差次染色によって定義することができる。
いくつかの実施形態において、本開示の抗体又は抗原結合断片は、フローサイトメトリーにより決定されるように、宿主細胞（例えば、Ｅｘｐｉ－ＣＨＯ細胞）の表面上に発現されるベータコロナウイルススパイクタンパク質（すなわち、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＯＣ４３、及びＭＥＲＳのうちの２つ、３つ、４つ、又は５つすべてから）に結合する。
ある実施形態において、本開示の抗体又は抗原結合断片は、バイオレイヤ－干渉測定法を用いて測定されるように、ベータコロナウイルスＳタンパク質に結合する。
ある実施形態において、本開示の抗体は、ベータコロナウイルスによる感染を中和することができる。ある実施形態において、本開示の抗体は、２、３、４、又は５種類のベータコロナウイルスによる感染を中和することができる。本明細書中で使用される「中和抗体」とは、病原体が宿主において感染を開始及び／又は持続させる能力を中和する、すなわち予防する、抑制する、減少させる、妨げる、又は妨げることができるものである。用語「中和抗体」及び「中和する抗体」又は「中和する抗体」は、本明細書において互換的に使用される。現在開示されている実施形態のいずれにおいても、抗体又は抗原結合断片は、感染のインビトロモデル及び／又は感染のインビボ動物モデル及び／又はヒトにおける２、３、４、又は５種類のベータコロナウイルスによる感染を予防及び／又は中和することができる。
いくつかの実施形態において、本開示の抗体又は抗原結合断片は、約３，３００μｇ／ｍＬ～約３，９００μｇ／ｍＬの範囲、約３，４００μｇ／ｍＬ～約３，８００μｇ／ｍＬの範囲、又は約３，５００μｇ／ｍＬ～約３，７００μｇ／ｍＬの範囲、又は約３，６００μｇ／ｍＬ、約３，６５０μｇ／ｍＬ、又は約３，７００μｇ／ｍＬの範囲で、生ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２により感染を中和することができる。いくつかの実施形態において、感染の中和は、ＶｅｒｏＥ６細胞上で２４時間、０．０１の多重感染（ＭＯＩ）を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／ルシフェラーゼを用いて決定される。
いくつかの実施形態において、本開示の抗体又は抗原結合断片は、ＭＥＲＳ－ＣｏＶシュードイルス（例えば、ＭＬＶ－ｐｐ）及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードイルス（例えば、ＭＬＶ－ｐｐ）による感染を、約４μｇ／ｍＬ～約７μｇ／ｍＬの範囲で、又は約４．５μｇ／ｍＬ～約６．５μｇ／ｍＬの範囲で、ＩＣ５０で中和することができる。いくつかの実施形態において、本開示の抗体又は抗原結合断片は、約６．３μｇ／ｍＬのＩＣ５０でＭＥＲＳ－ＣｏＶシュードイルス（例えば、ＭＬＶ－ｐｐ）による感染を中和することができ、及び／又は約４．７μｇ／ｍＬのＩＣ５０でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードイルス（例えば、ＭＬＶ－ｐｐ）による感染を中和することができる。ある実施形態において、感染の中和は、Ｈｕｈ７細胞上のＭＥＲＳ－ＣｏＶを用いて決定される。いくつかの実施形態において、感染の中和は、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を用いて決定される。
いくつかの実施形態において、本開示の抗体又は抗原結合断片は、ベータコロナウイルス感染（例えば、１、２、３、４、又は５種類のベータコロナウイルス）又はベータコロナウイルスシュードタイプ化ウイルスを、約１～約１０μｇ／ｍｌの範囲でＩＣ５０で中和することができる。いくつかの実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、ベータコロナウイルス感染又はベータコロナウイルスシュードタイプ化ウイルスを、約３～約６μｇ／ｍｌの範囲のＩＣ５０で中和することができる。
ある実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、（ｉ）２、３、４、５、又はそれ以上のベータコロナウイルスのスパイクタンパク質中のエピトープを認識し；（ｉｉ）１又はそれ以上のベータコロナウイルスのスパイクタンパク質と細胞表面受容体との間の相互作用をブロックし；（ｉｉｉ）２、３、４、５、又はそれ以上のベータコロナウイルスのスパイクタンパク質中に保存されているエピトープを認識し；（ｉｖ）２、３、４、５、又はそれ以上のベータコロナウイルスに対して交差反応性である；又は（ｖ）（ｉ）～（ｉｖ）の任意の組み合わせである。
抗体技術分野の当業者によって理解される用語は、それぞれ、本明細書において明確に定義されない限り、当該技術分野で獲得された意味を与えられる。例えば、用語「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重い（Ｈ）鎖及び２つの軽い（Ｌ）鎖を含む無傷の抗体、ならびにｓｃＦｖ、Ｆａｂ、又はＦａｂ’２断片のような無傷の抗体によって認識される抗原標的分子に結合する能力を有するか又は保持する無傷の抗体の任意の抗原結合部分又は断片を指す。従って、本明細書中の用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含み、それらの機能的（抗原結合）抗体断片は、断片抗原結合（Ｆａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆｖ断片、組換えＩｇＧ（ｒＩｇＧ）断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む一本鎖抗体断片、及び単一ドメイン抗体（例えば、ｓｄＡｂ、ｓｄＦｖ、ナノボディ）断片を含む。用語は、体内免疫グロブリン、ペプチボディ－、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、及びヘテロコンジュゲート抗体、多特異性抗体、例えば、二重特異性抗体、ジアボディ－、三重体、テトラボディ－、タンデムジ－ｓｃＦｖ、及びタンデムトリ－ｓｃＦｖのような、遺伝子操作及び／又は他の方法で修飾された形態の免疫グロブリンを包含する。特に断らない限り、用語「抗体」は、その機能性抗体断片を包含すると理解されるべきである。用語はまた、ＩｇＧ及びそのサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、及びＩｇＤを含む任意のクラス又はサブクラスの抗体を含む、無傷又は全長抗体を包含する。
用語「ＶＬ」又は「ＶＬ」及び「ＶＨ」又は「ＶＨ」は、それぞれ、抗体軽鎖及び抗体重鎖由来の可変結合領域を指す。特定の実施形態では、ＶＬはκ（κ）クラス（本明細書では「ＶＫ」でもある）である。ある実施形態において、ＶＬはλ（λ）クラスである。可変結合領域は、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）及び「フレームワーク領域」（ＦＲ）として知られる、離散的でよく定義されたサブ領域を含む。用語「相補性決定領域」及び「ＣＤＲ」は、「超可変領域」又は「ＨＶＲ」と同義であり、抗体可変領域内のアミノ酸の配列を指し、これらは、一般に、一緒になって、抗体の抗原特異性及び／又は結合親和性を付与し、ここで、連続するＣＤＲ（すなわち、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）は、フレームワーク領域によって一次構造において互いに分離される。各可変領域には３つのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３；ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３；それぞれＣＤＲＨ及びＣＤＲＬとも呼ばれる）がある。ある実施形態において、抗体ＶＨは、以下の４つのＦＲ及び３つのＣＤＲを含む：ＦＲ１－ＨＣＤＲ１－ＦＲ２－ＨＣＤＲ２－ＦＲ３－ＨＣＤＲ３－ＦＲ４；及び抗体ＶＬは、ＦＲ１－ＬＣＤＲ１－ＦＲ２－ＦＬＣＤＲ２－ＦＲ３－ＬＣＤＲ３－ＦＲ４の４つのＦＲ及び３つのＣＤＲを含む。一般に、ＶＨとＶＬは共に、それぞれのＣＤＲを介して抗原結合部位を形成する。
本明細書中で使用される場合、ＣＤＲの「バリアント」とは、１～３個までのアミノ酸置換（例えば、保存的又は非保存的置換）、欠失、又はそれらの組み合わせを有するＣＤＲ配列の機能的バリアントをいう。
ＣＤＲ及びフレームワーク領域の番号付けは、任意の公知の方法またはスキームにしたがってもよい。例えば、Kabat, Chothia, EU, IMGT, Contact, North, Martin, and AHo numbering schemes (see, e.g., Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5th ed.; Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)); Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003; Honegger and Pluckthun, J. Mol. Bio. 309:657-670 (2001); North et al. J Mol Biol. (2011) 406:228-56; doi:10.1016/j.jmb.2010.10.030; Abhinandan and Martin, Mol Immunol. (2008) 45:3832-9. 10.1016/j.molimm.2008.05.022)である。等価な残基位置を注釈し、抗原受容体番号及び受容体分類（ＡＮＡＲＣＩ）ソフトウェアツ－ル（２０１６，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １５：２９８－３００）を用いて異なる分子について比較することができる。従って、１つのナンバリングスキ－ムに従って本明細書に提供される例示的な可変ドメイン（ＶＨ又はＶＬ）配列のＣＤＲの同定は、異なるナンバリングスキ－ムを用いて決定されるように、同じ可変ドメインのＣＤＲを含む抗体を排除しない。ある実施形態において、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＥＵ、ＩＭＧＴ、Ｍａｒｔｉｎ（強化Ｃｈｏｔｈｉａ）、Ｃｏｎｔａｃｔ、Ｎｏｒｔｈ、及びＡＨｏナンバリング方法を含む任意の既知のＣＤＲナンバリング方法を用いて決定されるように、配列番号３０、４０、５１、６９、７５、７７、又は８２のいずれか１つに従うＶＬ配列の２６、３６、４７、６６、７１、７２、７３、又は７９のいずれか１つに従うＶＨ配列のＣＤＲ及びＶＬ配列のＣＤＲを含む抗体又は抗原結合断片が提供される。ある実施形態において、ＣＤＲは、ＩＭＧＴ番号付け方法に従う。ある実施形態において、ＣＤＲは、化学計算グループ（ＣＣＧ）によって開発された抗体番号付け方法に従っており；例えば、分子動作環境（ＭＯＥ）ソフトウェア（ｗｗｗ．ｃｈｅｍｃｏｍｐ．ｃｏｍ）を使用する。
ある実施形態において、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、ならびにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体又は抗原結合断片が提供され、ここで、（ｉ）ＣＤＲＨ１は、配列番号２７、３７、４８、６７、又は８０のいずれか１つに従うアミノ酸配列を含み、又はそれからなる、１つ、２つ、又は３つの酸置換を含む配列バリアント、置換が任意に保存的置換であり、及び／又は生殖細胞系にコードされるアミノ酸への置換である１つ以上の置換である；（ｉｉ）ＣＤＲＨ２は、配列番号２８、３８、４９、４９、６８、又は８１のいずれか１項に従うアミノ酸配列、又はそれらの１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換を含む配列バリアントを含み、又はそれからなり、それらの１つ以上の置換は、任意に保存的置換であり、及び／又は生殖細胞系にコードされるアミノ酸への置換である；（ｉｉｉ）ＣＤＲＨ３は、配列番号２９、３９、５０のいずれか１項に従うアミノ酸配列を含み、又はそれからなる；１個、２個、若しくは３個のアミノ酸置換を含むそれらの配列バリアント、又はその１個若しくは複数の置換が任意で保存的置換であり、及び／又は生殖細胞系にコードされるアミノ酸への置換である；（ｉｖ）ＣＤＲＬ１は、配列番号３１、４１、５２、７０、７６、７８、若しくは８３の何れか１つに従うアミノ酸配列、又はそれらの１個、２個、若しくは３個のアミノ酸置換を含むそれらの配列バリアントを含み、それらの１個若しくは複数の置換が任意で保存的置換であり、及び／又は生殖細胞系にコードされるアミノ酸への置換である；（ｖ）ＣＤＲＬ２は、配列番号３２、４２、もしくは５３のいずれか１つに従うアミノ酸配列、又はそれらの１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換を含む配列バリアントを含み、もしくはそれからなり、そのうちの１以上の置換は任意に保存的置換であり、及び／又は生殖細胞系にコードされるアミノ酸への置換である；及び／又は（ｖｉ）ＣＤＲＬ３は、配列番号３３、４３、もしくは５４のいずれか１つに従うアミノ酸配列、又はそれらの１つ、２つもしくは３つのアミノ酸置換を含む配列バリアントを含み、もしくはそれからなる。そのうちの１つ以上の置換は、任意に保存的置換であり、及び／又は生殖細胞にコードされたアミノ酸への置換であり、ここで、抗体又は抗原結合断片は、宿主細胞の細胞表面上及び／又はビリオン上に発現されているベータコロナウイルス又はベータコロナウイルスの表面糖タンパク質に結合することができる。
ある実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、感染のインビトロモデル及び／又は感染のインビボ動物モデル及び／又はヒトにおけるベータコロナウイルスの感染を中和することができる。ある実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、感染のインビトロモデル及び／又は感染のインビボ動物モデル及び／又はヒトにおける１、２、３、４、又は５種類のベータコロナウイルスによる感染を中和することができる。
現在開示されている実施形態のいずれかにおいて、抗体又は抗原結合断片は、配列番号（ｉ）それぞれ２７～２９及び３１～３３；（ｉｉ）それぞれ３７～３９及び４１～４３；（ｉｉｉ）それぞれ４８～５０及び５２～５４；（ｉｖ）それぞれ６７、６８及び２９ならびに７０、３２及び３３；（ｖ）それぞれ、２６、２７、及び７４ならびに３１～３３；（ｖｉ）それぞれ２７～２９ならびに７６、３２及び３３；（ｖｉｉ）それぞれ２７～２９ならびに７８、３２および３３；（ｖｉｉｉ）それぞれ８０、８１および５０ならびに８３、５３および５４によるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３ミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、本開示の抗体又は抗原結合断片は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を含み、ここで、各ＣＤＲは、表１に提供されるように、抗体４２０ １ １（抗体Ｓ２Ｐ６とも呼ばれる）、抗体４２０ １ ２（抗体Ｓ２Ｓ８とも呼ばれる）、又は抗体Ｓ２Ｓ４３の対応するＣＤＲ、又はその改変体抗体から独立して選択される。すなわち、表１に提供されるベータコロナウイルス抗体由来のＣＤＲの全ての組合せ及びそのバリアント配列が意図される。
ある実施形態において、本開示の抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２６、３６、４７、６６、７１、７２、７３又は７９のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３０、４０、５１、６９、７５、７７又は８２のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
ある実施形態において、本開示の抗体又は抗原結合断片は、配列番号２６、３６、４７、６６、７１、７２、７３又は７９のアミノ酸配列を含む２つの重鎖、及び配列番号３０、４０、５１、６９、７５、７７又は８２のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖を含む。
用語「ＣＬ」は、「免疫グロブリン軽鎖定常領域」又は「軽鎖定常領域」、すなわち抗体軽鎖由来の定常領域を指す。用語「ＣＨ」は、「免疫グロブリン重鎖定常領域」又は「重鎖定常領域」を指し、抗体アイソタイプに応じて、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ）、又はＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４ドメイン（ＩｇＥ、ＩｇＭ）にさらに分割可能である。抗体重鎖のＦｃ領域は、本明細書にさらに記載される。現在開示されている実施形態のいずれにおいても、本開示の抗体又は抗原結合断片は、ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３のいずれか１つ以上を含む。ある実施形態において、ＣＬは、配列番号８又は配列番号９のアミノ酸配列と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３は、配列番号６又は配列番号７のアミノ酸配列と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有するアミノ酸配列を含む。
例えば、哺乳動物細胞株における生産は、抗体重鎖の１以上のＣ末端リジンを除去することができることが理解されるであろう（例えば、ＬｉｕらのｍＡｂｓ ６（５）：１１４５－１１５４（２０１４）を参照されたい）。従って、本開示の抗体又は抗原結合断片は、Ｃ末端リジン残基が存在するか又は存在しない重鎖、ＣＨ１－ＣＨ３、ＣＨ３、又はＦｃポリペプチドを含むことができ、換言すれば、重鎖、ＣＨ１－ＣＨ３、又はＦｃポリペプチドのＣ末端残基がリジンでない実施形態、及びリジンがＣ末端残基である実施形態を包含する。ある実施形態において、組成物は、本開示の複数の抗体及び／又は抗原結合断片を含み、ここで、１以上の抗体又は抗原結合断片は、重鎖、ＣＨ１－ＣＨ３、又はＦｃポリペプチドのＣ末端におけるリジン残基を含まず、１以上の抗体又は抗原結合断片は、重鎖、ＣＨ１－ＣＨ３、又はＦｃポリペプチドのＣ末端におけるリジン残基を含む。
「Ｆａｂ」（断片抗原結合）は、抗原に結合する抗体の一部であり、鎖間ジスルフィド結合を介して軽鎖に連結された重鎖の可変領域及びＣＨ１を含む。各Ｆａｂ断片は、抗原結合に関して一価である、すなわち、単一の抗原結合部位を有する。抗体のペプシン処理は、２価の抗原結合活性を有する２つのジスルフィド結合Ｆａｂ断片にほぼ対応し、抗原を架橋することができる単一の大きなＦ（ａｂ’）２断片を生じる。Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２はいずれも、「抗原結合断片」の例である。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端にさらなる少数の残基を有することによって、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオ－ル基を有するＦａｂ’についての本明細書中の呼称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元来、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として産生された。抗体断片の他の化学的カップリングもまた公知である。
Ｆａｂ断片は、例えば、ペプチドリンカーによって連結されて、本明細書において「ｓｃＦａｂ」とも呼ばれる単一鎖Ｆａｂを形成することができる。これらの実施形態において、天然Ｆａｂに存在する鎖間ジスルフィド結合は存在し得ず、リンカーは、全部又は一部が、単一のポリペプチド鎖中のＦａｂ断片を連結又は連結するために役立つ。重鎖由来Ｆａｂ断片（例えば、ＶＨ＋ＣＨ１、又は「Ｆｄ」からなる、又は本質的にＶＨ＋ＣＨ１、又は「Ｆｄ」からなる、又はそれからなる）及び軽鎖由来Ｆａｂ断片（例えば、ＶＬ＋ＣＬからなる、又は本質的にＶＬ＋ＣＬからなる、又はそれからなる）を、任意の配置で連結して、ｓｃＦａｂを形成することができる。例えば、ｓｃＦａｂは、（重鎖Ｆａｂ断片－リンカー－軽鎖Ｆａｂ断片）又は（軽鎖Ｆａｂ断片－リンカー－重鎖Ｆａｂ断片）に従って、Ｎ末端からＣ末端方向に配列され得る。ｓｃＦａｂで使用するためのペプチドリンカー及び例示的リンカー配列は、本明細書においてさらに詳細に議論される。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む小さな抗体断片である。この断片は、一般に、１つの重鎖及び１つの軽鎖可変領域ドメインの二量体からなり、強固で非共有結合的に結合している。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、抗原を認識し、結合する能力を有するが、典型的には、結合部位全体よりも低い親和性である。
「一本鎖Ｆｖ」は、「ｓＦｖ」又は「ｓｃＦｖ」とも略されるが、単一のポリペプチド鎖に連結されたＶＨ及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインの間に配置され、ＶＬドメインを連結するポリペプチドリンカーを含み、これにより、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を保持又は形成することが可能となる。このようなペプチドリンカーは、当技術分野で周知の標準技術を用いて融合ポリペプチドに組み込むことができる。ｓｃＦｖのレビュ－については、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995を参照されたい。ある実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、及びＶＨドメインをＶＬドメインにリンキングするペプチドリンカーを含むｓｃＦｖを含む。特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、ＶＨ－リンカー－ＶＬ配向又はＶＬ－リンカー－ＶＨ配向であり得るペプチドリンカーによってＶＬドメインに連結されたＶＨドメインを含む。本開示の任意のｓｃＦｖは、ＶＬドメインのＣ末端が短いペプチド配列によりＶＨドメインのＮ末端に連結されるように、又はその逆（すなわち、（Ｎ）ＶＬ（Ｃ）－リンカー－（Ｎ）ＶＨ（Ｃ）又は（Ｎ）ＶＨ（Ｃ）－リンカー－（Ｎ）ＶＬ（Ｃ））に連結されるように操作することができる。あるいは、いくつかの実施形態において、リンカーは、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、又はその両方のＮ末端部分又は末端に連結されてもよい。
ペプチドリンカー配列は、例えば、（１）可撓性伸長コンホメ－ションを採用するそれらの能力；（２）第１及び第２のポリペプチド上の機能的エピトープ及び／又は標的分子上の機能的エピトープと相互作用し得る二次構造を採用する能力の欠如又は欠如；及び／又は（３）ポリペプチド及び／又は標的分子と反応し得る疎水性残基又は荷電残基の欠如又は相対的欠如に基づいて選択され得る。リンカー設計に関する他の考慮事項（例えば、長さ）は、ＶＨ及びＶＬが機能的抗原結合部位を形成し得るコンホメ－ション又はコンホメ－ションの範囲を含み得る。ある実施形態において、ペプチドリンカー配列は、例えば、Ｇｌｙ、Ａｓｎ及びＳｅｒ残基を含む。Ｔｈｒ及びＡｌａのような他の中性に近いアミノ酸もリンカー配列に含まれ得る。リンカーとして有用に使用され得る他のアミノ酸配列には、Maratea et al., Gene 40:39 46 (1985); Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258 8262 (1986); U.S. Pat. No. 4,935,233, and U.S. Pat. No. 4,751,180に開示されているものが含まれる。リンカーの他の例示的及び非限定的な例としては、例えば、Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｖａｌ－Ａｓｐ（配列番号１９）（Chaudhary et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1066-1070 (1990)）、およびＬｙｓ－Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｖａｌ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ（配列番号２０）（Bird et al., Science 242:423-426 (1988)）および五量体Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号２１）（１回の繰り返し又は１～５回以上の繰り返しで存在する場合）、例えば、配列番号１７を参照されたい。任意の適切なリンカーを使用することができ、一般的には、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２１、２２、１５、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、７０、９０、１００アミノ酸長、又は約２００アミノ酸長未満であり得、可撓性構造（リンカーによって連結された２つの領域ードメイン、モチーフ、断片、又はモジュール間のコンホメ－ション移動のための柔軟性及び余地を提供し得る）を含むことができ、好ましくは、生物学的に不活性であり、及び／又はヒトにおける免疫原性のリスクが低いであろう。例示的なリンカーは、配列番号１０～２１のいずれか１つ以上に記載されるアミノ酸配列を含むもの、又はそれからなるものを含む。ある実施形態において、リンカーは、配列番号１０－２１のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列と少なくとも７５％（すなわち、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上）同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
ｓｃＦｖは、ＶＨ及びＶＬ配列の任意の組合せ、又は本明細書に開示されているＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３配列の任意の組合せを用いて構築することができる。
ある実施形態において、リンカー配列は必要ではない；例えば、第１及び第２のポリペプチドが、機能ドメインを分離し、立体障害を防止するために使用することができる非必須のＮ末端アミノ酸領域を有する場合。
抗体の発達中に、生殖細胞系列変数（Ｖ）、連結（Ｊ）、及び多様性（Ｄ）遺伝子座のＤＮＡが再編成され、コード配列中のヌクレオチドの挿入及び／又は欠失が起こり得る。体細胞突然変異は、得られた配列によってコードされ得、対応する既知の生殖細胞系配列を参照することによって同定され得る。いくつかの文脈において、抗体の所望の特性（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原への結合）に重要ではない体細胞突然変異、又は抗体に望ましくない特性（例えば、抗体を投与された対象において免疫原性のリスクの増大）を与える体細胞突然変異、又はその両方は、対応する生殖細胞系にコードされたアミノ酸、又は異なるアミノ酸で置き換えられ得、その結果、抗体の望ましい特性が改良又は維持され、抗体の望ましくない特性が減少又は抑制される。従って、いくつかの実施形態において、本開示の抗体又は抗原結合断片は、親抗体又は抗原結合断片と比較して、可変領域において、親抗体又は抗原結合断片が１つ以上の体細胞突然変異を含む場合、少なくとも１つ以上の生殖細胞系にコードされたアミノ酸を含む。本開示の例示的な抗ベータコロナウイルス抗体の可変領域及びＣＤＲアミノ酸配列は、本明細書の表１に提供される。
ある実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、酸化、脱アミド化、及び／又は異性化の望ましくないリスクを除去するためのアミノ酸修飾（例えば、置換突然変異）を含む。
また、本明細書では、現在開示されている（「親」）抗体と比較して、可変領域（例えば、ＶＨ、ＶＬ、フレームワーク又はＣＤＲ）における１以上のアミノ酸改変を含む改変体抗体も提供され、ここで、改変体抗体はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原に結合することができる。
ある実施形態において、ＶＨは、配列番号２６、３６、４７、６６、７１、７２、７３、及び７９のいずれか１つに従うアミノ酸配列と少なくとも８５％（すなわち、８５％、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％）同一性を有するアミノ酸配列を含み、又はそれからなり、ここで、変異は、任意に、１以上のフレームワーク領域に限定され、及び／又は変異は、生殖細胞系にコードされるアミノ酸への１以上の置換を含む。及び／又は（ｉｉ）ＶＬは、配列番号３０、４０、５１、６９、７５、７７、及び８２のいずれか１つに従うアミノ酸配列と少なくとも８５％（すなわち、８５％、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％）同一性を有するアミノ酸配列を含み、又はそれからなり、ここで、変異は、場合により、１以上のフレームワーク領域に限定され、及び／又は変異は、生殖細胞系にコードされるアミノ酸への１以上の置換を含む。
ある実施形態において、ＶＨは、表１に示される任意のＶＨアミノ酸配列を含み、又はそれからなり、ＶＬは、表１に示される任意のＶＬアミノ酸配列を含み、又はそれからなる。特定の実施形態では、ＶＨ及びＶＬは、配列番号（ｉ）それぞれ２６及び３０；（ｉｉ）それぞれ２６及び６９；（ｉｉｉ）それぞれ２６及び７５；（ｉｖ）それぞれ２６及び７７；（ｖ）それぞれ６６及び６９；（ｖｉ）それぞれ６６及び３０；（ｖｉｉ）それぞれ６６及び７５；（ｖｉｉｉ）それぞれ６６及び７７；（ｉｘ）それぞれ７１及び３０；（ｘ）それぞれ７１及び６９；（ｘｉ）それぞれ７１及び７５；（ｘｉｉ）それぞれ７１及び７７；（ｘｉｉｉ）それぞれ７２及び３０；（ｘｉｖ）それぞれ７２及び６９；（ｘｖ）それぞれ７２及び７５；（ｘｖｉ）それぞれ７２及び７７；（ｘｖｉｉ）それぞれ７３及び３０；（ｘｖｉｉｉ）それぞれ７３及び６９；（ｘｉｘ）それぞれ７３及び７５；（ｘｘ）それぞれ７３及び７７；（ｘｘｉ）それぞれ３６及び４０；（ｘｘｉｉ）それぞれ４７及び５１；（ｘｘｉｉｉ）それぞれ４７及び８２；（ｘｉｖ）それぞれ７９及び８２、または（ｘｖ）それぞれ７９及び５１によるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
特定の実施形態では、ＶＨ及びＶＬは、配列番号（ｉ）それぞれ２６及び３０；（ｉｉ）それぞれ２６及び６９；（ｉｉｉ）それぞれ２６及び７５；（ｉｖ）それぞれ２６及び７７；（ｖ）それぞれ６６及び６９；（ｖｉ）それぞれ６６及び３０；（ｖｉｉ）それぞれ６６及び７５；（ｖｉｉｉ）それぞれ６６及び７７；（ｉｘ）それぞれ７１及び３０；（ｘ）それぞれ７１及び６９；（ｘｉ）それぞれ７１及び７５；（ｘｉｉ）それぞれ７１及び７７；（ｘｉｉｉ）それぞれ７２及び３０；（ｘｉｖ）それぞれ７２及び６９；（ｘｖ）それぞれ７２及び７５；（ｘｖｉ）それぞれ７２及び７７；（ｘｖｉｉ）それぞれ７３及び３０；（ｘｖｉｉｉ）それぞれ７３及び６９；（ｘｉｘ）それぞれ７３及び７５；（ｘｘ）それぞれ７３及び７７；（ｘｘｉ）それぞれ３６及び４０；（ｘｘｉｉ）それぞれ４７及び５１；（ｘｘｉｉｉ）それぞれ４７及び８２；（ｘｉｖ）それぞれ７９及び８２、または（ｘｖ）それぞれ７９及び５１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
いくつかの実施形態において、（１）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を含むＶＨ、ならびに（２）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を含むＶＬを含む抗体又は抗原結合断片が提供され、ここで、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３は、配列番号（ｉ）それぞれ２６および３０；（ｉｉ）それぞれ３６および４０；（ｉｉｉ）それぞれ４７および５０；（ｉｖ）それぞれ６６および６９；（ｖ）それぞれ７１および３０；（ｖｉｉ）それぞれ７２および３０；（ｖｉｉｉ）それぞれ７３および３０；（ｉｘ）それぞれ２６および６９；（ｘ）それぞれ７１および６９；（ｘｉ）それぞれ７２および６９；（ｘｉｉ）それぞれ７３および６９；（ｘｉｉｉ）それぞれ２６および７５；（ｘｉｖ）それぞれ２６および７７；（ｘｖ）それぞれ６６および７５；（ｘｖｉ）それぞれ６６および７７；（ｘｖｉｉ）それぞれ７３および７５；（ｘｖｉｉｉ）それぞれ７３および７７，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；（ｘｉｘ）それぞれ７２および７５；（ｘｘ）それぞれ７２および７７；（ｘｘｉ）それぞれ３６および４０；（ｘｘｉｉ）それぞれ４７および５１；（ｘｘｉｉｉ）それぞれ４７および８２；（ｘｘｉｖ）それぞれ４７および８２；（ｘｘｖ）それぞれ７９および５１；または（ｘｘｖｉ）それぞれ７９および８２に示されるＶＨおよびＶＬアミノ酸配列に従う。
いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、ＩＭＧＴ番号付けシステムに従う。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従う。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、チョッチア番号付けシステムに従う。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、ＡＨｏナンバリングシステムに従う。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、ノ－スナンバリングシステムに従う。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、マーチンナンバリングシステムに従う。
ある実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、又はＩｇＤアイソタイプである。いくつかの実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、ヒト、ヒト化、又はキメラである。
いくつかの実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、ヒト抗体、モノクローナル抗体、精製抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、又はｓｃＦａｂを含む。
ある実施形態において、本開示の抗体又は抗原結合断片は、単特異的（例えば、単一のエピトープに結合する）であるか、又は多特異的（例えば、複数のエピトープ及び／又は標的分子に結合する）である。抗体及び抗原結合断片は、種々のフォーマットで構築することができる。例示的な抗体フォーマットがSpiess et al., Mol. Immunol. 67(2):95 (2015)、およびBrinkmann and Kontermann, mAbs 9(2):182-212 (2017)に開示され、これを作製するフォーマット及び方法は、参照により本明細書に援用され、例えば、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、ＤＡＲＴ、Ｋｎｏｂｓ－Ｉｎｔｏ－Ｈｏｌｅｓ（ＫＩＨ）アセンブリ、ｓｃＦｖ－ＣＨ３－ＫＩＨアセンブリ、ＫＩＨ共通軽鎖抗体、ＴａｎｄＡｂ、トリプルボディ、ＴｒｉＢｉミニボディ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－ＣＨ－ＣＬ－ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２－ｓｃＦｖ２、四価ＨＣａｂ、イントラボディ、クロスマブ、デュアル クションＦａｂ（ＤＡＦ）（ツーインワンまたはフォーインワン）、ＤｕｔａＭａｂ、ＤＴ－ＩｇＧ、チャージペア、Ｆａｂアーム交換、ＳＥＥＤボディ、Ｔｒｉｏｍａｂ、ＬＵＺ－Ｙアセンブリ、Ｆｃａｂ、κλボディ、直交Ｆａｂ、ＤＶＤ-Ｉｇ（例えば、米国特許第８，２５８，２６８号、このフォーマットはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）、ＩｇＧ（Ｈ）－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－（Ｈ）ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ）－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－（Ｌ）ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ，Ｈ）－Ｆｖ、ＩｇＧ（Ｈ）－Ｖ、Ｖ（Ｈ）－ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ）－Ｖ、Ｖ（Ｌ）－ＩｇＧ、ＫＩＨ ＩｇＧ－ｓｃＦａｂ、２ｓｃＦｖ-ＩｇＧ、ＩｇＧ-２ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ４-Ｉｇ、Ｚｙｂｏｄｙ、およびＤＶＩ-ＩｇＧ（フォーインワン）、ならびにいわゆるＦＩＴ-Ｉｇ（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１５／１０３０７２、これらのフォーマットはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）、いわゆるＷｕｘｉＢｏｄｙフォーマット（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１９／０５７１２２、このフォーマットはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）、いわゆるＩｎ－Ｅｌｂｏｗ－Ｉｎｓｅｒｔ Ｉｇフォーマット（ＩＥＩ－Ｉｇ；例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１９／０２４９７９およびＷＯ２０１９／０２５３９１、これらのフォーマットはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を含む。
ある実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、２つ以上のＶＨドメイン、２つ以上のＶＬドメイン、又は両方（すなわち、２つ以上のＶＨドメイン及び２つ以上のＶＬドメイン）を含む。特定の実施形態では、抗原結合断片は、フォ－マット（Ｎ末端からＣ末端方向）ＶＨ－リンカー－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－リンカー－ＶＬを含み、ここで、２つのＶＨ配列は同一又は異なることができ、２つのＶＬ配列は同一又は異なることができる。そのような連結ｓｃＦｖは、所定の標的に結合するように配列されたＶＨ及びＶＬドメインの任意の組み合わせを含み得、２つ以上のＶＨ及び／又は２つ以上のＶＬ、１つ、２つ、又は複数の異なるペプチド又は抗原を含むフォ－マットで結合され得る。複数の抗原結合ドメインを組み込んだフォ－マットは、任意の組み合わせ又は方向のＶＨ及び／又はＶＬ配列を含み得ることが理解されるであろう。例えば、抗原結合断片は、フォ－マットＶＬ－リンカー－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－リンカー－ＶＨ、ＶＨ－リンカー－ＶＬ－リンカー－ＶＨ、又はＶＬ－リンカー－ＶＨ－リンカー－ＶＨ－リンカー－ＶＬを含むことができる。
構築された本開示の単特異的又は多特異的抗体又は抗原結合断片は、本明細書に開示されたＶＨ及びＶＬ配列、及び／又はＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３配列の任意の組合せを含む。二特異的又は多特異的抗体又は抗原結合断片は、いくつかの実施形態において、本開示の１つ、２つ、又はそれ以上の抗原結合ドメイン（例えば、ＶＨ及びＶＬ）を含むことができる。同一又は異なるベータコロナウイルスエピトープに結合する２つ以上の結合ドメイン、及び本明細書に提供される二特異的又は多特異的抗体又は抗原結合断片は、いくつかの実施形態において、さらなるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２結合ドメインを含むことができ、及び／又は異なる抗原又は病原体に完全に結合する結合ドメインを含むことができる。
現在開示されている実施形態のいずれにおいても、抗体又は抗原結合断片は、多特異的、例えば、二重特異的、三重特異的などであり得る。
ある実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、（ｉ）第１のＶＨ及び第１のＶＬ；ならびに（ｉｉ）第２のＶＨ及び第２のＶＨが異なり、かつ各々が配列番号２６、３６、４７、６６、７１、７２のいずれかに記載されるアミノ酸配列との少なくとも８５％（すなわち、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％、９９％、又は１００％）同一性を有するアミノ酸配列を独立して含む、第１のＶＨ及び第２のＶＬを含む。第１のＶＬ及び第２のＶＬは異なるが、第１のＶＬ及び第２のＶＬは、配列番号３０、４０、５１、６９、７５、７７及び８２のいずれかに記載されるアミノ酸配列と少なくとも８５％（すなわち、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％、９９％、又は１００％）同一性を有し、第１のＶＨ及び第１のＶＬは共に第１の抗原結合部位を形成し、第２のＶＨ及び第２のＶＬは共に第２の抗原結合部位を形成するアミノ酸配列をそれぞれ独立して含む。
ある実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、Ｆｃポリペプチド、又はその断片を含む。Ｆｃポリペプチド、Ｆｃ二量体、又はＦｃの断片は、Ｆｃ部分とも呼ばれ得る。「Ｆｃ」断片又はＦｃポリペプチドは、ジスルフィドによって一緒に保持された両方の抗体Ｈ鎖のカルボキシ末端部分（すなわち、ＩｇＧのＣＨ２及びＣＨ３ドメイン）を含む。抗体「エフェクタ－機能」とは、抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異型Ｆｃ領域）に起因する生物学的活性を指し、抗体アイソタイプによって変化する。抗体エフェクタ－機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害性；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレ－ション；及びＢ細胞活性化が含まれる。本明細書中で議論されるように、Ｆｃ含有ポリペプチド（例えば、本開示の抗体）の１以上の機能性を修飾（例えば、改良、還元、又は除去）するために、改変（例えば、アミノ酸置換）をＦｃドメインに行うことができる。そのような機能には、例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合、抗体半減期調節（例えば、ＦｃＲｎへの結合による）、ＡＤＣＣ機能、プロテインＡ結合、プロテインＧ結合、及び補体結合が含まれる。Ｆｃ官能基を修飾するアミノ酸修飾（例えば、改良、還元、又は除去）としては、例えば、
Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６＋Ａ３２７Ｇ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｅ３３３Ａ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｐ２５７Ｉ／Ｑ３１１、Ｋ３２６Ｗ／Ｅ３３３Ｓ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｇ２３６Ａ、Ｎ２９７Ｑ、Ｋ３２２Ａ、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ＋Ｅ３１８Ａ／Ｋ３２０Ａ／Ｋ３２２Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（本明細書では「ＬＡＬＡ」とも呼ばれる）、およびＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ突然変異が含まれ、これらの突然変異は、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（２０１１）によって出版され、オンラインでinvivogen.com/PDF/review/review-Engineered-Fc-Regions-invivogen.pdf?utm_source=review&utm_medium=pdf&utm_ campaign=review&utm_content=Engineered-Fc-Regions（参照により本明細書に援用される）で利用可能である「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｆｃ Ｒｅｇｉｏｎａｌｓ」に要約および注釈が付けられている。
例えば、補体カスケードを活性化するために、Ｃ１ｑタンパク質複合体は、免疫グロブリン分子が抗原標的に結合する場合、少なくとも２分子のＩｇＧ１又は１分子のＩｇＭに結合することができる（Ward, E. S., and Ghetie, V., Ther. Immunol. 2 (1995) 77-94）。Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．は、アミノ酸残基３１８～３３７を含む重鎖領域が補体結合に関与していることを報告した（Mol. Immunol. 22 (1985) 161-206）。Ｄｕｎｃａｎ，Ａ．Ｒ．およびＷｉｎｔｅｒ，Ｇ．（Nature 332 (1988) 738-740）は、部位特異的突然変異誘発を用いて、Ｇｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０及びＬｙｓ３２２がＣ１ｑへの結合部位を形成することを報告した。Ｃ１ｑの結合におけるＧｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０及びＬｙｓ ３２２残基の役割は、これらの残基を含む短い合成ペプチドが補体媒介溶解を阻害する能力によって確認された。
例えば、ＦｃＲ結合は、Ｆｃ部分（抗体の）と、造血細胞を含む細胞上の特殊化した細胞表面受容体であるＦｃ受容体（ＦｃＲ）との相互作用によって媒介され得る。Ｆｃ受容体は免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、抗体依存性細胞傷害性（ADCC; Van de Winkel, J. G., and Anderson, C. L., J. Leukoc. Biol. 49 (1991) 511-524）を介して、免疫複合体の食作用による抗体被覆病原体の除去、及び対応する抗体で被覆された赤血球及び種々の他の細胞標的（例えば、腫瘍細胞）の溶解の両方を媒介することが示されている。ＦｃＲは免疫グロブリンクラスに対する特異性によって定義され、ＩｇＧ抗体に対するＦｃ受容体はＦｃγＲ、ＩｇＥはＦｃεＲ、ＩｇＡはＦｃαＲなどと呼ばれ、新生児Ｆｃ受容体はＦｃＲｎと呼ばれる。Ｆｃ受容体結合は、例えば、Ravetch, J. V., and Kinet, J. P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492; Capel, P. J., et al., Immunomethods 4 (1994) 25-34; de Haas, M., et al., J Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-341; and Gessner, J. E., et al., Ann. Hematol. 76 (1998) 231-248に記載されている。
天然ＩｇＧ抗体（ＦｃγＲ）のＦｃドメインによる受容体の架橋は、食作用、抗体依存性細胞傷害、及び炎症性メディエ－タ－の放出、ならびに免疫複合体クリアランス及び抗体産生の調節を含む広範なエフェクタ－機能を誘発する。受容体（例えば、ＦｃγＲ）の架橋を提供するＦｃ部分は、本明細書において意図される。ヒトにおいて、３つのクラスのＦｃγＲが現在までに特徴付けられている：（ｉ）高親和性で単量体ＩｇＧに結合し、マクロファージ、単球、好中球及び好酸球上に発現されるＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）；（ｉｉ）中程度から低親和性で複合体化ＩｇＧに結合するＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）は、特に白血球上で広く発現され、抗体媒介性免疫の中心的役割を果たすと考えられ、免疫系において異なる機能を果たすがＩｇＧ－Ｆｃに類似した低親和性で結合するＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ及びＦｃγＲＩＩＣに分けることができるが、（ｉｉｉ）ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）；ＩｇＧは中～低親和性で結合し、ＮＫ細胞、マクロファージ、好酸球、一部の単球及びＴ細胞上に見出され、ＡＤＣＣを媒介すると考えられているＦｃγＲＩＩＩＡ、及び好中球上に高度に発現するＦｃγＲＩＩＩＢの２つの形態で見出されている。
ＦｃγＲＩＩＡは、殺傷に関与する多くの細胞（例えば、マクロファージ、単球、好中球）に見出され、殺傷プロセスを活性化することができるようである。ＦｃγＲＩＩＢは抑制過程に関与しているようであり、Ｂ細胞、マクロファージ、肥満細胞及び好酸球にみられる。重要なことに、全てのＦｃγＲＩＩＢの７５％が肝臓に見出されることが示されている（Ganesan, L. P. et al., 2012: “FcγRIIb on liver sinusoidal endothelium clears small immune complexes,” Journal of Immunology 189: 4981-4988）。ＦｃγＲＩＩＢは、ＬＳＥＣと呼ばれる肝類洞内皮上に豊富に発現され、肝臓及びＬＳＥＣ中のクッパ－細胞においては、小さな免疫複合体クリアランスの主要部位である（Ganesan, L. P. et al., 2012: FcγRIIb on liver sinusoidal endothelium clears small immune complexes. Journal of Immunology 189: 4981-4988）。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示された抗体及びその抗原結合断片は、ＦｃγＲＩＩｂ、特にＦｃ領域、例えばＩｇＧ型抗体に結合するためのＦｃポリペプチド又はその断片を含む。さらに、Chu, S. Y. et al., 2008: Inhibition of B cell receptor-mediated activation of primary human B cells by coengagement of CD19 and FcgammaRIIb with Fc-engineered antibodies. Molecular Immunology 45, 3926-3333に記載されるように、突然変異Ｓ２６７Ｅ及びＬ３２８Ｆを導入することによって、Ｆｃ部分を操作してＦｃγＲＩＩＢ結合を増強することが可能である。そこで、免疫複合体のクリアランスを増強することができる（Chu, S., et al., 2014: Accelerated Clearance of IgE In Chimpanzees Is Mediated By Xmab7195, An Fc-Engineered Antibody With Enhanced Affinity For Inhibitory Receptor FcγRIIb. Am J Respir Crit, American Thoracic Society International Conference Abstracts）。いくつかの実施形態において、本開示の抗体又はその抗原結合断片は、特にChu, S. Y. et al., 2008: Inhibition of B cell receptor-mediated activation of primary human B cells by coengagement of CD19 and FcgammaRIIb with Fc-engineered antibodies. Molecular Immunology 45, 3926-3933に記載されるように、突然変異Ｓ２６７Ｅ及びＬ３２８Ｆを有する操作されたＦｃ部分を含む。
Ｂ細胞において、ＦｃγＲＩＩＢは、さらなる免疫グロブリン産生及び例えばＩｇＥクラスへのイソタイプスイッチを抑制するために機能し得る。マクロファージでは、ＦｃγＲＩＩＢは、ＦｃγＲＩＩＡを介した食作用を阻害すると考えられている。好酸球及び肥満細胞では、Ｂ型は、ＩｇＥが別の受容体に結合することによって、これらの細胞の活性化を抑制するのを助けている可能性がある。
ＦｃγＲＩ結合に関しては、Ｅ２３３－Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７及びＰ３２９の少なくとも１つの天然ＩｇＧにおける修飾は、ＦｃγＲＩへの結合を減少させる。位置２３３～２３６にあるＩｇＧ２残基は、対応する位置ＩｇＧ１及びＩｇＧ４に置換され、１０３－ｆｏｌｄによるＩｇＧ１及びＩｇＧ４のＦｃγＲＩへの結合を減少させ、抗体感作赤血球に対するヒト単球反応を排除した（Armour, K. L., et al. Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613-2624）。
ＦｃγＲＩＩ結合に関しては、ＦｃγＲＩＩＡに対する減少した結合が、例えば、Ｅ２３３－Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ｐ３２９、Ｄ２７０、Ｑ２９５、Ａ３２７、Ｒ２９２及びＫ４１４の少なくとも１つのＩｇＧ突然変異について見出される。
ヒトＦｃγＲＩＩＡの２つの対立遺伝子型は、高親和性でＩｇＧ１ Ｆｃに結合する「Ｈ１３１」バリアントと、低親和性でＩｇＧ１ Ｆｃに結合する「Ｒ１３１」バリアントである。例えば、Bruhns et al., Blood 113:3716-3725 (2009)を参照されたい。
ＦｃγＲＩＩＩ結合に関して、ＦｃγＲＩＩＩＡへの減少した結合は、例えば、Ｅ２３３－Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ｐ３２９、Ｄ２７０、Ｑ２９５、Ａ３２７、Ｓ２３９、Ｅ２６９、Ｅ２９３、Ｙ２９６、Ｖ３０３、Ａ３２７、Ｋ３３８及びＤ３７６の少なくとも１つの突然変異について見出される。ヒトＩｇＧ１上のＦｃ受容体に対する結合部位、上述の突然変異部位、及びＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＡへの結合を測定する方法のマッピングは、Shields, R. L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604に記載されている。
ヒトＦｃγＲＩＩＩＡの２つの対立遺伝子型は、低親和性でＩｇＧ１ Ｆｃに結合する「Ｆ１５８」バリアント及び高親和性でＩｇＧ１ Ｆｃに結合する「Ｖ１５８」バリアントである。例えば、Bruhns et al., Blood 113:3716-3725 (2009)を参照されたい。
ＦｃγＲＩＩへの結合に関して、天然ＩｇＧ Ｆｃの２つの領域、すなわち、（ｉ）ＩｇＧ Ｆｃの下部ヒンジ部位、特にアミノ酸残基Ｌ、Ｌ、Ｇ、Ｇ（ＥＵ番号付け２３４～２３７）、および（ｉｉ）ＩｇＧ ＦｃのＣＨ２ドメインの隣接領域、特に下部ヒンジ領域に隣接する上部ＣＨ２ドメインのループおよび鎖、例えば、Ｐ３３１の領域内（Wines, B.D., et al., J. Immunol. 2000; 164: 5313 - 5318）である。さらに、ＦｃγＲＩはＩｇＧ Ｆｃ上の同じ部位に結合するようであり、一方、ＦｃＲｎ及びプロテインＡはＩｇＧ Ｆｃ上の異なる部位に結合し、これはＣＨ２－ＣＨ３界面にあるようである（Wines, B.D., et al., J. Immunol. 2000; 164: 5313 - 5318）。
また、本開示のＦｃポリペプチド又はその断片の（すなわち、１以上の）Ｆｃγ受容体に対する結合親和性を増大させる突然変異（例えば、参照Ｆｃポリペプチド又はその断片と比較した場合、又は突然変異を含まないものを含有する突然変異）も意図される。例えば、Delillo and Ravetch, Cell 161(5):1035-1045 (2015) and Ahmed et al., J. Struc. Biol. 194(1):78 (2016)を参照されたい。Ｆｃ突然変異及び技術は、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に開示される実施形態のいずれかにおいて、抗体又は抗原結合断片は、Ｇ２３６Ａ；Ｓ２３９Ｄ；Ａ３３０Ｌ；及びＩ３２Ｅから選択される突然変異を含むＦｃポリペプチド又はその断片；又はそれらのいずれかの２つ以上を含む組み合わせ；例えば、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３２Ｅ；Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３２Ｅ；Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３２Ｅ；Ｇ２３６Ａ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３２Ｅ（本明細書では「ＧＡＡＬＩＥ」とも言う）；又はＧ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３２Ｅを含む組み合わせを含むことができる。ある実施形態において、Ｆｃポリペプチド又はその断片は、Ｓ２３９Ｄを含まない。
ある実施形態において、Ｆｃポリペプチド又はその断片は、ＦｃＲｎ結合に関与するＦｃポリペプチド又はその断片の少なくとも一部を含んでもよく、又はそれからなってもよい。ある実施形態において、Ｆｃポリペプチド又はその断片は、ＦｃＲｎに対する結合親和性を改善する（例えば、約６．０のｐＨで）１以上のアミノ酸修飾を含み、それにより、いくつかの実施形態において、Ｆｃポリペプチド又はその断片を含む分子のインビボ半減期を延長する（例えば、参照Ｆｃポリペプチド又はその断片と比較して、さもなければ同じであるが修飾を含まない）。ある実施形態において、Ｆｃポリペプチド又はその断片は、ＩｇＧ Ｆｃを含み、又はＩｇＧ Ｆｃから誘導され、半減期延長突然変異は、Ｍ４２８Ｌ；Ｎ４３４Ｓ；Ｎ４３４Ｈ；Ｎ４３４Ａ；Ｎ４３４Ｓ；Ｍ２５２Ｙ；Ｓ２５４Ｔ；Ｔ２５６Ｅ；Ｔ２５０Ｑ；Ｐ２５７Ｉ；Ｑ３１１Ｉ；Ｄ３７６Ｖ；Ｔ３０７Ａ；Ｅ３８０Ａ（ＥＵ番号）のいずれか１つ以上を含む。ある実施形態において、半減期延長突然変異は、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ（本明細書では「ＭＬＮＳ」とも呼ばれる）を含む。ある実施形態において、半減期延長突然変異は、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅを含む。ある実施形態において、半減期延長突然変異は、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌを含む。ある実施形態において、半減期延長突然変異は、Ｐ２５７Ｉ／Ｑ３１１Ｉを含む。ある実施形態において、半減期延長突然変異は、Ｐ２５７Ｉ／Ｎ４３４Ｈを含む。ある実施形態において、半減期延長突然変異は、Ｄ３７６Ｖ／Ｎ４３４Ｈを含む。ある実施形態において、半減期延長突然変異は、Ｔ３０７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａを含む。
ある実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、置換突然変異Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含むＦｃ部分を含む。いくつかの実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、置換ｍｔｕｇ Ｇ２３６Ａ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３２Ｅを含むＦｃポリペプチド又はその断片を含む。ある実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、Ｇ２３６Ａ突然変異、Ａ３３０Ｌ突然変異、及びＩ３２Ｅ突然変異（ＧＡＡＬＩＥ）を含む（例えば、ＩｇＧ）Ｆｃ部分を含み、Ｓ２３９Ｄ突然変異を含まない（例えば、位置２３９における天然Ｓを含む）。特定の実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、置換変異：Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ及びＧ２３６Ａ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３２Ｅを含み、任意選択的にＳ２３９Ｄを含まないＦｃポリペプチド又はその断片を含む。ある実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、置換突然変異：Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ及びＧ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３２Ｅを含むＦｃポリペプチド又はその断片を含む。
ある実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、グリコシル化を変化させる突然変異を含み、ここで、グリコシル化を変化させる突然変異は、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、又はＮ２９７Ｇを含み、及び／又は抗体又は抗原結合断片は、部分的又は完全にアグリコシル化され、及び／又は部分的又は完全にアフコシル化される。宿主細胞株及び部分的又は完全にアグリコシル化された、又は部分的又は完全にアフコシル化された抗体及び抗原結合断片を作製する方法が公知である（例えば、ＰＣＴ公開番号WO 2016/181357; Suzuki et al. Clin. Cancer Res. 13(6):1875-82 (2007); Huang et al. MAbs 6:1-12 (2018)を参照されたい）。
ある実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、抗体又は抗原結合断片の検出可能なレベルが対象中に見出されない場合（すなわち、抗体又は抗原結合断片が投与後に対象から除去された場合）であっても、対象においてインビボで継続的な保護を引き出すことができる。このような防御は、本明細書ではワクチン効果と呼ばれる。理論に拘束されることを望まないが、樹状細胞は、抗体及び抗原の複合体を内部化し、その後、抗原に対する内因性免疫応答を誘導又は寄与することができると考えられる。ある実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、例えば、抗原に対するＴ細胞免疫を誘導し得る樹状細胞を活性化することができる、Ｇ２３６Ａ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３２Ｅを含むＦｃにおける突然変異などの１以上の修飾を含む。
現在開示されている実施形態のいずれかにおいて、抗体又は抗原結合断片は、ＣＨ２（又はその断片、ＣＨ３（又はその断片）、又はＣＨ２及びＣＨ３を含む、Ｆｃポリペプチド又はその断片を含み、ここで、ＣＨ２、ＣＨ３、又はその両方は、任意のアイソタイプであり得、対応する野生型ＣＨ２又はＣＨ３と比較して、それぞれアミノ酸置換又は他の修飾を含み得る。ある実施形態において、本開示のＦｃポリペプチドは、二量体を形成するために会合する２つのＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドを含む。
現在開示されている実施形態のいずれにおいても、抗体又は抗原結合断片はモノクローナルであり得る。用語「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）は、本明細書中で使用される場合、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体、すなわち、集団を含む個々の抗体は、ある場合には少量で存在し得る可能性のある天然に存在する突然変異を除いて、同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対して指向される。さらに、異なるエピトープに対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原の単一のエピトープに対して向けられる。モノクローナル抗体は、その特異性に加えて、他の抗体によって汚染されずに合成され得るという点で有利である。用語「モノクローナル」は、いかなる特定の方法によっても抗体の産生を必要とするものと解釈されるべきではない。例えば、本発明において有用なモノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature 256:495 (1975)によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって調製することができ、または細菌、真核動物、または植物細胞における組換えＤＮＡ法を使用して作製することができる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）。モノクローナル抗体はまた、Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)およびMarks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)に記載される技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離してもよい。モノクローナル抗体は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００４／０７６６７７Ａ２に開示されている方法を使用して得ることもできる。
本開示の抗体および抗原結合断片には、所望の生物活性を示す限り、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来する抗体、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同である一方、鎖の残りの部分は、別の種に由来する抗体、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体、ならびにそのような抗体の断片の対応する配列と同一または相同である「キメラ抗体」が含まれる（U.S. Pat. Nos. 4,816,567; 5,530,101 and 7,498,415; and Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)参照）。例えば、キメラ抗体は、ヒト残基および非ヒト残基を含み得る。さらに、キメラ抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体には見出されない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体の性能をさらに改良するために行われます。さらなる詳細については、Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照されたい。キメラ抗体には、霊長類化抗体およびヒト化抗体も含まれる。
「ヒト化抗体」は、一般に、ヒト以外の供給源から導入された１つ以上のアミノ酸残基を有するヒト抗体であると考えられる。これらの非ヒトアミノ酸残基は、典型的には可変ドメインから取られる。ヒト化は、ヒト抗体の対応する配列に対して非ヒト可変配列を置換することによって、Ｗｉｎｔｅｒ及び共同研究者（Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)）の方法に従って行うことができる。したがって、そのような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない部分が非ヒト種由来の対応する配列によって置換されているキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号、第５，５３０，１０１号および第７，４９８，４１５号）である。場合によっては、「ヒト化」抗体は、非ヒト細胞または動物によって産生され、ヒト配列、例えば、ＨＣドメインを含む抗体である。
「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体中に存在する配列のみを含む抗体である。しかしながら、本明細書中で使用する場合、ヒト抗体は、天然に存在するヒト抗体（例えば、ヒトから単離された抗体）中に見出されない残基又は修飾を含み得、それらの修飾及び本明細書中に記載される改変体配列を含む。これらは、典型的には、抗体性能をさらに改良又は増強するために作られる。場合によっては、ヒト抗体はトランスジェニック動物によって産生される。例えば、米国特許第５，７７０，４２９号、第６，５９６，５４１号及び第７，０４９，４２６号を参照されたい。
ある実施形態において、本開示の抗体又は抗原結合断片は、キメラ、ヒト化、又はヒトである。
ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞
別の実施形態では、本開示は、現在開示されている抗体のいずれか、又はその抗原結合断片、又はその一部（例えば、ＣＤＲ、ＶＨ、ＶＬ、重鎖、又は軽鎖）をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
ある実施形態において、ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸又はリボ核酸を含み、ここで、ＲＮＡは、任意にメッセンジャ－ＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオシド、ｃａｐ－１構造、ｃａｐ－２構造、又はそれらの任意の組合せを含む。ある実施形態において、ポリヌクレオチドは、プソイドウリジン、Ｎ６－メチルアデノンシン、５－メチルシチジン、２－チオウリジン、又はそれらの任意の組合せを含む。いくつかの実施形態において、プソイドウリジンは、Ｎ１－メチルプソイドウリジンを含む。
ある実施形態において、ポリヌクレオチドは、宿主細胞における発現のためにコドンを最適化される。コード配列が既知又は同定されると、例えば、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＯｐｔｉｍｉｕｍＧｅｎｅ（商標）ツ－ルを用いて、公知の技術及びツ－ルを用いてコドン最適化を実施することができる；Scholten et al., Clin. Immunol. 119:135, 2006も参照されたい。コドンを最適化された配列は、部分的にコドンを最適化された配列（すなわち、１つ以上のコドンが宿主細胞における発現のために最適化される）及び完全にコドンを最適化された配列を含む。
また、本開示の抗体及び抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドは、例えば、遺伝暗号、スプライシングなどの縮重のために、同一の抗体又は抗原結合断片を依然としてコードしているが、異なるヌクレオチド配列を有していてもよいことも理解されよう。
ある実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号３４、３５、４４、４５、５５、及び５６のいずれか１つ以上に従うポリヌクレオチド配列に対して少なくとも５０％（すなわち、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）同一性を有するポリヌクレオチドを含む。
ある実施形態において、抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号３４、４４、又は５５のポリヌクレオチド配列を含む。
ある実施形態において、抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号３５、４５、又は５６のポリヌクレオチド配列を含む。
ある実施形態において、抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号３４、４４、又は５５のポリヌクレオチド配列を含み、抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号３４、４４、又は５５のポリヌクレオチド配列を含み、又はそれからなる。
現在開示されている実施形態のいずれにおいても、ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）を含むことができる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡはメッセンジャ－ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む。
ベクターもまた提供され、ここで、ベクターは、本明細書に開示されたポリヌクレオチド（例えば、任意の２、３、４、又は５のベータコロナウイルスに結合する抗体又は抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド）を含むか、又は含む。ベクターは、本明細書に開示されたベクターのいずれか１つ以上を含むことができる。特定の実施形態では、抗体又は抗原結合断片、又はその一部（例えば、いわゆる「ＤＭＡｂ」；Muthumani et al., J Infect Dis. 214(3):369-378 (2016); Muthumani et al., Hum Vaccin Immunother 9:2253-2262 (2013)); Flingai et al., Sci Rep. 5:12616 (2015); and Elliott et al., NPJ Vaccines 18 (2017)は、抗体コードＤＮＡ構築物及びそれの投与を含む使用の関連方法を、参照により本明細書に組み入れる。ある実施形態において、ＤＮＡプラスミド構築物は、抗体又は抗原結合断片の重鎖及び軽鎖（又はＶＨ及びＶＬ）をコードする単一のオ－プンリ－ディングフレ－ムを含み、ここで、重鎖をコードする配列及び軽鎖をコードする配列は、プロテア－ゼ切断部位をコードするポリヌクレオチドにより、及び／又は自己切断ペプチドをコードするポリヌクレオチドにより任意に分離される。いくつかの実施形態において、抗体又は抗原結合断片の置換基成分は、単一プラスミド中に含まれるポリヌクレオチドによってコードされる。他の実施形態では、抗体又は抗原結合断片の置換基成分は、２つ以上のプラスミド（例えば、第１のプラスミドは、重鎖、ＶＨ、又はＶＨ＋ＣＨをコードするポリヌクレオチドを含み、第２のプラスミドは、同族軽鎖、ＶＬ、又はＶＬ＋ＣＬをコードするポリヌクレオチドを含む）に含まれるポリヌクレオチドによってコードされる。ある実施形態において、単一プラスミドは、本開示の２以上の抗体又は抗原結合断片からの重鎖及び／又は軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む。例示的な発現ベクターは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）から入手可能なｐＶａｘ１である。本開示のＤＮＡプラスミドは、例えば、エレクトロポレ－ション（例えば、筋肉内エレクトロポレ－ション）、又は適切な製剤（例えば、ヒアルロニダ－ゼ）を用いて対象に送達することができる。
ある実施形態において、抗体重鎖、ＶＨ、又はＦｄ（ＶＨ＋ＣＨ１）をコードする第１のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を対象に投与する工程、及び同族抗体軽鎖、ＶＬ、又はＶＬ＋ＣＬをコードする第２のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を対象に投与する工程を含む方法が提供される。
ある実施形態において、抗体又はその抗原結合断片の重鎖及び軽鎖をコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）が提供される。ある実施形態において、抗体又はその抗原結合断片の２つの重鎖及び２つの軽鎖をコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）が提供される。例えば、Li, JQ., Zhang, ZR., Zhang, HQ. et al. Intranasal delivery of replicating mRNA encoding neutralizing antibody against SARS-CoV-2 infection in mice. Sig Transduct Target Ther 6, 369 (2021). https://doi.org/10.1038/s41392-021-00783-1を参照されたい。抗体をコードするｍＲＮＡ構築物、ベクター、及び関連技術は、参照により本明細書に援用される。ある実施形態において、ポリヌクレオチドは、アルファウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）送達システムを介して対象に送達される。ある実施形態において、レプリコンは、２つのサブゲノムプロモーターを含む修飾されたＶＥＥＶレプリコンを含む。ある実施形態において、ポリヌクレオチド又はレプリコンは、抗体又はその抗原結合断片の重鎖（又はＶＨ、又はＶＨ＋１）及び軽鎖（又はＶＬ、又はＶＬ＋ＣＬ）を同時に翻訳することができる。ある実施形態において、そのようなポリヌクレオチド又はレプリコンを対象に送達することを含む方法が提供される。
さらなる実施形態において、本開示はまた、本開示による抗体又は抗原結合断片を発現する；又は本開示によるベクター又はポリヌクレオチドを含むか又は含む宿主細胞を提供する。
そのような細胞の例としては、真核細胞、例えば、酵母細胞、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞；及び大腸菌を含む原核細胞が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、細胞は、哺乳動物細胞である。特定のそのような実施形態において、細胞は、ＣＨＯ細胞（例えば、ＤＨＦＲＣＨＯ細胞（Urlaub et al., PNAS 77:4216 (1980)）、ヒト胚性腎細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、Ｙ０細胞、Ｓｐ２／０細胞）のような哺乳動物細胞株である。ＮＳ０細胞、ヒト肝細胞、例えば、Ｈｅｐａ ＲＧ細胞、骨髄腫細胞又はハイブリド－マ細胞。哺乳動物宿主細胞株の他の例としては、マウスセルトリ細胞（例えば、ＴＭ４細胞）；ＳＶ４０（ＣＯＳ－７）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ベビ－ハムスター腎細胞（ＢＨＫ）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ－７６）；サル腎細胞（ＣＶ１）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ；バッファロ－ラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２）；ＴＲＩ細胞； ＭＲＣ ５細胞；及びＦＳ４細胞が挙げられる。抗体産生に適した哺乳動物宿主細胞株には、例えば、ＹYazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J.), pp. 255-268 (2003)に記載されているものも含まれる。
ある実施形態において、宿主細胞は、大腸菌のような原核細胞である。大腸菌のような原核細胞におけるペプチドの発現は十分に確立されている（例えば、Pluckthun, A. Bio/Technology 9:545-551 (1991).参照）。例えば、抗体は、細菌において、特にグリコシル化及びＦｃエフェクタ－機能が必要でない場合に産生され得る。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、第５，７８９，１９９号、第５，８４０，５２３号を参照されたい。
特定の実施形態において、細胞は、発現ベクターを用いて本明細書に従うベクターでトランスフェクトされ得る。用語「トランスフェクション」は、ＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）分子などの核酸分子を、真核細胞などの細胞に導入することを指す。本明細書の文脈において、用語「トランスフェクション」は、哺乳動物細胞を含む、真核細胞などの細胞に核酸分子を導入するための、当業者に公知の任意の方法を包含する。そのような方法は、例えば、カチオン性脂質及び／又はリポソ－ムに基づくエレクトロポレ－ション、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ナノ粒子に基づくトランスフェクション、ウイルスに基づくトランスフェクション、又はＤＥＡＥ－デキストラン又はポリエチレンイミンなどのカチオン性ポリマーに基づくトランスフェクションを包含する。ある実施形態において、導入は、非ウイルス性である。
さらに、本開示の宿主細胞は、本開示に従って、例えば抗体又はその抗原結合断片を発現するために、本開示のベクターで安定的又は一時的にトランスフェクトされ得る。そのような実施形態において、細胞は、本明細書に記載されるように、ベクターで安定にトランスフェクトされ得る。あるいは、細胞を、本明細書に開示されているような抗体又は抗原結合断片をコードする本開示によるベクターで一時的にトランスフェクトしてもよい。現在開示されている実施形態のいずれにおいても、ポリヌクレオチドは宿主細胞に対して異種性であってもよい。
従って、本開示はまた、本開示の抗体又は抗原結合断片を異種的に発現する組換え宿主細胞を提供する。例えば、細胞は、抗体が完全に又は部分的に得られた種とは異なる種（例えば、ヒト抗体を発現するＣＨＯ細胞又は操作されたヒト抗体）のものであってもよい。ある実施形態において、宿主細胞の細胞型は、本質的に抗体又は抗原結合断片を発現しない。さらに、宿主細胞は、抗体又は抗原結合断片の天然状態（又は抗体又は抗原結合断片が操作又は誘導された親抗体の天然状態）に存在しない抗体又は抗原結合断片上に、翻訳後修飾（ＰＴＭ；例えば、グリソシル化又はフコシル化）を付与することができる。そのようなＰＴＭは、機能的差異（例えば、免疫原性の低下）をもたらす可能性がある。従って、本明細書に開示されているように宿主細胞によって産生される本開示の抗体又は抗原結合断片は、その天然状態（例えば、ＣＨＯ細胞によって産生されたヒト抗体）における抗体（又は親抗体）とは異なる１つ以上の翻訳後修飾を含むことができ、これは、ヒトから単離された場合、及び／又は天然のヒトＢ細胞又は形質細胞によって産生された場合、抗体とは異なる、より多くの翻訳後修飾を含むことができる。
本開示の結合タンパク質を発現するのに有用な昆虫細胞は、当技術分野で公知であり、例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒａ Ｓｆ９細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ ＢＴＩ－ＴＮ５Ｂ１－４細胞、及びＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒａ ＳｆＳＷＴ０１「模倣（商標）」細胞を含む。例えば、Palmberger et al., J. Biotechnol. 153(3-4):160-166 (2011).を参照されたい。昆虫細胞と組み合わせて、特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションに用いることができる多数のバキュロウイルス株が同定されている。
糸状菌又は酵母などの真核微生物も、タンパク質コードベクターをクロ－ニング又は発現するのに適した宿主であり、「ヒト化」グリコシル化経路を有する真菌及び酵母株を含み、その結果、部分的又は完全なヒトグリコシル化パタ－ンを有する抗体の産生がもたらされる。Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004); Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)を参照されたい。
植物細胞はまた、本開示の結合タンパク質を発現するための宿主として利用することもできる。例えば、ＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術（例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、第６，０４０，４９８号、第６，４２０，５４８号、第７，１２５，９７８号、及び第６，４１７，４２９号に記載される）は、抗体を産生するためにトランスジェニック植物を使用する。
ある実施形態において、宿主細胞は、哺乳動物細胞を含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、Ｙ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＮＳ０細胞、ヒト肝細胞、骨髄腫細胞、又はハイブリド－マ細胞である。
関連する実施形態において、本開示は、抗体又は抗原結合断片を産生する方法を提供し、ここで、該方法は、抗体又は抗原結合断片を産生するのに十分な条件下及び時間、本開示の宿主細胞を培養することを含む。組換えにより産生された抗体を、例えば、単離及び精製するのに有用な方法は、組換え抗体を培養培地中に分泌する適切な宿主細胞／ベクター系から上清を得ること、次に市販のフィルタ－を用いて培地を濃縮することを含み得る。濃縮後、濃縮物を単一の適切な精製マトリックス又はアフィニティ－マトリックス又はイオン交換樹脂のような一連の適切なマトリックスに塗布することができる。１以上の逆相ＨＰＬＣ工程を用いて、組換えポリペプチドをさらに精製することができる。これらの精製方法は、自然環境から免疫原を単離する場合にも使用することができる。本明細書に記載される１つ以上の単離／組換え抗体の大規模生産のための方法は、適切な培養条件を維持するためにモニタ－及び制御されるバッチ細胞培養を含む。可溶性抗体の精製は、本明細書に記載され、当技術分野で公知であり、国内及び外国の規制当局の法律及びガイドラインに適合する方法に従って行うことができる。
組成物
本明細書には、現在開示されている抗体、抗原結合断片、ポリヌクレオチド、ベクター、又は宿主細胞のいずれか１つ以上を単独で又は任意の組み合わせで含む組成物も提供され、さらに、薬学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤を含むことができる。担体、賦形剤、及び希釈剤は、本明細書においてさらに詳細に議論される。
ある実施形態において、組成物は、本開示による２つ以上の異なる抗体又は抗原結合断片を含む。ある実施形態において、組み合わせにおいて使用される抗体又は抗原結合断片は、それぞれ独立して、以下の特徴の１つ又は複数を有する：１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は複数の天然ベータコロナウイルスバリアントを中和する；スパイクタンパク質結合について互いに競合しない；別個のベータコロナウイルススパイクタンパク質エピトープに結合する；ベータコロナウイルスに対する抵抗性の形成が減少する；組み合わせにおいて、ベータコロナウイルスに対する抵抗性の形成が減少する；１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は複数の生ベータコロナウイルスを強力に中和する；１つ、２つ、３つ、５つ又は複数の生ベータコロナウイルスの中和に対して相加的又は相乗的効果を示す。５種類以上の生ベータコロナウイルスを組み合わせて使用した場合、エフェクタ－機能を示し、適切な感染動物モデルにおいて防御的であり、大規模生産に十分な量を生産することができる。
ある実施形態において、組成物は、本開示による２つ以上の異なる抗体又は抗原結合断片を含む。ある実施形態において、組成物は、配列番号２６、６６、７１、７２、又は７３に示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＨと、配列番号３０、６９、７５、又は７７に示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＬとを含む第１の抗体または抗原結合断片；ならびに配列番号３６に示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＨと、配列番号４０に示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＬとを含む第２の抗体または抗原結合断片を含む。
ある実施形態において、組成物は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む第１の抗体または抗原結合断片であって、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、配列番号（ｉ）それぞれ２７～２９、（ｉｉ）それぞれ６７、６８、および２９、または（ｉｉｉ）それぞれ２７、２７、および７４に記載のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、配列番号（ｉ）それぞれ３１～３３、（ｉｉ）それぞれ７０、３２、および３３、（ｉｉｉ）それぞれ７６、３２、および３３、（ｉｖ）それぞれ７８、３２、および３３に記載のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる、第１の抗体または抗原結合断片；ならびにＣＤＲＨ２１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＬ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む第２の抗体または抗原結合断片であって、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号３７～３９に示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号４１～４３に示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、第２の抗体または抗原結合断片を含む。
ある実施形態において、組成物は、本開示による２つ以上の異なる抗体又は抗原結合断片を含む。ある実施形態において、組成物は、配列番号２６、６６、７１、７２、又は７３に示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＨと、配列番号３０、６９、７５、又は７７に示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＬとを含む第１の抗体または抗原結合断片と、配列番号４７または７９に示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＨと、配列番号５１または８２に示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＬとを含む第２の抗体又は抗原結合断片を含む。
ある実施形態において、組成物は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む第１の抗体又は抗原結合断片であって、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＬ３は、配列番号（ｉ）それぞれ２７～２９、（ｉｉ）それぞれ６７、６８、及び２９、又は（ｉｉｉ）それぞれ２７、２７、及び７４に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３は、配列番号（ｉ）それぞれ３１～３３、（ｉｉ）それぞれ７０、３２、および３３、（ｉｉｉ）それぞれ７６、３２、および３３、（ｉｖ）それぞれ７８、３２、および３３、（ｉｖ）それぞれ７８、３２、および３３に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、第１の抗体又は抗原結合断片と、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む第２の抗体又は抗原結合断片であって、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号４８～５０またはそれぞれ配列番号８０、８１、もしくは５０に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号５２～５４またはそれぞれ配列番号８３、８３、もしくは５４に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、第２の抗体又は抗原結合断片とを含む。
ある実施形態において、組成物は、本開示による２つ以上の異なる抗体又は抗原結合断片を含む。ある実施形態において、組成物は、配列番号２６、６６、７１、７２、又は７３に示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＨと配列番号３０、６９、７５、又は７７に示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＬとを含む第１の抗体または抗原結合断片；ならびに配列番号４７又は７９に示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＨと配列番号５１又は８２に示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＬとを含む第２の抗体または抗原結合断片を含む。
ある実施形態において、組成物は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む第１の抗体又は抗原結合断片であって、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＬ３は、配列番号（ｉ）それぞれ２７～２９、（ｉｉ）それぞれ６７、６８、及び２９、又は（ｉｉｉ）それぞれ２７、２７、及び７４に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３は、配列番号（ｉ）それぞれ３１～３３、（ｉｉ）それぞれ７０、３２、および３３、（ｉｉｉ）それぞれ７６、３２、および３３、（ｉｖ）それぞれ７８、３２、および３３、（ｉｖ）それぞれ７８、３２、および３３に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、第１の抗体又は抗原結合断片と、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む第２の抗体又は抗原結合断片であって、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号４８～５０またはそれぞれ配列番号８０、８１、もしくは５０に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号５２～５４またはそれぞれ配列番号８３、８３、もしくは５４に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、第２の抗体又は抗原結合断片とを含む。
特定の実施形態では、組成物は、第１のプラスミドを含む第１のベクター、及び第２のプラスミドを含む第２のベクターを含み、第１のプラスミドは、重鎖、ＶＨ、又はＶＨ＋ＣＨをコードするポリヌクレオチドを含み、第２のプラスミドは、抗体又はその抗原結合断片の同族軽鎖、ＶＬ、又はＶＬ＋ＣＬをコードするポリヌクレオチドを含む。ある実施形態において、組成物は、適切な送達ビヒクル又は担体にカップリングされたポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を含む。ヒト対象に投与するための例示的なビヒクル又は担体は、リポソ－ム、固体脂質ナノ粒子、油性懸濁液、サブミクロン脂質エマルジョン、脂質ミクロバブル、逆脂質ミセル、か牛リポソーム、脂質微小管、脂質微小円筒、又は脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）又はナノスケールプラットフォーム（例えば、Li et al. Wilery Interdiscip Rev. Nanomed Nanobiotechnol. 11(2):e1530 (2019)参照）のような脂質又は脂質由来送達ベヒクルを含む。適切なｍＲＮＡを設計し、ｍＲＮＡ－ＬＮＰを設計し、及びそれらを送達するための原理、試薬、及び技術は、例えば、Pardi et al. (J Control Release 217345-351 (2015)); Thess et al. (Mol Ther 23: 1456-1464 (2015)); Thran et al. (EMBO Mol Med 9(10):1434-1448 (2017); Kose et al. (Sci. Immunol. 4 eaaw6647 (2019); and Sabnis et al. (Mol. Ther. 26:1509-1519 (2018))に記載され、技術は、キャッピング、コドン最適化、ヌクレオシド修飾、ｍＲＮＡの精製、安定な脂質ナノ粒子へのｍＲＮＡの取込み（例えば、イオン化可能なカチオン性脂質／ホスファチジルコリン／コレステロ－ル／ＰＥＧ－脂質；イオン化可能な脂質：ジステアロイルＰＣ：コレステロ－ル：ポリエチレングリコ－ル脂質）、及び同じものの皮下、筋肉内、皮内、静脈内、腹腔内、及び気管内投与を含む）を含む。
方法及び用途
また、本明細書には、ベータコロナウイルス感染（例えば、ヒト対象、又はヒト対象から得られた試料）の診断において、本開示の抗体又は抗原結合断片、核酸、ベクター、細胞、又は組成物を使用するための方法も提供される。
診断方法（例えば、インビトロ、エクスビボ）は、抗体、抗体断片（例えば、抗原結合断片）を試料と接触させることを含み得る。そのような試料は、例えば、鼻腔、副鼻腔、唾液腺、肺、肝臓、膵臓、腎臓、耳、眼、胎盤、消化管、心臓、卵巣、下垂体、副腎、甲状腺、脳、皮膚又は血液から採取された単離された組織試料から単離することができる。診断方法はまた、抗原／抗体複合体の検出、特に抗体又は抗体断片の試料との接触後の検出を含み得る。このような検出工程は、ベンチにおいて、すなわち、人体又は動物の体に何ら接触することなく実施することができる。検出方法の例は、当業者に周知であり、例えば、ＥＬＩＳＡ（直接、間接、及びサンドイッチＥＬＩＳＡを含む）を含む。
また、本明細書には、本開示の抗体又は抗原結合断片、又はそれを含む組成物を用いて対象を処置する方法が提供され、ここで、対象は、ベータコロナウイルスによる感染を有する、有すると考えられる、又は有するリスクがある。「治療する」、「治療」、又は「改善する」とは、対象（例えば、霊長類、ウマ、ネコ、イヌ、ヤギ、マウス又はラットのようなヒト又は非ヒト哺乳動物）の疾患、障害、又は状態の医学的管理を指す。一般に、本開示の抗体又は組成物を含む適切な投与量又は治療レジメンは、治療的又は予防的利益を引き出すのに十分な量で投与される。治療又は予防的／予防的利益には、臨床転帰の改善；疾患に関連する症状の軽減又は軽減；症状の発生の減少；ＱＯＬの改善；無病状態の延長；疾患の範囲の縮小、疾患状態の安定化；疾患進行の遅延又は予防；寛解；生存；延命；又はそれらの任意の組み合わせが含まれる。ある実施形態において、治療的又は予防的／予防的利益は、ベータコロナウイルス感染の治療のための入院の減少又は予防を含む（すなわち、統計的に有意な方法で）。ある実施形態において、治療的又は予防的／予防的利益は、ベータコロナウイルス感染の治療のための入院期間の短縮（すなわち、統計的に有意な方法）を含む。ある実施形態において、治療的又は予防的／予防的利益は、挿管及び／又は呼吸保護具の使用のような呼吸介入の必要性の減少又は停止を含む。ある実施形態において、治療的又は予防的／予防的利益は、後期疾患病理を逆転させること、及び／又は死亡率を低下させることを含む。
本開示の抗体、抗原結合断片、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、又は組成物の「治療有効量」又は「有効量」とは、治療効果をもたらすのに十分な組成物又は分子の量を指し、これには、改善された臨床転帰；疾患に関連する症状の軽減又は軽減；症状の発生の減少；改善されたＱＯＬ；より長い無病状態；疾患の広がりの減少；疾患状態の安定化；疾患進行の遅延；寛解；生存；又は統計的に有意な様式での延長が含まれる。単独で投与される個々の活性成分を指す場合、治療上有効量は、その成分又はその成分を単独で発現する細胞の効果を指す。組み合わせを指す場合、治療有効量とは、活性成分又は組み合わされた補助活性成分と、治療効果をもたらす活性成分を発現する細胞との組み合わされた量を指し、連続的に、連続的に、又は同時に投与されるかにかかわらない。組み合わせは、例えば、ベータコロナウイルス抗原に特異的に結合する２つの異なる抗体を含み得る。これらの抗体は、特定の実施形態では、同一又は異なるベータコロナウイルス抗原であり得、及び／又は同一又は異なるエピトープを含み得る。
従って、特定の実施形態では、対象におけるベータコロナウイルス感染を治療するための方法が提供され、ここで、方法は、本明細書に開示されているように、有効量の抗体、抗原結合断片、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、又は組成物を対象に投与することを含む。
本開示により治療することができる対象は、一般に、獣医学目的のサル及び類人猿のようなヒト及び他の霊長類対象である。マウス及びラットのような他のモデル生物も、本開示に従って処理することができる。前述の実施形態のいずれにおいても、対象はヒト対象であってもよい。対象は、男性であっても女性であってもよく、乳児、幼児、青年、成人、及び老年対象を含む任意の適切な年齢であってもよい。
多くの基準が、ベータコロナウイルス感染に関連する重度の症状又は死亡の高リスクの一因であると考えられている。これらには、年齢、職業、一般的健康、既存の健康状態、及び生活習慣が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本開示に従って治療される対象は、１つ以上の危険因子を含む。
ある実施形態において、本開示に従って治療されるヒト対象は、乳児、小児、若年成人、中年成人、又は高齢者である。ある実施形態において、本開示に従って治療されるヒト対象は、１歳未満であるか、１～５歳であるか、又は５～１２５歳である（例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、又は１２５歳であり、その中のあらゆる年齢及びその間を含む）。ある実施形態において、本開示に従って処置されるヒト対象は、０～１９歳、２０～４４歳、４５～５４歳、５５～６４歳、６５～７４歳、７５～８４歳、又は８５歳以上である。中年者、特に高齢者は特にリスクが高いと考えられている。特定の実施形態では、ヒト対象は、４５～５４歳、５５～６４歳、６５～７４歳、７５～８４歳、又は８５歳以上である。いくつかの実施形態において、ヒト対象は男性である。ある実施形態において、ヒト対象は女性である。
特定の実施形態では、本開示に従って治療されるヒト対象は、ナーシングホーム又は介護施設の居住者であり、ホスピスケアワーカーであり、医療提供者又は医療従事者であり、最初の対応者であり、ベータコロナウイルス感染症と診断されたか又はベータコロナウイルス感染症を有すると診断されたか又はその疑いのある対象の家族又は他の密接な接触者であり、過体重又は臨床的に肥満であり、喫煙者であるか又は喫煙者であったか、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息であるか（例えば、中等度から重度の喘息を有する）、自己免疫疾患又は状態（例えば、糖尿病）を有し、及び／又は免疫系（例えば、エイズ／ＨＩＶ感染、癌などの癌、化学療法、骨髄又は臓器移植などのリンパ球除去療法、又は遺伝的免疫状態）の低下又は枯渇、慢性肝疾患、心血管疾患、肺又は心臓の欠陥を有する、作用する、又は工場、出荷センタ－、病院などのような他のものと非常に近接して時間を過ごす。
ある実施形態において、本開示に従って治療された対象は、ベータコロナウイルスのためのワクチンを受けており、ワクチンは、例えば、臨床診断又は科学的又は規制上の基準により、対象におけるワクチン感染後又は症状によって、無効であると決定される。
ある実施形態において、治療は、曝露周囲予防として投与される。ある実施形態において、治療は、外来であってもよい軽度から中等度の疾患を有する対象に投与される。ある実施形態において、治療は、入院を必要とするような中等度から重度の疾患を有する対象に投与される。
従って、本開示の組成物を投与する典型的な経路には、経口、局所、経皮、吸入、非経口、舌下、口腔、直腸、膣、及び鼻腔内が含まれるが、これらに限定されない。本明細書中で使用される用語「非経口」は、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内注射又は注入技術を含む。ある実施形態において、投与は、経口、静脈内、非経口、胃内、胸膜内、肺内、直腸内、皮内、腹腔内、腫瘍内、皮下、局所、経皮、槽内、髄腔内、鼻腔内、及び筋肉内から選択される経路によって投与することを含む 特定の実施形態では、方法は、抗体、抗原結合断片、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、又は組成物を対象に経口投与することを含む。
本発明のある実施形態による医薬組成物は、その中に含まれる活性成分が患者への組成物の投与時に生物学的に利用可能であるように製剤化される。対象又は患者に投与される組成物は、１つ又は複数の投与単位の形態をとることができ、ここで、例えば、錠剤は、単一の投与単位であってもよく、本明細書中に記載された抗体又は抗原結合の容器は、エ－ロゾル形態で複数の投与単位を保持することができる。このような剤形を調製する実際の方法は、当業者に知られており、又は明らかであろう。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition (Philadelphia College of Pharmacy and Science, 2000)を参照されたい。投与される組成物は、いずれにせよ、本明細書の教示に従った疾患又は対象の状態の治療のために、有効量の本開示の抗体又は抗原結合断片、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、又は組成物を含有するであろう。
組成物は、固体又は液体の形態であってもよい。いくつかの実施形態において、担体は、組成物が、例えば、錠剤又は粉末形態であるように、粒子である。担体は液体であり得、組成物は、例えば、吸入投与に有用な、経口油、注射用液体又はエアゾ－ルであり得る。経口投与を意図する場合、医薬組成物は、好ましくは、固体又は液体形態であり、ここに、半固体、半液体、懸濁液及びゲル形態が、本明細書中で固体又は液体として考えられる形態に含まれる。
経口投与のための固体組成物として、医薬組成物は、粉末、顆粒、圧縮錠剤、丸剤、カプセル、チュ－インガム、ウエハ－等に製剤化することができる。このような固体組成物は、典型的には、１以上の不活性希釈剤又は食用担体を含有するであろう。さらに、カルボキシメチルセルロ－ス、エチルセルロ－ス、微結晶セルロ－ス、トラガカントゴム又はゼラチンのような結合剤；澱粉、ラクト－ス又はデキストリンのような賦形剤；アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、プリモゲル、トウモロコシ澱粉などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム又はステロテックスのような潤滑剤；二酸化ケイ素コロイドのようなグリダント；スクロ－ス又はサッカリンのような甘味剤；ペパ－ミント、サリチル酸メチル又はオレンジ香味料のような香味剤；及び着色剤が存在し得る。組成物がカプセル、例えばゼラチンカプセルの形態である場合、それは、上記タイプの材料に加えて、ポリエチレングリコ－ル又は油のような液体担体を含んでもよい。
組成物は、液体、例えばエリキシル、シロップ、溶液、エマルジョン又は懸濁液の形態であってもよい。液体は、２つの例として、経口投与のため、又は注射による送達のためであってもよい。経口投与を意図する場合、好ましい組成物は、本化合物に加えて、甘味剤、防腐剤、染料／着色剤及び香味増強剤の１つ以上を含有する。注射によって投与されることを意図した組成物には、界面活性剤、保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、緩衝剤、安定剤及び等張剤のうちの１つ以上が含まれてもよい。
液体医薬組成物は、溶液、懸濁液又は他の類似の形態であるか否かにかかわらず、以下のアジュバントの１つ以上を含み得る：注射用水、生理食塩水、好ましくは生理食塩水、リンゲル溶液、生理食塩水、等張塩化ナトリウム、溶媒又は懸濁媒体として役立つ合成モノ又はジグリセリドのような固定油、ポリエチレングリコ－ル、グリセリン、プロピレングリコ－ル又は他の溶媒；ベンジルアルコ－ル又はメチルパラベンのような抗菌剤；アスコルビン酸又は重亜硫酸ナトリウムのような酸化防止剤；エチレンジアミン四酢酸のようなキレ－ト化剤；酢酸塩のような緩衝剤。クエン酸塩又はリン酸塩、及び塩化ナトリウム又はデキストロ－スのような浸透圧調整剤。非経口製剤は、ガラス又はプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器又は多回投与バイアルに封入することができる。生理食塩水が好ましいアジュバントである。注射可能な医薬組成物は、好ましくは無菌である。
非経口投与又は経口投与のいずれかを意図した液体組成物は、適切な投与量が得られるように、本明細書に開示された抗体又は抗原結合断片の量を含むべきである。典型的には、この量は、組成物中の抗体又は抗原結合断片の少なくとも０．０１％である。経口投与を意図する場合、この量は組成物の重量の０．１～約７０％の間で変化させることができる。ある種の経口医薬組成物は、抗体又は抗原結合断片を約４％から約７５％の間で含有する。ある実施形態において、本発明による医薬組成物及び製剤は、非経口投与単位が希釈前に０．０１～１０重量％の抗体又は抗原結合断片を含有するように調製される。
組成物は局所投与を意図することができ、その場合、担体は、溶液、エマルジョン、軟膏又はゲル基剤を適切に含むことができる。基剤は、例えば、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコ－ル、ミツバチろう、鉱油、水及びアルコ－ルのような希釈剤、ならびに乳化剤及び安定剤のうちの１つ又は複数を含むことができる。増粘剤は、局所投与のための組成物中に存在し得る。経皮投与を意図する場合、組成物は、経皮パッチ又はイオン導入デバイスを含み得る。医薬組成物は、直腸内で溶融し、薬物を放出する座薬の形態での直腸投与を意図することができる。直腸投与用組成物は、適切な非刺激性賦形剤として油性塩基を含有することができる。そのような塩基には、ラノリン、カカオバタ－及びポリエチレングリコ－ルが含まれるが、これらに限定されない。
組成物は、固体又は液体投与単位の物理的形態を修飾する種々の材料を含み得る。例えば、組成物は、活性成分の周囲にコ－ティングシェルを形成する材料を含んでもよい。コ－ティングシェルを形成する材料は、典型的には不活性であり、例えば、糖、シェラック、及び他の腸溶性コ－ティング剤から選択することができる。あるいは、活性成分をゼラチンカプセルに入れてもよい。固体又は液体形態の組成物は、本開示の抗体又は抗原結合断片に結合し、それによって化合物の送達を支援する物質を含み得る。この能力で作用し得る適切な薬剤には、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、１つ以上のタンパク質又はリポソ－ムが含まれる。組成物は、本質的に、エ－ロゾルとして投与され得る投与単位からなり得る。用語「エ－ロゾル」は、コロイド性のものから加圧されたパッケ－ジからなるシステムまでの範囲の種々のシステムを示すために使用される。送達は、液化ガス又は圧縮ガスによって、又は活性成分を分配する適切なポンプシステムによって行うことができる。エアロゾルは、活性成分を送達するために、単相、二相、又は三相系で送達され得る。エアロゾルの送達には、必要な容器、アクティベータ－、バルブ、サブコンデンサ－などが含まれ、これらは共にキットを形成することができる。当業者は、過度の実験なしに、好ましいエアロゾルを決定することができる。
本開示の組成物はまた、本明細書に記載されるように、ポリヌクレオチドのための担体分子（例えば、脂質ナノ粒子、ナノスケ－ル送達プラットフォ－ムなど）を包含することが理解されるであろう。
医薬組成物は、医薬分野で周知の方法論によって調製することができ、例えば、注射によって投与されることが意図された組成物は、本明細書に記載されているような抗体、その抗原結合断片、又は抗体結合体を含む組成物、及び場合により、１種以上の塩、緩衝剤及び／又は安定剤を、滅菌蒸留水と組み合わせて溶液を形成することによって調製することができる。均一な溶液又は懸濁液の形成を容易にするために、界面活性剤を添加してもよい。界面活性剤は、水性送達システムにおける抗体又はその抗原結合断片の溶解又は均一懸濁を容易にするように、ペプチド組成物と非共有結合的に相互作用する化合物である。
一般に、適切な用量及び治療レジメンは、治療的及び／又は予防的利益（例えば、改善された臨床転帰（例えば、下痢又は関連する脱水又は炎症の頻度、持続期間、又は重症度の低下、又はより長い無病及び／又は全生存、又は症状の重症度の低下）を提供するのに十分な量の組成物を提供する。予防的使用のためには、疾患又は障害に関連する疾患の発症を予防し、発症を遅らせ、又は重症度を軽減するのに十分な用量が必要である。本明細書に記載される方法に従って投与される組成物の予防的利益は、前臨床（インビトロ及びインビボ動物研究を含む）及び臨床研究を実施し、適切な統計学的、生物学的、及び臨床的方法及び技術によって得られたデータを分析することによって決定することができ、これらのすべては当業者によって容易に実施することができる。
組成物は有効量（例えば、ベータコロナウイルス感染を治療するため）で投与され、これは、使用される特定の化合物の活性；化合物の代謝安定性及び作用の長さ；対象の年齢、体重、一般健康、性別及び食事；投与の様式及び時間；排泄速度；薬物の組み合わせ；特定の障害又は状態の重症度；及び治療を受ける対象を含む種々の要因に依存して変化する。特定の実施形態では、本開示の製剤及び方法による治療の低用量投与は、プラセボ処置又は他の適切な対照対象と比較して、治療される疾患又は障害に関連する１つ又は複数の症状の約１０％～約９９％の減少を示すであろう。
一般に、抗体又は抗原結合断片の治療上有効な１日用量は、（７０ｋｇの哺乳動物では）約０．００１ｍｇ／ｋｇ（すなわち、０．０７ｍｇ）から約１００ｍｇ／ｋｇ（すなわち、７．０ｇ）であり、好ましくは、治療上有効な用量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ（すなわち、０．７ｍｇ）から約５０ｍｇ／ｋｇ（すなわち、３．５ｇ）であり、より好ましくは、治療上有効な用量は、（７０ｋｇの哺乳動物では）約１ｍｇ／ｋｇ（すなわち、７０ｍｇ）から約２５ｍｇ／ｋｇ（すなわち、１．７５ｇ）である。本開示のポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、及び関連組成物については、治療的に有効な用量は、抗体又は抗原結合断片とは異なることができる。
ある実施形態において、方法は、抗体、抗原結合断片、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、又は組成物を、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍以上で対象に投与することを含む。
ある実施形態において、方法は、抗体、抗原結合断片、又は組成物を対象に複数回投与することを含み、第２又は連続投与は、それぞれ、第１又は事前投与後に、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約２４、約４８、約７４、約９６時間又はそれ以上で実施される。
ある実施形態において、方法は、ベータコロナウイルスに感染される前に、抗体、抗原結合断片、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、又は組成物を少なくとも１回投与することを含む。
本開示の抗体、抗原結合断片、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、又は組成物を含む組成物もまた、１種以上の他の治療剤と同時に、１種以上の他の治療剤の投与前又は投与後に投与することができる。このような組み合わせ療法は、本発明の化合物及び１以上のさらなる活性剤を含有する単一の医薬投与製剤の投与、ならびに本開示の抗体又は抗原結合断片及び各活性剤をそれ自身の別々の投与製剤中に含有する組成物の投与を含み得る。例えば、本明細書に記載された抗体又はその抗原結合断片及び他の活性剤を、錠剤又はカプセルのような単一の経口投与組成物、又は別々の経口投与処方で投与される各剤中で一緒に患者に投与することができる。同様に、本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片及び他の活性剤は、生理食塩水又は他の生理学的に許容される溶液中のような単一の非経口投与組成物中で、又は別々の非経口投与処方で投与される各剤中で、一緒に対象に投与され得る。別々の投薬処方が使用される場合、抗体又は抗原結合断片を含む組成物及び１種以上の追加の活性剤は、本質的に同時に、すなわち、同時に、又は別々にずれた時間で、すなわち、連続的に、及び任意の順序で投与することができ；併用療法は、これらのレジメンをすべて含むことが理解される。
ある実施形態において、本開示の１以上の抗ベータコロナウイルス抗体（又は１以上の核酸、宿主細胞、ベクター、又は組成物）及び１以上の抗炎症剤及び／又は１以上の抗ウイルス剤を含む併用療法が提供される。特定の実施形態では、１種以上の抗炎症剤は、例えば、デキサメタゾン、プレドニゾンなどのコルチコステロイドを含む。ある実施形態において、１以上の抗炎症剤は、例えば、ＩＬ６（シルツキシマブなど）、又はＩＬ－６Ｒ（トシリズマブなど）、又はＩＬ－１β、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＦＧＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－γ、ＩＰ－１０、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１Ａ、ＭＩＰ－１Ｂ、ＰＤＧＲ、ＴＮＦ－α、又はＶＥＧＦに結合する抗体などのサイトカインアンタゴニストを含む。ある実施形態において、レロノリマブ、ルキソリチニブ及び／又はアナキンラのような抗炎症剤が使用される。ある実施形態において、１以上の抗ウイルス剤は、ヌクレオチド類似体又はヌセロチド類似体プロドラッグ、例えば、レムデシビル、ソホスブビル、アシクロビル、及びジドブジンを含む。特定の実施形態では、抗ウイルス剤はロピナビル、リトナビル、ファビピラビル、又はそれらの任意の組み合わせを含む。本開示の併用療法に使用するための他の抗炎症剤には、非ステロイド性抗炎症薬が含まれる。このような組み合わせ療法において、１以上の抗体（又は１以上の核酸、宿主細胞、ベクター、又は組成物）及び１以上の抗炎症剤及び／又は１以上の抗ウイルス剤を、任意の順序及び任意の順序で、又は一緒に投与することができることが理解されるであろう。
ある実施形態において、抗体（又は１以上の核酸、宿主細胞、ベクター、又は組成物）は、１以上の抗炎症剤及び／又は１以上の抗ウイルス剤を事前に受け取った対象に投与される。ある実施形態において、１以上の抗炎症剤及び／又は１以上の抗ウイルス剤を、以前に抗体（又は１以上の核酸、宿主細胞、ベクター、又は組成物）を受け取った対象に投与する。
ある実施形態において、本開示の２以上の抗ベータコロナウイルス抗体を含む併用療法が提供される。方法は、第１の抗体を、第２の抗体を受け取った対象に投与することを含むことができ、又は２つ以上の抗体を一緒に投与することを含むことができる。例えば、特定の実施形態では、（ａ）対象が第２の抗体又は抗原結合断片を受け取った場合に、第１の抗体又は抗原結合断片；（ｂ）対象が第１の抗体又は抗原結合断片を受け取った場合に、第２の抗体又は抗原結合断片；又は（ｃ）第１の抗体又は抗原結合断片；及び第２の抗体又は抗原結合断片を対象に投与することを含む方法が提供される。
関連する実施形態において、本開示の抗体、抗原結合断片、ベクター、宿主細胞、及び組成物の使用が提供される。
ある実施形態において、抗体、抗原結合断片、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、又は組成物は、対象におけるベータコロナウイルス感染を治療する方法における使用のために提供される。
ある実施形態において、抗体、抗原結合断片、又は組成物は、対象におけるベータコロナウイルス感染を治療するための医薬の製造又は調製の方法における使用のために提供される。
別段の指定がない限り、Ｓ２Ｐ６ Ｑ３２Ｙなどの任意の所与のバリアント抗体のＶＨ、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、Ｖ１、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、又はＣＤＲＬ３は、表１に別段の指示がない限り、Ｓ２Ｐ６などの標記抗体におけるものと同じである。
特定の実施形態によれば、本開示はまた、他の実施形態において番号で参照され得る、以下の番号付き実施形態を提供する。
１．ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、ならびにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、抗体又はその抗原結合断片であって、
（ｉ）ＣＤＲＨ１は、配列番号２７、３７、４８、６７、もしくは８０に従うアミノ酸配列、又は１、２もしくは３つのアミノ酸置換を含むそれらの機能性バリアントを含むか又はそれからなり、１以上の置換が任意に保存的置換であり、及び／又は生殖細胞系にコードされるアミノ酸への置換である；
（ｉｉ）ＣＤＲＨ２は、配列番号２８、３８、４９、６８、もしくは８１に従うアミノ酸配列、又は１、２もしくは３つのアミノ酸置換を含むそれらの機能性バリアントを含むか又はそれからなり、１以上の置換が任意に保存的置換であり、及び／又は生殖細胞系にコードされるアミノ酸への置換である；
（ｉｉｉ）ＣＤＲＨ３は、配列番号２９、３９、もしくは５０に従うアミノ酸配列、又は１、２もしくは３つのアミノ酸置換を含むそれらの機能性バリアントを含むか又はそれからなり、１以上の置換が任意に保存的置換であり、及び／又は生殖細胞系にコードされるアミノ酸への置換である；
（ｉｖ）ＣＤＲＬ１は、配列番号３１、４１、５２、７０、７６、７８、もしくは８３に従うアミノ酸配列、又は１、２もしくは３つのアミノ酸置換を含むそれらの機能性バリアントを含むか又はそれからなり、１以上の置換が任意に保存的置換であり、及び／又は生殖細胞系にコードされるアミノ酸への置換である；
（ｖ）ＣＤＲＬ２は、配列番号３２、４２、もしくは５３に従うアミノ酸配列、又はそれらの機能性バリアントであって、１つ以上のアミノ酸置換が任意で保存的置換であり、及び／又は生殖細胞系にコードされるアミノ酸への置換である、１つ、２つ、又は３つのアミノ酸置換を含むか、又はそれからなる；及び／又は；
（ｖｉ）ＣＤＲＬ３は、配列番号３３、４３、もしくは５４に従うアミノ酸配列、又は１、２もしくは３つのアミノ酸置換を含むそれらの機能性バリアントを含むか又はそれからなり、１以上の置換が任意に保存的置換であり、及び／又は生殖細胞系にコードされるアミノ酸への置換であり、
ここで、抗体又は抗原結合断片は、ベータコロナウイルスの表面糖タンパク質に結合することができる。
２．２以上のベータコロナウイルスの表面糖タンパク質に結合することができる１の抗体又は抗原結合断片。
３．２、３、４、又は５種のベータコロナウイルスの表面糖タンパク質に結合することができる２の抗体又は抗原結合断片。
４．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＯＣ４３、及びＨＫＵ１に結合することができる１～３のいずれか１つの抗体又は抗原結合断片。
５．宿主細胞の表面及び／又はビリオン上に発現されたベータコロナウイルス又はベータコロナウイルスの表面糖タンパク質に結合することができる、１～４のいずれか１つの抗体又は抗原結合断片。
６．感染のインビトロモデル及び／又は感染のインビボ動物モデル及び／又はヒトにおけるベータコロナウイルスによる感染を中和することができる、１～５のいずれか１つの記載の抗体又は抗原結合断片。
７．感染のインビトロモデル及び／又は感染のインビボ動物モデル及び／又はヒトにおいて、１、２、３、４、又は５つのベータコロナウイルスによって感染を中和することができる、１～５のいずれか１つの抗体又は抗原結合断片。
８．感染のインビトロモデル及び／又は感染のインビボ動物モデル及び／又はヒトにおけるいずれか１、２、３、４、又は５種類のベータコロナウイルスによる感染を中和することができる、１～７のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片。
９．以下に記載するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む、１～８のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片：
（ｉ）それぞれ配列番号２７、２８、２９、３１、３２、３３；
（ｉｉ）それぞれ配列番号２７、２８、２９、７０、３２、３３；
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号２７、２８、７４、３１、３２、３３；
（ｉｖ）それぞれ配列番号２７、２８、７４、７０、３２、３３；
（ｖ）それぞれ配列番号２７、２８、２９、７６、３２、３３；
（ｖｉ）それぞれ配列番号２７、２８、２９、７８、３２、３３；
（ｖｉｉ）それぞれ配列番号２７、２８、７４、７６、３２、３３；
（ｖｉｉｉ）それぞれ配列番号２７、２８、７４、７８、３２、３３；
（ｉｘ）それぞれ配列番号２７、６８、２９、３１、３２、３３；
（ｘ）それぞれ配列番号２７、６８、２９、７０、３２、３３；
（ｘｉ）それぞれ配列番号２７、６８、７４、３１、３２、３３；
（ｘｉｉ）それぞれ配列番号２７、６８、７４、７０、３２、３３；
（ｘｉｉｉ）それぞれ配列番号２７、６８、２９、７６、３２、３３；
（ｘｉｖ）それぞれ配列番号２７、６８、２９、７８、３２、３３；
（ｘｖ）それぞれ配列番号２７、６８、７４、７６、３２、３３；
（ｘｖｉ）それぞれ配列番号２７、６８、７４、７８、３２、３３；
（ｘｖｉｉ）それぞれ配列番号６７、２８、２９、３１、３２、３３；
（ｘｖｉｉｉ）それぞれ配列番号６７、２８、７４、３１、３２、３３；
（ｘｉｘ）それぞれ配列番号６７、２８、７４、７０、３２、３３；
（ｘｘ）それぞれ配列番号６７、２８、２９、７６、３２、３３；
（ｘｘｉ）それぞれ配列番号６７、２８、２９、７８、３２、３３；
（ｘｘｉｉ）それぞれ配列番号６７、２８、７４、７６、３２、３３；
（ｘｘｉｉｉ）それぞれ配列番号６７、２８、７４、７８、３２、３３；
（ｘｘｉｖ）それぞれ配列番号６７、６８、２９、３１、３２、３３；
（ｘｘｖ）それぞれ配列番号６７、６８、２９、７０、３２、３３；
（ｘｘｖｉ）それぞれ配列番号６７、６８、７４、３１、３２、３３；
（ｘｘｖｉｉ）それぞれ配列番号６７、６８、７４、７０、３２、３３；
（ｘｘｖｉｉｉ）それぞれ配列番号６７、６８、２９、７６、３２、３３；
（ｘｘｉｘ）それぞれ配列番号６７、６８、２９、７８、３２、３３；
（ｘｘｘ）それぞれ配列番号６７、６８、７４、７６、３２、３３；
（ｘｘｘｉ）それぞれ配列番号４８、４９、５０、５２、５３、５４；
（ｘｘｘｉｉ）それぞれ配列番号４８、４９、５０、８３、５３、５４；
（ｘｘｘｉｉｉ）それぞれ配列番号４８、８１、５０、５２、５３、５４；
（ｘｘｘｉｖ）それぞれ配列番号４８、８１、５０、８３、５３、５４；
（ｘｘｘｖ）それぞれ配列番号８０、４９、５０、５２、５３、５４；
（ｘｘｘｖｉ）それぞれ配列番号８０、４９、５０、８３、５３、５４；
（ｘｘｘｖｉｉ）それぞれ配列番号８０、８１、５０、５２、５３、５４；
（ｘｘｘｖｉｉｉｉ）それぞれ配列番号８０、８１、５０、８３、５３、５４；又は
（ｘｘｘｉｘ）それぞれ配列番号３７、３８、３９、４１、４２、４３。
１０．（ｉ）配列番号２７又は配列番号６７に記載のＣＤＲＨ１アミノ酸配列；（ｉｉｉ）配列番号２８又は配列番号６８に記載のＣＤＲＨ２アミノ酸配列；（ｉｉｉ）配列番号２９に記載のＣＤＲＨ３アミノ酸配列；（ｉｖ）配列番号３１、配列番号７０、配列番号７６、又は配列番号７８に記載のＣＤＲＬ１アミノ酸配列；（ｖ）配列番号３２に記載のＣＤＲＬ２アミノ酸配列；及び（ｖｉ）配列番号３３に記載のＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む、１～９のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片。
１１．（ｉ）それぞれ配列番号２７、２８、２９、７０、３２、及び３３；（ｉｉ）それぞれ配列番号２７、２８、２９、７６、３２、及び３３；（ｉｉｉ）それぞれ配列番号２７、２８、２９、７８、３２、及び３３；（ｉｖ）それぞれ配列番号２７、６８、２９、３１、３２、及び３３；（ｖ）それぞれ配列番号２７、６８、２９、７０、３２、及び３３；（ｖｉ）それぞれ配列番号２７、６８、２９、７６、３２、及び３３；（ｖｉｉ）それぞれ配列番号２７、６８、２９、７８、３２、及び３３；（ｖｉｉｉ）それぞれ配列番号６７、２８、２９、３０、３２、及び３３；（ｉｘ）それぞれ配列番号６７、２８、２９、７０、３２、及び３３；（ｘ）それぞれ配列番号６７、２８、２９、７６、３２、及び３３；（ｘｉ）それぞれ配列番号６７、２８、２９、７８、３２、及び３３；（ｘｉｉ）それぞれ配列番号６７、６８、２９、３１、３２、及び３３；（ｘｉｉｉ）それぞれ配列番号６７、６８、２９、７０、３２、及び３３；（ｘｉｖ）それぞれ配列番号６７、６８、２９、７６、３２、及び３３；または（ｖｉｉ）それぞれ配列番号６７、６８、２９、７８、３２、及び３３に記載されるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む、１～８又は９のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片。
１２．（ｉ）配列番号４８又は配列番号８０に記載のＣＤＲＨ１アミノ酸配列；（ｉｉ）配列番号４９又は配列番号８１に記載のＣＤＲＨ２アミノ酸配列；（ｉｉｉ）配列番号５０に記載のＣＤＲＨ３アミノ酸配列；（ｉｖ）配列番号５２又は配列番号８３に記載のＣＤＲＬ１アミノ酸配列；（ｖ）配列番号５３に記載のＣＤＲＬ２アミノ酸配列；及び（ｖｉ）配列番号５４に記載のＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む、１～１１に記載の抗体又は抗原結合断片。
１３．（ｉ）それぞれ配列番号４８、４９、５０、５２、５３、及び５４；（ｉｉ）それぞれ配列番号４８、４９、５０、８３、５３、及び５４；（ｉｉｉ）それぞれ配列番号４８、８１、５０、５２、５３、及び５４；又は（ｉｖ）それぞれ配列番号４８、８１、５０、８３、５３、５３、及び５４に記載されるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む、１２に抗体又は抗原結合断片。
１４．（ｉ）配列番号２６、６６、７１、７２、及び７３のいずれか１つに記載のＶＨアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３；ならびに（ｉｉ）配列番号３０に記載のＶＬアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、ＣＤＬＲ２又は１つ、２つもしくは３つのアミノ酸置換を含むそのバリアント（その置換の１つ以上は、場合により保存的置換であり、及び／又は生殖細胞系にコードされるアミノ酸への置換である）、およびＣＤＲＬ３を含む抗体又は抗原結合断片であって、ＣＤＲは、ＩＭＧＴにより、抗体又は抗原結合断片はベータコロナウイルスの表面糖タンパク質に結合することができ、場合により、ベータコロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＯＣ４３、及びＨＫＵ１のいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つを含む、抗体又は抗原結合断片。
１５．（ｉ）配列番号２６、６６、７１、７２、及び７３のいずれか１つに記載のＶＨアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３；ならびに（ｉｉ）配列番号３０に記載のＶＬアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、ＣＤＬＲ２又は１つ、２つもしくは３つのアミノ酸置換を含むそのバリアント（その置換の１つ以上は、場合により保存的置換であり、及び／又は生殖細胞系にコードされるアミノ酸への置換である）、およびＣＤＲＬ３を含む抗体又は抗原結合断片であって、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔにより、抗体又は抗原結合断片はベータコロナウイルスの表面糖タンパク質に結合することができ、場合により、ベータコロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＯＣ４３、及びＨＫＵ１のいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つを含む、抗体又は抗原結合断片。
１６．（ｉ）配列番号２６、６６、７１、７２、及び７３のいずれか１つに記載のＶＨアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３；ならびに（ｉｉ）配列番号６９に記載のＶＬアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、ＣＤＬＲ２又は１つ、２つもしくは３つのアミノ酸置換を含むそのバリアント（その置換の１つ以上は、場合により保存的置換であり、及び／又は生殖細胞系にコードされるアミノ酸への置換である）、およびＣＤＲＬ３を含む抗体又は抗原結合断片であって、ＣＤＲは、ＩＭＧＴにより、抗体又は抗原結合断片はベータコロナウイルスの表面糖タンパク質に結合することができ、場合により、ベータコロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＯＣ４３、及びＨＫＵ１のいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つを含む、抗体又は抗原結合断片。
１７．（ｉ）配列番号２６、６６、７１、７２、及び７３のいずれか１つに記載のＶＨアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３；ならびに（ｉｉ）配列番号６９に記載のＶＬアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、ＣＤＬＲ２又は１つ、２つもしくは３つのアミノ酸置換を含むそのバリアント（その置換の１つ以上は、場合により保存的置換であり、及び／又は生殖細胞系にコードされるアミノ酸への置換である）、およびＣＤＲＬ３を含む抗体又は抗原結合断片であって、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔにより、抗体又は抗原結合断片はベータコロナウイルスの表面糖タンパク質に結合することができ、場合により、ベータコロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＯＣ４３、及びＨＫＵ１のいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つを含む、抗体又は抗原結合断片。
１８．（ｉ）配列番号２６、６６、７１、７２、及び７３のいずれか１つに記載のＶＨアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３；ならびに（ｉｉ）配列番号７５に記載のＶＬアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、ＣＤＬＲ２又は１つ、２つもしくは３つのアミノ酸置換を含むそのバリアント（その置換の１つ以上は、場合により保存的置換であり、及び／又は生殖細胞系にコードされるアミノ酸への置換である）、およびＣＤＲＬ３を含む抗体又は抗原結合断片であって、ＣＤＲは、ＩＭＧＴにより、抗体又は抗原結合断片はベータコロナウイルスの表面糖タンパク質に結合することができ、場合により、ベータコロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＯＣ４３、及びＨＫＵ１のいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つを含む、抗体又は抗原結合断片。
１９．（ｉ）配列番号２６、６６、７１、７２、及び７３のいずれか１つに記載のＶＨアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３；ならびに（ｉｉ）配列番号７５に記載のＶＬアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、ＣＤＬＲ２又は１つ、２つもしくは３つのアミノ酸置換を含むそのバリアント（その置換の１つ以上は、場合により保存的置換であり、及び／又は生殖細胞系にコードされるアミノ酸への置換である）、およびＣＤＲＬ３を含む抗体又は抗原結合断片であって、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔにより、抗体又は抗原結合断片はベータコロナウイルスの表面糖タンパク質に結合することができ、場合により、ベータコロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＯＣ４３、及びＨＫＵ１のいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つを含む、抗体又は抗原結合断片。
２０．（ｉ）配列番号２６、６６、７１、７２、及び７３のいずれか１つに記載のＶＨアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３；ならびに
（ｉｉ）配列番号７５に記載のＶＬアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、ＣＤＬＲ２又は１つ、２つもしくは３つのアミノ酸置換を含むそのバリアント（その置換の１つ以上は、場合により保存的置換であり、及び／又は生殖細胞系にコードされるアミノ酸への置換である）、およびＣＤＲＬ３を含む抗体又は抗原結合断片であって、
ＣＤＲは、ＩＭＧＴにより、
抗体又は抗原結合断片はベータコロナウイルスの表面糖タンパク質に結合することができ、場合により、ベータコロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＯＣ４３、及びＨＫＵ１のいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つを含む、抗体又は抗原結合断片。
２１．（ｉ）配列番号２６、６６、７１、７２、及び７３のいずれか１つに記載のＶＨアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３；ならびに
（ｉｉ）配列番号７５に記載のＶＬアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、ＣＤＬＲ２又は１つ、２つもしくは３つのアミノ酸置換を含むそのバリアント（その置換の１つ以上は、場合により保存的置換であり、及び／又は生殖細胞系にコードされるアミノ酸への置換である）、およびＣＤＲＬ３を含む抗体又は抗原結合断片であって、
ＣＤＲは、Ｋａｂａｔにより、
抗体又は抗原結合断片はベータコロナウイルスの表面糖タンパク質に結合することができ、場合により、ベータコロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＯＣ４３、及びＨＫＵ１のいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つを含む、抗体又は抗原結合断片。
２２．（ｉ）配列番号２６、６６、７１、７２、及び７３のいずれか１つに記載のＶＨアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３；ならびに（ｉｉ）配列番号７７に記載のＶＬアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、ＣＤＬＲ２又は１つ、２つもしくは３つのアミノ酸置換を含むそのバリアント（その置換の１つ以上は、場合により保存的置換であり、及び／又は生殖細胞系にコードされるアミノ酸への置換である）、およびＣＤＲＬ３を含む抗体又は抗原結合断片であって、ＣＤＲは、ＩＭＧＴにより、抗体又は抗原結合断片はベータコロナウイルスの表面糖タンパク質に結合することができ、場合により、ベータコロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＯＣ４３、及びＨＫＵ１のいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つを含む、抗体又は抗原結合断片。
２２．（ｉ）配列番号２６、６６、７１、７２、及び７３のいずれか１つに記載のＶＨアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３；ならびに（ｉｉ）配列番号７７に記載のＶＬアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、ＣＤＬＲ２又は１つ、２つもしくは３つのアミノ酸置換を含むそのバリアント（その置換の１つ以上は、場合により保存的置換であり、及び／又は生殖細胞系にコードされるアミノ酸への置換である）、およびＣＤＲＬ３を含む抗体又は抗原結合断片であって、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔにより、抗体又は抗原結合断片はベータコロナウイルスの表面糖タンパク質に結合することができ、場合により、ベータコロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＯＣ４３、及びＨＫＵ１のいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つを含む、抗体又は抗原結合断片。
２４．（ｉ）配列番号３６に記載のＶＨアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３；ならびに（ｉｉ）配列番号４０に記載のＶＬアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、ＣＤＬＲ２又は１つ、２つもしくは３つのアミノ酸置換を含むそのバリアント（その置換の１つ以上は、場合により保存的置換であり、及び／又は生殖細胞系にコードされるアミノ酸への置換である）、およびＣＤＲＬ３を含む抗体又は抗原結合断片であって、ＣＤＲは、ＩＭＧＴにより、抗体又は抗原結合断片はベータコロナウイルスの表面糖タンパク質に結合することができ、場合により、ベータコロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＯＣ４３、及びＨＫＵ１のいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つを含む、抗体又は抗原結合断片。
２５．（ｉ）配列番号３６に記載のＶＨアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３；ならびに（ｉｉ）配列番号４０に記載のＶＬアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、ＣＤＬＲ２又は１つ、２つもしくは３つのアミノ酸置換を含むそのバリアント（その置換の１つ以上は、場合により保存的置換であり、及び／又は生殖細胞系にコードされるアミノ酸への置換である）、およびＣＤＲＬ３を含む抗体又は抗原結合断片であって、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔにより、抗体又は抗原結合断片はベータコロナウイルスの表面糖タンパク質に結合することができ、場合により、ベータコロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＯＣ４３、及びＨＫＵ１のいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つを含む、抗体又は抗原結合断片。
２６．（ｉ）配列番号４７又は７９に記載のＶＨアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３；ならびに（ｉｉ）配列番号５１に記載のＶＬアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、ＣＤＬＲ２又は１つ、２つもしくは３つのアミノ酸置換を含むそのバリアント（その置換の１つ以上は、場合により保存的置換であり、及び／又は生殖細胞系にコードされるアミノ酸への置換である）、およびＣＤＲＬ３を含む抗体又は抗原結合断片であって、ＣＤＲは、ＩＭＧＴにより、抗体又は抗原結合断片はベータコロナウイルスの表面糖タンパク質に結合することができ、場合により、ベータコロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＯＣ４３、及びＨＫＵ１のいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つを含む、抗体又は抗原結合断片。
２７．（ｉ）配列番号４７又は７９に記載のＶＨアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３；ならびに（ｉｉ）配列番号５１に記載のＶＬアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、ＣＤＬＲ２又は１つ、２つもしくは３つのアミノ酸置換を含むそのバリアント（その置換の１つ以上は、場合により保存的置換であり、及び／又は生殖細胞系にコードされるアミノ酸への置換である）、およびＣＤＲＬ３を含む抗体又は抗原結合断片であって、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔにより、抗体又は抗原結合断片はベータコロナウイルスの表面糖タンパク質に結合することができ、場合により、ベータコロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＯＣ４３、及びＨＫＵ１のいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つを含む、抗体又は抗原結合断片。
２８．（ｉ）配列番号４７又は７９に記載のＶＨアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３；ならびに（ｉｉ）配列番号８２に記載のＶＬアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、ＣＤＬＲ２又は１つ、２つもしくは３つのアミノ酸置換を含むそのバリアント（その置換の１つ以上は、場合により保存的置換であり、及び／又は生殖細胞系にコードされるアミノ酸への置換である）、およびＣＤＲＬ３を含む抗体又は抗原結合断片であって、ＣＤＲは、ＩＭＧＴにより、抗体又は抗原結合断片はベータコロナウイルスの表面糖タンパク質に結合することができ、場合により、ベータコロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＯＣ４３、及びＨＫＵ１のいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つを含む、抗体又は抗原結合断片。
２９．（ｉ）配列番号４７又は７９に記載のＶＨアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３；ならびに（ｉｉ）配列番号８２に記載のＶＬアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、ＣＤＬＲ２又は１つ、２つもしくは３つのアミノ酸置換を含むそのバリアント（その置換の１つ以上は、場合により保存的置換であり、及び／又は生殖細胞系にコードされるアミノ酸への置換である）、およびＣＤＲＬ３を含む抗体又は抗原結合断片であって、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔにより、抗体又は抗原結合断片はベータコロナウイルスの表面糖タンパク質に結合することができ、場合により、ベータコロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＯＣ４３、及びＨＫＵ１のいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つを含む、抗体又は抗原結合断片。
３０．（ｉ）ＶＨが、配列番号２６、３６、４７、６６、７１、７２、又は８１によるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、変異が、場合により、１つ以上のフレームワーク領域に限定され、及び／又は変異が、生殖細胞系にコードされるアミノ酸への１つ以上の置換を含み；及び／又は（ｉｉ）ＶＬが、配列番号３０、４０、５１、６９、７５、７７、又は８４によるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、変異が、場合により、１つ以上のフレームワーク領域に限定され、及び／又は変異が、生殖細胞系にコードされるアミノ酸への１つ以上の置換を含む、１～２９のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片。
３１．ＶＨ及びＶＬが、配列番号（ｉ）それぞれ２６及び３０；（ｉｉ）それぞれ２６及び６９；（ｉｉｉ）それぞれ２６及び７５；（ｉｖ）それぞれ２６及び７７；（ｖ）それぞれ６６及び６９；（ｖｉ）それぞれ６６及び３０；（ｖｉｉ）それぞれ６６及び７５；（ｖｉｉｉ）それぞれ６６及び７７；（ｉｘ）それぞれ７１及び３０；（ｘ）それぞれ７１及び６９；（ｘｉ）それぞれ７１及び７５；（ｘｉｉ）それぞれ７１及び７７；（ｘｉｉｉ）それぞれ７２及び３０；（ｘｉｖ）それぞれ７２及び６９；（ｘｖ）それぞれ７２及び７５；（ｘｖｉ）それぞれ７２及び７７；（ｘｖｉｉ）それぞれ７３及び３０；（ｘｖｉｉｉ）それぞれ７３及び６９；（ｘｉｘ）それぞれ７３及び７５；（ｘｘ）それぞれ７３及び７７；（ｘｘｉ）それぞれ３６及び４０；（ｘｘｉｉ）それぞれ４７及び５１；（ｘｘｉｉｉ）それぞれ４７及び８２；（ｘｘｉｖ）それぞれ７９及び８２；又は（ｘｘｖ）それぞれ７９及び５１によるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、請求項１～３０のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片。
３２．ＶＨ及びＶＬが、配列番号（ｉ）それぞれ２６及び３０；（ｉｉ）それぞれ２６及び６９；（ｉｉｉ）それぞれ２６及び７５；（ｉｖ）それぞれ２６及び７７；（ｖ）それぞれ６６及び６９；（ｖｉ）それぞれ６６及び３０；（ｖｉｉ）それぞれ６６及び７５；（ｖｉｉｉ）それぞれ６６及び７７；（ｉｘ）それぞれ７１及び３０；（ｘ）それぞれ７１及び６９；（ｘｉ）それぞれ７１及び７５；（ｘｉｉ）それぞれ７１及び７７；（ｘｉｉｉ）それぞれ７２及び３０；（ｘｉｖ）それぞれ７２及び６９；（ｘｖ）それぞれ７２及び７５；（ｘｖｉ）それぞれ７２及び７７；（ｘｖｉｉ）それぞれ７３及び３０；（ｘｖｉｉｉ）それぞれ７３及び６９；（ｘｉｘ）それぞれ７３及び７５；（ｘｘ）それぞれ７３及び７７；（ｘｘｉ）それぞれ３６及び４０；（ｘｘｉｉ）それぞれ４７及び５１；（ｘｘｉｉｉ）それぞれ４７及び８２；（ｘｘｉｖ）それぞれ７９及び８２；又は（ｘｘｖ）それぞれ７９及び５１に記載のアミノ酸配列の少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％を有するか、または上記アミノ酸配列を含むかもしくはそれからなる、１～３１のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片。
３３．重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体又はその抗原結合断片であって、ＶＨは配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、ＶＬは配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、抗体又は抗原結合断片は、場合により２以上のベータコロナウイルスのベータコロナウイルスの表面糖タンパク質に結合することができる、抗体又はその抗原結合断片。
３４．重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体又はその抗原結合断片であって、ＶＨは配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、ＶＬは配列番号７７に示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、抗体又は抗原結合断片は、場合により２以上のベータコロナウイルスのベータコロナウイルスの表面糖タンパク質に結合することができる、抗体又はその抗原結合断片。
３５．重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体又はその抗原結合断片であって、ＶＨは配列番号７２に示されるアミノ酸配列を含み、又はそれからなり、ＶＬは配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含み、又はそれからなり、抗体又は抗原結合断片は、場合により２以上のベータコロナウイルスのベータコロナウイルスの表面糖タンパク質に結合することができる、抗体又はその抗原結合断片。
３６．重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体又はその抗原結合断片であって、ＶＨは配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、ＶＬは配列番号７５に示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、抗体又は抗原結合断片は、場合により２以上のベータコロナウイルスのベータコロナウイルスの表面糖タンパク質に結合することができる、抗体又はその抗原結合断片。
３７．ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、ならびにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体又はその抗原結合断片であって、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２７～２９に記載のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号３１～３３に記載のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、抗体又は抗原結合断片は、ベータコロナウイルスの表面糖タンパク質に、場合により２種以上のベータコロナウイルスの表面糖タンパク質結合し得る、抗体又は抗原結合断片。
３８．ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、ならびにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体又はその抗原結合断片であって、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２７～２９に記載のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号７８、３２、及び３３に記載のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、抗体又は抗原結合断片は、ベータコロナウイルスの表面糖タンパク質に、場合により２種以上のベータコロナウイルスの表面糖タンパク質結合し得る、抗体又は抗原結合断片。
３９．ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、ならびにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体又はその抗原結合断片であって、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２７、６８、及び２９に記載のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号３１～３３に記載のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、抗体又は抗原結合断片は、ベータコロナウイルスの表面糖タンパク質に、場合により２種以上のベータコロナウイルスの表面糖タンパク質結合し得る、抗体又は抗原結合断片。
４０．ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、ならびにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体又はその抗原結合断片であって、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２７～２９に記載のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号７６、３２、および３３に記載のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、抗体又は抗原結合断片は、ベータコロナウイルスの表面糖タンパク質に、場合により２種以上のベータコロナウイルスの表面糖タンパク質結合し得る、抗体又は抗原結合断片。
４１．重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体又はその抗原結合断片であって、ＶＨが配列番号３６に示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、ＶＬが配列番号４０に示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、抗体又は抗原結合断片が、ベータコロナウイルスの表面糖タンパク質、場合により２種以上のベータコロナウイルス、及び／又はアルファコロナウイルスの表面糖タンパク質、場合によりＮＬ６３－ＣｏＶ及び／又は２２９Ｅ－ＣｏＶに結合することができる抗体又はその抗原結合断片。
４２．ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、ならびにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体又はその抗原結合断片であって、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号３７～３９に記載のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号４１～４３に記載のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、抗体又は抗原結合断片は、ベータコロナウイルスの表面糖タンパク質、場合により２種以上のベータコロナウイルス、及び／又はアルファコロナウイルス、場合によりＮＬ６３－ＣｏＶ及び／又は２２９Ｅ－ＣｏＶの表面糖タンパク質に結合することができる抗体又はその抗原結合断片。
４３．重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体又はその抗原結合断片であって、ＶＨは配列番号４７に示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、ＶＬは配列番号５１に示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、抗体又は抗原結合断片は、ベータコロナウイルスの表面糖タンパク質に、場合により２種以上のベータコロナウイルスの表面糖タンパク質結合し得る、抗体又は抗原結合断片。
４４．重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体又はその抗原結合断片であって、ＶＨは配列番号７９に示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、ＶＬは配列番号８２に示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、抗体又は抗原結合断片は、ベータコロナウイルスの表面糖タンパク質に、場合により２種以上のベータコロナウイルスの表面糖タンパク質結合し得る、抗体又は抗原結合断片。
４５．ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、ならびにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体又はその抗原結合断片であって、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号４８～５０に記載のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号５２～５４に記載のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、抗体又は抗原結合断片は、ベータコロナウイルスの表面糖タンパク質に、場合により２種以上のベータコロナウイルスの表面糖タンパク質結合し得る、抗体又は抗原結合断片。
４６．ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、ならびにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体又はその抗原結合断片であって、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号８０、８１、及び５０に記載のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号８３及び５３～５４に記載のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、抗体又は抗原結合断片は、ベータコロナウイルスの表面糖タンパク質に、場合により２種以上のベータコロナウイルスの表面糖タンパク質結合し得る、抗体又は抗原結合断片。
４７．ＶＨ及びＶＬが、配列番号（ｉ）それぞれ２６及び３０；（ｉｉ）それぞれ２６及び６９；（ｉｉｉ）それぞれ２６及び７５；（ｉｖ）それぞれ２６及び７７；（ｖ）それぞれ６６及び６９；（ｖｉ）それぞれ６６及び３０；（ｖｉｉ）それぞれ６６及び７５；（ｖｉｉｉ）それぞれ６６及び７７；（ｉｘ）それぞれ７１及び３０；（ｘ）それぞれ７１及び６９；（ｘｉ）それぞれ７１及び７５；（ｘｉｉ）それぞれ７１及び７７；（ｘｉｉｉ）それぞれ７２及び３０；（ｘｉｖ）それぞれ７２及び６９；（ｘｖ）それぞれ７２及び７５；（ｘｖｉ）それぞれ７２及び７７；（ｘｖｉｉ）それぞれ７３及び３０；（ｘｖｉｉｉ）それぞれ７３及び６９；（ｘｉｘ）それぞれ７３及び７５；（ｘｘ）それぞれ７３及び７７；（ｘｘｉ）それぞれ３６及び４０；（ｘｘｉｉ）それぞれ４７及び５１；（ｘｘｉｉｉ）それぞれ４７及び８２；（ｘｘｉｖ）それぞれ７９及び５１；または（ｘｘｖ）それぞれ４７及び８２に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％を有するか、又は上記アミノ酸配列を含むか又はそれからなる、請求項１～４６のいずれかに記載の抗体又は抗原結合断片。
４８．抗体又は抗原結合断片が、ＫＤとの予備融合立体配座でヒトベータコロナウイルス表面糖タンパク質に結合することができ、ＫＤが（ｉ）表面糖タンパク質がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来である１．０Ｅ－１２Ｍ未満；（ｉｉ）表面糖タンパク質がＳＡＲＳ－ＣｏＶ由来である１．０Ｅ－１２Ｍ未満；（ｉｉｉ）表面糖タンパク質がＯＣ４３由来であ約３．７２Ｅ－１０Ｍ；（ｉｖ）表面糖タンパク質がＨＫＵ－１由来である約２．４４Ｅ－０９Ｍ；及び／又は（ｖ）、表面糖タンパク質がＭＥＲＳ由来である約１．１４Ｅ－０９Ｍであり、ここで、任意選択的に、ＫＤが、バイオレイヤ－干渉法（ＢＬＩ）を用いて決定される、請求項１～４７のいずれかに記載の抗体又は抗原結合断片。
４９．（ｉ）～（ｉｉｉ）：（ｉ）ＦＫＥＥＬＤＫＹＦ［配列番号５７］；（ｉｉ）ＧＩＤＦＱＤＥＬＤＥＦＦＫ［配列番号５８］；および／または（ｉｉｉ）ＤＦＫＥＥＬＤＱＷＦＫ［配列番号５９］のいずれか１つを含む、ベータコロナウイルス表面糖タンパク質アミノ酸配列又はペプチドに結合することができる抗体又は抗原結合断片。
５０．（ｉ）～（ｖｉ）；（ｉ）ＫＲＳＦＩＥＤＬＬＦＮ［配列番号６０］；（ｉｉ）ＡＲＳＡＩＥＤＬＬＦＤ［配列番号６１］；（ｉｉｉ）ＳＲＳＡＩＥＤＬＬＦＤ［配列番号６２］；（ｉｖ）ＲＳＦＦＥＤＬＬＦ［配列番号６３］；（ｖ）ＲＳＡＬＥＤＬＬＦＳＫ［配列番号６４］；および／または（ｖｉ）ＧＲＳＡＩＥＤＩＬＦＳ［配列番号６５］ のいずれか１つを含む、ベータコロナウイルス表面糖タンパク質アミノ酸配列又はペプチドに結合することができる抗体又は抗原結合断片。
５１．ベータコロナウイルス表面糖タンパク質のステムヘリックス中のエピトープを認識する抗体又はその抗原結合断片であって、エピトープが２、３、４、５又はそれ以上のベータコロナウイルス中に保存されている、抗体又はその抗原結合断片。
５２．２、３、４、５、又はそれ以上のベータコロナウイルスが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＯＣ４３、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＨＫＵ１、又はそれらの任意の組合せを含む、５１に記載の抗体又は抗原結合断片。
５３．ＶＨにおいて、Ｖ１－４６＊０１によってコードされるアミノ酸配列及び／又はＤ５－１２＊０１によってコードされるアミノ酸配列を含む、１～５２のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片。
５４．以下：（ｉ）ＶＨにおいて、Ｊ４＊０３又はＪ＊６０２によりコードされるアミノ酸配列；（ｉｉ）ＶＬにおいて、ＫＶ３－２０＊０１によりコードされるアミノ酸配列、及び／又はＫ３＊０１によりコードされるアミノ酸配列；（ｉｉｉ）ＶＬにおいて、ＬＶ１－５１＊０２によりコードされるアミノ酸配列、及び／又はＪ１＊０１によりコードされるアミノ酸配列のいずれか１つ以上をさらに含む、５３に記載の抗体又は抗原結合断片。
５５．クレード１ａのサルベコウイルス、クレード１ｂのサルベコウイルス、クレード２のサルベコウイルス、及びクレード３のサルベコウイルスの表面糖タンパク質に結合することができる、１～５４のいずれか１つに帰記載の抗体又は抗原結合断片。
５６．アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２ＦＸ３Ｘ４ＥＬＤＸ５ＹＦ（配列番号８４）を含むペプチドに結合することができる、１～５５のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片。
５７．アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２ＦＸ３Ｘ４ＥＬＤＸ５ＹＦ（配列番号８４）を含むペプチドに結合することができる抗体又は抗原結合断片。
５８．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合することができ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２がＤ６１４Ｇ突然変異を含むか、又はＡ２３．１、Ｂ．１．４２９、Ｂ．１．２５８、Ｂ．１．１．３１８、Ｒ．２、Ｂ．１．５２８、Ｂ．１．５２６、及びＢ．１．６１７から選択される、１～５７のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片。
５９．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｂ．１．１．７、Ｂ．１．３５１、Ｂ．１．１．２８、Ｂ．１．１．２０７及び／又はＰ．１によって感染を中和することができる、１～５８のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片。
６０．（ｉ）２、３、４、又は５種ベータコロナウイルスのスパイクタンパク質中のエピトープを認識し；（ｉｉ）２、３、４、又は５種のベータコロナウイルスのスパイクタンパク質とそれぞれの細胞表面受容体との相互作用をブロックすることができ；（ｉｉｉ）２、３、４、又は５種のベータコロナウイルスのスパイクタンパク質中に保存されているエピトープを認識し；（ｉｖ）２、３、４、又は５種のベータコロナウイルスに対して交差反応性であり；（ｖ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＯＣ４３、及びＨＫＵ１のいずれかの３つに対して交差反応性であり；（ｖｉｉ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＯＣ４３、及びＨＫＵ１のうちのいずれか４つに対して交差反応性であり；（ｖｉｉ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＯＣ４３、及びＨＫＵ１のうちのいずれか４つに対して交差反応性であり；（ｖｉｉｉ）インビトロ感染モデル及び／又はインビボ動物感染モデル及び／又はヒトにおいて、１、２、３、４、５又はそれ以上の異なるヒトベータコロナウイルスによる感染を中和することができ；（ｉｘ）抗体又は抗原結合断片がベータコロナウイルス及び／又はアルファコロナウイルス表面糖タンパク質に結合している場合、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ（随意にＶ１３１）、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ（随意にＶ１５８）又はその両方を活性化することができ；（ｘ）ベータコロナウイルスの表面糖タンパク質に結合した場合、表面糖タンパク質とヒトＡＣＥ２の結合を阻害しない；（ｘｉ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質に感染又はトランスフェクトされた第１の細胞と第２の細胞との間の細胞－細胞融合を阻害することができ；（ｘｉｉ）ベータコロナウイルスに感染した標的細胞に対して、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣ、又はそれらの任意の組合せを媒介することができ；（ｘｉｉｉ）哺乳動物におけるベータコロナウイルス感染を予防し、又はその重症度の進行を防止することができ；又は（ｘｉｖ）（ｉ）～（ｘｉｉ）の任意の組合せである、１～５９のいずれか１つの抗体又は抗原結合断片。
６１．（ｉ）抗体又は抗原結合断片のＦａｂは、表面プラズモン共鳴を用いて測定すると、約７．３ｎＭのＫｄを有する固定化前融合ＳＡＲＳ－ＣｏＶタンパク質三量体、約１６ｎＭのＫｄを有する固定化前融合ＯＣ４３ Ｓタンパク質三量体、約１２ｎＭのＫｄを有する固定化前融合ＭＥＲＳタンパク質三量体、及び／又は約１２０ｎＭのＫｄを有する固定化前融合ＨＫＵ１タンパク質三量体に結合することができ；及び／又は（ｉｉ）抗体又は抗原結合断片のＦａｂは、表面プラズモン共鳴を用いて測定すると、約６．８ｎＭのＫｄを有し、ｐＨ７．４でおよび／または約４４ｎＭのＫｄを有し、ｐＨ５．４で固定化前融合ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質エクトドメイン三量体に結合することができ；及び／又は（ｉｉｉ）抗体は、表面プラズモン共鳴を用いて測定すると、約０．４ｎＭのＫｄを有し、ｐＨ７．４でおよび／または約２．３ｎＭのＫｄを有し、ｐＨ５．４で固定化前融合ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質エクトドメイン三量体に結合することができる、１～６０のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片。
６２．アミノ酸配列ＤＳＦＫＥＥＬＤＫＹＦＫＮＨ（配列番号９５）を含むか又はそれからなるペプチドに結合することができる、１～６１のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片。
６３．アミノ酸配列ＤＳＦＫＥＥＬＤＫＹＦＫＮＨ（配列番号９５）を含むか又はそれからなるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２表面糖タンパク質のエピトープに結合することができる、１～６２のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片。
６４．配列番号９５が、アミノ酸配列ＱＰＥＬＤＳＦＫＥＥＬＤＫＹＦＫＮＨＴＳＰ（配列番号９６）内に含まれる、１～６３のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片。
６５．ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、又はＩｇＤアイソタイプである、６４のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片。
６６．ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４から選択されるＩｇＧアイソタイプである、１～６５のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片。
６７．ヒト、ヒト化、又はキメラである、１～６６のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片。
６８．抗体又は抗原結合断片が、ヒト抗体、モノクローナル抗体、精製抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、又はｓｃＦａｂを含む、１～６７のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片。
６９．ｓｃＦｖが１を超えるＶＨドメイン及び１を超えるＶＬドメインを含む、６８に記載の抗体又は抗原結合断片。
７０．抗体又は抗原結合断片が多特異的抗体又は抗原結合断片である、１～６９のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片。
７１．抗体又は抗原結合断片が二重特異的抗体又は抗原結合断片である、７０に記載の抗体又は抗原結合断片。
７２．（ｉ）第１のＶＨ及び第１のＶＬ；ならびに（ｉｉ）第２のＶＨ及び第２のＶＬを含み、第１のＶＨ及び第２のＶＨは異なるが、各々独立して、配列番号２６、３６、４７、６６、７１、７２又は７９に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；第１のＶＬ及び第２のＶＬは異なるが、各々独立して、配列番号３０、４０、５１、６９、７５、７７、又は８２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；第１のＶＨ及び第１のＶＬは共に第１の抗原結合部位を形成し、第２のＶＨ及び第２のＶＬは共に第２の抗原結合部位を形成する、７０又は７１に記載の抗体又は抗原結合断片。
７３．抗体又は抗原結合断片がＦｃポリペプチド又はその断片をさらに含む、１～７２のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片。
７４．Ｆｃポリペプチド又はその断片が、（ｉ）突然変異を含まない参照Ｆｃポリペプチドと比較してＦｃＲｎへの結合を増強する突然変異；及び／又は（ｉｉ）突然変異を含まない参照Ｆｃポリペプチドと比較してＦｃγＲへの結合を増強する突然変異を含む、７３に記載の抗体又は抗原結合断片。
７５．ＦｃＲｎへの結合を増強する突然変異が、Ｍ４２８Ｌ；Ｎ４３４Ｓ；Ｎ４３４Ｈ；Ｎ４３４Ａ；Ｎ４３４Ｓ；Ｍ２５２Ｙ；Ｓ２５４Ｔ；Ｔ２５６Ｅ；Ｔ２５０Ｑ；Ｐ２５７Ｉ；Ｑ３１１Ｉ；Ｄ３７６Ｖ；Ｔ３０７Ａ；Ｅ３８０Ａ；又はそれらの任意の組合せを含む、７４に記載の抗体又は抗原結合断片。
７６．ＦｃＲｎへの結合を増強する突然変異が、（ｉ）Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ；（ｉｉ）Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ；（ｉｉｉ）Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ；（ｉｖ）Ｐ２５７Ｉ／Ｑ３１１Ｉ；（ｖ）Ｐ２５７Ｉ／Ｎ４３４Ｈ；（ｖｉ）Ｄ３７６Ｖ／Ｎ４３４Ｈ；（ｖｉｉ）Ｔ３０７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａ；または（ｖｉｉｉ）（ｉ）～（ｖｉｉ）のいずれかの組み合わせを含む、７４に記載の抗体又は抗原結合断片。
７７．ＦｃＲｎへの結合を増強する突然変異がＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含む、７４に記載の抗体又は抗原結合断片。
７８．ＦｃγＲへの結合を増強する突然変異が、Ｓ２３９Ｄ；Ｉ３３２Ｅ；Ａ３３０Ｌ；Ｇ２３６Ａ；又はそれらの任意の組み合わせを含む、７４に記載の抗体又は抗原結合断片。
７９． ＦｃγＲへの結合を増強する突然変異が、（ｉ）Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３２Ｅ；（ｉｉ）Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３２Ｅ；（ｉｉｉ）Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３２Ｅ；又は（ｉｖ）Ｇ２３６Ａ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３２Ｅを含む、７４に記載の抗体又は抗原結合断片。
８０．グリコシル化を変化させる突然変異を含み、グリコシル化を変化させる突然変異がＮ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、又はＮ２９７Ｇを含み、及び／又はアグリコシル化及び／又はアフコシル化される、１～７９のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片。
８１．ＦｃポリペプチドがＬ２３４Ａ突然変異及びＬ２３５Ａ突然変異を含む、１～８０のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片。
８２．抗体又は抗原結合断片が、生物層干渉測定法を用いて測定した場合、２、３、４、又は５つのベータコロナウイルスＳタンパク質に結合する、１～８１のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片。
８３．抗体又は抗原結合断片が、ベータコロナウイルス感染を中和すること、及び／又は標的細胞の感染を約１～約１０μｇ／ｍｌのＩＣ５０で中和することができる、１～８２に記載の抗体又は抗原結合断片。
８４．抗体又は抗原結合断片が、ベータコロナウイルスに感染した標的細胞に対して抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び／又は抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）を誘導することができる、１～８３のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片。
８５．１～８４のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片とベータコロナウイルス表面糖タンパク質との結合について競合する抗体又はその抗原結合断片。
８６．抗体が、等価な位置にある対応するＵＣＡからのアミノ酸で置換された野生型配列の少なくとも１つのアミノ酸を含む、１～８５のいずれか１つに記載の抗体。
８７．１～８６のいずれか１つに記載の抗体もしくは抗原結合断片をコードするか、または抗体又は抗体断片のＶＨ、重鎖、ＶＬ、及び／もしくは軽鎖をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
８８．ポリヌクレオチドがデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）を含み、ＲＮＡが場合によりメッセンジャ－ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む、８７に記載のポリヌクレオチド。
８９．修飾ヌクレオシド、キャップ－１構造、キャップ－２構造、又はそれらの任意の組合せを含む、８７又は８８に記載のポリヌクレオチド。
９０．ポリヌクレオチドが、プソイドウリジン、Ｎ６－メチルアデノンシン、５－メチルシチジン、２－チオウリジン、又はそれらの任意の組合せを含む、８９に記載のポリヌクレオチド。
９１．プソイドウリジンがＮ１－メチルプソイドウリジンを含む、９０に記載のポリヌクレオチド。
９２．宿主細胞における発現のためにコドンが最適化されている、８７～９１のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
９３．配列番号３４、３５、４４、又は４５によるポリヌクレオチド配列と少なくとも５０％の同一性を有するポリヌクレオチドを含む、８７～９２のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
９４．ＶＨ及び／又はＶＬにおいて、同等の位置にある対応するＵＣＡからのアミノ酸で置換された野生型配列の少なくとも１つのアミノ酸を含む抗体をコードするポリヌクレオチドを含む、８７～９３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
９５．８７～９４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
９６．ポリヌクレオチドが宿主細胞に対して異種性である、８７～９４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド及び／又は９５に記載のベクターを含む宿主細胞。
９７．ポリヌクレオチドがヒトＢ細胞に対して異種性であり、及び／又はヒトＢ細胞が不死化されている、８７～９４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを含むヒトＢ細胞。
９８．（ｉ）１～８６のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片；（ｉｉ）８７～９４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド；（ｉｉｉ）９５に記載の組換えベクター；（ｉｖ）９６に記載の宿主細胞；及び／又は（ｖ）９７に記載のヒトＢ細胞、及び薬学的に許容される賦形剤、担体、又は希釈剤を含む組成物。
９９．１～８６のいずれか１つに記載の２つ以上の抗体又は抗原結合断片を含む、９８に記載の組成物。
１００．第１の抗体又は抗原結合断片及び第２の抗体又は抗原結合断片を含む組成物であって、（ｉ）第１の抗体又は抗原結合断片は、１～８６のいずれか１つのものであり；（ｉｉ）第２の抗体又は抗原結合断片は、（ｉｉ）（ａ）ＣＤＲＨ１アミノ酸配列GYPFTSYG（配列番号８６）、ＣＤＲＨ２アミノ酸配列ISTYQGNT（配列番号９４）又はISTYNGNT（配列番号８７）、ＣＤＲＨ３アミノ酸配列ARDYTRGAWFGESLIGGFDN（配列番号８８）、ＣＤＲＬ１アミノ酸配列ＱＴＶＳＳＴＳ（配列番号９０）、ＣＤＲＬ２アミノ酸配列ＧＡＳ（配列番号９１）、及びＣＤＲＬ３アミノ酸配列ＱＱＨＤＴＳＬＴ（配列番号９２）を含み、場合により（ｉｉ）（ａ）（１）ＶＨアミノ酸配列：ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＰＦＴＳＹＧＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＳＴＹＱＧＮＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＴＤＴＳＴＴＴＧＹＭＥＬＲＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＹＴＲＧＡＷＦＧＥＳＬＩＧＧＦＤＮＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号９３）、又はＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＰＦＴＳＹＧＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＳＴＹＮＧＮＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＴＤＴＳＴＴＴＧＹＭＥＬＲＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＹＴＲＧＡＷＦＧＥＳＬＩＧＧＦＤＮＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号８５）、および（ｉｉ）（ａ）（２）ＶＬアミノ酸配列：ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＴＶＳＳＴＳＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＨＤＴＳＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号８９）を含む組成物。
１０１．第１の抗体又は抗原結合断片及び／又は前記第２の抗体又は抗原結合断片が、（ｉ）Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓ突然変異；（ｉｉ）Ｇ２３６Ａ、Ａ３３０Ｌ及びＩ３２Ｅ突然変異；又は（ｉｉｉ）Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、Ｇ２３６Ａ、Ａ３３０Ｌ及びＩ３２Ｅ突然変異を含むＦｃポリペプチドを含む、１００に記載の組成物。
１０２．（ｉ）１～８６のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片；及び（ｉｉ）ステムヘリックスの外側にあり、場合により受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）に含まれるベータコロナウイルス表面糖タンパク質エピトープに結合することができる抗体又は抗原結合断片を含む組合せ。
１０３．（ｉｉ）の抗体又は抗原結合断片が、そのエピトープに結合した場合、ベータコロナウイルス表面糖タンパク質と、ＡＣＥ２、ＤＣ－ＳＩＧＮ、Ｌ－ＳＩＧＮ、ＳＩＧＬＥＣ－１、ジペプチジルペプチダ－ゼ－４（ＤＰＰ４）、及び９－Ｏ－アセチル化シアル酸（９－Ｏ－Ａｃ－Ｓｉａ）受容体から選択される細胞表面受容体との間の相互作用を阻害する、１０２に記載の組み合わせ。
１０４．担体分子に封入された８７～９４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを含む組成物であって、担体分子は、脂質、脂質由来送達ベヒクル、例えば、リポソ－ム、固体脂質ナノ粒子、油性懸濁液、サブミクロン脂質エマルジョン、脂質マイクロバブル、逆脂質ミセル、か牛リポソ－ム、脂質微小管、脂質マイクロシリンダ－、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、又はナノスケールプラットフォームを任意に含む、組成物。
対象におけるベータコロナウイルス感染を治療する方法であって、有効量の（ｉ）１～８６のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片；（ｉｉ）８７～９４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド；（ｉｉｉ）９５に記載の組換えベクター；（ｉｖ）９６に記載の宿主細胞；（ｖ）９７に記載のヒトＢ細胞；（ｖｉ）９８～１０１又は１０４のいずれか１つに記載の組成物；及び／又は（ｖｉｉ）１０２又は１０３に記載の組合せを対象に投与することを含む方法。
１０６．有効量の組み合わせを投与する工程が、（ｉ）の抗体又は抗原結合断片の有効量を投与する工程、及び任意に同時に又は連続して（ｉｉ）のポリヌクレオチドの有効量を投与する工程を含む、１０２又は１０３に記載の組み合わせの有効量を投与する工程を含む、１０５に記載の方法。
１０７．有効量の組合せを投与する工程が、（ｉ）の抗体又は抗原結合断片の有効量を投与する工程、及び（ｉｉ）のポリヌクレオチドの有効量を投与する工程を含む、１０２又は１０３に記載の組合せの有効量を投与する工程を含む、１０５に記載の方法。
１０８．有効量の組み合わせを投与する工程が、（ｉｉ）のポリヌクレオチドの有効量を投与する工程、及び（ｉ）の抗体又は抗原結合断片の有効量を投与する工程を含む、１０２又は１０３の組み合わせの有効量を投与する工程を含む、１０５に記載の方法。
１０９．対象におけるベータコロナウイルス感染を処置する方法における使用のための、１～８６のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片、８７～９４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、９５に記載の組換えベクター、９６に記載の宿主細胞、９７に記載のヒトＢ細胞、９８～１０１又は１０４のいずれか１つに記載の組成物、及び／又は１０２又は１０３に記載の組み合わせ。
１１０．対象におけるベータコロナウイルス感染の治療のための薬剤の調製における使用のための１～８６のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片、８７～９４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、９５に記載の組換えベクター、９６に記載の宿主細胞、９７に記載のヒトＢ細胞、９８～１０１又は１０４のいずれか１つに記載の組成物、及び／又は、１０２又は１０３に記載の組み合わせ。
１１１．ベータコロナウイルスが、（ｉ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ；（ｉｉ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２；（ｉｉｉ）ＭＥＲＳ－ＣｏＶ；（ｉｖ）ＯＣ４３；（ｖ）ＨＫＵ１；又は（ｖｉ）（ｉ）～（ｉｉｉｉ）のいずれかの組み合わせを含む、１０９又は１１０の使用のための抗体、抗原結合断片、ポリヌクレオチド、組換えベクター、宿主細胞、ヒトＢ細胞、組成物、及び／又は組み合わせ。
１１２．ベータコロナウイルスを治療する方法が、有効量の抗体又は抗原結合断片を投与することを含み、任意選択的には同時に又は配列で、有効量のポリヌクレオチドを投与することを含む、１０９又は１１０に記載の使用のための抗体、抗原結合断片、ポリヌクレオチド、組換えベクター、宿主細胞、ヒトＢ細胞、組成物、及び／又は組合せ。
１１３．有効量の組み合わせを投与することは、有効量の抗体又は抗原結合断片を投与し、次に有効量のポリヌクレオチドを投与することを含む、１１２に記載の抗体、抗原結合断片、ポリヌクレオチド、組換えベクター、宿主細胞、ヒトＢ細胞、組成物、及び／又は組み合わせ。
１１４．有効量の組み合わせを投与することが、有効量のポリヌクレオチドを投与することと、その後、有効量の抗体又は抗原結合断片を投与することとを含む、１１２の使用するための記載の抗体、抗原結合断片、ポリヌクレオチド、組換えベクター、宿主細胞、ヒトＢ細胞、組成物、及び／又は組み合わせ。
１１５．使用が、対象におけるベータコロナウイルス感染を治療する方法における、抗体又は抗原結合断片の第１の使用及びポリヌクレオチドの第２の使用を同時に又は連続して含む、１０９又は１１０の使用するための抗体、抗原結合断片、ポリヌクレオチド、組換えベクター、宿主細胞、ヒトＢ細胞、組成物、及び／又は組み合わせ。
１１６．使用が、対象におけるベータコロナウイルス感染を治療する方法における、抗体又は抗原結合断片の第１の使用及びポリヌクレオチドの第２の使用を含む、１１５の使用するための抗体、抗原結合断片、ポリヌクレオチド、組換えベクター、宿主細胞、ヒトＢ細胞、組成物、及び／又は組み合わせ。
１１７．使用が、対象におけるベータコロナウイルス感染を処置する方法における、ポリヌクレオチドの第１の使用及び配列における抗体又は抗原結合断片の第２の使用を含む、１１５に記載の抗体、抗原結合断片、ポリヌクレオチド、組換えベクター、宿主細胞、ヒトＢ細胞、組成物、及び／又は組み合わせ。
１１８．ベータコロナウイルス感染のインビトロ診断方法であって、（ｉ）対象由来の試料を１～８６のいずれか１つの抗体又は抗原結合断片と接触させる工程；及び（ｉｉ）抗原及び抗体を含む複合体、又は抗原及び抗原結合断片を含む複合体を検出する工程を含む方法。
１１９．試料が、対象から単離された血液を含む、１１８に記載の方法。
１２０．ベータコロナウイルスが、（ｉ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ；（ｉｉ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２；（ｉｉｉ）ＭＥＲＳ－ＣｏＶ；（ｉｖ）ＯＣ４３；（ｖ）ＨＫＵ１；又は（ｖｉ）（ｉ）～（ｉｉｉｉ）の任意の組合せを含む、１１８又は１１９に記載の方法。
実施例１：複数のベータコロナウイルスに対する抗体の検査
ヒトモノクローナル抗体４２０ １ ２（図１Ａ）及び抗体４２０ １ １（図１Ｂ）の異なるヒトベータコロナウイルスのスパイクタンパク質への結合を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により測定した。抗体４２０ １ ２は、本明細書ではＳ２Ｓ８とも呼ばれ、配列番号３６で提供される配列を含むＶＨ及び配列番号４０で提供される配列を含むＶＬを含む。抗体４２０ １ １は、本明細書ではＳ２Ｐ６とも呼ばれ、配列番号２６で提供される配列を含むＶＨ及び配列番号３０で提供される配列を含むＶＬを含む。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ（Ｕｒｂａｎｉ株、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＰ１３４４１；ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／３００２７６２０）、配列番号２２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＢｅｔａＣｏＶ／Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１／２０１９、ＧｅｎＢａｎｋ：ＭＮ９０８９４７）、配列番号３、ＭＥＲＳ（Ｌｏｎｄｏｎ１／２０１２；ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＣ１６４５０５）、配列番号２４、ＯＣ４３（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＴ８４３６２．１）、配列番号２３及びＨＫＵ１（ＧｅｎＢａｎｋ ＹＰ １７３２３８．１）からの融合前安定化スパイクタンパク質を、１μｇ／ｍｌで被覆し、ＰＢＳのみを陰性対照として使用した。最大有効濃度の半分（ＥＣ５０）を測定し、ｎｇ／ｍｌと報告した。α－コロナウイルスに対するこれらの抗体の結合もＥＬＩＳＡによって測定されたが、結合は観察されなかった（データは示されていない）。さらなるＥＬＩＳＡ研究は、抗体Ｓ２Ｓ８がアルファコロナウイルスＮＬ６３－ＣｏＶ及び２２９Ｅ－ＣｏＶのスパイクタンパク質に結合することを示した。
モノクローナル抗体Ｓ２Ｓ４０、Ｓ２Ｓ４１、Ｓ２Ｓ４２、Ｓ２Ｓ４３、及びＳ２Ｘ５２９を、上記のように、異なるヒトβ－コロナウイルスのスパイクタンパク質及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質サブユニットＳ２への結合について試験した。結果を表２に示す。
モノクローナル抗体４２０ １ ２（Ｓ２Ｓ８としても知られる）及び抗体４２０ １ １（Ｓ２Ｐ６としても知られる）（両方ともＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ Ｆｃ突然変異を有する組換えＩｇＧ１として発現される抗体；「ＭＬＮＳ」）による、哺乳動物細胞の表面に発現される異なるヒトβ－コロナウイルスのスパイクタンパク質への結合を、フローサイトメトリーにより測定した。簡単に述べると、Ｅｘｐｉ－ＣＨＯ細胞を、ヒトβ－コロナウイルス由来の完全長スパイクタンパク質をコードするｐｈＣＭＶ１発現プラスミドで一過性にトランスフェクトした。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＢｅｔａＣｏＶ／Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１／２０１９；図２Ａ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ（Ｕｒｂａｎｉ株、ＡＡＰ１３４４１；図２Ｂ）、ＯＣ４３（図２Ｃ）、及びＭＥＲＳ－ＣｏＶ（Ｌｏｎｄｏｎ１／２０１２；図２Ｄ）からのスパイクタンパク質への結合を測定した。
さらに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＢｅｔａＣｏＶ／Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１／２０１９）Ｓタンパク質由来のＳ１、Ｓ２、及び受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）への抗体４２０ １ １（Ｓ２Ｐ６としても知られる）（図３Ａ）及び抗体４２０ １ ２（Ｓ２Ｓ８としても知られる）（図３Ｂ）による結合をＥＬＩＳＡにより測定した。 タンパク質を１μｇ／ｍｌでコ－ティングした。これらのデータは、抗体４２０ １ １及び４２０ １ ２がＳ２において結合することを示す。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染に対する抗体４２０ １ １の中和活性を、ルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて評価した。ＶｅｒｏＥ６細胞を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ルシフェラーゼレポーターウイルスに０．０１の多重感染（ＭＯＩ）で２４時間感染させた。図４には、計算されたＩＣ５０値（ｎｇ／ｍｌ）と共に、抗体濃度を増加させたときの中和率を示す曲線を示す。比較抗体「Ｓ３０９」（Ｐｉｎｔｏら、ヒトモノクローナルＳＡＲＳ－ＣｏＶ抗体によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の交差中和、Ｎａｔｕｒｅ ５８３：２９０－２９５（２０２０年７月）を参照）による中和も試験した。
抗体４２０ １ １及び抗体４２０ １ ２によるシュードタイプウイルスの中和をルシフェラーゼレポーターアッセイにより評価した。Ｈｕｈ７細胞におけるＭＥＲＳ－ＣｏＶの抗体４２０ １ １中和（図５Ａ）及びＶｅｒｏ Ｅ６細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の抗体４２０ １ １中和（図５Ｂ）を検討した。Ｈｕｈ７細胞におけるＭＥＲＳ－ＣｏＶ感染の抗体４２０ １ ２による中和（図６Ａ）及びＶｅｒｏ Ｅ６細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の中和（図６Ｂ）も評価した。抗体濃度の上昇（ｎｇ／ｍｌ）時の中和率を示す曲線を示し、ＩＣ５０値をμｇ／ｍｌで報告する。比較抗体ＬＣＡ６０（抗ＭＥＲＳ；Ｃｏｒｔｉら、ＰＮＡＳ １２２（３３）：１０４７３－１０４７８（２０１５））及びＳ３０９による中和も測定した。
さらなるヒト抗体Ｓ２Ｓ４３を単離した。Ｓ２Ｓ４３は、配列番号４７（それぞれ、配列番号４８～５０のＣＤＲＨ１～Ｈ３）に示されるＶＨアミノ酸配列、及び配列番号５１（それぞれ、配列番号５２～５４のＣＤＲＬ１～Ｌ３）に示されるＶＬアミノ酸配列を含む。
Ｓ２Ｐ６及びＳ２Ｓ４３のＶ領域の生殖細胞系列配列を評価した。Ｓ２Ｐ６及びＳ２Ｓ４３の各々について、変異していない共通祖先（ＵＣＡ）Ｖ領域配列を含む抗体を作製した。１つ以上のＣＤＲ（ＩＭＧＴ）アミノ酸残基が生殖細胞系アミノ酸に復帰するＳ２Ｐ６抗体も作製した。図７６及び７８を参照のこと。
図３４－７５及び７７に示すデータを用いて、さらなる研究を実施した。現在開示されている抗体は、異なるヒトβ－コロナウイルスに結合し、中和することができる。Ｓ２Ｓ８はα－コロナウイルスに対して交差反応性を示すが、Ｓ２Ｐ６に対しては交差反応性を示さない（図３７）。Ｓ２Ｐ６は、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ（Ｈ１３１対立遺伝子）及びＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８対立遺伝子）を活性化し（図４２Ａ、４２Ｂ、及び６２）、エフェクタ－機能を誘導し（図６３）、シリアンハムスターモデルにおいてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染から保護することができる（図４５、６４、及び６５）。Ｓ２Ｐ６結合は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤのヒトＡＣＥ２への結合を阻害しなかった（図６０）。Ｓ２Ｐ６は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳをトランスフェクトしたＶｅｒｏ－Ｅ６細胞を用いて細胞－細胞融合を阻害した（図６１）。
ペプチドマッピング研究を行い、エピトープ領域を同定した。図４３、４４、５３、及び５４を参照のこと。これらの研究から、Ｓ２Ｐ６はβ－コロナウイルスステムヘリックス領域に保存されたエピトープに結合する（図５４；ヒトβ－コロナウイルスの間で高度に保存されているＳ２サブユニット内のステムヘリックスに位置するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２モチーフＦ１１４８ＫＥＥＬＤＫＹＦ１１５６）。
Ｓ２Ｐ６は、試験した全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓバリアント及びＥｘｐｉＣＨＯ細胞表面に一過性に発現した全サルベコウイルスクレードを代表する２４のＳ糖タンパク質に結合することが示された（図５０、６７Ａ－６７Ｃ、及び６８）。Ｓ２Ｐ６は、ヒトに感染する５種類のβ－コロナウイルス（ＨＫＵ１はオフレ－トが速いが）、ならびにＭＥＲＳ－ＣｏＶ関連コウモリウイルス（ＨＫＵ４及びＨＫＵ５）及びマウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）のステムヘリックスペプチド（データは示していない）と同程度に結合する。Ｓ２Ｐ６はまた、融合後のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質への結合を示したが、そのエピトープは標的プロトマーの界面にスパイクタンパク質のロッド形三量体の他の２つのプロトマーと埋め込まれているようであり、従って完全にアクセス可能であるとは期待できない（データは示されていない）。
生殖細胞系ＣＤＲアミノ酸を有するＳ２Ｐ６抗体の大部分はまた、少なくとも１つのベータコロナウイルスに結合するのに効果的であることが見出された。ＣＤＲＨ３の残基１０３にグリシンの代わりにバリンを含むバリアントは、試験したウイルスへの結合を欠いていた（図５９、及び７６－７７）。
さらなる考察
Ｓ２Ｐ６はインビトロで免疫細胞依存性エフェクタ－機能を活性化し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｗｕｈａｎ－１及びＢ．１．３５１株で攻撃したハムスターを保護する。
回復期ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２暴露個体からの広範に中和するβ－コロナウイルスｍＡｂの単離
Ｓ糖タンパク質の高度に保存された領域を標的とするｍＡｂを同定するために、ＣＯＶＩＤ－１９回復期ドナ－由来のヒトＩｇＧ＋記憶Ｂ細胞を調べた。ｍＡｂは、３種類のヒト感染性ベータコロナウイルス亜属、すなわちサルベコウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、メルベコウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）及びエンベコウイルス（ＯＣ４３及びＨＫＵ１）に属するウイルスの融合前安定化Ｓ外部ドメイン三量体に結合するが、ヒトアルファコロナウイルス（２２９Ｅ及びＮＬ６３）には結合しないことが同定された。 Ｓ２Ｐ６及びＳ２Ｓ４３ｍＡｂは２つのドナ－に由来し、ＶＨ１－４６＊０１及びＤ５－１２＊０１遺伝子を使用する。全体として、可変領域におけるこれらのｍＡｂの体細胞突然変異のレベルは限られていた。融合前及び融合後の両方のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓに結合したｍＡｂは、見かけ上同等の活性を有し、それらの同族エピトープがＳ糖タンパク質の両方の立体構造状態でアクセス可能であることを示す。
Ｓ２Ｐ６をさらに特徴付けるために選択し、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞の表面に一過性に発現するすべてのサルベコウイルスクレードを代表する２４種類のＳ糖タンパク質に対して試験した全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓバリアントに結合することを示した。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて、Ｓ２Ｐ６ Ｆａｂ断片は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ Ｓに対して最も高い親和性を有し、次にＭＥＲＳ－ＣｏＶ Ｓ及びＯＣ４３ Ｓに対してそれぞれ７、７、１２及び１６ ｎＭの平衡解離定数（ＫＤ）を有することが分かった。Ｓ２Ｐ６はＨＫＵ１ Ｓにも結合したが、親和性は低下した（ＫＤは約１２０ｎＭ）。このｍＡｂによる前融合ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓの認識は、ＩｇＧ及びＦａｂの両方のフォ－マットにおいて、ｐＨ５と比較してｐＨ７でより高い結合親和性でｐＨ依存性である。これらのデータは、すべてのヒト感染性ベータコロナウイルスに対するＳ２Ｐ６の独特かつ効率的な交差反応性を示している。
Ｓ２Ｐ６の中和能力及び広さを評価するために、Ｓ－活性化プロテア－ゼＴＭＰＲＳＳ２の存在下又は非存在下で、Ｖｅｒｏ－Ｅ６細胞への真正のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の侵入を阻害するその能力を調べた。Ｓ２Ｐ６はＴＭＰＲＳＳ２陽性Ｖｅｒｏ－Ｅ６細胞の感染を完全に中和したが、Ｖｅｒｏ－Ｅ６細胞の中和感染にはあまり効果がなかった。 以前の研究は、培養肺細胞へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の主な侵入経路が、ＴＭＰＲＳＳ２活性化融合を介して細胞質膜と融合することを明らかにした。（Hoffmann, Mosbauer, et al. 2020; Hoffmann, Kleine-Weber, et al. 2020; Hoffmann, Kleine-Weber, and Pohlmann 2020）。このプロテア－ゼを欠損した細胞と比較して、ＴＭＰＲＳＳ２を発現するＶｅｒｏ－Ｅ６細胞へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２侵入のより効率的なＳ２Ｐ６媒介中和は、エンドソ－ムｐＨでの緩和された結合と一致しており、Ｓ２Ｐ６が肺細胞感染に関連するウイルス侵入経路に向けて最大限効率的であることを示唆している。Ｂ．１．１．７、Ｂ．１．３５１及びＰ．１を含むいくつかの懸念されるバリアント（ＶＯＣ）を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓでシュードタイプ化した水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のＳ２Ｐ６媒介中和（Kaname et al. 2010）を評価した。親のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄ６１４Ｇ Ｓに対して同様の効力が認められ、さらにＳ２Ｐ６はＳＡＲＳ－ＣｏＶ Ｓ、Ｐａｎｇｏｌｉｎ Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ ２０１９（Ｐ－ＧＤ）Ｓ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ Ｓ及びＯＣＳ ＶＳＶシュードタイプを阻害し、ＩＣ５０値は０．０２～１７μｇ／ｍＬであった。従って、Ｓ２Ｐ６はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及び循環ＶＯＣを含む前例のない広範なβ－コロナウイルス中和活性を特徴とする。
同定されたｍＡｂによって認識されるエピトープを定義するために、ペプチドマッピング実験を１５量体直鎖重複ペプチドを用いて行った。すべてのｍＡｂはＳ２サブユニット内のステムらせんに位置するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２モチーフＦ１１４８ＫＥＥＬＤＫＹＦ１１５６を含むペプチドに結合することがわかった。この領域はベータコロナウイルスの間で高度に保存されている。Ｓ２Ｐ６は、ヒトに感染する５種類のベータコロナウイルス（ＨＫＵ１のオフレ－トは速いが）、ならびにＭＥＲＳ－ＣｏＶ関連コウモリウイルス（ＨＫＵ４及びＨＫＵ５）及びマウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）のステムヘリックスペプチドと同程度の大きさで結合した。Ｓ２Ｓ４３は、ＨＫＵ１、ＨＫＵ４及びＨＫＵ５ペプチドに対して著しく弱い反応性でＳ２Ｐ６と同様の全体的結合を示した。
ウイルスエスケ－プバリアントの選択は、複製可能なＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓキメラウイルスを用いて、Ｓ２Ｐ６の存在下でインビトロで行った（Ｃａｓｅ ｅｔ ａｌ． ２０２０）。２継代後、Ｓ２Ｐ６によるウイルス中和は完全に停止し、ディープシークエンシング解析により、Ｌ１１５２Ｆ、Ｄ１１５３Ｎ／Ｇ／Ａ及びＦ１１５６Ｌという５つの異なる耐性突然変異の出現が明らかになった。これらの突然変異は、置換スキャン分析においてＳ２Ｐ６による結合の減少と一致する。これらの突然変異の累積頻度は、２回目の継代後に９０％を超え、準種として生じた（すなわち、それらは、同一の配列決定読み取り内では見られなかった）。主要な界面残基における中和エスケ－プ突然変異体の単離は、Ｓ２Ｐ６ ｍＡｂ結合について同定された相互作用の重要な役割を強調する。 しかしながら、これらの突然変異は、循環血中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２分離株において非常に低い有病率で検出されている（２０２１年４月３０日現在、１，２１７，８１４の配列のうち１４６％、０．０１％）。
Ｓ２Ｐ６媒介広域コロナウイルス中和の推定メカニズムを検証するために、Ｓ２Ｐ６結合はＥＬＩＳＡを用いたＡＣＥ２によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓの結合を遮断しないことが初めて示された。しかし、Ｓ２Ｐ６は、完全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳをトランスフェクトしたＶｅｒｏ－Ｅ６細胞間の細胞間融合を、閉鎖状態でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓを固定するＳ２Ｍ１１ ｍＡｂと同程度に効果的に阻害した M. A. Tortorici et al. 2020）。ＲＢＤ抗原部位Ｉａを標的とするｍＡｂ（例）が報告されている。Ｓ２Ｅ１２及びＩＩａ（例）Ｓ２Ｘ２５９又はＳ２Ｘ３５）は、受容体への結合を模倣し、紡錘体Ｓのコンホメ－ション変化を早期に誘発することができる。（ A. C. Walls et al. 2019; Lempp et al. 2021; Piccoli et al. 2020）。従って、Ｓ２Ｐ６は１ｎｇ／ｍｌという低濃度でＳ２Ｅ１２を介したシンシチウムの形成を抑制した。まとめると、これらの結果は、Ｓ２Ｐ６中和の主なメカニズムが、Ｓ融合遺伝子再編成の妨害に起因する膜融合の阻害を介したウイルス侵入を阻止することであることを示唆している。
Ｓ２Ｐ６を介したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２攻撃に対する防御は、ハムスターにおけるＦｃを介したエフェクタ－機能によって増強される
Ｆｃを介したエフェクタ－機能は、ウイルスクリアランス及び抗ウイルス免疫応答を促進することにより、インビボ保護に寄与することができる Schafer et al. 2021; Bournazos, Wang, and Ravetch 2016; Bournazos et al. 2020; Winkler et al. 2020）。Ｓ２Ｐ６がＦｃγＲＩＩａ及びＦｃγＲＩＩＩａの活性化を誘発し、インビトロでＦｃエフェクタ－機能を発揮する可能性を分析した。Ｓ２Ｐ６は、ルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて、中等度の用量依存性ＦｃγＲＩＩａ及びＦｃγＲＩＩＩａ媒介シグナル伝達を促進した。Ｓ２Ｐ６は、ヒトＮＫ細胞とＥｘｐｉＣＨＯ標的細胞（ＣＨＯ－Ｓ）を発現するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓをインキュベートした後、Ｓ３０９ ｍＡｂで観察されるレベルに匹敵するＡｂ依存性細胞細胞傷害性（ＡＤＣＣ）のロバストな活性化を促進した（Pinto et al. 2020）。Ｓ２Ｐ６はまた、食細胞としてのＣｅｌｌ－Ｔｒａｃｅ－Ｖｉｏｌｅｔ標識末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）とＣＨＯ－Ｓ細胞を用いて、Ａｂ依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）活性を示した。最後に、Ｓ２Ｐ６は補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を促進しなかったことから、Ｓ２Ｐ６ Ｆｃ媒介エフェクタ－機能はインビボでのウイルス制御に関与するが、補体活性化には関与しないことが示唆された。
シリアンハムスターモデル（Boudewijns et al. 2020）における原型（Ｗｕｈａｎ－１関連）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の攻撃に対するＳ２Ｐ６（完全ヒトＩｇＧ１又はハムスターＩｇＧ２ａ定常領域のいずれかを有する）の予防活性を評価した。以前の知見は、ヒトＩｇＧ１ ｍＡｂがハムスターＦｃｇＲを認識できないことを示した（Lempp et al. 2021）；従って、Ｓ２Ｐ６はハムスターＦｃｇＲとの最適な相互作用を提供するためにハムスターＩｇＧ２フォ－マットでも産生された。２種類の異なる用量のヒトＩｇＧ１（Ｈｕ－Ｓ２Ｐ６）又はハムスターＩｇＧ２（Ｈｍ－Ｓ２Ｐ６）をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の鼻腔内投与の２４時間前に投与し、感染４日後にウイルスＲＮＡ量及び複製ウイルスについて動物の肺を評価した。２０ｍｇ／ｋｇで投与したＨｍ－Ｓ２Ｐ６は、対照（無関係な）ｍＡｂと比較して、ハムスターの肺におけるウイルスＲＮＡコピー及びウイルス力価を２桁減少させた。さらに、２０ｍｇ／ｋｇのＨｍ－Ｓ２Ｐ６は、Ｈｕ－Ｓ２Ｐ６で観察されたレベルよりも有意に低いレベルまで肺で検出されたウイルスＲＮＡコピーを減少させ、インビボでのＳ２Ｐ６エフェクタ－機能の有益な効果を示唆した。インビトロで観察されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＯＣに対する同等のＳ２Ｐ６中和効力に基づき、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｂ．１．３５１を投与したハムスターにおけるＳ２Ｐ６の防御効果を評価した。２０ｍｇ／ｋｇのＨｕ－Ｓ２Ｐ６の予防投与は、これまでに同定されたすべてのＶＯＣにおけるステムヘリックスエピトープの厳格な保存と一致して、対照群と比較して、肺における複製ウイルス力価を約１．５桁減少させた（ＲＮＡコピー数は減少させなかった）。
まとめると、これらの知見は、Ｓ融合装置において高度に保存されたエピトープを標的とする抗体が、インビトロでＦｃ媒介性ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰを誘発し、インビボでの中和及びエフェクタ－機能の両方を介してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２誘発に対して保護し得ることを示す。
自然感染又はワクチン接種は、狭い特異性のステムヘリックス指向性抗体を主に誘発する
ステムヘリックス特異的抗体がどのくらいの頻度で誘発されるかを理解するために、パンデミック前、回復期、及びワクチン接種された個人からの血漿試料を用いた血清学的分析を行った。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ／－２）、ＯＣ４３、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＨＫＵ１、ＨＫＵ４及びＨＫＵ５のステムヘリックスペプチドへの血漿ＩｇＧ結合力価を測定した。全体として、ＨＫＵ１を除いて、ステムヘリックスペプチドに結合する血漿抗体はパンデミック前の試料では認められなかったが、これはおそらくこのコホ－トにおけるこのウイルスへの以前の感染を反映していると思われる。逆に、以前にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した人や２回のｍＲＮＡワクチン接種を受けた人では、ステムヘリックス特異的抗体が低頻度で認められた。全体として、これらのデータは、ステムヘリックスに対する血漿Ａｂ応答がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染又はワクチン接種時に誘発されるが、比較的まれであることを示している。
回復期患者２１例及びワクチン接種患者１７例の記憶Ｂ細胞レパートリーにおける幹へリックス特異的抗体の頻度を、インビトロポリクローナル刺激（ここでは抗原特異的Ｂ細胞記憶レパートリー分析（ＡＭＢＲＡ）と呼ぶ）に基づくクローン分析を用いて調べた（Pinna et al. 2009）。両コホ－トにおいて、０．１～２．５％の範囲のステムヘリックス特異的ＩｇＧの頻度が観察されたが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ／－２特異的抗体の頻度が９７％であった１人の個体（感染させ、ｍＲＮＡワクチンを単回接種）を除いては観察されなかった。ほとんどのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ステムヘリックス特異的ＡｂはＯＣ４３と交差反応性を示し、これら２つのウイルスのステムヘリックスの高い配列同一性と一致した。ＨＫＵ１ Ｓステムヘリックスに特異的な抗体がいくつかの個体で認められたが、他のｂ－コロナウイルスとの交差反応性はなかった。この分析は、試験したすべてのステムヘリックスｂ－コロナウイルスペプチドに対する交差反応性の単一例を明らかにした。
これらの知見は、ステムヘリックスＡｂがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染又はワクチン接種によって誘導されることはまれであり、ｂ－コロナウイルス間の交差反応性は限られているようであることを示している。
広範な反応性をもつｂ－コロナウイルス抗体は、体細胞突然変異を介して親和性と幅を獲得する
Ｓ２Ｐ６の個体発生を定義するために、生殖細胞系変異のパネルを作成した。生殖細胞系に関連して突然変異した７つのＳ２Ｐ６重鎖残基のうち２つはエピトープ認識（Ｑ３２及びＨ５７）に寄与するが、５つの軽鎖突然変異残基のいずれもＳ結合に関与しない。ＶＨ及びＶＫ体細胞突然変異の役割に対処するために、重鎖又は軽鎖、又は両方の可変領域（ＶＨ及びＶＫ）のＳ２Ｐ６生殖細胞系変異のパネルを作成した。完全生殖系列Ｓ２Ｐ６（ＵＣＡ）はＯＣ４３及びＭＥＲＳ－ＣｏＶステムヘリックスペプチドに結合したが（変異ｍＡｂと比較して約１桁高いＥＣ５０で）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ／－２又はＨＫＵ１ペプチドには結合しなかった。ＶＨにおける体細胞突然変異はＳＡＲＳＣｏＶ／－２への高い結合活性に十分であったが、ＨＫＵ１への最適結合にはＶＨ及びＶＫ突然変異の両方が必要であった。ＣＤＲＨ３中の残基Ｇ１０３の存在は、全てのｂ－コロナウイルスへの結合に必須であることが見出された。まとめると、これらの知見は、Ｓ２Ｐ６ ｍＡｂがＯＣ４３感染に応答して発生した可能性が高く、その特異性は、これらのβ－コロナウイルスの一方又は両方による自然感染時に選択された体細胞突然変異を介して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＨＫＵ１に向けて拡大されたことを示す。
コロナウイルスのＳ２サブユニット（いわゆる融合装置）は、融合ペプチド及びヘプタッド－リピート２領域を含むいくつかの重要な抗原部位を含み、Ｓ１サブユニットよりも保存されている（Daniel et al. 1993; Zhang et al. 2004; Poh et al. 2020; Elshabrawy et al. 2012; Zheng et al. 2020）。その結果、これは広範なコロナウイルス検出及び中和のための魅力的な標的である(A. C. Walls et al. 2016）。ステムヘリックスを標的とする３つの交差反応性ｍＡｂの最近の同定は、β－コロナウイルスＳ糖タンパク質の間で保存されているこの未知のＳ２サブユニットエピトープを明らかにしたが、いずれも３つのβ－コロナウイルス亜属（系統）のメンバーを阻害しなかった(Sauer et al. 2020; C. Wang et al. 2021; Song et al. 2020）。本稿では、Ｓステムヘリックスの重複エピトープを標的とし、ヒト及び動物のｂ－コロナウイルスと交差反応するｍＡｂを同定する。Ｓ２Ｐ６は、膜融合の阻害を介して評価されたすべてのサルベコウイルス、メルベコウイルス及びエンベコウイルスを広範に中和し、Ｓ２サブユニット指向性ｍＡｂがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２負荷（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｂ．１．３５１ ＶＯＣを含む）からハムスターを保護し、Ｆｃ媒介性エフェクタ－機能の有益な効果を示す証拠を提供する。これらのデータは、エフェクタ－機能の関与を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ特異的ｍＡｂ（(Schafer et al. 2021; Winkler et al. 2020）、ならびにインフルエンザＡ血球凝集素幹特異的広範中和ｍＡｂのインビボでの有効性にまで記述したこれまでの研究を拡張したものである（(Corti et al. 2011; DiLillo et al. 2014）。この所見は、インフルエンザ血球凝集素のステム上の高度に保存されたエピトープに対するｍＡｂの同様の所見を思い起こさせ、交差反応性とエフェクター機能の組み合わせが、これらの感染に対する抗体に対して特別な効力を提供することを示す。
Ｓ２Ｐ６の例外的に広い交差反応性及び中和幅は、ｂ－コロナウイルス間のステムヘリックスの保存された性質によって説明できると思われる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２内では０．０１％未満の配列がＧＩＳＡＩＤ（日付）に蓄積された１３０万以上のゲノムのうちＳ残基１１４６と１１５９の間で変異しており、この領域内にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＶＯＣ残基置換は存在しないことが報告されている。
ステムヘリックスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓの融合前に３－ヘリックス束を形成すると考えられており、そうでなければ埋め込まれた疎水性エピトープを露出させるためには、動的なコンホメ－ション変化が必要であると思われる。このエピトープは、保存されたグリカンに囲まれており、この保存された部位をさらに遮蔽する可能性がある。本稿で示した結果は、ステムヘリックス標的抗体が、風土病性（ＯＣ４３又はＨＫＵ１）又はパンデミック（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）コロナウイルス、ならびにＣＯＶＩＤ－１９ ｍＲＮＡワクチンによる自然感染で誘発されるという証拠を提供する。しかし、幹へリックス特異的抗体は、回復期又はワクチン接種した患者では血漿試料中に低力価で存在し、記憶Ｂ細胞レパートリー中に低頻度で存在するが、これはおそらくエピトープ曝露が限られているためであろう。
ステムヘリックス標的抗体は主に狭い特異性を有し、体細胞突然変異の蓄積を介して広範なベータコロナウイルス中和と保護を媒介するものはほとんどない。
実施例２：ヒトベータコロナウイルススパイクタンパク質の分析
ヒトベータコロナウイルススパイクタンパク質由来の部分Ｓ２セグメントを図７に示す。融合前外部ドメインのＣ末端部分の領域（図８Ａ）は、ある程度保存されていることが明らかにされた。融合前外部ドメインの尾部における表面露出リンカー領域の螺旋構造を示すモデルを図８Ｂに示す。図８Ｃは、表面に露出したリンカー領域のより詳細な図を示し、特定のアミノ酸残基を示す。構造解析の結果、次のことがわかった。
融合後スパイクタンパク質の構造も調べた（図９Ａ）。リンカー領域の詳細な図（図９Ｂ及び９Ｃ（比較のために９Ｃの下部に示される融合前立体構造））は、残基１１４８～１１５８の部分的再配列及び露出を示す。融合後の図９Ａ～図９Ｃにおける残基の番号付けは、さらなる１８残基の位置を付加するシグナルペプチドを説明しない。
実施例３：材料及び方法
図１～４６に示すデータには、以下の材料及び方法を用いた。
安定な過剰発現細胞株の生成
レンチウイルスを、ＤＣ－ＳＩＧＮ（ＣＤ２０９）、Ｌ－ＳＩＧＮ（ＣＬＥＣ４Ｍ）、ＳＩＧＬＥＣ１、ＴＭＰＲＳＳ２又はＡＣＥ２（すべてＧｅｎｅｃｏｐｏｅｉａから入手）及びそれぞれのレンチウイルスヘルパ－プラスミドをコードするレンチウイルス発現プラスミドとＬｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ細胞（Ｔａｋａｒａ）を共トランスフェクションすることにより生成した。トランスフェクションから４８時間後、上清中のレンチウイルスを回収し、２０，０００ｒｐｍで２時間超遠心分離により濃縮した。Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ９３Ｔ（Ｔａｋａｒａ）、Ｖｅｒｏ Ｅ６（ＡＴＣＣ）、ＭＲＣ５（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ａ５４９（ＡＴＣＣ）を６ｕｇ／ｍＬポリブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の存在下で２４時間形質導入した。２つのトランスジ－ンを過剰発現する細胞株をその後に形質導入した。ピュ－ロマイシン及び／又はブラスチシジン（Ｇｉｂｃｏ）による選択は、形質導入の２日後に開始し、選択試薬をその後のすべての培養のために増殖培地中に維持した。単一細胞クローンは、Ａ５４９－ＡＣＥ２－ＴＭＰＲＳＳ２細胞株に由来し、他のすべての細胞株は、細胞プールを表す。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和
１０％ＦＢＳ（ＶＷＲ）及び１ｘペニシリン／ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加したＤＭＥＭ中で培養したＶｅｒｏ Ｅ６又はＶｅｒｏ Ｅ６－ＴＭＰＲＳＳ２細胞を、黒色９６ウェルプレートに２０，０００細胞／ウェルで播種した。モノクローナル抗体の一連の１：４希釈物を、２００ｐｆｕのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（分離株ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０、継代３、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞中で継代）と共に、ＢＳＬ－３施設において３７℃で３０分間インキュベートした。細胞上清を除去し、ウイルス－抗体混合物を細胞に添加した。感染２４時間後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで３０分間固定し、続いて２回のＰＢＳ（ｐＨ７．４）洗浄及びＰＢＳ中０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００による３０分間の透過処理を行った。５％ミルク粉末／ＰＢＳ中で３０分間ブロッキングした後、細胞をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質を標的とする一次抗体（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，ｃａｔ ４０１４３－Ｒ００１）と、１：２０００希釈で１時間インキュベートした。１ｕｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２と混合した二次Ａｌｅｘａ６４７標識抗体で１時間洗浄インキュベートした後、プレートを自動細胞イメージングリーダー（Ｃｙｔａｔｉｏｎ ５、Ｂｉｏｔｅｋ）上でイメ－ジングし、ヌクレオカプシド陽性細胞を製造者の供給するソフトウェアを用いて計数した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｎｌｕｃ中和
ウイルスＯＲＦ７の代わりにナノルシフェラーゼをコードするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｎｌｕｃ（株２０１９－ｎＣｏＶ／ＵＳＡ ＷＡ１／２０２０に基づく）の感染性クローンであるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｎｌｕｃを用いて中和を決定し、野生型ウイルス（Ｘｉｅら、Ｎａｔ Ｃｏｍｍ、２０２０、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１４６７－０２０－１９０５５－７）．）と同等の増殖動態を示した。細胞を、２０，０００細胞／ウェルの黒壁透明底９６ウェルプレートに播種し（２９３Ｔ細胞を、３５，０００細胞／ウェルのポリ－Ｌ－リジン被覆ウェルに播種し）、３７℃で一晩培養し、翌日、感染培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）中で抗体の９ポイント４倍連続希釈液を調製した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｎｌｕｃを、指示されたＭＯＩで感染培地中で希釈し、抗体希釈物に加え、３７℃で３０分間インキュベートし、培地を細胞から除去し、ｍＡｂ－ウイルス複合体を添加し、細胞を３７℃で２４時間インキュベートした。培地を細胞から除去し、製造業者の推奨に従ってＮａｎｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加し、室温で１０分間インキュベートし、ルシフェラーゼシグナルをＶＩＣＴＯＲ Ｎｉｖｏプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で定量した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードタイプＶＳＶ産生及び中和
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードタイプ水疱性口内炎ウイルスを作製するために、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ細胞（ＴａＫａＲａ）を１０ｃｍ皿に入れ、翌日の集密状態を８０％調べた。翌日、製造業者の指示に従って、Ｔｒａｎｓｉｔ－Ｌｅｎｔｉ（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ）を用いて、Ｃ末端１９ａａ切断を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－糖タンパク質（ＹＰ ００９７２４３９０．１）をコードするプラスミドで細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの１日後、細胞を３感染単位／細胞のＭＯＩでＶＳＶ（Ｇ＊ΔＧ－ルシフェラーゼ）（Ｋｅｒａｆａｓｔ）に感染させた。ウイルス接種物を１時間後に洗浄し、細胞を３７℃で別の日間インキュベートし、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽型ＶＳＶを含む細胞上清を、トランスフェクション後２日目に採取し、１０００×ｇで５分間遠心分離し、細胞残渣を除去し、アリコートし、－８０℃で凍結した。
ウイルス中和のため、細胞を黒壁透明底９６ウェルプレートに２０，０００細胞／ウェルで播種し（２９３Ｔ細胞を３５，０００細胞／ウェルでポリ－Ｌ－リジン被覆ウェルに播種）、３７℃で一晩培養し、翌日、抗体の９ポイント４倍連続希釈液を培地中で調製した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードタイプＶＳＶを、１００ｎｇ／ｍＬ抗ＶＳＶ－Ｇ抗体（クローン８Ｇ５Ｆ１１、絶対抗体）の存在下で培地中で１：３０に希釈し、各抗体希釈物に１：１を加えた。ウイルス：抗体混合物を３７℃で１時間インキュベートし、培地を細胞から除去し、５０μＬのウイルス：抗体混合物を細胞に添加した。感染１時間後、１００μＬの培地を全ウェルに加え、３７℃で１７～２０時間インキュベートし、培地を除去し、５０μＬのＢｉｏ－Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに添加した。プレートを３００ＲＰＭのプレート振盪機上で室温で１５分間振盪し、ＲＬＵをＥｎＳｉｇｈｔプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ）上で読み取った。
トランスフェクションに基づく接着受容体スクリ－ニング
Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ細胞（Ｔａｋａｒａ）を、以下の受容体候補をコードするプラスミド（全てＧｅｎｅｃｏｐｏｅｉａから購入）、ＡＣＥ２（ＮＭ ０２１８０４）、ＤＣ－ＳＩＧＮ（ＮＭ ０２１１５５）、Ｌ－ＳＩＧＮ（ＢＣ１１０６１４）、ＬＧＡＬＳ３（ＮＭ ０００２３０６）、ＳＩＧＬＥＣ１（ＮＭ ０２３０６８）、ＳＩＧＬＥＣ３（ＸＭ ０５０５７６０２）、ＳＩＧＬＥＣ９（ＢＣ０３５３６５）、ＳＩＧＬＥＣ１０（ＮＭ ０３３１３０）、ＭＧＬ（ＮＭ １８２９０６）、ＭＩＮＣＬＥ（ＮＭ ０１４３５８）、ＣＤ１４７（ＮＭ １９８５）、ＡＳＧＲ１（ＮＭ ００１６７１．４）、ＡＳＧＲ２（ＮＭ ０８０９１３）、ＮＲＰ１（ＮＭ ００３８７３）でトランスフェクトした。トランスフェクションの１日後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードタイプＶＳＶを１００ｎｇ／ｍＬ抗ＶＳＶ－Ｇ抗体（クローン８Ｇ５Ｆ１１、Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ）存在下、３７℃で１：２０希釈し、感染１時間後、１００μＬの培地を全ウェルに加え、３７℃で１７～２０時間インキュベートし、培地を除去し、５０μＬのＢｉｏ－Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに添加した。プレートを３００ＲＰＭのプレート振盪機上で室温で１５分間振盪し、ＲＬＵをＥｎＳｉｇｈｔプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ）上で読み取った。
トランス感染
ＤＣ－ＳＩＧＮ、Ｌ－ＳＩＧＮ又はＳＩＧＬＥＣ１を安定に発現する親ＨｅＬａ細胞又はＨｅＬａ細胞を、黒壁透明底９６ウェルプレート中でウェル当たり５，０００細胞で播種した。１日後、細胞は約５０％コンフルエントに達し、抗ＶＳＶ－Ｇ抗体（クローン８Ｇ５Ｆ１１、絶対抗体）１００ｎｇ／ｍＬの存在下、３７℃で２時間、１：１０希釈のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードタイプＶＳＶを接種した。トランス感染の抗体媒介阻害のために、細胞を１０ｕｇ／ｍＬ抗ＳＩＧＬＥＣ１抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローン７－２３９）で３０分間前インキュベートした。２時間の接種後、細胞を完全培地で４回洗浄し、ウェル当たり１０，０００個のＶｅｒｏＥ６－ＴＭＰＲＳＳ２細胞を添加し、トランス感染について３７℃で１７～２０時間インキュベートした。培地を除去し、５０μＬのＢｉｏ－Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに添加した。プレートを３００ＲＰＭのプレート振盪機上で室温で１５分間振盪し、ＲＬＵをＥｎＳｉｇｈｔプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ）上で読み取った。
ＣＨＯ－Ｓ細胞の細胞間融合
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－糖タンパク質を安定に発現するＣＨＯ細胞を、１２，５００細胞／ウェルで顕微鏡観察用の９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に播種し、翌日、種々の濃度のｍＡｂｓ及び核マーカーＨｏｅｃｈｓｔ（最終希釈１：１０００）を細胞に添加し、さらに２４時間インキュベートした。融合度はＣｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｉｍａｇｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ）を用いて確立し、物体としての核を検出し、それらのサイズを測定するために物体検出プロトコルを用いた。融合した細胞（すなわちシンシチウム）の核はシンシチウムの中心に集合しており、その大きさに従ってゲート化された独特の大きな物体として認識される。融合細胞中の物体の面積を全物体の総面積で除し、１００を掛けたものは、融合細胞のパーセンテージを提供する
免疫蛍光分析
ＨＥＫ ２９３Ｔ 細胞をポリ－Ｄ－リジンでコーティングした９６ウェルプレート（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に播種し、播種の２４時間後に４％パラホルムアルデヒドで３０分間固定し、続いてＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２回洗浄し、ＰＢＳ中の０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で３０分間透過処理しました。細胞は、３％スキムミルク／ＰＢＳに希釈した一次抗体抗ＤＣ－ＳＩＧＮ／Ｌ－ＳＩＧＮ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ８４５００２、１：５００希釈）、抗ＤＣ－ＳＩＧＮ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ１３１９３Ｓ、１：５００希釈）、抗ＳＩＧＬＥＣ１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ３４６００２、１：５００希釈）、または抗ＡＣＥ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログＡＦ９３３、１：２００）とともにお２時間室温でインキュベートした。洗浄し、１μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２と混合したＡｌｅｘａ６４７標識二次抗体で１時間インキュベートした後、プレートを倒立蛍光顕微鏡（Ｅｃｈｏ Ｒｅｖｏｌｖｅ）で画像化した。
ＡＣＥ２／ＴＭＰＲＳＳ２ ＲＴ－ｑＰＣＲ
ＲＮＡは、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡ Ｐｌｕｓキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を用いて、製造業者のプロトコ－ルに従って細胞から抽出した。ＲＮＡは、製造業者の指示に従って、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて逆転写した。ＡＣＥ２（前方プライマー：ＣＡＡＧＡＧＣＡＡＡＣＧＧＴＴＧＡＡＣＡＣ（配列番号９９）、逆プライマー：ＣＣＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＡＴＴＧＴＡＧＴＣＴ（配列番号１００）、ＨＰＲＴ（前方プライマー：ＣＣＴＧＧＣＧＴＣＧＴＧＡＴＴＡＧＴＧ）（配列番号１０２）、逆プライマー：ＡＣＡＣＣＣＴＴＴＣＣＡＡＡＴＣＣＴＣＡＧ（配列番号１０３）、及びＴＭＰＲＳ２（前方プライマー：ＣＡＡＧＴＧＣＴＣＣＲＡＣＴＣＴＧＧＧＡＴ（配列番号１０４）、逆プライマー：ＡＡＣＡＣＡＣＣＧＲＴＴＣＴＣＧＴＣＣＴＣ（配列番号１０５））の細胞内レベルを、製造業者のプロトコルに従って、Ｌｕｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ニュ－イングランドバイオラブ）を用いて定量した。ＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２のレベルはＨＰＲＴに正規化した。 Ｈｅｌａ細胞を参照試料として用いた。すべてのｑＰＣＲを、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ３リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で実行した。
ＳＡＲＳ２ Ｄ６１４Ｇスパイク製造及びビオチン化
Ｃ末端ＴＥＶ切断部位、Ｔ４バクテリオファージフィブリチンフォールドン、８ｘ Ｈｉｓ－、Ａｖｉａｎｄ ＥＰＥＡ－ｔａｇを有する前融合安定化ＳＡＲＳＤ６１４Ｇスパイク（アミノ酸配列Ｑ１４～Ｋ１２１１を含む）を、トランスフェクション試薬として２９３フェクチンを用いてＨＥＫ２９３ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞にトランスフェクトした。細胞を３７℃で３日間タンパク質を生成させた後、細胞を５００×ｇで３０分間遠心分離し、次に４０００×ｇで３０分間回転させ、上清を回収した。細胞培養上清を０．２ｕｍフィルタ－を通して濾過し、５ｍＬのＣ－タグアフィニティ－マトリックスカラム上にロードし、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８及び２００ｍＭ ＮａＣｌで予め平衡化した。ＳＡＲＳ２ Ｄ６１４Ｇスパイクを、１０カラム容量の１００ｍＭトリス、２００ｍＭ ＮａＣｌ及び３．８ｍＭ ＳＥＰＥＡペプチドを用いて溶出させた。溶出ピ－クを濃縮し、ランニング緩衝液として５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８及び２００ｍＭ ＮａＣｌを用いて、スーパーオース６増加１０／３００ＧＬゲル濾過カラム上に注入した。単分散ＳＡＲＳＤ２ Ｄ６１Ｇスパイクに対応するＳＥＣ画分を回収し、液体窒素中でフラッシュ凍結して－８０℃で保存し、精製ＳＡＲＳ２ Ｄ６１４Ｇスパイクタンパク質をＡｖｉｄｉｔｙ社のＢｉｒＡ５００ビオチン化キットを用いてビオチン化した。５０ｕｇのスパイクタンパク質、５ｕｇのＢｉｒＡ、及び１１ｕＬのＢｉｏｍｉｘＡ及びＢｉｏｍｉｘＢを添加した。ビオチン化反応中の最終スパイクタンパク質濃度は約１ｕＭであった。反応を４℃で１６時間進行させた後、１ｘＰＢＳｐ７．４で予め平衡化したゼバスピンカラム２本を用いてタンパク質を脱塩した。
ＤＣ－ＳＩＧＮ、Ｌ－ＳＩＧＮ、ＳＩＧＬＥＣ１及びＡＣＥ－２のためのフローサイトメトリー分析
ＤＣ－ＳＩＧＮ、Ｌ－ＳＩＧＮ、ＳＩＧＬＥＣ１又はＡＣＥ２を発現するＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を４×１０６細胞／ｍＬで再懸濁し、ウェル当たり１００μＬをＶ底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３８９４）に播種した。プレートを２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄した。
細胞を、Ｇｈｏｓｔバイオレット５１０生存色素（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ， ｃａｔ．１３－０８７０－Ｔ１００，１：１，０００希釈）を含有する２００μＬのＰＢＳに再懸濁した。１３－０８７０－Ｔ１００、１：１，０００希釈、氷上で１５分間インキュベートし、次に洗浄した。細胞を、一次抗体を含有するＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で調製した１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液中に、１：１００希釈：マウス抗ＤＣ／Ｌ－ＳＩＧＮ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ．８４５００２）、ウサギ抗ＤＣ－ＳＩＧＮ（細胞シグナル伝達、ｃａｔ．１３１９３）、マウス抗ＳＩＧＬＥＣ１（Ｂｉｏｌｏｇｅｎｄ、ｃａｔ．３４６００２ネコ）またはヤギ抗ＡＣＥ２（Ｒ＆Ｄシステムズ、ｃａｔ．Ａｆ９３３）で再懸濁した。氷上で１時間インキュベートした後、細胞を２回洗浄し、１：２００希釈のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－４８８標識二次抗体：ヤギ抗マウス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ カタログ Ａ１１００１）、ヤギ抗ウサギ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ カタログ Ａ１１００８）またはロバ抗ヤギ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ カタログ Ａ１１０５５）を含むＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。氷上で４５分間インキュベートした後、細胞を２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、２００μＬの４％ＰＦＡ（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）で室温で１５分間固定した。細胞を３回洗浄し、２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用するフローサイトメトリーによって分析した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク及びＲＢＤの細胞への結合のフローサイトメトリー
ビオチン化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ Ｄ６１４Ｇタンパク質（スパイクビオチン、自社生成）又はビオチン化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ受容体結合ドメイン（ＲＢＤビオチン、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃ、４０５９２－Ｖ０８Ｂ）を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ストレプトアビジン（ＡＦ６４７－ｓｔｒｅｐ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓ２１３７４）と共に、１：２０の割合で、室温で２０分間インキュベートした。次に、標識されたタンパク質をさらに使用するまで４℃で保存した。細胞をＴｒｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｇｉｂｃｏ，１２６０５－０１０）で解離し、１０５細胞を９６ウェルＶ底板（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３８９４）の各ウェルに移した。細胞をフローサイトメトリー緩衝液（ＰＢＳ中２％ＦＢＳ（ｗ／ｏ Ｃａ／Ｍｇ））中で２回洗浄し、氷上で７．５μｇ／ｍｌの最終濃度で２０μｇ／ｍｌ又はＲＢＤビオチン－ＡＦ６４７－ｓｔｒｅｐの最終濃度でＳｐｉｋｅｂｉｏｔｉｎ－ＡＦ６４７－ｓｔｒｅｐで１時間染色した。染色細胞をフローサイトメトリー緩衝液で２回洗浄し、１％ＰＦＡ（電子顕微鏡科学、１５７１４－Ｓ）に再懸濁し、Ｃｙｔｏｆｌｅｘ ＬＸ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ｍＡｂの組換え発現
ヒトモノクローナル抗体は、前述のように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２免疫ドナ－の形質細胞又は記憶Ｂ細胞から単離された。組換え抗体を３７℃及び８％ＣＯ２でＥｘｐｉＣＨＯ細胞中で発現させた。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅを用いて細胞をトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、ＥｘｐｉＣＨＯ Ｆｅｅｄ及びＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯ Ｅｎｈａｎｃｅｒでのトランスフェクションの１日後に補充した。細胞培養上清を、トランスフェクションの８日後に収集し、０．２μｍフィルタ－を通して濾過した。組換え抗体を、ＨｉＰｒｅｐ ２６／１０脱塩カラムを用いて、５ｍＬ ＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）Ｐｒｉｓｍａ カラムを用いて、ＫＴＡ ｘｐｒｅｓｓ ＦＰＬＣデバイス上でアフィニティ－精製し、次に、ＨｉＰｒｅｐ ２６／１０脱塩カラムを用いて、ヒスチジン緩衝液（２０ｍＭヒスチジン、８％ショ糖、ｐＨ６）へ緩衝液を交換した。
ハムスターのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染モデル
ウイルス製剤
本研究で使用したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株、ＢｅｔａＣｏｖ／Ｂｅｌｇｉｕｍ／ＧＨＢ－０３０２１／２０２０（ＥＰＩ ＩＳＬ １０９ ４０７９７６｜２０２０－０２－０３）は、２０２０年２月に中国武漢から帰還した無症候性であることが確認されたＲＴ－ｑＰＣＲ患者から採取した鼻咽頭スワブから回収された。系統解析により、原型Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１ ２０１９－ｎＣｏＶ（ＧｅｎＢａｎｋ系統１１２番号ＭＮ９０８９４７．３）株との密接な関係を確認した。 感染性ウイルスを、ＨｕＨ７及びＶｅｒｏ Ｅ６細胞上で連続継代することにより単離し、継代６ウイルスを本明細書に記載した研究に使用した。 ウイルスストックの力価は、Ｒｅｅｄ ａｎｄ Ｍｕｅｎｃｈ法によりＶｅｒｏ Ｅ６細胞上でのエンドポイント希釈により決定した。
細胞
Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞（アフリカミドリザル腎、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８６）を、１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｔｅｇｒｏ）、１％Ｌグルタミン（Ｇｉｂｃｏ）及び１％重炭酸塩（Ｇｉｂｃｏ）を補充した最小必須培地（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。エンドポイント滴定は、１０％ではなく２％ウシ胎児血清を含む培地を用いて行った。
ハムスターのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染モデル
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のハムスター感染モデルは以前に記載されている。具体的な試験デザインを以下の模式図に示す。簡単に説明すると、野生型シリアンゴールデンハムスター（Ｍｅｓｏｃｒｉｃｅｔｕｓ ａｕｒａｔｕｓ）をＪａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、換気された隔離ケ－ジ（ＩｓｏＣａｇｅ Ｎ Ｂｉｏｃｏｎｔａｉｎｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｔｅｃｎｉｐｌａｓｔ）２個に収容し、食物及び水に自由にアクセスできるようにした。動物を試験開始前４日間馴化した。飼育条件及び実験手順は、ＫＵ Ｌｅｕｖｅｎの動物実験倫理委員会（ライセンスＰ０６５－２０２０）により承認された。６～８週齢の雌ハムスターにケタミン／キシラジン／アトロピンを麻酔し、２×１０６ ＴＣＩＤ５０ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含む５０μＬを鼻腔内接種した（０日目）。
治療レジメン
動物を感染４８時間前に腹腔内投与（ｉ．ｐ．）で予防的に処置し、外観、行動、及び体重をモニタ－した。感染後４日目（ｐ．ｉ．）に、ハムスターを５００μＬの致死性（ペントバルビタ－ルナトリウム２００ｍｇ／ｍＬ、ベトキノ－ルＳＡ）の腹腔内注射により安楽死させた。肺を採取し、ウイルスＲＮＡ及び感染性ウイルスをそれぞれＲＴ－ｑＰＣＲ及びエンドポイントウイルス滴定により定量した。ＰＫ分析のために感染前に血液試料を採取した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＴ－ｑＰＣＲ
収集された肺組織を、３５０μＬのＲＬＴ緩衝液（ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）中のビーズ破壊（Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ）を用いてホモジナイズし、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、５分）して、細胞残渣をペレット化した。ＲＮＡは製造業者の指示に従って抽出した。５０μＬの溶出液のうち、４μＬをＲＴ－ｑＰＣＲ反応における鋳型として使用した。ＲＴ－ｑＰＣＲは、ｉＴａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅｓ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲキット（ＢｉｏＲａｄ）とＮ２プライマー及びヌクレオカプシドを標的とするプロ－ブを用いて、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ９６プラットフォ－ム（Ｒｏｃｈｅ）上で実施した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｃＤＮＡ（ＩＤＴ）の基準を用いて、組織１ｍｇあたり又は血清１ｍＬあたりのウイルスゲノムコピーを発現させた。
エンドポイントウイルス力
肺組織を、３５０μＬ最小必須培地中のビーズ破壊（プレセリ－）を用いてホモジナイズし、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、５分、４℃）して、細胞残渣をペレット化した。感染性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２粒子を定量するために、９６ウェルプレート中のコンフルエントＶｅｒｏ Ｅ６細胞でエンドポイント滴定を行った。ウイルス力価は、Ｌｉｎｄｅｎｂａｃｈ計算器を用いてＲｅｅｄ ａｎｄ Ｍｕｅｎｃｈ法により算出し、５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）／ｍｇ組織で表した。
組織学
組織学的検査のために、肺を４％ホルムアルデヒド中で一晩固定し、パラフィン中に包埋した。組織切片（５μｍ）を、ヘマトキシリン及びエオシンで染色後に分析し、専門病理学者により肺損傷について盲検的にスコア化した。スコアが１～３の累積スコアになったパラメータは、うっ血、肺胞内出血、気管支壁のアポト－シス小体、壊死性細気管支炎、血管周囲浮腫、気管支肺炎、血管周囲炎症、気管支周囲炎症、気管支周囲炎症、血管炎であった。
ハムスター単球への免疫複合体の結合
免疫複合体（ＩＣ）は、正確なモル比（それぞれ４：８：１）を用いて、ビオチン化抗イディオタイプｆａｂ断片及びＡｌｅｘａ－４８８－ストレプトアビジンとＳ３０９ ｍＡｂ（ハムスターＩｇＧ、ｗｔ又はＮ２９７Ａのいずれか）を錯体形成することによって作製した。予め生成された蛍光ＩＣを、ナイ－ブ動物から得られた新鮮に再活性化されたハムスター脾細胞と共に４℃で３時間連続的に希釈した。次に、細胞結合を、死細胞の排除及び単球集団に対する物理的ゲ－ティングの際に、サイトメトリ－により評価した。結果は、全単球集団のＡｌｅｘａ－４８８平均蛍光強度として表される。
バイオインフォマティクス解析
処理ヒト肺細胞アトラス（ＨＬＣＡ）データ及び細胞型アノテ－ションをＧｉｔｈｕｂ（ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｋｒａｓｎｏｗｌａｂ／ＨＬＣＡ）からダウンロードした。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染個体からの処理された単一細胞トランスクリプト－ムデータ及び肺上皮細胞及び免疫細胞の注釈を、ＮＣＢＩ ＧＥＯデータベース（ＩＤ：ＧＳＥ１５８０５５）及びＧｉｔｈｕｂ（ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｚｈａｎｇｚｌａｂ／ｃｏｖｉｄ ｂａｌｆ）からダウンロードした。Ｌｉａｏらによる２番目の単一細胞トランスクリプトミクス研究からの利用可能な配列データを、ウイルスＲＮＡに対応する読み取りの検査のために、ＮＣＢＩ ＳＲＡ（ＩＤ：ＰＲＪＮＡ６０８７４２）からダウンロードした。ゲノムＲＮＡに対するｓｇＲＮＡの割合は、リ－ダ－－ＴＲＳ結合を支持するＴＲＳ含有読み取りを計数することによって推定した。リ－ダ－－ＴＲＳジャンクションリードの検出基準及び方法は、Ａｌｅｘａｎｄｅｒｓｅｎらに適合させ、ウイルスゲノム参照及びＴＲＳアノテ－ションは、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１ ＮＣ ０４５５１２．２／ＭＮ９０８９４７に基づいた４９。重度のＣＯＶＩＤ－１９を有する個体からのわずか２つの試料のみが、検出可能なリ－ダ－－ＴＲＳ接合読み取りを有した（ＳＲＲ１１１８１９５８、ＳＲＲ１１１８１９５９）。
図４７～７９に示すデータについては、以下の材料及び方法を使用した。
細胞株
本研究で使用した細胞株は、ＡＴＣＣ（ＨＥＫ２９３Ｔ及びＶｅｒｏ－Ｅ６）又はＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｅｘｐｉ ＣＨＯ細胞、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３－Ｆ細胞及びＥｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞）から入手した。
試料ドナー
試料は、２０１９年６月以前（パンデミック前）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染者、又はＭｏｄｅｒｎａ又はＰｆｉｚｅｒ／ＢｉｏＮＴｅｃｈ ＢＮＴ１６２ｂ２ワクチンを接種した患者のコホ－トから採取し、地域の施設内審査委員会（Ｃａｎｔｏｎ Ｔｉｃｉｎｏ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ、スイス、Ｌｕｉｇｉ Ｓａｃｃｏ Ｈｏｓｐｉｔａｌの倫理委員会、ミラノ、イタリア、及びＷＣＧ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ、米国）により承認された試験プロトコ－ルに従った。全ドナ－は、血液及び血液成分（ＰＢＭＣ、血清又は血漿など）の使用について書面によるインフォ－ムドコンセントを提供し、病院又は外来患者として募集した。ＰＢＭＣを、フィコ－ル密度勾配遠心分離により血液から単離し、新しく使用するか、又は後の使用のために液体窒素中に貯蔵した。血餅活性化剤を含有するチュ－ブを用いて採取した血液から血清を得た後、遠心分離し、－８０℃で保存した。
ＩｇＧ抗体のＡＭＢＲＡ（抗原特異的記憶Ｂ細胞レパートリー分析）
ＰＢＭＣの複製培養物を９６Ｕ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種し、２．５μｇ／ｍｌのＲ８４８（３Ｍ）及び１０００ Ｕ／ｍｌのヒト組換えＩＬ－２で１０日間、３７℃５％ＣＯ２で刺激した。細胞培養上清を、さらなる分析のために収集した。
抗体の発見と発現
抗原特異的ＩｇＧ＋記憶Ｂ細胞を分離し、回復期の個体の全ＰＢＭＣからクローン化した。抗体ＶＨ及びＶＬ配列は逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）により得られ、ｍＡｂは組換えヒトＩｇＧ１として発現され、Ｆｃ領域又はＦａｂ断片における半減期延長Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ（ＬＳ）突然変異を有した。ＥｘｐｉＣＨＯ細胞を、以前に記載したように、重鎖及び軽鎖発現ベクターで一過性にトランスフェクトした（Ｐｉｎｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。Ｓｙｒｉａｎハムスターを用いたインビボ試験では、Ｓ２Ｐ６をシリアンハムスターＩｇＧ２ Ｆｃで作製した。ＵＣＡ配列は、体細胞突然変異を横臥位で産生したＩＭＧＴ／Ｖ－ＱＵＥＳＴ及びＶＨ及びＶＬを用いて構築した。ＭＡｂｓ親和性精製は、ＵＮＩＣＯＲＮソフトウェアバージョン５．１１（Ｂｕｉｌｄ ４０７）が操作するＫＴＡ Ｘｐｒｅｓｓ ＦＰＬＣ（Ｃｙｔｉｖａ）上で、完全長ヒト及びハムスターｍＡｂｓ用のＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（Ｃｙｔｉｖａ）及びＦａｂ断片用のＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＣＨ１－ＸＬ ＭｉｎｉＣｈｒｏｍカラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ＰＢＳを移動相として用いて行った。ＨｉＴｒａｐ Ｆａｓｔ脱塩カラム（Ｃｙｔｉｖａ）を用いて、適切な製剤緩衝液への緩衝液交換を行った。最終製品を０．２２μｍフィルタ－でろ過滅菌し、４℃で保存した。
ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞を発現するスパイクタンパク質上の抗体のフローサイトメトリー
Ｅｘｐｉ－ＣＨＯ細胞の一過性トランスフェクションのために、Ｓプラスミド（Ｐｉｎｔｏ ｅｔ ａｌ． ２０２０； Ｍ． Ａｌｅｊａｎｄｒａ Ｔｏｒｔｏｒｉｃｉ ｅｔ ａｌ． ２０２１）を、冷ＯｐｔｉＰＲＯ ＳＦＭ中で希釈し、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａ２９１３０）と混合し、５０ｍｌバイオリアクタ－中５ｍｌ容積中６×１０６細胞／ｍｌで播種した細胞に添加した。トランスフェクトした細胞を、２０９ｒｐｍ（軌道直径２５ｍｍ）の軌道振盪速度で３７℃、８％ＣＯ２で４２時間インキュベートした。ｍＡｂ結合を試験するために、トランスフェクトしたＥｘｐｉＣＨＯ細胞を回収し、洗浄緩衝液（ＰＢＳ中のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ）の１％ｗ／ｖ溶液、２ｍＭ ＥＤＴＡ）中で２回洗浄し、６万細胞／ウェルで９６ Ｕ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に分配した。１０μｇ／ｍｌからのｍＡｂ系列希釈物を氷上で３０分間細胞上に添加し、２回洗浄した後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｔ６４７標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，１０９－６０６－０９８）を検出に使用した。氷上で１５分間インキュベートした後、細胞を２回洗浄し、ＺＥ５ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂｉｏｒａｒｄ）を用いたフローサイトメトリーによりｍＡｂ結合を分析した。
酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）
高タンパク質結合処理（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）又は９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を用いたスペクトルプレート－３８４を、組換え安定化前融合スパイク三量体又はＳ２サブユニットで１μｇ／ｍｌ、又はコロナウイルスステムヘリックスペプチドで８μｇ／ｍｌ、すべてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈し、４℃で一晩コ－ティングした。プレートを、ＰＢＳ中のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ）の１％ｗ／ｖ溶液、又は血漿とのＥＬＩＳＡのために、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を補充したＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中のＢｌｏｃｋｅｒ Ｃａｓｅｉｎ（１％ｗ／ｖ）でブロックした。ｍＡｂ又は血漿の連続希釈物を室温で１時間添加した。さらなる洗浄後、アルカリホスファタ－ゼに結合した抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて１時間インキュベートし、結合したｍＡｂを明らかにした。基質（ｐ－ＮＰＰ、Ｓｉｇｍａ）をカラ－現像に使用し、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ）により４０５ｎｍで読み取ったプレートを使用した。データはＧｒａｐｈ Ｐｒｉｓｍソフトウェアでプロットされる。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクのＡＣＥ２への遮断
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ前融合（最終濃度３００ｎｇ／ｍｌ）を、１μｇ／ｍｌのＳ３０９マウスＦｃ標識ｍＡｂ（Ｓ３０９－ｍＦｃ）と共に３７℃で３０分間インキュベートし、その後、連続希釈Ｓ２Ｐ６（２０μｇ／ｍｌから）を添加し、さらに３７℃で３０分間インキュベートし、複合スパイク：Ｓ３０９：Ｓ２Ｐ６を、予めコ－ティングしたｈＡＣＥ２（ＰＢＳ中２μｇ／ｍｌ）９６ウェルプレートＭａｘｉｓｏｒｐ（Ｎｕｎｃ）に添加し、室温で１時間インキュベートした。その後、プレートを洗浄し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク：Ｓ３０９－ｍＦｃ結合を検出するために二次抗体ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を添加した。さらなる洗浄後、基質（ｐ－ＮＰＰ、Ｓｉｇｍａ）を添加し、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ）を用いて４０５ｎｍでプレートを読み取った。阻害のパーセンテージは以下のように計算した：（１－（（ＯＤ試料ＯＤ ｎｅｇ ｃｔｒ）／（ＯＤ ｐｏｓｔ．ｃｔｒ－ＯＤ ｎｅｇ．ｃｔｒ）＊１００。
エピトープ同定及び置換スキャン
ＰＥＰｐｅｒＭＡＰ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ（ＰＥＰｐｅｒＰＲＩＮＴ ＧｍｂＨ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を行って、全ベータコロナウイルスのスパイクタンパク質をカバーするＰａｎ－ｃｏｒｏｎａ Ｓｐｉｋｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙを介してｍＡｂｓエピトープを測定した。簡単に説明すると、１５量体ペプチドを含むマイクロアレイ（１３－ｍｅｒの重複）を、１０μｇ／ｍｌのｍＡｂと共に１４０ｒｐｍで振盪しながら１６時間インキュベートし、続いて二次抗体及び対照抗体で室温で４５分間染色した。マイクロアレイ読み出しは、走査強度７／７（赤／緑）でＬＩ－ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙイメ－ジングシステムを用いて行った。エピトープ置換スキャンは、すべてのアミノ酸位置における段階的な単一アミノ酸交換に基づいて、同定されたエピトープについて実施した。生成したマイクロアレイに結合したｍＡｂｓを上記のようにして行った。
ＳＰＲ結合測定
ＳＰＲ結合測定は、Ｃｙｔｉｖａ Ｂｉｏｔｉｎ ＣＡＰｔｕｒｅキットを用いてビオチン化ＯＣ４３ Ｓ ＥＣＤを捕捉した以外は、ＣＭ５チップ上に共有結合的に固定化された抗ＡｖｉＴａｇ ｐＡｂを用いてＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置を用いて行い、Ｓ ＥＣＤを捕捉した。流動緩衝液は、中性又は酸性ｐＨ実験のために、それぞれ、Ｃｙｔｉｖａ ＨＢＳ－ＥＰ＋（ｐＨ７．４）又は２０ｍＭリン酸塩ｐＨ５．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％Ｐ－２０であった。測定はすべて２５℃で行い、Ｓ２Ｐ６ Ｆａｂ又はＩｇＧ濃度は、単一サイクル速度論として１１、３３、１００及び３００ｎＭであった。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いて、二重参照減算データを結合モデルに適合させた。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ Ｓ、及びＯＣ４３ Ｓに関するすべてのデータは、１：１結合モデルに適合した。ＭＥＲＳ Ｓのデータは、ア－チファクトと推定される非常に遅い解離を伴う動態相のため、不均一リガンド結合モデルに適合した；適合によって戻された２つのＫＤのより低い親和性は、Ｓ２Ｐ６：ＭＥＲＳ Ｓ相互作用のＫＤとして報告され、近似であることが示された（より高い親和性動態相に関連するＲｍａｘは、ベースラインを超える最終シグナルの大きさに比例する）。ＨＫＵ１ Ｓのデータは、各会合相内の低信号と高速平衡へのアプロ－チのため、定常状態結合モデルに適合し、報告されたＫＤは近似であることを示した。ＩｇＧ結合データは、結合活性により「見かけ上のＫＤ」を生じる。
真正のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの中和
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和実験のために、１０％ＦＢＳ（ＶＷＲ ９７０６８－０８５ロット＃３４５Ｋ１９）及び１００Ｕ／ｍｌペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ １５１４０－１２２）を添加したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ １１９９５－０４０）中で細胞を培養した。細胞を、黒色、９６ウェルガラス底板（Ｃｅｌｌｖｉｓ Ｐ９６－１．５Ｈ－Ｎ）中に、２０，０００細胞／ウェルの密度で播種した。ＢＳＬ３施設では、真性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（分離株ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０、継代３、Ｖｅｒｏ－Ｅ６細胞）の２００個のＰＦＵ（プラ－ク形成単位、０．０１の感染多重度に相当する）のｍＡｂｓ（１：４）の連続希釈液を用いて３７℃で３０分間インキュベートし、細胞培養上清を除去した後、ウイルス：抗体混合物に感染させ、３７℃で２０時間インキュベートし、次に、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ １００１０－０３１）中の４％パラホルムアルデヒド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１５７１４－Ｓ）で３０分間固定し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ、Ｘ１００－５００ＭＬ）で３０分間透過処理し、ヒトＳＡＲＳコロナウイルス核タンパク質／ＮＰ抗体で染色した。ウサギＭａｂ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，４０１４３－Ｒ００１）を２％牛乳（ＲＰＩ，Ｍ１７２００－５００．０）で１：２０００希釈、１時間。続いて、細胞をヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＡＦ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ）で染色した。Ａ２１２４５ロット ２２３ ２８６２）２％ミルク中で１：１０００及び２ｕｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２の希釈液で１時間。プレートを自動顕微鏡（Ｃｙｔａｔｉｏｎ５、Ｂｉｏｔｅｋ）で画像化し、供給されたＧｅｎ５ソフトウェアを用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核タンパク質陽性の核及び細胞を定量した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎｌｕｃウイルスの中和
細胞を、１０％ＦＢＳ（ＶＷＲ ９７０６８－０８５ロット＃３４５Ｋ１９）及び１００Ｕ／ｍｌペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ １５１４０－１２２）を補充したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ １１９９５－０４０）中で培養した。中和実験のために、細胞を、２０，０００細胞／ウェルで黒色、９６ウェルガラス底板（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３９０４）に播種し、ＢＳＬ３施設に移した。一連の１：４希釈系列のｍＡｂを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染性クローン（株２０１９－ｎＣｏＶ／ＵＳＡ ＷＡ１／２０２０）であるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎｌｕｃの２００ ＰＦＵとインキュベートし、そこでウイルスＯＲＦ７遺伝子をナノルシフェラーゼレポーター（Ｘｉｅら、２０２０）で置換した。３７℃で３０分間インキュベートした後、ウイルス：抗体混合物を用いて、０．０１の感染の多重度で標的細胞に感染させた。感染後２０時間で、細胞を室温まで平衡化させ、細胞培養上清を吸引した。Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｎ２０１２）試薬とＤＰＢＳ（Ｃａ／Ｍｇを含む）（Ｇｉｂｃｏ １４０４０－１３３）の１：１混合物を細胞に添加した。室温で１０分間インキュベートした後、ルシフェラーゼシグナルをルミネッセンスプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＶＩＣＴＯＲ Ｎｉｖｏ（商標））で読み取った。
ＶＳＶシュードタイプウイルスの産生と中和
１９個のアミノ酸（Ｄ１９）のＣ末端欠失を有するサ－ベコウイルススパイクカセット（ｐｃＤＮＡ３．１（＋）又はｐＴｗｉｓｔ－ＣＭＶ）を合成し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（受入ＱＯＵ９９２９６．１）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１（受入ＡＡＰ１３４４１．１）、ｈＣｏＶ－１９／パンゴリン／広東／１／２０１９（ＧＤ１９、受入ＱＬＲ０６８６７．１）、及び中東呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＭＥＲＳ、受入ＹＰ ００９０４７２０４）について哺乳動物発現構築物（ｐｃＤＮＡ３．１（＋）又はｐＴｗｉｓｔ－ＣＭＶ）にクローン化した。シュードタイプＶＳＶを生成するために、２９３Ｔ Ｌｅｎｔｉ－Ｘパッケ－ジング細胞（ＴａＫａＲａ，６３２１８０）を、細胞が翌日に８０％コンフルエントになるように、１５ｃｍ皿に播種した。次に、ＴｒａｎｓＩＴ－Ｌｅｎｔｉトランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ，６６００）を用いて、製造者の指示に従って、培養物を種々のスパイク発現プラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、パッケ－ジング細胞をＶＳＶ－Ｇ＊ΔＧ－ルシフェラーゼ（Ｋｅｒａｆａｓｔ，ＥＨ１０２０－ＰＭ）で感染させた。感染４８時間後、ＳａｒｂｅｃｏｖｉｒｕｓシュードタイプＶＳＶ－ｌｕｃを含む上清を採取し、１０００×ｇで５分間遠心分離し、アリコートし、－８０℃で凍結した。偽ウイルス中和アッセイを実施するために、以下の頑強な偽ウイルスを支持する細胞を使用した：ＶｅｒｏＥ６－ＴＭＰＲＳＳ２細胞をＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＶＳＶ－ＧＤ１９及びＨｕｈ７細胞をＶＳＶ－ＭＥＲＳに使用した。細胞を、２０，０００細胞／ウェルで、透明底白色壁９６ウェルプレートに播種した。翌日、Ａｂの１：３系列希釈物を、３回の基礎ＤＭＥＭ中で調製した。偽型ＶＳＶを基礎ＤＭＥＭで希釈し、各Ａｂ希釈液に加えて、偽ウイルスの最終希釈液が１：２０になるようにした。偽ウイルス：抗体混合物を３７℃で１時間インキュベートし、前日播種した細胞から培地を取り出し、５０μｌの偽ウイルス：Ａｂ混合物で置き換え、３７℃でインキュベートし、感染後１時間、５０μｌの完全培養培地を各ウェルに添加し、３７℃で一晩インキュベートした後、感染細胞からの培地を取り出し、１００μｌの１：１希釈ＰＢＳ：Ｂｉｏ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｇ７９４０）ルシフェラーゼ基質を各ウェルに添加した。 プレートを室温で３００ｒｐｍで１０分間振盪し、次にＥｎＳｉｇｈｔマイクロプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）上で相対光ユニット（ＲＬＵ）を読み取った。 中和率は、全データ点からプレート当たり６ウェルの平均バックグラウンド（ルシフェラーゼ基質のみを有する非感染細胞）値を差し引くことにより決定した。各抗体濃度の中和率を、各プレートについて抗体を受け取らない対照ウェルに対して計算した。Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ，ｖ９．０．１）を用いて中和率データを分析した。絶対ＥＣ５０値は、可変傾き４パラメータの非線形回帰モデルを用いて曲線を適合させることにより計算し、値はｙ＝５０で曲線から内挿した。
ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｍＡｂエスケ－プ突然変異体の選択
耐性ウイルスの選択：
細胞を、１０％ＦＢＳ（ＶＷＲ ９７０６８－０８５ロット＃３４５Ｋ１９）及び１００Ｕ／ｍｌペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ １５１４０－１２２）を補充したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ １１９９５－０４０）中で培養した。感染の前日に、２５０，０００個のＶｅｒｏＥ６－ＴＭＰＲＳＳ２細胞を、１０％ＦＢＳ（ＶＷＲ ９７０６８－０８５ロット＃３４５Ｋ１９）及び１００Ｕ／ｍｌペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ １５１４０－１２２）を補充した２ｍｌのＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ １１９９５－０４０）中の１２ウェルプレートに播種し、３７Ｃで一晩インキュベートした。翌日、Ｓ２Ｐ６を、感染培地（２％ＦＢＳ及び２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ、１５６３０－０８０）を添加したＤＭＥＭ）中で８０ｕｇ／ｍｌから開始して１：４に連続希釈し、ＭＯＩで２時間、３７℃で複製可能なＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｃａｓｅら、２０２０）とインキュベートした。ｍＡｂ－ウイルス複合体を３７℃で１時間、手動で１５分ごとに揺動させて細胞に吸着させた。吸着後、細胞をＰＢＳで洗浄し、最初の感染に用いたのと同量のＳ２Ｐ６を含む感染培地で覆った。感染は、感染後１日目及び３日目に細胞のＧＦＰ発現及び細胞変性効果（ＣＰＥ）について顕微鏡により視覚的にモニタ－した。感染後３日目に、ｍＡｂ対照ウェルが５０％を超えるＣＰＥに達した場合、最高のＡｂ濃度が２０％を超えるＣＰＥ（この場合、８０ｕｇ／ｍｌウェル）を示すウェルを継代のために選択した。細胞上清を遠心分離して、細胞残渣を除去し、感染培地中で１：１０に希釈し、同じＳ２Ｐ６濃度範囲で新鮮なＶｅｒｏＥ６－ＴＭＰＲＳ２細胞に添加し、初期継代のために処理した。試験した最高濃度でウイルス中和が観察されなかった後、２継代後に選択を中止した。
Ｓ遺伝子の配列決定：
ウイルスＲＮＡを、キャリアＲＮＡを添加することなく、製造業者の指示に従って、ＱＩＡａｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，５２９０４）を用いてウイルス継代の上清から抽出した。 メ－カ－の指示に従って、６μｌの精製ＲＮＡ及びランダムプライマーを用いて、ＮＥＢ ＰｒｏｔｏＳｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＮＥＢ， Ｅ６５６０Ｓ）を用いて逆転写反応を行った。得られたｃＤＮＡを、プライマー５’－ＣＧＡＡＡＡＡＡＧＧＣＡＴＣＴＧＧＧＡＧ－３’（配列番号１０６）及び５’－ＣＡＴＴＧＡＡＣＴＣＧＴＣＧＴＣ－３’（配列番号１０７）を有するＫａｐａＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓポリメラ－ゼ（ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ ＰＣＲ Ｋｉｔ Ｋ２６０１）を用いて、スパイク遺伝子のＰＣＲ増幅のための鋳型として使用した。増幅条件は、９５℃での初期３分、続いて９８℃での２０秒、５９℃での１５秒及び７２℃での２分間の２８サイクルを含み、７２℃での最終４分間であった。ＰＣＲ産物を、製造業者の指示に従って、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ， Ａ６３８８１）を用いて精製した。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｄ５０００ ＳｃｒｅｅｎＴａｐｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｄ５０００ ＳｃｒｅｅｎＴａｐｅ，５０６７－５５８８，Ａｇｉｌｅｎｔ Ｄ５０００，Ｒｅａｇｅｎｔｓ ５０６７－５５８９）を用いて２μｌのＰＣＲ産物を分析することにより、アンプリコンのサイズを確認した。２μｌをＱｕａｎｔ－ｉＴ ｄｓＤＮＡ高感度アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｑ３３１１２０）で分析し、製品を定量した。ＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ ＦＳ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ ＮＥＢ，Ｅ６１７７Ｓ）を用いて、製造業者の指示に従って、２０ｎｇの精製ＰＣＲ産物をライブラリ－構築のためのインプットとして使用した。ＤＮＡ断片化を１３分間行った。 ＮＥＢＮｅｘｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｏｌｉｇｏｓ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｄｕａｌ Ｉｎｄｅｘ Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔ １ （ＮＥＢ，Ｅ７６００Ｓ）をライブラリ－構築に使用し、合計６サイクルのＰＣＲサイクルを行った。ライブラリ－サイズは、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｄ１０００スクリーンテープシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｄ１０００スクリーンテープ、５０６７－５５８２、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｄ５０００試薬、５０６７－５５８３）を用いて決定し、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ ｄｓＤＮＡ高感度アッセイキットで定量した。各ライブラリ－の等量を、多重化のために一緒にプールし、Ｉｌｌｕｍｉｎａライブラリ－調製ガイドの「プロトコ－ルＡ：標準正規化方法」を用いて、配列決定のために１％ＰｈｉＸスパイクインを有する８ｐＭ最終多重化ライブラリ－を調製した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｖ３ （６００－ｃｙｃｌｅ）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，ＭＳ－１０２－３００）を用いて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑプラットフォ－ム上のライブラリの配列決定を行い、Ｒｅａｄ １は３００サイクル、Ｒｅａｄ ２は３００サイクル、Ｉｎｄｅｘ １は８サイクル、Ｉｎｄｅｘ ２は８サイクルとした。
バイオインフォマティクス解析：
ＩｌｌｕｍｉｎａのＢｃｌ２ｆａｓｔｑコマンドを実行した後の平均リード長は、試料当たりの平均で１４９～１８８ｂｐの範囲であった。試料間の一貫性を確保するために、ペアエンドリードを最初に２×１５０ｂｐにトリミングし、さらにＩｌｌｕｍｉｎａアダプタ－及び低品質のベースを除去するために、Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ（Ｂｏｌｇｅｒ、Ｌｏｈｓｅ、及びＵｓａｄｅｌ ２０１４）を用いて洗浄した。 カスタム基準シ－ケンスを用いてＢｕｒｒｏｗｓＷｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ（ＢＷＡ（Ｌｉ ２０１３））を用いて読み出しアラインメントを行った。Ｖａｒｉａｎｔｓは、周波数しきい値１％を用いて、ＬｏＦｒｅｑを用いてインデル再配置及びベース品質再較正を行った（Ｗｉｌｍら、２０１２）。アライメントと異型呼び出しの２つの連続したラウンドが実行され、アレル頻度＞５０％で第１ラウンド中に呼び出されたバリアントは、アライメント速度と異型呼び出し精度を合わせるために第２ラウンドの基準に統合された。バリアントにはＳｎｐＥｆｆ（Ｃｉｎｇｏｌａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２）を注釈した。参照配列座標は、参照配列命名法と一致させるために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１配列（ＮＣＢＩ： ＮＣ ０４５５１２．２）にマッピングした。ＦａｓｔＱＣ、ｓａｍｔｏｏｌｓ、ｐｉｃａｒｄ、ｍｏｓｄｅｐｔｈ（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ及びＱｕｉｎｌａｎ ２０１８）、ｂｃｆｔｏｏｌｓ（Ｄａｎｅｃｅｋ ｅｔ ａｌ．２０２１）、ＭｕｌｔｉＱＣ（Ｅｗｅｌｓ ｅｔ ａｌ．２０１６）、及びインハウススクリプトを用いて、広範なＱＣを読み取り、位置合わせ及び変異レベルで実施した。特に、読み取り中の静的位置で一貫して呼び出されたバリアント（読み取り中にランダムに分布するのではなく、読み取りの開始又は終了など）を除去するためである。エンドツーエンドワークフローは、ＮｅｘｔＦｌｏｗ（Ｄｉ Ｔｏｍｍａｓｏ ｅｔ ａｌ．２０１７）を用いて自動化された。すべてのプログラムは、Ｂｉｏｃｏｎｄａ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ（Ｇｒｕｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１８）（ｂｉｏｃｏｎｄａ．ｇｉｔｈｕｂ．ｉｏ）を通じて入手可能である。
ヒトＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃγＲＩＩＩａのＭＡｂ依存性活性化
完全長野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）（標的細胞）を安定的に発現するＥｘｐｉＣＨＯ細胞を用いて、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃγＲＩＩＩａのｍＡｂ依存性活性化の測定を行った。ＦｃγＲＩＩＩａ受容体（Ｖ１５８バリアント）又はＦｃγＲＩＩａ受容体（Ｈ１３１バリアント）及びＮＦＡＴ駆動ルシフェラーゼ遺伝子（エフェクタ－細胞）を安定に発現するＪｕｒｋａｔ細胞とインキュベートする前に、細胞を異なる量のｍＡｂと１０分間インキュベートした。エフェクタ－対標的比は、ＦｃγＲＩＩＩａで６：１、ＦｃγＲＩＩａで５：１であった。ヒトＦｃγＲの活性化は、ＮＦＡＴ経路の活性化の結果として生成されるルシフェラーゼシグナルによって定量化された。発光は、製造業者の指示に従って、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ－ＴＭルシフェラーゼアッセイ試薬を用いて、ルミノメ－タ－を用いて３７℃で５％ＣＯ２で２１時間インキュベートした後に測定した（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔ．。Ｎｒ．：Ｇ７０１８及びＧ９９９５）。
抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）
ＡＤＣＣアッセイは、標的細胞としてのＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ ＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＨａｌｏＴａｇ－Ｈｉｔ－ｔａｇｇｅｄを安定に発現するように遺伝子操作された）及びエフェクタ－細胞としてのＰＢＭＣをＥ：Ｔ比３３：１で用いて実施した。ＨｉＢｉｔ細胞を３，０００細胞／ウェルで播種し、３７℃で１６時間インキュベートし、一方、新鮮血液（ＶＶドナ－）から単離したＰＢＭＣを５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－２の存在下で３７℃のインキュベータ－中で一晩培養した。翌日、培地を除去し、１００，０００細胞／ウェルでＰＢＭＣを添加する前にｍＡｂ濃度を滴定した。１００％特異的溶解として、１００ｕｇ／ｍｌのデジトニンを使用した。３７℃で４時間インキュベートした後、ＡＤＣＣは、ルミノメーター（積分時間００：３０）を使用して、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ ＨｉＢｉＴ細胞外検出システム（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｃａｔ．Ｎｒ．：Ｎ２４２１）により測定された。
抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）
ＡＤＣＰは、ＰＫＨ６７蛍光細胞リンカーキット（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｃａｔ．Ｎｒ．：ＭＩＮＩ６７）で蛍光標識した完全長野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（標的細胞）を安定に発現するＣＨＯ細胞を用いて行われた。標的細胞は、滴定濃度のｍＡｂと共に１０分間インキュベートし、次に、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ．Ｃ３４５５７）で蛍光標識したＰＢＭＣとインキュベートしたが、その前に、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－２（組換えヒトインタ－ロイキン－２；ＩｍｍｕｎｏＴｏｏｌｓ ＧｍｂＨ； Ｃａｔ Ｎｒ．：１１３４００２７）中で一晩インキュベートした。エフェクタ－：標的比２０：１を用いた。３７℃で一晩インキュベートした後、細胞を抗ヒトＣＤ１４－ＡＰＣ抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ｃａｔ Ｎｏ．５６１７０８、クローンＭ５Ｅ２）で染色し、単球を染色した。ＡＤＣＰは、フローサイトメトリーにより測定し、細胞トレ－スバイオレット及びＰＫＨ６７に対して二重陽性であったＣＤ１４＋細胞をゲートした。
補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（標的細胞）を安定に発現するＣＨＯ細胞上でＣＤＣを実施し、ｍＡｂの連続希釈液で１０分間インキュベートし、次に予め吸着したＬｏｗ－Ｔｏｘ Ｍウサギ補体（Ｃｅｄｅｒｌａｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ； Ｃａｔ Ｎｒ．：ＣＬ３０５１）と最終希釈液１：１２でインキュベートした。ＣＤＣは、製造者の指示に従って、ＣｙｔｏＴｏｘ－Ｇｌｏ細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｃａｔ Ｎｒ．：Ｇ９２９１）により、ルミノメーターを用いて３７℃、５％ＣＯ２で３時間インキュベートした後に測定した。
種々の合成コロナウイルスＳステムペプチドに対するＳ２Ｐ６結合及びＳ２Ｐ６／Ｂ６競合実験
全てのビオチン化コロナウイルスＳステムヘリックスペプチド結合実験を、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を添加したＰＢＳ中、３０℃及び１，０００ｒｐｍで行った。Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ装置（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）上で振とうした。異なるステムヘリックスペプチドへのＳ２Ｐ６結合のために、１μｇ／ｍｌＬビオチン化ステムペプチド（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔから合成された１５残基又は１６残基長ステムペプチド－ＰＥＧ６－Ｌｙｓ－ビオチン）をＳＡバイオセンサ－上に０．５ｎｍの閾値まで装填した。次に、３００秒間緩衝液中で解離する前に、センサをそれぞれ０．１μＭ Ｓ２Ｐ６ ｍＡｂ中に３００秒間浸漬する前に、システムを３００秒間ＰＢＳＴ中で平衡化した。Ｓ２Ｐ６－Ｂ６競合については、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ペプチドにビオチン化した１μｇ／ｍｌをＳＡバイオセンサ－上に０．５ｎｍの閾値まで負荷した。システムを１８０秒間ＰＢＳＴ中で平衡化し、その後の各段階を９００秒間モニタ－した。試料バイオセンサを０．１μＭ ｍＡｂ Ｓ２Ｐ６及びＢ６の溶液に浸漬する前に、最初の試料バイオセンサを０．１μＭ ｍＡｂ Ｓ２Ｐ６に浸漬した。第２の試料バイオセンサ－をＰＢＳＴに浸漬し、続いて０．１μＭ ｍＡｂ Ｂ６に浸漬した。非特異的結合をモニタ－するために、ステムペプチドをバイオセンサ－に負荷することなく同一の実験を行った。
融合阻害アッセイ
スパイク媒介細胞融合の阻害を試験するために、ＶｅｒｏＥ６細胞を、高グルコ－ス及び２．４％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含む７０μｌのＤＭＥＭ中、２０，０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種した。１６時間後、細胞を以下のようにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Ｄ１９ ｐｃＤＮＡ３．１でトランスフェクトした：１０ウェルについて、０．５７μｇのプラスミドＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－Ｄ１９ ｐｃＤＮＡ３．１を、３０μｌのＯＰＴＩＭＥＭ中で１．６８μｌのＸ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ＨＰと混合した。１５分間インキュベートした後、混合物をＤＭＥＭ培地中で１：１０に希釈し、ウェル当たり３０μｌを添加した。４倍系列希釈ｍＡｂを調製し、２０μｇ／ｍｌの開始濃度で細胞に添加した。翌日、ＤＭＥＭ中の５Ｘ濃縮ＤＲＡＱ５３０μｌをウェル当たり添加し、３７℃で２時間インキュベートし、各ウェルの９枚の画像をＣｙｔａｔｉｏｎ ５装置を用いて分析した。
シリアンハムスターモデルを用いたインビボ ｍＡｂ試験
ＫＵ ＬＥＵＶＥＮ Ｒ＆Ｄは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シリアンゴ－ルデンハムスター感染モデル（Boudewijns et al. 2020）を開発し、検証した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス産生
本研究で使用したｗｔ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株、ＢｅｔａＣｏｖ／Ｂｅｌｇｉｕｍ／ＧＨＢ－０３０２１／２０２０（ＥＰＩ ＩＳＬ １０９ ４０７９７６｜２０２０－０２－０３）は、２０２０年２月初めに中国武漢から帰還した無症候性であることが確認されたＲＴ－ｑＰＣＲ患者から採取した鼻咽頭スワブから回収された。系統解析により、原型Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１ ２０１９－ｎＣｏＶ（ＧｅｎＢａｎｋ系統１１２番号ＭＮ９０８９４７．３）株との密接な関係を確認した。感染性ウイルスを、ＨｕＨ７及びＶｅｒｏＥ６細胞上で連続継代することにより単離した（Ｂｏｕｄｅｗｉｊｎｓら、２０２０）；継代６ウイルスを、本明細書に記載の研究に使用した。ウイルスストックの力価は、Ｒｅｅｄ ａｎｄ Ｍｕｅｎｃｈ法（Ｒｅｅｄ ａｎｄ Ｍｕｅｎｃｈ １９３８）によりＶｅｒｏ－Ｅ６細胞上でのエンドポイント希釈により決定した。変異株Ｂ．１．３５１（ｈＣｏＶ－１９／ベルギ－／ｒｅｇａ－１９２０／２０２１； ＥＰＩ ＩＳＬ ８９６４７４、２０２１－０１－１１）は、ベルギ－に戻り呼吸器症状を発症した旅行者から採取した鼻咽頭スワブから分離された。患者の鼻咽頭スワブを、ミニオンプラットフォ－ム（オックスフォードナノポア）（Ａｂｄｅｌｎａｂｉらのｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｒｘｉｖ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／１０．１１０１／２０２１．０２．２６．４３３０６２ｖ１）上で直接配列決定に供した。
ＫＵ Ｌｅｕｖｅｎ Ｒｅｇａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（３ＣＡＰＳ）の高封じ込めＡ３及びＢＳＬ３＋施設において、施設のガイドラインに従い、ＡＭＶ ３０１１３０８ ＳＢＢ ２１９ ２０１８ ０８９２及びＡＭＶ ２３１０２０１７ ＳＢＢ ２１９ ２０１７０５８９のライセンスに基づき、ライブウイルス関連作業を実施した。
ハムスターのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染モデル
野生型Ｓｙｒｉａｎハムスター（Ｍｅｓｏｃｒｉｃｅｔｕｓ ａｕｒａｔｕｓ）をＪａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、換気された隔離ケ－ジ（ＩｓｏＣａｇｅ Ｎ Ｂｉｏｃｏｎｔａｉｎｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｔｅｃｎｉｐｌａｓｔ）２個に１個ずつ収容し、食物及び水に自由にアクセスし、ケ－ジを濃縮した（ウッドブロック）。飼育条件及び実験手順は、ＫＵ Ｌｅｕｖｅｎの動物実験倫理委員会（ライセンスＰ０６５－２０２０）により承認された。６～１０週齢の雌ハムスターにケタミン／キシラジン／アトロピンを麻酔し、２×１０６又は１×１０４ＴＣＩＤ５０を含有する５０μｌをそれぞれｗｔ又はＢ．１．３５１バリアントについて鼻腔内接種した。モノクローナル抗体処置（ヒト又はハムスターＳ２Ｐ６（２～２０ｍｇ／ｋｇ））を、腹腔内注射による感染の２４時間前又は４８時間前に開始した。ハムスターの外観、行動、体重をモニタ－した。感染後４日目に、ハムスターを５００μｌの致死性（ペントバルビタ－ルナトリウム２００ｍｇ／ｍＬ、ベトキノ－ルＳＡ）の腹腔内注射により安楽死させた。肺を採取し、ウイルスＲＮＡ及び感染性ウイルスをそれぞれＲＴ－ｑＰＣＲ及びエンドポイントウイルス滴定により定量した。感染前に血液検体を採取し、薬物動態解析を行った。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＴ－ｑＰＣＲ：
屠殺後にハムスター組織を採取し、３５０μｌのＲＬＴ緩衝液（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ）中でビーズ破壊（Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ）を用いてホモジナイズし、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，５分）して細胞残渣をペレット化した。ＲＮＡは製造業者の指示に従って抽出した。血清からＲＮＡを抽出するために、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を使用した。５０μｌの溶出液のうち４μｌを、ＲＴ－ｑＰＣＲ反応における鋳型として使用した。ＲＴ－ｑＰＣＲは、Ｎ２プライマー及びヌクレオカプシドを標的とするプロ－ブを用いたｉＴａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅｓ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴｑＰＣＲキット（ＢｉｏＲａｄ）を用いてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ９６プラットフォ－ム（Ｒｏｃｈｅ）上で実施した（Ｂｏｕｄｅｗｉｊｎｓ ｅｔ ａｌ．２０２０）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｃＤＮＡ（ＩＤＴ）の基準を用いて、組織１ｍｇあたり又は血清１ｍｌあたりのウイルスゲノムコピーを発現させた。
エンドポイントウイルス力価
肺組織を、３５０μｌの最小必須培地中でビーズ破壊（プレセリ－）を用いて均質化し、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、５分、４℃）して、細胞残渣をペレット化した。 感染性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２粒子を定量するために、９６ウェルプレート中のコンフルエントＶｅｒｏ－Ｅ６細胞でエンドポイント滴定を行った。Ｌｉｎｄｅｎｂａｃｈ計算機を用いてＲｅｅｄ ａｎｄ Ｍｕｅｎｃｈ法（Ｒｅｅｄ ａｎｄ Ｍｕｅｎｃｈ １９３８）によりウイルス力価を算出し、５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）／ｍｇ組織で表した。
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上述の様々な実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を提供することができる。
２０２０年１１月２５日出願の米国仮出願第６３／１１８，４７４号、２０２１年４月２１日出願の米国仮出願第６３／１７０，３４２号、２０２１年４月２１日出願の米国仮出願第６３／１７７，７２４号、及び２０２１年５月１０日出願の米国仮出願第６３／１８６，７７９号を含む、本明細書に言及され、及び／又は出願データシ－トに列挙された米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許出願及び非特許刊行物の全ては、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。実施形態の実施形態は、必要に応じて、種々の特許、出願、及び刊行物の概念を使用して、さらに別の実施形態を提供するように修正することができる。
これら及び他の変更は、上記の詳細な説明に照らして実施形態に対して行うことができる。一般に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、特許請求の範囲を、明細書及び特許請求の範囲で開示される特定の実施形態に限定すると解釈されるべきではなく、そのような特許請求の範囲が権利を有する等価物の全範囲と共に、すべての可能な実施形態を含むと解釈されるべきである。従って、クレームは開示によって限定されない。

Claims (42)

  1. ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、ならびにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、抗体又はその抗原結合断片であって、
    （ｉ）ＣＤＲＨ１は、配列番号２７、３７、４８、６７、もしくは８０に従うアミノ酸配列、又は１、２もしくは３つのアミノ酸置換を含むそれらの機能性バリアントを含むか又はそれからなり、１以上の置換が任意に保存的置換であり、及び／又は生殖細胞系にコードされるアミノ酸への置換である；
    （ｉｉ）ＣＤＲＨ２は、配列番号２８、３８、４９、６８、もしくは８１に従うアミノ酸配列、又は１、２もしくは３つのアミノ酸置換を含むそれらの機能性バリアントを含むか又はそれからなり、１以上の置換が任意に保存的置換であり、及び／又は生殖細胞系にコードされるアミノ酸への置換である；
    （ｉｉｉ）ＣＤＲＨ３は、配列番号２９、３９、もしくは５０に従うアミノ酸配列、又は１、２もしくは３つのアミノ酸置換を含むそれらの機能性バリアントを含むか又はそれからなり、１以上の置換が任意に保存的置換であり、及び／又は生殖細胞系にコードされるアミノ酸への置換である；
    （ｉｖ）ＣＤＲＬ１は、配列番号３１、４１、５２、７０、７６、７８、もしくは８３に従うアミノ酸配列、又は１、２もしくは３つのアミノ酸置換を含むそれらの機能性バリアントを含むか又はそれからなり、１以上の置換が任意に保存的置換であり、及び／又は生殖細胞系にコードされるアミノ酸への置換である；
    （ｖ）ＣＤＲＬ２は、配列番号３２、４２、もしくは５３に従うアミノ酸配列、又はそれらの機能性バリアントであって、１つ以上のアミノ酸置換が任意で保存的置換であり、及び／又は生殖細胞系にコードされるアミノ酸への置換である、１つ、２つ、又は３つのアミノ酸置換を含むか、又はそれからなる；及び／又は；
    （ｖｉ）ＣＤＲＬ３は、配列番号３３、４３、もしくは５４に従うアミノ酸配列、又は１、２もしくは３つのアミノ酸置換を含むそれらの機能性バリアントを含むか又はそれからなり、１以上の置換が任意に保存的置換であり、及び／又は生殖細胞系にコードされるアミノ酸への置換であり、
    ここで、抗体又は抗原結合断片は、ベータコロナウイルスの表面糖タンパク質に結合することができる、上記抗体又はその抗原結合断片。
  2. ２以上のベータコロナウイルスの表面糖タンパク質に結合することができる、請求項１に記載の抗体又は抗原結合断片。
  3. ２、３、４、又は５種のベータコロナウイルスの表面糖タンパク質に結合することができる、請求項２に記載の抗体又は抗原結合断片。
  4. ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＯＣ４３、及びＨＫＵ１に結合することができる、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  5. 宿主細胞の表面及び／又はビリオン上に発現されたベータコロナウイルス又はベータコロナウイルスの表面糖タンパク質に結合することができる、請求項１～４のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  6. 感染のインビトロモデル及び／又は感染のインビボ動物モデル及び／又はヒトにおけるベータコロナウイルスによる感染を中和することができる、請求項１～５のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  7. 感染のインビトロモデル及び／又は感染のインビボ動物モデル及び／又はヒトにおいて、１、２、３、４、又は５つのベータコロナウイルスによって感染を中和することができる、請求項１～５のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  8. 感染のインビトロモデル及び／又は感染のインビボ動物モデル及び／又はヒトにおけるいずれか１、２、３、４、又は５種類のベータコロナウイルスによる感染を中和することができる、請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  9. 以下に記載するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片：
    （ｉ）それぞれ配列番号２７、２８、２９、３１、３２、３３；
    （ｉｉ）それぞれ配列番号２７、２８、２９、７０、３２、３３；
    （ｉｉｉ）それぞれ配列番号２７、２８、７４、３１、３２、３３；
    （ｉｖ）それぞれ配列番号２７、２８、７４、７０、３２、３３；
    （ｖ）それぞれ配列番号２７、２８、２９、７６、３２、３３；
    （ｖｉ）それぞれ配列番号２７、２８、２９、７８、３２、３３；
    （ｖｉｉ）それぞれ配列番号２７、２８、７４、７６、３２、３３；
    （ｖｉｉｉ）それぞれ配列番号２７、２８、７４、７８、３２、３３；
    （ｉｘ）それぞれ配列番号２７、６８、２９、３１、３２、３３；
    （ｘ）それぞれ配列番号２７、６８、２９、７０、３２、３３；
    （ｘｉ）それぞれ配列番号２７、６８、７４、３１、３２、３３；
    （ｘｉｉ）それぞれ配列番号２７、６８、７４、７０、３２、３３；
    （ｘｉｉｉ）それぞれ配列番号２７、６８、２９、７６、３２、３３；
    （ｘｉｖ）それぞれ配列番号２７、６８、２９、７８、３２、３３；
    （ｘｖ）それぞれ配列番号２７、６８、７４、７６、３２、３３；
    （ｘｖｉ）それぞれ配列番号２７、６８、７４、７８、３２、３３；
    （ｘｖｉｉ）それぞれ配列番号６７、２８、２９、３１、３２、３３；
    （ｘｖｉｉｉ）それぞれ配列番号６７、２８、７４、３１、３２、３３；
    （ｘｉｘ）それぞれ配列番号６７、２８、７４、７０、３２、３３；
    （ｘｘ）それぞれ配列番号６７、２８、２９、７６、３２、３３；
    （ｘｘｉ）それぞれ配列番号６７、２８、２９、７８、３２、３３；
    （ｘｘｉｉ）それぞれ配列番号６７、２８、７４、７６、３２、３３；
    （ｘｘｉｉｉ）それぞれ配列番号６７、２８、７４、７８、３２、３３；
    （ｘｘｉｖ）それぞれ配列番号６７、６８、２９、３１、３２、３３；
    （ｘｘｖ）それぞれ配列番号６７、６８、２９、７０、３２、３３；
    （ｘｘｖｉ）それぞれ配列番号６７、６８、７４、３１、３２、３３；
    （ｘｘｖｉｉ）それぞれ配列番号６７、６８、７４、７０、３２、３３；
    （ｘｘｖｉｉｉ）それぞれ配列番号６７、６８、２９、７６、３２、３３；
    （ｘｘｉｘ）それぞれ配列番号６７、６８、２９、７８、３２、３３；
    （ｘｘｘ）それぞれ配列番号６７、６８、７４、７６、３２、３３；
    （ｘｘｘｉ）それぞれ配列番号４８、４９、５０、５２、５３、５４；
    （ｘｘｘｉｉ）それぞれ配列番号４８、４９、５０、８３、５３、５４；
    （ｘｘｘｉｉｉ）それぞれ配列番号４８、８１、５０、５２、５３、５４；
    （ｘｘｘｉｖ）それぞれ配列番号４８、８１、５０、８３、５３、５４；
    （ｘｘｘｖ）それぞれ配列番号８０、４９、５０、５２、５３、５４；
    （ｘｘｘｖｉ）それぞれ配列番号８０、４９、５０、８３、５３、５４；
    （ｘｘｘｖｉｉ）それぞれ配列番号８０、８１、５０、５２、５３、５４；
    （ｘｘｘｖｉｉｉｉ）それぞれ配列番号８０、８１、５０、８３、５３、５４；又は
    （ｘｘｘｉｘ）それぞれ配列番号３７、３８、３９、４１、４２、４３。
  10. （ｉ）ＶＨは、配列番号２６、３６、４７、６６、７１、７２、又は７９に従うアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、変異は、任意に、１以上のフレームワーク領域に限定され、及び／又は変異は、生殖細胞系にコードされるアミノ酸への１以上の置換を含む；及び／又は；
    （ｉｉ）ＶＬは、配列番号３０、４０、５１、６９、７５、７７、又は８２に従うアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、変異は、任意に、１以上のフレームワーク領域に限定され、及び／又は変異は、生殖細胞系にコードされるアミノ酸への１以上の置換を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  11. ＶＨ及びＶＬが、配列番号（ｉ）それぞれ２６及び３０；（ｉｉ）それぞれ２６及び６９；（ｉｉｉ）それぞれ２６及び７５；（ｉｖ）それぞれ２６及び７７；（ｖ）それぞれ６６及び６９；（ｖｉ）それぞれ６６及び３０；（ｖｉｉ）それぞれ６６及び７５；（ｖｉｉｉ）それぞれ６６及び７７；（ｉｘ）それぞれ７１及び３０；（ｘ）それぞれ７１及び６９；（ｘｉ）それぞれ７１及び７５；（ｘｉｉ）それぞれ７１及び７７；（ｘｉｉｉ）それぞれ７２及び３０；（ｘｉｖ）それぞれ７２及び６９；（ｘｖ）それぞれ７２及び７５；（ｘｖｉ）それぞれ７２及び７７；（ｘｖｉｉ）それぞれ７３及び３０；（ｘｖｉｉｉ）それぞれ７３及び６９；（ｘｉｘ）それぞれ７３及び７５；（ｘｘ）それぞれ７３及び７７；（ｘｘｉ）それぞれ３６及び４０；（ｘｘｉｉ）それぞれ４７及び５１；（ｘｘｉｉｉ）それぞれ４７及び８２；（ｘｘｉｖ）それぞれ７９及び８２；又は（ｘｘｖ）それぞれ７９及び５１によるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  12. ＶＨ及びＶＬが、配列番号（ｉ）それぞれ２６及び３０；（ｉｉ）それぞれ２６及び６９；（ｉｉｉ）それぞれ２６及び７５；（ｉｖ）それぞれ２６及び７７；（ｖ）それぞれ６６及び６９；（ｖｉ）それぞれ６６及び３０；（ｖｉｉ）それぞれ６６及び７５；（ｖｉｉｉ）それぞれ６６及び７７；（ｉｘ）それぞれ７１及び３０；（ｘ）それぞれ７１及び６９；（ｘｉ）それぞれ７１及び７５；（ｘｉｉ）それぞれ７１及び７７；（ｘｉｉｉ）それぞれ７２及び３０；（ｘｉｖ）それぞれ７２及び６９；（ｘｖ）それぞれ７２及び７５；（ｘｖｉ）それぞれ７２及び７７；（ｘｖｉｉ）それぞれ７３及び３０；（ｘｖｉｉｉ）それぞれ７３及び６９；（ｘｉｘ）それぞれ７３及び７５；（ｘｘ）それぞれ７３及び７７；（ｘｘｉ）それぞれ３６及び４０；（ｘｘｉｉ）それぞれ４７及び５１；（ｘｘｉｉｉ）それぞれ４７及び８２；（ｘｘｉｖ）それぞれ７９及び８２；又は（ｘｘｖ）それぞれ７９及び５１に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％を有するか、又は上記アミノ酸配列を含むか又はそれからなる、請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  13. （ｉ）～（ｉｉｉ）：
    （ｉ）ＦＫＥＥＬＤＫＹＦ［配列番号５７］；
    （ｉｉ）ＧＩＤＦＱＤＥＬＤＥＦＦＫ［配列番号５８］；及び／又は
    （ｉｉｉ）ＤＦＫＥＥＬＤＱＷＦＫ［配列番号５９］
    のいずれか１つを含むベータコロナウイルス表面糖タンパク質アミノ酸配列又はペプチドに結合することができる抗体又はその抗原結合断片。
  14. （ｉ）～（ｖｉ）：
    （ｉ）ＫＲＳＦＩＥＤＬＬＦＮ［配列番号６０］；
    （ｉｉ）ＡＲＳＡＩＥＤＬＬＦＤ［配列番号６１］；
    （ｉｉｉ）ＳＲＳＡＩＥＤＬＬＦＤ［配列番号６２］；
    （ｉｖ）ＲＳＦＦＥＤＬＬＦ［配列番号６３］；
    （ｖ）ＲＳＡＬＥＤＬＬＦＳＫ［配列番号６４］；及び／又は
    （ｖｉ）ＧＲＳＡＩＥＤＩＬＦＳ［配列番号６５］
    のいずれか１つを含むベータコロナウイルス表面糖タンパク質アミノ酸配列又はペプチドに結合することができる抗体又はその抗原結合断片。
  15. ベータコロナウイルス表面糖タンパク質のステムヘリックス中のエピトープを認識する抗体又はその抗原結合断片であって、エピトープが２、３、４、５又はそれ以上のベータコロナウイルス中に保存されている、抗体又はその抗原結合断片。
  16. アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２ＦＸ３Ｘ４ＥＬＤＸ５ＹＦ（配列番号８４）を含むペプチドに結合することができる抗体又は抗原結合断片。
  17. （ｉ）２、３、４、又は５種のベータコロナウイルスのスパイクタンパク質のエピトープを認識し；
    （ｉｉ）２、３、４、又は５種のベータコロナウイルスのスパイクタンパク質とそれぞれの細胞表面受容体の相互作用を阻害することができ；
    （ｉｉｉ）２、３、４、又は５種のベータコロナウイルスのスパイクタンパク質に保存されているエピトープを認識し；
    （ｉｖ）２、３、４、又は５種のベータコロナウイルスに対して交差反応性を示し；
    （ｖ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＯＣ４３、及びＨＫＵ１のいずれかの３種に対しても交差反応性を示し；
    （ｖｉ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＯＣ４３、及びＨＫＵ１のいずれかの４種に対して交差反応性を示し；
    （ｖｉｉ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＯＣ４３、及びＨＫＵ１に対して交差反応性を示し；
    （ｖｉｉｉ）感染のインビトロモデル及び／又は感染のインビボ動物モデル及び／又はヒトにおける１種、２種、３種、４種、５種又はそれ以上の異なるヒトベータコロナウイルスによる感染を中和することができ；
    （ｉｘ）抗体又は抗原結合断片がベータコロナウイルス及び／又はアルファコロナウイルス表面糖タンパク質に結合している場合、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ（随意にＶ１３１）、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ（随意にＶ１５８）、又はその両方を活性化することができ；
    （ｘ）ベータコロナウイルスの表面糖タンパク質に結合しても、表面糖タンパク質とヒトＡＣＥ２との結合を阻害せず；
    （ｘｉ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質に感染又はトランスフェクトされた第１の細胞と第２の細胞との間の細胞－細胞融合を阻害することができ；
    （ｘｉｉ）ベータコロナウイルスに感染した標的細胞に対して、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣ、又はそれらの任意の組み合わせを媒介することができ；
    （ｘｉｉｉ）哺乳動物におけるベータコロナウイルス感染を予防し、又はその重症度の進行を防ぐことができ；又は
    （ｘｉｖ）（ｉ）～（ｘｉｉ））の任意の組い合わせである、請求項１～１６のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  18. 抗体又は抗原結合断片が多特異的抗体又は抗原結合断片である、請求項１～１７のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  19. 抗体又は抗原結合断片が二重特異的抗体又は抗原結合断片である、請求項１８に記載の抗体又は抗原結合断片。
  20. Ｆｃポリペプチド又はその断片が、
    （ｉ）突然変異を含まない参照Ｆｃポリペプチドと比較してＦｃＲｎへの結合を増強する突然変異；及び／又は
    （ｉｉ）突然変異を含まない参照Ｆｃポリペプチドと比較して、ＦｃγＲへの結合を増強する突然変異
    を含む、請求項１～１９のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  21. ＦｃＲｎへの結合を増強する突然変異が、Ｍ４２８Ｌ；Ｎ４３４Ｓ；Ｎ４３４Ｈ；Ｎ４３４Ｓ；Ｎ４３４Ｓ；Ｍ２５２Ｙ；Ｓ２５４Ｔ；Ｔ２５６Ｅ；Ｔ２５０Ｑ；Ｐ２５０Ｑ；Ｐ２５７Ｉ；Ｑ３１１Ｉ；Ｄ３７６Ｖ；Ｔ３０７Ａ；Ｅ３８０Ａ；又はそれらの任意の組合せ、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４３４Ｓ；Ｓ２３９Ｄ；Ｉ３２Ｅ；Ａ３３０Ｌ；又はそれらの任意の組合せ；あるいはＳ２３９Ｄ／Ｉ３２Ｅ；Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３２Ｅ；Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３２Ｅ；又はＧ２３６Ａ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３２Ｅを含む、請求項２０に記載の抗体又は抗原結合断片。
  22. 請求項１～２１のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片とベータコロナウイルス表面糖タンパク質との結合について競合する抗体又はその抗原結合断片。
  23. 抗体が、等価な位置にある対応するＵＣＡからのアミノ酸で置換された野生型配列の少なくとも１つのアミノ酸を含む、請求項１～２２のいずれか１項に記載の抗体。
  24. 請求項１～２３のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片をコードするか、又は抗体もしくは抗原結合断片のＶＨ、重鎖、ＶＬ、及び／又は軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチド。
  25. ポリヌクレオチドがデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）を含み、ＲＮＡがメッセンジャ－ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を任意に含む、請求項２４に記載のポリヌクレオチド。
  26. 宿主細胞における発現のためにコドンを最適化されている、請求項２４又は２５に記載のポリヌクレオチド。
  27. 配列番号３４、３５、４４、又は４５に従ってポリヌクレオチド配列と少なくとも５０％の同一性を有するポリヌクレオチドを含む、請求項２４～２６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  28. 請求項２４～２７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
  29. ポリヌクレオチドが宿主細胞に対して異種性である、請求項２４～２７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド及び／又は請求項２８記載のベクターを含む宿主細胞。
  30. ポリヌクレオチドがヒトＢ細胞に対して異種性であり、及び／又はヒトＢ細胞が不死化されている、請求項２４～２７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むヒトＢ細胞。
  31. （ｉ）請求項１～２３のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片；
    （ｉｉ）請求項２４～２７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド；
    （ｉｉｉ）請求項２８に記載の組換えベクター；
    （ｉｖ）請求項２９に記載の宿主細胞；及び／又は
    （ｖ）請求項３０記載のヒトＢ細胞
    ならびに薬学的に許容される賦形剤、担体、又は希釈剤を含む組成物。
  32. 請求項１～２３のいずれか１つの２以上の抗体又は抗原結合断片を含む、請求項３１に記載の組成物。
  33. （ｉ）請求項１～２３のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片；
    （ｉｉ）ステムヘリックスの外側にあり、任意で受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）に含まれるベータコロナウイルス表面糖タンパク質エピトープに結合することができる抗体又は抗原結合断片を含む組合せ。
  34. 担体分子に封入されている、請求項２４～２７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む組成物であって、担体分子は、脂質、リポソ－ムなどの脂質由来送達ビヒクル、固体脂質ナノ粒子、油性懸濁液、サブミクロン脂質エマルジョン、脂質マイクロバブル、逆脂質ミセル、蝸牛リポソ－ム、脂質微小管、脂質マイクロシリンダ－、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、又はナノスケールプラットフォームを任意に含む、上記組成物。
  35. （ｉ）請求項１～２３のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片；
    （ｉｉ）請求項２４～２７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド；
    （ｉｉｉ）請求項２８に記載の組換えベクター；
    （ｉｖ）請求項２９記載の宿主細胞；
    （ｖ）請求項３０記載のヒトＢ細胞；
    （ｖｉ）請求項３１～３２又は３４のいずれか１項に記載の組成物、及び／又は
    （ｖｉｉ）請求項３３の組み合わせ
    の有効量を対象に投与することを含む、対象におけるベータコロナウイルス感染を治療する方法。
  36. 有効量の前記組み合わせを投与する工程が、（ｉ）の抗体又は抗原結合断片の有効量を投与する工程、及び任意に同時に又は配列で、（ｉｉ）のポリヌクレオチドの有効量を投与する工程を含む、請求項３２に記載の組み合わせの有効量を投与する工程を包含する、請求項３５に記載の方法。
  37. 請求項１～２３のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片、請求項２４～２７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項２８に記載の組換えベクター、請求項２９に記載の宿主細胞、請求項３０に記載のヒトＢ細胞、請求項３１～３２又は３４のいずれか１項に記載の組成物、及び／又は対象におけるベータコロナウイルス感染を治療する方法における使用のための請求項３３に記載の組み合わせ。
  38. 請求項１～２３のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片、請求項２４～２７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項２８に記載の組換えベクター、請求項２９に記載の宿主細胞、請求項３０に記載のヒトＢ細胞、請求項３１～３２又は３４のいずれか１項に記載の組成物、及び／又は対象におけるベータコロナウイルス感染の治療のための薬剤の調製に使用するための請求項３３に記載の組み合わせ。
  39. ベータコロナウイルスが、
    （ｉ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ；
    （ｉｉ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２；
    （ｉｉｉ）ＭＥＲＳ－ＣｏＶ；
    （ｉｖ）ＯＣ４３；
    （ｖ）ＨＫＵ１；又は
    （ｖｉ）（ｉ）～（ｉｉｉ）の任意の組み合わせ
    を含む、請求項３７又は３８に記載の使用のための抗体、抗原結合断片、ポリヌクレオチド、組換えベクター、宿主細胞、ヒトＢ細胞、組成物、及び／又は組み合わせ。
  40. ベータコロナウイルスを治療する方法が、有効量の前記抗体又は抗原結合断片を投与することを含み、任意選択的に同時又は配列で、有効量の前記ポリヌクレオチドを投与することを含む、請求項３７又は３８に記載の使用のための抗体、抗原結合断片、ポリヌクレオチド、組換えベクター、宿主細胞、ヒトＢ細胞、組成物、及び／又は組み合わせ。
  41. 抗体、抗原結合断片、ポリヌクレオチド、組換えベクター、宿主細胞、ヒトＢ細胞、組成物、及び／又は請求項３７又は３８の使用のための組み合わせであって、前記使用が、対象におけるベータコロナウイルス感染を治療する方法において、抗体又は抗原結合断片の第１の使用、及びポリヌクレオチドの第２の使用を同時又は配列で含む、前記抗体、抗原結合断片、ポリヌクレオチド、組換えベクター、宿主細胞、ヒトＢ細胞、組成物、及び／又は組み合わせ。
  42. ベータコロナウイルス感染のインビトロ診断方法であって、
    （ｉ）対象由来の試料を、請求項１～２３のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片と接触させる工程；
    （ｉｉ）抗原及び抗体を含む複合体、又は抗原及び抗原結合断片を含む複合体を検出する工程
    を含む上記方法。
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