CN116286976A - CRISPR/Cas9-gRNA打靶质粒、供体质粒以及永生化小鼠细胞系的制备方法 - Google Patents

CRISPR/Cas9-gRNA打靶质粒、供体质粒以及永生化小鼠细胞系的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了CRISPR/Cas9‑gRNA打靶质粒、供体质粒以及永生化小鼠细胞系的制备方法，打靶质粒包括靶向小鼠Rosa26基因的sgRNA序列对sgRNA‑F和sgRNA‑R，其序列分别如SEQ ID NO.1和2所示。供体质粒包含骨架载体以及自5’端至3’端顺次连接的左同源臂、EF1α、外源基因、Myc、SV40poly(A)、SV40、NeoR/KanR、SV40poly(A)和右同源臂；左同源臂和右同源臂的序列分别如SEQ ID NO.12和15所示。永生化小鼠细胞系由打靶质粒和供体质粒共转染原代细胞而得。本发明方法避免了细胞基因组随机插入外源基因从而可能影响其他基因表达的情况的发生。

Description

CRISPR/Cas9-gRNA打靶质粒、供体质粒以及永生化小鼠细胞 系的制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及CRISPR/Cas9-gRNA打靶质粒、供体质粒以及永生化小鼠细胞系的制备方法。
背景技术
小鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)属于成体干细胞，具有自我更新和分化为多种类型细胞的潜能和响应细胞损伤的信号分子(称为归巢信号，如趋化因子、生长因子和黏附分子等)向损伤区域移动的迁移特性。在一定条件下，BMSCs在体内和体外可分化为多种细胞以及骨、软骨以及脂肪等组织，发挥免疫调节、分泌营养因子等功能，促进受损组织的修复和再生，为基于MSC治疗的疾病带来希望。
BMSC属于原代细胞，增殖周期有限，体外传代不能超过10代，这种特性限制了基于BMSC的相关研究和治疗的能力。有研究显示，细胞引入SV40 large T antigen基因，可以在不影响细胞其他特定功能的同时，使细胞永生化。通过慢病毒感染或转染法使永生化基因随机敲入到原代细胞，可能会影响到其他基因的表达。CRISPR Cas9技术是一种基因编辑技术，可用于体内体外定点敲除、敲入或突变基因，用于原代细胞敲入SV40 large T antigen基因时存在以下缺点：1)制备原代小鼠骨髓间充质干细胞时，已有的骨片迁移法从小鼠长骨分离骨髓间充质干细胞时，细胞容易被污染；2)Donor载体质粒构建步骤繁琐；3)基于慢病毒系统把打靶质粒引入细胞，由于脱靶效应，可能会影响其他基因；4)在抗生素筛选细胞后，没有进行干细胞分选，增加了后续筛选鉴定单克隆细胞的工作量。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明旨在提供CRISPR/Cas9-gRNA打靶质粒、供体质粒以及永生化小鼠细胞系的制备方法。CRISPR Cas9技术是一种基因编辑技术，可用于体内体外定点敲除、敲入或突变基因。本发明基于CRISPR Cas9基因编辑技术制备具有永生化特性细胞系，为基础研究及临床应用提供了便利。
具体技术方案如下：
本发明第一方面提供一种小鼠Rosa26基因的CRISPR/Cas9-gRNA打靶质粒，所述打靶质粒包括靶向小鼠Rosa26基因的sgRNA序列对sgRNA-F和sgRNA-R，所述sgRNA-F和sgRNA-R的序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述sgRNA序列对构建至骨架载体中。
进一步地，所述骨架载体为lentiCRISPRv2。
本发明第二方面提供一种表达外源基因的供体质粒，所述供体质粒包含骨架载体以及自5’端至3’端顺次连接的左同源臂、EF1α启动子、外源基因、Myc标签、SV40poly(A)信号序列、SV40启动子、NeoR/KanR抗性基因、SV40poly(A)信号序列和右同源臂；
所述左同源臂的序列如SEQ ID NO.12所示；
所述右同源臂的序列如SEQ ID NO.15所示；
优选地，所述骨架载体为pUC19。
进一步地，所述外源基因为SV40大T抗原基因。
进一步地，所述供体质粒的构建方法包括：
1)利用限制性内切酶BamHI和Hind III酶切pUC19质粒，得到线性化的pUC19 DNA片段，记为DNA片段II；
2)以小鼠基因组DNA为模板，以Left arm-F和Left arm-R为引物，PCR扩增获得左同源臂，记为DNA片段III；所述Left arm-F的序列如SEQ ID NO.3所示，所述Left arm-R的序列如SEQ ID NO.4所示；
3)以FUGW-EF1α-SV40LT(HygR)质粒为模板，以SV40LT-F和SV40LT-R为引物，PCR扩增获得EF1α-SV40大T抗原基因-Myc标签-SV40 poly(A)信号序列，记为DNA片段IV；所述SV40LT-F的序列如SEQ ID NO.5所示，所述SV40LT-R的序列如SEQ ID NO.6所示；
4)以pcDNA3.1(+)质粒为模板，以NeoR/KanR-F和NeoR/KanR-R为引物，PCR扩增获得SV40-NeoR/KanR抗性基因-SV40poly(A)信号序列，记为DNA片段V；所述NeoR/KanR-F的序列如SEQ ID NO.7所示，所述NeoR/KanR-R的序列如SEQ ID NO.8所示；
5)以小鼠基因组DNA为模板，以Right arm-F和Right arm-R为引物，PCR扩增获得右同源臂，记为DNA片段Ⅵ；所述Right arm-F的序列如SEQ ID NO.9所示，所述Right arm-R的序列如SEQ ID NO.10所示；
6)连接上述DNA片段Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ，获得EF1α-SV40大T抗原基因-Myc标签-SV40 poly(A)信号序列-SV40-NeoR/KanR抗性基因-SV40poly(A)信号序列-右同源臂，记为DNA片段Ⅶ；
7)以步骤6)所得DNA片段Ⅶ为模板，以SV40LT-F和Right arm-R为引物，PCR扩增，获得大量DNA片段Ⅶ；所述SV40LT-F的序列如SEQ ID NO.5所示，所述Right arm-R的序列如SEQ ID NO.10所示；
8)连接步骤7)所得DNA片段Ⅶ与DNA片段Ⅲ、Ⅱ，即获得供体质粒。
本发明第三方面提供一种用于在小鼠Rosa26位点定点敲入外源基因的CRISPR/Cas9系统，所述CRISPR/Cas9系统包含所述的CRISPR/Cas9-gRNA打靶质粒和所述的供体质粒。
本发明第四方面提供所述CRISPR/Cas9系统在制备表达外源基因的小鼠组织、器官或细胞中的应用。
本发明第五方面提供一种永生化小鼠细胞系，其由所述的CRISPR/Cas9-gRNA打靶质粒和所述的供体质粒共转染原代细胞而得；
优选地，所述永生化小鼠细胞系为永生化小鼠骨髓间充质干细胞系，所述原代细胞为原代小鼠骨髓间充质干细胞。
本发明第六方面提供一种永生化小鼠细胞系的制备方法，包括如下步骤：
(1)将所述的CRISPR/Cas9-gRNA打靶质粒、所述的供体质粒与转染试剂混合，获得转染试剂/DNA复合物；
(2)将上述转染试剂/DNA复合物加入至原代细胞中，同时加入Scr7，孵育；
(3)上述转染细胞经G418抗生素筛选、免疫磁珠富集分选、挑选单克隆细胞，即获得永生化小鼠细胞系。
进一步地，所述打靶质粒与供体质粒的质量比为1:3。
进一步地，所述永生化小鼠细胞系为永生化小鼠骨髓间充质干细胞系，所述原代细胞为原代小鼠骨髓间充质干细胞；
优选地，所述原代小鼠骨髓间充质干细胞的分离方法包括如下步骤：
S1.将2-3周C57BL/6J小鼠颈椎脱臼处死后，浸泡于75％酒精；
S2.去除后肢皮毛，完整分离小鼠后肢，PBS进行清洗；
S3.转移至超净台，将完整小鼠后肢浸泡于75％酒精中10-20s，PBS清洗2-5次，置于干净的细胞培养皿；
S4.去掉骨上附着的组织，分离股骨及胫骨，去掉骺骨端；
S5.用α-MEM培养基冲洗股骨及胫骨骨腔内骨髓，至骨片呈苍白色；
S6.将长骨剪成约1-3mm3大小的骨片，转移至离心管中，加胶原酶Ⅱ，37℃摇床消化，直至骨片松散；
S7.将消化后的骨片用α-MEM培养基清洗，随后将骨片接种于细胞培养皿，加入新鲜的α-MEM+10％FBS培养基后放细胞培养箱中，37℃培养72h后，更换新鲜的α-MEM+10％FBS培养基，使骨髓间充质干细胞从骨片迁出，呈贴壁单层；
S8.5天后，用胰蛋白酶消化原代培养的小鼠骨髓间充质干细胞至细胞变圆，加入2倍胰蛋白酶体积的α-MEM+10％FBS培养基终止消化，离心，弃上清，加入完全培养基重悬沉淀，即得到原代小鼠骨髓间充质干细胞。
本发明的有益效果为：
1、本发明基于CRISPR-Cas9基因编辑技术，将CRISPR/Cas9-gRNA打靶质粒和供体质粒转染至原代细胞中，在小鼠“安全港”Rosa26位点敲入外源基因，避免了细胞基因组随机插入外源基因从而可能影响其他基因表达的情况的发生。当外源基因为SV40 large Tantigen基因时，可获得永生化细胞系。此外，本发明采用同源重组一步克隆法，将Donor的四个片段和线性化pUC19载体连接起来，简化了Donor载体质粒构建流程。
2、本发明通过瞬时转染方法在原代小鼠骨髓间充质干细胞Rosa26位点敲入SV40large Tantigen基因，构建永生化小鼠骨髓间充质干细胞系：
1)优化从小鼠体内分离原代骨髓间充质干细胞方案，分离原代小鼠骨髓间充质干细胞时，在完整后肢转入超净台后，加入了75％乙醇消毒完整后肢和PBS润洗操作，降低了污染风险；
2)选用转染法在小鼠“安全港”Rosa26位点敲入SV40 LT基因，避免了细胞基因组随机插入基因后，其他基因可能受到影响的同时，使细胞永生化；
3)NeoR/KanR抗性基因的敲入便于细胞的筛选，在用G418筛选细胞后，加入干细胞免疫磁珠分选操作，优化了永生化小鼠骨髓间充质干细胞系构建的方法，减少了后续干细胞鉴定的工作量，提高了永生化干细胞阳性率；
4)经过实验验证，本发明构建的永生化小鼠骨髓间充质细胞系可以传代四十代，保持原有的细胞形态和干细胞功能，且可用于细胞治疗。
附图说明
图1为分离培养的原代小鼠骨髓间充质干细胞的显微镜观察结果；A：第0代的WTBMSC；B：第6代的WTBMSC；
图2为含有在Rosa26位点发挥核酸内切酶活性的Cas9酶的重组质粒lentiCRISPRv2-Rosa26模式图；
图3为在细胞DNA同源重组修复中提供Donor供体的重组质粒pUC19-Donor模式图；
图4为双质粒系统在小鼠骨髓间充质干细胞定点插入基因示意图；
图5为永生化小鼠骨髓间充质干细胞系的基因组DNA鉴定结果；
图6为im BMSC的MSCs主要相关表面抗原的流式细胞检测结果；
图7为永生化小鼠骨髓间充质干细胞的显微镜观察结果；A：第10代的im BMSC；B：第40代的im BMSC；
图8为im BMSC和Hepa 1-6细胞皮下植瘤生长趋势。
具体实施方式
本发明实施方式中提供一种永生化小鼠骨髓间充质干细胞系的制备方法，利用CRISPR Cas9基因编辑技术，设计sgRNA和插入片段，构建出用于在Rosa26位点敲入SV40large Tantigen基因的打靶质粒和模板质粒，通过瞬时共转染质粒的方法，将SV40 largeT antigen基因定点敲入原代小鼠骨髓间充质干细胞的Rosa26位点，经过G418抗生素筛选、小鼠骨髓间充质干细胞分选以及单克隆的挑选与鉴定，并检测其是否成瘤，从而制备出具备安全性的永生化的小鼠骨髓间充质细胞系。本发明实施例制备的永生化的小鼠骨髓间充质细胞系，细胞增殖快，易于培养和传代，可传代40代以上。制备的细胞株为小鼠骨髓间充质干细胞在干细胞治疗和组织工程的进一步研究提供良好的基础。
为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。
实施例1：原代小鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养
本实施例提供一种原代小鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养方法，具体步骤如下：
1.将2-3周C57BL/6J小鼠颈椎脱臼处死后，浸泡于75％酒精5min；
2.去除后肢皮毛，完整分离小鼠后肢(股骨及胫骨)，PBS清洗3次；
3.转移至超净台，将完整小鼠后肢浸泡于75％酒精中大约10s，PBS清洗3次，置于干净的6cm细胞培养皿；
4.用无菌器械和纱布去掉骨上附着的组织，分离股骨及胫骨，去掉骺骨端；
5.用α-MEM培养基冲洗股骨及胫骨骨腔内骨髓，至骨片呈苍白色；
6.将长骨剪成约1-3mm3大小的骨片，转移至15mL离心管中，加适量胶原酶Ⅱ(含1mg/ml胶原酶Ⅱ的α-MEM培养基)，37℃摇床消化30min，直至骨片松散；
7.将消化后的骨片用α-MEM培养基洗5次，随后将骨片接种于10cm细胞培养皿，加入新鲜的α-MEM+10％FBS培养基后放细胞培养箱中，37℃培养72h后，更换新鲜的α-MEM+10％FBS培养基，使骨髓间充质干细胞充分从骨片迁出，呈贴壁单层；
8.5天后，用胰蛋白酶消化原代培养的小鼠骨髓间充质干细胞至细胞变圆，加入2倍胰蛋白酶体积的α-MEM+10％FBS培养基终止消化，200g，离心5min，弃上清，加入少量完全培养基重悬沉淀，记为P0，用于后续实验。图1显示了分离培养的原代小鼠骨髓间充质干细胞。
实施例2：打靶质粒lentiCRISPRv2-Rosa26的构建
打靶质粒lentiCRISPR v2-Rosa26为用于在小鼠Rosa26位点发挥核酸内切酶功能的重组质粒，其构建具体包括以下步骤：
1.Rosa26基因的sgRNA设计
设计一对靶向小鼠Rosa26基因的互补sgRNA：
sgRNA-F(5’-3’)：CACCGGAAGATGGGCGGGAGTCTTC；SEQ ID NO.1
sgRNA-R(5’-3’)：AAACGAAGACTCCCGCCCATCTTCC；SEQ ID NO.2
2.sgRNA退火成双链sgRNA
将两条所述sgRNA寡聚核苷酸单链退火形成双链。退火反应体系为：浓度为50μM的Rosa26-sgRNA F和Rosa26-sgRNA R各5μL、10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 2μL、ddH2O8μL，混匀后放置PCR仪中反应；反应程序为：95℃反应3min。反应结束后自然降至室温，即获得双链sgRNA，放于-20℃冰箱保存。
3.酶切lentiCRISPRv2载体及胶回收
利用Type IIs型内切酶BsmBI酶切lentiCRISPRv2质粒，得到线性化的lentiCRISPRv2 DNA片段。酶切反应体系为：lentiCRISPRv2质粒2μg、BsmBI 2μL、10×BsmBIBuffer 5μL，加ddH2O补足体系到50μL，混匀后放置PCR仪中反应；反应程序为：55℃，1小时；80℃，20min。随后经DNA琼脂糖凝胶电泳分离目的DNA片段，利用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒纯化回收酶切产物，即获得线性化lentiCRISPRv2载体，记为DNA片段I，放于-20℃冰箱保存。
4.连接双链sgRNA和线性化lentiCRISPRv2载体
利用T4酶连接双链sgRNA与线性化lentiCRISPRv2载体。T4酶连接反应体系为：DNA片段I 100ng、双链sgRNA 500ng、10×T4 DNA Ligase Buffer 2μL、T4 DNA Ligase 1WeissU，加ddH2O补足体系到20μL，混匀后放置PCR仪中反应。反应程序为：22℃，30min。即获得连接产物i，放于-20℃冰箱保存。
5.转化连接产物i及单克隆挑选
取100μL DH5α感受态细胞，冰浴解冻后，立即向感受态细胞悬液加入10μL上述连接产物i，轻轻混匀，冰浴20-30min；42℃水浴中热激45sec后，立即将EP离心管转移至冰上，冰浴2min；向EP离心管中加入900μL不含抗生素的LB培养基，混匀后37℃，200rpm复苏30-60min；5000rpm，离心1min收集菌体，留取100μL上清重菌液，涂布于带有氨苄抗性的固体LB平板上，37℃培养12-16h；随后挑取数个单克隆菌落进行菌液培养，用甘油保存菌种后，使用
Figure BDA0004108331020000072
PlasmidMini Kit提取质粒。
6.质粒测序，获得重组质粒lentiCRISPRv2-Rosa26
用U6启动子通用引物hU6-F对上述质粒进行测序，鉴定正确的的重组质粒lentiCRISPR v2-Rosa26(如图2所示)，进行菌液扩大培养，使用无内毒素质粒中提试剂盒抽提质粒并保存。
实施例3：Donor载体质粒pUC19-Donor的构建
图3为Donor载体质粒pUC19-Donor的模式图，Donor载体质粒的构建步骤如下：
1.酶切pUC19载体及胶回收
利用限制性内切酶BamHI和Hind III酶切pUC19质粒，得到线性化的pUC19 DNA片段。酶切反应体系为：pUC19质粒2μg、BamHI 2μL、HindIII 2μL、10*NEB cut smartbuffer 5μL，加ddH2O补足体系到50μL，混匀后放置PCR仪中反应；反应程序为：37℃，1小时；85℃，5min。随后经DNA琼脂糖凝胶电泳分离目的DNA片段,利用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒纯化回收酶切产物，即获得线性化pUC19载体(SEQ ID NO.11)，记为DNA片段II，放于-20℃冰箱保存。
2.Donor的PCR引物设计
针对Donor的左同源臂(Left arm)、EF1α-SV40 large T antigen-Myc、SV40-NeoR/KanR-poly(A)以及右同源臂(Right arm)设计PCR引物，具体PCR引物见表1；
表1
Figure BDA0004108331020000071
Figure BDA0004108331020000081
3.PCR扩增及胶回收获得Donor DNA片段
通过PCR扩增获得Left arm、EF1α-SV40 large T antigen-Myc、SV40-NeoR/KanR-poly(A)以及Right arm。PCR扩增获得Donor DNA片段的过程具体为：
1)用
Figure BDA0004108331020000082
Cell/Tissue DNA Kit组织DNA提取试剂盒(Yeasen)从小鼠肝脏组织中提取小鼠DNA，获得小鼠基因组DNA。
2)Left arm片段扩增：以上述小鼠基因组DNA为模板，Left arm-F，Left arm-R作为引物，进行PCR扩增。PCR反应体系为：基因组DNA 20ng-300ng、Left arm-F(10μM)2.5μL、Left arm-R(10μM)2.5μL、2×SuperNova超保真PCR预混液25μL、10×High-GC Enhancer2.5μL，加ddH2O补足体系到50μL，混匀后放置PCR仪中反应；随后经DNA琼脂糖凝胶电泳分离DNA，利用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒纯化回收DNA片段，即获得Left arm片段(SEQ IDNO.12)，记为DNA片段III，置于-20℃冰箱保存。
3)EF1α-SV40 large T antigen-Myc-SV40 poly(A)片段扩增：以FUGW-EF1α-SV40LT(HygR)质粒为模板，SV40LT-F，SV40LT-R作为引物，进行PCR扩增。PCR反应体系为：FUGW-FE1α-SV40LT(HygR)质粒1ng、SV40LT-F(10μM)2.5μL、SV40LT-R(10μM)2.5μL、2×SuperNova超保真PCR预混液25μL、10×High-GC Enhancer 2.5μL，加ddH2O补足体系到50μL，混匀后放置PCR仪中反应；随后经DNA琼脂糖凝胶电泳分离DNA，利用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒纯化回收DNA片段，即获得EF1α-SV40 large T antigen-Myc-SV40 poly(A)片段(SEQ ID NO.13)，记为DNA片段IV，放于-20℃冰箱保存。
4)SV40-NeoR/KanR-SV40 poly(A)片段扩增：以pcDNA3.1(+)质粒为模板，NeoR/KanR-F，NeoR/KanR-R作为引物，进行PCR扩增。PCR反应体系为：pcDNA3.1(+)质粒质粒1ng、NeoR/KanR-F(10μM)2.5μL、NeoR/KanR-R(10μM)2.5μL、2×SuperNova超保真PCR预混液25μL、10×High-GC Enhancer 2.5μL，加ddH2O补足体系到50μL，混匀后放置PCR仪中反应；随后经DNA琼脂糖凝胶电泳分离DNA，利用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒纯化回收DNA片段，即获得SV40-NeoR/KanR-SV40 poly(A)片段(SEQ ID NO.14)，记为DNA片段V，放于-20℃冰箱保存。
5)Right arm片段扩增：以上述小鼠基因组DNA为模板，Right arm-F，Right arm-R作为引物，进行PCR扩增。PCR反应体系为：基因组DNA 20ng-300ng、Right arm-F(10μM)2.5μL、Right arm-R(10μM)2.5μL、2×SuperNova超保真PCR预混液25μL、10×High-GCEnhancer2.5μL，加ddH2O补足体系到50μL，混匀后放置PCR仪中反应；随后经DNA琼脂糖凝胶电泳分离DNA，利用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒纯化回收DNA片段，即获得Right arm片段(SEQ ID NO.15)，记为DNA片段Ⅵ，放于-20℃冰箱保存。
4.连接Donor片段和线性化pUC19载体
1)使用
Figure BDA0004108331020000091
Ultra One Step Cloning Kit(Vazyme)连接上述DNA片段Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ。连接反应体系为：DNA片段Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ各0.03pmol、2×ClonExpress Mix 5μL，加ddH2O补足体系到10μL，混匀后放置PCR仪中反应；反应程序为：50℃，30min；降至4℃。即获得EF1α-SV40 large T antigen-Myc-SV40 poly(A)-SV40-NeoR/KanR-SV40 poly(A)-Right arm，记为DNA片段Ⅶ，放于-20℃冰箱保存。
2)以上述DNA片段Ⅶ为模板，SV40LT-F，Right arm-R作为引物，进行PCR扩增。PCR反应体系为：DNA片段Ⅶ1ng、SV40LT-F(10μM)2.5μL、Right arm-R(10μM)2.5μL、2×SuperNova超保真PCR预混液25μL、10×High-GC Enhancer 2.5μL，加ddH2O补足体系到50μL，混匀后放置PCR仪中反应；随后经DNA琼脂糖凝胶电泳分离DNA，利用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒纯化回收PCR产物，即获得大量DNA片段Ⅶ，放于-20℃冰箱保存。
3)使用
Figure BDA0004108331020000092
Ultra One Step Cloning Kit(Vazyme)连接上述DNA片段Ⅶ、Ⅲ和Ⅱ。连接反应体系为：DNA片段Ⅶ、Ⅲ和Ⅱ各0.03pmol、2×ClonExpress Mix 5μL，加ddH2O补足体系到10μL，混匀后放置PCR仪中反应；反应程序为：50℃，30min；降至4℃。即获得连接产物ⅱ，放于-20℃冰箱保存。
5.转化连接产物ii及单克隆挑选
取100μL DH5α感受态细胞，冰浴解冻后，立即向感受态细胞悬液加入10μL上述连接产物ii，轻轻混匀，冰浴20-30min；42℃水浴中热激45sec后，立即将EP离心管转移至冰上，冰浴2min；向EP离心管中加入900μL不含抗生素的LB培养基，混匀后37℃，200rpm复苏30-60min；5000rpm，离心1min收集菌体，留取100μL上清重菌液，涂布于带有氨苄抗性的固体LB平板上，37℃培养12-16h；随后挑取数个单克隆菌落进行菌液培养，用甘油保存菌种后，使用
Figure BDA0004108331020000101
PlasmidMini Kit提取质粒。
6.质粒酶切鉴定及测序，获得重组质粒pUC19-Donor
1)用核酸内切酶BamH1和HindⅢ酶切上述质粒，筛选阳性克隆。酶切反应体系为：重组质粒pUC19-Donor质粒1μg、BamHI 1μL、HindIII 1μL、10*NEB cut smartbuffer 5μL，加ddH2O补足体系到50μL，混匀后放置PCR仪中反应；反应程序为：37℃，1小时；85℃，5min。随后经DNA琼脂糖凝胶电泳分离目的DNA片段，拍摄DNA胶记录目的条带，筛选阳性克隆。
2)用通用引物M13-F对上述阳性质粒进行测序，选择测序正确的质粒。对测序正确的的重组质粒pUC19-Donor进行菌液扩大培养，使用金牌超量无内毒素质粒中提试剂盒抽提质粒并保存。
实施例4：永生化小鼠骨髓间充质干细胞系的构建
1.实验分组
分为实验组(转染试剂+lentiCRISPR v2-Rosa26和pUC19-Donor质粒)和空白对照组(转染试剂)；转染试剂采用SuperluminalTM转染试剂(高效)。
2.细胞转染
1)准备待转染细胞
将P0代小鼠骨髓间充质干细胞传代至25cm2细胞培养瓶，每瓶铺3×10^5个细胞，待培养瓶细胞度汇合达到70％左右转染细胞。
2)准备转染试剂/DNA复合物
实验组为：将2μg lentiCRISPRv2-Rosa26和6μgpUC19-Donor加入含有400μL的α-MEM培养基的灭菌离心管中，漩涡震荡混匀，加入24μL转染试剂至上述培养基中，漩涡震荡混匀，室温孵育10min；空白对照组为将24μL转染试剂加入含有400μL的α-MEM培养基的灭菌离心管中，漩涡震荡混匀，室温孵育10min。
3)转染
将上述转染试剂/DNA复合物缓慢滴加入25cm2细胞培养瓶(含3600μL新鲜的α-MEM培养基)，加入Scr7(终浓度为3μM)后，轻轻晃动细胞培养瓶使其分布均匀，放入培养箱，37℃孵育24小时后，更换为α-MEM+10％FBS培养基，37℃再次孵育24小时。
3.G418筛选
在转染72h后，实验组和对照组细胞均更换为含150μg/ml G418抗生素的新鲜α-MEM+10％FBS培养基，之后每48h更换一次含150μg/ml G418抗生素的新鲜α-MEM+10％FBS培养基，筛选一周后，空白对照组细胞全部死亡，转染组细胞几乎不再死亡，获得具有G418抗性的永生化细胞。
4.免疫磁珠富集分选小鼠间充质干细胞
利用小鼠间充质干细胞免疫磁珠试剂盒富集上述具有G418抗性的永生化细胞，即获得永生化干细胞，将分选得到的永生化干细胞进行扩大培养。
5.挑选单克隆细胞
用胰蛋白酶消化上述永生化干细胞，制备成单细胞悬液，稀释后接种至96孔板，使各孔含有0.5-1个细胞。细胞贴壁后，观察并标记单克隆孔，待单克隆密度长到孔的70-80％时，收集细胞进行扩大培养，即获得永生化小鼠骨髓间充质干细胞系(im BMSC)。
图4为双质粒系统在小鼠骨髓间充质干细胞定点插入目的基因模式图。
6.永生化小鼠骨髓间充质干细胞系的鉴定
6.1.PCR鉴定Donor定点插入情况
1)用
Figure BDA0004108331020000111
Cell/Tissue DNA Kit组织DNA提取试剂盒(Yeasen)提取上述imBMSC基因组DNA，放于-20℃冰箱保存；
2)以上述im BMSC基因组DNA为模板，Rosa26-F(GAAGCACTTGCTCTCCCAAAGTC；SEQID NO.16)，Rosa26-R(GATCACAAGCAATAATAACCTGT；SEQ ID NO.17)作为引物，进行PCR扩增。PCR反应体系为：永生化小鼠骨髓间充质干细胞系基因组DNA 200ng、Rosa26-F(10μM)2.5μL、Rosa26-R(10μM)2.5μL、2×SuperNova超保真PCR预混液25μL、10×High-GC Enhancer2.5μL，加ddH2O补足体系到50μL，混匀后放置PCR仪中反应；
3)经DNA琼脂糖凝胶电泳分离上述PCR产物，拍摄DNA胶记录目的条带，筛选阳性imBMSC。小鼠为二倍体，在两个同源臂设计特异性PCR引物，基因组DNA经扩增后，一条带为野生型，一条带插入SV40LT-目的序列，如图5所示。
6.2.流式细胞仪鉴定im BMSC表面标志物表达情况
1)用胰蛋白酶消化上述im BMSC，制备成单细胞悬液，PBS洗一次，离心后弃去上清液，用含10％大鼠血清的冰冷PBS溶液重悬细胞至约0.5-1*10^7/mL；
2)向离心管中加100μL细胞悬液后，加入0.1-10μg/mL的一抗(A管：FITC:CD29+，APC:Scal+，APC/CY7:CD31-510:CD45-，PE:CD11b-；B管：FITC:CD29+，APC:Scal+，APC/CY7:CD31-510:CD45-，PE:CD86-，PP:CD44+)后，4℃避光孵育30min；
3)加入900μL冰冷PBS进行洗涤，离心后弃去上清液；
4)用200μL冰冷PBS重悬细胞后用流式细胞分析仪进行分析。
结果分析：如图6所示，流式细胞分析结果显示阳性细胞表面标志物和阴性表面标志物均占细胞总量的99％，说明上述制备的im BMSC是骨髓间充质干细胞。
6.3.细胞形态学特征
经PCR和流式细胞鉴定筛选得到的im BMSC细胞株进行细胞形态观察。
结果如图7，im BMSC呈单层贴壁生长、纤维细胞样，且经过多次传代仍然具有典型的小鼠骨髓间充质干细胞的形态。
6.4.皮下荷瘤鉴定im BMSC安全性情况
1)实验分组
分为实验组(im BMSC)和阳性对照组(Hepa 1-6)，每组4只C56BL/6；
2)小鼠皮下荷瘤
胰蛋白酶消化上述im BMSC和Hepa 1-6细胞，制备成单细胞悬液，PBS洗一次，离心后弃去上清液，将细胞用PBS重悬细胞至1×10^8cells/mL，每只小鼠皮下注射100μL相应细胞，随后记录小鼠成瘤情况。
结果分析：结果如图8，阳性对照组小鼠均长出肿瘤，实验组小鼠均无肿瘤。由此可知，im BMSC无成瘤性。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (11)

1.一种小鼠Rosa26基因的CRISPR/Cas9-gRNA打靶质粒，其特征在于，所述打靶质粒包括靶向小鼠Rosa26基因的sgRNA序列对sgRNA-F和sgRNA-R，所述sgRNA-F和sgRNA-R的序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述sgRNA序列对构建至骨架载体中。
2.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9-gRNA打靶质粒，其特征在于，所述骨架载体为lentiCRISPRv2。
3.一种表达外源基因的供体质粒，其特征在于，所述供体质粒包含骨架载体以及自5’端至3’端顺次连接的左同源臂、EF1α启动子、外源基因、Myc标签、SV40 poly(A)信号序列、SV40启动子、NeoR/KanR抗性基因、SV40 poly(A)信号序列和右同源臂；
所述左同源臂的序列如SEQ ID NO.12所示；
所述右同源臂的序列如SEQ ID NO.15所示；
优选地，所述骨架载体为pUC19。
4.根据权利要求3所述的供体质粒，其特征在于，所述外源基因为SV40大T抗原基因。
5.根据权利要求4所述的供体质粒，其特征在于，所述供体质粒的构建方法包括：
1)利用限制性内切酶BamHI和Hind III酶切pUC19质粒，得到线性化的pUC19 DNA片段，记为DNA片段II；
2)以小鼠基因组DNA为模板，以Left arm-F和Left arm-R为引物，PCR扩增获得左同源臂，记为DNA片段III；所述Left arm-F的序列如SEQ ID NO.3所示，所述Left arm-R的序列如SEQ ID NO.4所示；
3)以FUGW-EF1α-SV40LT(HygR)质粒为模板，以SV40LT-F和SV40LT-R为引物，PCR扩增获得EF1α-SV40大T抗原基因-Myc标签-SV40 poly(A)信号序列，记为DNA片段IV；所述SV40LT-F的序列如SEQ ID NO.5所示，所述SV40LT-R的序列如SEQ ID NO.6所示；
4)以pcDNA3.1(+)质粒为模板，以NeoR/KanR-F和NeoR/KanR-R为引物，PCR扩增获得SV40-NeoR/KanR抗性基因-SV40 poly(A)信号序列，记为DNA片段V；所述NeoR/KanR-F的序列如SEQ ID NO.7所示，所述NeoR/KanR-R的序列如SEQ ID NO.8所示；
5)以小鼠基因组DNA为模板，以Right arm-F和Right arm-R为引物，PCR扩增获得右同源臂，记为DNA片段Ⅵ；所述Right arm-F的序列如SEQ ID NO.9所示，所述Right arm-R的序列如SEQ ID NO.10所示；
6)连接上述DNA片段Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ，获得EF1α-SV40大T抗原基因-Myc标签-SV40 poly(A)信号序列-SV40-NeoR/KanR抗性基因-SV40 poly(A)信号序列-右同源臂，记为DNA片段Ⅶ；
7)以步骤6)所得DNA片段Ⅶ为模板，以SV40LT-F和Right arm-R为引物，PCR扩增，获得大量DNA片段Ⅶ；所述SV40LT-F的序列如SEQ ID NO.5所示，所述Right arm-R的序列如SEQID NO.10所示；
8)连接步骤7)所得DNA片段Ⅶ与DNA片段Ⅲ、Ⅱ，即获得供体质粒。
6.一种用于在小鼠Rosa26位点定点敲入外源基因的CRISPR/Cas9系统，其特征在于，所述CRISPR/Cas9系统包含权利要求1或2所述的CRISPR/Cas9-gRNA打靶质粒和权利要求3-5任一项所述的供体质粒。
7.权利要求6所述CRISPR/Cas9系统在制备表达外源基因的小鼠组织、器官或细胞中的应用。
8.一种永生化小鼠细胞系，其特征在于，其由权利要求1或2所述的CRISPR/Cas9-gRNA打靶质粒和权利要求4或5所述的供体质粒共转染原代细胞而得；
优选地，所述永生化小鼠细胞系为永生化小鼠骨髓间充质干细胞系，所述原代细胞为原代小鼠骨髓间充质干细胞。
9.一种永生化小鼠细胞系的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将权利要求1或2所述的CRISPR/Cas9-gRNA打靶质粒、权利要求4或5所述的供体质粒与转染试剂混合，获得转染试剂/DNA复合物；
(2)将上述转染试剂/DNA复合物加入至原代细胞中，同时加入Scr7，孵育；
(3)上述转染细胞经G418抗生素筛选、免疫磁珠富集分选、挑选单克隆细胞，即获得永生化小鼠细胞系。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述打靶质粒与供体质粒的质量比为1:3-1:4。
11.根据权利要求9或10所述的制备方法，其特征在于，所述永生化小鼠细胞系为永生化小鼠骨髓间充质干细胞系，所述原代细胞为原代小鼠骨髓间充质干细胞；
优选地，所述原代小鼠骨髓间充质干细胞的分离方法包括如下步骤：
S1.将2-3周C57BL/6J小鼠颈椎脱臼处死后，浸泡于75％酒精；
S2.去除后肢皮毛，完整分离小鼠后肢，PBS进行清洗；
S3.转移至超净台，将完整小鼠后肢浸泡于75％酒精中10-20s，PBS清洗2-5次，置于干净的细胞培养皿；
S4.去掉骨上附着的组织，分离股骨及胫骨，去掉骺骨端；
S5.用α-MEM培养基冲洗股骨及胫骨骨腔内骨髓，至骨片呈苍白色；
S6.将长骨剪成约1-3mm3大小的骨片，转移至离心管中，加胶原酶Ⅱ，37℃摇床消化，直至骨片松散；
S7.将消化后的骨片用α-MEM培养基清洗，随后将骨片接种于细胞培养皿，加入新鲜的α-MEM+10％FBS培养基后放细胞培养箱中，37℃培养72h后，更换新鲜的α-MEM+10％FBS培养基，使骨髓间充质干细胞从骨片迁出，呈贴壁单层；
S8.5天后，用胰蛋白酶消化原代培养的小鼠骨髓间充质干细胞至细胞变圆，加入2倍胰蛋白酶体积的α-MEM+10％FBS培养基终止消化，离心，弃上清，加入完全培养基重悬沉淀，即得到原代小鼠骨髓间充质干细胞。
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