BR112020003207A2

BR112020003207A2 - métodos de tratar um sujeito humano sofrendo de ou em risco de desenvolver doença do enxerto versus hospedeiro, hemorragia alveolar difusa e doença veno-oclusiva e de tratar, prevenir ou melhorar um ou mais sintomas neurológicos associados com a doença do enxerto versus hospedeiro ou microangiopatia trombótica associada com transplante de célula-tronco hematopoiética.

Info

Publication number: BR112020003207A2
Application number: BR112020003207-7A
Authority: BR
Inventors: Gregory A. Demopulos; Thomas Dudler; Hans-Wilhelm Schwaeble
Original assignee: Omeros Corporation; University Of Leicester
Priority date: 2017-08-15
Filing date: 2018-08-14
Publication date: 2020-10-06
Also published as: IL272674A; SG11202001014WA; MA49915A; JP2023123627A; US11896621B2; TW201920288A; US20190125802A1; EP3668531A1; KR20240105500A; CN111278449A; TW202402809A; US20240293465A1; US11013772B2; JOP20200021A1; MX2020001728A; CA3072940A1; CN118436776A; AU2018318982A2; KR102679441B1; GEP20237541B

Abstract

Em um aspecto, a invenção provê métodos de inibir os efeitos de ativação de complemento dependente de MASP-2 em um sujeito humano sofrendo de doença do enxerto versus hospedeiro e/ou hemorragia alveolar difusa e/ou doença veno-oclusiva associadas com um transplante de célula-tronco hematopoiética. Os métodos compreendem a etapa de administrar, a um sujeito em necessidade do mesmo, uma quantidade de um agente inibidor de MASP-2 eficaz para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2.

Description

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MÉTODOS DE TRATAR UM SUJEITO HUMANO SOFRENDO DE OU EM RISCO DE DESENVOLVER DOENÇA DO ENXERTO VERSUS HOSPEDEIRO, HEMORRAGIA ALVEOLAR DIFUSA E DOENÇA VENO-OCLUSIVA DECLARAÇÃO COM RESPEITO À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[001] A listagem de sequências associada com este pedido é provida no formato de texto em vez de uma cópia de papel e é por meio deste incorporada por referência no relatório descritivo. O nome do arquivo de texto contendo a listagem de sequências é MP_1_0278_PCT_SequenceListingasFiled_20180807; o arquivo txt tem 116 KB; foi criado em 7 de agosto de 2018, e está sendo submetido por intermédio de EFS-Web com o depósito do relatório descritivo.

FUNDAMENTOS

[002] O sistema de complemento provê um mecanismo de ação precoce para iniciar, amplificar e orquestrar a resposta imune à infecção microbiana e outros insultos agudos (M.K. Liszewski e J.P. Atkinson, 1993, em Fundamental Immunology, Terceira Edição, editado por W.E. Paul, Raven Press, Ltd., Nova Iorque), nos seres humanos e outros vertebrados. Embora a ativação de complemento proveja uma defesa de primeira linha valiosa contra patógenos potenciais, as atividades de complemento que promovem uma resposta imune protetiva também podem representar uma ameaça potencial para o hospedeiro (K.R. Kalli, et al., Springer Semin. Immunopathol. 15: 417-431, 1994; B.P. Morgan, Eur. J. Clinical Investig. 24: 219-228, 1994). Por exemplo, os produtos proteolíticos C3 e C5 recrutam e ativam neutrófilos. Embora indispensáveis para a defesa do hospedeiro, os neutrófilos ativados são indiscriminados na sua liberação de enzimas destrutivas e podem causar dano a órgão. Além disso, a ativação de complemento pode causar a deposição de componentes de complemento líticos nos arredores das células hospedeiras assim como nos alvos microbianos, resultando na lise da célula

2 / 394 hospedeira.

[003] O sistema de complemento também foi implicado na patogênese de numerosos estados de doença agudos e crônicos, incluindo: infartação miocárdica, acidente vascular cerebral, ARDS, lesão de reperfusão, choque séptico, vazamento capilar a seguir de queimaduras térmicas, inflamação após desvio cardiopulmonar, rejeição de transplante, artrite reumatoide, esclerose múltipla, miastenia grave e doença de Alzheimer. Em quase todas destas condições, o complemento não é a causa, mas é um dos diversos fatores envolvidos na patogênese. Não obstante, a ativação de complemento pode ser um mecanismo patológico principal e representa um ponto efetivo para o controle clínico em muitos destes estados de doença. O reconhecimento crescente da importância da lesão tecidual mediada por complemento em uma variedade de estados de doença ressalta a necessidade quanto a fármacos inibidores de complemento eficazes. Até agora, Eculizumab (Solaris®), um anticorpo contra C5, é o único fármaco alvejando complemento que foi aprovado para o uso humano. Até o momento, C5 é uma das diversas moléculas efetoras localizadas “a jusante” no sistema de complemento e o bloqueio de C5 não inibe a ativação do sistema de complemento. Portanto, um inibidor das etapas de iniciação da ativação de complemento teria vantagens significantes em relação a um inibidor de complemento “a jusante”.

[004] Atualmente, é amplamente aceito que o sistema de complemento pode ser ativado através de três caminhos distintos: o caminho clássico, o caminho da lectina e o caminho alternativo. O caminho clássico é usualmente deflagrado por um complexo composto de anticorpos hospedeiros ligados a uma partícula estranha (isto é, um antígeno) e assim requer exposição anterior a um antígeno para a geração de uma resposta de anticorpo específica. Visto que a ativação do caminho clássico depende de uma resposta imune adaptativa anterior pelo hospedeiro, o caminho clássico é parte do

3 / 394 sistema imune adquirido. Ao contrário, os caminhos tanto da lectina quanto alternativo são independentes da imunidade adaptativa e são parte do sistema imune inato.

[005] A ativação do sistema de complemento resulta na ativação sequencial de zimogênios da serina protease. A primeira etapa na ativação do caminho clássico é a ligação de uma molécula de reconhecimento específica, C1q, às moléculas de IgG e IgM ligadas a antígeno. C1q está associada com as proenzimas da serina protease Clr e Cls como um complexo chamado Cl. Na ligação de C1q a um complexo imune, a clivagem autoproteolítica do sítio Arg-Ile de Clr é seguido pela clivagem e ativação mediada por Clr de Cls, que assim adquire a capacidade para clivar C4 e C2. C4 é clivado em dois fragmentos, designados C4a e C4b, e, similarmente, C2 é clivado em C2a e C2b. Os fragmentos C4b são capazes de formar ligações covalentes com grupos hidroxila ou amino adjacentes e geram a C3 convertase (C4b2a) através da interação não covalente com o fragmento C2a de C2 ativado. A C3 convertase (C4b2a) ativa C3 pela clivagem proteolítica em subcomponentes C3a e C3b levando à geração da C5 convertase (C4b2a3b), que, pela clivagem de C5 leva à formação do complexo de ataque à membrana (C5b combinado com C6, C7, C8 e C-9, também aludido como “MAC”) que pode romper membranas celulares levando à lise celular. As formas ativadas de C3 e C4 (C3b e C4b) são covalentemente depositadas nas superfícies alvos estranhas, que são reconhecidas pelos receptores de complemento nos fagócitos múltiplos.

[006] Independentemente, a primeira etapa na ativação do sistema de complemento através do caminho da lectina também é a ligação das moléculas de reconhecimento específicas, que é seguida pela ativação de proenzimas da serina protease associadas. Entretanto, ao invés da ligação de complexos imunes pela C1q, as moléculas de reconhecimento no caminho da lectina compreendem um grupo de proteínas de ligação de carboidrato (lectina

4 / 394 de ligação de manana (MBL), H-ficolina, M-ficolina, L-ficolina e lectina tipo C CL-11), coletivamente aludidas como lectinas. Ver J. Lu et al., Biochim. Biophys. Acta 1572: 387-400, (2002); Holmskov et al., Annu. Rev. Immunol. 21: 547-578 (2003); Teh et al., Immunology 101:225-232 (2000)). Ver também J. Luet et al., Biochim Biophys Acta 1572: 387-400 (2002); Holmskov et al, Annu Rev Immunol 21: 547-578 (2003); Teh et al., Immunology 101:225-232 (2000); Hansen et al, J. Immunol 185(10): 6096- 6104 (2010).

[007] Ikeda et al. primeiro demonstraram que, como C1q, MBL ativaria o sistema de complemento na ligação aos eritrócitos revestidos com a levedura manana em uma maneira dependente de C4 (Ikeda et al., J. Biol. Chem. 262: 7451-7454, (1987)). MBL, um membro da família da proteína colectina, é uma lectina dependente de cálcio que liga carboidratos com 3 e 4 grupos hidróxi orientados no plano equatorial do anel de piranose. Os ligantes proeminentes para MBL são assim D-manose e N-acetil-D-glicosamina, enquanto os carboidratos não se encaixam nesta exigência estérica têm afinidade indetectável para MBL (Weis et al., Nature 360: 127-134, (1992)). A interação entre MBL e açúcares monovalentes é extremamente fraca, com constantes de dissociação tipicamente na faixa milimolar de dígito único. MBL alcança ligação firme, específica aos ligantes de glicano pela avidez, isto é, pela interação simultânea com resíduos de monossacarídeos múltiplos localizados em proximidade imediata um do outro (Lee et al., Archiv. Biochem. Biophys. 299: 129-136, (1992)). MBL reconhece os padrões de carboidrato que habitualmente decoram microrganismos tais como bactérias, leveduras, parasitas e certos vírus. Ao contrário, MBL não reconhece D- galactose e ácido siálico, o penúltimo e último açúcares que usualmente decoram glicoconjugados complexos “maduros” presentes no plasma mamífero e glicoproteínas de superfície celular. Esta especificidade de ligação é considerada promover o reconhecimento de superfícies “estranha” e ajudam

5 / 394 a proteger da “autoativação.” Entretanto, MBL se liga com alta afinidade aos agrupamentos de glicanos “precursores” com alto teor de manose nas glicoproteínas e glicolipídeos ligados a N sequestrados no retículo endoplasmático e aparelho de Golgi de células mamíferas (Maynard et al., J. Biol. Chem. 257: 3788-3794, (1982)). Portanto, as células danificadas são alvos potenciais para a ativação do caminho da lectina por intermédio da ligação de MBL.

[008] As ficolinas possuem um tipo diferente de domínio da lectina do que MBL, chamado de domínio igual ao fibrinogênio. As ficolinas se ligam aos resíduos de açúcar em uma maneira independente de Ca++. Nos seres humanos, três tipos de ficolinas (L-ficolina, M-ficolina e H-ficolina) foram identificados. As duas ficolinas séricas, L-ficolina e H-ficolina, têm em comum uma especificidade para a N-acetil-D-glicosamina; entretanto, a H- ficolina também liga N-acetil-D-galactosamina. A diferença na especificidade do açúcar da L-ficolina, H-ficolina, CL-11 e MBL significa que as lectinas diferentes podem ser complementares e diferentes nos glicoconjugados alvos, embora sobrepondo-se. Este conceito é sustentado pelo relato recente de que, das lectinas conhecidas no caminho da lectina, apenas a L-ficolina se liga especificamente ao ácido lipoteicoico, um glicoconjugado da parede celular encontrado em todas as bactérias Gram positivas (Lynch et al., J. Immunol. 172: 1198-1202, (2004)). As colectinas (isto é, MBL) e as ficolinas não carregam similaridade significante na sequência de aminoácidos. Entretanto, os dois grupos de proteínas têm organizações de domínio similares e, igual C1q, montam em estruturas oligoméricas, que maximizam a possibilidade de ligação de sítio múltiplo.

[009] As concentrações séricas de MBL são altamente variáveis nas populações saudáveis e isto é geneticamente controlado pelos polimorfismos/ mutações nas regiões tanto promotoras quanto codificadoras do gene MBL. Como uma proteína de fase aguda, a expressão de MBL é suprarregulada

6 / 394 adicionalmente durante a inflamação. A L-ficolina está presente no soro em concentrações similares àquelas de MBL. Portanto, o ramo da L-ficolina do caminho da lectina é potencialmente comparável ao braço MBL na intensidade. MBL e ficolinas também podem funcionar como opsoninas, que permitem que os fagócitos alvejem as superfícies decoradas com MBL e ficolina (ver Jack et al., J Leukoc Biol., 77(3): 328-36 (2004), Matsushita e Fujita, Immunobiology, 205(4-5): 490-7 (2002), Aoyagi et al., J Immunol, 174(1): 418-25(2005). Esta opsonização requer a interação destas proteínas com receptores fagocíticos (Kuhlman et al., J. Exp. Med. 169: 1733, (1989); Matsushita et al., J. Biol. Chem. 271:2448-54, (1996)), a identidade dos quais não foi estabelecida.

[0010] A MBL humana forma uma interação específica e de alta afinidade através do seu domínio igual a colágeno com serinas proteases iguais a C1r/Cls únicas, denominadas serina proteases associadas com MBL (MASPs). Até agora, três MASPs foram descritas. Primeiro, uma enzima “MASP” única foi identificada e distinguida como a enzima responsável pela iniciação da cascata de complemento (isto é, clivagem de C2 e C4) (Matsushita et al., J Exp Med 176(6): 1497-1502 (1992); Ji et al., J. Immunol. 150: 571-578, (1993)). Foi subsequentemente determinado que a atividade de MASP foi, de fato, uma mistura de duas proteases: MASP-1 e MASP-2 (Thiel et al., Nature 386: 506-510, (1997)). Entretanto, foi demonstrado que o complexo MBL-MASP-2 sozinho é suficiente para a ativação de complemento (Vorup-Jensen et al., J. Immunol. 165: 2093-2100, (2000)). Além disso, apenas MASP-2 clivou C2 e C4 em altas taxas (Ambrus et al., J. Immunol. 170: 1374-1382, (2003)). Portanto, MASP-2 é a protease responsável pela ativação de C4 e C2 para gerar a C3 convertase, C4b2a. Esta é uma diferença significante do complexo do caminho clássico C1, onde a ação coordenada de duas serina proteases específicas (C1r e C1s) leva à ativação do sistema de complemento. Além disso, uma terceira nova protease,

7 / 394 MASP-3, foi isolada (Dahl, M.R., et al., Immunity 15: 127-35, 2001). MASP- 1 e MASP-3 são alternativamente produtos unidos do mesmo gene.

[0011] MASPs compartilha organizações de domínio idêntico com aqueles de Clr e Cls, os componentes enzimáticos do complexo Cl (Sim et al., Biochem. Soc. Trans. 28: 545, (2000)). Estes domínios incluem um domínio da proteína Clr/Cls/VEGF de ouriço-do-mar/óssea de terminal N (CUB), um domínio igual ao fator de crescimento epidérmico, um segundo domínio CUB, um tandem de domínios de proteína de controle de complemento e um domínio de serina protease. Como nas proteases C1, a ativação de MASP-2 ocorre através da clivagem de uma ligação de Arg-Ile adjacente ao domínio de serina protease, que divide a enzima em cadeias A e B ligadas a dissulfeto, a última consistindo do domínio de serina protease.

[0012] MBL também pode associar com uma forma alternativamente fatiada de MASP-2, conhecida como proteína associada a MBL de 19 kDa (MAp19) ou proteína pequena associada a MBL (sMAP), que carece da atividade catalítica de MASP2. (Stover, J. Immunol. 162: 3481-90, (1999); Takahashi et al., Int. Immunol. 11: 859-863, (1999)). MAp19 compreende os primeiros dois domínios de MASP-2, seguida por uma sequência extra de quatro aminoácidos únicos. A função de Map19 é incerta (Degn et al., J Immunol. Methods, 2011). Os genes de MASP-1 e MASP-2 estão localizados nos cromossomas humanos 3 e 1, respectivamente (Schwaeble et al., Immunobiology 205: 455-466, (2002)).

[0013] Diversas linhas de evidência sugerem que existem complexos de MBL-MASP diferentes e uma grande fração dos MASPs no soro não é complexada com MBL (Thiel, et al., J. Immunol. 165: 878-887, (2000)). Tanto H- quanto L-ficolina se ligam a todos MASPs e ativam o caminho de complemento de lectina, como o faz a MBL (Dahl et al., Immunity 15: 127- 35, (2001); Matsushita et al., J. Immunol. 168: 3502-3506, (2002)). Os caminhos tanto da lectina quanto o clássico formam uma C3 convertase

8 / 394 comum (C4b2a) e os dois caminhos convergem nesta etapa.

[0014] O caminho da lectina é amplamente considerado ter um papel principal na defesa do hospedeiro contra infecção no hospedeiro ingênuo. Evidência forte quanto ao envolvimento da MBL na defesa do hospedeiro origina-se da análise de pacientes com níveis séricos diminuídos de MBL funcional (Kilpatrick, Biochim. Biophys. Acta 1572: 401-413, (2002)). Tais pacientes exibem susceptibilidade para infecções bacterianas e fúngicas recorrentes. Estes sintomas são usualmente evidentes, durante uma janela aparente de vulnerabilidade conforme o título de anticorpo maternalmente derivado declina, mas antes que um repertório completo de respostas de anticorpo se desenvolva. Esta síndrome frequentemente resulta de mutações em diversos sítios na porção de colágeno de MBL, que interfere com a formação apropriada de oligômeros de MBL. Entretanto, visto que MBL pode funcionar como uma opsonina independente de complemento, não é conhecido em qual grau a susceptibilidade aumentada à infecção é devida à ativação de complemento prejudicada.

[0015] Ao contrário dos caminhos clássico e da lectina, nenhum dos iniciadores do caminho alternativo foi verificado satisfazer as funções de reconhecimento que C1q e lectinas realizam nos outros dois caminhos. Atualmente, é amplamente aceito que o caminho alternativo espontaneamente passa por um nível baixo de ativação de metabolização, que pode ser facilmente amplificado na superfície estranha ou outras superfícies anormais (bactérias, levedura, células viralmente infectadas ou tecido danificado) que carece dos elementos moleculares apropriados que mantém a ativação de complemento espontânea sob controle. Existem quatro proteínas plasmáticas diretamente envolvidas na ativação do caminho alternativo: C3, fatores B e D e properdina.

[0016] Embora existam evidências extensivas implicando os caminhos de complemento tanto clássico quanto alternativo na patogênese de

9 / 394 doenças humanas não infecciosas, o papel do caminho da lectina está apenas começando a ser avaliado. Estudos recentes provêem evidência de que a ativação do caminho da lectina pode ser responsável pela ativação de complemento e inflamação relacionada com a lesão de isquemia/reperfusão. Collard et al. (2000) relatou que as células endoteliais cultivadas submetidas ao estresse oxidativo ligam MBL e mostram deposição de C3 na exposição ao soro humano (Collard et al., Am. J. Pathol. 156: 1549-1556, (2000)). Além disso, o tratamento de soros humanos com anticorpos monoclonais anti-MBL bloqueadores inibiu a ligação de MBL e a ativação de complemento. Estas verificações foram estendidas para um modelo de rato de isquemia-reperfusão miocárdicas em que os ratos tratados com um anticorpo bloqueador direcionado contra MBL de rato mostrou significantemente menos dano miocárdico na oclusão de uma artéria coronariana do que os ratos tratados com um anticorpo de controle (Jordan et al., Circulation 104: 1413-1418, (2001)). O mecanismo molecular de ligação de MBL ao endotélio vascular depois do estresse oxidativo é incerto; um estudo recente sugere que a ativação do caminho da lectina depois do estresse oxidativo pode ser mediado pela ligação de MBL às citoqueratinas endoteliais vasculares e não aos glicoconjugados (Collard et al., Am. J. Pathol. 159: 1045-1054, (2001)). Outros estudos têm implicado os caminhos clássicos e alternativos na patogênese da lesão de isquemia/reperfusão e o papel do caminho da lectina nesta doença permanece controversa (Riedermann, N.C., et al., Am. J. Pathol. 162: 363-367, 2003).

[0017] Um estudo recente tem mostrado que MASP-1 (e possivelmente também MASP-3) é requerido para converter o Fator D da enzima de ativação do caminho alternativo da sua forma zimogênica para a sua forma enzimaticamente ativa (ver Takahashi M. et al., J Exp Med 207(1): 29-37 (2010)). A importância fisiológica deste processo é enfatizada pela ausência de atividade funcional do caminho alternativo no plasma de

10 / 394 camundongos deficientes em MASP-1/3. A geração proteolítica de C3b a partir do C3 nativo é requerido para o caminho alternativo funcionar. Visto que a C3 convertase do caminho alternativo (C3bBb) contém C3b como uma subunidade essencial, a questão com referência à origem do primeiro C3b por intermédio do caminho alternativo tem apresentado um problema intrigante e tem estimulado pesquisa considerável.

[0018] C3 pertence a uma família de proteínas (junto com C4 e α-2 macroglobulina) que contém uma rara modificação pós-translacional conhecida como uma ligação de tioéster. O grupo tioéster é composto de uma glutamina cujo grupo carbonila terminal forma uma ligação de tioéster covalente com o grupo sulfidrila de uma cisteína de três aminoácidos ausente. Esta ligação é instável e o glutamil-tioéster eletrofílico pode reagir com porções nucleofílicas tais como grupos hidroxila ou amino e assim formar uma ligação covalente com outras moléculas. A ligação de tioéster é razoavelmente estável quando sequestrada dentro de uma bolsa hidrofóbica de C3 intacto. Entretanto, a clivagem proteolítica de C3 para C3a e C3b resulta na exposição da ligação de tioéster altamente reativa no C3b e, seguindo o ataque nucleofílico pelas porções adjacentes compreendendo grupos hidroxila ou amino, C3b torna-se covalentemente ligado a um alvo. Além do seu papel bem documentado na união covalente de C3b com alvos de complemento, o tioéster de C3 também é considerado ter um papel central na deflagração do caminho alternativo. De acordo com a “teoria do tick-over” amplamente aceita, o caminho alternativo é iniciado pela geração de uma convertase de fase fluida, iC3Bb, que é formada a partir de C3 com tioéster hidrolisado (iC3; C3(H2O)) e fator B (Lachmann, P.J., et al., Springer Semin. Immunopathol. 7: 143-162, (1984)). O C3(H2O) tipo C3b é gerado de C3 nativo por uma hidrólise lenta espontânea do tioéster interno na proteína (Pangburn, M.K., et al., J. Exp. Med. 154: 856-867, 1981). Através da atividade da C3(H2O)Bb convertase, as moléculas de C3b são depositadas

11 / 394 sobre a superfície alvo iniciando assim o caminho alternativo.

[0019] Muito pouco é conhecido acerca dos iniciadores de ativação do caminho alternativo. Os ativadores são considerados incluir paredes de célula de levedura (zimosana), muitos polissacarídeos puros, eritrócitos de coelho, certas imunoglobulinas, vírus, fungos, bactérias, células de tumor de animal, parasitas e células danificadas. O único traço comum entre estes ativadores é a presença de carboidrato, mas a complexidade e variedade das estruturas de carboidrato tem tornado difícil estabelecer os determinantes moleculares compartilhados que são reconhecidos. Foi amplamente aceito que a ativação do caminho alternativo é controlado através do equilíbrio fino entre componentes regulatórios inibidores deste caminho, tais como o Fator H, Fator I, DAF e CR1 e properdina, que é o único regulador positivo do caminho alternativo (ver Schwaeble W.J. e Reid K.B., Immunol Today 20(1): 17-21 (1999)).

[0020] Além do mecanismo de ativação aparentemente desregulado descrito acima, o caminho alternativo também pode prover uma alça de amplificação poderosa para o caminho da lectina/clássico C3 convertase (C4b2a) visto que o C3b gerado pode participar com o fator B na formação da C3 convertase do caminho alternativo adicional (C3bBb). O caminho alternativo da C3 convertase é estabilizado pela ligação de properdina. A properdina prolonga a meia vida da C3 convertase do caminho alternativo de seis a dez vezes. A adição de C3b à C3 convertase do caminho alternativo leva à formação da C5 convertase do caminho alternativo.

[0021] Todos os três caminhos (isto é, o clássico, o da lectina e o alternativo) foram julgados convergir em C5, que é clivado para formar produtos com múltiplos efeitos pró-inflamatórios. O caminho convergido foi aludido como o caminho de complemento terminal. C5a é a anafilatoxina mais potente, induzindo alterações no músculo liso e tônus vascular, assim como na permeabilidade vascular. O mesmo também é uma quimiotaxina

12 / 394 poderosa e o ativador tanto de neutrófilos quanto de monócitos. A ativação celular mediada por C5a pode significantemente amplificar respostas inflamatórias pela indução da liberação de múltiplos mediadores inflamatórios adicionais, incluindo citocinas, enzimas hidrolíticas, metabólitos do ácido araquidônico e espécies de oxigênio reativo. A clivagem de C5 leva à formação de C5b-9, também conhecido como o complexo de ataque à membrana (MAC). Existe agora forte evidência de que a deposição sublítica de MAC possa desempenhar um papel importante na inflamação além do seu papel como um complexo lítico de formação de poro.

[0022] Além do seu papel essencial na defesa imune, o sistema de complemento contribui para o dano tecidual em muitas condições clínicas. Assim, existe uma necessidade urgente para desenvolver inibidores de complemento terapeuticamente eficazes para prevenir estes efeitos adversos.

SUMÁRIO

[0023] Este sumário é provido para introduzir uma seleção de conceitos em uma forma simplificada que são adicionalmente descritos abaixo na Descrição Detalhada. Este sumário não é intencionado a identificar traços chaves do assunto reivindicado, nem é intencionado a ser usado como uma ajuda na determinação do escopo do assunto reivindicado.

[0024] Em um aspecto, a presente invenção provê um método de inibir lesão microvascular de célula endotelial e/ou formação de trombo em um sujeito sofrendo de uma microangiopatia trombótica (TMA) compreendendo administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um anticorpo inibidor de MASP-2 eficaz para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2. Em algumas modalidades, o sujeito está sofrendo de ou em risco de desenvolver uma TMA selecionada do grupo consistindo de síndrome urêmica hemolítica (aHUS), púrpura trombocitopênica trombótica (TTP) e síndrome urêmica hemolítica atípica (HUS). Em algumas modalidades, antes da administração da composição o

13 / 394 sujeito é determinado exibir um ou mais sintomas selecionados do grupo consistindo de (i) anemia, (ii) trombocitopenia (iii) insuficiência renal e (iv) aumento da creatinina e a composição é administrada em uma quantidade eficaz e durante um período de tempo suficiente para melhorar o dito um ou mais sintomas. Em algumas modalidades, o agente inibidor de MASP-2 é um anticorpo anti-MASP-2 ou fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, o agente inibidor de MASP-2 é um anticorpo monoclonal anti-MASP-2 ou fragmento do mesmo que especificamente se liga a uma porção da SEQ ID NO: 6. Em algumas modalidades, o agente inibidor de MASP-2 inibe a lesão microvascular de célula endotelial.

[0025] Em um outro aspecto, a invenção provê um método de inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2 em um sujeito sofrendo de ou em risco de desenvolver síndrome urêmica hemolítica atípica (aHUS), compreendendo administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um agente inibidor de MASP-2 eficaz para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2. Em uma modalidade, antes da administração da composição o sujeito é determinado exibir um ou mais sintomas selecionados do grupo consistindo de (i) anemia, (ii) trombocitopenia (iii) insuficiência renal e (iv) aumento da creatinina e a composição é administrada em uma quantidade eficaz e durante um período de tempo suficiente para melhorar o dito um ou mais sintomas. Em uma modalidade, o sujeito está sofrendo de ou em risco de desenvolver aHUS não dependente do Fator H. Em uma modalidade, o sujeito está sofrendo de aHUS associada com fator I, fator B ou cofator de membrana CD46. Em uma modalidade, o agente inibidor de MASP-2 é um anticorpo anti-MASP-2 ou fragmento do mesmo, tal como um anticorpo monoclonal anti-MASP-2 ou fragmento do mesmo que especificamente se liga a uma porção da SEQ ID NO: 6. Em uma modalidade, o agente inibidor de MASP-2 inibe a lesão microvascular de célula endotelial. Em uma modalidade, o agente inibidor de

14 / 394 MASP-2 inibe a formação de trombo.

[0026] Em um outro aspecto, a invenção provê um método para reduzir a probabilidade de que um sujeito em risco de desenvolver síndrome urêmica hemolítica atípica (aHUS) sofrerá de sintomas clínicos associados com aHUS. O método de acordo com este aspecto da invenção compreende (a) determinar a presença de um marcador genético no sujeito conhecido estar associado com aHUS; (b) periodicamente monitorar o sujeito para determinar a presença ou ausência de pelo menos um sintoma selecionado do grupo consistindo de anemia, trombocitopenia, insuficiência renal e aumento da creatinina; e (c) administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um agente inibidor de MASP-2 eficaz para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2 na determinação da presença de pelo menos um de anemia, trombocitopenia, insuficiência renal ou aumento da creatinina, em que a composição é administrada em uma quantidade eficaz e durante um período de tempo suficiente para melhorar o dito um ou mais sintomas. Em uma modalidade, o agente inibidor de MASP-2 é um anticorpo anti-MASP-2 ou fragmento do mesmo, tal como um anticorpo monoclonal anti-MASP-2 ou fragmento do mesmo que especificamente se liga a uma porção da SEQ ID NO: 6. Em uma modalidade do método, a etapa (a) compreende realizar um teste de triagem genética em uma amostra obtida do sujeito e identificar a presença de pelo menos um marcador genético associado com aHUS em um gene selecionado do grupo consistindo de fator de complemento H (CFH), fator I (CFI), fator B (CFB), cofator de membrana CD46, C3, proteína relacionada com o fator H de complemento (CFHR1), proteína anticoagulante trombodulina (THBD), proteína relacionada com o fator H de complemento 3 (CFHR3) e proteína relacionada com o fator H de complemento 4 (CFHR4). Em uma modalidade, o método compreende ainda monitorar o sujeito quanto à ocorrência de um evento conhecido estar associado com a deflagração de sintomas clínicos da aHUS e administrar ao

15 / 394 sujeito a composição compreendendo o agente inibidor de MASP-2 antes, durante ou depois da ocorrência da deflagração do evento. Em uma modalidade, o evento associado com a deflagração de sintomas clínicos da aHUS é selecionado do grupo consistindo de exposição a fármaco, infecção, malignidade, lesão, transplante de órgão ou tecido e gravidez. Em uma modalidade, a infecção é uma infecção bacteriana. Em uma modalidade, a composição é administrada subcutaneamente. Em uma modalidade, o agente inibidor de MASP-2 inibe a lesão microvascular de célula endotelial. Em uma modalidade, o agente inibidor de MASP-2 inibe a formação de trombo.

[0027] Em um outro aspecto, a invenção provê um método de inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2 em um sujeito sofrendo de ou em risco de desenvolver, síndrome urêmica hemolítica atípica (aHUS) secundária a uma infecção, compreendendo administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um agente inibidor de MASP-2 eficaz para inibir a ativação de complemento de MASP-2. Em uma modalidade, o sujeito está sofrendo de ou em risco de desenvolver aHUS não entérica associada com uma infecção pela S. pneumoniae. Em uma modalidade, o agente inibidor de MASP-2 é um anticorpo anti-MASP-2 ou fragmento do mesmo, tal como um anticorpo monoclonal anti-MASP-2 ou fragmento do mesmo que especificamente se liga a uma porção da SEQ ID NO: 6. Em uma modalidade, o agente inibidor de MASP-2 inibe a lesão microvascular de célula endotelial. Em uma modalidade, o agente inibidor de MASP-2 inibe a formação de trombo.

[0028] Em um outro aspecto, a invenção provê um método de tratar um sujeito sofrendo de síndrome urêmica hemolítica atípica (aHUS) compreendendo administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um agente inibidor de MASP-2 eficaz para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2, em que a administração do agente inibidor de MASP-2 é administrado por intermédio de um cateter intravenoso

16 / 394 ou outro método de distribuição por cateter. Em uma modalidade, o método compreende ainda tratar o paciente com plasmaférese. Em uma modalidade, a composição compreendendo o agente inibidor de MASP-2 é administrado na ausência de plasmaférese. Em uma modalidade, a composição compreendendo o agente inibidor de MASP-2 é administrado por intermédio de um cateter durante um primeiro período de tempo, compreendendo adicionalmente administrar a composição compreendendo o agente inibidor de MASP-2 durante um segundo período de tempo, em que a composição é administrada subcutaneamente durante o segundo período de tempo. Em uma modalidade, o método compreende ainda periodicamente determinar o nível de pelo menos um fator de complemento, em que a determinação de um nível reduzido do pelo menos um fator de complemento em comparação a um valor padrão ou um sujeito saudável é indicativo da necessidade quanto ao tratamento continuado com a composição. Em uma modalidade, o agente inibidor de MASP-2 é um anticorpo anti-MASP-2 ou fragmento do mesmo, tal como um anticorpo monoclonal anti-MASP-2 ou fragmento do mesmo que especificamente se liga a uma porção da SEQ ID NO: 6. Em uma modalidade, o agente inibidor de MASP-2 inibe a lesão microvascular de célula endotelial. Em uma modalidade, o agente inibidor de MASP-2 inibe a formação de trombo.

[0029] Em um outro aspecto, a invenção provê um método de tratar um sujeito sofrendo de púrpura trombocitopênica trombótica (TTP) ou exibindo sintomas compatíveis com um diagnóstico de TTP, compreendendo administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um agente inibidor de MASP-2 eficaz para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2, em que a administração do agente inibidor de MASP-2 é administrado ao sujeito por intermédio de um cateter intravenoso ou outro método de distribuição por cateter. Em uma modalidade, o sujeito exibe pelo menos um ou mais sintomas selecionados do grupo consistindo de

17 / 394 envolvimento do sistema nervoso central, trombocitopenia, envolvimento cardíaco severo, envolvimento pulmonar severo, infartação gastrointestinal e gangrena. Em uma modalidade, o sujeito testa positivo quanto à presença de um inibidor de ADAMTS13 e o método compreende ainda administrar um imunossupressor ao sujeito. Em uma modalidade, a composição compreendendo o agente inibidor de MASP-2 é administrado durante um primeiro período de tempo na ausência de plasmaférese. Em uma modalidade, o sujeito testa positivo quanto à presença de um inibidor de ADAMTS-13 e o método compreende ainda administrar ADAMTS-13. Em uma modalidade, o método compreende ainda tratar o paciente com plasmaférese. Em uma modalidade, a composição compreendendo o agente inibidor de MASP-2 é administrado na presença de plasmaférese. Em uma modalidade, a composição compreendendo o agente inibidor de MASP-2 é administrado por intermédio de um cateter durante um primeiro período de tempo, compreendendo adicionalmente administrar a composição compreendendo o agente inibidor de MASP-2 durante um segundo período de tempo, em que a composição é administrada subcutaneamente durante o segundo período de tempo. Em uma modalidade, o método compreende ainda periodicamente determinar o nível de pelo menos um fator de complemento, em que a determinação de um nível reduzido do pelo menos um fator de complemento em comparação a um valor padrão ou um sujeito saudável é indicativo da necessidade quanto ao tratamento continuado com a composição. Em uma modalidade, o agente inibidor de MASP-2 é um anticorpo anti-MASP-2 ou fragmento do mesmo, tal como um anticorpo monoclonal anti-MASP-2 ou fragmento do mesmo que especificamente se liga a uma porção da SEQ ID NO: 6. Em uma modalidade, o agente inibidor de MASP-2 inibe a lesão microvascular de célula endotelial. Em uma modalidade, o agente inibidor de MASP-2 inibe a formação de trombo.

[0030] Em um outro aspecto, a invenção provê um método de tratar

18 / 394 um sujeito sofrendo de púrpura trombocitopênica trombótica (TTP) refratária compreendendo administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um agente inibidor de MASP-2 eficaz para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2. Em uma modalidade, a composição é administrada subcutaneamente. Em uma modalidade, o método compreende ainda periodicamente determinar o nível de pelo menos um fator de complemento, em que a determinação de um nível reduzido do pelo menos um fator de complemento em comparação a um valor padrão ou um sujeito saudável é indicativo da necessidade quanto ao tratamento continuado com a composição. Em uma modalidade, o agente inibidor de MASP-2 é um anticorpo anti-MASP-2 ou fragmento do mesmo, tal como um anticorpo monoclonal anti-MASP-2 ou fragmento do mesmo que especificamente se liga a uma porção da SEQ ID NO: 6. Em uma modalidade, o agente inibidor de MASP-2 inibe a lesão microvascular de célula endotelial. Em uma modalidade, o agente inibidor de MASP-2 inibe a formação de trombo.

[0031] Em um outro aspecto, a presente invenção provê um método de inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2 em um sujeito sofrendo de ou em risco de desenvolver uma microangiopatia trombótica (TMA), em que a TMA é pelo menos uma de (i) uma TMA secundária ao câncer; (ii) uma TMA secundária à quimioterapia ou (iii) uma TMA secundária a transplante, compreendendo administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um agente inibidor de MASP-2 eficaz para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-

2. Em algumas modalidades, o sujeito está sofrendo de ou está em risco de desenvolver uma TMA secundária ao câncer e o agente inibidor de MASP-2 é administrado sistemicamente ao sujeito em uma quantidade eficaz para reduzir o risco de desenvolver TMA ou reduzir a severidade de TMA. Em algumas modalidades, o sujeito está sofrendo de ou está em risco de desenvolver uma TMA secundária à quimioterapia e o agente inibidor de

19 / 394 MASP-2 é administrado sistemicamente ao sujeito antes, durante ou depois da quimioterapia, em uma quantidade eficaz para reduzir o risco de desenvolver TMA ou reduzir a severidade de TMA. Em algumas modalidades, o sujeito está sofrendo de ou está em risco de desenvolver uma TMA secundária ao transplante e o agente inibidor de MASP-2 é administrado sistemicamente ao sujeito antes, durante ou depois do procedimento de transplante, em uma quantidade eficaz para reduzir o risco de desenvolver TMA ou reduzir a severidade de TMA. Em algumas modalidades o procedimento de transplante é um transplante alogênico de célula-tronco hematopoiética. Em algumas modalidades, o sujeito anteriormente passou ou está atualmente passando por tratamento com um inibidor de complemento de terminal que inibe a clivagem da proteína de complemento C5. Em algumas modalidades, o método compreende ainda administrar ao sujeito um inibidor de complemento de terminal que inibe a clivagem da proteína de complemento C5, tal como um anticorpo anti-C5 humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, tal como eculizumab.

[0032] Em um outro aspecto, a invenção provê um método de inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2 em um sujeito sofrendo de ou em risco de desenvolver a Síndrome de Upshaw-Schulman (USS) compreendendo administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um agente inibidor de MASP-2 eficaz para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2. Em algumas modalidades, o método compreende tratar um sujeito em risco de desenvolver USS, em que o método compreende administrar uma quantidade de um agente inibidor de MASP-2 durante um período de tempo eficaz para melhorar ou prevenir um ou mais sintomas clínicos associados com TTP. Em algumas modalidades, o método compreende ainda periodicamente monitorar o sujeito e administrar o agente inibidor de MASP-2 na presença de um evento conhecido estar associado com a deflagração de sintomas clínicos de TTP. Em algumas modalidades, o

20 / 394 método compreende ainda periodicamente monitorar o sujeito e administrar o agente inibidor de MASP-2 na determinação da presença de anemia, trombocitopenia ou elevação da creatinina. Em algumas modalidades, o sujeito anteriormente passou ou está atualmente passando por tratamento com um inibidor de complemento de terminal que inibe a clivagem da proteína de complemento C5. Em algumas modalidades, o método compreende ainda administrar ao sujeito um inibidor de complemento de terminal que inibe a clivagem da proteína de complemento C5, tal como um anticorpo anti-C5 humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, tal como eculizumab.

[0033] Em um outro aspecto, a invenção provê um método de inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2 em um sujeito sofrendo da doença de Degos, compreendendo administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um agente inibidor de MASP-2 eficaz para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2. Em algumas modalidades, o sujeito anteriormente passou ou está atualmente passando por tratamento com um inibidor de complemento de terminal que inibe a clivagem da proteína de complemento C5. Em algumas modalidades, o método compreende ainda administrar ao sujeito um inibidor de complemento de terminal que inibe a clivagem da proteína de complemento C5, tal como um anticorpo anti-C5 humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, tal como eculizumab.

[0034] Em um outro aspecto, a invenção provê um método de inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2 em um sujeito sofrendo de Síndrome Antifosfolipídica Catastrófica (CAPS), compreendendo administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um agente inibidor de MASP-2 eficaz para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2. Em algumas modalidades, o sujeito anteriormente passou ou está atualmente passando por tratamento com um inibidor de complemento de

21 / 394 terminal que inibe a clivagem da proteína de complemento C5. Em algumas modalidades, o método compreende ainda administrar ao sujeito um inibidor de complemento de terminal que inibe a clivagem da proteína de complemento C5, tal como um anticorpo anti-C5 humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, tal como eculizumab.

[0035] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos divulgados da invenção, o agente inibidor de MASP-2 é um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, o anticorpo inibidor de MASP-2 tem função efetora reduzida. Em algumas modalidades, o anticorpo inibidor de MASP-2 não inibe substancialmente o caminho clássico. Em algumas modalidades, o agente inibidor de MASP-2 é um anticorpo monoclonal anti-MASP-2 ou fragmento do mesmo que especificamente se liga a uma porção da SEQ ID NO: 6. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-MASP-2 ou fragmento do mesmo é selecionado do grupo consistindo de um anticorpo recombinante, um anticorpo tendo função efetora reduzida, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado e um anticorpo humano. Em algumas modalidades, o anticorpo inibidor de MASP-2 é um fragmento de anticorpo selecionado do grupo consistindo de Fv, Fab, Fab’, F(ab)2 e F(ab’)2. Em algumas modalidades, o anticorpo inibidor de MASP-2 é uma molécula de cadeia única. Em algumas modalidades, o anticorpo inibidor de MASP-2 é selecionado do grupo consistindo de uma molécula de IgG1, uma de IgG2 e uma molécula de IgG4. Em algumas modalidades, o anticorpo inibidor de MASP-2 é uma molécula de IgG4 compreendendo uma mutação S228P. Em algumas modalidades, o anticorpo inibidor de MASP-2 se liga à MASP-2 humana com um KD de 10 nM ou menos. Em algumas modalidades, o anticorpo inibidor de MASP-2 liga um epítopo no domínio CCP1 de MASP-

2. Em algumas modalidades, o anticorpo inibidor de MASP-2 inibe a deposição de C3b em um ensaio in vitro soro humano a 1% em uma IC50 de 10 nM ou menos. Em algumas modalidades, o anticorpo inibidor de MASP-2

22 / 394 inibe a deposição de C3b em soro humano a 90% com uma IC50 de 30 nM ou menos.

[0036] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos divulgados da invenção o anticorpo monoclonal inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo: i) uma CDR-H1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de 31 a 35 da SEQ ID NO: 67; e ii) uma CDR-H2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de 50 a 65 da SEQ ID NO: 67; e iii) uma CDR-H3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de 95 a 102 da SEQ ID NO: 67 e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo: i) uma CDR-L1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de 24 a 34 da SEQ ID NO: 70; e ii) uma CDR-L2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de 50 a 56 da SEQ ID NO: 70; e iii) uma CDR-L3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de 89 a 97 da SEQ ID NO: 70. Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal inibidor de MASP-2 compreende uma região variável de cadeia pesada apresentada como SEQ ID NO: 67 e uma região variável de cadeia leve apresentada como SEQ ID NO: 70. Em algumas modalidades, o anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo especificamente reconhece pelo menos parte de um epítopo reconhecido por um anticorpo de referência compreendendo uma região variável de cadeia pesada como apresentada na SEQ ID NO: 67 e uma região variável de cadeia leve como apresentada na SEQ ID NO: 70.

[0037] Em um outro aspecto da invenção, métodos são providos para inibir a formação de trombo em um sujeito sofrendo de síndrome urêmica hemolítica atípica (aHUS), compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo para inibir a ativação de complemento

23 / 394 dependente de MASP-2. Em algumas modalidades, o anticorpo inibidor de MASP-2 inibe a formação de trombo no soro de um sujeito sofrendo de aHUS em pelo menos 40% quando comparado com o soro não tratado. Em algumas modalidades, o anticorpo inibidor de MASP-2 inibe a formação de trombo no soro de um sujeito sofrendo de aHUS em um nível de pelo menos 20% maior (por exemplo, pelo menos 30% maior, pelo menos 40% maior ou pelo menos 50% maior) do que o seu efeito inibidor sobre a deposição de C5b-9 no soro do mesmo sujeito. Em algumas modalidades, o sujeito está na fase aguda de aHUS. Em algumas modalidades, o sujeito está na fase de remissão de aHUS. Em algumas modalidades, o anticorpo inibidor de MASP-2 é um anticorpo monoclonal ou fragmento do mesmo que especificamente se liga a uma porção da SEQ ID NO: 6. Em algumas modalidades, o anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento do mesmo é selecionado do grupo consistindo de um anticorpo recombinante, um anticorpo tendo função efetora reduzida, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado e um anticorpo humano. Em algumas modalidades, o anticorpo inibidor de MASP-2 é um fragmento de anticorpo selecionado do grupo consistindo de Fv, Fab, Fab’, F(ab)2 e F(ab’)2. Em algumas modalidades, o anticorpo inibidor de MASP-2 é uma molécula de cadeia única. Em algumas modalidades, o anticorpo inibidor de MASP-2 é selecionado do grupo consistindo de uma molécula de IgG1, uma de IgG2 e uma molécula de IgG4. Em algumas modalidades, o anticorpo inibidor de MASP-2 é uma molécula de IgG4 compreendendo uma mutação S228P. Em algumas modalidades, o anticorpo inibidor de MASP-2 se liga à MASP-2 humana com um KD de 10 nM ou menos. Em algumas modalidades, o anticorpo inibidor de MASP-2 liga um epítopo no domínio CCP1 de MASP-

2. Em algumas modalidades, o anticorpo inibidor de MASP-2 inibe a deposição de C3b em um ensaio in vitro de soro humano a 1% em uma IC50 de 10 nM ou menos. Em algumas modalidades, o anticorpo inibidor de MASP-2 inibe a deposição de C3b em soro humano a 90% com uma IC50 de

24 / 394 30 nM ou menos. Em algumas modalidades o anticorpo monoclonal inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo: i) uma CDR-H1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de 31 a 35 da SEQ ID NO: 67; e ii) uma CDR-H2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de 50 a 65 da SEQ ID NO: 67; e iii) uma CDR-H3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de 95 a 102 da SEQ ID NO: 67 e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo: i) uma CDR-L1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de 24 a 34 da SEQ ID NO: 70; e ii) uma CDR-L2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de 50 a 56 da SEQ ID NO: 70; e iii) uma CDR-L3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de 89 a 97 da SEQ ID NO: 70. Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal inibidor de MASP-2 compreende uma região variável de cadeia pesada apresentada como SEQ ID NO: 67 e uma região variável de cadeia leve apresentada como SEQ ID NO: 70. Em algumas modalidades, o anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo especificamente reconhece pelo menos parte de um epítopo reconhecido por um anticorpo de referência compreendendo uma região variável de cadeia pesada como apresentada na SEQ ID NO: 67 e uma região variável de cadeia leve como apresentada na SEQ ID NO: 70.

[0038] Em um outro aspecto, a presente invenção provê um método de tratar um sujeito sofrendo de aHUS resistente à terapia plasmática compreendendo administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um anticorpo inibidor de MASP-2 eficaz para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2. Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 é um anticorpo monoclonal anti-MASP-2 ou fragmento do mesmo que especificamente se liga à MASP-2 humana. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento do mesmo é selecionado do grupo

25 / 394 consistindo de um anticorpo recombinante, um anticorpo tendo função efetora reduzida, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado e um anticorpo humano. Em uma modalidade, o sujeito anteriormente passou ou está atualmente passando por tratamento com um inibidor de complemento de terminal que inibe a clivagem da proteína de complemento C5, tal como em que o inibidor de complemento de terminal é um anticorpo anti-C5 humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Em uma modalidade, o método compreende ainda tratar o paciente com plasmaférese. Em uma modalidade, a composição compreendendo o anticorpo inibidor de MASP-2 é administrado na ausência de plasmaférese.

[0039] Em um outro aspecto, a presente invenção provê um método de tratar um sujeito sofrendo de TMA associada com transplante de célula- tronco hematopoiética compreendendo administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um anticorpo inibidor de MASP-2 eficaz para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-

2. Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 é um anticorpo monoclonal anti-MASP-2 ou fragmento do mesmo que especificamente se liga à MASP-2 humana. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento do mesmo é selecionado do grupo consistindo de um anticorpo recombinante, um anticorpo tendo função efetora reduzida, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado e um anticorpo humano. Em uma modalidade, o sujeito anteriormente passou ou está atualmente passando por tratamento com um inibidor de complemento de terminal que inibe a clivagem da proteína de complemento C5. Em uma modalidade, o sujeito está sofrendo de uma TMA associada com transplante de célula-tronco hematopoiética que é resistente ao tratamento com uma transfusão de plaqueta e/ou resistente ao tratamento com plasmaférese. Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 é administrado em uma quantidade eficaz para melhorar pelo menos um ou mais parâmetros clínicos associados com TMA associada com transplante de

26 / 394 célula-tronco hematopoiética, tal como um aumento na contagem de plaqueta (por exemplo, pelo menos o dobro, pelo menos o triplo, pelo menos o quádruplo da contagem de plaqueta antes do tratamento), um aumento na haptoglobina e/ou uma diminuição na lactato desidrogenase.

[0040] Em um outro aspecto, a presente invenção provê um método de tratar um sujeito humano sofrendo de TMA persistente associada com transplante de célula-tronco hematopoiética (HSCT-TMA) compreendendo administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2. Em uma modalidade, o método compreende ainda identificar um sujeito humano tendo TMA persistente associada com transplante de célula- tronco hematopoiética antes da etapa de administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2. Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 é um anticorpo monoclonal ou fragmento do mesmo que especificamente se liga à MASP-2 humana. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é selecionado do grupo consistindo de um anticorpo recombinante, um anticorpo tendo função efetora reduzida, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado e um anticorpo humano. Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 não inibe substancialmente o caminho clássico. Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 inibe a deposição de C3b em soro humano a 90% com uma IC50 de 30 nM ou menos. Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR- H3 da sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 67 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a CDR-L1, CDR-L2 e CDR-

27 / 394 L3 da sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 70. Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 é administrado ao paciente na ausência de plasmaférese. Em uma modalidade, o sujeito anteriormente passou ou está atualmente passando por tratamento com um anticorpo anti-C5 humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, tal como em que o inibidor de complemento de terminal é um anticorpo anti-C5 humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 é ministrado ao sujeito sistemicamente. Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é administrado em uma quantidade eficaz para melhorar pelo menos um ou mais dos seguintes parâmetros clínicos associados com TMA persistente associada com transplante de célula-tronco hematopoiética: (i) um aumento na contagem de plaqueta (por exemplo, pelo menos o dobro, pelo menos o triplo, pelo menos o quádruplo da contagem de plaqueta antes do tratamento)); (ii) um aumento na haptoglobina; (iii) uma diminuição na lactato desidrogenase (LDH); e/ou (iv) uma diminuição na creatinina.

[0041] Em um outro aspecto, a presente invenção provê um método de tratar um sujeito humano sofrendo de ou em risco de desenvolver doença do enxerto versus hospedeiro (GVHD) compreendendo administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2. Em uma modalidade, o sujeito anteriormente passou ou está atualmente passando por ou passará por um transplante de célula-tronco hematopoiética. Em uma modalidade, o método compreende ainda identificar um sujeito humano sofrendo de ou em risco de desenvolver doença do enxerto versus hospedeiro antes da etapa de administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo para inibir a ativação de complemento dependente de

28 / 394 MASP-2. Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 é um anticorpo monoclonal ou fragmento do mesmo que especificamente se liga à MASP-2 humana. Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento do mesmo é selecionado do grupo consistindo de um anticorpo recombinante, um anticorpo tendo função efetora reduzida, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado e um anticorpo humano. Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 não inibe substancialmente o caminho clássico. Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 inibe a deposição de C3b em soro humano a 90% com uma IC50 de 30 nM ou menos. Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 é ministrado ao sujeito sistemicamente. Em uma modalidade, o sujeito está sofrendo de GVHD aguda. Em uma modalidade, o sujeito está sofrendo de GVHD resistente a esteroide. Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 da sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 67 e uma região variável de cadeia leve compreendendo CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 da sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 70.

[0042] Em um outro aspecto, a presente invenção provê um método de tratar, prevenir ou melhorar um ou mais sintomas neurológicos associados com a doença do enxerto versus hospedeiro ou TMA compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2. Em uma modalidade, o um ou mais sintomas neurológicos associados com a doença do enxerto versus hospedeiro ou TMA são selecionados do grupo consistindo de astenia, parestesia, tetraplegia, déficit sensoriomotor, polineuropatia disautonômica e/ou bexiga neurogênica. Em uma modalidade, o sujeito recebeu um transplante de célula-

29 / 394 tronco hematopoiética e o sujeito está sofrendo de um ou mais sintomas neurológicos selecionados do grupo consistindo de parestesias, tetraplegia e bexiga neurogênica. Em uma modalidade, o sujeito recebeu um transplante de célula-tronco hematopoiética e está sofrendo de doença do enxerto versus hospedeiro. Em uma modalidade, o sujeito recebeu um transplante de célula- tronco hematopoiética e está sofrendo de HSCT-TMA. Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 é um anticorpo monoclonal ou fragmento do mesmo que especificamente se liga à MASP-2 humana. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento do mesmo é selecionado do grupo consistindo de um anticorpo recombinante, um anticorpo tendo função efetora reduzida, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado e um anticorpo humano. Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 não inibe substancialmente o caminho clássico. Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 inibe a deposição de C3b em soro humano a 90% com uma IC50 de 30 nM ou menos. Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 é ministrado ao sujeito sistemicamente. Em uma modalidade, o método compreende ainda identificar um sujeito humano sofrendo de um ou mais sintomas neurológicos associados com transplante de célula-tronco hematopoiética antes da etapa de administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2. Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 da sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 67 e uma região variável de cadeia leve compreendendo CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 da sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 70.

[0043] Em um outro aspecto, a presente invenção provê um método de tratar um sujeito humano sofrendo de ou em risco de desenvolver

30 / 394 hemorragia alveolar difusa (DAH) associada com transplante de célula-tronco hematopoiética compreendendo administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2. Em uma modalidade, o sujeito anteriormente passou ou está atualmente passando ou passará por um transplante de célula-tronco hematopoiética.

Em uma modalidade, o método compreende ainda identificar um sujeito humano sofrendo de ou em risco de desenvolver hemorragia alveolar difusa (DAH) antes da etapa de administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2. Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 é um anticorpo monoclonal ou fragmento do mesmo que especificamente se liga à MASP-2 humana.

Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento do mesmo é selecionado do grupo consistindo de um anticorpo recombinante, um anticorpo tendo função efetora reduzida, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado e um anticorpo humano.

Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 não inibe substancialmente o caminho clássico.

Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 inibe a deposição de C3b em soro humano a 90% com uma IC50 de 30 nM ou menos.

Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 é ministrado ao sujeito sistemicamente.

Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 da sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 67 e uma região variável de cadeia leve compreendendo CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 da sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 70. Em um outro aspecto, a presente invenção provê composições para inibir os efeitos adversos da

31 / 394 ativação de complemento dependente de MASP-2, compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente inibidor de MASP-2, tal como um anticorpo inibidor de MASP-2 e um carreador farmaceuticamente aceitável. Métodos também são providos para fabricar um medicamento para o uso na inibição dos efeitos adversos da ativação de complemento dependente de MASP-2 em sujeitos vivos em necessidade do mesmo, compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente inibidor de MASP-2 em um carreador farmacêutico. Métodos também são providos para fabricar medicamentos para o uso na inibição da ativação de complemento dependente de MASP-2 para o tratamento de cada uma das condições, doenças e distúrbios aqui descritos abaixo.

[0044] Em um outro aspecto, a presente invenção provê um método de tratar um sujeito humano sofrendo de ou em risco de desenvolver doença veno-oclusiva (VOD) associada com transplante de célula-tronco hematopoiética compreendendo administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2. Em uma modalidade, o sujeito anteriormente passou ou está atualmente passando ou passará por um transplante de célula-tronco hematopoiética. Em uma modalidade, o método compreende ainda identificar um sujeito humano sofrendo de ou em risco de desenvolver doença veno-oclusiva (VOD) antes da etapa de administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2. Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 é um anticorpo monoclonal ou fragmento do mesmo que especificamente se liga à MASP-2 humana. Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento do mesmo é selecionado do grupo consistindo de um anticorpo recombinante, um

32 / 394 anticorpo tendo função efetora reduzida, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado e um anticorpo humano. Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 não inibe substancialmente o caminho clássico. Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 inibe a deposição de C3b em soro humano a 90% com uma IC50 de 30 nM ou menos. Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 é ministrado ao sujeito sistemicamente. Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 da sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 67 e uma região variável de cadeia leve compreendendo CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 da sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 70. Em um outro aspecto, a presente invenção provê composições para inibir os efeitos adversos da ativação de complemento dependente de MASP-2, compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente inibidor de MASP-2, tal como um anticorpo inibidor de MASP-2 e um carreador farmaceuticamente aceitável. Métodos também são providos para fabricar um medicamento para o uso na inibição dos efeitos adversos da ativação de complemento dependente de MASP-2 em sujeitos vivos em necessidade do mesmo, compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente inibidor de MASP-2 em um carreador farmacêutico. Métodos também são providos para fabricar medicamentos para o uso na inibição da ativação de complemento dependente de MASP-2 para o tratamento de cada uma das condições, doenças e distúrbios aqui descritos abaixo.

[0045] Os métodos, composições e medicamentos da invenção são úteis para inibir os efeitos adversos da ativação de complemento dependente de MASP-2 in vivo em sujeitos mamíferos, incluindo seres humanos sofrendo de ou em risco de desenvolver uma microangiopatia trombótica (TMA) e/ou um sujeito sofrendo de ou em risco de desenvolver GVHD e/ou um sujeito

33 / 394 sofrendo de ou em risco de desenvolver hemorragia alveolar difusa após o transplante de célula-tronco e/ou um sujeito sofrendo de ou em risco de desenvolver doença veno-oclusiva (VOD) como aqui adicionalmente descrita. Descrição dos Desenhos

[0046] Os aspectos precedentes e muitas das vantagens decorrentes desta invenção tornar-se-ão mais facilmente avaliada conforme os mesmos se tornam melhor entendidos por referência à seguinte descrição detalhada, quando considerada em conjunção com os desenhos anexos, em que: A FIGURA 1 é um diagrama ilustrando a estrutura genômica de MASP-2 humana; A FIGURA 2A é um diagrama esquemático ilustrando a estrutura de domínio da proteína de MASP-2 humana; A FIGURA 2B é um diagrama esquemático ilustrando a estrutura de domínio da proteína MAp19 humana; A FIGURA 3 é um diagrama ilustrando a estratégia de knockout de MASP-2 de murino; A FIGURA 4 é um diagrama ilustrando a construção de minigene de MASP-2 humana; A FIGURA 5A apresenta resultados demonstrando que a deficiência em MASP-2 leva à perda de ativação de C4 mediada pelo caminho da lectina como medida pela falta de deposição de C4b sobre manana, como descrito no Exemplo 2; A FIGURA 5B apresenta resultados demonstrando que a deficiência de MASP-2 leva à perda da ativação de C4 mediada pelo caminho da lectina como medida pela falta de deposição de C4b na zimosana, como descrito no Exemplo 2; A FIGURA 5C apresenta resultados demonstrando os níveis relativos de ativação de C4 de amostras de soro obtidas das cepas MASP-2+/- ; MASP-2-/- e tipo selvagem como medidos pela deposição de C4b sobre

34 / 394 manana e sobre zimosana, como descrito no Exemplo 2; A FIGURA 6 apresenta resultados demonstrando que a adição de MASP-2 recombinante de murino às amostras de soro MASP-2-/- recupera a ativação de C4 mediada pelo caminho da lectina em uma maneira dependente da concentração de proteína, como medida pela deposição de C4b sobre manana, como descrito no Exemplo 2; A FIGURA 7 apresenta resultados demonstrando que o caminho clássico é funcional na cepa MASP-2-/-, como descrito no Exemplo 8; A FIGURA 8A apresenta resultados demonstrando que o anticorpo Fab2 anti-MASP-2 #11 inibe a formação da C3 convertase, como descrito no Exemplo 10; A FIGURA 8B apresenta resultados demonstrando que o anticorpo Fab2 anti-MASP-2 #11 se liga ao MASP-2 nativo de rato, como descrito no Exemplo 10; A FIGURA 8C apresenta resultados demonstrando que o anticorpo Fab2 anti-MASP-2 #41 inibe a clivagem de C4, como descrito no Exemplo 10; A FIGURA 9 apresenta resultados demonstrando que todos dos anticorpos Fab2 anti-MASP-2 testados que inibiram a formação da C3 convertase também foram verificados inibir a clivagem de C4, como descrito no Exemplo 10; A FIGURA 10 é um diagrama ilustrando os polipeptídeos recombinantes derivados de MASP-2 de rato que foram usados para mapeamento de epítopo dos anticorpos Fab2 bloqueadores anti-MASP-2, como descrito no Exemplo 11; A FIGURA 11 apresenta resultados demonstrando a ligação de Fab2 anti-MASP-2 #40 e #60 aos polipeptídeos MASP-2 de rato, como descrito no Exemplo 11;

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A FIGURA 12 apresenta resultados demonstrando a depuração do nitrogênio da ureia do sangue para camundongos tipo selvagem (+/+) e MASP-2 (-/-) em 24 e 48 horas depois da reperfusão em um modelo de lesão de isquemia/reperfusão renal, como descrito no Exemplo 12; A FIGURA 13A apresenta resultados mostrando os níveis de proteína VEGF da linha de base em complexo RPE-coroide isolado de camundongos tipo selvagem (+/+) e MASP-2 (-/-), como descrito no Exemplo 13; A FIGURA 13B apresenta resultados mostrando os níveis da proteína VEGF no complexo RPE-coroide no dia 3 nos camundongos do tipo selvagem (+/+) e MASP-2 (-/-) a seguir da lesão induzida por laser em um modelo de degeneração macular, como descrito no Exemplo 13; A FIGURA 14 apresenta resultados mostrando o volume médio da neovascularização coroidal (CNV) no dia sete a seguir da lesão induzida por laser nos camundongos do tipo selvagem (+/+) e MASP-2 (-/-), como descrito no Exemplo 13; As FIGURAS 15A e 15B apresentam curvas de resposta de dose para a inibição da deposição de C4b (FIG. 15A) e a inibição da ativação de trombina (FIG 15B) a seguir da administração de um anticorpo MASP-2 Fab2 em soro de rato normal, como descrito no Exemplo 14; As FIGURAS 16A e 16B apresentam a agregação de plaqueta medida (expressa como área agregada) em camundongos MASP-2 (-/-) (FIG. 16B) quando comparada com agregação de plaqueta em camundongos do tipo selvagem não tratados e camundongos do tipo selvagem em que o caminho de complemento é inibido pelo agente depletor fator de veneno de cobra (CVF) e um inibidor do caminho terminal (antagonista de C5aR) (FIGURA 16A) em um modelo da reação de Schwartzman localizado de coagulação intravascular disseminada, como descrito no Exemplo 15; A FIGURA 17 graficamente ilustra os níveis de nitrogênio da

36 / 394 ureia do sangue (BUN) medidos nos camundongos WT (+/+) (B6) ou MASP- 2 (-/-) receptores de transplante de rins de doadores WT (+/+), como descrito no Exemplo 16; A FIGURA 18 ilustra graficamente a sobrevivência percentual de camundongos WT (+/+) e MASP-2 (-/-) como uma função do número de dias depois da infecção microbiana no modelo da ligação e punção cecal (CLP), como descrito no Exemplo 17; A FIGURA 19 ilustra graficamente o número de bactérias medidas em WT (+/+) e MASP-2 (-/-) depois da infecção microbiana no modelo de ligação e punção cecal (CLP), como descrito no Exemplo 17; A FIGURA 20 é uma plotagem de Kaplan-Mayer ilustrando a sobrevivência percentual de camundongos WT (+/+), MASP-2 (-/-) e C3 (-/-) seis dias depois da inoculação com a administração intranasal de Pseudomonas aeruginosa, como descrito no Exemplo 18; A FIGURA 21 ilustra graficamente o nível de deposição de C4b, medida como % do controle, em amostras coletadas em vários pontos de tempo depois da dosagem subcutânea de 0,3 mg/kg ou 1,0 mg/kg de anticorpo monoclonal anti-MASP-2 de camundongo em camundongos WT, como descrito no Exemplo 19; A FIGURA 22 ilustra graficamente o nível de deposição de C4b, medida como % de controle, em amostras coletadas em vários pontos de tempo depois da dosagem ip de 0,6 mg/kg de anticorpo monoclonal anti- MASP-2 de camundongo em camundongos WT, como descrito no Exemplo 19; A FIGURA 23 ilustra graficamente o volume médio da neovascularização coroidal (CNV) no dia sete a seguir da lesão induzida por laser em WT (+/+) camundongos pré-tratados com uma única injeção ip de 0,3 mg/kg ou 1,0 mg/kg de anticorpo monoclonal anti-MASP-2 de camundongo; como descrito no Exemplo 20;

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A FIGURA 24A ilustra graficamente a sobrevivência percentual de camundongos MASP-2 (-/-) e WT (+/+) depois da infecção com 5 x 108/100 μl cfu de N. meningitidis, como descrito no Exemplo 21; A FIGURA 24B ilustra graficamente o log cfu/ml de N. meningitidis recuperado em pontos de tempo diferentes em amostras de sangue coletadas dos camundongos MASP-2 KO (-/-) e WT (+/+) infectados com 5 x 108 cfu/100 μl de N. meningitidis, como descrito no Exemplo 21; A FIGURA 25A ilustra graficamente a sobrevivência percentual de camundongos MASP-2 KO (-/-) e WT (+/+) depois da infecção com 2 x 108 cfu/100 μl de N. meningitidis, como descrito no Exemplo 21; A FIGURA 25B ilustra graficamente o log cfu/ml de N. meningitidis recuperado nos pontos de tempo diferentes em amostras de sangue coletadas dos camundongos WT (+/+) infectados com 2 x 108 cfu/100 μl de N. meningitidis, como descrito no Exemplo 21; A FIGURA 25C ilustra graficamente o log cfu/ml de N. meningitidis recuperado nos pontos de tempo diferentes em amostras de sangue coletadas dos camundongos MASP-2 (-/-) infectados com 2 x 108 cfu/100 μl de N. meningitidis, como descrito no Exemplo 21; A FIGURA 26A ilustra graficamente os resultados de um ensaio de deposição de C3b demonstrando que camundongos MASP-2 (-/-) retêm um caminho clássico funcional, como descrito no Exemplo 22; A FIGURA 26B ilustra graficamente os resultados de um ensaio de deposição de C3b sobre placas revestidas com zimosana, demonstrando que camundongos MASP-2 (-/-) retêm um caminho alternativo funcional, como descrito no Exemplo 22; A FIGURA 27A ilustra graficamente a perda tecidual induzida pela lesão de isquemia/reperfusão miocárdica (MIRI) a seguir da ligação do ramo descendente anterior esquerdo da artéria coronária (LAD) e reperfusão em camundongos C4 (-/-) (n=6) e equiparação com controles irmãos do tipo

38 / 394 selvagem (n=7), mostrando a área em risco (AAR) e o tamanho do infarte (INF) como descrito no Exemplo 22; A FIGURA 27B ilustra graficamente o tamanho do infarte (INF) como uma função da área em risco (AAR) em camundongos C4 (-/-) e WT tratados como descrito na FIGURA 42A, demonstrando que os camundongos C4 (-/-) são tão suscetíveis à MIRI quanto os controles WT (linha tracejada), como descrito no Exemplo 22; A FIGURA 28A ilustra graficamente os resultados de um ensaio de deposição de C3b usando soro de camundongos WT, os camundongos C4 (-/-) e soro dos camundongos C4 (-/-) pré-incubados com manana, como descrito no Exemplo 22; A FIGURA 28B ilustra graficamente os resultados de um ensaio de deposição de C3b no soro de camundongos WT, C4 (-/-) e MASP-2 (-/-) misturados com várias concentrações de um mAb MASP-2 antimurino (mAbM11), como descrito no Exemplo 22; A FIGURA 28C ilustra graficamente os resultados de um ensaio de deposição de C3b sobre soro humano de WT (suficiente em C4) e soro deficiente em C4 e soro de sujeitos deficientes em C4 pré-incubados com manana, como descrito no Exemplo 22; A FIGURA 28D ilustra graficamente os resultados de um ensaio de deposição de C3b sobre soro humano de sujeitos WT (suficientes em C4) e deficientes em C4 misturados com mAb anti-MASP-2 humana (mAbH3), como descrito no Exemplo 22; A FIGURA 29A ilustra graficamente uma análise comparativa da atividade da C3 convertase em plasma de várias cepas de camundongo deficiente em complemento testadas sob condições de ensaio específicas do caminho de ativação de lectina ou sob condições de ensaio específicas do caminho clássico de ativação, como descrito no Exemplo 22; A FIGURA 29B ilustra graficamente as cinéticas resolvidas

39 / 394 com o tempo da atividade da C3 convertase em plasma de várias cepas de camundongo deficiente em complemento testadas sob condições específicas do caminho de ativação de lectina, como descrito no Exemplo 22; A FIGURA 30 ilustra os resultados de uma análise de Western blot mostrando a ativação de C3 humano, mostrado pela presença da cadeia a’, pelos substratos de trombina FXIa e FXa, como descrito no Exemplo 23; A FIGURA 31 mostra os resultados do ensaio de deposição de C3 sobre amostras de soro obtidas de WT, MASP-2 (-/-), F11(-/-), F11(-/-)/C4 (-/-) e C4 (-/-), como descrito no Exemplo 23; A FIGURA 32A é uma plotagem da sobrevivência de Kaplain- Meier mostrando o percentual de sobrevivência com o tempo depois da exposição a 7,0 Gy de radiação em camundongos de controle e em camundongos tratados com anticorpo anti-MASP-2 de murino (mAbM11) ou anti-MASP-2 humana anticorpo (mAbH6) como descrito no Exemplo 29; A FIGURA 32B é uma plotagem de sobrevivência de Kaplain- Meier mostrando o percentual de sobrevivência com o tempo depois da exposição a 6,5 Gy de radiação em camundongos de controle e em camundongos tratados com anticorpo anti-MASP-2 de murino (mAbM11) ou anticorpo anti-MASP-2 humana (mAbH6), como descrito no Exemplo 29; A FIGURA 33 é uma plotagem de Kaplan-Meyer graficamente ilustrando o percentual de sobrevivência de camundongos MASP-2 KO e WT depois da administração de uma dose infecciosa de 2,6 x 107 cfu de N. meningitidis sorogrupo A Z2491, demonstrando que camundongos deficientes em MASP-2 são protegidos da mortalidade induzida pela N. meningitidis, como descrito no Exemplo 30; A FIGURA 34 é uma plotagem de Kaplan-Meyer graficamente ilustrando o percentual de sobrevivência de camundongos MASP-2 KO e WT depois da administração de uma dose infecciosa de 6 x 106 cfu de N. meningitidis sorogrupo B cepa MC58, demonstrando que

40 / 394 camundongos deficientes em MASP-2 são protegidos da mortalidade induzida pela N. meningitidis sorogrupo B cepa MC58, como descrito no Exemplo 30; A FIGURA 35 ilustra graficamente o log cfu/ml de N. meningitidis sorogrupo B cepa MC58 recuperada em pontos de tempo diferentes em amostras de sangue coletadas dos camundongos MASP-2 KO e WT depois da infecção i.p. com 6 x 106 cfu de N. meningitidis sorogrupo B cepa MC58 (n=3 nos pontos de tempo diferentes para ambos os grupos de camundongos, os resultados são expressos como Médias ± SEM) demonstrando que embora os camundongos MASP-2 KO fossem infectados com a mesma dose de N. meningitidis sorogrupo B cepa MC58 como os camundongos WT, os camundongos MASP-2 KO têm depuração realçada de bacteremia quando comparados com WT, como descrito no Exemplo 30; A FIGURA 36 ilustra graficamente a contagem média de enfermidade de camundongos MASP-2 e WT em 3, 6, 12 e 24 horas depois da infecção com 6 x 106 cfu/100 μl de N. meningitidis Sorogrupo B cepa MC58, demonstrando que os camundongos deficientes em MASP-2 mostraram alta resistência à infecção, com contagens de enfermidade muito mais baixas em 6 horas, como descrito no Exemplo 30; A FIGURA 37 é uma plotagem de Kaplan-Meyer graficamente ilustrando o percentual de sobrevivência de camundongos depois da administração de uma dose infecciosa de 4 x 106/100 μl cfu de N. meningitidis Sorogrupo B cepa MC58, seguida pela administração 3 horas após a infecção de anticorpo inibidor anti-MASP-2 (1 mg/kg) ou anticorpo de controle de isótipo, demonstrando que o anticorpo anti-MASP-2 é eficaz para tratar e melhorar a sobrevivência em sujeitos infectados com N. meningitidis, como descrito no Exemplo 31; A FIGURA 38 ilustra graficamente o log cfu/ml de contagens viáveis de N. meningitidis sorogrupo B-MC58 recuperadas em pontos de tempo diferentes na concentração de 20% de soro humano depois da infecção

41 / 394 i.p. com 6,5 x 106 cfu/100 μl de N. meningitidis sorogrupo B cepa MC58 em 0, 30, 60 e 90 minutos depois da incubação na presença de: (a) soro humano normal (NHS) mais anticorpo humano anti-MASP-2; (B) soro humano normal (NHS) mais anticorpo de controle de isótipo; (C) soro humano MBL- /-; (D) soro humano normal (NHS) e (E) soro humano normal inativado por calor (NHS), mostrando que o extermínio dependente de complemento de N. meningitidis em soro humano foi significantemente realçado pela adição do anticorpo humano anti-MASP-2, como descrito no Exemplo 32; A FIGURA 39 ilustra graficamente o log cfu/ml de contagens viáveis de N. meningitidis sorogrupo B-MC58 recuperadas em pontos de tempo diferentes nas amostras séricas de camundongo, demonstrando que os soros de camundongo MASP-2 -/- tem um nível mais alto de atividade bactericida para N. meningitidis do que soros de camundongo WT, como descrito no Exemplo 32; A FIGURA 40 ilustra graficamente a hemólise (como medida pela liberação de hemoglobina de eritrócitos de camundongo lisados (Crry/C3-/-) no sobrenadante medida pela fotometria) de eritrócitos de murino revestidos com manana pelo soro humano em uma faixa de concentrações séricas.

Os soros testados incluíram NHS inativado por calor (HI), MBL-/-, NHS +anticorpo anti-MASP-2 e controle de NHS, como descrito no Exemplo 33; A FIGURA 41 ilustra graficamente a hemólise (como medida pela liberação de hemoglobina de eritrócitos lisados de camundongo WT dentro do sobrenadante medida pela fotometria) de eritrócitos de murino não revestidos pelo soro humano em uma faixa de concentrações séricas.

Os soros testados incluíram NHS inativado por calor (HI), MBL-/-, NHS +anticorpo anti-MASP-2 e controle de NHS, demonstrando que a inibição de MASP-2 inibe a lise mediada por complemento de eritrócitos de camundongo WT não sensibilizado, como descrito no Exemplo 33;

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A FIGURA 42 ilustra graficamente a hemólise (como medida pela liberação de hemoglobina de eritrócitos lisados de camundongo (CD55/59 -/-) dentro do sobrenadante medida pela fotometria) de eritrócitos de murino não revestidos pelo soro humano em uma faixa de concentrações séricas.

Os soros testados incluíram NHS inativado por calor (HI), MBL-/-, NHS +anticorpo anti-MASP-2 e controle de NHS, como descrito no Exemplo 33; A FIGURA 43 ilustra graficamente o percentual de sobrevivência com o tempo (dias) depois da exposição à radiação de 8,0 Gy em camundongos de controle e em camundongos tratados com anticorpo anti- MASP-2 humana (mAbH6), como descrito no Exemplo 34; A FIGURA 44 ilustra graficamente o tempo para o início da oclusão microvascular a seguir da injeção de LPS em camundongos MASP-2 -/- e WT, mostrando a porcentagem de camundongos com formação de trombo medida em 60 minutos, demonstrando que a formação de trombo é detectada depois de 15 minutos em camundongos WT, com até 80% dos camundongos WT demonstrando a formação de trombo em 60 minutos; ao contrário, nenhum dos camundongos MASP-2 -/- mostrou qualquer formação de trombo durante o período de 60 minutos (log rank: p=0,0005), como descrito no Exemplo 35; A FIGURA 45 ilustra graficamente o percentual de sobrevivência de camundongos de controle tratados com solução salina (n=5) e camundongos tratados com anticorpo anti-MASP-2 (n=5) no modelo induzido com STX/LPS de HUS com o tempo (horas), demonstrando que todos os camundongos de controle morreram em 42 horas, ao passo que, ao contrário, 100% dos camundongos tratados com o anticorpo anti-MASP-2 sobreviveram durante todo o decurso temporal do experimento, como descrito no Exemplo 36; A FIGURA 46 ilustra graficamente, como uma função do

43 / 394 tempo depois da indução de lesão, a porcentagem de camundongos com oclusão microvascular no modelo UV de FITC/Dextrano depois do tratamento com controle de isótipo ou anticorpo mAbH6 de MASP-2 humana (10 mg/kg) dosados em 16 horas e 1 hora antes da injeção de FITC/Dextrano, como descrito no Exemplo 37; A FIGURA 47 ilustra graficamente o tempo de oclusão em minutos para camundongos tratados com o anticorpo de MASP-2 humana (mAbH6) e o anticorpo de controle de isótipo, em que os dados são relatados como pontos de dispersão com valores médios (barras horizontais) e barras de erro padrão (barras verticais). O teste estatístico usado para análise foi o teste t não emparelhado; em que o símbolo “*” indica p=0,0129, como descrito no Exemplo 37; e A FIGURA 48 ilustra graficamente o tempo até a oclusão em minutos para camundongos tipo selvagem, camundongos MASP-2 KO e camundongos tipo selvagem pré-tratados com anticorpo de MASP-2 humana (mAbH6) administrados i.p. a 10 mg/kg 16 horas antes e novamente 1 hora antes da indução de trombose no modelo de lesão de célula endotelial induzido por FITC-dextrano/luz de trombose com intensidade de luz baixa (800 a 1500), como descrito no Exemplo 37; A FIGURA 49 é uma plotagem de Kaplan-Meier mostrando a porcentagem de camundongos com trombos como uma função do tempo na microangiopatia trombótica induzida por FITC-Dextrano em camundongos tratados com doses crescentes de anticorpo inibidor de MASP-2 humana (mAbH6) ou um anticorpo de controle de isótipo, como descrito no Exemplo 39; A FIGURA 50 ilustra graficamente o tempo médio para o início (minutos) da formação de trombo como uma função da dose de mAbH6 (*p<0,01 comparado ao controle), como descrito no Exemplo 39; A FIGURA 51 é uma plotagem de Kaplan-Meier mostrando a

44 / 394 porcentagem de camundongos com oclusão microvascular como uma função do tempo na microangiopatia trombótica induzida por FITC-Dextrano em camundongos tratados com doses crescentes de anticorpo inibidor de MASP- 2 humana (mAbH6) ou um anticorpo de controle de isótipo, como descrito no Exemplo 39; A FIGURA 52 ilustra graficamente o tempo médio para a oclusão microvascular como uma função da dose de mAbH6 (*p<0,05 comparado ao controle), como descrito no Exemplo 39; A FIGURA 53A ilustra graficamente o nível de deposição de MAC na presença ou ausência de anticorpo monoclonal de MASP-2 humana (OMS646) sob as condições de ensaio específicas do caminho da lectina, demonstrando que OMS646 inibe a deposição de MAC mediada pela lectina com um valor IC50 de aproximadamente 1 nM, como descrito no Exemplo 40; A FIGURA 53B ilustra graficamente o nível de deposição de MAC na presença ou ausência de anticorpo monoclonal de MASP-2 humana (OMS646) sob as condições de ensaio específicas do caminho clássico, demonstrando que OMS646 não inibe a deposição de MAC mediada pelo caminho clássico, como descrito no Exemplo 40; A FIGURA 53C ilustra graficamente o nível de deposição de MAC na presença ou ausência de anticorpo monoclonal de MASP-2 humana (OMS646) sob as condições de ensaio específicas do caminho alternativo, demonstrando que OMS646 não inibe a deposição de MAC mediada pelo caminho alternativo, como descrito no Exemplo 40; A FIGURA 54 ilustra graficamente o perfil farmacocinético (PK) do anticorpo monoclonal de MASP-2 humana (OMS646) em camundongos, mostrando a concentração de OMS646 (média de n=3 animais/grupo) como uma função do tempo depois da administração na dose indicada, como descrito no Exemplo 40; A FIGURA 55A ilustra graficamente a resposta

45 / 394 farmacodinâmica (PD) de anticorpo monoclonal de MASP-2 humana (OMS646), medida como uma queda na atividade sistêmica do caminho da lectina em camundongos a seguir da administração intravenosa, como descrito no Exemplo 40; A FIGURA 55B ilustra graficamente a resposta farmacodinâmica (PD) de anticorpo monoclonal de MASP-2 humana (OMS646), medida como uma queda na atividade sistêmica do caminho da lectina em camundongos a seguir da administração subcutânea, como descrito no Exemplo 40; A FIGURA 56 ilustra graficamente o efeito inibidor do anticorpo de MASP-2 (OMS646) quando comparado com sCR1 na deposição de C5b-9 induzida pelo soro aHUS sobre as células HMEC-1 ativadas com ADP, como descrito no Exemplo 41; A FIGURA 57 ilustra graficamente o efeito inibidor do anticorpo de MASP-2 (OMS646) quando comparado com sCR1 na formação de trombo induzida por soro aHUS sobre as células HMEC-1 ativadas com ADP, como descrito no Exemplo 42; A FIGURA 58 ilustra graficamente a mudança média na contagem de plaqueta a partir da linha de base com o tempo (semanas) em sujeitos sofrendo de angiopatia trombótica persistente associada com transplante de célula-tronco hematopoiética (HSCT-TMA) depois do tratamento com anticorpo inibidor de MASP-2 (OMS646), como descrito no Exemplo 46; A FIGURA 59 ilustra graficamente a mudança média no LDH da linha de base com o tempo (semanas) em sujeitos sofrendo de (HSCT- TMA) persistente depois do tratamento com anticorpo inibidor de MASP-2 (OMS646), como descrito no Exemplo 46; A FIGURA 60 ilustra graficamente a mudança média na haptoglobina a partir da linha de base com o tempo (semanas) em sujeitos

46 / 394 sofrendo de (HSCT-TMA) persistente depois do tratamento com anticorpo inibidor de MASP-2 (OMS646), como descrito no Exemplo 46; A FIGURA 61 ilustra o curso clínico de um paciente após o transplante de célula-tronco hematopoiética (HSCT) que desenvolveu HSCT- TMA e doença do enxerto versus hospedeiro (GVHD), demonstrando melhora na HSCT-TMA, GVHD e melhora nos sintomas neurológicos depois do tratamento com anticorpo inibidor de MASP-2 (OMS646), como descrito no Exemplo 47; A FIGURA 62A ilustra graficamente o nível de creatinina com o tempo no uso compassivo com o paciente #1, em que a linha vertical indica o início do tratamento com o anticorpo inibidor de MASP-2 (OMS646), como descrito no Exemplo 48; A FIGURA 62B graficamente ilustra o nível de haptoglobina com o tempo no uso compassivo com o paciente #1, em que a linha vertical indica o início de tratamento com anticorpo inibidor de MASP-2 (OMS646), como descrito no Exemplo 48; A FIGURA 62C ilustra graficamente o nível de hemoglobina com o tempo no uso compassivo com o paciente #1, em que a linha vertical indica o início de tratamento com anticorpo inibidor de MASP-2 (OMS646), como descrito no Exemplo 48; FIGURA 62D ilustra graficamente o nível de LDH com o tempo no uso compassivo com o paciente #1, em que a linha vertical indica o início de tratamento com anticorpo inibidor de MASP-2 (OMS646), como descrito no Exemplo 48; e A FIGURA 62E ilustra graficamente o nível de plaquetas com o tempo no uso compassivo com o paciente #1, em que a linha vertical indica o início de tratamento com anticorpo inibidor de MASP-2 (OMS646), como descrito no Exemplo 48.

DESCRIPÇÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

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SEQ ID NO: 1 cDNA de MAp19 humana SEQ ID NO: 2 proteína de MAp19 humana (com líder) SEQ ID NO: 3 proteína de MAp19 humana (madura) SEQ ID NO: 4 cDNA de MASP-2 humana SEQ ID NO: 5 proteína de MASP-2 humana (com líder) SEQ ID NO: 6 proteína de MASP-2 humana (madura) SEQ ID NO: 7 gDNA de MASP-2 humana (éxons 1-6) Antígenos: (em referência à proteína de MASP-2 madura) SEQ ID NO: 8 sequência CUBI (aa 1-121) SEQ ID NO: 9 sequência CUBEGF (aa 1-166) SEQ ID NO: 10 CUBEGFCUBII (aa 1-293) SEQ ID NO: 11 região EGF (aa 122-166) SEQ ID NO: 12 domínio de serina protease (aa 429 – 671) SEQ ID NO: 13 domínio de serina protease inativo (aa 610- 625 com mutação de Ser618 para Ala) SEQ ID NO: 14 TPLGPKWPEPVFGRL (peptídeo CUB1) SEQ ID NO: 15 TAPPGYRLRLYFTHFDLELSHLCEYDF VKLSSGAKVLATLCGQ (peptídeo CUBI) SEQ ID NO: 16 TFRSDYSN (ligação de núcleo da região de MBL) SEQ ID NO: 17 FYSLGSSLDITFRSDYSNEKPFTGF (região de ligação de MBL) SEQ ID NO: 18 IDECQVAPG (PETÍDEO EGF) SEQ ID NO: 19 ANMLCAGLESGGKDSCRGDSGGALV (núcleo de ligação da serina protease) Inibidores Peptídicos: SEQ ID NO: 20 cDNA de MBL de comprimento total SEQ ID NO: 21 proteína de MBL de comprimento total SEQ ID NO: 22 OGK-X-GP (ligação de consenso)

48 / 394 SEQ ID NO: 23 OGKLG SEQ ID NO: 24 GLR GLQ GPO GKL GPO G SEQ ID NO: 25 GPO GPO GLR GLQ GPO GKL GPO GPO

GPO SEQ ID NO: 26 GKDGRDGTKGEKGEPGQGLRGLQGP

OGKLGPOG SEQ ID NO: 27 GAOGSOGEKGAOGPQGPOGPOGKMGPK GEOGDO (h-ficolina humana) SEQ ID NO: 28

GCOGLOGAOGDKGEAGTNGKRGERGPO GPOGKAGPOGPNGAOGEO (ficolina humana p35) SEQ ID NO: 29 LQRALEILPNRVTIKANRPFLVFI (sítio de clivagem C4) Inibidores de expressão: SEQ ID NO: 30 cDNA de domínio CUBI-EGF (nucleotídeos 22-680 da SEQ ID NO: 4) SEQ ID NO: 31 5’ CGGGCACACCATGAGGCTGCTGACCCTCCTGGGC 3’ Nucleotídeos 12-45 da SEQ ID NO: 4 incluindo o sítio de início da tradução de MASP-2 (sentido) SEQ ID NO: 32 5’GACATTACCTTCCGCTCCGACTCCAACGAGAAG3’ Nucleotídeos 361-396 da SEQ ID NO: 4 codificando uma região compreendendo o sítio de ligação de MBL de MASP-2 (sentido) SEQ ID NO: 33 5’AGCAGCCCTGAATACCCACGGCCGTATCCCAAA3’ Nucleotídeos 610-642 da SEQ ID NO: 4 codificando uma região compreendendo o domínio CUBII

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Iniciadores de Clonagem: SEQ ID NO: 34 CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC (5’ PCR para CUB) SEQ ID NO: 35 GGAATTCCTAGGCTGCATA (3’ PCR para CUB) SEQ ID NO: 36 GGAATTCCTACAGGGCGCT (3’ PCR para CUBIEGF) SEQ ID NO: 37 GGAATTCCTAGTAGTGGAT (3’ PCR para CUBIEGFCUBII) As SEQ ID NOS: 38-47 são iniciadores de clonagem para anticorpo humanizado SEQ ID NO: 48 é ligação peptídica de 9 aa Vetor de Expressão: SEQ ID NO: 49 é o inserto do minigene de MASP-2 SEQ ID NO: 50 é o cDNA de MASP-2 de murino SEQ ID NO: 51 é a proteína de MASP-2 de murino (p/líder) SEQ ID NO: 52 é a proteína madura de MASP-2 de murino SEQ ID NO: 53 o cDNA de MASP-2 de rato SEQ ID NO: 54 é a proteína de MASP-2 de rato (w/líder) SEQ ID NO: 55 é a proteína madura de MASP-2 de rato SEQ ID NO: 56-59 são os oligonucleotídeos para a mutagênese locodirigida de MASP-2 humana usada para gerar MASP-2A humana SEQ ID NO: 60-63 são os oligonucleotídeos para a mutagênese locodirigida de MASP-2 de murino usados para gerar MASP-2A de murino SEQ ID NO: 64-65 são os oligonucleotídeos para a mutagênese locodirigida de MASP-2 de rato usada para gerar MASP-2A de rato

50 / 394 SEQ ID NO: 66 DNA codificando 17D20_dc35VH21N11VL (OMS646) cadeia pesada região variável (VH) (sem peptídeo de sinal) SEQ ID NO: 67 polipeptídeo da região variável de cadeia pesada (VH) 17D20_dc35VH21N11VL (OMS646) SEQ ID NO: 68 polipeptídeo da região variável de cadeia pesada (VH) 17N16mc SEQ ID NO: 69: DNA codificando região variável de cadeia leve (VL) 17D20_dc35VH21N11VL (OMS646) SEQ ID NO: 70: polipeptídeo da região variável de cadeia leve (VL) 17D20_dc35VH21N11VL (OMS646) SEQ ID NO: 71: polipeptídeo região variável de cadeia leve (VL) 17N16_dc17N9 Descrição Detalhada

[0047] A presente invenção está fundamentada na surpreendente verificação pelos presentes inventores que é possível inibir o caminho de MASP-2 mediado pela lectina enquanto deixa o caminho clássico intacto. A presente invenção também descreve o uso de MASP-2 como um alvo terapêutico para inibir a lesão celular associada com a ativação do caminho de complemento mediada pela lectina enquanto deixa o componente do caminho clássico (dependente de C1q) do sistema imune intacto. I. Definições

[0048] A menos que aqui especificamente definido, todos os termos aqui usados têm o mesmo significado como seria entendido por aqueles de habilidade comum na técnica da presente invenção. As seguintes definições são providas de modo a prover clareza com respeito aos termos como eles são usados no relatório descritivo e reivindicações para descrever a presente invenção.

[0049] Como aqui usado, o termo “ativação de complemento dependente de MASP-2” compreende a ativação dependente de MASP-2 do

51 / 394 caminho da lectina, que ocorre sob condições fisiológicas (isto é, na presença de Ca++) levando à formação do caminho da lectina C3 convertase C4b2a e no acúmulo do produto da clivagem de C3, C3b subsequentemente à C5 convertase C4b2a(C3b)n, que foi determinada primariamente causar a opsonização.

[0050] Como aqui usado, o termo “caminho alternativo” se refere à ativação de complemento que é deflagrada, por exemplo, pela zimosana de paredes de célula fúngica e de levedura, lipopolissacarídeo (LPS) de membranas externas Gram negativas e eritrócitos de coelho, assim como de muitos polissacarídeos puros, eritrócitos de coelho, vírus, bactérias, células de tumor de animal, parasitas e células danificadas e que tradicionalmente foram julgados surgir da geração proteolítica espontânea de C3b a partir do fator de complemento C3.

[0051] Como aqui usado, o termo “caminho de lectina” se refere à ativação de complemento que ocorre por intermédio da ligação específica do soro e proteínas de ligação de carboidrato que não do soro incluindo lectina de ligação de manana (MBL), CL-11 e as ficolinas (H-ficolina, M-ficolina, ou L-ficolina).

[0052] Como aqui usado, o termo “caminho clássico” se refere à ativação de complemento que é iniciada pelo anticorpo ligado a uma partícula externa e requer a ligação da molécula de reconhecimento C1q.

[0053] Como aqui usado, o termo “agente inibidor de MASP-2” se refere a qualquer agente que se liga à MASP-2 ou diretamente interage com a mesma e eficazmente inibe a ativação de complemento dependente de MASP- 2, incluindo anticorpos anti-MASP-2 e fragmentos de ligação de MASP-2 dos mesmos, peptídeos naturais e sintéticos, moléculas pequenas, receptores de MASP-2 solúveis, inibidores de expressão e inibidores naturais isolados e também abrange peptídeos que competem com MASP-2 quanto à ligação a uma outra molécula de reconhecimento (por exemplo, MBL, H-ficolina, M-

52 / 394 ficolina ou L-ficolina) no caminho da lectina, mas não abrange anticorpos que se ligam a tais outras moléculas de reconhecimento. Os agentes inibidores de MASP-2 úteis no método da invenção podem reduzir a ativação de complemento dependente de MASP-2 em mais do que 20%, tal como mais do que 50%, tal como maior do que 90%. Em uma modalidade, o agente inibidor de MASP-2 reduz a ativação de complemento dependente de MASP-2 em mais do que 90% (isto é, resultando na ativação de complemento de MASP-2 de apenas 10% ou menos).

[0054] Como aqui usado, o termo “anticorpo” abrange os anticorpos e fragmentos de anticorpos do mesmo, derivados de qualquer mamífero que produz anticorpo (por exemplo, camundongo, rato, coelho, e primata incluindo o ser humano), ou de um hibridoma, seleção de fago, expressão recombinante ou animais transgênicos (ou outros métodos de produzir anticorpos ou fragmento de anticorpos”), que especificamente ligam a um alvo polipeptídeo, tal como, por exemplo, polipeptídeos de MASP-2 ou porções do mesmo. Não é intencionado que o termo “anticorpo” limitado com relação à fonte do anticorpo ou à maneira na qual este é feito (por exemplo, através de hibridoma, seleção de fago, expressão recombinante, animal transgênico, síntese de peptídeo, etc.). os anticorpos exemplares incluem anticorpos policlonais, monoclonais e recombinantes; anticorpos pan- específicos, multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos, anticorpos triespecíficos); anticorpos humanizados; anticorpos de murino; anticorpos monoclonais quiméricos, camundongo-humano, camundongo-primata, primata-humano; e anti-idiotípicos, e podem ser qualquer anticorpo intacto ou fragmento do mesmo. Como aqui usado, o termo “anticorpo” abrange não somente os anticorpos policlonais ou monoclonais intactos, mas também os fragmentos dos mesmos (tais como dAb, Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv), cadeia única (ScFv), variantes sintéticas do mesmo, variantes de ocorrência natural, proteínas de fusão que compreendem

53 / 394 uma porção de anticorpo com um fragmento de ligação a antígeno de especificidade necessária, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunoglobulina que compreende um local ou fragmento de ligação a antígeno (local de reconhecimento de epítopo) da especificidade requerida.

[0055] Um “anticorpo monoclonal” se refere a uma população de anticorpo homogênea em que o anticorpo monoclonal é compreendido de aminoácidos (de ocorrência natural e de ocorrência não natural) que são envolvidos na ligação seletiva de um epítopo. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos para o antígeno alvo. O termo “anticorpo monoclonal” abrange não somente os anticorpos monoclonais intactos e os anticorpos monoclonais de tamanho natural, mas também os fragmentos do mesmo (tais como Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv), cadeia única (ScFv), variantes do mesmo, proteínas e fusão que compreendem uma porção de ligação a antígeno, anticorpos monoclonais humanizados, anticorpos monoclonais quiméricos, e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunoglobulina que compreende um fragmento de ligação a antígeno (local de reconhecimento de epítopo) da especificidade necessária e a capacidade de ligar a um epítopo. Esta não é intencionada ser limitada com relação à fonte do anticorpo ou a maneira na qual este é feito (por exemplo, por hibridoma, seleção de fago, expressão recombinante, animais transgênicos, etc.). O termo inclui as imunoglobulinas integrais, assim como os fragmentos etc. descritos acima sob a definição de “anticorpo”.

[0056] Como aqui usado, o termo “fragmento de anticorpo” se refere a uma porção derivada de ou relacionada a um anticorpo de tamanho natural, tal como, por exemplo, um anticorpo anti-MASP-2, geralmente incluindo a ligação a antígeno ou região variável do mesmo. Os exemplos ilustrativos dos fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab’, F(ab)2, F(ab’)2 e Fv, fragmentos scFv, diacorpos, anticorpos lineares, moléculas de anticorpo de

54 / 394 cadeia única e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos.

[0057] Como aqui usado, um fragmento de anticorpo “Fv de cadeia única” ou “scFv” compreende os domínios VH e VL de um anticorpo, em que estes domínios estão presentes em uma única cadeia de polipeptídeo. Geralmente, o polipeptídeo Fv compreende ainda um ligador de polipeptídeo entre os domínios VH e VL, que permite ao scFv formar a estrutura desejada para a ligação a antígeno.

[0058] Como aqui usado, um “anticorpo quimérico” é uma proteína recombinante que contém os domínios variáveis e regiões que determinam a complementariedade derivada de um anticorpo de espécie não humana (por exemplo, roedor), enquanto o restante da molécula de anticorpo é derivado de um anticorpo humano.

[0059] Como aqui usado, um “anticorpo humanizado” é um anticorpo quimérico que compreende uma sequência mínima que se conforma às regiões que determinam a complementariedade específica derivadas de imunoglobulina não humana que é transplantada em uma estrutura de anticorpo humano. Os anticorpos humanizados são proteínas tipicamente recombinantes em que somente as regiões determinantes de complementaridade do anticorpo são de origem não humana.

[0060] Como aqui usado, o termo “lectina de ligação de manana” (“MBL”) é equivalente à proteína de ligação de manana (“MBP”).

[0061] Como aqui usado, o “complexo de ataque de membrana” (“MAC”) se refere a um complexo dos cinco componentes complementares terminais (C5b combinado com C6, C7, C8 e C-9) que insere nas e rompe as membranas (também indicado como C5b-9).Como aqui usado, “um indivíduo” inclui todos os mamíferos, incluindo, sem limitação, humanos, primatas não humanos, cães, gatos, cavalos, ovelhas, carneiros, vacas, coelhos, porcos e roedores.

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[0062] Como aqui usado, os resíduos de aminoácido são abreviados como segue: alanina (Ala;A), asparagina (Asn;N), ácido aspártico (Asp;D), arginina (Arg;R), cisteína (Cys;C), ácido glutâmico (Glu;E), glutamina (Gln;Q), glicina (Gly;G), histidina (His;H), isoleucina (Ile;I), leucina (Leu;L), lisina (Lys;K), metionina (Met;M), fenilalanina (Phe;F), prolina (Pro;P), serina (Ser;S), treonina (Thr;T), triptofano (Trp;W), tirosina (Tyr;Y), e valina (Val;V).

[0063] No sentido mais amplo, os aminoácidos de ocorrência natural podem ser divididos em grupos com base na característica química da cadeia lateral dos respectivos aminoácidos. Por aminoácido “hidrofóbica” é intencionado ou Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr, Val, Ala, Cys ou Pro. Por aminoácido “hidrofílico” é intencionado ou Gly, Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, Arg ou His. O grupo de aminoácidos pode ser novamente classificado em subclasses como segue. Por aminoácido “hidrofílico não carregado” é intencionado Ser, Thr, Asn ou Gln. Por aminoácido “ácido” é intencionado Glu ou Asp. Por aminoácido “básico” é intencionado Lys, Arg ou His.

[0064] Como aqui usado o termo “substituição de aminoácido conservativa” é ilustrado por uma substituição entre os aminoácidos dentro de cada um dos seguintes grupos: (1) glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina, (2) fenilalanina, tirosina, e triptofano, (3) serina e treonina, (4) aspartato e glutamato, (5) glutamina e asparagina, e (6) lisina, arginina e histidina.

[0065] O termo “oligonucleotídeo” como aqui usado se refere a um oligômero ou polímero de ácido ribonucleico (RNA) ou ácido desoxirribonucleico (DNA) ou mímicos do mesmo. Este termo também cobre aquelas oligonucleobases compostas de nucleotídeos de ocorrência natural, açúcares e ligações internucleosídicas covalentes (estrutura) assim como oligonucleotídeos tendo modificações de ocorrência não natural.

[0066] Como aqui usado, um “epítopo” se refere ao local em uma

56 / 394 proteína (por exemplo, uma proteína MASP-2 humana) que é ligada por um anticorpo. Os “epítopos sobrepostos” incluem pelo menos um (por exemplo, dois, três, quatro, cinco ou seis) resíduos de aminoácido comuns, incluindo epítopos lineares e non-lineares.

[0067] Como aqui usado, os termos “polipeptídeo,” “peptídeo,” e “proteína” são usados permutavelmente e significam qualquer cadeia de peptídeo-ligados de aminoácidos, sem considerar a extensão ou modificação pós-translacional. A proteína MASP-2 aqui descrita podem conter ou ser proteínas do tipo selvagem ou podem ser variantes que não possuem mais do que 50 (por exemplo, não mais do que uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, ou 50) substituições de aminoácido conservativas. As substituições conservativas tipicamente incluem as substituições dentro dos seguintes grupos: glicina e alanina; valina, isoleucina, e leucina; ácido aspártico e ácido glutâmico; asparagina, glutamina, serina e treonina; lisina, histidina e arginina; e fenilalanina e tirosina.

[0068] Em algumas modalidades, a proteína MASP-2 humana pode ter uma sequência de aminoácidos que é, ou é maior do que, 70 (por exemplo, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100)% idêntica à proteína MASP-2 humana tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 5.

[0069] Em algumas modalidades, os fragmentos de peptídeo podem ser de pelo menos 6 (por exemplo, pelo menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, ou 600 ou mais) resíduos de aminoácido em extensão (por exemplo, pelo menos 6 resíduos de aminoácido contíguos na SEQ ID NO: 5). Em algumas modalidades, um fragmento de peptídeo antígeno de uma

57 / 394 proteína MASP-2 humana é menor do que 500 (por exemplo, menor do que 450, 400, 350, 325, 300, 275, 250, 225, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, ou 6) resíduos de aminoácido de extensão (por exemplo, menor do que 500 resíduos de aminoácido contíguos em qualquer uma das SEQ ID NOS: 5).

[0070] A porcentagem da identidade da sequência de aminoácidos (%) é definida como a porcentagem dos aminoácidos em uma sequência candidata que é idêntica aos aminoácidos em uma sequência de referência, depois de alinhar as sequências e introduzir intervalos, se necessário, para se alcançar a identidade de sequência de porcentagem máxima. O alinhamento para propósitos de determinar a identidade da sequência de porcentagem pode ser obtido de várias maneiras que estão dentro da habilidade na técnica, por exemplo, usando suportes lógicos computacionais publicamente disponíveis tais como suportes lógicos BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 ou Megalign (DNASTAR). Os parâmetros apropriados para medir o alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para se alcançar o alinhamento máximo sobre o tamanho natural das sequências sendo comparadas podem ser determinados através de métodos conhecidos. II. Visão geral da invenção

[0071] As lectinas (MBL, M-ficolina, H-ficolina, L-ficolina e CL-11) são as moléculas de reconhecimento específicas que deflagram o sistema de complemento inato e o sistema inclui o caminho da iniciação da lectina e a alça de amplificação do caminho terminal associada que amplifica a ativação iniciada pela lectina das moléculas efetoras de complemento de terminal. C1q é a molécula de reconhecimento específica que deflagra o sistema de complemento adquirido e o sistema inclui o caminho clássico de iniciação e a alça de amplificação do caminho de terminal associada que amplifica a

58 / 394 ativação iniciada por C1q de moléculas efetoras de complemento de terminal. Nós nos referimos a estes dois sistemas de ativação de complemento principais como o sistema de complemento dependente da lectina e o sistema de complemento dependente de C1q, respectivamente.

[0072] Além do seu papel essencial na defesa imune, o sistema de complemento contribui para o dano de tecido em muitas condições clínicas. Assim, existe uma necessidade premente para desenvolver inibidores de complemento terapeuticamente eficazes para prevenir estes efeitos adversos. Com o reconhecimento de que é possível inibir o caminho de MASP-2 mediada pela lectina enquanto deixa o caminho clássico intacto vem a constatação de que seria altamente desejável inibir especificamente apenas o sistema de ativação de complemento causando uma patologia particular sem completamente paralisar as capacidades de defesa imune de complemento. Por exemplo, em estados de doença nos quais a ativação de complemento é predominantemente mediada pelo sistema de complemento dependente da lectina, seria vantajoso especificamente inibir apenas este sistema. Isto deixaria o sistema de ativação de complemento dependente de C1q intacto para manipular o processamento do complexo imune e ajudar na defesa do hospedeiro contra infecção.

[0073] O componente de proteína preferido para alvejar no desenvolvimento de agentes terapêuticos para inibir especificamente o sistema de complemento dependente da lectina é MASP-2. De todos os componentes de proteína conhecidos do sistema de complemento dependente da lectina (MBL, H-ficolina, M-ficolina, L-ficolina, MASP-2, C2-C9, Fator B, Fator D e properdina), apenas MASP-2 tanto é único para o sistema de complemento dependente da lectina quanto requerido para o sistema funcionar. As lectinas (MBL, H-ficolina, M-ficolina, L-ficolina e CL-11) também são componentes únicos no sistema de complemento dependente da lectina. Entretanto, a perda de qualquer um dos componentes de lectina não

59 / 394 inibiria necessariamente a ativação do sistema devido à redundância da lectina. Seria necessário inibir todas as cinco lectinas de modo a garantir a inibição do sistema de ativação de complemento dependente de lectina. Além disso, visto que MBL e as ficolinas também são conhecidas ter atividade opsônica independente de complemento, a inibição da função da lectina resultaria na perda deste mecanismo benéfico de defesa do hospedeiro contra infecção. Ao contrário, esta atividade opsônica da lectina independente de complemento permaneceria intacta se MASP-2 fosse o alvo inibidor. Um benefício adicional de MASP-2 como o alvo terapêutico para inibir o sistema de ativação de complemento dependente de lectina é que a concentração plasmática de MASP-2 está entre as mais baixas de qualquer proteína de complemento (≈ 500 ng/ml); portanto, concentrações correspondentemente baixas de inibidores de MASP-2 de alta afinidade podem ser suficientes para se obter a inibição total (Moller-Kristensen, M., et al., J. Immunol Methods 282: 159-167, 2003). III. O PAPEL DE MASP-2 NAS MICROANGIOPATIAS TROMBÓTICAS

E MÉTODOS TERAPÊUTICOS USANDO AGENTES INIBIDORES DE MASP-2 Vista Global

[0074] A microangiopatia trombótica (TMA) é uma patologia distinguida pelos coágulos sanguíneos em vasos sanguíneos pequenos (Benz, K.; et al., Curr Opin Nephrol Hypertens 19(3): 242–7 (2010)). Acredita-se que o estresse ou lesão do endotélio vascular subjacente seja um condutor primário. As verificações clínicas e laboratoriais de TMA incluem trombocitopenia, anemia, púrpura e insuficiência renal. As TMAs clássicas são a síndrome urêmica hemolítica (HUS) e a púrpura trombocitopênica trombótica (TTP). As características patológicas subjacentes de TMAs são a ativação de plaqueta e a formação de microtrombos nas arteríolas e vênulas pequenas. A ativação de complemento iniciada, pelo menos em parte, por

60 / 394 uma lesão ou estresse ao endotélio microvascular, também é implicado em outras TMAs incluindo a Síndrome Antifosfolipídica Catastrófica (CAPS), doença de Degos sistêmica e TMAs secundárias ao câncer, quimioterapia contra o câncer e transplante.

[0075] Evidência direta para um papel patológico de complemento em um hospedeiro de nefrite é provido pelos estudos de pacientes com deficiências genéticas em componentes específicos de complemento. Vários relatos documentaram uma associação de lesão renal com deficiências de fator H regulador de complemento (Ault, B.H., Nephrol. 14: 1045-1053, 2000; Levy, M., et al., Kidney Int. 30: 949-56, 1986; Pickering, M.C., et al., Nat. Genet. 31: 424-8, 2002). A deficiência de fator H resulta em níveis plasmáticos baixos de fator B e C3 devido ao consumo relacionado com a ativação destes componentes. Os níveis circulantes de C5b-9 também são elevados no soro destes pacientes, implicando na ativação de complemento. A glomerulonefrite membranoproliferativa (MPGN) e a síndrome urêmica hemolítica (HUS) idiopática estão associadas com a deficiência do fator H ou mutações do fator H. Porcos deficientes no fator H (Jansen, J.H., et al., Kidney Int. 53: 331-49, 1998) e camundongos knockout no fator H (Pickering, M.C., 2002) demonstram sintomas tipo MPGN, confirmando a importância do fator H na regulagem de complemento. Deficiências de outros componentes de complemento estão associadas com doença renal, secundária ao desenvolvimento de lúpus eritematoso sistêmico (SLE) (Walport, M.J., Davies, et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 815: 267-81, 1997). A deficiência de C1q, C4 e C2 predispõem fortemente ao desenvolvimento de SLE por intermédio de mecanismos referentes à depuração defeituosa de complexos imunes e material apoptótico. Em muitos destes pacientes com SLE a nefrite de lúpus ocorre, distinguida pela deposição de complexos imunes por todo o glomérulo. aHUS

61 / 394

[0076] A síndrome urêmica hemolítica atípica (aHUS) é parte de um grupo de condições chamadas de “Microangiopatias Trombóticas”. Na forma atípica de HUS (aHUS), a doença está associada com a regulagem de complemento defeituosa e pode ser esporádica ou familiar. Os casos familiares de aHUS estão associados com mutações nos genes codificando a ativação de complemento ou proteínas reguladoras de complemento, incluindo fator de complemento H, fator I, fator B, cofator de membrana CD46 assim como proteína relacionada com o fator H de complemento 1 (CFHR1) e proteína relacionada com o fator H de complemento 3 (CFHR3). (Zipfel, P.F., et al., PloS Genetics 3(3): e41 (2007)). O traço unificador deste arranjo diverso de mutações genéticas associadas com aHUS é uma predisposição para a ativação de complemento realçada nas superfícies celulares ou teciduais. Portanto, um aspecto da presente invenção compreende tratar um paciente sofrendo com aHUS que está associada com uma deficiência do fator H pela administrar de uma quantidade eficaz de um agente inibidor de MASP-2. Um outro aspecto da presente invenção compreende tratar um paciente sofrendo com HUS que está associada com um fator I, fator B, cofator de membrana CD46, deficiência de CFHR1 ou CFHR3 pela administração de uma quantidade eficaz de um agente inibidor de MASP-2.

[0077] Progresso significante foi feito recentemente para o entendimento da ativação de complemento realçada subjacente à fisiopatologia molecular na aHUS causada pelo conjunto diverso de fatores de complemento mutante. Este mecanismo é melhor entendido para as mutações do fator H. O fator H é uma proteína sérica abundante compreendendo 20 domínios de repetição de consenso curta (SCR) que atua como um regulador negativo de ativação de complemento tanto em solução assim como nas superfícies da célula hospedeira. O mesmo alveja a forma ativada de C3 e, junto com o fator I e outros cofatores, promove a sua inativação, impedindo a

62 / 394 ativação adicional de complemento. Para controlar eficazmente a ativação de complemento nas superfícies da célula hospedeira, o fator H precisa interagir com as células hospedeiras, que é mediado pelos domínios SCR 16-20. Todas as mutações do fator H associadas com aHUS descritas até agora são agrupadas nos domínios abrangendo a região de terminal C (SCR) 16-20. Estas proteínas mutantes do fator H são totalmente funcionais no controle da ativação de C3 em solução, mas são incapazes de interagir com as superfícies da célula hospedeira e consequentemente não podem controlar a ativação de C3 nas superfícies celulares (Exp Med 204(6): 1249-56 (2007)). Assim, certas mutações de fator H estão associadas com aHUS porque a proteína mutante do fator H falha em interagir com as superfícies da célula hospedeira e assim não podem inframodular eficazmente a ativação de complemento nas superfícies da célula hospedeira, incluindo o endotélio microvascular. Como um resultado, uma vez que a ativação de C3 inicial ocorreu, a ativação de complemento subsequente nas superfícies endoteliais microvasculares prossegue inalterada em pacientes com mutações do fator H. Esta ativação descontrolada de complemento por fim leva à lesão progressiva ao endotélio vascular, agregação de plaqueta subsequente e coagulação microvascular e hemólise causada pelo estresse no cisalhamento da passagem de RBC através dos microvasos parcialmente fechado. Assim, manifestações da doença de aHUS e as verificações clínicas e laboratoriais estão diretamente ligadas a um defeito na regulagem negativa de complemento na superfície do endotélio microvascular.

[0078] Análogas à mutação do fator H, as mutações de perda de função nos moduladores de complemento negativos fator I e cofator de proteína de membrana (CD46) também são ligadas a aHUS. O oposto foi observado para o fator B a proteína C3 na qual aHUS foi verificada estar associada com as mutações de ganho de função nestas proteínas (Pediatr Nephrol 25(12): 2431-42 (2010)). Assim, um hospedeiro de dados

63 / 394 convergentes implica a ativação de complemento na patogênese da aHUS. Esta noção é mais convincentemente sustentada pela eficácia terapêutica de ofeculizumab, um anticorpo monoclonal que bloqueia a proteína de complemento de terminal C5 no tratamento da aHUS.

[0079] Embora o papel central de complemento como um mecanismo efetor na aHUS seja amplamente aceito, os deflagradores que iniciam a ativação de complemento e os caminhos moleculares envolvidos não estão resolvidos. Nem todos os indivíduos que carregam as mutações descritas acima desenvolvem aHUS. De fato, estudos familiares têm sugerido que a penetração da aHUS é de apenas ~50% (Ann Hum Genet 74(1): 17-26 (2010)). A história natural da doença sugere que aHUS mais frequentemente se desenvolve depois de um evento iniciador tal como um episódio infeccioso ou uma lesão. Os agentes infecciosos são bem conhecidos para ativar o sistema de complemento. Na ausência de imunidade adaptativa pré-existente, a ativação de complemento pelos agentes infecciosos pode ser primariamente iniciada por intermédio do caminho da lectina. Assim, a ativação do caminho da lectina deflagrado por uma infecção pode representar o gatilho iniciador para a amplificação patológica subsequente da ativação de complemento em indivíduos predispostos à aHUS, que pode por fim levar à progressão da doença. Consequentemente, um outro aspecto da presente invenção compreende tratar um paciente sofrendo com aHUS secundária a uma infecção pela administração de uma quantidade eficaz de um agente inibidor de MASP-2.

[0080] Outras formas de lesão ao tecido hospedeiro ativará complemento por intermédio do caminho da lectina, em particular lesão ao endotélio vascular. As células endoteliais vasculares humanas submetidas ao estresse oxidativo por exemplo respondem pela expressando porções de superfície que ligam lectinas e ativam o caminho da lectina de complemento (Am J. Pathol 156(6): 1549-56 (2000)). A lesão vascular a seguir da

64 / 394 isquemia/reperfusão também ativa complemento por intermédio do caminho da lectina in vivo (Scand J Immunol 61(5): 426-34 (2005)). A ativação do caminho da lectina neste ambiente tem consequências patológicas para o hospedeiro e a inibição do caminho da lectina pelo bloqueio de MASP-2 previne lesão tecidual adicional no hospedeiro e resultados adversos (Schwaeble PNAS 2011).

[0081] Assim, outros processos que precipitam aHUS também são conhecidos ativar o caminho da lectina de complemento. É portanto provável que o caminho da lectina possa representar o mecanismo ativador de complemento inicial que é inadequadamente amplificado em uma maneira desregulada em indivíduos geneticamente predispostos à aHUS, iniciando assim a patogênese da aHUS. Por inferência, os agentes que bloqueiam a ativação de complemento por intermédio do caminho da lectina, incluindo anticorpos anti-MASP-2, são esperados prevenir a progressão da doença ou reduzir as exacerbações nos indivíduos susceptíveis à aHUS.

[0082] Em suporte adicional deste conceito, estudos recentes identificaram a S. pneumoniae como um agente etiológico importante em casos pediátricos de aHUS. (Nephrology (Carlton), 17: 48-52 (2012); Pediatr Infect Dis J. 30(9): 736-9 (2011)). Esta etiologia particular parece ter um prognóstico desfavorável, com mortalidade significante e morbidez de longa duração. Notavelmente, estes casos envolveram infecções não entéricas levando às manifestações de microangiopatia, uremia e hemólise sem evidência de mutações concorrentes em genes de complemento conhecidas predispor à aHUS. É importante mencionar que a S. pneumoniae é particularmente eficaz na ativação de complemento e assim o faz predominantemente através do caminho da lectina. Assim, em casos de HUS não entérica associada com infecção pneumocócica, manifestações de microangiopatia, uremia e hemólise são esperadas ser acionadas predominantemente pela ativação do caminho da lectina e agentes que

65 / 394 bloqueiam o caminho da lectina, incluindo anticorpos anti-MASP-2, são esperados prevenir a progressão da aHUS ou reduzir a severidade da doença nestes pacientes. Consequentemente, um outro aspecto da presente invenção compreende tratar um paciente sofrendo com aHUS não entérica que está associada com infecção pela S. pneumoniae pela administração de uma quantidade eficaz de um agente inibidor de MASP-2.

[0083] De acordo com o precedente, em algumas modalidades, no ambiente de um sujeito em risco de desenvolver insuficiência renal associada com aHUS, um método é provido para diminuir a probabilidade de desenvolver aHUS ou de desenvolver insuficiência renal associada com aHUS, compreendendo administrar uma quantidade de um agente inibidor de MASP-2 durante um período de tempo eficaz para melhorar ou prevenir a insuficiência renal no sujeito. Em algumas modalidades, o método compreende ainda a etapa de determinar se um sujeito está em risco de desenvolver aHUS antes do início de quaisquer sintomas associados com aHUS. Em outras modalidades, o método compreende determinar se um sujeito está em risco de desenvolver aHUS no início de pelo menos um ou mais sintomas indicativos de aHUS (por exemplo, a presença de anemia, trombocitopenia e/ou insuficiência renal) e/ou a presença de microangiopatia trombótica em uma biópsia obtida do sujeito. A determinação de se um sujeito está em risco de desenvolver aHUS compreende determinar se o sujeito tem uma predisposição genética para desenvolver aHUS, que pode ser realizada pela avaliação da informação genética (por exemplo a partir de uma base de dados contendo o genótipo do sujeito) ou realizando pelo menos um teste de triagem genética no sujeito para determinar a presença ou ausência de um marcador genético associado com aHUS (isto é, determinar a presença ou ausência de uma mutação genética associada com aHUS nos genes codificando o fator de complemento H (CFH), fator I (CFI), fator B (CFB), cofator de membrana CD46, C3, proteína relacionada com o fator H de

66 / 394 complemento 1 (CFHR1) ou THBD (codificando a proteína anticoagulante trombodulina) ou proteína relacionada com o fator H de complemento 3 (CFHR3) ou proteína relacionada com o fator H de complemento 4 (CFHR4)) por intermédio de sequenciamento de genoma ou análise específica de gene (por exemplo, análise pela PCR) e/ou determinar se o sujeito tem um histórico familiar de aHUS. Métodos de triagem genética quanto à presença ou ausência de uma mutação genética associada com aHUS são bem estabelecidos, por exemplo, ver Noris M et al. “Atypical Hemolytic-Uremic Syndrome,” 16 de novembro de 2007 [Atualizada em 10 de março de 2011]. Em: Pagon RA, Bird TD, Dolan CR, et al., editores. GeneReviews®, Seattle (WA): University of Washington, Seattle.

[0084] Por exemplo, de ponta a ponta a penetração da doença naqueles com mutações do fator de complemento H (CFH) é de 48% e a penetração para mutações em CD46 é de 53%, para mutações em CFI é de 50%, para mutações em C3 é de 56% e para mutações em THBD é de 64% (Caprioli J. et al., Blood, 108: 1267-79 (2006); Noris et al., Clin J Am Soc Nephrol 5: 1844-59 (2010)). Como descrito em Caprioli et al., (2006), supra, um número substancial de indivíduos com uma mutação no fator de complemento H (CFH) nunca desenvolvem aHUS e é postulado que a atividade de CFH subótima nestes indivíduos é suficiente para proteger o hospedeiro dos efeitos da ativação de complemento em condições fisiológicas, entretanto, a atividade subótima de CFH não é suficiente para prevenir C3b de ser depositado nas células endoteliais vasculares quando a exposição a um agente que ativa complemento produz quantidades mais altas que o normal de C3b.

[0085] Consequentemente, em uma modalidade, um método é provido para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2 em um sujeito sofrendo de ou em risco de desenvolver síndrome urêmica hemolítica atípica não dependente do Fator H, compreendendo administrar ao sujeito uma

67 / 394 composição compreendendo uma quantidade de um agente inibidor de MASP-2 eficaz para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-

2. Em uma outra modalidade, um método é provido para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2 em um sujeito em risco de desenvolver a síndrome urêmica hemolítica atípica dependente do Fator H, compreendendo periodicamente monitorar o sujeito para determinar a presença ou ausência de anemia, trombocitopenia ou aumento da creatinina e tratar com um agente inibidor de MASP-2 na determinação da presença de anemia, trombocitopenia ou aumento da creatinina. Em uma outra modalidade, um método é provido para reduzir a probabilidade de que um sujeito em risco de desenvolver aHUS dependente do Fator H sofrerá de sintomas clínicos associados com aHUS, compreendendo administrar um agente inibidor de MASP-2 antes ou durante ou depois de um evento conhecido estar associado com a deflagração de sintomas clínicos da aHUS, por exemplo, exposição a fármaco (por exemplo, quimioterapia), infecção (por exemplo, infecção bacteriana), malignidade, uma lesão, transplante de órgão ou tecido ou gravidez.

[0086] Em uma modalidade, um método é provido para reduzir a probabilidade de que um sujeito em risco de desenvolver aHUS sofrerá de sintomas clínicos associados com aHUS, compreendendo periodicamente monitorar o sujeito para determinar a presença ou ausência de anemia, trombocitopenia ou aumento da creatinina e tratar com um agente inibidor de MASP-2 na determinação da presença de anemia, trombocitopenia ou aumento da creatinina.

[0087] Em uma outra modalidade, um método é provido para reduzir a probabilidade de que um sujeito em risco de desenvolver aHUS sofrerá de sintomas clínicos associados com aHUS compreendendo administrar um agente inibidor de MASP-2 antes ou durante ou depois de um evento conhecido estar associado com a deflagração de sintomas clínicos da aHUS,

68 / 394 por exemplo, exposição a fármaco (por exemplo, quimioterapia), infecção (por exemplo, infecção bacteriana), malignidade, uma lesão, transplante de órgão ou tecido ou gravidez.

[0088] Em algumas modalidades, o agente inibidor de MASP-2 é administrado durante um período de tempo de pelo menos um, dois, três, quatro dias ou mais longo, antes, durante ou depois do evento associado com a deflagração de sintomas clínicos da aHUS e podendo ser repetido como determinado por um médico até que a condição tenha sido resolvida ou esteja controlada. Em um ambiente pré-aHUS, o agente inibidor de MASP-2 pode ser administrado ao sujeito sistemicamente, tal como pela administração intra- arterial, intravenosa, intramuscular, inalacional, nasal, subcutânea ou outra administração parenteral.

[0089] Em algumas modalidades, no ambiente de diagnóstico inicial de aHUS ou em um sujeito exibindo um ou mais sintomas compatíveis com um diagnóstico de aHUS (por exemplo, a presença de anemia, trombocitopenia e/ou insuficiência renal), o sujeito é tratado com uma quantidade eficaz de um agente inibidor de MASP-2 (por exemplo, um anticorpo anti-MASP-2) como uma terapia de primeira linha na ausência de plasmaférese ou em combinação com plasmaférese. Como uma terapia de primeira linha, o agente inibidor de MASP-2 pode ser administrado ao sujeito sistemicamente, tal como pela administração intra-arterial, intravenosa, intramuscular, inalacional, nasal, subcutânea ou outra administração parenteral. Em algumas modalidades, o agente inibidor de MASP-2 é administrado a um sujeito como uma terapia de primeira linha na ausência de plasmaférese para evitar as complicações potenciais de plasmaférese incluindo hemorragia, infecção e exposição aos distúrbios e/ou alergias inerentes no doador de plasma ou em um sujeito de outro modo avesso à plasmaférese ou em um ambiente onde a plasmaférese não esteja disponível.

[0090] Em algumas modalidades, o método compreende administrar

69 / 394 um agente inibidor de MASP-2 a um sujeito sofrendo de aHUS por intermédio de um cateter (por exemplo, intravenosamente) durante um primeiro período de tempo (por exemplo, pelo menos um dia a uma semana ou duas semanas) seguido pela administração de um agente inibidor de MASP-2 ao sujeito subcutaneamente durante um segundo período de tempo (por exemplo, uma fase crônica de pelo menos duas semanas ou mais longa). Em algumas modalidades, a administração no primeiro e/ou segundo períodos de tempo ocorre na ausência de plasmaférese. Em algumas modalidades, o método compreende ainda determinar o nível de pelo menos um fator de complemento (por exemplo, C3, C5) no sujeito antes do tratamento e opcionalmente durante o tratamento, em que a determinação de um nível reduzido de pelo menos um fator de complemento em comparação a um valor padrão ou sujeito de controle saudável é indicativo da necessidade quanto ao tratamento continuado com o agente inibidor de MASP-2.

[0091] Em algumas modalidades, o método compreende administrar um agente inibidor de MASP-2, tal como um anticorpo anti-MASP-2, a um sujeito sofrendo de ou em risco de desenvolver, aHUS intravenosamente, intramuscularmente ou preferivelmente, subcutaneamente. O tratamento pode ser crônico e administrado diariamente a mensalmente, mas preferivelmente a cada duas semanas. O anticorpo anti-MASP-2 pode ser administrado sozinho ou em combinação com um inibidor de C5, tal como eculizamab.

HUS

[0092] Como a HUS atípica, a forma típica de HUS exibe todas as verificações clínicas e laboratoriais de uma TMA. A HUS típica, entretanto, é frequentemente uma doença pediátrica e usualmente não tem nenhum componente familiar ou associação direta com mutações nos genes de complemento. A etiologia da HUS típica está firmemente ligada à infecção com certos patógenos intestinais. Os pacientes tipicamente se apresentam com insuficiência renal aguda, hemoglobinuria e trombocitopenia, que tipicamente

70 / 394 segue um episódio de diarreia sanguinolenta. A condição é causada por uma infecção entérica com Shigella dissenteria, Salmonella ou toxina semelhante à shiga produzindo cepas entero-hemorrágicas de E. coli. tais como a E. coli O157:H7. Os patógenos são adquiridos de alimentos ou abastecimentos de água contaminados. A HUS é uma emergência médica e carrega uma mortalidade de 5 a 10%. Uma porção significante de sobreviventes desenvolvem doença renal crônica (Corrigan e Boineau, Pediatr Rev 22 (11): 365–9 (2011)) e pode requerer transplante renal.

[0093] A coagulação microvascular na HUS típica ocorre predominantemente, embora não exclusivamente, na microvasculatura renal. A fisiopatologia subjacente é mediada pela toxina de Shiga (STX). Excretada pelos micróbios enteropáticos dentro do lúmen intestinal, a STX cruza a barreira intestinal, entra na corrente sanguínea e se liga às células endoteliais vasculares por intermédio do receptor blobotriaosil ceramida CD77 (Boyd e Lingwood Nephron 51:207 (1989)), que é preferencialmente expresso no endotélio glomerular e medeia o efeito tóxico de STX. Uma vez ligado ao endotélio, a STX induz uma série de eventos que danificam o endotélio vascular, ativam leucócitos e causam a formação de trombo dependente de vWF (Forsyth et al., Lancet 2: 411–414 (1989); Zoja et al., Kidney Int. 62: 846–856 (2002); Zanchi et al., J. Immunol. 181: 1460–1469 (2008); Morigi et al., Blood 98: 1828–1835 (2001); Guessou et al., Infect. Immun., 73: 8306– 8316 (2005)). Estes microtrombos obstruem ou fecham as arteríolas e capilares dos rins e de outros órgãos. A obstrução do fluxo sanguíneo nas arteríolas e capilares pelos microtrombos aumenta a força de cisalhamento aplicada às RBCs conforme elas se espremem através dos vasos sanguíneos estreitados. Isto pode resultar na destruição de RBC pela força de cisalhamento e a formação de fragmentos de RBC chamados de esquizócitos. A presença de esquizócitos é uma verificação característica na HUS. Este mecanismo é conhecido como hemólise microangiopática. Além disso, a

71 / 394 obstrução do fluxo sanguíneo resulta em isquemia, iniciando uma resposta inflamatória mediada por complemento que causa dano adicional ao órgão afetado.

[0094] O caminho da lectina de complemento contribui para a patogênese de HUS pelos mecanismos principais: 1) ativação direta mediada por MASP-2 da cascata de coagulação causada pela lesão endotelial e 2) ativação de complemento subsequente mediada pela lectina induzida pela isquemia resultante da oclusão inicial do fluxo sanguíneo microvascular.

[0095] A STX lesa as células endoteliais microvasculares e as células endoteliais lesadas são conhecidas ativar o sistema de complemento. Como detalhado acima, a ativação de complemento a seguir da lesão de célula endotelial é predominantemente conduzido pelo caminho da lectina. As células endoteliais vasculares humanas sujeitas ao estresse oxidativo respondem pela expressão de porções superficiais que ligam lectinas e ativam o caminho da lectina de complemento (Collard et al., Am J Pathol. 156(5): 1549-56 (2000)). A lesão vascular a seguir da reperfusão da isquemia também ativa complemento por intermédio do caminho da lectina in vivo (Scand J Immunol 61(5): 426-34 (2005)). A ativação do caminho da lectina neste ambiente tem consequências patológicas para o hospedeiro e a inibição do caminho da lectina pelo bloqueio de MASP-2 previne lesão tecidual adicional para o hospedeiro e resultados adversos (Schwaeble et al., PNAS (2011)). Além da ativação de complemento, a ativação dependente da lectina de MASP-2 foi mostrada resultar na clivagem de protrombina para formar trombina e para promover a coagulação. Assim, a ativação do caminho da lectina de complemento pelas células endoteliais lesadas pode diretamente ativar o sistema de coagulação. O caminho da lectina de complemento, em virtude da ativação da protrombina mediada por MASP-2, portanto é provavelmente o caminho molecular dominante ligando a lesão endotelial inicial pela STX à coagulação e trombose microvascular que ocorre na HUS.

72 / 394 É, portanto, esperado que os inibidores do caminho da lectina, incluindo, mas não limitado a anticorpos que bloqueiam a função de MASP-2, prevenirá ou mitigará a coagulação microvascular, trombose e hemólise em pacientes sofrendo de HUS. De fato, a administração de anticorpo anti-MASP-2 profundamente protege os camundongos em um modelo de HUS típica. Como descrito no Exemplo 36 e mostrado na FIGURA 45, todos camundongos de controle expostos à STX e LPS desenvolveram HUS severa e ficaram moribundos ou morreram dentro de 48 horas. Por outro lado, como mostrado adicionalmente na FIGURA 45, todos os camundongos tratados com um anticorpo anti-MASP-2 e depois expostos à STX e LPS sobreviveram (exato de Fisher p<0,01; N=5). Assim, a terapia anti-MASP-2 protege profundamente os camundongos neste modelo de HUS. É esperado que a administração de um agente inibidor de MASP-2, tal como um anticorpo MASP-2, seja eficaz no tratamento de pacientes com HUS e proveja proteção da coagulação microvascular, trombose e hemólise causada pela infecção com E. coli enteropática ou outros patógenos que produzem STX.

[0096] Embora aqui mostrado para HUS causada pela STX, é esperado que a terapia anti-MASP-2 também será benéfica para as síndromes tipo HUS devido à lesão endotelial causada por outros agentes tóxicos. Isto inclui agentes tais como mitomicina, ticlopidina, cicplatina, quinina, ciclosporina, bleomicina assim como outros fármacos para quimioterapia e fármacos imunossupressivos. Assim, é esperado que a terapia de anticorpo anti-MASP-2 ou outras modalidades que inibam a atividade de MASP-2 eficazmente impedirão ou limitarão a coagulação, formação de trombo e destruição de RBC e prevenirão a insuficiência renal na HUS e outras doenças relacionadas com TMA (isto é, aHUS e TTP).

[0097] Os pacientes sofrendo de HUS frequentemente se apresentam com diarreia e vômito, a sua contagem de plaquetas é usualmente reduzida (trombocitopenia) e RBCs são reduzidas (anemia). Uma fase de diarreia pré-

73 / 394 HUS tipicamente dura por cerca de quatro dias, durante a qual os sujeitos em risco de desenvolver HUS tipicamente exibem um ou mais dos seguintes sintomas além da diarreia severa: um nível de hematócrito abaixo de 30% com evidência no esfregaço de destruição de eritrócito intravascular, trombocitopenia (contagem de plaqueta <150 x 103/mm3) e/ou a presença de função renal prejudicada (concentração de creatinina sérica maior do que o limite superior da faixa de referência para a idade). A presença de oligoanuria (débito urinário ≤0,5 mL/kg/h por >1 dia) pode ser usada como uma medida para a progressão para desenvolver HUS (ver C. Hickey et al., Arch Pediatr Adolesc Med 165(10): 884-889 (2011)). O teste é tipicamente realizado quanto à presença de infecção com bactérias E. coli (E. coli O157:H7) ou espécies Shigella ou Salmonella. Em um sujeito testando positivo para infecção com E. coli enterogênica (por exemplo, E. coli 0157:H7), o uso de antibióticos é contraindicado porque o uso de antibióticos pode aumentar o risco de desenvolver HUS através da produção aumentada de STX (Ver Wong C. et al., N Engl J. Med 342: 1930-1936 (2000). Para os sujeitos testando positivo para Shigella ou Salmonella, antibióticos são tipicamente administrados para depurar a infecção. Outra terapia de primeira linha bem estabelecida para HUS inclui a expansão de volume, diálise e plasmaférese.

[0098] De acordo com o precedente, em algumas modalidades, no ambiente de um sujeito sofrendo de um ou mais sintomas associados com uma fase pré-HUS e em risco de desenvolver HUS (isto é, o sujeito exibe um ou mais dos seguintes: diarreia, um nível de hematócrito menor do que 30% com evidência no esfregaço de destruição de eritrócito intravascular, trombocitopenia (contagem de plaqueta menor do que 150 x 103/mm3) e/ou a presença de função renal prejudicada (concentração de creatinina sérica maior do que o limite superior da faixa de referência para a idade)), um método é provido para diminuir o risco de desenvolver HUS ou para diminuir a probabilidade de insuficiência renal no sujeito, compreendendo administrar

74 / 394 uma quantidade de um agente inibidor de MASP-2 durante um período de tempo eficaz para melhorar ou prevenir a função renal prejudicada. Em algumas modalidades, o agente inibidor de MASP-2 é administrado durante um período de tempo de pelo menos um, dois, três, quatro ou mais dias e pode ser repetido como determinado por um médico até que a condição tenha sido resolvida ou esteja controlada. Em um ambiente pré-HUS, o agente inibidor de MASP-2 pode ser administrado ao sujeito sistemicamente, tal como pela administração intra-arterial, intravenosa, intramuscular, inalacional, nasal, oral, subcutânea ou outra administração parenteral.

[0099] O tratamento da infecção pela E. coli 0157:H7 com antibióticos bactericidas, particularmente β-lactamas, foi associada com um risco aumentado de desenvolver HUS (Smith et al., Pediatr Infect Dis J 31(1): 37-41 (2012). Em algumas modalidades, no ambiente de um sujeito sofrendo de sintomas associados com uma fase pré-HUS, em que o sujeito é conhecido ter uma infecção com E. coli enterogênica para a qual o uso de antibióticos é contraindicado (por exemplo, E. coli 0157:H7), um método é provido para diminuir o risco de desenvolver HUS ou para diminuir a probabilidade de insuficiência renal no sujeito, compreendendo administrar uma quantidade de um agente inibidor de MASP-2 durante um primeiro período de tempo eficaz para inibir ou prevenir a presença de oligoanuria no sujeito (por exemplo, pelo menos um, dois, três ou quatro dias), em que a administração do agente inibidor de MASP-2 durante o primeiro período de tempo ocorre na ausência de um antibiótico. Em algumas modalidades, o método compreende ainda administrar o agente inibidor de MASP-2 ao sujeito em combinação com um antibiótico durante um segundo período de tempo (tal como pelo menos uma a duas semanas).

[00100] Em outras modalidades, no ambiente de um sujeito sofrendo de sintomas associados com uma fase pré-HUS, em que o sujeito é conhecido ter uma infecção com Shigella ou Salmonella, um método é provido para

75 / 394 diminuir o risco de desenvolver HUS ou para diminuir a probabilidade de insuficiência renal no sujeito, compreendendo administrar uma quantidade de um agente inibidor de MASP-2 e durante um período de tempo eficaz para inibir ou prevenir a presença de oligoanuria no sujeito, em que a administração do agente inibidor de MASP-2 é na presença ou na ausência de um antibiótico adequado.

[00101] Em algumas modalidades, no ambiente de um diagnóstico inicial de HUS ou em um sujeito exibindo um ou mais sintomas compatíveis com um diagnóstico de HUS (por exemplo, a presença de insuficiência renal ou anemia hemolítica microangiopática na ausência de fibrinogênio baixo ou trombocitopenia) o sujeito é tratado com uma quantidade eficaz de um agente inibidor de MASP-2 (por exemplo um anticorpo anti-MASP-2) como uma terapia de primeira linha na ausência de plasmaférese ou em combinação com plasmaférese. Como uma terapia de primeira linha, o agente inibidor de MASP-2 pode ser administrado ao sujeito sistemicamente, tal como pela administração intra-arterial, intravenosa, intramuscular, inalacional, nasal, subcutânea ou outra administração parenteral. Em algumas modalidades, o agente inibidor de MASP-2 é administrado a um sujeito como uma terapia de primeira linha na ausência de plasmaférese para evitar as complicações da plasmaférese tais como hemorragia, infecção e exposição aos distúrbios e/ou alergias inerentes no doador de plasma ou em um sujeito de outro modo avesso à plasmaférese ou em um ambiente onde a plasmaférese não esteja disponível.

[00102] Em algumas modalidades, o método compreende administrar um agente inibidor de MASP-2 a um sujeito sofrendo de HUS por intermédio de um cateter (por exemplo, intravenosamente) durante um primeiro período de tempo (por exemplo, uma fase aguda durando pelo menos um dia a uma semana ou duas semanas) seguida pela administração de um agente inibidor de MASP-2 ao sujeito subcutaneamente durante um segundo período de

76 / 394 tempo (por exemplo, uma fase crônica de pelo menos duas semanas ou mais longa). Em algumas modalidades, a administração no primeiro e/ou segundo períodos de tempo ocorre na ausência de plasmaférese. Em algumas modalidades, o método compreende ainda determinar o nível de pelo menos um fator de complemento (por exemplo, C3, C5) no sujeito antes do tratamento e opcionalmente durante tratamento, em que a determinação de um nível reduzido do pelo menos um fator de complemento em comparação a um valor padrão ou sujeito de controle saudável é indicativo da necessidade para tratamento e em que a determinação de um nível normal é indicativo de melhora.

[00103] Em algumas modalidades, o método compreende administrar um agente inibidor de MASP-2, tal como um anticorpo anti-MASP-2, a um sujeito sofrendo de ou em risco de desenvolver, HUS subcutaneamente ou intravenosamente. O tratamento é preferivelmente diário, mas pode ser tão infrequente como semanalmente ou mensalmente. O tratamento continuará durante pelo menos uma semana e tão longo quanto 3 meses. O anticorpo anti-MASP-2 pode ser administrado sozinho ou em combinação com um inibidor de C5, tal como eculizamab. TTP:

[00104] A púrpura trombocitopênica trombótica (TTP) é um distúrbio potencialmente letal do sistema de coagulação do sangue causado pelas disfunções autoimunes ou hereditárias que ativam a cascata de coagulação ou o sistema de complemento (George, JN, N Engl J Med; 354: 1927-35, 2006). Isto resulta em numerosos coágulos microscópicos, ou tromboses, em vasos sanguíneos pequenos por todo o corpo. As células sanguíneas vermelhas são submetidas ao estresse de cisalhamento, que danifica as suas membranas, levando à hemólise intravascular. O fluxo sanguíneo reduzido resultante e a lesão endotelial resulta em dano ao órgão, incluindo cérebro, coração, e rins. A TTP é clinicamente distinguida pela trombocitopenia, anemia hemolítica

77 / 394 microangiopática, mudanças neurológicas, insuficiência renal e febre. Na era antes da troca de plasma, a taxa de fatalidade foi de 90% durante os episódios agudos. Mesmo com a troca de plasma, a sobrevivência de seis meses é de cerca de 80%.

[00105] A TTP pode surgir da inibição genética ou adquirida da enzima ADAMTS-13, uma metaloprotease responsável pela clivagem de multímeros grandes do fator de von Willebrand (vWF) em unidades menores. A inibição ou deficiência de ADAMTS-13 por fim resulta na coagulação aumentada (Tsai, H. J Am Soc Nephrol 14: 1072–1081, 2003). ADAMTS-13 regula a atividade de vWF; na sua ausência, vWF forma multímeros grandes que são mais prováveis de ligar plaquetas e predispor os pacientes à agregação de plaqueta e trombose na microvasculatura.

[00106] A síndrome de Upshaw-Schulman (USS, também descrita como TTP congênita) é uma deficiência congênita da atividade de ADAMTS13 devido às mutações do gene ADAMTS13 (Schulman et al., Blood, 16(1): 943-57, 1960; Upshaw et al., New Engl. J. Med, 298 (24): 1350- 2, 1978). Numerosas mutações em ADAMTS13 foram identificadas em indivíduos com TTP congênita (Kinoshita et al., International Journal of Hematology, 74: 101-108 (2001); Levy et al., Nature, 413 (6855): 488-494 (2001); Kokame et al., PNAS 99(18): 11902-11907 (2002); Savasan et al., Blood, 101: 4449-4451 (2003); Matsumoto et al., Blood, 103: 1305-1310 (2004) e Fujimura et al., Brit. J. Haemat 144: 742-754 (2008)). Sujeitos com USS tipicamente têm 5 a 10% de atividade de ADAMTS13 normal (Kokame et al., PNAS 99(18): 11902-11907, 2002). Embora a TTP e USS adquiridas tenham algumas similaridades, a USS tem algumas diferenças importantes nos traços clínicos. A USS usualmente se apresenta na infância ou meninice e é distinguida pela hiperbilirrubinemia severa com teste de Coombs negativo logo depois do nascimento, resposta à infusão de plasma fresco e recaídas frequentes (Savasan et al., Blood, 101: 4449-4451, 2003). Em alguns casos,

78 / 394 pacientes com esta deficiência de ADAMTS13 herdada têm um fenótipo brando no nascimento e apenas desenvolvem sintomas associados com TTP em situações clínicas com níveis do fator de von Willebrand aumentados, tais como infecção ou gravidez. Por exemplo, Fujimura et al. relataram 9 mulheres japonesas de 6 famílias com USS geneticamente confirmada que foram diagnosticadas com o distúrbio durante a sua primeira gravidez. A trombocitopenia ocorreu durante o segundo ao terceiro trimestres em cada uma de suas 15 gravidezes, frequentemente seguida pela TTP. Todas estas mulheres foram verificadas serem severamente deficientes na atividade de ADAMTS13 (Fujimura et al., Brit. J. Haemat 144: 742-754, 2008).

[00107] De acordo com o precedente, em algumas modalidades, no ambiente de um sujeito com Síndrome de Upshaw-Schulman (USS) (isto é, o sujeito é conhecido ser deficiente na atividade de ADAMTS13 e/ou o sujeito é conhecido ter uma ou mais mutação(ões) do gene ADAMTS13), um método é provido para diminuir a probabilidade de desenvolver sintomas clínicos associados com a TTP congênita (por exemplo, trombocitopenia, anemia, febre e/ou insuficiência renal) compreendendo administrar uma quantidade de um agente inibidor de MASP-2 (por exemplo, um anticorpo de MASP-2) durante um período de tempo eficaz para melhorar ou prevenir um ou mais sintomas clínicos associados com TTP. Em algumas modalidades, o método compreende ainda a etapa de determinar se um sujeito está em risco de desenvolver sintomas associados com TTP congênita antes do início de quaisquer sintomas associados com TTP ou no início de pelo menos um ou mais sintomas indicativos de TTP (por exemplo, a presença de anemia, trombocitopenia e/ou insuficiência renal). A determinação de se um sujeito está em risco de desenvolver sintomas associados com TTP congênita (isto é, o sujeito tem USS) compreende determinar se o sujeito tem uma mutação no gene codificando ADAMTS13 e/ou determinar se o sujeito é deficiente na atividade de ADAMTS13 e/ou determinar se o sujeito tem um histórico

79 / 394 familiar de USS. Métodos de triagem genética quanto à presença ou ausência de uma mutação genética associada com USS são bem estabelecidos, por exemplo ver Kinoshita et al., International Journal of Hematology, 74: 101- 108 (2001); Levy et al., Nature, 413 (6855): 488-494 (2001); Kokame et al., PNAS 99(18): 11902-11907 (2002); Savasan et al., Blood, 101: 4449-4451 (2003); Matsumoto et al., Blood, 103: 1305-1310 (2004) e Fujimura et al., Brit. J. Haemat 144: 742-754 (2008).

[00108] Em uma modalidade, um método é provido para reduzir a probabilidade de que um sujeito diagnosticado com USS sofrerá de sintomas clínicos associados com TTP compreendendo periodicamente monitorar o sujeito para determinar a presença ou ausência de anemia, trombocitopenia ou aumento da creatinina e tratar com um agente inibidor de MASP-2 (por exemplo, um anticorpo de MASP-2) na determinação da presença de anemia, trombocitopenia ou aumento da creatinina ou na presença de um evento conhecido estar associado com a deflagração de sintomas clínicos de TTP, por exemplo, exposição a fármaco (por exemplo, quimioterapia), infecção (por exemplo infecção bacteriana), malignidade, lesão, transplante ou gravidez.

[00109] Em uma outra modalidade, um método é provido para tratar um sujeito com USS e sofrendo de sintomas clínicos associados com TTP compreendendo administrar uma quantidade de um agente inibidor de MASP- 2 (por exemplo, um anticorpo de MASP-2) durante um período de tempo eficaz para melhorar ou prevenir um ou mais sintomas clínicos associados com TTP.

[00110] A TTP também pode se desenvolver devido aos autoanticorpos contra ADAMTS-13. Além disso, a TTP pode desenvolver-se durante o câncer de mama, trato gastrointestinal, ou próstata (George J N., Oncology (Williston Park)). 25: 908-14, 2011), gravidez (segundo trimestre ou pós parto), (George JN., Curr Opin Hematol 10: 339-344, 2003), ou está associada com doenças, tais como HIV ou doenças autoimunes como lupo

80 / 394 eritematoso sistêmico (Hamasaki K, et al., Clin Rheumatol, 22: 355-8, 2003). A TTP também pode ser causada por certas terapias medicamentosas, incluindo heparina, Quinina, ingrediente imunomediado, agentes quimioterapêuticos contra o câncer (bleomicina, cisplatina, citosina arabinosida, daunomicina gencitabina, mitomicina C, e tamoxifeno), ciclosporina A, contraceptivos orais, penicilina, rifampina e medicamentos antiplaquetários incluindo ticlopidina e clopidogrel (Azarm, T. et al., J Res Med Sci., 16: 353–357, 2011). Outros fatores ou condições associadas com TTP são toxinas tais como venenos de abelha, septicemia, sequestro esplênico, transplante, vasculite, cirurgia vascular, e infecções como pneumonia pelo Streptococcus pneumoniae e citomegalovírus (Moake JL., N Engl J Med., 347: 589–600, 2002). A TTP devido à deficiência de ADAMTS- 13 funcional transitória pode ocorrer como uma consequência da lesão de célula endotelial associada com a infecção pela S. pneumoniae (Pediatr Nephrol, 26: 631-5, 2011).

[00111] A troca de plasma é o tratamento padrão para a TTP (Rock GA, et al., N Engl J Med 325: 393-397, 1991). A troca de plasma repõe a atividade de ADAMTS-13 em pacientes com defeitos genéticos e remove os autoanticorpos de ADAMTS-13 naqueles pacientes com TTP autoimune adquirida (Tsai, H-M, Hematol Oncol Clin North Am., 21(4): 609–v, 2007). Agentes adicionais tais como medicamentos imunossupressivos são rotineiramente adicionado à terapia (George, JN, N Engl J Med, 354: 1927- 35, 2006). Entretanto, a troca de plasma não é bem sucedida para cerca de 20% dos pacientes, a recaída ocorre em mais do que um terço dos pacientes, e a plasmaferese é cara e tecnicamente exigente. Além disso, muitos pacientes são incapazes de tolerar a troca de plasma. Consequentemente permanece uma necessidade crítica quanto a tratamentos adicionais e melhores para a TTP.

[00112] Porque a TTP é um distúrbio da cascata da coagulação

81 / 394 sanguínea, o tratamento com antagonistas do sistema de complemento pode ajudar na estabilização e correção da doença. Embora a ativação patológica do caminho de complemento alternativo esteja ligada à aHUS, o papel da ativação de complemento na TTP está menos clara. A deficiência funcional de ADAMTS13 é importante para a suscetibilidade de TTP, entretanto não é suficiente causar episódios agudos. Fatores ambientais e/ou outras variações genéticas podem contribuir para a manifestação da TTP. Por exemplo, genes que codificam proteínas envolvidas na regulagem da cascata de coagulação, vWF, função de plaqueta, componentes da superfície do vaso endotelial, ou o sistema de complemento podem estar implicados no desenvolvimento da microangiopatia trombótica aguda (Galbusera, M. et al., Haematologica, 94: 166–170, 2009). Em particular, a ativação de complemento foi mostrada desempenhar um papel crítico; soro de microangiopatia trombótica associada com a deficiência de ADAMTS-13 foi mostrado causar deposição de C3 e MAC e subsequente ativação de neutrófilo que seria anulada pela inativação de complemento (Ruiz-Torres MP, et al., Thromb Haemost, 93: 443-52, 2005). Além disso, foi recentemente mostrado que durante episódios agudos de TTP existem níveis aumentados de C4d, C3bBbP, e C3a (M. Réti et al., J Thromb Haemost. 28 Fev (2012) doi: 10.1111/j.1538-7836.2012.04674.x. [Epub antes da impressão]), compatível com a ativação dos caminhos clássico, da lectina e alternativo. Esta quantidade aumentada de ativação de complemento em episódios agudos pode iniciar a ativação do caminho terminal e ser responsável por mais exacerbação de TTP.

[00113] O papel de ADAMTS-13 e vWF na TTP claramente é responsável pela ativação e agregação de plaquetas e o seu papel subsequente no estresse de cisalhamento e deposição em microangiopatias. As plaquetas ativadas interagem com e deflagram o caminho de complemento tanto clássico quanto alternativo. A ativação de complemento mediada por plaqueta aumenta os mediadores inflamatórios C3a e C5a (Peerschke E. et al., Mol

82 / 394 Immunol, 47: 2170-5 (2010)). As plaquetas podem assim servir como alvos de ativação de complemento clássico na TTP herdada ou autoimune.

[00114] Como descrito acima, o caminho da lectina de complemento, em virtude da ativação de protrombina mediada por MASP-2, é o caminho molecular dominante que liga a lesão endotelial à coagulação e trombose microvascular que ocorre na HUS. Similarmente, a ativação do caminho da lectina de complemento pode diretamente direcionar o sistema de coagulação na TTP. A ativação do caminho da lectina pode ser iniciada em resposta à lesão do endotélio inicial causada pela deficiência em ADAMTS-13 na TTP. É portanto esperado que os inibidores do caminho da lectina, incluindo mas não limitado aos anticorpos que bloqueiam a função de MASP-2 mitigarão as microangiopatias associadas com a coagulação microvascular, trombose, e hemólise em pacientes que sofrem de TTP.

[00115] Os pacientes que sofrem de TTP tipicamente se apresentam na sala de emergência com um ou mais dos que seguem: púrpura, insuficiência renal, plaquetas baixas, anemia e/ou trombose, incluindo acidente vascular cerebral. O padrão corrente de cuidado para TTP envolve a liberação intracateter (por exemplo, intravenosa ou outra forma de cateter) de plasmaferese de substituição por um período de duas semanas ou mais longo, tipicamente três vezes por semana, mas até diariamente. Se o indivíduo testa positivo quanto à presença de um inibidor de ADAMTS13 (isto é, um anticorpo endógeno contra ADAMTS13), então a plasmaferese pode ser realizada em combinação com a terapia imunossupressiva (por exemplo, corticoesteroides, rituxan, ou ciclosporina). Os indivíduos com TTP refratária (aproximadamente 20% de pacientes com TTP) não respondem a pelo menos duas semanas de terapia de plasmaferese.

[00116] De acordo com o precedente, em uma modalidade, no ambiente de um diagnóstico inicial de TTP, ou em um indivíduo que exibe um ou mais sintomas compatíveis com um diagnóstico de TTP (por exemplo,

83 / 394 envolvimento do sistema nervoso central, trombocitopenia severa (uma contagem de plaqueta de menos que ou igual a 5000/µl se sem aspirina, menos do que ou igual a 20.000/µl se com aspirina), envolvimento cardíaco severo, envolvimento pulmonar severo, infartação gastrointestinal ou gangrena), um método é fornecido para tratar o indivíduo com uma quantidade eficaz de um agente inibidor de MASP-2 (por exemplo, um anticorpo anti-MASP-2) como uma terapia de primeiro linha na ausência de plasmaferese, ou em combinação com plasmaferese. Como uma terapia de primeira linha, o agente inibidor de MASP-2 pode ser administrado ao indivíduo sistemicamente, tal como pela administração intra-arterial, intravenosa, intramuscular, inalacional, nasal, subcutânea ou outra administração parenteral. Em algumas modalidades, o agente inibidor de MASP-2 é administrado a um indivíduo como uma terapia de primeira linha na ausência de plasmaferese para evitar as complicações potenciais da plasmaferese, tais como hemorragia, infecção, e exposição aos distúrbios e/ou alergias inerentes no doador de plasma, ou em um indivíduo de outro modo avesso à plasmaferese, ou em um ambiente onde a plasmaferese não esteja disponível. Em algumas modalidades, o agente inibidor de MASP-2 é administrado ao indivíduo que sofre de TTP em combinação (incluindo a coadministração) com um agente imunossupressivo (por exemplo, corticoesteroides, rituxan ou ciclosporina) e/ou em combinação com ADAMTS-13 concentrado.

[00117] Em algumas modalidades, o método compreende administrar um agente inibidor de MASP-2 a um indivíduo que sofre de TTP por intermédio de um cateter (por exemplo, intravenosamente) durante um primeiro período de tempo (por exemplo, uma fase aguda que dure pelo menos um dia a uma semana ou duas semanas) seguido pela administração a um agente inibidor de MASP-2 ao indivíduo subcutaneamente durante um segundo período de tempo (por exemplo, uma fase crônica de pelo menos

84 / 394 duas semanas ou mais longa). Em algumas modalidades, a administração no primeiro e/ou segundo períodos de tempo ocorre na ausência de plasmaferese. Em algumas modalidades, o método é usado para manter o indivíduo para prevenir o indivíduo de sofrer de um ou mais sintomas associados com a TTP.

[00118] Em uma outra modalidade, um método é fornecido para tratar um indivíduo que sofre de TTP refratária (isto é, um indivíduo que não respondeu a pelo menos duas semanas de terapia de plasmaférese), pela administração de uma quantidade de um inibidor de MASP-2 eficaz para reduzir um ou mais sintomas da TTP. Em uma modalidade, o inibidor de MASP-2 (por exemplo, um anticorpo anti-MASP-2) é administrado a um indivíduo com TTP refratária em uma base crônica, em um período de tempo de pelo menos duas semanas ou mais longa por intermédio da administração subcutânea ou outra administração parenteral. A administração pode ser repetida como determinado por um médico até que a condição tenha sido resolvida ou esteja controlada.

[00119] Em algumas modalidades, o método compreende ainda determinar o nível de pelo menos um fator de complemento (por exemplo, C3, C5) no indivíduo antes do tratamento, e opcionalmente durante o tratamento, em que a determinação de um nível reduzido do pelo menos um fator de complemento em comparação a um valor padrão ou indivíduo de controle saudável é indicativo da necessidade quanto ao tratamento continuado com o agente inibidor de MASP-2.

[00120] Em algumas modalidades, o método compreende administrar um agente inibidor de MASP-2, tal como um anticorpo anti-MASP-2, a um indivíduo que sofre, ou em risco de desenvolver TTP subcutaneamente ou intravenosamente. O tratamento é preferivelmente diário, mas pode ser tão infrequente quanto bissemanalmente. O tratamento é continuado até que a contagem de plaqueta do indivíduo seja maior do que 150.000/ml durante pelo menos dois dias consecutivos. O anticorpo anti-MASP-2 pode ser

85 / 394 administrado sozinho ou em combinação com um inibidor C5, tal como eculizamab.

[00121] Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 exibe pelo menos uma ou mais das seguintes características: o dito anticorpo liga a MASP-2 humana com um KD de 10 nM ou menos, o dito anticorpo liga um epítopo no domínio CCP1 de MASP-2, o dito anticorpo inibe a deposição de C3b em um ensaio in vitro com o soro humano a 1% em uma IC50 de 10 nM ou menos, o dito anticorpo inibe a deposição de C3b em soro humano a 90% com uma IC50 de 30 nM ou menos, em que o anticorpo é um fragmento de anticorpo selecionado do grupo consistindo de Fv, Fab, Fab’, F(ab)2 e F(ab’)2, em que o anticorpo é uma molécula de cadeia única, em que o dito anticorpo é uma de molécula de IgG2, em que o dito anticorpo é uma molécula de IgG1, em que o dito anticorpo é uma molécula de IgG4, em que a molécula de IgG4 compreende uma mutação S228P e/ou em que o anticorpo não inibe substancialmente o caminho clássico. Em uma modalidade, o anticorpo se liga à MASP-2 e seletivamente inibe o caminho da lectina e não inibe substancialmente o caminho alternativo. Em uma modalidade, o anticorpo se liga à MASP-2 e seletivamente inibe o caminho da lectina e não inibe substancialmente o caminho clássico ou o caminho alternativo (isto é, inibe o caminho da lectina enquanto deixa os caminhos de complemento clássico e alternativo intactos).

[00122] Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 inibe a formação de trombo no soro de um sujeito sofrendo de TTP em pelo menos 30%, tal como pelo menos 40%, tal como pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 80% tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% até 99%, quando comparado com o soro não tratado. Em algumas modalidades, o anticorpo inibidor de MASP-2 inibe a formação de trombo no soro de um sujeito sofrendo de TTP em um nível de pelo menos 20 por cento ou maior,

86 / 394 (tal como pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%) maior do que o efeito inibidor sobre a deposição de C5b-9 no soro.

[00123] Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 inibe a formação de trombo no soro de um paciente com TTP em pelo menos 30%, tal como pelo menos 40%, tal como pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 80% tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% até 99%, quando comparado com o soro não tratado.

[00124] Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 é administrado ao sujeito por intermédio de um cateter intravenoso ou outro método de distribuição por cateter.

[00125] Em uma modalidade, a invenção provê um método de inibir a formação de trombo em um sujeito sofrendo de TTP compreendendo administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo (I) (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo: i) uma CDR-H1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de 31 a 35 da SEQ ID NO: 67; e ii) uma CDR-H2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de 50 a 65 da SEQ ID NO: 67; e iii) uma CDR-H3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de 95 a 102 da SEQ ID NO: 67 e b) uma região variável de cadeia leve compreendendo: i) uma CDR-L1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de 24 a 34 da SEQ ID NO: 70; e ii) uma CDR-L2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de 50 a 56 da SEQ ID NO: 70; e iii) uma CDR-L3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de 89 a 97 da SEQ ID NO: 70 ou (II) uma variante do mesmo compreendendo uma região variável de cadeia pesada com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 67 (por exemplo, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos

87 / 394 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 67) e uma região variável de cadeia leve com pelo menos 90% de identidade (por exemplo, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 70.

[00126] Em algumas modalidades, o método compreende administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 67. Em algumas modalidades, o método compreende administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 70.

[00127] Em algumas modalidades, o método compreende administrar ao sujeito uma composição compreendendo um anticorpo inibidor de MASP- 2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, que especificamente reconheça pelo menos parte de um epítopo na MASP-2 humana reconhecido pelo anticorpo de referência OMS646 compreendendo uma região variável de cadeia pesada como apresentada na SEQ ID NO: 67 e uma região variável de cadeia leve como apresentada na SEQ ID NO: 70. Doença de Degos

[00128] A doença de Degos, também conhecida como papulose atrófica maligna, é uma TMA muito rara afetando o endotélio de vasos pequenos da pele, trato gastrointestinal e CNS. Esta vasculopatia causa oclusão de vênulas e arteríolas, resultando em lesões de pele, isquemia intestinal e distúrbios do CNS incluindo acidentes vasculares cerebrais,

88 / 394 epilepsia e distúrbios cognitivos. Na pele, a necrose de tecido conectivo é devido à oclusão trombótica das artérias pequenas. Entretanto, a causa da doença de Degos é desconhecida. Vasculite, coagulopatia ou disfunção primária das células endoteliais foram implicadas. A doença de Degos tem uma sobrevivência de 50% de apenas dois a três anos. Não há nenhum tratamento eficaz para a doença de Degos embora fármacos antiplaquetários, anticoagulantes e imunossupressores sejam utilizados para aliviar sintomas.

[00129] Embora o mecanismo da doença de Degos seja desconhecido, o caminho de complemento foi implicado. Margo et al., identificaram depósitos proeminentes de C5b-9 na pele, trato gastrointestinal e vasos cerebrais de quatro pacientes terminais com a doença de Degos (Margo et al., Am J Clin Pathol 135(4): 599-610, 2011). O tratamento experimental com eculizumab foi inicialmente eficaz no tratamento de lesões de pele e intestinais, mas não preveniram a progressão de doença sistêmica (ver Garrett-Bakelman F. et al., “C5b-9 is a potential effector in the pathophysiology of Degos disease; a case report of treatment with eculizumab” (Abstract), Jerusalém: International Society of Hematology; 2010, Poster #156; e Polito J. et al, “Early detection of systemic Degos disease (DD) or malignant atrophic papulosis (MAP) may increase survival” (Abstract), San Antonio, TX: American College of Gastroenterology; 2010, Poster #1205).

[00130] Muitos pacientes sofrendo da doença de Degos têm defeitos de coagulação sanguínea. A oclusão trombótica de artérias pequenas na pele é característica da doença. Porque o caminho de complemento está implicado nesta doença, como aqui descrito para outras TMAs, é esperado que os inibidores do caminho da lectina, incluindo, mas não limitado aos anticorpos que bloqueiam a função de MASP-2, serão benéficos no tratamento de pacientes sofrendo da doença de Degos.

[00131] Consequentemente, em uma outra modalidade, a invenção

89 / 394 provê métodos para tratar a doença de Degos pela administração de uma composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente inibidor de MASP-2, tal como um anticorpo de MASP-2, em um carreador farmacêutico a um sujeito sofrendo da doença de Degos ou uma condição resultante da doença de Degos. O agente inibidor de MASP-2 é administrado sistemicamente ao sujeito sofrendo da doença de Degos ou uma condição resultante da doença de Degos, tal como pela administração intra- arterial, intravenosa, intramuscular, inalacional, subcutânea ou outra administração parenteral ou potencialmente pela administração oral para agentes não peptidérgicos. O anticorpo anti-MASP-2 pode ser administrado sozinho ou em combinação com um inibidor de C5, tal como eculizamab.

[00132] Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 exibe pelo menos uma ou mais das seguintes características: o dito anticorpo liga a MASP-2 humana com um KD de 10 nM ou menos, o dito anticorpo liga um epítopo no domínio CCP1 de MASP-2, o dito anticorpo inibe a deposição de C3b em um ensaio in vitro com o soro humano a 1% em uma IC50 de 10 nM ou menos, o dito anticorpo inibe a deposição de C3b em soro humano a 90% com uma IC50 de 30 nM ou menos, em que o anticorpo é um fragmento de anticorpo selecionado do grupo consistindo de Fv, Fab, Fab’, F(ab)2 e F(ab’)2, em que o anticorpo é uma molécula de cadeia única, em que o dito anticorpo é uma de molécula de IgG2, em que o dito anticorpo é uma molécula de IgG1, em que o dito anticorpo é uma molécula de IgG4, em que a molécula de IgG4 compreende uma mutação S228P e/ou em que o anticorpo não inibe substancialmente o caminho clássico. Em uma modalidade, o anticorpo se liga à MASP-2 e seletivamente inibe o caminho da lectina e não inibe substancialmente o caminho alternativo. Em uma modalidade, o anticorpo se liga à MASP-2 e seletivamente inibe o caminho da lectina e não inibe substancialmente o caminho clássico ou o caminho alternativo (isto é, inibe o caminho da lectina enquanto deixa os caminhos de complemento

90 / 394 clássico e alternativo intactos).

[00133] Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 inibe a formação de trombo no soro de um sujeito sofrendo da doença de Degos em pelo menos 30%, tal como pelo menos 40%, tal como pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 80% tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% até 99%, quando comparado com o soro não tratado. Em algumas modalidades, o anticorpo inibidor de MASP-2 inibe a formação de trombo no soro de um sujeito sofrendo da doença de Degos em um nível de pelo menos 20 por cento ou maior, (tal como pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%) maior do que o efeito inibidor sobre a deposição de C5b-9 no soro.

[00134] Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 inibe a formação de trombo no soro de um paciente com doença de Degos em pelo menos 30%, tal como pelo menos 40%, tal como pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 80% tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% até 99%, quando comparado com o soro não tratado.

[00135] Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 é administrado ao sujeito por intermédio de um cateter intravenoso ou outro método de distribuição por cateter.

[00136] Em uma modalidade, a invenção provê um método de inibir a formação de trombo em um sujeito sofrendo da doença de Degos compreendendo administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo (I) (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo: i) uma CDR-H1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de 31 a 35 da SEQ ID NO: 67; e ii) uma CDR-H2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de 50 a 65 da

91 / 394 SEQ ID NO: 67; e iii) uma CDR-H3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de 95 a 102 da SEQ ID NO: 67 e b) uma região variável de cadeia leve compreendendo: i) uma CDR-L1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de 24 a 34 da SEQ ID NO: 70; e ii) uma CDR-L2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de 50 a 56 da SEQ ID NO: 70; e iii) uma CDR-L3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de 89 a 97 da SEQ ID NO: 70 ou (II) uma variante do mesmo compreendendo uma região variável de cadeia pesada com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 67 (por exemplo, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 67) e uma região variável de cadeia leve com pelo menos 90% de identidade (por exemplo, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 70.

[00137] Em algumas modalidades, o método compreende administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 67. Em algumas modalidades, o método compreende administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 70.

[00138] Em algumas modalidades, o método compreende administrar ao sujeito uma composição compreendendo um anticorpo inibidor de MASP- 2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, que especificamente

92 / 394 reconheça pelo menos parte de um epítopo na MASP-2 humana reconhecido pelo anticorpo de referência OMS646 compreendendo uma região variável de cadeia pesada como apresentada na SEQ ID NO: 67 e uma região variável de cadeia leve como apresentada na SEQ ID NO: 70. Síndrome Antifosfolipídica Catastrófica (CAPS)

[00139] Síndrome Antifosfolipídica Catastrófica (CAPS) é uma variante da síndrome do anticorpo antifosfolipídico (APLA). CAPS é distinguido pela trombose venosa e arterial devido aos anticorpos patogênicos. CAPS é uma TMA com trombose de múltiplos órgãos, isquemia e falência de órgãos. Como outras TMAs, a oclusão de vasos pequenos em vários órgãos é característica. Existe uma alta taxa de mortalidade em CAPS de cerca de 50% e frequentemente está associada com infecção ou trauma. Os pacientes têm anticorpos antifosfolipídeos, geralmente IgG.

[00140] Clinicamente, CAPS envolve pelo menos três órgãos ou tecidos com evidência histopatológica de oclusão de vaso pequeno. A trombose periférica pode envolver veias e artérias no CNS, sistemas cardiovasculares, renais ou pulmonares. Os pacientes são tratados com antibióticos, anticoagulantes, corticosteroides, troca de plasma e imunoglobulina intravenosa. Não obstante, a morte pode resultar da falência múltipla de órgãos.

[00141] O caminho de complemento foi implicado em CAPS. Por exemplo, estudos em modelos de animal indicam que a inibição de complemento pode ser um meio eficaz para prevenir a trombose associada com CAPS (Shapira L. et al., Arthritis Rheum 64(8): 2719-23, 2012). Além disso, como adicionalmente relatado por Shapira et al., a administração de eculizumab a um sujeito sofrendo de CAPS em doses que bloqueassem o caminho de complemento abortaram eventos trombóticos progressivos agudos e reverteram a trombocitopenia (ver também Lim W., Curr Opin Hematol 18(5): 361-5, 2011). Portanto, como aqui descrito para outras TMAs, é

93 / 394 esperado que os inibidores do caminho da lectina, incluindo, mas não limitados aos anticorpos que bloqueiam a função de MASP-2, sejam benéficos no tratamento de pacientes sofrendo de CAPS.

[00142] Consequentemente, em uma outra modalidade, a invenção provê métodos para tratar CAPS pela administração de uma composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente inibidor de MASP-2, tal como um anticorpo de MASP-2, em um carreador farmacêutico a um sujeito sofrendo de CAPS ou uma condição resultante de CAPS. O agente inibidor de MASP-2 é administrado sistemicamente ao sujeito sofrendo de CAPS ou uma condição resultante de CAPS, tal como pela administração intra-arterial, intravenosa, intramuscular, inalacional, subcutânea ou outra administração parenteral ou potencialmente pela administração oral para agentes não peptidérgicos. O anticorpo anti-MASP-2 pode ser administrado sozinho ou em combinação com um inibidor de C5, tal como eculizamab.

[00143] Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 exibe pelo menos uma ou mais das seguintes características: o dito anticorpo liga a MASP-2 humana com um KD de 10 nM ou menos, o dito anticorpo liga um epítopo no domínio CCP1 de MASP-2, o dito anticorpo inibe a deposição de C3b em um ensaio in vitro com soro humano a 1% em uma IC50 de 10 nM ou menos, o dito anticorpo inibe a deposição de C3b em soro humano a 90% com uma IC50 de 30 nM ou menos, em que o anticorpo é um fragmento de anticorpo selecionado do grupo consistindo de Fv, Fab, Fab’, F(ab)2 e F(ab’)2, em que o anticorpo é uma molécula de cadeia única, em que o dito anticorpo é uma de molécula IgG2, em que o dito anticorpo é uma molécula de IgG1, em que o dito anticorpo é uma molécula de IgG4, em que a molécula de IgG4 compreende uma mutação S228P e/ou em que o anticorpo não inibe substancialmente o caminho clássico. Em uma modalidade, o anticorpo se liga à MASP-2 e seletivamente inibe o caminho da lectina e não inibe

94 / 394 substancialmente o caminho alternativo. Em uma modalidade, o anticorpo se liga à MASP-2 e seletivamente inibe o caminho da lectina e não inibe substancialmente o caminho clássico ou o caminho alternativo (isto é, inibe o caminho da lectina enquanto deixa os caminhos de complemento clássico e alternativo intactos).

[00144] Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 inibe a formação de trombo no soro de um sujeito sofrendo de CAPS em pelo menos 30%, tal como pelo menos 40%, tal como pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 80% tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% até 99%, quando comparado com o soro não tratado. Em algumas modalidades, o anticorpo inibidor de MASP-2 inibe a formação de trombo no soro de um sujeito sofrendo de CAPS em um nível de pelo menos 20 por cento ou maior, (tal como pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%) maior do que o efeito inibidor sobre a deposição de C5b-9 em soro.

[00145] Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 inibe a formação de trombo no soro de um paciente com CAPS em pelo menos 30%, tal como pelo menos 40%, tal como pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 80% tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% até 99%, quando comparado com o soro não tratado.

[00146] Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 é administrado ao sujeito por intermédio de um cateter intravenoso ou outro método de distribuição por cateter.

[00147] Em uma modalidade, a invenção provê um método de inibir a formação de trombo em um sujeito sofrendo de CAPS compreendendo administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo (I) (a) uma região variável de cadeia pesada

95 / 394 compreendendo: i) uma CDR-H1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de 31 a 35 da SEQ ID NO: 67; e ii) uma CDR-H2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de 50 a 65 da SEQ ID NO: 67; e iii) uma CDR-H3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de 95 a 102 da SEQ ID NO: 67 e b) uma região variável de cadeia leve compreendendo: i) uma CDR-L1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de 24 a 34 da SEQ ID NO: 70; e ii) uma CDR-L2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de 50 a 56 da SEQ ID NO: 70; e iii) uma CDR-L3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de 89 a 97 da SEQ ID NO: 70 ou (II) uma variante do mesmo compreendendo uma região variável de cadeia pesada com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 67 (por exemplo, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 67) e uma região variável de cadeia leve com pelo menos 90% de identidade (por exemplo, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 70.

[00148] Em algumas modalidades, o método compreende administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 67. Em algumas modalidades, o método compreende administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 70.

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[00149] Em algumas modalidades, o método compreende administrar ao sujeito uma composição compreendendo um anticorpo inibidor de MASP- 2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, que especificamente reconheça pelo menos parte de um epítopo na MASP-2 humana reconhecido pelo anticorpo de referência OMS646 compreendendo uma região variável de cadeia pesada como apresentada na SEQ ID NO: 67 e uma região variável de cadeia leve como apresentada na SEQ ID NO: 70. TMA Secundária ao Câncer

[00150] As malignidades sistêmicas de qualquer tipo podem levar às manifestações clínicas e patológicas de TMA (ver por exemplo, Batts e Lazarus, Bone Marrow Transplantation 40: 709-719, 2007). A TMA associada com o câncer é frequentemente encontrada nos pulmões e parece estar associada com êmbolos tumorais (Francis KK et al., Commun Oncol 2: 339-43, 2005). Os êmbolos tumorais podem reduzir o fluxo sanguíneo e assim levar a um estado hipoperfundido nas arteríolas e vênulas afetadas. O estresse e lesão teciduais resultantes são esperados ativar o caminho da lectina de complemento em uma maneira localizada. O caminho da lectina ativado por sua vez pode ativar a cascata de coagulação por intermédio da clivagem dependente da MASP-2 da protrombina para trombina, levando a um estado pró-trombótico característico de TMA. A inibição de MASP-2 neste ambiente é esperada reduzir a ativação localizada de trombina e deste modo aliviar o estado pró-trombótico.

[00151] Portanto, como aqui descrito para outras TMAs, é esperado que os inibidores do caminho da lectina, incluindo, mas não limitados aos anticorpos que bloqueiam a função de MASP-2, sejam benéficos no tratamento de pacientes sofrendo de TMA secundária ao câncer.

[00152] Consequentemente, em uma outra modalidade, a invenção provê métodos para tratar ou prevenir TMA secundária ao câncer pela administração de uma composição compreendendo uma quantidade

97 / 394 terapeuticamente eficaz de um agente inibidor de MASP-2, tal como um anticorpo MASP-2, em um carreador farmacêutico a um sujeito sofrendo de ou em risco de desenvolver, uma TMA secundária ao câncer. O agente inibidor de MASP-2 é administrado sistemicamente ao sujeito sofrendo de ou em risco de desenvolver, uma TMA secundária ao câncer, tal como pela administração intra-arterial, intravenosa, intramuscular, inalacional, subcutânea ou outra administração parenteral ou potencialmente pela administração oral para agentes não peptidérgicos. O anticorpo anti-MASP-2 pode ser administrado sozinho ou em combinação com um inibidor de C5, tal como eculizamab.

[00153] Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 exibe pelo menos uma ou mais das seguintes características: o dito anticorpo liga a MASP-2 humana com um KD de 10 nM ou menos, o dito anticorpo liga um epítopo no domínio CCP1 de MASP-2, o dito anticorpo inibe a deposição de C3b em um ensaio in vitro com soro humano a 1% em uma IC50 de 10 nM ou menos, o dito anticorpo inibe a deposição de C3b em soro humano a 90% com uma IC50 de 30 nM ou menos, em que o anticorpo é um fragmento de anticorpo selecionado do grupo consistindo de Fv, Fab, Fab’, F(ab)2 e F(ab’)2, em que o anticorpo é uma molécula de cadeia única, em que o dito anticorpo é uma de molécula de IgG2, em que o dito anticorpo é uma molécula de IgG1, em que o dito anticorpo é uma molécula de IgG4, em que a molécula de IgG4 compreende uma mutação S228P e/ou em que o anticorpo não inibe substancialmente o caminho clássico. Em uma modalidade, o anticorpo se liga à MASP-2 e seletivamente inibe o caminho da lectina e não inibe substancialmente o caminho alternativo. Em uma modalidade, o anticorpo se liga à MASP-2 e seletivamente inibe o caminho da lectina e não inibe substancialmente o caminho clássico ou o caminho alternativo (isto é, inibe o caminho da lectina enquanto deixa os caminhos de complemento clássico e alternativo intactos).

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[00154] Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 inibe a formação de trombo no soro de um sujeito sofrendo de TMA secundária ao câncer em pelo menos 30%, tal como pelo menos 40%, tal como pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 80% tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% até 99%, quando comparado com o soro não tratado.

[00155] Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 inibe a formação de trombo no soro de um paciente sofrendo de TMA secundária ao câncer em pelo menos 30%, tal como pelo menos 40%, tal como pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 80% tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% até 99%, quando comparado com o soro não tratado.

[00156] Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 é administrado ao sujeito por intermédio de um cateter intravenoso ou outro método de distribuição por cateter.

[00157] Em uma modalidade, a invenção provê um método de inibir a formação de trombo em um sujeito sofrendo de TMA secundária ao câncer compreendendo administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo (I) (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo: i) uma CDR-H1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de 31 a 35 da SEQ ID NO: 67; e ii) uma CDR-H2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de 50 a 65 da SEQ ID NO: 67; e iii) uma CDR-H3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de 95 a 102 da SEQ ID NO: 67 e b) uma região variável de cadeia leve compreendendo: i) uma CDR-L1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de 24 a 34 da SEQ ID NO: 70; e ii) uma CDR-L2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de 50 a 56 da SEQ ID NO: 70; e iii) uma CDR-L3 de cadeia leve

99 / 394 compreendendo a sequência de aminoácidos de 89 a 97 da SEQ ID NO: 70 ou (II) uma variante do mesmo compreendendo uma região variável de cadeia pesada com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 67 (por exemplo, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 67) e uma região variável de cadeia leve com pelo menos 90% de identidade (por exemplo, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 70.

[00158] Em algumas modalidades, o método compreende administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 67. Em algumas modalidades, o método compreende administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 70.

[00159] Em algumas modalidades, o método compreende administrar ao sujeito uma composição compreendendo um anticorpo inibidor de MASP- 2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, que especificamente reconheça pelo menos parte de um epítopo na MASP-2 humana reconhecido pelo anticorpo de referência OMS646 compreendendo uma região variável de cadeia pesada como apresentada na SEQ ID NO: 67 e uma região variável de cadeia leve como apresentada na SEQ ID NO: 70. TMA Secundária à Quimioterapia Contra o Câncer

[00160] A TMA associada com a quimioterapia é uma condição

100 / 394 envolvendo trombocitopenia, anemia hemolítica microangiopática e disfunção renal que desenvolve em 2 a 10% dos pacientes com um histórico de neoplasmas malignos tratados com agentes quimioterapêuticos tal como gencitabina, mitomicina oxaliplatina e outros. A TMA associada com quimioterapia é associada com resultados clínicos insuficientes com alta taxa de mortalidade (ver, por exemplo, Blake-Haskins et al., Clin Cancer Res 17(18): 5858-5866, 2011).

[00161] A etiologia da TMA associada com a quimioterapia é julgada abranger uma agressão tóxica não específica ao endotélio microvascular. Uma lesão direta às células endoteliais foi mostrada em um modelo animal de TMA induzido por mitomicina (Dlott J. et al., Ther Apher Dial 8: 102–11, 2004). A lesão da célula endotelial através uma variedade de mecanismos foi mostrada ativar o caminho da lectina do complemento. Por exemplo, Stahl et al. mostrara que as células endoteliais expostas ao estresse oxidativo ativa o caminho da lectina do complemento tanto in vitro quanto in vivo (Collard et al., Am J Pathol. 156(5): 1549-56, 2000; La Bonte et al, J Immunol. 15;188(2): 885-91, 2012). In vivo, este processo leva à trombose e à inibição do caminho da lectina foi mostrado prevenir a trombose (La Bonte et al. J Immunol. 15;188(2): 885-91, 2012). Além disso, como demonstrado nos Exemplos de 37 a 39 aqui contidos, no modelo de camundongo de TMA onde a fotoexcitação localizada de FITC-Dex foi usada para introduzir a lesão localizada à microvasculatura com desenvolvimento subsequente de uma resposta de TMA, os presentes inventores mostraram que a inibição de MASP-2 pode prevenir a TMA. Deste modo, a lesão microvascular do endotélio através de agentes quimioterapêuticos pode ativar o caminho da lectina do complemento que então cria um estado pró-trombótico localizado e promove uma resposta de TMA. Visto que a ativação do caminho da lectina e a criação de um estado pró-trombótico é dependente de MASP-2, é esperado que os inibidores de MASP-2, incluindo, mas não limitado aos anticorpos que

101 / 394 bloqueiam a função de MASP-2, aliviaram a resposta de TMA e reduziram o risco de TMA associada com a quimioterapia contra o câncer.

[00162] Portanto, em uma outra modalidade, a invenção provê os métodos para tratar ou prevenir a TMA secundária à quimioterapia administrando-se uma composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente inibidor de MASP-2, tal como um anticorpo de MASP-2, em um carreador farmacêutico a um sujeito sofrendo de ou em risco de desenvolver, uma TMA secundária à quimioterapia. O agente inibidor de MASP-2 é administrado sistemicamente a um sujeito que foi submetido, está sendo submetido ou será submetido à quimioterapia, tal como através da administração intra-arterial, intravenosa, intramuscular, por inalação, subcutânea ou outra administração parenteral ou potencialmente através da administração oral para os agentes não peptidérgicos. O anticorpo anti-MASP-2 pode ser administrado sozinho ou em combinação com um inibidor de C5, tal como eculizamab.

[00163] Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 apresenta pelo menos uma ou mais das seguintes características: o dito anticorpo liga à MASP-2 humana com um KD de 10 nM ou menos, o dito anticorpo liga um epítopo no domínio CCP1 de MASP-2, o dito anticorpo inibe a deposição de C3b em um ensaio in vitro em soro humano a 1% em uma IC50 de 10 nM ou menos, o dito anticorpo inibe a deposição de C3b em soro humano a 90% com uma IC50 de 30 nM ou menos, em que o anticorpo é um fragmento de anticorpo selecionado do grupo consistindo de Fv, Fab, Fab’, F(ab)2 e F(ab’)2, em que o anticorpo é uma molécula de cadeia única, em que o dito anticorpo é uma de molécula de IgG2, em que o dito anticorpo é uma molécula de IgG1, em que o dito anticorpo é uma molécula de IgG4, em que a molécula de IgG4 compreende uma mutação S228P e/ou em que o anticorpo não inibe substancialmente o caminho clássico. Em uma modalidade, o anticorpo liga aa MASP-2 e seletivamente inibe o caminho da

102 / 394 lectina e não inibe substancialmente o caminho alternativo. Em uma modalidade, o anticorpo liga à MASP-2 e seletivamente inibe o caminho da lectina e não inibe substancialmente o caminho clássico ou o caminho alternativo (isto é, inibe o caminho da lectina enquanto deixando os caminhos de complemento clássicos e alternativos intactos).

[00164] Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 inibe a formação de trombo no soro de um sujeito sofrendo de TMA secundária à quimioterapia contra câncer em pelo menos 30%, tal como pelo menos 40%, tal como pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 80% tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% até 99%, quando comparado com o soro não tratado.

[00165] Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 inibe a formação de trombo no soro de um paciente que sofre de uma TMA secundária à quimioterapia para câncer em pelo menos 30%, tal como pelo menos 40%, tal como pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 80% tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% até 99%, quando comparado com o soro não tratado.

[00166] Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 é administrado ao sujeito por intermédio de um cateter intravenoso ou outro método de distribuição por cateter.

[00167] Em uma modalidade, a invenção provê um método de inibir a formação de trombo em um sujeito sofrendo de TMA secundária à quimioterapia para câncer compreendendo administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo (I) (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo: i) uma CDR-H1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de 31 a 35 da SEQ

103 / 394 ID NO: 67; e ii) uma CDR-H2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de 50 a 65 da SEQ ID NO: 67; e iii) uma CDR-H3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de 95 a 102 da SEQ ID NO: 67 e b) uma região variável de cadeia leve compreendendo: i) uma CDR- L1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de 24 a 34 da SEQ ID NO: 70; e ii) uma CDR-L2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de 50 a 56 da SEQ ID NO: 70; e iii) uma CDR-L3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de 89 a 97 da SEQ ID NO: 70 ou (II) um variante do mesma compreendendo uma região variável de cadeia pesada com pelo menos 90% de identidade à SEQ ID NO: 67 (por exemplo, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade à SEQ ID NO: 67) e uma região variável de cadeia leve com pelo menos 90% de identidade (por exemplo, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade à SEQ ID NO: 70.

[00168] Em algumas modalidades, o método compreende administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 67. Em algumas modalidades, o método compreende administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 70.

[00169] Em algumas modalidades, o método compreende administrar ao sujeito uma composição compreendendo um anticorpo inibidor de MASP-

104 / 394 2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, que especificamente reconhece pelo menos parte de um epítopo na MASP-2 humana reconhecido pelo anticorpo de referência OMS646 compreendendo uma região variável de cadeia pesada como apresentado na SEQ ID NO: 67 e uma região variável de cadeia leve como apresentado na SEQ ID NO: 70. TMA Secundária a um Transplante

[00170] A TMA associada a um transplante (TA-TMA) é uma síndrome devastadora que pode ocorrer em pacientes transplantados, tal como recipientes de transplante alogênico de célula-tronco hematopoiética (ver, por exemplo, Batts e Lazarus, Bone Marrow Transplantation 40: 709-719, 2007). A patogênese desta condição é pouco entendida, mas envolve provavelmente uma confluência das respostas que culminam na lesão da célula endotelial (Laskin B.L. et al., Blood 118(6): 1452-62, 2011). Como divulgado acima, a lesão da célula endotelial é um estímulo prototípico para a ativação do caminho da lectina e a geração de um ambiente pró-trombótico.

[00171] Dados recentes também suportam o papel da ativação de complemento por intermédio do caminho da lectina na patogênese TA-TMA. Laskin et al., demonstraram que a deposição de C4d arteriolar renal foi muito mais comum em sujeitos com TA-TMA histológico (75%) se comparado com os controles (8%) (Laskin B.L., et al., Transplantation, 27; 96(2): 217-23, 2013). Deste modo, a C4d pode ser um marcador patológico da TA-TMA, implicando a fixação de complemento localizada, por intermédio do caminho de lectina ou clássico.

[00172] Visto que a ativação do caminho da lectina e a criação de um estado pró-trombótico é dependente de MASP-2, é esperado que os inibidores de MASP-2, incluindo, mas não limitado aos anticorpos que bloqueiam a função de MASP-2, aliviarão a resposta de TMA e reduzirão o risco de TMA associado ao transplante (TA-TMA).

[00173] Portanto, em uma outro modalidade, a invenção provê

105 / 394 métodos para tratar ou prevenir uma TMA secundária ao transplante administrando-se uma composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente inibidor de MASP-2, tal como um anticorpo de MASP-2, em um carreador farmacêutico a um sujeito sofrendo de ou em risco de desenvolver uma TMA secundária ao transplante. O agente inibidor de MASP-2 é administrado sistemicamente a um sujeito que foi submetido, está sendo submetido ou será submetido a um procedimento de transplante, tal como através da administração intra-arterial, intravenosa, intramuscular, por inalação, subcutânea ou outra administração parenteral ou potencialmente através da administração oral para os agentes não- peptidérgicos. O anticorpo anti-MASP-2 pode ser administrado sozinho ou em combinação com um inibidor de C5, tal como eculizamab. Em algumas modalidades, a invenção provê métodos para tratar ou prevenir uma TMA secundária ao transplante alogênico de célula-tronco compreendendo administrar uma composição compreendendo uma quantidade de um agente inibidor de MASP-2, tal como um anticorpo inibidor de MASP-2, a um sujeito antes, durante ou depois de ser submetido a um transplante alogênico de célula-tronco.

[00174] Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 apresenta pelo menos uma ou mais das seguintes características: o dito anticorpo liga à MASP-2 humana com uma KD de 10 nM ou menos, o dito anticorpo liga um epítopo no domínio CCP1 de MASP-2, o dito anticorpo inibe a deposição de C3b em um ensaio in vitro em soro humano a 1% em uma IC50 de 10 nM ou menos, o dito anticorpo inibe a deposição de C3b em soro humano a 90% com uma IC50 de 30 nM ou menos, em que o anticorpo é um fragmento de anticorpo selecionado do grupo consistindo de Fv, Fab, Fab’, F(ab)2 e F(ab’)2, em que o anticorpo é uma molécula de cadeia única, em que o dito anticorpo é uma de molécula de IgG2, em que o dito anticorpo é uma molécula de IgG1, em que o dito anticorpo é uma molécula de IgG4,

106 / 394 em que a molécula de IgG4 compreende uma mutação S228P e/ou em que o anticorpo não inibe substancialmente o caminho clássico. Em uma modalidade, o anticorpo liga a MASP-2 e seletivamente inibe o caminho da lectina e não inibe substancialmente o caminho alternativo. Em uma modalidade, o anticorpo liga a MASP-2 e seletivamente inibe o caminho da lectina e não inibe substancialmente o caminho clássico ou o caminho alternativo (isto é, inibe o caminho da lectina enquanto deixando os caminhos de complemento clássicos e alternativos intactos).

[00175] Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 inibe a formação de trombo no soro de um sujeito sofrendo de TMA secundária ao transplante em pelo menos 30%, tal como pelo menos 40%, tal como pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 80% tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% até 99%, quando comparado com o soro não tratado.

[00176] Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 inibe a formação de trombo no soro de um paciente sofrendo de TMA secundária ao transplante em pelo menos 30%, tal como pelo menos 40%, tal como pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 80% tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% até 99%, quando comparado com o soro não tratado. Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 é administrado ao sujeito por intermédio de um cateter intravenoso ou outro método de distribuição por cateter.

[00177] Em uma modalidade, a invenção provê um método de inibir a formação de trombo em um sujeito sofrendo de TMA secundária ao transplante compreendendo administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo (I) (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo: i) uma CDR-H1 de cadeia

107 / 394 pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de 31 a 35 da SEQ ID NO: 67; e ii) uma CDR-H2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de 50 a 65 da SEQ ID NO: 67; e iii) uma CDR-H3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de 95 a 102 da SEQ ID NO: 67 e b) uma região variável de cadeia leve compreendendo: i) uma CDR- L1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de 24 a 34 da SEQ ID NO: 70; e ii) uma CDR-L2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de 50 a 56 da SEQ ID NO: 70; e iii) uma CDR-L3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de 89 a 97 da SEQ ID NO: 70 ou (II) uma variante do mesmo compreendendo uma região variável de cadeia pesada com pelo menos 90% de identidade à SEQ ID NO: 67 (por exemplo, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade à SEQ ID NO: 67) e uma região variável de cadeia leve com pelo menos 90% de identidade (por exemplo, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade à SEQ ID NO: 70.

[00178] Em algumas modalidades, o método compreende administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 67. Em algumas modalidades, o método compreende administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 70.

[00179] Em algumas modalidades, o método compreende administrar

108 / 394 ao sujeito uma composição compreendendo um anticorpo inibidor de MASP- 2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, que especificamente reconhece pelo menos parte de um epítopo em MASP-2 humana reconhecido pelo anticorpo de referência OMS646 compreendendo uma região variável de cadeia pesada como apresentada na SEQ ID NO: 67 e uma região variável de cadeia leve como apresentada na SEQ ID NO: 70. IV. O papel de MASP-2 em outras doenças e condições e métodos terapêuticos usando agentes inibidores de MASP-2 Condições Renais

[00180] A ativação do sistema de complemento foi implicado na patogênese de uma ampla variedade de doenças renais; incluindo, glomerulonefrite mesangioproliferativa (nefropatia de IgA, doença de doença Berger) (Endo, M., et al., Clin. Nephrology 55: 185-191, 2001), glomerulonefrite da membrana (Kerjashki, D., Arch B Cell Pathol. 58: 253- 71, 1990; Brenchley, P.E., et al., Kidney Int., 41: 933-7, 1992; Salant, D.J., et al., Kidney Int. 35: 976-84, 1989), glomerulonefrite membranoproliferativa (glomerulonefrite mesangiocapilar) (Bartlow, B.G., et al., Kidney Int. 15: 294-300, 1979; Meri, S., et al., J. Exp. Med. 175: 939-50, 1992), glomerulonefrite pós infecciosa aguda (glomerulonefrite pós-estreptocócica), glomerulonefrite crioglobulinêmica (Ohsawa, I., et al., Clin Immunol. 101: 59-66, 2001), nefrite de lupo (Gatenby, P.A., Autoimmunity 11: 61-6, 1991) e Nefrite Púrpura de Henoch-Schonlein (Endo, M., et al., Am. J. Kidney Dis. 35: 401-407, 2000). O envolvimento do complemento na doença renal foi apreciado por várias décadas, mas ainda uma discussão maior no seu papel exato na fase de início, desenvolvimento e resolução da doença renal. Sob condições normais a contribuição do complemento é benéfica ao hospedeiro, mas a ativação e deposição inapropriada do complemento pode contribuir ao dano tissular.

[00181] Não há evidência substancial que a glomerulonefrite,

109 / 394 inflamação dos glomérulos, seja frequentemente iniciada através da deposição dos complexos imunes em estruturas glomerulares ou tubulares que então provocam a ativação de complemento, inflamação e dano de tecido. Kahn e Sinniah demonstraram a deposição aumentada de C5b-9 in nas membranas de base tubulares nas biópsias retiradas de pacientes com várias formas de glomerulonefrite (Kahn, T.N., et al., Histopath. 26: 351-6, 1995). Em um estudo dos pacientes com nefrologia de IgA (Alexopoulos, A., et al., Nephrol. Dial. Transplantation 10: 1166-1172, 1995), a deposição de C5b-9 nas estruturas epiteliais tubulares/membranas de base correlacionadas com os níveis de creatinina no plasma. Um outro estudo da nefropatia da membrana demonstrou uma relação entre o resultado clínico e níveis de sC5b-9 urinário (Kon, S.P., et al., Kidney Int. 48: 1953-58, 1995). Os níveis de sC5b-9 elevados foram correlativamente positivos com uma prognose insuficiente. Lehto et al., mediu os níveis elevados de CD59, um fator regulador de complemento que inibe o complexo de ataque à membrana nas membranas plasmáticas, assim como C5b-9 na urina a partir de pacientes com glomerulonefrite da membrana (Lehto, T., et al., Kidney Int. 47: 1403-11, 1995). A análise histopatológica das amostras de biópsia retiradas destes mesmos pacientes demonstrou a deposição das proteínas C3 e C9 nos glomérulos, considerando que a expressão de CD59 nestes tecidos foi diminuída se comparado àquela do tecido hepático normal. Estes vários estudos sugerem que a glomerulonefrite mediada por complemento contínuo resultaram na excreção da proteína de complementos que correlacionam com o grau de dano no tecido e prognose da doença.

[00182] A inibição da ativação de complemento em vários modelos animais de glomerulonefrite também demonstraram a importância da ativação de complemento na etiologia da doença. Em um modelo de glomerulonefrite membranoproliferativa (MPGN), a infusão de antissoro anti-Thy1 em ratos deficientes em C6 (que não podem formar C5b-9) resultaram em 90% menos

110 / 394 de proliferação celular glomerular, 80% de redução nas plaquetas e infiltração de macrófago, síntese de colágeno diminuía tipo 4 (um marcador para a expansão da matriz mesangial) e 50% menos proteinúria do que em ratos C6+ normais (Brandt, J., et al., Kidney Int. 49: 335-343, 1996). Estes resultados implicam em C5b-9 como um mediador principal do dano tissular pelo complemento neste modelo de soro antitimócito do rato.

Em um outro modelo de glomerulonefrite, a infusão das dosagens graduadas de membrana de base glomerular de coelho anti-rato produziu um influxo dependente da dose de leucócitos polimorfonucleares (PMN) que foi atenuado pelo tratamento anterior com fator de veneno de cobra (para consumir o complemento) (Scandrett, A.L., et al., Am.

J.

Physiol. 268: F256-F265, 1995). Os ratos tratados com fator de veneno de cobra também mostraram uma histopatologia diminuída, proteinúria de longo-prazo diminuída e níveis de creatinina inferiores do que os ratos de controle.

Utilizando três modelos de GN em ratos (soro antitimócito, Con A antiCon A e nefrite passiva de Heymann), Couser et al., demonstraram a eficácia terapêutica potencial dos métodos para inibir complemento usando-se a proteína de sCR1 recombinante (Couser, W.G., et al., J.

Am.

Soc.

Nephrol. 5: 1888-94, 1995). Os ratos tratados com sCR1 apresentaram PMN significantemente diminuída, influxo de plaquetas e macrófagos, mesangiólise diminuída e proteinúria contra os ratos de controle.

Outras evidências para a importância da ativação de complemento na glomerulonefrite foram providas através do uso de um MoAb anti-C5 no modelo de camundongo NZB/W F1. O MoAb anti-C5 inibe a clivagem de C5, deste modo bloqueando a geração de C5a e C5b-9. A terapia contínua com MoAb anti-C5 por 6 meses resultou na melhora significante do progresso da glomerulonefrite.

Um anticorpo monoclonal de MoAb anti-C5 humanizado (5G1,1) que previne a clivagem do componente C5 de complemento humano em seus componentes pró-inflamatórios está sob desenvolvimento pela Alexion Pharmaceuticals, Inc., New Haven, Connecticut, como um

111 / 394 tratamento potencial para a glomerulonefrite.

[00183] A evidência direta para um papel patológico de complemento na lesão renal é provida através dos estudos dos pacientes com deficiências genéticas nos componentes de complemento específicos. Vários relatórios documentaram uma associação da doença renal com deficiências do fator H regulador de complemento (Ault, B.H., Nephrol. 14: 1045-1053, 2000; Levy, M., et al., Kidney Int. 30: 949-56, 1986; Pickering, M.C., et al., Nat. Genet. 31: 424-8, 2002). Resultados de deficiência do Fator H em níveis de plasma baixo do fator B e C3 e no consumo de C5b-9. Tanto a glomerulonefrite membranoproliferativa atípica (MPGN) quanto a síndrome urêmica hemolítica idiopática (HUS) são associadas com a deficiência do fator H. Os porcos deficientes no Fator H (Jansen, J.H., et al., Kidney Int. 53: 331-49, 1998) e os camundongos de knockout do fator H (Pickering, M.C., 2002) apresentam sintomas semelhantes à MPGN, confirmando a importância do fator H na regulação do complemento. As deficiências dos outros componentes de complemento são associadas com doença renal, secundária ao desenvolvimento do lúpus eritematoso sistêmico (SLE) (Walport, M.J., Davies, et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 815: 267-81, 1997). A deficiência para C1q, C4 e C2 predispõem bastante ao desenvolvimento de SLE por intermédio de mecanismos relacionados com a depuração defeituosa dos complexos imunes e material apoptótico. Em muitos destes pacientes SLE, a nefrite de lupo ocorre, distinguido pela deposição de complexos imunes por todos os glomérulos.

[00184] Outras evidências ligando a ativação de complemento e doença renal tem foram providas através da identificação em pacientes de autoanticorpos direcionados contra componentes de complemento, alguns dos quais foram diretamente relacionados à doença renal (Trouw, L.A., et al., Mol. Immunol. 38: 199-206, 2001). Vários destes autoanticorpos mostram um tal grau de correlação com a doença renal que o termo fator nefrítico (NeF)

112 / 394 foi introduzido para indicar esta atividade. Nos estudos clínicos, cerca de 50% dos pacientes positivos para fatores nefríticos desenvolveram MPGN (Spitzer, R.E., et al., Clin. Immunol. Immunopathol. 64: 177-83, 1992). C3NeF é um autoanticorpo direcionado contra o caminho alternativo C3 convertase (C3bBb) e este estabiliza esta convertase, promovendo deste modo a ativação do caminho alternativo (Daha, M.R., et al., J. Immunol. 116: 1-7, 1976). Do mesmo modo, o autoanticorpo com uma especificidade para o caminho clássico C3 convertase (C4b2a), chamado de C4NeF, estabiliza esta convertase e deste modo promove a ativação do caminho clássico (Daha, M.R. et al., J. Immunol. 125: 2051-2054, 1980; Halbwachs, L., et al., J. Clin. Invest. 65: 1249-56, 1980). Os autoanticorpos anti-C1q foram descritos estar relacionados com a nefrite em pacientes SLE (Hovath, L., et al., Clin. Exp. Rheumatol. 19: 667-72, 2001; Siegert, C., et al., J. Rheumatol. 18: 230-34, 1991; Siegert, C., et al., Clin. Exp. Rheumatol. 10: 19-23, 1992) e um aumento na titulação destes autoanticorpos anti-C1q foi reportada prever uma queima da nefrite (Coremans, I.E, et al., Am. J. Kidney Dis. 26: 595-601, 1995). Os depósitos imunológicos eluidos dos rins pós-morte dos pacientes com SLE revelaram o acúmulo destes autoanticorpos anti-C1q (Mannick, M., et al., Arthritis Rheumatol. 40: 1504-11, 1997). Todos estes fatos apontam para um papel patológico para estes autoanticorpos. Entretanto, nem todos os pacientes com autoanticorpos anti-C1q desenvolvem a doença renal e também alguns indivíduos saudáveis têm baixos autoanticorpos anti-C1q de titulação (Siegert, C.E., et al., Clin. Immunol. Immunopathol. 67: 204-9, 1993).

[00185] Além dos caminhos alternativos e clássicos da ativação de complemento, o caminho da lectina também pode ter um papel patológico importante na doença renal. Os níveis elevados de MBL, serina protease associada com MBL e produtos de ativação de complemento foram detectadas através de técnicas imuno-histoquímicas no material de biópsia renal obtido de pacientes diagnosticados com várias doenças renais diferentes, incluindo

113 / 394 Nefrite Púrpura de Henoch-Schonlein (Endo, M., et al., Am. J. Kidney Dis. 35: 401-407, 2000), glomerulonefrite crioglobulinêmica (Ohsawa, I., et al., Clin. Immunol. 101: 59-66, 2001) e neuropatia de IgA (Endo, M., et al., Clin. Nephrology 55: 185-191, 2001). Portanto, apesar do fato de que uma associação entre o complemento e doenças renais foi conhecida por várias décadas, os dados em como o complemento influencia exatamente estas doenças renais estão longe de estar completos. Distúrbios Sanguíneos

[00186] A septicemia é causada por uma reação esmagadora do paciente aos microrganismos invasores. Uma função principal do sistema de complemento é orquestrar a resposta inflamatória para invadir as bactérias e outros patógenos. Compatíveis com este papel fisiológico, a ativação de complemento foi mostrada em vários estudos ter um papel principal na patogênese da septicemia (Bone, R.C., Annals. Internal. Med. 115: 457-469, 1991). A definição das manifestações clínicas da septicemia está sempre evoluindo. A septicemia é geralmente definida como a resposta hospedeira sistêmica de uma infecção. Entretanto, em muitas ocasiões, nenhuma evidência clínica para a infecção (por exemplo, culturas sanguíneas positivas para bactérias) foi encontrada em pacientes com sintomas sépticos. Esta discrepância foi primeiro levada em consideração em uma Conferência de Consenso em 1992 quando o termo “síndrome inflamatória da resposta sistêmica” (SIRS) foi estabelecido e para o qual nenhuma presença explicável da infecção bacteriana foi necessária (Bone, R.C., et al., Crit. Care Med. 20: 724-726, 1992). Agora há uma concordância geral de que a septicemia e SIRS são acompanhadas pela inabilidade de regular a resposta inflamatória. Para os propósitos desta breve revisão, vamos considerar a definição clínica da septicemia para também incluir várias septicemias, choque séptico e SIRS.

[00187] A fonte predominante da infecção em pacientes sépticos antes do final dos anos 1980 foram as bactérias Gram-negativas. Os

114 / 394 lipopolissacarídeos (LPS), o componente principal da parede celular bacteriana gram-negativa, foi conhecido estimular a liberação dos mediadores inflamatórios de vários tipos celulares e induzir os sintomas infecciosos quando injetado nos animais (Haeney, M.R., et al., Antimicrobial Chemiotherapy 41(Supl. A): 41-6, 1998). De modo interessante, o espectro de microrganismos responsáveis parecem ter trocados de bactérias predominantemente gram-negativas no final dos anos 1970 e 1980 para predominantemente bactérias Gram-positivas no presente, por razões que não são claras no presente (Martin, G.S., et al., N. Eng. J. Med. 348: 1546-54, 2003).

[00188] Muitos estudos mostraram a importância da ativação de complemento na mediação da inflamação e contribuíram para as características de choque, particularmente choque séptico e hemorrágico. Os organismos tanto Gram-negativos quanto Gram-positivos comumente precipitaram o choque séptico. LPS é um ativador potente do complemento, predominantemente por intermédio do caminho alternativo, embora a ativação do caminho clássico mediada pelos anticorpos também ocorra (Fearon, D.T., et al., N. Engl. J. Med. 292: 937-400, 1975). Os componentes principais da parede celular Gram-positiva são peptidoglicano e ácido lipoteicoico e ambos os componentes são ativadores potentes do caminho de complemento alternativo, embora na presença dos anticorpos específicos estes também possam ativar o clássico (Joiner, K.A., et al., Ann. Rev. Immunol. 2: 461-2, 1984).

[00189] O sistema de complemento foi inicialmente implicado na patogênese da septicemia quando foi notado por pesquisadores que as anafilatoxinas C3a e C5a mediam uma variedade de reações inflamatórias que também podem ocorrer durante a septicemia. Estas anafilatoxinas evocam a vasodilatação e um aumento na permeabilidade microvascular, eventos que desempenham um papel central no choque séptico (Schumacher, W.A., et al.,

115 / 394 Agents Actions 34: 345-349, 1991). Além disso, as anafilatoxinas induzem broncoespasmo, liberação de histamina dos mastoides e agregação de plaquetas. Além disso, estas exercem vários efeitos nos granulócitos, tais como quimiotaxia, agregação, adesão, liberação das enzimas lisossômicas, geração de ânion de óxido super tóxico e formação de leucotrienos (Shin, H.S., et al., Science 162: 361-363, 1968; Vogt, W., Complement 3: 177-86, 1986). Estes efeitos biológicos são julgados desempenhar um papel no desenvolvimento de complicações de septicemia tal como choque ou síndrome da aflição respiratória aguda (ARDS) (Hammerschmidt, D.E., et al., Lancet 1: 947-949, 1980; Slotman, G.T., et al., Surgery 99: 744-50, 1986). Além disso, os níveis elevados da anafilatoxina C3a são associados com um resultado fatal na septicemia (Hack, C.E., et al., Am. J. Med. 86: 20-26, 1989). Em alguns modelos animais de choque, algumas cepas deficientes de complemento (por exemplo, aquelas deficientes em C5) são mais resistentes aos efeitos das infusões de LPS (Hseuh, W., et al., Immunol. 70: 309-14, 1990).

[00190] O bloqueio da geração C5a com os anticorpos durante o início da septicemia em roedores foi mostrado aumentar muito a sobrevivência (Czermak, B.J., et al., Nat. Med. 5: 788-792, 1999). Verificações similares foram feitas quando o receptor de C5a (C5aR) foi bloqueado, com anticorpos ou com um inibidor de moléculas pequenas (Huber-Lang, M.S., et al., FASEB J. 16: 1567-74, 2002; Riedemann, N.C., et al., J. Clin. Invest. 110: 101-8, 2002). Os estudos experimentais anteriores em macacos sugeriram que o bloqueio de anticorpo de C5a atenuaram o choque séptico induzido por E. Coli e a síndrome da aflição respiratória aguda (Hangen, D.H., et al., J. Surg. Res. 46: 195-9, 1989; Stevens, J.H., et al., J. Clin. Invest. 77: 1812-16, 1986). Em seres humanos com septicemia, C5a foi elevada e associada com taxas de sobrevivência significantemente reduzidas junto com a falha de múltiplos órgãos, quando comparado com aquele em pacientes menos severamente

116 / 394 sépticos e sobreviventes (Nakae, H., et al., Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 84: 189-95, 1994; Nakae, et al., Surg. Today 26: 225-29, 1996; Bengtson, A., et al., Arch. Surg. 123: 645-649, 1988). Os mecanismos através dos quais C5a exerce seus efeitos nocivos durante a septicemia ainda devem ser investigados em maiores detalhes, mas dados recentes sugerem que a geração de C5a durante a septicemia significantemente compromete as funções imunológicas inatas dos neutrófilos sanguíneos (Huber-Lang, M.S., et al., J. Immunol. 169: 3223-31, 2002), sua capacidade de expressar uma queima respiratória e sua capacidade de gerar citocinas (Riedemann, N.C., et al., Immunity 19: 193-202, 2003). Além disso, a geração de C5a durante a septicemia parece ter efeitos procoagulantes (Laudes, I.J., et al., Am. J. Pathol. 160: 1867-75, 2002). A proteína CI INH que modula complemento também mostrou eficácia nos modelos animais de septicemia e ARDS (Dickneite, G., Behring Ins. Mitt. 93: 299-305, 1993).

[00191] O caminho da lectina também pode ter um papel na patogênese da septicemia. A MBL foi mostrada ligar a uma faixa de microrganismos clinicamente importantes incluindo bactérias tanto Gram- negativas quanto Gram-positivas e para ativar o caminho da lectina (Neth, O., et al., Infect. Immun. 68: 688, 2000). Ácido lipoteicoico (LTA) é crescentemente relacionado como a contraparte Gram-positiva da LPS. Este é um imunoestimulante potente que induz a liberação de citocina dos fagócitos mononucleares e sangue integral (Morath, S., et al., J. Exp. Med. 195: 1635, 2002; Morath, S., et al., Infect. Immun. 70: 938, 2002). Recentemente, foi demonstrado que a L-ficolina especificamente liga ao LTA isolado de várias espécies de bactérias Gram-positivas, incluindo Staphilococcus aureus e ativa o caminho da lectina (Lynch, N.J., et al., J. Immunol. 172: 1198-02, 2004). A MBL também foi mostrada ligar ao LTA do Enterococcus spp em que a cadeia de poliglicerofosfato é substituída com grupos glicosila), mas não ao LTA das nove outras espécies incluindo S. aureus (Polotsky, V.Y., et al.,

117 / 394 Infect. Immun. 64: 380, 1996).

[00192] Um aspecto da invenção deste modo provê um método para tratar a septicemia ou uma condição resultante da septicemia, administrando- se uma composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente inibidor de MASP-2 em um carreador farmacêutico a um sujeito sofrendo de septicemia ou uma condição resultante da septicemia incluindo sem limitação septicemia severa, choque séptico, síndrome da aflição respiratória aguda resultando da septicemia e síndrome inflamatória da resposta sistêmica. Os métodos relacionados são providos para o tratamento de outros distúrbios sanguíneos, incluindo choque hemorrágico, anemia hemolítica, trombocitopênica trombótica púrpura autoimune (TTP), síndrome urêmica hemolítica (HUS), síndrome urêmica hemolítica atípica (aHUS) ou outras condições destrutivas da medula/ossos, administrando-se uma composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente inibidor de MASP-2 em um carreador farmacêutico a um sujeito sofrendo de uma tal condição. O agente inibidor de MASP-2 é administrado ao sujeito sistemicamente, tal como através da administração intra-arterial, intravenosa, intramuscular, por inalação (particularmente no caso da ARDS), subcutânea ou outra administração parenteral ou potencialmente através da administração oral para os agentes não-peptidérgicos. A composição do agente inibidor de MASP-2 pode ser combinada com um ou mais agentes terapêuticos adicionais para combater as sequelas da septicemia e/ou choque. Para a septicemia avançada ou choque ou uma condição de aflição resultante deste, a composição inibidora de MASP-2 pode ser adequadamente administrada em uma forma de dosagem de ação rápida, tal como através da liberação intravenosa ou intra-arterial de um bolo de uma solução contendo a composição do agente inibidor de MASP-2. A administração repetida pode ser realizada como determinado por um médico até a condição ter sido resolvida.

118 / 394

COAGULOPATIAS

[00193] Evidências foram desenvolvidas para o papel do sistema de complemento na coagulação intravascular disseminada (“DIC”), tal como DIC secundária para um trauma corporalmente significante.

[00194] Os estudos anteriores mostraram que os camundongos C4-/- não são protegidos da lesão de reperfusão. (Zhou, W., et al, “Predominant role for C5b-9 in renal lesion of ischemia/reperfusion,” J Clin Invest 105: 1363-1371 (2000)). De modo a investigar se os camundongos C4-/- ainda podem ser capazes de ativar o complemento por intermédio do caminho clássico ou do caminho da lectina, o C3 transformado em plasma C4-/- foi medido em ensaios específicos para o caminho clássico ou a via de ativação do caminho da lectina. Enquanto nenhuma clivagem de C3 pode ser observada quando provocando a ativação por intermédio do caminho clássico, um caminho altamente eficiente da ativação dependente de lectina de C3 em soro deficiente em C4 foi observado (FIGURA 30). Pode ser visto que a deposição de C3b em manana e zimosana é severamente comprometida em camundongos MASP-2-/-, mesmo sob condições experimentais, que, de acordo com muitos papéis previamente publicados na ativação do caminho alternativo, deve ser permissiva para todos os três caminhos. Quando usando o mesmo soro em poços revestidos com complexos de imunoglobulina ao invés de manana ou zimosana, deposição de C3b e clivagem do Fator B são vistos em soro de camundongo MASP-2+/+ e soro de MASP-2-/-, mas não em soro esgotado em C1q. Isto indica que a ativação do caminho alternado é facilitado em sora MASP-2-/- quando o C3b inicial é provido por intermédio da atividade clássica. A FIGURA 30C descreve a surpreendente verificação de que C3 pode ser eficazmente ativada em uma maneira dependente do caminho da lectina no plasma deficiente em C4.

[00195] Esta “passagem secundária de C4” é abolida através da inibição-ativação do caminho da lectina através da pré-incubação do plasma

119 / 394 com manana ou manose solúveis.

[00196] A ativação do sistema de complemento aberrante, não imune, é potencialmente perigosa ao ser humano e também pode desempenhar um papel importante na ativação do caminho hematológico, particularmente, em situações de trauma severo em que os caminhos tanto inflamatórios quanto hematológicos são ativados. Em saúde normal, a conversão de C3 é de <5% da proteína C3 do plasma total. Na infecção excessiva, incluindo septicemia e doença do complexo imune, a conversão de C3 reestabelece a si mesma em cerca de 30% com níveis de complemento frequentemente menores que o normal, devido à utilização aumentada e mudanças na distribuição de grupo. A ativação do caminho de C3 imediata de mais do que 30% geralmente produz uma evidência clinica óbvia da vasodilatação e da perda de fluidos aos tecidos. Acima de 30% a conversão de C3, os mecanismos de início que são predominantemente não imunes e as manifestações clínicas resultantes são nocivas ao paciente. Os níveis de C5 complementares na saúde e na doença controlada parecem muito mais estáveis do que C3. As diminuições significantes e ou conversão dos níveis de C5 são associados com a resposta do paciente ao politrauma anormal (por exemplo, acidentes de tráfego em estradas) e o provável desenvolvimento de síndromes pulmonares de choque. Deste modo, qualquer evidência da ativação do complemento de C3 além de 30% do grupo vascular ou de qualquer envolvimento de C5 ou ambos, pode ser considerada provável ser um aviso de uma mudança patológica nociva no paciente.

[00197] Tanto C3 quanto C5 liberam anafilatoxinas (C3a e C5a) que agem nos mastoides e produtos químicos vasodilatadores que liberam basófilos. Estes ajustam os gradientes quimiotáticos para guiar as células polimorfonucleares (PMN) para o centro dos distúrbios imunológicos (uma resposta benéfica), mas aqui, estes diferem, porque C5a tem um efeito de acúmulo específico (agregação) nestas células fagocíticas, prevenindo seu

120 / 394 movimento aleatório para longe do sítio de reação. No controle normal da infecção, C3 ativa C5. Entretanto, no politrauma, C5 parece ser amplamente ativado, gerando anafilatoxinas C5a. Esta atividade descontrolada faz com que os polimorfos acumulem dentro do sistema vascular e estas acumulações são depois retiradas dos capilares dos pulmões, porque obstruem e geram efeitos de danos locais como um resultado da liberação de superóxido. Enquanto não desejando estar ligado pela teoria, o mecanismo é provavelmente importante na patogênese da síndrome da aflição respiratória aguda (ARDS), embora esta visão tenha sido recentemente recusada. As anafilatoxinas C3a in vitro podem ser mostradas ser agregadores de plaqueta potentes, mas seu envolvimento in vivo é menos definido e the a liberação das substâncias das plaquetas e plasmina na cicatrização de feridas pode somente envolver secundariamente o complemento C3. É possível que a elevação secundária da ativação de C3 seja necessária para gerar DIC.

[00198] Além dos efeitos celulares e vasculares do componente de complemento ativado descritos acima que explicariam a ligação entre o trauma e DIC, as verificações científicas emergentes identificaram as ligações moleculares diretas e conversa cruzada funcional entre o complemento e os sistemas de coagulação. Os dados de suporte foram obtidos a partir de estudos em camundongos deficientes em C3. Porque o C3 é o componente compartilhado para cada um dos caminhos de complemento, os camundongos deficientes em C3 são preditos não ter toda a funções de complemento. Surpreendentemente, entretanto, os camundongos deficientes em C3 são perfeitamente capazes de ativar os componentes de complemento terminal. (Huber-Lang, M., et al., “Generation of C5a in the absence of C3: a new activation of complement pathway,” Nat. Med 12: 682-687 (2006)) em estudos profundos revelaram que a ativação independente de C3 dos componentes de complemento terminal é mediada por trombina, a taxa de enzima limitante da cascata de coagulação. (Huber et al., 2006) Os

121 / 394 componentes moleculares mediando a ativação de trombina após a ativação inicial de complemento permaneceram elusivos.

[00199] Os presentes inventores explicaram o que é acreditado ser a base molecular para a conversa cruzada entre o complemento e as cascatas de coagulação e MASP-2 identificada como um ponto de controle central ligando os dois sistemas. Os estudos bioquímicos na especificidade do substrato de MASP-2 identificaram a protrombina como um possível substrato, além das proteínas de complemento C2 e C4 bem conhecidas. MASP-2 especificamente cliva a protrombina nos sítios funcionalmente relevantes, gerando a trombina, a taxa de limitação de enzima da cascata de coagulação. (Krarup, A., et al., “Simultaneous Activation of Complement and Coagulation by MBL-Associated Serine protease 2,” PLoS. A. 2: e623 (2007)) A trombina gerada por MASP-2 é capaz de promover a deposição de fibrina em um sistema in vitro reconstituído definido, demonstrando a relevância funcional da clivagem de MASP-2. (Krarup et al., 2007) Como divulgado nos exemplos abaixo, os inventores também corroboraram a significância fisiológica desta verificação documentando-se a ativação da trombina em soro de roedor normal após a ativação do caminho da lectina e demonstraram que este processo é bloqueado pela neutralização dos anticorpos monoclonais MASP-2.

[00200] MASP-2 pode representar um ponto de ramificação central no caminho da lectina, capaz de promover a ativação tanto do complemento quanto dos sistemas de coagulação. Devido à ativação do caminho da lectina ser uma resposta fisiológica aos muitos tipos de lesão traumática, os presentes inventores acreditam que a inflamação sistêmica concorrente (mediada pelos componentes de complemento) e a coagulação disseminada (mediada por intermédio do caminho de coagulação) pode ser explicados pela capacidade da MASP-2 de ativar ambos os caminhos. Estas verificações sugerem claramente um papel para a MASP-2 na geração de DIC e benefício

122 / 394 terapêutico da inibição de MASP-2 no tratamento ou prevenção de DIC. A MASP-2 pode prover a ligação molecular entre o sistema de complemento e coagulação e a ativação do caminho da lectina conforme este ocorre nos casos de trauma pode iniciar diretamente a ativação do sistema de coagulação por intermédio do eixo de MASP-2-trombina, provendo uma ligação de mecanismo entre trauma e DIC. De acordo com um aspecto da presente invenção, a inibição de MASP-2 inibiria a ativação do caminho da lectina e reduziria a geração das anafilatoxinas tanto C3a quanto C5a. É acreditado que a elevação prolongada da ativação de C3 é necessária para gerar DIC.

[00201] A coagulação microcirculatória (coágulos de sangue nos capilares e vasos sanguíneos pequenos) ocorre nas configurações de tal choque séptico. Um papel do caminho da lectina no choque séptico é estabelecido, como evidenciado pelo fenótipo protegido dos modelos de camundongo MASP-2 (-/-) de septicemia, descrito no Exemplo 17 e FIGURAS 18 e 19. Além disso, como demonstrado no Exemplo 15 e FIGURAS 16A e 16B, os camundongos MASP-2 (-/-) são protegidos no modelo de reação de Schwartzman localizada da coagulação intravascular disseminada (DIC), um modelo de coagulação localizada nos microvasos. V. AGENTES INIBIDORES DE MASP-2

[00202] Em um aspecto, a presente invenção provê métodos de inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2 em um sujeito sofrendo de ou em risco de desenvolver uma microangiopatia trombótica. Os agentes inibidores de MASP-2 são administrados em uma quantidade eficaz para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2 em um sujeito vivo. Na prática deste aspecto da invenção, os agentes inibidores de MASP-2 representativos incluem: moléculas que inibem a atividade biológica de MASP-2 (tal como inibidores de molécula pequena, anticorpos anti-MASP-2 ou peptídeos de bloqueio que interagem com MASP-2 ou interferem com uma interação de proteína-proteína) e moléculas que diminuem a expressão de

123 / 394 MASP-2 (tais como as moléculas de ácido nucleico de antissentido de MASP- 2, moléculas de RNAi específicas para MASP-2 e ribozimas de MASP-2), prevenindo deste modo a MASP-2 de ativar o caminho de complemento de lectina. Os agentes inibidores de MASP-2 podem ser usados sozinhos como uma terapia primária ou em combinação com outros terapêuticos como uma terapia adjuvante para intensificar os benefícios terapêuticos de outros tratamentos médicos.

[00203] A inibição da ativação de complemento dependente de MASP- 2 é distinguida em pelo menos uma das seguintes mudanças em um componente do sistema de complemento que ocorre como um resultado da administração de um agente inibidor de MASP-2 de acordo com os métodos da invenção: a inibição da geração ou produção da ativação dos produtos do sistema de complemento dependente de MASP-2 C4b, C3a, C5a e/ou C5b-9 (MAC) (medida, por exemplo, como descrito no Exemplo 2), a redução da ativação de complemento avaliada em um ensaio hemolítico usando células vermelhas do sangue de coelho ou porquinho-da-Índia sem sensibilização (medida, por exemplo como descrito no Exemplo 33), a redução da clivagem de C4 e deposição de C4b (medidas, por exemplo como descrito no Exemplo 2) ou a redução da clivagem de C3 e deposição de C3b (medidas, por exemplo, como descrito no Exemplo 2).

[00204] De acordo com a presente invenção, os agentes inibidores de MASP-2 são utilizados, os quais são eficazes na inibição do sistema de ativação de complemento dependente de MASP-2. Os agentes inibidores de MASP-2 úteis na prática deste aspecto da invenção incluem, por exemplo, os anticorpos anti-MASP-2 e os fragmentos do mesmo, os peptídeos inibidores de MASP-2, moléculas pequenas, receptores solúveis de MASP-2 e inibidores de expressão. Os agentes inibidores de MASP-2 podem inibir O sistema de ativação de complemento dependente de MASP-2 bloqueando-se a função biológica de MASP-2. Por exemplo, um agente inibidor pode bloquear

124 / 394 eficazmente as interações de proteína-para-proteína de MASP-2, interferir com a dimerização ou montagem de MASP-2, bloquear a ligação de Ca2+, interferir com o local ativo de serina protease de MASP-2 ou pode reduzir a expressão da proteína de MASP-2.

[00205] Em algumas modalidades, os agentes inibidores de MASP-2 seletivamente inibem a ativação de complemento de MASP-2, deixando o sistema de ativação de complemento dependente de C1q funcionalmente intacto.

[00206] Em uma modalidade, um agente inibidor de MASP-2 útil nos métodos da invenção é um agente inibidor específico de MASP-2 que especificamente se liga a um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO: 6 com uma afinidade de pelo menos dez vezes mais do que a outros antígenos no sistema de complemento. Em uma outra modalidade, um agente inibidor de MASP-2 especificamente liga a um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO: 6 com uma afinidade de ligação de pelo menos 100 vezes mais do que a outros antígenos no sistema de complemento. A afinidade de ligação do agente inibidor de MASP-2 pode ser determinada usando um ensaio de ligação adequado.

[00207] O polipeptídeo de MASP-2 apresenta uma estrutura molecular similar a MASP-1, MASP-3 e C1r e C1s, as proteases do sistema de complemento C1. A molécula de cDNA apresentada na SEQ ID NO: 4 codifica um exemplo representativo de MASP-2 (consistindo da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 5) e provê o polipeptídeo da MASP-2 humana com uma sequência líder (aa 1 a 15) que é clivada depois da secreção, resultando na forma madura da MASP-2 humana (SEQ ID NO: 6). Como mostrado na FIGURA 2, o gene MASP 2 humano abrange doze éxons. O cDNA de MASP-2 humana é codificado pelos éxons B, C, D, F, G, H, I, J, K E L. Os resultados unidos alternativos em uma proteína de 20 kDa chamada de proteína associada à MBL 19 (“MAp19”, também indicada como “sMAP”)

125 / 394 (SEQ ID NO: 2), codificada pela (SEQ ID NO: 1) surge dos éxons B, C, D e como mostrado na FIGURA 2. A molécula de cDNA apresentada na SEQ ID NO: 50 codifica a MASP-2 murino (consistindo da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 51) e provê o polipeptídeo de MASP-2 murino com uma sequência líder que é clivada depois secreção, resultando na forma madura da MASP-2 murino (SEQ ID NO: 52). A molécula de cDNA apresentada na SEQ ID NO: 53 codifica a MASP-2 de rato (consistindo da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 54) e provê o polipeptídeo de MASP-2 de rato com uma sequência líder que é clivada depois da secreção, resultando na forma madura da MASP-2 de ratos (SEQ ID NO: 55).

[00208] Aqueles habilitados na técnica reconhecerão que as sequências divulgadas na SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 50 e SEQ ID NO: 53 representam alelos simples da MASP-2 de seres humanos, murinos e ratos, respectivamente, e aquela variação alélica e junção alternativa são esperadas ocorrer. As variantes alélicas das sequências de nucleotídeos mostrados na SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 50 e SEQ ID NO: 53, incluindo aquelas contendo mutações silenciosas e aquelas nas quais as mutações resulta em mudanças na sequência de aminoácidos, são estão dentro do escopo da presente invenção. As variantes alélicas da sequência de MASP-2 podem ser clonadas sondando-se o cDNA ou bibliotecas genômicas de indivíduos diferentes de acordo com procedimentos padrão.

[00209] Os domínios da proteína de MASP-2 humana (SEQ ID NO: 6) são mostrados na FIGURA 1 e 2A e incluem um domínio da proteína Clr/Cls/VEGF de ouriço-do-mar/morfogênica óssea de terminal N (CUBI) (aa 1 a 121 da SEQ ID NO: 6), um domínio semelhante ao fator de crescimento epidérmico (aa 122 a 166), um segundo domínio de CUBI (aa 167 a 293), assim como uma comutação dos domínios de proteína de controle do complemento e um domínio de serina protease. A junção alternativa do gene

126 / 394 de MASP 2 resultou na MAp19 mostrada na FIGURA 1. A MAp19 é uma proteína não-enzimáticos contendo a região N-terminal CUB1-EGF de MASP-2 com quatro resíduos adicionais (EQSL) derivados do éxon E como mostrado na FIGURA 1.

[00210] Várias proteínas foram mostradas ligar a ou interagir com a MASP-2 através das interações de proteína-a-proteína. Por exemplo, a MASP-2 é conhecida ligar a, e formar complexos dependentes de Ca2+ com, as proteínas de lectina MBL, H-ficolina e L-ficolina. Cada complexo de MASP-2/lectina foi mostrado ativar complemento através da clivagem dependente de MASP-2 das proteínas C4 e C2 (Ikeda, K., et al., J. Biol. Chem. 262: 7451-7454, 1987; Matsushita, M., et al., J. Exp. Med. 176: 1497- 2284, 2000; Matsushita, M., et al., J. Immunol. 168: 3502-3506, 2002). Foram apresentados estudos nos quais os domínios de MASP-2 CUB1-EGF são essenciais para a associação de MASP-2 com MBL (Thielens, N.M., et al., J. Immunol. 166: 5068, 2001). Também foi apresentado que os domínios CUB1EGFCUBII mediam a dimerização de MASP-2, que é necessária para a formação de um complexo de MBL ativo (Wallis, R., et al., J. Biol. Chem. 275: 30962-30969, 2000). Portanto, os agentes inibidores de MASP-2 podem ser identificados que ligam a ou interferem com as regiões alvo de MASP-2 conhecidas ser importantes para a ativação de complemento dependente de MASP-2. ANTICORPOS ANTI-MASP-2

[00211] Em algumas modalidades deste aspecto da invenção, o agente inibidor de MASP-2 compreende um anticorpo anti-MASP-2 que inibe a ativação de complemento dependente do sistema de MASP-2. Os anticorpos anti-MASP-2 úteis neste aspecto da invenção incluem anticorpos policlonais, monoclonais ou recombinantes derivados de qualquer mamífero que produz anticorpo e pode ser multiespecífico, quimérico, humanizado, anti-idiotípico e fragmentos de anticorpos. Os fragmentos de anticorpos incluem Fab, Fab’,

127 / 394 F(ab)2, F(ab’)2, fragmentos de Fv, fragmentos de scFv e anticorpos de cadeia única como aqui adicionalmente descrito.

[00212] Vários anticorpos anti-MASP-2 foram descritos na literatura, alguns dos quais são listados abaixo na TABELA 1. Estes anticorpos anti- MASP-2 previamente descritos podem ser triados quanto a capacidade de inibir o sistema de ativação de complemento dependente de MASP-2 usando os ensaios aqui descritos. Por exemplo, os anticorpos Fab2 anti-MASP-2 de rato foram identificados, os quais bloqueiam a ativação de complemento dependente de MASP-2, como descrito em mais detalhes nos Exemplos 10 e 11 aqui contidos. Uma vez que um anticorpo anti-MASP-2 é identificado como funcionando como um agente inibidor de MASP-2, este pode ser usado para produzir anticorpos anti-idiotípicos e usados para identificar outras moléculas de ligação de MASP-2 como novamente descrito abaixo. TABELA 1: ANTICORPOS ESPECÍFICOS DE MASP-2 DA

LITERATURA

ANTÍGENO TIPO DE ANTICORPO REFERÊNCIA MASP-2 Recombinante Policlonal de rato Peterson, S. V., et al., Mol. Immunol. 37: 803-811, 2000 Fragmento CCP1/2-SP MoAb de Rato Moller-Kristensen, M., et al., J. of Recombinante humano (subclasse IgG1) Immunol. Methods 282: 159-167, 2003 (MoAb 8B5) MAp19 Recombinante MoAb de Rato Moller-Kristensen, M., et al., J. of humano (MoAb 6G12) (subclasse IgG1) Immunol. Methods 282: 159-167, 2003 (reage cruzado com MASP- 2) hMASP-2 MoAb de Camundongo (S/P) MoAb Peterson, S. V., et al., Mol. Immunol. de Camundongo (terminal N) 35: 409, Abril 1998 Domínio de hMASP-2 MoAb de rato: Nimoab101, produzido WO 2004/106384 (CCP1-CCP2-SP pela linhagem de célula de hibridoma 03050904 (ECACC) hMASP-2 (tamanho natural MoAbs de murino: WO 2004/106384 rotulado em his) NimoAb104, produzido pela linhagem de célula de hibridoma M0545YM035 (DSMZ) NimoAb108, produzido pela linhagem de célula de hibridoma M0545YM029 (DSMZ) NimoAb109 produzido pela linhagem de célula de hibridoma M0545YM046 (DSMZ) NimoAb110 produzido pela linhagem de célula de hibridoma M0545YM048 (DSMZ) ANTICORPOS ANTI-MASP-2 COM FUNÇÃO EFETORA REDUZIDA

128 / 394

[00213] Em algumas modalidades deste aspecto da invenção, os anticorpos anti-MASP-2 têm uma função efetora reduzida de modo a reduzir a inflamação que pode surgir da ativação do clássico. A capacidade das moléculas de IgG de provocar o clássico foi mostrada residir dentro da porção de Fc da molécula (Duncan, A.R., et al., Nature 332: 738-740 1988). As moléculas IgG em que a porção de Fc da molécula foi removida através da clivagem enzimática são isentas desta função efetora (ver Harlow, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nova Iorque, 1988). Portanto, os anticorpos com função efetora reduzida podem ser gerados como o resultado da falta da porção de Fc da molécula tendo uma sequência de Fc geneticamente engenheirada que minimiza a função efetora ou sendo do isótipo IgG2 ou IgG4 humano.

[00214] Os anticorpos com função efetora reduzida podem ser produzidos pela manipulação biológica molecular padrão da porção de Fc dos IgG de cadeias pesadas como descrito no Exemplo 9 e também descrito em Jolliffe et al., Int’l Rev. Immunol. 10: 241-250, 1993 e Rodrigues et al., J. Immunol. 151: 6954-6961, 1998. Os anticorpos com função efetora reduzida também incluem os isótipos IgG2 e IgG4 humanos que têm uma capacidade reduzida de ativar complemento e/ou interagir com os receptores de Fc (Ravetch, J.V., et al., Annu. Rev. Immunol. 9: 457-492, 1991; Isaacs, J.D., et al., J. Immunol. 148: 3062-3071, 1992; van de Winkel, J.G., et al., Immunol. Today 14: 215-221, 1993). Os anticorpos humanizados ou completamente humanos específicos para a MASP-2 humana compreendidos dos isótipos IgG2 ou IgG4 podem ser produzidos através de vários métodos conhecidos a uma pessoa de habilidade comum na técnica, como descrito em Vaughan, T.J., et al., Nature Biotechnical 16: 535-539, 1998. PRODUÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-MASP-2

[00215] Os anticorpos anti-MASP-2 podem ser produzidos usando polipeptídeos de MASP-2 (por exemplo, MASP-2 de comprimento total) ou

129 / 394 usando peptídeos que carregam o epítopo de MASP-2 do antígeno (por exemplo, uma porção do polipeptídeo de MASP-2). Os peptídeos imunogênicos podem ser tão pequenos quanto resíduos de aminoácidos. Por exemplo, o polipeptídeo MASP-2 incluindo a sequência de aminoácidos inteira da SEQ ID NO: 6 pode ser usada para induzir os anticorpos anti- MASP-2 úteis no método da invenção. Os domínios de MASP-2 particulares conhecidos estar envolvidos nas interações de proteína-proteína, tais como os domínios de CUBI e CUBIEGF, assim como a região abrangendo o sítio ativo de serina-protease, podem ser expressados como polipeptídeos recombinantes como descrito no Exemplo 3 e usados como antígenos. Além disso, os peptídeos compreendendo uma porção de pelo menos 6 aminoácidos do polipeptídeo MASP-2 (SEQ ID NO: 6) também são úteis para induzir os anticorpos de MASP-2. Os exemplos adicionais de antígenos derivados de MASP-2 úteis para induzir os anticorpos de MASP-2 são providos abaixo na TABELA 2. Os peptídeos de e polipeptídeos de MASP-2 usados para aumentar os anticorpos podem ser isolados como polipeptídeos naturais ou recombinantes ou peptídeos sintéticos e polipeptídeos recombinantes cataliticamente inativos, tal como MASP-2A, como também descrito nos Exemplos de 5 a 7. Em algumas modalidades deste aspecto da invenção, os anticorpos anti-MASP-2 são obtidos usando uma cepa de camundongo transgênico como descrito nos Exemplos 8 e 9 e novamente descrito abaixo.

[00216] Os antígenos úteis para produzir os anticorpos anti-MASP-2 também incluem polipeptídeos de fusão, tais como as fusões de MASP-2 ou uma porção da mesma com um polipeptídeo de imunoglobulina ou com uma proteína de ligação à maltose. O imunógeno polipeptídico pode ser uma molécula de comprimento total ou uma porção do mesmo. Se a porção de polipeptídeo é tipo hapteno, tal porção pode ser vantajosamente unida ou ligada a um carreador macromolecular (tal como a hemocianina do lapa buraco de fechadura (KLH), albumina de soro bovino (BSA) ou toxoide do

130 / 394 tétano) para a imunização. TABELA 2: ANTÍGENOS DERIVADOS DE MASP-2 SEQ ID NO: Sequência de aminoácido SEQ ID NO: 6 Proteína humana de MASP-2 SEQ ID NO: 51 Proteína MASP-2 de Murino SEQ ID NO: 8 Domínio CUBI da MASP-2 humana (aa 1 a 121 da SEQ ID NO: 6) SEQ ID NO: 9 Domínios CUBIEGF da MASP-2 humana (aa 1-166 da SEQ ID NO: 6) SEQ ID NO: 10 Domínios CUBIEGFCUBII da MASP-2 humana (aa 1 a 293 da SEQ ID NO: 6) SEQ ID NO: 11 Domínio EGF de MASP-2 humana (aa 122 a 166 da SEQ ID NO: 6) SEQ ID NO: 12 Domínio de Serina-Protease da MASP-2 humana (aa 429-671 da SEQ ID NO: 6) SEQ ID NO: 13 Forma mutante inativada de Serina-Protease (aa 610 a 625 da GKDSCRGDAGGALVFL SEQ ID NO: 6 com Ser 618 mutada) SEQ ID NO: 14 Peptídeo CUBI humano

TPLGPKWPEPVFGRL SEQ ID NO: 15: Peptídeo CUBI humano

TAPPGYRLRLYFTHFDLELSHLCEYDF

VKLSSGAKVLATLCGQ SEQ ID NO: 16: Região de ligação de MBL no domínio CUBI humano

TFRSDYSN SEQ ID NO: 17: Região de ligação de MBL no domínio CUBI humano

FYSLGSSLDITFRSDYSNEKPFTGF SEQ ID NO: 18 Peptídeo EGF

IDECQVAPG SEQ ID NO: 19 Peptídeo do sítio ativo de serina-protease

ANMLCAGLESGGKDSCRGDSGGALV ANTICORPOS POLICLONAIS

[00217] Os anticorpos policlonais contra MASP-2 podem ser preparados imunizando um animal com polipeptídeo MASP-2 ou uma porção imunogênica do mesmo usando métodos bem conhecidos àqueles de habilidade comum na técnica. Ver, por exemplo, Green et al., “Production of Policlonal Antisera,” in Immunochemical Protocols (Manson, ed)., página 105 e como também descrito no Exemplo 6. A imunogenicidade de um polipeptídeo de MASP-2 pode ser aumentada através do uso de um adjuvante, incluindo géis minerais, tais como hidróxido de alumínio ou adjuvante de Freund (completo ou incompleto), substâncias de superfície ativa tais como lisolecitina, polióis plurônicos, poliânions, emulsões em óleo, hemocianina do lapa buraco de fechadura e dinitrofenol. Os anticorpos policlonais são tipicamente elevados em animais tais como cavalos, vacas, cães, frangos, ratos, camundongos, coelhos, porquinhos da Índia, cabras ou ovelhas.

131 / 394 Alternativamente, um anticorpo anti-MASP-2 útil na presente invenção também pode ser derivado de um primata sub-humano. As técnicas gerais para aumentar os anticorpos úteis do ponto de vista de diagnóstico e terapêutico úteis em babuínos podem ser encontrados, por exemplo, em Goldenberg et al., Publicação de Patente Internacional No. WO 91/11465 e em Losman, M.J., et al., Int. J. Cancer 46: 310, 1990. Um soro contendo anticorpos imunologicamente ativos são então produzidos a partir do sangue de tais animais imunizados usando procedimentos padrão bem conhecidos na técnica. Anticorpos monoclonais

[00218] Em algumas modalidades, o agente inibidor de MASP-2 é um anticorpo monoclonal anti-MASP-2. Os anticorpos monoclonais anti-MASP- 2 são altamente específicos, sendo direcionados contra um epítopo de MASP- 2 único. Como aqui usado, o modificador “monoclonal” indica a característica do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos e não deve ser interpretada como requerendo a produção do anticorpo através de qualquer método particular. Os anticorpos monoclonais podem ser obtidos usando qualquer técnica que provê a produção das moléculas de anticorpos através das linhagens celulares contínuas na cultura, tal como o método de hibridoma descrito por Kohler, G., et al., Nature 256: 495, 1975 ou estes podem ser feitos através de métodos de DNA recombinantes (ver, por exemplo, a Patente U.S. No. 4.816.567 para Cabilly). Os anticorpos monoclonais também podem ser isolados das bibliotecas de anticorpo de fago usando as técnicas descritas em Clackson, T., et al., Nature 352: 624-628, 1991 e Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222: 581- 597, 1991. Tais anticorpos podem ser de qualquer classe de imunoglobulina incluindo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD e qualquer subclasse dos mesmos.

[00219] Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser obtidos injetando-se em um mamífero adequado (por exemplo, um camundongo

132 / 394 BALB/c) uma composição compreendendo um polipeptídeo de MASP-2 ou porção do mesmo. Depois de um período de tempo predeterminado, os esplenócitos são removidos do camundongo e colocados em suspensão em um meio de cultura celular. Os esplenócitos são depois fundidos com uma linhagem celular imortal para formar um hibridoma. Os hibridomas formados são cultivados em uma cultura celular e triados quanto sua capacidade de produzir um anticorpo monoclonal contra MASP-2. Um exemplo que também descreve a produção dos anticorpos monoclonais anti-MASP-2 é provido no Exemplo 7. (Ver também, Current Protocols in Immunology, Vol. 1., John Wiley & Sons, páginas 2,5,1-2,6,7, 1991).

[00220] Os anticorpos monoclonais humanos podem ser obtidos através do uso de camundongos transgênicos que foram engendrados para produzir anticorpos humanos específicos em resposta à inoculação antigênica. Nesta técnica, elementos do local da cadeia pesada e leve da imunoglobulina humana são introduzidos em cepas de camundongos derivadas das linhagens de célula-tronco embrionárias que contêm interrupções alvejadas dos locais de cadeia pesada e cadeia leve da imunoglobulina endógena. Os camundongos transgênicos podem sintetizar anticorpos humanos específicos para os antígenos humanos, tais como os antígenos de MASP-2 aqui descritos, e os camundongos podem ser usados para produzir hibridomas que secretam anticorpo de MASP-2 humano pela fusão de células B de tais animais às linhagens de célula de mieloma adequadas usando a tecnologia de Kohler-Milstein convencionais como adicionalmente descrito no Exemplo 7. Camundongos transgênicos com um fgenoma da imunoglobulina humana são comercialmente disponíveis (por exemplo, da Abgenix, Inc., Fremont, CA, e Medarex, Inc., Annandale, N.J.). Os métodos para a obtenção de anticorpos humanos a partir de camundongos transgênicos são descritos, por exemplo, por Green, L. L., et al., Nature Genet. 7: 13, 1994; Lonberg, N., et al., Nature 368: 856, 1994; e Taylor, L. D., et al., Int. Immun. 6: 579, 1994.

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[00221] Os anticorpos monoclonais podem ser isolados e purificados a partir de culturas de hibridoma por uma variedade de técnicas bem estabelecidas. Tais técnicas de isolação incluem a cromatografia de afinidade com Proteína-A Sepharose, cromatografia de exclusão de tamanho, e cromatografia de troca de íon (ver, por exemplo, Coligan nas páginas 2.7.1-

2.7.12 e páginas 2.9.1-2.9.3; Baines et al., “Purification of Immunoglobulin G (IgG),” em Methods in Molecular Biology, The Humana Press, Inc., Vol. 10, páginas 79-104, 1992).

[00222] Uma vez produzidos, os anticorpos policlonais, monoclonais ou derivados de fago são primeiro testados quanto à ligação de MASP-1, MASP-2 ou MASP-3 específica ou, onde desejado, a ligação de MASP-1/3, MASP-2/3 ou MASP-1/2 dual. Os métodos para determinar se um anticorpo liga-se a um antígeno de proteína e/ou a afinidade de um anticorpo a um antígeno de proteína são conhecidos na técnica. Por exemplo, a ligação de um anticorpo a um antígeno de proteína pode ser detectada e/ou quantificada usando uma variedade de técnicas tais como, mas não limitadas ao método de Western blot, pontos e manchas, ressonância de superfície de plásmon (por exemplo, BIAcore system; Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden e Piscataway, NJ), ou ensaios imunossorventes ligados à enzima (ELISA). Ver, por exemplo, Harlow e Lane (1988) “Antibodies: A Laboratory Manual” Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.; Benny K. C. Lo (2004) “Antibody Engineering: Methods and Protocols,” Humana Press (ISBN: 1588290921); Borrebaek (1992) “Antibody Engineering, A Practical Guide,” W. H. Freeman e Co., NY; Borrebaek (1995) “Antibody Engineering,” 2a Edição, Oxford University Press, NY, Oxford; Johne et al. (1993), Immunol. Meth. 160: 191-198; Jonsson et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51: 19-26; e Jonsson et al. (1991) Biotechniques 11: 620-627. Ver também, Patente U.S. No. 6.355.245.

[00223] A afinidade dos anticorpos monoclonais de MASP pode ser

134 / 394 facilmente determinada por uma pessoa de habilidade comum na técnica (ver, por exemplo, Scatchard, A., NY Acad. Sci. 51: 660-672, 1949). Em uma modalidade, os anticorpos monoclonais de MASP-1, MASP-2 ou MASP-3 úteis para os métodos da invenção ligam-se a MASP-1, MASP-2, ou MASP-3 com uma afinidade de ligação de <100 nM, preferivelmente <10 nM e o mais preferivelmente <2 nM.

[00224] Uma vez que anticorpos são identificados que especificamente se ligam a MASP-1, MASP-2 ou MASP-3, os anticorpos de MASP-1, MASP- 2 ou MASP-3 são testados quanto à capacidade para funcionar como um agente inibidor de LEA-1 ou um agente inibidor LEA-2 em um de vários ensaios funcionais, por exemplo como descritos na TABELA 2. Por exemplo, anticorpos identificados que especificamente se ligam a MASP-2 são testados quanto a capacidade para funcionar como um agente inibidor de LEA-2 em um de vários ensaios, tais como, por exemplo, como descrito na TABELA 2 (por exemplo, um ensaio de clivagem de C4 específico da lectina (tal como o ensaio descrito no Exemplo 8 ou Exemplo 9), ou um ensaio de deposição de C3b (tal como o ensaio descrito no Exemplo 4 ou Exemplo 11)). Como um outro exemplo, os anticorpos identificados que especificamente se ligam a MASP-1 ou MASP-3 são testados quanto à capacidade para funcionar como um agente inibidor de LEA-1 em um de vários ensaios, tais como, por exemplo, como descrito na TABELA 2 (por exemplo, a redução da hemólise, medida, por exemplo como descrito no Exemplo 5, ou a redução da clivagem de C3 e deposição de C3b, medidas, por exemplo, como descrito no Exemplo 4 e Exemplo 11). ANTICORPOS QUIMÉRICOS/HUMANIZADOS

[00225] Os anticorpos monoclonais úteis no método da invenção incluem anticorpos em que uma porção das cadeias pesada e/ou leve é idêntica com ou homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencendo a uma classe ou subclasse

135 / 394 de anticorpo particular, enquanto que o resto da cadeia(s) é idêntico com ou homólogo às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma outra espécie ou pertencendo a uma outra classe ou subclasse de anticorpo, assim como fragmentos de tais anticorpos (Patente U.S. No. 4.816.567, concedida a Cabilly; e Morrison, S. L., et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 81: 6851-6855, (1984)).

[00226] Uma forma de um anticorpo quimérico útil na invenção é um anticorpo monoclonal humanizado anti-MASP-2. As formas humanizadas de anticorpos não humanos (por exemplo, murino) são anticorpos quiméricos, que contêm derivado de sequência mínima de imunoglobulina não humana. Os anticorpos monoclonais humanizados são produzidos pela transferência das regiões determinadoras de complementaridade (CDRs) não humanas (por exemplo, de camundongo), das cadeias variáveis pesada e leve da imunoglobulina de camundongo em um domínio variável humano. Tipicamente, os resíduos de anticorpos humanos são depois substituídos nas regiões de armação das contrapartes não humanas. Além disso, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Estas modificações são feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo. No geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois domínios variáveis em que todas ou substancialmente todas das alças hipervariáveis correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões de armação de Fv são aquelas de uma sequência da imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado opcionalmente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante (Fc) da imunoglobulina, tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para mais detalhes, ver Jones, P.T., et al., Nature 321: 522-525, 1986; Reichmann, L., et al., Nature 332: 323-329, 1988; e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596, 1992.

136 / 394

[00227] Os anticorpos humanizados úteis na invenção incluem anticorpos monoclonais humanos incluindo pelo menos uma região de CDR3 de ligação a MASP-2. Além disso, as porções Fc podem ser substituídas de modo a produzir IgA ou IgM assim como anticorpos IgG humanos. Tais anticorpos humanizados terão utilidade clínica particular porque eles especificamente reconhecerão MASP-2 humana mas não evocarão uma resposta imune nos seres humanos contra o próprio anticorpo. Consequentemente, eles são melhor adaptados para a administração in vivo em seres humanos, especialmente quando administração repetida ou de longa duração é necessária.

[00228] Um exemplo da geração de um anticorpo anti-MASP-2 humanizado a partir de um anticorpo monoclonal anti-MASP-2 de murino é aqui provido no Example 6. As técnicas para produzir anticorpos monoclonais humanizados também são descritas, por exemplo, por Jones, P. T., et al., Nature 321: 522, (1986); Carter, P., et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 89: 4285, (1992); Sandhu, J. S., Crit. Rev. Biotech. 12: 437, (1992); Singer, I. I., et al., J. Immun. 150: 2844, (1993); Sudhir (ed.), Antibody Engineering Protocols, Humana Press, Inc., (1995); Kelley, “Engineering Therapeutical Antibodies,” em Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), John Wiley & Sons, Inc., páginas 399-434, (1996); e pela Patente U.S. No. 5.693.762, concedida a Queen, 1997. Além disso, existem entidades comerciais que sintetizarão anticorpos humanizados a partir de regiões específicas de anticorpo de murino, tais como a Protein Design Labs (Mountain View, CA).

ANTICORPOS RECOMBINANTES

[00229] Os anticorpos de MASP-2 também podem ser fabricados usando-se métodos recombinantes. Por exemplo, anticorpos humanos podem ser fabricados usando bibliotecas de expressão da imunoglobulina humana (disponível por exemplo, da Stratagene, Corp., La Jolla, CA) para produzir

137 / 394 fragmentos de anticorpos humanos (VH, VL, Fv, Fd, Fab ou F(ab’)2). Estes fragmentos são depois usados para construir anticorpos humanos integrais usando técnicas similares àquelas para produzir anticorpos quiméricos. ANTICORPOS ANTI-IDIOTÍPICOS

[00230] Uma vez que os anticorpos de MASP-2 são identificados com a atividade inibidora desejada, estes anticorpos podem ser usados para gerar anticorpos anti-idiotípicos que lembram uma porção de MASP-2 usando técnicas que são bem conhecidas no ramo. Ver, por exemplo, Greenspan, N. S., et al., FASEB J. 7: 437, 1993. Por exemplo, anticorpos que se ligam a MASP-2 e competitivamente inibem uma interação da proteína MASP-2 requerida para a ativação de complemento pode ser usada para gerar anti- idiotipos que se parecem com o sítio de ligação de MBL na proteína MASP-2 e portanto liga e neutraliza um ligando de ligação de MASP-2 tal como, por exemplo, MBL.

FRAGMENTOS DE IMUNOGLOBULINA

[00231] Os agentes inibidores de MASP-2 úteis no método da invenção abrangem não apenas moléculas de imunoglobulina intactas mas também os fragmentos bem conhecidos incluindo os fragmentos Fab, Fab’, F(ab)2, F(ab’)2 e Fv, scFv, diacorpos, anticorpos lineares, moléculas de anticorpo de cadeia única e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo.

[00232] É bem conhecido na técnica que apenas uma pequena porção de uma molécula de anticorpo, o parátopo, está envolvido na ligação do anticorpo ao seu epítopo (ver, por exemplo, Clark, W. R., The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons, Inc., NY, 1986). As regiões de pFc’ e Fc do anticorpo são efetores do caminho de complemento clássico mas não estão envolvidos na ligação a antígeno. Um anticorpo a partir do qual a região pFc’ foi enzimaticamente clivada, ou que foi produzida sem a região pFc’, é designado um fragmento F(ab’)2 e retém ambos dos

138 / 394 sítios de ligação a antígeno de um anticorpo intacto. Um fragmento F(ab’)2 isolado é aludido como um fragmento monoclonal bivalente por causa dos seus dois sítios de ligação a antígeno. Similarmente, um anticorpo do qual a região de Fc foi enzimaticamente clivada, ou que foi produzido sem a região Fc, é designado um fragmento Fab, e retém um dos sítios de ligação a antígeno de uma molécula de anticorpo intacta.

[00233] Fragmentos de anticorpo podem ser obtidos pela hidrólise proteolítica, tal como pela digestão com pepsina ou papaína de anticorpos inteiros pelos métodos convencionais. Por exemplo, fragmentos de anticorpo podem ser produzidos pela clivagem enzimática de anticorpos com pepsina para fornecer um fragmento 5S designado F(ab’)2. Este fragmento pode ser clivado ainda usando um agente redutor de tiol para produzir fragmentos monovalentes 3,5S Fab’. Opcionalmente, a reação de clivagem pode ser realizada usando um grupo de bloqueio para os grupos sulfidrila que resultam da clivagem de ligações de dissulfeto. Como uma alternativa, uma clivagem enzimática usando pepsina produz dois fragmentos Fab monovalentes e um fragmento Fc diretamente. Estes métodos são descritos, por exemplo, na Patente U.S. No. 4.331.647 concedida a Goldenberg; Nisonoff, A., et al., Arch. Biochem. Biophys. 89: 230, 1960; Porter, R. R., Biochem. J. 73: 119, 1959; Edelman, et al., em Methods in Enzymology 1: 422, Academic Press, 1967; e por Coligan nas páginas 2.8.1-2.8.10 e 2.10.-2.10.4.

[00234] Em algumas formas de realização, o uso de fragmentos de anticorpo que carecem da região Fc são preferidos para evitar a ativação do caminho de complemento clássico que é iniciado na ligação de Fc ao receptor de Fcγ. Existem vários métodos pelos quais pode-se produzir um MoAb que evita interações com o receptor de Fcγ. Por exemplo, a região Fc de um anticorpo monoclonal pode ser removida quimicamente usando a digestão parcial pelas enzimas proteolíticas (tais como digestão com ficina), generando deste modo, por exemplo, fragmentos de anticorpo que ligam antígeno tais

139 / 394 como fragmentos Fab ou F(ab)2 (Mariani, M., et al., Mol. Immunol. 28: 69- 71, 1991). Alternativamente, o isótipo γ4 de IgG humano, que não liga receptores de Fcγ, podem ser usados durante a construção de um anticorpo humanizado como aqui descrito. Os anticorpos, anticorpos de cadeia única e domínios de ligação a antígeno que carecem do domínio Fc também podem ser engendrados usando técnicas recombinantes aqui descritas.

FRAGMENTOS DE ANTICORPO DE CADEIA ÚNICA

[00235] Alternativamente, pode-se criar moléculas de ligação de cadeia de peptídeo única específicas para MASP-2 em que as regiões Fv de cadeia pesada e leve são conectadas. Os fragmentos de Fv podem ser conectados por um ligador de peptídeo para formar uma proteína de ligação a antígeno (scFv). Estas proteínas de ligação a antígeno de cadeia única são preparadas construindo-se um gene estrutural que compreende sequências de DNA que codificam os domínios VH e VL que são conectados por um oligonucleotídeo. O gene estrutural é inserido em um vetor de expressão, que é subsequentemente introduzido em uma célula hospedeira, tal como E. coli. As células hospedeiras recombinantes sintetizam uma única cadeia de polipeptídeo com um peptídeo ligador que liga os dois domínios V. Os métodos para produzir scFvs são descritos por exemplo, por Whitlow, et al., “Methods: A Companion to Methods in Enzymology” 2: 97, (1991); Bird, et al., Science 242: 423, (1988); Patente U.S. No. 4.946.778, concedida a Ladner; Pack, P., et al., Bio/Technology 11: 1271, (1993).

[00236] Como um exemplo ilustrativo, um scFv específico de MASP-2 pode ser obtido pela exposição dos linfócitos para polipeptídeo de MASP-2 in vitro e seleção de bibliotecas de demonstração de anticorpo em fago ou vetores similares (por exemplo, através do uso de proteína ou peptídeo de MASP-2 imobilizado ou rotulado). Genes que codificam polipeptídeos tendo domínios de ligação de polipeptídeo de MASP-2 potenciais podem ser obtidos pela triagem de bibliotecas de peptídeo aleatórias demonstradas em fago ou

140 / 394 em bactérias tais como E. coli. Estas bibliotecas de demonstração de peptídeo aleatórias podem ser usadas para triar quanto aos peptídeos que interagem com MASP-2. As técnicas para criar e triar tais bibliotecas de demonstração de peptídeo aleatórias são bem conhecidas na técnica (Patente U.S. No.

5.223.409, concedida a Lardner; Patente U.S. No. 4.946.778, concedida a Ladner; Patente U.S. No. 5.403.484, concedida a Lardner; Patente U.S. No.

5.571.698, concedida a Lardner; e Kay et al., Phage Display of Peptides and Proteins Academic Press, Inc., 1996) e bibliotecas de demonstração de peptídeo aleatórias e kits para a triagem de tais bibliotecas estão comercialmente disponíveis, por exemplo da CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, Calif.), Invitrogen Inc. (San Diego, Calif.), New England Biolabs, Inc. (Beverly, Mass.), e Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, N.J.).

[00237] Uma outra forma de um fragmento de anticorpo de MASP-2 útil neste aspecto da invenção é um peptídeo que codifica uma única região determinadora de complementaridade (CDR) que se liga a um epítopo em um antígeno de MASP-2 e inibe a ativação de complemento dependente de MASP-2. Os peptídeos de CDR (“unidades de reconhecimento mínimas”) podem ser obtidos pela construção de genes que codificam a CDR de um anticorpo de interesse. Tais genes são preparados, por exemplo, pelo uso da reação da cadeia da polimerase para sintetizar a região variável do RNA de células que produzem anticorpo (ver, por exemplo, Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2: 106, 1991; Courtenay-Luck, “Genetic Manipulation of Monoclonals Antibodies,” em Monoclonals Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), página 166, Cambridge University Press, 1995; e Ward et al., “Genetic Manipulation and Expression of Antibodies,” em Monoclonals Antibodies: Principles and Applications, Birch et al. (eds.), página 137, Wiley-Liss, Inc., 1995).

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[00238] Os anticorpos de MASP-2 aqui descritos são administrados a um indivíduo em necessidade dos mesmos para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2. Em algumas formas de realização, o agente inibidor de MASP é um anticorpo anti-MASP-2 humano ou humanizado monoclonal com alta afinidade com função efetora reduzida.

INIBIDORES PEPTÍDICOS

[00239] Em algumas modalidades deste aspecto da invenção, o agente inibidor de MASP-2 compreende inibidores peptídicos de MASP-2 isolados, incluindo inibidores peptídicos naturais isolados e inibidores peptídicos sintéticos que inibem a ativação do sistema de complemento dependente de MASP-2. Como aqui usado, o termo “inibidores peptídicos de MASP-2 isolados” se refere aos peptídeos que inibem a ativação de complemento dependente de MASP-2 pela ligação a, competindo com MASP-2 quanto à ligação a, uma outra molécula de reconhecimento (por exemplo, MBL, H- ficolina, M-ficolina ou L-ficolina) no caminho da lectina e/ou diretamente interagindo com MASP-2 para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2 que são substancialmente puros e são essencialmente livres de outras substâncias com as quais eles podem ser encontrados na natureza até um grau prático e apropriado para o seu uso pretendido.

[00240] Os inibidores peptídicos foram usados com êxito in vivo para interferir com as interações de proteína-proteína e sítios catalíticos. Por exemplo, inibidores peptídicos para moléculas de adesão estruturalmente relacionadas com LFA-1 foram recentemente aprovados para uso clínico em coagulopatias (Ohman, E.M., et al., European Heart J. 16: 50-55, 1995). Foi descrito que os peptídeos lineares curtos (<30 aminoácidos) previnem ou interferem com a adesão dependente de integrina (Murayama, O., et al., J. Biochem. 120: 445-51, 1996). Peptídeos mais longos, variando no comprimento de 25 a 200 resíduos de aminoácido, também foram usados com êxito para bloquear a adesão dependente de integrina (Zhang, L., et al., J.

142 / 394 Biol. Chem. 271(47): 29953-57, 1996). No geral, inibidores peptídicos mais longos têm afinidades mais altas e/ou taxas de dissociação mais lentas do que os peptídeos curtos e, portanto, podem ser inibidores mais potentes. Os inibidores peptídicos cíclicos também foram mostrados ser inibidores eficazes de integrinas in vivo para o tratamento de doença inflamatória humana (Jackson, D.Y., et al., J. Med. Chem. 40: 3359-68, 1997). Um método de produzir peptídeos cíclicos envolve a síntese de peptídeos na qual os aminoácidos terminais do peptídeo são cisteínas, permitindo deste modo que o peptídeo exista em uma forma cíclica pela ligação de dissulfeto entre os aminoácidos terminais, que foram mostrados melhorar a afinidade e meia- vida in vivo para o tratamento de neoplasmos hematopoiéticos (por exemplo, Patente U.S. No. 6.649.592, concedida a Larson). INIBIDORES PEPTÍDICOS DE MASP-2 SINTÉTICOS

[00241] Os peptídeos inibidores de MASP-2 úteis nos métodos deste aspecto da invenção são exemplificados pela sequência de aminoácidos que imita as regiões alvos importantes para a função de MASP-2. Os peptídeos inibidores úteis na prática dos métodos da invenção variam no tamanho de cerca de 5 aminoácidos a cerca de 300 aminoácidos. A TABLE 3 provê uma lista de peptídeos inibidores exemplares que podem ser úteis na prática deste aspecto da presente invenção. Um peptídeo inibidor de MASP-2 candidato pode ser testado quanto à capacidade para funcionar como um agente inibidor de MASP-2 em um de diversos ensaios incluindo, por exemplo, um ensaio de clivagem C4 específico de lectina (descrito no Exemplo 2) e um ensaio de deposição de C3b (descrito no Exemplo 2).

[00242] Em algumas modalidades, os peptídeos inibidores de MASP-2 são derivados de polipeptídeos de MASP-2 e são selecionados da proteína de MASP-2 madura de comprimento total (SEQ ID NO: 6) ou de um domínio particular da proteína de MASP-2 tal como, por exemplo, o domínio CUBI (SEQ ID NO: 8), o domínio CUBIEGF (SEQ ID NO: 9), o domínio EGF

143 / 394 (SEQ ID NO: 11) e o domínio da serina protease (SEQ ID NO: 12). Como anteriormente descrito, as regiões CUBEGFCUBII foram mostradas ser requeridas para dimerização e ligação com MBL (Thielens et al., supra). Em particular, a sequência de peptídeo TFRSDYN (SEQ ID NO: 16) no domínio CUBI de MASP-2 foi mostrada estar envolvida na ligação ao MBL em um estudo que identificou uma ser humano portando uma mutação homozigótica em Asp105 para Gly105, resultando na perda de MASP-2 do complexo de MBL (Stengaard-Pedersen, K., et al., New England J. Med. 349: 554-560, 2003).

[00243] Em algumas modalidades, os peptídeos inibidores de MASP-2 são derivados das proteínas lectina que se ligam a MASP-2 e estão envolvidas no caminho de complemento da lectina. Diversas lectinas diferentes foram identificadas que estão envolvidas neste caminho, incluindo a lectina de ligação de manana (MBL), L-ficolina, M-ficolina e H-ficolina. (Ikeda, K., et al., J. Biol. Chem. 262: 7451-7454, 1987; Matsushita, M., et al., J. Exp. Med. 176: 1497-2284, 2000; Matsushita, M., et al., J. Immunol. 168: 3502-3506, 2002). Estas lectinas estão presentes no soro como oligômeros de subunidades homotriméricas, cada uma tendo fibras tipo colágeno de terminal N com domínios de reconhecimento de carboidrato. Estas lectinas diferentes foram mostradas ligar à MASP-2 e o complexo de lectina/MASP-2 ativa complemento através da clivagem das proteínas C4 e C2. H-ficolina tem uma região de terminal amino de 24 aminoácidos, um domínio tipo colágeno com 11 repetições de Gly-Xaa-Yaa, um domínio gargalo de 12 aminoácidos e um domínio tipo fibrinogênio de 207 aminoácidos (Matsushita, M., et al., J. Immunol. 168: 3502-3506, 2002). A H-ficolina se liga à GlcNAc e aglutina eritrócitos humanos revestidos com LPS derivado de S. typhimurium, S. minnesota e. coli. A H-ficolina foi mostrada estar associada com MASP-2 e MAp19 e ativa o caminho da lectina. Id. A L-ficolina/P35 também se liga à GlcNAc e foi mostrada estar associada com MASP-2 e MAp19 no soro

144 / 394 humano e este complexo foi mostrado ativar o caminho da lectina (Matsushita, M., et al., J. Immunol. 164: 2281, 2000). Portanto, os peptídeos inibidores de MASP-2 úteis na presente invenção podem compreendem uma região de pelo menos 5 aminoácidos selecionada da proteína MBL (SEQ ID NO: 21), a proteína H-ficolina (Número de acesso no Genbank NM_173452), a proteína M-ficolina (Número de acesso no Genbank O00602) e a proteína L-ficolina (Número de acesso no Genbank NM_015838).

[00244] Mais especificamente, os cientistas identificaram o sítio de ligação de MASP-2 na MBL para estar dentro dos 12 tripletos Gly-X-Y “GKD GRD GTK GEK GEP GQG LRG LQG POG KLG POG NOG PSG SOG PKG QKG DOG KS” (SEQ ID NO: 26) que residem entre a dobradiça e o gargalo na porção de terminal C do domínio tipo colágeno de MBP (Wallis, R., et al., J. Biol. Chem. 279: 14065, 2004). Esta região do sítio de ligação de MASP-2 também é altamente conservada na H-ficolina humana e L-ficolina humana. Um sítio de ligação de consenso foi descrito que está presente em todas as três proteínas de lectina compreendendo a sequência de aminoácidos “OGK-X-GP” (SEQ ID NO: 22) onde a letra “O” representa hidroxiprolina e a letra “X” é um resíduo hidrofóbico (Wallis et al., 2004, supra). Portanto, em algumas modalidades, os peptídeos inibidores de MASP-2 úteis neste aspecto da invenção são pelo menos 6 aminoácidos no comprimento e compreendem a SEQ ID NO: 22. Os peptídeos derivados de MBL que incluem a sequência de aminoácidos “GLR GLQ GPO GKL GPO G” (SEQ ID NO: 24) foram mostradas ligar MASP-2 in vitro (Wallis, et al., 2004, supra). Para realçar a ligação à MASP-2, os peptídeos podem ser sintetizados que são flanqueados por dois tripletos GPO em cada extremidade (“GPO GPO GLR GLQ GPO GKL GPO GGP OGP O” SEQ ID NO: 25) para realçar a formação das hélices triplas como encontrado na proteína MBL nativa (como adicionalmente descrito em Wallis, R., et al., J. Biol. Chem. 279: 14065, 2004).

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[00245] Os peptídeos inibidores de MASP-2 também podem ser derivados de H-ficolina humana que incluem a sequência “GAO GSO GEK GAO GPQ GPO GPO GKM GPK GEO GDO” (SEQ ID NO: 27) da região de ligação de MASP-2 de consenso na H-ficolina. Também são incluídos peptídeos derivados de L-ficolina humana que incluem a sequência “GCO

GLO GAO GDK GEA GTN GKR GER GPO GPO GKA GPO GPN GAO GEO” (SEQ ID NO: 28) da região de ligação de MASP-2 de consenso na L- ficolina.

[00246] Os peptídeos inibidores de MASP-2 também podem ser derivados do sítio de clivagem de C4 tais como “LQRALEILPNRVTIKANRPFLVFI” (SEQ ID NO: 29) que é o sítio de clivagem de C4 ligado à porção de terminal C da antitrombina III (Glover, G.I., et al., Mol. Immunol. 25: 1261 (1988)). TABELA 3: PEPTÍDEOS INIBIDORES DE MASP-2 EXEMPLARES SEQ ID NO Fonte SEQ ID NO: 6 Proteína de MASP-2 humana SEQ ID NO: 8 Domínio CUBI de MASP-2 (aa 1-121 da SEQ ID NO: 6) SEQ ID NO: 9 domínios CUBIEGF de MASP-2 (aa 1-166 da SEQ ID NO: 6) SEQ ID NO: 10 domínios CUBIEGFCUBII de MASP-2 (aa 1-293 da SEQ ID NO: 6) SEQ ID NO: 11 Domínio EGF de MASP-2 (aa 122-166) SEQ ID NO: 12 Domínio da serina-protease de MASP-2 (aa 429-671) SEQ ID NO: 16 Região de ligação de MBL em MASP-2 SEQ ID NO: 3 MAp19 Humana SEQ ID NO: 21 Proteína MBL humana SEQ ID NO: 22 Sítio de ligação de consenso de peptídeo sintético de MBL Humana e OGK-X-GP, Ficolinas Humanas Onde “O” = hidroxiprolina e “X” é um resíduo de aminoácido hidrofóbico SEQ ID NO: 23 Sítio de ligação ao núcleo de MBL humana

OGKLG SEQ ID NO: 24 tripletos de MBP humana 6-10- demonstraram ligação à MASP-2

GLR GLQ GPO GKL GPO G SEQ ID NO: 25 Tripletos de MBP humana com GPO adicionado para realçar a formação GPOGPOGLRGLQGPOGKLGP das hélices triplas

OGGPOGPO SEQ ID NO: 26 Tripletos de MBP humana 1-17

GKDGRDGTKGEKGEPGQGL RGLQGPOGKLGPOGNOGPSG

SOGPKGQKGDOGKS SEQ ID NO: 27 H-Ficolina humana (Hataka)

GAOGSOGEKGAOGPQGPOG POGKMGPKGEOGDO

146 / 394 SEQ ID NO Fonte SEQ ID NO: 28 L-Ficolina humana P35

GCOGLOGAOGDKGEAGTNG KRGERGPOGPOGKAGPOGP

NGAOGEO SEQ ID NO: 29 Sítio de clivagem de C4 humana

LQRALEILPNRVTIKANRPFL

VFI Nota: A letra “O” representa hidroxiprolina. A letra “X” é um resíduo hidrofóbico.

[00247] Os peptídeos derivados do sítio de clivagem C4 assim como outros peptídeos que inibem o sítio da serina protease de MASP-2 podem ser quimicamente modificados de modo que sejam inibidores de protease irreversíveis. Por exemplo, as modificações apropriadas podem incluir, mas não são necessariamente limitadas a, halometil cetonas (Br, Cl, I, F) no terminal C, Asp ou Glu ou anexados às cadeias laterais funcionais; os grupos haloacetila (ou outra α-haloacetila) nos grupos amino ou outras cadeias laterais funcionais; grupos contendo epóxido ou imina nos terminais amino ou carbóxi ou nas cadeias laterais funcionais; ou ésteres de imidato nos terminais amino ou carbóxi ou nas cadeias laterais funcionais. Tais modificações proporcionariam a vantagem de permanentemente inibir a enzima pela ligação covalente do peptídeo. Isto resultaria em doses eficazes mais baixas e/ou a necessidade quanto à administração menos frequente do inibidor peptídico.

[00248] Além dos peptídeos inibidores descritos acima, os peptídeos inibidores de MASP-2 úteis no método da invenção incluem peptídeos contendo a região CDR3 de ligação de MASP-2 de MoAb anti-MASP-2 obtida como aqui descrito. A sequência das regiões de CDR para o uso na sintetização dos peptídeos pode ser determinada pelos métodos conhecidos na técnica. A região variável de cadeia pesada é um peptídeo que geralmente varia de 100 a 150 aminoácidos no comprimento. A região variável de cadeia leve é um peptídeo que geralmente varia de 80 a 130 aminoácidos no comprimento. As sequências de CDR dentro da região variável de cadeias pesada e leve incluem aproximadamente apenas 3 a 25 sequências de aminoácido que podem ser facilmente sequenciadas por uma pessoa de habilidade comum na técnica.

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[00249] Aqueles versados na técnica reconhecerão que variações substancialmente homólogas dos peptídeos inibidores de MASP-2 descritos acima também exibirão atividade inibidora de MASP-2. As variações exemplares incluem, mas não são necessariamente limitadas aos peptídeos tendo inserções, deleções, substituições e/ou aminoácidos adicionais nas porções de terminal carbóxi ou de terminal amino dos peptídeos objetos e misturas dos mesmos. Portanto, aqueles peptídeos homólogos tendo atividade inibidora de MASP-2 são consideradas ser úteis nos métodos desta invenção. Os peptídeos descritos também podem incluir motivos de duplicação e outras modificações com substituições conservativas. As variantes conservativas são aqui descritas em outro lugar e incluem a troca de um aminoácido no lugar de um outro de carga, tamanho ou hidrofobicidade iguais e similares.

[00250] Os peptídeos inibidores de MASP-2 podem ser modificados para aumentar a solubilidade e/ou para maximizar a carga positiva ou negativa de modo a mais intimamente parecer o segmento na proteína intacta. O derivado pode ter ou não a estrutura de aminoácido primária exata de um peptídeo aqui divulgado contanto que a funcionalidade derivada retenha a propriedade desejada de inibição de MASP-2. As modificações podem incluir substituição de aminoácido com um dos vinte aminoácidos habitualmente conhecidos ou com um outro aminoácido, com um aminoácido derivatizado ou substituído com características auxiliares desejáveis, tais como resistência à degradação enzimática ou com um D-aminoácido ou substituição com uma outra molécula ou composto, tal como um carboidrato, que imita a natural conformação e função do aminoácido, aminoácidos ou peptídeo; deleção de aminoácido; inserção de aminoácido com um dos vinte aminoácidos habitualmente conhecidos ou com um outro aminoácido, com um aminoácido derivatizado ou substituído com características auxiliares desejadas, tais como resistência à degradação enzimática ou com um D-aminoácido ou substituição com uma outra molécula ou composto, tal como um carboidrato, que imite a

148 / 394 conformação e função naturais do aminoácido, aminoácidos ou peptídeo; ou substituição com uma outra molécula ou composto, tal como um carboidrato ou monômero de ácido nucleico, que imite a conformação natural, distribuição de carga e função do peptídeo precursor. Os peptídeos também podem ser modificados pela acetilação ou amidação.

[00251] A síntese de peptídeos inibidores derivados pode contar com técnicas conhecidas de biossíntese de peptídeo, biossíntese de carboidrato e similares. Como um ponto de partida, o técnico pode contar com um programa de computador adequado para determinar a conformação de um peptídeo de interesse. Uma vez que a conformação do peptídeo aqui divulgado é conhecida, então o técnico pode determinar em uma maneira de concepção racional quais tipos de substituições podem ser feitos em um ou mais sítios moldar um derivado que retenha a conformação e distribuição de carga básicas do peptídeo precursor mas que pode possuir características que não estejam presentes ou sejam realçadas em relação àquelas encontradas no peptídeo precursor. Uma vez que as moléculas derivadas candidatas são identificadas, os derivados podem ser testados para determinar se eles funcionam como agentes inibidores de MASP-2 usando os ensaios aqui descritos. TRIAGEM QUANTO AOS PEPTÍDEOS INIBIDORES DE MASP-2

[00252] Também pode-se usar a modelagem molecular e projeto molecular racional para gerar e triar quanto a peptídeos que imitam as estruturas moleculares das regiões de ligação chave de MASP-2 e inibem as atividades de complemento de MASP-2. As estruturas moleculares usadas para a modelagem incluem as regiões de CDR de anticorpos monoclonais anti-MASP-2, assim como as regiões alvos conhecidas serem importantes para a função de MASP-2 incluindo a região requerida para a dimerização, a região envolvida na ligação ao MBL e o sítio ativo da serina protease como anteriormente descrito. Os métodos para identificar peptídeos que se ligam a

149 / 394 um alvo particular são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, a impressão molecular pode ser usada para a construção de novo de estruturas macromoleculares tais como peptídeos que se ligam a uma molécula particular. ver, por exemplo, Shea, K.J., “Molecular Imprinting of Synthetic Network Polymers: The De Novo synthesis of Macromolecular Binding and Catalytic Sties,” TRIP 2(5) 1994.

[00253] Como um exemplo ilustrativo, um método de preparar imitações de peptídeos de ligação de MASP-2 é como segue. Os monômeros funcionais de um peptídeo de ligação MASP-2 conhecido ou a região de ligação de um anticorpo anti-MASP-2 que exibe a inibição de MASP-2 (o padrão) são polimerizados. O padrão é depois removido, seguido pela polimerização de uma segunda classe de monômeros no vazio deixado pelo padrão, para prover uma nova molécula que exiba uma ou mais propriedades desejadas que são similares ao padrão. Além da preparar peptídeos desta maneira, outras moléculas de ligação de MASP-2 que são agentes inibidores de MASP-2 tais como polissacarídeos, nucleosídeos, fármacos, nucleoproteínas, lipoproteínas, carboidratos, glicoproteínas, esteroide, lipídeos e outros materiais biologicamente ativos também podem ser preparados. Este método é útil para planejar uma ampla variedade de imitações biológicas que são mais estáveis do que as suas contrapartes naturais porque elas são tipicamente preparadas pela polimerização de radical livre de monômeros funcionais, resultando em um composto com uma cadeia principal não biodegradável.

SÍNTESE DE PEPTÍDEO

[00254] Os peptídeos inibidores de MASP-2 podem ser preparados usando técnicas bem conhecidas na técnica, tais como a técnica sintética de fase sólida inicialmente descrita por Merrifield, em J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149-2154, 1963. A síntese automatizada pode ser obtida, por exemplo, usando o Sintetizador de Peptídeo 431A da Applied Biosystems (Foster City,

150 / 394 Calif.) de acordo com as instruções providas pelo fabricante. Outras técnicas podem ser encontradas, por exemplo, em Bodanszky, M., et al., Peptide Synthesis, segunda edição, John Wiley & Sons, 1976, assim como em outros trabalhos de referência conhecidos por aqueles habilitados na técnica.

[00255] Os peptídeos também podem ser preparados usando técnicas da engenharia genética padrão conhecidas por aqueles versados na técnica. Por exemplo, o peptídeo pode ser enzimaticamente produzido pela inserção de ácido nucleico codificando o peptídeo dentro de um vetor de expressão, expressando o DNA e traduzindo o DNA no peptídeo na presença dos aminoácidos requeridos. O peptídeo é depois purificado usando técnicas cromatográficas ou eletroforéticas ou por meio de uma proteína carreadora que pode ser fundida ao peptídeo e subsequentemente dele clivada, pela inserção dentro do vetor de expressão na fase com a sequência codificando o peptídeo uma sequência de ácido nucleico codificando a proteína carreadora. A fusão de proteína-peptídeo pode ser isolada usando técnicas cromatográficas, eletroforéticas ou imunológicas (tais como ligação a uma resina por intermédio de um anticorpo para a proteína carreadora). O peptídeo pode ser clivado usando metodologia química ou enzimaticamente, como, por exemplo, pelas hidrolases.

[00256] Os peptídeos inibidores de MASP-2 que são úteis no método da invenção também podem ser produzidos em células hospedeiras recombinantes seguindo técnicas convencionais. Para expressar uma sequência codificadora de peptídeo inibidor de MASP-2, uma molécula de ácido nucleico codificando o peptídeo deve ser operavelmente ligada às sequências reguladoras que controlam a expressão transcricional em um vetor de expressão e depois introduzidas dentro de uma célula hospedeira. Além das sequências reguladoras transcricionais, tais como promotores e realçadores, vetores de expressão podem incluir sequências reguladoras traducionais e um gene marcador, que são adequados para a seleção de células que carregam o

151 / 394 vetor de expressão.

[00257] As moléculas de ácido nucleico que codificam um peptídeo inibidor de MASP-2 podem ser sintetizadas com “máquinas de gene” usando protocolos tais como o método da fosforamidita. Se quimicamente sintetizado o DNA de filamento duplo é requerido para uma aplicação tal como a síntese de um gene ou um fragmento de gene, depois cada filamento complementar é fabricado separadamente. A produção de genes curtos (60 a 80 pares de base) é tecnicamente direta e pode ser realizada pela sintetização dos filamentos complementares e depois recozendo-os. Para a produção de genes mais longos, genes sintéticos (de filamento duplo) são montados na forma modular a partir de fragmentos de filamento único que são de 20 a 100 nucleotídeos no comprimento. Para as revisões sobre a síntese de polinucleotídeo, ver, por exemplo, Glick e Pasternak, “Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA”, ASM Press, 1994; Itakura, K., et al., Annu. Rev. Biochem. 53: 323, 1984; e Climie, S., et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 87: 633, 1990.

INIBIDORES DE MOLÉCULA PEQUENA

[00258] Em algumas modalidades, os agentes inibidores de MASP-2 são inibidores de molécula pequena incluindo substâncias naturais e sintéticas que têm um peso molecular baixo, tais como por exemplo, peptídeos, peptidomiméticos e inibidores não peptídicos (incluindo oligonucleotídeos e compostos orgânicos). Os inibidores de molécula pequena de MASP-2 podem ser gerados com base na estrutura molecular das regiões variáveis dos anticorpos anti-MASP-2.

[00259] Os inibidores de molécula pequena também podem ser projetados e gerados com base na estrutura cristalina de MASP-2 usando projeto computacional de fármaco (Kuntz I.D., et al., Science 257: 1078, 1992). A estrutura cristalina de MASP-2 de rato foi descrita (Feinberg, H., et al., EMBO J. 22: 2348-2359, 2003). Usando o método descrito por Kuntz et

152 / 394 al., as coordenadas da estrutura cristalina de MASP-2 são usadas como uma entrada para um programa de computador tal como DOCK, que produz uma lista de estruturas de molécula pequena que são esperadas ligar à MASP-2. O uso de tais programas de computador é bem conhecido por uma pessoa versada na técnica. Por exemplo, a estrutura cristalina do inibidor de protease do HIV-1 foi usada para identificar ligantes não peptídicos únicos que são inibidores de protease do HIV-1 pela avaliação do ajuste dos compostos encontrados na Cambridge Crystallographic Database com o sítio de ligação da enzima usando o programa DOCK (Kuntz, I.D., et al., J. Mol. Biol. 161:269-288, 1982; DesJarlais, R.L., et al., PNAS 87: 6644-6648, 1990).

[00260] A lista de estruturas de molécula pequena que são identificadas por um método computacional como inibidores de MASP-2 potenciais são triadas usando um ensaio de ligação de MASP-2 tal como descrito no Exemplo 10. As moléculas pequenas que são verificadas ligar à MASP-2 são depois ensaiadas em um ensaio funcional tal como descrito no Exemplo 2 para determinar se elas inibem a ativação de complemento dependente de MASP-2. RECEPTORES SOLÚVEIS DE MASP-2

[00261] Acredita-se que outros agentes inibidores de MASP-2 adequados incluam receptores solúveis de MASP-2, que podem ser produzidos usando técnicas conhecidas por aqueles de habilidade comum na técnica. INIBIDORES DE EXPRESSÃO DE MASP-2

[00262] Em uma outra modalidade deste aspecto da invenção, o agente inibidor de MASP-2 é um inibidor da expressão de MASP-2 capaz de inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2. Na prática deste aspecto da invenção, os inibidores da expressão de MASP-2 representativos incluem moléculas de ácido nucleico de antissentido de MASP-2 (tais como mRNA antissentido, DNA antissentido ou oligonucleotídeos antissentido), ribozimas

153 / 394 de MASP-2 e moléculas de RNAi de MASP-2.

[00263] As moléculas de RNA e DNA antissentido atuam para bloquear diretamente a tradução do mRNA de MASP-2 pela hibridização do mRNA de MASP-2 e impedir a tradução da proteína de MASP-2. Uma molécula de ácido nucleico antissentido pode ser construída em vários modos diferentes contanto que seja capaz de interferir com a expressão de MASP-2. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico antissentido pode ser construída pela inversão da região codificadora (ou uma porção da mesma) do cDNA de MASP-2 (SEQ ID NO: 4) em relação à sua orientação normal para a transcrição para permitir a transcrição do seu complemento.

[00264] A molécula de ácido nucleico de antissentido é usualmente substancialmente idêntica a pelo menos uma porção do gene ou genes alvos. O ácido nucleico, entretanto, não precisa ser perfeitamente idêntico para inibir a expressão. Geralmente, homologia mais alta pode ser usada para compensar quanto ao uso de uma molécula de ácido nucleico de antissentido mais curta. A identidade percentual mínima é tipicamente maior do que cerca de 65%, mas uma identidade percentual mais alta pode exercer uma repressão mais eficaz da expressão da sequência endógena. Identidade percentual substancialmente maior de mais do que cerca de 80% é tipicamente preferida, embora cerca de 95% para identidade absoluta seja tipicamente mais preferida.

[00265] A molécula de ácido nucleico antissentido não precisa ter o mesmo padrão de íntron ou éxon como o gene alvo e segmentos não codificadores do gene alvo podem ser igualmente eficazes na obtenção da supressão antissentido de expressão de gene alvo como segmentos codificadores. Uma sequência de DNA de pelo menos cerca de 8 ou mais nucleotídeos pode ser usada como a molécula de ácido nucleico antissentido, embora uma sequência mais longa seja preferível. Na presente invenção, um exemplo representativo de um agente inibidor útil de MASP-2 é uma

154 / 394 molécula de ácido nucleico de antissentido de MASP-2 que é pelo menos noventa por cento idêntico ao complemento do cDNA de MASP-2 consistindo da sequência de ácido nucleico apresentada na SEQ ID NO: 4. A sequência de ácido nucleico apresentada na SEQ ID NO: 4 codifica a proteína de MASP-2 consistindo da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 5.

[00266] O alvejamento de oligonucleotídeos de antissentido para ligar mRNA de MASP-2 é um outro mecanismo que pode ser usado para reduzir o nível de síntese de proteína de MASP-2. Por exemplo, a síntese de poligalacturonase e o receptor de acetilcolina muscarínico tipo 2 é inibido pelos oligonucleotídeos antissentido direcionados às suas respectivas sequências de mRNA (Patente U.S. No. 5.739.119, concedida a Cheng e Patente U.S. No. 5.759.829, concedida a Shewmaker). Além disso, os exemplos de inibição antissentido foram demonstrados com a proteína nuclear ciclina, o gene de resistência a fármaco múltiplo (MDG1), ICAM-1, E- selectina, STK-1, receptor GABAA estriatal e EGF humano (ver, por exemplo, Patente U.S. No. 5.801.154, concedido a Baracchini; Patente U.S. No. 5.789.573, concedida a Baker; Patente U.S. No. 5.718.709, concedido a Considine; e Patente U.S. No. 5.610.288, concedida a Reubenstein).

[00267] Um sistema foi descrito que permite uma pessoa de habilidade comum determinar quais oligonucleotídeos são úteis na invenção, que envolve sondar quanto aos sítios adequados no mRNA alvo usando a clivagem de Rnase H como um indicador para a acessibilidade de sequências dentro dos transcritos. Scherr, M., et al., Nucleic Acids Res. 26: 5079-5085, 1998; Lloyd, et al., Nucleic Acids Res. 29: 3665-3673, 2001. Uma mistura de oligonucleotídeos antissentido que sejam complementares a certas regiões do transcrito de MASP-2 é adicionada aos extratos de célula expressando MASP- 2, tal como hepatócitos e hibridizadas de modo a criar um sítio vulnerável à RNAseH. Este método pode ser combinado com a seleção de sequência

155 / 394 auxiliada por computador que pode predizer a seleção de sequência ótima para composições de antissentido com base na sua capacidade relativa para formar dímeros, grampos de cabelo ou outras estruturas secundárias que reduziriam ou impediriam a ligação específica ao mRNA alvo em uma célula hospedeira.

Esta análise de estrutura secundária e considerações de seleção de sítio alvo podem ser realizadas usando o software de análise de iniciador OLIGO (Rychlik, I., 1997) e o software de algoritmo BLASTN 2.0.5 (Altschul, S.F., et al., Nucl.

Acids Res. 25: 3389-3402, 1997). Os compostos de antissentido direcionados para a sequência alvo preferivelmente compreendem de cerca de 8 a cerca de 50 nucleotídeos no comprimento.

Os oligonucleotídeos de antissentido compreendendo de cerca de 9 a cerca de 35 ou mais nucleotídeos são particularmente preferidos.

Os inventores consideram todas as composições de oligonucleotídeo na faixa de 9 a 35 nucleotídeos (isto é, aqueles de 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 ou 35 ou mais bases no comprimento) são altamente preferidos para a prática de métodos com base em oligonucleotídeo de antissentido da invenção.

As regiões alvos altamente preferidos do mRNA de MASP-2 são aqueles que estão no códon de início de tradução AUG ou próximo a ele e aquelas sequências que são substancialmente complementares às regiões 5’ do mRNA, por exemplo, entre as regiões –10 e +10 da sequência de nucleotídeo do gene MASP-2 (SEQ ID NO: 4). Os inibidores de expressão de MASP-2 exemplares são providos na TABELA 4. TABELA 4: INIBIDORES DE EXPRESSÃO EXEMPLARES DE MASP-2 SEQ ID NO: 30 (nucleotídeos 22-680 da SEQ ID Sequência de ácido nucleico do cDNA de MASP-2 NO: 4) (SEQ ID NO: 4) codificando CUBIEGF SEQ ID NO: 31 Nucleotídeos 12-45 da SEQ ID NO: 4 incluindo o sítio 5’CGGGCACACCATGAGGCTGCTGACCCTCC de início de tradução de MASP-2 (sentido) TGGGC3 SEQ ID NO: 32 Nucleotídeos 361-396 da SEQ ID NO: 4 codificando 5’GACATTACCTTCCGCTCCGACTCCAACGA uma região compreendendo o sítio de ligação de MBL GAAG3’ de MASP-2 (sentido)

156 / 394 SEQ ID NO: 33 Nucleotídeos 610-642 da SEQ ID NO: 4 codificando 5’AGCAGCCCTGAATACCCACGGCCGTATCC uma região compreendendo o domínio CUBII CAAA3’

[00268] Como observado acima, o termo “oligonucleotídeo” como aqui usado se refere a um oligômero ou polímero de ácido ribonucleico (RNA) ou ácido desoxirribonucleico (DNA) ou imitações dos mesmos. Este termo também abrange aqueles composto de oligonucleobases de nucleotídeos, açúcares e ligações internucleosídicas covalentes (cadeia principal) que ocorrem naturalmente assim como oligonucleotídeos tendo modificações que não ocorrem naturalmente. Estas modificações permitem que se introduza certas propriedades desejáveis que não são oferecidas através dos oligonucleotídeos que ocorrem naturalmente, tais como propriedades tóxicas reduzidas, estabilidade aumentada contra degradação pela nuclease e captação celular realçada. Em modalidades ilustrativas, os compostos de antissentido da invenção diferem do DNA nativo pela modificação da cadeia principal de fosfodiéster para prolongar a vida do oligonucleotídeo de antissentido no qual os substituintes de fosfato são substituídos pelos fosforotioatos. Do mesmo modo, uma ou ambas as extremidades do oligonucleotídeo podem ser substituídas por um ou mais derivados de acridina que intercalam entre pares de base adjacentes dentro de um filamento de ácido nucleico.

[00269] Uma outra alternativa para antissentido é o uso da “interferência de RNA” (RNAi). Os RNAs de filamento duplo (dsRNAs) podem provocar o silenciamento do gene em mamíferos in vivo. A função natural do RNAi e a cossupressão parecem ser a proteção do genoma contra a invasão pelos elementos genéticos móveis tais como retrotransposons e vírus que produzem RNA ou dsRNA aberrantes na célula hospedeira quando eles se tornam ativos (ver, por exemplo, Jensen, J., et al., Nat. Genet. 21:209-12, 1999). A molécula de RNA de filamento duplo pode ser preparada sintetizando-se dois filamentos de RNA capazes de formar uma molécula de RNA de filamento duplo, cada uma tendo um comprimento de cerca de 19 a

157 / 394 25 (por exemplo, 19 a 23 nucleotídeos). Por exemplo, uma molécula de dsRNA útil nos métodos da invenção pode compreender o RNA correspondendo a uma sequência e o seu complemento listado na TABELA 4. Preferivelmente, pelo menos um filamento de RNA tem uma projeção 3’ de 1 a 5 nucleotídeos. Os filamentos de RNA sintetizados são combinados sob condições que formam uma molécula de filamento duplo. A sequência de RNA pode compreender pelo menos uma porção de 8 nucleotídeos da SEQ ID NO: 4 com um comprimento total de 25 nucleotídeos ou menos. O projeto das sequências de siRNA para um dado alvo está dentro da habilidade comum de uma pessoa na técnica. Serviços comerciais estão disponíveis que projetam sequências de siRNA e garantem pelo menos 70% de silenciamento de expressão (Qiagen, Valencia, Calif).

[00270] O dsRNA pode ser administrado como uma composição farmacêutica e realizado pelos métodos conhecidos, em que um ácido nucleico é introduzido dentro de uma célula alvo desejada. Os métodos de transferência de gene habitualmente usados incluem fosfato de cálcio, DEAE- dextrano, eletroporação, microinjeção e métodos virais. Tais métodos são divulgados em Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 1993.

[00271] Ribozimas também podem ser utilizadas para diminuir a quantidade e/ou atividade biológica de MASP-2, tais como ribozimas que alvejam o mRNA de MASP-2. As ribozimas são moléculas catalíticas de RNA que podem clivar as moléculas de ácido nucleico tendo uma sequência que seja completamente ou parcialmente homóloga à sequência da ribozima. É possível projetar transgenes de ribozima que codifiquem as ribozimas de RNA que especificamente formem par com um RNA alvo e clivem a cadeia principal de fosfodiéster em um local específico, inativando funcionalmente deste modo o RNA alvo. Na realização desta clivagem, a ribozima não é por si só alterada e é assim capaz de reciclar e clivar outras moléculas. A inclusão

158 / 394 de sequências de ribozima dentro dos RNAs de antissentido confere atividade de clivagem de RNA a elas, aumentando por meio disso a atividade das construções antissentido.

[00272] As ribozimas úteis na prática da invenção tipicamente compreendem uma região hibridizadora de pelo menos cerca de nove nucleotídeos, que é complementar na sequência de nucleotídeo a pelo menos parte do mRNA de MASP-2 alvo e uma região catalítica que é adaptada para clivar o mRNA de MASP-2 alvo (ver no geral, EPA No. 0 321 201; WO88/04300; Haseloff, J., et al., Nature 334: 585-591, 1988; Fedor, M.J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1668-1672, 1990; Cech, T.R., et al., Ann. Rev. Biochem. 55: 599-629, 1986).

[00273] As ribozimas podem ser diretamente alvejadas às células na forma de oligonucleotídeos de RNA incorporando as sequências de ribozima ou introduzidas dentro da célula como um vetor de expressão codificando o RNA ribozímico desejado. As ribozimas podem ser usadas e aplicadas da mesma maneira como descrito para os polinucleotídeos antissentido.

[00274] As moléculas de RNA e DNA, ribozimas e RNAi antissentido úteis nos métodos da invenção podem ser preparadas por qualquer método conhecido na técnica para a síntese de moléculas de DNA e RNA. Estas incluem técnicas para sintetizar quimicamente oligodesoxirribonucleotídeos e oligorribonucleotídeos bem conhecidos na técnica, tais como por exemplo a síntese química de fosforamidita de fase sólida. Alternativamente, as moléculas de RNA podem ser geradas pela transcrição in vitro e in vivo de sequências de DNA codificando a molécula de RNA antissentido. Tais sequências de DNA podem ser incorporadas em uma ampla variedade de vetores que incorporam promotores da RNA polimerase adequados tais como os promotores da polimerase T7 ou SP6. Alternativamente, as construções de cDNA de antissentido que sintetizam RNA antissentido constitutivamente ou indutivelmente, dependendo do promotor usado, podem ser introduzidas

159 / 394 estavelmente dentro de linhagens de célula.

[00275] Várias modificações bem conhecidas das moléculas de DNA podem ser introduzidas como um meio de aumentar a estabilidade e meia- vida. As modificações úteis incluem, mas não são limitadas à adição de sequências flanqueadoras de ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos às extremidades 5’ e/ou 3’ da molécula ou o uso de fosforotioato ou 2’ O-metil ao invés das ligações de fosfodiesterase dentro da cadeia principal de oligodesoxirribonucleotídeo. VI. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E MÉTODOS DE LIBERAÇÃO Dosagem

[00276] Em um outro aspecto, a invenção provê composições para inibir os efeitos adversos da ativação de complemento dependente de MASP- 2 em um sujeito sofrendo de uma doença ou condição como aqui divulgadas, compreendendo administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente inibidor de MASP-2 e um carreador farmaceuticamente aceitável. Os agentes inibidores de MASP-2 podem ser administrados a um sujeito em necessidade do mesmo, em doses terapeuticamente eficazes para tratar ou melhorar condições associadas com a ativação de complemento dependente de MASP-2. Uma dose terapeuticamente eficaz se refere à quantidade do agente inibidor de MASP-2 suficiente para resultar na melhora de sintomas associados com a doença ou condição.

[00277] A toxicidade e eficácia terapêutica de agentes inibidores de MASP-2 podem ser determinadas pelos procedimentos farmacêuticos padrão utilizando animais modelos experimentais, tais como o modelo de camundongo de MASP-2 -/- expressando o transgene de MASP-2 humana descrito no Exemplo 1. Usando tais modelos de animal, o NOAEL (nenhum nível de efeito adverso observado) e o MED (a dose minimamente eficaz) podem ser determinados usando métodos padrão. A razão de dose entre os

160 / 394 efeitos de NOAEL e MED é a razão terapêutica, que é expressa como a razão NOAEL/MED. agentes inibidores de MASP-2 que exibem razões ou índices terapêuticos grandes são mais preferidos. Os dados obtidos a partir dos ensaios de cultura de célula e estudos com animal podem ser usados na formulação de uma faixa de dosagens para o uso em seres humanos. A dosagem do agente inibidor de MASP-2 preferivelmente reside dentro de uma faixa de concentrações circulantes que incluem o MED com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro desta faixa dependendo da forma de dosagem utilizada e da via de administração utilizada.

[00278] Para qualquer formulação de composto, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada usando modelos de animal. Por exemplo, uma dose pode ser formulada em um modelo animal para obter uma faixa de concentração plasmática circulante que inclua o MED. Os níveis quantitativos do agente inibidor de MASP-2 no plasma também podem ser medidos, por exemplo, pela cromatografia líquida de alto desempenho.

[00279] Além dos estudos de toxicidade, a dosagem eficaz também pode ser estimada com base na quantidade de proteína de MASP-2 presente em um sujeito vivo e a afinidade de ligação do agente inibidor de MASP-2. Foi mostrado que os níveis de MASP-2 em sujeitos humanos normais está presente no soro em níveis baixos na faixa de 500 ng/ml e níveis de MASP-2 em um sujeito particular podem ser determinados usando um ensaio quantitativo para MASP-2 descrito em Moller-Kristensen M., et al., J. Immunol. Methods 282: 159-167, 2003.

[00280] Geralmente, a dosagem de composições administradas compreendendo agentes inibidores de MASP-2 varia dependendo de fatores tais como a idade do sujeito, peso, altura, sexo, condição médica geral e histórico médico anterior. Como uma ilustração, agentes inibidores de MASP- 2, tais como anticorpos anti-MASP-2, podem ser administrados em faixas de dosagem de cerca de 0,010 a 10,0 mg/kg, preferivelmente 0,010 a 1,0 mg/kg,

161 / 394 mais preferivelmente de 0,010 a 0,1 mg/kg de peso corporal do sujeito. Em algumas modalidades a composição compreende uma combinação de anticorpos anti-MASP-2 e os peptídeos inibidores de MASP-2.

[00281] A eficácia terapêutica das composições inibidoras de MASP-2 e métodos da presente invenção em um dado sujeito e as dosagens apropriadas, podem ser determinadas de acordo com ensaios de complemento bem conhecidos por aqueles versados na técnica. O complemento gera numerosos produtos específicos. Durante a última década, ensaios sensíveis e específicos foram desenvolvidos e estão disponíveis comercialmente para a maioria destes produtos de ativação, incluindo os fragmentos de ativação pequenos C3a, C4a e C5a e os fragmentos de ativação grandes iC3b, C4d, Bb e sC5b-9. A maioria destes ensaios utiliza anticorpos monoclonais que reagem com novos antígenos (neoantígenos) expostos sobre o fragmento, mas não nas proteínas nativas a partir das quais eles são formados, tornando estes ensaios muito simples e específicos. A maioria conta com a tecnologia ELISA, embora o radioimunoensaio seja ainda algumas vezes usado para C3a e C5a. Estes últimos ensaios medem tanto os fragmentos não processados quanto seus fragmentos ‘desArg’, que são as formas principais encontradas na circulação. Os fragmentos não processados e C5adesArg são rapidamente depurados pela ligação aos receptores de superfície celular e estão consequentemente presentes em concentrações muito baixas, ao passo que C3adesArg não se liga às células e acumula no plasma. As medições de C3a provêem um indicador sensível, independente de caminho da ativação de complemento. A ativação do caminho alternativo pode ser avaliada pela medição do fragmento Bb. A detecção do produto da fase fluídica da ativação do caminho de ataque à membrana, sC5b-9, provê evidência de que o complemento está sendo ativado até a conclusão. Porque os caminhos tanto da lectina quanto o clássico geram os mesmos produtos de ativação, C4a e C4d, a medição destes dois fragmentos não provê nenhuma informação acerca de

162 / 394 qual destes dois caminhos gerou os produtos de ativação.

[00282] A inibição da ativação de complemento dependente de MASP- 2 é distinguida por pelo menos uma das seguintes mudanças em um componente do sistema de complemento que ocorre como um resultado da administração de um agente inibidor de MASP-2 de acordo com os métodos da invenção: a inibição da geração ou produção de ativação dos produtos C4b, C3a, C5a e/ou C5b-9 do sistema de complemento dependente de MASP-2 (MAC) (medida, por exemplo, como descrito no Exemplo 2, a redução da clivagem de C4 e deposição de C4b (medida, por exemplo como descrito no Exemplo 10) ou a redução da clivagem de C3 e deposição de C3b (medida, por exemplo, como descrito no Exemplo 10). Agentes Adicionais

[00283] As composições e métodos compreendendo os agentes inibidores de MASP-2 podem opcionalmente compreender um ou mais agentes terapêuticos adicionais, que podem aumentar a atividade do agente inibidor de MASP-2 ou que provêem funções terapêuticas relacionadas em uma maneira aditiva ou sinergística. Por exemplo, no contexto de tratar um sujeito sofrendo de TTP, em que o sujeito é positivo para um inibidor de ADAM-TS13, um ou mais agentes inibidores de MASP-2 podem ser administrados em combinação (incluindo coadministração) com um ou mais agentes imunossupressivos. Os agentes imunossupressivos adequados incluem: corticosteroides, rituxan, ciclosporina e similares. No contexto de tratar um sujeito sofrendo de ou em risco de desenvolver, HUS ou aHUS, um ou mais agentes inibidores de MASP-2 podem ser administrados em combinação (incluindo a coadministração) com um antibiótico adequado. No contexto de tratar um sujeito sofrendo de ou em risco de desenvolver aHUS, um ou mais agentes inibidores de MASP-2 podem ser administrados em combinação (incluindo coadministração) com outros agentes inibidores de complemento tais como eculizumab (Soliris), TT-30, anticorpo para fator B

163 / 394 ou outros agentes que inibem componentes de complemento de terminal ou amplificação do caminho alternativo.

[00284] A inclusão e seleção de agente(s) adicional(is) serão determinadas para alcançar um resultado terapêutico desejado. Em algumas modalidades, o agente inibidor de MASP-2 pode ser administrado em combinação com um ou mais agentes anti-inflamatórios e/ou analgésicos. Os agentes anti-inflamatórios e/ou analgésicos adequados incluem: antagonistas do receptor de serotonina; agonistas do receptor de serotonina; antagonistas do receptor de histamina; antagonistas do receptor de bradicinina; inibidores de calicreína; antagonistas do receptor de taquicinina, incluindo antagonistas do subtipo de receptor neurocinina1 e neurocinina2; antagonistas do receptor do peptídeo relacionado com o gene de calcitonina (CGRP); antagonistas do receptor de interleucina; inibidores de enzimas ativas no caminho sintético para metabólitos do ácido araquidônico, incluindo inibidores de fosfolipase, incluindo inibidores da isoforma PLA2 e inibidores da isoforma PLCγ, inibidores da ciclooxigenase (COX) (que pode ser COX-1, COX-2 ou inibidores não seletivos COX-1 e -2), inibidores da lipooxigenase; antagonistas do receptor de prostanoide incluindo antagonistas de subtipo de receptor EP-1 e EP-4 eicosanoide e antagonistas de subtipo do receptor de tromboxano; antagonistas do receptor de leucotrieno incluindo antagonistas de subtipo de receptor B4 de leucotrieno e antagonistas de subtipo de receptor D4 de leucotrieno; agonistas do receptor de opioide, incluindo agonistas de subtipo do receptor de µ-opioide, δ-opioide e κ-opioide; agonistas de purinoceptor e antagonistas incluindo antagonistas do receptor de P2X e agonistas do receptor de P2Y; abridores do canal de potássio sensíveis ao trifosfato de adenosina (ATP); inibidores da MAP cinase; inibidores de acetilcolina nicotínica; e agonistas do receptor alfa adrenérgico (incluindo os agonistas alfa-1, alfa-2 e alfa-1 e 2 não seletivo).

[00285] Os agentes inibidores de MASP-2 da presente invenção

164 / 394 também podem ser administrados em combinação com um ou mais outros inibidores de complemento, tais como um inibidor de C5. Até agora, Eculizumab (Solaris®), um anticorpo contra C5, é o único fármaco que alveja complemento que foi aprovado para uso humano. Entretanto alguns agentes farmacológicos foram mostrados bloquear complemento in vivo. K76COOH e mesilato de nafamstat são dois agentes que têm mostrado alguma eficácia em modelos de animal de transplante (Miyagawa, S., et al., Transplant Proc. 24: 483-484, 1992). Heparinas de peso molecular baixo também foram mostradas ser eficazes na atividade reguladora de complemento (Edens, R.E., et al., Complement Today, pp. 96-120, Basel: Karger, 1993). Acredita-se que estes inibidores de molécula pequena possam ser úteis como agentes para o uso em combinação com os agentes inibidores de MASP-2 da presente invenção.

[00286] Outros inibidores de complemento que ocorrem naturalmente podem ser úteis em combinação com os agentes inibidores de MASP-2 da presente invenção. Os inibidores biológicos de complemento incluem o fator de complemento 1 solúvel (sCR1). Este é um inibidor de ocorrência natural que pode ser encontrado na membrana externa de células humanas. Outros inibidores de membrana incluem DAF, MCP e CD59. As formas recombinantes foram testadas quanto à sua atividade anticomplemento in vitro e in vivo. O sCR1 foi mostrado ser eficaz em xenotransplante, em que o sistema de complemento (tanto o alternativo quanto o clássico) provê o gatilho para uma síndrome de rejeição hiperativa dentro de minutos de sangue perfundindo através do órgão recém transplantado (Platt, J.L., et al., Immunol. Today 11: 450-6, 1990; Marino, I.R., et al., Transplant Proc. 1071: 6, 1990; Johnstone, P.S., et al., Transplantion 54: 573-6, 1992). O uso de sCR1 protege e prolonga o tempo de sobrevivência do órgão transplantado, implicando o caminho de complemento na patogênese de sobrevivência de órgão (Leventohal, J.R., et al., Transplantation 55: 857-66, 1993; Pruitt, S.K., et al., Transplantation 57: 363-70, 1994).

165 / 394

[00287] Os inibidores de complemento adicionais adequados para o uso em combinação com as composições da presente invenção também incluem, por via de exemplo, MoAbs tais como um anticorpo anti-C5 (por exemplo, eculizumab) sendo desenvolvido pela Alexion Pharmaceuticals, Inc., New Haven, Connecticut e MoAbs antiproperdina.

CARREADORES E VEÍCULOS DE LIBERAÇÃO FARMACÊUTICOS

[00288] No geral, as composições do agente inibidor de MASP-2 da presente invenção combinadas com qualquer um de outros agentes terapêuticos selecionados, são adequadamente contidos em um carreador farmaceuticamente aceitável. O carreador é não tóxico, biocompatível e é selecionado de modo a não afetar de forma prejudicial a atividade biológica do agente inibidor de MASP-2 (e qualquer outro dos agentes terapêuticos combinados com o mesmo). Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis exemplares para os peptídeos são descritos na Patente U.S. No. 5.211.657 concedido a Yamada. Os anticorpos anti-MASP-2 e peptídeos inibidores úteis na invenção podem ser formulados em preparações nas formas sólidas, semi- sólidas, de gel, líquidas ou gasosas tais como tabletes, cápsulas, pós, grânulos, unguentos, soluções, depósitos, inalantes e injeções que permitem a administração oral, parenteral ou cirúrgica. A invenção também considera a administração local das composições pelo revestimento de dispositivos médicos e os semelhantes.

[00289] Os carreadores adequados para a liberação parenteral via injetável, infusão ou irrigação e a liberação tópica inclui água destilada, solução salina tamponada com fosfato fisiológica, soluções de Ringer normais ou lactatadas, solução de dextrose, solução de Hank, ou propanodiol. Além disso, óleos estéreis, fixos podem ser utilizados como um solvente ou meio de suspensão. Para este propósito qualquer óleo biocompatível pode ser utilizado incluindo mono ou diglicerídeos sintéticos. Além disso, ácidos graxos tais como o ácido oleico encontram uso na preparação de injetáveis. O carreador e

166 / 394 agente podem ser combinados como um líquido, suspensão, gel polimerizável ou não polimerizável, pasta ou pomada.

[00290] O carreador também pode compreender um veículo de liberação para prolongar (isto é, estender, retardar ou regular) a liberação do(s) agente(s) ou para realçar a liberação, absorção, estabilidade ou farmacocinéticas do(s) agente(s) terapêutico(s). Um tal veículo de liberação pode incluir, por via de exemplo não limitante, micropartículas, microesferas, nanoesferas ou nanopartículas compostas de proteínas, lipossomas, carboidratos, compostos orgânicos sintéticos, compostos inorgânicos, hidrogéis poliméricos ou copoliméricos e micelas poliméricas. Os sistemas de liberação de hidrogel e micela adequados incluem os copolímeros PEO:PHB:PEO e os complexos de copolímero/ciclodextrina divulgados na WO 2004/009664 A2 e os complexos de PEO e PEO/ciclodextrina divulgados na Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2002/0019369 A1. Tais hidrogéis podem ser injetados localmente no sítio de ação pretendido, ou subcutaneamente ou intramuscularmente para formar um depósito de liberação prolongada.

[00291] Para a liberação intra-articular, o agente inibidor de MASP-2 pode ser carregado nos carreadores líquidos ou em gel descritos acima que são veículos de liberação injectáveis, de liberação prolongada dscritos acima que são injetáveis, ou um ácido hialurônico ou derivado do ácido hialurônico.

[00292] Para a administração oral de agentes não peptidérgicos, agente inibidor de MASP-2 pode ser carregado em um enchedor ou diluente inertes tais como sacarose, amido de milho, ou celulose.

[00293] Para a administração tópica, o agente inibidor de MASP-2 pode ser carregado em unguento, loção, creme, gel, pastilha, supositório, pulverização, líquida ou em pó, ou em gel ou sistemas de liberação microcapsulares por intermédio de um emplastro transdérmico.

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[00294] Vários sistemas de liberação nasal e pulmonar, incluindo aerossóis, inaladores de dose medida, inaladores de pó seco, e nebulizadores, estão sendo desenvolvidos e podem ser adequadamente adaptados para a liberação da presente invenção em um veículo de liberação aerossol, inalante, ou nebulizado, respectivamente.

[00295] Para a liberação intratecal (IT) ou intracerebroventricular (ICV), sistemas de liberação apropriadamente estéreis (por exemplo, líquidos; géis, suspensões, etc.) podem ser usados para administrar a presente invenção.

[00296] As composições da presente invenção também podem incluir excipientes biocompatíveis, tais como agentes de dispersão ou umectação, agentes de suspensão, diluentes, tampões, realçadores de penetração, emulsificantes, aglutinantes, espessadores, agentes flavorizantes (para a administração oral).

CARREADORES FARMACÊUTICOS PARA ANTICORPOS E PEPTÍDEOS

[00297] Mais especificamente com respeito aos anticorpos anti-MASP- 2 e peptídeos inibidores, formulações exemplares podem ser parenteralmente administradas como dosagens injetáveis de uma solução ou suspensão do composto em um diluente fisiologicamente aceitável com um carreador farmacêutico que pode ser um líquido estéril tal como água, óleos, solução salina, glicerol ou etanol. Adicionalmente, substâncias auxiliares tais como agentes de umectação ou emulsificação, tensoativos, substâncias tamponantes de pH e os semelhantes podem estar presentes em composições que compreendem os anticorpos anti-MASP-2 e peptídeos inibidores. Os componentes adicionais de composições farmacêuticas incluem petróleo (tal como de origem animal, vegetal ou sintética), por exemplo, óleo de soja e óleo mineral. No geral, glicóis tais como propileno glicol ou polietileno glicol são carreadores líquidos preferidos para as soluções injetáveis.

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[00298] Os anticorpos anti-MASP-2 e peptídeos inibidores também podem ser administrados na forma de uma injeção de depósito ou preparação de implante que podem ser formuladas em uma tal maneira como para permitir uma liberação prolongada ou pulsátil dos agentes ativos.

CARREADORES FARMACEUTICAMENTE ACEITÁVEIS PARA INIBIDORES DE EXPRESSÃO

[00299] Mais especificamente com respeito aos inibidores de expressão úteis nos métodos da invenção, composições são providas que compreendem um inibidor de expressão como descrito acima e um carreador ou diluente farmaceuticamente aceitáveis. A composição pode compreender ainda um sistema de dispersão coloidal.

[00300] As composições farmacêuticas que incluem inibidores de expressão podem incluir, mas não são limitadas a soluções, emulsões e formulações contendo lipossoma. Estas composições podem ser geradas a partir de uma variedade de componentes que incluem, mas não são limitados a líquidos pré-formados, sólidos autoemulsificantes e semissólidos autoemulsificantes. A preparação de tais composições tipicamente envolve combinar o inibidor de expressão com um ou mais dos seguintes: tampões, antioxidantes, polipeptídeos de peso molecular baixo, proteínas, aminoácidos, carboidratos incluindo glicose, sacarose ou dextrinas, agentes quelantes tais como EDTA, glutationa e outros estabilizantes e excipientes. Solução salina tamponada neutral ou solução salina mista com albumina sérica não específica são exemplos de diluentes adequados.

[00301] Em algumas modalidades, as composições podem ser preparadas e formuladas como emulsões que são tipicamente sistemas heterogêneos de um líquido dispersos em um outro na forma de gotículas (ver, Idson, em Pharmaceutical Dosage Forms, Vol. 1, Rieger e Banker (eds)., Marcek Dekker, Inc., N.Y., 1988). Os exemplos de emulsificantes de ocorrência natural usados nas formulações em emulsão incluem acácia, cera

169 / 394 de abelhas, lanolina, lecitina e fosfatídeos.

[00302] Em uma modalidade, as composições incluindo ácidos nucleicos podem ser formuladas como microemulsões. Uma microemulsão, como aqui usada se refere a um sistema de água, óleo e anfifílico, que é uma solução líquida única oticamente isotrópica e termodinamicamente estável (ver Rosoff em Pharmaceutical Dosage Forms, Vol. 1). O método da invenção também pode usar lipossomas para a transferência e liberação de oligonucleotídeos antissentido para o sítio desejado.

[00303] As composições farmacêuticas e formulações de inibidores de expressão para a administração tópica podem incluir emplastros transdérmicos, unguentos, loções, cremes, géis, gotas, supositórios, pulverizações, líquidos e pós. Os carreadores farmacêuticos convencionais, assim como bases aquosas, em pó ou oleosas e espessantes e similares podem ser usados.

MODOS DE ADMINISTRAÇÃO

[00304] As composições farmacêuticas compreendendo os agentes inibidores de MASP-2 podem ser administradas em vários modos dependendo de se um local ou modo sistêmico de administração é mais apropriado para a condição sendo tratada. Adicionalmente, como aqui descrito acima com respeito aos procedimentos de reperfusão extracorpórea, agentes inibidores de MASP-2 podem ser administrados por intermédio da introdução das composições da presente invenção ao sangue ou plasma recirculantes. Além disso, as composições da presente invenção podem ser ministradas revestindo-se ou incorporando-se as composições sobre ou dentro de um dispositivo médico implantável.

LIBERAÇÃO SISTÊMICA

[00305] Como aqui usado, os termos “liberação sistêmica” e “administração sistêmica” são intencionados a incluir mas não são limitados às vias oral e parenteral incluindo intramuscular (IM), subcutânea,

170 / 394 intravenosa (IV), intra-arterial, inalacional, sublingual, bucal, tópica, transdérmica, nasal, retal, vaginal e outras vias de administração que eficazmente resultam na dispersão do agente liberado a um sítio único ou múltiplo de ação terapêutica pretendida. As vias preferidas de liberação sistêmica para as presentes composições incluem intravenosa, intramuscular, subcutânea e inalacional. Será avaliado que a via de administração sistêmica exata para os agentes selecionados utilizados nas composições particulares da presente invenção será determinada em parte levando-se em conta a susceptibilidade do agente para os caminhos de transformação metabólica associados com uma dada via de administração. Por exemplo, os agentes peptidérgicos podem ser mais adequadamente administrados pelas vias outras que não a oral.

[00306] Os anticorpos inibidores de MASP-2 e polipeptídeos podem ser liberados em um indivíduo em necessidade dos mesmos por qualquer meio adequado. Os métodos de liberação de anticorpos e polipeptídeos de MASP-2 incluem a administração pela via oral, pulmonar, parenteral (por exemplo, injeção intramuscular, intraperitoneal, intravenosa (IV) ou subcutânea), inalação (tal como por intermédio de uma formulação de pó fino), transdérmica, nasal, vaginal, retal, ou sublingual de administração, e podem ser formuladas em formas de dosagem apropriadas para cada via de administração.

[00307] Por via de exemplo representativo, os anticorpos e peptídeos inibidores de MASP podem ser introduzidos em um corpo vivo pelaby aplicação a uma membrana corporal capaz de absorver os polipeptídeos, por exemplo as membranas nasal, gastrointestinal e retal. Os polipeptídeos são tipicamente aplicados à membrana absortiva em conjunção com um realçador de permeação. (Ver, por exemplo, Lee, V.H.L., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Sys. 5: 69, 1988; Lee, V.H.L., J. Controlled Release 13: 213, 1990; Lee, V.H.L., Ed., Peptide and Protein Drug Delivery, Marcel Dekker, Nova Iorque

171 / 394 1991; DeBoer, A. G., et al., J. Controlled Release 13: 241, 1990. Por exemplo, STDHF é um derivado sintético do ácido fusídico, um tensoativo esteroidal que é similar em estrutura aos sais biliares, e foram usados como um realçador de permeação para a liberação nasal. (Lee, W. A., Biopharm. 22, Nov./Dez. 1990).

[00308] Os anticorpos de MASP-2 inibidores e polipeptídeos podem ser introduzidos em associação com uma outra molécula, tal como um lipídeo, para proteger os polipeptídeos da degradação enzimática. Por exemplo, a ligação covalente de polímeros, especialmente polietileno glicol (PEG), foi usada para proteger certas proteínas da hidrólise enzimática no corpo e assim prolongar a meia vida (Fuertges, F., et al., J. Controlled Release 11: 139, 1990). Muitos sistemas poliméricos foram relatados para a liberação de proteína (Bae, Y. H., et al., J. Controlled Release 9: 271, 1989; Hori, R., et al., Pharm. Res. 6: 813, 1989; Yamakawa, I., et al., J. Pharm. Sci. 79: 505, 1990; Yoshihiro, I., et al., J. Controlled Release 10: 195, 1989; Asano, M., et al., J. Controlled Release 9: 111, 1989; Rosenblatt, J., et al., J. Controlled Release 9: 195, 1989; Makino, K., J. Controlled Release 12: 235, 1990; Takakura, Y., et al., J. Pharm. Sci. 78: 117, 1989; Takakura, Y., et al., J. Pharm. Sci. 78: 219, 1989).

[00309] Recentemente, lipossomas foram desenvolvidos com estabilidade sérica e meias-vidas em circulação melhoradas (ver, por exemplo, a Patente U.S. No. 5.741.516, concendida a Webb). Além disso, vários métodos de lipossoma e preparações como lipossoma como carreadores de medicamento potenciais foram revistos (ver, por exemplo, a Patente U.S. No. 5.567.434, concedida a Szoka; Patente U.S. No. 5.552.157, concedida a Yagi; Patente U.S. No. 5.565.213, concedida a Nakamori; Patente U.S. No. 5.738.868, concedida a Shinkarenko; e Patente U.S. No. 5.795.587, concedida a Gao).

[00310] Para as aplicações transdérmicas, os anticorpos inibidores de

172 / 394 MASP-2 e polipeptídeos podem ser combinados com outros ingredientes adequados, tais como carreadores e/ou adjuvantes. Não há nenhuma limitação na natureza de tais outros ingredientes, exceto que os mesmos devem ser farmaceuticamente aceitáveis para a sua administração pretendida, e não podem degradar a atividade dos ingredientes ativos da composição. Os exemplos de veículos adequados incluem unguentos, cremes, géis, ou suspensões, com ou sem colágeno purificado. Os anticorpos inibidores de MASP-2 e polipeptídeos também podem ser impregnados em emplastros transdérmicos, curativos, e bandagens, preferivelmente na forma líquida ou semi-líquida.

[00311] As composições da presente invenção podem ser sistemicamente administradas em uma base periódica em intervalos determinados para se manter um nível desejado de efeito terapêutico. Por exemplo, as composições podem ser administradas, tais como pela injeção subcutânea, a cada duas a quatro semanas ou em intervalos menos frequentes. O regime de dosagem será determinado pelo médico considerando vários fatores que podem influenciar a ação da combinação de agentes. Estes fatores incluirão o grau de progresso da condição que é tratada, a idade, sexo e peso do paciente, e outros fatores clínicos. A dosagem para cada agente individual variará como uma função do agente inibidor de MASP-2 que é incluído na composição, assim como a presença e natureza de qualquer veículo de liberação de medicamento (por exemplo, um veículo de liberação prolongada). Além disso, a quantidade de dosagem pode ser ajustada levando- se em conta a variação na frequência de administração e o compostamento farmacocinético do(s) agente(s) liberado(s).

LIBERAÇÃO LOCAL

[00312] Como aqui usado, o termo “local” abrange a aplicação de um medicamento em ou em torno de um sítio de ação localizada pretendido, e pode incluir por exemplo a liberação tópica à pele ou outros tecidos afetados,

173 / 394 administração, colocação ou irrigação de liberação oftálmica, intratecal (IT), intracerebroventricular (ICV), intraarticular, intracavidade, intracraniana ou intravesicular. A administração local pode ser preferida para permitir a administração de uma dose mais baixa, para evitar os efeitos colaterais sistêmicos, e para o controle mais preciso da cronometragem da liberação e concentração dos agentes ativos no sítio de liberação local. A administração local fornece uma concentração conhecida no sítio alvo, independente da variabilidade interpaciente no metabolismo, fluxo sanguíneo, etc. O controle de dosagem melhorado também é fornecido pelo modo direto de liberação.

[00313] A liberação local de um agente inibidor de MASP-2 pode ser obtida no contexto de métodos cirúrgicos para tratar uma doença ou condição, tal como por exemplo durante procedimentos tais como cirurgia de desvio arterial, aterectomia, procedimentos a laser, procedimentos ultrassônicos, angioplastia de balão e colocação de stent. Por exemplo, um inibidor de MASP-2 pode ser administrado a um indivíduo em conjunção com um procedimento de angioplastia de balão. Um procedimento de angioplastia de balão envolve inserir um cateter tendo um balão desinflado em uma artéria. O balão desinflado é posicionado em proximidade à placa aterosclerótica e é inflado tal que a placa seja comprimida contra a parede vascular. Como um resultado, a superfície do balão está em contato com a camada de células endoteliais vasculares na superfície do vaso sanguíneo. O agente inibidor de MASP-2 pode ser ligado ao cateter da angiplastia de balão em uma maneira que permita a liberação do agente no sítio da placa aterosclerótica. O agente pode ser ligado ao cateter de balão de acordo com procedimentos padrão conhecidos na técnica. Por exemplo, o agente pode ser armazenado em um compartimento do cateter de balão até que o balão seja inflado, ponto no qual o mesmo é liberado dentro do ambiente local. Alternativamente, o agente pode ser impregnado na superfície do balão, tal que o mesmo contate as células da parede arterial conforme o balão é inflado. O agente também pode

174 / 394 ser liberado em um cateter de balão perfurado tal como aqueles divulgados em Flugelman, M. Y., et al., Circulation 85: 1110-1117, 1992. Ver também o pedido PCT publicado WO 95/23161 para um procedimento exemplar para a ligação de uma proteína terapêutica a um cateter de angioplastia de balão. Do mesmo modo, o agente inibidor de MASP-2 podem ser incluídos em um gel ou revestimento polimérico aplicado a um stent, ou podem ser incorporados no material do stent, tal que o stent elua o agente inibidor de MASP-3 ou agente inibidor de MASP-2 depois da colocação vascular.

[00314] As composições inibidoras de MASP-2 usadas no tratamento de artrites e outros distúrbios musculoesqueletais podem ser localmente liberados pela injeção intra-articular. Tais composições podem adequadamente incluir um veículo de liberação prolongada. Como um outro exemplo de casos em que a liberação local pode ser desejada, as composições inibidoras de MASP-2 usadas no tratamento de condições urogenitais podem ser adequadamente instiladas intravesicalmente ou dentro de uma outra estrutura urogenital.

REVESTIMENTOS SOBRE UM DISPOSITIVO MÉDICO

[00315] Os agentes inibidores de MASP-2 tais como anticorpos e peptídeos inibidores podem ser imobilizados sobre (ou dentro de) uma superfície de um dispositivo médico implantável ou fixável. A superfície modificada tipicamente estará em contato com tecido vivo depois da implantação dentro de um corpo de animal. Por “dispositivo médico implantável ou fixável” é intencionado qualquer dispositivo que seja implantado dentro ou fixável ao tecido de um corpo de animal, durante a operação normal do dispositivo (por exemplo, stents e dispositivos de distribuição de fármaco implantáveis). Tais dispositivos médicos implantáveis ou fixáveis podem ser fabricados, por exemplo, de nitrocelulose, diazocelulose, vidro, poliestireno, cloreto de polivinila, polipropileno, polietileno, dextrano, Sefarose, ágar, amido, náilon, aço inoxidável, titânio e

175 / 394 polímeros biodegradáveis e/ou biocompatíveis. A ligação da proteína a um dispositivo pode ser realizada por qualquer técnica que não destrua a atividade biológica da proteína ligada, por exemplo fixando-se um ou ambos dos resíduos dos terminais N ou C da proteína ao dispositivo. A fixação também pode ser feita em um ou mais sítios internos na proteína. Fixações múltiplas (tanto internas quanto nas extremidades da proteína) também podem ser usadas. Uma superfície de um dispositivo médico implantável ou fixável pode ser modificada para incluir grupos funcionais (por exemplo, carboxila, amida, amino, éter, hidroxila, ciano, nitreto, sulfanamido, acetilínico, epóxido, silânico, anídrico, succinímico, azido) para a imobilização de proteína a ela. As químicas de fixação incluem, mas não são limitadas à formação de ésteres, éteres, amidas, azido e derivados de sulfanamido, cianato e outras ligações aos grupos funcionais disponíveis sobre os anticorpos ou peptídeos inibidores de MASP-2. Os anticorpos ou fragmentos inibidores de MASP-2 também podem ser fixados de modo não covalente pela adição de uma sequência de etiqueta de afinidade à proteína, tal como GST (D.B. Smith e K.S. Johnson, Gene 67: 31, 1988), polihistidinas (E. Hochuli et al., J. Chromatog. 411: 77, 1987) ou biotina. Tais etiquetas de afinidade podem ser usadas para a fixação reversível da proteína a um dispositivo.

[00316] As proteínas também podem ser covalentemente fixadas à superfície de um corpo do dispositivo, por exemplo, pela ativação covalente da superfície do dispositivo médico. Por via de exemplo representativo, proteína(s) matricelular(es) podem ser fixadas ao corpo do dispositivo por qualquer um dos seguintes pares de grupos reativos (um membro do par estando presente na superfície do corpo do dispositivo e o outro membro do par estando presente na(s) proteína(s) matricelular(es)): hidroxila/ácido carboxílico para produzir uma ligação de éster; hidroxila/anidrido para produzir uma ligação de éster; hidroxila/isocianato para produzir uma ligação de uretano. Uma superfície de um corpo do dispositivo que não possui grupos

176 / 394 reativos úteis pode ser tratada com gravação com plasma com descarga de radiofrequência (RFGD) para gerar grupos reativos de modo a permitir deposição de proteína(s) matricelular(es) (por exemplo, tratamento com plasma de oxigênio para introduzir grupos contendo oxigênio; tratamento com plasma de propil amino para introduzir grupos amina).

[00317] Agentes inibidores de MASP-2 compreendendo moléculas de ácido nucleico tais como inibidores peptídicos antissentido, codificando RNAi ou DNA podem ser embutidos em matrizes porosas fixadas a um corpo do dispositivo. As matrizes porosas representativas úteis para fabricar a camada de superfície são aquelas preparadas a partir de tendão ou colágeno dérmico, como pode ser obtida de uma variedade de fontes comerciais (por exemplo, Sigma e Collagen Corporation) ou as matrizes de colágeno preparadas como descrito nas Patentes U.S. Nos. 4.394.370, concedida a Jefferies e 4.975.527, concedida a Koezuka. Um material colagenoso é denominado UltraFiber® e é obtenível da Norian Corp. (Mountain View, Califórnia).

[00318] Certas matrizes poliméricas também podem ser utilizadas se desejado e incluem polímeros de éster acrílico e polímeros de ácido láctico, como divulgado, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos. 4.526.909 e 4.563.489, concedida a Urist. Os exemplos particulares de polímeros úteis são aqueles de ortoésteres, anidridos, propileno-cofumaratos ou um polímero de um ou mais monômeros do ácido α-hidróxi carboxílico, (por exemplo, ácido α-hidróxi acético (ácido glicólico) e/ou ácido α-hidróxi propiônico (ácido láctico)).

REGIMES DE TRATAMENTO

[00319] Em aplicações profiláticas, as composições farmacêuticas são administradas a um sujeito susceptível a ou de outro modo em risco de uma condição associada com a ativação de complemento dependente de MASP-2 em uma quantidade suficiente para eliminar ou reduzir o risco de desenvolver sintomas da condição. Em aplicações terapêuticas, as composições

177 / 394 farmacêuticas são administradas a um sujeito suspeito de ou já sofrendo de uma condição associada com a ativação de complemento dependente de MASP-2 em uma quantidade terapeuticamente eficaz suficiente para aliviar ou pelo menos parcialmente reduzir, os sintomas da condição. Nos regimes tanto profiláticos quanto terapêuticos, as composições compreendendo os agentes inibidores de MASP-2 podem ser administradas em diversas dosagens até que um resultado terapêutico suficiente tenha sido obtido no sujeito. A aplicação das composições inibidoras de MASP-2 da presente invenção pode ser realizada por uma única administração da composição ou uma sequência limitada de administrações, para o tratamento de uma condição aguda, por exemplo, lesão de reperfusão ou outra lesão traumática. Alternativamente, a composição pode ser administrada em intervalos periódicos em um período prolongado de tempo para o tratamento de condições crônicas, por exemplo, artrite ou psoríase.

[00320] Os métodos e composições da presente invenção podem ser usadas para inibir inflamação e processos relacionados que tipicamente resultam de procedimentos de diagnóstico e médico terapêutico e cirúrgicos. Para inibir tais processos, a composição inibidora de MASP-2 da presente invenção pode ser aplicada periproceduralmente. Como aqui usado “periproceduralmente” se refere à administração da composição inibidora preproceduralmente e/ou intraproceduralmente e/ou pós-proceduralmente, isto é, antes do procedimento, antes e durante o procedimento, antes e depois do procedimento, antes, durante e depois do procedimento, durante o procedimento, durante e depois do procedimento ou depois do procedimento. A aplicação periprocedural pode ser realizada pela administração local da composição ao sítio cirúrgico ou procedural, tal como pela injeção ou irrigação contínua ou intermitente do sítio ou pela administração sistêmica. Os métodos adequados para a liberação perioperativa local de soluções do agente inibidor de MASP-2 são divulgadas na Patente US Nos. 6.420.432

178 / 394 concedida a Demopulos e 6.645.168 concedida a Demopulos. Métodos adequados para a liberação local de composições condroprotetivas incluindo agente(s) inibidor(es) de MASP-2 são divulgados no Pedido de Patente PCT Internacional WO 01/07067 A2. Os métodos e composições adequados para alvejar a distribuição sistêmica de composições condroprotetivas incluindo agente(s) inibidor(es) de MASP-2 são divulgadas no Pedido de Patente PCT internacional WO 03/063799 A2.

[00321] Em um aspecto da invenção, as composições farmacêuticas são administradas a um sujeito sofrendo de ou em risco de desenvolver uma microangiopatia trombótica (TMA). Em uma modalidade, a TMA é selecionada do grupo consistindo de síndrome urêmica hemolítica (HUS), púrpura trombocitopênica trombótica (TTP) e síndrome urêmica hemolítica atípica (aHUS). Em uma modalidade, a TMA é aHUS. Em uma modalidade, a composição é administrada a um paciente com aHUS durante a fase aguda da doença. Em uma modalidade, a composição é administrada a um paciente com aHUS durante a fase de remissão (isto é, em um sujeito que se recuperou ou se recuperou parcialmente de um episódio de aHUS de fase aguda, tal remissão evidenciada, por exemplo, pela contagem aumentada de plaqueta e/ou concentrações séricas reduzidas de LDH, por exemplo como descrito em Loirat C et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 6: 60, 2011, por meio deste aqui incorporada por referência). Em uma modalidade, o sujeito está sofrendo de ou em risco de desenvolver uma TMA que é (i) uma TMA secundária ao câncer; (ii) uma TMA secundária à quimioterapia; ou (iii) uma TMA secundária a transplante (por exemplo, transplante de órgão, tal como transplante renal ou transplante alogênico de célula-tronco hematopoiética). Em uma modalidade, o sujeito está sofrendo de ou em risco de desenvolver a Síndrome de Upshaw-Schulman (USS). Em uma modalidade, o sujeito está sofrendo de ou em risco de desenvolver a doença de Degos. Em uma modalidade, o sujeito está sofrendo de ou em risco de desenvolver a Síndrome

179 / 394 Antifosfolipídica Catastrófica (CAPS). Nas aplicações terapêuticas, as composições farmacêuticas são administradas a um sujeito sofrendo de ou em risco de desenvolver uma TMA em uma quantidade terapeuticamente eficaz suficiente para inibir a formação de trombo, aliviar ou pelo menos parcialmente reduzir, os sintomas da condição.

[00322] Nos regimes tanto profiláticos quanto terapêuticos, as composições compreendendo os agentes inibidores de MASP-2 podem ser administradas em diversas dosagens até que um resultado terapêutico suficiente tenha sido obtido no sujeito. Em uma modalidade da invenção, o agente inibidor de MASP-2 compreende um anticorpo anti-MASP-2, que adequadamente pode ser administrado a um paciente adulto (por exemplo, um adulto pesando em média 70 kg) em uma dosagem de 0,1 mg a 10.000 mg, mais adequadamente de 1,0 mg a 5.000 mg, mais adequadamente 10,0 mg a

2.000 mg, mais adequadamente 10,0 mg a 1.000 mg e ainda mais adequadamente de 50,0 mg a 500 mg. Para pacientes pediátricos, a dosagem pode ser ajustada em proporção ao peso do paciente. A aplicação das composições inibidoras de MASP-2 da presente invenção pode ser realizada por uma única administração da composição ou uma sequência limitada de administrações, para o tratamento de TMA. Alternativamente, a composição pode ser administrada em intervalos periódicos tais como diariamente, bissemanalmente, semanalmente, semana sim semana não, mensalmente ou bimensalmente em um período prolongado de tempo para o tratamento de TMA.

[00323] Em algumas modalidades, o sujeito sofrendo de ou em risco de desenvolver uma TMA anteriormente passou ou está atualmente passando por tratamento com um inibidor de complemento de terminal que inibe a clivagem da proteína de complemento C5. Em algumas modalidades, o método compreende administrar ao sujeito uma composição da invenção compreendendo um inibidor de MASP-2 e administrar adicionalmente ao

180 / 394 sujeito um inibidor de complemento de terminal que iniba a clivagem da proteína de complemento C5. Em algumas modalidades, o inibidor de complemento de terminal é um anticorpo anti-C5 humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, o inibidor de complemento de terminal é eculizumab.

[00324] Em um aspecto da invenção, as composições farmacêuticas são administradas a um sujeito susceptível a ou de outro modo em risco de aHUS em uma quantidade suficiente para eliminar ou reduzir o risco de desenvolver sintomas da condição. Nas aplicações terapêuticas, as composições farmacêuticas são administradas a um sujeito suspeito de ou já sofrendo de aHUS em uma quantidade terapeuticamente eficaz suficiente para aliviar ou pelo menos parcialmente reduzir, os sintomas da condição. Em um aspecto da invenção, antes da administração, o sujeito pode ser examinado para determinar se o sujeito exibe um ou mais sintomas de aHUS, incluindo (i) anemia, (ii) trombocitopenia (iii) insuficiência renal e (iv) aumento da creatinina e a composição da presente invenção é depois administrada em uma quantidade eficaz e durante um período de tempo suficiente para melhorar este(s) sintoma(s).

[00325] Em um outro aspecto da invenção, as composições inibidoras de MASP-2 da presente invenção podem ser usadas para tratar profilaticamente um sujeito que tem um risco elevado de desenvolver aHUS e deste modo reduzir a probabilidade de que o sujeito se livrará da aHUS. A presença de um marcador genético no sujeito conhecido estar associado com aHUS é primeiro determinada realizando-se um teste de triagem genética em uma amostra obtida do sujeito e identificando a presença de pelo menos um marcador genético associado com aHUS, fator de complemento H (CFH), fator I (CFI), fator B (CFB), cofator de membrana CD46, C3, proteína relacionada com o fator H de complemento (CFHR1), proteína anticoagulante trombodulina (THBD), proteína relacionada com o fator H de complemento 3

181 / 394 (CFHR3) ou proteína relacionada com o fator H de complemento 4 (CFHR4). O sujeito é depois periodicamente monitorado (por exemplo, mensalmente, trimestralmente, duas vezes ao ano ou anualmente) para determinar a presença ou ausência de pelo menos um sintoma de aHUS, tal como anemia, trombocitopenia, insuficiência renal e aumento da creatinina. Na determinação da presença de pelo menos um destes sintomas, o sujeito pode ser administrado uma quantidade de um agente inibidor de MASP-2 eficaz para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2, em uma quantidade eficaz e durante um período de tempo suficiente para melhorar o dito um ou mais sintomas. Ainda em um ainda em um outro ainda em um aspecto adicional da presente invenção, um sujeito em risco aumentado de desenvolver aHUS devido a ter sido triado e determinado ter um dos marcadores genéticos associados com aHUS pode ser monitorado quanto à ocorrência de um evento associado com a deflagração de sintomas clínicos da aHUS, incluindo exposição a fármaco, infecção (por exemplo, infecção bacteriana), malignidade, lesão, transplante de órgão ou tecido e gravidez.

[00326] Ainda em um aspecto adicional da presente invenção, uma composição compreendendo uma quantidade de um agente inibidor de MASP-2 eficaz para inibir a ativação de complemento dependente de MASP- 2 pode ser administrada a uma pessoa sofrendo de ou em risco de desenvolver síndrome urêmica hemolítica atípica (aHUS) secundária a uma infecção. Por exemplo, um paciente sofrendo de ou em risco de desenvolver aHUS não entérica associada com uma infecção de S. pneumonia pode ser tratada com as composições da presente invenção.

[00327] Ainda em um aspecto adicional da presente invenção, um sujeito sofrendo de aHUS pode inicialmente ser tratado com uma composição inibidora de MASP-2 da presente invenção que é administrada através de uma linha de cateter, tal como uma linha de cateter intravenoso ou uma linha de cateter subcutânea, durante um primeiro período de tempo tal como uma hora,

182 / 394 doze horas, um dia, dois dias ou três dias. O sujeito pode depois ser tratado durante um segundo período de tempo com a composição inibidora de MASP-2 administrada através de injeções subcutâneas regulares, tais como injeções diárias, bissemanais, semanais, semana sim semana não, mensais ou bimensais.

[00328] Ainda em um aspecto adicional da presente invenção, uma composição inibidora de MASP-2 da presente invenção pode ser administrada a um sujeito sofrendo de aHUS na ausência de plasmaférese (isto é, um sujeito cujos sintomas de aHUS não foram tratados com plasmaférese e não são tratados com plasmaférese no momento do tratamento com a composição inibidora de MASP-2), para evitar as complicações potenciais da plasmaférese incluindo hemorragia, infecção e exposição aos distúrbios e/ou alergias inerentes no doador de plasma ou em um sujeito de outro modo avesso à plasmaférese ou em um cenário onde a plasmaférese é indisponível.

[00329] Ainda em um aspecto adicional da presente invenção, uma composição inibidora de MASP-2 da presente invenção pode ser administrada a um sujeito sofrendo de aHUS coincidente com o tratamento do paciente com plasmaférese. Por exemplo, um sujeito recebendo tratamento de plasmaférese pode ser depois administrado com a composição inibidora de MASP-2 a seguir ou alternando com a troca de plasma.

[00330] Ainda em um aspecto adicional da presente invenção, um sujeito sofrendo de ou em risco de desenvolver aHUS e sendo tratado com uma composição inibidora de MASP-2 da presente invenção pode ser monitorado determinando-se periodicamente, tal como a cada doze horas ou em uma base diária, o nível de pelo menos um fator de complemento, em que a determinação de um nível reduzido do pelo menos um fator de complemento em comparação a um valor padrão ou a um sujeito saudável é indicativo da necessidade quanto ao tratamento continuado com a composição.

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[00331] Em regimes tanto profiláticos quanto terapêuticos, as composições compreendendo os agentes inibidores de MASP-2 podem ser administradas em diversas dosagens até que um resultado terapêutico suficiente tenha sido obtido no sujeito. Em uma modalidade da invenção, o agente inibidor de MASP-2 compreende um anticorpo anti-MASP-2, que adequadamente pode ser administrado a um paciente adulto (por exemplo, um peso adulto médio de 70 kg) em uma dosagem de 0,1 mg a 10.000 mg, mais adequadamente de 1,0 mg a 5.000 mg, mais adequadamente 10,0 mg a 2.000 mg, mais adequadamente 10,0 mg a 1.000 mg e ainda mais adequadamente de 50,0 mg a 500 mg. Para pacientes pediátricos, a dosagem pode ser ajustada em proporção ao peso do paciente. A aplicação das composições inibidoras de MASP-2 da presente invenção pode ser realizada por uma única administração da composição ou uma sequência limitada de administrações, para o tratamento de aHUS. Alternativamente, a composição pode ser administrada em intervalos periódicos, tais como diariamente, bissemanalmente, semanalmente, semana sim semana não, mensalmente ou bimensalmente, em um período prolongado de tempo para o tratamento de aHUS.

[00332] Em algumas modalidades, o sujeito sofrendo de aHUS anteriormente passou ou está atualmente passando por tratamento com um inibidor de complemento de terminal que inibe a clivagem da proteína de complemento C5. Em algumas modalidades, o método compreende administrar ao sujeito uma composição da invenção compreendendo um inibidor de MASP-2 e administrar adicionalmente ao sujeito um inibidor de complemento de terminal que inibe a clivagem da proteína de complemento C5. Em algumas modalidades, o inibidor de complemento de terminal é um anticorpo anti-C5 humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, o inibidor de complemento de terminal é eculizumab.

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[00333] Em um aspecto da invenção, as composições farmacêuticas são administradas a um sujeito susceptível a ou de outro modo em risco de HUS em uma quantidade suficiente para eliminar ou reduzir o risco de desenvolver sintomas da condição. Em aplicações terapêuticas, as composições farmacêuticas são administradas a um sujeito suspeito de ou já sofrendo de HUS em uma quantidade terapeuticamente eficaz suficiente para aliviar ou pelo menos parcialmente reduzir, os sintomas da condição.

[00334] Em um outro aspecto da presente invenção, a probabilidade de desenvolver função renal prejudicada em um sujeito em risco de desenvolver HUS pode ser reduzida administrando-se ao sujeito uma composição inibidora de MASP-2 da presente invenção em uma quantidade eficaz para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2. Por exemplo, um sujeito em risco de desenvolver HUS e ser tratado com uma composição inibidora de MASP-2 da presente invenção pode exibir um ou mais sintomas associado com HUS, incluindo diarreia, um nível de hematócrito de menos do que 30% com evidência de esfregaço de destruição de eritrócito intravascular, trombocitopenia e aumento dos níveis de creatinina. Como um exemplo adicional, um sujeito em risco de desenvolver HUS e ser tratado com as composições inibidoras de MASP-2 da presente invenção pode estar infectado com E. coli, shigella ou salmonella. Tais sujeitos infectados com E. coli, shigella ou salmonella podem ser tratados com uma composição inibidora de MASP-2 da presente invenção concorrente com tratamento com antibiótico ou alternativamente pode ser tratado com uma composição inibidora de MASP-2 sem tratamento concorrente com um antibiótico, particularmente para E. coli enterogênica para a qual o tratamento com antibiótico é contraindicado. Um sujeito infectado com E. coli que foi tratado com um antibiótico pode estar em risco elevado de desenvolver HUS e pode ser adequadamente tratado com uma composição inibidora de MASP-2 da presente invenção para reduzir este risco. Um sujeito infectado com E. coli

185 / 394 enterogênica pode ser tratado durante um primeiro período de tempo com uma composição inibidora de MASP-2 da presente invenção na ausência de um antibiótico e depois durante um segundo período de tempo tanto com uma composição inibidora de MASP-2 da presente invenção quanto com um antibiótico.

[00335] Ainda em um aspecto adicional da presente invenção, um sujeito sofrendo de HUS pode inicialmente ser tratado com uma composição inibidora de MASP-2 da presente invenção que é administrada através de uma linha de cateter, tal como uma linha de cateter intravenoso ou uma linha de cateter subcutânea, durante um primeiro período de tempo tal como uma hora, doze horas, um dia, dois dias ou três dias. O sujeito pode ser depois tratado durante um segundo período de tempo com a composição inibidora de MASP-2 administrada através de injeções subcutâneas regulares, tais como injeções diárias, bissemanais, semanais, semana sim semana não, mensais ou bimensais.

[00336] Ainda em um aspecto adicional da presente invenção, uma composição inibidora de MASP-2 da presente invenção pode ser administrada a um sujeito sofrendo de HUS na ausência de plasmaférese (isto é, um sujeito cujos sintomas de HUS não foram tratados com plasmaférese e não são tratados com plasmaférese no momento do tratamento com a composição inibidora de MASP-2), para evitar as complicações potenciais da plasmaférese incluindo hemorragia, infecção e exposição aos distúrbios e/ou alergias inerentes no doador de plasma ou em um sujeito de outro modo avesso à plasmaférese ou em um cenário onde a plasmaférese é indisponível.

[00337] Ainda em um aspecto adicional da presente invenção, uma composição inibidora de MASP-2 da presente invenção pode ser administrada a um sujeito sofrendo de HUS coincidentemente com o tratamento do paciente com plasmaférese. Por exemplo, um sujeito recebendo tratamento de plasmaférese pode ser depois administrado com a composição inibidora de

186 / 394 MASP-2 a seguir ou alternando com troca de plasma.

[00338] Ainda em um aspecto adicional da presente invenção, um sujeito sofrendo de ou em risco de desenvolver HUS e sendo tratado com uma composição inibidora de MASP-2 da presente invenção pode ser monitorado determinando-se periodicamente, tal como a cada doze horas ou em uma base diária, o nível de pelo menos um fator de complemento, em que a determinação de um nível reduzido do pelo menos um fator de complemento em comparação a um valor padrão ou a um sujeito saudável é indicativo da necessidade quanto ao tratamento continuado com a composição.

[00339] Em regimes tanto profiláticos quanto terapêuticos, as composições compreendendo agentes inibidores de MASP-2 podem ser administradas em diversas dosagens até que um resultado terapêutico suficiente tenha sido obtido no sujeito. Em uma modalidade da invenção, o agente inibidor de MASP-2 compreende um anticorpo anti-MASP-2, que adequadamente pode ser administrado a um paciente adulto (por exemplo, um adulto pesando em média 70 kg) em uma dosagem de 0,1 mg a 10.000 mg, mais adequadamente de 1,0 mg a 5.000 mg, mais adequadamente 10,0 mg a

2.000 mg, mais adequadamente 10,0 mg a 1.000 mg e ainda mais adequadamente de 50,0 mg a 500 mg. Para pacientes pediátricos, a dosagem pode ser ajustada em proporção ao peso do paciente. A aplicação das composições inibidoras de MASP-2 da presente invenção pode ser realizada por uma única administração da composição ou uma sequência limitada de administrações, para o tratamento de HUS. Alternativamente, a composição pode ser administrada em intervalos periódicos, tais como diariamente, bissemanalmente, semanalmente, semana sim semana não, mensalmente ou bissemanalmente, em um período de tempo prolongado para o tratamento de HUS.

[00340] Em algumas modalidades, o sujeito sofrendo de HUS anteriormente passou ou está atualmente passando por tratamento com um

187 / 394 inibidor de complemento de terminal que inibe a clivagem da proteína de complemento C5. Em algumas modalidades, o método compreende administrar ao sujeito uma composição da invenção compreendendo um inibidor de MASP-2 e adicionalmente administrar ao sujeito um inibidor de complemento de terminal que iniba a clivagem da proteína de complemento C5. Em algumas modalidades, o inibidor de complemento de terminal é um anticorpo anti-C5 humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, o inibidor de complemento de terminal é eculizumab.

[00341] Em um aspecto da invenção, as composições farmacêuticas são administradas a um sujeito susceptível a ou de outro modo em risco de TTP em uma quantidade suficiente para eliminar ou reduzir o risco de desenvolver sintomas da condição. Em aplicações terapêuticas, as composições farmacêuticas são administradas a um sujeito suspeito de sofrer ou já sofrendo de TTP em uma quantidade terapeuticamente eficaz suficiente para aliviar ou pelo menos parcialmente reduzir, os sintomas da condição.

[00342] Em um outro aspecto da presente invenção, um sujeito exibindo um ou mais dos sintomas de TTP, incluindo o envolvimento do sistema nervoso central, trombocitopenia, envolvimento cardíaco severo, envolvimento pulmonar severo, infartação gastrointestinal e gangrena, pode ser tratado com uma composição inibidora de MASP-2 da presente invenção. Em um outro aspecto da presente invenção, um sujeito determinado ter um nível reduzido de ADAMTS13 e também testando positivo quanto à presença de um inibidor (isto é, um anticorpo) de ADAMTS13 pode ser tratado com uma composição inibidora de MASP-2 da presente invenção. Ainda em um aspecto adicional da presente invenção, um sujeito testando positivo quanto à presença de um inibidor de ADAMTS13 pode ser tratado com um imunossupressor (por exemplo, corticosteroides, rituxano ou ciclosporina) conatualmente com o tratamento com uma composição inibidora de MASP-2

188 / 394 da presente invenção. Ainda em um aspecto adicional da presente invenção, um sujeito determinado ter um nível reduzido de ADAMTS13 e testando positivo quanto à presença de um inibidor de ADAMTS13 pode ser tratado com ADAMTS13 conatualmente com o tratamento com uma composição inibidora de MASP-2 da presente invenção.

[00343] Ainda em um aspecto adicional da presente invenção, um sujeito sofrendo de TTP pode inicialmente ser tratado com uma composição inibidora de MASP-2 da presente invenção que é administrada através de uma linha de cateter, tal como uma linha de cateter intravenoso ou uma linha de cateter subcutânea, durante um primeiro período de tempo tal como uma hora, doze horas, um dia, dois dias ou três dias. O sujeito pode ser depois tratado durante um segundo período de tempo com a composição inibidora de MASP-2 administrada através de injeções subcutâneas regulares, tais como injeções diárias, bissemanais, semanais, semana sim semana não, mensais ou bimensais.

[00344] Ainda em um aspecto adicional da presente invenção, uma composição inibidora de MASP-2 da presente invenção pode ser administrada a um sujeito sofrendo de HUS na ausência de plasmaférese (isto é, um sujeito cujos sintomas de TTP não foram tratados com plasmaférese e não são tratados com plasmaférese no momento do tratamento com a composição inibidora de MASP-2), para evitar as complicações potenciais da plasmaférese incluindo hemorragia, infecção e exposição aos distúrbios e/ou alergias inerentes no doador de plasma ou em um sujeito de outro modo avesso à plasmaférese ou em um cenário onde a plasmaférese é indisponível.

[00345] Ainda em um aspecto adicional da presente invenção, uma composição inibidora de MASP-2 da presente invenção pode ser administrada a um sujeito sofrendo de TTP coincidente com o tratamento do paciente com plasmaférese. Por exemplo, um sujeito recebendo tratamento de plasmaférese pode depois ser administrado com a composição inibidora de MASP-2

189 / 394 seguindo ou alternando com a troca de plasma.

[00346] Ainda em um aspecto adicional da presente invenção, um sujeito sofrendo de TTP refratária, isto é, sintomas de TTP que não responderam adequadamente a outro tratamento tal como plasmaférese, podem ser tratados com uma composição inibidora de MASP-2 da presente invenção, com ou sem plasmaférese adicional.

[00347] Ainda em um aspecto adicional da presente invenção, um sujeito sofrendo de ou em risco de desenvolver TTP e sendo tratado com uma composição inibidora de MASP-2 da presente invenção pode ser monitorado determinando-se periodicamente, tal como a cada doze horas ou em uma base diária, o nível de pelo menos um fator de complemento, em que a determinação de um nível reduzido do pelo menos um fator de complemento em comparação a um valor padrão ou a um sujeito saudável é indicativo da necessidade quanto ao tratamento continuado com a composição.

[00348] Em regimes tanto profiláticos quanto terapêuticos, as composições compreendendo agentes inibidores de MASP-2 podem ser administradas em diversas dosagens até que um resultado terapêutico suficiente tenha sido obtido no sujeito. Em uma modalidade da invenção, o agente inibidor de MASP-2 compreende um anticorpo anti-MASP-2, que adequadamente pode ser administrado a um paciente adulto (por exemplo, um peso adulto médio de 70 kg) em uma dosagem de 0,1 mg a 10.000 mg, mais adequadamente de 1,0 mg a 5.000 mg, mais adequadamente 10,0 mg a 2.000 mg, mais adequadamente 10,0 mg a 1.000 mg e ainda mais adequadamente de 50,0 mg a 500 mg. Para pacientes pediátricos, a dosagem pode ser ajustada em proporção ao peso do paciente. A aplicação das composições inibidoras de MASP-2 da presente invenção pode ser realizada por uma administração única da composição ou uma sequência limitada de administrações, para o tratamento de TTP. Alternativamente, a composição pode ser administrada em intervalos periódicos, tais como diariamente, bissemanalmente,

190 / 394 semanalmente, semana sim semana não, mensalmente ou bimensalmente, em um período prolongado de tempo para o tratamento de TTP.

[00349] Em algumas modalidades, o sujeito sofrendo de TTP anteriormente passou, ou está atualmente passando por um tratamento com um inibidor de complemento terminal que inibe a clivagem da proteína de complemento C5. Em algumas formas de realização, o método compreende administrar ao indivíduo uma composição da invenção que compreende um inibidor de MASP-3 e opcionalmente um de MASP-2 e administrar ainda ao indivíduo um inibidor de complemento terminal que inibe a clivagem da proteína de complemento C5. Em algumas formas de realização, o inibidor de complemento terminal é um anticorpo anti-C5 humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Em algumas formas de realização, o inibidor de complemento terminal é eculizumab. VI. EXEMPLOS

[00350] Os exemplos que seguem meramente ilustram o melhor modo agora considerado para praticar a invenção, mas não deve ser interpretado como limitando a invenção. Todas as citações da literatura aqui são expressamente incorporadas por referência. Exemplo 1

[00351] Este exemplo descreve a geração de uma cepa de camundongo deficiente em MASP-2 (MASP-2-/-) mas suficiente de MAp19 (MAp19+/+).

[00352] Materiais e Métodos: O vetor alvo pKO-NTKV 1901 foi projetado para romper os três éxons que codificam a extremidade C-terminal de MASP-2 murino, incluindo o éxon que codifica o domínio de serina protease, como mostrado na FIGURA 3. PKO-NTKV 1901 foi usado para transfectar a linhagem celular ES de murino E14,1a (SV129 Ola). Os clones resistentes à neomicina sensíveis à Timidina Cinase foram selecionados. 600 clones ES foram triados e, destes, quatro diferentes clones foram identificados e verificados por Southern blot conter o alvejamento seletivo esperado e o

191 / 394 evento de recombinação como mostrado na FIGURA 3. As quimeras foram geradas a partir destes quatro clones positivos através da transferência de embriões. As quimeras foram depois retrocruzadas no fundo C57/BL6 para criar machos transgênicos. Os machos transgênicos foram cruzados com fêmeas para gerar F1s com 50% da progênie mostrando uma heterozigosidade para o gene de MASP-2 rompido. Os camundongos heterozigóticos foram entrecruzados para gerar progênie deficiente em MASP-2 homozigótica, resultando em camundongos heterozigóticos e do tipo selvagem na razão de 1: 2: 1, respectivamente.

[00353] Resultados e Fenótipo: Os camundongos deficientes em MASP-2-/- homozigóticos resultantes foram verificados ser viáveis e férteis e foram verificados ser deficientes em MASP-2 por Southern blot para confirmar o evento de alvejamento correto, por Northern blot para confirmar a ausência de mRNA de MASP-2 e por Western blot para confirmar a ausência da proteína de MASP-2 (dados não mostrados). A presença de mRNA MAp19 e a ausência de mRNA de MASP-2 foram novamente confirmadas usando RT-PCR resolvida no tempo em uma máquina LightCycler. Os camundongos MASP-2-/- continuam a expressar o mRNA MAp19, MASP-1 e MASP-3 e a proteína como esperado (dados não mostrados). A presença e a abundância de mRNA nos camundongos MASP-2-/- para Properdina, Fator B, Fator D, C4, C2 e C3 foram avaliadas pela análise de LightCycler e verificadas serem idênticas àquela dos controles de ninhada do tipo selvagem (dados não mostrados). O plasma dos camundongos MASP-2-/- homozigóticos é totalmente deficiente daquele mediada pela ativação de complemento do caminho de lectina como também descrito no Exemplo 2.

[00354] Geração de uma cepa MASP-2-/- em um fundo de C57BL6 puro: os camundongos MASP-2-/- foram retrocruzados com uma linhagem C57BL6 pura por nove gerações antes do uso da cepa de MASP-2-/-como um modelo de animal experimental.

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[00355] Uma cepa de camundongo transgênica que é MASP-2-/- de murino, MAp19+/+ e que expressa um transgene do MASP-2 humano (um knock-out em MASP-2 de murino e um knock-in em MASP-2 humana) também foi gerada como segue:

[00356] Materiais e Métodos: Um minigene codificando MASP-2 humana chamado “mini hMASP-2” (SEQ ID NO: 49) como mostrado na FIGURA 4 foi construído, o qual inclui a região promotora do gene da MASP 2 humana, incluindo os primeiros 3 éxons (éxon 1 ao éxon 3) seguido pela sequência de que reapresenta a sequência de codificação dos seguintes 8 éxons, deste modo codificando a proteína MASP-2 de comprimento total conduzida por seu promotor endógeno. O mini construto de hMASP-2 foi injetado nos ovos fertilizados de MASP-2-/- de modo a substituir o gene da MASP 2 de murino deficiente através da MASP-2 humana transgenicamente expressada. Exemplo 2

[00357] Este exemplo demonstra que a MASP-2 é necessária para a ativação de complemento por intermédio do caminho de lectina. Métodos e Materiais: Ensaio de Clivagem de C4 específico do Caminho da Lectina: Um ensaio de clivagem de C4 foi descrito por Petersen, et al., J. Immunol. Methods 257: 107 (2001) que mede a ativação do caminho de lectina que resulta do ácido lipoteicoico (LTA) de S. aureus, que liga L- ficolina. O ensaio descrito por Petersen et al., (2001) foi adaptado para medir a ativação do caminho de lectina por intermédio de MBL revestindo-se a placa com LPS e manana ou zimosana antes de adicionar soro de camundongos MASP-2 -/- como descrito abaixo. O ensaio também foi modificado para remover a possibilidade da clivagem de C4 devido ao caminho clássico. Isto foi obtido através do uso de uma tampão de diluição de amostra contendo 1 M de NaCl, que permite a ligação de alta afinidade dos

193 / 394 componentes de reconhecimento do caminho de lectina ao seus ligantes, mas previne a ativação do C4 endógeno, deste modo excluindo a participação do caminho clássico dissociando-se o complexo de C1. Resumidamente descrito, as amostras de soro de ensaio modificadas (diluídas em sal alto (tampão 1 M de NaCl)) são adicionadas às placas revestidas com ligando, seguido pela adição de uma quantidade constante de C4 purificado em um tampão com uma concentração fisiológica do sal. Os complexos de reconhecimento de ligado contendo MASP-2 clivam o C4, resultando na deposição de C4b. Métodos de Ensaio: 1) As placas de microtitulação Nunc Maxisorb (Maxisorb, Nunc, Cat. No. 442404, Fisher Scientific) foram revestidas com 1 µg/ml de manana (M7504 Sigma) ou qualquer outro ligando (por exemplo, tal como aqueles listados abaixo) diluídos em tampão de revestimento (15 mM de Na2CO3, 35 mM de NaHCO3, pH 9,6).

[00358] Os seguintes reagentes foram usados no ensaio: a. manana (1 µg/poço de manana (M7504 Sigma) em 100 µl de tampão de revestimento): b. zimosana (1 µg/poço de zimosana (Sigma) em 100 µl tampão de revestimento); c. LTA (1µg/poço em 100 µl de tampão de revestimento ou 2 µg/poço em 20 µl de metanol) d. 1 µg do Mab 4H5 específico de H-ficolina no tampão de revestimento e. PSA da Aerococcus viridans (2 µg/poço em 100 µl de tampão de revestimento) f. 100 µl/poço de S. aureus fixado em formalina DSM20233 (OD550 = 0,5) no tampão de revestimento. 2) As placas foram incubadas durante a noite a 4° C. 3) Então, durante a incubação noturna, os sítios de ligação de

194 / 394 proteína residual foram saturados incubando-se as placas com tampão de bloqueio a 0,1% de HSA-TBS (0,1% (p/v) de HSA em 10 mM de Tris-CL, 140 mM de NaCl, 1,5 mM de NaN3, pH 7,4) por 1 a 3 horas, depois lavando as placas 3X com TBS/tween/Ca2+ (TBS com 0,05% de Tween 20 e 5 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, pH 7,4). 4) As amostras de soro a serem testadas foram diluídas no tampão de ligação de MBL (1 M de NaCl) e as amostras diluídas foram adicionadas às placas e incubadas durante a noite a 4° C. os poços recebendo apenas tampão foram usados como controles negativos. 5) Após a incubação durante a noite a 4° C, as placas foram lavadas 3X com TBS/tween/Ca2+. C4 Humana (100 µl/poço de 1 µg/ml diluído em BBS (4 mM de barbital, 145 mM de NaCl, 2 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, pH 7,4)) foi depois adicionada às placas e incubadas por 90 minutos a 37° C. As placas foram novamente lavadas 3X com TBS/tween/Ca2+. 6) A deposição de C4b foi detectada com uma C4c de frango anti-humano conjugado com fosfatase alcalino (diluída 1:1000 em TBS/tween/Ca2+), que foi adicionada às placas e incubadas por 90 minutos na temperatura ambiente. As placas foram então novamente lavadas 3X com TBS/tween/Ca2+. 7) A fosfatase alcalina foi detectada adicionando-se 100 µl de solução de substrato de fosfato de p-nitrofenila, incubando na temperatura ambiente por 20 minutos e lendo a OD405 em um leitor de placas de microtitulação.

[00359] Resultados: AS FIGURAS 5A-B mostram a quantidade da deposição de C4b em manana (FIGURA 5A) e zimosana (FIGURA 5B) nas diluições de soro da MASP-2+/+ (cruzes), MASP-2+/- (círculos fechados) e MASP-2-/- (triângulos fechados). A FIGURA 5C mostra a atividade de C4 convertase relativa nas placas revestidas com zimosana (barras brancas) ou

195 / 394 manana (barras sombreadas) de camundongos MASP-2-/+ (n = 5) e camundongos MASP-2-/- (n = 4) com relação aos camundongos tipo selvagem (n = 5) com base na medição da quantidade de deposição de C4b normalizada para o soro do tipo selvagem. As barras de erro representam o desvio padrão. Como mostrado nas FIGURAS 5A-C, o plasma dos camundongos MASP-2-/- é totalmente deficiente em complemento mediado pela ativação do caminho de lectina em manana e nas placas revestidas com zimosana. Estes resultados demonstram claramente que a MASP-2 é um componente efetor do caminho de lectina. MASP-2 recombinante reconstitui a ativação no soro de C4 dependente do caminho da lectina dos camundongos MASP-2-/-

[00360] De modo a estabelecer que a ausência de MASP-2 foi a causa direta da perda da ativação de C4 dependente do caminho de lectina nos camundongos MASP-2-/-, o efeito de adicionar a proteína MASP-2 recombinante às amostras de soro foi examinado no ensaio de clivagem C4 descrito acima. A MASP-2 de murino funcionalmente ativa e MASP-2A de murino cataliticamente inativa (em que o resíduo de serina de sítio ativo no domínio de serina protease foi substituído pelo resíduo de alanina) as proteínas recombinantes foram produzidas e purificadas como descrito abaixo no Exemplo 3. Soro reunido de 4 camundongos MASP-2 -/- foi pré-incubado com concentrações crescentes de proteína de MASP-2 de murino recombinante ou MASP-2A inativo de murino recombinante e a atividade de C4 convertase foi ensaiada como descrito acima.

[00361] Resultados: Como mostrado na FIGURA 6, a adição de proteína MASP-2 de murino recombinante funcionalmente ativa (mostrada como triângulos abertos) ao soro obtido dos camundongos MASP-2 -/- restauraram a ativação de C4 dependente do caminho de lectina em uma maneira dependente da concentração de proteína, considerando que a proteína MASP-2A de murino cataliticamente inativa (mostrada como estrelas) não

196 / 394 restaura a ativação de C4. Os resultados mostrados na FIGURA 6 são normalizados para a ativação de C4 observada com soro reunido de camundongo do tipo selvagem (mostrado como uma linha pontilhada). Exemplo 3

[00362] Este exemplo descreve a expressão recombinante e a produção de proteínas de MASP-2 humana, de rato e murino de comprimento total, os polipeptídeos derivados de MASP-2 e formas mutantes cataliticamente inativadas de MASP-2 Expressão da MASP-2 humana, de murino e ratos de comprimento total:

[00363] A sequência de cDNA de comprimento total da MASP-2 humana (SEQ ID NO: 4) também foi subclonada no vetor de expressão mamífero pCI-Neo (Promega), que conduz a expressão eucariótica sob o controle da região intensificadora/promotora de CMV (descrita em Kaufman R.J. et al., Nucleic Acids Research 19: 4485-90, 1991; Kaufman, Methods in Enzymology, 185: 537-66 (1991)). O cDNA de camundongo de comprimento total (SEQ ID NO: 50) e o cDNA de MASP-2 de ratos (SEQ ID NO: 53) foram cada um subclonados no vetor de expressão de pED. Os vetores de expressão de MASP-2 foram depois transfectados na linhagem celular aderente do ovário de hamster chinês DXB1 usando o procedimento de transfecção de fosfato de cálcio padrão descrito em Maniatis et al., 1989. As células transfectadas com estes construtos crescem muito lentamente, implicando em que a protease codificada é citotóxica.

[00364] Em um outro método, o construto de minigene (SEQ ID NO: 49) contendo o cDNA humano de MASP-2 conduzido pelo seu promotor endógeno é transitoriamente transfectado em células ovarianas de hamster chinês (CHO). A proteína MASP-2 humana é secretada no meio de cultura e isolada como descrito abaixo. Expressão da MASP-2 cataliticamente ativa de comprimento total:

[00365] Raciocínio: A MASP-2 é ativada pela clivagem autocatalítica

197 / 394 depois dos subcomponentes de reconhecimento de MBL ou ficolinas (L- ficolina, H-ficolina ou M-ficolina) ligarem aos seus respectivos padrões de carboidrato. A clivagem autocatalítica que resulta na ativação de MASP-2 frequentemente ocorre durante o procedimento de isolação de MASP-2 do soro ou durante a purificação após a expressão recombinante. De modo a obter uma preparação de proteína mais estável para o uso como um antígeno, uma forma cataliticamente inativa de MASP-2, projetada como MASP-2A foi criada substituindo-se o resíduo de serina que é apresentado na tríade catalítica do domínio de protease com um resíduo de alanina em ratos (SEQ ID NO: 55 Ser617 a Ala617); em camundongos (SEQ ID NO: 52 Ser617 a Ala617); ou em seres humanos (SEQ ID NO: 3 Ser618 a Ala618).

[00366] De modo a gerar proteínas MASP-2A humanas e de murino cataliticamente inativas, a mutagênese locodirigida foi realizada usando os oligonucleotídeos mostrados na TABELA 5.

[00367] Os oligonucleotídeos na TABELA 5 foram projetados para anelar à região do cDNA humano e de murino codificando a serina enzimaticamente ativa e o oligonucleotídeo contém um mal emparelhamento de modo a mudar o códon de serina em um códon de alanina. Por exemplo, os oligonucleotídeos de PCR SEQ ID NOS: 56 a 59 foram usados em combinação com o cDNA da MASP-2 humana (SEQ ID NO: 4) para amplificar a região do início do códon para a serina enzimaticamente ativa e da serina para o códon de parada para gerar a leitura aberta completa da MASP-2A mutada contendo a mutação de Ser618 para Ala618. Os produtos de PCR foram purificados e depois a eletroforese por eletroforese em gel e preparação de faixa e sobreposições de adenosina únicas foram geradas usando um procedimento de formação de causa padrão. A MASP-2A com cauda de adenosina foi depois clonada dentro do vetor pGEM-T easy, transformado na E. coli.

[00368] Uma proteína MASP-2A de rato cataliticamente inativa foi

198 / 394 gerada by kinasing e anelando-se a SEQ ID NO: 64 e SEQ ID NO: 65 combinando-se estes dois oligonucleotídeos em quantidades molares iguais, aquecendo a 100° C por 2 minutos e diminuindo lentamente até a temperatura ambiente. O fragmento anelado resultante tem terminações compatíveis Pst1 e Xba1 e foi inserido no lugar do fragmento de Pst1-Xba1 do cDNA de MASP- 2 de rato de tipo selvagem (SEQ ID NO: 53) para gerar MASP-2A de rato. 5’GAGGTGACGCAGGAGGGGCATTAGTGTTT 3’ (SEQ ID NO: 64) 5’CTAGAAACACTAATGCCCCTCCTGCGTCACCTCTGC A 3’ (SEQ ID NO: 65)

[00369] A MASP-2A humana, murino e de ratos foram cada uma subclonadas no vetor de expressão mamíferos pED ou pCI-Neo e transfectadas na linhagem celular do ovário DXB1 de hamster chinês como descrito abaixo.

[00370] Em um outro método, uma forma cataliticamente inativa de MASP-2 é construída usando o método descrito em Chen et al., J. Biol. Chem., 276(28): 25894-25902, 2001. Em resumo, o plasmídeo contendo o cDNA humano de MASP-2 de comprimento total (descrito em Thiel et al., Nature 386: 506, 1997) é digerido com Xho1 e EcoR1 e o cDNA da MASP-2 (aqui descrito como SEQ ID NO: 4) é clonado nos sítios de restrição correspondentes do vetor de transferência de baculovírus pFastBac1 (Life Technologies, NI). O sítio ativo de serina protease da MASP-2 na Ser618 é depois alterado para Ala618 substituindo-se os oligonucleotídeos de filamento duplo codificando o aminoácido de região de peptídeos 610 a 625 (SEQ ID NO: 13) com os aminoácidos de região nativa de 610 a 625 para criar um polipeptídeo de MASP-2 de comprimento total com um domínio de protease inativo. Construção das Regiões de Polipeptídeo Contendo Plasmídeos de Expressão.

[00371] Depois os construtos são produzidos usando o peptídeo de

199 / 394 sinal MASP-2 (os resíduos de 1 a 15 da SEQ ID NO: 5) para secretar vários domínios de MASP-2. Um construto expressando o domínio de CUBI da MASP-2 humana (SEQ ID NO: 8) é feito através da amplificação de PCR da região que codifica os resíduos de 1 a 121 de MASP-2 (SEQ ID NO: 6) (correspondendo ao domínio de CUB1 N-terminal). Um construto expressando o domínio CUBIEGF da MASP-2 humana (SEQ ID NO: 9) é feito através do PCR que amplifica a região que codifica os resíduos de 1 a 166 de MASP-2 (SEQ ID NO: 6) (correspondendo ao domínio de CUB1EGF N-terminal). Um construto que expressa o domínio CUBIEGFCUBII da MASP-2 humana (SEQ ID NO: 10) é feito através do PCR que amplifica a região codificando os resíduos de 1 a 293 de MASP-2 (SEQ ID NO: 6) (correspondendo ao N- domínio CUBIEGFCUBII terminal). Os domínios acima mencionados são amplificados usando-se PCR usando a VentR polimerase e pBS-MASP-2 como um modelo, de acordo com os métodos de PCR estabelecidos.

A sequência iniciadora 5’ do iniciador de sentido (5’- CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC-3’ SEQ ID NO: 34) introduz um sítio de restrição BamHI (sublinhado) na terminação 5’ dos produtos de PCR.

Os iniciadores de antissentido para cada um dos domínios de MASP-2, mostrados abaixo na TABELA 5, são projetados para introduzir um códon de parada (tipo negrito) seguido por um sítio de EcoRI (sublinhado) da extremidade de cada produto de PCR.

Uma vez amplificados, os fragmentos de DNA são digeridos com BamHI e EcoRI e clonados nos sítios correspondentes do vetor de pFastBac1. Os construtos resultantes são distinguidos pelo mapeamento de restrição e confirmados pelo sequenciamento de dsDNA.

TABELA 5: INICIADORES DE PCR DE MASP-2 Domínio de MASP-2 Iniciador PCR 5’ Iniciador PCR 3’ SEQ ID NO: 8 5’CGGGATCCATGAGGCTGCT 5’GGAATTCCTAGGCTGCAT CUBI (aa 1–121 da SEQ ID NO: 6) GACCCTC-3’ (SEQ ID NO: 34) A (SEQ ID NO: 35) SEQ ID NO: 9 5’CGGGATCCATGAGGCTGCT 5’GGAATTCCTACAGGGCGC CUBIEGF (aa 1–166 da SEQ ID NO: 6) GACCCTC-3’ (SEQ ID NO: 34) T-3’ (SEQ ID NO: 36)

200 / 394 Domínio de MASP-2 Iniciador PCR 5’ Iniciador PCR 3’ SEQ ID NO: 10 5’CGGGATCCATGAGGCTGCT 5’GGAATTCCTAGTAGTGGA CUBIEGFCUBII (aa 1-293 da SEQ ID GACCCTC-3’ (SEQ ID NO: 34) T 3’ (SEQ ID NO: 37) NO: 6) SEQ ID NO: 4 5’ATGAGGCTGCTGACCCTCC 5’TTAAAATCACTAATTATG MASP-2 humana TGGGCCTTC 3’ (SEQ ID NO: TTCTCGATC 3’ (SEQ ID NO: 56) hMASP-2_forward 59) hMASP-2_reverse SEQ ID NO: 4 5’CAGAGGTGACGCAGGAGG 5’GTGCCCCTCCTGCGTCAC cDNA da MASP-2 humana GGCAC 3’ (SEQ ID NO: 58) CTCTG 3’ (SEQ ID NO: 57) hMASP-2_ala_avançada hMASP-2_ala_reversa SEQ ID NO: 50 5’ATGAGGCTACTCATCTTCC 5’TTAGAAATTACTTATTAT cDNA de MASP-2 Murino TGG3’ (SEQ ID NO: 60) GTTCTCAATCC3’ (SEQ ID mMASP-2_avançada NO: 63) mMASP-2_reversa SEQ ID NO: 50 5’CCCCCCCTGCGTCACCTCT 5’CTGCAGAGGTGACGCAGG cDNA de MASP-2 Murino GCAG3’ (SEQ ID NO: 62) GGGGG 3’ (SEQ ID NO: 61) mMASP-2_ala_ avançada mMASP-2_ala_reversa Expressão eucariótica recombinante de MASP-2 e produção de proteínas de MASP-2A humana, de camundongo e rato enzimaticamente inativas.

[00372] Os construtos de expressão de MASP-2 e MASP-2A descritos acima foram transfectados em células DXB1 usando o procedimento de transfecção de fosfato de cálcio padrão (Maniatis et al., 1989). A MASP-2A foi produzida em um meio isento de soro para garantir que as preparações não fossem contaminadas com outras proteínas do soro. O meio foi coletado das células confluentes a cada segundo dia (quatro vezes no total). O nível de MASP-2A recombinante foi uma média de aproximadamente 1,5 mg/litro de meio de cultura para cada uma das três espécies.

[00373] Purificação da proteína MASP-2A: A MASP-2A (mutante de Ser-Ala descrita acima) foi purificada por cromatografia de afinidade em colunas de MBP-A-agarose. Esta estratégia permitiu a purificação rápida sem o uso de etiquetas estranhas. A MASP-2A (100 a 200 ml de meio diluído com um volume igual de tampão de carga (50 mM de Tris-Cl, pH 7,5, contendo 150 mM de NaCl e 25 mM de CaCl2) foi carregada em uma coluna de afinidade de MBP-agarose (4 ml) pré-equilibrada com 10 ml de tampão de carga. Após a lavagem com outros 10 ml de tampão de carga, a proteína foi eluída em frações de 1 ml com 50 mM de Tris-Cl, pH 7,5, contendo 1,25 M de NaCl e 10 mM de EDTA. As frações contendo a MASP-2A foram identificadas pela eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida. Onde

201 / 394 necessário, a MASP-2A foi novamente purificada através da cromatografia de troca de íons em uma coluna MonoQ (HR 5/5). A proteína foi dialisada com 50 mM de Tris-Cl pH 7,5, contendo 50 mM de NaCl e carregada na coluna equilibrada no mesmo tampão. Após a lavagem, o MASP-2A ligado foi eluído com um gradiente de NaCl de 0,05 a 1 M em 10 ml.

[00374] Resultados: Os rendimentos de 0,25 a 0,5 mg de proteína MASP-2A foram obtidos a partir de 200 ml de meio. A massa molecular de 77,5 kDa determinada por MALDI-MS é maior do que o valor calculado do polipeptídeo não modificado (73,5 kDa) devido à glicosilação. A ligação dos glicanos a cada um dos sítios de N-glicosilação conta para a massa observada. A MASP-2A migra como uma faixa única nos géis de poliacrilamida de SDS, demonstrando que esta não é proteoliticamente processada durante a biossíntese. A massa molecular média em peso determinada pela ultracentrifugação de equilíbrio está em concordância com o valor calculado para os homodímeros do polipeptídeo glicosilado.

[00375] Um outro método para produzir os polipeptídeos derivados de MASP-2 e MASP2A recombinantes é descrito em Thielens, N.M., et al., J. Immunol. 166: 5068-5077, 2001. Em resumo, as células do inseto Spodoptera frugiperda (células Sf9 de Placa-Pronta obtidas da Novagen, Madison, WI) são cultivadas e mantidas em um meio isento de soro Sf900II (Life Technologies) suplementado com 50 IU/ml de penicilina e 50 mg/ml de estreptomicina (Life Technologies). As células de insetos Trichoplusia ni (High Five) (providas pela Jadwiga Chroboczek, Institut de Biologie Structurale, Grenoble, França) são mantidas em um meio TC100 (Life Technologies) contendo 10% de FCS (Dominique Dutscher, Brumath, França) suplementado com 50 IU/ml de penicilina e 50 mg/ml de estreptomicina. Os baculovírus recombinantes são gerados usando o sistema de Bac-para-Bac (Life Technologies). O DNA de bacmídeo é purificado usando o sistema de purificação midiprep Qiagen (Qiagen) e é usado para

202 / 394 transfectar as células de insetos Sf9 usando Cellfectin em um meio SFM Sf900 II (Life Technologies) como descrito no protocolo do fabricante. As partículas de vírus recombinantes são coletadas 4 dias depois, tituladas pelo ensaio de placa viral e amplificadas como descrito por King e Possee, no The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, Chapman and Hall Ltd., Londres, pp. 111-114, 1992.

[00376] As células High Five (frascos de cultura tissular de 1,75 x 107 células/175-cm2) são infectadas com os vírus recombinantes contendo os polipeptídeos de MASP-2 em uma multiplicidade de infecção de 2 em um meio de SFM Sf900 II a 28° C por 96 h. Os sobrenadantes são coletados por centrifugação e fosforofluoridato de diisopropila é adicionado até uma concentração final de 1 mM.

[00377] Os polipeptídeos de MASP-2 são secretados no meio de cultura. Os sobrenadantes de cultura são dialisados contra 50 mM de NaCl, 1 mM de CaCl2, 50 mM de cloridreto de trietanolamina, pH 8,1 e carregados a 1,5 ml/min em uma Coluna de Fluxo Rápido de Q-Sefarose (Amersham Pharmacia Biotech) (2,8 x 12 cm) equilibrada no mesmo tampão. A eluição é conduzida aplicando-se 1,2 litros de gradiente linear a 350 mM de NaCl no mesmo tampão. As frações contendo os polipeptídeos de MASP-2 recombinantes são identificados através da análise de Western blot, precipitadas através da adição de (NH4)2SO4 até 60% (p/v) e deixadas durante a noite a 4° C. As pelotas são recolocadas em suspensão em 145 mM de NaCl, 1 mM de CaCl2, 50 mM de cloridreto de trietanolamina, pH 7,4 e aplicadas em uma coluna de TSK G3000 SWG (7,5 x 600 mm) (Tosohaas, Montgomeryville, PA) equilibrada no mesmo tampão. Os polipeptídeos purificados são depois concentrados até 0,3 mg/ml através da ultrafiltração em microconcentradores Microsep (corte pelo peso molecular = 10+000) (Filtron, Karlstein, Alemanha). Exemplo 4

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[00378] Este exemplo descreve um método de produzir anticorpos policlonais contra os polipeptídeos de MASP-2. Materiais e Métodos: Antígenos de MASP-2: O antissoro anti-MASP-2 humana policlonal é produzido imunizando-se coelhos com os seguintes polipeptídeos de MASP-2 isolados: MASP-2 humana (SEQ ID NO: 6) isolada do soro; MASP-2 humana recombinante (SEQ ID NO: 6), MASP-2A contendo o domínio de protease inativo (SEQ ID NO: 13), como descrito no Exemplo 3; e CUBI recombinante (SEQ ID NO: 8), CUBEGFI (SEQ ID NO: 9) e CUBEGFCUBII (SEQ ID NO: 10) expressado como descrito acima no Exemplo 3.

[00379] Anticorpos policlonais: Coelhos com seis semanas de idade, iniciados com BCG (vacina do bacilo de Calmette-Guerin) são imunizados injetando-se 100 μg de polipeptídeo MASP-2 a 100 μg/ml em solução salina estéril. As injeções são feitas a cada 4 semanas, com titulador de anticorpo monitorado por ensaio de ELISA como descrito no Exemplo 5. Os sobrenadantes de cultura são coletados para a purificação do anticorpo cromatografia de afinidade em proteína A. Exemplo 5

[00380] Este exemplo descreve um método para produzir anticorpos monoclonais de murino contra polipeptídeos de MASP-2 de ratos ou humana. Materiais e Métodos:

[00381] Camundongos A/J machos (Harlan, Houston, Tex.), 8 a 12 semanas de idade, são injetados subcutaneamente com 100 μg de polipeptídeos de rMASP-2 ou rMASP-2A humana ou de ratos (feitos como descrito no Exemplo 3) em adjuvante de Freund completo (Difco Laboratories, Detroit, Mich.) em 200 μl de solução salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7,4. Em intervalos de duas semanas, os camundongos foram duas vezes injetados subcutaneamente com 50 μg de polipeptídeo de rMASP-

204 / 394 2 ou rMASP-2A humana ou de ratos em adjuvante de Freund incompleto. Na quarta semana, os camundongos são injetados com 50 μg de polipeptídeo de rMASP-2 ou rMASP-2A humana ou de ratos em PBS e são fundidos 4 dias depois.

[00382] Para cada fusão, as suspensões de célula única são preparadas do baço de um camundongo imunizado e usadas para a fusão com as células do mieloma Sp2/0. 5 x 108 de Sp2/0 e 5x108 células do baço são fundidas em um meio contendo 50% de polietileno glicol (M.W. 1450) (Kodak, Rochester, N.I.) e 5% de sulfóxido de dimetila (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.). As células são depois ajustadas até uma concentração de 1,5 x 105 células do baço por 200 μl da suspensão em um meio de Iscove (Gibco, Grand Island, N.I.), suplementado com 10% de soro bovino fetal, 100 unidades/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina, 0,1 mM de hipoxantina, 0,4 μM de aminopterina e 16 μM de timidina. Duzentos microlitros da suspensão celular são adicionados a cada poço de cerca de vinte placas de microcultura de 96 poços. Depois de cerca de dez dias, os sobrenadantes de cultura são retirados par triagem quanto a reatividade com fator de MASP-2 purificado em um ensaio ELISA.

[00383] Ensaio ELISA: A placas de microteste com poços de Immulon 2 (Dynatech Laboratories, Chantilly, Va.) são revestidas adicionando-se 50 μl de hMASP-2 purificado a 50 ng/ml ou rMASP-2 de rato (ou rMASP-2A) durante a noite na temperatura ambiente. A baixa concentração de MASP-2 para revestimento permite a seleção de anticorpos de alta afinidade. Depois da solução de revestimento ser removida agitando-se a placa, 200 μl de BLOTTO (leite seco não gorduroso) em PBS foram adicionados a cada poço por uma hora para bloquear os sítios não específicos. Uma hora mais tarde, os poços são depois lavados com um tampão de PBST (PBS contendo 0,05% de Tween 20). Cinquenta microlitros de sobrenadantes de cultura de cada poço de fusão são coletados e misturados com 50 μl de

205 / 394 BLOTTO e depois adicionados aos poços individuais das placas de microteste. Depois de uma hora de incubação, os poços são lavados com PBST. Os anticorpos de murino ligados são depois detectados através da reação com IgG de cabra anticamundongo (específico de Fc) conjugado com peroxidase de rábano-silvestre (HRP) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Pa.) e diluídos a 1:2.000 em BLOTTO. A solução de substrato de peroxidase contendo 0,1% de 3,3,5,5 tetrametil benzidina (Sigma, St. Louis, Mo.) e 0,0003% de peróxido de hidrogênio (Sigma) é adicionada aos poços para o desenvolvimento da cor por 30 minutos. A reação é terminada através da adição de 50 μl de 2M de H2SO4 por poço. A Densidade Óptica a 450 nm da mistura de reação é lida com um leitor de ELISA BioTek (BioTek Instruments, Winooski, Vt.). Ensaio de Ligação de MASP-2: Os sobrenadantes de cultura que testam positivo no ensaio de ELISA de MASP-2 descrito acima podem ser testados em um ensaio de ligação para determinar a afinidade de ligação que os agentes inibidores de MASP-2 têm para MASP-2. Um ensaio similar também pode ser usado para determinar se os agentes inibidores se ligam a outros antígenos no sistema de complemento.

[00384] Os poços da placa microtituladora de poliestireno (placas de ligação de meio de 96 poços, Corning Costar, Cambridge, MA) são revestidos com MASP-2 (20 ng/100 μl/poço, Advanced Research Technology, San Diego, CA) em solução salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7,4 durante a noite a 4 ºC. Depois de aspirar a solução de MASP-2, os poços são bloqueados com PBS contendo 1% de albumina sérica bovina (BSA; Sigma Chemical) por 2 h na temperatura ambiente. Os poços sem revestimento com MASP-2 servem como os controles de fundo. As alíquotas de sobrenadantes de hibridoma ou MoAbs anti-MASP-2 purificados, nas concentrações variáveis em solução de bloqueio, são adicionados aos poços. A seguir de uma incubação de 2 h na temperatura ambiente, os poços são extensivamente

206 / 394 enxaguados com PBS. MoAb anti-MASP-2 ligado a MASP-2 é detectado pela adição de IgG de cabra anticamundongo conjugada à peroxidase (Sigma Química) em solução de bloqueio, que é deixada incubar por 1 h na temperatura ambiente. A placa é enxaguada mais uma vez cuidadosamente com PBS, e 100 μl de substrato de 3,3’,5,5’-tetrametil benzidina (TMB) (Kirkegaard e Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) é adicionado. A reação de TMB é extinta pela adição de 100 μl de ácido fosfórico 1 M, e a placa é lida a 450 nm em uma leitora de microplaca (SPECTRA MAX 250, Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

[00385] Os sobrenadantes de cultura dos poços positivos são depois testados quanto à capacidade para inibir a ativação de complemento em um ensaio funcional tal como o ensaio de clivagem C4 como descrito no Exemplo

2. As células nos poços positivos são depois clonadas pela diluição limitante. Os MoAbs são testados mais uma vez quanto à reatividade com hMASP-2 em um ensaio de ELISA como descrito acima. Os hibridomas selecionados são cultivados em frascos giratórios e o sobrenadante de cultura gasto coletado para a purificação de anticorpo pela cromatografia de afinidade em proteína A. Exemplo 6

[00386] Este exemplo descreve a geração e produção de anticorpos e fragmentos de anticorpos anti-MASP-2s de murino humanizados.

[00387] Um anticorpo monoclonal anti-MASP-2 murino é gerado em camundongos machos A/J como descrito no Exemplo 5. O anticorpo murino é depois humanizado como descrito abaixo para reduzir sua imunogenicidade substituindo-se as regiões constantes de murino com suas contrapartes humanas para gerar um IgG quimérico e fragmento de Fab do anticorpo, que é útil para inibir os efeitos adversos da ativação de complemento dependente de MASP-2 em sujeito humanos de acordo com a presente invenção.

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[00388] 1. Clonagem dos genes da região variável de anti-MASP-2 a partir das células de hibridoma de murinos. O RNA total é isolado das células de hibridoma secretando MoAb anti-MASP-2 (obtida como descrito no Exemplo 7) usando RNAzol seguindo o protocolo do fabricante (Biotech, Houston, Tex.). O primeiro filamento de cDNA é sintetizado a partir do RNA total usando oligo dT como o iniciador. PCR é realizado usando os iniciadores 3’ derivados da região C constante de imunoglobulina e derivados de conjuntos de iniciadores degenerados do peptídeo líder ou a primeira região de estrutura dos genes VH ou VK de murino como os iniciadores 5’. O PCR ancorado é realizado como descrito por Chen and Platsucas (Chen, P.F., Scand. J. Immunol. 35: 539-549, 1992). Para clonar o gene VK, o cDNA de filamento duplo é preparado usando um iniciador Notl-MAK1 (5’- TGCGGCCGCTGTAGGTGCTGTCTTT-3’ SEQ ID NO: 38). Os adaptadores anelados AD1 (5’-GGAATTCACTCGTTATTCTCGGA-3’ SEQ ID NO: 39) e AD2 (5’-TCCGAGAATAACGAGTG-3’ SEQ ID NO: 40) são ligados tanto aos terminais 5’ quanto 3’ do cDNA de filamento duplo. Os adaptadores nas terminações 3’ são removidos pela digestão de Notl. O produto digerido é depois usado como o modelo em PCR com o oligonucleotídeo de AD1 como o iniciador 5’ e MAK2 (5’- CATTGAAAGCTTTGGGGTAGAAGTTGTTC-3’ SEQ ID NO: 41) como o iniciador 3’. Os fragmentos de DNA de aproximadamente 500 pares de base são clonados em pUC19. Vários clones são selecionados para a análise de sequência para verificar que a sequência clonada abrange a região constante de imunoglobulina de murino esperada. Os oligonucleotídeos Not1-MAK1 e MAK2 são derivados da região VK e são 182 e 84 pares de base, respectivamente, à jusante do primeiro par de base do gene capa C. Os clones são escolhidos os quais incluem a VK completa e o peptídeo líder.

[00389] Para clonar o gene VH, o cDNA de filamento duplo é preparado usando o iniciador Not1 MAG1 (5’-

208 / 394 CGCGGCCGCAGCTGCTCAGAGT GTAGA-3’ SEQ ID NO: 42). Os adaptadores anelados AD1 e AD2 são ligados tanto ao terminal 5’ quanto ao terminal 3’ do cDNA de filamento duplo. Os adaptadores nas terminações 3’ são removidos pela digestão de Notl. Os produtos digeridos são usados como o modelo em PCR com o oligonucleotídeo de AD1 e MAG2 (5’- CGGTAAGCTTCACTGGCTCAGGGAAATA-3’ SEQ ID NO: 43) como iniciadores. Os fragmentos de DNA de 500 a 600 pares de base de comprimento são clonados em pUC19. Os oligonucleotídeos Notl-MAG1 e MAG2 são derivados da região Cγ,7,1 de murino e são de 180 e 93 pares de base, respectivamente, à jusante do primeiro par de base do gene Cγ,7,1 murino. Os clones são escolhidos, os quais abrangem o VH completo e o peptídeo líder.

[00390] 2. Construção dos Vetores de Expressão para o IgG de MASP-2 quimérico e Fab. Os genes VH e VK clonados descritos acima são usados como modelos em uma reação de PCR para adicionar a sequência de consenso de Kozak à terminação 5’ e o doador de junção à terminação 3’ da sequência de nucleotídeos. Depois das sequências serem analisadas para confirmar a ausência de erros de PCR, os genes VH e VK genes são inseridos nos cassetes do vetor de expressão contendo C.γ1 e C. capa humanos respectivamente, para fornecer pSV2neoVH-huCγ1 e pSV2neoV-huCγ. Os DNAs de plasmídeo purificados com gradiente de CsCl dos vetores de cadeia pesada e leve são usados para transfectar as células de COS através da eletroporação. Depois de 48 horas, o sobrenadante de cultura é testado por ELISA para confirmar a presença de aproximadamente 200 ng/ml de IgG quimérico. As células são coletadas e o RNA total é preparado. Primeiro, o filamento do cDNA é sintetizado do RNA total usando oligo dT como o iniciador. Este cDNA é usado como o modelo em PCR para gerar os fragmentos de DNA Fd e capa. Para o gene Fd, o PCR é realizado usando 5’- AAGAAGCTTGCCGCCACCATGGATTGGCTGTGGAACT-3’ (SEQ ID

209 / 394 NO: 44) como o iniciador 5’ e um iniciador 3’ derivado de CH1 (5’- CGGGATCCTCAAACTTTCTTGTCCACCTTGG-3’ SEQ ID NO: 45). A sequência de DNA é confirmada conter a VH completa e o domínio CH1 o IgG1 humano. Depois da digestão com as enzimas apropriadas, os fragmentos Fd de DNA são inseridos nos sítios de restrição de HindIII e BamHI do cassete do vetor de expressão pSV2dhfr-TUS para fornecer pSV2dhfrFd. O plasmídeo pSV2 é comercialmente disponível e consiste dos segmentos de DNA de várias fontes: o DNA pBR322 (linha fina) contém a origem pBR322 da replicação de DNA (pBR ori) e o gene de resistência à ampicilina lactamase (Amp); DNA SV40, representado pelo pela incubação mais ampla e notada, contém a origem SV40 da replicação de DNA (SV40 ori), promotor precoce (5’ dos genes dhfr e neo) e sinal de poliadenilação (3’ para o dhfr e neo genes). O sinal de poliadenilação (pA) derivado de SV40 também é colocado na terminação 3’ do gene Fd gene.

[00391] Para o gene capa, a PCR é realizada usando 5’- AAGAAAGCTTGCCGCCACCATGTTCTCACTAGCTCT-3’ (SEQ ID NO: 46) como o iniciador 5’ e um iniciador 3’ derivado de CK (5’- CGGGATCCTTCTCCCTCTAACACTCT-3’ SEQ ID NO: 47). A sequência de DNA é confirmada conter as regiões VK e CK humanas completas. Depois da digestão com as enzimas de restrição apropriadas, os fragmentos capa de DNA são inseridos nos sítios de restrição HindIII e BamHI do cassete do vetor de expressão pSV2neo-TUS para fornecer pSV2neoK. A expressão dos genes tanto Fd quanto capa são conduzidas pelos elementos intensificadores e promotores derivados de HCMV. Visto que o gene Fd não inclui o resíduo de aminoácido cisteína envolvido na ligação de dissulfeto intercadeias, este Fab quimérico recombinante contém cadeias pesadas e leves não covalentemente ligadas. Este Fab quimérico é indicado como cFab.

[00392] Para obter o Fab recombinante com uma ligação de dissulfeto de intercadeia leve e pesada, o gene Fd acima pode ser estendido para incluir

210 / 394 a sequência de codificação para 9 aminoácidos adicionais (EPKSCDKTH SEQ ID NO: 48) da região de dobradiça do IgG1 humano. O segmento de DNA BstEII-BamHI codificando os 30 aminoácidos na terminação 3’ do gene Fd pode ser substituído com segmentos de DNA codificando o Fd estendido, resultando em pSV2dhfrFd/9aa.

3. Expressão e Purificação de IgG Anti-MASP-2 Quimérico

[00393] Para gerar linhagens celulares que secretam IgG anti-MASP-2 quimérico, as células de NSO são transfectadas com os DNAs de plasmídeo purificados de pSV2neoVH-huC.γ1 e pSV2neoV-huC capa através da eletroporação. As células transfectadas são selecionadas na presença de 0,7 mg/ml G418. As células são cultivadas em um frasco giratório de 250 ml usando um meio contendo soro.

[00394] O sobrenadante de cultura de 100 ml da cultura giratória é carregado em uma coluna PROSEP-A de 10 ml (Bioprocessing, Inc., Princeton, N.J.). A coluna é lavada com 10 volumes de leito de PBS. O anticorpo ligado é eluído com 50 mM de tampão de citrato, pH 3,0. Um volume igual de 1 M de Hepes, pH 8,0 é adicionado à fração contendo o anticorpo purificado para ajustar o pH até 7,0. Os sais residuais são removidos através da troca de tampão com PBS através da ultrafiltração de membrana Millipore (Corte pelo peso molecular: 3.000). A concentração da proteína do anticorpo purificado é determinada pelo método de BCA (Pierce).

4. Expressão e purificação do Fab anti-MASP-2 quimérico

[00395] Para gerar linhagens celulares que secretam Fab anti-MASP-2 quiméricos, as células CHO são transfectadas com DNAs de plasmídeos purificados de pSV2dhfrFd (ou pSV2dhfrFd/9aa) e pSV2neocapa, através da eletroporação. As células transfectadas são selecionadas na presença de G418 e metotrexato. As linhagens celulares selecionadas são amplificadas em concentrações crescentes de metotrexato. As células são subclonadas com célula única limitando-se a diluição. As linhagens celulares subclonadas de

211 / 394 célula única de alta produção são depois cultivadas em 100 ml de cultura giratória usando o meio isento de soro.

[00396] O Fab anti-MASP-2 quimérico é purificado através da cromatografia de afinidade usando um camundongo anti-idiotípico MoAb para o MoAb MASP-2. Um MoAb MASP-2 anti-idiotípico pode ser feito imunizando-se os camundongos com um MoAb anti-MASP-2 de murino conjugado com hemocianina do lapa buraco de fechadura (KLH) e triagem quanto a ligação de MoAb específica que pode ser competida com a MASP-2 humana. Para a purificação, 100 ml de sobrenadante das culturas giratórias das células de CHO produzindo cFab ou cFab/9aa são carregados na coluna de afinidade ligada com um MoAb de MASP-2 anti-idiotípico. A coluna é então lavada completamente com PBS antes do Fab ligado ser eluído com 50 mM de dietilamina, pH 11,5. Os dais residuais são removidos através da troca de tampão como descrito acima. A concentração de proteína do Fab purificado é determinada pelo método de BCA método (Pierce).

[00397] A capacidade do IgG, cFab e cFAb/9aa de MASP-2 quimérico de inibir os caminhos de complemento dependentes de MASP-2- pode ser determinada através do uso dos ensaios inibidores descritos no Exemplo 2 ou Exemplo 7. Exemplo 7

[00398] Este exemplo descreve um ensaio de clivagem de C4 in vitro usado como uma triagem funcional para identificar agentes inibidores de MASP-2 capazes de bloquear a ativação de complemento dependente de MASP-2 por intermédio da L-ficolina/P35, H-ficolina, M-ficolina ou manana.

[00399] Ensaio de clivagem de C4: Um ensaio de clivagem de C4 foi descrito por Petersen, S. V., et al., J. Immunol. Methods 257: 107, 2001, que mediu a ativação do caminho de lectina que resulta do ácido lipoteicoico (LTA) da S. aureus, que liga a L-ficolina.

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[00400] Reagentes: A S. aureus fixada em formalina (DSM20233) é preparada como segue: as bactérias são cultivadas durante a noite a 37 ºC em meio de soja sangue tríptico, lavadas três vezes com PBS, depois fixadas por 1 h na temperatura ambiente em PBS/0,5% de formalina, e lavadas três vezes mais com PBS, antes de serem recolocadas em suspensão em tampão de revestimento (15 mM de Na2CO3, 35 mM de NaHCO3, pH 9,6).

[00401] Ensaio: Os poços de uma placa microtituladora Nunc MaxiSorb (Nalgene Nunc International, Rochester, NY) são revestidos com: 100 μl de S. aureus fixada em formalina DSM20233 (OD550 = 0,5) em tampão de revestimento com 1 µg de L-ficolina em tampão de revestimento. Depois da incubação durante a noite, os poços são bloqueados com 0,1% de albumina sérica humana (HSA) em TBS (10 mM de Tris-HCl, 140 mM de NaCl, pH 7,4), depois são lavadas com TBS contendo 0,05% de Tween 20 e 5 mM de CaCl2 (tampão de lavagem). As amostras de soro humano são diluídas em 20 mM de Tris-HCl, 1 M de NaCl, 10 mM de CaCl2, 0,05% de Triton X- 100, 0,1% de HSA, pH 7,4, que impede a ativação de C4 endógeno e dissocia o complexo C1 (composto de C1q, C1r e C1s). Os agentes inibidores MASP- 2, incluindo MoAbs anti-MASP-2 e peptídeos inibidores, são adicionados às amostras de soro em concentrações variáveis. As amostras diluídas são adicionadas à placa e incubadas durante a noite a 4 ºC. Depois de 24 horas, as placas são lavadas cuidadosamente com tampão de lavagem, depois 0,1 μg de C4 humano purificado (obtido como descrito em Dodds, A.W., Methods Enzymol. 223: 46, 1993) em 100 μl de barbital a 4 mM, 145 mM de NaCl, 2 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, pH 7,4 é adicionado a cada poço. Depois de 1,5 h a 37 ºC, as placas são lavadas mais uma vez e a deposição de C4b é detectada usando C4c de galinha anti-ser humano conjugada à fosfatase alcalina (obtida da Immunsystem, Uppsala, Suécia) e medida usando o substrato colorimétrico fosfato de ρ-nitrofenila.

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[00402] Ensaio de C4 em manana: O ensaio descrito acima é adaptado para medir a ativação do caminho de lectina por intermédio de MBL revestindo-se a placa com LSP e manana antes de adicionar soro misturado com vários agentes inibidores de MASP-2.

[00403] Ensaio de C4 em H-ficolina (Hakata Ag): O ensaio descrito acima é adaptado para medir a ativação do caminho de lectina por intermédio da H-ficolina revestindo-se a placa com LPS e H-ficolina antes de adicionar soro misturado com vários agentes inibidores de MASP-2. EXEMPLO 8

[00404] O seguinte ensaio demonstra a presença da ativação do caminho clássico em camundongos do tipo selvagem e MASP-2-/-.

[00405] Métodos: Os complexos imunes foram gerados in situ revestindo-se as placas de microtitulação (Maxisorb, Nunc, cat. No. 442404, Fisher Scientific) com albumina de soro humano a 0,1% em 10 mM de Tris, 140 mM de NaCl, pH 7,4 por 1 hora na temperatura ambiente seguido pela incubação durante a noite a 4° C com antissoro de ovelha antissoro integral (Scottish Antibody Production Unit, Carluke, Escócia) diluída 1: 1000 em TBS/tween/Ca2+. As amostras de soro foram obtidas de camundongos tipo selvagem e MASP-2-/- e adicionadas às placas revestidas. As amostras de controle foram preparadas nas quais o C1q foi exaurido das amostras de soro tipo selvagem e MASP-2-/-. O soro de camundongo exaurido em C1q foi preparado usando Dynabeads ligados à proteína-A (Dynal Biotech, Oslo, Noruega) revestidas com IgG C1q de coelho anti-humano (Dako, Glostrup, Dinamarca), de acordo com as instruções do fornecedor. As placas foram incubadas por 90 minutos a 37° C. O C3b ligado foi detectado com um Anticorpo anti-human-C3c policlonal (Dako A 062) diluído em TBS/tw/Ca++ a 1:1000. O anticorpo secundário é IgG de cabra anticoelho.

[00406] Resultados: A FIGURA 7 mostra os níveis de deposição de C3b relativos em placas revestidas com IgG no soro do tipo selvagem, soro de

214 / 394 MASP-2-/-, soro do tipo selvagem exaurido em C1q e MASP-2-/- exaurido em C1q. Estes resultados demonstram que o caminho clássico está intacto na cepa de camundongo de MASP-2-/-. EXEMPLO 9

[00407] O ensaio a seguir é usado para testar se um agente inibidor de MASP bloqueia o caminho clássico analisando-se o efeito de um agente inibidor de MASP sob condições em que o caminho clássico é iniciado pelos complexos imunes.

[00408] Métodos: Para testar o efeito de um agente inibidor de MASP nas condições de ativação de complemento ondo caminho clássico é iniciado pelos complexos imunes, amostras de 50 μl em triplicata contendo 90% de NHS são incubadas a 37 ºC na presença de 10 μg/ml de complexo imune (IC) ou PBS, e amostras triplicatas em paralelo (+/- IC) também são incluídas que contêm 200 nM de anticorpo monoclonal antiproperdina durante a incubação a 37 ºC. Depois de uma incubação de duas horas a 37 ºC, 13 mM de EDTA são adicionados a todas as amostras para interromper ativação de complemento adicional e as amostras são imediatamente resfriadas para 5 ºC. As amostras são depois armazenadas a -70 ºC antes de serem ensaiadas quanto aos produtos de ativação de complemento (C3a e sC5b-9) usando kits de ELISA (Quidel, Catálogo Nos. A015 e A009) seguindo as instruções do fabricante. EXEMPLO 10

[00409] Este exemplo descreve a identificação de fragmentos de anticorpo Fab2 anti-MASP-2 de alta afinidade que bloqueia a atividade de MASP-2.

[00410] Fundamentos e Análise Racional: MASP-2 é uma proteína complexa com muitos domínios funcionais separados, incluindo: sítio(s) de ligação para MBL e ficolinas, um sítio catalítico de serina protease, um sítio de ligação para o substrato proteolítico C2, um sítio de ligação para o

215 / 394 substrato proteolítico C4, um sítio de clivagem de MASP-2 para a autoativação de zimogênio de MASP-2, e dois sítios de ligação de Ca++. Os fragmentos de anticorpo de Fab2 foram identificados que se ligam com alta afinidade ao MASP-2, e os fragmentos Fab2 identificados foram testados em um ensaio funcional para determinar se eles foram capazes de bloquear a atividade funcional de MASP-2.

[00411] Para bloquear a atividade funcional de MASP-2, um anticorpo ou fragmento de anticorpo Fab2 deve ligar e interferir com um epítopo estrutural no MASP-2 que é requerido para a atividade funcional de MASP-2. Portanto, muitos ou todos dos Fab2s ant-MASP-2 com ligação de alta afinidade podem não inibir a atividade funcional de MASP-2 a menos que eles se liguem aos epítopos estruturais no MASP-2 que estão diretamente envolvidos na atividade funcional de MASP-2.

[00412] Um ensaio funcional que mede a inibição da formação da C3 convertase no caminho de lectina foi usado para avaliar a “atividade de bloqueio” de Fab2s anti-MASP-2. É conhecido que o papel fisiológico primário de MASP-2 no caminho de lectina é gerar o componente funcional seguinte do caminho de complemento mediado pela lectina, a saber a C3 convertase do caminho de lectina. A C3 convertase do caminho de lectina é um complexo enzimático crítico (C4bC2a) que proteoliticamente cliva C3 em C3a e C3b. MASP-2 não é um componente estrutural da C3 convertase do caminho de lectina (C4bC2a); entretanto, a atividade funcional de MASP-2 é requerida de modo a gerar os dois componentes de proteína (C4b, C2a) que compreendem a C3 convertase do caminho de lectina. Além disso, todas das atividades funcionais separadas de MASP-2 listadas acima parecem ser requeridas de modo que MASP-2 gere a C3 convertase do caminho de lectina. Por estas razões, acredita-se que um ensaio preferido para o uso na avaliação da “atividade bloqueadora” de Fab2s anti-MASP-2 seja um ensaio funcional que meça a inibição da formação da C3 convertase do caminho de lectina.

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[00413] Geração de Fab2s de Alta Afinidade: Uma biblioteca de exibição de fago das sequências de anticorpo de cadeia leve e pesada variável humana e a tecnologia de seleção de anticorpo automatizada para identificar Fab2s que reajam com os ligantes selecionados de interesse foi usada para criar Fab2s de alta afinidade para a proteína MASP-2 de rato (SEQ ID NO: 55). Uma quantidade conhecida de proteína MASP-2 de rato (~1 mg, >85% puro) foi utilizada para a triagem de anticorpo. Três rodadas de amplificação foram utilizadas para a seleção dos anticorpos com a melhor afinidade. Aproximadamente 250 acertos diferentes que expressam fragmentos de anticorpo foram escolhidos para a triagem pelo ELISA. Acertos de alta afinidade foram subsequentemente sequenciados para determinar a singularidade dos anticorpos diferentes.

[00414] Cinquenta anticorpos anti-MASP-2 únicos foram purificados e 250 µg de cada anticorpo Fab2 purificado foi usado para a caracterização da afinidade de ligação de MASP-2 e testar o caminho funcional de complemento, como descrito em mais detalhes abaixo. Ensaios usados para avaliar a Atividade Inibidora (bloqueadora) de Fab2s anti-MASP-2

1. Ensaio para medir a inibição da Formação da C3 Convertase do Caminho da Lectina: Fundamentos: A C3 convertase do caminho de lectina é o complexo enzimático (C4bC2a) que proteoliticamente cliva C3 dentro de dois fragmentos proinflamatórios potentes, anafilatoxina C3a e C3b opsônico. A formação da C3 convertase parece ser uma etapa chave no caminho de lectina em termos de mediar a inflamação. MASP-2 não é um componente estrutural da C3 convertase do caminho de lectina (C4bC2a); portanto os anticorpos anti-MASP-2 (ou Fab2) não inibirão diretamente a atividade da C3 convertase pré-existente. Entretanto, a atividade de serina protease de MASP-2 é requerida de modo a gerar os dois componentes de proteína (C4b, C2a) que compreendem a C3 convertase do caminho de lectina. Portanto, Fab2 de anti-

217 / 394 MASP-2 que inibem a atividade funcional de MASP-2 (isto é, bloqueia Fab2 anti-MASP-2) inibirá de novo a formação da C3 convertase do caminho de lectina. C3 contém um grupo de tioéster incomum e altamente reativo como parte da sua estrutura. Na clivagem de C3 pela C3 convertase neste ensaio, o grupo de tioéster na C3b pode formar uma ligação covalente com dos grupos hidroxila ou amino nas macromoléculas imobilizadas no fundo dos poços plásticos por intermédio das ligações de éster ou amida, facilitando assim a detecção de C3b no ensaio de ELISA.

[00415] A manana de levedura é um ativador conhecido do caminho de lectina. No método que segue para medir a formação da C3 convertase, poços plásticos revestidos com manana foram incubadas por 30 min a 37 ºC com o soro de rato diluído para ativar o caminho de lectina. Os poços foram depois lavados e ensaiados quanto à C3b imobilizada nos poços usando métodos de ELISA padrão. A quantidade de C3b gerada neste ensaio é uma reflexão direta da formação de novo da C3 convertase do caminho de lectina. Os Fab2s anti-MASP-2 nas concentrações selecionadas foram testados neste ensaio quanto à sua capacidade para inibir a formação da C3 convertase e geração de C3b consequente. Métodos:

[00416] Placas de Ligação de Meio Costar de 96 poços foram incubadas durante a noite a 5 ºC com manana diluída em 50 mM de tampão de carbonato, pH 9,5 a 1 µg/50 Tl/poço. Depois da incubação durante a noite, cada poço foi lavado três vezes com 200 Tl de PBS. Os poços foram depois bloqueados com 100 Tl/poço de albumina sérica bovina a 1% em PBS e incubadas por uma hora na temperatura ambiente com mistura suave. Cada poço foi depois lavado três vezes com 200 Tl de PBS. As amostras de Fab2 anti-MASP-2 foram diluídas nas concentrações selecionadas em tampão GVB contendo Ca++ e Mg++ (4,0 mM de barbital, 141 mM de NaCl, 1,0 mM de MgCl2, 2,0 mM de CaCl2, 0,1% de gelatina, pH 7,4) a 5° C. Um soro de rato a 0,5% foi adicionado às amostras acima a 5° C e 100 Tl foram transferidos

218 / 394 para cada poço. As placas foram cobertas e incubadas por 30 minutos em um banho maria a 37° C para permitir a ativação de complemento. A reação foi interrompida transferindo-se as placas do banho maria a 37° C para um recipiente contendo uma mistura de gelo-água. Cada poço foi lavado cinco vezes com 200 µl de PBS-Tween 20 (0,05% de Tween 20 em PBS), depois lavado duas vezes com 200 Tl de PBS. 100 Tl/poço da diluição 1:10.000 do anticorpo primário (C3c de coelho anti-ser humano, DAKO A0062) foi adicionado em PBS contendo 2,0 mg/ml de albumina sérica bovina e incubados 1 h na temperatura ambiente com mistura suave. Cada poço foi lavado 5x 200 Tl de PBS. 100 Tl/poço de diluição 1:10.000 do anticorpo secundário (IgG de cabra anticoelho conjugada à peroxidase, American Qualex A102PU) foram adicionados em PBS contendo 2,0 mg/ml de albumina sérica bovina e incubados por uma hora na temperatura ambiente em um agitador com mistura suave. Cada poço foi lavado cinco vezes com 200 Tl de PBS. 100 Tl/poço do substrato de peroxidase TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories) foram adicionados e incubados na temperatura ambiente por 10 min. A reação de peroxidase foi interrompida pela adição de 100 Tl/poço de H3PO4 1,0 M e a OD450 foi medida.

2. Ensaio para medir a Inibição da Clivagem de C4 dependente de MASP-2

[00417] Fundamentos: A atividade de serina protease de MASP-2 é altamente específica e apenas dois substratos de proteína para MASP-2 foram identificados; C2 e C4. A clivagem de C4 gera C4a e C4b. Fab2 anti-MASP-2 pode ligar-se aos epítopos estruturais no MASP-2 que estão diretamente envolvidos na clivagem de C4 (por exemplo, sítio de ligação de MASP-2 para C4; sítio catalítico de serina protease de MASP-2) e deste modo inibem a atividade funcional da clivagem de C4 do MASP-2.

[00418] A levedura manana é um ativador conhecido do caminho de lectina. No método que segue para medir a atividade de clivagem de C4 de MASP-2, poços plásticos revestidos com manana foram incubados por 30

219 / 394 minutos a 37° C com o soro de rato diluído para ativar o caminho de lectina. Visto que o anticorpo primário usado neste ensaio de ELISA apenas reconhece a C4 humana, o soro de rato diluído também foi suplementado com C4 humana (1,0 Tg/ml). Os poços foram depois lavados e ensaiados quanto à C4b humana imobilizada nos poços usando métodos de ELISA padrão. A quantidade de C4b gerada neste ensaio é uma medida da atividade de clivagem de C4 dependente de MASP-2. Fab2 anti-MASP-2 nas concentrações selecionadas foi testado neste ensaio quanto à sua capacidade para inibir a clivagem de C4.

[00419] Métodos: As placas de Ligação de Meio Costar de 96 poços foram incubadas durante a noite a 5° C com manana diluída em 50 mM de tampão de carbonato, pH 9,5 a 1,0 Tg/50 Tl/poço. Cada poço foi lavado 3x 200 Tl de PBS. Os poços foram depois bloqueados com 100 Tl/poço de albumina sérica bovina a 1% em PBS e incubadas por uma hora na temperatura ambiente com mistura suave. Cada poço foi lavado 3x 200 Tl de PBS. As amostras de Fab2 anti-MASP-2 foram diluídas nas concentrações selecionadas em tampão GVB contendo Ca++ e Mg++ (4,0 mM de barbital, 141 mM de NaCl, 1,0 mM de MgCl2, 2,0 mM de CaCl2, 0,1% de gelatina, pH 7,4) a 5° C. 1,0 Tg/ml de C4 humana (Quidel) também foi incluído nestas amostras. 0,5% de soro de rato foi adicionado às amostras acima a 5° C e 100 Tl foram transferidos para cada poço. As placas foram cobertas e incubadas por 30 min em um banho maria a 37° C para permitir a ativação de complemento. A reação foi interrompida transferindo-se as placas do banho maria a 37° C para um recipiente contendo uma mistura de gelo-água. Cada poço foi lavado 5x 200 Tl de PBS-Tween 20 (0,05% de Tween 20 em PBS), depois cada poço foi lavado 2x com 200 Tl de PBS. 100 Tl/poço de diluição 1:700 de C4c de galinha anti-ser humano conjugada com biotina (Immunsystem AB, Uppsala, Suécia) foram adicionados em PBS contendo 2,0 mg/ml de albumina sérica bovina (BSA) e incubados uma hora na

220 / 394 temperatura ambiente com mistura suave. Cada poço foi lavado 5x com 200 Tl de PBS. 100 Tl/poço de 0,1 Tg/ml de estreptavidina conjugada à peroxidase (Pierce Chemical #21126) foram adicionados em PBS contendo 2,0 mg/ml de BSA e incubadas por uma hora na temperatura ambiente em um agitador com mistura suave. Cada poço foi lavado 5 x 200 Tl com PBS. 100 Tl/poço do substrato de peroxidase TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories) foram adicionados e incubados na temperatura ambiente por 16 min. A reação da peroxidase foi interrompida pela adição de 100 Tl/poço de H3PO4 1,0 M e a OD450 foi medida.

3. Ensaio de Ligação de Fab2 anti-MASP-2 anti-rato ao MASP-2 de rato ‘Nativo’

[00420] Fundamentos: MASP-2 está usualmente presente no plasma como um complexo dimérico de MASP-2 que também inclui moléculas de lectina específicas (proteína de ligação de manose (MBL) e ficolinas). Portanto, se uma pessoa está interessada em estudar a ligação de Fab2 anti- MASP-2 à forma fisiologicamente relevante de MASP-2, é importante desenvolver um Ensaio de Ligação em que a interação entre o Fab2 e MASP- 2 ‘nativo’ em plasma seja usada, ao invés de MASP-2 recombinante purificado. Neste Ensaio de Ligação, o complexo ‘nativo’ MASP-2-MBL de soro de rato a 10% foi primeiro imobilizado em poços revestidos com manana. A afinidade de ligação de vários Fab2s anti-MASP-2 ao MASP-2 ‘nativo’ imobilizado foi depois estudada usando uma metodologia de ELISA padrão.

[00421] Métodos: Placas de Alta Ligação Costar de 96 poços foram incubadas durante a noite a 5 ºC com manana diluída em 50 mM de tampão de carbonato, pH 9,5 a 1 Tg/50 Tl/poço. Cada poço foi lavado 3x com 200 Tl de PBS. Os poços foram bloqueados com 100 Tl/poço de leite em pó desnatado a 0,5% em PBST (PBS com 0,05% de Tween 20) e incubados por uma hora na temperatura ambiente com mistura suave. Cada poço foi lavado

221 / 394 3x com 200 Tl de Tampão de Lavagem de TBS/Tween/Ca++ (solução salina tamponada com Tris, 0,05% de Tween 20, contendo 5,0 mM de CaCl2, pH 7,4. Soro de rato a 10% em Tampão de Ligação de Sal Alto (20 mM de Tris, 1,0 M de NaCl, 10 mM de CaCl2, 0,05% de Triton-X100, 0,1% (p/v) de albumina sérica bovina, pH 7,4) foi preparado em gelo. 100 Tl/poço foram adicionados e incubados durante a noite a 5 ºC. Os poços foram lavados 3x com 200 Tl de Tampão de Lavagem TBS/Tween/Ca++. Os poços foram depois lavados 2x com 200 Tl de PBS. 100 Tl/poço de concentração selecionada de Fab2 anti-MASP-2 diluído em Tampão GVB contendo Ca++ e Mg++ (4,0 mM de barbital, 141 mM de NaCl, 1,0 mM de MgCl2, 2,0 mM de CaCl2, 0,1% de gelatina, pH 7,4) foram adicionados e incubados por uma hora na temperatura ambiente com mistura suave. Cada poço foi lavado 5x 200 Tl de PBS. 100 Tl/poço de anti-Fab2 de cabra conjugado com HRP (Biogenesis Cat No 0500- 0099) diluído 1:5000 em 2,0 mg/ml de albumina sérica bovina em PBS foram adicionados e incubados por uma hora na temperatura ambiente com mistura suave. Cada poço foi lavado 5 vezes com 200 Tl de PBS. 100 Tl/poço do substrato de peroxidase TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories) foi adicionado e incubadas na temperatura ambiente por 70 min. A reação de peroxidase foi interrompida pela adição de 100 Tl/poço de H3PO4 1,0 M e a OD450 foi medida. RESULTADOS:

[00422] Aproximadamente 250 Fab2s diferentes que reagiram com alta afinidade com a proteína MASP-2 de rato foram escolhidos para a triagem por ELISA. Estes Fab2s de alta afinidade foram sequenciados para determinar a singularidade dos anticorpos diferentes, e 50 anticorpos anti-MASP-2 únicos foram purificados para mais análise. 250 µg de cada anticorpo Fab2 purificado foi usado para a caracterização da afinidade de ligação de MASP-2 e teste funcional do caminho complemento. Os resultados desta análise são mostrados abaixo na Tabela 6.

222 / 394 TABELA 6: FAB2 ANTI-MASP-2 QUE BLOQUEIA A ATIVAÇÃO DE

COMPLEMENTO DO CAMINHO DA LECTINA C3 Convertase Kd Clivagem de C4 Anticorpo Fab2 # IC50 (nM) IC50 (nM) 88 0,32 4,1 ND 41 0,35 0,30 0,81 11 0,46 0,86 <2 nM 86 0,53 1,4 ND 81 0,54 2,0 ND 66 0,92 4,5 ND 57 0,95 3,6 <2 nM 40 1,1 7,2 0,68 58 1,3 2,6 ND 60 1,6 3,1 ND 52 1,6 5,8 <2 nM 63 2,0 6,6 ND 49 2,8 8,5 <2 nM 89 3,0 2,5 ND 71 3,0 10,5 ND 87 6,0 2,5 ND 67 10,0 7,7 ND

[00423] Como mostrado acima na TABELA 6, dos 50 Fab2s anti- MASP-2 testados, dezessete Fab2s foram identificados como um Fab2 que bloqueia MASP-2 que inibe potencialmente a formação de C3 convertase com IC50 igual a ou menor do que 10 nM de Fab2s (uma taxa de acerto positivo de 34%). Oito das dezessete Fab2s identificadas têm IC50s na faixa subnanomolar. Além disso, todos os dezessete dos Fab2s que bloqueiam MASP-2 na TABELA 6 concedem essencialmente a inibição completa da formação de C3 convertase no ensaio de caminho de lectina C3 convertase. A FIGURA 8A ilustra graficamente os resultados do ensaio de formação de C3 convertase para o anticorpo Fab2 #11, que é representativo dos outros anticorpos Fab2 testados, os resultados os quais são mostrados na TABELA

6. Esta é uma consideração importante, visto que é teoricamente possível que um Fab2 de “bloqueio” possa somente inibir fracionalmente a função de MASP-2 mesmo quando cada molécula de MASP-2 é ligada pelo Fab2.

[00424] Embora a manana seja um ativador conhecido do caminho de lectina, é teoricamente possível que a presença de anticorpos antimanana no soro do rato também possa ativar o caminho clássico e gerar C3b por intermédio do caminho clássico de C3 convertase. Entretanto, cada um dos

223 / 394 dezessete Fab2s anti-MASP-2 de bloqueio listadas neste exemplo inibem potencialmente a geração de C3b (>95%), deste modo demonstrando a especificidade deste ensaio para o caminho de lectina C3 convertase.

[00425] Os ensaios de ligação também foram realizados com todas as dezessete dos Fab2s de bloqueio de modo a calcular uma Kd aparente para cada um. Os resultados dos ensaios de ligação dos Fab2s de MASP-2 anti-rato para o MASP-2 de rato nativo para o seus dos Fab2s de bloqueio são também mostrados na TABELA 6. A FIGURA 8B ilustra graficamente os resultados de um ensaio de ligação com o anticorpo Fab2 #11. Os ensaios de ligação similares também foram realizados para os outros Fab2s, os resultados os quais que são mostrados na TABELA 6. Em geral, a Kds evidente obtida para a ligação de cada um dos seis Fab2s ao MASP-2 ‘nativo’ corresponde razoavelmente bem com a IC50 para o Fab2 no ensaio funcional de C3 convertase. Há evidência de que a MASP-2 sofre uma mudança configuracional de uma forma ‘inativa’ para uma forma ‘ativa’ na ativação da sua atividade de protease (Feinberg et al., EMBO J 22: 2348-59 (2003); Gal et al., J. Biol. Chem. 280: 33435-44 (2005)). No plasma de rato normal usado no Ensaio de formação de C3 convertase, MASP-2 é apresentado primeiramente na configuração de zimógeno ‘inativa’. Ao contrário, no ensaio de ligação, MASP-2 é apresentado como parte de um complexo com MBL ligado à manana imobilizada; portanto, o MASP-2 estaria na configuração ‘ativa’ (Petersen et al., J. Immunol Methods 257: 107-16, 2001). Consequentemente, não seria necessariamente esperada uma correspondência exata entre a IC50 e a Kd para cada um dos dezessete Fab2 de bloqueio testados nestes dois ensaios funcionais visto que em cada ensaio o Fab2 seria a ligação de uma forma configuracional diferente de MASP-2. Não obstante, com a exceção de Fab2 #88, parece haver uma correspondência razoavelmente próxima entre a IC50 e Kd aparente para cada um dos outros dezesseis Fab2 testados nos dois ensaios (ver a TABELA 6).

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[00426] Vários dos Fab2s de bloqueio foram avaliados quanto a inibição da clivagem mediada por MASP-2 de C4. A FIGURA 8C ilustra graficamente os resultados de um ensaio de clivagem de C4, mostrando a inibição com Fab2 #41, com uma IC50 = 0,81 nM (ver a TABELA 6). Como mostrado na FIGURA 9, todos dos Fab2s testados foram encontrados para inibir a clivagem C4 com IC50s similares àqueles obtidos no ensaio de C3 convertase (ver a TABELA 6).

[00427] Embora a manana seja um ativador conhecido do caminho de lectina, é teoricamente possível que a presença de anticorpos antimanana no soro do rato também possa ativar o caminho clássico e deste modo gerar C4b através da clivagem mediada por C1s de C4. Entretanto, vários Fab2s anti- MASP-2 foram identificados, os quais potencialmente inibem a geração de C4b (>95%), deste modo demonstrando a especificidade deste ensaio para a clivagem de C4 mediada por MASP-2. C4, como C3, contém um grupo tioéster não-usual e altamente reativo como parte de sua estrutura. Na clivagem de C4 por MASP-2 neste ensaio, o grupo tioéster em C4b pode formar uma ligação covalente com hidroxila ou grupos amino e, macromoléculas imobilizadas no fundo dos poços plásticos por intermédio do éster ou ligações de amida, facilitando deste modo a detecção de C4b no ensaio ELISA.

[00428] Estes estudos demonstram claramente a criação de FAB2s de alta afinidade para a proteína de MASP-2 do rato que bloqueia funcionalmente a atividade tanto de C4 quanto de C3 convertase, deste modo prevenindo a ativação do caminho de lectina. EXEMPLO 11

[00429] Este exemplo descreve o mapeamento de epítopo para vários dos Fab2s de MASP-2 do anticorpo anti-rato de bloqueio que foram gerados como descrito no Exemplo 10. Métodos:

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[00430] Como mostrado na FIGURA 10, depois das proteínas, todas as etiquetas His com N-terminal 6X foram expressadas em células CHO usando o vetor pED4: MASP-2A de rato, um comprimento de proteína de MASP-2 total, inativada alterando-se a serina no centro ativo para alanina (S613A); MASP-2K de rato, uma proteína de MASP-2 de comprimento total alterada para reduzir a autoativação (R424K); CUBI-II, um fragmento N-terminal da MASP-2 de rato que contém CUBI, semelhante à EGF e domínios de CUBII apenas; e

[00431] um fragmento N-terminal semelhante à CUBI/EGF, da MASP- 2 de rato que contém os domínios de CUBI e semelhantes à EGF-apenas.

[00432] Estas proteínas foram purificadas dos sobrenadantes de cultura através da cromatografia de afinidade de níquel, como previamente descrito (Chen et al., J. Biol. Chem. 276: 25894-02 (2001)).

[00433] Um polipeptídeo C-terminal (CCPII-SP), contendo CCPII e o domínio de serina protease da MASP-2 de rato, foi expressado em E. coli como uma proteína de fusão de tiorredoxina usando pTrxFus (Invitrogen). A proteína foi purificada a partir dos lisados célula usando a resina de afinidade Tiobond. O parceiro de fusão de tiorredoxina foi expressado do pTrxFus vazio como um controle negativo.

[00434] Todas as proteínas recombinantes foram dialisadas e, tampão de TBS e suas concentrações determinadas medindo-se OD em 280 nm. Análise de pontos e mancha:

[00435] As diluições em série dos cinco polipeptídeos de MASP-2 recombinantes descritos acima e mostrados na FIGURA 10 (e o polipeptídeo de tiorredoxina como um controle negativo para o polipeptídeo de serina protease CCPII) foram manchados em uma membrana de nitrocelulose. A quantidade de proteína manchada variou de 100 ng a 6,4 pg, e, cinco etapas de dobra. Nos experimentos posteriores, a quantidade da proteína manchada

226 / 394 variou de 50 ng até 16 pg, novamente em etapas de cinco dobras. As membranas foram bloqueadas com 5% de leite em pó desnatado em TBS (tampão de bloqueio) de depois incubadas com 1,0 μg/ml de Fab2s anti- MASP-2 em tampão de bloqueio (contendo 5,0 mM de Ca2+). As Fab2s ligadas foram detectadas usando Fab anti-ser humano conjugado com HRP (AbD/Serotec; diluídas 1/10.000) e um kit de detecção de ECL (Amersham). Uma membrana foi incubada com Ab de MASP-2 humana anticoelho monoclonal (descrito e, Stover et al., J Immunol 163: 6848-59 (1999)) como um controle positivo. Neste caso, o Ab ligado foi detectado usando IgG de cabra anticoelho conjugada com HRP (Dako; Diluições 1/2.000). Ensaio de Ligação de MASP-2

[00436] As placas de ELISA foram revestidas com 1,0 μg/poço de MASP-2A recombinante ou polipeptídeo CUBI-II em tampão de carbonato (pH 9,0) durante a noite a 4º C. Os poços foram bloqueados com 1% de BSA e, TBS, e depois as diluições em série das Fab2s anti-MASP-2 foram adicionadas em TBS contendo 5,0 mM Ca2+. As placas foram incubadas por uma hora na RT. Depois de lavar três vezes com TBS/tween/Ca2+, o Fab anti- humano conjugado com HRP (AbD/Serotec) diluído 1/10.000 em TBS/ Ca2+ foi adicionado e as placas foram incubadas por uma hora adicional na RT. O anticorpo ligado foi detectado usando um kit de substrato de TMB peroxidase (Biorad). RESULTADOS:

[00437] Os resultados da análise de mancha de pontos demonstrando a reatividade dos Fab2s com vários polipeptídeos de MASP-2 são providos abaixo na TABELA 7. Os valores numéricos providos na TABELA 7 indicam a quantidade de proteína manchada necessária para fornecer aproximadamente uma intensidade de sinal meia máxima. Como mostrado, todos os polipeptídeos (com a exceção do parceiro de fusão tiorredoxina sozinho) foram reconhecidos pelo controle positivo Ab (soro anti-MASP-2

227 / 394 policlonal humano, cultivado em coelhos). TABELA 7: REATIVIDADE COM VÁRIOS POLIPEPTÍDEOS DE MASP- 2 DE RATO RECOMBINANTES EM DOT BLOTS Semelhante à Anticorpo Fab2 # MASP-2A CUBI-II CCPII-SP Tiorredoxina CUBI/EGF- 40 0,16 ng NR NR 0,8 ng NR 41 0,16 ng NR NR 0,8 ng NR 11 0,16 ng NR NR 0,8 ng NR 49 0,16 ng NR NR >20 ng NR 52 0,16 ng NR NR 0,8 ng NR 57 0,032 ng NR NR NR NR 58 0,4 ng NR NR 2,0 ng NR 60 0,4 ng 0,4 ng NR NR NR 63 0,4 ng NR NR 2,0 ng NR 66 0,4 ng NR NR 2,0 ng NR 67 0,4 ng NR NR 2,0 ng NR 71 0,4 ng NR NR 2,0 ng NR 81 0,4 ng NR NR 2,0 ng NR 86 0,4 ng NR NR 10 ng NR 87 0,4 ng NR NR 2,0 ng NR Controle Positivo <0,032 ng 0,16 ng 0,16 ng <0,032 ng NR

[00438] A atividade do caminho foi observada sobre a segunda e terceira semanas, com a restauração do caminho de lectina completo nos camundongos pelos 17 dias após a administração de MoAb anti-MASP-2. NR = Nenhuma reação. O anticorpo de controle positivo é soro policlonal anti- MASP-2 humana, cultivado em coelhos.

[00439] Todos dos Fab2s são reagidos com MASP-2A assim como MASP-2K (dados não mostrados). A maioria dos Fab2s reconheceram o outro polipeptídeo CCPII-SP mas não os fragmentos N-terminais. As duas exceções são Fab2 #60 e Fab2 #57. Fab2 #60 reconhece MASP-2A e o fragmento CUBI-II, mas não o polipeptídeo semelhante à CUBI/EGF ou o polipeptídeo de CCPII-SP, sugerindo que este liga a um epítopo em CUBII ou rodeando o CUBII e o domínio semelhante à EGF. O Fab2 # 57 reconhece MASP-2A mas não qualquer um dos fragmentos de MASP-2 testados, indicando que este Fab2 reconhece um epítopo e CCP1. Fab2 #40 e #49 ligado somente para completar MASP-2A. No ensaio de ligação de ELISA mostrado na FIGURA 11, Fab2 #60 também ligado ao polipeptídeo CUBI-II, embora com uma afinidade aparente levemente menor.

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[00440] Esta verificação demonstra a identificação dos Fab2s de bloqueio únicos às regiões múltiplas da proteína de MASP-2 EXEMPLO 12

[00441] Este exemplo descreve a análise de camundongos MASP-2-/- em um Modelo de Isquemia/Reperfusão Renal de Murino.

[00442] Fundamentos/Análise Racional: A Lesão de Isquemia- Reperfusão (I/R) no rim em uma temperatura corporal tem relevância em várias condições clínicas, incluindo choque hipovolêmico, oclusão da artéria renal e procedimentos de grampeamento cruzado.

[00443] A isquemia-reperfusão (I/R) é uma causa importante da insuficiência renal aguda, associada com uma taxa de mortalidade de até 50% (Levy et al., JAMA 275: 1489-94, 1996; Thadhani et al., N. Engl. J. Med. 334: 1448-60, 1996). A insuficiência renal pós transplante é uma complicação comum e ameaçadora depois do transplante renal (Nicholson et al., Kidney Int. 58: 2585-91, 2000). O tratamento eficaz para a lesão de I/R renal não está disponível no presente e a hemodiálise é o único tratamento disponível. A fisiopatologia da lesão renal de I/R é complicada. Estudos recentes têm mostrado que o caminho de lectina da ativação de complemento pode ter um papel importante na patogênese da lesão de I/R renal (deVries et al., Am. J. Path. 165: 1677-88, 2004). Métodos:

[00444] Um camundongo MASP-2(-/-) foi gerado como descrito no Exemplo 1 e retrocruzado por pelo menos 10 gerações com C57Bl/6. A seis camundongos MASP-2(-/-) machos e seis do tipo selvagem (+/+) pesando entre 22 a 25 g foram administrados uma injeção intraperitoneal de Hypnovel (6,64 mg/kg; Roche products Ltd. Welwyn Garden City, UK) e subsequentemente anestesiados através da inalação de isoflurano (Abbott Laboratories Ltd., Kent, UK). O isoflurano foi escolhido porque este é um anestésico de inalação branda com toxicidade mínima do fígado; as

229 / 394 concentrações são precisamente produzidas e o animal se recupera rapidamente, mesmo depois da anestesia prolongada. Hipnovel foi administrado porque este produz uma condição de neuroleptanalgesia no animal e significa que menos isoflurano precisa ser administrado. Uma almofada quente foi colocada debaixo do animal de modo a manter uma temperatura corporal constante. Em seguida, uma incisão abdominal de linha média foi realizada e a cavidade do corpo mantida aberta usando um par de retratores. O tecido conectivo foi limpado acima e abaixo da veia renal e a artéria tanto do rim direito quanto esquerdo e o pedículo renal foi grampeado por intermédio da aplicação de grampos de microaneurisma por um período de 55 minutos. Este período de isquemia teve base inicialmente em um estudo prévio realizado neste laboratório (Zhou et al., J. Clin. Invest. 105: 1363-71 (2000)). Além disso, um tempo isquêmico padrão de 55 minutos foi escolhido depois da titulação isquêmica e foi verificado que 55 minutos forneceram lesões compatíveis que também foram reversíveis, com baixa mortalidade, menos do que 5%. Depois da oclusão, 0,4 ml de solução salina quente (37° C) foi colocado na cavidade abdominal e depois o abdômen foi fechado para o período de isquemia. Após a remoção dos grampos de microaneurisma, os rins foram observados até a mudança de cor, uma indicação de refluxo de sangue aos rins. Outro 0,4 ml da solução salina quente foi colocado na cavidade abdominal e a abertura foi suturada, depois dos animais terem sido retornados às suas gaiolas. As amostras de sangue das caudas foram coletadas a 24 horas depois de remover os grampos e a 48 horas, os camundongos foram sacrificados e uma amostra de sangue adicional foi coletada.

[00445] Avaliação da Lesão Renal: A função renal foi avaliada em 24 e 48 horas depois da reperfusão em seis MASP-2(-/-) machos e seis camundongos tipo selvagem (+/+) fêmeas. A medição de creatinina no sangue foi determinada através da espectrometria de massa, que provê um índice reprodutível de função renal (sensibilidade < 1,0 µmol/l). A FIGURA 12

230 / 394 ilustra graficamente a depuração do nitrogênio da ureia do sangue para os controles de C57Bl/6 do tipo selvagem e MASP-2 (-/-) a 24 horas e 48 horas depois da reperfusão. Como mostrado na FIGURA 12, os camundongos MASP-2(-/-) apresentaram uma redução significante na quantidade de ureia no sangue a 24 e 48 horas, em comparação os camundongos de controle e do tipo selvagem, indicando um efeito funcional de proteção do dano renal no modelo de isquemia de lesão de reperfusão.

[00446] Em geral, a ureia aumentada no sangue foi vista tanto nos camundongos tipo selvagem (+/+) quanto MASP-2 (-/-) a 24 e 48 horas depois do procedimento cirúrgico e lesão isquêmica. Os níveis de ureia no sangue em um animal de cirurgia não-isquêmico tipo selvagem (+/+) foram separadamente determinados ser de 5,8 mmol/l. Além dos dados apresentados na FIGURA 12, um animal MASP-2 (-/-) mostrou uma proteção quase completa da lesão isquêmica, com valores de 6,8 e 9,6 mmol/l a 24 e 48 horas, respectivamente. Este animal foi excluído do grupo de análise como um estranho potencial, em que nenhuma lesão isquêmica pode ter sido apresentada. Portanto, a análise final mostrada na FIGURA 12 incluiu 5 camundongos MASP-2(-/-)e 6 camundongos tipo selvagem (+/+) e uma redução estatisticamente significante na ureia do sague foi vista a 24 e 48 horas nos camundongos MASP-2 (-/-) (teste em t de Student p<0,05). Estas verificações indicam que a inibição da atividade de MASP-2 seria esperada ter um efeito protetivo ou terapêutico do dano renal devido à lesão isquêmica. EXEMPLO 13

[00447] Este exemplo descreve os resultados de MASP-2-/- em um Modelo de Degeneração Macular em Murinos.

[00448] Fundamentos/Análise Racional: A degeneração macular relacionada com a idade (AMD) é a causa principal da cegueira depois dos 55 anos de idade no mundo industrializado. A AMD ocorre em duas formas principais: AMD neovascular (úmida) e AMD atrófica (seca). A forma

231 / 394 neovascular (úmida) considera 90% da perda visual severa associada com AMD, mesmo se somente ~20% dos indivíduos com AMD desenvolvem a forma úmida. As indicações clínicas da AMD incluem drusa múltipla, atrofia geográfica e neovascularização coroidal (CNV). Em dezembro de 2004, a FDA aprovou o Macugen (pegaptanib), uma nova classe de fármacos oftálmicos para alvejar especificamente e bloquear os efeitos do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), para o tratamento da forma úmida (neovascular) da AMD (Ng et al., Nat Rev. Drug Discov 5: 123-32 (2006)). Embora o Macugen reapresente uma nova opção farmacêutica promissora para um subgrupo de pacientes com AMD, ainda existe uma necessidade urgente de desenvolver tratamentos adicionais para esta doença complexa. Linhagens independentes múltiplas de investigação implicam em um papel central para a ativação de complemento na patogênese de AMD. A patogênese da neovascularização coroidal (CNV), a forma mais séria da AMD, pode envolver a ativação dos caminhos de complemento.

[00449] Mais de vinte e cinco anos atrás, Ryan descreveu um modelo de lesão induzido a laser de CNV em animais (Ryan, S.J., Tr. Am. Opth. Soc. LXXVII: 707-745, 1979). O modelo foi inicialmente desenvolvido usando macacos reso, entretanto, a mesma tecnologia tem sido usada para desenvolver modelos similares de CNV em uma variedade de animais de pesquisa, incluindo o camundongo (Tobe et al., Am. J. Pathol. 153: 1641-46, 1998). Neste modelo, a fotocoagulação a laser é usada para quebrar a membrana de Bruch, um ato que resulta na formação das membranas semelhantes a CNV. O modelo induzido a laser captura muitas das características importantes da condição humana (para uma revisão recente, ver, Ambati et al., Survey Ophthalmology 48: 257-293, 2003). O modelo de camundongo induzido a laser é agora bem estabelecido e é usado como uma base experimental em um grande e ainda crescente número de projetos de pesquisa. É geralmente aceito que o modelo induzido a laser compartilha uma

232 / 394 similaridade biológica suficiente com CNV em seres humanos em que os estudos pré-clínicos da patogênese e inibição de fármaco usando este modelo são relevantes para CNV em humanos. Métodos:

[00450] Um camundongo de MASP-2-/-foi gerado como descrito no Exemplo 1 e retrocruzado por 10 gerações com C57Bl/6. O presente estudo comparou os resultados quando camundongos machos MASP-2 (-/-) e MASP-2 (+/+) foram avaliados no decorrer do CNV induzido a laser, um modelo acelerado de AMD neovascular focando no volume de CNV induzido a laser escaneando-se a microscopia confocal a laser como uma medida da lesão tissular e determinação dos níveis de VEGF, um fator angiogênico potente implicado em CNV, no epitélio do pigmento retinal (RPE)/coroides através de ELISA depois da lesão por laser.

[00451] Indução da neovascularização coroidal (CNV): A fotocoagulação a laser (532 nm, 200 mW, 100 ms, 75 µm; Oculight GL, Iridex, Mountain View, CA) foi realizada em ambos os olhos de cada animal no dia zero por um único indivíduo mascarado para a designação do grupo de fármaco. Pontos de laser foram aplicados de uma maneira padronizada em torno do nervo ótico, usando um sistema de liberação de lâmpada de fenda e uma lamela como uma lente de contato. O ponto final morfológico da lesão a laser foi a aparência de uma bolha de cavitação, um sinal julgado correlacionar com o rompimento da membrana de Bruch. Os métodos detalhados e os pontos finais foram avaliados como segue.

[00452] Angiografia de Fluoresceína: A angiografia de fluoresceína foi realizada com uma câmera e um sistema de visualização (câmera TRC 50 1A; sistema ImageNet 2,01; Topcon, Paramus, NJ) em 1 semana depois da fotocoagulação a laser. As fotografias foram capturadas com uma lente 20-D em contato com a lente da câmera de fundo depois da injeção intraperitoneal de 0,1 ml de fluoresceína sódica a 2,5%. Um especialista em retina não

233 / 394 envolvido na fotocoagulação no laser ou angiografia avaliou os angiogramas de fluoresceína em uma seção única em uma maneira mascarada.

[00453] Volume de neovascularização coroidal (CNV): Uma semana depois da lesão por laser, os olhos foram enucleados e fixados com 4% de paraformaldeído por 30 min a 4º C. Copos oculares foram obtidos removendo-se os segmentos anteriores e foram lavados três vezes em PBS, seguido pela desidratação e reidratação através de uma série de metanol. Depois de bloquear duas vezes com um tampão (PBS contendo 1% de albumina do soro bovino e 0,5% de Triton X-100) por 30 minutos na temperatura ambiente, os copos oculares foram incubados durante a noite a 4º C com 0,5% de FITC-isolectina B4 (Vector laboratories, Burlingame, CA), diluído com PBS contendo 0,2% de BSA e 0,1% de Triton X-100, que liga aos resíduos de β-D-galactose terminais na superfície das células endoteliais e seletivamente aos rótulos da vasculatura dos murinos. Depois de duas lavagens com PBS contendo 0,1% de Triton X-100, a retina neurossensorial foi gentilmente destacada e cortada do nervo ótico. Quatro incisões de relaxamento radial foram feitas e o complexo de RPE coroide-esclerótico restante foi montado de maneira plana no meio antidesbotamento (Immu- Mount Vectashield Mounting Medium; Vector Laboratories) e com uma tampa de deslizamento.

[00454] As montagens planas foram examinadas com um microscópio confocal de laser de varredura (TCS SP; Leica, Heidelberg, Alemanha). Os recipientes foram visualizados através do excitamento com um comprimento de onda de argônio azul (488 nm) e emissão de captura entre 515 e 545 nm. Um objetivo de imersão no óleo 40X foi usado para todos os estudos de imageamento. As seções óticas horizontais (etapa de 1 µm) foram obtidas a partir da superfície do complexo RPE-coroide-esclerótico. O plano focal mais profundo em que a rede vascular coroidal adjacente conectando à lesão pode ser identificada foi julgado ser o fundo da lesão. Qualquer recipiente na área

234 / 394 alvejada a laser e superficial a este plano de referência foi julgado como CNV. As imagens de cada seção foram digitalmente armazenadas. A área da fluorescência relacionada com o CNV foi medida através da análise da imagem computadorizada com o suporte lógico do microscópio (TCS SP; Leica). A soma da área fluorescente total em cada seção horizontal foi usada como um índice para o volume de CNV. O imageamento foi realizado por um operador mascarado para a avaliação do grupo de tratamento.

[00455] Por causa da probabilidade de cada lesão por laser desenvolver CNV ser influenciada pelo grupo ao qual a mesma pertence (camundongo, olho e ponto de laser), os volumes de lesão médios foram comparados usando um modelo misto linear com um projeto de medidas repetidas de plotagem dividida. O fator de plotagem total foi o grupo genético ao qual o animal pertence, considerando que o fator de plotagem dividida foi o olho. A significância estatística foi determinada no nível 0,05. As comparações post hoc dos meios foram formadas com um ajuste de Bonferroni para comparações múltiplas. ELISA DE VEGF. A três dias depois da lesão por 12 pontos de laser, o complexo RPE-coroide foi sonificado no tampão de lise (20 mM de HCl de imidazol, 10 mM de KCl, 1 mM de MgCL2, 10 mM de EGTA, 1% de Triton X-100, 10 mM de NaF, 1 mM de molibdato de Na e 1 mM de EDTA com inibidor de protease) em gelo por 15 minutos. Os níveis proteicos de VEGF no sobrenadante foram determinados por um kit ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN) que reconhece todas as variantes de união, de 450 a 570 nm (Emax; Molecular Devices, Sunnyvale, CA) e normalizados para a proteína total. As medições em duplicata foram realizadas em uma maneira ocultada por um operador não envolvido na fotocoagulação, imagiologia ou angiografia. Os números de VEGF foram representados como a média +/- SEM de pelo menos três experimentos independentes e comparados usando o teste em U de Mann-Whitney. A hipótese nula foi rejeitada a P<0,05.

235 / 394 RESULTADOS: Avaliação dos níveis de VEGF:

[00456] A FIGURA 13A ilustra graficamente os níveis de proteínas de VEGF no complexo RPE-coroide isoladas de camundongos C57Bl6 tipo selvagem e MASP-2(-/-) no dia zero. Como mostrado na FIGURA 13A, a avaliação dos níveis de VEGF indicam uma diminuição nos níveis de linha de base para VEGF nos camundongos MASP-2 (-/-) contra os camundongos C57bl de controle e do tipo selvagem. A FIGURA 13B ilustra graficamente os níveis de proteína VEGF medidos no dia três depois da lesão induzida por laser. Como mostrado na FIGURA 13B, os níveis de VEGF foram significantemente aumentados nos camundongos do tipo selvagem (+/+) três dias depois da lesão induzida por laser, compatíveis com os estudos publicados (Nozaki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 2328-33 (2006)). Entretanto, os níveis surpreendentemente muito baixos de VEGF foram vistos nos camundongos MASP-2 (-/-). Avaliação da neovascularização coroidal (CNV):

[00457] Além da redução nos níveis de VEGF após a degeneração macular induzida por laser, a área de CNV foi determinada antes e depois da lesão por laser. A FIGURA 14 ilustra graficamente o volume de CNV medido nos camundongos C57bl tipo selvagem e camundongos MASP-2(-/-) no dia sete após a lesão induzida por laser. Como mostrado na FIGURA 14, os camundongos MASP-2 (-/-) apresentaram cerca de um 30% de redução na área de CNV depois do dano induzido por laser no dia sete em comparação aos camundongos de controle e do tipo selvagem.

[00458] Estas verificações indicam uma redução em VEGF e CNV como visto nos camundongos MASP (-/-) contra o controle do tipo selvagem (+/+) e aquele bloqueio de MASP-2 com um inibidor teria um efeito preventivo ou terapêutico no tratamento da degeneração macular. EXEMPLO 14

236 / 394

[00459] Este exemplo demonstra que a ativação de trombina pode ocorrer após a ativação do caminho de lectina sob condições fisiológicas e demonstra o grau do envolvimento de MASP-2. Em soro de rato normal, a ativação do caminho de lectina leva à ativação de trombina (avaliada como deposição de trombina) concorrente com a ativação de complemento (avaliada como deposição de C4). Como pode ser visto nas FIGURAS 15A e 15B, a ativação de trombina neste sistema é inibida por um anticorpo de bloqueio de MASP-2 (formato de Fab2), exibindo uma curva de resposta de concentração de inibição (FIGURA 15B) que é paralela àquela para a ativação de complemento (FIGURA 15A). Estes dados sugerem que a ativação do caminho de lectina como este ocorre no trauma levará à ativação dos sistemas tanto de complemento quanto de coagulação em um processo que é inteiramente dependente de MASP-2. Por inferência, os anticorpos de bloqueio de MASP2 podem provar eficazes em mitigar casos de coagulação sistêmica excessiva, por exemplo, coagulação intravascular disseminada, que é uma das marcas que leva à mortalidade em casos de traumas maiores. EXEMPLO 15

[00460] Este exemplo provê resultados gerados usando um modelo da reação de Schwartzman localizado da coagulação intravascular disseminada (“DIC”) e, camundongos deficientes em MASP-2 -/- e deficientes em MASP- 2 +/+ suficiente para avaliar o papel do caminho de lectina em DIC. Fundamentos/Análise Racional:

[00461] Como descrito acima, o bloqueio de MASP-2 inibe a ativação do caminho de lectina e reduz a geração das anafilatoxinas C3a e C5a. As anafilatoxinas C3a podem ser mostradas ser agregadores de plaquetas potentes in vitro, mas seu envolvimento in vivo é menos bem definido e a liberação das substâncias de plaquetas e plasmina no reparo de ferimentos pode envolver apenas secundariamente o complemento C3. Neste exemplo, o papel d o caminho de lectina foi analisado em camundongos MASP-2 (-/-) e

237 / 394 Tipo Selvagem (+/+) de modo a indicar se a elevação prolongada da ativação de C3 é necessária para gerar a coagulação intravascular disseminada. Métodos:

[00462] Os camundongos MASP-2 (-/-) usados neste foram gerados como descrito no Exemplo 1 e retrocruzados por pelo menos 10 gerações com C57Bl/6.

[00463] O modelo da reação de Schwartzman localizado foi usado neste experimento. A reação de Schwartzman localizada (LSR) é uma resposta induzida por lipopolissacarídeo (LPS) com contribuições bem distinguidas dos elementos celulares e humorais do sistema imune inato. Dependente se o LSR no complemento é bem estabelecido (Polak, L., et al., Nature 223: 738-739 (1969); Fong J.S. et al., J Exp Med 134: 642-655 (1971)). No modelo de LSR, os camundongos foram iniciados por 4 horas com alfa TNF (500 ng, intraescrotal), depois os camundongos foram anestesiados e preparados quanto a microscopia intravital do músculo cremaster. As redes de vênulas pós-capilares (15 a 60 µm de diâmetro) com bom fluxo sanguíneo (1 a 4 mm/s) foram selecionadas para observação. Os animais foram tratados com anticorpos fluorescentes para seletivamente rotular os neutrófilos ou plaquetas. A rede de vasos foi sequencialmente escaneada e as imagens de todos os vasos foram digitalmente registradas da última análise. Depois de registrar o estado basal da microcirculação, os camundongos receberam uma injeção intravenosa única de LPS (100 µg), sozinhos ou com os agentes listados abaixo. A mesma rede de vasos foi depois escaneada a cada 10 minutos por 1 hora. O acúmulo específico de fluoforos foi identificado pela subtração da fluorescência de base e realçados pela limitação da imagem. A magnitude das reações foi medida a partir das imagens registradas. A medição primária das reações de Schwartzman foi de dados agregados.

[00464] Os estudos compararam os camundongos MASP-2 +/+

238 / 394 suficientes ou do tipo selvagem, expostos a um agente depletor de caminho de complemento conhecido, fator de veneno de cobra (CVF) ou um inibidor do caminho terminal (antagonista de C5aR). Os resultados (FIGURA 16A) demonstram que o CVF assim como um antagonista de C5aR ambos preveniram o aparecimento de agregados na vasculatura. Além disso, os camundongos deficientes em MASP-2 -/- (FIGURA 16B) também demonstraram a inibição completa da reação de Schwartzman localizada, suportando o envolvimento do caminho de lectina. Estes resultados demonstram claramente o papel da MASP-2 na geração de DIC e suporta o uso dos inibidores de MASP-2 para o tratamento e prevenção de DIC. EXEMPLO 16

[00465] Este exemplo descreve a análise de camundongos MASP-2 (-/-) em um Modelo de Transplante Renal Murino. Fundamentos/Análise Racional:

[00466] O papel de MASP-2 no resultado funcional do transplante de rins foi avaliado usando um modelo de camundongo. Métodos:

[00467] O resultado funcional do transplante de rins foi avaliado usando um isoenxerto de rim único nos camundongos de recipiente uninefrecomizado, com seis recipientes de transplante de tipo selvagem (+/+) (B6) e seis recipientes de transplante de MASP-2 (-/-). Para avaliar a função do rim transplantado, o rim nativo restante foi removido do recipiente 5 dias depois do transplante e a função renal foi avaliada 24 horas mais tarde após a medição dos níveis de nitrogênio na ureia no sangue (BUN). Resultados:

[00468] A FIGURA 17 ilustra graficamente os níveis de nitrogênio na ureia do sangue (BUN) do rim nos 6 dias após o transplante dos rins nos recipientes tipo selvagem (+/+) e nos recipientes MASP-2 (-/-). Como mostrado na FIGURA 17, os níveis de BUN muito elevados foram

239 / 394 observados nos recipientes de transplante do tipo selvagem (+/+) (B6) (níveis de BUN normais em camundongos são < 5 mM), indicando insuficiência renal. Ao contrário, os camundongos MASP-2 (-/-) recipientes de xenoenxerto apresentaram níveis de BUN substancialmente baixos, sugerindo uma função renal melhorada. É sabido que estes resultados foram obtidos usando enxertos dos doadores de rins do tipo selvagem (+/+), sugerindo que a ausência de um caminho de lectina funcional no recipiente do transplante sozinho seja suficiente para obter um benefício terapêutico.

[00469] Tomados juntos, estes resultados indicam que a inibição transitória do caminho de lectina por intermédio da inibição de MASP-2 provê um método de reduzir a morbidez e a função de enxerto atrasada no transplante renal e que este método é provável ser útil em outros ambientes de transplante. EXEMPLO 17

[00470] Este exemplo demonstra que os camundongos MASP-2 (-/-) são resistentes ao choque séptico em um Modelo de Peritonite Séptica Polimicrobiana de Murinos. Fundamentos/Análise Racional:

[00471] Para avaliar os efeitos potenciais de MASP-2 (-/-) na infecção, o modelo de ligação e punção cecal (CLP), um modelo de peritonite polimicrobiana séptica foi avaliado. Este modelo é julgado imitar mais precisamente o curso da peritonite séptica humana. O modelo de ligação e punção cecal (CLP) é um modelo em que o ceco é ligado e puncionado por uma agulha, levando ao vazamento contínuo das bactérias na cavidade abdominal que atinge o sangue através da drenagem linfática e são depois distribuídas em todos os órgãos abdominais, levando à falha de múltiplos órgãos e choque séptico (Eskandari et al., J Immunol 148(9): 2724-2730 (1992)). O modelo de CLP imita o curso da septicemia observado em pacientes e induz uma resposta hiperinflamatória precoce seguida por uma

240 / 394 fase hipoinflamatória pronunciada. Durante esta fase, os animais são altamente sensíveis às inoculações bacterianas (Wichterman et al., J. Surg. Res. 29(2): 189-201 (1980)). Métodos:

[00472] A mortalidade da infecção polimicrobiana usando o modelo de ligação e punção cecal (CLP) foi medida em camundongos do tipo selvagem (+/+) (n = 18) e MASP-2 (-/-) (n = 16). Em resumo descrito, os camundongos deficientes em MASP-2 e suas ninhadas do tipo selvagem foram anestesiados e o ceco foi exteriorizado e ligado 30% acima da terminação distal. Depois disto, o ceco foi puncionado uma vez com uma agulha de 0,4 mm de diâmetro. O ceco foi depois substituído na cavidade abdominal e a pele foi fechada com grampos. A sobrevivência dos camundongos submetidos à CLP foi monitorada durante um período de 14 dias depois da CLP. Uma lavagem peritoneal foi coletada em camundongos 16 horas após CLP para medir a carga bacteriana. As diluições em série da lavagem peritoneal foram preparadas em PBS e inoculadas em placas de Mueller Hinton com a incubação subsequente a 37° C sob condições anaeróbicas por 24 horas depois de que a carga das bactérias foi determinada.

[00473] A resposta de TNF-alfa citocina para a infecção bacteriana também foi medida nos Camundongos tipo selvagem (+/+) e MASP-2 (-/-) 16 horas depois do CLP nos pulmões e baços por intermédio da reação de cadeia de polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR). O nível no soro de TNF-alfa 16 horas depois da CLP nos Camundongos tipo selvagem (+/+) e MASP-2 (-/-) também foi quantificado por ELISA intercalado. Resultados:

[00474] A FIGURA 18 ilustra graficamente o porcentual de sobrevivência dos animais tratados com CLP como uma função dos dias depois do procedimento de CLP. Como mostrado na FIGURA 18, a deficiência do caminho de lectina nos camundongos MASP-2 (-/-) não

241 / 394 aumenta a mortalidade dos camundongos depois da poliinfecção microbiana usando o modelo de ligação e punção cecal quando comparado com os camundongos do tipo selvagem (+/+) . Entretanto, como mostrado na FIGURA 19, os camundongos MASP-2 (-/-) mostraram uma carga bacteriana significantemente maior (aproximadamente um aumento de 1000 vezes nos números bacterianos) na lavagem peritoneal depois da CLP quando comparado às suas ninhadas do tipo selvagem (+/+). Estes resultados indicam que os camundongos deficientes em MASP-2 (-/-) são resistentes ao choque séptico. A depuração bacteriana reduzida nos camundongos deficientes em MASP-2 neste modelo pode ser devido a uma fagocitose mediada por C3b prejudicada, conforme foi demonstrado que a deposição de C3 é dependente de MASP-2.

[00475] Foi determinado que a resposta de TNF-alfa citocina à infecção bacteriana não foi elevada nos camundongos MASP-2 (-/-) quando comparado com os controles do tipo selvagem (+/+) (dados não mostrados). Também foi determinado que houve uma concentração o soro significantemente alta de TNF-alfa nos camundongos do tipo selvagem (+/+) 16 horas depois do CLP ao contrário dos camundongos MASP-2 (-/-), onde o nível de soro de TNF-alfa permaneceu quase inalterado. Estes resultados sugerem que a resposta inflamatória intensa à condição séptica foi temperada em camundongos MASP-2 (-/-) e deixados que os animais sobrevivessem na presença de altas contagens bacterianas.

[00476] Tomados juntos, estes resultados demonstram os efeitos prejudiciais potenciais da ativação do caminho de lectina de complemento no caso da septicemia e a mortalidade aumentada em pacientes com septicemia predominante. Estes resultados também demonstram que a deficiência em MASP-2 modula a resposta imune inflamatória e reduz os níveis de expressão dos mediadores inflamatórios durante a septicemia. Portanto, é acreditado que a inibição de MASP-2 (-/-) através da administração dos anticorpos

242 / 394 monoclonais inibidores contra MASP-2 seria eficaz para reduzir a resposta inflamatória em um sujeito sofrendo de choque séptico. EXEMPLO 18

[00477] Este exemplo descreve a análise de camundongos MASP-2 (-/- ) em um Modelo de Infectividade Intranasal em Murino. Fundamentos/Análise Racional:

[00478] Pseudomonas aeruginosa é um Patógeno bacteriano humano oportunista Gram-negativo que causa uma ampla faixa de infecções, particularmente em indivíduos imunocomprometidos. É uma fonte principal de infecções nosocomiais adquiridas, em particular, pneumonia adquirida em hospital. Este também é responsável pela morbidez e mortalidade significante em pacientes com fibrose cística (CF). A infecção pulmonar por P. aeruginosa é distinguida por um forte recrutamento de neutrófilos e uma significante inflamação pulmonar resultando no dano tissular extensivo (Palanki M.S. et al., J. Med. Chem 51: 1546-1559 (2008)).

[00479] Neste exemplo, um estudo foi subcoletado para determinar se a remoção do caminho de lectina em camundongos MASP-2 (-/-) aumenta a suscetibilidade dos camundongos às infecções bacterianas. Métodos:

[00480] Vinte e dois camundongos do tipo selvagem (+/+) , vinte e dois camundongos MASP-2 (-/-) e onze camundongos C3 (-/-) foram inoculados com a administração intranasal de cepas bacterianas de P. aeruginosa. Os camundongos foram monitorados durante seis dias após a infecção e a plotagem de Kaplan-Mayers foi feita mostrando o percentual de sobrevivência. Resultados:

[00481] A FIGURA 20 é uma plotagem de Kaplan-Mayer do percentual de sobrevivência dos camundongos tipo selvagem (+/+), MASP-2 (-/-) ou C3 (-/-) seis dias após a infecção. Como mostrado na FIGURA 20,

243 / 394 nenhuma diferença foi observada nos camundongos MASP-2 (-/-) versus o Camundongos do tipo selvagem (+/+). Entretanto, a remoção do caminho clássico (C1q) nos camundongos C3 (-/-) resultou em uma suscetibilidade severa à infecção bacteriana. Estes resultados demonstraram que a inibição de MASP-2 não aumenta a suscetibilidade à infecção bacteriana, indicando que é possível reduzir complicações inflamatórias indesejadas nos pacientes com trauma inibindo-se a MASP-2 sem comprometer a capacidade do paciente de lutar contra infecções usando o caminho clássico do complemento. EXEMPLO 19

[00482] Este exemplo descreve a análise farmacodinâmica do anticorpo Fab2 anti-MASP-2s com alta afinidade representativa que foi identificado como descrito no Exemplo 10. Fundamentos/Análise Racional:

[00483] Como descrito no Exemplo 10, de modo a identificar os anticorpos de alta afinidade que bloqueiam o caminho de lectina de rato, a proteína de MASP-2 foi utilizada para garimpar uma biblioteca de visualização de fago. Esta biblioteca foi projetada para prover uma alta diversidade imunológica e foi construída usando sequências genéticas de imunoglobina inteiramente humanas. Como descrito no Exemplo 10, aproximadamente 250 clones de fagos individuais foram identificados que ligaram com alta afinidade à proteína MASP-2 do rato através da triagem por ELISA. O sequenciamento destes clones identificou 50 anticorpos MASP-2 únicos que codificam fago. A proteína Fab2 foi expressada destes clones, purificada e analisada quanto a afinidade de ligação de MASP-2 e a inibição do caminho de complemento de lectina funcional.

[00484] Como mostrado na TABELA 6 do Exemplo 10, 17 Fab2s anti-MASP-2 com atividade de bloqueio funcional foram identificados como um resultado desta análise (uma taxa de acerto de 34% para anticorpos de bloqueio). A inibição funcional do caminho de complemento de lectina pelos

244 / 394 Fab2s foi evidente no nível de deposição de C4, que é uma medição direta da clivagem de C4 by MASP-2. De modo importante, a inibição foi igualmente evidente quando a atividade de C3 convertase foi avaliada, demonstrando um bloqueio funcional do caminho de complemento de lectina. Os 17 Fab2s do bloqueio de MASP-2 identificados como descrito no Exemplo 10 inibiram potencialmente a formação de C3 convertase com valores IC50 iguais a ou menores do que 10 nM. Oito das 17 Fab2s identificadas têm valores IC50 na faixa subnanomolar. Além disso, todos os 17 dos Fab2s que bloqueiam MASP-2 fornecem a inibição essencialmente completa da formação de C3 convertase no ensaio de caminho de lectina C3 convertase, como mostrado nas FIGURAS 8A a C e sumarizado na TABELA 6 do Exemplo 10. Além disso, cada uma dos 17 Fab2s anti-MASP-2 de bloqueio mostrados na TABELA 6 inibem potencialmente a geração de C3b (>95%), demonstrando deste modo a especificidade deste ensaio para o caminho de lectina C3 convertase.

[00485] As variantes do isótipo dos anticorpos IgG2c de Rato e IgG2a de camundongo de comprimento total foram derivadas de Fab2 #11. Este exemplo descreve a caracterização in vivo destes isótopos para os parâmetros farmacodinâmicos. Métodos:

[00486] Como descrito no Exemplo 10, a proteína MASP-2 de rato foi utilizada para garimpar uma biblioteca de Fab de visualização de fago, a partir da qual o Fab2#11 foi identificado. As variantes do isótipo de anticorpo IgG2c de rato e IgG2a de camundongo de comprimento total foram derivadas de Fab2#11. Ambos os isótipos de anticorpo IgG2c de rato e IgG2a de camundongo de comprimento total foram distinguidos in vivo quanto seus parâmetros farmacodinâmicos como segue. Estudo In vivo em camundongos:

[00487] Um estudo farmacodinâmico foi realizado em camundongos

245 / 394 para investigar o efeito da dosagem do anticorpo anti-MASP-2 na atividade do caminho de lectina no plasma in vivo. Neste estudo, a deposição de C4 foi medida ex vivo em um ensaio de caminho de lectina em vários pontos de tempo após a administração subcutânea (sc) e intraperitoneal (ip) de 0,3 mg/kg ou 1,0 mg/kg do MoAb de camundongo anti-MASP-2 (isótipos de anticorpo IgG2a de camundongo de comprimento total derivados de Fab2#11).

[00488] A FIGURA 21 ilustra graficamente a deposição específica do caminho de lectina C4b, medida ex vivo em amostras de soro não diluídas coletadas de camundongos (n = 3 camundongos/grupo) em vários pontos de tempo depois da dosagem subcutânea de 0,3 mg/kg ou 1,0 mg/kg do MoAb de camundongo anti-MASP-2. As amostras de soro dos camundongos coletados antes de dosar o anticorpo serviram como controles negativos (100% de atividade), enquanto o soro suplementado in vitro com 100 nM do mesmo anticorpo anti-MASP-2 de bloqueio foi usado como um controle positivo (0% de atividade).

[00489] Os resultados mostrados na FIGURA 21 demonstram uma inibição rápida e completa da deposição de C4b após a administração subcutânea de uma dose de 1,0 mg/kg de MoAb de camundongo anti-MASP-

2. Uma inibição parcial da deposição de C4b foi vista depois da administração subcutânea de 0,3 mg/kg dose de MoAb de camundongo anti-MASP-2.

[00490] O decorrer de tempo da recuperação do caminho de lectina foi seguido por três semanas após uma administração ip única de MoAb de camundongo anti-MASP-2 a 0,6 mg/kg em camundongos. Como mostrado na FIGURA 22, uma queda aguda na atividade do caminho de lectina ocorreu após a dosagem seguido pelo anticorpo através da inibição completa do caminho de lectina que durou cerca de 7 dias após a administração ip reduziu a restauração da lectina.

[00491] Estes resultados demonstram que os derivados de Moab de

246 / 394 camundongo anti-MASP-2 de Fab2 #11 inibem o caminho de lectina dos camundongos em uma maneira responsiva à dose quando ministrados sistemicamente. EXEMPLO 20

[00492] Este exemplo descreve a análise dos derivados Moab anti- MASP-2 de camundongo de Fab2 #11 quanto a eficácia em um modelo camundongo para degeneração macular relacionada com a idade. Fundamentos/Análise Racional:

[00493] Como descrito no Exemplo 10, a proteína MASP-2 de rato foi utilizada para garimpar uma biblioteca de Fab de visualização de fago, a partir da qual Fab2#11 foi identificado como um anticorpo funcionalmente ativo. Os anticorpos de comprimento total dos isótipos IgG2c de rato e IgG2a de camundongo foram gerados de Fab2 #11. O anticorpo de anti-MASP-2 de comprimento total do isótipo IgG2a de camundongo foi distinguido pelos parâmetros farmacodinâmicos como descrito no Exemplo 19. Neste exemplo, os derivados do anticorpo anti-MASP-2 de camundongo de Fab2 #11 de comprimento total foram analisados no modelo de camundongo de degeneração macular relacionada com a idade (AMD), descrito por Bora P.S. et al, J Immunol 174: 491-497 (2005). Métodos:

[00494] Os derivados do isótipo anti-MASP-2 de Fab2 #11 do anticorpo IgG2a de camundongo de comprimento total como descrito no Exemplo 19, foram testados nos modelos de camundongo de degeneração macular relacionada com a idade (AMD) como descrito no Exemplo 13 com as seguintes modificações. Administração de MoAbs anti-MASP-2 de camundongo

[00495] Duas doses diferentes (0,3 mg/kg e 1,0 mg/kg) de MoAb anti- MASP-2 de camundongo junto com um tratamento com isótipo MoAb de controle foram injetadas ip em camundongos do tipo selvagem (+/+) (n = 8

247 / 394 camundongos por grupo) 16 horas antes da indução de CNV Indução da neovascularização coroidal (CNV)

[00496] A indução de neovascularização coroidal (CNV) e medição do volume de CNV foi realizada usando fotocoagulação a laser como descrito no Exemplo 13. Resultados:

[00497] A FIGURA 23 ilustra graficamente a área medida da CNV 7 dias após a lesão por laser em camundongos tratados com o isótipo MoAb de controle ou MoAb anti-MASP-2 de camundongo (0,3 mg/kg e 1,0 mg/kg). Como mostrado na FIGURA 23, nos camundongos pré-tratados com 1,0 mg/kg de MoAb anti-MASP-2, uma redução estatisticamente significante (p <0,01) de aproximadamente 50% na CNV foi observada sete dias após o tratamento com laser. Como também mostrado na FIGURA 23, foi observado que uma dose de 0,3 mg/kg de MoAb anti-MASP-2 não foi eficaz na redução da CNV. É mencionado que a dose de 0,3 mg/kg de MoAb anti-MASP-2 foi mostrada ter uma inibição parcial e transitória da deposição de C4b após a administração subcutânea, como descrito no Exemplo 19 e mostrado na FIGURA 21.

[00498] Os resultados descritos neste exemplo demonstram que o bloqueio de MASP-2 com um inibidor, tal como MoAb anti-MASP-2, tem um efeito preventivo e/ou terapêutico no tratamento da degeneração macular. É mencionado que estes resultados são compatíveis com os resultados observados nos estudos realizados nos camundongos MASP-2 (-/-), descritos no Exemplo 13, em que uma redução de 30% na CNV 7 dias após o tratamento com laser foi observada em camundongos MASP-2 (-/-) em comparação aos camundongos de controle do tipo selvagem. Além disso, os resultados neste exemplo também demonstram que o anticorpo anti-MASP-2 sistemicamente administrado provê um benefício terapêutico local no olho, deste modo destacando o potencial para uma via sistêmica de administração

248 / 394 para tratar os pacientes com AMD. Em resumo, estes resultados fornecem evidências que suportam o uso de MoAb de MASP-2 no tratamento da AMD. EXEMPLO 21

[00499] Este exemplo demonstra que os camundongos deficientes em MASP-2 são protegidos da mortalidade induzida por Neisseria meningitidis depois da infecção com N. meningitidis e aumentaram a depuração bacteriana se comparado com os camundongos de controle do tipo selvagem.

[00500] Análise Racional: Neisseria meningitidis é uma bactéria diplocócica heterotrófica gram-negativa conhecida por seu papel na meningite e outras formas de doença meningocócica tal como meningococcemia. A N. meningitide é uma causa principal da morbidez e mortalidade durante a infância. Complicações severas incluem septicemia, síndrome de Waterhouse- Friderichsen, insuficiência adrenal e coagulação intravascular disseminada (DIC). Ver, por exemplo, Rintala E. et al., Critical Care Medicine 28(7): 2373-2378 (2000). Neste exemplo, o papel do caminho de lectina foi analisado em MASP-2 (-/-) e os camundongos do tipo selvagem (+/+) de modo a indicar se os camundongos deficientes em MASP-2 seriam suscetíveis à mortalidade induzida por N. meningitidis. Métodos:

[00501] Os camundongos MASP-2 knockout foram gerados como descrito no Exemplo 1 e retrocruzados por pelo menos 10 gerações com C57Bl/6. camundongos MASP-2 KO com 10 semanas de idades (n = 10) e camundongos C57/B6 do tipo selvagem (n = 10) foram inoculados através da injeção intravenosa com uma dosagem de 5 x 108 cfu/100 μl, 2x108 cfu/100 μl ou 3 x 107 cfu/100 μl de Neisseria meningitidis Sorogrupo A Z2491 e, 400 mg/kg de ferro dextrano. A sobrevivência dos camundongos depois da infecção foi monitorada durante um período de tempo de 72 horas. As amostras de sangue foram coletadas dos camundongos em intervalos horários depois da infecção e analisados para determinar o nível de soro (cfu/ml em

249 / 394 log) de N. meningitidis de modo a verificar a infecção e determinar a taxa de depuração das bactérias do soro. Resultados:

[00502] A FIGURA 24A ilustra graficamente o percentual de sobrevivência de MASP-2 KO e camundongos do tipo selvagem depois da administração de uma dose infectiva de 5x108/100 μl cfu de N. meningitidis. Como mostrado na FIGURA 24A, depois da infecção com a dose mais alta de 5 x 108/100 μl cfu de N. meningitidis, 100% dos camundongos MASP-2 KO sobreviveram por todo o período de 72 horas depois da infecção. Ao contrário, somente 20% dos camundongos do tipo selvagem ainda estavam vivos 24 horas depois da infecção. Estes resultados demonstram que os camundongos deficientes em MASP-2 são protegidos da mortalidade induzida pela N. meningitidis.

[00503] A FIGURA 24B ilustra graficamente o log cfu/ml de N. meningitidis recuperado em pontos de tempo diferentes em amostras de sangue coletadas dos camundongos MASP-2 KO e do tipo selvagem infectados com 5 x 108 cfu/100 μl de N. meningitidis. Como mostrado na FIGURA 24B, em camundongos do tipo selvagem, o nível de N. meningitidis no sangue atingiu um pico de cerca de 6,5 log cfu/ml a 24 horas depois da infecção e caiu para zero em 48 horas depois da infecção. Ao contrário, nos camundongos MASP-2 KO, o nível de N. meningitidis atingiu um pico de cerca de 3,5 cfu/ml em log a 6 horas depois da infecção e caiu para zero em 36 horas depois da infecção.

[00504] A FIGURA 25A ilustra graficamente o percentual de sobrevivência de camundongos MASP-2 KO e do tipo selvagem depois da infecção com 2 x 108 cfu/100 μl de N. meningitidis. Como mostrado na FIGURA 25A, depois da infecção com a dose de 2x108 cfu/100 μl N. meningitidis, 100% dos camundongos MASP-2 KO sobreviveram por todo o período de 72 horas depois da infecção. Ao contrário, somente 80% dos

250 / 394 camundongos do tipo selvagem ainda estavam vivos 24 horas depois da infecção. Compatíveis com os resultados mostrados na FIGURA 24A, estes resultados também demonstram que os camundongos deficientes em MASP-2 são protegidos da mortalidade induzida pela N. meningitidis.

[00505] A FIGURA 25B ilustra graficamente o cfu/ml em log de N. meningitidis recuperada em pontos de tempo diferentes em amostras de sangue coletadas dos camundongos do tipo selvagem infectados com 2x108 cfu/100 μl de N. meningitidis. Como mostrado na FIGURA 25B, o nível de N. meningitidis no sangue dos camundongos do tipo selvagem infectados com 2 x 108 cfu atingiu um pico de cerca de 4 log cfu/ml em 12 horas depois da infecção e caiu para zero em 24 horas depois da infecção. A FIGURA 25C ilustra graficamente o log cfu/ml da N. meningitidis recuperada em pontos de tempo diferentes em amostras de sangue coletadas dos camundongos MASP- 2 KO infectados com 2 x 108 cfu/100 de μl N. meningitidis. Como mostrado na FIGURA 25C, o nível de N. meningitidis no sangue de camundongos MASP-2 KO infectados com 2 x 108 cfu atingiram um nível de pico de cerca de 3,5 log cfu/ml em 2 horas depois da infecção e caiu para zero em 3 horas depois da infecção. Compatíveis com os resultados mostrados na FIGURA 24B, estes resultados demonstram que, embora os camundongos MASP-2 KO foram infectados com a mesma dose de N. meningitidis que os camundongos do tipo selvagem, os camundongos MASP-2 KO têm uma depuração melhorada das bactérias se comparado com o tipo selvagem.

[00506] O percentual de sobrevivência dos camundongos MASP-2 KO e do tipo selvagem depois da infecção com a menor dose de 3x107 cfu/100 μl de N. meningitidis foi de 100% no período de tempo de 72 horas (dados não mostrados). Debate

[00507] Estes resultados mostram que os camundongos deficientes em MASP-2 são protegidos da mortalidade induzida pela N. meningitidis e têm a

251 / 394 depuração bacteriana melhorada se comparado com os camundongos do tipo selvagem. Portanto, em vista destes resultados, é esperado que a aplicação terapêutica de inibidores de MASP-2, tais como MoAb de MASP-2, seria esperada ser eficaz para tratar, prevenir ou mitigar os efeitos da infecção com as bactérias de N. meningitidis (isto é, septicemia e DIC). Além disso, estes resultados indicam que a aplicação terapêutica dos inibidores de MASP-2, tais como MoAb de MASP-2 não predisporia um sujeito a um risco aumentado de contrair as infecções de N. meningitidis. EXEMPLO 22

[00508] Este exemplo descreve a verificação da nova ativação de desvio C4 mediada pelo caminho de lectina e dependente de MASP-2 do complemento C3. Análise Racional:

[00509] O principal benefício terapêutico de utilizar os inibidores da ativação de complemento para limitar a lesão miocárdica de isquemia/reperfusão (MIRI) foi convincentemente demonstrado em um modelo de infarto do miocárdio em ratos experimentais duas décadas atrás: o sCR1 recombinante, um derivado truncado solúvel do receptor de complemento da superfície celular tipo-1 (CR1), foi fornecido intravenosamente e seu efeito foi avaliado em um modelo de ratos in vivo de MIRI. O tratamento com sCR1 reduziu o volume de infarto em mais do que 40% (Weisman, H.F., et al., Science 249: 146-151 (1990)). O potencial terapêutico deste inibidor recombinante foi subsequentemente demonstrado em um teste clínico mostrando que a administração de sCR1 em pacientes com MI preveniu a falha contrátil no coração pós-isquêmico (Shandelya, S., et al., Circulation 87: 536-546 (1993)). O mecanismo primário que leva à ativação do complemento no tecido isquêmico, entretanto, não foi finalmente definido, principalmente devido à falta de modelos experimentais apropriados, o entendimento limitado dos processos moleculares que levam à

252 / 394 ativação de complemento de células privadas de oxigênio e a diafonia e sinergismos entre os diferentes caminhos de ativação de complemento.

[00510] Como um componente fundamental da resposta imune, o sistema de complemento provê a proteção contra microrganismos invasores através mecanismos tanto dependentes quanto independentes de anticorpos. O mesmo orquestra muitas interações celulares e humorais dentro da resposta imune, incluindo a quimiotaxia, fagocitose, adesão celular e diferenciamento da célula B. Três caminhos diferentes iniciam a cascata de complemento: o caminho clássico, o caminho alternativo e o caminho de lectina. O subcomponente de reconhecimento do caminho clássico C1q liga a uma variedade de alvos – mais proeminentemente aos complexos imunes - para iniciar a ativação às etapas da serina proteases associadas, C1r e C1s, provendo um mecanismo principal para a depuração de patógeno e complexo imune após o engrenamento pelo sistema imune adaptativo. A ligação de C1q aos complexos imunes converte o dímero de zimogênio C1r na sua forma ativa para clivar e deste modo ativar as C1s. As C1s traduzem a ligação de C1q na ativação de complemento em duas etapas de clivagem: Esta primeiro converte C4 em C4a e C4b e depois cliva C2 ligado a C4b para formar a C4b2a de C3 convertase. Este complexo converte o componente C3 abundante em plasma em C3a e C3b. O acúmulo de C3b na proximidade imediata do complexo de C4b2a troca a especificidade do substrato de C3 a C5 para formar a C5 convertase C4b2a(C3b)n. Os complexos de C3 e C5 convertase gerados por intermédio da ativação do caminho clássico são idênticoss àqueles gerados através da via de ativação do caminho de lectina. No caminho alternativo, a hidrólise espontânea de baixo nível do componente C3 resultaram na deposição dos fragmentos de proteína nas superfícies celulares, provocando a ativação de complemento em células estranhas, enquanto as proteínas reguladoras associadas com células nos tecidos hospedeiros evitam a ativação, deste modo prevenindo um autodano. Como o

253 / 394 caminho alternativo, o caminho de lectina pode ser ativado na ausência de complexos imunes. A ativação é iniciada através da ligação de uma ativação multimolecular do complexo do caminho de lectina para os Padrões Moleculares Associados ao Patógeno (PAMPs), principalmente as estruturas de carboidrato apresentadas nos patógenos bacterianos, fúngicos ou virais ou padrões de glicosilação aberrantes em células privadas de oxigênio apoptóticas, necróticas ou malignas (Collard, C.D., et al., Am. J. Pathol. 156: 1549-1556 (2000); Walport, M.J., N. Engl. J. Med. 344: 1058-1066 (2001); Schwaeble, W., et al., Immunobiology 205: 455-466 (2002); e Fujita, T., Nat. Rev. Immunol. 2: 346-353 (2002)).

[00511] A lectina de ligação de manana (MBL) foi o primeiro subcomponente de reconhecimento de carboidrato mostrado formar complexos com um grupo de novas serinas proteases, chamadas serina proteases associadas com MBL (MASPs) e numeradas de acordo com a sequência da sua verificação (isto é, MASP-1, MASP-2 e MASP-3). No ser humano, os complexos de ativação do caminho de lectina podem ser formados com quatro subcomponentes de reconhecimento de carboidrato alternativos com diferentes especificidades de ligação ao carboidrato, isto é, MBL 2 e três diferentes membros da família da ficolina, a saber, L-Ficolina, H-ficolina e M-ficolina e MASPs. Duas formas de MBL, MBL A e MBL C e ativação da lectina ficolina-A forma os complexos de caminhos com MASPs no plasma de camundongos e ratos. Nós possuímos previamente MASP-2 clonada e distinguida e um produto genético de MASP-2 adicional truncado de 19 kDa, chamado de MAp19 ou sMAP, nos seres humanos, camundongos e ratos (Thiel, S., et al., Nature 386: 506-510 (1997);. Stover, C.M., et al., J. Immunol. 162: 3481-3490 (1999); Takahashi, M., et al., Int. Immunol. 11: 859-863 (1999); e Stover, C.M., et al., J. Immunol. 163: 6848-6859 (1999)). MAp19/ sMAP é destituído da atividade de protease, mas pode regular a ativação do caminho de lectina competindo-se quanto a ligação das MASPs

254 / 394 para os complexos de reconhecimento de carboidrato (Iwaki, D. et al., J. Immunol. 177: 8626-8632 (2006)).

[00512] Existem evidências sugerindo que das três MASPs, somente a MASP-2 é necessária para traduzir a ligação do caminho dos complexos de reconhecimento da lectina na ativação de complemento (Thiel, S., et al. (1997); Vorup-Jensen, T., et al., J. Immunol. 165: 2093-2100 (2000); Thiel, S., et al., J. Immunol. 165: 878-887 (2000); Rossi, V., et al., J. Biol. Chem. 276: 40880-40887 (2001)). Esta conclusão é sublinhada pelo fenótipo de uma cepa de camundongo mais recentemente descrita deficiente em MASP-1 e MASP-3. Além de um atraso no início da ativação de complemento mediada pelo caminho de lectina in vitro – os camundongos deficientes em MASP-1/3 retém a atividade funcional do caminho de lectina. A reconstituição de soro de MASP-1 e MASP-3 deficiente com MASP-1 recombinante supera este atraso na ativação do caminho de lectina implicando que a MASP-1 pode facilitar a ativação da MASP-2 (Takahashi, M., et al., J. Immunol. 180: 6132- 6138 (2008)). Um estudo mais recente tem mostrado que a MASP-1 (e provavelmente também a MASP-3) é necessária para converter a Fator D da enzima de ativação do caminho alternativo de sua forma zimogênica em sua forma enzimaticamente ativa (Takahashi, M., et al., J. Exp. Med. 207: 29-37 (2010)). A importância fisiológica deste processo é enfatizada pela ausência da atividade do caminho alternativo funcional no plasma de camundongos deficientes em MASP-1/3.

[00513] As cepas de camundongo recentemente geradas com deficiências alvejadas combinadas do caminho dos subcomponentes do reconhecimento do carboidrato de lectina MBL A e MBL C podem ainda iniciar a ativação do caminho de lectina por intermédio do subcomponente do reconhecimento do caminho de lectina de murino remanescente ficolina A (Takahashi, K., et al., Microbes Infect. 4: 773-784 (2002)). A ausência de qualquer atividade funcional no caminho de lectina residual nos camundongos

255 / 394 deficientes em MASP-2 libera um modelo conclusivo ao estudo no papel do seu braço efetor da imunidade humoral inato na saúde e doença.

[00514] A disponibilidade de cepas de camundongos deficientes em C4 e MASP-2 nos permitiu definir um novo caminho de ativação de desvio de C4 específico do caminho de lectina, mas dependente de MASP-2 do complemente C3. A contribuição essencial deste novo caminho de ativação de desvio de C4 mediado pelo caminho de lectina para a perda tissular pós- isquêmica é sublinhada pelo fenótipo de proteção proeminente de deficiência de MASP-2 em MIRI enquanto os camundongos deficientes em C4 testados no mesmo modelo não mostram nenhuma proteção.

[00515] Neste exemplo, nós descrevemos um novo caminho de ativação do desvio de C4 mediado pela lectina e dependente de MASP-2 do complemento C3. A relevância fisiológica desta nova via de ativação é estabelecida pelo fenótipo de proteção de deficiência em MASP-2 em um modelo experimental de lesão do miocárdio de isquemia/reperfusão (MIRI), onde os animais deficientes em C4 não foram protegidos. Métodos:

[00516] Camundongos deficientes em MASP-2 não apresentaram anormalidades graves. Os camundongos deficientes em MASP-2 foram gerados como descrito no Exemplo 1. Os camundongos deficientes em MASP-2 tanto heterozigóticos (+/-) quanto homozigóticos (-/-) são saudáveis e férteis e não mostram nenhuma anormalidade grave. Sua expectativa de vida é similar àquela das suas ninhadas do tipo selvagem (>18 meses). Antes de estudar o fenótipo destes camundongos e, modelos experimentais da doença, nossa linha de MASP-2-/- foi retrocruzada por onze gerações em um fundo de C57BL/6. A ausência total de MASP-2 no mRNA foi confirmada por Northern blotting das preparações de RNA do fígado selecionadas poli A+ , enquanto o mRNA de 1,2kb codificando MAp19 ou sMAP (um produto de entrançamento alternativo truncado do gene MASP2) é abundantemente

256 / 394 expressado.

[00517] A análise de qRT-PCR usando pares de iniciadores específicos para a sequência de codificação para o domínio de serina protease de MASP-2 (cadeia B) ou o restante da sequência de codificação para a cadeia A mostrou que nenhuma cadeia B que codifica o mRNA é detectável em camundongos MASP-2-/- enquanto a abundância do transcrito de mRNA de cadeia A rompido foi significantemente aumentada. Do mesmo modo, a abundância do mRNA que codifica MAp19/sMAP é aumentada em camundongos MASP-2 +/- e MASP-2 -/-. Os níveis de MASP-2 no plasma, determinados por ELISA para os 5 animais de cada genótipo, foram de 300 ng/ml para os controles do tipo selvagem (faixa de 260 a 330 ng/ml), 360 ng/ml para camundongos heterozigóticos (faixa de 330 a 395 ng/ml) e indetectável em camundongos MASP-2-/-. Usando qRT-PCR, os perfis de expressão de mRNA foram estabelecidos demonstrando que os camundongos MASP-2-/- expressam mRNA para MBL A , MBL C, ficolina A, MASP-1, MASP-3, C1q, C1rA, C1sA, Fator B, Fator D, C4 e C3 em uma abundância similar àquela das suas ninhadas suficientes em P-2 (dados não mostrados).

[00518] Os níveis de C3 no plasma das ninhadas MASP-2-/- (n = 8) e MASP-2+/+ (n = 7) foram medidos usando um kit ELISA de camundongo C3 comercialmente disponível (Kamiya, Biomedical, Seattle, WA). Os níveis de C3 dos camundongos deficientes em MASP-2 (média de 0,84 mg/ml, +/- 0,34) foram similares àqueles dos controles do tipo selvagem (média de 0,92, +/- 0,37). Resultados: A MASP-2 é essencial para a atividade funcional do caminho de lectina.

[00519] Como descrito no Exemplo 2 e mostrado na FIGURA 5, as análises in vitro de MASP-2-/- no plasma mostraram uma ausência total da atividade do caminho de lectina funcional nas superfícies que ativam Manana e revestidas com Zimosano para a ativação de C4. Do mesmo modo, nem o

257 / 394 C4 dependente do caminho de lectina nem a clivagem de C3 foram detectáveis no plasma de MASP-2-/- nas superfícies revestidas com N-acetil glicosamina, que liga e provoca a ativação por intermédio de MBL A, MBL C e ficolina A (dados não mostrados).

[00520] As análises do soro e plasma dos camundongos MASP-2-/- demonstram claramente que MASP-2 é essencialmente necessária para ativar o complemento por intermédio do caminho de lectina. A deficiência total da atividade funcional do caminho de lectina, entretanto, deixa os outros caminhos de ativação de complemento intactos: o MASP-2-/- no plasma pode ainda ativar o complemento por intermédio do caminho clássico (FIGURA 26A) e do caminho alternativo (FIGURA 26B). Nas FIGURAS 26A e 26B, o símbolo “*” indica o soro do tipo selvagem (MASP-2 (+/+)); o símbolo “●” indica o soro do tipo selvagem (C1q esgotado); o símbolo “□” indica o soro de MASP-2 (-/-); e o símbolo “∆” indica o soro de MASP-2 (-/-) (C1q esgotado).

[00521] A FIGURA 26A ilustra graficamente que os camundongos MASP-2-/- retém um caminho clássico funcional: a deposição de C3b foi ensaiada em placas de microtitulação revestidas com complexos imunes (gerados in situ revestindo com BSA e depois adicionando IgG de cabra anti- BSA). A FIGURA 26B ilustra graficamente que os camundongos deficientes em MASP-2 retêm um caminho alternativo funcional: A deposição de C3b foi ensaiada em placas de microtitulação revestidas com Zimosano sob condições que permitem apenas a ativação do caminho alternativo (tampão contendo Mg2+ e EGTA). Os resultados mostrados na FIGURA 26A e FIGURA 26B são as médias das duplicatas e são típicos dos três experimentos independentes. Os mesmos símbolos para as fontes de plasma foram usados em todos os lugares. Estes resultados mostram que um caminho alternativo funcional é apresentado em camundongos deficientes em MASP-2, como evidenciado nos resultados mostrados na FIGURA 26B sob condições

258 / 394 experimentais projetadas para provocar diretamente o caminho alternativo, enquanto inativando tanto o caminho clássico quanto o caminho de lectina. O caminho de lectina da ativação de complemento contribui criticamente para a perda do tecido inflamatório na lesão do miocárdio por isquemia/reperfusão (MIRI).

[00522] De modo a estudar a contribuição da atividade funcional do caminho de lectina para MIRI, nós comparamos os camundongos MASP-2-/- e os controles de ninhada do tipo selvagem em um modelo de MIRI após a ligação transitória e reperfusão do ramo descendente anterior esquerdo da artéria coronária (LAD). A presença ou ausência do complemento C4 não tem impacto no grau de perda isquêmica de tecido em MIRI. Nós avaliamos o impacto da deficiência de C4 no tamanho dos infartes a seguir da MIRI experimental. Como mostrado na FIGURA 27A e FIGURA 27B, os tamanhos do infartes idênticos foram observados nos camundongos tanto deficientes em C4 quanto em suas ninhadas do tipo selvagem. A FIGURA 27A ilustra graficamente a perda de tecido induzida por MIRI após a ligação de LAD e reperfusão em camundongos C4-/- (n = 6) e controles de ninhada do tipo selvagem coincidentes (n = 7). A FIGURA 27B ilustra graficamente INF como uma função de AAR, demonstrando claramente que os camundongos C4-/- são tão suscetíveis à MIRI quanto seus controles do tipo selvagem (linha tracejada).

[00523] Estes resultados demonstram que os camundongos deficientes em C4 não são protegidos da MIRI. Este resultado foi inesperado, considerando que há um conflito com a visão amplamente aceita de que o fragmento de ativação C4 principal, C4b, é um componente essencial do caminho de lectina clássico e de C3 convertase C4b2a. Portanto, nós avaliamos se uma ativação específica do caminho de lectina residual do complemente C3 pode ser detectada em camundongo deficiente em C4 e plasma humano.

259 / 394 O caminho de lectina pode ativar o complemento C3 na ausência de C4 por intermédio de uma nova Via de ativação de caminho secundário de C4 dependente de MASP-2.

[00524] Encorajado por relatos históricos que indicam a existência de uma via de ativação de passagem secundária de C4 no soro de porquinhos-da- índia deficientes em C4 (May, J.E. and M. Frank, J. Immunol. 111: 1671- 1677 (1973)), nós analisamos se os camundongos deficientes em C4 podem ter um caminho residual clássico ou de atividade funcional de lectina e a ativação monitorada de C3 sob condições de ensaio específicos do caminho que excluem as contribuições do caminho alternativo.

[00525] A deposição de C3b foi ensaiada em placas de microtitulação revestidas com manana usando o plasma recalcificado em concentrações plasmáticas proibitivas para a ativação do caminho alternativo (1,25% e abaixo). Enquanto nenhuma clivagem de C3 foi detectável em plasma deficiente em C4 testado quanto a ativação do caminho clássico (dados não mostrados), uma atividade de clivagem de C3 residual forte foi observada no plasma de camundongo deficiente em C4 quando iniciando a ativação de complemento por intermédio do caminho de lectina. A dependência do caminho de lectina é demonstrada através da inibição competitiva da clivagem de C3 após a pré-incubação das diluições de plasma deficiente em C4 com Manana solúvel (ver a FIGURA 28A). Como mostrado na FIGURA 28A-D, a ativação dependente de MASP-2 de C3 foi observada na ausência de C4. A FIGURA 28A ilustra graficamente a deposição de C3b por C4+/+ (cruzes) e C4-/- (círculos abertos) plasma de camundongo. Pré-incubar o plasma de C4-/- com excesso (1 µg/ml) de Manana na fase fluida antes do ensaio inibe completamente a deposição de C3 (círculos preenchidos). Os resultados são típicos de 3 experimentos dependentes. A FIGURA 28B ilustra graficamente os resultados de um experimento em que o plasma de camundongos do tipo selvagem, deficiente em MASP-2 (quadrados abertos) e

260 / 394 C4-/- (1%) foram misturados com várias concentrações de mAbM11 de MASP-2 anti-rato (abscissa) e ensaio de deposição de C3bed em placas revestidas com Manana. Os resultados são as médias (± SD) de 4 ensaios (duplicatas de 2 de cada tipo de plasma). A FIGURA 28C ilustra graficamente os resultados de um experimento no plasma humano: NHS reunidos(cruzes), plasma C4-/- (círculos abertos) e plasma C4-/- pré-incubado com 1 µg/ml de manana (círculos preenchidos). Os resultados são representativos dos três experimentos dependentes. A FIGURA 28D ilustra graficamente que a inibição da deposição de C3b em plasma humano suficiente em C4 e deficiente em C4 (1%) pelo mAbH3 anti-MASP-2 humano (Médias ± SD das triplicatas). Como mostrado na FIGURA 28B, a ativação de C3 dependente do caminho de lectina foi detectada em plasma de MASP-2-/- ensaiado em paralelo, implicando que esta via de ativação de passagem secundária de C4 e de C3 é dependente de MASP-2.

[00526] Para adicionalmente corroborar estas ideias, nós estabelecemos uma série de mAbs inibitórias recombinantes isoladas das bibliotecas de anticorpo de visualização de fago através da triagem de afinidade contra o resíduo de MASP-2A recombinante humano e de rato (onde o resíduo de serina do domínio de protease ativo foi substituído por um resíduo de alanina através da mutagênese dirigida ao local para prevenir a degradação autolítica do antígeno). Os anticorpos recombinantes contra MASP-2 (AbH3 e AbM11) foram isolados das Bibliotecas de Anticorpo Combinatórias (Knappik, A., et al., J. Mol. Biol. 296: 57-86 (2000)), usando MASP-2A recombinante humana e de rato como antígenos (Chen, C.B. e Wallis, J. Biol. Chem. 276: 25894- 25902 (2001)). Um fragmento de Fab2 anti-rato que inibiu potencialmente a ativação mediada pelo caminho de lectina de C4 e C3 em plasma de camundongo (IC50~1 nM) foi convertido a um anticorpo IgG2a de comprimento total. O soro policlonal anti-MASP-2A antimurino foi elevado em ratos. Estas ferramentas nos permitiram confirmar a dependência de

261 / 394 MASP-2 deste novo caminho de lectina da cia de ativação de passagem secundária de C4 específica de C3, como novamente descrito abaixo.

[00527] Como mostrado na FIGURA 28B, M211, um anticorpo monoclonal inibidor que seletivamente liga ao MASP-2 de camundongo e rato inibiu a ativação da passagem secundária de C4 de C3 em camundongo deficientes em C4 assim como a ativação de C3 do plasma de camundongo do tipo selvagem por intermédio do caminho de lectina em uma maneira dependente da concentração com valores de IC50 similares. Todos os ensaios foram realizados em altas diluições plasmáticas rendendo a via de ativação do caminho alternativo disfuncional (com a concentração plasmática mais alta sendo de 1,25%).

[00528] De modo a investigar a presença de uma ativação análoga do caminho secundário de C4 específico do caminho de lectina de C3 em seres humanos, nós analisamos o plasma de um doador com uma deficiência herdada de ambos os genes C4 humanos (isto é, C4A e C4B), resultando na ausência total de C4 (Yang, Y., et al., J. Immunol. 173: 2803-2814 (2004)). A FIGURA 28C mostra que este plasma do paciente ativa eficazmente C3 em altas diluições plasmáticas (produzindo o caminho de ativação alternativa disfuncional). O modo específico do caminho de lectina da ativação de C3 em placas revestidas com Manana é demonstrado em plasma deficiente em C4 de murino (FIGURA 28A) e plasma deficiente em C4 humano (FIGURA 28C) adicionando-se concentrações em excesso de Manana de fase fluida. A dependência de MASP-2 deste mecanismo de ativação de C3 no plasma deficiente em C4 humano foi avaliada usando AbH3, um anticorpo monoclonal que especificamente se liga à MASP-2 humana e remove a atividade funcional de MASP-2. Como mostrado na FIGURA 28D, AbH3 inibiu a deposição de C3b (e C3dg) em plasma humano tanto suficiente em C4 quanto deficiente em C4 com potência comparável.

262 / 394

[00529] De modo a avaliar um possível papel de outros componentes de complemento na ativação de desvio de C4 de C3, nós testamos plasma de camundongos MASP-1/3 -/- e Bf/C2 -/- junto com plasma de MASP-2 -/-, C4 -/- e C1q -/- (como controles) sob as condições de ensaio tanto específicas do caminho da lectina quanto específicas do caminho clássico. A quantidade relativa da clivagem de C3 foi plotada contra a quantidade de C3 depositada quando do uso de plasma WT.

[00530] A FIGURA 29A ilustra graficamente uma análise comparativa da atividade da C3 convertase em plasma de várias cepas de camundongo deficientes em complemento testadas sob condições de ensaio específicas do caminho de ativação da lectina ou caminho de ativação clássico. Amostras de plasma diluídas (1%) de camundongos WT (n = 6), camundongos MASP-2 -/- (n = 4), camundongos MASP-1/3 -/- (n = 2), camundongos C4 -/- (n = 8), camundongos C4/MASP-1/3 -/- (n = 8), camundongos Bf/C2 -/- (n = 2) e C1q -/- (n = 2) foram testadas em paralelo. A reconstituição de plasma de Bf/C2 -/- com 2,5 µg/ml de C2 recombinante de rato (Bf/C2 -/-+C2) restaurou a deposição de C3b. Os resultados são médias (±SD). **p<0,01 (comparado com plasma WT). Como mostrado na FIGURA 29A, deposição de C3 substancial é observada em plasma C4 -/- testado sob as condições de ensaio específicas do caminho da lectina, mas não sob as condições específicas do caminho clássico. Mais uma vez, nenhuma deposição de C3 foi observada em plasma deficiente de MASP-2 por intermédio da via de ativação do caminho da lectina, enquanto que o mesmo plasma depositou C3 por intermédio do caminho clássico. No plasma MASP-1/3 -/-, a deposição de C3 ocorreu nas condições de ensaio específicas tanto do caminho da lectina quanto no clássico. Nenhuma deposição de C3 foi observada em plasma com uma deficiência combinada de C4 e MASP-1/3, usando as condições específicas do caminho da lectina ou caminho clássico. Nenhuma deposição de C3 é detectável em plasma C2/Bf -/-, por intermédio do caminho da lectina, ou por

263 / 394 intermédio do caminho clássico. A reconstituição de plasma de camundongo C2/Bf-/- com C2 recombinante, entretanto, restaurou a clivagem de C3 tanto mediada pelo caminho da lectina quanto pelo caminho clássico. As condições de ensaio foram validadas usando plasma C1q -/-. A FIGURA 29B ilustra graficamente as cinéticas resolvidas pelo tempo da atividade da C3 convertase em plasma de várias cepas de camundongo deficientes em plasma de complemento WT, fB -/-, C4 -/-, MASP-1/3-/-, e MASP-2-/-, testadas sob as condições de ensaio específicas do caminho de ativação da lectina (1% de plasma, os resultados são típicos de três experimentos independentes). Como mostrado na FIGURA 29B, enquanto que nenhuma clivagem de C3 foi observada em plasma MASP-2-/-, o plasma fB-/- clivou C3 com cinéticas similares ao plasma WT. Uma demora significante no caminho da conversão dependente de lectina de C3 para C3b (e C3dg) foi observada em C4 -/- assim como em plasma deficiente em MASP-1/3. Esta demora de ativação de C3 em plasma MASP-1/3-/- foi recentemente mostrada ser MASP-1, ao invés de dependente de MASP-3 (Takahashi, M., et al., J. Immunol. 180: 6132-6138 (2008)). Debate:

[00531] Os resultados descritos neste Exemplo fortemente sugerem que a atividade funcional de MASP-2 é essencial para a ativação de C3 por intermédio do caminho da lectina tanto na presença quanto na ausência de C4. Além disso, C2 e MASP-1 são requeridos para esta nova via de ativação de desvio de C4 específica do caminho da lectina de C3 funcionar. A análise comparativa de atividade funcional do caminho da lectina em plasma MASP- 2 -/- assim como C4 -/- revelou a existência de uma via de ativação independente de C4, mas dependente de MASP-2 anteriormente não reconhecida de C3 de complemento e mostrou que C3 pode ser ativado em um modo dependente do caminho da lectina na ausência total de C4. Embora a composição molecular detalhada e a sequência de eventos de ativação desta

264 / 394 nova C3 convertase dependente de MASP-2 permaneça para ser elucidada, nossos resultados implicam que esta via de ativação do desvio C4 adicionalmente requer a presença de C2 de complemento assim como MASP-

1. A perda da atividade de clivagem de C3 mediada pelo caminho da lectina em plasma de camundongos com deficiência de C4 e MASP-1/3 combinada pode ser explicada por um papel mais recentemente descrito de MASP-1 para realçar a ativação de complemento dependente de MASP-2 através da clivagem e ativação diretas de MASP-2 (Takahashi, M., et al., J. Immunol. 180: 6132-6138 (2008)). Do mesmo modo, MASP-1 pode ajudar a atividade funcional de MASP-2 através da sua capacidade para clivar C2 (Moller- Kristensen, et al., Int. Immunol. 19: 141-149 (2007)). Ambas as atividades podem explicar a taxa reduzida pela qual plasma deficiente em MASP-1/3 cliva C3 por intermédio da ativação do caminho da lectina e porque MASP-1 pode ser requerido para sustentar a conversão de C3 por intermédio da via de ativação do desvio de C4.

[00532] A incapacidade do plasma C2/fB -/- para ativar C3 por intermédio do caminho da lectina foi mostrado ser dependente de C2 como a adição de plasma C2 para C2/fB -/- de rato recombinante restaura a capacidade do plasma reconstituído para ativar C3 nas placas revestidas com manana.

[00533] A verificação de que a deficiência de C4 especificamente rompe o caminho clássico de ativação de complemento enquanto que o caminho da lectina retém um nível fisiologicamente crítico da atividade de C3 convertase por intermédio de uma via de ativação do desvio de C4 dependente de MASP-2 requer uma reavaliação do papel do caminho da lectina em vários modelos de doença, incluindo infecção pela S. pneumoniae experimental (Brown, J. S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99: 16969-16974 (2002)); Encefalomielite Alérgica Experimental (Boos, L. A., et al., Glia 49: 158-160 (2005)); e modelos de regeneração hepática de murino dependente de C3

265 / 394 (Clark, A., et al., Mol. Immunol. 45: 3125-3132 (2008)). O último grupo demonstrou que os camundongos deficientes em C4 podem ativar C3 em uma maneira independente do caminho alternativo como a inibição in vivo do caminho alternativo por uma depleção mediada por anticorpo da atividade funcional do fator B não afetou a regeneração hepática dependente da clivagem de C3 em camundongos C4 -/- (Clark, A., et al. (2008)). Esta via de ativação do desvio de C4 mediada pelo caminho da lectina de C3 também pode explicar a falta de um fenótipo protetivo de deficiência de C4 no nosso modelo de MIRI assim como em um modelo anteriormente descrito de rejeição de aloenxerto renal (Lin, T., et al., Am. J. Pathol. 168: 1241-1248 (2006)). Ao contrário, nosso resultado recente tem independentemente demonstrado um fenótipo protetivo significante de camundongos MASP-2 -/- em modelos de transplante renal (Farrar, C. A., et al., Mol. Immunol. 46: 2832 (2009)).

[00534] Em resumo, os resultados deste Exemplo sustentam a vista de que a ativação de desvio de C4 dependente de MASP-2 de C3 é um mecanismo fisiologicamente relevante que pode ser importante sob condições onde a disponibilidade de C4 é limitar a ativação de C3. EXEMPLO 23

[00535] Este exemplo descreve a ativação de C3 pelos substratos de trombina e deposição de C3 sobre manana nos camundongos tipo selvagem (+/+), MASP-2 (-/-), F11 (-/-), F11/C4 (-/-) e C4 (-/-). Análise Racional:

[00536] Como descrito no Exemplo 14, foi determinado que a ativação de trombina pode ocorrer após a ativação do caminho de lectina sob condições fisiológicas e demonstra o grau de envolvimento de MASP-2. C3 desempenha um papel central na ativação do sistema de complemento. A ativação de C3 é necessária para a ativação dos caminhos tanto clássico quanto alternativo de complemento. Um experimento foi realizado para

266 / 394 determinar se C3 é ativado pelos substratos de trombina. Métodos: Ativação de C3 pelos substratos de trombina

[00537] A ativação de C3 foi medida na presença das seguintes formas ativadas de substratos de trombina; FCXIa humana, FVIIa humana, FXa bovina, FXa humana, proteína C ativada humana e trombina humana. C3 foi incubado com os vários substratos de trombina, depois separado sob condições redutoras sobre géis de poliacrilamida com 10% de SDS. Depois transferência eletroforética usando membrana de celulose, a membrana foi incubada com C3 monoclonal anticamundongo de rato acoplado a biotina, detectado com um kit de estreptavidina-HRP e desenvolvido usando reagente ECL. Resultados:

[00538] A ativação de C3 envolve a clivagem da cadeia a intacta na cadeia a’ truncada e C3a solúvel (não mostrado na FIGURA 30). A FIGURA 30 mostra os resultados de uma análise de Western blot na ativação de C3 humana pelos substratos de trombina, em que a cadeia alfa de C3 não clivada e a cadeia a’ de produto de ativação são mostradas pelas setas. Como mostrado na FIGURA 30, a incubação de C3 com as formas ativadas do fator de coagulação humano XI e fator X, assim como fator de coagulação bovino ativado X, pode clivar C3 in vitro na ausência de qualquer protease de complemento. Deposição de C3 sobre manana

[00539] Os ensaios de deposição de C3 foram realizados sobre as amostras de soro obtidas de tipo selvagem, MASP-2 (-/-), F11(-/-), F11(-/-)/C4(-/-) e C4(-/-). F11 é o gene codificando fator de coagulação XI. Para medir a ativação de C3, as placas de microtitulação foram revestidas com manana (1 µg/poço), depois adicionando soro anti-HSA de ovelha (2 µg/ml) em TBS/tween/Ca2+. As placas foram bloqueadas com 0,1% de HSA

267 / 394 em TBS e lavadas como acima. As amostras de plasma foram diluídas em 4 mM de barbital, 145 mM de NaCl, 2 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, pH 7,4, adicionados às placas e incubados durante 1,5 h a 37° C. Depois da lavagem, o C3b ligado foi detectado usando C3c anti-ser humano de coelho (Dako), seguido pela IgG anticoelho de cabra conjugada com fosfatase alcalina e pNPP. Resultados:

[00540] A FIGURA 31 mostra os resultados do ensaio da deposição de C3 sobre as amostras de soro obtidas de tipo selvagem, MASP-2 (-/-), F11(-/- ), F11(-/-)/C4 (-/-) e C4 (-/-). Como mostrado na FIGURA 31, existe um caminho de lectina funcional mesmo na completa ausência de C4. Como adicionalmente mostrado na FIGURA 31, esta nova ativação de complemento dependente do caminho de lectina requer o fator de coagulação XI. Debate:

[00541] Antes dos resultados obtidos neste experimento, foi acreditado por aqueles na técnica que o caminho de lectina de complemento requeria C4 para atividade. Consequentemente, os dados de camundongos knockout em C4 (e seres humanos deficientes em C4) foram interpretados com a suposição de que tais organismos fossem deficientes no caminho de lectina (além da deficiência no caminho clássico). Os presentes resultados demonstram que esta noção é falsa. Assim, conclusões de estudos passados sugerindo que o caminho de lectina não fosse importante em certos ambientes de doença com base no fenótipo de animais deficientes em C4 podem ser falsas. Os dados descritos neste exemplo também mostram que no contexto fisiológicos de soro integral o caminho de lectina pode ativar componentes da cascata de coagulação. Assim, é demonstrado que existe conversa cruzada entre complemente e coagulação envolvendo MASP-2. EXEMPLO 24

[00542] Este exemplo descreve métodos para avaliar o efeito de um

268 / 394 anticorpo anti-MASP-2 sobre a lise de células sanguíneas vermelhas de amostras de sangue obtidas de pacientes com hemoglobinuria paroxismal noturna (PNH). Fundamentos/Análise Racional:

[00543] A hemoglobinuria paroxismal noturna (PNH), também aludida como síndrome de Marchiafava-Micheli, é uma doença adquirida, potencialmente fatal do sangue, distinguida pela anemia hemolítica intravascular induzida por complemento. A marca da PNH é a hemólise intravascular crônica que é uma consequência de ativação desregulada do caminho alternativo de complemento. Lindorfer, M.A., et al., Blood 115(11) (2010). A anemia na PNH é devida à destruição das células sanguíneas vermelhas na corrente sanguínea. Os sintomas de PNH incluem urina vermelha, devido ao aparecimento de hemoglobina na urina e trombose. A PNH pode se desenvolver por si só, aludida como “PNH primária” ou no contexto de outros distúrbios da medula óssea tais como anemia aplástica, aludida como “PNH secundária”. O tratamento para PNH inclui transfusão de sangue para anemia, anticoagulação para trombose e o uso do anticorpo monoclonal eculizumab (Soliris), que protege as células sanguíneas contra a destruição imune pela inibição do sistema de complemento (Hillmen P. et al., N. Engl. J. Med. 350(6): 552-9 (2004)). Entretanto, uma porção significante de pacientes com PNH tratados com eculizumab são deixados com anemia hemolítica imunomediada clinicamente significante porque o anticorpo não bloqueia a ativação do caminho alternativo de complemento.

[00544] Este exemplo descreve métodos para avaliar o efeito de um anticorpo anti-MASP-2 sobre a lise de células sanguíneas vermelhas de amostras de sangue obtidas de pacientes com PNH (não tratados com Soliris) que são incubados com soro humano normal acidificado ABO-compatível. Métodos: Reagentes:

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[00545] Eritrócitos de doadores normais e de pacientes sofrendo de PNH (não tratados com Soliris) são obtidos pela venipunção e preparados como descrito em Wilcox, L.A., et al., Blood 78: 820-829 (1991), por meio deste aqui incorporada por referência. Os anticorpos anti-MASP-2 com atividade bloqueadora funcional do caminho de lectina podem ser gerados como descrito no Exemplo 10. Análise de Hemólise:

[00546] O método para determinar o efeito de anticorpos anti-MASP-2 sobre a capacidade para bloquear hemólise de eritrócitos de pacientes com PNH é realizado usando os métodos descritos em Lindorfer, M.A., et al., Blood 15(11): 2283-91 (2010) e Wilcox, L.A., et al., Blood 78: 820-829 (1991), ambas as referências por meio deste aqui incorporadas por referência. Como descrito em Lindorfer et al., os eritrócitos de Amostras de paciente com PNH são centrifugadas, a camada leucocitária é aspirada e as células são lavadas em tampão veronal de gelatina (GVB) antes de cada experimento. Os eritrócitos são testados quanto à susceptibilidade para a lise mediada por APC como segue. Os soros humanos normais ABO-compatíveis são diluídos com GVB contendo 0,15 mM de CaCl2 e 0,5 mM de MgCl2 (GVB+2) e acidificado até o pH 6,4 (NHS acidificado, aNHS) e usados para reconstituir os eritrócitos até um hematócrito de 1,6% em 50% de aNHS. As misturas são depois incubadas a 37ºC e depois de 1 hora, os eritrócitos são pelotizados pela centrifugação. A densidade óptica de uma alíquota do sobrenadante recuperado é medida a 405 nM e usada para calcular a lise percentual. As amostras reconstituídas em soro acidificado-EDTA são processadas similarmente e usadas para definir a lise não mediada por complemento de fundo (tipicamente menor do que 3%). A lise completa (100%) é determinada depois incubando os eritrócitos em água destilada.

[00547] DE modo a determinar o efeito de anticorpos anti-MASP-2 sobre a hemólise de eritrócitos PNH, os eritrócitos de pacientes com PNH são

270 / 394 incubados em aNHS na presença de concentrações incrementais dos anticorpos anti-MASP-2 e a presença/quantidade de hemólise é subsequentemente quantificada.

[00548] Em vista do fato de que os anticorpos anti-MASP-2 foram mostrados bloquear a ativação subsequente do caminho alternativo de complemento, é esperado que os anticorpos anti-MASP-2 sejam eficazes em bloquear a hemólise mediada pelo caminho alternativo de eritrócitos PNH e serão úteis como um produto terapêutico para tratar pacientes sofrendo de PNH. EXEMPLO 25

[00549] Este exemplo descreve métodos para avaliar o efeito de um anticorpo bloqueador anti-MASP-2 sobre a ativação de complemento pelas crioglobulinas em amostras de sangue obtidas de pacientes sofrendo de crioglobulinemia. Fundamentos/Análise Racional:

[00550] A crioglobulinemia é distinguida pela presença de crioglobulinas no soro. As crioglobulinas são imunoglobulinas únicas ou mistas (tipicamente anticorpos IgM) que passam pela agregação reversível em baixas temperaturas. A agregação leva à ativação do caminho clássico de complemento e inflamação em leitos vasculares, particularmente na periferia. As apresentações clínicas de crioglobulinemia incluem vasculite e glomerulonefrite.

[00551] A crioglobulinemia pode ser classificada como segue com base na composição da crioglobulina: Crioglobulinemia Tipo I ou crioglobulinemia simples, é o resultado de uma imunoglobulina monoclonal, usualmente imunoglobulina M (IgM); crioglobulinemia Tipos II e III (crioglobulinemia mista) contêm fatores reumatoides (RFs), que são usualmente IgM em complexos com a porção Fc de IgG policlonal.

[00552] As condições associadas com crioglobulinemia incluem

271 / 394 infecção pela hepatite C, distúrbios linfoproliferativos e outras doenças autoimunes. Os complexos imunes contendo crioglobulina resultam em uma síndrome clínica de inflamação sistêmica, possivelmente devido à sua capacidade para ativar complemento. Enquanto complexos imunes de IgG normalmente ativam o caminho clássico de complemento, complexos contendo IgM também podem ativar complemento por intermédio do caminho de lectina (Zhang, M., et al., Mol Immunol 44(1-3): 103-110 (2007) e Zhang. M., et al., J. Immunol. 177(7): 4727-34 (2006)).

[00553] Estudos imunohistoquímicos adicionalmente demonstraram que os complexos imunes de crioglobulina contêm componentes do caminho da lectina e biópsias de pacientes com glomerulonefrite crioglobulinêmica mostraram evidência imunohistoquímica de ativação do caminho de lectina in situ (Ohsawa, I., et al., Clin Immunol 101(1): 59-66 (2001)). Estes resultados sugerem que o caminho de lectina pode contribuir para a inflamação e resultados adversos em doenças crioglobulinêmicas. Métodos:

[00554] O método para determinar o efeito de anticorpos anti-MASP-2 sobre a capacidade para bloquear os efeitos adversos da crioglobulinemia é realizado usando o ensaio para a conversão de C3 de fase fluida como descrito em Ng Y.C. et al., Arthritis and Rheumatism 31(1): 99-107 (1988), por meio deste aqui incorporada por referência. Como descrito em Ng et al., na crioglobulinemia mista essencial (EMC), o fator reumatoide monoclonal (mRF), usualmente IgM, complexa com IgG policlonal para forma os complexos imunes (IC) crioprecipitados característicos (crioglobulina tipo II). As imunoglobulinas e C3 foram demonstrados nas paredes de vaso em tecidos afetados tais como pele, nervo e rim. Como descrito em Ng et al., mRF rotulado com 125I é adicionado ao soro (soro humano normal e soro obtido de pacientes sofrendo de crioglobulinemia), incubados a 37ºC e a ligação aos eritrócitos é medida.

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[00555] A conversão de C3 de fase fluida é determinada no soro (soro humano normal e soro obtido de pacientes sofrendo de crioglobulinemia) na presença ou ausência dos seguintes IC: BSA-anti BSA, mRF, mRF mais IgG ou crioglobulinas, na presença ou ausência de anticorpos anti-MASP-2. A fixação de C3 e C4 ao IC é medida usando um ensaio de coprecipitação com F(ab’)2 anti-C3 e F(ab’)2 anti-C4.

[00556] Em vista do fato de que os anticorpos anti-MASP-2 foram mostrados bloquear a ativação do caminho de lectina é esperado que os anticorpos anti-MASP-2 sejam eficazes em bloquear os efeitos adversos mediados por complemento associados com crioglobulinemia e serão úteis como um produto terapêutico para tratar pacientes sofrendo de crioglobulinemia. EXEMPLO 26

[00557] Este exemplo descreve métodos para avaliar o efeito de um anticorpo anti-MASP-2 sobre amostras de sangue obtidas de pacientes com Doença da Aglutinina Fria, que se manifesta como anemia. Fundamentos/Análise Racional:

[00558] A Doença da Aglutinina Fria (CAD), é um tipo de anemia hemolítica autoimune. Anticorpos de aglutininas frias (usualmente IgM) são ativadas pelas temperaturas frias e se ligam e agregam células sanguíneas vermelhas. Os anticorpos de aglutinina fria combinam com complemento e atacam o antígeno na superfície de células sanguíneas vermelhas. Isto leva à opsonização de células sanguíneas vermelhas (hemólise) que deflagram a sua depuração pelo sistema reticuloendotelial. A temperatura na qual a aglutinação ocorre varia de paciente para paciente.

[00559] CAD se manifesta como anemia. Quando a taxa de destruição da destruição de célula sanguínea vermelha excede a capacidade da medula óssea para produzir um número adequado de células que carregam oxigênio, então a anemia ocorre. CAD pode ser causada por uma doença ou distúrbio

273 / 394 subjacente, aludidos como “CAD Secundária”, tal como uma doença infecciosa (pneumonia de micoplasma, caxumba, mononucleose), doença linfoproliferativa (linfoma, leucemia linfocítica crônica) ou distúrbio de tecido conectivo. Os pacientes com CAD primária são considerados ter um grau baixo de distúrbio de medula óssea linfoproliferativa. Tanto a CAD primária quanto a secundária são condições adquiridas. Métodos: Reagentes:

[00560] Os eritrócitos de doadores normais e de pacientes sofrendo de CAD são obtidos pela venipunção. Os anticorpos anti-MASP-2 com atividade bloqueadora funcional do caminho de lectina podem ser gerados como descrito no Exemplo 10.

[00561] O efeito de anticorpos anti-MASP-2 para bloquear a ativação mediada pela aglutinina fria do caminho de lectina pode ser determinado como segue. Os eritrócitos de pacientes do grupo sanguíneo I positivo são sensibilizados com aglutininas frias (isto é, anticorpos IgM), na presença ou ausência de anticorpos anti-MASP-2. Os eritrócitos são depois testados quanto à capacidade para ativar o caminho de lectina medindo-se a ligação de C3.

[00562] Em vista do fato de que os anticorpos anti-MASP-2 foram mostrado para bloquear a ativação do caminho de lectina, é esperado que os anticorpos anti-MASP-2 sejam eficazes em bloquear efeitos adversos mediados por complemento associados com a Doença da Aglutinina Fria e sejam úteis como um produto terapêutico para tratar pacientes sofrendo de Doença da Aglutinina Fria. EXEMPLO 27

[00563] Este exemplo descreve métodos para avaliar o efeito de um anticorpo anti-MASP-2 sobre a lise de células sanguíneas vermelhas em amostras de sangue obtidas de camundongos com síndrome urêmica

274 / 394 hemolítica atípica (aHUS). Fundamentos/Análise Racional:

[00564] A síndrome urêmica hemolítica atípica (aHUS) é distinguida pela anemia hemolítica, trombocitopenia e insuficiência renal causada pelos trombos de plaqueta na microcirculação do rim e outros órgãos. A aHUS está associada com a regulagem de complemento defeituosa e pode ser esporádica ou familiar. A aHUS está associada com mutações nos genes codificando a ativação de complemento, incluindo fator de complemento H, cofator de membrana B e fator I e bem como o fator de complemento H-relacionado 1 (CFHR1) e fator de complemento H-relacionado 3 (CFHR3). Zipfel, P.F., et al., PloS Genetics 3(3): e41 (2007). Este exemplo descreve métodos para avaliar o efeito de um anticorpo anti-MASP-2 sobre a lise de células sanguíneas vermelhas de amostras de sangue obtidas de camundongos com aHUS. Métodos:

[00565] O efeito de anticorpos anti-MASP-2 para tratar aHUS pode ser determinado em um modelo de camundongo desta doença na qual o gene fH de camundongo endógeno foi substituído com um homólogo humano codificando uma forma mutante de fH frequentemente encontrada em pacientes com aHUS. Ver Pickering M.C. et al., J. Exp. Med. 204(6): 1249- 1256 (2007), por meio deste aqui incorporada por referência. Como descrito em Pickering et al., tais camundongos desenvolvem uma patologia tipo aHUS. De modo a avaliar o efeito de um anticorpo anti-MASP-2 para o tratamento de aHUS, anticorpos anti-MASP-2 são administrados com os camundongos aHUS mutantes e a lise de células sanguíneas vermelhas obtidas de controles tratados e não tratados com ab anti-MASP-2 é comparada. Em vista do fato de que os anticorpos anti-MASP-2 mostraram bloquear a ativação do caminho de lectina é esperado que os anticorpos anti- MASP-2 sejam eficazes em bloquear a lise de células sanguíneas vermelhas

275 / 394 em sujeitos mamíferos sofrendo de aHUS. EXEMPLO 28

[00566] Este exemplo descreve métodos para avaliar o efeito de um anticorpo anti-MASP-2 para o tratamento de glaucoma. Análise Racional/Fundamentos:

[00567] Foi mostrado que a ativação de complemento descontrolada contribui para a progressão de lesão degenerativa para as células ganglionárias retinais (RGCs), as suas sinapses e axons em glaucoma. Ver Tezel G. et al., Invest Ophthalmol Vis Sci 51: 5071-5082 (2010). Por exemplo, estudos histopatológicos de tecidos humanos e estudos in vivo usando modelos de animal diferentes têm demonstrado que os componentes de complemento, incluindo C1q e C3, são sintetizados e complexo de complemento de terminal é formado na retina glaucomatosa (ver Stasi K. et al., Invest Ophthalmol Vis Sci 47: 1024-1029 (2006), Kuehn M.H. et al., Exp Eye Res 83: 620-628 (2006)). Como adicionalmente descrito em Kuehn M.H. et al., Experimental Eye Research 87: 89-95 (2008), a síntese e a deposição de complemento são induzidas pela I/R retinal e o rompimento da cascata de complemento retarda a degeneração de RGC. Neste estudo, os camundongos carregando um rompimento alvejado do componente de complemento C3 foram verificadas exibir degeneração de RGC retardada depois da I/R retinal transitória quando comparados com animais normais. Métodos:

[00568] O método para determinar o efeito de anticorpos anti-MASP-2 sobre a degeneração de RGC é realizado em um modelo de animal de I/R retinal como descrito em Kuehn M.H. et al., Experimental Eye Research 87: 89-95 (2008), por meio deste aqui incorporada por referência. Como descrito em Kuehn et al., a isquemia retinal é induzida anestesiando-se os animais, depois inserindo uma agulha calibre 30 conectada a um poço contendo solução salina tamponada com fosfato através da córnea dentro da câmara

276 / 394 anterior do olho. O poço de solução salina é depois elevado para produzir uma pressão intraocular de 104 mmHg, suficiente para impedir completamente a circulação através da vasculatura retinal. A isquemia intraocular elevada é confirmada pelo branqueamento da íris e retina e a isquemia é mantida durante 45 minutos apenas no olho esquerdo; o olho direito serve como um controle e não recebe canulação. Os camundongos são depois eutanizados 1 ou 3 semanas depois da lesão isquêmica. Os anticorpos anti-MASP-2 são administrados aos camundongos localmente ao olho ou sistemicamente para avaliar o efeito de um anticorpo anti-MASP administrado antes da lesão isquêmica.

[00569] A imunohistoquímica dos olhos é realizada usando anticorpos contra C1q e C3 para detectar a deposição de complemento. O dano ao nervo óptico também pode ser avaliado usando métodos de microscopia eletrônica padrão. A quantificação de RGCs retinais sobreviventes é realizada usando rotulação de gama sinucleína. Resultados:

[00570] Como descrito em Kuehn et al., em camundongos de controle normais, a isquemia retinal transitória resulta em mudanças degenerativas do nervo óptico e depósitos retinais de C1q e C3 detectáveis pela imunohistoquímica. Ao contrário, camundongos deficientes em C3 demonstraram uma redução acentuada na degeneração axonal, exibindo apenas níveis menores de dano ao nervo óptico 1 semana depois da indução. Com base nestes resultados, é esperado que resultados similares sejam observados quando este ensaio é realizado em um camundongo knockout em MASP-2 e quando os anticorpos anti-MASP-2 são administrados a um camundongo normal antes da lesão isquêmica. EXEMPLO 29

[00571] Este exemplo demonstra que um inibidor de MASP-2, tal como um anticorpo anti-MASP-2, é eficaz para o tratamento de exposição à

277 / 394 radiação e/ou para o tratamento, melhora ou prevenção da síndrome da radiação aguda. Análise Racional:

[00572] A exposição a altas doses de radiação ionizante causa mortalidade por dois mecanismos principais: toxidez para a medula óssea e síndrome gastrointestinal. A toxidez para a medula óssea resulta em uma queda em todas as células hematológicas, predispondo o organismo à morte pela infecção e hemorragia. A síndrome gastrointestinal é mais severa e é acionada por uma perda de função da barreira intestinal devido à desintegração da camada epitelial intestinal e uma perda de função endócrina intestinal. Isto leva à septicemia e síndrome da resposta inflamatória sistêmica associada que pode resultar em morte.

[00573] O caminho da lectina de complemento é um mecanismo imune inato que inicia a inflamação em resposta à lesão tecidual e exposição às superfícies estranhas (isto é, bactérias). O bloqueio deste caminho leva a melhores resultados em modelos de camundongo de lesão tecidual intestinal isquêmica ou choque séptico. É levantada a hipótese de que o caminho de lectina pode deflagrar inflamação excessiva e nociva em resposta à lesão tecidual induzida por radiação. O bloqueio do caminho de lectina pode assim reduzir a lesão secundária e aumentar a sobrevivência a seguir da exposição à radiação aguda.

[00574] O objetivo do estudo realizado como descrito neste exemplo foi avaliar o efeito do bloqueio do caminho de lectina sobre a sobrevivência em um modelo de camundongo de lesão por radiação pela administração de anticorpos anti-MASP-2 de murino. Métodos e Materiais: Materiais. Os artigos de teste usados neste estudo foram (i) um anticorpo anti-MASP-2 de murino de alta afinidade (mAbM11) e (ii) um anticorpo anti-MASP-2 humano de alta afinidade (mAbH6) que bloqueia o

278 / 394 componente da proteína de MASP-2 do caminho de complemento da lectina que foi produzido em células mamíferas transfectadas. As concentrações de dosagem foram 1 mg/kg de anticorpo anti-MASP-2 de murino (mAbM11), 5 mg/kg de anticorpo anti-MASP-2 humano (mAbH6) ou solução salina estéril. Para cada sessão de dosagem, um volume adequado de soluções de dosagem frescas foi preparado.

[00575] Animais. Camundongos Swiss-Webster machos adultos jovens foram obtidos da Harlan Laboratories (Houston, TX). Os animais foram alojados em gaiolas de fundo sólido com forragem Alfa-Dri e providos com Dieta de Roedor PMI 5002 certificada (Animal Specialties, Inc., Hubbard OR) e água ad libitum. A temperatura foi monitorada e o alojamento dos animais operado com um ciclo de iluminação de 12 horas com luz/12 horas no escuro.

[00576] Irradiação. Depois de uma aclimatização de 2 semanas na instalação, os camundongos foram irradiados a 6,5 e 7,0 Gy pela exposição de corpo inteiro em grupos de 10 em uma taxa de dose de 0,78 Gy/min usando um sistema Therapax X-RAD 320 equipado com um gerador de raio X de alta estabilidade com 320 kV, tubo de raio X de metal cerâmico, colimador de feixe de raio X variável e filtro (Precision X-ray Incorporated, East Haven, CT). Os níveis de dose foram selecionados com base nos estudos anteriores conduzidos com a mesma cepa de camundongos indicando que a LD50/30 foi entre 6,5 e 7,0 Gy (dados não mostrados).

[00577] Formulação e Administração de Fármaco. O volume apropriado de soluções de estoque concentradas foi diluído com solução salina gelada para preparar soluções de dosagem de 0,2 mg/ml de anticorpo anti-MASP-2 de murino (mAbM11) ou 0,5 mg/ml de anticorpo anti-MASP-2 humano (mAbH6) de acordo com o protocolo. A administração de anticorpo anti-MASP-2 mAbM11 e mAbH6 foi por intermédio de injeção IP usando

279 / 394 uma agulha calibre 25 com base no peso do animal para liberar 1 mg/kg de mAbM11, 5 mg/kg de mAbH6 ou veículo de solução salina.

[00578] Projeto do Estudo. Os camundongos foram aleatoriamente designados aos grupos como descrito na Tabela 8. O peso e temperatura corporais foram medidos e registrados diariamente. Os camundongos nos Grupos 7, 11 e 13 foram sacrificados no dia 7 após a irradiação e o sangue coletado pela punção cardíaca sob anestesia profunda. Os animais sobreviventes até o dia 30 após a irradiação foram sacrificados na mesma maneira e o sangue coletado. O plasma foi preparado a partir das amostras de sangue coletadas de acordo com o protocolo e retornadas para o Patrocinador para análise. TABELA 8: Grupos de Estudo Grupo Nível de N Tratamento Programa de Dose ID Irradiação (Gy) 18 h antes da irradiação, 2 h após a 1 20 6,5 Veículo irradiação, reforço semanal Ab de MASP-2 antimurino 2 20 6,5 Apenas 18 h antes da irradiação (mAbM11) ab de MASP-2 antimurino 18 h antes da irradiação, 2 h após a 3 20 6,5 (mAbM11) irradiação, reforço semanal ab de MASP-2 antimurino 4 20 6,5 2 h após a irradiação, reforço semanal (mAbM11) ab anti-MASP-2 humana 18 h antes da irradiação, 2 h após a 5 20 6,5 (mAbH6) irradiação, reforço semanal 18 h antes da irradiação, 2 h após a 6 20 7,0 Veículo irradiação, reforço semanal 7 5 7,0 Veículo apenas 2 h após a irradiação ab de MASP-2 antimurino 8 20 7,0 apenas 18 h antes da irradiação (mAbM11) ab de MASP-2 antimurino 18 h antes da irradiação, 2 h após a 9 20 7,0 (mAbM11) irradiação, reforço semanal ab de MASP-2 antimurino 10 20 7,0 2 h após a irradiação, reforço semanal (mAbM11) ab de MASP-2 antimurino 11 5 7,0 apenas 2 h após a irradiação (mAbM11) ab anti-MASP-2 humana 18 h antes da irradiação, 2 h após a 12 20 7,0 (mAbH6) irradiação, reforço semanal 13 5 nenhum nenhum nenhum

[00579] Análise Estatística. As curvas de sobrevivência de Kaplan- Meier foram geradas e usadas para comparar o tempo de sobrevivência médio entre grupos de tratamento usando os métodos de log-Rank e Wilcoxon. As médias com desvios padrão ou médias com erro padrão da média são

280 / 394 relatadas. As comparações estatísticas foram feitas usando um teste t desemparelhado de cauda dupla entre animais irradiados controlado e grupos de tratamento individuais. Resultados

[00580] As plotagens de sobrevivência de Kaplan-Meier para grupos de exposição de 7,0 e 6,5 Gy são providos nas FIGURAS 32A e 32B, respectivamente e resumidas abaixo na Tabela 9. No geral, o tratamento de pré-irradiação com ab de MASP-2 antimurino (mAbM11) aumentou a sobrevivência de camundongos irradiados comparada com os animais de controle irradiados tratados com veículo nos níveis de exposição tanto de 6,5 (20% de aumento) quanto de 7,0 Gy (30% de aumento). No nível de exposição de 6,5 Gy, o tratamento com ab de MASP-2 antimurino após a irradiação resultou em um aumento modesto na sobrevivência (15%) comparada com os animais irradiados do controle de veículo.

[00581] Em comparação, todos os animais tratados no nível de exposição de 7,0 Gy mostrou um aumento na sobrevivência comparada com os animais de controle irradiados tratados com veículo. A mudança maior na sobrevivência ocorreu nos animais recebendo mAbH6, com um aumento de 45% comparado com os animais de controle. Adicionalmente, no nível de exposição de 7,0 Gy, as mortalidades no grupo tratado com mAbH6 primeiro ocorreram no dia 15 após a irradiação comparadas com o dia 8 após a irradiação para os animais de controle irradiados tratados com veículo, um aumento de 7 dias em relação aos animais de controle. O tempo médio para a mortalidade para os camundongos recebendo mAbH6 (27,3 ± 1,3 dias) foi significantemente aumentado (p = 0,0087) comparado com os animais de controle (20,7 ± 2,0 dias) no nível de exposição de 7,0 Gy.

[00582] A mudança percentual no peso corporal comparado com o dia pré-irradiação (dia -1) foi registrada durante todo o estudo. Uma perda de peso transitória ocorreu em todos os animais irradiados, sem nenhuma

281 / 394 evidência de mudanças diferenciais devido ao tratamento com mAbM11 ou mAbH6 comparado com os controles (dados não mostrados). Ao término do estudo, todos os animais sobreviventes mostraram um aumento no peso corporal a partir do peso corporal de partida (dia -1). TABELA 9: Taxas de sobrevivência de animais de teste expostos à radiação Grupo de Teste Nível de Sobrevivência Tempo para Morte Primeira/Última Exposição (%) (Média ± SEM, Dia) Morte (Dia) Irradiação de Controle 6,5 Gy 65% 24,0 ± 2,0 9/16 mAbM11 pré-exposição 6,5 Gy 85% 27,7 ± 1,5 13/17 mAbM11 pré- + pós-exposição 6,5 Gy 65% 24,0 ± 2,0 9/15 mAbM11 pós-exposição 6,5 Gy 80% 26,3 ± 1,9 9/13 mAbH6 pré- + pós-exposição 6,5 Gy 65% 24,6 ± 1,9 9/19 Irradiação de Controle 7,0 Gy 35% 20,7 ± 2,0 8/17 mAbM11 pré-exposição 7,0 Gy 65% 23,0 ± 2,3 7/13 mAbM11 pré- + pós-exposição 7,0 Gy 55% 21,6 ± 2,2 7/16 mAbM11 pós-exposição 7,0 Gy 70% 24,3 ± 2,1 9/14 mAbH6 pré- + pós-exposição 7,0 Gy 80% 27,3 ± 1,3* 15/20 *p = 0,0087 pelo teste desemparelhado de duas caudas entre animais irradiados controlados e grupo de tratamento no mesmo nível de exposição à irradiação.

Debate

[00583] A síndrome da radiação aguda consiste de três subsíndromes definidas: hematopoiética, gastrointestinal e cerebrovascular. A síndrome observada depende da dose de radiação, com os efeitos hematopoiéticos observados nos seres humanos com exposições à radiação parcial ou de corpo inteiro significante excedendo 1 Gy. A síndrome hematopoiética é distinguida pela diminuição severa da função da medula óssea levando à pancitopenia com mudanças nas contagens sanguíneas, células sanguíneas vermelhas e brancas e plaquetas ocorrendo concomitante com dano ao sistema imune. Conforme o nadir ocorre, com poucos neutrófilos e plaquetas presentes no sangue periférico, a neutropenia, febre, complicações de septicemia e hemorragia incontrolável levam à morte.

[00584] No presente estudo, a administração de mAbH6 foi verificada aumentar a capacidade de sobrevivência de irradiação de raio X de corpo inteiro em camundongos Swiss-Webster machos irradiados a 7,0 Gy. Notavelmente, no nível de 7,0 Gy de exposição, 80% dos animais recebendo mAbH6 sobreviveram aos 30 dias comparados com 35% dos animais

282 / 394 irradiados de controle tratados com veículo. Importantemente, o primeiro dia de morte neste grupo tratado não ocorreu até o dia 15 após a irradiação, um aumento de 7 dias em relação ao observado nos animais irradiados de controle tratados com veículo. Curiosamente, na exposição ao raio X mais baixa (6,5 Gy), a administração de mAbH6 não pareceu impactar a capacidade de sobrevivência ou retardar a mortalidade comparada com os animais irradiados de controle tratados com veículo. Existiriam múltiplas razões para esta diferença na resposta entre os níveis de exposição, embora a verificação de qualquer hipótese possa requerer estudos adicionais, incluindo coleta de amostra interinas para cultura microbiológica e parâmetros hematológicos. Uma explicação pode simplesmente ser que o número de animais designados aos grupos pode ter impedido a percepção de quaisquer diferenças sutis relacionadas com tratamento. Por exemplo, com tamanhos de grupos de n = 20, a diferença na sobrevivência entre 65% (mAbH6 na exposição de 6,5 Gy) e 80% (mAbH6 na exposição de 7,0 Gy) é de 3 animais. Por outro lado, a diferença entre 35% (controle de veículo na exposição de 7,0 Gy) e 80% (mAbH6 na exposição de 7,0 Gy) é de 9 animais e provê evidência confiável de uma diference relacionada com o tratamento.

[00585] Estes resultados demonstram que os anticorpos anti-MASP-2 são eficazes no tratamento de um sujeito mamífero em risco para ou sofrendo dos efeitos nocivos da síndrome da radiação aguda. EXEMPLO 30

[00586] Este exemplo demonstra que camundongos deficientes em MASP-2 são protegidos da mortalidade induzida pela Neisseria meningitidis depois da infecção com sorogrupo A de N. meningitidis ou sorogrupo B de Neisseria meningitidis. Métodos:

[00587] Camundongos knockout MASP-2 (camundongos MASP-2 KO) foram gerados como descrito no Exemplo 1. Camundongos MASP-2 KO

283 / 394 de 10 semanas de idade (n = 10) e camundongos C57/BL6 tipo selvagem (WT) (n = 10) foram inoculados pela injeção intraperitoneal (i.p.) com uma dosagem de 2,6 x 107 CFU de Neisseria meningitidis sorogrupo A Z2491 em um volume de 100 µl. A dose infecciosa foi administrada aos camundongos em conjunção com ferro dextrano a uma concentração final de 400 mg/kg. A sobrevivência dos camundongos depois da infecção foi monitorada em um período de tempo de 72 horas.

[00588] Em um experimento separado, camundongos MASP-2 KO de 10 semanas de idade (n = 10) e camundongos C57/BL6 tipo selvagem (n = 10) foram inoculados pela injeção i.p. com uma dosagem de 6 x 106 CFU de Neisseria meningitidis sorogrupo B cepa MC58 em um volume de 100 µl. A dose infecciosa foi administrada aos camundongos em conjunção com ferro dextrano em uma dose final de 400 mg/kg. A sobrevivência dos camundongos depois da infecção foi monitorada em um período de tempo de 72 horas. Uma contagem de enfermidade também foi determinada para os camundongos tipo selvagem e MASP-2 KO durante o período de tempo de 72 horas depois da infecção, com base nos parâmetros de contagem de enfermidade descritos abaixo na TABELA 10, que estão fundamentados no esquema de Fransen et al. (2010) com leves modificações. TABELA 10: Contagem de enfermidade associada com sinais clínicos em camundongos infectados Sinais Contagem Normal 0 Pelo levemente desarranjado 1 Pelo desarranjado, olhos lentos e úmidos 2 Pelo desarranjado, letárgico e olhos fechados 3 Muito doente e nenhum movimento depois da estimulação 4 Morte 5

[00589] As amostras de sangue foram coletadas dos camundongos em intervalos horários depois da infecção e analisados para determinar o nível de soro (log cfu/mL) de N. meningitidis de modo a verificar a infecção e determinar a taxa de depuração das bactérias do soro. Resultados:

284 / 394

[00590] A FIGURA 33 é uma plotagem de Kaplan-Meyer graficamente ilustrando o percentual de sobrevivência de camundongos KO em MASP-2 e do tipo selvagem depois da administração de uma dose infecciosa de 2,6 x 107 cfu de N. meningitidis sorogrupo A Z2491. Como mostrado na FIGURA 33, 100% dos camundongos MASP-2 KO sobreviveram durante todo o período de 72 horas depois da infecção. Ao contrário, apenas 80% dos camundongos do tipo selvagem (p = 0,012) ainda estavam vivos 24 horas depois da infecção e apenas 50% dos camundongos do tipo selvagem ainda estavam vivos nas 72 horas depois da infecção. Estes resultados demonstram que os camundongos deficientes MASP-2 são protegidos da mortalidade induzida pela N. meningitidis sorogrupo A Z2491.

[00591] A FIGURA 34 é uma plotagem de Kaplan-Meyer graficamente ilustrando o percentual de sobrevivência de camundongos MASP-2 KO e do tipo selvagem depois da administração de uma dose infecciosa de 6 x 106 cfu de N. meningitidis sorogrupo B cepa MC58. Como mostrado na FIGURA 34, 90% dos camundongos MASP-2 KO sobreviveram por todo o período de 72 horas depois da infecção. Ao contrário, apenas 20% dos camundongos do tipo selvagem (p = 0,0022) ainda estavam vivos 24 horas depois da infecção. Estes resultados demonstram que camundongos deficientes em MASP-2 são protegidos da mortalidade induzida pela N. meningitidis sorogrupo B cepa MC58.

[00592] A FIGURA 35 ilustra graficamente o log cfu/mL de N. meningitidis sorogrupo B cepa MC58 recuperado nos pontos de tempo diferentes em amostras de sangue coletadas dos camundongos MASP-2 KO e do tipo selvagem depois da infecção i.p. com 6x 106 cfu de N. meningitidis sorogrupo B cepa MC58 (n = 3 em pontos de tempo diferentes para ambos os grupos de camundongos). Os resultados são expressos como Médias ± SEM. Como mostrado na FIGURA 35, em camundongos tipo selvagem o nível de N. meningitidis no sangue atingiu um pico de cerca de 6,0 log cfu/mL em 24

285 / 394 horas depois da infecção e caiu para cerca de 4,0 log cfu/mL em 36 horas depois da infecção. Ao contrário, nos camundongos MASP-2 KO, o nível de N. meningitidis atingiu um pico de cerca de 4,0 log cfu/mL em 12 horas depois da infecção e caiu para cerca de 1,0 log cfu/mL em 36 horas depois da infecção (o símbolo “*” indica p<0,05; o símbolo “**” indica p = 0,0043). Estes resultados demonstram que embora os camundongos MASP-2 KO foram infectados com a mesma dose de N. meningitidis sorogrupo B cepa MC58 como os camundongos do tipo selvagem, os camundongos MASP-2 KO tiveram depuração bacteriana melhorada quando comparados com os do tipo selvagem.

[00593] A FIGURA 36 ilustra graficamente a contagem média de enfermidade de camundongos MASP-2 KO e do tipo selvagem em 3, 6, 12 e 24 horas depois da infecção com 6 x 106 cfu de N. meningitidis sorogrupo B cepa MC58. Como mostrado na FIGURA 36, os camundongos deficientes em MASP-2 mostraram alta resistência à infecção, com contagens de enfermidade muito mais baixas em 6 horas (símbolo “*” indica p = 0,0411), 12 horas (o símbolo “**” indica p = 0,0049) e 24 horas (o símbolo “***” indica p = 0,0049) depois da infecção, quando comparados com os camundongos do tipo selvagem. Os resultados na FIGURA 36 são expressos como médias ± SEM.

[00594] Em resumo, os resultados neste exemplo demonstram que camundongos deficientes em MASP-2 são protegidos da mortalidade induzida pela Neisseria meningitides depois da infecção com N. meningitidis sorogrupo A ou N. meningitidis sorogrupo B. EXEMPLO 31

[00595] Este exemplo demonstra que a administração do anticorpo anti-MASP-2 depois da infecção com N. meningitidis aumenta a sobrevivência de camundongos infectados com N. meningitidis. Fundamentos/Análise Racional:

286 / 394

[00596] Como descrito no Exemplo 10, a proteína de MASP-2 de rato foi utilizada para garimpar uma biblioteca de visualização de fago de Fab, a partir da qual Fab2 #11 foi identificado como um anticorpo funcionalmente ativo. Os anticorpos de tamanho completo dos isótopos IgG2c de rato e IgG2a de camundongo foram gerados a partir de Fab2 #11. O anticorpo anti-MASP- 2 de tamanho completo dos camundongos isótipo IgG2a foi distinguido para os parâmetros farmacodinâmicos (como descrito no Exemplo 19).

[00597] Neste exemplo, o anticorpo anti-MASP-2 de camundongo de tamanho completo derivado de Fab2 #11 foi analisado no modelo de camundongo de infecção pela N. meningitidis. Métodos:

[00598] O isótipo IgG2a de anticorpo anti-MASP-2 de camundongo de comprimento total derivado de Fab2 #11, gerado como descrito acima, foi testado no modelo de camundongo de infecção pela N. meningitidis como segue. Administração de anticorpos monoclonais anti-MASP-2 (MoAb) de camundongo depois da infecção

[00599] Camundongos Charles River C57/BL6 de 9 semanas de idade foram tratados com anticorpo inibidor anti-MASP-2 de camundongo (1,0 mg/kg) (n = 12) ou anticorpo de controle de isótipo (n = 10) em 3 horas depois da injeção i.p. com uma alta dose (4 x 106 cfu) de N. meningitidis sorogrupo B cepa MC58. Resultados:

[00600] A FIGURA 37 é uma plotagem de Kaplan-Meyer graficamente ilustrando o percentual de sobrevivência de camundongos depois da administração de uma dose infecciosa de 4 x 106 cfu de N. meningitidis sorogrupo B cepa MC58, seguida pela administração 3 horas após a infecção de anticorpo inibidor anti-MASP-2 (1,0 mg/kg) ou anticorpo de controle de isótipo. Como mostrado na FIGURA 37, 90% dos

287 / 394 camundongos tratados com anticorpo anti-MASP-2 sobreviveram por todo o período de 72 horas depois da infecção. Ao contrário, apenas 50% dos camundongos tratados com anticorpo de controle de isótipo sobreviveram por todo o período de 72 horas depois da infecção. O símbolo “*” indica p = 0,0301, como determinado pela comparação das duas curvas de sobrevivência.

[00601] Estes resultados demonstram que a administração de anticorpo anti-MASP-2 é eficaz para tratar e melhorar a sobrevivência em sujeitos infectados com N. meningitidis.

[00602] Como aqui demonstrado, o uso de anticorpo anti-MASP-2 no tratamento de um sujeito infectado com N. meningitidis é eficaz quando administrado dentro de 3 horas após a infecção e é esperado ser eficaz dentro de 24 horas a 48 horas depois da infecção. A doença meningocócica (meningococcemia ou meningite) é uma emergência médica e a terapia tipicamente será iniciada imediatamente se a doença meningocócica é suspeitada (isto é, antes que a N. meningitidis seja positivamente identificada como o agente etiológico).

[00603] Em vista dos resultados no camundongo MASP-2 KO demonstrados no Exemplo 30, acredita-se que a administração de anticorpo anti-MASP-2 antes da infecção com N. meningitidis também fosse eficaz para prevenir ou melhorar a severidade de infecção. EXEMPLO 32

[00604] Este exemplo demonstra que a administração de anticorpo anti-MASP-2 é eficaz para tratar infecção pela N. meningitidis em soro humano. Análise Racional:

[00605] Pacientes com níveis séricos diminuídos de MBL funcional exibem susceptibilidade aumentada para infecções bacterianas e fúngicas recorrentes (Kilpatrick et al., Biochim Biophys Acta 1572: 401-413 (2002)). É

288 / 394 conhecido que a N. meningitidis é reconhecida pela MBL e foi mostrado que os soros deficientes em MBL não lisam Neisseria.

[00606] Em vista dos resultados descritos nos Exemplos 30 e 31, uma série de experimentos foi realizada para determinar a eficácia da administração de anticorpo anti-MASP-2 para tratar infecção pela N. meningitidis em soros humanos deficientes de complemento e de controle. Os experimentos foram realizados em uma alta concentração de soro (20%) de modo a preservar o caminho de complemento. Métodos:

1. Atividade bactericida sérica em vários soros humanos deficientes em complemento e em soros humanos tratados com anticorpo humano anti- MASP-2

[00607] Os seguintes soros humanos deficientes em complemento e de controle foram usados neste experimento: TABELA 11: Amostras de soros humanos testados (como mostrado na FIGURA 38) Amostra Tipo de Soro A Soros humanos normais (NHS) + Ab anti-MASP-2 humano B NHS + Ab de controle de isótipo C Soro humano MBL -/-

D NHS E NHS inativado por calor (HI)

[00608] Um anticorpo recombinante contra MASP-2 humana foi isolado de uma Biblioteca Combinatória de Anticorpo (Knappik, A., et al., J. Mol. Biol. 296: 57-86 (2000)), usando MASP-2A humana recombinante como um antígeno (Chen, C.B. e Wallis, J. Biol. Chem. 276: 25894-25902 (2001)). Um fragmento de scFv anti-ser humano que potentemente inibiu a ativação mediada pelo caminho da lectina de C4 e C3 em plasma humano (IC50~20 nM) foi identificado e convertido para um anticorpo IgG4 humano de tamanho completo.

[00609] N. meningitidis sorogrupo B-MC58 foi incubada com os soros diferentes mostrados na TABELA 11, cada um em uma concentração de soro

289 / 394 de 20%, com ou sem a adição de anticorpo humano anti-MASP-2 inibidor (3 µg em volume total de 100 µl) a 37° C com agitação. As amostras foram coletadas nos seguintes pontos de tempo: intervalos de 0, 30, 60 e 90 minutos, plaqueados e depois as contagens viáveis foram determinadas. Soro humano inativado por calor foi usado como um controle negativo. Resultados:

[00610] A FIGURA 38 ilustra graficamente o log cfu/mL de contagens viáveis de N. meningitidis sorogrupo B-MC58 recuperadas em pontos de tempo diferentes nas amostras de soros humanos mostradas na TABELA 11. A TABELA 12 provê os resultados do teste t de Student para a FIGURA 38. TABELA 12: Resultados do teste t de Student para a FIGURA 38 (ponto de tempo de 60 minutos) Dif. Média (Log) Significante? P<0,05? Sumário do valor P A vs B -0,3678 Sim ***(0,0002) A vs C -1,1053 Sim ***(p<0,0001) A vs D -0,2111 Sim **(0,0012) C vs D 1,9 Sim ***(p<0,0001)

[00611] Como mostrado na FIGURA 38 e TABELA 12, o extermínio dependente de complemento de N. meningitidis em 20% de soro humano foi significantemente realçada pela adição do anticorpo anti-MASP-2 humano inibidor.

2. Extermínio dependente de complemento de N. meningitidis em 20% (v/v) de soros de camundongo deficientes em MASP-2.

[00612] Os seguintes soros de camundongo deficiente em complemento e soros de camundongo de controle foram usados neste experimento: TABELA 13: Amostras de soros de camundongo testados (como mostrado na FIGURA 39) Amostra Tipo de Soro A tipo selvagem B MASP-2 -/- C MBL A/C -/- D tipo selvagem inativado por calor (HIS)

[00613] N. meningitidis sorogrupo B-MC58 foi incubada com soros de

290 / 394 camundongo deficiente em complemento diferentes, cada um em uma concentração de soro de 20%, a 37° C com agitação. As amostras foram coletadas nos seguintes pontos de tempo: intervalos de 0, 15, 30, 60, 90 e 120 minutos, plaqueadas e depois as contagens viáveis foram determinadas. Soro humano inativado por calor foi usado como um controle negativo. Resultados:

[00614] A FIGURA 39 ilustra graficamente o log cfu/mL das contagens viáveis de N. meningitidis sorogrupo B-MC58 recuperadas em pontos de tempo diferentes nas amostras de soro de camundongo mostradas na TABELA 13. Como mostrado na FIGURA 39, os soros de camundongo MASP-2 -/- têm um nível mais alto de atividade bactericida para N. meningitidis do que os soros de camundongo tipo selvagem. O símbolo “**” indica p = 0,0058, o símbolo “***” indica p = 0,001. A TABELA 14 provê os resultados do teste t de Student para a FIGURA 39. TABELA 14: Resultados do teste t de Student para a FIGURA 39 Dif. Média Significante? Comparação Ponto de tempo Sumário do valor P (LOG) (p<0,05)? A vs. B 60 min. 0,39 sim ** (0,0058) A vs. B 90 min. 0,6741 sim *** (0,001)

[00615] Em resumo, os resultados neste exemplo demonstram que os soros de MASP-2 -/- têm um nível mais alto de atividade bactericida para N. meningitidis do que os soros do tipo selvagem. EXEMPLO 33

[00616] Este exemplo demonstra que o efeito inibidor da deficiência de MASP-2 sobre a lise de células sanguíneas vermelhas de amostras obtidas a partir de um modelo de camundongo de hemoglobinuria paroxismal noturna (PNH). Fundamentos/Análise Racional:

[00617] Hemoglobinuria paroxismal noturna (PNH), também aludida como síndrome de Marchiafava-Micheli, é uma doença adquirida, potencialmente fatal do sangue, distinguida pela anemia hemolítica

291 / 394 intravascular induzida por complemento.

A marca da PNH é a hemólise intravascular mediada por complemento crônica que é uma consequência de ativação desregulada do caminho alternativo de complemento devido à ausência dos reguladores de complemento CD55 e CD59 nos eritrócitos de PNH, com hemoglobinuria e anemia subsequentes.

Lindorfer, M.

A., et al., Blood 115(11) (2010), Risitano, A.

M, Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 11: 528-535 (2011). A anemia na PNH é devido à destruição de células sanguíneas vermelhas na corrente sanguínea.

Os sintomas de PNH incluem urina vermelha, devido ao aparecimento de hemoglobina na urina, dor lombar, fadiga, falta de ar e trombose.

A PNH pode desenvolver por si mesma, aludida como “PNH primária” ou no contexto de outros distúrbios da medula óssea tal como anemia aplástica, aludida como “PNH secundária”. O tratamento para PNH inclui transfusão de sangue para anemia, anticoagulação para a trombose e o uso de anticorpo monoclonal eculizumab (Soliris®), que protege células sanguíneas contra destruição imune pela inibição do sistema de complemento (Hillmen P. et al., N.

Engl.

J.

Med. 350(6): 552-9 (2004)). Eculizumab (Soliris®) é um anticorpo monoclonal humanizado que alveja o componente de complemento C5, bloqueando a sua clivagem pelas C5 convertases, prevenindo deste modo a produção de C5a e a montagem do MAC.

O tratamento de pacientes com PNH com eculizumab tem resultado em um redução de hemólise intravascular, como medida pela lactato desidrogenase (LDH), levando à estabilização de hemoglobina e independência de transfusão em cerca de metade dos pacientes (Hillmen P, et al., Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, vol 11(6) (2011)). Enquanto quase todos os pacientes passando pela terapia com eculizumab alcançam níveis de LDH normais ou quase normais (devido ao controle de hemólise intravascular), apenas cerca de um terço dos pacientes atingiu um valor de hemoglobina acima 11 gr/dL e os pacientes restantes no eculizumab continuam a exibir anemia moderada para severa (isto é, dependente de

292 / 394 transfusão), em cerca de proporções iguais (Risitano A. M. et al., Blood 113: 4094-100 (2009)). Como descrito em Risitano et al., Mini-Reviews in Medicinal Chemistry 11: 528-535 (2011), foi demonstrado que os pacientes com PNH no eculizumab contiveram fragmentos C3 ligados a uma porção substancial de seus eritrócitos de PNH (enquanto os pacientes não tratados não contiveram), levando a conclusão que os fragmentos C3 ligados à membrana funcionam como opsoninas nos eritrócitos de PNH, resultando em seu aprisionamento nas células retículo endoteliais através de receptores de C3 específicos e hemólise extravascular subsequente. Portanto, as estratégias terapêuticas além do uso de eculizumab são necessárias para estes pacientes desenvolverem hemólise extravascular mediada pelo fragmento de C3 porque eles continuam a requerer transfusão de células vermelhas.

[00618] Este exemplo descreve métodos para avaliar o efeito de soro deficiente em MASP-2 e soro tratado com agente inibidor de MASP-2 sobre a lise de células sanguíneas vermelhas de amostras obtidas a partir de um modelo da camundongo de PNH e demonstra a eficácia da inibição de MASP-2 para tratar sujeitos sofrendo de PNH e também sustenta o uso de inibidores de MASP-2 para melhorar o efeitos de hemólise extravascular mediada pelo fragmento C3 em Sujeitos passando pela terapia de PNH com um inibidor de C5 tal como eculizumab. Métodos: Modelo animal de PNH:

[00619] As amostras de sangue foram obtidas a partir de camundongos alvejados com gene com deficiências de Crry e C3 (Crry/C3-/-) e camundongos deficientes em CD55/CD59. Estes camundongos perderam os respectivos reguladores de complemento de superfície e seus eritrócitos são, portanto, suscetíveis à autólise de complemento espontânea como são Células sanguíneas humanas com PNH.

[00620] De modo a sensibilizar estes eritrócitos ainda mais, estas

293 / 394 células foram usadas com e sem revestimento pela manana e depois testadas quanto à hemólise no plasma C56/BL6 do tipo selvagem , Plasma nulo em MBL, plasma MASP-2 -/-, NHS humano, plasma MBL -/- humano e NHS tratados com anticorpo humano anti-MASP-2.

1. Ensaio de hemólise de Crry/C3 e eritrócitos de murino duplamente deficientes em CD55/CD59 soros deficientes/dependentes em MASP-2 e controles Dia 1. Preparação de RBC de murino (± revestimento com manana)

[00621] Os materiais incluem: sangue fresco de camundongo, BBS/Mg2+/Ca2+ (4,4 mM de ácido barbitúrico, 1,8 mM de barbitona de sódio, 145 mM de NaCl, pH 7,4, de 5 mM de Mg2+, 5 mM de Ca2+), cloreto de cromo, CrCl3·6H20 (0,5 mg/mL em BBS/Mg2+/Ca2+) e manana, 100 µg/mL em BBS /Mg2+/Ca2+.

[00622] O sangue integral (2 mL) foi girado em 1 a 2 min a 2000xg em uma centrífuga refrigerada a 4˚C. O plasma e a camada leucocitária foram retirados por aspiração. A amostra foi depois lavada três vezes recolocando-se em suspensão os grânulos de RBC em 2 mL de BBS/gelatina/Mg2+/Ca2+ gelado e repetindo a etapa de centrifugação. Depois da terceira lavagem, o grânulo foi recolocado em suspensão em 4 mL de BBS/Mg2+/Ca2+. Uma alíquota de 2 ml do RBC foi retirada como um controle não revestido. Aos 2 mL remanescentes, 2 mL de CrCl3 e 2 mL de manana foram adicionados e a amostra foi incubada com misturando suavemente na temperatura ambiente por 5 minutos. A reação foi terminada pela adição de 7,5 mL de BBS/gelatina/Mg2+/Ca2+. A amostra foi girada como acima, recolocada em suspensão em 2 mL de BBS/gelatina/Mg2+/ Ca2+ e lavada um adicional de duas vezes como acima, depois armazenada a 4˚C. Dia 2. Ensaio de hemólise

[00623] Os materiais incluem BBS/gelatina/Mg2+/Ca2+ (como acima), soros de teste, placas de 96 poços de fundo redondo e fundo chato e um

294 / 394 espectrofotômetro que lê placas de 96 poços de 410 a 414 nm.

[00624] A concentração do RBC foi primeiro determinada e as células foram ajustadas a 109/mL e armazenadas a esta concentração. Antes do uso, o tampão de ensaio foi diluído a 108/mL e depois 100 µl por poço foram usados. Hemólise foi medida de 410 a 414 nm (permitindo maior sensibilidade depois de 541 nm). As diluições de soros de teste foram preparadas em BBS/gelatina/Mg2+/Ca2+ gelado. 100 µl de cada diluição de soro foram pipetados em placa de fundo redondo (ver layout de placa). 100 µl de preparação de RBC apropriadamente diluída foi adicionada (isto é, 108 /mL) (ver layout de placa), incubada a 37° C por cerca de 1 hora e observada quanto a lise. (As placas podem ser fotografadas neste ponto.) A placa foi depois girada na velocidade máxima por 5 minutos. 100 µl foram aspirados da fase de fluído, transferidos para as placas de fundo chato e a OD foi registrada de 410 a 414 nm. As placas de RBC foram retidas (estas podem ser subsequentemente lisadas com água para obter um resultado inverso). Experimento #1:

[00625] O sangue fresco foi obtido a partir de camundongos duplamente deficientes em CD55/CD59 e sangue de camundongos duplamente deficientes em Crry/C3 e eritrócitos foram preparados como descrito em detalhes no protocolo cima. As células foram divididas e metade das células foram revestidas com manana e a outra metade foi deixada sem tratamento, ajustando a concentração final para 1 x 108 por mL, dos quais 100 µl foram usados no ensaio de hemólise, que foi realizado como descrito acima. Resultados de Experimento #1: O caminho de lectina está envolvido em lise de eritrócito no modelo animal de PNH

[00626] Em um experimento inicial, foi determinado que eritrócitos de camundongo tipo selvagens não revestidos não foram lisados em qualquer soro de camundongo. Foi adicionalmente determinado que eritrócitos de

295 / 394 camundongo Crry-/- revestidos com manana foram lentamente lisados (mais do que 3 horas a 37 graus) no soro de camundongo tipo selvagem, mas eles não foram lisados no soro nulo em MBL. (Dados não mostrados).

[00627] Foi determinado que eritrócitos de camundongo Crry-/- revestidos com manana foram rapidamente lisados no soro humano mas não em NHS inativado por calor. Importantemente, eritrócitos de camundongo Crry-/- revestidos com manana foram lisados em NHS diluídos a 1/640 (isto é, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320 e 1/640 diluições todas lisadas). (Dados não mostrado). Nesta diluição, o caminho alternativo não funciona (a atividade funcional de AP é significantemente reduzida abaixo da concentração sérica a 8%). Conclusões do Experimento #1

[00628] Os eritrócitos de camundongo Crry-/- revestidos com manana são muito bem lisados soro humano altamente diluído com MBL mas não naqueles sem MBL. A lise eficiente em cada concentração de soro testada implica que o caminho alternativo não é envolvido ou necessário para esta lise. A incapacidade do soro de camundongo deficiente em MBL e soro humano para lisar os eritrócitos de camundongo Crry-/- revestidos com manana indica que o caminho clássico também não tem nada para fazer com a lise observado. Como caminho de lectina moléculas de reconhecimento são requeridas (isto é, MBL), esta lise é mediada pelo caminho de lectina. Experimento #2:

[00629] O sangue fresco foi obtido dos camundongos Crry/C3 e duplamente deficientes em CD55/CD59 e os eritrócitos de camundongo Crry- /- revestidos com manana foram analisados no ensaio de hemólise como descrito acima na presença dos seguintes soros humanos: nulo em MBL; tipo selvagem; NHS pré-tratado com anticorpo humano anti-MASP-2; e NHS inativado por calor como um controle. Resultados do Experimento #2: Os inibidores de MASP-2 previnem a lise de

296 / 394 eritrócito no modelo animal de PNH

[00630] Com os eritrócitos de camundongo Crry-/- revestidos com manana, NHS foi incubada nas diluições diluídas a 1/640 (isto é, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320 e 1/640), soro MBL-/- humano, NHS pré-tratado com anti- MASP-2 mAb e NHS inativado por calor como um controle.

[00631] A placa microtituladora de ELISA foi girada e os eritrócitos não lisados foram coletados no fundo da placa de poço redondo. O sobrenadante de cada poço foi coletado e a quantidade de hemoglobina liberada dos eritrócitos lisados foi medida lendo-se a OD415 nm em uma leitora de ELISA

[00632] Na NHS inativado por calor de controle (controle negativo), como esperado, nenhuma lise foi observada. Eritrócitos de camundongo revestidos com manana lisados com soro humano de MBL-/- a 1/8 e 1/16 diluições. Eritrócitos de camundongo revestidos com manana lisados com NHS pré-tratados com anticorpo anti-MASP-2 nas diluições de 1/8 e 1/16 enquanto eritrócitos de camundongo revestidos com manana lisados com soro humano tipo selvagem para diluições de 1/32.

[00633] A FIGURA 40 ilustra graficamente a hemólise (como medida pela liberação de hemoglobina de eritrócitos lisados de camundongo (Cryy/C3-/-) dentro do sobrenadante medida pela fotometria) eritrócitos de murino revestidos com manana em soro humano em uma faixa de concentrações séricas no soro de NHS inativado por calor (HI), MBL-/-, NHS pré-tratado com anticorpo anti-MASP-2 e NHS de controle.

[00634] A partir dos resultados mostrado na FIGURA 40, é demonstrado que a inibição de MASP-2 com anticorpo anti-MASP-2 significantemente mudou a CH50 e inibiu a lise mediada por complemento de eritrócitos sintetizados com proteção deficiente da ativação autóloga de complemento. Experimento #3

297 / 394

[00635] O sangue fresco obtido dos camundongos Crry/C3 duplamente deficientes em CD55/CD59 em eritrócitos não revestidos de camundongo Crry-/- foi analisado no ensaio de hemólise como descrito acima na presença das seguintes soros: MBL -/-; soros tipo selvagem; NHS pré-tratado com anticorpo humano anti-MASP-2 e NHS inativado por calor como um controle. Resultados:

[00636] A FIGURA 41 ilustra graficamente a hemólise (como medida pela liberação de hemoglobina de eritrócitos lisados de camundongo tipo selvagem dentro do sobrenadante medida pela fotometria) de eritrócitos de murino não revestidos em soro humano em uma faixa de concentrações séricas no soro de NHS inativada por calor (HI), MBL-/-, NHS pré-tratada com anticorpo anti-MASP-2 e NHS de controle. Como mostrado na FIGURA 41, é demonstrado que a inibição de MASP-2 inibe a lise mediada por complemento de eritrócitos de camundongo tipo selvagem não sensibilizado.

[00637] A FIGURA 42 ilustra graficamente a hemólise (como medida pela liberação de hemoglobina de eritrócitos lisados de camundongo (CD55/59 -/-) dentro do sobrenadante medida pela fotometria) de eritrócitos de murino não revestidos em soro humano em uma faixa de concentração de soro no soro de NHS inativado por calor (HI), MBL-/-, NHS pré-tratado com anticorpo anti-MASP-2 e NHS de controle. TABELA 12: Valores de CH50 expressos como concentrações séricas Soro tipo selvagem CD55/59 -/- NHS inativado por calor Nenhuma lise Nenhuma lise MBL AO/XX doador (deficiente MBL) 7,2% 2,1% NHS + anticorpo anti-MASP-2 5,4% 1,5% NHS 3,1% 0,73% Nota: “CH50” é o ponto no qual a hemólise mediada por complemento atinge 50%.

[00638] Em resumo, os resultados neste exemplo demonstram que a inibição de MASP-2 inibe a lise mediada por complemento de eritrócitos sensibilizados e não sensibilizados com proteção deficiente de ativação autóloga de complemento. Portanto, os inibidores de MASP-2 podem ser

298 / 394 usados para tratar sujeitos sofrendo de PNH e também podem ser usados para melhorar (isto é, inibir, prevenir ou reduzir a severidade de) hemólise extravascular em pacientes com PNH passando por tratamento com um inibidor de C5 tal como eculizumab (Soliris®). EXEMPLO 34

[00639] Este exemplo descreve um estudo de continuação para o estudo descrito acima no Exemplo 29, provendo adicionalmente evidências confirmando que um inibidor de MASP-2, tal como um anticorpo de MASP- 2, é eficaz para o tratamento de exposição à radiação e/ou para o tratamento, melhora ou prevenção de síndrome da radiação aguda. Análise Racional: No estudo inicial descrito no Exemplo 29, foi demonstrado que o tratamento de pré-irradiação com um anticorpo anti- MASP-2 em camundongos aumentou a sobrevivência de camundongos irradiados quando comparado com animais de controle irradiados tratados com veículo em ambos os níveis de exposição de 6,5 Gy e 7,0 Gy. Foi adicionalmente demonstrado no Exemplo 29 que no nível de exposição de 6,5 Gy, o tratamento após a irradiação com anticorpo anti-MASP-2 resultou em um aumento modesto na sobrevivência quando comparado com animais irradiados com controle de veículo. Este exemplo descreve um segundo estudo de radiação que foi realizado para confirmar os resultados do primeiro estudo. Métodos: Projeto do Estudo A:

[00640] Os camundongos Swiss Webster (n = 50) foram expostos à radiação de ionização (8,0 Gy). O efeito da terapia de anticorpo anti-MASP-2 (mAbH6 5 mg/kg), administrada 18 horas antes e 2 horas depois da exposição à radiação e semanalmente depois disso, sobre a mortalidade foi avaliada. Resultados do Estudo A:

[00641] Como mostrado na FIGURA 43, foi determinado que a

299 / 394 administração do anticorpo anti-MASP-2 mAbH6 aumentou a sobrevivência em camundongos expostos a 8,0 Gy, com uma taxa de sobrevivência mediana ajustada aumentada de 4 a 6 dias quando comparados com camundongos que receberam controle de veículo e uma mortalidade reduzida em 12% quando comparado aos camundongos que receberam controle de veículo (teste de log- rank, p = 0,040). Projeto do Estudo B:

[00642] Camundongos Swiss Webster (n = 50) foram expostos à radiação de ionização (8,0 Gy) nos seguintes grupos (I: veículo) controle de solução salina; (II: baixo) anticorpo anti-MASP-2 mAbH6 (5 mg/kg) administrada 18 horas antes da irradiação e 2 horas depois da irradiação; (III: alta) mAbH6 (10 mg/kg) administrada 18 horas antes da irradiação e 2 horas após irradiação; e (IV: pós alta) mAbH6 (10 mg/kg) administrada 2 horas após apenas irradiação. Resultados do Estudo B:

[00643] A administração de anticorpo anti-MASP-2 pré- e pós- irradiação ajustou a sobrevivência média de 4 a 5 dias em comparação com os animais que receberam controle de veículo. A mortalidade nos camundongos tratados com anticorpo anti-MASP-2 foi reduzida em 6 a 12% em comparação aos camundongos de controle de veículo. É adicionalmente mencionado que nenhum efeito prejudicial significante do tratamento foi observado (dados não mostrados).

[00644] Em resumo, os resultados mostrados neste exemplo são compatíveis com os resultados mostrados no Exemplo 29 e adicionalmente demonstram que os anticorpos anti-MASP-2 são eficazes no tratamento de um sujeito mamífero em risco para ou sofrendo dos efeitos prejudiciais da síndrome da radiação aguda. EXEMPLO 35

[00645] Este estudo investiga o efeito da deficiência de MASP-2 em

300 / 394 um model de camundongo de trombose induzida pelo LPS (lipopolissacarídeo). Análise Racional:

[00646] A síndrome urêmica hemolítica (HUS), que é causada pela infecção pela E. coli que produz a toxina Shiga, é a causa principal de insuficiência renal aguda em crianças. Neste Exemplo, um modelo de Schwartzman de trombose induzida pelo LPS (coagulação microvascular) foi realizada em camundongos MASP-2 -/- (KO) para determinar se a inibição de MASP-2 é eficaz para inibir ou prevenir a formação de trombos intravasculares. Métodos:

[00647] MASP-2 -/- (n = 9) e WT (n = 10) camundongos foram analisados em um modelo de Schwarztman de trombose induzida pelo LPS (coagulação microvascular). Os camundongos foram administrados com LPS Serratia e a formação de trombo foi monitorada com o tempo. Uma comparação da incidência de microtrombos e coagulação microvascular induzida pelo LPS foi realizada. Resultados:

[00648] Notavelmente, todos os camundongos MASP-2 -/- testados (9/9) não formaram trombos intravasculares depois da administração de LPS Serratia. Ao contrário, microtrombos foram detectados em 7 de 10 dos camundongos WT testados em paralelo (p = 0,0031, exato de Fischer). Como mostrado na Figura 44, o tempo para o início da oclusão microvascular a seguir da infecção pelo LPS foi medido em camundongos MASP-2 -/- e WT, mostrando a porcentagem de camundongos WT com formação de trombo medida em 60 minutos, com a formação de trombo detectada tão cedo quanto cerca de 15 minutos. Até 80% dos camundongos WT demonstraram a formação de trombo em 60 minutos. Ao contrário, como mostrado na Figura 44, nenhum dos MASP-2 -/- tiveram formação de trombo em 60 minutos

301 / 394 (classificação log: p = 0,0005).

[00649] Estes resultados demonstram que a inibição de MASP-2 é protetiva contra o desenvolvimento de trombos intravasculares em um modelo de HUS. EXEMPLO 36

[00650] Este Exemplo descreve o efeito dos anticorpos anti-MASP-2 em um modelo de camundongo de HUS usando coinjeção intraperitoneal de toxina Shiga 2 (STX2) purificada mais LPS. Fundamentos:

[00651] Um modelo de camundongo de HUS foi desenvolvido usando a coinjeção intraperitoneal da toxina Shiga 2 (STX2) purificada mais LPS. A bioquímica e análise de microarranjo de rins de camundongo revelaram que a inoculação de STX2 mais LPS é distinta dos efeitos de cada agente sozinho. As análises de sangue e soro destes camundongos mostraram neutrofilia, trombocitopenia, hemólise de célula vermelha, e creatinina sérica e nitrogênio da ureia do sangue aumentados. Além disso, a análise histológica e microscopia eletrônica de rins de camundongo demonstraram deposição de fibrina glomerular, congestão de célula vermelha, formação de microtrombos, e mudanças ultraestruturais glomerulares. Foi estabelecido que este modelo de HUS induz todos os sintomas clínicos de patologia HUS humana em camundongos C57BL/6 incluindo trombocitopenia, anemia hemolítica, e insuficiência renal que define a doença humana. (J. Immunol 187(1): 172-80 (2011)). Métodos:

[00652] Camundongos C57BL/6 fêmeas que pesaram entre 18 e 20 g foram adquiridos da Charles River Laboratories e divididos em 2 grupos (5 camundongos em cada grupo). Um grupo de camundongos foi pré-tratado pela injeção intraperitoneal (i.p.) com o anticorpo recombinante mAb anti- MASP-2M11 (100 µg por camundongo; que corresponde a uma concentração

302 / 394 final de 5 mg/kg de peso corporal) diluído em um volume total de 150 µl de solução salina. O grupo de controle recebeu solução salina sem nenhum anticorpo. Seis horas depois da injeção i.p. do anticorpo mAb anti-MASP- 2M11, todos os camundongos receberam uma injeção i.p. combinada de uma dose subletal (3 µg/animal; que corresponde a 150 µg/kg de peso corporal) de LPS de Serratia marcescens (L6136; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) e uma dose de 4,5 ng/animal (que corresponde a 225 ng/kg) de STX2 (duas vezes a dose LD50) em um volume total de 150 µl. A injeção de solução salina foi usada para o controle.

[00653] A sobrevivência dos camundongos foi monitorada a cada 6 horas depois da dosagem. Os camundongos foram mortos tão logo eles atingiram o estágio letárgico da patologia HUS. Depois de 36 horas, todos os camundongos foram mortos e ambos os rins foram removidos para a imunoistoquímica e microscopia de varredura de elétron. As amostras de sangue foram coletadas no final do experimento pela punção cardíaca. O soro foi separado e mantido congelado a -80 ºC para medir BUN e os níveis séricos de creatinina tanto nos grupos tratados quanto nos de controle. Imunoistoquímica

[00654] Um terço de cada rim de camundongo foi fixado em 4% de paraformaldeído por 24 h, processado, e embutido em parafina. Seções de três-mícrons de espessura foram cortadas e colocadas em lâminas carregadas para o tingimento subsequente com corante H & E. Microscopia Eletrônica

[00655] A seção intermediária dos rins foi cortada em blocos de aproximadamente 1 a 2 mm3, e fixadas durante a noite a 4°C em 2,5% de glutaraldeído em 1x PBS. O tecido fixo foi subsequentemente processado pela University of Leicester Electron Microscopy Facility. Seções de criostato

[00656] A outra terça parte dos rins foi cortada em blocos de

303 / 394 aproximadamente 1 a 2 mm3 e subtamente congelada em nitrogênio líquido e mantida a -80°C para seções de criostato e análise de mRNA. Resultados:

[00657] A FIGURA 45 ilustra graficamente a sobrevivência percentual dos camundongos de controle tratados com solução salina (n = 5) e camundongos tratados com anticorpo anti-MASP-2 (n = 5) no modelo induzido por STX/LPS com o tempo (horas). Notavelmente, como mostrado na Figura 45, todos os camundongos de controle morreram em 42 horas. Em nítido contraste, 100% dos camundongos tratados com o anticorpo anti- MASP-2 sobreviveram por todo o curso de tempo do experimento. Compatível com os resultados mostrados na Figura 45, foi observado que todos os camundongos não tratados que morreram ou tiveram que ser mortos com sinais de doença severa tiveram lesões glomerulares significantes, enquanto que os glomérulos de todos os camundongos tratados com anti- MASP-2 pareceram normais (dados não mostrados). Estes resultados demonstram que os inibidores de MASP-2, tais como os anticorpos anti- MASP-2, podem ser usados para tratar indivíduos que sofrem de, ou em risco para o desenvolvimento de uma microangiopatia trombótica (TMA), tal como a síndrome urêmica hemolítica (HUS), HUS atípico (aHUS), ou púrpura trombocitopênica trombótica (TTP). EXEMPLO 37

[00658] Este Exemplo descreve o efeito da deficiência de MASP-2 e inibição de MASP-2 em um modelo de lesão de célula endotelial de murino induzido por FITC-dextrano/luz de trombose.

[00659] Fundamentos/Análise Racional: Como demonstrado nos Exemplos 35 e 36, a deficiência de MASP-2 (MASP-2 KO) e inibição de MASP-2 (por intermédio da administração de um inibidor do anticorpo de MASP-2) protege camundongos em um modelo de HUS típico, ao passo que todos os camundongos de controle expostos ao STX e LPS desenvolveram

304 / 394 HUS severa e tornaram-se moribundos ou morreram dentro de 48 horas. Por exemplo, como mostrado na Figura 54, todos os camundongos tratados com um inibidor de anticorpo MASP-2 e depois expostos ao STX e LPS sobreviveram (exato de Fisher p<0,01; N = 5). Assim, a terapia anti-MASP-2 protege os camundongos neste modelo de HUS.

[00660] Os experimentos a seguir foram realizados para analisar o efeito da deficiência de MASP-2 e inibição de MASP-2 em um modelo de lesão de célula endotelial induzida pelo isotiocianato de fluoresceína (FITC)- dextrano de microangiopatia trombótica (TMA) de modo a demonstrar ainda mais o benefício dos inibidores de MASP-2 para o tratamento de HUS, aHUS, TTP, e TMA’s com outras etiologias. Métodos: Microscopia Intravital

[00661] Camundongos foram preparados para a microscopia intravital como descrito por Frommhold et al., BMC Immunology 12: 56-68, 2011. Em resumo, os camundongos foram anestesiados com injeção intraperitoneal (i.p.) de cetamina (125 mg/kg de peso corporal, Ketanest, Pfitzer GmbH, Karlsruhe, Alemanha) e xilazina (12,5 mg/kg de peso corporal; Rompun, Bayer, Leverkusen, Alemanha) e colocados em uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal a 37°C. A microscopia intravital foi conduzida em um microscópio vertical (Leica, Wetzlar, Alemanha) com uma objetiva de imersão em solução salina (SW 40/0,75 abertura numérica, Zeiss, Jena, Alemanha). Para facilidade de respiração, os camundongos foram intubados usando tubo PE 90 (Becton Dickson and Company, Sparks, MD, USA). A artéria carótida esquerda foi canulada com o tubo PE10 (Becton Dickson and Company, Sparks, MD, USA) para a amostragem de sangue e administração sistêmica de sistemaic anticorpo monoclonal (mAb). Preparação do Músculo Cremaster

305 / 394

[00662] A preparação cirúrgica do músculo cremaster para a microscopia intravital foi realizada como descrito por Sperandio et al., Blood, 97: 3812-3819, 2001. Em resumo, o escroto foi aberto e o músculo cremaster mobilizado. Depois da incisão longitudinal e arrumação do músculo em um vidro de cobertura, o epidídimo e testículo foram movidos e presos para o lado, dando acesso microscópico total à microcirculação do músculo cremaster. As vênulas do músculo Cremaster foram registradas por intermédio de uma câmara CCD (CF8/1; Kappa, Gleichen, Alemanha) em um gravador Panasonic S-VHS. O músculo cremaster foi superfundido com (solução salina tamponada com bicarbonato a 35°C) termocontrolada como anteriormente descrito por Frommhold et al., BMC Immunology 12: 56-68,

20112011. Modelo de lesão de FITC dextrano de excitação por luz

[00663] Uma lesão vascular controlada por luz, dependente da dose, do endotélio de vênulas e arteríolas do músculo cremaster foi induzida pela excitação de luz de (FITC)-dextrano fototóxica (Cat. No. FD150S, Sigma Aldrich, Poole, U.K.). Este procedimento inicia a trombose localizada. Como um reagente fototóxico, 60 µL de uma solução a 10% p/v de FITC–dextrano foram injetados através do acesso da artéria carótida esquerda e deixada se espalhar homogeneamente por todo o sangue circulante por 10 minutos. Depois de selecionar uma vênula bem perfundida, luz halogênica de intensidade de faixa baixa a média (800 a 1500) foi focalizada no vaso de interesse para induzir a fluorescência de FITC-dextrano e fototoxicidade de branda a moderada à superfície endotelial de modo a estimular a trombose em uma maneira reprodutível, controlada. A intensidade de luz fototóxica necessária para a excitação de FITC-dextran foi gerada usando uma lâmpada halogênica (12V, 100W, Zeiss, Oberkochen, Alemanha). A fototoxicidade que resultou da excitação induzida por luz do fluorocromo requer um limiar de intensidade de luz e/ou duração de iluminação e é causada pelo

306 / 394 aquecimento direto da superfície endotelial ou pela geração de radicais de oxigênio reativo como descrito por Steinbauer et al., Langenbecks Arch Surg 385: 290-298, 2000.

[00664] A intensidade de luz da aplicação em cada vaso foi medida para ajuste por um detector de diodo que corrige o comprimento de onda para medições de baixa potência (Labmaster LM-2, Coherent, Auburn, USA). A análise fora de linha de varreduras de vídeo foi realizada por meio de um sistema de análise de microcirculação assistida por computador (CAMAS, Dr. Zeintl, Heidelberg) e velocidade de célula sanguínea vermelha foi medida como descrito por Zeintl et al., Int J Microcirc Clin Exp, 8(3): 293-302, 2000. Aplicação do inibidor de anticorpo monoclonal de MASP-2 anti-ser humano (mAbH6) e controle de veículo antes da indução de trombose

[00665] Usando um projeto de estudo cego, camundongos da ninhada C57BL/6 WT com 9 semanas de idade macho foram dadas injeções i.p. do anticorpo MASP-2 monoclonal recombinante humano (mAbH6), um inibidor da atividade funcional de MASP-2 (dado em uma concentração final de 10 mg/kg de peso corporal), ou a mesma quantidade de um anticorpo de controle de isótipo (sem atividade inibidora de MASP-2) 16 horas antes da indução fototóxica de trombose no modelo do cremaster de microscopia intravital. Uma hora antes da indução da trombose, uma segunda dose de mAbH6 ou o anticorpo de controle foi dado. camundongos knockout (KO) em MASP-2 também foram avaliados neste modelo.

[00666] mAbH6 (estabelecido contra MASP-2 recombinante humano) é um inibidor potente da atividade funcional de MASP-2 humano, que reage cruzado com, liga-se a e inibe MASP-2 de camundongo mas com afinidade mais baixa devido à sua especificidade de espécie (dados não mostrados). De modo a compensar quanto à afinidade mais baixa de mAbH6 para o MASP-2 de camundongo, mAbH6 foi dado em uma alta concentração (10 mg/kg de peso corporal) para superar a variação em especificidade de espécie, e a

307 / 394 afinidade menor para MASP-2 de camundongo, fornecer bloqueio eficaz da atividade funcional de MASP-2 de murino sob condições in vivo.

[00667] Neste estudo cego, o tempo requerido para cada vênula individual testada (critérios de seleção foram pelos diâmetros comparáveis e velocidade do fluxo sanguíneo) para ocluir totalmente foi registrado.

[00668] A porcentagem de camundongos com oclusão microvascular, o tempo de início, e o tempo para oclusão foram avaliados em um período de observação de 60 minutos usando registros de video de microscopia intravital. Resultados:

[00669] A FIGURA 46 ilustra graficamente, como uma função do tempo depois da indução de lesão, a porcentagem de camundongos com oclusão microvascular no modelo de FITC/Dextran UV depois do tratamento com controle de isótipo ou anticorpo mAb MASP-2H6 de ser humano (10 mg/kg) dosado em 16 horas e 1 hora antes da injeção de FITC/Dextrano. Como mostrado na Figura 46, 85% dos camundongos do tipo selvagem que recebem o anticorpo de controle de isótipo ocluíram dentro de 30 minutos ou menos, ao passo que apenas 19% dos camundongos do tipo selvagem pré- tratado com o anticorpo MASP-2 humano (mAbH6) ocluído dentro do mesmo período de tempo, e o tempo para oclusão foi retardado nos camundongos que eventualmente ocluíram no grupo tratado com anticorpo MASP-2 humano. É observado ainda que três dos camundongos tratados com mAb MASP-2H6 não ocluíram de modo algum dentro do período de observação de 60 minutos (isto é, foram protegidos da oclusão trombótica).

[00670] A FIGURA 47 ilustra graficamente o tempo de oclusão em minutos para os camundongos tratados com o anticorpo MASP-2 humano (mAbH6) e o anticorpo de controle de isótipo. Os dados são relacionados como pontos de dispersão com valores médios (barras horizontais) e barras de erro padrão (barras verticais). Esta figura mostra o tempo de oclusão nos camundongos onde a foi observável. Assim, os três camundongos tratados

308 / 394 com anticorpo MASP-2 não ocluíram durante o período de observação de 60 minutos não foram incluídos nesta análise (não houve nenhum camundongo tratado com controle que não ocluísse). O teste estatístico usado para a análise foi o teste t não emparelhado; em que o símbolo “*” indica p = 0,0129. Como mostrado na Figura 47, nos quatro camundongos tratados com o anticorpo MASP-2 (mAbH6) que ocluíram, o tratamento com anticorpo MASP-2 significantemente aumentou o tempo de oclusão venosa no modelo de lesão de célula endotelial induzido por FITC-dextrano/luz de trombose com baixa intensidade de luz (800 a 1500) quando comparado aos camundongos tratados com o anticorpo de controle de isótipo. A média do tempo de oclusão total do controle de isótipo foi de 19,75 minutos, enquanto que a média do tempo de oclusão total para o grupo tratado com o anticorpo MASP-2 foi de 32,5 minutos.

[00671] A FIGURA 48 ilustra graficamente o tempo até a oclusão em minutos para os camundongos do tipo selvagem, camundongos MASP-2 KO, e camundongos tipo selvagem pré-tratados com anticorpo MASP-2 humano (mAbH6) administrados i.p. a 10 mg/kg 16 horas antes, e depois administrados mais uma vez i.v. 1 hora antes da indução de trombose no modelo de lesão de célula epitelial induzida por FITC-dextrano/luz de trombose com baixa intensidade de luz (800 a 1500). Apenas os animais que ocluíram foram incluídos na Figura 48; n = 2 para os camundongos do tipo selvagem que recebem anticorpo de controle de isótipo; n = 2 para MASP-2 KO; e n = 4 para camundongos do tipo selvagem que recebem anticorpo MASP-2 humano (mAbH6). O símbolo “*” indica p<0,01. Como mostrado na Figura 48, a deficiência de MASP-2 e a inibição de MASP-2 (mAbH6 a 10 mg/kg) aumentaram o tempo de oclusão venosa no modelo de lesão de célula endotelial induzida por FITC-dextrano/luz de trombose com baixa intensidade de luz (800 a 1500). Conclusões:

309 / 394

[00672] Os resultados neste Exemplo demonstram ainda que um agente inibidor de MASP-2 que bloqueia o caminho da lectina (por exemplo, anticorpos que bloqueiam a função de MASP-2), inibe a coagulação microvascular e a trombose, as características distintivas dos distúrbios microangiopáticos multiplos, em um modelo de camundongo de TMA. Portanto, é esperado que a administração de um agente inibidor de MASP-2, tal como um anticorpo inibidor de MASP-2, será uma terapia eficaz em pacientes que sofrem de HUS, aHUS, TTP, ou outros distúrbios microangiopáticos e fornecem proteção da coagulação microvascular e trombose. EXEMPLO 38

[00673] Este Exemplo descreve um estudo que demonstra que o anticorpo inibidor de MASP-2 humano (mAbH6) não tem nenhum efeito sobre a função de plaqueta em plasma humano rico em plaqueta.

[00674] Fundamentos/Análise Racional: Como descrito no Exemplo 37, foi demonstrado que a inibição de MASP-2 com o anticorpo inibidor de MASP-2 humano (mAbH6) aumentou o tempo de oclusão venosa no modelo de lesão de célula endotelial induzida por FITC-dextrano/luz de trombose. O experimento a seguir foi realizado para determinar se o inibidor de anticorpo de MASP-2 (mAbH6) tem um efeito sobre a função de plaqueta.

[00675] Métodos: O efeito do anticorpo de MASP-2 mAbH6 humano foi testado na agregação of plaquetas induzida por ADP como segue. mAb humano MASP-2H6 em uma concentração de 1 µg/ml ou 0,1 µg/ml foi adicionado em uma solução de 40 µL a 360 µL de plasma humano rico em plaqueta recém preparado. Um anticorpo de controle de isótipo foi usado como o controle negativo. Depois de adicionar os anticorpos ao plasma, a ativação de plaqueta foi induzida pela adição de ADP em uma concentração final de 2 µM. O ensaio foi iniciado pela agitação das soluções com um imã pequeno na cubeta de 1 ml. A agregação de plaqueta foi medida em um

310 / 394 Agregômetro de Plaqueta Chrono-log de dois canais Modelo 700 Whole Blood/Optical Lumi-Aggregometer. Resultados:

[00676] A agregação percentual nas soluções foi medida em um período de tempo de cinco minutos. Os resultados são mostrados abaixo na Tabela 13. TABELA 13: Agregação de Plaqueta em um período de tempo de cinco minutos. Anticorpo Amplitude Inclinação (agregação percentual) (agregação percentual com o tempo) Anticorpo MASP-2 (mAbH6) 46% 59 (1 µg/ml) Anticorpo de controle de isótipo 49% 64 (1 µg/ml) anticorpo MASP-2 (mAbH6) 52% 63 (0,1 µg/ml) Anticorpo de controle de isótipo 46% 59 (0,1 µg/ml)

[00677] Como mostrado acima na Tabela 13, nenhuma diferença significante foi observada entre a agregação das plaquetas induzida por ADP tratado com o anticorpo de controle ou o anticorpo mAb MASP-2H6. Estes resultados demonstram que o anticorpo MASP-2 humano (mAbH6) não tem nenhum efeito sobre a função de plaqueta. Portanto, os resultados descritos no Exemplo 37 demonstrando que a inibição de MASP-2 com anticorpo inibidor de MASP-2 humano (mAbH6) aumentou o tempo de oclusão venosa no modelo de lesão de célula endotelial induzida por FITC-dextrano/luz de trombose, não foi devida a um efeito de mAbH6 sobre a função da plaqueta. Assim, a inibição de MASP-2 impede a trombose sem impactar diretamente a função da plaqueta, revelando um mecanismo terapêutico que é distinto dos agentes anti-trombóticos existentes. EXEMPLO 39

[00678] Este Exemplo descreve o efeito da inibição de MASP-2 sobre a formação de trombo e oclusão de vaso em um modelo de murino de TMA. Fundamento/Análise racional: O caminho da lectina desempenha um papel

311 / 394 dominante na ativação do sistema de complemento em ambientes de estresse ou lesão de célula endotelial. Esta ativação é rapidamente amplificada pelo caminho alternativo, que é desregulado em muitos pacientes apresentando com aHUS. A prevenção da ativação de MASP-2 e do caminho da lectina é assim esperada deter a sequência de reações enzimáticas que leva à formação do complexo de ataque à membrana, ativação de plaqueta e recrutamento de leucócito. Este efeito limita o dano tecidual.

[00679] Além disso, MASP-2 tem atividade semelhante ao Fator Xa e cliva protrombina para formar trombina. Esta ativação acionada pela MASP-2 do sistema de coagulação pode desequilibrar a hemostase e resultar na patologia de TMA. Assim, a inibição de MASP-2 usando um inibidor de MASP-2, tal como um anticorpo inibidor de MASP-2 que bloqueie a ativação dos sistemas de complemento e coagulação é esperada melhorar resultados na aHUS e outras condições relacionadas com TMA.

[00680] Como descrito no Exemplo 37, foi demonstrado que a inibição de MASP-2 com anticorpo inibidor de MASP-2 humana (mAbH6) aumentou o tempo de oclusão venoso no modelo de lesão de célula endotelial induzido por FITC-dextrano/luz de trombose. Neste modelo de TMA, os camundongos foram sensibilizados pela injeção IV de FITC-dextrano, seguida pela fotoativação localizada do FITC-dextrano na microvasculatura do músculo cremaster de camundongo (Thorlacius H et al., Eur J Clin. Invest 30(9): 804- 10, 2000; Agero et al., Toxicon 50(5): 698-706, 2007).

[00681] O experimento a seguir foi realizado para determinar se o anticorpo inibidor de MASP-2 (mAbH6) tem um efeito de dose-resposta sobre a formação de trombo e a oclusão de vaso em um modelo de murino de TMA. Métodos: A trombose localizada foi induzida pela fotoativação de dextrano rotulado com isotiocianato de fluoresceína (FITC-dextrano) na microvasculatura do músculo cremaster de camundongos C57 Bl/6 e a

312 / 394 microscopia intravital foi usada para medir o início da formação de trombo e a oclusão de vaso usando os métodos descritos no Exemplo 37, com as seguintes modificações. Os grupos de camundongos foram dosados com mAbH6 (2 mg/kg, 10 mg/kg ou 20 mg/kg) ou anticorpo de controle de isótipo (20 mg/kg) foi administrado pela injeção intravenosa (iv) uma hora antes da indução de TMA. O tempo do início da formação de trombo e o tempo para completar a oclusão de vaso foram registrados. A análise de reprodução de vídeo das imagens da microscopia intravital gravados em 30 a 60 minutos foi usada para avaliar o tamanho do vaso, velocidade do fluxo sanguíneo, intensidade de luz, taxa de início da formação de trombo como equivalente da adesão de plaquetas, tempo para o início da formação de trombo, taxa de oclusão de vaso total e tempo até a oclusão total de vaso. A análise estatística foi conduzida usando SigmaPlot v12.0. Resultados: Início da Formação de Trombo

[00682] A FIGURA 49 é uma plotagem de Kaplan-Meier mostrando a porcentagem de camundongos com trombos como uma função do tempo na microangiopatia trombótica induzida por FITC-Dextrano em camundongos tratados com doses crescentes de anticorpo inibidor de MASP-2 humana (mAbH6 a 2 mg/kg, 10 mg/kg ou 20 mg/kg) ou um anticorpo de controle de isótipo. Como mostrado na FIGURA 49, o início da formação de trombo foi atrasado nos camundongos tratados com mAbH6 em uma maneira dependente da dose em relação aos camundongos tratados com controle.

[00683] A FIGURA 50 ilustra graficamente o tempo médio (minutos) para o início da formação de trombo como uma função da dose de mAbH6 (*p<0,01 comparado ao controle). Como mostrado na FIGURA 50, o tempo médio para o início da formação de trombo aumentou com o aumento das doses de mAbH6 de 6,8 minutos no grupo de controle

313 / 394 para 17,7 minutos no grupo tratado com 20 mg/kg de mAbH6 (p<0,01). Os dados experimentais e análise estatística subjacentes são providos nas TABELAS 14 e 15.

[00684] O tempo para o início da formação de trombo em camundongos individuais registrado com base na avaliação da gravação videográfica é detalhado abaixo na TABELA 14. TABELA 14: Tempo para o Início da Formação de Trombo Depois da Lesão induzida por Corante Claro Tratamento de Controle Tratamento com mAbH6 Controle 2 mg/kg 10 mg/kg 20 mg/kg 6,07 5,93 12,75 10,00 1,07 6,95 2,53 10,33 8,00 8,92 14,00 21,00 2,40 11,92 3,05 11,50 Tempo para o início 8,48 12,75 8,00 19,00 (minutos) 4,00 12,53 8,17 10,37 4,00 15,83 22,65 7,83 11,70 16,37 6,83 50,67 21,75* 15,00 32,25* 15,67 * os vasos não mostraram início durante o período de observação indicado

[00685] A análise estatística comparando o tempo para o início da oclusão entre os animais tratados com controle e mAbH6 é mostrada abaixo na TABELA 15. TABELA 15: Tempo para o Início: dados do estudo de dose resposta de FITC Dex mAbH6 mAbH6 mAbH6 Estatística Controle (2 mg/kg) (10 mg/kg) (20 mg/kg) 11/11 6/6 9/9 8/10 Número de eventos/ número de animais (%) (100%) (100%) (100%) (80,0%) 6,8 10,4 11,7 17,7 Tempo médio (minutos) (95% CI) (2,4, 8,5) (5,9, 12,8) (2,5, 15,8) (10,0, 22,7) Valor p de Wilcoxon* 0,2364 0,1963 0,0016 Evento = Tempo para o início observado Média (minutos) e a sua CI a 95% foram com base na estimativa de Kaplan-Meier NE = não estimável *Os valores p foram ajustados pela comparação múltipla de Dunnett-Hsu Oclusão Microvascular

[00686] A FIGURA 51 é uma plotagem de Kaplan-Meier mostrando a porcentagem de camundongos com oclusão microvascular como uma função do tempo na microangiopatia trombótica induzida por FITC-Dextrano em

314 / 394 camundongos tratados com doses crescentes de inibidor de anticorpo de MASP-2 humana (mAbH6 a 2 mg/kg, 10 mg/kg ou 20 mg/kg) ou um anticorpo de controle de isótipo. Como mostrado na FIGURA 51, a oclusão microvascular completa foi atrasada nos grupos tratados com mAbH6 quando comparados com os camundongos de controle.

[00687] A FIGURA 52 ilustra graficamente o tempo médio para a oclusão microvascular como uma função da dose de mAbH6 (*p<0,05 comparado ao controle). Como mostrado na FIGURA 52, o tempo médio para completar a oclusão microvascular aumentou de 23,3 minutos no grupo de controle para 38,6 minutos no grupo tratado com 2 mg/kg de mAbH6 (p<0,05). As doses de 10 mg/kg ou 20 mg/kg de mAbH6 desempenharam similarmente (tempo médio para a oclusão microvascular completa foi de 40,3 e 38 minutos, respectivamente) para o grupo tratado com 2 mg/kg de mAbH6. Os dados experimentais subjacentes e a análise estatística são providos nas TABELAS 16 e 17.

[00688] O tempo para a oclusão de vaso completa nos camundongos individuais gravados com base na avaliação primária da gravação videográfica é detalhado abaixo na TABELA 16. TABELA 16: Tempo para a Oclusão Completa Depois da Lesão Induzida por Corante Claro Tratamento de Controle Tratamento com mAbH6 Controle 2 mg/kg 10 mg/kg 20 mg/kg 37,50 42,3 30,92 38,00 29,07 21,91 17,53 28,00 27,12 24,4 51,38 40,58 19,38 31,38 36,88 33,00 Tempo para 19,55 61,17* 26,83 39,10 Oclusão 18,00 61,55* 40,28 32,03 (minutos) 16,50 55,83 38,53 23,33 71,93* 21,75* 14,83 98,22* 32,25* 30* 33,17* 61,8* *Os vasos não ocluíram completamente durante o período de observação indicado.

[00689] A análise estatística comparando o tempo para completar a oclusão entre animais de controle e tratados com mAbH6 é mostrada abaixo

315 / 394 na TABELA 17. TABELA 17: Tempo para Completar a Oclusão Microvascular: dados do estudo de dose resposta de FITC Dex mAbH6 mAbH6 mAbH6 Estatística Controle (2 mg/kg) (10 mg/kg) (20 mg/kg) 9/11 4/6 7/9 7/10 Número de eventos/ número de animais (%) (81,8%) (66,7%) (77,8%) (70,0%) 23,3 36,8 40,3 38,0 Tempo médio (minutos) (95% CI) (16,5, 37,5) (21,9, NE) (17,5, NE) (28,0, 40,6) Valor p de Wilcoxon* 0,0456 0,0285 0,0260 Evento = Tempo para oclusão observado Média (minutos) e a sua CI a 95% foram com base na estimativa de Kaplan-Meier NE = não estimável *Os valores p foram ajustados pela comparação múltipla de Dunnett-Hsu Sumário

[00690] Como resumido na TABELA 18, o início da formação de trombo foi atrasado nos camundongos tratados com mAbH6 em uma maneira dependente da dose em relação aos camundongos tratados com controle (tempo médio para início 10,4 a 17,7 minutos vs 6,8 minutos). O tempo médio para a oclusão completa foi significantemente atrasada em todos os grupos tratados com mAbH6 em relação aos grupos tratados com controle (Tabela 18). TABELA 18: Tempo médio para o Início da Formação de Trombo e Oclusão Completa mAbH6 mAbH6 mAbH6 Controle (2 mg/kg) (10 mg/kg) (20 mg/kg) Tempo médio# para o início da 6,8 10,4 11,7 17,7* formação de trombo (minutos) Tempo médio# para o início da oclusão microvascular completa 23,3 36,8* 40,3* 38,0* (minutos) #Os valores médios estão fundamentados na estimativa de Kaplan-Meier *p<0,05 comparado ao controle (Wilcoson ajustado por Dunnett-Hsu para comparações múltiplas)

[00691] Estes resultados demonstram que mAbH6, um anticorpo monoclonal humano que se liga à MASP-2 e bloqueia o caminho da lectina do sistema de complemento, reduziu a trombose microvascular em uma maneira dependente da dose em um modelo experimental de camundongo de TMA. Portanto, é esperado que a administração de um agente inibidor de MASP-2, tal como um anticorpo inibidor de MASP-2, seja uma terapia eficaz

316 / 394 em pacientes sofrendo de HUS, aHUS, TTP ou outros distúrbios microangiopáticos tais como outras TMAs incluindo a Síndrome Antifosfolipídica Catastrófica (CAPS), doença de Degos sistêmica e TMAs secundárias ao câncer, quimioterapia contra o câncer e transplante e proveja proteção da coagulação microvascular e trombose. EXEMPLO 40

[00692] Este Exemplo descreve a identificação, usando a exibição de fago, de anticorpos scFv totalmente humanos que se ligam à MASP-2 e inibem a ativação de complemento mediada por lectina enquanto deixa os componentes do caminho clássico (dependente de C1q) e do caminho alternativo do sistema imune intactos. Vista Geral:

[00693] Anticorpos MASP-2 totalmente humanos, com alta afinidade foram identificados pela triagem de uma biblioteca de demonstração de fago. Os fragmentos de cadeia leve e pesada variável dos anticorpos foram isolados tanto em um formato scFv quanto em um formato de IgG de tamanho natural. Os anticorpos MASP-2 humanos são úteis para a inibição da lesão celular associada com a ativação do caminho de complemento alternativo do caminho mediado pela lectina enquanto deixa o componente do caminho clássico (dependente de C1q) do sistema imune intacto. Em algumas formas de realização, os anticorpos inibidores de MASP-2 individuais têm as características que seguem: (a) alta afinidade para MASP-2 humano (por exemplo, um KD de 10 nM ou menos), e (b) inibem a atividade de complemento dependente de MASP-2 em 90% de soro humano com um IC50 de 30 nM ou menos. Métodos: Expressão de MASP-2 de tamanho natural cataliticamente inativo:

[00694] A sequência de cDNA de tamanho natural de MASP-2 humano (SEQ ID NO: 4), que codifica o polipeptídeo MASP-2 humano com

317 / 394 a sequência líder (SEQ ID NO: 5) foi subclonada dentro do vetor de expressão de mamífero pCI-Neo (Promega), que direciona a expressão eucariótica sob o controle da região realçadora/promotora (descrito em Kaufman R. J. et al., Nucleic Acids Research 19: 4485-90, 1991; Kaufman, Methods in Enzymology, 185: 537-66 (1991)).

[00695] De modo a gerar a proteína MASP-2A cataliticamente inativa humana, a mutagênese loco-dirigida foi realizada como descrito na US2007/0172483, por meio deste aqui incorporada por referência. Os produtos de PCR foram purificados depois da eletroforese em gel de agarose e preparação de faixa e sobreposições de adenosina única foram geradas usando um procedimento de formação de cauda padrão. O MASP-2A com cauda de adenosina foi depois clonado dentro do vetor fácil pGEM-T e transformado na E. coli. A MASP-2A humana foi subclonada ainda em cada um dos vetores de expressão de mamífero pED ou pCI-Neo.

[00696] A construção de expressão de MASP-2A descrita acima foi transfectada em células DXB1 usando o procedimento de transfecção com fosfato de cálcio padrão (Maniatis et al., 1989). MASP-2A foi produzido em meio isento de soro para garantir que as preparações não foram contaminadas com outras proteínas séricas. Os meios foram colhidos das células confluentes a cada segundo dia (quatro vezes no total). O nível de MASP-2A recombinante teve uma média de aproximadamente 1,5 mg/litro de meio de cultura. O MASP-2A (mutante Ser-Ala descrito acima) foi purificado pela cromatografia de afinidade em colunas de MBP-A-agarose ELISA de MASP-2A em Clones Candidatos ScFv identificados pelo garimpo/ conversão de scFv e triagem em filtro

[00697] Uma biblioteca de demonstração de fago das sequências da região variável das cadeias leve e pesada da imunoglobulina humana foi individualizada para o garimpo de antígeno seguido pela triagem automatizada de anticorpo e seleção para identificar anticorpos scFv de alta-

318 / 394 afinidade para a proteína de MASP-2 humana. Três rodadas de garimpo da biblioteca de fago scFv contra MASP-2A rotulada com HIS ou rotulada com biotina foram realizadas. A terceira rodada de garimpo foi eluída primeiro com MBL e depois com TEA (alcalino). Para monitorar o enriquecimento específico de fragmentos scFv que demonstram fago contra a MASP-2A alvo, um ELISA de fago policlonal contra MASP-2A imobilizada foi realizado. Os genes de scFv da rodada de garimpo 3 foram clonados em um vetor de expressão pHOG e conduzidos em uma triagem em filtro em pequena escala para observar quanto aos clones específicos contra MASP-2A.

[00698] As colônias bacterianas contendo fragmentos de scFv que codificam plasmídeos da terceira rodada de garimpo foram escolhidos, quadriculados sobre membranas de nitrocelulose e cultivados durante a noite em meio não indutor para produzir placas mestras. Um total de 18.000 colônias foram escolhidas e analisadas da terceira rodada de garimpo, metade da elução competitiva e metade da elução de TEA subsequente. O garimpo da biblioteca de fagomídeo scFv contra MASP-2A seguido pela conversão de scFv e uma triagem em filtro produziu 137 clones positivos. 108/137 clones foram positivos em um ensaio de ELISA para a ligação de MASP-2 (dados não mostrados), dos quais 45 clones foram analisados ainda quanto a capacidade para bloquear a atividade de MASP-2 em soro humano normal. Ensaio para medir a inibição da Formação da C3 Convertase do Caminho da Lectina

[00699] Um ensaio funcional que mede a inibição da formação da C3 convertase do caminho da lectina foi usado para avaliar a “atividade bloqueadora” dos clones candidatos scFv de MASP-2. A atividade da serina protease de MASP-2 é requerida de modo a gerar os dois componentes de proteína (C4b, C2a) que compreendem a C3 convertase do caminho da lectina. Portanto, um scFv de MASP-2 que inibe a atividade funcional de MASP-2 (isto é, um scFv de MASP-2 bloqueador), inibirá a formação de

319 / 394 novo da C3 convertase do caminho da lectina. A C3 contém um grupo de tioéster incomum e altamente reativo como parte da sua estrutura. Na clivagem de C3 pela C3 convertase neste ensaio, o grupo tioéster na C3b pode formar uma ligação covalente com os grupos hidroxila ou amino nas macromoléculas imobilizadas no fundo dos poços plásticos por intermédio das ligações de éster ou amida, facilitando assim a detecção de C3b no ensaio de ELISA.

[00700] A levedura manana é um ativador conhecido do caminho da lectina. No método a seguir para medir a formação da C3 convertase, poços plásticos revestidos com manana foram incubados com soro humano diluído para ativar o caminho da lectina. Os poços foram depois lavados e ensaiados quanto à C3b imobilizada nos poços usando métodos de ELISA padrão. A quantidade de C3b gerada neste ensaio é uma reflexão direta da formação de novo da C3 convertase do caminho da lectina. clones scFv de MASP-2 nas concentrações selecionadas foram testadas neste ensaio quanto à sua capacidade para inibir a formação da C3 convertase e consequente geração de C3b. Métodos:

[00701] Os 45 clones candidatos identificados como descrito acima foram expressados, purificados e diluídos até a mesma concentração de estoque, que foi mais uma vez diluído em tampão de GVB contendo Ca++ e Mg++ (4,0 mM de barbital, 141 mM de NaCl, 1,0 mM de MgCl2, 2,0 mM de CaCl2, 0,1% de gelatina, pH 7,4) para garantir que todos os clones tiveram a mesma quantidade de tampão. Os clones de scFv foram cada um testados em triplicata na concentração de 2 μg/ml. O controle positivo foi OMS100 Fab2 e foi testado a 0,4 μg/ml. A formação de C3c foi monitorada na presença e ausência dos clones scFv/IgG.

[00702] Manana foi diluída a uma concentração de 20 μg/ml (1 μg/ poço) em tampão de carbonato a 50 mM (15 mM de Na2CO3 + 35 mM de

320 / 394 NaHCO3 + 1,5 mM de NaN3), pH 9,5 e revestida em uma placa de ELISA durante a noite a 4 ºC. No dia seguinte, as placas revestidas com manana foram lavadas 3 vezes com 200 μl de PBS. 100 μl de solução de bloqueio de 1% HSA foi depois adicionado aos poços e incubados por 1 hora na temperatura ambiente. As placas foram lavadas 3 vezes com 200 μl de PBS, e armazenadas em gelo com 200 μl de PBS até a adição das amostras.

[00703] Soro humano normal foi diluído para 0,5% em tampão CaMgGVB, e clones scFv ou o Fab2 OMS100 de controle positivo foram adicionados em triplicatas a 0,01 μg/ml; 1 μg/ml (apenas controle de OMS100) e 10 μg/ml para este tampão e pré-incubados 45 minutos em gelo antes da adição à placa de ELISA bloqueada. A reação foi iniciada pela incubação por uma hora a 37 ºC e foi interrompida transferindo-se as placas para um banho de gelo. A deposição de C3b foi detectada com um anticorpo C3c de Coelho α-Camundongo seguido pelo HRP de Cabra α-Coelho. O controle negativo foi tampão sem anticorpo (nenhum anticorpo = deposição de C3b máxima), e o controle positivo foi tampão com EDTA (nenhuma deposição de C3b). O fundo foi determinado pela realização do mesmo ensaio exceto que os poços foram isentos de manana. O sinal de fundo contra placas sem manana foi subtraído dos sinais nos poços contendo manana. Um critério de corte foi ajustado na metade da atividade de um clone scFv irrelevante (VZV) e tampão sozinho. Resultados: Com base no critério de corte, um total de 13 clones foram verificados bloquear a atividade de MASP-2. Todos os 13 clones produzindo > 50% da supressão do caminho foram selecionados e sequenciados, produzindo 10 clones únicos. Todos os dez clones foram verificados ter a mesma subclasse de cadeia leve, λ3, mas três subclasses de cadeia pesada diferentes: VH2, VH3 e VH6. No ensaio funcional, cinco dos dez clones scFv candidatos deram valores de IC50 nM menores do que os critérios alvos de 25 nM usando 0,5% de soro humano.

321 / 394

[00704] Para identificar anticorpos com potência melhorada, os três clones de scFv, identificados como descrito acima, foram individualizados para o embaralhamento de cadeia leve. Este processo envolveu a geração de uma biblioteca combinatória que consiste do VH de cada um dos clones mães emparelhados com uma biblioteca de cadeias leves lambda ingênuas, humanas (VL) derivadas de seis doadores saudáveis. Esta biblioteca foi depois triada quanto aos clones scFv com afinidade e/ou funcionalidade de ligação melhoradas. TABELA 15: Comparação da potência funcional em IC50 (nM) dos clones filhas principais e seus respectivios clones mães (todos no formato scFv) Ensaio de C3 humano a Ensaio de C3 humano a Ensaio de C4 humano a Clone scFv 1% de soro 90% soro (IC50 nM) 90% soro (IC50 nM) (IC50 nM) 17D20mc 38 nd nd 17D20m_d3521N11 26 >1000 140 17N16mc 68 nd nd 17N16m_d17N9 48 15 230

[00705] São apresentadas abaixo as sequências da região variável da cadeia pesada (VH) para os clones mãe e clones filhas mostrados acima na TABELA 19.

[00706] As CDRs de Kabat (31-35 (H1), 50-65 (H2) e 95-107 (H3)) estão em negrito; e as CDRs de Chothia (26-32 (H1), 52-56 (H2) e 95-101 (H3)) estão sublinhadas. Região variável da cadeia pesada (VH) 17D20_35VH-21N11VL (SEQ ID NO: 67, codificada pela SEQ ID NO: 66)

QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSRGKMGVSWIRQPPGKAL EWLAHIFSSDEKSYRTSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTAT

YYCARIRRGGIDYWGQGTLVTVSS Região variável da cadeia pesada (VH) d17N9 (SEQ ID NO: 68)

QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSTSAAWNWIRQSPSRGLE WLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTA VYYCARDPFGVPFDIWGQGTMVTVSS

[00707] São apresentadas abaixo as sequências da região variável de

322 / 394 cadeia leve (VL) para os clones mães e clones filhas.

[00708] As CDRs de Kabat (24-34 (L1); 50-56 (L2); e 89-97 (L3) estão em negrito; e as CDRs de Chothia (24-34 (L1); 50-56 (L2) e 89-97 (L3) estão sublinhadas. Estas regiões são as mesmas sejam numeradas pelo sistema de Kabat ou Chothia. Região variável de cadeia leve (VL) 17D20m_d3521N11 (SEQ ID NO: 70, codificada pela SEQ ID NO: 69)

QPVLTQPPSLSVSPGQTASITCSGEKLGDKYAYWYQQKPGQSPVLV MYQDKQRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDS

STAVFGGGTKLTVL Região variável de cadeia leve (VL) 17N16m_d17N9 (SEQ ID NO: 71)

SYELIQPPSVSVAPGQTATITCAGDNLGKKRVHWYQQRPGQAPVLVI YDDSDRPSGIPDRFSASNSGNTATLTITRGEAGDEADYYCQVWDIAT DHVVFGGGTKLTVLAAAGSEQKLISE

[00709] Os anticorpos de MASP-2 OMS100 e MoAb_d3521N11VL, (compreendendo uma região variável de cadeia pesada apresentada como SEQ ID NO: 67 e uma região variável de cadeia leve apresentada como SEQ ID NO: 70, também aludidos como “OMS646” e “mAbH6”), que ambos demonstraram ligar à MASP-2 humana com alta afinidade e ter a capacidade para bloquear a atividade funcional de complemento, foram analisados com respeito à ligação de epítopo pela análise de pontos mancha. Os resultados mostraram que os anticorpos OMS646 e OMS100 são altamente específicos para MASP-2 e não se ligam à MASP-1/3. Nenhum anticorpo se ligou ao MAp19 nem aos fragmentos de MASP-2 que não contivessem o domínio CCP1 de MASP-2, levando à conclusão de que os sítios de ligação abrangem CCP1.

[00710] O anticorpo OMS646 de MASP-2 foi determinado se ligar avidamente ao MASP-2 recombinante (Kd 60 a 250 pM) com seletividade >5000 vezes quando comparada à C1s, C1r ou MASP-1 (ver a TABELA 20

323 / 394 abaixo): TABELA 20: Afinidade e Especificidade da interação do anticorpo OMS646 de MASP-2-MASP-2 como avaliadas pelos estudos de ELISA de fase sólida Antígeno KD (pM) MASP-1 >500.000 MASP-2 62 ± 23* MASP-3 >500.000 C1r humana purificada >500.000 C1s humana purificada ~500.000 *Média±SD; n=12 OMS646 especificamente bloqueia a ativação dependente da lectina de componentes de complemento de terminal Métodos:

[00711] O efeito de OMS646 sobre a deposição do complexo de ataque à membrana (MAC) foi analisado usando condições específicas de caminho para o caminho da lectina, o caminho clássico e o caminho alternativo. Para este propósito, o kit de triagem de complemento Wieslab Comp300 (Wieslab, Lund, Suíça) foi usado seguindo as instruções do fabricante. Resultados:

[00712] A FIGURA 53A ilustra graficamente o nível de deposição de MAC na presença ou ausência do anticorpo anti-MASP-2 (OMS646) sob as condições de ensaio específicas do caminho da lectina. A FIGURA 53B ilustra graficamente o nível de deposição de MAC na presença ou ausência de anticorpo anti-MASP-2 (OMS646) sob as condições de ensaio específicas do caminho clássico. A FIGURA 53C ilustra graficamente o nível de deposição de MAC na presença ou ausência de anticorpo anti-MASP-2 (OMS646) sob as condições de ensaio específicas do caminho alternativo.

[00713] Como mostrado na FIGURA 53A, OMS646 bloqueia o caminho da ativação mediada pela lectina da deposição de MAC com um valor IC50 de aproximadamente 1nM. Entretanto, OMS646 não teve nenhum efeito sobre a deposição de MAC gerado a partir da ativação mediada pelo caminho clássico (FIGURA 53B) ou a partir da ativação mediada pelo caminho alternativo (FIGURA 53C).

324 / 394 Farmacocinéticas e Farmacodinâmicas de OMS646 a seguir da Administração intravenosa (IV) ou Subcutânea (SC) aos Camundongos

[00714] As farmacocinéticas (PK) e farmacodinâmicas (PD) de OMS646 foram avaliadas em um estudo de PK/PD de dose única de 28 dias em camundongos. O estudo testou níveis de dose de 5 mg/kg e 15 mg/kg de OMS646 administrados subcutaneamente (SC), assim como um nível de dose de 5 mg/kg de OMS646 administrados intravenosamente (IV).

[00715] Com respeito ao perfil PK de OMS646, a FIGURA 54 ilustra graficamente a concentração de OMS646 (média de n=3 animais/grupo) como uma função do tempo depois da administração de OMS646 na dose indicada. Como mostrado na FIGURA 54, a 5 mg/kg SC, OMS646 atingiu a concentração plasmática máxima de 5 a 6 µg/mL aproximadamente 1 a 2 dias depois da dosagem. A biodisponibilidade de OMS646 a 5 mg/kg SC foi de aproximadamente 60%. Como adicionalmente mostrado na FIGURA 54, a 15 mg/kg SC, OMS646 atingiu uma concentração plasmática máxima de 10 a 12 µg/mL aproximadamente 1 a 2 dias depois da dosagem. Para todos os grupos, o OMS646 foi depurado lentamente da circulação sistêmica com uma meia- vida terminal de aproximadamente 8 a 10 dias. O perfil de OMS646 é típico para anticorpos humanos em camundongos.

[00716] A atividade de PD de OMS646 é graficamente ilustrado nas FIGURAS 55A e 55B. As FIGURAS 55A e 55B mostram a resposta PD (queda na atividade sistêmica do caminho da lectina) para cada camundongo nos grupos de 5 mg/kg IV (FIGURA 55A) e 5 mg/kg SC (FIGURA 55B). A linha tracejada indica a linha de base do ensaio (inibição máxima; soro de camundongo ingênuo reforçado in vitro com OMS646 em excesso antes do ensaio). Como mostrado na FIGURA 55A, a seguir da administração IV de 5 mg/kg de OMS646, a atividade sistêmica do caminho da lectina imediatamente caiu a níveis quase indetectáveis a atividade do caminho da lectina mostrou apenas uma recuperação modesta durante o período de

325 / 394 observação de 28 dias. Como mostrado na FIGURA 55B, nos camundongos dosados com 5 mg/kg de OMS646 SC, a inibição dependente do tempo de atividade do caminho da lectina foi observada. A atividade do caminho da lectina caiu para níveis quase indetectáveis dentro de 24 horas da administração de fármaco e permaneceu em níveis baixos durante pelo menos 7 dias. A atividade do caminho da lectina gradualmente aumentou com o tempo, mas não reverteu para os níveis de pré-dose dentro do período de observação de 28 dias. O perfil da atividade do caminho da lectina versus tempo observado depois da administração de 15 mg/kg SC foi similar à dose de 5 mg/kg SC (dados não mostrados), indicando a saturação do ponto final de PD. Os dados indicaram adicionalmente que doses semanais de 5 mg/kg de OMS646, administradas IV ou SC, são suficientes para alcançar a supressão contínua de atividade sistêmica do caminho da lectina em camundongos. EXEMPLO 41

[00717] Este Exemplo demonstra que um anticorpo inibidor de MASP- 2 (OMS646) inibe deposição de complemento C5b-9 induzida pelo soro aHUS sobre a superfície de células endoteliais microvasculares humanas ativadas (HMEC-1) depois da exposição ao soro de pacientes com síndrome urêmica hemolítica atípica (aHUS) obtido durante a fase aguda e a fase de remissão da doença.

[00718] Fundamento/Análise racional: O seguinte estudo foi realizado para analisar a deposição de complemento C5b-9 induzida pelo soro aHUS sobre a superfície de células HMEC-1 ativadas depois da exposição ao soro de paciente com aHUS obtido (1) durante a fase aguda e (2) durante a fase de remissão da doença na presença ou ausência de OMS646, um anticorpo de MASP-2 que especificamente se liga à MASP-2 e inibe a ativação do caminho da lectina. Métodos:

[00719] Pacientes: Quatro pacientes com aHUS, estudados tanto

326 / 394 durante a fase aguda da doença quanto na remissão, foram selecionados para este estudo entre aqueles incluídos no International Registry of HUS/TTP e genotipado pelo Laboratory of Immunology and Genetics of Transplantation and Rare Diseases of the Mario Negri Institute. Um paciente com aHUS teve uma mutação heterozigótica p.R1210C do fator de complemento H (CFH) e um teve autoanticorpos anti-CFH, enquanto nenhuma mutação ou anticorpos para CFH foram encontrados nos outros dois pacientes aHUS.

[00720] As Tabelas 21 e 22 resumem os resultados da triagem para as mutações de gene de complemento e autoanticorpos anti-CFH nos quatro pacientes com aHUS analisados neste estudo junto com dados clínicos e bioquímicos medidos durante a fase aguda ou na remissão. TABELA 21: Parâmetros clínicos dos quatro pacientes com aHUS neste estudo s-Creatinina Caso Mutação ou Ab anti- Fase da Plaquetas LDH Hemoglobina (0,55-1,25 No. CFH Doença (150-400*103/µl) (266-500 IU/l) (14-18g/dl) mg/dl) nenhuma mutação, aguda 31.000 1396 12,9 2,37 #1 nenhum Ab anti-CFH remissão 267.000 n.a. 11,5 3,76 aguda 46.000 1962 7 5,7 #2 CFH-R1210C remissão 268.000 440 13,4 7,24 aguda 40.000 3362 9,5 1,77 #3 anti-CFH Ab remissão 271.000 338 8,8 0,84 nenhuma mutação, aguda 83.000 1219 7,8 6,8 #4 nenhum Ab anti-CFH remissão 222.000 495 12,2 13 Nota: n.a. = não disponível TABELA 22: Parâmetros de Complemento dos quatro pacientes com aHUS neste estudo Mutação de Ab Soro C3 Plasma SC5b-9 Caso No. Fase da doença anti-CFH (83-180 mg/dl) (127-400 ng/ml) nenhuma mutação, aguda 51 69 #1 nenhum Ab anti-CFH remissão n.a. 117 aguda 79 421 #2 CFH-R1210C remissão 119 233 aguda 58 653 #3 Ab anti-CFH remissão 149 591 nenhuma mutação, aguda 108 n.a. #4 nenhum Ab anti-CFH remissão n.a. n.a.

[00721] Métodos Experimentais: As células de uma linhagem de célula endotelial microvascular humana (HMEC-1) de origem dérmica foram plaqueadas sobre lâminas de vidro e usadas quando confluentes. As células

327 / 394 HMEC-1 confluentes foram ativadas com 10 µM de ADP (difosfato de adenosina) durante 10 minutos e depois incubadas durante quatro horas com o soro dos quatro pacientes com aHUS descritos acima nas Tabelas 23 e 24 coletadas durante a fase aguda da doença ou dos mesmos pacientes com aHUS na remissão ou de 4 sujeitos de controle saudáveis. O soro foi diluído 1:2 com meio de teste (HBSS com 0,5% de BSA) na presença ou na ausência de um anticorpo inibidor de MASP-2, OMS646 (100 µg/mL), gerado como descrito acima no Exemplo 40 ou na presença de receptor de complemento solúvel 1 (sCR1) (150 µg/mL), como um controle positivo de inibição de complemento. No final da etapa de incubação, as células HMEC-1 foram tratadas com complemento anti-ser humano de coelho C5b-9 seguido pelo anticorpo secundário conjugado a FITC. em cada experimento, soro de um controle saudável foi testado em paralelo com soro de paciente com aHUS (fase aguda e remissão). Um microscópio a laser invertido confocal foi usado para a aquisição do tingimento fluorescente sobre a superfície da célula endotelial. Quinze campos por amostra foram adquiridos e a área ocupada pelo tingimento fluorescente foi avaliada pela detecção de borda automática usando funções específicas integradas do software Image J e expressa como pixel2 por campo analisado. Os campos mostrando os valores mais baixos e mais altos foram excluídos do cálculo.

[00722] Para a análise estatística (ANOVA de uma via seguido pelo teste de Tukey para comparações múltiplas) os resultados em pixel2 dos 13 campos considerados em cada condição experimental para cada paciente e controle foram usados. Resultados:

[00723] Os resultados da análise de deposição de complemento com os soros dos quatro pacientes com estão resumidos abaixo na Tabela 23A e os resultados com os soros dos quatro sujeitos saudáveis estão resumidos abaixo na Tabela 23B.

328 / 394 TABELA 23A: Efeito de inibidores de complemento na deposição de C5b-9 induzida pelo soro aHUS sobre células HMEC-1 ativadas com ADP Paciente com Fase aguda da aHUS Fase de remissão da aHUS aHUS não tratados +sCR1 +OMS646 não tratados +sCR1 +OMS646 # Paciente #1 (nenhuma mutação, 5076 ± 562º 551 ± 80* 3312 ± 422** 4507 ± 533º 598 ± 101§ 1650 ± 223§ nenhum Ab anti-CFH) Paciente #2 (CFH- 5103 ± 648º 497 ± 67* 2435 ± 394* 3705 ± 570º 420 ± 65§ 2151 ± 250§§§ R1210C) Paciente #3 3322 ± 421º 353 ± 64* 2582 ± 479 6790 ± 901º 660 ± 83§ 2077 ± 353§ (ab anti-CFH) Paciente #4 (nenhuma mutação, 4267 ± 488º 205 ± 34* 2369 ± 265** 5032 ± 594º 182 ± 29§ 3290 ± 552§§ nenhum Ab anti-CFH) TABELA 23B: Efeito de inibidores de complemento sobre os soros de quatro sujeitos de controle saudáveis (não sofrendo de aHUS) na deposição de C5b-9 sobre células HMEC-1 ativadas com ADP Sujeito de Controle Saudável # Não tratados +sCR1 +OMS646 Sujeito de Controle #1 481 ± 66 375 ± 43 213 ± 57 (ensaiado em paralelo com sujeito com aHUS #1) Sujeito de Controle #2 651 ± 61 240 ± 33 490 ± 69 (ensaiado em paralelo com sujeito com aHUS #2) Sujeito de Controle #3 602 ± 83 234 ± 35 717 ± 109 (ensaiado em paralelo com sujeito com aHUS #3) Sujeito de Controle #4 370 ± 53 144 ± 20 313 ± 36 (ensaiado em paralelo com sujeito com aHUS #4)

[00724] Para as Tabelas 23A e 23B: Os dados são a média ± SE. °P<0,001 vs controle; *P<0,001, **P<0,01 vs aHUS fase aguda não tratada; §P<0,001, §§P<0,01, §§§P<0,05 vs aHUS fase de remissão não tratada.

[00725] A Figura 56 ilustra graficamente o efeito inibidor de anticorpo de MASP-2 (OMS646) e sCR1 sobre a deposição de C5b-9 induzida pelo soro aHUS nas células HMEC-1 ativadas com ADP. Na Figura 56, os dados são média ± SE. °P<0,0001 vs controle; *P<0,0001 vs aHUS fase aguda não tratada; ^P<0,0001 vs aHUS fase aguda + sCR1; §P<0,0001 vs aHUS fase de remissão não tratada e #P<0,0001 vs aHUS fase de remissão + sCR1.

[00726] Como mostrado na Tabela 23A, 23B e Figura 56, as células HMEC-1 estimuladas com ADP expostas ao soro de pacientes com aHUS

329 / 394 (coletado na fase aguda ou na remissão) durante quatro horas em condições estáticas mostraram uma deposição intensa de C5b-9 na superfície da célula como detectado pela microscopia confocal. Medindo-se a área coberta por C5b-9, uma quantidade significantemente mais alta de deposição de C5b-9 foi observada nas células expostas ao soro de pacientes com aHUS do que nas células expostas ao soro de sujeitos de controle saudáveis, independente de se o soro de aHUS fosse coletado na fase aguda ou durante remissão. Nenhuma diferença nos depósitos endoteliais de C5b-9 induzidos pelo soro foi observada entre a fase aguda e a remissão.

[00727] Como adicionalmente mostrado na Tabela 23A, 23B e Figura 56, a adição do anticorpo de MASP-2 OMS646 ao soro de aHUS (obtido de pacientes durante a fase aguda ou na remissão) levou a uma redução significante de deposição de C5b-9 sobre a superfície da célula endotelial quando comparado com soro de aHUS não tratado. Entretanto, o efeito inibidor de OMS646 sobre a deposição de C5b-9 foi menos profunda do que o efeito exercido pelo pan-inibidor de complemento sCR1. De fato, uma diferença estatisticamente significante foi observada entre depósitos de C5b-9 induzido pelo soro de aHUS na presença de OMS646 vs. sCR1 (Figura 56 e Tabelas 23A e 23B).

[00728] Quando calculada como uma média dos quatro pacientes com aHUS, a vs de redução de depósitos de C5b-9 (quando comparado com depósitos de C5b-9 induzidos pelo soro não tratado dos mesmos pacientes coletados como 100%) observados na presença dos inibidores de complemento foram como segue: Fase aguda: sCR1 (150 µg/ml): 91% de redução nos depósitos de C5b-9 OMS646 (100 µg/ml): 40% de redução nos depósitos de C5b-9 Fase de Remissão: sCR1 (150 µg/ml): 91% de redução nos depósitos de C5b-9

330 / 394 OMS646 (100 µg/ml): 54% de redução nos depósitos de C5b-9 Conclusão: Os resultados descritos neste Exemplo demonstram que o caminho da lectina de complemento é estimulado pelas células endoteliais microvasculares ativadas e que essa estimulação é um condutor significante para a ativação exagerada de resposta de complemento característica da aHUS. Também é demonstrado que esta estimulação do caminho da lectina e ativação exagerada resultante de resposta de complemento ocorre tanto durante a fase aguda e em remissão clínica de aHUS. Além disso, esta verificação não parece estar limitada a nenhum defeito de complemento particular associado com aHUS. Como adicionalmente demonstrado neste Exemplo, a inibição seletiva do caminho da lectina com um anticorpo inibidor de MASP-2 tal como OMS646 reduz a deposição de complemento em pacientes com aHUS com etiologias diversas. EXEMPLO 42

[00729] Este Exemplo demonstra que um anticorpo inibidor de MASP- 2 (OMS646) inibe a agregação de plaqueta e formação de trombo induzidas com soro de aHUS sobre a superfície de células endoteliais microvasculares humanas ativadas (HMEC-1) depois da exposição ao soro de paciente com aHUS obtido durante (1) a fase aguda e (2) a fase de remissão de aHUS. Métodos:

[00730] Pacientes: Três pacientes (pacientes #1, #2 e #4 como descritos nas Tabelas 21, 22, 23A e 23B no Exemplo 41) com aHUS (um paciente teve uma mutação CFH p.R1210C heterozigótica, enquanto que nenhuma mutação ou anticorpos anti-CFH foi encontrada nos outros dois pacientes) foram estudados tanto durante a fase aguda da doença quanto na remissão. Os pacientes foram selecionados para este estudo entre aqueles incluídos no Registro Internacional de HUS/TTP e genotipados pelo Laboratory of Immunology and Genetics of Transplantation and Rare Diseases of the Mario Negri Institute. Cinco sujeitos saudáveis também foram

331 / 394 selecionados como doadores de sangue para experimentos de perfusão.

[00731] Métodos: Células HMEC-1 confluentes foram ativadas com 10 µM de ADP durante 10 minutos e depois foram incubadas durante três horas com soros de três pacientes com aHUS (pacientes #1, 2 e 4 descritos no Exemplo 41) coletados durante a fase aguda da doença ou dos mesmos pacientes na remissão ou com soros de controle de sujeitos saudáveis. O soro foi diluído 1:2 com meio de teste (HBSS com 0,5% de BSA), na presença ou na ausência de um anticorpo inibidor de MASP-2, OMS646 (100 µg/mL), gerado como descrito no Exemplo 40; ou com sCR1 (150 µg/mL), como um controle positivo de inibição de complemento. Para os pacientes #1 e #2 poços adicionais foram incubados com soros (da fase aguda e remissão) diluídos 1:2 com meio de teste contendo 100 µg/mL de anticorpo de controle de isótipo irrelevante ou com 20 µg/mL de OMS646 (para o último, o case #1 foi testado apenas na remissão e o caso #2 tanto durante a fase aguda quanto na remissão).

[00732] No final da etapa de incubação, as células HMEC-1 foram perfundidas em uma câmara de fluxo com sangue integral heparinizado (10 UI/mL) obtido de sujeitos saudáveis (contendo o corante fluorescente mepacrina que rotula plaquetas) no estresse ao cisalhamento encontrado na microcirculação (60 dina/cm2, três minutos). Depois de três minutos de perfusão, as monocamadas de célula endotelial foram fixadas em acetona. Quinze imagens por amostra de trombos de plaqueta sobre a superfície de célula endotelial foram adquiridas pelo microscópio a laser invertido confocal e as áreas ocupadas pelos trombos foram avaliadas usando o software Image J. Os campos mostrando os valores mais baixos e o mais alto foram excluídos do cálculo.

[00733] Para a análise estatística (ANOVA de uma via seguido pelo teste de Tukey para comparações múltiplas), resultados em pixel2 dos 13 campos considerados em cada condição experimental para cada paciente e

332 / 394 controle foram usados. Resultados:

[00734] Os resultados dos experimentos de formação de trombo com o poço dos três pacientes com aHUS estão resumidos abaixo na Tabela 24A e os resultados com o poço dos cinco sujeitos saudáveis estão resumidos abaixo na Tabela 24B. TABELA 24A: Efeito de inibidores de complemento sobre a formação de trombo induzida pelo soro de aHUS (pixel2±SE) nas células HMEC-1 Ativadas com ADP Condições Fase da Caso de aHUS #1 Caso de aHUS #2 Caso de aHUS #4 experimentais doença formação de trombo formação de trombo formação de trombo (pixel2±SE) (pixel2±SE) (pixel2±SE) (nenhuma mutação, (CFH-R1210C) (nenhuma mutação, nenhum Ab anti-CFH) nenhum Ab anti-CFH) não tratados aguda 5499 ± 600 22320 ± 1273º 10291 ± 1362º remissão 6468 ± 1012º 3387 ± 443º 17676 ± 1106º +sCR1 aguda 4311 ± 676 5539 ± 578* 5336 ± 1214*** (150 µg/mL) remissão 573 ± 316§ 977 ± 102§ 2544 ± 498§ +OMS646 aguda não determinado 6974 ± 556* não determinado (20 µg/mL) remissão 832 ± 150§ 1224 ± 252§ não determinado +OMS646 aguda 3705 ± 777 9913 ± 984* 2836 ±509* (100 µg/mL) remissão 3321 ± 945§§§ 733 ± 102§ 1700 ± 321§ + anticorpo irrelevante aguda 5995 ± 725 18655 ± 1699 não determinado de controle de isótipo remissão 10885 ± 1380 2711 ± 371 não determinado (100 µg/mL) TABELA 24B: Efeito de inibidores de complemento sobre o poço de cinco sujeitos de controle saudáveis (não sofrendo de aHUS) no ensaio de formação de trombo (pixel2±SE) nas células HMEC-1 ativadas com ADP Controle #1 Controle #2 Controle #3 Controle #4 Controle #5 Condições formação de formação de formação de formação de formação de experimentais trombo trombo trombo trombo trombo (pixel2±SE) (pixel2±SE) (pixel2±SE) (pixel2±SE) (pixel2±SE) não tratados 2880±510 1046 ± 172 1144 ± 193 735 ± 124 2811 ± 609 +sCR1 5192 ± 637 1527 ± 153 1198 ± 138 2239 ± 243 2384 ± 410 (150 µg/mL) +OMS646 7637 ± 888 1036 ± 175 731 ± 203 2000 ± 356 7177 ± 1477 (100 µg/mL) +anticorpo irrelevante de 6325 ± 697 1024 ± 235 399 ± 82 45269 não determinado controle de isótipo (100 µg/mL Ensaiada em #5 (soro na fase paralelo com o soro #1 (soro na fase #1 (soro na fase #2 (soro na fase #2 (soro na fase aguda e de de sujeito com aguda) de remissão) aguda) de remissão) remissão) aHUS

[00735] Para as Tabelas 24A e 24B: Os dados são média ± SE.

333 / 394 °P<0,001 vs controle; *P<0,001, ***P<0,05 vs fase aguda da aHUS não tratada; §P<0,001, §§§P<0,05 vs fase de remissão da aHUS não tratada.

[00736] A Figura 57 ilustra graficamente o efeito de anticorpo de MASP-2 (OMS646) e sCR1 sobre a formação de trombo induzida pelo soro de aHUS nas células HMEC-1 ativadas com ADP. Na Figura 57, os dados mostrados são média ± SE. °P<0,0001, °°P<0,01 vs controle; *P<0,0001, **P<0,01 vs fase aguda da aHUS não tratada; §P<0,0001 vs fase de remissão da aHUS não tratada.

[00737] Como mostrado na Tabela 24A e Figura 57, um aumento acentuado na área coberta pelos trombos foi observada nas células HMEC-1 tratadas com soro de aHUS, coletada durante fase aguda ou na remissão, em comparação com as células expostas ao soro de sujeitos de controle saudáveis (Tabela 24B e Figura 57). Como mostrado na Figura 57 e Tabela 24A, OMS646 (tanto a 100 µg/ml quanto a 20 µg/ml) mostrou uma inibição parcial de formação de trombo nas células pré-expostas ao soro de aHUS coletadas durante a fase aguda. O efeito antitrombogênico foi comparável entre as duas doses diferentes de OMS646 e não foi diferente do efeito de sCR1 (Figura 57 e Tabela 24A). A adição do anticorpo irrelevante de controle de isótipo não teve nenhum efeito inibidor sobre a formação de trombo induzida pelo soro de aHUS.

[00738] Como adicionalmente mostrado na Figura 57 e Tabela 24A, o efeito inibidor de OMS646 foi ainda mais evidente sobre o soro de aHUS coletado durante a fase de remissão. De fato, a adição de OMS646, nas doses tanto a 100 µg/ml quanto a 20 µg/ml, ao soro de paciente com aHUS coletado na remissão resultou em uma inibição quase completa da formação de trombo, similar àquela observada com a adição de sCR1. O anticorpo irrelevante de controle de isótipo não mostrou nenhum efeito inibidor significante.

[00739] Quando calculada como uma média dos três pacientes com aHUS, as vs de redução da superfície de HMEC-1 coberta pelos depósitos de

334 / 394 trombos (quando comparada com a área de trombo induzida pelos poços não tratados dos mesmos pacientes coletados como 100%) registrados com os inibidores de complemento foram como segue: Fase aguda: sCR1 (150 µg/ml): 60% de redução OMS646 (100 µg/ml): 57% de redução OMS646 (20 µg/ml): 45% de redução Fase de Remissão: sCR1 (150 µg/ml): 85% de redução OMS646 (100 µg/ml): 79% de redução OMS646 (20 µg/ml): 89% de redução Debate dos Resultados:

[00740] Os resultados neste Exemplo demonstram que um anticorpo inibidor de MASP-2, tal como OMS646 (gerado como descrito no Exemplo 40), tem um forte efeito inibidor sobre a formação de trombo induzida pelo soro de aHUS nas células HMEC-1. Surpreendentemente, o efeito inibidor de OMS646 sobre a formação de trombo foi maior do que o seu efeito sobre os depósitos de C5b-9 induzidos sobre HMEC-1 (como descrito no Exemplo 41). Também é surpreendente que a adição de OMS646, tanto na dose de 100 µg/ml quanto na de 20 µg/ml, ao soro de paciente com aHUS coletado na remissão resultou em uma inibição quase completa da formação de trombo. Uma outra verificação surpreendente é a observação de que OMS646, tanto na fase aguda quanto na remissão, foi tão eficaz quanto o controle positivo sCR1, que é um inibidor amplo e quase completo do sistema de complemento (Weisman H. et al., Science 249: 146-151, 1990; Lazar H. et al., Circulation 100: 1438-1442, 1999).

[00741] É observado que o soro de controle de sujeitos saudáveis também induziu uma formação de trombo modesta nas células HMEC-1. Nós não observamos um efeito inibidor compatível sobre a formação de trombo

335 / 394 induzida pelo soro de controle com OMS646 ou com sCR1. Embora não desejando estar ligado por qualquer teoria particular, acredita-se que os trombos induzidos por controle não dependem do complemento, como sustentado pelos depósitos de C5b-9 muito baixos observados nas HMEC-1 incubadas com soro de controle (ver o Exemplo 41). Conclusão:

[00742] Em conclusão, o efeito antitrombótico observado de um anticorpo inibidor de MASP-2, tal como OMS646, parece substancialmente maior do que ter-se-ia esperado com base no efeito inibidor de OMS646 sobre a deposição de C5b-9 observada neste sistema experimental (como descrito no Exemplo 41 e mostrado na Figura 56). Por exemplo, como descrito em Gastoldi et al., Immunobiology 217: 1129-1222 Abstract 48 (2012) intitulado “C5a/C5aR interaction mediates complement activation and thrombosis on endothelial cells in atypical hemolytic uremic syndrome (aHUS),” foi determinado que a adição de um anticorpo C5 inibindo depósitos de C5b-9 (60% de redução) limitou a formação de trombo sobre HMEC-1 a um grau comparável (60% de redução). Ao contrário, o anticorpo inibidor de MASP-2 (OMS646 a 100 µg/mL) inibiu depósitos de C5b-9 com valores médios de (fase aguda = 40% de redução; fase de remissão = 54% de redução); e inibiu a formação de trombo em uma porcentagem substancialmente mais lata (fase aguda = 57% de redução; fase de remissão = 79% de redução). Em comparação, OMS646 inibiu a deposição de complemento em um porcentagem mais baixa do que a do inibidor de complemento de controle positivo (sCR1 a 150 µg/mL, inibição da deposição de C5b-9 na fase aguda = 91% de redução; fase de remissão = 91% de redução) embora fosse igualmente eficaz como o controle positivo de sCR1 na inibição da formação de trombo (sCR1 a 150 µg/mL, fase aguda = 60% de redução; fase de remissão = 85% de redução). Estes resultados demonstram que um anticorpo inibidor de MASP-2 (por exemplo, OMS646) é surpreendentemente eficaz na

336 / 394 inibição da formação de trombo em soro obtido de sujeitos com aHUS tanto na fase aguda quanto na fase de remissão.

[00743] De acordo com o precedente, em uma modalidade, a invenção provê um método de inibir a formação de trombo em um sujeito sofrendo de ou em risco de desenvolver, uma microangiopatia trombótica (TMA) compreendendo administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um anticorpo inibidor de MASP-2 eficaz para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2. Em uma modalidade, a TMA é selecionada do grupo consistindo de síndrome urêmica hemolítica (HUS), púrpura trombocitopênica trombótica (TTP) e síndrome urêmica hemolítica atípica (aHUS). Em uma modalidade, a TMA é aHUS. Em uma modalidade, a composição é administrada a um paciente com aHUS durante a fase aguda da doença. Em uma modalidade, a composição é administrada a um paciente com aHUS durante a fase de remissão (isto é, em um sujeito que foi recuperado ou parcialmente recuperado de um episódio de fase aguda de aHUS, tal remissão evidenciada, por exemplo, pela contagem de plaqueta aumentada e/ou concentrações de LDH séricas reduzidas, por exemplo como descrito em Loirat C et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 6: 60, 2011, por meio deste aqui incorporada por referência).

[00744] Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 exibe pelo menos uma ou mais das seguintes características: o dito anticorpo liga a MASP-2 humana com um KD de 10 nM ou menos, o dito anticorpo liga um epítopo no domínio CCP1 de MASP-2, o dito anticorpo inibe a deposição de C3b em um ensaio in vitro de soro humano a 1% em uma IC50 de 10 nM ou menos, o dito anticorpo inibe a deposição de C3b em soro humano a 90% com uma IC50 de 30 nM ou menos, em que o anticorpo é um fragmento de anticorpo selecionado do grupo consistindo de Fv, Fab, Fab’, F(ab)2 e F(ab’)2, em que o anticorpo é uma molécula de cadeia única, em que o dito anticorpo é uma molécula de IgG2, em que o dito anticorpo é uma molécula

337 / 394 de IgG1, em que o dito anticorpo é uma molécula de IgG4, em que a molécula de IgG4 compreende uma mutação S228P e/ou em que o anticorpo não inibe substancialmente o caminho clássico. Em uma modalidade, o anticorpo se liga à MASP-2 e seletivamente inibe o caminho da lectina e não inibe substancialmente o caminho alternativo. Em uma modalidade, o anticorpo se liga à MASP-2 e seletivamente inibe o caminho da lectina e não inibe substancialmente o caminho clássico ou o caminho alternativo (isto é, inibe o caminho da lectina enquanto deixa os caminhos de complemento clássico e alternativo intactos).

[00745] Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 inibe a formação de trombo no soro de um sujeito sofrendo de uma TMA tal como aHUS (de fase aguda ou de remissão), em pelo menos 30%, tal como pelo menos 40%, tal como pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 80% tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% até 99%, quando comparado com o soro não tratado. Em algumas modalidades, o anticorpo inibidor de MASP-2 inibe a formação de trombo no soro de um sujeito sofrendo de aHUS em um nível de pelo menos 20 por cento ou maior, (tal como pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%) maior do que o efeito inibidor sobre a deposição de C5b-9 no soro.

[00746] Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 inibe a formação de trombo no soro de um paciente com aHUS na fase de remissão em pelo menos 30%, tal como pelo menos 40%, tal como pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 80% tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% até 99%, quando comparado com o soro não tratado. Em algumas modalidades, o anticorpo inibidor de MASP-2 inibe a formação de trombo no soro em um paciente com aHUS na fase de remissão em um nível de pelo menos 20 por cento ou maior, (tal como pelo menos 30%, pelo menos 40%,

338 / 394 pelo menos 50%) maior do que o efeito inibidor sobre a deposição de C5b-9 no soro.

[00747] Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 é administrado ao sujeito por intermédio de um cateter intravenoso ou outro método de distribuição por cateter.

[00748] Em uma modalidade, a invenção provê um método de inibir a formação de trombo em um sujeito sofrendo de uma TMA compreendendo administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo (I) (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo: i) uma CDR-H1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de 31 a 35 da SEQ ID NO: 67; e ii) uma CDR-H2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de 50 a 65 da SEQ ID NO: 67; e iii) uma CDR-H3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de 95 a 102 da SEQ ID NO: 67 e b) uma região variável de cadeia leve compreendendo: i) uma CDR-L1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de 24 a 34 da SEQ ID NO: 70; e ii) uma CDR-L2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de 50 a 56 da SEQ ID NO: 70; e iii) uma CDR-L3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de 89 a 97 da SEQ ID NO: 70 ou (II) uma variante do mesmo compreendendo uma região variável de cadeia pesada com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 67 (por exemplo, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 67) e uma região variável de cadeia leve com pelo menos 90% de identidade (por exemplo, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 70.

339 / 394

[00749] Em uma modalidade, a TMA é selecionada do grupo consistindo de síndrome urêmica hemolítica atípica (aHUS) (de fase aguda ou de remissão), HUS e TTP. Em uma modalidade, o sujeito está na fase aguda de aHUS. Em uma modalidade, o sujeito está na fase de remissão de aHUS.

[00750] Em algumas modalidades, o método compreende administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 67. Em algumas modalidades, o método compreende administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 70.

[00751] Em algumas modalidades, o método compreende administrar ao sujeito uma composição compreendendo um anticorpo inibidor de MASP- 2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, que especificamente reconhece pelo menos parte de um epítopo na MASP-2 humana reconhecido pelo anticorpo de referência OMS646 compreendendo uma região variável de cadeia pesada como apresentada na SEQ ID NO: 67 e uma região variável de cadeia leve como apresentada na SEQ ID NO: 70. A competição entre os membros de ligação pode ser ensaiada facilmente in vitro, por exemplo usando ELISA e/ou pela etiquetagem de uma molécula repórter específica a um membro de ligação que pode ser detectado na presença de outro(s) membro(s) de ligação não rotulado(s), para permitir a identificação de membros de ligação específicos que se ligam ao mesmo epítopo ou um epítopo de sobreposição. Assim, é presentemente provido um anticorpo específico ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo um sítio de ligação a antígeno de anticorpo humano, que compete com o

340 / 394 anticorpo de referência OMS646 quanto à ligação à MASP-2 humana. EXEMPLO 43

[00752] Este Exemplo demonstra que um anticorpo inibidor de MASP- 2 humana (OMS646) é capaz de inibir a indução mediada pelo plasma de paciente com TMA de apoptose nas células endoteliais microvasculares humanas (MVECs) primárias de origem dérmica. Fundamento/Análise racional:

[00753] A fisiopatologia de TMA é conhecida envolver uma lesão de célula endotelial induzida por vários fatores que são seguidos pela oclusão de vasos pequenos (por exemplo, arteríolas pequenas e capilares) pelos tampões de plaquetas e/ou trombos de fibrina (Hirt-Minkowsk P. et al., Nephron Clin Pract 114: c219-c235, 2010; Goldberg R.J. et al., Am J Kidney Dis 56(6): 1168-1174, 2010). Foi mostrado que MVECs sofreram lesão apoptótica quando expostas in vitro ao plasma de pacientes com distúrbios relacionados com TMA (ver Stefanescu et al., Blood Vol 112 (2): 340-349, 2008; Mitra D. et al., Blood 89: 1224-1234, 1997). A lesão apoptótica associada com TMAs foi documentada em MVEC obtida de biópsias de tecido (pele, osso, medula, baço, rim, íleo) de tais pacientes. Também foi mostrado que os insultos apoptóticos para MVECs reduzem os níveis de proteínas reguladoras de complemento ligadas à membrana em MVECs (ver por exemplo, Mold & Morris, Immunology 102: 359-364, 2001; Christmas et al., Immunology 119: 522, 2006).

[00754] Acredita-se que uma alça de retroalimentação positiva envolvendo componentes de complemento de terminal esteja envolvida na fisiopatologia de TMAs incluindo a síndrome hemolítica-urêmica atípica (aHUS) e TMAs associadas com a Síndrome Antifosfolipídica Catastrófica (CAPS), doença de Degos e TMAs secundárias ao câncer, quimioterapia contra o câncer, autoimunidade e transplante, cada uma dessas condições são conhecidas ou julgadas ser responsivas à terapia anti-C5 com o mAb

341 / 394 eculizumab (Chapin J. et al., Brit. J. Hematol 157: 772-774, 2012; Tsai et al., Br J Haematol 162(4): 558-559, 2013); Magro C. M. et al., Journal of Rare Diseases 8: 185, 2013).

[00755] O seguinte experimento foi realizado para analisar a capacidade do anticorpo inibidor de MASP-2 humana (OMS646) para bloquear a indução mediada por plasma de paciente com TMA de apoptose em MVECs dérmicas primárias humanas em amostras de plasma obtidas de pacientes sofrendo de aHUS, púrpura trombocitopênica trombótica (TTP) relacionada com a deficiência de ADAMTS13, CAPS e doença de Degos sistêmica, assim como TMAs secundárias ao câncer, transplante, doença autoimune e quimioterapia. Métodos:

[00756] Um ensaio in vitro foi realizado para analisar a eficácia de um anticorpo inibidor de MASP-2 (OMS646) para bloquear a indução mediada pelo soro de paciente com TMA de apoptose em MVECs humanas primárias de origem dérmica como descrito em Stefanescu R. et al., Blood Vol 112 (2): 340-349, 2008, que é por meio deste aqui incorporada por referência. As amostras de plasma usadas neste ensaio foram obtidas de uma coleção de sujeitos de controle saudáveis e de indivíduos com microangiopatias trombóticas de fase aguda ou convalescentes. A presença de microangiopatia nos pacientes com TMA foi avaliada pela detecção de esquizócitos em um esfregaço sanguíneo periférico. Além disso, a TTP foi diagnosticada como descrito em Stefanescu R. et al., Blood Vol 112 (2): 340-349, 2008. Cultura de Célula endotelial (EC)

[00757] Como descrito em Stefanescu et al., as MVECs humanas primárias de origem dérmica foram adquiridas do ScienCell Research Labs (San Diego, CA). As MVECs expressaram CD34 através das passagens 5 e 6 (Blood 89: 1224-1234, 1997). As MVECs foram mantidas em frascos de poliestireno revestidos com 0,1% de gelatina em água em meio ECM1001

342 / 394 (ScienCell Research Labs) contendo suplemento de crescimento de célula endotelial, penicilina, estreptomicina e 15% de soro fetal bovino. Todas as MVECs foram usadas nas passagens 2 a 6. As subculturas envolveram uma exposição de 5 a 10 minutos a 0,25% de tripsina-EDTA. Ensaio de Apoptose

[00758] MVECs humanas primárias representativas de origem dérmica conhecidas serem susceptíveis à apoptose induzida por plasma TTP/HUS foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e plaqueadas em câmaras de placas de 12 poços, revestidas com 0,1% de gelatina em água a 0,15x106 células viáveis/mL. As células MVEC plaqueadas foram privadas em meio completo durante 24 horas depois expostas às concentrações variáveis (2% a 20% v/v) de amostras de plasma de paciente com TMA ou plasma de doador saudável durante 18 horas na presença ou ausência de mAb de MASP-2 OMS646 (150 µg/mL) e as células foram depois colhidas pela tripsinização. Cada amostra de paciente com TMA foi analisada em duplicata. O grau de apoptose mediada por plasma foi avaliado usando tingimento com iodeto de propídio (PI), com >5 x103 células analisadas em um citofluorógrafo e picos A0 definidos pelo software de computador (MCycle Av, Phoenix Flow Systems, San Diego, CA). A quantificação com base no ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA) de fragmentos de DNA associados com a histona citoplásmica de lisado de célula também foi realizada como pelas instruções do fabricante (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha). Resultados:

[00759] Os resultados do ensaio de apoptose de MVEC induzida pelo plasma de paciente com TMA na presença de mAb MASP-2 (OMS646) são mostrados abaixo na Tabela 25. Tabela 25: Plasma de paciente com TMA testado nas MVEC humanas primárias de origem dérmica na presença de mAb de MASP-2 (OMS646)

343 / 394 Diagnóstico Diagnóstico Diagnóstico Clínico Atividade Idade/ MASP-2 com base com base na Proteção com Sujeito # (TMA) e C5a sC5-b9 de Sexo ng/ml em atividade de OMS646 outras ADAMS Cre/LDH ADAMS condições #2 41/f TTP 174 TTP 34,42 772 30% aHUS respondedor não #3 52/f TTP 150 TTP 48,32 1399 70% aHUS respondedor #4 20/m TTP 224 TTP 36,9 1187 <10% TTP respondedor não #10 60/f TTP 175,4 TTP 49,5 4406 64% aHUS respondedor não #11 59/f TTP 144,9 TTP 40,3 1352 <10% TTP respondedor HUS, não #13 49/f Câncer, 142,8 TTP 48,6 3843 86% aHUS respondedor

TTP não #42 27/m TTP 341,5 TTP 100,0 5332 <5% TTP respondedor TTP, #46 25/f Degos, 225,11 TTP 53,9 3426 ND ND respondedor

SLE TTP, SLE, nefrite #48 53/f s/p 788,5 aHUS 31,2 1066 66% aHUS respondedor transplante renal TTP, #49 64/f APLAs, 494,5 35,4 2100 ND ND respondedor

CVA aHUS, #51 25/f 313,1 TTP 26,8 1595 23% aHUS respondedor APLAs aHUS, não #52 56/f 333,1 TTP 18,9 1103 97% aHUS SLE respondedor Remissão Remissão não #53 56/f 189,9 28,69 344 74% aHUS de aHUS de TTP respondedor Abreviações usadas na Tabela 25: “APLAs” = anticorpos antifosfolipídicos, associados com a Síndrome Antifosfolipídica Catastrófica (CAPS). “SLE” = lúpus eritematoso sistêmico “CVA” = acidente cerebrovascular (acidente vascular cerebral)

[00760] Compatíveis com os resultados relatados em Stefanescu R. et al., Blood Vol 112 (2): 340-349, 2008, apoptose significante foi observada para MVECs primárias de origem dérmica na presença de amostras de plasma dos treze pacientes com TMA na ausência de anticorpo de MASP-2. As amostras de plasma de controle de sujeitos humanos saudáveis foram conduzidas em paralelo e não induziram a apoptose nas MVECs (dados não mostrados). Como mostrado na Tabela 25, o mAb inibidor de MASP-2 (OMS646) inibiu a indução mediada pelo soro de paciente com TMA de apoptose nas MVECs primarias (“respondedores” na Tabela 25) em 6 das 13 amostras de plasma de paciente testadas (46%). Em particular, é observado

344 / 394 que o mAb inibidor de MASP-2 (OMS646) inibiu a apoptose no plasma obtido de pacientes sofrendo de aHUS, TTP, doença de Degos, SLE, transplante e APLAs (CAPS). Com respeito às sete amostras de paciente testadas neste ensaio nas quais o mAb de MASP-2 não bloqueou a apoptose (“não respondedores” na Tabela 25), é observado que a apoptose pode ser induzida pelos diversos caminhos, nem todos dos quais são dependentes de complemento. Por exemplo, como observado em Stefanescu R. et al., Blood Vol 112 (2): 340-349, 2008, a apoptose em um ensaio de EC é dependente do estado de ativação da EC basal que é influenciada pelos fatores plasmáticos que podem desempenhar um papel na determinação do nível de insulto requerido para induzir a apoptose. Como adicionalmente observado em Stefanescu R. et al., fatores adicionais capazes de modular a apoptose podem estar presentes no plasma de paciente com TMA, tais como citocinas e vários componentes do sistema de complemento. Portanto, devido a estes fatores complicantes, não é surpreendente que o anticorpo de MASP-2 não mostrasse um efeito bloqueador em todas as amostras de plasma que exibiram Apoptose induzida por plasma com TMA.

[00761] Adicionalmente a este respeito, é observado que uma análise similar foi realizada usando o ensaio de apoptose induzida por plasma com TMA com o anticorpo anti-C5 eculizumab e resultados muito similares foram observados (ver Chapin et al., Blood (ASH Annual Meeting Abstracts): Abstract #3342, 120: 2012). A eficácia clínica de eculizumab, um produto comercial altamente bem sucedido, parece maior do que a eficácia demonstrada neste modelo, sugerindo que este modelo in vitro pode subestimar o potencial clínico de fármacos inibidores de complemento.

[00762] Estes resultados demonstram que um anticorpo inibidor de MASP-2 tal como OMS646 é eficaz na inibição de apoptose induzida pelo plasma com TMA em plasma obtido de pacientes sofrendo de uma TMA tal como aHUS, TTP, doença de Degos, SLE, transplante e APLAs (CAPS). É

345 / 394 conhecido que o dano endotelial e a apoptose desempenham um papel chave na patologia de TMAs tais como TTP idiopática e HUS esporádica (Kim et al., Microvascular Research vol 62(2): 83-93, 2001). Como descrito em Dang et al., a apoptose foi demonstrada na polpa vermelha esplênica de pacientes com TTP mas não nos sujeitos de controle saudáveis (Dang et al., Blood 93(4): 1264-1270, 1999). Evidência de apoptose também foi observada nas células glomerulares renais de origem MVEC em um paciente com HUS (Arends M. J. et al., Hum Pathol 20: 89, 1989). Portanto, é esperado que a administração de um agente inibidor de MASP-2, tal como um anticorpo inibidor de MASP-2 (por exemplo, OMS646) será uma terapia eficaz em pacientes sofrendo de uma TMA tal como aHUS, TTP ou outros distúrbios microangiopáticos tais como outras TMAs incluindo CAPS, doença de Degos sistêmica e uma TMA secundária ao câncer; uma TMA secundária à quimioterapia ou uma TMA secundária a transplante.

[00763] De acordo com o precedente, em uma modalidade, a invenção provê um método de inibir dano à célula endotelial e/ou apoptose de célula endotelial e/ou formação de trombo em um sujeito sofrendo de ou em risco de desenvolver, uma microangiopatia trombótica (TMA) compreendendo administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um anticorpo inibidor de MASP-2 eficaz para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2. Em uma modalidade, a TMA é selecionada do grupo consistindo de síndrome urêmica hemolítica atípica (aHUS), púrpura trombocitopênica trombótica (TTP) e síndrome urêmica hemolítica (HUS). Em uma modalidade, a TMA é aHUS. Em uma modalidade, a composição é administrada a um paciente com aHUS durante a fase aguda da doença. Em uma modalidade, a composição é administrada a um paciente com aHUS durante a fase de remissão (isto é, em um sujeito que se recuperou ou parcialmente se recuperou de um episódio de aHUS de fase aguda, tal remissão evidenciada, por exemplo, pela contagem de plaqueta

346 / 394 aumentada e/ou concentrações séricas de LDH reduzidas, por exemplo como descrito em Loirat C et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 6: 60, 2011, por meio deste aqui incorporada por referência).

[00764] Em uma modalidade, o sujeito está sofrendo de ou em risco de desenvolver uma TMA que é (i) uma TMA secundária ao câncer; (ii) uma TMA secundária à quimioterapia; ou (iii) uma TMA secundária ao transplante (por exemplo, transplante de órgão, tal como transplante de rim ou transplante alogênico de célula-tronco hematopoiética). Em uma modalidade, o sujeito está sofrendo de ou em risco de desenvolver Síndrome de Upshaw-Schulman (USS). Em uma modalidade, o sujeito está sofrendo de ou em risco de desenvolver doença de Degos. Em uma modalidade, o sujeito está sofrendo de ou em risco de desenvolver Síndrome Antifosfolipídica Catastrófica (CAPS).

[00765] De acordo com qualquer uma das modalidades aqui divulgadas, o anticorpo inibidor de MASP-2 exibe pelo menos uma ou mais das seguintes características: o dito anticorpo se liga a MASP-2 humana com um KD de 10 nM ou menos, o dito anticorpo liga um epítopo no domínio CCP1 de MASP-2, o dito anticorpo inibe a deposição de C3b em um ensaio in vitro com soro humano a 1% em uma IC50 de 10 nM ou menos, o dito anticorpo inibe a deposição de C3b em soro humano a 90% com uma IC50 de 30 nM ou menos, em que o anticorpo é um fragmento de anticorpo selecionado do grupo consistindo de Fv, Fab, Fab’, F(ab)2 e F(ab’)2, em que o anticorpo é uma molécula de cadeia única, em que o dito anticorpo é uma molécula de IgG2, em que o dito anticorpo é uma molécula de IgG1, em que o dito anticorpo é uma molécula de IgG4, em que a molécula de IgG4 compreende uma mutação S228P e/ou em que o anticorpo não inibe substancialmente o caminho clássico. Em uma modalidade, o anticorpo se liga à MASP-2 e seletivamente inibe o caminho da lectina e não inibe substancialmente o caminho alternativo. Em uma modalidade, o anticorpo se liga à MASP-2 e seletivamente inibe o caminho da lectina e não inibe

347 / 394 substancialmente o caminho clássico (isto é, inibe o caminho da lectina enquanto deixa o caminho clássico de complemento intacto).

[00766] Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 a inibe a apoptose de MVEC induzida por plasma no soro de um sujeito sofrendo de uma TMA tal como aHUS (fase aguda ou de remissão), síndrome urêmica hemolítica (HUS), púrpura trombocitopênica trombótica (TTP), uma TMA secundária a câncer; uma TMA secundária à quimioterapia; uma TMA secundária a transplante (por exemplo, transplante de órgão, tal como transplante renal ou transplante alogênico de célula-tronco hematopoiética) ou no soro de um sujeito sofrendo de Síndrome de Upshaw-Schulman (USS) ou no soro de um sujeito sofrendo da doença de Degos ou em um sujeito sofrendo de Síndrome Antifosfolipídica Catastrófica (CAPS), em que a apoptose de MVEC induzida por plasma é inibida em pelo menos 5%, tal como pelo menos 10%, tal como pelo menos 20%, tal como pelo menos 30%, tal como pelo menos 40%, tal como pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 80% tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% até 99%, quando comparada com o soro não tratado. Em algumas modalidades, o anticorpo inibidor de MASP-2 inibe a formação de trombo no soro de um sujeito sofrendo de uma TMA (por exemplo, tal como aHUS (fase aguda ou de remissão), síndrome urêmica hemolítica (HUS), púrpura trombocitopênica trombótica (TTP), uma TMA secundária a câncer; uma TMA secundária à quimioterapia; uma TMA secundária a transplante (por exemplo, transplante de órgão, tal como transplante renal ou transplante alogênico de célula-tronco hematopoiética) ou no soro de um sujeito sofrendo de Síndrome de Upshaw- Schulman (USS) ou no soro de um sujeito sofrendo da doença de Degos ou em um sujeito sofrendo de Síndrome Antifosfolipídica Catastrófica (CAPS)), em um nível de pelo menos 20 por cento ou maior, (tal como pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%) maior do que o efeito inibidor sobre

348 / 394 a deposição de C5b-9 no soro.

[00767] Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 é administrado ao sujeito por intermédio de um cateter intravenoso ou outro método de distribuição por cateter.

[00768] Em uma modalidade, a invenção provê um método de inibir a formação de trombo em um sujeito sofrendo de uma TMA (tal como aHUS (fase aguda ou de remissão), síndrome urêmica hemolítica (HUS), púrpura trombocitopênica trombótica (TTP), uma TMA secundária a câncer; uma TMA secundária à quimioterapia; uma TMA secundária a transplante (por exemplo, transplante de órgão, tal como transplante renal ou transplante alogênico de célula-tronco hematopoiética) ou no soro de um sujeito sofrendo de Síndrome de Upshaw-Schulman (USS) ou no soro de um sujeito sofrendo da doença de Degos ou em um sujeito sofrendo de Síndrome Antifosfolipídica Catastrófica (CAPS)), compreendendo administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo (I) (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo: i) uma CDR-H1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de 31 a 35 da SEQ ID NO: 67; e ii) uma CDR-H2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de 50 a 65 da SEQ ID NO: 67; e iii) uma CDR-H3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de 95 a 102 da SEQ ID NO: 67 e b) uma região variável de cadeia leve compreendendo: i) uma CDR- L1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de 24 a 34 da SEQ ID NO: 70; e ii) uma CDR-L2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de 50 a 56 da SEQ ID NO: 70; e iii) uma CDR-L3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de 89 a 97 da SEQ ID NO: 70 ou (II) um variante do mesmo compreendendo uma região variável de cadeia pesada com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 67 (por exemplo, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%,

349 / 394 pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 67) e uma região variável de cadeia leve com pelo menos 90% de identidade (por exemplo, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 70.

[00769] Em uma modalidade, o sujeito está sofrendo de uma TMA selecionada do grupo consistindo de uma TMA secundária a câncer; uma TMA secundária à quimioterapia; uma TMA secundária a transplante (por exemplo, transplante de órgão, tal como transplante renal ou transplante alogênico de célula-tronco hematopoiética), Síndrome de Upshaw-Schulman (USS), doença de Degos e Síndrome Antifosfolipídica Catastrófica (CAPS).

[00770] Em algumas modalidades, o método compreende administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 67. Em algumas modalidades, o método compreende administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 70.

[00771] Em algumas modalidades, o método compreende administrar ao sujeito uma composição compreendendo um anticorpo inibidor de MASP- 2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, que especificamente reconhece pelo menos parte de um epítopo na MASP-2 humana reconhecido pelo anticorpo de referência OMS646 compreendendo uma região variável de cadeia pesada como apresentada na SEQ ID NO: 67 e uma região variável de cadeia leve como apresentada na SEQ ID NO: 70.

350 / 394 EXEMPLO 44

[00772] Este Exemplo descreve os resultados iniciais de um Teste Clínico de Fase 2 em andamento para Avaliar a Segurança e Eficácia Clínica de um anticorpo monoclonal inibidor de MASP-2 totalmente humano em Adultos com Microangiopatias Trombóticas (TMAs).

[00773] Fundamento: As TMAs são uma família de distúrbios raros, debilitantes e fatais distinguidos pelos trombos (coágulos) excessivos – agregações de plaquetas – na microcirculação dos órgãos do corpo, mais habitualmente nos rins e cérebro. Métodos:

[00774] O primeiro estágio de um teste clínico de Fase 2 de rótulo aberto foi realizado em sujeitos com síndrome urêmica hemolítica atípica (aHUS) primária, aHUS resistente à terapia plasmática e púrpura trombocitopênica trombótica (TTP). Este teste clínico de fase 2 não tem nenhum ramo de placebo dada a natureza fatal da doença.

[00775] Os sujeitos tiveram idade ≥18 na triagem e foram incluídos neste estudo apenas se tivessem um diagnóstico de uma das seguintes TMAs: aHUS Primária, diagnosticada clinicamente e tendo atividade de ADAMTS13 > 10% no plasma. Os pacientes são elegíveis com ou sem uma mutação de complemento ou anticorpo anti-CFH documentados. Os pacientes são categorizados de acordo com a sua resposta à terapia plasmática (troca de plasma ou infusão de plasma): Os pacientes com aHUS resistente à terapia plasmática, para os propósitos deste estudo, atingem todos dos seguintes: (a) contagem de plaqueta na triagem < 150.000/µL a despeito de pelo menos quatro tratamentos de terapia plasmática antes da triagem; (b) evidência de hemólise microangiopática (presença de esquizócitos, lactato desidrogenase (LDH) sérica > limite superior da normal (ULN), haptoglobina < LLN); e

351 / 394 (c) creatinina sérica > ULN.

[00776] Os pacientes com aHUS resposivos à terapia plasmática crônica (sensíveis à terapia plasmática) devem requerer terapia plasmática pelo menos uma vez por semana durante quatro semanas antes da primeira dose de OMS646 com a creatinina sérica > ULN.

[00777] TTP definida como tendo todos dos seguintes: Contagem de plaqueta < 150.000/µL; Evidência de hemólise microangiopática (presença de esquizócitos, soro LDH > ULN ou haptoglobina < LLN); e Atividade de ADAMTS13 ≤ 10% durante o episódio corrente de TTP ou historicamente.

[00778] Nota: Os sujeitos foram excluídos do estudo se eles tiveram terapia com eculizumab dentro de três meses antes da triagem. Os critérios para um paciente qualificar como resistente à terapia plasmática foram para os propósitos de determinar a eligibilidade neste estudo. Em aspectos adicionais da invenção, um paciente resistente à terapia plasmática a ser tratado com um inibidor de MASP-2 foi anteriormente tratado com terapia plasmática pelo menos uma vez e depois tal tratamento com terapia plasmática teve ainda um ou mais marcadores clínicos de aHUS que não foram adequadamente reduzidos ou eliminados pelo tal tratamento com terapia plasmática.

[00779] O anticorpo monoclonal usado neste estudo, OMS646, é um mAb de IgG4 totalmente humano direcionado contra MASP-2 humana. Como demonstrado no Exemplo 40, OMS646 avidamente se liga à MASP-2 recombinante (constante de dissociação no equilíbrio aparente na faixa de 100 pM) e exibe seletividade maior do que 5.000 vezes em relação às proteínas homólogas C1s, C1r e MASP-1. Em ensaios funcionais, OMS646 inibe o caminho da lectina humana com potência nanomolar (concentração levando a 50% de inibição [IC50] de aproximadamente 3 nM) mas não tem nenhum efeito significante sobre o caminho clássico. OMS646 administrada pela

352 / 394 injeção intravenosa (IV) ou subcutânea (SC) aos camundongos, primatas não humanos e seres humanos resultou em altas concentrações plasmáticas que foram associadas com a supressão de ativação do caminho da lectina em um ensaio ex vivo. Como adicionalmente descrito no Exemplo 42, o tratamento com OMS646 reduziu a deposição de C5b-9 e a formação de trombo em modelos in vitro de TMA e a formação de trombo em um modelo de camundongo de TMA, demonstrando assim que OMS646 tem utilidade terapêutica.

[00780] Neste estudo, a substância de fármaco de OMS646 foi provida em uma concentração de 100 mg/mL, que foi adicionalmente diluída para a administração IV. O volume calculado apropriado de OMS646 100 mg/mL de solução de injeção foi retirado do frasco usando uma seringa para a preparação de dose. A bolsa de infusão foi administrada dentro de quatro horas da preparação.

[00781] No Estágio 1 do estudo, OMS646 foi administrada para aumentar gradativamente grupos de dose de três sujeitos por grupo. Cada sujeito no Estágio 1 recebeu quatro doses semanais de OMS646 como mostrado abaixo na Tabela 26. TABELA 26: Programa de Dosagem para o Estágio 1 Número de Estágio, Grupo Dose de OMS646 (mg/kg) Sujeitos 1, Grupo 1 3 0,675, semanalmente x 4 1, Grupo 2 3 2,0, semanalmente x 4 1, Grupo 3 3 4,0, semanalmente x 4 Estágio 1 Esquema de projeto de Estudo

[00782] O fármaco de estudo diluído foi infundido intravenosamente em um período de 30 minutos. Pontos Finais Primários

[00783] Os pontos finais coprimários foram:

353 / 394 Segurança como avaliado pelos AEs, sinais vitais, ECGs e testes de laboratório clínico Atividade clínica como avaliada pela mudança na contagem de plaqueta Pontos Finais Secundários

[00784] Os pontos finais secundários foram: Atividade clínica de TMA LDH sérico Haptoglobina sérica Hemoglobina Creatinina sérica Sintomas relacionados com TMA Necessidade para terapia plasmática (troca de plasma ou infusão de plasma) Necessidade para diálise Terapias Concomitantes Permitidas

[00785] aHUS resistente à terapia plasmática – a terapia plasmática durante tratamento com OMS646 foi permitida se o pesquisador considerou-a ser medicamente indicada.

[00786] aHUS responsiva à terapia plasmática crônica – os pesquisadores foram aconselhados que a terapia plasmática deve ser continuada até que houvesse um sinal de melhora na TMA, por exemplo, aumento na contagem de plaqueta, diminuição na LDH, aumento na haptoglobina, aumento na hemoglobina, diminuição na creatinina, tempo no qual o pesquisador foi aconselhado considerar reter a terapia plasmática e monitorar os parâmetros de TMA para avaliar se a terapia plasmática pode ser descontinuada.

[00787] TTP – a terapia plasmática foi permitida se o pesquisador considerou-a ser medicamente indicada.

[00788] Os pesquisadores foram aconselhados que a terapia de diálise

354 / 394 renal devesse ser administrada de acordo com o padrão de cuidado.

[00789] Eculizumab não foi administrado durante o estudo. Resultados:

[00790] O primeiro grupo de sujeitos consistiu de três pacientes com aHUS tratados com a dose mais baixa de OMS646. As melhoras foram observadas através dos marcadores da doença de TMA em todos os pacientes neste grupo de estudo. A contagem de plaqueta, a lactato desidrogenase (LDH) sérica e a haptoglobina sérica foram medidas como marcadores de atividade da doença. Quando comparado aos níveis da linha de base, a contagem de plaquetas melhorou em todos os pacientes. Os níveis séricos de LDH permaneceram normais em um paciente, diminuíram substancialmente até próximo à faixa normal em um outro e permaneceu elevada no terceiro. A haptoglobina melhorou em dois pacientes, normalizando em um. Os níveis de creatinina no paciente com função renal independente também melhoraram.

[00791] Como planejado, três pacientes foram tratados no segundo grupo de dose intermediária deste teste clínico. Dois pacientes tiveram aHUS resistente à terapia plasmática e um paciente teve púrpura trombocitopênica trombótica (TTP). Ambos os pacientes com aHUS estavam em diálise renal antes e no momento do alistamento no estudo. No segundo ou grupo da dose intermediária, os dois pacientes com aHUS resistente à terapia plasmática demonstraram: 47% de aumento na contagem média de plaqueta, resultando em ambos os pacientes tendo contagens na faixa normal 86% de diminuição na contagem média de esquizócito, com esquizócitos desaparecendo em um paciente 71% de aumento na haptoglobina média com ambos os pacientes atingindo a faixa normal durante o tratamento, um leve deslocamento abaixo do normal em uma semana a seguir da última dose 5% de diminuição nos níveis médios de LDH, com níveis em

355 / 394 ambos os pacientes permanecendo levemente elevados acima da faixa normal.

[00792] O paciente do grupo da dose intermediária com TTP requereu terapia de infusão de plasma repetida antes de entrar no estudo. Os parâmetros de laboratório não mostraram melhoras compatíveis, mas o paciente não requereu terapia plasmática enquanto sob tratamento com OMS646, nem, até agora, desde a conclusão do tratamento.

[00793] O fármaco foi bem tolerado por todos os pacientes por todo o período de tratamento. Com base nos dados positivos do segundo ou grupo da dose intermediária, o terceiro ou grupo da dose alta foi iniciado e um paciente com aHUS já completou o período de tratamento do estudo. Os dados de referência para todos os pacientes incluem medidas para uma semana a seguir da última dose.

[00794] O primeiro paciente no terceiro grupo (dose alta) – um paciente com aHUS resistente à terapia plasmática com distúrbios complicantes adicionais incluindo hepatite C, crioglobulinemia e linfoma – também completou o tratamento com OMS646. Antes do tratamento com OMS646, o paciente requereu diálise repetida. Por todo o tratamento e a seguir da conclusão do curso de OMS646, até agora o paciente permaneceu fora da diálise. Os parâmetros hematológicos e renais mostraram: 63% de melhora na contagem de plaqueta, retornando para os níveis normais 100% de diminuição nos esquizócitos A haptoglobina aumentou de um nível indetectável e normalizou 43% de diminuição na LDH, resultando em um nível apenas levemente acima do normal 24% de redução no nível da creatinina

[00795] Como no primeiro e segundo grupos, o fármaco foi bem tolerado.

356 / 394

[00796] O ponto final primário neste teste clínico de Fase 2 de rótulo aberto é mudado na contagem de plaqueta. A contagem de plaquetas em todos os três pacientes com aHUS nos grupos de doses intermediária e alta (dois no grupo de dose intermediária e no da dose alta) retornaram para normal, com um aumento médio estatisticamente significante a partir da linha de base de aproximadamente 68.000 plaquetas/mL (p=0,0055).

[00797] Em resumo, os dados obtidos até agora deste teste clínico de Fase 2 mostraram a eficácia de OMS646 nos pacientes com aHUS primária, aHUS resistente à terapia plasmática e nos pacientes com TTP.

[00798] De acordo com o precedente, em uma modalidade, a invenção provê um método de tratar um sujeito sofrendo de aHUS resistente à terapia plasmática compreendendo administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um anticorpo inibidor de MASP-2 eficaz para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2. Em algumas modalidades, o método compreende ainda a etapa de identificar um sujeito sofrendo de aHUS resistente à terapia plasmática antes de administrar ao sujeito uma composição compreendendo um anticorpo inibidor de MASP-2.

[00799] De acordo com qualquer uma das modalidades aqui divulgada, o anticorpo inibidor de MASP-2 exibe pelo menos uma ou mais das seguintes características: o dito anticorpo liga a MASP-2 humana com um KD de 10 nM ou menos, o dito anticorpo liga um epítopo no domínio CCP1 de MASP- 2, o dito anticorpo inibe a deposição de C3b em um ensaio in vitro de soro humano a 1% em uma IC50 de 10 nM ou menos, o dito anticorpo inibe a deposição de C3b em soro humano a 90% com uma IC50 de 30 nM ou menos, em que o anticorpo é um fragmento de anticorpo selecionado do grupo consistindo de Fv, Fab, Fab’, F(ab)2 e F(ab’)2, em que o anticorpo é uma molécula de cadeia única, em que o dito anticorpo é uma de molécula de IgG2, em que o dito anticorpo é uma molécula de IgG1, em que o dito anticorpo é uma molécula de IgG4, em que a molécula de IgG4 compreende

357 / 394 uma mutação S228P. Em uma modalidade, o anticorpo se liga à MASP-2 e seletivamente inibe o caminho da lectina e não inibe substancialmente o caminho clássico (isto é, inibe o caminho da lectina enquanto deixa o caminho de complemento clássico intacto).

[00800] Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 é administrado em uma quantidade eficaz para melhorar pelo menos um ou mais parâmetros clínicos associados com aHUS tal como um aumento na contagem de plaqueta, uma diminuição na LDH, um aumento na haptoglobina, um aumento na hemoglobina e/ou uma diminuição na creatinina.

[00801] Em algumas modalidades, o método compreende administrar um anticorpo inibidor de MASP-2 a um sujeito sofrendo de aHUS resistente à terapia plasmática por intermédio de um cateter (por exemplo, intravenosamente) durante um primeiro período de tempo (por exemplo, pelo menos um dia a uma semana ou duas semanas) seguida pela administração de um anticorpo inibidor de MASP-2 ao sujeito subcutaneamente durante um segundo período de tempo (por exemplo, uma fase crônica de pelo menos duas semanas ou mais longo). Em algumas modalidades, a administração no primeiro e/ou segundo períodos de tempo ocorre na ausência de terapia plasmática. Em algumas modalidades, a administração no primeiro e/ou segundo períodos de tempo ocorre na presença de terapia plasmática.

[00802] Em algumas modalidades, o método compreende administrar um anticorpo inibidor de MASP-2, a um sujeito sofrendo de aHUS resistente à terapia plasmática intravenosamente, intramuscularmente ou preferivelmente, subcutaneamente. O tratamento pode ser crônico e administrado diariamente a mensalmente, mas preferivelmente a cada duas semanas. O anticorpo inibidor de MASP-2 pode ser administrado sozinho ou em combinação com um inibidor de C5, tal como eculizamab.

[00803] Em uma modalidade, o método compreende tratar um sujeito

358 / 394 sofrendo de aHUS resistente à terapia plasmática compreendendo administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo (I) (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo: i) uma CDR-H1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de 31 a 35 da SEQ ID NO: 67; e ii) uma CDR-H2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de 50 a 65 da SEQ ID NO: 67; e iii) uma CDR-H3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de 95 a 107 da SEQ ID NO: 67 e b) uma região variável de cadeia leve compreendendo: i) uma CDR-L1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de 24 a 34 da SEQ ID NO: 70; e ii) uma CDR-L2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de 50 a 56 da SEQ ID NO: 70; e iii) uma CDR-L3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de 89 a 97 da SEQ ID NO: 70 ou (II) uma variante do mesmo compreendendo uma região variável de cadeia pesada com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 67 (por exemplo, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 67) e uma região variável de cadeia leve com pelo menos 90% de identidade (por exemplo, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 70.

[00804] Em algumas modalidades, o método compreende administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 67 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos

359 / 394 apresentada como SEQ ID NO: 70.

[00805] Em algumas modalidades, o método compreende administrar ao sujeito uma composição compreendendo um anticorpo inibidor de MASP- 2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, que especificamente reconhece pelo menos parte de um epítopo na MASP-2 humana reconhecido pelo anticorpo de referência OMS646 compreendendo uma região variável de cadeia pesada como apresentada na SEQ ID NO: 67 e uma região variável de cadeia leve como apresentada na SEQ ID NO: 70. EXEMPLO 45

[00806] Este Exemplo descreve resultados adicionais obtidos no teste clínico de Fase 2 em andamento para avaliar a Segurança e Eficácia Clínica de um anticorpo monoclonal totalmente humano inibidor de MASP-2 em Adultos com Microangiopatias Trombóticas (TMAs) descrito no Exemplo 44. Fundamento: Como descrito no Exemplo 44, TMAs são uma família de distúrbios raros, debilitantes e fatais distinguidos pelos trombos (coágulos) excessivos – agregações de plaquetas – na microcirculação dos órgãos do corpo, o mais habitualmente os rins e cérebro. Como aqui descrito, a TMA associada com transplante (TA-TMA) é uma síndrome devastadora que pode ocorrer em pacientes de transplante, tal como os receptores de transplante de célula-tronco hematopoiética (HSCT). Este Exemplo descreve os resultados iniciais do teste clínico de Fase 2 para avaliar a segurança e eficácia clínica de um anticorpo monoclonal totalmente humano inibidor de MASP-2 em um paciente sofrendo de TMA relacionada com o transplante de célula-tronco hematopoiética. Métodos:

[00807] Como descrito no Exemplo 44, o teste de TMA de Fase 2 consiste de um estágio de variação de dose de três níveis, seguido por um estágio de dose fixa do anticorpo inibidor de MASP-2 OMS646. Como adicionalmente descrito no Exemplo 44, os resultados positivos foram obtidos

360 / 394 de pacientes com aHUS e um paciente com TTP, com melhoras compatíveis e robustas nas medidas de eficácia. Como no grupo de dose baixa, OMS646 foi bem tolerado por todos os pacientes nos grupos de dose branda e alta por todo o período de tratamento. Os estudos pré-clínicos de toxicidade foram completados e não demonstram nenhum problema de segurança, permitindo a dosagem crônica nos testes clínicos.

[00808] Como descrito no Exemplo 44, os dados do teste clínico de TMA de Fase 2 com OMS646 foram obtidos de pacientes com aHUS e TTP. A dosagem foi agora completada para um paciente de TMA relacionado com transplante de célula-tronco hematopoiética adicional no grupo da dose alta usando os métodos descritos no Exemplo 44. Este é um paciente com um histórico de linfoma para o qual ele passou por um transplante de célula- tronco hematopoiética. O seu curso pós transplante foi complicado por vários distúrbios fatais, incluindo TMA requerendo transfusão de plaqueta. A despeito das transfusões, a sua TMA relacionada com transplante de célula- tronco persistiu e ele foi alistado no Teste de Fase 2 com OMS646. Resultados:

[00809] A seguir do período de dosagem de quatro semanas (grupo da dose alta) como descrito no Exemplo 44, o paciente com TMA relacionado com transplante de célula-tronco demonstrou: Contagem de plaqueta quadruplicada, resultando em uma contagem de plaqueta de mais do que 100.000; Nível de haptoglobina mais do que dobrado e foi normal; Nível da lactato desidrogenase plasmática, uma medida de dano dentro dos vasos sanguíneos, diminuído em 35%, mas ainda foi acima do normal; A contagem de Esquizócitos permaneceu em apenas um.

[00810] Por toda a dosagem com OMS646 e desde a conclusão do tratamento com OMS646, o paciente não requereu nenhuma transfusão de

361 / 394 plaquetas ou plasmaférese.

[00811] Em resumo, os dados obtidos até agora deste teste clínico de Fase 2 (como descrito no Exemplo 44 e neste Exemplo) mostram eficácia de OMS646 em pacientes com aHUS primária, aHUS resistente à terapia plasmática, TTP e em um paciente com TMA associada com transplante de célula-tronco hematopoiética.

[00812] De acordo com o precedente, em uma modalidade, a invenção provê um método de tratar um sujeito humano sofrendo de uma TMA associada com transplante de célula-tronco hematopoiética compreendendo administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um anticorpo inibidor de MASP-2 eficaz para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2. Em uma modalidade, o sujeito está sofrendo de uma TMA associada com transplante de célula-tronco hematopoiética que é resistente ao tratamento com transfusão de plaquetas e/ou plasmaférese. Em uma modalidade, o método compreende ainda identificar um sujeito humano sofrendo de uma TMA associada com transplante de célula-tronco hematopoiética que é resistente ao tratamento com transfusão de plaquetas e/ou plasmaférese antes da etapa de administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um anticorpo inibidor de MASP-2 eficaz para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2.

[00813] De acordo com qualquer uma das modalidades aqui divulgadas, o anticorpo inibidor de MASP-2 exibe pelo menos uma ou mais das seguintes características: o dito anticorpo se liga à MASP-2 humana com um KD de 10 nM ou menos, o dito anticorpo liga um epítopo no domínio CCP1 de MASP-2, o dito anticorpo inibe a deposição de C3b em um ensaio in vitro de soro humano a 1% em uma IC50 de 10 nM ou menos, o dito anticorpo inibe a deposição de C3b em soro humano a 90% com uma IC50 de 30 nM ou menos, em que o anticorpo é um fragmento de anticorpo selecionado do

362 / 394 grupo consistindo de Fv, Fab, Fab’, F(ab)2 e F(ab’)2, em que o anticorpo é uma molécula de cadeia única, em que o dito anticorpo é uma molécula de IgG2, em que o dito anticorpo é uma molécula de IgG1, em que o dito anticorpo é uma molécula de IgG4, em que a molécula de IgG4 compreende uma mutação S228P. Em uma modalidade, o anticorpo se liga à MASP-2 e seletivamente inibe o caminho da lectina e não inibe substancialmente o caminho clássico (isto é, inibe o caminho da lectina enquanto deixa o caminho de complemento clássico intacto).

[00814] Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 é administrado em uma quantidade eficaz para melhorar pelo menos um ou mais parâmetros clínicos associados com TMA associada com transplante de célula-tronco hematopoiética, tal como um aumento na contagem de plaqueta (por exemplo, pelo menos o dobro, pelo menos o triplo, pelo menos o quádruplo da contagem de plaqueta antes do tratamento), um aumento na haptoglobina e/ou uma diminuição na lactato desidrogenase.

[00815] Em algumas modalidades, o método compreende administrar um anticorpo inibidor de MASP-2 a um sujeito sofrendo de TMA associada com transplante de célula-tronco hematopoiética por intermédio de um cateter (por exemplo, intravenosamente) durante um primeiro período de tempo (por exemplo, pelo menos um dia a uma semana ou duas semanas) seguido pela administração de um anticorpo inibidor de MASP-2 ao sujeito subcutaneamente durante um segundo período de tempo (por exemplo, uma fase crônica de pelo menos duas semanas ou mais longo). Em algumas modalidades, a administração no primeiro e/ou segundo períodos de tempo ocorre na ausência de terapia plasmática. Em algumas modalidades, a administração no primeiro e/ou segundo períodos de tempo ocorre na presença de terapia plasmática.

[00816] Em algumas modalidades, o método compreende administrar um anticorpo inibidor de MASP-2 a um sujeito sofrendo de TMA associada

363 / 394 com transplante de célula-tronco hematopoiética intravenosamente, intramuscularmente ou preferivelmente, subcutaneamente. O tratamento pode ser crônico e administrado diariamente a mensalmente, mas preferivelmente a cada duas semanas. O anticorpo inibidor de MASP-2 pode ser administrado sozinho ou em combinação com um inibidor de C5, tal como eculizamab.

[00817] Em uma modalidade, o método compreende tratar um sujeito sofrendo de TMA associada com transplante de célula-tronco hematopoiética compreendendo administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo (I) (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo: i) uma CDR-H1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de 31 a 35 da SEQ ID NO: 67; e ii) uma CDR-H2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de 50 a 65 da SEQ ID NO: 67; e iii) uma CDR-H3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de 95 a 107 da SEQ ID NO: 67 e b) uma região variável de cadeia leve compreendendo: i) uma CDR-L1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de 24 a 34 da SEQ ID NO: 70; e ii) uma CDR-L2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de 50 a 56 da SEQ ID NO: 70; e iii) uma CDR-L3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de 89 a 97 da SEQ ID NO: 70 ou (II) uma variante do mesmo compreendendo uma região variável de cadeia pesada com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 67 (por exemplo, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 67) e uma região variável de cadeia leve com pelo menos 90% de identidade (por exemplo, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 70.

364 / 394

[00818] Em algumas modalidades, o método compreende administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 67 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 70.

[00819] Em algumas modalidades, o método compreende administrar ao sujeito uma composição compreendendo um anticorpo inibidor de MASP- 2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, que especificamente reconhece pelo menos parte de um epítopo na MASP-2 humana reconhecido pelo anticorpo de referência OMS646 compreendendo uma região variável de cadeia pesada como apresentada na SEQ ID NO: 67 e uma região variável de cadeia leve como apresentada na SEQ ID NO: 70. EXEMPLO 46

[00820] Este Exemplo descreve adicionalmente resultados obtidos no teste Clínico de Fase 2 em andamento para avaliar a Segurança e Eficácia Clínica de um anticorpo monoclonal inibidor de MASP-2 totalmente humano em adultos com Microangiopatias Trombóticas (TMAs) descritos nos Exemplos 44 e 45. Fundamento: Como descrito no Exemplo 45, a TMA associada com transplante (TA-TMA) é uma síndrome devastadora que pode ocorrer em pacientes de transplante, tais como receptores de transplante de célula-tronco hematopoiética (HSCT). A TMA associada com transplante de célula-tronco hematopoiética (HSCT-TMA) é uma complicação fatal que é deflagrada pela lesão endotelial. O rim é o órgão mais afetado, embora a HSCT-TMA possa ser uma doença de sistema múltiplo que também envolve o pulmão, intestino, coração e cérebro. A ocorrência de TMA mesmo branda está associada com a insuficiência renal de longa duração. O desenvolvimento de TMA associada

365 / 394 com HSCT pós-alogênica difere na frequência com base em critérios de diagnóstico e condicionamento variáveis e regimes de profilaxia da doença do enxerto versus hospedeiro, com inibidores de calcineurina sendo os fármacos mais frequentemente implicados (Ho VT et al., Biol Blood Marrow Transplant, 11(8): 571-5, 2005). A modificação do regime do inibidor imunossupressivo de calcineurina pode resultar na melhora da TMA em alguns pacientes dentro de umas poucas semanas da redução ou descontinuação da administração de inibidor da calcineurina.

[00821] A TMA é uma complicação potencialmente fatal de HSCT e é atualmente controlada amplamente pela melhora de fatores incitantes incluindo a evitação de agentes imunossupressivos (por exemplo, inibidores de calcineurina) e tratamento de infecções em andamento, assim como medidas suportivas tais como hemodiálise. Embora muitos pacientes com HSCT-TMA respondam bem à redução ou descontinuação de agentes imunossupressivos, há um subconjunto de pacientes que tem HSCT-TMA persistente a despeito de medidas de tratamento conservativas (isto é, a TMA não respondeu à redução ou descontinuação de imunossupressivos). Os pacientes que não respondem a estas medidas de tratamento conservativas têm prognóstico insuficiente. A troca de plasma não mostrou eficácia e nenhuma outra terapia é aprovada.

[00822] O Exemplo 45 descreve os resultados positivos iniciais do teste Clínico de Fase 2 para avaliar a segurança e Eficácia Clínica de um anticorpo monoclonal inibidor de MASP-2 totalmente humano (OMS646) em um paciente sofrendo de TMA relacionada com transplante de célula-tronco hematopoiética persistente (HSCT-TMA). Este Exemplo descreve resultados adicionais do teste Clínico de Fase 2 em andamento para avaliar a segurança e Eficácia Clínica de OMS646 em três sujeitos adicionais sofrendo de HSCT- TMA persistente resistente às medidas de tratamento conservativas. Métodos:

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[00823] Como descrito no Exemplo 44, o teste de TMA de Fase 2 consiste de um estágio de variação de dose de três níveis, seguido por um estágio de dose fixa do anticorpo inibidor de MASP-2 OMS646. OMS646 foi bem tolerado por todos os pacientes nos grupos de dose baixa, intermediária e alta durante todo o período de tratamento. Os estudos de toxicidade pré- clínicos foram completados e não demonstraram nenhum problema de segurança, permitindo a dosagem crônica em testes clínicos.

[00824] O teste de TMA de Fase 2 inclui sujeitos sofrendo de TMA associada com HSCT persistente resistente às medidas de tratamento conservativas, que é definido, para os propósitos deste estudo, como tendo todos dos seguintes pelo menos duas semanas a seguir da redução ou descontinuação de agente imunossupressão (por exemplo, tratamento com inibidor de calcineurina) ou pelo menos 30 dias depois do transplante: - Trombocitopenia (Contagem de plaqueta < 150.000/µL); e - Evidência de anemia hemolítica microangiopática (presença de esquizócitos, lactato desidrogenase (LDH) sérica > limite superior do normal (ULN) ou haptoglobina < limite inferior do normal (LLN). Terapias Concomitantes Permitidas para TMA associada com HSCT

[00825] • A terapia plasmática durante o tratamento com OMS646 é permitida se o pesquisador a considera medicamente indicada. Pacientes administrados com terapia plasmática podem receber meias doses adicionais de OMS646.

[00826] • Os pesquisadores foram aconselhados que a terapia de diálise renal devesse ser controlada de acordo com o padrão de cuidado.

[00827] • Eculizumab não foi administrado durante o estudo.

[00828] O estudo de TMA precedente inclui sujeitos sofrendo de HSCT-TMA persistente que é resistente às medidas de tratamento padrão (isto é, TMA persistente pelo menos duas semanas depois da redução ou descontinuação do tratamento com o inibidor calcineurina).

367 / 394

[00829] Como descrito no Exemplo 45, a dosagem foi completada para um paciente sofrendo de HSCT-TMA persistente (paciente #1) no grupo da dose alta (4 mg/kg de OMS646 administrados IV uma vez por semana durante quatro semanas) usando os métodos descritos no Exemplo 44.

[00830] A dosagem foi agora completada para um adicional de 4 pacientes sofrendo de HSCT-TMA persistente, como descrito abaixo.

[00831] O paciente #1 (descrito no Exemplo 44) foi tratado durante quatro semanas com OMS646 (4 mg/kg IV uma vez por semana);

[00832] Os pacientes #2 e #3 foram tratados durante oito semanas com OMS646 (4 mg/kg IV uma vez por semana);

[00833] Os pacientes #4 e #5 foram tratados com OMS646 (4 mg/kg IV uma vez por semana) durante duas e três semanas, respectivamente. Os pacientes #4 e #5 que se retiraram do estudo depois de duas e três semanas, respectivamente, não responderam ao tratamento e pioraram. É observado que um destes pacientes teve creatinina acentuadamente elevada no momento da admissão no estudo. Resultados:

[00834] Cinco pacientes com HSCT-TMA persistente foram alistados neste estudo. Todos os sujeitos foram adultos e receberam HSCT para malignidades hematológicas. As FIGURAS 58, 59 e 60 provêem a mudança da linha de base nas TMAs variáveis depois do tratamento com anticorpo inibidor de MASP-2 OMS646. Estas figuras provêem dados sobre todos os cinco pacientes, dois dos quais descontinuaram o estudo depois de 2 a 3 semanas, com um retorno subsequente e o outro recebendo cuidados paliativos. Como observado na FIGURAS 58, 59 e 60, o último tratamento possível dado ocorreu na semana 7.

[00835] A FIGURA 58 ilustra graficamente a mudança média na contagem de plaqueta a partir da linha de base com o tempo (semanas) em sujeitos sofrendo de microangiopatia trombótica persistente associada com

368 / 394 transplante de célula-tronco hematopoiética (HSCT-TMA) depois do tratamento com anticorpo inibidor de MASP-2 (OMS646).

[00836] A FIGURA 59 ilustra graficamente a mudança média na LDH a partir da linha de base com o tempo (semanas) em sujeitos sofrendo de (HSCT-TMA) persistente depois de tratamento com anticorpo inibidor de MASP-2 (OMS646).

[00837] A FIGURA 60 ilustra graficamente a mudança média na haptoglobina a partir da linha de base com o tempo (semanas) em sujeitos sofrendo de (HSCT-TMA) persistente depois de tratamento com anticorpo inibidor de MASP-2 (OMS646).

[00838] Como mostrado na FIGURAS 59 e 60, melhoras estatisticamente significantes na LDH e haptoglobina foram observadas durante o tratamento. Como mostrado na FIGURA 58, a contagem de plaqueta melhorou, mas não atingiu significância estatística neste pequeno número de pacientes. Dos três pacientes que completarem o tratamento, um não mostrou melhoras na creatinina, mas estava recebendo agentes nefrotóxicos concomitantes. A creatinina melhorou ou permaneceu normal nos outros dois pacientes. No acompanhamento prolongado, um paciente experienciou falência do enxerto e está esperando um segundo transplante. Os outros dois pacientes permaneceram estáveis.

[00839] A despeito dos efeitos potencialmente confusos das medicações associadas com a supressão da medula óssea e nefrotoxicidade em dois dos sujeitos, efeitos de tratamento benéficos com OMS646 foram observados em três dos sujeitos sofrendo de HSCT-TMA persistente (um dos quais está descrito no Exemplo 45) e adicionalmente descrito abaixo. Notavelmente, os efeitos de tratamento em cada um dos três respondedores foram inicialmente observados depois de aproximadamente três semanas de tratamento com OMS646.

[00840] Paciente #1 (tratado durante 4 semanas como descrito no

369 / 394 Exemplo 45). Brevemente resumido, a contagem de plaqueta quadruplicou, resultando em uma contagem de plaqueta de mais do que 100.000/µL; o nível de haptoglobina mais do que dobrou e foi normal; o nível plasmático da lactato desidrogenase diminuiu em 35%, mas ainda foi acima do normal; e a contagem dos esquizócitos permaneceu em apenas um.

[00841] Paciente #2 (tratado durante 8 semanas): a contagem de plaqueta não respondeu ao tratamento, embora o paciente também sofresse de supressão da medula secundária ao tratamento concorrente com valganciclovir e mais tarde falência de enxerto; o nível plasmático da lactato desidrogenase diminuiu de 712 U/L para tão baixo quanto 256 U/L; o nível de haptoglobina aumentou dos níveis indetectáveis para tão alto quanto 250 mg/dL.

[00842] Paciente #3 (tratado durante 8 semanas): a contagem de plaqueta aumentou de 13.500/µL para 133.000/µL; o nível plasmático da lactato desidrogenase diminuiu de 537 para 225 U/L, o nível de haptoglobina aumentou de níveis indetectáveis para tão alto quanto 181 mg/dL. Sumário dos Resultados:

[00843] Para os três pacientes sofrendo de TMA associada com HSCT persistente que completou a dosagem com OMS646, os dados demonstram um sinal de eficácia forte e compatível. Melhoras estatisticamente significantes na LDH e haptoglobina foram observadas durante o tratamento. A contagem de plaquetas melhorou, mas não atingiram significância estatística neste número pequeno de pacientes. Dos três pacientes que completaram o tratamento, um não mostrou uma melhora na creatinina, mas estava recebendo agentes nefrotóxicos concomitantes. A creatinina melhorou ou permaneceu normal nos outros dois pacientes. Conclusões:

[00844] A OMS646 melhorou os marcadores de TMA em pacientes sofrendo de HSCT-TMA persistente que não responderam às medidas de

370 / 394 tratamento conservativas. Os pacientes com HSCT-TMA tratados com OMS646 representam alguns dos mais difíceis para tratar, demonstrando deste modo evidência clínica de um efeito terapêutico de OMS646 nos pacientes com HSCT-TMA persistente de alto risco a despeito das medidas de tratamento conservativas.

[00845] De acordo com o precedente, em uma modalidade, a invenção provê um método de tratar um sujeito humano sofrendo de uma TMA associada com transplante de célula-tronco hematopoiética compreendendo administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um anticorpo inibidor de MASP-2 eficaz para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2. Em uma modalidade, o sujeito está sofrendo de TMA persistente associada com transplante de célula-tronco hematopoiética que é resistente às medidas de tratamento conservativas. Em uma modalidade, o método compreende ainda identificar um sujeito humano sofrendo de TMA persistente associada com transplante de célula-tronco hematopoiética que é resistente às medidas de tratamento conservativas antes da etapa de administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um anticorpo inibidor de MASP-2 eficaz para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2.

[00846] De acordo com qualquer uma das modalidades aqui divulgadas, o anticorpo inibidor de MASP-2 exibe pelo menos uma ou mais das seguintes características: o dito anticorpo liga a MASP-2 humana com um KD de 10 nM ou menos, o dito anticorpo liga um epítopo no domínio CCP1 de MASP-2, o dito anticorpo inibe a deposição de C3b em um ensaio in vitro de soro humano a 1% em uma IC50 de 10 nM ou menos, o dito anticorpo inibe a deposição de C3b em soro humano a 90% com uma IC50 de 30 nM ou menos, em que o anticorpo é um fragmento de anticorpo selecionado do grupo consistindo de Fv, Fab, Fab’, F(ab)2 e F(ab’)2, em que o anticorpo é uma molécula de cadeia única, em que o dito anticorpo é uma molécula de

371 / 394 IgG2, em que o dito anticorpo é uma molécula de IgG1, em que o dito anticorpo é uma molécula de IgG4, em que a molécula de IgG4 compreende uma mutação S228P. Em uma modalidade, o anticorpo se liga à MASP-2 e seletivamente inibe o caminho da lectina e não inibe substancialmente o caminho clássico (isto é, inibe o caminho da lectina enquanto deixa o caminho de complemento clássico intacto).

[00847] Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 é administrado em uma quantidade eficaz para melhorar pelo menos um ou mais parâmetros clínicos associados com TMA associada com transplante de célula-tronco hematopoiética, tal como um aumento na contagem de plaqueta (por exemplo, pelo menos o dobro, pelo menos o triplo, pelo menos o quádruplo da contagem de plaqueta antes do tratamento), um aumento na haptoglobina e/ou uma diminuição na lactato desidrogenase.

[00848] Em algumas modalidades, o método compreende administrar um anticorpo inibidor de MASP-2 a um sujeito sofrendo de TMA associada com transplante de célula-tronco hematopoiética por intermédio de um cateter (por exemplo, intravenosamente) durante um primeiro período de tempo (por exemplo, pelo menos um dia a uma semana ou duas semanas ou três semanas ou quatro semanas ou mais longo) seguida pela administração de um anticorpo inibidor de MASP-2 ao sujeito subcutaneamente durante um segundo período de tempo (por exemplo, uma fase crônica de pelo menos duas semanas ou mais longo). Em algumas modalidades, a administração no primeiro e/ou segundo período de tempo ocorre na ausência de terapia plasmática. Em algumas modalidades, a administração no primeiro e/ou segundo período de tempo ocorre na presença de terapia plasmática.

[00849] Em algumas modalidades, o método compreende administrar um anticorpo inibidor de MASP-2 a um sujeito sofrendo de TMA associada com transplante de célula-tronco hematopoiética intravenosamente, intramuscularmente ou subcutaneamente. O tratamento pode ser crônico e

372 / 394 administrado diariamente a mensalmente, mas preferivelmente a cada pelo menos duas semanas ou pelo menos uma vez por semana, tal como duas vezes por semana ou três vezes por semana. O anticorpo inibidor de MASP-2 pode ser administrado sozinho ou em combinação com um inibidor de C5, tal como eculizamab.

[00850] Em uma modalidade, o método compreende tratar um sujeito sofrendo de TMA persistente associada com transplante de célula-tronco hematopoiética compreendendo administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 da sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 67 e uma região variável de cadeia leve compreendendo CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 da sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 70. Em algumas modalidades, a composição compreende um anticorpo inibidor de MASP-2 compreendendo (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo: i) uma CDR-H1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de 31 a 35 da SEQ ID NO: 67; e ii) uma CDR-H2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de 50 a 65 da SEQ ID NO: 67; e iii) uma CDR-H3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de 95 a 107 da SEQ ID NO: 67 e b) uma região variável de cadeia leve compreendendo: i) uma CDR-L1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de 24 a 34 da SEQ ID NO: 70; e ii) uma CDR-L2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de 50 a 56 da SEQ ID NO: 70; e iii) uma CDR-L3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de 89 a 97 da SEQ ID NO: 70 ou (II) uma variante do mesmo compreendendo uma região variável de cadeia pesada com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 67 (por exemplo, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%,

373 / 394 pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 67) e uma região variável de cadeia leve com pelo menos 90% de identidade (por exemplo, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 70.

[00851] Em algumas modalidades, o método compreende administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 67 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 70.

[00852] Em algumas modalidades, o método compreende administrar ao sujeito uma composição compreendendo um anticorpo inibidor de MASP- 2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, que especificamente reconhece pelo menos parte de um epítopo na MASP-2 humana reconhecido pelo anticorpo de referência OMS646 compreendendo uma região variável de cadeia pesada como apresentada na SEQ ID NO: 67 e uma região variável de cadeia leve como apresentada na SEQ ID NO: 70.

[00853] Em algumas modalidades, o método compreende administrar a um sujeito sofrendo de ou em risco de desenvolver TMA associada com HSCT, incluindo um sujeito sofrendo de TMA persistente associada com transplante de célula-tronco hematopoiética que é resistente às medidas de tratamento conservativas, uma composição compreendendo um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 67 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos

374 / 394 apresentada como SEQ ID NO: 70 em uma dosagem de 1 mg/kg a 10 mg/kg (isto é, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg ou 10 mg/kg) pelo menos uma vez por semana (tal como pelo menos duas vezes semanalmente ou pelo menos três vezes semanalmente) durante um período de pelo menos 3 semanas ou durante pelo menos 4 semanas ou durante pelo menos 5 semanas ou durante pelo menos 6 semanas ou durante pelo menos 7 semanas ou durante pelo menos 8 semanas. EXEMPLO 47

[00854] Este Exemplo descreve um estudo de caso demonstrando tratamento eficaz de doença do enxerto versus hospedeiro (GVHD) associada com microangiopatia com um anticorpo inibidor de MASP-2, OMS646.

[00855] Fundamento: A doença do enxerto versus hospedeiro é uma complicação comum de transplante de célula-tronco hematopoiética (HSCT). Tanto a forma aguda quanto a crônica existem e resultam de células imunes doadoras que reconhecem o paciente receptor como tecido estranho. Isto deflagra uma resposta imune contra o paciente receptor. A GVHD aguda ocorre em até 50% ou mais dos pacientes que recebem transplantes alogênicos. A GVHD aguda mais habitualmente alveja a pele, trato gastrointestinal e fígado, mas também pode afetar os rins, olho, pulmões e células sanguíneas. A GVHD crônica ocorre em aproximadamente 40% dos pacientes que recebem transplantes alogênicos e a maior parte habitualmente afeta a pele, fígado, olho, trato gastrointestinal e pulmões. A GVHD tanto aguda quanto crônica estão relacionadas com morbidez e mortalidade significantes. Métodos e Resultados

[00856] Um homem com 46 anos de idade afetado pela leucemia linfoblástica aguda de célula T (T-ALL) em segunda remissão completa (CR) passaram por um condicionamento mieloablativo completo com uma ciclofosfamida e regime de irradiação corporal total (TBI-Cy) e transplante

375 / 394 HSCT alogênico de célula-tronco de sangue periférico (PBSC) de uma doadora do sexo feminino de 35 anos de idade sem parentesco 9/10 HLA compatível (emparelhamento antigênico no local A). A profilaxia da doença do enxerto versus hospedeiro (GVHD) foi com base em globulina antitimócito (ATG, 5 mg/kg) durante o condicionamento, Ciclosporina A (CSA) e curso curto de Metotrexato (isto é, Metotrexato nos dias +1, +3, +6 (redução de dose devido a CD34+ baixa)). Nós obtivemos uma reconstituição hematológica robusta (enxerto: WBC >1000/mmc, neutrófilos >500/mmc no dia +15; plaquetas >20000/mmc no dia +18, 50000/mmc no dia +21). Quimerismo foi observado com doador total (medula óssea e sangue periférico, frações CD3+ e CD3-) nos dias +30, +60, +90, +180, +354. A remissão completa foi confirmada (imunofenótipo, molecular MRD) nos dias +30, +60, +90, +180.

[00857] No dia +35 após transplante, nós desenvolvemos GVHD gastrointestinal (GI) (apresentada com êmese, anorexia, diarreia, dor abdominal; colonoscopia: erosões difusas; histologia: ulcerações mucósicas difusa, inflamação linfogranulocíticas na lâmina própria, glândula e distorção críptica, corpos apoptóticos) e foi diagnosticado com GVHD aguda, estágio 4 (intestino), grau global 4 junto com colite de citomegalovírus (CMV) (determinada pela imuno-histoquímica positiva e PCR em tempo real na biópsia do intestino; reativação de CMV sistêmica (2614 UI/mL no sangue periférico). As duas condições foram simultaneamente tratadas com metilprednisolona (1 mg/Kg), foscarnet e ganciclovir com boa resposta e esteroide progressivamente reduzido para retirada.

[00858] No dia +121 após o transplante ele experienciou retorno de GVHD de GI refratário a esteroide (apresentado com êmese, anorexia, diarreia, dor abdominal; achados histológicos (estômago e duodeno) e foi diagnosticado com GvHD de GI aguda de início tardio estágio 4 (intestino), grau global 4, que foi tratado, com boa resposta, pela continuação de CSA e

376 / 394 com uma administração sequencial de pentostatina e células-tronco mesenquimatosas de acordo com um estudo clínico registrado (ClinicalTrials.Gov Identifier NCT02032446).

[00859] No dia +210 após o transplante o paciente se apresentou com perda de peso, astenia acentuada, atrofia muscular generalizada, tetraparesia, reflexos de tendão profundo reduzidos, parestesia da panturrilha bilateral, bexiga neurogênica e incontinência urinária na ausência de estímulo mincional (isto é, micturicional). Exame clínico e fluido cerebroespinhal, achados neurorradiológicos e eletrofisiológicos descreveram uma imagem de polineuropatia axonal, sensoriomotor e disautonômica. A neurorradiologia indicou um MRI normal (cérebro e espinha) e o fluido cerebroespinhal foi normal. O retorno de T-ALL, infecções, dano vascular, deficiências nutricionais, distúrbios desmielinantes e síndrome da encefalopatia reversível posterior (PRES) foi excluído. A alta dose de imunoglobulina foi administrada sem nenhum benefício. Uma trombocitopenia concomitante (6 x 109/L) com traços de anemia hemolítica macroangiopática (6,7 g/dL) sem insuficiência renal, reticulocitose (335 x 109/L), LDH aumentada (1635 U/L) e haptoglobina indetectável também foram documentadas. Um teste antiglobulina direto foi negativo. Esquistócitos foram observados no esfregaço de sangue periférico (2-3/campo 50x), assim como ausência de abs anti-B (incompatibilidade maior de paciente/doador), atividade de ADAMTS13 normal, ausência de Abs anti-ADAMTS13, testes de coagulação normal e proteinuria com valores de creatinina normal. Ele também apresentou melena com ulcerações cólicas documentadas no exame endoscópico; o estudo histopatológico revelou edema mucósico, fibrose, vasos pequenos ectáticos com deposição de fibrina intraluminal, atrofia glandular e corpos apoptóticos sem nenhum achado microbiológico. Assim, embora houvesse evidência de GVHD GI persistente, a imagem clínica e histopatológica também foi compatível com um diagnóstico de

377 / 394 microangiopatia trombótica associada com transplante cólico. Por causa da GVHD GI recorrente, CSA foi progressivamente reduzido, mas não retirado (nível mínimo 100 a 150 ng/mL), sem obter mudanças clínicas ou hematológicas.

[00860] No dia +263 após o transplante o paciente foi alistado no teste clínico descrito acima nos Exemplos 45 e 46, que envolve o tratamento com OMS646, um anticorpo inibidor de MASP-2 que inibe o caminho da lectina de ativação de complemento. Como mostrado na FIGURA 61, depois das primeiras 2 doses semanais do fármaco uma resposta clínica e laboratorial foi observada com resolução de melena e hemólise e elevação da contagem de plaqueta. Depois de 4 doses, interessantemente, uma melhora neurológica acentuada também foi documentada tanto com melhora clínica quanto eletrofisiológica do déficit sensoriomotor. Depois de 8 doses de OMS646, a resposta a GvHD foi mantida a despeito da redução progressiva de CSA, sem nenhuma toxidez observada. No dia +354 após o transplante, o paciente demonstrou melhora neurológica adicional e recuperação inicial de déficit mincional (isto é, micturicional). O rápido benefício clínico obtido por este paciente sugere que a inibição eficaz do dano endotelial mediado por complemento, resultante da administração de OMS646, pode ser altamente eficaz para o tratamento de TMA associada com GVHD.

[00861] Em resumo, este Exemplo descreve um relato de caso de um paciente HSCT pós-transplante tendo HSCT-TMA e GvHD coexistente, que tanto resolveu o tratamento seguinte com um anticorpo inibidor de MASP-2 (OMS646). Antes do tratamento com OMS646 o paciente teve um curso de pós transplante difícil complicado pelos múltiplos episódios de GvHD refratária a esteroide, infecção pelo citomegalovírus e HSCT-TMA. Depois de dois episódios anteriores de GvHD, o paciente se apresentou com diarreia sanguinolenta. A biópsia intestinal demonstrou tanto HSCT-TMA quanto GvHD. Nenhuma infecção foi identificada. Notavelmente, o paciente também

378 / 394 teve novo início de sintomas neurológicos de parestesia, tetraplegia e uma bexiga neurogênica, que foi relatada como manifestações neurológicas de GvHD e TMA. O paciente foi incapaz de andar devido à tetraplegia e requereu transfusões de sangue pelo menos uma vez ao dia. Os marcadores hematológicos demonstraram HSCT-TMA com trombocitopenia, lactato desidrogenase elevada (LDH) e esquizócitos. O paciente entrou no teste clínico e começou a receber OMS646. A sua imunossupressão (ciclosporina) foi diminuída 2 semanas antes e ele recebeu apenas dose baixa de corticosteroides em vista do seu histórico de GvHD refratária a esteroide. Ele não recebeu nenhum outro tratamento para GvHD. A sua diarreia sanguinolenta resolvida e os seus marcadores hematológicos melhoraram depois de 2 Doses de OMS646. Depois de 4 Doses de OMS646 ele foi capaz de caminhar. Ele completou 8 semanas de tratamento com OMS646 e está indo bem em casa. Todos os sinais e sintomas de HSCT-TMA e GvHD foram resolvidos. Seus sintomas neurológicos continuam a melhorar. Antes do tratamento com OMS646 este paciente estava deteriorando e em alto risco de morte precoce. A seguir do tratamento com OMS646, a melhora de GvHD, HSCT-TMA e os sintomas neurológicos foram observados e o paciente está indo bem em casa.

[00862] De acordo com o precedente, em uma modalidade, a invenção provê um método de tratar um sujeito humano sofrendo de ou em risco de desenvolver doença do enxerto versus hospedeiro (GVHD) compreendendo administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um anticorpo inibidor de MASP-2 eficaz para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2 e deste modo tratar ou reduzir o risco de desenvolver GVHD ou reduzir a severidade de um ou mais sintomas associados com GVHD. Em uma modalidade, a GVHD é ativa, GVHD aguda. Em uma modalidade, a GVHD é GVHD crônica. Em uma modalidade, a GVHD é resistente a esteroide (isto é, persistente a despeito do tratamento

379 / 394 com esteroide). Em uma modalidade, a GVHD é a GVHD gastrointestinal (GI). Em uma modalidade, o método compreende ainda a etapa de determinar a presença de GVHD em um sujeito antes do tratamento com o anticorpo inibidor de MASP-2.

[00863] Em uma modalidade, o sujeito está sofrendo de ou em risco de desenvolver GVHD associada com um transplante de célula-tronco hematopoiética. Em uma modalidade, o sujeito está sofrendo de ou em risco de desenvolver GVHD associada com uma TMA associada com transplante de célula-tronco hematopoiética. Em uma modalidade, o sujeito está sofrendo de leucemia, tal como leucemia linfoblástica aguda de célula T.

[00864] Em uma modalidade, o sujeito está sofrendo de um ou mais sintomas neurológicos associados com GvHD e/ou TMA, tal como, por exemplo, astenia, parestesias, tetraplegia, déficit sensoriomotor, polineuropatia disautonômica e/ou bexiga neurogênica e o anticorpo inibidor de MASP-2 é administrado em uma quantidade e durante um período de tempo suficiente para melhorar um ou mais dos sintomas neurológicos.

[00865] De acordo com qualquer uma das modalidades aqui divulgadas modalidades, o anticorpo inibidor de MASP-2 exibe pelo menos uma ou mais das seguintes características: o dito anticorpo se liga a MASP-2 humana com um KD de 10 nM ou menos, o dito anticorpo liga um epítopo no domínio CCP1 de MASP-2, o dito anticorpo inibe a deposição de C3b em um ensaio in vitro soro humano a 1% em uma IC50 de 10 nM ou menos, o dito anticorpo inibe a deposição de C3b em soro humano a 90% com uma IC50 de 30 nM ou menos, em que o anticorpo é um fragmento de anticorpo selecionado do grupo consistindo de Fv, Fab, Fab’, F(ab)2 e F(ab’)2, em que o anticorpo é uma molécula de cadeia única, em que o dito anticorpo é uma molécula de IgG2, em que o dito anticorpo é uma molécula de IgG1, em que o dito anticorpo é uma molécula de IgG4, em que a molécula de IgG4 compreende uma mutação S228P. Em uma modalidade, o anticorpo se liga à MASP-2 e

380 / 394 seletivamente inibe o caminho da lectina e não inibe substancialmente o caminho clássico (isto é, inibe o caminho da lectina enquanto deixa o caminho clássico de complemento intacto).

[00866] Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 é administrado em uma quantidade eficaz para melhorar pelo menos um ou mais parâmetros clínicos associados com GVHD.

[00867] Em algumas modalidades, o método compreende administrar um anticorpo inibidor de MASP-2 a um sujeito sofrendo de GVHD associada com transplante de célula-tronco hematopoiética intravenosamente, intramuscularmente ou subcutaneamente. O tratamento pode ser crônico e administrado diariamente a mensalmente, mas preferivelmente a cada pelo menos duas semanas ou pelo menos uma vez por semana, tal como duas vezes por semana ou três vezes por semana. O anticorpo inibidor de MASP-2 pode ser administrado sozinha ou em combinação com um inibidor de C5, tal como eculizamab.

[00868] Em uma modalidade, o método compreende tratar um sujeito sofrendo de GVHD associada com transplante de célula-tronco hematopoiética compreendendo administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 da sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 67 e uma região variável de cadeia leve compreendendo CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 da sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 70. Em algumas modalidades, a composição compreende um anticorpo inibidor de MASP-2 compreendendo (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo: i) uma CDR-H1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de 31 a 35 da SEQ ID NO: 67; e ii) uma CDR-H2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de 50 a 65 da SEQ ID NO: 67; e

381 / 394 iii) uma CDR-H3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de 95 a 107 da SEQ ID NO: 67 e b) uma região variável de cadeia leve compreendendo: i) uma CDR-L1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de 24 a 34 da SEQ ID NO: 70; e ii) uma CDR-L2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de 50 a 56 da SEQ ID NO: 70; e iii) uma CDR-L3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de 89 a 97 da SEQ ID NO: 70 ou (II) uma variante do mesmo compreendendo uma região variável de cadeia pesada com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 67 (por exemplo, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 67) e uma região variável de cadeia leve com pelo menos 90% de identidade (por exemplo, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 70.

[00869] Em algumas modalidades, o método compreende administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 67 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 70.

[00870] Em algumas modalidades, o método compreende administrar ao sujeito uma composição compreendendo um anticorpo inibidor de MASP- 2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, que especificamente reconhece pelo menos parte de um epítopo na MASP-2 humana reconhecido pelo anticorpo de referência OMS646 compreendendo uma região variável de cadeia pesada como apresentada na SEQ ID NO: 67 e uma região variável de

382 / 394 cadeia leve como apresentada na SEQ ID NO: 70.

[00871] Em algumas modalidades, o método compreende administrar a um sujeito sofrendo de ou em risco de desenvolver GVHD, tal como um sujeito que passará por, está passando ou passou pelo HSCT, incluindo um sujeito sofrendo de TMA associada com GVHD, uma composição compreendendo um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 67 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 70 em uma dosagem de 1 mg/kg a 10 mg/kg (isto é, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg ou 10 mg/kg) pelo menos uma vez por semana (tal como pelo menos duas vezes semanalmente ou pelo menos três vezes semanalmente) durante um período de pelo menos 3 semanas ou durante pelo menos 4 semanas ou durante pelo menos 5 semanas ou durante pelo menos 6 semanas ou durante pelo menos 7 semanas ou durante pelo menos 8 semanas. EXEMPLO 48

[00872] Este Exemplo descreve um estudo de caso demonstrando tratamento eficaz de TMA e hemorragia alveolar difusa (DAH) depois do transplante de célula-tronco hematopoiética com um anticorpo inibidor de MASP-2, OMS646. Fundamento: O transplante de célula-tronco hematopoiética (HSCT) induz lesão endotelial substancial, que contribui para complicações pós-HSCT sérias tais como microangiopatia trombótica (TMA), doença do enxerto versus hospedeiro (GvHD), hemorragia alveolar difusa (DAH) e doença veno- oclusiva (VOD). (ver E. Carreras e M. Diaz-Ricart, Bone Marrow Transplant vol 46: 1495-1502, 2011; Akil et al., Biol Blood Marrow Transplant 21: 1739-1745, 2015; e Vion et al., Semin Thromb Hemost 41(06): 629-643, 2015, cada uma da qual é por meio deste aqui incorporada por referência).

383 / 394

[00873] A hemorragia alveolar difusa (DAH) é uma síndrome que pode ocorrer em um receptor de transplante de célula-tronco hematopoiética (HSCT). Os critérios de diagnóstico de DAH no receptor de HSCT incluem infiltrados pulmonares, dispneia e hipoxia (ver E. Carreras e M. Diaz-Ricart, Bone Marrow Transplant vol 46: 1495-1502, 2011, por meio deste aqui incorporada por referência). A patogênese suspeita de DAH são danos no endotélio capilar pulmonar pelo condicionamento de HSCT mais neutrófilos enxertados e infecções silenciosas, permitindo o vazamento de células sanguíneas vermelhas dentro dos alvéolos pulmonares (E. Carreras e M. Diaz-Ricart, Bone Marrow Transplant vol 46: 1495-1502, 2011). A doença veno-oclusiva (VOD), também conhecida como síndrome obstrutiva sinusoidal (SOS), é uma outra síndrome que pode ocorrer em um paciente de transplante de célula-tronco hematopoiética (HSCT). As manifestações clínicas de VOD incluem ganho de peso acentuado devido à retenção de fluido, tamanho do fígado aumentado e níveis elevados de bilirrubina no sangue (ver E. Carreras e M. Diaz-Ricart, Bone Marrow Transplant vol 46: 1495-1502, 2011, por meio deste aqui incorporada por referência). Métodos e Resultados: Demografia e Histórico Médico Passado

[00874] O paciente foi uma mulher branca de 14 anos de idade no momento de início do tratamento, aludido neste Exemplo como “uso compassivo com o paciente #1.” O paciente teve um histórico de anemia de Blackfan-Diamond e síndrome da sela vazia. Resultados do Paciente

[00875] O paciente está vivo no Dia 877. Doença Requerendo Transplante

[00876] O paciente tem um histórico de anemia de Blackfan-Diamond. Ela requereu infusões de RBC a cada 3 semanas desde a infância e anteriormente desenvolveu sobrecarga de ferro.

384 / 394 Transplante

[00877] O paciente passou pelo seu transplante de célula-tronco em setembro de 2015. Ela recebeu um transplante de PBSC de um doador sem parentesco com compatibilidade 9/10. O enxerto de neutrófilo ocorreu aproximadamente no Dia 35. O enxerto de plaquetas não foi obtido até o Dia

184. Ela requereu infusões de plaqueta e RBC durante mais de 1 ano. Complicações Pós-Transplante

[00878] O paciente teve um curso pós-transplante complicado. Logo depois da alta ela foi reinternada no Dia 67 por falta de ar e pneumonia presumida. Ela teve alta no Dia 162. Ela foi reinternada no Dia 167 com reativação de varicela zoster tratada com aciclovir e polisserosite tratada com corticosteroides. Ela teve trombocitopenia e anemia persistentes, LDH elevado, haptoglobina diminuída, esquizócitos e um teste de anticorpo direto negativo. Um diagnóstico de TMA foi feito. A imunossupressão foi mudada para MMF e prednisona. Ela também experienciou reativação de HHV6 e EBV. Ela teve alta no Dia 197.

[00879] No Dia 229 ela foi reinternada com TMA persistente e angústia respiratória severa. Ela foi diagnosticada com hemorragia alveolar difusa que foi tratada com CPAP e corticosteroides. No Dia 231 ela teve efusões pleurais e pericardiais com piora na oxigenação. A sua pressão sanguínea aumentou. Ela requereu um inibidor de ACE, bloqueador do canal de cálcio, beta bloqueador, diurético e nitroglicerina para controle da BP. Ela experienciou uma convulsão e clonidina foi adicionada. A MRI cerebral mostrou ferro no cérebro compatível com hemocromatose secundária do seu histórico de transfusão de RBC. Hemodiálise foi iniciada no Dia 231. No Dia 259 ela iniciou o tratamento com eculizumab devido à disfunção renal continuada e piora na sua situação pulmonar. A sua TMA melhorou, mas ela desenvolveu edema pulmonar agudo e eculizumab foi descontinuado. A sua TMA piorou e ela passou pela troca de plasma nos dias Dias 269, 276 e 278

385 / 394 sem melhora. Ela foi tratada com defibrotida que foi descontinuada devido a uma coagulopatia e nenhuma melhora na TMA. Ela novamente recebeu dose mais baixa de eculizumab começando aproximadamente no Dia 320. O eculizumab foi novamente interrompido devido a edema pulmonar. A TMA persistiu. Ela também desenvolveu infecção pela C. difficile. Ela teve alta no Dia 379 recebendo prednisona, MMF, voriconazol, cotrimazol, amlodipina, eritropoietina, ursodiol e omeprazol.

[00880] Ela foi reinternada no Dia 380 com febre, calafrios e dispneia. Ela teve pneumonia pela K. pneumoniae e septicemia de E. faecium. O seu MMF foi interrompido. Ela foi tratada com Tazocin, meropenem e vancomicina. Com bacteremia persistente, a sua linha central foi mudada e seus antibióticos foram mudados para linezolid, daptomicina e clindamicina. A sua TMA persistiu requerendo hemodiálise 3 vezes por semana e transfusão diária de plaquetas. O edema pulmonar diagnosticado como hemorragia alveolar difusa (tratada com corticosteroides sem resposta). No dia 404 tratamento com OMS646 começou sob um protocolo de uso compassivo. Como aqui descrito, OMS646 é um anticorpo inibidor de MASP-2 que inibe o caminho da lectina de ativação de complemento.

[00881] Ela foi tratada 3 vezes semanalmente com uma dose de 4 mg/kg de OMS646. O seu oxigênio foi descontinuado e a sua dose de corticosteroide foi diminuída. Os seus marcadores de TMA laboratoriais melhoraram. Ela teve alta no Dia 414.

[00882] Ela continuou o tratamento ambulatorial de OMS646 3 vezes semanalmente e no Dia 416 a sua hemodiálise foi diminuída para uma vez por semana. A sua medicação anti-hipertensiva também foi reduzida para apenas amlodipina, clonidina e furosemida. No Dia 423 ela descontinuou a hemodiálise e no Dia 428 o seu OMS646 foi diminuído para duas vezes semanalmente com reduções nas suas doses de corticosteroide e furosemida. A sua transfusão de plaquetas foi substancialmente diminuída durante este

386 / 394 período.

[00883] Ela continuou a se sentir bem até o Dia 486 quando ela desenvolveu uma infecção por RSV. A sua creatinina e LDH aumentaram e a sua contagem de plaqueta e haptoglobina caíram. Ela foi diagnosticada com TMA recorrente e o tratamento com OMS646 foi aumentado para 3 vezes semanalmente. A sua TMA resolveu com o tratamento com OMS646 aumentado.

[00884] Ela permaneceu livre da hemodiálise e a sua última transfusão de plaquetas ocorreu em torno do Dia 630. Ela é atualmente está indo bem e recebendo tratamento com OMS646, desfuroxamina, levotiroxina, sevelamer, Augmentina, levetiracetam, alopurinol, amlodipina, nevibolol, clonidina e eritropoietina. Ela está recebendo flebotomias para a hemocromatose. Episódios de TMA

[00885] Este paciente teve um curso difícil com TMA persistente e/ou recorrente. O seu curso é compatível com TMA de órgão múltiplo e ela teve hemorragia alveolar difusa (DAH), uma outra síndrome de lesão endotelial. Ela inicialmente respondeu ao eculizumab, mas não tolerou o tratamento. Antes de iniciar o tratamento com OMS646 ela estava na hemodiálise e requerendo transfusões diárias. Logo depois do tratamento com OMS646 a sua TMA resolveu, a sua DAH resolveu e ela foi capaz de descontinuar a diálise. Ela foi mais tarde capaz de reduzir substancialmente e mais tarde descontinuar as transfusões de plaquetas e RBC enquanto manteve estável ou aumentando a contagem de plaqueta e os valores de hemoglobina. Estes resultados são demonstrados nas FIGURAS 62A-62E como seguem:

[00886] A FIGURA 62A ilustra graficamente o nível de creatinina com o tempo no uso compassivo com o paciente #1, em que a linha vertical indica o início de tratamento com anticorpo inibidor de MASP-2 (OMS646).

[00887] A FIGURA 62B ilustra graficamente o nível de haptoglobina com o tempo no uso compassivo com o paciente #1, em que a linha vertical

387 / 394 indica o início de tratamento com anticorpo inibidor de MASP-2 (OMS646).

[00888] A FIGURA 62C ilustra graficamente o nível de hemoglobina com o tempo no uso compassivo com o paciente #1, em que a linha vertical indica o início de tratamento com anticorpo inibidor de MASP-2 (OMS646).

[00889] A FIGURA 62D ilustra graficamente o nível de LDH com o tempo no uso compassivo com o paciente #1, em que a linha vertical indica o início de tratamento com anticorpo inibidor de MASP-2 (OMS646).

[00890] A FIGURA 62E ilustra graficamente o nível de plaquetas com o tempo no uso compassivo com o paciente #1, em que a linha vertical indica o início de tratamento com anticorpo inibidor de MASP-2 (OMS646).

[00891] No geral, este curso do paciente demonstra tratamento bem sucedido com OMS646 de TMA e DAH permitindo que o paciente descontinuasse a terapia com oxigênio, hemodiálise e transfusões. Sumário

[00892] Em resumo, este Exemplo descreve um relato de caso de HCST-TMA de uma adolescente (uso compassivo com o paciente #1) que não tolerou o tratamento com eculizumab, mas respondeu bem ao uso compassivo de tratamento com OMS646. Logo depois do tratamento com OMS646 a sua TMA resolveu, a sua DAH resolveu e ela foi capaz de descontinuar a diálise. Como descrito no Exemplo 47, um outro relato de caso de HSCT-TMA foi provido descrevendo um paciente que teve um curso pós- transplante difícil, incluindo GvHD resistente a esteroide e infecção por citomegalovírus. Ele desenvolveu TMA que não respondeu às medidas conservativas e teve GvHD coexistente com complicações neurológicas múltiplas e foi incapaz de andar. Como descrito no Exemplo 47, a seguir do tratamento com OMS646, a sua TMA e GvHD resolveram e as suas complicações neurológicas melhoraram. Ele foi capaz de retornar ao trabalho e a sua situação neurológica tem continuado a melhorar.

[00893] A melhora na sobrevivência global e marcadores de TMA nos

388 / 394 receptores de HSCT combinados com a resolução de GvHD e resolução de hemorragia alveolar difusa nestes pacientes criticamente enfermos indica o papel que o caminho da lectina desempenha nestas síndromes e a eficácia para o uso de um anticorpo OMS646 inibidor de MASP-2 no tratamento e/ou prevenção de TMA pós-transplante de célula-tronco, doença do enxerto versus hospedeiro e hemorragia alveolar difusa.

[00894] De acordo com o precedente, em uma modalidade, a invenção provê um método de tratar um sujeito humano sofrendo de hemorragia alveolar difusa associada com transplante de célula-tronco hematopoiética (isto é, em um receptor de HSCT) compreendendo administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um anticorpo inibidor de MASP-2 eficaz para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-

2. Em uma modalidade, o método compreende ainda identificar um sujeito humano sofrendo de hemorragia alveolar difusa associada com HSCT antes da etapa de administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um anticorpo inibidor de MASP-2 eficaz para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2.

[00895] De acordo com qualquer uma das modalidades aqui divulgadas, o anticorpo inibidor de MASP-2 exibe pelo menos uma ou mais das seguintes características: o dito anticorpo liga a MASP-2 humana com um KD de 10 nM ou menos, o dito anticorpo liga um epítopo no domínio CCP1 de MASP-2, o dito anticorpo inibe a deposição de C3b em um ensaio in vitro de soro humano a 1% em uma IC50 de 10 nM ou menos, o dito anticorpo inibe a deposição de C3b em soro humano a 90% com uma IC50 de 30 nM ou menos, em que o anticorpo é um fragmento de anticorpo selecionado do grupo consistindo de Fv, Fab, Fab’, F(ab)2 e F(ab’)2, em que o anticorpo é uma molécula de cadeia única, em que o dito anticorpo é uma molécula de IgG2, em que o dito anticorpo é uma molécula de IgG1, em que o dito anticorpo é uma molécula de IgG4, em que a molécula de IgG4 compreende

389 / 394 uma mutação S228P. Em uma modalidade, o anticorpo se liga à MASP-2 e seletivamente inibe o caminho da lectina e não inibe substancialmente o caminho clássico (isto é, inibe o caminho da lectina enquanto deixa o caminho clássico de complemento intacto).

[00896] Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 é administrado em uma quantidade eficaz para melhorar pelo menos um ou mais parâmetros clínicos associados com hemorragia alveolar difusa em um receptor de HSCT. Em algumas modalidades, o método compreende administrar um anticorpo inibidor de MASP-2 a um sujeito sofrendo de hemorragia alveolar difusa intravenosamente, intramuscularmente ou subcutaneamente. O tratamento pode ser crônico e administrado diariamente a mensalmente, mas preferivelmente a cada pelo menos duas semanas ou pelo menos uma vez por semana, tal como duas vezes por semana ou três vezes por semana. O anticorpo inibidor de MASP-2 pode ser administrado sozinho ou em combinação com um inibidor de C5, tal como eculizamab.

[00897] Em uma modalidade, o método compreende tratar um sujeito sofrendo de hemorragia alveolar difusa associada com transplante de célula- tronco hematopoiética compreendendo administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR- H3 da sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 67 e uma região variável de cadeia leve compreendendo CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 da sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 70. Em algumas modalidades, a composição compreende um anticorpo inibidor de MASP-2 compreendendo (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo: i) uma CDR-H1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de 31 a 35 da SEQ ID NO: 67; e ii) uma CDR-H2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de 50 a 65 da SEQ ID NO: 67; e

390 / 394 iii) uma CDR-H3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de 95 a 107 da SEQ ID NO: 67 e b) uma região variável de cadeia leve compreendendo: i) uma CDR-L1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de 24 a 34 da SEQ ID NO: 70; e ii) uma CDR-L2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de 50 a 56 da SEQ ID NO: 70; e iii) uma CDR-L3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de 89 a 97 da SEQ ID NO: 70 ou (II) uma variante do mesmo compreendendo uma região variável de cadeia pesada com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 67 (por exemplo, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 67) e uma região variável de cadeia leve com pelo menos 90% de identidade (por exemplo, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 70.

[00898] Em algumas modalidades, o método compreende administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 67 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 70.

[00899] Em algumas modalidades, o método compreende administrar ao sujeito uma composição compreendendo um anticorpo inibidor de MASP- 2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, que especificamente reconhece pelo menos parte de um epítopo na MASP-2 humana reconhecido pelo anticorpo de referência OMS646 compreendendo uma região variável de cadeia pesada como apresentada na SEQ ID NO: 67 e uma região variável de

391 / 394 cadeia leve como apresentada na SEQ ID NO: 70.

[00900] Em algumas modalidades, o método compreende administrar a um sujeito sofrendo de ou em risco de desenvolver hemorragia alveolar difusa associada com HSCT, uma composição compreendendo um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 67 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 70 em uma dosagem de 1 mg/kg a 10 mg/kg (isto é, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg ou 10 mg/kg) pelo menos uma vez por semana (tal como pelo menos duas vezes semanalmente ou pelo menos três vezes semanalmente) durante um período de pelo menos 3 semanas ou durante pelo menos 4 semanas ou durante pelo menos 5 semanas ou durante pelo menos 6 semanas ou durante pelo menos 7 semanas ou durante pelo menos 8 semanas.

[00901] De acordo com o precedente, em uma outra modalidade, a invenção provê um método de tratar um sujeito humano sofrendo de doença veno-oclusiva (VOD) associada com transplante de célula-tronco hematopoiética (isto é, em um receptor de HSCT) compreendendo administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um anticorpo inibidor de MASP-2 eficaz para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2. Em uma modalidade, o método compreende ainda identificar um sujeito humano sofrendo de doença veno-oclusiva associada com HSCT antes da etapa de administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um anticorpo inibidor de MASP-2 eficaz para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2.

[00902] De acordo com qualquer uma das modalidades aqui divulgadas, o anticorpo inibidor de MASP-2 exibe pelo menos uma ou mais das seguintes características: o dito anticorpo liga a MASP-2 humana com um

392 / 394 KD de 10 nM ou menos, o dito anticorpo liga um epítopo no domínio CCP1 de MASP-2, o dito anticorpo inibe a deposição de C3b em um ensaio in vitro de soro humano a 1% em uma IC50 de 10 nM ou menos, o dito anticorpo inibe a deposição de C3b em soro humano a 90% com uma IC50 de 30 nM ou menos, em que o anticorpo é um fragmento de anticorpo selecionado do grupo consistindo de Fv, Fab, Fab’, F(ab)2 e F(ab’)2, em que o anticorpo é uma molécula de cadeia única, em que o dito anticorpo é uma molécula de IgG2, em que o dito anticorpo é uma molécula de IgG1, em que o dito anticorpo é uma molécula de IgG4, em que a molécula de IgG4 compreende uma mutação S228P. Em uma modalidade, o anticorpo se liga à MASP-2 e seletivamente inibe o caminho da lectina e não inibe substancialmente o caminho clássico (isto é, inibe o caminho da lectina enquanto deixa o caminho clássico de complemento intacto).

[00903] Em uma modalidade, o anticorpo inibidor de MASP-2 é administrado em uma quantidade eficaz para melhorar pelo menos um ou mais parâmetros clínicos associados com doença veno-oclusiva em um receptor de HSCT. Em algumas modalidades, o método compreende administrar um anticorpo inibidor de MASP-2 a um sujeito sofrendo de doença veno-oclusiva intravenosamente, intramuscularmente ou subcutaneamente. O tratamento pode ser crônico e administrado diariamente a mensalmente, mas preferivelmente a cada pelo menos duas semanas ou pelo menos uma vez por semana, tal como duas vezes por semana ou três vezes por semana. O anticorpo inibidor de MASP-2 pode ser administrado sozinho ou em combinação com um inibidor de C5, tal como eculizamab.

[00904] Em uma modalidade, o método compreende tratar um sujeito sofrendo de doença veno-oclusiva associada com transplante de célula-tronco hematopoiética compreendendo administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade de um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo uma região

393 / 394 variável de cadeia pesada compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 da sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 67 e uma região variável de cadeia leve compreendendo CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 da sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 70. Em algumas modalidades, a composição compreende um anticorpo inibidor de MASP-2 compreendendo (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo: i) uma CDR-H1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de 31 a 35 da SEQ ID NO: 67; e ii) uma CDR-H2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de 50 a 65 da SEQ ID NO: 67; e iii) uma CDR-H3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de 95 a 107 da SEQ ID NO: 67 e b) uma região variável de cadeia leve compreendendo: i) uma CDR-L1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de 24 a 34 da SEQ ID NO: 70; e ii) uma CDR-L2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de 50 a 56 da SEQ ID NO: 70; e iii) uma CDR-L3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de 89 a 97 da SEQ ID NO: 70 ou (II) uma variante do mesmo compreendendo uma região variável de cadeia pesada com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 67 (por exemplo, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 67) e uma região variável de cadeia leve com pelo menos 90% de identidade (por exemplo, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 70.

[00905] Em algumas modalidades, o método compreende administrar ao sujeito sofrendo de doença veno-oclusiva associada com HSCT uma composição compreendendo uma quantidade de um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo

394 / 394 uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 67 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 70.

[00906] Em algumas modalidades, o método compreende administrar ao sujeito uma composição compreendendo um anticorpo inibidor de MASP- 2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, que especificamente reconhece pelo menos parte de um epítopo na MASP-2 humana reconhecido pelo anticorpo de referência OMS646 compreendendo uma região variável de cadeia pesada como apresentada na SEQ ID NO: 67 e uma região variável de cadeia leve como apresentada na SEQ ID NO: 70.

[00907] Em algumas modalidades, o método compreende administrar a um sujeito sofrendo de ou em risco de desenvolver doença veno-oclusiva associada com HSCT, uma composição compreendendo um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 67 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 70 em um dosagem de 1 mg/kg a 10 mg/kg (isto é, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg ou 10 mg/kg) pelo menos uma vez por semana (tal como pelo menos duas vezes semanalmente ou pelo menos três vezes semanalmente) durante um período de pelo menos 3 semanas ou durante pelo menos 4 semanas ou durante pelo menos 5 semanas ou durante pelo menos 6 semanas ou durante pelo menos 7 semanas ou durante pelo menos 8 semanas.

[00908] Embora modalidades ilustrativas tenham sido ilustradas e descritas, será avaliado que várias mudanças podem ser feitas nelas sem divergir do espírito e escopo da invenção.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método de tratar um sujeito humano sofrendo de ou em risco de desenvolver doença do enxerto versus hospedeiro (GVHD), caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo inibidor monoclonal de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2, em que o anticorpo inibidor de MASP-2 não inibe substancialmente o caminho clássico.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método compreende adicionalmente identificar um sujeito humano sofrendo de ou em risco de desenvolver doença do enxerto versus hospedeiro antes da etapa de administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o sujeito passou anteriormente ou está atualmente passando ou passará por um transplante de célula-tronco hematopoiética.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o sujeito está sofrendo de GVHD aguda.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o sujeito está sofrendo de GVHD crônica.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o sujeito está sofrendo de GVHD resistente a esteroide.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 da sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 67 e uma região variável de cadeia leve compreendendo CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 da sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 70.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o método compreende administrar ao sujeito uma composição compreendendo o dito anticorpo inibidor de MASP-2 em uma dosagem de 1 mg/kg a 10 mg/kg pelo menos uma vez por semana.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o sujeito está sofrendo deum ou mais sintomas neurológicos associados com a doença do enxerto versus hospedeiroe o método compreende administrar a um sujeito antes, durante ou depois de receber um transplante de célula-tronco hematopoiética uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo para tratar, prevenir ou melhorar um ou mais sintomas neurológicos associados com a doença do enxerto versus hospedeiro.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o um ou mais sintomas neurológicos associados com doença do enxerto versus hospedeiro ou HSCT-TMA são selecionados do grupo consistindo de astenia, parestesias, tetraplegia, déficit sensoriomotor, polineuropatia disautonômica e/ou bexiga neurogênica.

11. Método de tratar um sujeito humano sofrendo de ou em risco de desenvolver hemorragia alveolar difusa, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo inibidor monoclonal de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2, em que o anticorpo inibidor de MASP- 2 não inibe substancialmente o caminho clássico.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o método compreende adicionalmente identificar um sujeito humano sofrendo de ou em risco de desenvolver hemorragia alveolar difusa antes da etapa de administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2.

13. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o sujeito passou anteriormente ou está atualmente passando ou passará por um transplante de célula-tronco hematopoiética.

14. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 da sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 67 e uma região variável de cadeia leve compreendendo CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 da sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 70.

15. Método de tratar um sujeito humano sofrendo de ou em risco de desenvolver doença veno-oclusiva, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo inibidor monoclonal de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2, em que o anticorpo inibidor de MASP- 2 não inibe substancialmente o caminho clássico.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o método compreende adicionalmente identificar um sujeito humano sofrendo de ou em risco de desenvolver doença veno-oclusiva antes da etapa de administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2.

17. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o sujeito passou anteriormente ou está atualmente passando ou passará por um transplante de célula-tronco hematopoiética.

18. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 da sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 67 e uma região variável de cadeia leve compreendendo CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 da sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 70.