JP2010162016A - 乾癬の治療のための新規組成物と方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】正常な皮膚と比較して乾癬に過剰発現するポリペプチドを同定し、これらポリペプチド及びそれらのコード化核酸を使用し、哺乳動物の乾癬の治療的処置及び診断的検出に有用な物質の組成物を生産する。
【選択図】なし
Description
これらの疾患の発生は、多くの場合、多段階経路及びしばしば多数の異なった生物学的システム/経路に関与しているが、一又は複数のこれら経路の重要な点における介在により改善又は治療効果を有し得る。治療的介在は有害なプロセス/経路の拮抗作用又は有益なプロセス/経路の刺激の何れかにより生じる。
多くの免疫関連疾患が知られており、広範囲にわたって研究されている。このような疾患には、免疫媒介炎症疾患、非免疫媒介炎症疾患、感染疾患、免疫欠損症、異常増殖等が含まれる。
Tリンパ球(T細胞)は哺乳動物の免疫反応の重要な成分である。T細胞は主要組織適合性複合体(MHC)内の遺伝子によりコードされる自己分子と結合する抗原を認識する。抗原は抗原提示細胞、ウイルス感染細胞、癌細胞、移植片等の表面上のMHC分子と共に提示され得る。T細胞系は宿主哺乳動物の健康を脅かすこれらの改変細胞を除去するものである。T細胞はヘルパーT細胞及び細胞障害性T細胞を含む。ヘルパーT細胞は、抗原提示細胞上の抗原-MHC複合体の認識に続いて広範囲に増殖する。またヘルパーT細胞は種々のサイトカイン、例えばリンホカインを分泌し、これはB細胞、細胞障害性T細胞、及び免疫反応に寄与している種々の他の細胞の活性化において中心的な役割を担っている。
上記のような乾癬研究の進歩にも関わらず、哺乳動物における乾癬の存在を検出することができ、この疾患を効果的に抑制できる診断及び治療のための新しい薬剤が望まれている。従って、本発明の目的は、正常な皮膚と比較して乾癬に過剰発現するポリペプチドを同定し、これらポリペプチド及びそれらのコード化核酸を使用すること、哺乳動物の乾癬の治療的処置及び診断的検出に有用な物質の組成物を生産することである。
本発明は、ヒトを含む哺乳動物における乾癬の診断と治療に有用な組成物と方法に関する。本発明は、哺乳動物における感染に起因するタンパク質(アゴニスト及びアンタゴニスト抗体を含む)の同定に基づいている。乾癬等の免疫関連疾患は免疫反応を抑制又は増強することで治療することができる。免疫反応を増強する分子は、抗原に対する免疫反応を刺激又は強化する。免疫反応の増強が有益である場合には、免疫反応を刺激する分子が治療に使用可能である。あるいは、免疫反応の鎮静が有用である場合(例えば炎症)には、抗原に対する免疫反応を鎮静又は低減するといった、免疫反応を抑制する分子(例えば中和抗体)を治療的に使用することができる。従って、PROポリペプチド、そのアゴニスト及びアンタゴニストは、乾癬の治療のための医薬及び薬物の調製に有用である。特定の態様では、このような医薬及び薬物は、製薬的に許容可能な担体と共に、治療的有効量のPROポリペプチド、そのアゴニスト又はアンタゴニストを含有する。好ましくは、混合物は滅菌される。
更なる実施態様では、本発明は、PROポリペプチドを候補分子と接触させ、前記PROポリペプチドによって媒介される生物学的活性をモニターすることを含んでなる、PROポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストの同定方法に関する。好ましくは、PROポリペプチドは天然配列PROポリペプチドである。特定の態様では、PROアゴニスト又はアンタゴニストは抗PRO抗体である。
他の実施態様では、本発明は、担体又は賦形剤と混合されてPROポリペプチド又は該ポリペプチドと結合するアゴニスト又はアンタゴニスト抗体を含んでなる組成物に関する。一態様では、組成物は治療に有効な量のポリペプチド又は抗体を含む。更なる態様では、組成物が乾癬阻害分子を含むとき、組成物は、(a)その必要とする哺乳動物の乾癬組織の量を減少させ、(b)その必要とする哺乳動物における自己免疫反応を阻害又は低減させるのに有用である。他の態様では、組成物は、例えば更なる抗体又は細胞障害又は化学療法剤であり得る更なる活性成分を含有する。好ましくは、組成物は滅菌されている。
他の実施態様では、本発明は上述の又は下記のポリペプチドの何れかに特異的に結合する抗体を提供する。場合によっては、該抗体はモノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗体断片又は単鎖抗体である。一態様では、本発明は、PROポリペプチドに結合する単離された抗体に関する。他の態様では、抗体はPROポリペプチドの活性を模倣し(アゴニスト抗体)、又は逆に抗体がPROポリペプチドの活性を阻害又は中和する(アンタゴニスト抗体)。他の態様では、抗体はモノクローナル抗体であり、好ましくは非ヒト相補性決定領域(CDR)残基及びヒトフレームワーク領域(FR)残基を有する。抗体は標識されていても固体支持体上に固定化されていてもよい。更なる態様では、抗体は抗体断片、モノクローナル抗体、単鎖抗体、又は抗イディオタイプ抗体である。
更なる実施態様では、本発明は:
(a)PROポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストを含有する物質の組成物;
(b)該組成物を収容する容器;及び
(c)免疫関連疾患の治療における該PROポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストの使用に言及した、該容器に添付されたラベル又は該容器に含められた包装挿入物を具備する製造品を提供する。該組成物は、治療的有効量のPROポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストを含んでいてもよい。
他の実施態様では、本発明は(a)抗PRO抗体を哺乳動物から得た組織細胞の試験試料に接触させ、(b)試験試料中における、PROポリペプチドと抗体との複合体形成を検出することを含む哺乳動物における乾癬の診断方法に関し、ここで、該複合体の形成は、乾癬の有無を示す。検出は、定性的でも定量的でもよく、同じ細胞型の既知の正常組織細胞のコントロール試料における複合体形成をモニターして比較することで実施してもよい。試験試料中に生成される多量の複合体は、試験組織細胞が得られた哺乳動物における乾癬の有無を示す。抗体は、好ましくは検出可能な標識を有する。複合体生成は、例えば、光学顕微鏡、フローサイトメトリー、蛍光測定、又は他のこの分野で知られた技術によりモニターすることができる。通常、試験試料は、乾癬を有すると疑われる個体から採取される。
他の実施態様では、本発明は適当なパッケージ中に抗PRO抗体と担体を含んでなる乾癬の診断キットに関する。キットは好ましくはPROポリペプチドの有無を検出するために抗体を使用するための説明書を含む。好ましくは、担体は製薬的に許容可能なものである。
他の実施態様では、本発明は適当なパッケージに抗PRO抗体を含んでなる診断キットに関する。好ましくはキットはPROポリペプチドを検出するための抗体を使用するための説明書を含む。
他の実施態様では、本発明は、PROポリペプチドのアゴニストを同定する方法を提供し、それは:
(a)細胞とスクリーニングされる試験化合物とを、PROポリペプチドによって通常誘発される細胞性反応の誘発に適した条件下で接触させ;
(b)前記細胞性反応の誘発を測定して、試験化合物が有効なアゴニストであるか否かを決定することを含んでなり、前記細胞性反応の誘発が前記試験化合物が有効なアゴニストであることを示す。
(a)細胞とスクリーニングされる試験化合物とを、PROポリペプチドが存在し、PROポリペプチドによって通常誘発される細胞性反応の誘発に適した条件下で接触させ;
(b)前記細胞性反応の誘発を測定して、試験化合物が有効なアンタゴニストであるか否かを決定する工程を含んでなる。
他の実施態様では、本発明は、通常はPROポリペプチドを発現する細胞におけるPROポリペプチドの発現を阻害する化合物の同定方法を提供し、該方法は、細胞と試験化合物とを接触させ、PROポリペプチドの発現が阻害されるか否かを測定することを含む。好ましい態様では、この方法は:
(a)細胞とスクリーニングされる試験化合物とをPROポリペプチドを発現させるのに適した条件下で接触させ;
(b)前記ポリペプチドの発現の阻害を測定する工程を含んでなる。
また、他の態様において、本発明は、プロモータ、(a)PROポリペプチド、(b)PROポリペプチドのアゴニストポリペプチド、又は(c)PROポリペプチドのアンタゴニストポリペプチドをコードする核酸、及びポリペプチドの細胞分泌のためのシグナル配列から本質的になるウイルスベクターを含有する組換えウイルス粒子を提供し、ここでウイルスベクターはウイルス構造タンパク質に付随している。好ましくは、シグナル配列は哺乳動物、例えば天然PROポリペプチドからのものである。
また、更なる実施態様では、本発明は、レトロウイルス構造タンパク質を発現する核酸構築物を含有し、またプロモータ、(a)PROポリペプチド、(b)PROポリペプチドのアゴニストポリペプチド、又は(c)PROポリペプチドのアンタゴニストポリペプチドをコードする核酸、及びポリペプチドの細胞分泌のためのシグナル配列から本質的になるレトロウイルスベクターを更に含むエキソビボ産生細胞に関し、ここで該産生細胞は、組換えレトロウイルス粒子を生産させるために構造タンパク質に付随してレトロウイルスベクターを包含している。
本発明の他の態様では、本発明はここに記載したポリペプチドの任意のものをコードするDNAを含むベクターを提供する。また、そのようなベクターの任意のものを含む宿主細胞も提供される。例として、宿主細胞はCHO細胞、大腸菌、又は酵母菌であってよい。ここに記載したポリペプチドの任意のものの製造方法が更に提供され、それは、宿主細胞を所望のポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、細胞培養物から所望のポリペプチドを回収することを含む。
他の実施態様では、本発明は、異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合した、ここに記載したポリペプチドの任意のものを含んでなるキメラ分子を提供する。そのようなキメラ分子の例は、エピトープタグ配列又は免疫グロブリンのFc領域に融合したここに記載の任意のポリペプチドを含む。
他の実施態様では、本発明は、上記又は下記のポリペプチドの任意のものに特異的に結合する抗体を提供する。場合によっては、抗体はモノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗体断片又は単鎖抗体である。
更に他の実施態様では、本発明は、ゲノム及びcDNAヌクレオチド配列又はアンチセンスプローブを単離するのに有用なオリゴヌクレオチドプローブを提供し、それらのプローブは上記又は下記のヌクレオチド配列の任意のものから誘導されうる。
一態様では、単離された核酸分子は、(a)ここに開示された全長アミノ酸配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠くアミノ酸配列、ここに開示されたシグナルペプチドを伴うか伴わない膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、又はここに開示された全長アミノ酸配列の任意の他の特に定められた断片を有するPROポリペプチドをコードするDNA分子、又は(b)(a)のDNA分子の相補鎖に対して、少なくとも約80%の核酸配列同一性、又は少なくとも約81%の核酸配列同一性、又は少なくとも約82%の核酸配列同一性、又は少なくとも約83%の核酸配列同一性、又は少なくとも約84%の核酸配列同一性、又は少なくとも約85%の核酸配列同一性、又は少なくとも約86%の核酸配列同一性、又は少なくとも約87%の核酸配列同一性、又は少なくとも約88%の核酸配列同一性、又は少なくとも約89%の核酸配列同一性、又は少なくとも約90%の核酸配列同一性、又は少なくとも約91%の核酸配列同一性、又は少なくとも約92%の核酸配列同一性、又は少なくとも約93%の核酸配列同一性、又は少なくとも約94%の核酸配列同一性、又は少なくとも約95%の核酸配列同一性、又は少なくとも約96%の核酸配列同一性、又は少なくとも約97%の核酸配列同一性、又は少なくとも約98%の核酸配列同一性、又は少なくとも約99%の核酸配列同一性を有しているヌクレオチド配列を含んでなる。
他の実施態様は、PROポリペプチドコード配列の断片、又はその相補鎖に関し、それらは、例えば、場合によっては抗PRO抗体に対する結合部位を含むポリペプチドをコードするPROポリペプチドの断片をコードする、ハイブリッド形成プローブとして、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドプローブとしての用途が見いだされる。そのような核酸断片は通常少なくとも約20のヌクレオチド長、又は少なくとも約30のヌクレオチド長、又は少なくとも約40のヌクレオチド長、又は少なくとも約50のヌクレオチド長、又は少なくとも約60のヌクレオチド長、又は少なくとも約70のヌクレオチド長、又は少なくとも約80のヌクレオチド長、又は少なくとも約90のヌクレオチド長、又は少なくとも約100のヌクレオチド長、又は少なくとも約110のヌクレオチド長、又は少なくとも約120のヌクレオチド長、又は少なくとも約130のヌクレオチド長、又は少なくとも約140のヌクレオチド長、又は少なくとも約150のヌクレオチド長、又は少なくとも約160のヌクレオチド長、又は少なくとも約170のヌクレオチド長、又は少なくとも約180のヌクレオチド長、又は少なくとも約190のヌクレオチド長、又は少なくとも約200のヌクレオチド長、又は少なくとも約250のヌクレオチド長、又は少なくとも約300のヌクレオチド長、又は少なくとも約350のヌクレオチド長、又は少なくとも約400のヌクレオチド長、又は少なくとも約450のヌクレオチド長、又は少なくとも約500のヌクレオチド長、又は少なくとも約600のヌクレオチド長、又は少なくとも約700のヌクレオチド長、又は少なくとも約800のヌクレオチド長、又は少なくとも約900のヌクレオチド長、又は少なくとも約1000のヌクレオチド長であり、ここで、「約」という用語は、その参照している長さのプラス又はマイナス10%の参照ヌクレオチド配列長を意味する。PROポリペプチドコード化ヌクレオチド配列の新規な断片は、多くのよく知られた配列アラインメントプログラムの任意のものを使用して、PROポリペプチドコードヌクレオチド配列を他の既知のヌクレオチド配列にアラインメントさせ、どのPROポリペプチドコード化ヌクレオチド配列断片(類)が新規であるかを決定することにより常套的な形で決定することができることに留意される。そのようなPROポリペプチドコード化ヌクレオチド配列の全てがここで考慮される。また考慮されるものは、これらのヌクレオチド分子断片によりコードされるPROポリペプチド断片、好ましくは抗PRO抗体に対する結合部位を含んでなるそれらのPROポリペプチド断片である。
ある態様では、本発明は、ここに開示された全長アミノ酸配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠くアミノ酸配列、ここに開示されたシグナルペプチドを伴うか伴わない膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、又はここに開示された全長アミノ酸配列の任意の他の特に定められた断片を有するPROポリペプチドに対して、少なくとも約80%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約81%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約82%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約83%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約84%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約85%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約86%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約87%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約88%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約89%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約90%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約91%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約92%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約93%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約94%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約95%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約96%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約97%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約98%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約99%のアミノ酸配列同一性を有しているアミノ酸配列を含んでなる単離されたPROポリペプチドに関する。
他の態様では、本発明は、膜貫通ドメインが欠失されたか膜貫通ドメインが不活性化された単離されたPROポリペプチドを提供する。これを生産する方法もまたここに記載され、ここで、これらの方法はPROポリペプチドの発現に適した条件下で適当なコード化核酸分子を含むベクターを含んでなる宿主細胞を培養し、細胞培養物からPROポリペプチドを回収することを含んでなる。
更に他の実施態様では、本発明は、ここで定められる天然PROポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストに関する。特定の実施態様では、アゴニスト又はアンタゴニストは抗PRO抗体又は小分子である。
更なる実施態様では、本発明は、PROポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法に関し、それは、PROポリペプチドを候補分子と接触させ、前記PROポリペプチドによって媒介される生物学的活性をモニターすることを含む。好ましくは、PROポリペプチドは天然PROポリペプチドである。
また更なる実施態様では、本発明は、PROポリペプチド、又はここに記載するPROポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニスト、又は抗PRO抗体を、担体と組み合わせて含有する物質の組成物に関する。場合によっては、担体は製薬的に許容される担体である。
本発明の他の実施態様は、PROポリペプチド、又は上記したようなそのアゴニスト又はアンタゴニスト、又は抗PRO抗体の、PROポリペプチド、そのアゴニスト又はアンタゴニスト又は抗PRO抗体に起因する病状の治療に有用な医薬の調製のための使用に関する。
1.定義
ここで使用される際の「PROポリペプチド」及び「PRO」という用語は、直後に数値標記がある場合、種々のポリペプチドを指し、完全な符号(すなわち、PRO/番号)は、ここに記載する特定のポリペプチド配列を指す。「PRO/番号ポリペプチド」及び「PRO/番号」であって、「番号」がここで使用される実際の数値標記として与えられる用語は、天然配列ポリペプチド及びポリペプチド変異体(ここで更に定義する)を含む。ここに記載されるPROポリペプチドは、ヒト組織型又は他の供給源といった種々の供給源から単離してもよく、組換え又は合成法によって調製してもよい。「PROポリペプチド」なる用語は、ここで記載する個々のPRO/番号ポリペプチドをそれぞれ指す。「PROポリペプチド」を意味するこの明細書における全開示は、ポリペプチドのそれぞれを個々に、また一緒に併せて意味する。例えば、それに対する抗体の調製、精製、誘導、精製、それを含む組成物、それを用いた病気の治療等々の記載は、本発明の各ポリペプチドにそれぞれ関与している。また「PROポリペプチド」なる用語には、ここに開示されるPRO/番号ポリペプチドの変異体も含まれる。
PROポリペプチド「細胞外ドメイン」又は「ECD」は、膜貫通及び細胞質ドメインを本質的に有しないPROポリペプチドの形態を称する。通常、PROポリペプチドECDは、それらの膜貫通及び/又は細胞質ドメインを1%未満、好ましくはそのようなドメインを0.5%未満しか持たない。本発明のPROポリペプチドについて同定された任意の膜貫通ドメインは、疎水性ドメインのその型を同定するために当該分野において日常的に使用される基準に従い同定されることが理解されるであろう。膜貫通ドメインの厳密な境界は変わり得るが、ここで最初に同定されたドメインのいずれかの末端から約5アミノ酸を越えないと思われる。よって、PROポリペプチド細胞外ドメインは、場合によっては、実施例又は明細書で同定されるように膜貫通ドメイン/細胞外ドメインの境界のいずれかの側から約5又はそれ未満のアミノ酸を含んでもよく、シグナルペプチドを伴う又は伴わない、そのようなポリペプチド及びそれらをコードする核酸は、本発明で考慮される。
分率X/Yの100倍
ここで、Xは配列アラインメントプログラムALIGN−2のA及びBのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、YはBの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと異なる場合、AのBに対する%アミノ酸配列同一性は、BのAに対する%アミノ酸配列同一性とは異なることは認識されるであろう。この方法を用いた%アミノ酸配列同一性の計算の例として、表2と3は、「比較タンパク質」と称されるアミノ酸配列の「PRO」と称されるアミノ酸配列に対する%アミノ酸配列同一性の計算方法を示し、ここで「PRO」とは関心ある仮のPROポリペプチドのアミノ酸配列を表し、「比較タンパク質」とは関心ある「PRO」ポリペプチドが比較されているポリペプチドのアミノ酸配列を表し、「X」、「Y」及び「Z」はそれぞれ異なった仮のアミノ酸配列を表す。
アミノ酸配列比較にNCBI−BLAST2が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Aの、与えられたアミノ酸配列Bとの、又はそれに対する%アミノ酸配列同一性(与えられたアミノ酸配列Bと、又はそれに対して或る程度の%アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Aと言うこともできる)は次のように計算される:
分率X/Yの100倍
ここで、Xは配列アラインメントプログラムNCBI−BLAST2のA及びBのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、YはBの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと異なる場合、AのBに対する%アミノ酸配列同一性は、BのAに対する%アミノ酸配列同一性とは異なると認識されるであろう。
通常は、PROポリペプチド変異体ポリヌクレオチドは、少なくとも約30のヌクレオチド長、又は少なくとも約60のヌクレオチド長、又は少なくとも約90のヌクレオチド長、又は少なくとも約120のヌクレオチド長、又は少なくとも約150のヌクレオチド長、又は少なくとも約180のヌクレオチド長、又は少なくとも約210のヌクレオチド長、又は少なくとも約240のヌクレオチド長、又は少なくとも約270のヌクレオチド長、又は少なくとも約300のヌクレオチド長、又は少なくとも約450のヌクレオチド長、又は少なくとも約600のヌクレオチド長、又は少なくとも約900のヌクレオチド長である。
分率W/Zの100倍
ここで、Wは配列アラインメントプログラムALIGN−2のC及びDのアラインメントによって同一であると一致したスコアのヌクレオチドの数であり、ZはDの全ヌクレオチド数である。核酸配列Cの長さが核酸配列Dの長さと異なる場合、CのDに対する%核酸配列同一性は、DのCに対する%核酸配列同一性とは異なると認識されるであろう。%核酸配列同一性の計算の例として、表4と5は、「比較DNA」と称される核酸配列の「PRO-DNA」と称される核酸配列に対する%核酸配列同一性の計算方法を示し、ここで「PRO-DNA」は、関心ある仮のPRO-コード化核酸配列を表し、「比較DNA」は関心ある「PRO-DNA」核酸分子が比較されている核酸分子のヌクレオチド配列を表し、「N」、「L」及び「V」はそれぞれ異なった仮のヌクレオチドを表す。
配列比較にNCBI−BLAST2が用いられる状況では、与えられた核酸配列Cの、与えられた核酸配列Dとの、又はそれに対する%核酸配列同一性(与えられた核酸配列Dとの、又はそれに対して或る程度の%核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Cと言うこともできる)は次のように計算される:
分率W/Zの100倍
ここで、Wは配列アラインメントプログラムNCBI−BLAST2のC及びDのアラインメントによって同一であると一致したスコアのヌクレオチド数であり、ZはDの全ヌクレオチド数である。核酸配列Cの長さが核酸配列Dの長さと異なる場合、CのDに対する%核酸配列同一性は、DのCに対する%核酸配列同一性とは異なると認識されるであろう。
「単離された」とは、ここで開示された種々のポリペプチドを記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び/又は回収されたポリペプチドを意味する。その自然環境の汚染成分とは、そのポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、ポリペプチドは、(1)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも15残基のN末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(2)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのSDS-PAGEによる均一性まで精製される。単離されたポリペプチドには、自然環境におけるPROポリペプチドの少なくとも1つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのポリペプチドが含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも1つの精製工程により調製される。
「単離された」PROポリペプチドコード化核酸又は他のポリペプチドコード化核酸は、同定され、ポリペプチドコード化核酸の天然源に通常付随している少なくとも1つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離されたポリペプチドコード化核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離されたポリペプチドコード化核酸は、天然の細胞中に存在する特定のポリペプチドコード化核酸分子とは区別される。しかし、単離されたポリペプチドコード化核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なった染色体位置にあるポリペプチドを通常発現する細胞に含まれるものを含む。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのDNAは、ポリペプチドの分泌に寄与するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのDNAに作用可能に結合している;プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している;又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したDNA配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
ハイブリッド形成反応の「緊縮性」は、通常、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなればなる程、適切なアニーリングのために温度を高くする必要があり、プローブが短くなればなる程、温度を低くする必要が生じる。ハイブリッド形成は、一般的に、相補鎖がその融点より低い環境に存在する場合、変性DNAの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリッド形成可能な配列との間の所望の相同性の程度が高くなると、使用できる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をより緊縮性にするが、低い温度は緊縮性を低下させる。ハイブリッド形成反応の緊縮性の更なる詳細及び説明は、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照のこと。
ここで定義される「ストリンジェントな条件」又は「高度にストリンジェントな条件」は、(1)洗浄のために低イオン強度及び高温度、例えば、50℃において0.015Mの塩化ナトリウム/0.0015Mのクエン酸ナトリウム/0.1%のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの;(2)ハイブリッド形成中にホルムアミド等の変性剤、例えば、42℃において50%(v/v)ホルムアミドと0.1%ウシ血清アルブミン/0.1%フィコール/0.1%のポリビニルピロリドン/50mMのpH6.5のリン酸ナトリウムバッファー、及び750mMの塩化ナトリウム、75mMクエン酸ナトリウムを用いるもの;又は(3)42℃における50%ホルムアミド、5xSSC(0.75MのNaCl、0.075Mのクエン酸ナトリウム)、50mMのリン酸ナトリウム(pH6.8)、0.1%のピロリン酸ナトリウム、5xデンハート液、超音波処理サケ精子DNA(50μg/ml)、0.1%SDS、及び10%のデキストラン硫酸と、42℃における0.2xSSC(塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム)中の洗浄及び55℃での50%ホルムアミド、次いで55℃におけるEDTAを含む0.1xSSCからなる高緊縮性洗浄を用いるものによって同定され得る。
「中程度にストリンジェントな条件」は、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual.New York: Cold Spring Harbor Press, 1989に記載されているように同定され、上記の緊縮性より低い洗浄溶液及びハイブリッド形成条件(例えば、温度、イオン強度及び%SDS)の使用を含む。中程度にストリンジェントな条件の例は、20%ホルムアミド、5xSSC(150mMのNaCl、15mMのクエン酸三ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5xデンハート液、10%デキストラン硫酸、及び20mg/mLの変性剪断サケ精子DNAを含む溶液中の37℃での終夜インキュベーション、次いで1xSSC中37-50℃でのフィルターの洗浄といったものある。当業者であれば、プローブ長等の因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかを認識するであろう。
ここで用いられる「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質(「アドヘシン」)の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とを結合した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位以外である(即ち「異種の」)アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、IgG-1、IgG-2、IgG-3又はIgG-4サブタイプ、IgA(IgA-1及びIgA-2を含む)、IgE、IgD又はIgM等の任意の免疫グロブリンから得ることができる。
「アンタゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然PROポリペプチドの生物学的活性を部分的又は完全に阻止、阻害、又は中和する任意の分子を含む。同様に「アゴニスト」なる用語も最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然PROポリペプチドの生物学的活性を模倣する任意の分子を含む。好適なアゴニスト又はアンタゴニスト分子は特に、アゴニスト又はアンタゴニスト抗体又は抗体断片、天然PROポリペプチドの断片又はアミノ酸配列変異体、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、有機小分子等を含む。PROポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストの同定方法は、PROポリペプチドを候補アンタゴニスト又はアゴニスト分子と接触させ、PROポリペプチドに通常付随する一又は複数の生物学的活性の検出可能な変化を測定することを含みうる。
「慢性」投与とは、急性様式とは異なり連続的な様式で薬剤を投与し、初期の治療効果(活性)を長時間に渡って維持することを称する。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる処理である。
治療の目的のための「哺乳動物」は、ヒト、家庭及び農業用動物、及び動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなどを含む哺乳動物に分類される任意の動物を称する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
一又は複数の治療薬と「組み合わせた」投与とは、同時(同時期)及び任意の順序での連続した投与を含む。
抗体のパパイン消化は、「Fab」断片と呼ばれる2つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Fc」断片と命名される。ペプシン処理はF(ab')2断片を生じ、それは2つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
「Fv」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は、密接に非共有結合した1本の重鎖と1本の軽鎖の可変領域の二量体からなる。この配置において各可変ドメインの3つのCDRが相互作用してVH−VL二量体の表面に抗原結合部位を決定する。正しくは、6つのCDRsが抗体に対する抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン(又は抗原に特異的な3つのCDRのみを含んでなるFvの半分)でさえ、結合部位全体よりは低い親和性であるが、抗原を認識し結合する能力を持つ。
またFab断片は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第1の定常ドメイン(CH1)も含む。Fab断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖CH1ドメインのカルボキシ末端に幾つかの残基が付加されていることによりFab'断片と相違する。ここで、Fab'-SHは、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を持つFab’を表す。F(ab')2抗体断片は、通常はFab’断片の対として生成され、それらの間にヒンジシステインを有する。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
任意の脊椎動物種からの抗体(免疫グロブリン)の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる二つの明らかに異なる型の一つが割り当てられる。
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンには5つの主たるクラス:IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMがあり、それらのいくつかは更にサブクラス(アイソタイプ)、例えばIgG1、IgG2、IgG3及びIgG4、IgA及びIgA2に分割される。
「ダイアボディ(diabodies)」という用語は、二つの抗原結合部位を持つ小型の抗体断片を指し、その断片は同じポリペプチド鎖(VH-VL)内で軽鎖可変ドメイン(VL)に結合した重鎖可変ドメイン(VH)を含む。同じ鎖の二つのドメイン間に対形成するには短すぎるリンカーを用いることにより、ドメインは強制的に他の鎖の相補的ドメインと対形成して二つの抗原結合部位を生成する。ダイアボディは、例えば、EP 404,097; WO 93/11161; 及びHollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)により十分に記載されている。
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され分離及び/又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、その抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、抗体は、(1)ローリ法(Lowry method)で測定した場合95重量%を越える、最も好ましくは99重量%を越えるまで、(2)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも15残基のN末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(3)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのSDS-PAGEにより均一になるまで精製される。単離された抗体には、抗体の自然環境の少なくとも1つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも1つの精製工程により調製される。
「標識」なる語は、ここで用いられる場合、抗体に直接又は間接的に結合して「標識」抗体を生成する検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識は、それ自身検出可能でもよく(例えば、放射性標識又は蛍光標識)、又は酵素標識の場合、検出可能な基質化合物又は組成物の化学変換を触媒してもよい。
「固相」とは、本発明の抗体がそれに付着することのできる非水性マトリクスを意味する。ここに意図する固相の例は、部分的又は全体的に、ガラス(例えば、孔制御ガラス)、多糖類(例えばアガロース)、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンから形成されたものを含む。或る種の実施態様では、内容に応じて、固相はアッセイプレートのウェルを構成することができ;その他では精製カラム(例えばアフィニティクロマトグラフィーカラム)とすることもできる。また、この用語は、米国特許第4,275,149号に記載されたような、別個の粒子の不連続な固相も包含する。
「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質及び/又は界面活性剤からなる小型の小胞であり、哺乳動物への薬物(PROポリペプチド又はその抗体など)の輸送に有用である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質配列に類似する二層形式に配列させる。
「小分子」とは、ここで、約500ダルトン未満の分子量を持つと定義される。
「T細胞媒介疾患」という用語は、T細胞が直接的又は間接的に哺乳動物の病的状態を媒介するか又は寄与等する疾患を意味する。T細胞媒介疾患は細胞媒介効果、リンホカイン媒介効果等に、また例えばT細胞により分泌されるリンホカインによりB細胞が刺激されるならばB細胞に関連した効果にさえも関連している。
本明細書で使用する「乾癬」という用語は、肘、膝又は体幹に顕著に現れる限局性の発疹で、分散性及び極限性で赤みがあり、銀の鱗状になった斑点状丘疹を特徴とする。
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学化合物である。化学療法剤の例は、アドリアマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、5-フルオロウラシル、シトシンアラビノシド(「Ara−C」)、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、サイトキシン、タキソイド類、例えばパクリタキセル(Taxol, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ)及びドキセタキセル(Taxotere, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France)、トキソテール、メトトレキセート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イフォスファミド、マイトマイシンC、マイトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラマイシン(米国特許第4,675,187号を参照のこと)、メルファラン、及び他の関連するナイトロジェンマスタードを含む。また、この定義に含まれるのは、タモキシフェン及びオナプリストン等の腫瘍へのホルモン作用を調節又は阻害するように作用するホルモン様薬剤である。
ここで用いられる際の「成長阻害剤」は、細胞、特にここで同定される任意の遺伝子を過剰発現する癌細胞の成長を、インビトロ又はインビボで阻害する化合物又は組成物を称する。即ち、成長阻害剤は、S相でそのような遺伝子を過剰発現する細胞の割合を有意に減少させるものである。成長阻害剤の例は、細胞周期の進行を(S相以外の位置で)ブロックする薬剤、例えばG1停止又はM相停止を誘発する薬剤を含む。古典的なM相ブロッカーは、ビンカス(ビンクリスチン及びビンブラスチン)、タキソール、及びトポIIインヒビター、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。G1停止させるこれらの薬剤は、S相停止にも溢流し、例えば、DNAアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、5-フルオロウラシル、及びara-Cである。更なる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael, 編, Chapter 1, 表題「Cell cycle reguration, oncogene, and antineoplastic drugs」, Murakami等, (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特にp13に見出すことができる。
ここで用いられる「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質(「アドヘシン」)の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とを結合した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位以外である(即ち「異種の」)アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、IgG-1、IgG-2、IgG-3又はIgG-4サブタイプ、IgA(IgA-1及びIgA-2を含む)、IgE、IgD又はIgM等の任意の免疫グロブリンから得ることができる。
A.全長PROポリペプチド
本発明は、本出願でPROポリペプチドと称されるポリペプチドをコードする新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に下記の実施例で更に詳細に開示するように、種々のPROポリペプチドをコードするcDNAが同定され単離された。しかしながら、単純化のために、本明細書において、ここに開示した全長天然核酸分子にコードされるタンパク質並びに上記のPROの定義に含まれる更なる天然相同体及び変異体は、それらの起源又は調製形式に関わらず、「PRO/番号」として呼称する。
下記の実施例に開示するように、種々のcDNAクローンの配列が開示される。これらのクローンの事実上のヌクレオチド配列は、この分野で日常的な方法を用いて寄託されたクローンを配列決定することにより容易に決定することができる。予測されるアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列から常套的技量を用いて決定できる。ここに記載したPROポリペプチド及びコード化核酸について、本出願人は、現時点で入手可能な配列情報と最も良く一致するリーディングフレームであると考えられるものを同定した。
ここに記載した全長天然配列PROポリペプチドに加えて、PRO変異体も調製できると考えられる。PRO変異体は、PRODNAに適当なヌクレオチド変化を導入することにより、及び/又は所望のPROポリペプチドを合成することにより調製できる。当業者は、グリコシル化部位の数又は位置の変化あるいは膜固着特性の変化などのアミノ酸変化がPROの翻訳後プロセスを変えうると認識するであろう。
天然全長配列PRO又はここに記載したPROの種々のドメインにおける変異は、例えば、米国特許第5,364,934号に記載されている保存的及び非保存的変異についての技術及び指針の任意のものを用いてなすことができる。変異は、結果として天然配列PROと比較してPROのアミノ酸配列が変化するPROをコードする一又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってよい。場合によっては、変異は少なくとも1つのアミノ酸のPROの一又は複数のドメインの任意の他のアミノ酸による置換である。いずれのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失されるかの指針は、PROの配列を相同性の知られたタンパク質分子の配列と比較し、相同性の高い領域内でなされるアミノ酸配列変化の数を最小にすることによって見出される。アミノ酸置換は、一のアミノ酸の類似した構造及び/又は化学特性を持つ他のアミノ酸での置換、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換の結果とすることができる。挿入又は欠失は、場合によっては1から5のアミノ酸の範囲内とすることができる。許容される変異は、配列においてアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に作成し、得られた変異体を全長又は成熟天然タンパク質によって提示された活性について試験することにより決定される。
PRO断片は、多くの従来技術の任意のものによって調製してよい。所望のペプチド断片は化学合成してもよい。代替的方法は、酵素的消化、例えば特定のアミノ酸残基によって決定される部位のタンパク質を切断することが知られた酵素でタンパク質を処理することにより、あるいは適当な制限酵素でDNAを消化して所望の断片を単離することによるPRO断片の生成を含む。更に他の好適な技術は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により、所望のポリペプチド断片をコードするDNA断片を単離し増幅することを含む。DNA断片の所望の末端を決定するオリゴヌクレオチドは、PCRの5’及び3’プライマーで用いられる。好ましくは、PROポリペプチド断片は、ここに開示した天然PROポリペプチドと少なくとも1つの生物学的及び/又は免疫学的活性を共有する。
(1)疎水性:ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile;
(2)中性の親水性:cys, ser, thr;
(3)酸性:asp, glu;
(4)塩基性:asn, gln, his, lys, arg;
(5)鎖配向に影響する残基:gly, pro; 及び
(6)芳香族:trp, tyr, phe。
変異は、オリゴヌクレオチド媒介(部位特異的)突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びPCR突然変異誘発等のこの分野で知られた方法を用いてなすことができる。部位特異的突然変異誘発[Carter等, Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller等, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)]、カセット突然変異誘発[Wells等, Gene, 34: 315 (1985)]、制限的選択突然変異誘発[Wells等, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)]、又は他の知られた技術をクローニングしたDNAに実施してPRO変異体DNAを作成することもできる。
また、隣接配列に沿って一又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である[Cunningham及びWells, Science, 244: 1081-1085 (1989)]。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい。更に、それは埋もれた及び露出した位置の両方に頻繁に見られることが多い[Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)]。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリック(isoteric)アミノ酸を用いることができる。
PROの共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有結合的修飾の一型は、PROポリペプチドの標的とするアミノ酸残基を、PROの選択された側鎖又はN-又はC-末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることを含む。二官能性試薬での誘導体化が、例えばPROを水不溶性支持体マトリクスあるいは抗PRO抗体の精製方法、及びその逆で用いるための表面に架橋させるのに有用である。通常用いられる架橋剤は、例えば、1,1-ビス(ジアゾアセチル)-2-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば4-アジドサリチル酸、3,3’-ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス-N-マレイミド-1,8-オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル-3-[(p-アジドフェニル)-ジチオ]プロピオイミダート等の試薬を含む。
他の修飾は、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル及びアスパルチルへの脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp.79-86 (1983)]、N末端アミンのアセチル化、及び任意のC末端カルボキシル基のアミド化を含む。
PROポリペプチドへのグリコシル化部位の付加はアミノ酸配列の変更を伴ってもよい。この変更は、例えば、一又は複数のセリン又はトレオニン残基の天然配列PRO(O-結合グリコシル化部位)への付加、又は置換によってなされてもよい。PROアミノ酸配列は、場合によっては、DNAレベルでの変化、特に、PROポリペプチドをコードするDNAを予め選択された塩基において変異させ、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成させることを通して変更されてもよい。
PROポリペプチド上に炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的又は酵素的結合による。このような方法は、この技術分野において、例えば、1987年9月11日に公開されたWO87/05330、及びAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)に記載されている。
PROポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に、あるいはグルコシル化の標的として提示されたアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によってなすことができる。化学的脱グリコシル化技術は、この分野で知られており、例えば、Hakimuddin等, Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)により、及びEdge等, Anal. Biochem., 118: 131 (1981)により記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura等, Meth. Enzymol. 138:350 (1987)に記載されているように、種々のエンド-及びエキソ-グリコシダーゼを用いることにより達成される。
また、本発明のPROポリペプチドは、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したPROを含むキメラ分子を形成する方法で修飾されてもよい。
一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとPROとの融合を含む。エピトープタグは、一般的にはPROのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このようなPROのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によってPROを容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ポリ-ヒスチジン(poly-his)又はポリ-ヒスチジン-グリシン(poly-his-gly)タグ;flu HAタグポリペプチド及びその抗体12CA5[Field等, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)];c-mycタグ及びそれに対する8F9、3C7、6E10、G4、B7及び9E10抗体[Evan等, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)];及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質D(gD)タグ及びその抗体[Paborsky等, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド[Hopp等, BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)];KT3エピトープペプチド[Martin等, Science, 255:192-194 (1992)];α-チューブリンエピトープペプチド[Skinner等, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)];及びT7遺伝子10タンパク質ペプチドタグ[Lutz-Freyermuth等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)]を含む。
以下の記述は、主として、PRO核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することによりPROを生産する方法に関する。もちろん、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてPROを調製することができると考えられる。例えば、PRO配列、又はその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生産してもよい[例えば、Stewart等, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969);Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)参照]。手動技術又は自動によるインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機(Foster City, CA)を用いて、製造者の指示により実施してもよい。PROの種々の部分は別々に化学的に合成され、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて全長PROを生産してもよい。
PROをコードするDNAは、mRNAを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたcDNAライブラリーから得ることができる。従って、ヒトPRODNAは、実施例に記載されるように、ヒトの組織から調製されたcDNAライブラリーから簡便に得ることができる。またPROコード化遺伝子は、ゲノムライブラリー、オリゴヌクレオチド合成、又は他の既知の合成方法(例えば、自動化核酸合成)により得ることもできる。
ライブラリーは、関心ある遺伝子あるいはそれによりコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ(例えば、PROに対する抗体又は少なくとも約20-80塩基のオリゴヌクレオチド)によってスクリーニングできる。選択されたプローブによるcDNA又はゲノムライブラリーのスクリーニングは、例えばSambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。PROをコードする遺伝子を単離する他の手段はPCR法を使用するものである[Sambrook等,上掲;Dieffenbach等, PCR Primer:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)]。
下記の実施例には、cDNAライブラリーのスクリーニング技術を記載している。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、充分な長さで、疑陽性が最小化されるよう充分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリー内のDNAとのハイブリッド形成時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野において良く知られており、32P標識されたATPのような放射線標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用が含まれる。中程度の緊縮性及び高度の緊縮性を含むハイブリッド形成条件は、上掲のSambrook等に与えられている。
タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、cDNAに逆転写されなかったmRNAの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrook等に記述されているような従来のプライマー伸展法を使用し、選択されたcDNA又はゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより得られる。
宿主細胞を、ここに記載したPRO生産のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された従来の栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、pH等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)及びSambrook等, 上掲に見出すことができる。
真核生物細胞形質移入及び原核生物細胞形質転換の方法、例えば、CaCl2、CaPO4、リポソーム媒介及びエレクトロポレーションは、通常、当業者に知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。上掲のSambrook等に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、一般的に原核生物に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shaw等, Gene, 23:315 (1983)及び1989年6月29日公開のWO 89/05859に記載されているように、或る種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法を使用することができる。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第4,399,216号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Van Solingen等, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、DNAを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いられる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keown等, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及び Mansour等, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。
PROをコードする核酸(例えば、cDNA又はゲノムDNA)は、クローニング(DNAの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、DNAはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、一又は複数のシグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の一又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
PROは直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのN-末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるPROコード化DNAの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、lppあるいは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母菌の分泌に関しては、シグナル配列は、例えば酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第5010182号に記載されている)、又は酸ホスフォターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(1990年4月4日公開のEP362179)、又は1990年11月15日に公開されたWO90/13646に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連ある種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選べるマーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)例えばバチルスの遺伝子コードD-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
哺乳動物細胞に適切な選択可能なマーカーの例は、DHFRあるいはチミジンキナーゼのように、PROコード化核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型DHFRを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaub 等により, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたDHFR活性に欠陥のあるCHO株化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドYRp7に存在するtrp1遺伝子である[Stinchcomb等, Nature, 282:39(1979);Kingsman等, Gene, 7:141(1979);Tschemper等, Gene, 10:157(1980)]。trp1遺伝子は、例えば、ATCC番号44076あるいはPEP4-1のようなトリプトファン内で成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する[Jones, Genetics, 85:12 (1977)]。
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、3-ホスホグリセラートキナーゼ[Hitzeman 等, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)]又は他の糖分解酵素[Hess 等, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968);Holland, Biochemistry, 17:4900(1987)]、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、3-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソチトクロムC、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースを利用する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に用いられるベクターとプロモータはEP 73,657に更に記載されている。
より高等の真核生物によるPROをコードするDNAの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約10から300塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するDNAのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製開始点の後期側のSV40エンハンサー(100-270塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、PROコード化配列の5'又は3'位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから5'位に位置している。
また真核生物宿主細胞(酵母菌、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びmRNAの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのDNA又はcDNAの通常は5'、時には3'の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、PROをコードするmRNAの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
組換え脊椎動物細胞培養でのPROの合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething等, Nature, 293:620-625 (1981); Mantei等, Nature, 281:40-46 (1979); EP117060; 及びEP117058に記載されている。
遺伝子増幅及び/又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりの、mRNAの転写を定量化するノーザンブロット法[Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)]、サザンブロット法、ドットブロット法(DNA分析)、又はインサイツハイブリッド形成法によって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、DNA二本鎖、RNA二本鎖及びDNA-RNAハイブリッド二本鎖又はDNA-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。次いで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び/又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列PROポリペプチドに対して、又はここで提供されるDNA配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はPRO DNAに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
PROの形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-X100)又は酵素的切断を用いて膜から引き離すことができる。PROの発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
PROを、組換え細胞タンパク又はポリペプチドから精製することが望ましい。次の手順が適切な精製手順の例である:すなわち、イオン交換カラムでの分画;エタノール沈殿;逆相HPLC;シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばDEAEによるクロマトグラフィー;クロマトフォーカシング;SDS-PAGE;硫酸アンモニウム沈殿;例えばセファデックスG-75を用いるゲル濾過;IgGのような汚染物を除くプロテインAセファロースカラム;及びPROのエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Deutscher, Method in Enzymology, 182 (1990);Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)に記載された種々のタンパク質精製方法を用いることができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生産方法及び特に生産される特定のPROの性質に依存する。
PROを発現させる組織の位置は、種々のヒト組織におけるmRNA発現を測定することにより特定可能である。このような遺伝子の位置により、PROポリペプチドの刺激及び阻害活性の影響を最も受けていると思われる組織の情報が提供される。また、特定の組織における遺伝子の位置により、以下で検討される活性阻止アッセイのための試料組織も提供される。
上記したように、種々の組織における遺伝子発現は、従来のサザンブロット、mRNAの転写の定量化のためのノーザンブロット(Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205 [1980])、ドットブロット(DNA分析)、又はインサイツハイブリッド形成により、ここに提供する配列に基づいて適切な標識プローブを用いて測定できる。あるいは、DNA二重鎖、RNA二重鎖、及びDNA-RNAハイブリッド二重鎖又はDNA-タンパク質二重鎖を含む特定の二重鎖を認識可能な抗体を用いてもよい。
あるいは、種々の組織における遺伝子発現は、遺伝子産物を直接定量化するための、組織断片の免疫組織学的染色、及び細胞培養物又は体液のアッセイ等の免疫学的方法によっても測定できる。免疫組織学的染色及び/又は試料液のアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の動物から調製される。便利には、抗体は天然配列PROポリペプチドに対して、又はPROポリペプチドをコードするDNA配列に基づく合成ペプチドに対して、又はPROポリペプチドをコードするDNAに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。抗体を生成する一般的技術、及びノーザンブロット及びインサイツハイブリッド形成の特定のプロトコールは以下に提供する。
PROポリペプチドの活性は、それぞれ、組織細胞上でのPROポリペプチドの効果を阻害する、抗PRO抗体の能力が試験される抗体結合性の研究によって更に証明できる。例示的な抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性、及びへテロ結合体抗体を含み、その調製は以下に記載する。
抗体結合性の研究は、競合的結合アッセイ、直接及び間接サンドウィッチアッセイ、及び免疫沈降アッセイなどの既知のアッセイ法で実施してよい。Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc., 1987)。
競合的結合アッセイは、標識標準物の、限られた量の抗体との結合について試験分析物と競合する能力による。試験試料中の標的タンパク質の量は、抗体に結合する標準物の量に逆比例する。結合する標準物の量の測定を促進するために、抗体は好ましくは競合の前又は後に不溶化し、抗体に結合した標準品及び分析物が未結合で残っている標準物及び分析物から容易に分離できるようにする。
サンドウィッチアッセイは2つの抗体の使用を含み、各々、検出されるタンパク質の異なる免疫原部分、又はエピトープに結合できる。サンドウィッチアッセイにおいて試験試料分析物は固体支持体上に固定化された第1の抗体に結合し、その後第2の抗体が分析物に結合し、よって不溶性の3成分複合体が形成される。例えば米国特許第4,376,110号参照。第2の抗体は検出可能部分で標識され(直接サンドウィッチアッセイ)、あるいは検出可能部分で標識された抗-免疫グロブリン抗体を用いて測定してもよい(間接サンドウィッチアッセイ)。例えば、サンドウィッチアッセイの一形態はELISAアッセイであり、この場合の検出可能部分は酵素である。
免疫組織学のために、組織試料は新鮮でも凍結したものでもよく、パラフィンに包埋して、例えばホルマリン等の保存剤で固定してもよい。
細胞ベースアッセイ及び乾癬等の免疫関連疾患の動物モデルは、ここで同定されたポリペプチドと遺伝子との関係、及び乾癬の進行及び病理との関係を更に理解するために使用することができる。
異なる方法では、乾癬に関わっていることが知られた細胞型の細胞をここに記載のcDNAで形質移入し、これらのcDNAの乾癬を刺激又は阻害する能力を分析する。適当な細胞を所望の遺伝子で形質移入し、機能活性を監視できる。このような形質移入株化細胞は、乾癬を刺激又は阻害するポリ-又はモノクローナル抗体又は抗体組成物の能力を試験するのに使用できる。ここに同定した遺伝子のコード化配列で形質移入した細胞は、更に、免疫関連疾患治療用の候補薬の同定に使用できる。
更に、(下記のような)トランスジェニック動物から誘導された一次培地は、ここでの細胞ベースアッセイに使用できるが、安定な株化細胞が好ましい。トランスジェニック動物から連続株化細胞を誘導する技術はこの分野で良く知られている(Small等, Mol. Cell. Biol. 5, 642-648 [1985]参照)。
更に、インビトロにおける細胞ベースアッセイの結果は、インビボ動物モデルを使用し、乾癬アッセイにより証明することができる。乾癬の進行及び病因におけるここに同定される遺伝子の役割を更に理解するために、そして抗体、及び小分子アンタゴニストを含む天然ポリペプチドの他のアゴニストを含む候補治療薬の有効性を試験するために、種々の良く知られた動物モデルが使用できる。これらのモデルのインビボ性質により、特にヒト患者における反応を予測できる。免疫関連疾患の動物モデルは、非組換え及び組換え(トランスジェニック)動物の両方を含む。非組換え動物モデルは、例えば、齧歯類、例えばマウスモデルを含む。このようなモデルは、標準的な技術、例えば、皮下注射、尾部静脈注射、脾臓移植、腹膜内移植、腎被膜下移植等により、細胞を同系マウスに導入することにより作成される。
移植片対宿主疾患は、免疫適格細胞が免疫抑制され又は耐性のある患者に移植された場合に生じる。ドナー細胞は宿主抗原を認識しそれに反応する。反応は生命に危険性のある重度の炎症から、下痢や体重の減少等の軽度のケースまで多様である。移植片対宿主疾患モデルはMHC抗原及び少量の移植抗原に対するT細胞反応性を評価する手段を提供する。適切な手順は上掲のCurrent Protocols in Immunology, unit4.3.に詳細に記載されている。
皮膚同種移植片拒絶のための動物モデルは、T細胞がインビボで組織の破壊を媒介する能力を試験する手段であり、移植拒絶におけるそれらの役割の指標である。最も一般的で容認されているモデルではマウスの尾の皮膚の移植片が使用される。繰り返し実験により、皮膚同種移植片拒絶がT細胞、ヘルパーT細胞及びキラー-エフェクターT細胞により媒介されるが、抗体では媒介されないことが分かった。Auchincloss, H. Jr.及びSachs, D.H., Fundamental Immunology, 2版, W.E.Paul編, Raven Press, NY, 1989, 889-992。適切な手順は上掲のCurrent Protocols in Immunology, unit4.4.に詳細に記載されている。本発明の化合物の試験に使用可能な他の移植拒絶モデルは、Tanabe, M.等, Transplantation(1994)58:23及びTinubu, S.A.等, J. Immunol.(1994)4330-4338により記載されている同種心臓移植片モデルである。
更に、本発明の化合物は乾癬用疾患の動物モデルにおいて試験することができる。T細胞が乾癬の病原であることを証拠が示唆している。本発明の化合物は、Schon. M.P.等, Nat. Med.(1997)3:183により記載されているscid/scidマウスモデルにおいて試験することができ、そのモデルではマウスは乾癬に類似した組織病理学的皮膚病巣を示す。他の適切なモデルはNickoloff, B.J.等, Am. J. Path.(1995)146:580に記載されているようにして調製されたヒトskin/scidマウスキメラである。
本発明の目的のために、トランスジェニック動物は、それらの細胞の一部にのみ導入遺伝子を有するもの(「モザイク動物」)を含む。導入遺伝子は、単一の導入遺伝子として、又はコンカテマー、例えば頭部と頭部又は頭部と尾部の直列型として組み込まれる。特定の細胞型への導入遺伝子の選択的導入も、例えば、Lasko等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6232-636 (1992)の技術に従って可能である。
トランスジェニック動物における導入遺伝子の発現は、標準的技術によって監視できる。例えば、導入遺伝子の組み込みの確認にサザンブロット分析又はPCR増幅が用いられる。次いで、mRNA発現のレベルは、インサイツハイブリッド形成、ノーザンブロット分析、PCR、又は免疫組織化学等の技術を用いて分析できる。
あるいは、動物の胚性細胞に導入されたポリペプチドをコードする変更ゲノムDNAと、その同じポリペプチドをコードする内在性遺伝子との間の相同的組換えの結果、ここに同定するポリペプチドをコードする欠陥又は変更遺伝子を有する「ノックアウト」動物を作成することができる。例えば、特定のポリペプチドをコードするcDNAは、確立された技術に従って当該ポリペプチドをコードするゲノムDNAのクローニングに使用できる。特定のポリペプチドをコードするゲノムDNAの一部を欠失したり、組み込みをモニターするために使用する選択可能なマーカーをコードする遺伝子等の他の遺伝子で置換することができる。典型的には、ベクターは無変化のフランキングDNA(5'と3'末端の両方)を数キロベース含む[例えば、相同的組換えベクターの記述についてはThomas and Capecchi, Cell, 51: 503 (1987)を参照のこと]。ベクターは胚性幹細胞に(例えばエレクトロポレーションによって)導入され、導入されたDNAが内在性DNAと相同的に組換えられた細胞を選択する[例えば、Li等, Cell,69:915 (1992)参照]。選択された細胞は次に動物(例えばマウス又はラット)の胚盤胞内に注入され、集合キメラを形成する[例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152参照]。その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、「ノックアウト」動物を作ると言われる。胚細胞に相同的に組換えられたDNAを有する子孫は標準的な技術により同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたDNAを含む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、ポリペプチドが存在しないことによるある種の病理的状態及び病理的状態の進行に対して防御する能力によって特徴付けられる。
一実施態様では、本発明の免疫刺激化合物は腫瘍(癌)治療における免疫アジュバント治療に使用することができる。T細胞がヒト腫瘍特異的抗原を認識することは十分に確立されている。遺伝子のMAGE、BAGE及びGAGEファミリーによりコードされる腫瘍抗原の一グループは全ての成人の正常組織において無症状であるが、腫瘍、例えばメラノーマ、肺腫瘍、頭部及び頸部の腫瘍、膀胱癌においては有意の量で発現している。DeSmet. C.等, (1996)Proc. Natl. Acad. Sci.93:7149。T細胞の同時刺激により、インビトロ及びインビボの双方において、腫瘍の退行及び抗腫瘍反応が誘発されることが示されている。Melero. I.等, Nature Medicine(1997)3:682;Kwon. E.D.等, Proc. Natl. Acad. Sci.USA(1997)94:8099;Lynch. D.H.等, Nature Medicine(1997)3:625;Finn. O.J.及びLotze. M.T., J. Immunol.(1998)21:114。本発明の刺激化合物はアジュバントとして単独で又は成長調節剤、細胞障害薬又は化学療法剤と共に投与することができ、T細胞増殖/活性化及び腫瘍抗原に対する抗腫瘍反応を刺激する。成長調節剤、細胞障害薬又は化学療法剤は既知の投与方法で使用されている従来からの量で投与することができる。本発明の化合物による免疫刺激活性により、成長調節剤、細胞障害薬又は化学療法剤の量を減らすことができ、よって、潜在的に患者に対する毒性を低下させることができる。
候補薬のスクリーニングアッセイは、ここで同定される遺伝子にコードされるポリペプチド、又はその生物学的に活性な断片と結合又は結合する化合物、あるいはコード化ポリペプチドと他の細胞性タンパク質との相互作用を阻害する化合物を同定するために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、特に小分子候補薬の同定に適したものにする、化学的ライブラリーの高スループットスクリーニングに従うアッセイを含む。考慮される小分子とは、合成有機又は無機化合物を含み、それらは、ペプチド、好ましくは可溶性ペプチド、(ポリ)ペプチド-免疫グロブリン融合体、特に、限定されないが、ポリ-及びモノクローナル抗体及び抗体断片、単鎖抗体、抗-イディオタイプ抗体、及びそれらの抗体又は断片のキメラ又はヒト化形、並びにヒト抗体及び抗体断片を含む抗体を含んでいる。アッセイは、種々の形式で実施でき、この分野で良く特徴付けられたタンパク質-タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ及び細胞ベースのアッセイを含む。全てのアッセイは、それらが候補薬をここで同定された核酸にコードされるポリペプチドと、これら2つの成分が相互作用するのに十分な条件下及び時間で接触させることを必要とすることにおいて共通する。
結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離されるか、又は反応混合物中で検出される。特別な実施態様では、ここに同定された遺伝子にコードされるポリペプチド、即ち候補薬が、共有又は非共有結合により固相、例えばマイクロタイタープレートに固定化される。非共有結合は、一般的に固体表面をポリペプチドの溶液で被覆し乾燥させることにより達成される。あるいは、固定化すべきポリペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を固体表面に固着させるために用いることができる。アッセイは、固定化成分、例えば固着成分を含む被覆表面に、検出可能な標識で標識されていてもよい非固定化成分を添加することにより実施される。反応が完了したとき、未反応成分を例えば洗浄により除去し、固体表面に固着した複合体を検出する。最初の非固定化成分が検出可能な標識を有している場合、表面に固定化された標識の検出は複合体形成が起こったことを示す。最初の非固定化成分が標識を持たない場合は、複合体形成は、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体によって検出できる。
ここで同定される遺伝子と他の細胞内又は細胞外成分との相互作用を阻害する化合物を見出すために、次のように試験することができる:通常は、遺伝子の生成物及び細胞内又は外成分を含む反応混合物を、条件下で2つの生成物が相互作用及び結合する時間に渡って調製する。試験化合物が結合を阻害する能力を試験するために、反応は試験化合物有り又は無しで実施する。更に、第3の反応混合物にプラシーボを添加してポジティブ対照としてもよい。混合物中に存在する試験化合物と細胞内又は外成分との結合(複合体形成)は上記のようにモニターする。対照反応において複合体が形成され、試験化合物を含む反応混合物ではしないことは、試験化合物が試験化合物とその反応パートナーとの相互作用を妨害することを示す。
乾癬の治療に有用な組成物は、限定するものではないが、例えば、T細胞の増殖/活性化、リンホカインの放出、又は免疫細胞の浸潤等の免疫機能を阻害するタンパク質、抗体、有機小分子、ペプチド、リンペプチド、アンチセンス及びリボザイム分子、三重螺旋分子等々を含む。
例えば、アンチセンスRNA及びRNA分子は、標的mRNAにハイブリッド形成してタンパク質翻訳を妨害することによりmRNAの翻訳を直接的に阻止するように作用する。アンチセンスDNAが用いられる場合、翻訳開始部位、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列のおよそ−10から+10位置の間から取り出されるオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
リボザイムは、RNAの特異的切断を触媒できる酵素的RNA分子である。リボザイムは、相補的標的RNAへの配列特異的ハイブリッド形成、次いでヌクレオチド鎖切断的切断により作用する。潜在的RNA標的内の特異的リボザイム切断部位は、既知の技術で同定できる。更なる詳細は、例えば、Rossi, Current Biology 4: 469-471 (1994)及びPCT公報、番号WO 97/33551(1997年9月18日公開)を参照のこと。
転写阻害に用いられる三重螺旋形成における核酸分子は単鎖でデオキシヌクレオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドの基本組成は、フーグスチン塩基対則を介する三重螺旋形成を促進するように設計され、それは一般に二重鎖の一方の鎖上のプリン又はピリミジンのサイズ変更可能な伸展を必要とする。更なる詳細は、例えば、PCT公報、番号WO 97/33551, 上掲を参照のこと。
これらの分子は、上記で議論したスクリーニングアッセイの任意のもの又は任意の組合せにより、及び/又は当業者に良く知られた他の任意のスクリーニング技術により同定できる。
本発明は更に抗PRO抗体を提供する。例示的な抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロ結合体抗体が含まれる。
1.ポリクローナル抗体
抗PRO抗体はポリクローナル抗体を含む。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫化剤、及び所望するのであればアジュバントを、一又は複数回注射することで発生させることができる。典型的には、免疫化剤及び/又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫化剤は、PROポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。免疫化剤を免疫化された哺乳動物において免疫原性が知られているタンパク質に結合させるのが有用である。このような免疫原タンパク質の例は、これらに限られないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びMPL-TDMアジュバント(モノホスホリル脂質A、合成トレハロースジコリノミコラート)が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。
あるいは、抗PRO抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫化剤により免疫化することで、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するかあるいは生成可能なリンパ球を誘発する。また、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
免疫化剤は、典型的にはPROポリペプチド又はその融合タンパク質を含む。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「PBL」)が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する[Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103]。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫株化細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培養培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠いていると、ハイブリドーマの培養培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含み(「HAT培地」)、この物質がHGPRT欠乏性細胞の増殖を阻止する。
次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、PROに対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(RIA)や酵素結合免疫測定法(ELISA)等のインビトロ結合検定法によって測定される。このような技術及びアッセイは、当該分野において既知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード分析法によって測定することができる。
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを制限希釈工程によりサブクローニングし、標準的な方法で成長させることができる[Goding, 上掲]。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びRPMI-1640倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として成長させることもできる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインA-セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。
一価抗体の調製にはインビトロ法がまた適している。抗体の消化による、その断片、特にFab断片の生成は、当該分野において知られている慣用的技術を使用して達成できる。
本発明の抗PRO抗体は、更にヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはその断片(例えばFv、Fab、Fab'、F(ab')2あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(CDR)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のCDRの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたCDRもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのCDR領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのFR領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる[Jones等, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann等, Nature, 332:323-329 (1988); 及びPresta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593-596 (1992)]。
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的に齧歯動物のCDR又はCDR配列でヒト抗体の該当する配列を置換することによりウィンター(Winter)及び共同研究者[Jones等, Nature, 321:522-525 (1986);Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988);Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988)]の方法に従って実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのCDR残基及び場合によっては幾つかのFR残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
また、抗体は上述した既知の選択及び/又は突然変異誘発法を使用し、親和成熟させてもよい。好ましい親和成熟抗体は、成熟抗体が調製された(一般的にマウス、ヒト化又はヒトの)出発抗体のものよりも、5倍、より好ましくは10倍、更に好ましくは20又は30倍の親和性を有する。
二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本ケースにおいて、結合特異性の一方はPROに対してであり、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに対してである。
二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖/軽鎖対の同時発現に基づく[Milstein及びCuello, Nature, 305:537-539(1983)]。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は10種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順が1993年5月13日公開のWO93/08829、及びTraunecker等, EMBO J.,10:3655-3659 (1991)に開示されている。
所望の結合特異性(抗体-抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、CH2及びCH3領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(CH1)を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするDNA、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を作成するための更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210(1986)を参照されたい。
二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片(例えば、F(ab')2二重特異性抗体)として調製できる。抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等, Science, 229:81 (1985) は無傷の抗体をタンパク分解性に切断してF(ab')2断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたFab'断片はついでチオニトロベンゾアート(TNB)誘導体に転換される。Fab'-TNB誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりFab'-チオールに再転換し、他のFab'-TNB誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
大腸菌からFab'断片を直接回収でき、これは化学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Shalaby等, J. Exp. Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体F(ab')2分子の製造を記述している。各Fab'断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。このようにして形成された二重特異性抗体は、正常なヒトT細胞及びErbB2レセプターを過剰発現する細胞に結合可能で、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の細胞溶解活性の誘因となる。
例示的な二重特異性抗体は、ここに与えられたPROポリペプチドの2つの異なるエピトープに結合しうる。あるいは、抗PROポリペプチドアームは、特定のPROポリペプチド発現細胞に細胞防御メカニズムを集中させるように、T細胞レセプター分子(例えばCD2、CD3、CD28、又はB7)等の白血球上のトリガー分子又はFcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)及びFcγRIII(CD16)等のIgG(FcγR)に対するFcレセプターに結合するアームと結合しうる。また、二重特異性抗体は特定のPROポリペプチドを発現する細胞に細胞障害薬を局在化させるためにも使用されうる。これらの抗体はPRO-結合アーム及び細胞障害薬又は放射性キレート化剤、例えばEOTUBE、DPTA、DOTA、又はTETAと結合するアームを有する。関心ある他の二重特異性抗体はPROポリペプチドに結合し、そして更に組織因子(TF)に結合する。
ヘテロ結合抗体も本発明の範囲内に入る。ヘテロ結合抗体は2つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため[米国特許第4,676,980号]及びHIV感染の治療のために[WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089]提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル-4-メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第4676980号に開示されているものが含まれる。
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えば癌の治療における抗体の有効性を向上させるのが望ましい。例えば、システイン残基をFc領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成させるようにしてもよい。そのようにして生成されたホモダイマー抗体は、向上した内部移行能力及び/又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体-依存性細胞性細胞毒性(ADCC)を有しうる。Caron等, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)参照。向上した抗腫瘍活性を持つホモダイマー抗体はまた、Wolff等, Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)に記載されたような異種二官能性架橋を用いても調製しうる。あるいは、抗体は、2つのFc領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びADCC能力を向上させることもできる。Stevenson等, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)参照。
本発明はまた、化学療法剤、毒素(例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はその断片)などの細胞障害薬、あるいは放射性同位体(即ち、放射性結合)に結合された抗体を含む免疫複合体にも関する。
このような免疫結合体の生成に有用な化学療法剤は上記した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片は、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、(緑膿菌からの)外毒素A鎖、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデクシン(modeccin)A鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質(PAPI、PAPII、及びPAP-S)、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)を含む。様々な放射性ヌクレオチドが放射性結合抗体の生成に利用可能である。例として、212Bi、131I、131In、90Y及び186Reを含む。
抗体及び細胞障害薬の結合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオール)プロピオネート(SPDP)、イミノチオラン(IT)、イミドエステルの二官能性誘導体(ジメチルアジピミデートHCL等)、活性エステル(ジスクシンイミジルスベレート等)、アルデヒド(グルタルアルデヒド等)、ビス-アジド化合物(ビス(p-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等)、ビス-ジアゾニウム誘導体(ビス-(p-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等)、ジイソシアネート(トリエン2,6-ジイソシアネート等)、及びビス-活性フッ素化合物(1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン等)を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238: 1098 (1987)に記載されたように調製することができる。カーボン-14-標識1-イソチオシアナトベンジル-3-メチルジエチレントリアミン五酢酸(MX-DTPA)は、放射性ヌクレオチドの抗体への結合のためのキレート剤の例である。WO94/11026参照。
他の実施態様では、腫瘍の予備標的化で使用するために、抗体は「レセプター」(ストレプトアビジン等)に結合されてもよく、抗体-レセプター結合体は患者に投与され、次いで清澄化剤を用いて未結合結合体を循環から除去し、次に細胞障害薬(放射性ヌクレオチド等)に結合された「リガンド」(アビジン等)を投与する。
また、ここに開示するタンパク質、抗体は、免疫リポソームとして調製してもよい。抗体を含むリポソームは、Epstein等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang等, Proc. natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); 及び米国特許第4,485,045号及び同第4,544,545号に記載されたような、この分野で知られた方法で調製される。向上した循環時間を持つリポソームは、米国特許第5,013,556号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びPEG-誘導ホスファチジルエタノールアミン(PEG-PE)を含む脂質組成物での逆相蒸発法によって生成される。リポソームは、定められた孔サイズのフィルターを通して押し出され、所望の径を有するリポソームが生成される。本発明の抗体のFab’断片は、Martin等, J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)に記載されているように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに結合され得る。化学療法剤(ドキソルビシン等)は、場合によってはリポソーム内に包含される。Gabizon等, J. National Cancer Inst. 81(19) 1484 (1989)参照。
本発明の活性PRO分子(例えばPROポリペプチド、抗PRO抗体、及び/又はその変異体)、並びに上述のスクリーニングアッセイで同定された他の分子は、乾癬の治療のために、製薬組成物の形態で投与することができる。
本発明の活性PRO分子、好ましくはポリペプチド又は抗体の治療用製剤は、所望される程度の純度を持つ活性分子を、親油性製剤又は水性溶液の形態で、任意の製薬上許容される担体、賦形剤又は安定化剤と混合することにより調製され保存される(Remington's Pharmaceutical Science 16th edition, Osol, A. Ed. [1980])。許容される担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度で受容者に非毒性であり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などのバッファー;アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤;防腐剤(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;ヘキサメトニウムクロリド;ベンズアルコニウムクロリド;ベンズエトニウムクロリド;フェノール;ブチル又はベンジルアルコール;メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;及びm-クレゾールなど);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質;ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン等のアミノ酸;グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物;EDTA等のキレート剤;スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖;ナトリウムなどの塩形成対イオン;金属錯体(例えば、Zn-タンパク質錯体);及び/又はトゥイーン(TWEEN)(商品名)、プルロニクス(PLURONICS)(商品名)、又はポリエチレングリコール(PEG)等の非イオン性界面活性剤を含む。
リポフェクション又はリポソームもPRO分子を細胞に送達するのに使用できる。抗体断片が用いられる場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小阻害断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持したペプチド分子が設計できる。このようなペプチドは、化学的に合成でき、及び/又は組換えDNA技術によって生成できる。(例えば、Marasco等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 [1993]を参照のこと)。
ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に1以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、細胞障害薬、サイトカイン又は成長阻害剤を含んでもよい。これらの分子は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
また、活性PRO分子は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ(メタクリル酸メチル)マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)中、又はマイクロエマルション中に包括されていてもよい。これらの技術は、Remington's Pharmaceutical Science 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなけらばならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
本発明のポリペプチド、抗体及び他の活性物質は、組織への炎症細胞の浸潤によって特徴付けられるものを含む、T細胞媒介疾患等の乾癬及びそれに関連する病状を治療するために使用できると考えられる。
脊椎関節症は、いくつかの共通した臨床的特徴とHLA-B27遺伝子産物の発現との共通の関連性を持つ疾患のグループである。該疾患には:強直性脊椎炎、ライター症候群(反応性関節炎)、炎症性大腸疾患に関連した関節炎、乾癬に関連した脊椎炎、若年発生脊椎関節症及び未分化脊椎関節症が含まれる。区別する特徴には、脊椎炎を伴うか伴わない仙腸関節炎;炎症非対称性関節炎;HLA-B27(クラスI MHCのHLA-B座位にある血清学的に定義された対立遺伝子)との関連;眼の炎症、及び他のリウマチ疾患に関連した自己抗体の不在が含まれる。疾患の誘導に対する鍵として最も関わっている細胞はCD8+Tリンパ球で、クラスI MHC分子により提示される抗原を標的としている細胞である。CD8+T細胞は、MHCクラスI分子により発現された外来ペプチドであるかのように、クラスI MHC対立遺伝子HLA-B27に対して反応する。HLA-27のエピトープが細菌性又は他の微生物の抗原性エピトープを模倣し、よってCD8+細胞の反応を誘発すると仮定されている。
全身性硬化症(強皮症)は病因がよく知られていない。疾患の顕著な特徴は皮膚の硬結であり;これは活性な炎症プロセスにより誘発されると思われる。強皮症は局部的又は全身性であり:血管病巣が共通しており、微小血管系における内皮細胞傷害が全身性硬化症の発達における初期の重要な事象であり;血管傷害は免疫媒介されうる。免疫学的基準は、皮膚病巣における単核細胞浸潤の存在と、多くの患者において抗細胞核抗体の存在によって導かれる。多くの場合、ICAM-1が皮膚病巣の線維芽細胞の細胞表面でアップレギュレーションされ、これらの細胞とのT細胞の相互作用が疾患の病因においてある役割を担っていることが示唆される。関連する他の器官には:胃腸管:萎縮症及び線維症があり、結果として異常なぜん動/運動性となっている平滑筋:腎臓:小弓形及び小葉間動脈に影響を及ぼし、結果として腎皮質の血流が低下し、タンパク尿、高窒素血尿及び高血圧になる同心性内皮下内膜増殖:骨格筋:萎縮、間質性線維症:炎症:肺:間質性肺炎及び間質性線維症:及び心臓:収縮バンド壊死、瘢痕/線維症が含まれる。
乾癬はTリンパ球媒介炎症疾患であるとされている。病巣にはTリンパ球、マクロファージ及び抗原プロセシング細胞及びある種の好中球の浸潤が含まれる。
拒絶反応及び移植片対宿主疾患(GVHD)を含む移植関連疾患はTリンパ球依存性であり;Tリンパ球の機能を阻害することで改善される。
免疫アジュバント治療、他の治療的養生法において、抗癌剤を、本発明のタンパク質、抗体又は化合物の投与と組み合わせて投与してもよい。例えば、本発明の免疫アジュバントで治療される患者は、抗癌剤(化学療法剤)又は放射線治療を受けてもよい。このような化学療法剤の調製法及び用量スケジュールは、製造者の指示に従って使用されるか、熟練した実務者により経験的に決定される。そのような化学療法に対する調製法及び用量スケジュールはまたChemotherapy Service M.C. Perry編, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)にも記載されている。化学療法剤は、免疫アジュバントの投与に先立って、又は続いて投与してもよく、あるいはそれらと同時に投与してもよい。加えて、タモキシフェン等の抗エストロゲン化合物又はオナプリストンなどの抗プロゲステロン(EP 616812参照)を、それらの分子について知られた用量で付与してもよい。
重篤な免疫関連疾患の治療又は低減のための、本発明の化合物の適切な用量は、上記で定義したような治療される疾患の型、疾患の重篤さ及び経過、防止又は治療目的で薬剤が投与されるか否か、従前の治療、患者の臨床履歴及び化合物に対する反応、及び主治医の裁量に依存する。化合物は、適切には患者に一回又は一連の治療に渡って適切に投与される。
例えば、疾患の型及び重篤さに応じて、約1μg/kgから15mg/kg(例えば、0.1-20mg/kg)のポリペプチド又は抗体が、例えば、一又はそれ以上の別々の投与あるいは連続注入のいずれにしても、患者に投与するための最初の候補用量である。典型的な1日の用量は、上記の要因に応じて、約1μg/kgから100mg/kgの範囲又はそれ以上であろう。数日以上に渡る繰り返し投与のためには、状態に応じて、疾患の徴候に所望の抑制が現れるまで治療が続けられる。しかしながら、他の用量計画が有用であることもある。この治療の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易に監視される。
本発明の他の実施態様では、上記の疾患の診断又は治療に有用な物質(例えばPRO分子を含有するもの)を含む製造品が提供される。この製造品は容器と使用説明書とを含んでなる。好適な容器は、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、及び試験管を含む。容器は、ガラス又はプラスチックなどの種々の材料から形成されてよい。容器は、状態を診断し治療するのに有効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る(例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい)。組成物中の活性剤は通常、本発明のポリペプチド又は抗体である。容器上又は添付される使用説明書又はラベルは、組成物が選択した状態の診断又は治療のために使用されることを示す。製造品は更に、リン酸緩衝塩水、リンガー液及びデキストロース溶液などの製薬的に許容されるバッファーを含む第2の容器を具備してもよい。更に、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用上の指示を付けたパッケージ挿入物を含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
乾癬で過剰発現されるタンパク質等の細胞表面タンパク質は候補薬剤又は疾患治療の優れた標的である。同じタンパク質は乾癬で増幅された遺伝子にコードされる分泌タンパク質とともに、この疾病の診断及び予知における用途が見出される。例えば、乾癬で増幅された遺伝子のタンパク質産物に対する抗体は診断又は予知として使用できる。
例えば、抗体断片を含む抗体は、増幅又は過剰発現された遺伝子にコードされるタンパク質(「マーカー遺伝子産物」)の発現の定性的又は定量的検出に用いることができる。抗体は、好ましくは検出可能な、例えば蛍光標識を備え、結合は光学顕微鏡、フローサイトメトリー、フルオロメトリー、又はこの分野で知られた他の技術によって監視できる。これらの技術は、過剰発現した遺伝子が細胞表面タンパク質をコードする場合に特に適切である。このような結合アッセイは、本質的に上述したように実施される。
マーカー遺伝子産物に結合する抗体のインサイツ検出は、例えば、免疫蛍光又は免疫電子顕微鏡によって実施できる。この目的のために、組織学的試料を患者から取り出し、好ましくは生物学的試料に抗体を被せることにより、標識抗体をそれに適用する。この手法はまた、試験される組織におけるマーカー遺伝子産物の分布も決定できるようにする。当業者には、インサイツ検出のために広範な組織学的方法が容易に利用できることは明らかであろう。
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
本明細書で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに取り込む。
乾癬患者及び健常ドナー(「正常な皮膚」)由来の皮膚バイオプシーを用意した。各乾癬患者からは、乾癬組織に差別的に発現するこの疾患に特異的な遺伝子を同定するため、病変部位と非病変部位から皮膚試料を採取した。乾癬皮膚試料のすべてについて、免疫組織化学によるケラチン16染色と上皮の厚さを分析した。RNA単離の準備が整うまで、すべての試料を−70℃で保存した。皮膚バイオプシーを600μlのRLT緩衝液(+BME)で均質化し、製造者の指示に従うオンカラムDNase処理を行うQiagen(登録商標)Rneasy Miniカラム(Qiagen)を用いてRNAを単離した。RNAを単離した後、製造者の指示に従ってRiboGreen(登録商標)を用いてRNAを定量化し、完全性をアガロースゲルでチェックした。RNAの収量は、乾癬病変皮膚では19〜54μg、同一の対照の非病変皮膚では7.7〜24μg、正常な皮膚では5.4〜10μgであった。マイクロアレイ分析用に4μgのRNAに標識し、試料をジェネンテック社専売のマイクロアレイとAffymetricsマイクロアレイにかけた。感染皮膚において発現が上方制御された遺伝子を非病変皮膚と比較し、よって同じ患者由来の非病変皮膚と乾癬皮膚における発現特性を比較した。また、更なる対照として正常で健常なドナー由来の正常な皮膚バイオプシーとの比較も行った。本実験の結果、同じ乾癬患者の非病巣皮膚、及び乾癬を有しない対象由来の正常皮膚と比較して、乾癬病変皮膚において図1〜2484の核酸及びコードされたタンパク質が異なって発現することが示された。図13、図336、図393、図477、図513、図593、図853、図1004、図1283、図1730、図1861、及び図2227の核酸及びコードされたタンパク質は、同じ乾癬患者の非病巣皮膚、及び乾癬を有しない対象由来の正常皮膚と比較して、乾癬病変皮膚において有意に過剰発現した。
以下の方法は、PROをコードするヌクレオチド配列のハイブリッド形成プローブとしての使用を記載する。
全長又は成熟PROのコード配列を含むDNAは、ヒト組織cDNAライブラリー又はヒト組織ゲノムライブラリーにおける同種DNA類(PROの自然に生じる変異体をコードするものなど)のスクリーニングのためのプローブとして用いられる。
いずれかのライブラリーDNAを含むフィルターのハイブリッド形成及び洗浄は、以下の高い緊縮条件で実施した。放射性標識PRO-誘導プローブのフィルターへのハイブリッド形成は、50%ホルムアミド、5xSSC、0.1%SDS、0.1%ピロリン酸ナトリウム、50mMリン酸ナトリウム、pH6.8、2xデンハート液、及び10%デキストラン硫酸の溶液中で、42℃において20時間行った。フィルターの洗浄は0.1xSSC及び0.1%SDSの水溶液中、42℃で行った。
次いで、全長天然配列PROをコードするDNAと所望の配列同一性を有するDNAは、この分野で知られた標準的な方法を用いて同定できる。
この実施例は、大腸菌における組み換え発現によるPROの非グリコシル化形態の調製を例示する。
PROをコードするDNA配列は、選択されたPCRプライマーを用いて最初に増幅する。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位を持たなければならない。種々の発現ベクターを用いることができる。好適なベクターの例は、pBR322(大腸菌から誘導されたもの;Bolivar等, Gene, 2:95 (1977)を参照)であり、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性についての遺伝子を含む。ベクターは制限酵素で消化され、脱リン酸化される。PCR増幅した配列は、次いで、ベクターに結合させる。ベクターは、好ましくは抗生物質耐性遺伝子、trpプロモーター、polyhisリーダー(最初の6つのSTIIコドン、polyhis配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を含む)、PROコード化領域、ラムダ転写終結区、及びargU遺伝子を含む。
ライゲーション混合物は、次いで、上掲のSambrook等に記載された方法を用いた選択した大腸菌株の形質転換に使用される。形質転換体は、それらのLBプレートで成長する能力により同定され、次いで抗生物質耐性クローンが選択される。プラスミドDNAが単離され、制限分析及びDNA配列分析で確認される。
選択されたクローンは、抗生物質を添加したLBブロスなどの液体培地で終夜成長させることができる。終夜培養は、続いて大規模培養の播種に用いられる。次に細胞を最適光学密度まで成長させ、その間に発現プロモーターが作動する。
更に数時間の培養の後、細胞を遠心分離して採集することができる。遠心分離で得られた細胞ペレットは、この分野で知られた種々の試薬を用いて可溶化され、次いで可溶化PROタンパク質を金属キレート化カラムを用いてタンパク質を緊密に結合させる条件下で精製することができる。
0.5から1Lの発酵(6−10gペレット)からの大腸菌ペーストを、7Mのグアニジン、20mMのトリス、pH8バッファー中で10容量(w/v)で再懸濁させる。固体硫酸ナトリウム及びテトラチオン酸ナトリウムを添加して最終濃度を各々0.1M及び0.02Mとし、溶液を4℃で終夜撹拌する。この工程により、亜硫酸化によりブロックされた全てのシステイン残基を持つ変性タンパク質がもたらされる。溶液をBeckman Ultracentrifuge中で40000rpmで30分間遠心分離する。上清を金属キレートカラムバッファー(6Mのグアニジン、20mMのトリス、pH7.4)の3−5容量で希釈し、0.22ミクロンフィルターを通して濾過して透明化する。透明化抽出物を、金属キレートカラムバッファーで平衡化させた5mlのQiagen Ni-NTA金属キレートカラムに充填する。カラムを50mMのイミダゾール(Calbiochem, Utrol grade)を含む添加バッファー、pH7.4で洗浄する。タンパク質を250mMのイミダゾールを含有するバッファーで溶離する。所望のタンパク質を含有する画分をプールし、4℃で保存する。タンパク質濃度は、そのアミノ酸配列に基づいて計算した吸光係数を用いて280nmにおけるその吸収により見積もる。
所望の折りたたまれたPROポリペプチドタンパク質を含有する画分をプールし、溶液に向けた窒素の弱い気流を用いてアセトニトリルを除去する。タンパク質を、透析又は調製バッファーで平衡化したG25 Superfine(Pharmacia)樹脂でのゲル濾過及び滅菌濾過により、0.14Mの塩化ナトリウム及び4%のマンニトールを含む20mMのHepes、pH6.8に処方した。
上述したように、ここに開示された多くのPROポリペプチドが成功裏に発現した。
この実施例は、哺乳動物細胞における組み換え発現による潜在的にグリコシル化した形態のPROの調製を例示する。
発現ベクターとしてベクターpRK5(1989年3月15日公開のEP 307,247参照)を用いる。場合によっては、PRODNAを選択した制限酵素を持つpRK5に結合させ、上掲のSambrook等に記載されたようなライゲーション方法を用いてPRODNAを挿入させる。得られたベクターは、例えばpRK5-PROと呼ばれる。
一実施態様では、選択された宿主細胞は293細胞とすることができる。ヒト293細胞(ATCC CCL 1573)は、ウシ胎児血清及び場合によっては滋養成分及び/又は抗生物質を添加したDMEMなどの培地中で組織培養プレートにおいて成長させて集密化する。約10μgのpRK5-PRODNAを約1μgのVARNA遺伝子コード化DNA[Thimmappaya等, Cell, 31:543 (1982)]と混合し、500μlの1mMトリス−HCl、0.1mMEDTA、0.227MCaCl2に溶解させる。この混合物に、滴状の、500μlの50mMHEPES(pH7.35)、280mMのNaCl、1.5mMのNaPO4を添加し、25℃で10分間析出物を形成させる。析出物を懸濁し、293細胞に加えて37℃で約4時間定着させる。培地を吸引し、2mlのPBS中20%グリセロールを30秒間添加する。293細胞を、次いで無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加し、細胞を約5日間インキュベートする。
形質移入の約24時間後、培地を除去し、培地(のみ)又は200μCi/ml35S-システイン及び200μCi/ml35S−メチオニンを含む培地で置換する。12時間のインキュベーションの後、条件培地を回収し、スピンフィルターで濃縮し、15%SDSゲルに充填する。処理したゲルを乾燥させ、PROポリペプチドの存在を現す選択された時間にわたってフィルムにさらす。形質移入した細胞を含む培地に、更なるインキュベーションを施し(無血清培地で)、培地を選択されたバイオアッセイで試験する。
他の実施態様では、PROをCHO細胞で発現させることができる。pRK5-PROは、CaPO4又はDEAE−デキストランなどの既知の試薬を用いてCHO細胞に形質移入することができる。上記したように、細胞培地をインキュベートし、培地を培養培地(のみ)又は35S-メチオニン等の放射性標識を含む培地に置換することができる。PROポリペプチドの存在を決定した後、培地を無血清培地に置換してもよい。好ましくは、培地を約6日間インキュベートし、次いで条件培地を収集する。次いで、発現されたPROを含む培地を濃縮して、任意の選択した方法によって精製することができる。
また、エピトープタグPROは、宿主CHO細胞において発現させてもよい。PROはpRK5ベクターからサブクローニングしてもよい。サブクローン挿入物は、PCRを施してバキュロウイルス発現ベクター中のポリ-Hisタグ等の選択されたエピトープタグを持つ枠に融合できる。関心あるポリ-hisタグPRO挿入物は、次いで、安定なクローンの選択のためのDHFR等の選択マーカーを含むSV40プロモーター/エンハンサーにサブクローニングできる。最後に、CHO細胞をベクターを含むSV40プロモーター/エンハンサーで(上記のように)形質移入することができる。発現を確認するために、上記のように標識化を行ってもよい。発現されたポリ-hisタグPROを含む培地を次いで濃縮し、Ni2+−キレートアフィニティクロマトグラフィー等の選択された任意の方法により精製できる。
またPROは、一過性発現法によりCHO及び/又はCOS細胞で、又は他の安定な発現方法によりCHO細胞で発現させてもよい。
PCR増幅に続いて、それぞれのDNAを、Ausubel等, Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley and Sons (1997)に記載されたような標準的技術を用いてCHO発現ベクターにサブクローニングする。CHO発現ベクターは、関心あるDNAの5’及び3’に適合する制限部位を有し、cDNAの便利なシャトル化ができるように作成される。CHO細胞における発現に使用されたベクターは、Lucas等, Nucl. Acids Res. 24: 9, 1774-1779 (1996)に記載されたようなものであり、関心あるcDNA及びジヒドロフォレートレダクターゼ(DHFR)の発現の制御にSV40初期プロモーター/エンハンサーを用いる。DHFR発現は、形質移入に続くプラスミドの安定な維持のための選択を可能にする。
所望のプラスミドDNAの12マイクログラムを、市販の形質移入試薬Superfect(登録商標)(Quiagen), Dosper(登録商標)及びFugene(登録商標)(Boehringer Mannheim)を使用し約一千万のCHO細胞に導入する。細胞は、上掲のLucas等に記載されているように成長させる。約3x10−7細胞を、下記のような更なる成長及び生産のためにアンプル中で凍結させる。
プラスミドDNAを含むアンプルを水槽に配して解凍し、ボルテックスにより混合する。内容物を10mLの媒質を含む遠心管にピペットして、1000rpmで5分間遠心分離した。上清を吸引して細胞を10mLの選択培地(0.2μm濾過PS20、5%の0.2μm透析濾過ウシ胎児血清)中に懸濁させる。次いで細胞を90mLの選択培地を含む100mlスピナーに分ける。1−2日後、細胞を150mLの選択培地を満たした250mLスピナーに移し、37℃でインキュベートする。更に2−3日後、250mL、500mL及び2000mLのスピナーを3x105細胞/mLで播種する。細胞培地を遠心分離により新鮮培地に交換し、生産培地に再懸濁させる。任意の適切なCHO培地を用いてもよいが、実際には1992年6月16日に発行された米国特許第5122469号に記載された生産培地を使用した。3Lの生産スピナーを1.2x106細胞/mLで播種する。0日目に、pHを測定する。1日目に、スピナーをサンプルし、濾過空気での散布を実施する。2日目に、スピナーをサンプルし、温度を33℃に変え、500g/Lのグルコース及び0.6mLの10%消泡剤(例えば35%ポリジメチルシロキサンエマルション、Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion)の30mLとする。生産を通して、pHを7.2近傍に調節し維持した。10日後、又は生存率が70%を下回るまで、細胞培地を遠心分離で回収して0.22μmフィルターを通して濾過する。濾過物を、4℃で貯蔵するか、即座に精製用カラムに充填する。
イムノアドヘシン(Fc含有)作成物を以下のようにして条件培地から精製する。条件培地を、20mMのリン酸ナトリウムバッファー、pH6.8で平衡化した5mlのプロテインAカラム(Pharmacia)に汲み上げる。充填後、100mMのクエン酸、pH3.5で溶離する前に、カラムを平衡バッファーで強く洗浄する。溶離したタンパク質を、1mlの画分を275μlの1Mトリスバッファー、pH9を含む管に回収することにより即座に中性化する。高度に精製されたタンパク質を、続いてポリ-Hisタグタンパク質について上記した貯蔵バッファー中で脱塩する。均一性はSDSポリアクリルアミドゲルとエドマン(Edman)分解によるN-末端アミノ酸配列決定により評価した。
ここに開示したPROポリペプチドの多くが上記のようにして成功裏に発現された。
以下の方法は、酵母菌中でのPROの組換え発現を記載する。
第1に、ADH2/GAPDHプロモーターからのPROの細胞内生産又は分泌のための酵母菌発現ベクターを作成する。PROをコードするDNA及びプロモーターを選択したプラスミドの適当な制限酵素部位に挿入してPROの細胞内発現を指示する。分泌のために、PROをコードするDNAを選択したプラスミドに、ADH2/GAPDHプロモーターをコードするDNA、天然配列PROシグナルペプチド又は他の哺乳動物シグナルペプチド、又は、例えば酵母菌アルファ因子又はインベルターゼ分泌シグナル/リーダー配列、及び(必要ならば)PRO発現のためのリンカー配列とともにクローニングすることができる。
酵母菌株AB110等の酵母菌を、次いで上記の発現プラスミドで形質転換し、選択された発酵培地中で培養できる。形質転換した酵母菌上清を、10%トリクロロ酢酸での沈降及びSDS-PAGEによる分離で分析し、次いでクマシーブルー染色でゲルの染色をすることができる。
続いて組換えPROは、発酵培地から遠心分離により酵母菌細胞を除去し、次いで選択されたカートリッジフィルターを用いて培地を濃縮することによって単離及び精製できる。PROを含む濃縮物は、選択されたカラムクロマトグラフィー樹脂を用いて更に精製してもよい。
ここに開示されるPROポリペプチドの多くが上記のようにして成功裏に発現された。
以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞中におけるPROの組換え発現を記載する。
PROをコードする配列を、バキュロウイルス発現ベクターに含まれるエピトープタグの上流に融合させる。このようなエピトープタグは、ポリ-hisタグ及び免疫グロブリンタグ(IgGのFc領域など)を含む。pVL1393(Novagen)などの市販されているプラスミドから誘導されるプラスミドを含む種々のプラスミドを用いることができる。簡単には、PROをコードする配列又はPROのコード配列の所望部分、例えば膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列又はタンパク質が細胞外である場合の成熟タンパク質をコードする配列が、5’及び3’領域に相補的なプライマーでのPCRにより増幅される。5’プライマーは、側方に位置する(選択された)制限酵素部位を包含していてもよい。生産物は、次いで、選択された制限酵素で消化され、発現ベクターにサブクローニングされる。
組換えバキュロウイルスは、上記のプラスミド及びBaculoGold(商品名)ウイルスDNA(Pharmingen)を、Spodoptera frugiperda(「Sf9」)細胞(ATCC CRL 1711)中にリポフェクチン(GIBCO-BRLから市販)を用いて同時形質移入することにより作成される。28℃で4−5日インキュベートした後、放出されたウイルスを回収し、更なる増幅に用いる。ウイルス感染及びタンパク質発現は、O'Reilley等, Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)に記載されているように実施する。
あるいは、IgGタグ(又はFcタグ)PROの精製は、例えば、プロテインA又はプロテインGカラムクロマトグラフィーを含む既知のクロマトグラフィー技術を用いて実施できる。
ここに開示されるPROポリペプチドの多くが上記のようにして成功裏に発現された。
この実施例は、PROに特異的に結合できるモノクローナル抗体の調製を例示する。
モノクローナル抗体の生産のための技術はこの分野で知られており、例えば、上掲のGodingに記載されている。用いられ得る免疫原は、本発明の精製PRO、PROを含む融合タンパク質、及び細胞表面にPROを発現する細胞を含む。免疫原の選択は、当業者が過度の実験をすることなくなすことができる。
Balb/c等のマウスを、完全フロイントアジュバントに乳化して皮下又は腹腔内に1−100マイクログラムの量で注入したPRO免疫原で免疫化する。あるいは、免疫原をMPL−TDMアジュバント(Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT)に乳化し、動物の後足蹠に注入する。免疫化したマウスを、次いで10から12日後に、選択したアジュバント中に乳化した付加的免疫源で追加免疫する。その後、数週間、マウスを更なる免疫化注射で追加免疫する。抗PRO抗体の検出のためのELISAアッセイで試験するために、レトロオービタル出血からの血清試料をマウスから周期的に採取してもよい。
適当な抗体力価が検出された後、抗体に「ポジティブ(陽性)」な動物に、PROの最後の静脈内注射を注入することができる。3から4日後、マウスを屠殺し、脾臓細胞を取り出す。次いで脾臓細胞を(35%ポリエチレングリコールを用いて)、ATCC番号CRL1597で入手可能なP3X63AgU.1等の選択されたマウス骨髄腫株化細胞に融合させる。融合によりハイブリドーマ細胞が生成され、次いで、HAT(ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン)培地を含む96ウェル組織培養プレートに蒔き、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害する。
ハイブリドーマ細胞を、PROに対する反応性についてELISAでスクリーニングする。PROに対する所望のモノクローナル抗体を分泌する「ポジティブ(陽性)」ハイブリドーマ細胞の決定は、技術常識の範囲内である。
ポジティブハイブリドーマ細胞を同系のBalb/cマウスに腹腔内注入し、抗PROモノクローナル抗体を含む腹水を生成させる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、組織培養フラスコ又はローラーボトルで成長させることもできる。腹水中に生成されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈降、それに続くゲル排除クロマトグラフィーを用いて行うことができる。あるいは、抗体のプロテインA又はプロテインGへの結合性に基づくアフィニティクロマトグラフィーを用いることもできる。
天然又は組換えPROポリペプチドは、この分野の種々の標準的なタンパク質精製方法によって精製できる。例えば、プロ-PROポリペプチド、成熟ポリペプチド、又はプレ-PROポリペプチドは、関心あるPROポリペプチドに特異的な抗体を用いた免疫親和性クロマトグラフィーによって精製される。一般に、免疫親和性カラムは抗PROポリペプチド抗体を活性化クロマトグラフィー樹脂に共有結合させて作成される。
ポリクローナル免疫グロブリンは、硫酸アンモニウムでの沈殿又は固定化プロテインA(Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.)での精製のいずれかにより免疫血清から調製される。同様に、モノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿又は固定化プロテインAでのクロマトグラフィーによりマウス腹水液から調製される。部分的に精製された免疫グロブリンは、CnBr-活性化セファロースTM(Pharmacia LKB Biotechnology)等のクロマトグラフィー樹脂に共有結合される。抗体が樹脂に結合され、樹脂がブロックされ、誘導体樹脂は製造者の指示に従って洗浄される。
このような免疫親和性カラムは、可溶化形態のPROポリペプチドを含有する細胞からの画分を調製することによるPROポリペプチドの精製において利用される。この調製物は、洗浄剤の添加又はこの分野で公知の方法により微分遠心分離を介して得られる全細胞又は細胞成分画分の可溶化により誘導される。あるいは、シグナル配列を含む可溶化PROポリペプチドは、細胞が成長する培地中に有用な量で分泌される。
可溶化PROポリペプチド含有調製物は、免疫親和性カラムを通され、カラムはPROポリペプチドの好ましい吸着をさせる条件下(例えば、洗浄剤存在下の高イオン強度バッファー)で洗浄される。次いで、カラムは、抗体/PROポリペプチド結合を分解する条件下(例えば、約2-3といった低pH、又は高濃度の尿素又はチオシアン酸イオン等のカオトロープ)で溶離され、PROポリペプチドが回収される。
本発明は、PROポリペプチド又はその結合断片を任意の種々の薬物スクリーニング技術において使用することによる化合物のスクリーニングに特に有用である。そのような試験に用いられるPROポリペプチド又は断片は、溶液中の遊離状態でも、固体支持体に固定されても、細胞表面に担持されていても、細胞内に位置していてもよい。薬剤スクリーニングの1つの方法は、PROポリペプチド又は断片を発現する組換え核酸で安定に形質移入される真核生物又は原核生物宿主細胞を利用する。薬剤は、そのような形質移入細胞に対して、競合的結合アッセイにおいてスクリーニングされる。そのような細胞は、生存可能又は固定化形態のいずれかにおいて、標準的な結合アッセイに使用できる。例えば、PROポリペプチド又は断片と試験される試薬の間での複合体の形成を測定してよい。あるいは、試験する試薬によって生ずるPROポリペプチドとその標的細胞又は標的レセプターとの間の複合体形成における減少を試験することもできる。
しかして、本発明は、PROポリペプチド関連疾患又は疾病に影響を与えうる薬剤又は任意の他の試薬のスクリーニング方法を提供する。これらの方法は、その試薬をPROポリペプチド又は断片に接触させ、(i)試薬とPROポリペプチド又は断片との間の複合体の存在について、又は(ii)PROポリペプチド又は断片と細胞との間の複合体の存在について、当該技術でよく知られた方法でアッセイすることを含む。これらの競合結合アッセイでは、PROポリペプチド又は断片が典型的には標識される。適切なインキュベーションの後、自由なPROポリペプチド又は断片を結合形態のものから分離し、自由又は未複合の標識の量が、特定の試薬がPROポリペプチドに結合する又はPROポリペプチド/細胞複合体を阻害する能力の尺度となる。
薬剤スクリーニングのための他の技術は、ポリペプチドに対して適当な結合親和性を持つ化合物についての高スループットスクリーニングを提供し、1984年9月13日に公開されたWO84/03564に詳細に記載されている。簡単に述べれば、多数の異なる小型ペプチド試験化合物が、プラスチックピン等の固体支持体又は幾つかの他の表面上で合成される。PROポリペプチドに適用すると、ペプチド試験化合物はPROポリペプチドと反応して洗浄される。結合したPROポリペプチドはこの分野で良く知られた方法により検出される。精製したPROポリペプチドは、上記の薬剤スクリーニング技術に使用するためにプレート上に直接被覆することもできる。更に、非中和抗体は、ペプチドを捕捉し、それを固体支持体上に固定化するのに使用できる。
また、本発明は、PROポリペプチドに結合可能な中和抗体がPROポリペプチド又はその断片について試験化合物と特異的に競合する競合薬剤スクリーニングアッセイに使用されることも考慮する。この方法において、抗体は、PROポリペプチドで一又は複数の抗原決定基を持つ任意のペプチドの存在を検出するのに使用できる。
合理的薬物設計の目的は、関心ある生物学的活性ポリペプチド(例えば、PROポリペプチド)又はそれらが相互作用する小分子、例えばアゴニスト、アンタゴニスト、又はインヒビターの構造的類似物を製造することである。これらの例の任意のものが、PROポリペプチドのより活性で安定な形態又はインビボでPROポリペプチドの機能を向上又は阻害する薬物の創作に使用できる(参考、Hodgson, Bio/Technology, 9: 19-21 (1991))。
1つの方法において、PROポリペプチド、又はPROポリペプチド-インヒビター複合体の三次元構造が、x線結晶学により、コンピュータモデル化により、最も典型的には2つの方法の組み合わせにより決定される。分子の構造を解明し活性部位を決定するためには、PROポリペプチドの形状及び電荷の両方が確認されなければならない。数は少ないが、PROポリペプチドの構造に関する有用な情報が相同タンパク質の構造に基づいたモデル化によって得られることもある。両方の場合において、関連する構造情報は、類似PROポリペプチド様分子の設計又は効果的なインヒビターの同定に使用される。合理的な薬剤設計の有用な例は、Braxton及びWells, Biochemistry, 31: 7796-7801 (1992)に示されているような向上した活性又は安定性を持つ分子、又はAthauda等, J. Biochem., 113: 742-746 (1993)に示されているような天然ペプチドのインヒビター、アゴニスト、又はアンタゴニストとして作用する分子を含む。
また、上記のような機能アッセイによって選択された標的特異的な抗体を単離しその結晶構造を解明することもできる。この方法は、原理的には、それに続く薬剤設計が基礎をおくことのできるファーマコア(pharmacore)を生成する。機能的で薬理学的に活性な抗体に対する抗-イディオタイプ抗体(抗-ids)を生成することにより、タンパク質結晶学をバイパスすることができる。鏡像の鏡像として、抗-idsの結合部位は最初のレセプターの類似物であると予測できる。抗-idは、次いで、化学的又は生物学的に製造したペプチドのバンクからペプチドを同定及び単離するのに使用できる。単離されたペプチドは、ファーマコアとして機能するであろう。
本発明により、十分な量のPROポリペプチドがX線結晶学などの分析実験を実施するために入手可能である。更に、ここに提供したPROポリペプチドアミノ酸配列の知識は、x線結晶学に換える、又はそれに加えるコンピュータモデル化技術で用いられる指針を提供する。
Claims (25)
- 図1(配列番号1)、図3(配列番号3)、図5(配列番号5)、図7(配列番号7)、図9A−B(配列番号9)、図11(配列番号11)、図13(配列番号13)、図15A−B(配列番号15)、図17(配列番号17)、図19(配列番号19)、図21(配列番号21)、図23A−B(配列番号23)、図25(配列番号25)、図27A−C(配列番号27)、図29(配列番号29)、図31(配列番号31)、図33A−B(配列番号33)、図35(配列番号35)、図37(配列番号37)、図39(配列番号39)、図41(配列番号41)、図42(配列番号42)、図45(配列番号45)、図47(配列番号47)、図49(配列番号49)、図51(配列番号51)、図53(配列番号53)、図55A−B(配列番号55)、図57(配列番号57)、図59(配列番号59)、図61(配列番号61)、図63A−B(配列番号63)、図65(配列番号65)、図67A−B(配列番号67)、図69(配列番号69)、図71A−B(配列番号71)、図73(配列番号73)、図75(配列番号75)、図77(配列番号77)、図79(配列番号79)、図81(配列番号81)、図83(配列番号83)、図85(配列番号85)、図87(配列番号87)、図89(配列番号89)、図91(配列番号91)、図93A−B(配列番号93)、図95A−B(配列番号95)、図97(配列番号97)、図99(配列番号99)、図101(配列番号101)、図103(配列番号103)、図105(配列番号105)、図107(配列番号107)、図109(配列番号109)、図111A−B(配列番号111)、図113(配列番号113)、図114(配列番号114)、図116(配列番号116)、図118(配列番号118)、図120A−B(配列番号120)、図122(配列番号122)、図124A−B(配列番号124)、図126(配列番号126)、図128(配列番号128)、図130(配列番号130)、図132(配列番号132)、図134(配列番号134)、図136(配列番号136)、図138A−B(配列番号138)、図140(配列番号140)、図142(配列番号142)、図144(配列番号144)、図146(配列番号146)、図148(配列番号148)、図150(配列番号150)、図152A−B(配列番号152)、図154(配列番号154)、図156(配列番号156)、図158A−B(配列番号158)、図160(配列番号160)、図162(配列番号162)、図164A−B(配列番号164)、図166(配列番号166)、図168(配列番号168)、図170(配列番号170)、図172(配列番号172)、図174(配列番号174)、図176(配列番号176)、図178(配列番号178)、図180(配列番号180)、図182(配列番号182)、図184A−B(配列番号184)、図186(配列番号186)、図188(配列番号188)、図190(配列番号190)、図192A−B(配列番号192)、図193(配列番号193)、図195A−B(配列番号195)、図197(配列番号197)、図199(配列番号199)、図201A−B(配列番号201)、図203A−B(配列番号203)、図205A−B(配列番号205)、図207A−B(配列番号207)、図209(配列番号209)、図211(配列番号211)、図213A−B(配列番号213)、図215(配列番号215)、図217(配列番号217)、図219(配列番号219)、図220(配列番号220)、図222(配列番号222)、図224A−B(配列番号224)、図226(配列番号226)、図228(配列番号228)、図230(配列番号230)、図232(配列番号232)、図234(配列番号234)、図236(配列番号236)、図238(配列番号238)、図240A−D(配列番号240)、図242(配列番号242)、図244A−B(配列番号244)、図246(配列番号246)、図248(配列番号248)、図250(配列番号250)、図252(配列番号252)、図254(配列番号254)、図256A−B(配列番号256)
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番号2174:)、図2176(配列番号2176)、図2178(配列番号2178)、図2180(配列番号2180)、図2182(配列番号2182)、図2184(配列番号2184)、図2186(配列番号2186)、図2188(配列番号2188)、図2190(配列番号2190)、図2192(配列番号2192)、図2194(配列番号2194)、図2196(配列番号2196)、図2198(配列番号2198)、図2200(配列番号2200)、図2202(配列番号2202)、図2204(配列番号2204)、図2206(配列番号2206)、図2208(配列番号2208)、図2210(配列番号2210)、図2212(配列番号2212)、図2214(配列番号2214)、図2216(配列番号2216)、図2217A−B(配列番号2217)、図2219(配列番号2219)、図2221(配列番号2221)、図2223(配列番号2223)、図2225(配列番号2225)、図2227(配列番号2227)、図2229(配列番号2229)、図2230(配列番号2230)、図2232(配列番号2232)、図2234(配列番号2234)、図2236A−B(配列番号2236)、図2238(配列番号2238)、図2240(配列番号2240)、図2242(配列番号2242)、図2244(配列番号2244)、図2246(配列番号2246)、図2248A−B(配列番号2248)、図2250A−B(配列番号2250)、図2252(配列番号2252)、図2254(配列番号2254)、図2256(配列番号2256)、図2258(配列番号2258)、図2260(配列番号2260)、図2262(配列番号2262)、図2264(配列番号2264)、図2266(配列番号2266)、図2268(配列番号2268)、図2270(配列番号2270)、図2272(配列番号2272)、図2274(配列番号2274)、図2276(配列番号2276)、図2278A−B(配列番号2278)、図2280(配列番号2280)、図2282(配列番号2282)、図2284(配列番号2284)、図2286(配列番号2286)、図2288(配列番号2288)、図2290(配列番号2290)、図2292(配列番号2292)、図2294(配列番号2294)、図2296A−B(配列番号2296)、図2298(配列番号2298)、図2300(配列番号2300)、図2301(配列番号2301)、図2303(配列番号2303)、図2305A−B(配列番号2305)、図2307(配列番号2307)、図2308(配列番号2308)、図2309A−B(配列番号2309)、図2311(配列番号2311)、図2312(配列番号2312)、図2314(配列番号2314)、図2316(配列番号2316)、図2318A−B(配列番号2318)、図2320(配列番号2320)、図2322A−B(配列番号2322)、図2323A−B(配列番号2323)、図2325(配列番号2325)、図2327(配列番号2327)、図2329(配列番号2329)、図2331A−B(配列番号2331)、図2333(配列番号2333)、図2335(配列番号2335)、図2337(配列番号2337)、図2339A−B(配列番号2339)、図2341A−C(配列番号2341)、図2343(配列番号2343)、図2345(配列番号2345)、図2346(配列番号2346)、図2348(配列番号2348)、図2349(配列番号2349)、図2351(配列番号2351)、図2353A−B(配列番号2353)、図2355A−C(配列番号2355)、図2357(配列番号2357)、図2359(配列番号2359)、図2361(配列番号2361)、図2363(配列番号2363)、図2365(配列番号2365)、図2367(配列番号2367)、図2369(配列番号2369)、図2371(配列番号2371)、図2373(配列番号2373)、図2375(配列番号2375)、図2377(配列番号2377)、図2379(配列番号2379)、図2381(配列番号2381)、図2383(配列番号2383)、図2385(配列番号2385)、図2387(配列番号2387)、図2389(配列番号2389)、図2391(配列番号2391)、図2393(配列番号2393)、図2395(配列番号2395)、図2397(配列番号2397)、図2399(配列番号2399)、図2401(配列番号2401)、図2403(配列番号2403)、図2405A−B(配列番号2405)、図2406(配列番号2406)、図2408(配列番号2408)、図2410A−B(配列番号2410)、図2411(配列番号2411)、図2413(配列番号2413)、図2414(配列番号2414)、図2416(配列番号2416)、図2417(配列番号2417)、図2418(配列番号2418)、図2420(配列番号2420)、図2421(配列番号2421)、図2422(配列番号2422)、図2424(配列番号2424)、図2426A−B(配列番号2426)、図2428(配列番号2428)、図2430(配列番号2430)、図2432A−B(配列番号2432)、図2434(配列番号2434)、図2436(配列番号2436)、図2438(配列番号2438)、図2440(配列番号2440)、図2442(配列番号2442)、図2444(配列番号2444)、図2446(配列番号2446)、図2447(配列番号2447)、図2449(配列番号2449)、図2451(配列番号2451)、図2453(配列番号2453)、
図2455(配列番号2455)、図2456A−B(配列番号2456)、図2458(配列番号2458)、図2460(配列番号2460)、図2462(配列番号2462)、図2463(配列番号2463)、図2464(配列番号2464)、図2466(配列番号2466)、図2467(配列番号2467)、図2469(配列番号2469)、図2470(配列番号2470)、図2471A−B(配列番号2471)、図2473(配列番号2473)、図2475(配列番号2475)、図2476(配列番号2476)、図2477(配列番号2477)、図2478(配列番号2478)、図2479(配列番号2479)、図2480(配列番号2480)、図2481(配列番号2481) 又は図2483(配列番号2483)に示すヌクレオチド配列に対し、少なくとも80%の核酸配列同一性を有する単離された核酸。 - 図1(配列番号1)、図3(配列番号3)、図5(配列番号5)、図7(配列番号7)、図9A−B(配列番号9)、図11(配列番号11)、図13(配列番号13)、図15A−B(配列番号15)、図17(配列番号17)、図19(配列番号19)、図21(配列番号21)、図23A−B(配列番号23)、図25(配列番号25)、図27A−C(配列番号27)、図29(配列番号29)、図31(配列番号31)、図33A−B(配列番号33)、図35(配列番号35)、図37(配列番号37)、図39(配列番号39)、図41(配列番号41)、図42(配列番号42)、図45(配列番号45)、図47(配列番号47)、図49(配列番号49)、図51(配列番号51)、図53(配列番号53)、図55A−B(配列番号55)、図57(配列番号57)、図59(配列番号59)、図61(配列番号61)、図63A−B(配列番号63)、図65(配列番号65)、図67A−B(配列番号67)、図69(配列番号69)、図71A−B(配列番号71)、図73(配列番号73)、図75(配列番号75)、図77(配列番号77)、図79(配列番号79)、図81(配列番号81)、図83(配列番号83)、図85(配列番号85)、図87(配列番号87)、図89(配列番号89)、図91(配列番号91)、図93A−B(配列番号93)、図95A−B(配列番号95)、図97(配列番号97)、図99(配列番号99)、図101(配列番号101)、図103(配列番号103)、図105(配列番号105)、図107(配列番号107)、図109(配列番号109)、図111A−B(配列番号111)、図113(配列番号113)、図114(配列番号114)、図116(配列番号116)、図118(配列番号118)、図120A−B(配列番号120)、図122(配列番号122)、図124A−B(配列番号124)、図126(配列番号126)、図128(配列番号128)、図130(配列番号130)、図132(配列番号132)、図134(配列番号134)、図136(配列番号136)、図138A−B(配列番号138)、図140(配列番号140)、図142(配列番号142)、図144(配列番号144)、図146(配列番号146)、図148(配列番号148)、図150(配列番号150)、図152A−B(配列番号152)、図154(配列番号154)、図156(配列番号156)、図158A−B(配列番号158)、図160(配列番号160)、図162(配列番号162)、図164A−B(配列番号164)、図166(配列番号166)、図168(配列番号168)、図170(配列番号170)、図172(配列番号172)、図174(配列番号174)、図176(配列番号176)、図178(配列番号178)、図180(配列番号180)、図182(配列番号182)、図184A−B(配列番号184)、図186(配列番号186)、図188(配列番号188)、図190(配列番号190)、図192A−B(配列番号192)、図193(配列番号193)、図195A−B(配列番号195)、図197(配列番号197)、図199(配列番号199)、図201A−B(配列番号201)、図203A−B(配列番号203)、図205A−B(配列番号205)、図207A−B(配列番号207)、図209(配列番号209)、図211(配列番号211)、図213A−B(配列番号213)、図215(配列番号215)、図217(配列番号217)、図219(配列番号219)、図220(配列番号220)、図222(配列番号222)、図224A−B(配列番号224)、図226(配列番号226)、図228(配列番号228)、図230(配列番号230)、図232(配列番号232)、図234(配列番号234)、図236(配列番号236)、図238(配列番号238)、図240A−D(配列番号240)、図242(配列番号242)、図244A−B(配列番号244)、図246(配列番号246)、図248(配列番号248)、図250(配列番号250)、図252(配列番号252)、図254(配列番号254)、図256A−B(配列番号256)、図258(配列番号258)、図260(配列番号260)、図262A−B(配列番号262)、図264(配列番号264)、図266A−B(配列番号266)、図268A−B(配列番号268)、図270A−C(配列番号270)、図271(配列番号271)、図273(配列番号273)、図275A−D(配列番号275)、図277A−B(配列番号277)、図279(配列番号279)、図281(配列番号281)、図283(配列番号283)、図285(配列番号285)、図287(配列番号287)、図289(配列番号289)、図291A−G(配列番号291)、図293(配列番号293)、図295A−B(配列番号295)、図297(配列番号297)、図299(配列番号299)、図301(配列番号301)、図303(配列番号303)、図305(配列番号305)、図307(配列番号307)、図309A−B(配列番号309)、図311(配列番号311)、図313A−B(配列番号313)、図315(配列番号315)、図317(配列番号317)、図319(配列番号319)、図321(配列番号321)、図323A−B(配列番号323)、図325(配列番号325)、図327(配列番号327)、図329(配列番号329)、図331(配列番号331)、図333(配列番号333)、図335(配列番号335)、図337(配列番号337)、図339A−E(配列番号339)、図341(配列番号341)、図343(配列番号343)、図345(配列番号345)、図347(配列番号347)、図349(配列番号349)、図351(配列番号351)、図353(配列番号353)、図355(配列番号355)、図357A−B(配列番号357)、図359(配列番号359)、図361(配列番号361)、図363(配列番号363)、図365(配列番号365)、図367A−B(配列番号367)、図369A−B(配列番号369)、図371(配列番号371)、図373A−B(配列番号373)、図375A−B(配列番号375)、図377(配列番号377)、図379(配列番号379)、図381A−B(配列番号381)、図383(配列番号383)、図385(配列番号385)、図387(配列番号387)、図389(配列番号389)、図391(配列番号391)、図393(配列番号393)、図395(配列番号395)、図397A−D(配列番号397)、図399A−B(配列番号399)、図401(配列番号401)、図403(配列番号403)、図405(配列番号405)、図407(配列番号407)、図409(配列番号409)、図411(配列番号411)、図413(配列番号413)、図415(配列番号415)、図417(配列番号417)、図419(配列番号419)、図421(配列番号421)、図423(配列番号423)、図425(配列番号425)、図427A−B(配列番号427)、図429(配列番号429)、図431(配列番号431)、図433(配列番号433)、図435(配列番号435)、図437A−B(配列番号437)、図439(配列番号439)、図441(配列番号441)、図443(配列番号443)、図445(配列番号445)、図447(配列番号447)、図449A−B(配列番号449)、図451(配列番号451)、図453(配列番号453)、図455A−C(配列番号455)、図457(配列番号457)、図459(配列番号459)、図461(配列番号461)、図463(配列番号463)、図465A−B(配列番号465)、図466(配列番号466)、図469(配列番号469)、図471(配列番号471)、図473(配列番号473)、図475(配列番号475)、図477(配列番号477)、図479(配列番号479)、図481(配列番号481)、図483(配列番号483)、図485(配列番号485)、図487(配列番号487)、図489A−B(配列番号489)、図491(配列番号491)、図493(配列番号493)、図495A−B(配列番号495)、図497(配列番号497)、図499(配列番号499)、図501(配列番号501)、図503(配列番号503)、図505(配列番号505)、図507(配列番号507)、図509(配列番号509)、図511(配列番号511)、図513(配列番号513)、図515(配列番号515)、図517A−B(配列番号517)、図519(配列番号519)、図521(配列番号521)、図523(配列番号523)、図525(配列番号525)、図527(配列番号527)、図529(配列番号529)、図531(配列番号531)、図533(配列番号533)、図535(配列番号535)、図537(配列番号537)、図539(配列番号539)、図541(配列番号541)、図543(配列番号543)、図545(配列番号545)、図547(配列番号547)、図549(配列番号549)、図551(配列番号551)、図553(配列番号553)、図555A−B(配列番号555)、図557(配列番号557)、図559(配列番号559)、図561(配列番号561)、図563(配列番号563)、図565(配列番号565)、図567(配列番号567)、図569(配列番号569)、図571A−B(配列番号571)、図573(配列番号573)、図575(配列番号575)、図577(配列番号577)、図579A−B(配列番号579)、図581(配列番号581)、図583(配列番号583)、図585(配列番号585)、図587(配列番号587)、図589A−B(配列番号589)、図591(配列番号591)、図593A−B(配列番号593)、図595(配列番号595)、図597(配列番号597)、図599(配列番号599)、図601A−B(配列番号601)、図603(配列番号603)、図605(配列番号605)、図607(配列番号607)、図609(配列番号609)、図611(配列番号611)、図613(配列番号613)、図615A−B(配列番号615)、図617(配列番号617)、図619(配列番号619)、図621(配列番号621)、図623(配列番号623)、図625(配列番号625)、図627(配列番号627)、図629(配列番号629)、図631(配列番号631)、図633(配列番号633)、図635A−B(配列番号635)、図636(配列番号636)、図638(配列番号638)、図640(配列番号640)、図642(配列番号642)、図644(配列番号644)、図646(配列番号646)、図648(配列番号648)、図650(配列番号650)、図652(配列番号652)、図654(配列番号654)、図656(配列番号656)、図658(配列番号658)、図660(配列番号660)、図662(配列番号662)、図664(配列番号664)、図666(配列番号666)、図668(配列番号668)、図670(配列番号670)、図672(配列番号672)、図674A−B(配列番号674)、図676(配列番号676)、図678(配列番号678)、図680A−B(配列番号680)、図682(配列番号682)、図684(配列番号684)、図686(配列番号686)、図688(配列番号688)、図690(配列番号690)、図692(配列番号692)、図694(配列番号694)、図696(配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図1954(配列番号1954)、図1956(配列番号1956)、図1958(配列番号1958)、図1960(配列番号1960)、図1962(配列番号1962)、図1963(配列番号1963)、図1965(配列番号1965)、図1967(配列番号1967)、図1969(配列番号1969)、図1971(配列番号1971)、図1973(配列番号1973)、図1975(配列番号1975)、図1977(配列番号1977)、図1979(配列番号1979)、図1981(配列番号1981)、図1983(配列番号1983)、図1985(配列番号1985)、図1987(配列番号1987)、図1989(配列番号1989)、図1991(配列番号1991)、図1993(配列番号1993)、図1995(配列番号1995)、図1997(配列番号1997)、図1999(配列番号1999)、図2001(配列番号2001)、図2003(配列番号2003)、図2005(配列番号2005)、図2007(配列番号2007)、図2009(配列番号2009)、図2011(配列番号2011)、図2013(配列番号2013)、図2015(配列番号2015)、図2017(配列番号2017)、図2019(配列番号2019)、図2021(配列番号2021)、図2023(配列番号2023)、図2025(配列番号2025)、図2027(配列番号2027)、図2029(配列番号2029)、図2031(配列番号2031)、図2033(配列番号2033)、図2035(配列番号2035)、図2037(配列番号2037)、図2039(配列番号2039)、図2041(配列番号2041)、図2043(配列番号2043)、図2045(配列番号2045)、図2047(配列番号2047)、図2049(配列番号2049)、図2051(配列番号2051)、図2053(配列番号2053)、図2055(配列番号2055)、図2057(配列番号2057)、図2059(配列番号2059)、図2061(配列番号2061)、図2063(配列番号2063)、図2065(配列番号2065)、図2067(配列番号2067)、図2069(配列番号2069)、図2071(配列番号2071)、図2073(配列番号2073)、図2075(配列番号2075)、図2077(配列番号2077)、図2079(配列番号2079)、図2081(配列番号2081)、図2083(配列番号2083)、図2085(配列番号2085)、図2087(配列番号2087)、図2089(配列番号2089)、図2091(配列番号2091)、図2093(配列番号2093)、図2095(配列番号2095)、図2097(配列番号2097)、図2099(配列番号2099)、図2101(配列番号2101)、図2103(配列番号2103)、図2105(配列番号2105)、図2107(配列番号2107)、図2109(配列番号2109)、図2111(配列番号2111)、図2113(配列番号2113)、図2115(配列番号2115)、図2117(配列番号2117)、図2119(配列番号2119)、図2121(配列番号2121)、図2123(配列番号2123)、図2125(配列番号2125)、図2127(配列番号2127)、図2129(配列番号2129)、図2131(配列番号2131)、図2133(配列番号2133)、図2135(配列番号2135)、図2137(配列番号2137)、図2138(配列番号2138)、図2140(配列番号2140)、図2142(配列番号2142)、図2144(配列番号2144)、図2146(配列番号2146)、図2147(配列番号2147)、図2148(配列番号2148)、図2150(配列番号2150)、図2152(配列番号2152)、図2154(配列番号2154)、図2156(配列番号2156)、図2158(配列番号2158)、図2160(配列番号2160)、図2162(配列番号2162)、図2164(配列番号2164)、図2166(配列番号2166)、図2168(配列番号2168)、図2170(配列番号2170)、図2172(配列番号2172)、図2174(配列番号2174)、図2176(配列番号2176)、図2178(配列番号2178)、図2180(配列番号2180)、図2182(配列番号2182)、図2184(配列番号2184)、図2186(配列番号2186)、図2188(配列番号2188)、図2190(配列番号2190)、図2192(配列番号2192)、図2194(配列番号2194)、図2196(配列番号2196)、図2198(配列番号2198)、図2200(配列番号2200)、図2202(配列番号2202)、図2204(配列番号2204)、図2206(配列番号2206)、図2208(配列番号2208)、図2210(配列番号2210)、図2212(配列番号2212)、図2214(配列番号2214)、図2216(配列番号2216)、図2217A−B(配列番号2217)、図2219(配列番号2219)、図2221(配列番号2221)、図2223(配列番号2223)、図2225(配列番号2225)、図2227(配列番号2227)、図2229(配列番号2229)、図2230(配列番号2230)、図2232(配列番号2232)、図2234(配列番号2234)、図2236A−B(配列番号2236)、図2238(配列番号2238)、図2240(配列番号2240)、図2242(配列番号2242)、図2244(配列番号2244)、図2246(配列番号2246)、図2248A−B(配列番号2248)、図2250A−B(配列番号2250)、図2252(配列番号2252)、図2254(配列番号2254)、図2256(配列番号2256)、図2258(配列番号2258)、図2260(配列番号2260)、図2262(配列番号2262)、図2264(配列番号2264)、図2266(配列番号2266)、図2268(配列番号2268)、図2270(配列番号2270)、図2272(配列番号2272)、図2274(配列番号2274)、図2276(配列番号2276)、図2278A−B(配列番号2278)、図2280(配列番号2280)、図2282(配列番号2282)、図2284(配列番号2284)、図2286(配列番号2286)、図2288(配列番号2288)、図2290(配列番号2290)、図2292(配列番号2292)、図2294(配列番号2294)、図2296A−B(配列番号2296)、図2298(配列番号2298)、図2300(配列番号2300)、図2301(配列番号2301)、図2303(配列番号2303)、図2305A−B(配列番号2305)、図2307(配列番号2307)、図2308(配列番号2308)、図2309A−B(配列番号2309)、図2311(配列番号2311)、図2312(配列番号2312)、図2314(配列番号2314)、図2316(配列番号2316)、図2318A−B(配列番号2318)、図2320(配列番号2320)、図2322A−B(配列番号2322)、図2323A−B(配列番号2323)、図2325(配列番号2325)、図2327(配列番号2327)、図2329(配列番号2329)、図2331A−B(配列番号2331)、図2333(配列番号2333)、図2335(配列番号2335)、図2337(配列番号2337)、図2339A−B(配列番号2339)、図2341A−C(配列番号2341)、図2343(配列番号2343)、図2345(配列番号2345)、図2346(配列番号2346)、図2348(配列番号2348)、図2349(配列番号2349)、図2351(配列番号2351)、図2353A−B(配列番号2353)、図2355A−C(配列番号2355)、図2357(配列番号2357)、図2359(配列番号2359)、図2361(配列番号2361)、図2363(配列番号2363)、図2365(配列番号2365)、図2367(配列番号2367)、図2369(配列番号2369)、図2371(配列番号2371)、図2373(配列番号2373)、図2375(配列番号2375)、図2377(配列番号2377)、図2379(配列番号2379)、図2381(配列番号2381)、図2383(配列番号2383)、図2385(配列番号2385)、図2387(配列番号2387)、図2389(配列番号2389)、図2391(配列番号2391)、図2393(配列番号2393)、図2395(配列番号2395)、図2397(配列番号2397)、図2399(配列番号2399)、図2401(配列番号2401)、図2403(配列番号2403)、図2405A−B(配列番号2405)、図2406(配列番号2406)、図2408(配列番号2408)、図2410A−B(配列番号2410)、図2411(配列番号2411)、図2413(配列番号2413)、図2414(配列番号2414)、図2416(配列番号2416)、図2417(配列番号2417)、図2418(配列番号2418)、図2420(配列番号2420)、図2421(配列番号2421)、図2422(配列番号2422)、図2424(配列番号2424)、図2426A−B(配列番号2426)、図2428(配列番号2428)、図2430(配列番号2430)、図2432A−B(配列番号2432)、図2434(配列番号2434)、図2436(配列番号2436)、図2438(配列番号2438)、図2440(配列番号2440)、図2442(配列番号2442)、図2444(配列番号2444)、図2446(配列番号2446)、図2447(配列番号2447)、図2449(配列番号2449)、図2451(配列番号2451)、図2453(配列番号2453)、図2455(配列番号2455)、図2456A−B(配列番号2456)、図2458(配列番号2458)、図2460(配列番号2460)、図2462(配列番号2462)、図2463(配列番号2463)、図2464(配列番号2464)、図2466(配列番号2466)、図2467(配列番号2467)、図2469(配列番号2469)、図2470(配列番号2470)、図2471A−B(配列番号2471)、図2473(配列番号2473)、図2475(配列番号2475)、図2476(配列番号2476)、図2477(配列番号2477)、図2478(配列番号2478)、図2479(配列番号2479)、図2480(配列番号2480)、図2481(配列番号2481)又は図2483(配列番号2483)に示すヌクレオチド配列の完全長コード化配列を有するヌクレオチド配列に対し、少なくとも80%の核酸配列同一性を有する単離された核酸。 - 図1〜2484に示すヌクレオチド配列からなる単離された核酸。
- 請求項1に記載の核酸を含んでなるベクター。
- ベクターで形質転換した宿主細胞によって認識される制御配列に作用可能に結合する請求項4に記載のベクター。
- 請求項4に記載のベクターを有する宿主細胞。
- CHO細胞、大腸菌細胞又は酵母細胞である、請求項6に記載の宿主細胞。
- PROポリペプチドの産生方法において、請求項6に記載の宿主細胞を、前記PROポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、前記PROポリペプチドを細胞培養物から回収することを含む方法。
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図2(配列番号2)、図4(配列番号4)、図6(配列番号6)、図8(配列番号8)、図10(配列番号10)、図12(配列番号12)、図14(配列番号14)、図16(配列番号16)、図18(配列番号18)、図20(配列番号20)、図22(配列番号22)、図24(配列番号24)、図26(配列番号26)、図28(配列番号28)、図30(配列番号30)、図32(配列番号32)、図34(配列番号34)、図36(配列番号36)、図38(配列番号38)、図40(配列番号40)、図42(配列番号42)、図43(配列番号43)、図46(配列番号46)、図48(配列番号48)、図50(配列番号50)、図52(配列番号52)、図54(配列番号54)、図56(配列番号56)、図58(配列番号58)、図60(配列番号60)、図62(配列番号62)、図64(配列番号64)、図66(配列番号66)、図68(配列番号68)、図70(配列番号70)、図72(配列番号72)、図74(配列番号74)、図76(配列番号76)、図78(配列番号78)、図80(配列番号80)、図80(配列番号80)、図84(配列番号84)、図86(配列番号86)、図88(配列番号88)、図90(配列番号90)、図92(配列番号92)、図94(配列番号94)、図96(配列番号96)、図98(配列番号98)、図100(配列番号100)、図102(配列番号102)、図104(配列番号104)、図106(配列番号106)、図108(配列番号108)、図108(配列番号108)、図112(配列番号112)、図115(配列番号115)、図117(配列番号117)、図119(配列番号119)、図121(配列番号121)、図123(配列番号123)、図125(配列番号125)、図127(配列番号127)、図129(配列番号129)、図131(配列番号131)、図133(配列番号133)、図135(配列番号135)、図137(配列番号137)、図139(配列番号139)、図141(配列番号141)、図143(配列番号143)、図145(配列番号145)、図147(配列番号147)、図149(配列番号149)、図151(配列番号151)、図153(配列番号153)、図155(配列番号155)、図157(配列番号157)、図159(配列番号159)、図161(配列番号161)、図163(配列番号163)、図165(配列番号165)、図167(配列番号167)、図169(配列番号169)、図171(配列番号171)、図173(配列番号173)、図175(配列番号175)、図177(配列番号177)、図179(配列番号179)、図181(配列番号181)、図183(配列番号183)、図185(配列番号185)、図187(配列番号187)、図189(配列番号189)、図191(配列番号191)、図194(配列番号194)、図196(配列番号196)、図198(配列番号198)、図200(配列番号200)、図202(配列番号202)、図204(配列番号204)、図206(配列番号206)、図208(配列番号208)、図210(配列番号210)、図212(配列番号212)、図214(配列番号214)、図216(配列番号216)、図218(配列番号218)、図221(配列番号221)、図223(配列番号223)、図225(配列番号225)、図227(配列番号227)、図229(配列番号229)、図231(配列番号231)、図233(配列番号233)、図235(配列番号235)、図237(配列番号237)、図239(配列番号239)、図241(配列番号241)、図243(配列番号243)、図245(配列番号245)、図247(配列番号247)、図249(配列番号249)、図251(配列番号251)、図253(配列番号253)、図255(配列番号255)、図257(配列番号257)、図259(配列番号259)、図261(配列番号261)、図263(配列番号263)、図265(配列番号265)、図267(配列番号267)、図269(配列番号269)、図272(配列番号272)、図274(配列番号274)、図276(配列番号276)、図278(配列番号278)、図280(配列番号280)、図282(配列番号282)、図284(配列番号284)、図286(配列番号286)、図288(配列番号288)、図290(配列番号290)、図292(配列番号292)、図294(配列番号294)、図296(配列番号296)、図298(配列番号298)、図300(配列番号300)、図302(配列番号302)、図304(配列番号304)、図306(配列番号306)、図308(配列番号308)、図310(配列番号310)、図312(配列番号312)、図314(配列番号314)、図316(配列番号316)、図318(配列番号318)、図320(配列番号320)、図322(配列番号322)、図324(配列番号324)、図326(配列番号326)、図328(配列番号328)、図330(配列番号330)、図332(配列番号332)、図334(配列番号334)、図336(配列番号336)、図338(配列番号338)、図340(配列番号340)、図342(配列番号342)、図344(配列番号344)、図346(配列番号346)、図348(配列番号348)、図350(配列番号350)、図352(配列番号352)、図354(配列番号354)、図356(配列番号356)、図358(配列番号358)、図360(配列番号360)、図362(配列番号362)、図364(配列番号364)、図366(配列番号366)、図368(配列番号368)、図370(配列番号370)、図372(配列番号372)、図374(配列番号374)、図376(配列番号376)、図378(配列番号378)、図380(配列番号380)、図382(配列番号382)、図384(配列番号384)、図386(配列番号386)、図388(配列番号388)、図390(配列番号390)、図392(配列番号392)、図394(配列番号394)、図396(配列番号396)、図398(配列番号398)、図400(配列番号400)、図402(配列番号402)、図404(配列番号404)、図406(配列番号406)、図408(配列番号408)、図410(配列番号410)、図412(配列番号412)、図414(配列番号414)、図416(配列番号416)、図418(配列番号418)、図420(配列番号420)、図422(配列番号422)、図424(配列番号424)、図426(配列番号426)、図428(配列番号428)、図430(配列番号430)、図432(配列番号432)、図434(配列番号434)、図436(配列番号436)、図438(配列番号438)、図440(配列番号440)、図442(配列番号442)、図444(配列番号444)、図446(配列番号446)、図448(配列番号448)、図450(配列番号450)、図452(配列番号452)、図454(配列番号454)、図456(配列番号456)、図458(配列番号458)、図460(配列番号460)、図462(配列番号462)、図464(配列番号464)、図466(配列番号466)、図467(配列番号467)、図470(配列番号470)、図472(配列番号472)、図474(配列番号474)、図476(配列番号476)、図478(配列番号478)、図480(配列番号480)、図482(配列番号482)、図484(配列番号484)、図486(配列番号486)、図488(配列番号488)、図490(配列番号490)、図492(配列番号492)、図494(配列番号494)、図496(配列番号496)、図498(配列番号498)、図500(配列番号500)、図502(配列番号502)、図504(配列番号504)、図506(配列番号506)、図508(配列番号508)、図510(配列番号510)、図512(配列番号512)、図514(配列番号514)、図516(配列番号516)、図518(配列番号518)、図520(配列番号520)、図522(配列番号522)、図524(配列番号524)、図526(配列番号526)、図528(配列番号528)、図530(配列番号530)、図532(配列番号532)、図534(配列番号534)、図536(配列番号536)、図538(配列番号538)、図540(配列番号540)、図542(配列番号542)、図544(配列番号544)、図546(配列番号546)、図548(配列番号548)、図550(配列番号550)、図552(配列番号552)、図554(配列番号554)、図556(配列番号556)、図558(配列番号558)、図560(配列番号560)、図562(配列番号562)、図564(配列番号564)、図566(配列番号566)、図568(配列番号568)、図570(配列番号570)、図572(配列番号572)、図574(配列番号574)、図576(配列番号576)、図578(配列番号578)、図580(配列番号580)、図582(配列番号582)、図584(配列番号584)、図586(配列番号586)、図588(配列番号588)、図590(配列番号590)、図592(配列番号592)、図594(配列番号594)、図596(配列番号596)、図598(配列番号598)、図600(配列番号600)、図602(配列番号602)、図604(配列番号604)、図606(配列番号606)、図608(配列番号608)、図610(配列番号610)、図612(配列番号612)、図614(配列番号614)、図616(配列番号616)、図618(配列番号618)、図620(配列番号620)、図622(配列番号622)、図624(配列番号624)、図626(配列番号626)、図628(配列番号628)、図630(配列番号630)、図632(配列番号632)、図634(配列番号634)、図637(配列番号637)、図639(配列番号639)、図641(配列番号641)、図643(配列番号643)、図645(配列番号645)、図647(配列番号647)、図649(配列番号649)、図651(配列番号651)、図653(配列番号653)、図655(配列番号655)、図657(配列番号657)、図659(配列番号659)、図661(配列番号661)、図663(配列番号663)、図665(配列番号665)、図667(配列番号667)、図669(配列番号669)、図671(配列番号671)、図673(配列番号673)、図675(配列番号675)、図677(配列番号677)、図679(配列番号679)、図681(配列番号681)、図683(配列番号683)、図685(配列番号685)、図687(配列番号687)、図689(配列番号689)、図691(配列番号691)、図693(配列番号693)、図695(配列番号695)、図697(配列番号697)、図699(配列番号699)、図701(配列番号701)、図703(配列番号703)、図705(配列番号705)、図707(配列番号707)、図709(配列番号709)、図711(配列番号711)、図713(配列番号713)、図715(配列番号715)、図717(配列番号717)、図719(配列番号719)、図721(配列番号721)、図723(配列番号723)、図725(配列番号725)、図727(配列番号727)、図729(配列番号729)、図731(配列番号731)、図733(配列番号733)、図735(配列番号7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52)、図1454(配列番号1454)、図1456(配列番号1456)、図1458(配列番号1458)、図1460(配列番号1460)、図1462(配列番号1462)、図1464(配列番号1464)、図1466(配列番号1466)、図1468(配列番号1468)、図1470(配列番号1470)、図1472(配列番号1472)、図1474(配列番号1474)、図1476(配列番号1476)、図1478(配列番号1478)、図1480(配列番号1480)、図1482(配列番号1482)、図1484(配列番号1484)、図1486(配列番号1486)、図1488(配列番号1488)、図1490(配列番号1490)、図1492(配列番号1492)、図1494(配列番号1494)、図1496(配列番号1496)、図1498(配列番号1498)、図1500(配列番号1500)、図1502(配列番号1502)、図1504(配列番号1504)、図1506(配列番号1506)、図1508(配列番号1508)、図1510(配列番号1510)、図1512(配列番号1512)、図1514(配列番号1514)、図1516(配列番号1516)、図1518(配列番号1518)、図1520(配列番号1520)、図1522(配列番号1522)、図1524(配列番号1524)、図1526(配列番号1526)、図1528(配列番号1528)、図1530(配列番号1530)、図1532(配列番号1532)、図1534(配列番号1534)、図1536(配列番号1536)、図1538(配列番号1538)、図1540(配列番号1540)、図1542(配列番号1542)、図1544(配列番号1544)、図1546(配列番号1546)、図1548(配列番号1548)、図1550(配列番号1550)、図1552(配列番号1552)、図1554(配列番号1554)、図1556(配列番号1556)、図1558(配列番号1558)、図1560(配列番号1560)、図1562(配列番号1562)、図1564(配列番号1654)、図1566(配列番号1566)、図1568(配列番号1568)、図1570(配列番号1570)、図1572(配列番号1572)、図1574(配列番号1574)、図1576(配列番号1576)、図1578(配列番号1578)、図1580(配列番号1580)、図1582(配列番号1582)、図1585(配列番号1585)、図1587(配列番号1587)、図1590(配列番号1590)、図1592(配列番号1592)、図1594(配列番号1594)、図1597(配列番号1597)、図1599(配列番号1599)、図1601(配列番号1601)、図1603(配列番号1603)、図1605(配列番号1605)、図1607(配列番号1607)、図1610(配列番号1610)、図1613(配列番号1613)、図1615(配列番号1615)、図1617(配列番号1617)、図1619(配列番号1619)、図1621(配列番号1621)、図1623(配列番号1623)、図1625(配列番号1625)、図1627(配列番号1627)、図1629(配列番号1629)、図1631(配列番号1631)、図1633(配列番号1633)、図1635(配列番号1635)、図1637(配列番号1637)、図1639(配列番号1639)、図1641(配列番号1641)、図1643(配列番号1643)、図1645(配列番号1645)、図1647(配列番号1647)、図1650(配列番号1650)、図1654(配列番号1654)、図1656(配列番号1656)、図1658(配列番号1658)、図1660(配列番号1660)、図1662(配列番号1662)、図1664(配列番号1664)、図1666(配列番号1666)、図1668(配列番号1668)、図1670(配列番号1670)、図1672(配列番号1672)、図1674(配列番号1674)、図1676(配列番号1676)、図1678(配列番号1678)、図1680(配列番号1680)、図1682(配列番号1682)、図1686(配列番号1686)、図1688(配列番号1688)、図1691(配列番号1691)、図1693(配列番号1693)、図1695(配列番号1695)、図1697(配列番号1697)、図1699(配列番号1699)、図1701(配列番号1701)、図1703(配列番号1703)、図1705(配列番号1705)、図1708(配列番号1708)、図1710(配列番号1710)、図1712(配列番号1712)、図1714(配列番号1714)、図1716(配列番号1716)、図1718(配列番号1718)、図1720(配列番号1720)、図1722(配列番号1722)、図1725(配列番号1725)、図1727(配列番号1727)、図1729(配列番号1729)、図1731(配列番号1731)、図1733(配列番号1733)、図1735(配列番号1735)、図1738(配列番号1738)、図1740(配列番号1740)、図1742(配列番号1742)、図1744(配列番号1744)、図1746(配列番号1746)、図1748(配列番号1748)、図1750(配列番号1750)、図1752(配列番号1752)、図1754(配列番号1754)、図1756(配列番号1756)、図1758(配列番号1758)、図1760(配列番号1760)、図1762(配列番号1762)、図1764(配列番号1764)、図1767(配列番号1767)、図1769(配列番号1769)、図1771(配列番号1771)、図1774(配列番号1774)、図1776(配列番号1776)、図1779(配列番号1779)、図1782(配列番号1782)、図1784(配列番号1784)、図1786(配列番号1786)、図1789(配列番号1789)、図1791(配列番号1791)、図1794(配列番号1794)、図1796(配列番号1796)、図1798(配列番号1798)、図1800(配列番号1800)、図1802(配列番号1802)、図1804(配列番号1804)、図1806(配列番号1806)、図1808(配列番号1808)、図1810(配列番号1810)、図1812(配列番号1812)、図1814(配列番号1814)、図1816(配列番号1816)、図1818(配列番号1818)、図1820(配列番号1820)、図1822(配列番号1822)、図1824(配列番号1824)、図1826(配列番号1826)、図1828(配列番号1828)、図1830(配列番号1830)、図1832(配列番号1832)、図1834(配列番号1834)、図1836(配列番号1836)、図1838(配列番号1838)、図1840(配列番号1840)、図1842(配列番号1842)、図1844(配列番号1844)、図1846(配列番号1846)、図1848(配列番号1848)、図1850(配列番号1850)、図1852(配列番号1852)、図1856(配列番号1856)、図1858(配列番号1858)、図1860(配列番号1860)、図1862(配列番号1862)、図1864(配列番号1864)、図1867(配列番号1867)、図1869(配列番号1869)、図1871(配列番号1871)、図1873(配列番号1873)、図1876(配列番号1876)、図1878(配列番号1878)、図1880(配列番号1880)、図1883(配列番号1883)、図1885(配列番号1885)、図1887(配列番号1887)、図1890(配列番号1890)、図1892(配列番号1892)、図1894(配列番号1894)、図1896(配列番号1896)、図1898(配列番号1898)、図1900(配列番号1900)、図1902(配列番号1902)、図1904(配列番号1904)、図1906(配列番号1906)、図1908(配列番号1908)、図1910(配列番号1910)、図1912(配列番号1912)、図1914(配列番号1914)、図1916(配列番号1916)、図1918(配列番号1918)、図1920(配列番号1920)、図1922(配列番号1922)、図1924(配列番号1924)、図1926(配列番号1926)、図1928(配列番号1928)、図1930(配列番号1930)、図1932(配列番号1932)、図1934(配列番号1934)、図1936(配列番号1936)、図1938(配列番号1938)、図1940(配列番号1940)、図1942(配列番号1942)、図1944(配列番号1944)、図1946(配列番号1946)、図1948(配列番号1948)、図1951(配列番号1951)、図1953(配列番号1953)、図1955(配列番号1955)、図1957(配列番号1957)、図1959(配列番号1959)、図1961(配列番号1961)、図1964(配列番号1964)、図1966(配列番号1966)、図1968(配列番号1968)、図1970(配列番号1970)、図1972(配列番号1972)、図1974(配列番号1974)、図1976(配列番号1976)、図1978(配列番号1978)、図1980(配列番号1980)、図1982(配列番号1982)、図1984(配列番号1984)、図1986(配列番号1986)、図1988(配列番号1988)、図1990(配列番号1990)、図1992(配列番号1992)、図1994(配列番号1994)、図1996(配列番号1996)、図1998(配列番号1998)、図2000(配列番号2000)、図2002(配列番号2002)、図2004(配列番号2004)、図2006(配列番号2006)、図2008(配列番号2008)、図2010(配列番号2010)、図2012(配列番号2012)、図2014(配列番号2014)、図2016(配列番号2016)、図2018(配列番号2018)、図2020(配列番号2020)、図2022(配列番号2022)、図2024(配列番号2024)、図2026(配列番号2026)、図2028(配列番号2028)、図2030(配列番号2030)、図2032(配列番号2032)、図2034(配列番号2034)、図2036(配列番号2036)、図2038(配列番号2038)、図2040(配列番号2040)、図2042(配列番号2042)、図2044(配列番号2044)、図2046(配列番号2046)、図2048(配列番号2048)、図2050(配列番号2050)、図2052(配列番号5052)、図2054(配列番号2054)、図2056(配列番号2056)、図2058(配列番号2058)、図2060(配列番号2060)、図2062(配列番号2062)、図2064(配列番号2064)、図2066(配列番号2066)、図2068(配列番号2068)、図2070(配列番号2070)、図2072(配列番号2072)、図2074(配列番号2074)、図2076(配列番号2076)、図2078(配列番号2078)、図2080(配列番号2080)、図2082(配列番号2082)、図2084(配列番号2084)、図2086(配列番号2086)、図2088(配列番号2088)、図2090(配列番号2090)、図2092(配列番号2092)、図2094(配列番号2094)、図2096(配列番号2096)、図2098(配列番号2098)、図2100(配列番号2100)、図2102(配列番号2102)、図2104(配列番号2104)、図210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- 前記異種アミノ酸配列がエピトープタグ配列又は免疫グロブリンのFc領域である、請求項9に記載のキメラ分子。
- 請求項9に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
- モノクローナル抗体、ヒト化抗体又は一本鎖抗体である、請求項12に記載の抗体。
- 担体との組み合わせで、(a)請求項9に記載のポリペプチド、(b)前記ポリペプチドのアゴニスト、(c)前記ポリペプチドのアンタゴニスト、又は(d)前記ポリペプチドに結合する抗体を含有する物質の組成物。
- 前記担体が製薬的に許容可能な担体である、請求項14に記載の物質の組成物。
- (a)、(b)、(c)又は(d)の治療的有効量を含有してなる請求項15に記載の物質の組成物。
- 容器、
前記容器上のラベル、及び
前記容器に収容された、(a)請求項9に記載のポリペプチド、(b)前記ポリペプチドのアゴニスト、(c)前記ポリペプチドのアンタゴニスト、又は(d)前記ポリペプチドに結合する抗体を含有する物質の組成物、
を含み、前記容器上のラベルが前記物質の組成物が乾癬の治療に有用であることを示す、製造品。 - 乾癬の治療を必要とする哺乳動物に対し、(a)請求項9に記載のポリペプチド、(b)前記ポリペプチドのアンタゴニスト、又は(c)前記ポリペプチドに結合する抗体の治療的有効量を投与することを含む、哺乳動物の乾癬を治療する方法。
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図2(配列番号2)、図4(配列番号4)、図6(配列番号6)、図8(配列番号8)、図10(配列番号10)、図12(配列番号12)、図14(配列番号14)、図16(配列番号16)、図18(配列番号18)、図20(配列番号20)、図22(配列番号22)、図24(配列番号24)、図26(配列番号26)、図28(配列番号28)、図30(配列番号30)、図32(配列番号32)、図34(配列番号34)、図36(配列番号36)、図38(配列番号38)、図40(配列番号40)、図42(配列番号42)、図43(配列番号43)、図46(配列番号46)、図48(配列番号48)、図50(配列番号50)、図52(配列番号52)、図54(配列番号54)、図56(配列番号56)、図58(配列番号58)、図60(配列番号60)、図62(配列番号62)、図64(配列番号64)、図66(配列番号66)、図68(配列番号68)、図70(配列番号70)、図72(配列番号72)、図74(配列番号74)、図76(配列番号76)、図78(配列番号78)、図80(配列番号80)、図80(配列番号80)、図84(配列番号84)、図86(配列番号86)、図88(配列番号88)、図90(配列番号90)、図92(配列番号92)、図94(配列番号94)、図96(配列番号96)、図98(配列番号98)、図100(配列番号100)、図102(配列番号102)、図104(配列番号104)、図106(配列番号106)、図108(配列番号108)、図108(配列番号108)、図112(配列番号112)、図115(配列番号115)、図117(配列番号117)、図119(配列番号119)、図121(配列番号121)、図123(配列番号123)、図125(配列番号125)、図127(配列番号127)、図129(配列番号129)、図131(配列番号131)、図133(配列番号133)、図135(配列番号135)、図137(配列番号137)、図139(配列番号139)、図141(配列番号141)、図143(配列番号143)、図145(配列番号145)、図147(配列番号147)、図149(配列番号149)、図151(配列番号151)、図153(配列番号153)、図155(配列番号155)、図157(配列番号157)、図159(配列番号159)、図161(配列番号161)、図163(配列番号163)、図165(配列番号165)、図167(配列番号167)、図169(配列番号169)、図171(配列番号171)、図173(配列番号173)、図175(配列番号175)、図177(配列番号177)、図179(配列番号179)、図181(配列番号181)、図183(配列番号183)、図185(配列番号185)、図187(配列番号187)、図189(配列番号189)、図191(配列番号191)、図194(配列番号194)、図196(配列番号196)、図198(配列番号198)、図200(配列番号200)、図202(配列番号202)、図204(配列番号204)、図206(配列番号206)、図208(配列番号208)、図210(配列番号210)、図212(配列番号212)、図214(配列番号214)、図216(配列番号216)、図218(配列番号218)、図221(配列番号221)、図223(配列番号223)、図225(配列番号225)、図227(配列番号227)、図229(配列番号229)、図231(配列番号231)、図233(配列番号233)、図235(配列番号235)、図237(配列番号237)、図239(配列番号239)、図241(配列番号241)、図243(配列番号243)、図245(配列番号245)、図247(配列番号247)、図249(配列番号249)、図251(配列番号251)、図253(配列番号253)、図255(配列番号255)、図257(配列番号257)、図259(配列番号259)、図261(配列番号261)、図263(配列番号263)、図265(配列番号265)、図267(配列番号267)、図269(配列番号269)、図272(配列番号272)、図274(配列番号274)、図276(配列番号276)、図278(配列番号278)、図280(配列番号280)、図282(配列番号282)、図284(配列番号284)、図286(配列番号286)、図288(配列番号288)、図290(配列番号290)、図292(配列番号292)、図294(配列番号294)、図296(配列番号296)、図298(配列番号298)、図300(配列番号300)、図302(配列番号302)、図304(配列番号304)、図306(配列番号306)、図308(配列番号308)、図310(配列番号310)、図312(配列番号312)、図314(配列番号314)、図316(配列番号316)、図318(配列番号318)、図320(配列番号320)、図322(配列番号322)、図324(配列番号324)、図326(配列番号326)、図328(配列番号328)、図330(配列番号330)、図332(配列番号332)、図334(配列番号334)、図336(配列番号336)、図338(配列番号338)、図340(配列番号340)、図342(配列番号342)、図344(配列番号344)、図346(配列番号346)、図348(配列番号348)、図350(配列番号350)、図352(配列番号352)、図354(配列番号354)、図356(配列番号356)、図358(配列番号358)、図360(配列番号360)、図362(配列番号362)、図364(配列番号364)、図366(配列番号366)、図368(配列番号368)、図370(配列番号370)、図372(配列番号372)、図374(配列番号374)、図376(配列番号376)、図378(配列番号378)、図380(配列番号380)、図382(配列番号382)、図384(配列番号384)、図386(配列番号386)、図388(配列番号388)、図390(配列番号390)、図392(配列番号392)、図394(配列番号394)、図396(配列番号396)、図398(配列番号398)、図400(配列番号400)、図402(配列番号402)、図404(配列番号404)、図406(配列番号406)、図408(配列番号408)、図410(配列番号410)、図412(配列番号412)、図414(配列番号414)、図416(配列番号416)、図418(配列番号418)、図420(配列番号420)、図422(配列番号422)、図424(配列番号424)、図426(配列番号426)、図428(配列番号428)、図430(配列番号430)、図432(配列番号432)、図434(配列番号434)、図436(配列番号436)、図438(配列番号438)、図440(配列番号440)、図442(配列番号442)、図444(配列番号444)、図446(配列番号446)、図448(配列番号448)、図450(配列番号450)、図452(配列番号452)、図454(配列番号454)、図456(配列番号456)、図458(配列番号458)、図460(配列番号460)、図462(配列番号462)、図464(配列番号464)、図466(配列番号466)、図467(配列番号467)、図470(配列番号470)、図472(配列番号472)、図474(配列番号474)、図476(配列番号476)、図478(配列番号478)、図480(配列番号480)、図482(配列番号482)、図484(配列番号484)、図486(配列番号486)、図488(配列番号488)、図490(配列番号490)、図492(配列番号492)、図494(配列番号494)、図496(配列番号496)、図498(配列番号498)、図500(配列番号500)、図502(配列番号502)、図504(配列番号504)、図506(配列番号506)、図508(配列番号508)、図510(配列番号510)、図512(配列番号512)、図514(配列番号514)、図516(配列番号516)、図518(配列番号518)、図520(配列番号520)、図522(配列番号522)、図524(配列番号524)、図526(配列番号526)、図528(配列番号528)、図530(配列番号530)、図532(配列番号532)、図534(配列番号534)、図536(配列番号536)、図538(配列番号538)、図540(配列番号540)、図542(配列番号542)、図544(配列番号544)、図546(配列番号546)、図548(配列番号548)、図550(配列番号550)、図552(配列番号552)、図554(配列番号554)、図556(配列番号556)、図558(配列番号558)、図560(配列番号560)、図562(配列番号562)、図564(配列番号564)、図566(配列番号566)、図568(配列番号568)、図570(配列番号570)、図572(配列番号572)、図574(配列番号574)、図576(配列番号576)、図578(配列番号578)、図580(配列番号580)、図582(配列番号582)、図584(配列番号584)、図586(配列番号586)、図588(配列番号588)、図590(配列番号590)、図592(配列番号592)、図594(配列番号594)、図596(配列番号596)、図598(配列番号598)、図600(配列番号600)、図602(配列番号602)、図604(配列番号604)、図606(配列番号606)、図608(配列番号608)、図610(配列番号610)、図612(配列番号612)、図614(配列番号614)、図616(配列番号616)、図618(配列番号618)、図620(配列番号620)、図622(配列番号622)、図624(配列番号624)、図626(配列番号626)、図628(配列番号628)、図630(配列番号630)、図632(配列番号632)、図634(配列番号634)、図637(配列番号637)、図639(配列番号639)、図641(配列番号641)、図643(配列番号643)、図645(配列番号645)、図647(配列番号647)、図649(配列番号649)、図651(配列番号651)、図653(配列番号653)、図655(配列番号655)、図657(配列番号657)、図659(配列番号659)、図661(配列番号661)、図663(配列番号663)、図665(配列番号665)、図667(配列番号667)、図669(配列番号669)、図671(配列番号671)、図673(配列番号673)、図675(配列番号675)、図677(配列番号677)、図679(配列番号679)、図681(配列番号681)、図683(配列番号683)、図685(配列番号685)、図687(配列番号687)、図689(配列番号689)、図691(配列番号691)、図693(配列番号693)、図695(配列番号695)、図697(配列番号697)、図699(配列番号699)、図701(配列番号701)、図703(配列番号703)、図705(配列番号705)、図707(配列番号707)、図709(配列番号709)、図711(配列番号711)、図713(配列番号713)、図715(配列番号715)、図717(配列番号717)、図719(配列番号719)、図721(配列番号721)、図723(配列番号723)、図725(配列番号725)、図727(配列番号727)、図729(配列番号729)、図731(配列番号731)、図733(配列番号733)、図735(配列番号7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52)、図1454(配列番号1454)、図1456(配列番号1456)、図1458(配列番号1458)、図1460(配列番号1460)、図1462(配列番号1462)、図1464(配列番号1464)、図1466(配列番号1466)、図1468(配列番号1468)、図1470(配列番号1470)、図1472(配列番号1472)、図1474(配列番号1474)、図1476(配列番号1476)、図1478(配列番号1478)、図1480(配列番号1480)、図1482(配列番号1482)、図1484(配列番号1484)、図1486(配列番号1486)、図1488(配列番号1488)、図1490(配列番号1490)、図1492(配列番号1492)、図1494(配列番号1494)、図1496(配列番号1496)、図1498(配列番号1498)、図1500(配列番号1500)、図1502(配列番号1502)、図1504(配列番号1504)、図1506(配列番号1506)、図1508(配列番号1508)、図1510(配列番号1510)、図1512(配列番号1512)、図1514(配列番号1514)、図1516(配列番号1516)、図1518(配列番号1518)、図1520(配列番号1520)、図1522(配列番号1522)、図1524(配列番号1524)、図1526(配列番号1526)、図1528(配列番号1528)、図1530(配列番号1530)、図1532(配列番号1532)、図1534(配列番号1534)、図1536(配列番号1536)、図1538(配列番号1538)、図1540(配列番号1540)、図1542(配列番号1542)、図1544(配列番号1544)、図1546(配列番号1546)、図1548(配列番号1548)、図1550(配列番号1550)、図1552(配列番号1552)、図1554(配列番号1554)、図1556(配列番号1556)、図1558(配列番号1558)、図1560(配列番号1560)、図1562(配列番号1562)、図1564(配列番号1654)、図1566(配列番号1566)、図1568(配列番号1568)、図1570(配列番号1570)、図1572(配列番号1572)、図1574(配列番号1574)、図1576(配列番号1576)、図1578(配列番号1578)、図1580(配列番号1580)、図1582(配列番号1582)、図1585(配列番号1585)、図1587(配列番号1587)、図1590(配列番号1590)、図1592(配列番号1592)、図1594(配列番号1594)、図1597(配列番号1597)、図1599(配列番号1599)、図1601(配列番号1601)、図1603(配列番号1603)、図1605(配列番号1605)、図1607(配列番号1607)、図1610(配列番号1610)、図1613(配列番号1613)、図1615(配列番号1615)、図1617(配列番号1617)、図1619(配列番号1619)、図1621(配列番号1621)、図1623(配列番号1623)、図1625(配列番号1625)、図1627(配列番号1627)、図1629(配列番号1629)、図1631(配列番号1631)、図1633(配列番号1633)、図1635(配列番号1635)、図1637(配列番号1637)、図1639(配列番号1639)、図1641(配列番号1641)、図1643(配列番号1643)、図1645(配列番号1645)、図1647(配列番号1647)、図1650(配列番号1650)、図1654(配列番号1654)、図1656(配列番号1656)、図1658(配列番号1658)、図1660(配列番号1660)、図1662(配列番号1662)、図1664(配列番号1664)、図1666(配列番号1666)、図1668(配列番号1668)、図1670(配列番号1670)、図1672(配列番号1672)、図1674(配列番号1674)、図1676(配列番号1676)、図1678(配列番号1678)、図1680(配列番号1680)、図1682(配列番号1682)、図1686(配列番号1686)、図1688(配列番号1688)、図1691(配列番号1691)、図1693(配列番号1693)、図1695(配列番号1695)、図1697(配列番号1697)、図1699(配列番号1699)、図1701(配列番号1701)、図1703(配列番号1703)、図1705(配列番号1705)、図1708(配列番号1708)、図1710(配列番号1710)、図1712(配列番号1712)、図1714(配列番号1714)、図1716(配列番号1716)、図1718(配列番号1718)、図1720(配列番号1720)、図1722(配列番号1722)、図1725(配列番号1725)、図1727(配列番号1727)、図1729(配列番号1729)、図1731(配列番号1731)、図1733(配列番号1733)、図1735(配列番号1735)、図1738(配列番号1738)、図1740(配列番号1740)、図1742(配列番号1742)、図1744(配列番号1744)、図1746(配列番号1746)、図1748(配列番号1748)、図1750(配列番号1750)、図1752(配列番号1752)、図1754(配列番号1754)、図1756(配列番号1756)、図1758(配列番号1758)、図1760(配列番号1760)、図1762(配列番号1762)、図1764(配列番号1764)、図1767(配列番号1767)、図1769(配列番号1769)、図1771(配列番号1771)、図1774(配列番号1774)、図1776(配列番号1776)、図1779(配列番号1779)、図1782(配列番号1782)、図1784(配列番号1784)、図1786(配列番号1786)、図1789(配列番号1789)、図1791(配列番号1791)、図1794(配列番号1794)、図1796(配列番号1796)、図1798(配列番号1798)、図1800(配列番号1800)、図1802(配列番号1802)、図1804(配列番号1804)、図1806(配列番号1806)、図1808(配列番号1808)、図1810(配列番号1810)、図1812(配列番号1812)、図1814(配列番号1814)、図1816(配列番号1816)、図1818(配列番号1818)、図1820(配列番号1820)、図1822(配列番号1822)、図1824(配列番号1824)、図1826(配列番号1826)、図1828(配列番号1828)、図1830(配列番号1830)、図1832(配列番号1832)、図1834(配列番号1834)、図1836(配列番号1836)、図1838(配列番号1838)、図1840(配列番号1840)、図1842(配列番号1842)、図1844(配列番号1844)、図1846(配列番号1846)、図1848(配列番号1848)、図1850(配列番号1850)、図1852(配列番号1852)、図1856(配列番号1856)、図1858(配列番号1858)、図1860(配列番号1860)、図1862(配列番号1862)、図1864(配列番号1864)、図1867(配列番号1867)、図1869(配列番号1869)、図1871(配列番号1871)、図1873(配列番号1873)、図1876(配列番号1876)、図1878(配列番号1878)、図1880(配列番号1880)、図1883(配列番号1883)、図1885(配列番号1885)、図1887(配列番号1887)、図1890(配列番号1890)、図1892(配列番号1892)、図1894(配列番号1894)、図1896(配列番号1896)、図1898(配列番号1898)、図1900(配列番号1900)、図1902(配列番号1902)、図1904(配列番号1904)、図1906(配列番号1906)、図1908(配列番号1908)、図1910(配列番号1910)、図1912(配列番号1912)、図1914(配列番号1914)、図1916(配列番号1916)、図1918(配列番号1918)、図1920(配列番号1920)、図1922(配列番号1922)、図1924(配列番号1924)、図1926(配列番号1926)、図1928(配列番号1928)、図1930(配列番号1930)、図1932(配列番号1932)、図1934(配列番号1934)、図1936(配列番号1936)、図1938(配列番号1938)、図1940(配列番号1940)、図1942(配列番号1942)、図1944(配列番号1944)、図1946(配列番号1946)、図1948(配列番号1948)、図1951(配列番号1951)、図1953(配列番号1953)、図1955(配列番号1955)、図1957(配列番号1957)、図1959(配列番号1959)、図1961(配列番号1961)、図1964(配列番号1964)、図1966(配列番号1966)、図1968(配列番号1968)、図1970(配列番号1970)、図1972(配列番号1972)、図1974(配列番号1974)、図1976(配列番号1976)、図1978(配列番号1978)、図1980(配列番号1980)、図1982(配列番号1982)、図1984(配列番号1984)、図1986(配列番号1986)、図1988(配列番号1988)、図1990(配列番号1990)、図1992(配列番号1992)、図1994(配列番号1994)、図1996(配列番号1996)、図1998(配列番号1998)、図2000(配列番号2000)、図2002(配列番号2002)、図2004(配列番号2004)、図2006(配列番号2006)、図2008(配列番号2008)、図2010(配列番号2010)、図2012(配列番号2012)、図2014(配列番号2014)、図2016(配列番号2016)、図2018(配列番号2018)、図2020(配列番号2020)、図2022(配列番号2022)、図2024(配列番号2024)、図2026(配列番号2026)、図2028(配列番号2028)、図2030(配列番号2030)、図2032(配列番号2032)、図2034(配列番号2034)、図2036(配列番号2036)、図2038(配列番号2038)、図2040(配列番号2040)、図2042(配列番号2042)、図2044(配列番号2044)、図2046(配列番号2046)、図2048(配列番号2048)、図2050(配列番号2050)、図2052(配列番号5052)、図2054(配列番号2054)、図2056(配列番号2056)、図2058(配列番号2058)、図2060(配列番号2060)、図2062(配列番号2062)、図2064(配列番号2064)、図2066(配列番号2066)、図2068(配列番号2068)、図2070(配列番号2070)、図2072(配列番号2072)、図2074(配列番号2074)、図2076(配列番号2076)、図2078(配列番号2078)、図2080(配列番号2080)、図2082(配列番号2082)、図2084(配列番号2084)、図2086(配列番号2086)、図2088(配列番号2088)、図2090(配列番号2090)、図2092(配列番号2092)、図2094(配列番号2094)、図2096(配列番号2096)、図2098(配列番号2098)、図2100(配列番号2100)、図2102(配列番号2102)、図2104(配列番号2104)、図210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0)、図2122(配列番号2122)、図2124(配列番号2124)、図2126(配列番号2126)、図2128(配列番号2128)、図2130(配列番号2130)、図2132(配列番号2132)、図2134(配列番号2134)、図2136(配列番号2136)、図2139(配列番号2139)、図2141(配列番号2141)、図2143(配列番号2143)、図2145(配列番号2145)、図2149(配列番号2149)、図2151(配列番号2151)、図2153(配列番号2153)、図2155(配列番号2155)、図2157(配列番号2157)、図2159(配列番号2159)、図2161(配列番号2161)、図2163(配列番号2163)、図2165(配列番号2165)、図2167(配列番号2167)、図2169(配列番号2169)、図2171(配列番号2171)、図2173(配列番号2173)、図2175(配列番号2175)、図2177(配列番号2177)、図2179(配列番号2179)、図2181(配列番号2181)、図2183(配列番号2183)、図2185(配列番号2185)、図2187(配列番号2187)、図2189(配列番号2189)、図2191(配列番号2191)、図2193(配列番号2193)、図2195(配列番号2195)、図2197(配列番号2197)、図2199(配列番号2199)、図2201(配列番号2201)、図2203(配列番号2203)、図2205(配列番号2205)、図2207(配列番号2207)、図2209(配列番号2209)、図2211(配列番号2211)、図2213(配列番号2213)、図2215(配列番号2215)、図2218(配列番号2218)、図2220(配列番号2220)、図2222(配列番号2222)、図2224(配列番号2224)、図2226(配列番号2226)、図2228(配列番号2228)、図2231(配列番号2231)、図2233(配列番号2233)、図2235(配列番号2235)、図2237(配列番号2237)、図2239(配列番号2239)、図2241(配列番号2241)、図2243(配列番号2243)、図2245(配列番号2245)、図2247(配列番号2247)、図2249(配列番号2249)、図2251(配列番号2251)、図2253(配列番号2253)、図2255(配列番号2255)、図2257(配列番号2257)、図2259(配列番号2259)、図2261(配列番号2261)、図2263(配列番号2263)、図2265(配列番号2265)、図2267(配列番号2267)、図2269(配列番号2269)、図2271(配列番号2271)、図2273(配列番号2273)、図2275(配列番号2275)、図2277(配列番号2277)、図2279(配列番号2279)、図2281(配列番号2281)、図2283(配列番号2283)、図2285(配列番号2285)、図2287(配列番号2287)、図2289(配列番号2289)、図2291(配列番号2291)、図2293(配列番号2293)、図2295(配列番号2295)、図2297(配列番号2297)、図2299(配列番号2299)、図2302(配列番号2302)、図2304(配列番号2304)、図2306(配列番号2306)、図2310(配列番号2310)、図2313(配列番号2313)、図2315(配列番号2315)、図2317(配列番号2317)、図2319(配列番号2319)、図2321(配列番号2321)、図2324(配列番号2324)、図2326(配列番号2326)、図2328(配列番号2328)、図2330(配列番号2330)、図2332(配列番号2332)、図2334(配列番号2334)、図2336(配列番号2336)、図2338(配列番号2338)、図2340(配列番号2340)、図2342(配列番号2342)、図2344(配列番号2344)、図2347(配列番号2347)、図2350(配列番号2350)、図2352(配列番号2352)、図2354(配列番号2354)、図2356(配列番号2356)、図2358(配列番号2358)、図2360(配列番号2360)、図2362(配列番号2362)、図2364(配列番号2364)、図2366(配列番号2366)、図2368(配列番号2368)、図2370(配列番号2370)、図2372(配列番号2372)、図2374(配列番号2374)、図2376(配列番号2376)、図2378(配列番号2378)、図2380(配列番号2380)、図2382(配列番号2382)、図2384(配列番号2384)、図2386(配列番号2386)、図2388(配列番号2388)、図2390(配列番号2390)、図2392(配列番号2392)、図2394(配列番号2394)、図2396(配列番号2396)、図2398(配列番号2398)、図2400(配列番号2400)、図2402(配列番号2402)、図2404(配列番号2404)、図2407(配列番号2407)、図2409(配列番号2409)、図2412(配列番号2412)、図2415(配列番号2415)、図2419(配列番号2419)、図2423(配列番号2423)、図2425(配列番号2425)、図2427(配列番号2427)、図2429(配列番号2429)、図2431(配列番号2431)、図2433(配列番号2433)、図2435(配列番号2435)、図2437(配列番号2437)、図2439(配列番号2439)、図2441(配列番号2441)、図2443(配列番号2443)、図2445(配列番号2445)、図2448(配列番号2448)、図2450(配列番号2450)、図2452(配列番号2452)、図2454(配列番号2454)、図2457(配列番号2457)、図2459(配列番号2459)、図2461(配列番号2461)、図2465(配列番号2465)、図2468(配列番号2468)、図2472(配列番号2472)、図2474(配列番号2474)、図2482(配列番号2482)又は図2484(配列番号2484)に示す本発明のPROポリペプチドを含むことが疑われる試料中の前記ポリペプチドの存在を決定する方法であって、抗PROポリペプチド抗体に前記試料を曝し、前記抗体の前記試料の成分への結合を決定することを含む方法。 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哺乳動物の乾癬の診断方法であって、(a)哺乳動物から採取した組織細胞の試験試料中と、(b)同一の細胞型の既知の正常組織細胞のコントロール試料中における図2(配列番号2)、図4(配列番号4)、図6(配列番号6)、図8(配列番号8)、図10(配列番号10)、図12(配列番号12)、図14(配列番号14)、図16(配列番号16)、図18(配列番号18)、図20(配列番号20)、図22(配列番号22)、図24(配列番号24)、図26(配列番号26)、図28(配列番号28)、図30(配列番号30)、図32(配列番号32)、図34(配列番号34)、図36(配列番号36)、図38(配列番号38)、図40(配列番号40)、図42(配列番号42)、図43(配列番号43)、図46(配列番号46)、図48(配列番号48)、図50(配列番号50)、図52(配列番号52)、図54(配列番号54)、図56(配列番号56)、図58(配列番号58)、図60(配列番号60)、図62(配列番号62)、図64(配列番号64)、図66(配列番号66)、図68(配列番号68)、図70(配列番号70)、図72(配列番号72)、図74(配列番号74)、図76(配列番号76)、図78(配列番号78)、図80(配列番号80)、図80(配列番号80)、図84(配列番号84)、図86(配列番号86)、図88(配列番号88)、図90(配列番号90)、図92(配列番号92)、図94(配列番号94)、図96(配列番号96)、図98(配列番号98)、図100(配列番号100)、図102(配列番号102)、図104(配列番号104)、図106(配列番号106)、図108(配列番号108)、図108(配列番号108)、図112(配列番号112)、図115(配列番号115)、図117(配列番号117)、図119(配列番号119)、図121(配列番号121)、図123(配列番号123)、図125(配列番号125)、図127(配列番号127)、図129(配列番号129)、図131(配列番号131)、図133(配列番号133)、図135(配列番号135)、図137(配列番号137)、図139(配列番号139)、図141(配列番号141)、図143(配列番号143)、図145(配列番号145)、図147(配列番号147)、図149(配列番号149)、図151(配列番号151)、図153(配列番号153)、図155(配列番号155)、図157(配列番号157)、図159(配列番号159)、図161(配列番号161)、図163(配列番号163)、図165(配列番号165)、図167(配列番号167)、図169(配列番号169)、図171(配列番号171)、図173(配列番号173)、図175(配列番号175)、図177(配列番号177)、図179(配列番号179)、図181(配列番号181)、図183(配列番号183)、図185(配列番号185)、図187(配列番号187)、図189(配列番号189)、図191(配列番号191)、図194(配列番号194)、図196(配列番号196)、図198(配列番号198)、図200(配列番号200)、図202(配列番号202)、図204(配列番号204)、図206(配列番号206)、図208(配列番号208)、図210(配列番号210)、図212(配列番号212)、図214(配列番号214)、図216(配列番号216)、図218(配列番号218)、図221(配列番号221)、図223(配列番号223)、図225(配列番号225)、図227(配列番号227)、図229(配列番号229)、図231(配列番号231)、図233(配列番号233)、図235(配列番号235)、図237(配列番号237)、図239(配列番号239)、図241(配列番号241)、図243(配列番号243)、図245(配列番号245)、図247(配列番号247)、図249(配列番号249)、図251(配列番号251)、図253(配列番号253)、図255(配列番号255)、図257(配列番号257)、図259(配列番号259)、図261(配列番号261)、図263(配列番号263)、図265(配列番号265)、図267(配列番号267)、図269(配列番号269)、図272(配列番号272)、図274(配列番号274)、図276(配列番号276)、図278(配列番号278)、図280(配列番号280)、図282(配列番号282)、図284(配列番号284)、図286(配列番号286)、図288(配列番号288)、図290(配列番号290)、図292(配列番号292)、図294(配列番号294)、図296(配列番号296)、図298(配列番号298)、図300(配列番号300)、図302(配列番号302)、図304(配列番号304)、図306(配列番号306)、図308(配列番号308)、図310(配列番号310)、図312(配列番号312)、図314(配列番号314)、図316(配列番号316)、図318(配列番号318)、図320(配列番号320)、図322(配列番号322)、図324(配列番号324)、図326(配列番号326)、図328(配列番号328)、図330(配列番号330)、図332(配列番号332)、図334(配列番号334)、図336(配列番号336)、図338(配列番号338)、図340(配列番号340)、図342(配列番号342)、図344(配列番号344)、図346(配列番号346)、図348(配列番号348)、図350(配列番号350)、図352(配列番号352)、図354(配列番号354)、図356(配列番号356)、図358(配列番号358)、図360(配列番号360)、図362(配列番号362)、図364(配列番号364)、図366(配列番号366)、図368(配列番号368)、図370(配列番号370)、図372(配列番号372)、図374(配列番号374)、図376(配列番号376)、図378(配列番号378)、図380(配列番号380)、図382(配列番号382)、図384(配列番号384)、図386(配列番号386)、図388(配列番号388)、図390(配列番号390)、図392(配列番号392)、図394(配列番号394)、図396(配列番号396)、図398(配列番号398)、図400(配列番号400)、図402(配列番号402)、図404(配列番号404)、図406(配列番号406)、図408(配列番号408)、図410(配列番号410)、図412(配列番号412)、図414(配列番号414)、図416(配列番号416)、図418(配列番号418)、図420(配列番号420)、図422(配列番号422)、図424(配列番号424)、図426(配列番号426)、図428(配列番号428)、図430(配列番号430)、図432(配列番号432)、図434(配列番号434)、図436(配列番号436)、図438(配列番号438)、図440(配列番号440)、図442(配列番号442)、図444(配列番号444)、図446(配列番号446)、図448(配列番号448)、図450(配列番号450)、図452(配列番号452)、図454(配列番号454)、図456(配列番号456)、図458(配列番号458)、図460(配列番号460)、図462(配列番号462)、図464(配列番号464)、図466(配列番号466)、図467(配列番号467)、図470(配列番号470)、図472(配列番号472)、図474(配列番号474)、図476(配列番号476)、図478(配列番号478)、図480(配列番号480)、図482(配列番号482)、図484(配列番号484)、図486(配列番号486)、図488(配列番号488)、図490(配列番号490)、図492(配列番号492)、図494(配列番号494)、図496(配列番号496)、図498(配列番号498)、図500(配列番号500)、図502(配列番号502)、図504(配列番号504)、図506(配列番号506)、図508(配列番号508)、図510(配列番号510)、図512(配列番号512)、図514(配列番号514)、図516(配列番号516)、図518(配列番号518)、図520(配列番号520)、図522(配列番号522)、図524(配列番号524)、図526(配列番号526)、図528(配列番号528)、図530(配列番号530)、図532(配列番号532)、図534(配列番号534)、図536(配列番号536)、図538(配列番号538)、図540(配列番号540)、図542(配列番号542)、図544(配列番号544)、図546(配列番号546)、図548(配列番号548)、図550(配列番号550)、図552(配列番号552)、図554(配列番号554)、図556(配列番号556)、図558(配列番号558)、図560(配列番号560)、図562(配列番号562)、図564(配列番号564)、図566(配列番号566)、図568(配列番号568)、図570(配列番号570)、図572(配列番号572)、図574(配列番号574)、図576(配列番号576)、図578(配列番号578)、図580(配列番号580)、図582(配列番号582)、図584(配列番号584)、図586(配列番号586)、図588(配列番号588)、図590(配列番号590)、図592(配列番号592)、図594(配列番号594)、図596(配列番号596)、図598(配列番号598)、図600(配列番号600)、図602(配列番号602)、図604(配列番号604)、図606(配列番号606)、図608(配列番号608)、図610(配列番号610)、図612(配列番号612)、図614(配列番号614)、図616(配列番号616)、図618(配列番号618)、図620(配列番号620)、図622(配列番号622)、図624(配列番号624)、図626(配列番号626)、図628(配列番号628)、図630(配列番号630)、図632(配列番号632)、図634(配列番号634)、図637(配列番号637)、図639(配列番号639)、図641(配列番号641)、図643(配列番号643)、図645(配列番号645)、図647(配列番号647)、図649(配列番号649)、図651(配列番号651)、図653(配列番号653)、図655(配列番号655)、図657(配列番号657)、図659(配列番号659)、図661(配列番号661)、図663(配列番号663)、図665(配列番号665)、図667(配列番号667)、図669(配列番号669)、図671(配列番号671)、図673(配列番号673)、図675(配列番号675)、図677(配列番号677)、図679(配列番号679)、図681(配列番号681)、図683(配列番号683)、図685(配列番号685)、図687(配列番号687)、図689(配列番号689)、図691(配列番号691)、図693(配列番号693)、図695(配列番号695)、図697(配列番号697)、図699(配列番号699)、図701(配列番号701)、図703(配列番号703)、図705(配列番号705)、図707(配列番号707)、図709(配列番号709)、図711(配列番号711)、図713(配列番号713)、図715(配列番号715)、図717(配列番号717)、図719(配列番号719)、図721(配列番号721)、図723(配列番号723)、図725(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哺乳動物の乾癬の診断方法であって、(a)前記哺乳動物から採取した組織細胞の試験試料に図2(配列番号2)、図4(配列番号4)、図6(配列番号6)、図8(配列番号8)、図10(配列番号10)、図12(配列番号12)、図14(配列番号14)、図16(配列番号16)、図18(配列番号18)、図20(配列番号20)、図22(配列番号22)、図24(配列番号24)、図26(配列番号26)、図28(配列番号28)、図30(配列番号30)、図32(配列番号32)、図34(配列番号34)、図36(配列番号36)、図38(配列番号38)、図40(配列番号40)、図42(配列番号42)、図43(配列番号43)、図46(配列番号46)、図48(配列番号48)、図50(配列番号50)、図52(配列番号52)、図54(配列番号54)、図56(配列番号56)、図58(配列番号58)、図60(配列番号60)、図62(配列番号62)、図64(配列番号64)、図66(配列番号66)、図68(配列番号68)、図70(配列番号70)、図72(配列番号72)、図74(配列番号74)、図76(配列番号76)、図78(配列番号78)、図80(配列番号80)、図80(配列番号80)、図84(配列番号84)、図86(配列番号86)、図88(配列番号88)、図90(配列番号90)、図92(配列番号92)、図94(配列番号94)、図96(配列番号96)、図98(配列番号98)、図100(配列番号100)、図102(配列番号102)、図104(配列番号104)、図106(配列番号106)、図108(配列番号108)、図108(配列番号108)、図112(配列番号112)、図115(配列番号115)、図117(配列番号117)、図119(配列番号119)、図121(配列番号121)、図123(配列番号123)、図125(配列番号125)、図127(配列番号127)、図129(配列番号129)、図131(配列番号131)、図133(配列番号133)、図135(配列番号135)、図137(配列番号137)、図139(配列番号139)、図141(配列番号141)、図143(配列番号143)、図145(配列番号145)、図147(配列番号147)、図149(配列番号149)、図151(配列番号151)、図153(配列番号153)、図155(配列番号155)、図157(配列番号157)、図159(配列番号159)、図161(配列番号161)、図163(配列番号163)、図165(配列番号165)、図167(配列番号167)、図169(配列番号169)、図171(配列番号171)、図173(配列番号173)、図175(配列番号175)、図177(配列番号177)、図179(配列番号179)、図181(配列番号181)、図183(配列番号183)、図185(配列番号185)、図187(配列番号187)、図189(配列番号189)、図191(配列番号191)、図194(配列番号194)、図196(配列番号196)、図198(配列番号198)、図200(配列番号200)、図202(配列番号202)、図204(配列番号204)、図206(配列番号206)、図208(配列番号208)、図210(配列番号210)、図212(配列番号212)、図214(配列番号214)、図216(配列番号216)、図218(配列番号218)、図221(配列番号221)、図223(配列番号223)、図225(配列番号225)、図227(配列番号227)、図229(配列番号229)、図231(配列番号231)、図233(配列番号233)、図235(配列番号235)、図237(配列番号237)、図239(配列番号239)、図241(配列番号241)、図243(配列番号243)、図245(配列番号245)、図247(配列番号247)、図249(配列番号249)、図251(配列番号251)、図253(配列番号253)、図255(配列番号255)、図257(配列番号257)、図259(配列番号259)、図261(配列番号261)、図263(配列番号263)、図265(配列番号265)、図267(配列番号267)、図269(配列番号269)、図272(配列番号272)、図274(配列番号274)、図276(配列番号276)、図278(配列番号278)、図280(配列番号280)、図282(配列番号282)、図284(配列番号284)、図286(配列番号286)、図288(配列番号288)、図290(配列番号290)、図292(配列番号292)、図294(配列番号294)、図296(配列番号296)、図298(配列番号298)、図300(配列番号300)、図302(配列番号302)、図304(配列番号304)、図306(配列番号306)、図308(配列番号308)、図310(配列番号310)、図312(配列番号312)、図314(配列番号314)、図316(配列番号316)、図318(配列番号318)、図320(配列番号320)、図322(配列番号322)、図324(配列番号324)、図326(配列番号326)、図328(配列番号328)、図330(配列番号330)、図332(配列番号332)、図334(配列番号334)、図336(配列番号336)、図338(配列番号338)、図340(配列番号340)、図342(配列番号342)、図344(配列番号344)、図346(配列番号346)、図348(配列番号348)、図350(配列番号350)、図352(配列番号352)、図354(配列番号354)、図356(配列番号356)、図358(配列番号358)、図360(配列番号360)、図362(配列番号362)、図364(配列番号364)、図366(配列番号366)、図368(配列番号368)、図370(配列番号370)、図372(配列番号372)、図374(配列番号374)、図376(配列番号376)、図378(配列番号378)、図380(配列番号380)、図382(配列番号382)、図384(配列番号384)、図386(配列番号386)、図388(配列番号388)、図390(配列番号390)、図392(配列番号392)、図394(配列番号394)、図396(配列番号396)、図398(配列番号398)、図400(配列番号400)、図402(配列番号402)、図404(配列番号404)、図406(配列番号406)、図408(配列番号408)、図410(配列番号410)、図412(配列番号412)、図414(配列番号414)、図416(配列番号416)、図418(配列番号418)、図420(配列番号420)、図422(配列番号422)、図424(配列番号424)、図426(配列番号426)、図428(配列番号428)、図430(配列番号430)、図432(配列番号432)、図434(配列番号434)、図436(配列番号436)、図438(配列番号438)、図440(配列番号440)、図442(配列番号442)、図444(配列番号444)、図446(配列番号446)、図448(配列番号448)、図450(配列番号450)、図452(配列番号452)、図454(配列番号454)、図456(配列番号456)、図458(配列番号458)、図460(配列番号460)、図462(配列番号462)、図464(配列番号464)、図466(配列番号466)、図467(配列番号467)、図470(配列番号470)、図472(配列番号472)、図474(配列番号474)、図476(配列番号476)、図478(配列番号478)、図480(配列番号480)、図482(配列番号482)、図484(配列番号484)、図486(配列番号486)、図488(配列番号488)、図490(配列番号490)、図492(配列番号492)、図494(配列番号494)、図496(配列番号496)、図498(配列番号498)、図500(配列番号500)、図502(配列番号502)、図504(配列番号504)、図506(配列番号506)、図508(配列番号508)、図510(配列番号510)、図512(配列番号512)、図514(配列番号514)、図516(配列番号516)、図518(配列番号518)、図520(配列番号520)、図522(配列番号522)、図524(配列番号524)、図526(配列番号526)、図528(配列番号528)、図530(配列番号530)、図532(配列番号532)、図534(配列番号534)、図536(配列番号536)、図538(配列番号538)、図540(配列番号540)、図542(配列番号542)、図544(配列番号544)、図546(配列番号546)、図548(配列番号548)、図550(配列番号550)、図552(配列番号552)、図554(配列番号554)、図556(配列番号556)、図558(配列番号558)、図560(配列番号560)、図562(配列番号562)、図564(配列番号564)、図566(配列番号566)、図568(配列番号568)、図570(配列番号570)、図572(配列番号572)、図574(配列番号574)、図576(配列番号576)、図578(配列番号578)、図580(配列番号580)、図582(配列番号582)、図584(配列番号584)、図586(配列番号586)、図588(配列番号588)、図590(配列番号590)、図592(配列番号592)、図594(配列番号594)、図596(配列番号596)、図598(配列番号598)、図600(配列番号600)、図602(配列番号602)、図604(配列番号604)、図606(配列番号606)、図608(配列番号608)、図610(配列番号610)、図612(配列番号612)、図614(配列番号614)、図616(配列番号616)、図618(配列番号618)、図620(配列番号620)、図622(配列番号622)、図624(配列番号624)、図626(配列番号626)、図628(配列番号628)、図630(配列番号630)、図632(配列番号632)、図634(配列番号634)、図637(配列番号637)、図639(配列番号639)、図641(配列番号641)、図643(配列番号643)、図645(配列番号645)、図647(配列番号647)、図649(配列番号649)、図651(配列番号651)、図653(配列番号653)、図655(配列番号655)、図657(配列番号657)、図659(配列番号659)、図661(配列番号661)、図663(配列番号663)、図665(配列番号665)、図667(配列番号667)、図669(配列番号669)、図671(配列番号671)、図673(配列番号673)、図675(配列番号675)、図677(配列番号677)、図679(配列番号679)、図681(配列番号681)、図683(配列番号683)、図685(配列番号685)、図687(配列番号687)、図689(配列番号689)、図691(配列番号691)、図693(配列番号693)、図695(配列番号695)、図697(配列番号697)、図699(配列番号699)、図701(配列番号701)、図703(配列番号703)、図705(配列番号705)、図707(配列番号707)、図709(配列番号709)、図711(配列番号711)、図713(配列番号713)、図715(配列番号715)、図717(配列番号717)、図719(配列番号719)、図721(配列番号721)、図723(配列番号723)、図725(配列番号725)、図727(配列番号727)、図729(配列番号7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448(配列番号1448)、図1450(配列番号1450)、図1452(配列番号1452)、図1454(配列番号1454)、図1456(配列番号1456)、図1458(配列番号1458)、図1460(配列番号1460)、図1462(配列番号1462)、図1464(配列番号1464)、図1466(配列番号1466)、図1468(配列番号1468)、図1470(配列番号1470)、図1472(配列番号1472)、図1474(配列番号1474)、図1476(配列番号1476)、図1478(配列番号1478)、図1480(配列番号1480)、図1482(配列番号1482)、図1484(配列番号1484)、図1486(配列番号1486)、図1488(配列番号1488)、図1490(配列番号1490)、図1492(配列番号1492)、図1494(配列番号1494)、図1496(配列番号1496)、図1498(配列番号1498)、図1500(配列番号1500)、図1502(配列番号1502)、図1504(配列番号1504)、図1506(配列番号1506)、図1508(配列番号1508)、図1510(配列番号1510)、図1512(配列番号1512)、図1514(配列番号1514)、図1516(配列番号1516)、図1518(配列番号1518)、図1520(配列番号1520)、図1522(配列番号1522)、図1524(配列番号1524)、図1526(配列番号1526)、図1528(配列番号1528)、図1530(配列番号1530)、図1532(配列番号1532)、図1534(配列番号1534)、図1536(配列番号1536)、図1538(配列番号1538)、図1540(配列番号1540)、図1542(配列番号1542)、図1544(配列番号1544)、図1546(配列番号1546)、図1548(配列番号1548)、図1550(配列番号1550)、図1552(配列番号1552)、図1554(配列番号1554)、図1556(配列番号1556)、図1558(配列番号1558)、図1560(配列番号1560)、図1562(配列番号1562)、図1564(配列番号1654)、図1566(配列番号1566)、図1568(配列番号1568)、図1570(配列番号1570)、図1572(配列番号1572)、図1574(配列番号1574)、図1576(配列番号1576)、図1578(配列番号1578)、図1580(配列番号1580)、図1582(配列番号1582)、図1585(配列番号1585)、図1587(配列番号1587)、図1590(配列番号1590)、図1592(配列番号1592)、図1594(配列番号1594)、図1597(配列番号1597)、図1599(配列番号1599)、図1601(配列番号1601)、図1603(配列番号1603)、図1605(配列番号1605)、図1607(配列番号1607)、図1610(配列番号1610)、図1613(配列番号1613)、図1615(配列番号1615)、図1617(配列番号1617)、図1619(配列番号1619)、図1621(配列番号1621)、図1623(配列番号1623)、図1625(配列番号1625)、図1627(配列番号1627)、図1629(配列番号1629)、図1631(配列番号1631)、図1633(配列番号1633)、図1635(配列番号1635)、図1637(配列番号1637)、図1639(配列番号1639)、図1641(配列番号1641)、図1643(配列番号1643)、図1645(配列番号1645)、図1647(配列番号1647)、図1650(配列番号1650)、図1654(配列番号1654)、図1656(配列番号1656)、図1658(配列番号1658)、図1660(配列番号1660)、図1662(配列番号1662)、図1664(配列番号1664)、図1666(配列番号1666)、図1668(配列番号1668)、図1670(配列番号1670)、図1672(配列番号1672)、図1674(配列番号1674)、図1676(配列番号1676)、図1678(配列番号1678)、図1680(配列番号1680)、図1682(配列番号1682)、図1686(配列番号1686)、図1688(配列番号1688)、図1691(配列番号1691)、図1693(配列番号1693)、図1695(配列番号1695)、図1697(配列番号1697)、図1699(配列番号1699)、図1701(配列番号1701)、図1703(配列番号1703)、図1705(配列番号1705)、図1708(配列番号1708)、図1710(配列番号1710)、図1712(配列番号1712)、図1714(配列番号1714)、図1716(配列番号1716)、図1718(配列番号1718)、図1720(配列番号1720)、図1722(配列番号1722)、図1725(配列番号1725)、図1727(配列番号1727)、図1729(配列番号1729)、図1731(配列番号1731)、図1733(配列番号1733)、図1735(配列番号1735)、図1738(配列番号1738)、図1740(配列番号1740)、図1742(配列番号1742)、図1744(配列番号1744)、図1746(配列番号1746)、図1748(配列番号1748)、図1750(配列番号1750)、図1752(配列番号1752)、図1754(配列番号1754)、図1756(配列番号1756)、図1758(配列番号1758)、図1760(配列番号1760)、図1762(配列番号1762)、図1764(配列番号1764)、図1767(配列番号1767)、図1769(配列番号1769)、図1771(配列番号1771)、図1774(配列番号1774)、図1776(配列番号1776)、図1779(配列番号1779)、図1782(配列番号1782)、図1784(配列番号1784)、図1786(配列番号1786)、図1789(配列番号1789)、図1791(配列番号1791)、図1794(配列番号1794)、図1796(配列番号1796)、図1798(配列番号1798)、図1800(配列番号1800)、図1802(配列番号1802)、図1804(配列番号1804)、図1806(配列番号1806)、図1808(配列番号1808)、図1810(配列番号1810)、図1812(配列番号1812)、図1814(配列番号1814)、図1816(配列番号1816)、図1818(配列番号1818)、図1820(配列番号1820)、図1822(配列番号1822)、図1824(配列番号1824)、図1826(配列番号1826)、図1828(配列番号1828)、図1830(配列番号1830)、図1832(配列番号1832)、図1834(配列番号1834)、図1836(配列番号1836)、図1838(配列番号1838)、図1840(配列番号1840)、図1842(配列番号1842)、図1844(配列番号1844)、図1846(配列番号1846)、図1848(配列番号1848)、図1850(配列番号1850)、図1852(配列番号1852)、図1856(配列番号1856)、図1858(配列番号1858)、図1860(配列番号1860)、図1862(配列番号1862)、図1864(配列番号1864)、図1867(配列番号1867)、図1869(配列番号1869)、図1871(配列番号1871)、図1873(配列番号1873)、図1876(配列番号1876)、図1878(配列番号1878)、図1880(配列番号1880)、図1883(配列番号1883)、図1885(配列番号1885)、図1887(配列番号1887)、図1890(配列番号1890)、図1892(配列番号1892)、図1894(配列番号1894)、図1896(配列番号1896)、図1898(配列番号1898)、図1900(配列番号1900)、図1902(配列番号1902)、図1904(配列番号1904)、図1906(配列番号1906)、図1908(配列番号1908)、図1910(配列番号1910)、図1912(配列番号1912)、図1914(配列番号1914)、図1916(配列番号1916)、図1918(配列番号1918)、図1920(配列番号1920)、図1922(配列番号1922)、図1924(配列番号1924)、図1926(配列番号1926)、図1928(配列番号1928)、図1930(配列番号1930)、図1932(配列番号1932)、図1934(配列番号1934)、図1936(配列番号1936)、図1938(配列番号1938)、図1940(配列番号1940)、図1942(配列番号1942)、図1944(配列番号1944)、図1946(配列番号1946)、図1948(配列番号1948)、図1951(配列番号1951)、図1953(配列番号1953)、図1955(配列番号1955)、図1957(配列番号1957)、図1959(配列番号1959)、図1961(配列番号1961)、図1964(配列番号1964)、図1966(配列番号1966)、図1968(配列番号1968)、図1970(配列番号1970)、図1972(配列番号1972)、図1974(配列番号1974)、図1976(配列番号1976)、図1978(配列番号1978)、図1980(配列番号1980)、図1982(配列番号1982)、図1984(配列番号1984)、図1986(配列番号1986)、図1988(配列番号1988)、図1990(配列番号1990)、図1992(配列番号1992)、図1994(配列番号1994)、図1996(配列番号1996)、図1998(配列番号1998)、図2000(配列番号2000)、図2002(配列番号2002)、図2004(配列番号2004)、図2006(配列番号2006)、図2008(配列番号2008)、図2010(配列番号2010)、図2012(配列番号2012)、図2014(配列番号2014)、図2016(配列番号2016)、図2018(配列番号2018)、図2020(配列番号2020)、図2022(配列番号2022)、図2024(配列番号2024)、図2026(配列番号2026)、図2028(配列番号2028)、図2030(配列番号2030)、図2032(配列番号2032)、図2034(配列番号2034)、図2036(配列番号2036)、図2038(配列番号2038)、図2040(配列番号2040)、図2042(配列番号2042)、図2044(配列番号2044)、図2046(配列番号2046)、図2048(配列番号2048)、図2050(配列番号2050)、図2052(配列番号5052)、図2054(配列番号2054)、図2056(配列番号2056)、図2058(配列番号2058)、図2060(配列番号2060)、図2062(配列番号2062)、図2064(配列番号2064)、図2066(配列番号2066)、図2068(配列番号2068)、図2070(配列番号2070)、図2072(配列番号2072)、図2074(配列番号2074)、図2076(配列番号2076)、図2078(配列番号2078)、図2080(配列番号2080)、図2082(配列番号2082)、図2084(配列番号2084)、図2086(配列番号2086)、図2088(配列番号2088)、図2090(配列番号2090)、図2092(配列番号2092)、図2094(配列番号2094)、図2096(配列番号2096)、図2098(配列番号2098)、図2100(配列番号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16(配列番号2116)、図2118(配列番号2118)、図2120(配列番号2120)、図2122(配列番号2122)、図2124(配列番号2124)、図2126(配列番号2126)、図2128(配列番号2128)、図2130(配列番号2130)、図2132(配列番号2132)、図2134(配列番号2134)、図2136(配列番号2136)、図2139(配列番号2139)、図2141(配列番号2141)、図2143(配列番号2143)、図2145(配列番号2145)、図2149(配列番号2149)、図2151(配列番号2151)、図2153(配列番号2153)、図2155(配列番号2155)、図2157(配列番号2157)、図2159(配列番号2159)、図2161(配列番号2161)、図2163(配列番号2163)、図2165(配列番号2165)、図2167(配列番号2167)、図2169(配列番号2169)、図2171(配列番号2171)、図2173(配列番号2173)、図2175(配列番号2175)、図2177(配列番号2177)、図2179(配列番号2179)、図2181(配列番号2181)、図2183(配列番号2183)、図2185(配列番号2185)、図2187(配列番号2187)、図2189(配列番号2189)、図2191(配列番号2191)、図2193(配列番号2193)、図2195(配列番号2195)、図2197(配列番号2197)、図2199(配列番号2199)、図2201(配列番号2201)、図2203(配列番号2203)、図2205(配列番号2205)、図2207(配列番号2207)、図2209(配列番号2209)、図2211(配列番号2211)、図2213(配列番号2213)、図2215(配列番号2215)、図2218(配列番号2218)、図2220(配列番号2220)、図2222(配列番号2222)、図2224(配列番号2224)、図2226(配列番号2226)、図2228(配列番号2228)、図2231(配列番号2231)、図2233(配列番号2233)、図2235(配列番号2235)、図2237(配列番号2237)、図2239(配列番号2239)、図2241(配列番号2241)、図2243(配列番号2243)、図2245(配列番号2245)、図2247(配列番号2247)、図2249(配列番号2249)、図2251(配列番号2251)、図2253(配列番号2253)、図2255(配列番号2255)、図2257(配列番号2257)、図2259(配列番号2259)、図2261(配列番号2261)、図2263(配列番号2263)、図2265(配列番号2265)、図2267(配列番号2267)、図2269(配列番号2269)、図2271(配列番号2271)、図2273(配列番号2273)、図2275(配列番号2275)、図2277(配列番号2277)、図2279(配列番号2279)、図2281(配列番号2281)、図2283(配列番号2283)、図2285(配列番号2285)、図2287(配列番号2287)、図2289(配列番号2289)、図2291(配列番号2291)、図2293(配列番号2293)、図2295(配列番号2295)、図2297(配列番号2297)、図2299(配列番号2299)、図2302(配列番号2302)、図2304(配列番号2304)、図2306(配列番号2306)、図2310(配列番号2310)、図2313(配列番号2313)、図2315(配列番号2315)、図2317(配列番号2317)、図2319(配列番号2319)、図2321(配列番号2321)、図2324(配列番号2324)、図2326(配列番号2326)、図2328(配列番号2328)、図2330(配列番号2330)、図2332(配列番号2332)、図2334(配列番号2334)、図2336(配列番号2336)、図2338(配列番号2338)、図2340(配列番号2340)、図2342(配列番号2342)、図2344(配列番号2344)、図2347(配列番号2347)、図2350(配列番号2350)、図2352(配列番号2352)、図2354(配列番号2354)、図2356(配列番号2356)、図2358(配列番号2358)、図2360(配列番号2360)、図2362(配列番号2362)、図2364(配列番号2364)、図2366(配列番号2366)、図2368(配列番号2368)、図2370(配列番号2370)、図2372(配列番号2372)、図2374(配列番号2374)、図2376(配列番号2376)、図2378(配列番号2378)、図2380(配列番号2380)、図2382(配列番号2382)、図2384(配列番号2384)、図2386(配列番号2386)、図2388(配列番号2388)、図2390(配列番号2390)、図2392(配列番号2392)、図2394(配列番号2394)、図2396(配列番号2396)、図2398(配列番号2398)、図2400(配列番号2400)、図2402(配列番号2402)、図2404(配列番号2404)、図2407(配列番号2407)、図2409(配列番号2409)、図2412(配列番号2412)、図2415(配列番号2415)、図2419(配列番号2419)、図2423(配列番号2423)、図2425(配列番号2425)、図2427(配列番号2427)、図2429(配列番号2429)、図2431(配列番号2431)、図2433(配列番号2433)、図2435(配列番号2435)、図2437(配列番号2437)、図2439(配列番号2439)、図2441(配列番号2441)、図2443(配列番号2443)、図2445(配列番号2445)、図2448(配列番号2448)、図2450(配列番号2450)、図2452(配列番号2452)、図2454(配列番号2454)、図2457(配列番号2457)、図2459(配列番号2459)、図2461(配列番号2461)、図2465(配列番号2465)、図2468(配列番号2468)、図2472(配列番号2472)、図2474(配列番号2474)、図2482(配列番号2482)又は図2484(配列番号2484)に示す本発明のPROポリペプチド抗PRO抗体を接触させ、(b)試験試料中における抗体とポリペプチドの間の複合体形成を検出することを含み、前記複合体の形成により試験組織細胞を採取した哺乳動物における乾癬の存在が示される方法。 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図2(配列番号2)、図4(配列番号4)、図6(配列番号6)、図8(配列番号8)、図10(配列番号10)、図12(配列番号12)、図14(配列番号14)、図16(配列番号16)、図18(配列番号18)、図20(配列番号20)、図22(配列番号22)、図24(配列番号24)、図26(配列番号26)、図28(配列番号28)、図30(配列番号30)、図32(配列番号32)、図34(配列番号34)、図36(配列番号36)、図38(配列番号38)、図40(配列番号40)、図42(配列番号42)、図43(配列番号43)、図46(配列番号46)、図48(配列番号48)、図50(配列番号50)、図52(配列番号52)、図54(配列番号54)、図56(配列番号56)、図58(配列番号58)、図60(配列番号60)、図62(配列番号62)、図64(配列番号64)、図66(配列番号66)、図68(配列番号68)、図70(配列番号70)、図72(配列番号72)、図74(配列番号74)、図76(配列番号76)、図78(配列番号78)、図80(配列番号80)、図80(配列番号80)、図84(配列番号84)、図86(配列番号86)、図88(配列番号88)、図90(配列番号90)、図92(配列番号92)、図94(配列番号94)、図96(配列番号96)、図98(配列番号98)、図100(配列番号100)、図102(配列番号102)、図104(配列番号104)、図106(配列番号106)、図108(配列番号108)、図108(配列番号108)、図112(配列番号112)、図115(配列番号115)、図117(配列番号117)、図119(配列番号119)、図121(配列番号121)、図123(配列番号123)、図125(配列番号125)、図127(配列番号127)、図129(配列番号129)、図131(配列番号131)、図133(配列番号133)、図135(配列番号135)、図137(配列番号137)、図139(配列番号139)、図141(配列番号141)、図143(配列番号143)、図145(配列番号145)、図147(配列番号147)、図149(配列番号149)、図151(配列番号151)、図153(配列番号153)、図155(配列番号155)、図157(配列番号157)、図159(配列番号159)、図161(配列番号161)、図163(配列番号163)、図165(配列番号165)、図167(配列番号167)、図169(配列番号169)、図171(配列番号171)、図173(配列番号173)、図175(配列番号175)、図177(配列番号177)、図179(配列番号179)、図181(配列番号181)、図183(配列番号183)、図185(配列番号185)、図187(配列番号187)、図189(配列番号189)、図191(配列番号191)、図194(配列番号194)、図196(配列番号196)、図198(配列番号198)、図200(配列番号200)、図202(配列番号202)、図204(配列番号204)、図206(配列番号206)、図208(配列番号208)、図210(配列番号210)、図212(配列番号212)、図214(配列番号214)、図216(配列番号216)、図218(配列番号218)、図221(配列番号221)、図223(配列番号223)、図225(配列番号225)、図227(配列番号227)、図229(配列番号229)、図231(配列番号231)、図233(配列番号233)、図235(配列番号235)、図237(配列番号237)、図239(配列番号239)、図241(配列番号241)、図243(配列番号243)、図245(配列番号245)、図247(配列番号247)、図249(配列番号249)、図251(配列番号251)、図253(配列番号253)、図255(配列番号255)、図257(配列番号257)、図259(配列番号259)、図261(配列番号261)、図263(配列番号263)、図265(配列番号265)、図267(配列番号267)、図269(配列番号269)、図272(配列番号272)、図274(配列番号274)、図276(配列番号276)、図278(配列番号278)、図280(配列番号280)、図282(配列番号282)、図284(配列番号284)、図286(配列番号286)、図288(配列番号288)、図290(配列番号290)、図292(配列番号292)、図294(配列番号294)、図296(配列番号296)、図298(配列番号298)、図300(配列番号300)、図302(配列番号302)、図304(配列番号304)、図306(配列番号306)、図308(配列番号308)、図310(配列番号310)、図312(配列番号312)、図314(配列番号314)、図316(配列番号316)、図318(配列番号318)、図320(配列番号320)、図322(配列番号322)、図324(配列番号324)、図326(配列番号326)、図328(配列番号328)、図330(配列番号330)、図332(配列番号332)、図334(配列番号334)、図336(配列番号336)、図338(配列番号338)、図340(配列番号340)、図342(配列番号342)、図344(配列番号344)、図346(配列番号346)、図348(配列番号348)、図350(配列番号350)、図352(配列番号352)、図354(配列番号354)、図356(配列番号356)、図358(配列番号358)、図360(配列番号360)、図362(配列番号362)、図364(配列番号364)、図366(配列番号366)、図368(配列番号368)、図370(配列番号370)、図372(配列番号372)、図374(配列番号374)、図376(配列番号376)、図378(配列番号378)、図380(配列番号380)、図382(配列番号382)、図384(配列番号384)、図386(配列番号386)、図388(配列番号388)、図390(配列番号390)、図392(配列番号392)、図394(配列番号394)、図396(配列番号396)、図398(配列番号398)、図400(配列番号400)、図402(配列番号402)、図404(配列番号404)、図406(配列番号406)、図408(配列番号408)、図410(配列番号410)、図412(配列番号412)、図414(配列番号414)、図416(配列番号416)、図418(配列番号418)、図420(配列番号420)、図422(配列番号422)、図424(配列番号424)、図426(配列番号426)、図428(配列番号428)、図430(配列番号430)、図432(配列番号432)、図434(配列番号434)、図436(配列番号436)、図438(配列番号438)、図440(配列番号440)、図442(配列番号442)、図444(配列番号444)、図446(配列番号446)、図448(配列番号448)、図450(配列番号450)、図452(配列番号452)、図454(配列番号454)、図456(配列番号456)、図458(配列番号458)、図460(配列番号460)、図462(配列番号462)、図464(配列番号464)、図466(配列番号466)、図467(配列番号467)、図470(配列番号470)、図472(配列番号472)、図474(配列番号474)、図476(配列番号476)、図478(配列番号478)、図480(配列番号480)、図482(配列番号482)、図484(配列番号484)、図486(配列番号486)、図488(配列番号488)、図490(配列番号490)、図492(配列番号492)、図494(配列番号494)、図496(配列番号496)、図498(配列番号498)、図500(配列番号500)、図502(配列番号502)、図504(配列番号504)、図506(配列番号506)、図508(配列番号508)、図510(配列番号510)、図512(配列番号512)、図514(配列番号514)、図516(配列番号516)、図518(配列番号518)、図520(配列番号520)、図522(配列番号522)、図524(配列番号524)、図526(配列番号526)、図528(配列番号528)、図530(配列番号530)、図532(配列番号532)、図534(配列番号534)、図536(配列番号536)、図538(配列番号538)、図540(配列番号540)、図542(配列番号542)、図544(配列番号544)、図546(配列番号546)、図548(配列番号548)、図550(配列番号550)、図552(配列番号552)、図554(配列番号554)、図556(配列番号556)、図558(配列番号558)、図560(配列番号560)、図562(配列番号562)、図564(配列番号564)、図566(配列番号566)、図568(配列番号568)、図570(配列番号570)、図572(配列番号572)、図574(配列番号574)、図576(配列番号576)、図578(配列番号578)、図580(配列番号580)、図582(配列番号582)、図584(配列番号584)、図586(配列番号586)、図588(配列番号588)、図590(配列番号590)、図592(配列番号592)、図594(配列番号594)、図596(配列番号596)、図598(配列番号598)、図600(配列番号600)、図602(配列番号602)、図604(配列番号604)、図606(配列番号606)、図608(配列番号608)、図610(配列番号610)、図612(配列番号612)、図614(配列番号614)、図616(配列番号616)、図618(配列番号618)、図620(配列番号620)、図622(配列番号622)、図624(配列番号624)、図626(配列番号626)、図628(配列番号628)、図630(配列番号630)、図632(配列番号632)、図634(配列番号634)、図637(配列番号637)、図639(配列番号639)、図641(配列番号641)、図643(配列番号643)、図645(配列番号645)、図647(配列番号647)、図649(配列番号649)、図651(配列番号651)、図653(配列番号653)、図655(配列番号655)、図657(配列番号657)、図659(配列番号659)、図661(配列番号661)、図663(配列番号663)、図665(配列番号665)、図667(配列番号667)、図669(配列番号669)、図671(配列番号671)、図673(配列番号673)、図675(配列番号675)、図677(配列番号677)、図679(配列番号679)、図681(配列番号681)、図683(配列番号683)、図685(配列番号685)、図687(配列番号687)、図689(配列番号689)、図691(配列番号691)、図693(配列番号693)、図695(配列番号695)、図697(配列番号697)、図699(配列番号699)、図701(配列番号701)、図703(配列番号703)、図705(配列番号705)、図707(配列番号707)、図709(配列番号709)、図711(配列番号711)、図713(配列番号713)、図715(配列番号715)、図717(配列番号717)、図719(配列番号719)、図721(配列番号721)、図723(配列番号723)、図725(配列番号725)、図727(配列番号727)、図729(配列番号729)、図731(配列番号731)、図733(配列番号733)、図735(配列番号7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52)、図1454(配列番号1454)、図1456(配列番号1456)、図1458(配列番号1458)、図1460(配列番号1460)、図1462(配列番号1462)、図1464(配列番号1464)、図1466(配列番号1466)、図1468(配列番号1468)、図1470(配列番号1470)、図1472(配列番号1472)、図1474(配列番号1474)、図1476(配列番号1476)、図1478(配列番号1478)、図1480(配列番号1480)、図1482(配列番号1482)、図1484(配列番号1484)、図1486(配列番号1486)、図1488(配列番号1488)、図1490(配列番号1490)、図1492(配列番号1492)、図1494(配列番号1494)、図1496(配列番号1496)、図1498(配列番号1498)、図1500(配列番号1500)、図1502(配列番号1502)、図1504(配列番号1504)、図1506(配列番号1506)、図1508(配列番号1508)、図1510(配列番号1510)、図1512(配列番号1512)、図1514(配列番号1514)、図1516(配列番号1516)、図1518(配列番号1518)、図1520(配列番号1520)、図1522(配列番号1522)、図1524(配列番号1524)、図1526(配列番号1526)、図1528(配列番号1528)、図1530(配列番号1530)、図1532(配列番号1532)、図1534(配列番号1534)、図1536(配列番号1536)、図1538(配列番号1538)、図1540(配列番号1540)、図1542(配列番号1542)、図1544(配列番号1544)、図1546(配列番号1546)、図1548(配列番号1548)、図1550(配列番号1550)、図1552(配列番号1552)、図1554(配列番号1554)、図1556(配列番号1556)、図1558(配列番号1558)、図1560(配列番号1560)、図1562(配列番号1562)、図1564(配列番号1654)、図1566(配列番号1566)、図1568(配列番号1568)、図1570(配列番号1570)、図1572(配列番号1572)、図1574(配列番号1574)、図1576(配列番号1576)、図1578(配列番号1578)、図1580(配列番号1580)、図1582(配列番号1582)、図1585(配列番号1585)、図1587(配列番号1587)、図1590(配列番号1590)、図1592(配列番号1592)、図1594(配列番号1594)、図1597(配列番号1597)、図1599(配列番号1599)、図1601(配列番号1601)、図1603(配列番号1603)、図1605(配列番号1605)、図1607(配列番号1607)、図1610(配列番号1610)、図1613(配列番号1613)、図1615(配列番号1615)、図1617(配列番号1617)、図1619(配列番号1619)、図1621(配列番号1621)、図1623(配列番号1623)、図1625(配列番号1625)、図1627(配列番号1627)、図1629(配列番号1629)、図1631(配列番号1631)、図1633(配列番号1633)、図1635(配列番号1635)、図1637(配列番号1637)、図1639(配列番号1639)、図1641(配列番号1641)、図1643(配列番号1643)、図1645(配列番号1645)、図1647(配列番号1647)、図1650(配列番号1650)、図1654(配列番号1654)、図1656(配列番号1656)、図1658(配列番号1658)、図1660(配列番号1660)、図1662(配列番号1662)、図1664(配列番号1664)、図1666(配列番号1666)、図1668(配列番号1668)、図1670(配列番号1670)、図1672(配列番号1672)、図1674(配列番号1674)、図1676(配列番号1676)、図1678(配列番号1678)、図1680(配列番号1680)、図1682(配列番号1682)、図1686(配列番号1686)、図1688(配列番号1688)、図1691(配列番号1691)、図1693(配列番号1693)、図1695(配列番号1695)、図1697(配列番号1697)、図1699(配列番号1699)、図1701(配列番号1701)、図1703(配列番号1703)、図1705(配列番号1705)、図1708(配列番号1708)、図1710(配列番号1710)、図1712(配列番号1712)、図1714(配列番号1714)、図1716(配列番号1716)、図1718(配列番号1718)、図1720(配列番号1720)、図1722(配列番号1722)、図1725(配列番号1725)、図1727(配列番号1727)、図1729(配列番号1729)、図1731(配列番号1731)、図1733(配列番号1733)、図1735(配列番号1735)、図1738(配列番号1738)、図1740(配列番号1740)、図1742(配列番号1742)、図1744(配列番号1744)、図1746(配列番号1746)、図1748(配列番号1748)、図1750(配列番号1750)、図1752(配列番号1752)、図1754(配列番号1754)、図1756(配列番号1756)、図1758(配列番号1758)、図1760(配列番号1760)、図1762(配列番号1762)、図1764(配列番号1764)、図1767(配列番号1767)、図1769(配列番号1769)、図1771(配列番号1771)、図1774(配列番号1774)、図1776(配列番号1776)、図1779(配列番号1779)、図1782(配列番号1782)、図1784(配列番号1784)、図1786(配列番号1786)、図1789(配列番号1789)、図1791(配列番号1791)、図1794(配列番号1794)、図1796(配列番号1796)、図1798(配列番号1798)、図1800(配列番号1800)、図1802(配列番号1802)、図1804(配列番号1804)、図1806(配列番号1806)、図1808(配列番号1808)、図1810(配列番号1810)、図1812(配列番号1812)、図1814(配列番号1814)、図1816(配列番号1816)、図1818(配列番号1818)、図1820(配列番号1820)、図1822(配列番号1822)、図1824(配列番号1824)、図1826(配列番号1826)、図1828(配列番号1828)、図1830(配列番号1830)、図1832(配列番号1832)、図1834(配列番号1834)、図1836(配列番号1836)、図1838(配列番号1838)、図1840(配列番号1840)、図1842(配列番号1842)、図1844(配列番号1844)、図1846(配列番号1846)、図1848(配列番号1848)、図1850(配列番号1850)、図1852(配列番号1852)、図1856(配列番号1856)、図1858(配列番号1858)、図1860(配列番号1860)、図1862(配列番号1862)、図1864(配列番号1864)、図1867(配列番号1867)、図1869(配列番号1869)、図1871(配列番号1871)、図1873(配列番号1873)、図1876(配列番号1876)、図1878(配列番号1878)、図1880(配列番号1880)、図1883(配列番号1883)、図1885(配列番号1885)、図1887(配列番号1887)、図1890(配列番号1890)、図1892(配列番号1892)、図1894(配列番号1894)、図1896(配列番号1896)、図1898(配列番号1898)、図1900(配列番号1900)、図1902(配列番号1902)、図1904(配列番号1904)、図1906(配列番号1906)、図1908(配列番号1908)、図1910(配列番号1910)、図1912(配列番号1912)、図1914(配列番号1914)、図1916(配列番号1916)、図1918(配列番号1918)、図1920(配列番号1920)、図1922(配列番号1922)、図1924(配列番号1924)、図1926(配列番号1926)、図1928(配列番号1928)、図1930(配列番号1930)、図1932(配列番号1932)、図1934(配列番号1934)、図1936(配列番号1936)、図1938(配列番号1938)、図1940(配列番号1940)、図1942(配列番号1942)、図1944(配列番号1944)、図1946(配列番号1946)、図1948(配列番号1948)、図1951(配列番号1951)、図1953(配列番号1953)、図1955(配列番号1955)、図1957(配列番号1957)、図1959(配列番号1959)、図1961(配列番号1961)、図1964(配列番号1964)、図1966(配列番号1966)、図1968(配列番号1968)、図1970(配列番号1970)、図1972(配列番号1972)、図1974(配列番号1974)、図1976(配列番号1976)、図1978(配列番号1978)、図1980(配列番号1980)、図1982(配列番号1982)、図1984(配列番号1984)、図1986(配列番号1986)、図1988(配列番号1988)、図1990(配列番号1990)、図1992(配列番号1992)、図1994(配列番号1994)、図1996(配列番号1996)、図1998(配列番号1998)、図2000(配列番号2000)、図2002(配列番号2002)、図2004(配列番号2004)、図2006(配列番号2006)、図2008(配列番号2008)、図2010(配列番号2010)、図2012(配列番号2012)、図2014(配列番号2014)、図2016(配列番号2016)、図2018(配列番号2018)、図2020(配列番号2020)、図2022(配列番号2022)、図2024(配列番号2024)、図2026(配列番号2026)、図2028(配列番号2028)、図2030(配列番号2030)、図2032(配列番号2032)、図2034(配列番号2034)、図2036(配列番号2036)、図2038(配列番号2038)、図2040(配列番号2040)、図2042(配列番号2042)、図2044(配列番号2044)、図2046(配列番号2046)、図2048(配列番号2048)、図2050(配列番号2050)、図2052(配列番号5052)、図2054(配列番号2054)、図2056(配列番号2056)、図2058(配列番号2058)、図2060(配列番号2060)、図2062(配列番号2062)、図2064(配列番号2064)、図2066(配列番号2066)、図2068(配列番号2068)、図2070(配列番号2070)、図2072(配列番号2072)、図2074(配列番号2074)、図2076(配列番号2076)、図2078(配列番号2078)、図2080(配列番号2080)、図2082(配列番号2082)、図2084(配列番号2084)、図2086(配列番号2086)、図2088(配列番号2088)、図2090(配列番号2090)、図2092(配列番号2092)、図2094(配列番号2094)、図2096(配列番号2096)、図2098(配列番号2098)、図2100(配列番号2100)、図2102(配列番号2102)、図2104(配列番号2104)、図210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図2(配列番号2)、図4(配列番号4)、図6(配列番号6)、図8(配列番号8)、図10(配列番号10)、図12(配列番号12)、図14(配列番号14)、図16(配列番号16)、図18(配列番号18)、図20(配列番号20)、図22(配列番号22)、図24(配列番号24)、図26(配列番号26)、図28(配列番号28)、図30(配列番号30)、図32(配列番号32)、図34(配列番号34)、図36(配列番号36)、図38(配列番号38)、図40(配列番号40)、図42(配列番号42)、図43(配列番号43)、図46(配列番号46)、図48(配列番号48)、図50(配列番号50)、図52(配列番号52)、図54(配列番号54)、図56(配列番号56)、図58(配列番号58)、図60(配列番号60)、図62(配列番号62)、図64(配列番号64)、図66(配列番号66)、図68(配列番号68)、図70(配列番号70)、図72(配列番号72)、図74(配列番号74)、図76(配列番号76)、図78(配列番号78)、図80(配列番号80)、図80(配列番号80)、図84(配列番号84)、図86(配列番号86)、図88(配列番号88)、図90(配列番号90)、図92(配列番号92)、図94(配列番号94)、図96(配列番号96)、図98(配列番号98)、図100(配列番号100)、図102(配列番号102)、図104(配列番号104)、図106(配列番号106)、図108(配列番号108)、図108(配列番号108)、図112(配列番号112)、図115(配列番号115)、図117(配列番号117)、図119(配列番号119)、図121(配列番号121)、図123(配列番号123)、図125(配列番号125)、図127(配列番号127)、図129(配列番号129)、図131(配列番号131)、図133(配列番号133)、図135(配列番号135)、図137(配列番号137)、図139(配列番号139)、図141(配列番号141)、図143(配列番号143)、図145(配列番号145)、図147(配列番号147)、図149(配列番号149)、図151(配列番号151)、図153(配列番号153)、図155(配列番号155)、図157(配列番号157)、図159(配列番号159)、図161(配列番号161)、図163(配列番号163)、図165(配列番号165)、図167(配列番号167)、図169(配列番号169)、図171(配列番号171)、図173(配列番号173)、図175(配列番号175)、図177(配列番号177)、図179(配列番号179)、図181(配列番号181)、図183(配列番号183)、図185(配列番号185)、図187(配列番号187)、図189(配列番号189)、図191(配列番号191)、図194(配列番号194)、図196(配列番号196)、図198(配列番号198)、図200(配列番号200)、図202(配列番号202)、図204(配列番号204)、図206(配列番号206)、図208(配列番号208)、図210(配列番号210)、図212(配列番号212)、図214(配列番号214)、図216(配列番号216)、図218(配列番号218)、図221(配列番号221)、図223(配列番号223)、図225(配列番号225)、図227(配列番号227)、図229(配列番号229)、図231(配列番号231)、図233(配列番号233)、図235(配列番号235)、図237(配列番号237)、図239(配列番号239)、図241(配列番号241)、図243(配列番号243)、図245(配列番号245)、図247(配列番号247)、図249(配列番号249)、図251(配列番号251)、図253(配列番号253)、図255(配列番号255)、図257(配列番号257)、図259(配列番号259)、図261(配列番号261)、図263(配列番号263)、図265(配列番号265)、図267(配列番号267)、図269(配列番号269)、図272(配列番号272)、図274(配列番号274)、図276(配列番号276)、図278(配列番号278)、図280(配列番号280)、図282(配列番号282)、図284(配列番号284)、図286(配列番号286)、図288(配列番号288)、図290(配列番号290)、図292(配列番号292)、図294(配列番号294)、図296(配列番号296)、図298(配列番号298)、図300(配列番号300)、図302(配列番号302)、図304(配列番号304)、図306(配列番号306)、図308(配列番号308)、図310(配列番号310)、図312(配列番号312)、図314(配列番号314)、図316(配列番号316)、図318(配列番号318)、図320(配列番号320)、図322(配列番号322)、図324(配列番号324)、図326(配列番号326)、図328(配列番号328)、図330(配列番号330)、図332(配列番号332)、図334(配列番号334)、図336(配列番号336)、図338(配列番号338)、図340(配列番号340)、図342(配列番号342)、図344(配列番号344)、図346(配列番号346)、図348(配列番号348)、図350(配列番号350)、図352(配列番号352)、図354(配列番号354)、図356(配列番号356)、図358(配列番号358)、図360(配列番号360)、図362(配列番号362)、図364(配列番号364)、図366(配列番号366)、図368(配列番号368)、図370(配列番号370)、図372(配列番号372)、図374(配列番号374)、図376(配列番号376)、図378(配列番号378)、図380(配列番号380)、図382(配列番号382)、図384(配列番号384)、図386(配列番号386)、図388(配列番号388)、図390(配列番号390)、図392(配列番号392)、図394(配列番号394)、図396(配列番号396)、図398(配列番号398)、図400(配列番号400)、図402(配列番号402)、図404(配列番号404)、図406(配列番号406)、図408(配列番号408)、図410(配列番号410)、図412(配列番号412)、図414(配列番号414)、図416(配列番号416)、図418(配列番号418)、図420(配列番号420)、図422(配列番号422)、図424(配列番号424)、図426(配列番号426)、図428(配列番号428)、図430(配列番号430)、図432(配列番号432)、図434(配列番号434)、図436(配列番号436)、図438(配列番号438)、図440(配列番号440)、図442(配列番号442)、図444(配列番号444)、図446(配列番号446)、図448(配列番号448)、図450(配列番号450)、図452(配列番号452)、図454(配列番号454)、図456(配列番号456)、図458(配列番号458)、図460(配列番号460)、図462(配列番号462)、図464(配列番号464)、図466(配列番号466)、図467(配列番号467)、図470(配列番号470)、図472(配列番号472)、図474(配列番号474)、図476(配列番号476)、図478(配列番号478)、図480(配列番号480)、図482(配列番号482)、図484(配列番号484)、図486(配列番号486)、図488(配列番号488)、図490(配列番号490)、図492(配列番号492)、図494(配列番号494)、図496(配列番号496)、図498(配列番号498)、図500(配列番号500)、図502(配列番号502)、図504(配列番号504)、図506(配列番号506)、図508(配列番号508)、図510(配列番号510)、図512(配列番号512)、図514(配列番号514)、図516(配列番号516)、図518(配列番号518)、図520(配列番号520)、図522(配列番号522)、図524(配列番号524)、図526(配列番号526)、図528(配列番号528)、図530(配列番号530)、図532(配列番号532)、図534(配列番号534)、図536(配列番号536)、図538(配列番号538)、図540(配列番号540)、図542(配列番号542)、図544(配列番号544)、図546(配列番号546)、図548(配列番号548)、図550(配列番号550)、図552(配列番号552)、図554(配列番号554)、図556(配列番号556)、図558(配列番号558)、図560(配列番号560)、図562(配列番号562)、図564(配列番号564)、図566(配列番号566)、図568(配列番号568)、図570(配列番号570)、図572(配列番号572)、図574(配列番号574)、図576(配列番号576)、図578(配列番号578)、図580(配列番号580)、図582(配列番号582)、図584(配列番号584)、図586(配列番号586)、図588(配列番号588)、図590(配列番号590)、図592(配列番号592)、図594(配列番号594)、図596(配列番号596)、図598(配列番号598)、図600(配列番号600)、図602(配列番号602)、図604(配列番号604)、図606(配列番号606)、図608(配列番号608)、図610(配列番号610)、図612(配列番号612)、図614(配列番号614)、図616(配列番号616)、図618(配列番号618)、図620(配列番号620)、図622(配列番号622)、図624(配列番号624)、図626(配列番号626)、図628(配列番号628)、図630(配列番号630)、図632(配列番号632)、図634(配列番号634)、図637(配列番号637)、図639(配列番号639)、図641(配列番号641)、図643(配列番号643)、図645(配列番号645)、図647(配列番号647)、図649(配列番号649)、図651(配列番号651)、図653(配列番号653)、図655(配列番号655)、図657(配列番号657)、図659(配列番号659)、図661(配列番号661)、図663(配列番号663)、図665(配列番号665)、図667(配列番号667)、図669(配列番号669)、図671(配列番号671)、図673(配列番号673)、図675(配列番号675)、図677(配列番号677)、図679(配列番号679)、図681(配列番号681)、図683(配列番号683)、図685(配列番号685)、図687(配列番号687)、図689(配列番号689)、図691(配列番号691)、図693(配列番号693)、図695(配列番号695)、図697(配列番号697)、図699(配列番号699)、図701(配列番号701)、図703(配列番号703)、図705(配列番号705)、図707(配列番号707)、図709(配列番号709)、図711(配列番号711)、図713(配列番号713)、図715(配列番号715)、図717(配列番号717)、図719(配列番号719)、図721(配列番号721)、図723(配列番号723)、図725(配列番号725)、図727(配列番号727)、図729(配列番号729)、図731(配列番号731)、図733(配列番号733)、図735(配列番号7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52)、図1454(配列番号1454)、図1456(配列番号1456)、図1458(配列番号1458)、図1460(配列番号1460)、図1462(配列番号1462)、図1464(配列番号1464)、図1466(配列番号1466)、図1468(配列番号1468)、図1470(配列番号1470)、図1472(配列番号1472)、図1474(配列番号1474)、図1476(配列番号1476)、図1478(配列番号1478)、図1480(配列番号1480)、図1482(配列番号1482)、図1484(配列番号1484)、図1486(配列番号1486)、図1488(配列番号1488)、図1490(配列番号1490)、図1492(配列番号1492)、図1494(配列番号1494)、図1496(配列番号1496)、図1498(配列番号1498)、図1500(配列番号1500)、図1502(配列番号1502)、図1504(配列番号1504)、図1506(配列番号1506)、図1508(配列番号1508)、図1510(配列番号1510)、図1512(配列番号1512)、図1514(配列番号1514)、図1516(配列番号1516)、図1518(配列番号1518)、図1520(配列番号1520)、図1522(配列番号1522)、図1524(配列番号1524)、図1526(配列番号1526)、図1528(配列番号1528)、図1530(配列番号1530)、図1532(配列番号1532)、図1534(配列番号1534)、図1536(配列番号1536)、図1538(配列番号1538)、図1540(配列番号1540)、図1542(配列番号1542)、図1544(配列番号1544)、図1546(配列番号1546)、図1548(配列番号1548)、図1550(配列番号1550)、図1552(配列番号1552)、図1554(配列番号1554)、図1556(配列番号1556)、図1558(配列番号1558)、図1560(配列番号1560)、図1562(配列番号1562)、図1564(配列番号1654)、図1566(配列番号1566)、図1568(配列番号1568)、図1570(配列番号1570)、図1572(配列番号1572)、図1574(配列番号1574)、図1576(配列番号1576)、図1578(配列番号1578)、図1580(配列番号1580)、図1582(配列番号1582)、図1585(配列番号1585)、図1587(配列番号1587)、図1590(配列番号1590)、図1592(配列番号1592)、図1594(配列番号1594)、図1597(配列番号1597)、図1599(配列番号1599)、図1601(配列番号1601)、図1603(配列番号1603)、図1605(配列番号1605)、図1607(配列番号1607)、図1610(配列番号1610)、図1613(配列番号1613)、図1615(配列番号1615)、図1617(配列番号1617)、図1619(配列番号1619)、図1621(配列番号1621)、図1623(配列番号1623)、図1625(配列番号1625)、図1627(配列番号1627)、図1629(配列番号1629)、図1631(配列番号1631)、図1633(配列番号1633)、図1635(配列番号1635)、図1637(配列番号1637)、図1639(配列番号1639)、図1641(配列番号1641)、図1643(配列番号1643)、図1645(配列番号1645)、図1647(配列番号1647)、図1650(配列番号1650)、図1654(配列番号1654)、図1656(配列番号1656)、図1658(配列番号1658)、図1660(配列番号1660)、図1662(配列番号1662)、図1664(配列番号1664)、図1666(配列番号1666)、図1668(配列番号1668)、図1670(配列番号1670)、図1672(配列番号1672)、図1674(配列番号1674)、図1676(配列番号1676)、図1678(配列番号1678)、図1680(配列番号1680)、図1682(配列番号1682)、図1686(配列番号1686)、図1688(配列番号1688)、図1691(配列番号1691)、図1693(配列番号1693)、図1695(配列番号1695)、図1697(配列番号1697)、図1699(配列番号1699)、図1701(配列番号1701)、図1703(配列番号1703)、図1705(配列番号1705)、図1708(配列番号1708)、図1710(配列番号1710)、図1712(配列番号1712)、図1714(配列番号1714)、図1716(配列番号1716)、図1718(配列番号1718)、図1720(配列番号1720)、図1722(配列番号1722)、図1725(配列番号1725)、図1727(配列番号1727)、図1729(配列番号1729)、図1731(配列番号1731)、図1733(配列番号1733)、図1735(配列番号1735)、図1738(配列番号1738)、図1740(配列番号1740)、図1742(配列番号1742)、図1744(配列番号1744)、図1746(配列番号1746)、図1748(配列番号1748)、図1750(配列番号1750)、図1752(配列番号1752)、図1754(配列番号1754)、図1756(配列番号1756)、図1758(配列番号1758)、図1760(配列番号1760)、図1762(配列番号1762)、図1764(配列番号1764)、図1767(配列番号1767)、図1769(配列番号1769)、図1771(配列番号1771)、図1774(配列番号1774)、図1776(配列番号1776)、図1779(配列番号1779)、図1782(配列番号1782)、図1784(配列番号1784)、図1786(配列番号1786)、図1789(配列番号1789)、図1791(配列番号1791)、図1794(配列番号1794)、図1796(配列番号1796)、図1798(配列番号1798)、図1800(配列番号1800)、図1802(配列番号1802)、図1804(配列番号1804)、図1806(配列番号1806)、図1808(配列番号1808)、図1810(配列番号1810)、図1812(配列番号1812)、図1814(配列番号1814)、図1816(配列番号1816)、図1818(配列番号1818)、図1820(配列番号1820)、図1822(配列番号1822)、図1824(配列番号1824)、図1826(配列番号1826)、図1828(配列番号1828)、図1830(配列番号1830)、図1832(配列番号1832)、図1834(配列番号1834)、図1836(配列番号1836)、図1838(配列番号1838)、図1840(配列番号1840)、図1842(配列番号1842)、図1844(配列番号1844)、図1846(配列番号1846)、図1848(配列番号1848)、図1850(配列番号1850)、図1852(配列番号1852)、図1856(配列番号1856)、図1858(配列番号1858)、図1860(配列番号1860)、図1862(配列番号1862)、図1864(配列番号1864)、図1867(配列番号1867)、図1869(配列番号1869)、図1871(配列番号1871)、図1873(配列番号1873)、図1876(配列番号1876)、図1878(配列番号1878)、図1880(配列番号1880)、図1883(配列番号1883)、図1885(配列番号1885)、図1887(配列番号1887)、図1890(配列番号1890)、図1892(配列番号1892)、図1894(配列番号1894)、図1896(配列番号1896)、図1898(配列番号1898)、図1900(配列番号1900)、図1902(配列番号1902)、図1904(配列番号1904)、図1906(配列番号1906)、図1908(配列番号1908)、図1910(配列番号1910)、図1912(配列番号1912)、図1914(配列番号1914)、図1916(配列番号1916)、図1918(配列番号1918)、図1920(配列番号1920)、図1922(配列番号1922)、図1924(配列番号1924)、図1926(配列番号1926)、図1928(配列番号1928)、図1930(配列番号1930)、図1932(配列番号1932)、図1934(配列番号1934)、図1936(配列番号1936)、図1938(配列番号1938)、図1940(配列番号1940)、図1942(配列番号1942)、図1944(配列番号1944)、図1946(配列番号1946)、図1948(配列番号1948)、図1951(配列番号1951)、図1953(配列番号1953)、図1955(配列番号1955)、図1957(配列番号1957)、図1959(配列番号1959)、図1961(配列番号1961)、図1964(配列番号1964)、図1966(配列番号1966)、図1968(配列番号1968)、図1970(配列番号1970)、図1972(配列番号1972)、図1974(配列番号1974)、図1976(配列番号1976)、図1978(配列番号1978)、図1980(配列番号1980)、図1982(配列番号1982)、図1984(配列番号1984)、図1986(配列番号1986)、図1988(配列番号1988)、図1990(配列番号1990)、図1992(配列番号1992)、図1994(配列番号1994)、図1996(配列番号1996)、図1998(配列番号1998)、図2000(配列番号2000)、図2002(配列番号2002)、図2004(配列番号2004)、図2006(配列番号2006)、図2008(配列番号2008)、図2010(配列番号2010)、図2012(配列番号2012)、図2014(配列番号2014)、図2016(配列番号2016)、図2018(配列番号2018)、図2020(配列番号2020)、図2022(配列番号2022)、図2024(配列番号2024)、図2026(配列番号2026)、図2028(配列番号2028)、図2030(配列番号2030)、図2032(配列番号2032)、図2034(配列番号2034)、図2036(配列番号2036)、図2038(配列番号2038)、図2040(配列番号2040)、図2042(配列番号2042)、図2044(配列番号2044)、図2046(配列番号2046)、図2048(配列番号2048)、図2050(配列番号2050)、図2052(配列番号5052)、図2054(配列番号2054)、図2056(配列番号2056)、図2058(配列番号2058)、図2060(配列番号2060)、図2062(配列番号2062)、図2064(配列番号2064)、図2066(配列番号2066)、図2068(配列番号2068)、図2070(配列番号2070)、図2072(配列番号2072)、図2074(配列番号2074)、図2076(配列番号2076)、図2078(配列番号2078)、図2080(配列番号2080)、図2082(配列番号2082)、図2084(配列番号2084)、図2086(配列番号2086)、図2088(配列番号2088)、図2090(配列番号2090)、図2092(配列番号2092)、図2094(配列番号2094)、図2096(配列番号2096)、図2098(配列番号2098)、図2100(配列番号2100)、図2102(配列番号2102)、図2104(配列番号2104)、図210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図2(配列番号2)、図4(配列番号4)、図6(配列番号6)、図8(配列番号8)、図10(配列番号10)、図12(配列番号12)、図14(配列番号14)、図16(配列番号16)、図18(配列番号18)、図20(配列番号20)、図22(配列番号22)、図24(配列番号24)、図26(配列番号26)、図28(配列番号28)、図30(配列番号30)、図32(配列番号32)、図34(配列番号34)、図36(配列番号36)、図38(配列番号38)、図40(配列番号40)、図42(配列番号42)、図43(配列番号43)、図46(配列番号46)、図48(配列番号48)、図50(配列番号50)、図52(配列番号52)、図54(配列番号54)、図56(配列番号56)、図58(配列番号58)、図60(配列番号60)、図62(配列番号62)、図64(配列番号64)、図66(配列番号66)、図68(配列番号68)、図70(配列番号70)、図72(配列番号72)、図74(配列番号74)、図76(配列番号76)、図78(配列番号78)、図80(配列番号80)、図80(配列番号80)、図84(配列番号84)、図86(配列番号86)、図88(配列番号88)、図90(配列番号90)、図92(配列番号92)、図94(配列番号94)、図96(配列番号96)、図98(配列番号98)、図100(配列番号100)、図102(配列番号102)、図104(配列番号104)、図106(配列番号106)、図108(配列番号108)、図108(配列番号108)、図112(配列番号112)、図115(配列番号115)、図117(配列番号117)、図119(配列番号119)、図121(配列番号121)、図123(配列番号123)、図125(配列番号125)、図127(配列番号127)、図129(配列番号129)、図131(配列番号131)、図133(配列番号133)、図135(配列番号135)、図137(配列番号137)、図139(配列番号139)、図141(配列番号141)、図143(配列番号143)、図145(配列番号145)、図147(配列番号147)、図149(配列番号149)、図151(配列番号151)、図153(配列番号153)、図155(配列番号155)、図157(配列番号157)、図159(配列番号159)、図161(配列番号161)、図163(配列番号163)、図165(配列番号165)、図167(配列番号167)、図169(配列番号169)、図171(配列番号171)、図173(配列番号173)、図175(配列番号175)、図177(配列番号177)、図179(配列番号179)、図181(配列番号181)、図183(配列番号183)、図185(配列番号185)、図187(配列番号187)、図189(配列番号189)、図191(配列番号191)、図194(配列番号194)、図196(配列番号196)、図198(配列番号198)、図200(配列番号200)、図202(配列番号202)、図204(配列番号204)、図206(配列番号206)、図208(配列番号208)、図210(配列番号210)、図212(配列番号212)、図214(配列番号214)、図216(配列番号216)、図218(配列番号218)、図221(配列番号221)、図223(配列番号223)、図225(配列番号225)、図227(配列番号227)、図229(配列番号229)、図231(配列番号231)、図233(配列番号233)、図235(配列番号235)、図237(配列番号237)、図239(配列番号239)、図241(配列番号241)、図243(配列番号243)、図245(配列番号245)、図247(配列番号247)、図249(配列番号249)、図251(配列番号251)、図253(配列番号253)、図255(配列番号255)、図257(配列番号257)、図259(配列番号259)、図261(配列番号261)、図263(配列番号263)、図265(配列番号265)、図267(配列番号267)、図269(配列番号269)、図272(配列番号272)、図274(配列番号274)、図276(配列番号276)、図278(配列番号278)、図280(配列番号280)、図282(配列番号282)、図284(配列番号284)、図286(配列番号286)、図288(配列番号288)、図290(配列番号290)、図292(配列番号292)、図294(配列番号294)、図296(配列番号296)、図298(配列番号298)、図300(配列番号300)、図302(配列番号302)、図304(配列番号304)、図306(配列番号306)、図308(配列番号308)、図310(配列番号310)、図312(配列番号312)、図314(配列番号314)、図316(配列番号316)、図318(配列番号318)、図320(配列番号320)、図322(配列番号322)、図324(配列番号324)、図326(配列番号326)、図328(配列番号328)、図330(配列番号330)、図332(配列番号332)、図334(配列番号334)、図336(配列番号336)、図338(配列番号338)、図340(配列番号340)、図342(配列番号342)、図344(配列番号344)、図346(配列番号346)、図348(配列番号348)、図350(配列番号350)、図352(配列番号352)、図354(配列番号354)、図356(配列番号356)、図358(配列番号358)、図360(配列番号360)、図362(配列番号362)、図364(配列番号364)、図366(配列番号366)、図368(配列番号368)、図370(配列番号370)、図372(配列番号372)、図374(配列番号374)、図376(配列番号376)、図378(配列番号378)、図380(配列番号380)、図382(配列番号382)、図384(配列番号384)、図386(配列番号386)、図388(配列番号388)、図390(配列番号390)、図392(配列番号392)、図394(配列番号394)、図396(配列番号396)、図398(配列番号398)、図400(配列番号400)、図402(配列番号402)、図404(配列番号404)、図406(配列番号406)、図408(配列番号408)、図410(配列番号410)、図412(配列番号412)、図414(配列番号414)、図416(配列番号416)、図418(配列番号418)、図420(配列番号420)、図422(配列番号422)、図424(配列番号424)、図426(配列番号426)、図428(配列番号428)、図430(配列番号430)、図432(配列番号432)、図434(配列番号434)、図436(配列番号436)、図438(配列番号438)、図440(配列番号440)、図442(配列番号442)、図444(配列番号444)、図446(配列番号446)、図448(配列番号448)、図450(配列番号450)、図452(配列番号452)、図454(配列番号454)、図456(配列番号456)、図458(配列番号458)、図460(配列番号460)、図462(配列番号462)、図464(配列番号464)、図466(配列番号466)、図467(配列番号467)、図470(配列番号470)、図472(配列番号472)、図474(配列番号474)、図476(配列番号476)、図478(配列番号478)、図480(配列番号480)、図482(配列番号482)、図484(配列番号484)、図486(配列番号486)、図488(配列番号488)、図490(配列番号490)、図492(配列番号492)、図494(配列番号494)、図496(配列番号496)、図498(配列番号498)、図500(配列番号500)、図502(配列番号502)、図504(配列番号504)、図506(配列番号506)、図508(配列番号508)、図510(配列番号510)、図512(配列番号512)、図514(配列番号514)、図516(配列番号516)、図518(配列番号518)、図520(配列番号520)、図522(配列番号522)、図524(配列番号524)、図526(配列番号526)、図528(配列番号528)、図530(配列番号530)、図532(配列番号532)、図534(配列番号534)、図536(配列番号536)、図538(配列番号538)、図540(配列番号540)、図542(配列番号542)、図544(配列番号544)、図546(配列番号546)、図548(配列番号548)、図550(配列番号550)、図552(配列番号552)、図554(配列番号554)、図556(配列番号556)、図558(配列番号558)、図560(配列番号560)、図562(配列番号562)、図564(配列番号564)、図566(配列番号566)、図568(配列番号568)、図570(配列番号570)、図572(配列番号572)、図574(配列番号574)、図576(配列番号576)、図578(配列番号578)、図580(配列番号580)、図582(配列番号582)、図584(配列番号584)、図586(配列番号586)、図588(配列番号588)、図590(配列番号590)、図592(配列番号592)、図594(配列番号594)、図596(配列番号596)、図598(配列番号598)、図600(配列番号600)、図602(配列番号602)、図604(配列番号604)、図606(配列番号606)、図608(配列番号608)、図610(配列番号610)、図612(配列番号612)、図614(配列番号614)、図616(配列番号616)、図618(配列番号618)、図620(配列番号620)、図622(配列番号622)、図624(配列番号624)、図626(配列番号626)、図628(配列番号628)、図630(配列番号630)、図632(配列番号632)、図634(配列番号634)、図637(配列番号637)、図639(配列番号639)、図641(配列番号641)、図643(配列番号643)、図645(配列番号645)、図647(配列番号647)、図649(配列番号649)、図651(配列番号651)、図653(配列番号653)、図655(配列番号655)、図657(配列番号657)、図659(配列番号659)、図661(配列番号661)、図663(配列番号663)、図665(配列番号665)、図667(配列番号667)、図669(配列番号669)、図671(配列番号671)、図673(配列番号673)、図675(配列番号675)、図677(配列番号677)、図679(配列番号679)、図681(配列番号681)、図683(配列番号683)、図685(配列番号685)、図687(配列番号687)、図689(配列番号689)、図691(配列番号691)、図693(配列番号693)、図695(配列番号695)、図697(配列番号697)、図699(配列番号699)、図701(配列番号701)、図703(配列番号703)、図705(配列番号705)、図707(配列番号707)、図709(配列番号709)、図711(配列番号711)、図713(配列番号713)、図715(配列番号715)、図717(配列番号717)、図719(配列番号719)、図721(配列番号721)、図723(配列番号723)、図725(配列番号725)、図727(配列番号727)、図729(配列番号729)、図731(配列番号731)、図733(配列番号733)、図735(配列番号7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