JPH08511682A

JPH08511682A - 組み換えｂｐｉ蛋白およびｌｂｐ蛋白、それをコードする核酸分子、その生産方法並びにそれらの使用

Info

Publication number: JPH08511682A
Application number: JP6524554A
Authority: JP
Inventors: ランダルダヴリュウ．スコット; マリアンエヌ．マッラ
Original assignee: インサイトファーマシューティカルズ，インク．
Priority date: 1993-04-30
Filing date: 1994-04-29
Publication date: 1996-12-10
Also published as: WO1994025476A1; CA2161971A1; EP0760849A1; EP0760849A4; AU6942994A

Abstract

(57)【要約】本発明は、BPI変異体、LBP変異体、LBP-BPIキメラ、BPI-IgGキメラ、LBP-IgGキメラあるいはLBP-BPI-IgGキメラをコードする組換え核酸分子と、それらによってコードされるタンパク質を提供するものである。本発明はさらに、BPI変異体、ＬBP変異体、LBP-BPIキメラ、BPI-IgGキメラ、LBP-IgGキメラあるいはLBP-BPI-IgGキメラを生産するための宿主ベクター系と、これらの宿主ベクター系を用いて上記タンパク質を産生させるための方法を提供するものである。本発明は、治療上有効な量のBPI変異体、LBP変異体、LBP-BPIキメラ、BPI-IgGキメラ、LBP-IgGキメラあるいはLBP-BPI-IgGキメラと薬剤学的に許容されるキャリヤーを含む薬剤学的組成物、およびこれらを用いて内毒素関連疾患を患う患者を治療するための方法を提供するものである。最後に、本発明は、予防上有効な分量のBPI変異体、LBP変異体、LBP-BPIキメラ、BPI-IgGキメラ、LBP-IgGキメラあるいはLBP-BPI-IgGキメラを被検者に投与することを含む、患者の内毒素関連疾患を予防する方法を提供するものである。

Description

【発明の詳細な説明】組み換えＢＰＩ蛋白およびＬＢＰ蛋白、それをコードする核酸分子、その生産方法並びにそれらの使用本出願は、１９９３年１２月１０日に出願された米国出願番号０８／１６５，７１７号の一部継続出願であり、前記米国出願番号０８／１６５，７１７号は、次の出願（ａ）および（ｂ）の一部継続出願である。（ａ）１９９０年８月１３日に出願された米国出願番号０７／５６７，０１６号および１９９１年４月３０日に出願されたＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９１／０５７５８の一部継続出願である１９９３年４月３０日に出願された米国出願番号０８／０５６，２９２号（ｂ）１９９２年９月２８日に出願されたＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９２／０８２３４。ここで、ＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９２／０８２３４は、１９９１年４月５日に出願された米国出願番号０７／６８１，５５１号の一部継続出願である１９９１年９月２７日に出願された米国出願番号０７／７６６，５６６号の一部継続出願として、アメリカ合衆国を指定したものである。ＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９１／０５７５８は、１９９０年８月１３日に出願された米国出願番号０７／５６７，０１６号および１９９１年４月５日に出願された米国出願番号０７／６８１，５５１号（この出願は、１９９０年１月２２日に出願された米国出願番号０７／４６８，６９６号（この出願は、１９８９年２月１４日に出願された米国出願番号０７／３１０，８４２号の一部継続出願である）の一部継続出願である１９９０年４月１３日に出願された米国出願番号０７／５６７，０１６号の一部継続出願である）の一部継続出願として、アメリカ合衆国を指定したものである。なお、これらの出願の内容は参考文献として本明細書中に含まれている。発明の背景本出願全体を通じて種々の公報が引用されている。これらの公報の開示は、本発明が属する技術をより完全に記述するために参考文献として本明細書中に含まれている。グラム陰性菌の感染は、特に、入院していて免疫無防備状態にある患者の罹病と死亡の主要な原因となっている（Duma,R.J.，Am.J.of Med.,78(Suppl.6A):154 -164(1985);Kreger,B.E.,D.E.Craven and W.R.McCabe,Am.J.Med.,68:344-355(19 80)）。利用可能な抗生物質は、グラム陰性菌に感染していても通常有効であるが、溶菌によってグラム陰性菌の外膜から放出される、熱に対して安定な細菌毒素（内毒素あるいはリポ多糖（LPS）と呼ばれる）に関わる病態生理学的な効果を中和するものではない（Shenep,J.L．and K.A.Morgan,J.Infect.Dis.,150(3): 380-388(1984)）。内毒素は炎症反応を刺激する作用を持つ物質である。内毒素血症は、内毒素が血流に入って劇症の全身性炎症反応を起こすことから発症する。生体内におけるLPSの有害な効果の多くは、炎症細胞から放出される可溶性の媒介物質によって引き起こされる（Morrison,D.C．and R.J.Ulevitch,Am.J.Path ol,93(2):527-617(1978)）。単球と好中球が、このプロセスにおいて重要な役割を果たす。これらの細胞は微生物を細胞内に取り込んで殺すが、さらに殺菌作用や、タンパク質分解作用、オプソニン作用、発熱作用、補体活性化作用、組織損傷作用をもつ可溶性タンパク質を放出して、生体内で内毒素に反応する。腫瘍壊死因子（TNF）は内毒素によって刺激を受けた単球が放出するサイトカインであるが、この因子は内毒素が生体内でもつ毒素としての効果のいくつかを模倣する。TNFを動物に注射すると、発熱したり、ショックを起こしたり、グルコース代謝に変化が起きる。また、TNFは好中球を刺激する作用をもつ物質でもある。IL- 1やIL-6、IL-8などの他のサイトカインも、組織因子、キニノーゲン、酸化窒素、および補体による内皮細胞の活性化に関する経路だけでなく、LPSの病態生理学的効果の多くを媒介する。内毒素の存在とその結果起こる炎症反応は、例えば、汎発性血管内凝固症（DI C）、成人呼吸促進症（ARDS）、心不全、器官不全、肝不全（肝胆汁性機能障害）、脳不全（CNSの機能障害）、腎不全、多器官不全やショックを惹き起こすかもしれない。内毒素血症に関連する疾病には、例示すれば、全身性炎症反応症候群（SIRS）敗血症候群、敗血性ショック、細菌性髄膜炎、新生児敗血症、嚢胞性線維症、腸炎および肝硬変、グラム陰性菌肺炎、グラム陰性菌腹部膿瘍、出血性ショックや汎発性血管内凝固症などがある。化学療法を受けているか免疫無防備状態にある（例えば、AIDS）患者を含む、白血球減少症または好中球減少症の被検者は、細菌感染や内毒素による二次的影響に対して、特に感受性が強い。内毒素関連疾患は、グラム陰性菌の感染があるところではいつでも発生しうる。また、内毒素関連疾患は、(a)出血性ショックの後やある種の外科手術の過程で起こりうるような胃腸管の虚血状態が発生したときや、(b)全身性あるいは局所性炎症によって、内毒素やグラム陰性生物の腸管透過性が増大したときにも発生しうる。目下のところグラム陰性菌感染への対処法は、抗生物質を用いて支持療法を行うというものである。しかし、抗菌療法には成功しても、内毒素血症関連の罹病率や死亡率は依然として高いままである。抗生物質はLPSの毒性効果を中和するのには有効ではない。このため、直接に内毒素を中和する活性をもった治療法に対する需要が生じたのである。ポリミクシンＢ（PMB）は塩基性のポリペプチド抗生物質で、大抵の毒素や生物学的に活性のある内毒素成分であるリピドＡに結合して、それらを構造的に破壊することが明らかになっている。PMBは、インビトロで、内毒素による好中性顆粒放出の活性化を阻害することが明かにされているので、グラム陰性菌感染に対する治療薬となる可能性がある。しかし、全身毒性があるため、この抗生物質は、局所治療薬として使用される場合を除いては、治療薬としての使用は制約されてきた。抗生物質と多用量のコハク酸メチルプレドニゾロンナトリウム（MPSS）を用いた組み合わせ療法が、イヌを用いたグラム陰性菌性敗血症のモデル実験において死を回避できたことが示されている。しかし、抗生物質とともにMPSSを用いて、臨床上、全身性敗血症の病徴を示していた223人の患者にマルチセンター法で二重盲検法により偽薬を対照とした臨床実験を行った研究の結果、治療グループと偽薬グループの死亡率に有意な差はないことが分かった（Bone,R.C.,etal.,N.En gl.J.of Med.317:653(1987)）。内毒素血症を治療するための比較的新しいアプローチは、内毒素を中和する抗体で受動免疫するというものである。大腸菌Ｊ５に対して過免疫したヒトの免疫グロブリンが、グラム陰性菌血症およびショックを起こした患者の死亡率を50％減少させることが明らかにされた。他のグループは、内毒素に対する、マウス、キメラあるいはヒトのモノクローナル抗体を用いることを提案した。しかしながら、これらの抗体は内毒素を中和しないのである。内毒素血症を治療するもう一つの方法は、可溶化されたIL-1とTNF受容体あるいはIL-1受容体の拮抗剤と抗TNF抗体などのサイトカイン遮断因子の使用を伴うものである。しかし、サイトカイン遮断因子は、それにとって特異的なサイトカインを遮断できるだけで、他のサイトカインを遮断することはできない。さらに、サイトカインを遮断することは、他の有害な影響をもたらすかもしれない。内毒素に対する生理的反応において、ある種の役割を担う可溶性の内毒素結合性タンパク質が今までに２つ同定されている。一つはリポ多糖結合タンパク質（ LBP）で、血清の中で見いだされた細胞の内毒素活性化を媒介する可溶性受容体である。二つめは殺菌性のある透過性増加タンパク質（BPI）で、内毒素に結合してこれを中和し、炎症細胞の活性化を阻害する。これら２つの天然の結合性タンパク質は、内毒素の結末と、局所的あるいは全身的なグラム陰性菌感染に対して身体がどのように反応するかを決定する際に相反する役割を果たす。 1980年代に、ユーレヴィッチとその共同研究者らは、ウサギの急性期血清から、強い親和性をもってLPSに結合するタンパク質を単離したと報告した（Tobias, P.S.,Soldau,K.and Ulevitch,R.J.(1986)J.Exp.Med.164:777-793）。彼らはこのタンパク質をリポ多糖結合タンパク質（LBP）と名付けた。LBPは次に、LPSでコートされた粒子が単球によってオプソニン化される作用を刺激することが示された（Wright,S.D.,Tobias,P.S.,Ulevitch,R.J．and Ramos,R.A.(1989)J.Exp.Med. 170:1231-1241）。さらにLBPは内毒素のリピドＡ部位に結合することが明らかにされたが、内毒素の生物活性の多くはリピドＡとの結合が要因になっている（To bias,P.S.,Soldau,K.and Ulevitch,R.J.(1989)J.Biol.Chem.264:10867-10871）。 BPIは好中性顆粒タンパク質として、1975年に初めて発見された（Weiss,J.,R. C.Eranson,S.Becherdite,K.Schmeidler，and P.Elsbach,J.Clin.Invest．55:33( 1975)）。BPIは1978年にヒトの好中球から高純度の形態で得られ、リン酸緩衝食塩水内というインビトロでの実験で、膜透過性を増加させ、グラム陰性菌に対する殺菌活性をもつことが示された（Weiss,J.,et al.,J.Biol.Chem,253:2664-267 2(1978)）。ワイスらはBPIがホスホリパーゼA2の活性を高めることを明らかにしたが、このことは、インビトロでの殺菌活性に加えて、BPIに対する前炎症活性があることを示唆している（Weiss et al.,J.Biol.Chem.254:11010-11014(1979) ）。ウサギのBPIは1979年に精製された（Elsbach et al.,J.Biol.Chem.254:11000- 11009）が、ヒトからのBPI同様、殺菌作用と透過性を増加させる性質があることが明らかにされた。このため、ウサギのBPIはさらに研究を押し進めてゆくための材料となることが分かった。ウサギのBPIもヒトのBPIも、Kl被膜をもつ大腸菌など、様々なグラム陰性菌に対して、インビトロで有効であることが示された（ Weiss et al.,Infection and Immunity 38:1149-1153(1982)）。 1984年にはBPIと同じ性質をもつタンパク質がヒトの好中球から単離されて、カチオン性抗菌蛋白57（CAP57）と名付けられた（Shafer,W.M.,C.E.Martin and J.K.Spitznagel,Infect.Immun.45:29(1984)）。1986年には、ホブドとグレイがB PIと実質的に同じ性質をもつ殺菌性糖タンパク質を報告している（Hovde and Gr ay,Infection and Immunity 54(1):142-148(1986)）。 1984年にはワイスらによって、インビトロでのBPIの殺菌作用におけるリポ多糖の役割について議論された（J.Immunol.132(6):3109-3115(1984)）。ワイスらは、BPIがグラム陰性菌の外膜に結合すると、LPSが細胞外へ放出し、LPSの生合成を選択的に剌激することを示した。 1985年に大井らは、BPIは、好中球のプロテアーゼで切断された後でもインビトロでの殺菌活性を保持していることを報告しており、BPI分子の断片が活性を持つことを示唆した（Ooi and Elsbach,Clinical Research 33(2):567A(1985)）。BPIのインビトロでの殺菌作用及び透過性増加活性はすべて、このタンパク質のＮ末端側の25kDの断片に依存している（Ooi,C.E.,et al.,J.Biol.Chem.262:14 891(1987)）。BPIのグラム陰性菌への結合は、当初LPSの構造を壊して微生物の疎水性低分子への透過性を変化させ、細胞死をもたらすものとして報告されていた（Weiss，et al.(1987)）。BPIとLBPの分子構造 BPIはLBPと相同なアミノ酸配列をもち、免疫交差反応性をもつ（Tobias et al ., J.Biol.Chem.263:13479-13481(1988)）。また、BPIをコードする遺伝子も、LBP をコードする遺伝子もクローニングされている（Gray,P.W.,Flaggs,G.,Leong,S. R.,Gumina,R.J.,Weiss,Ooi,C.E．and Elsbach,P.(1989)J.Biol.Chem.264:9505-9 509）。両遺伝子とも疎水性のリーダー配列をコードし、44％のアミノ酸配列が同一なポリペプチドをコードしている。LBPは４つのシステイン残基と５つの糖鎖付加が可能部位をもち、一方、BPIは３つのシステイン残基と糖鎖付加部位を２つだけもっていることがシューマンらによって報告された。しかし、本研究で用いられたLBPのｃＤＮＡ配列とアミノ酸配列は、システイン残基を欠き、４個のアミノ酸の挿入があるという重要な違いがあるなど、シューマンらによって発表されたものとは異なることを注記しておきたい。ここで用いられたLBPとは、図５でヒトのLBPとして示す配列をもつタンパク質を意味する。BPIは、プロリンを多く含むヒンジ領域により分けられるＮ末端側領域とＣ末端側領域という２つの別々の領域をもつと言い表せる。LBP分子のＮ末端側の領域はBPIと同じ殺菌活性とLPS結合ドメインをもつことが明らかにされている（Ooi and Elsbach,Clini cal Research 33(2):567A(1985);Ooi,C.E.,et al.,J.Biol.Chem．262:14891(198 7)）。BPIのＣ末端側領域には緩やかなLPS結合活性があることが報告されている。 LBPのＣ末端側領域は単球との結合とその活性化に関係すると考えられている。BPIのＮ末端側領域とＣ末端側領域には際立った電荷の不斉性が見られるが、これはLBPでは見られない。BPIのＮ末端側の領域には陽性の電荷をもつリシン残基が非常に多く、この電荷のために、Ｃ末端側領域は僅かに陰性に荷電しているにも関わらず、分子全体のpI値は10以上と推定されている。BPIの殺菌活性はこのカチオン性に由来するのかもしれない。LBPはほぼ中性で片寄った電荷の分布は見られず、殺菌作用も持たない（Tobias,P.S.,Mathison,J.C．and Ulevitch,R .J.(1988)J.Biol.Chem.263:13479-13481）。BPIとLBPのＮ末端側およびＣ末端側領域の推定される機能を図２に示す。表１は、BPIとLBPの構造と機能を比較したものである。BPIとLBPの治療への応用 LPSの炎症作用を遮断する治療的介入によって、内毒素血症と敗血性ショック関連の罹病率と死亡率を低下させることができる。残念ながら、天然のBPIはヒトの血流中での半減期が非常に短いため、治療への利用は制約されている。天然のLB Pは比較的長い半減期をもつが、内毒素存在下では単球活性を強く誘導するため、もしこの反応が過剰になるとサイトカインが身体に有害になるほど大量に放出されてしまうことになる。理想的な候補は、より長い半減期を持ち、単球を刺激せずに内毒素に結合してこれを不活化する効力を持つものであろう。発明の要約本発明は、BPIの変異体をコードする組み換え核酸分子を提供するものである。本発明はまた、本発明に係る組換え核酸分子によってコードされるBPI変異体を提供するものである。本発明はさらに、本発明の組換えｃＤＮＡ分子を含むベクターを提供するものである。本発明はさらに、適切な宿主の中に取り込まれた本発明に係るベクターを含む、BPI変異体を産生するための宿主ベクター系をも提供するものである。本発明はさらに、本発明に係る宿主ベクター系を、BPI変異体を産生させ、かつ産生されたBPI変異体を回収しうる条件下で培養することを含む、BPI変異体の生産方法を提供するものである。本発明は、LBPの変異体をコードする組換え核酸分子を提供するものである。本発明はまた、本発明に係る組換え核酸分子によってコードされるLBP変異体を提供するものである。本発明はさらに、本発明の組換えｃＤＮＡ分子を含むベクターを提供するものである。本発明はさらに、適切な宿主の中に取り込まれた本発明に係るベクターを含む、LBP変異体を産生するための宿主ベクター系をも提供するものである。本発明はさらに、本発明に係る宿主ベクター系を、LBP変異体を産生させ、かつ産生されたLBP変異体を回収しうる条件下で培養することを含む、LBP変異体の生産方法を提供するものである。本発明は、LBP-BPIキメラ体をコードする組換え核酸分子を提供するものである。本発明はまた、本発明に係る組換え核酸分子によってコードされるLBP-BPI キメラ体を提供するものである。本発明はさらに、本発明に係る組換えｃＤＮＡ分子を含むベクターを提供するものである。本発明はさらに、適切な宿主の中に取り込まれた本発明に係るベクターを含む、LBP-BPIキメラ体を産生するための宿主ベクター系をも提供するものである。本発明はさらに、本発明に係る宿主ベクター系を、LBP-BPIキメラ体を産生させ、かつ産生されたLBP-BPIキメラ体を回収しうる条件下で培養することを含む、LBP-BPIキメラ体の生産方法を提供するものである。本発明は、BPI-IgGキメラ体をコードする組換え核酸分子を提供するものである。本発明はまた、本発明に係る組換え核酸分子によってコードされるBPI-IgG キメラ体を提供するものである。本発明はさらに、本発明に係る組換えｃＤＮＡ分子を含むベクターを提供するものである。本発明はさらに、適切な宿主の中に取り込まれた本発明に係るベクターを含む、BPI-IgGキメラ体を産生するための宿主ベクター系をも提供するものである。本発明はさらに、本発明に係る宿主ベクター系を、BPI-IgGキメラ体を産生させ、かつ産生されたBPI-IgGキメラ体を回収しうる条件下で培養することを含む、BPI-IgGキメラ体の生産方法を提供するものである。本発明は、LBP-IgGキメラ体をコードする組換え核酸分子を提供するものである。本発明はまた、本発明に係る組換え核酸分子によってコードされるLBP-IgG キメラ体を提供するものである。本発明はさらに、本発明に係る組換えｃＤＮＡ分子を含むベクターを提供するものである。本発明はさらに、適切な宿主の中に取り込まれた本発明に係るベクターを含む、LBP-IgGキメラ体を産生するための宿主ベクター系をも提供するものである。本発明はさらに、本発明に係る宿主ベクター系を、LBP-IgGキメラ体を産生させ、かつ産生されたLBP-IgGキメラ体を回収しうる条件下で培養することを含む、LBP-IgGキメラ体の生産方法を提供するものである。本発明は、LBP-BPI-IgGキメラ体をコードする組換え核酸分子を提供するものである。本発明はまた、本発明に係る組換え核酸分子によってコードされるLBP- BPI-IgGキメラ体を提供するものである。本発明はさらに、本発明に係る組換え核酸分子を含むベクターを提供するものである。本発明はさらに、適切な宿主の中に取り込まれた本発明に係るベクターを含む、LBP-BPI-IgGキメラ体を産生するための宿主ベクター系をも提供するものである。本発明はさらに、本発明に係る宿主ベクター系を、LBP-BPI-IgGキメラ体を産生させ、かつ産生されたLBP-BPI-IgGキメラ体を回収しうる条件下で培養することを含む、LBP-BPI-IgGキメラ体の生産方法を提供するものである。本発明は、治療上有効な分量のBPI変異体、LBP変異体、LBP-BPIキメラ体、BPI -IgGキメラ体、LBP-IgGキメラ体あるいはLBP-BPI-IgGキメラ体と薬学的に許可された賦形剤とを含む薬学的組成物を提供するものである。本発明はさらに、LPSに結合することによってLPSが媒介する好中球および単球細胞への刺激を阻害しつつ対象者を治療する効果をもつ、本発明に係る薬剤組成物を一用量投与することを含む、内毒素関連疾病に羅患した対象者の治療方法を提供するものである。最後に、本発明は、内毒素関連疾病を防止する方法を提供するものであり、この方法には、被検者が内毒素関連疾患を起こすのを防止するために、予防上有効な分量のBPI変異体、LBP変異体、LBP-BPIキメラ体、BPI-IgGキメラ体、LBP-IgG キメラ体あるいはLBP-BPI-IgGキメラ体を対象者に投与することが含まれる。図面の簡単な説明図１Aおよび１B 本発明で利用されたLBPの配列（LBP-b）と、シューマン（Schumann）らにより発表されたLBPの配列（LBP-a）との相違点を示す。図２ BPIおよびLBPの、LPSおよび単球に対する相互作用のモデルを示す。LBPはLPS に結合してLBP-LPS複合体を作り、この複合体は次にCD14に結合して単球を活性化し炎症性のサイトカインを作らせる。BPIはLPSと結合するが、BPI-LPS複合体はCD14には結合せず、単球を活性化することもない。図３および３B BPIの塩基およびアミノ酸配列を示す。図４および４B LBPの塩基およびアミノ酸配列を示す。図５および５B いくつかの種におけるBPIとLBP蛋白のアミノ酸配列を示す。図６ NCY118蛋白のアミノ酸配列を示す。図７および７B ヒトIgG-1のアミノ酸および塩基配列を示す。図８ビオチン化BPIのLPSへの結合に及ぼす、BPI,NCY102,NCY103,およびNCY104の効果を示す。図９発色性LAL検定において、BPI,NCY102,NCY103,NCY104およびNCY105蛋白がLPS活性に及ぼす効果を示す。図１０ BPIおよびNCY103存在下での、FITC-LPSの単球との結合を示す。図１１ LPSによる全血へのNIFの放出に及ぼすBPI,NCY102,NCY103およびNCY104への効果を示す。図１２静脈内注射後のマウス血清からのBPI,NCY102,NCY103およびNCY104のクリアランスを示す。図１３内毒素投与前に与えられたBPIとNCY103の効力の比較を示す。図１４ビオチン化BPIのLPSとの結合に及ぼすBPI,NCY103,NCY1118,NCY114,NCY115およびNCY117の効果を示す。図１５ 10％自己由来血清存在下（パネルA）および血清非存在下ならびに、0.5％ヒト血清アルブミン存在下（パネルB）におけるFITCでラベルされたLPSのヒト抹消血単球への結合に及ぼすBPI,LBP,NCY103およびNCY104の効果を示す。図１６血清非存在下において、フォルボルエステルにより誘導されたTHP-1細胞によるTNFαの放出に及ぼすLBP対NCY103,NCY104,NCY117およびPLL（ポリ-L-リジン）の刺激効果の比較を示す。図１７血清なしで培養されたTHP-1細胞でのLPSにより媒介されるTNFの産生を示す。図１８A,１８B,１８C,１８D,１８E,および１８F クリアランス：BPI,LBP,NCY103,NCY104,NCY118（パネルA）；BPI,NCY114,NCY1 15,NCY139（パネルB）；BPI,LBP,NCY117,NCY118（パネルC）；CD-1マウスにおけるBPI,LBP,NCY114（FC,BPI双方について計った場合）（パネルD）；LBP,NCY116, NCY117,NCY118（パネルE）；NCY102,NCY103,NCY115,NCY135,NCY134（パネルF）；NCY102,NCY141,NCY142,NCY143,BPI（パネルG）；およびBPI,NCY115,NCY114（パネルH）図１９ピキア・パストリス（Pichia pastoris）により産生されたBPIとNCY118のウエスタンブロットを示す。図２０内毒素による単球の活性化に及ぼすBPIとNCY103の効果を示す。発明の詳細な説明本発明は、内毒素血症及び敗血症に関連した罹病率及び死亡率を改善することを目的とし、天然BPI、天然LBPのいずれとも異なり、より有益な生物学的性質を有するBPI変異体、LBP変異体、BPI-LBPキメラ、BPI-IgGキメラ、LBP-IgGキメラを提供するものである。本発明はまた、これらの分子の治療及び予防への利用を提供するものである。特に、本発明はBPI変異体をコードする組み換え核酸分子を提供するものである。一つの態様として、組み換え核酸分子はDNA分子である。好ましい態様として、DNA分子はcDNA分子である。本明細書において用いられているように、BPI又は殺菌性透過性増加タンパク質（bactericidal permeability increasing protein）とは、図５に示したアミノ酸配列を有するタンパク質を意味する。BPIヌクレオチド及びアミノ酸配列は、図３に示した。本明細書において用いられているように、BPI変異体とは、BPIの一部を含むタンパク質であり、（ａ）LPSに結合し、（ｂ）LPSへの結合についてBPI又はLBPに匹敵し、（ｃ）ヒト単球によるLPSを介したTNFαの生産を阻害することのできるタンパク質であるものを意味する。例えば、BPI変異体には、BPIのフラグメント BPIの点変異体、PBIの欠失変異体又は、PBIの点及び欠失両方の変異体が含まれる。本明細書において用いられているように、LPSは「内毒素」と同義に用いられるリポ多糖を意味する。本明細書において、TNFαは腫瘍壊死因子アルファを意味する。一つの態様として、BPI変異体は、セリン残基351がセリン以外のアミノ酸Xに置換されたBPI_(S351→X)という構造を有する。好ましい態様として、Xはアラニンである。本出願において、BPI変異体及びキメラ中のBPIの部分は、文字Bで表し、図５に示したヒトBPIのアミノ酸に相当するアミノ酸配列番号を後に続ける。図５は、成熟N末端アミノ酸を残基１として表している。LBP変異体及びキメラ中のLBP の部分は、文字Lで表し、図５に示したヒトLBPのアミノ酸に相当するアミノ酸配列の番号を後ろに続ける。図５は、成熟N末端アミノ酸を残基１として表している。例えば、L_1-197B_200-456(NCY118)は、BPIのアミノ酸残基200-456のN末端にC末端が融合したLBPのアミノ酸残基1-197を含む。L_1-197B_200-456は、図６に示した。L_1-197B_200-456は、BPIのC末端ドメイン（LPSを除去すると考えられているドメインを含む）に融合したLBPのN末端ドメイン（内毒素結合ドメインを含む）を有する。本出願において、一つのアミノ酸置換は括弧内に記す。元のアミノ酸残基（標準的なアミノ酸の一文字表記を用いた）を先に示し、その後に矢印と置換したアミノ酸残基を続ける。例えば、あるBPI変異体においては、元のセリン残基351がアラニンに置換され（それにより糖結合シグナルが除去される。）、それをBPI₍ _S351→A) と表す。もう一つの例として、LBP-BPIキメラNCY103はL_{1-197(143→V)}B_{200-456(N206→D)} と表され、それはLBP部分の元のイソロイシン残基43がバリン残基に置換され、BPIの元のアスパラギン残基206がアスパラギン酸に置換されたことを意味する。適当なアミノ酸置換には、一つのタンパク質のある特定のアミノ酸を、別のタンパク質の相当する位置の残基に置換するものが含まれるが、これに限定されない。例えば、BPI_(Xn→Y)は、そのような置換の一般的な表示である。これは、BPIの位置ｎにおけるアミノ酸残基Xを、LBP（又はウサギ或いはウシLBP ）の位置ｎにおける残基Ｙに置換したことを意味する。「X」及び「Y」は、アミノ酸の一次配列におけるアミノ酸の位置を表す。これに関連する「Y」は、アミノ酸残基チロシンを表す記号「Y」とは混同してはいけない。BPI_(Xn→Y)は、LBP の位置ｎの残基XをBPI（又はウサギ或いはウシBPI）の位置ｎの残基Yと置換するようなもう一つの例である。アミノ酸残基の挿入もまた、括弧内に示す。まず、挿入が起こる前のアミノ酸残基及びその番号を示す。矢印の後に、挿入前のアミノ酸残基、そして挿入アミノ酸を示す。例えば、B_(DS200→DP)においては、プロリン残基が、位置200のセリン残基と置換している。本発明はまた、本発明の組み換え核酸分子によりコードされるBPI変異体を提供するものである。本発明はさらに、本発明の組み換えcDNA分子を含むベクターを提供するものである。本発明の組み換えcDNAを含まないベクターは、当業者が容易に入手でき、本発明のベクターの作成に容易に用いられる。本発明のタンパク質を発現するために、非常に多くのベクターが使用される。プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクター、そしてその他のウイルスなどを含むそのようなベクターは、当業者によく知られている。例えば、あるクラスのベクターは、ウシパピローマウイルス(bovine papillom avirus)、ポリオーマウイルス(poryoma virus)、アデノウイルス(adenovirus)、ワクシニアウイルス(vaccinia virus)、バキュロウイルス(baculovirus)、レトロウイルス(retrovirus)（RSV、MMTV、MoMLVのいずれか）、セムリキ森林熱ウイルス(Semliki Forest virus)、SV40ウイルスのような動物ウイルス由来のDNA因子を利用する。さらに、DNAを染色体に安定に取り込んだ細胞は、トランスフェクトされた宿主細胞を選択するためのマーカーを、一つ又は複数導入することにより選別される。マーカーは、例えば、栄養要求性の宿主に対する原栄養性、生物毒抵抗性、銅などの重金属抵抗性を供給する。選別のためのマーカー遺伝子は、DNA配列に直接連結させ発現させることもできるし、同一細胞に同時トランスフォーメーション(cotransformatin)させることもできる。発現に必要な調節因子には、RNAポリメラーゼの結合するプロモーター配列及びリボソーム結合のための転写開始配列が含まれる。mRNAの最適な合成のためにも、特別な因子が必要である。これらの特別因子には、スプライスシグナル、エンハンサー、終止シグナルが含まれる。例えば、細菌の発現ベクターには、ラクトース(lac)プロモーターのようなプロモーター、転写開始のためのシャイン− ダルガーノ(Shine Dalgarno)配列、開始コドンAUGが含まれる。同様に、真核細胞の発現ベクターには、RNAポリメラーゼIIのための異種又は同種のプロモーター、下流のポリアデニル化シグナル、開始コドンAUG、リボソーム解離のための終止コドンが含まれる。このようなベクターは、市販のものを購入するか、当業者に知られた方法、例えば一般的なベクター作成のための上記方法により、前記の配列から組み立てることもできる。本発明はさらに、適当な宿主中に本発明のベクターを含むような、BPI変異体の作成のための宿主ベクター系を提供するものである。宿主ベクター系の作成法は、当業者によく知られている。適当な宿主細胞には、細菌の細胞（グラム陽性細胞も含む）、酵母の細胞、菌類の細胞、昆虫の細胞、動物の細胞が含まれるが、これに限定されない。適当な動物細胞には、Hela細胞、COS細胞、（COS-7細胞も含む）、CVl細胞、NIH-3T3細胞、CHO細胞、LtK細胞が含まれるが、これに限定されない。ある種の動物細胞、即ち哺乳類の細胞には、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションのような当業者によく知られた方法によりトランスフェクトできる。一つの態様として、適当な宿主は細菌の細胞である。細菌の細胞には、例えばグラム陰性細胞（例えば大腸菌細胞）が含まれる。もう一つの態様として、適当な細胞は真核細胞である。真核細胞には、哺乳類の細胞がある。哺乳類の細胞には、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）が含まれる。真核細胞には、酵母細胞もある。酵母細胞には、例えばPichia細胞が含まれる。本発明はまた、BPI変異体を作成するための方法を供給するものである。それは、 BPI変異体が生産され、そうして生産されたBPI変異体が回収されるような条件下における、本発明の生育に関した宿主ベクター系を含む。宿主ベクター系において、タンパク質が生産される条件は、当業者によく知られている。タンパク質の回収は、当業者によく知られた方法により達成される。このような方法には、ゲル電気泳動、イオン交換クロマトグラフィ、アフィニテイクロマトグラフィ、又はそれらの組み合わせが含まれるが、これに限定されない。本発明は、LBP変異体をコードする組み換え核酸分子を提供する。一つの態様として、組み換え核酸分子はDNA分子である。好ましい態様として、DNA分子はcD NA分子である。本明細書において用いられているように、LBP又はリポ多糖体結合タンパク質とは、図５に示したヒトLBPのアミノ酸配列を有するタンパク質を意味する。図５に示したヒトLBPのアミノ酸配列は、Schumannらにより報告されたアミノ酸配列(Science 249:1429-1431(1990))と異なる。従って、図５に示したヒトLBPのアミノ酸配列は、Schumannらにより報告された配列と混同してはいけない。図１は、ここで用いているLBP配列と、Schumannらにより発表されたLBP配列の間の違いを示している。LBPヌクレオチド及びアミノ酸配列は、図４に示した。本明細書において用いられているように、LBP変異体とは、LBPの一部を含むタンパク質であり、（ａ）LPSに結合し、（ｂ）LPSへの結合についてBPI又はLBPに匹敵し、（ｃ）ヒト単球によるTNFαの生産を阻害することのできるタンパク質であるものを意味する。例えば、LBP変異体には、LBPのフラグメントLBPの点変異体、LPBの欠失変異体又は、LPBの点及び欠失両方の変異体が含まれる。本発明は、LBP-BPIキメラをコードする組み換え核酸分子を提供するものである。一つの態様として、組み換え核酸分子はDNA分子である。好ましい態様として、DNA分子はcDNA分子である。本明細書において用いられているように、キメラとは、第二のタンパク質のすべて又は一部に融合した、第一のタンパク質のすべて又は一部を含むタンパク質を意味する。こうしてできた融合タンパク質は、次に第三のタンパク質のすべて又は一部と融合することも可能である。キメラには、（ａ）BPIの一部に融合した LBPの一部を含むタンパク質、（ｂ）BPIの一部に融合したLBPの一部が、次に免疫グロブリンの一部に融合したタンパク質、（ｃ）BPIの一部と融合したLBPの一部が、次にLBPの一部に融合したタンパク質が含まれるが、これに限定されない。キメラの各タンパク部分は、タンパク質のフラグメント、タンパク質の点変異体、タンパク質の欠失変異体又は、タンパク質の点及び欠失両方の変異体を含む。本明細書において用いられているように、LBP-BPIキメラとは、（i）BPIの一部に融合したLBPの一部を含み、（ii）（ａ）LPSに結合し、（ｂ）LPSへの結合についてBPI又はLBPに匹敵し（ｃ）ヒト単球によるTNFαの生産を阻害することのできるタンパク質を意味する。 LBP及びBPIのキメラは、BPI及びLBP両方の性質を持ち合わせている。例えば、 BPIのC末端ドメインにLBPのN末端ドメインが融合したものはLBP-BPIキメラとなる（例えば、NCY103又はNCY118）。このLBP-BPIキメラは、血液全体の内毒素を中和するという点でLBPと異なり、長いインビボ半減期を有するという点においてBPIと異なる。このようなキメラは、内毒素血症の患者の血液から内毒素を除去することに使用できる。BPI-LBPキメラは、BPIのN末端ドメインのすべて又は一部が、LBPのC末端ドメインのすべて又は一部に融合したものを含むタンパク質である（例えば、NCY104）。このキメラは、内毒素への結合についてBPIに匹敵する効果を持ち、しかし、LBPのように内毒素の存在化で単球を活性化することはない。例えば、一つ又は複数のBPI中の陽性の非保存残基（つまり、LBPの相当部位には存在しない残基）を、一つ又は複数のLBP中の相当する残基と置換することができる（例えばNCY139のように）。このような置換により、BPIの陽性は低下するであろう。もう一つの例としては、LBP中の非保存（BPIの陽性の残基に相当する部位における）残基を、BPI中の相当する陽性の残基と置換することができる（例えばNCY141のように）。そしてその結果、陽性の増した変異体が得られ、LP Sの陰性のリン酸基への結合が強化され、陰性のグラム陰性菌表面との相互作用が促進される。陽性の残基の例としては、リジン、アルギニン、ヒスチジンがある。その他のBPI或いはLBP変異体及びキメラは、一つ又は複数のシステイン残基が欠失しているか、セリン又はその他のアミノ酸で置換されている。このような変異体及びキメラは、作成過程又は使用過程における、BPI或いはLBP変異体又はキメラの凝集の防止に役に立つ。例えば、BPIのシステイン残基132（LBPには保存されていない）は、アラニン（LBPの相当する残基）又はセリンと置換される。その他のBPI、LBP変異体及びキメラは、一つ又は複数の非保存糖結合部位を、アミノ酸置換又は欠失により失っている（例えば、NCY105のように）。又は、その他のBPI或いはLBP変異体及びキメラは、アミノ酸挿入又は置換により糖結合部位を付加されている。その他のBPI或いはLBP変異体及びキメラは、一つ又は複数の二次構造を変化させるアミノ酸を欠失又は挿入されている。例えば、BPI中の一つ又は複数の非保存プロリン残基は、プロリン以外のLBP中の相当する残基と置換され得る。又は、ＬBPの一つ又は複数の（BPIのプロリンに相当する位置に存在する）非保存残基は、LBPの二次構造をBPIにより近付けるように変化させる、プロリンと置換され得る。一つの態様として、LBP-BPIキメラは、LBP_1-197BPI_200-456という構造を有する。さらに別の態様として、LBP-BPIキメラは、LBP_{1-197(143→V)}BPI_200-456(N2 _06→D) という構造を有する。好ましい態様として、LBP-BPIキメラは、BPIの残基199から残基359までのアミノ酸配列のすべて又は一部を含む。、BPIの残基199から残基359までのアミノ酸配列は、LPSを中和する、つまりLPSが炎症反応を刺激するのを妨げるために必要な領域を含む。本発明はまた、LBP-BPIキメラをコードする組み換え核酸分子、ベクター、宿主ベクター系を提供するものである。本発明は、BPI-IgGキメラ及びBPI-IgGキメラをコードする組み換え核酸分子を提供するものである。一つの態様として、組み換え核酸はDNAである。好ましい態様として、DNA分子はcDNA分子である。本発明において用いられているように、BPI-IgGキメラとは、（i）IgG分子の一部のN末端にC末端が融合したBPIの一部（少なくとも10アミノ酸残基の長さ）を含み、（ii）（ａ）LPSに結合し、（ｂ）LPS結合についてBPI又はLBPに匹敵し、（ｃ）ヒト単球によるTNFαの生産を阻害することのできるタンパク質を意味する。好ましい態様として、IgG分子の一部は、IgG重鎖Fcドメインである。IgG 重鎖Fcドメインには、図７に示したような配列を有するIgG重鎖Fcドメインがある。BPI-I gGキメラの例としては、B_1-199Fcがある。本発明は、LBP-IgGキメラ及びLBP-IgGキメラをコードする組み換え核酸分子を提供するものである。一つの態様として、組み換え核酸はDNAである。好ましい態様として、DNA分子はcDNA分子である。本発明において用いられているように、LBP-IgGキメラとは、（i）IgG分子の一部のN末端にC末端が融合したBPIの一部（少なくとも10アミノ酸残基の長さ）を含み、（ii）（ａ）LPSに結合し、（ｂ）LPS結合についてBPI又はLBPに匹敵し、（ｃ）ヒト単球によるTNFαの生産を阻害することのできるタンパク質を意味する。本発明はまた、本発明の組み換え核酸分子によりコードされるLBP-IgGキメラを提供するものである。本発明はさらに、本発明の組み換えcDNA分子を含むベクターを提供するものである。本発明は、LBP-BPI-IgGキメラ及びLBP-BPI-IgGキメラをコードする組み換え核酸分子を提供するものである。一つの態様として、組み換え核酸はDNAである。好ましい態様として、DNA分子はcDNA分子である。本発明において用いられているように、LBP-BPI-IgGキメラとは、（i）IgG分子の一部のN末端にC末端が融合したBPIの一部（少なくとも10アミノ酸残基の長さ）を含み、（ii）（ａ）LPSに結合し、（ｂ）LPS結合についてBPI又はLBPに匹敵し、（ｃ）ヒト単球によるTNFαの生産を阻害することのできるタンパク質を意味する。本発明の、BPI変異株、LBP変異株、LBP-BPIキメラ、BPI-IgGキメラ、LBP-IgG キメラ、LBP-BPI-IgGキメラは、ポリエチレングリコールで修飾し、分子の血中半減期および／または生物学的利用能を増大させることができる。本発明は、治療上有効量のBPI変異株、LBP変異株、LBP-BPIキメラ、BPI-IgGキメラ、LBP-IgGキメラ、LBP-PBI-IgGキメラと薬剤学的に許容されるキャリアを含む、薬剤学的組成物を提供するものである。薬剤学的に許容されるキャリアは、当業者によく知られたものであり、これに限られたものではないが、0.01-0.1M、好ましくは0.05Mのコハク酸緩衝液、または0.8％生理食塩水である。そして、このような薬剤学的に許容されるキャリアは、水性または非水性の溶液、懸濁液、乳液であり得る。さらに、薬剤学的に許容されるキャリヤーは、洗浄剤、リン脂質、脂肪酸、またはその他の脂質キャリヤーを含み得る。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物油、エチルオレアートのような注射可能な有機エステルがある。水溶性キャリアは、水、アルコール性／水溶性の溶液、乳液、懸濁液で、生理食塩水と、緩衝剤で処理した溶媒を含む。非経口の溶媒には、食塩水、リンゲルブドウ糖液（Ringer's dextrose）、ブドウ糖と食塩、乳酸リンゲル液、固定油がある。脂質キャリヤーは、タンパク質の沈殿を起こさず、本発明のタンパク質が溶けるような、脂溶性の物質である。脂質キャリヤーは、無菌の溶液またはゲルの形を取りうる。脂質キャリアは洗浄剤、または洗浄剤を含む生物学的界面活性剤でありうる。非イオン性洗浄剤の例には、ポリソルベート80（TWEEN80またはポリオキシエチレンソルビタンモノオレアートとしても知られている）がある。イオン性洗浄剤の例には、アルキルトリメチルアンモニウムブロマイドがあるがこれに限定されない。さらに、脂質キャリヤーはリポソームでありうる。リポソームは、BPI或いはBPI変異株のような、目的とする物質をその親水性の内部に含有できる、膜結合性のリン脂質小胞である。静脈注射の溶媒は、流体と栄養補給物、リンゲルブドウ糖液由来のもののような電解質補給物などを含む。例えば抗菌薬、酸化防止剤、キレート試薬、不活性ガスなどの、保存料やその他の添加物も含まれうる。本発明はさらに、内毒素による疾患をもつ患者に対して、LPSに結合し、LPSの生物学的活性を抑制する効果をもつ本発明の薬剤学的組成物を投与することを含む、治療法を提供するものである。本明細書において用いられているように、内毒素による疾患とは、内毒素によるショック、内毒素による播種性血管内血液凝固、内毒素による貧血、内毒素による血小板減少、内毒素による成人呼吸窮迫症候群、内毒素による腎不全、内毒素による肝障害や肝炎、グラム陰性菌の感染によるSIRS（全身性免疫応答症候群）、グラム陰性菌による新生児敗血症、グラム陰性菌による髄膜炎、グラム陰性菌による肺炎、グラム陰性菌の感染による好中球減少症および／または白血球減少症、血流力学的ショックや内毒素による発熱を含むが、これに限定されない。内毒素による発熱は、経尿道的前立腺切除や歯肉の手術のような、ある外科的な操作に伴う。内毒素の存在は、あらゆる場所でのグラム陰性微生物の感染、出血や、体外循環を要する手術のように、消化管の虚血を惹起するような状態によって起こりうる。本明細書において用いられているように、投薬は当業者に既知の方法で行われうる。一つの態様として、この投薬は、エアロゾルによる運搬経路、または直接の喉頭注入法による、肺への供給を含む。エアロゾルは、噴霧されうる。その他の投薬方法としては、静脈内、筋肉内、皮下への投与や感染した体腔への直接供給があるが、これに限定されない。本明細書において用いられているように、本発明の薬剤学的組成物がLPSに結合することにより、LPSを介した好中球と単球の刺激を抑制する有効量は、本発明のタンパク質を体重1kgあたり約0.1mgから約100mgの濃度で、患者に供給するに足る量である。一つの具体例としては、その用量は、本発明のタンパク質を体重1kgあたり約1mgから約10mgの濃度で、患者に供給するに足る量である。薬剤学的組成物内における本発明のタンパク質の、治療上の有効量は、上記の有効量に基づく既知の方法により、求められる。本明細書において用いられているように、抑制とは、統計学的に有意であり用量依存的なレベルにおいて、抑制することを意味する。「統計学的に有意」と「用量依存」という用語は、当業者によく知られている。本発明はさらに、対象に予防薬として、BPI変異株、LBP変異株、LBP-BPIキメラ、BPI-IgGキメラ、LBP-IgGキメラ、LBP-BPI-IgGキメラの有効量を投与することによって内毒素に関連した疾患を予防する方法を含む、内毒素に関連した疾患の予防法を提供するものである。本明細書において用いられているように、予防薬として有効な用量は、体重1k gあたり約0.1mgから約100mgである。好ましくは、予防薬として有効な用量は、体重1kgあたり約1mgから約10mgである。「本発明のタンパク質」という用語は、本明細書を通じて使われている。本明細書において用いられているように、「本発明のタンパク質」という用語は、BP I変異株、LBP変異株、LBP-BPIキメラ、BPI-LBPキメラ、BPI-IgGキメラ、LBP-IgG キメラ、LBP-BPI-IgGキメラ、LBPまたはBPIの部分を含む組み換えタンパク質、および、そのいかなる組合わせをも意味する。本発明は、L_1-199(NCY109)、L_1-357B_360-456(NCY117)、LBP(NCY102)、L_1-199F c(NCY111)、L_200-458(NCY113)、LBP_(A132->C)(NCY126)、LBP_(C61->F(NCY127)、L BP_(C61->S)(NCY128)、LBP_(C135->S)(NCY129)、LBP_(A175->S)(NCY130)、LBP_C61-> _{F)(C135->S)(A175->S)} (NCY131)、LBP_{(C61->S)(C135->S)(A175->s)(NCY1}32)をコードする組み換え核酸分子を提供するものである。一つの態様として、組み換え核酸分子は、DNA分子である。好ましい態様として、DNA分子は、cDNA分子である。本発明はまた、これらの組み換え核酸分子によってコードされたタンパク質を提供するものである。本発明はさらに、これらの組み換えcDNA分子を含むベクターを提供するものである。本発明はさらに、適当な宿主内のこれらのベクターを含む、これらのタンパク質生産のための宿主ベクター系を提供するものである。一つの態様として、適当な宿主とは、細菌の細胞である。その他の態様として、適当な宿主とは、真核生物の細胞である。真核生物の細胞は、哺乳類の細胞でありうる。真核生物の細胞はまた、酵母菌の細胞でありうる。本発明はさらに、これらのタンパク質を産生させ、その結果、産生されたタンパク質を回収するような条件のもとで、これらの宿主ベクター系を育てることを含む、これらのタンパク質の産生方法を提供するものである。タンパク質L_1-199(NCY109)、L_1-357B_360-456(NCY117)、LBP(NCY102)、L_1-199F c(NCY111)、L_200-458(NCY113)、LBP_(A132->c)(NCY126)、LBP_(C61->F)(NCY127)、 LBP_(C61->S)(NCY128)、LBP_(C135->S)(NCY129)、LBP_(A175->S)(NCY130)、LBP_C61- _{>F)(C135->S)(A175->S)} (NCY131)、LBP(_{C61->S)(C135->S)(Al75->S)}(NCY132)は、インビトロとインビボの両方において、LPSを介する細胞の反応を抑制するのに有効である。最後に、本発明は、包含している物質と、その中に含まれる薬剤学的組成物を含む、製造法に関する論文を提供するものである。ここで言う包含している物質とは、その中に、(a)内毒素による疾患をもつ患者の治療と、内毒素による炎症の予防とに用いられる、薬剤学的組成物を示す標識を含む物質であり、薬剤学的組成物とは、(b)治療上有効な量のBPI変異株、LBP変異株、LBP-BPIキメラ、BPI- IgGキメラ、LBP-IgGキメラ、LBP-BPI-IgGキメラ及び薬剤学的に許容されるキャリアを含む。これらのベクターは、適当な宿主細胞に導入され、本発明のタンパク質を産生する、宿主ベクター系を形成しうるものである。宿主ベクター系の作成方法は、当業者に既知である。本発明は、下記の実験の詳細を参照することにより、よりよく理解されよう。詳述された特定の実験は、下記に続く本発明において、より完全に説明されたものの実例にすぎないということが、当業者には直ちに理解されよう。実験の詳細材料と方法 BPI及びLBP変異体とキメラの系列は表2,3で記載される。表2は例として示したBP I及びLBP変異体とキメラの一般的な種類を記載している。BPI及びLBP変異体とキメラの特殊な例は表3に記載され、さらに産物名（例えばNCY103）により称される。上記の全ての構築物はまた、IgGキメラとして設計される。そのような構築物ではFcすなわち定常部ドメイン又はヒト免疫グロブリン重鎖がBPI変異体タンパク質に結合できる。 nはBPI又はLBPの成熟配列におけるアミノ酸残基の位置を表し、xはBPI又はLBP の配列内にあるnに対してC末に位置するアミノ酸残基を表している。yはBPI又は LBPの配列内にあるxに対してC末に位置するアミノ酸残基を表している。記号n,x 及びyは、非変異タンパク質の成熟配列内におけるアミノ酸残基の位置を示しており、必ずしも変異体タンパク質における位置を示すものではない。本発明のタンパク質の構築 BPI及びLBPのcDNA配列はそれぞれ図3,4で示され、各ヌクレオチドには番号が付与されている。本発明のタンパク質をコードするDNAは、当該分野ではよく知られている標準的な技術を用いて部位特異的突然変異導入により調製された（Zo ll er，M.J.，et al.,(1977) Methods Enzymol．154:329）。例えば、配列「ATAGAT₇₂₃ 」と「ATTGAC₇₀₀」は、ClaI制限部位（ATCGAT）を挿入するために都合の良い部位として選ばれた。ClaI制限部位により、BPI及びLBP部分はそれぞれ組み換えられる。オリゴヌクレオチドプライマーはこの領域を重複し、ClaI配列を付加するように設計され、ABI380B合成装置（Applied Biosystems社、Foster City,CA ）で合成された。両分子の5'及び3'末端に結合でき、ベクター内へ挿入するため NheI(5')及びXhoI(3')制限部位を含む新たなプライマーが設計された。これらのプライマーは環状DNA増幅により、LBP及びBPIのアミノ酸残基1-197(A)と200-456 (B)をコードする部分のcDNA分子を増幅するために用いられた。生成したDNA断片は適当な制限酵素で加水分解し、その後ゲル電気泳動により精製した。有用なLBP-BPI,BPI-IgG,LBP-IgG及びLBP-BPI-IgGキメラが公表されたからには、これらのキメラをコードするDNA分子は当業者に精通している諸方法を用いて構築されても良い。哺乳類での発現組み換えBPI,LBP及び本発明のタンパク質を哺乳類の細胞で産生するため、当該cDNA配列を適切なプラスミドベクター内へ挿入した。このような適用にふさわしいベクターの一つとしてpSEがある。pSEは、SV40の初期及び後期プロモーターに続いてマルチ挿入クローニング部位とB型肝炎ウイルス表面抗原遺伝子由来の終止配列を含んでいる。バクテリアDNAの複製起点、そしてアンピシリン耐性及びジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする遺伝子もプラスミド内に含まれている。同様なベクターが他の外来遺伝子を発現する為に用いられてきた（McGrogan,e t al.Biotechnology 6,172-177）。特に少量の本発明のタンパク質を迅速に得るために適した他のベクターはpCEP4（Invitrogen社、San Diego,California）であった。pCEP4はCMVプロモーターに続いて、マルチ挿入クローニング部位とSV40 終止配列を含んでいる。バクテリアDNAの複製起点、そしてアンピシリン及びハイグロマイシンB耐性をコードする遺伝子もプラスミド内に含まれている。pCEP4 とpSEでは、ベクター間で容易に挿入シャトリングできるように、同じ挿入クローニング部位が用いられた。１度哺乳類細胞の宿主に導入すると、この特殊なプラスミドはエピソームとして複製し、導入したDNA配列は半ば安定した増幅を行う。高い遺伝子コピー数は、ハイグロマイシンBの存在下で培養する選択圧によって維持される。どちらの場合もベクターDNAはcDNAを受容するため、NheI及びXhoIでの加水分解によって調製し、次にアルカリホスファターゼ処理により脱リン酸化した。BP I,LBP又は他の発明タンパク質をコードする調製cDNA断片をpSE又はpCEP4に連結し、生じた組み換えコロニーをアガロースゲル電気泳動によりスクリーニングした。その後、DNA配列を標準的な酵素配列決定法（例えばSanger法、1974年）により、確認した。塩化セシウム勾配またはMidiキット（Qiagen社、Chatsworth,California）により精製した発現用プラスミドDNAは、チャイニーズハムスター卵巣細胞株DUKXB 11(pSE)と293-EBNA細胞（Invitrogen社、San Diego,California）(pCEP4)に形質転換するために用いられた。形質転換は標準的な方法によってリポフェクチン（ Bethesda,Research Labs,Gaithersberg,MD）を用いて行った。生じた形質転換細胞はGHT(-)培地(DUKX11s)またはハイグロマイシンB添加培地(293s)で選別される。細胞は透析した10％のウシ胎児血清を添加したGHT(-)REM培地(DUKXB11s)またはREM及び10％仔ウシ血清(293s)で培養した。DUKXB11sでは、クローンを選別し、DHFR遺伝子とそれに付随する異型遺伝子を増幅するため、メトトレキサートの濃度を増加させる一連の培養を行った。形質転換した細胞は、混合集団又は混合集団に由来するクローンであり、それらの上清はELISAによってBPI,LBP又は本発明のタンパク質の検定を行った。酵母における発現 BPIとNCY118はメチロトローフである酵母のPichia pastorisで効率よく発現した。PichiaはLPS（BPIが結合する内毒素）を欠き、哺乳類のタンパク質を高レベルで産生できるため、BPI及びBPI変異体に適した発現システムとして選ばれた。 P.pastoris株GS115（Invitrogen社、San Diego,California）はBPIとNCY118をコードするプラスミドによって形質転換され、形質転換したコロニーはInvitrogen 社による概説手順に従って選別した（A Manual of Methods for Expression of Recombinant Proteins in Pichia Pastoris,Version 1.5,Invitrogen社、San Di ego,California）。BPIとNCY118ともに、タンパク質は小型のバッチ培養培地へ分泌された。検定した１つのBPI構築物では116ng/mlが分泌され、3つのNCY118構築物では14,11,10ng/mlが分泌された。分泌は酵素結合イムノソルベント測定法（E LISA）によって検定した。ポリクローナル抗BPI抗体混合液（INVN 1-2）及びアルカリホスファターゼに結合したヤギ抗ウサギ抗体でのウエスタンブロット分析により示されたように、両構築物とも大半のタンパク質は分泌されなかった。ウエスタンブロットを図19に示す。チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHOs）から精製したBPIは、対照として使用した（レーン12）。レーン1は形質転換していないGS115細胞のサンプルである。測定法の検出限界により、抗体はこのような細胞のいかなるタンパク質も認識しなかった。隣の3つのレーン（2-4）はBPI構築物で形質転換されたコロニーの例であり、残りの6つのレーン（5-10）はNCY118構築物で形質転換されたコロニーの例である。加えた標準BPIの量に基づいて、バッチ培養で発現した細胞内BPI 又はNCY118の量は、BPI及びNCY118コロニーの培地でおよそ100μg/mlであった。タンパク質の精製 BPY（NCY101）は以下の4段階の精製により、調製培地から精製された。BPIはC Mセファロース（Pharmacia LKB Biotechnology）で回収した。カラムはpH7.4の5 0mM Trisで洗浄し、タンパク質はpH7.4の50mM Tris緩衝液と1M NaClで溶出した。溶出液はpH8.5の50mM Trisで10倍に希釈し、高速Qセファロースにかけ、溶出液を採取した。BPIはCMセファロースで再回収し、再度前述のように溶出した。1 0mMのコハク酸及びpH6.0の110mM NaClへの緩衝液交換はセファロースCL6B（Phar maciaLKB Biotechnology）を用いて行った。最後にTWEEN 20を最終濃度0.05％になるように調製物に加えた。 LBP（NCY102）は高速Sセファロース（Pharmacia社）で細胞培養の培地から回収した。カラムはpH7.4の50mM Trisで洗浄し、タンパク質はpH7.4の50mM Trisと 1MNaClを用いて溶出した。溶出液はpH8.5の50mM Trisで10倍に希釈し、ハイロードQセファロース（Pharmacia社）にかけた。タンパク質はpH8.5の50mM TrisとO- 1MのNaCl勾配で溶出した。固有の分画はSDS-PAGEの移動度に応じて回収された。NCY102濃度は4.0mg/mlに希釈し、pHは100mM HClで7.0に調製した。NCY103はNCY102と同じ方法により、細胞培養の培地から精製された。 NCY104とNCY105はサイズによる選別段階を省略した点を除いて、BPIと同じプロトコールを用いて精製された。 NCY114,NCY115及びNCY138はph7.4のポロス II HS陽イオン交換カラム（PerSep tive Biosystems,Cambridge,MA）で回収した。カラムはpH7.5の20mM HEPES緩衝液で洗浄し、pH7.5の20mM HEPESと1M NaClで溶出した。溶出液はpH7.5の20mM HE PESで5倍に希釈し、ポロス HQ 陰イオン交換カラム（PerSeptive）にかけ、溶出液は直接ポロス II HSカラムに流した。ポロス II HSカラムは3.3mM酢酸、3.3mM MES、pH6.5の3.3mM HEPESと0-1M NaCl勾配で溶出した。 NCY117とNCY144はpH7.4でポロス II HSカラムにより調製培地から回収した。カラムはpH7.5の20mM HEPES緩衝液で洗浄し、pH7.5の20mM HEPESと1M NaClで溶出した。溶出液はpH7.5の20mM HEPESで10倍に希釈し、次に小型のポロス II HS カラムにかけ、3.3mM 酢酸、3,3mM MES及びpH6.0の3.3mM HEPESと0-1M NaCl勾配で溶出した。 BPI、LBP及びIgGの精製はよく知られており、典型的なキメラの精製は上述したので、これらの精製法を用いることにより、そして（または）当業者になじみの深いやり方でこれらの方法を修正することにより、当業者はさらに本発明のBP I-IgG、LBP-IgG、LBP-BPI-IgGキメラを精製できると考えられる。代表的な化合物のインビトロ及びインビボ検定インビトロ及びインビボ検定はここで公表した代表的な化合物で行った。インビトロ検定はLPS結合競合測定法、Limulus amebocyte Iysate(LAL)阻害検定、TN F放出阻害測定、FITC標識LPS結合阻害、Neisseriaに対するTHP-l細胞のTNF産生やBPI活性化を含んでいる。インビボ検定はラットにおけるマウスLPSの半減期、マウスの内毒素変化及びLPSにより誘導されるサイトカインの機能、死亡率、そして気管支分泌液におけるLPS活性を含んでいる。 S.minnesota Re 変異体のLPSとFITCで標識したE.Coli 055:B5のLPSはList Bio logical Laboratories(Campbell，CA)から購入した。E.Coil 0111:B4のLPSはWhi taker Biologicals社(Walkersville,MD)から購入した。S.abortus eqilのLPSはS igma Chemical社(St.Louis,MO)から購入した。カルシウムとマグネシウムが含まれていないHBSSとRoswell Park Memorial Institute(RPMI溶液)1640はGibco BRL 社(Grand Island,MD)から購入した。蛍光標示式細胞分取器(FACS)解析はBecton Dickingson免疫細胞測定システム(Mountain View，CA)のFACStarで行った。BPI結合競合測定微量滴定プレートに固定化したLBSに対する結合はUlevitchらによって述べられている修正法を用いて行った。簡潔に述べると、Immulon３微量滴定プレート（96ウエル、Dynatech Biotechnology Products社、Chantilly,VA）を37度で一晩、pH9.5-9.8の50mMのホウ酸塩及び20-25mMのEDTAと1又は4μgのS.minnesota R 595 Re LPS（LIST Biological Labs,Inc.,＃304）でコートした。ブランクの非L PSコートウェルが各プレートに含まれており、これらのウェルに対する結合は非特異的結合を検出するために用いられた。予めLPSでコートしていないウェルの吸光度は、一貫して0.05以下の光学濃度を記録した。プレートは蒸留脱イオン水でよく洗浄し、37度で乾燥した。全てのウェルは、発熱物質の含まれていないTr is緩衝塩水（pH7.4の50mM Trisと150mM NaCl）で調製された1-2％という非常に低い濃度の内毒素BSA(Sigma社,St.Louis,MO)で37度60分間ブロックした。ウェルを空にし、ビオチニル化したBPIを非標識BPIの存在下、もしくは非存在下でインキュベートするか、または本発明のタンパク質（発熱物質を含まないTBSと1mg/m lの低内毒素BSA及び0.05％Tween-20）をLPSコートしたウェル及びコートしていないウェルで37度2-3時間、1ウェルにつき全量100μlで定温放置した。測定用緩衝液で4回洗浄後、プレートにアルカリホスファターゼと結合したストレプタビジンを加え、その後、2つの5mg錠剤を溶解した10mlの基質緩衝液より新しく調製したPNP基質溶液（Sigma社）100μlを加えて発色させた。基質緩衝液に24.5mgの塩化マグネシウムと48mlのジエタノールアミンを加え、容量を400mlにし、pHを9 .8に合わせ、容量を500mlに調製した。吸光度はVmax kinetic微量滴定プレート記録器（Molecular Devices社、Menlo Park,CA）により405nmで記録した。発色LAL検定 BPIと本発明のタンパク質（0-200μg/ml中25μl）は、1EU/mlのE.Coli 0111:B 4LPS（2EU/ml溶液中25μl）（Whitaker Biologicals,Walkersville,Maryland）で、 37度1時間、予めインキュベートした。その後、混合液は発色LAL検定キット（Wh itaker Biologicals,Walkersville,MD）を用いてLAL活性を測定した。FITC-LPS結合検定クエン酸塩とブドウ糖を入れたバクテイナーチューブ(Becton Dickinson，Rut herford,ニュージャージー州)に収集した血液は、カルシウムとマグネシウムを除いたハンクス液中で1:4に希釈した。単核細胞をフィコールパック(Pharmacia Inc．Piscataway，ニュージャージー州)を使って単離した。細胞はハンクス液中で3回洗浄し、その後1ml中およそ1x106個の細胞が含まれるように、グルタミンと抗生物質でRPMI 1640を適切な容積に調製した。1ml容量の細胞に対して、最終濃度が500ng/mlになるようにFITC-LPSを加えた。チューブを密閉し、37℃で振盪培養した。培養後、細胞を0.05％のヒト血清アルブミン及び0.02％のアジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝食塩水で2度洗浄した。細胞集団における単球の割合はサイドスキャターとフォワードスキャターのゲーティング比により決定し、フィコエリスリンが結合した抗DR抗体(Becton Dickinson Immunocytometry Systems ，Milpitas,カリフォルニア州)で個々の細胞分画を染色することにより確認した。平均蛍光強度を対数目盛りで示した結果を示す。全身血におけるLPSに誘導されるTNFの放出健常者のボランティアから得た末梢血を、ヘパリンを含むバクテイナーチューブ(Becton Dickinson，Rutherford，NJ)に収集した。全血1mlに、本発明のタンパク質であるBPI、あるいは対照としての緩衝液を加え、さらにE.coli055:B5 1n g/mlの精製した標準内毒素(RSE)(Whitaker Bioproducts)を加えた。サンプルを密閉したマイクロチューブに入れ、37℃で4時間振盪培養した。培養後、サンプルは4℃で5分間、500xgで遠心し、血漿を回収して、サイトカインの含有を検定するまでドライアイスで凍結しておいた。TNFのレベルはヒト組み換えTNF(Genzy me,Cambridge，MA or Genentech Inc.，South San Francisco,カリフオルニア州)を基準とした酵素結合免疫吸着検定法により測定した。最近、全身血中でのBPI活性はヘパリンにより阻害されることが判明し、抗凝固剤をクエン酸塩に変更した。これらの実験では、全血サンプル中の細胞を刺激するため、120μlのクエン酸塩を添加した全血に、BPIすなわち本発明のタンパク質 (0-1mg/mlで)もしくは対照としての緩衝液を20μl、そして100ng/mlのE.Co1i 05 5:B5 LPS 20μlを加えた。これらの実験は、4℃で15分間、500ｘgで遠心したポリプロピレン微量滴定プレート(Coster，Cambridge，MA)中で行った。THP-1細胞のTNF産生検定 THP-1細胞はATCC(American Tissue Culture Collection／Rockville，MD)から購入し、REM培地(10％のウシ胎児血清、2mML-グルタミン、ペニシリン100ユニット、100μg/mlのストレプトマイシンを含む)で維持した。細胞は3日毎に2ｘ105 個/ml以上になる。細胞を5％のCO₂を含む湿った空気中で37度,48時間、REM培地( 10％のウシ胎児血清、2mML-グルタミン、ペニシリン100ユニット、100μg/mlのストレプトマイシン、100nMのPMAを含む)中で培養することにより、LPSに対する THP-1細胞の反応を誘発した。細胞は96ウエルの平底の組織培養プレート中で、1 ウェルあたり1-2ｘ105個で200μlの最終容量で培養した。48時間後、粘着性の細胞は血清を含まない200μlの培地で3回洗浄した。血清を含まず、0.5％のHSAを含む180μlの培地に、LPS(200ng/mlで10μl)と（または）BPI,LBPもしくは他の発明タンパク質をともに、あるいはどちらかを加え、細胞をさらに4時間培養した。４時間後、上清を96ウエルのU型底プレートに移し、細胞の細片すべてをペレットにするため、プレートを500ｘgで12分間遠心した。上清は酵素結合免疫吸着検定法によるTNFの検定を行うまで、-20℃で2番目のプレートに貯蔵した。マウス血清半減期の検定約20グラムのCD-1マウスに0.1mlのBPI,LBPまたは本発明のタンパク質(1mg/ml) を注射し、この時点を0時間とした。ヘパリン処置した(後にはEDTAを含むようにした)チューブに、各検定時点において3匹の動物のretroorbital plexusから血液を採取した。典型的な血液採取スケジュールは5,10,15,30,45,60,90,120,240, 360分とした。血液を約10分間、1000ｘgで遠心し、上清の血漿は検定までドライアイスで凍結した。血漿サンプル中のBPI,LBPまたは本発明のタンパク質のレベルは、適切なタンパク質を基準とする酵素結合免疫吸着検定法により決定した。マウス内毒素の投与検定メスのCD-1マウスの外側尾静脈に、サルモネラ・アボータス・エクイ（Salmon ella abortus equi）内毒素のLD100投与量(25-35 mg/kg)を注射し、その後BPI, 本発明のタンパク質、または対照である溶媒を逆側の外側尾静脈に、指定した時間に注射した。タンパク質注入濃度を変えて、0.5，1，5mg/kgを投与した。対照である溶媒を用いて検定動物での内毒素の投与効果を示した。動物は死亡率を24 ,48,72時間の時点で観測した。ラットにおけるLPS誘導性サイトカイン機能のBPI減少及び死亡率 LPSに関連するサイトカインの形成と死亡率に対するNCY101（BPI）の潜在的な効果は、ラットにおいて(a)出血性ショック（出血させて血圧を下げ、平均動脈血圧が30-35mmHgになった状態を90分間持続し、その後流出した血液および等体積のリンガー液を30分間にわたり再輸液した）(b)内毒素ショック(100μgのLPS と500mg D-ガラクトサミン/kgによって起きる)の両方で調べた。BPIグループに対しては5mg BPI/kgの静脈内注射、対照グループに対しては1mlの生理食塩水の静脈内注射処置を行った。髄膜炎菌(N．meninitidis)と淋菌(N．gonorrhoeae)に対するBPIの活性 BPIは、広範囲のグラム陰性菌種に由来するリポ多糖(LPS)に反応して起こるヒトの炎症細胞からのTNF遊離を抑制する。病原菌である髄膜炎菌（Neisseriameni ngitidis）と淋菌（Neisseria gonorrhoeae）からのグラム陰性リポオリゴ糖(LO S)に対するBPIの活性を試験するために、生育不能な細菌を組み換えBPIで前処置し、ヒト全血と共に37℃で4時間培養した。BPI非存在下では髄膜炎菌の10⁵細菌/ mlは2.93±0.53ng/mlのTNFの遊離を誘発したが、一方淋菌はさらに有力なTNF遊離刺激物質であり、10⁴細菌/mlで8.23±0.32ng/mlのTNF遊離を誘発した。どちらの場合においても、10μg/mlのBPIはTNFの遊離を完全に阻害した。このことは、 BPIはLPSに結合するのと同じようにこれらの生物体のLOSにも結合して解毒することが可能であることを示している。それゆえBPIは、これらの病原性ナイセリア属に関係するLOSが媒介する組織障害に対する治療薬として有効であろう。 BPI,LBPと本発明のタンパク質の、相対的なLPS結合親和性を比較するために、これらのタンパク質について、10ng/mlのビオチン標識したBPIと、上に示したようなLPSで被膜した微量滴定プレートに対する結合を競合する能力を試験した。これらの実験では、BPIはビオチン標識したBPIがLPSに結合するのを、濃度に依存するかたちで阻害した（図８）。NCY102(LBP)とNCY103はビオチン標識したBPI の結合を適度に阻害した。このことは、BPIは、表面に結合したLPSに対して高い親和性を持ち、またNCY102とNCY103はLPSの異なった部位に結合する性質を持つことを示唆している。BPIのN末端ドメインを持つNCY104は、ビオチン標識したBPIに対して、標識していないBPIに類似した濃度で競合し、類似した親和性と結合部を持つことを示唆している。NCY118とNCY103の、ビオチン標識したBPIに対する競合は類似した濃度で起こり、重なり合う曲線を呈している（図14，パネルA）。このことは、これら2つの分子の間の2つのアミノ酸の違い(NCY118-〉NCY103：（ 143-〉V)及び(N206-＞D))が固定しているLPSに対する親和性に影響を与えないことを示している。NCY144(免疫グロブリン分子のヒトIgG1の)Fc定常部に連接した NCY118からなるIgGキメラ)はビオチン標識したBPIと競合する能力が変化しない( 図14，パネルA)。NCY114とNCY115が示すLPS親和性は、BPIが示すものに非常に類似しており、このことはアミノ酸残基1-59(または1-134)の間の領域がLPS結合において最小限の役割を果たしていることを示唆している（図14，パネルB）。NCY 104がBPIと効果的に競合していることを示すデータ（図８）とあわせ、これらの結果は134-197のアミノ酸残基が、BPIの高親和性LPS結合部位の重要な構造成分であることを示している。 LPS親和性におけるアミノ酸残基134から197の間の領域の重要性は、BPI分子のうち全ての陽イオンを有するアミノ酸残基をLBPにおける対応するアミノ酸領域に置換した変異体であるNCY139における親和性の著名な減少によりさらに実証された。これらの変化は、LPSに対する結合親和性がBPIよりもむしろLBPに類似している分子を生じさせた（図14，パネルC，及び図B）。NCY117は、ビオチン標識したBPIをLPSからとりはずす能力が比較的減少していることから実証できるように、BPIのアミノ酸残基359から456は、LPS結合に関与していない（図14，パネルC ）。NCY117の見かけ上のLPSに対する結合親和性は、LBPとNCY139に類似しているが、それらの親和性はBPIのLPSに対する見かけ上の親和性の1/100程度である。それゆえ、固定化LPSへの結合に関与するBPIのドメインはBPI分子のN末端側半分に局在している。なぜなら、NCY104は本来のBPIをLPSで被膜した微量滴定プレートからとりはずす最大の能力を持っているからである。BPIのこのドメインはさらに特異的に、アミノ酸残基134-199の間の領域に局在していた。 BPI,LBP及び本発明のタンパク質がインビトロでLPS中和活性を解析するために、これらのタンパク質を発色LAL検定（図９及び表４）によりLPSを阻害活性を試験した。これらのタンパク質がLPSを中和する程度は、NCY105≧BPI＞NCY103＞NCY1 04＞NCY102という順序だった。いくつかの研究（試料数参照）で、各々のタンパク質ごとに異なる量で実験を行ない、IC₅₀値を決定した。IC₅₀値の平均を表4に示す。これらの結果は、LAL検定において、BPIはLBPよりも低い濃度でLPS活性を中和することを実証している。NCY104はBPIのN末端ドメインを含んでいるが、これは LAL検定においては比較的能力の低い阻害物質である。NCY103はNCY102(LBP)やNC Y104より有力な阻害物質であった。これらの結果は、BPIのN末端(LPS結合)ドメイン単体ではLAL検定におけるBPIの中和活性を説明できないことと、BPIのC末端ドメインがLAL検定における内毒素中和において非常に重要な役割を果たしていることを示している。色素産生性LAL検定におけるLPS中和活性の結果をさらに表5に示す。NCY103，N CY114，NCY115はBPI分子のC末端側半分を共有しており、このドメインがLPS中和活性において重要な役割を果たしていることを再度示している。また、これらのデータは199-456領域がLPS中和において最も重要であることを示している。なぜならBPIアミノ酸残基の136-456の間や60-456の間を加えてもLPS中和活性は改善しないからである。LPS結合データとあわせ、これらの結果はBPIのC末端側半分はL PS中和に重要であり、一方N末端配列はLPS結合に対してより決定的であることを強く示している。 NCY139は148と197の間の9つの陽イオン性残基を除く全てのBPI配列を含んでいるが、これは非常に低いLPS中和活性を示しており、これらの残基がLPS中和活性に重要であることを示唆している。同様に、この化合物はLPS結合においても比較的効力がない。NCY103とNCY139はともにBPIのC末端ドメインを含んでいるが、 NCY103は有力な中和活性を(NCY139はそうでないのに対して)持っているので、これらの陽イオン性残基は分子が正しい高次構造をとることに寄与していると考えられる。 BPIとNCY103の、ヒト末梢血中の単球へのLPSの結合を阻害する相対的な能力を決定するため、単離されたヒト末梢血単核球を、10％のヒト血清(500ng/mlのFIT C結合E.Coli 055:B5 LPSを含む)とともに、BPIとNCY103それぞれの存在下および非存在下で培養した。FITC-LPSの単球への結合はBPIとNCY103の両方の濃度の増加により阻害され得た。それゆえ、NCY103はLBPのN末端ドメインを含むという事実にもかかわらず、NCY103はBPIに似た結合活性をもつ。これらのデータは、図9 に示してあるLPS中和の研究結果とともに、BPIとLBPの(Ｎ末端ドメインではなく )C末端ドメインが、タンパク質が細胞のLPS活性化を阻害するかそれとも仲介するかを決定しているということを示唆する。さらに、血清の存在下および非存在下で、末梢血単球に結合するFITC標識LPS に対して、BPI,LBP,NCY103,NCY104が与える影響を決定するために、実験を行った。血清がないFITC標識LPS結合系で、LBPが存在しない場合には、FITC標識LPS は細胞に結合しない。一方、組み換えLBPは、細胞へのLPS結合を100ng/mlという低濃度で促進した。NYC104もまた、より低い程度ではあったが結合を促進した。 BPIもNCY103もLPSの細胞への結合を有意に刺激しなかった。これらのデータは、 LBPのC末端ドメインはLPSが細胞に結合する際に活性を有していることを示している。NCY104がLBPよりも活性が低いので、BPIのN末端ドメインはLBPのC末端ドメインによるLPSの細胞への結合仲介に阻害的影響を及ぼすのだろう。正常のヒト血清は約1-10μg/mlのLBPを含んでいる。10％の自己血清の存在下で、BPIとNCY103は有力にFITC LPSの単球への結合を阻害した（BPIの方がわずかに強力であった）。NCY104は最低の活性を示し、LBPは全く効果を持たなかった（図15、パネルA）。これらのデータは、この試験ではBPI分子のC末端側半分がL PSを中和したことを示している。NCY104はBPIのC末端ドメインを含まないが、これは血清存在下におけるLPS結合阻害に関しておよそ2ケタ少ない効能しかもたない。LB Pは、予期されるように全く効果を持たなかった。これは、BPIは、LPSが単球に結合しTNFαの遊離を起こすのを防止することにより、敗血症カスケードに介入しうることを示している。更に、BPIのLPS中和作用に寄与している領域、およびLBPのLPSシグナルを細胞に伝達することに関与しているドメインを同定するために、見い出されたタンパク質のLBPを置換する能力が血清の非存在下で比較された。これらの実験においては、48時間ホルボールエステルとともに培養することにより、前単球細胞系の THP-1の細胞のLPSへの反応性を誘発した。誘発ののち、細胞は組み換えタンパク質の存在化または非存在化において19ng/mlのLPSで刺激された。この系においては、LBPの供給なしではTNFは全く遊離されない。これらの実験のデータ（図16）は、LBPとNCY117だけがTNFの遊離を刺激したことを示している。それゆえ、LPS で誘発されるTNF遊離を促進することに関与しているLBPのドメインは、アミノ酸残基199-357の中にあることになる。興味深いことに、NCY104は血清の非存在化ではTNF遊離を仲介しない。これは、BPIのN末端ドメインはLPSへの結合が緊密すぎて、マクロファージの表面にあるCD14へのLPSの転移が不可能であることを示していると考えられる。図17にTNF産生のさらなる比較を示す。NCY135はLBPドメイン274-456を含んでいるが、これは大きな活性を持ち、活性のあるドメインは2 74-357に限定されている。 BPI、LBP及び本発明のタンパク質が、全血におけるTNF産生のLPS活性化に影響を与えるかを調べるために、BPI、NCY102、NCY103あるいはNCY104をヘパリン処理した血液と混合し、この混合液にLPSを加えた。前記血液は、37度、4時間インキュベートして、その後、血漿中のTNFを上述の通り測定した。結果を、図11に示す。NCY103は、TNFの産出の阻害において最も有効であり、BPIが次に有効な阻害剤であることを示した。NCY104およびLBPはほとんど作用しなかった。そのため、全血液中において、NCY103がLPSによるサイトカイン誘導亢進に対する最も有効な阻害剤であることが証明された。実験がヘパリン処理でなくクエン酸処理による血液を用いて行われた場合、BP I及びNCY103は、内毒素を中和する活性においては同等であった（表６）。全血に加える前に、組換えタンパク質を内毒素と予めインキュベートした場合、これらの物質はおおまかに2つのグループに分かれた。BPI、NCY103、NCY114、NCY115 及びNCY118はLPS中和活性を有しており、一方、NCY104、NCY109及びNCY117は比較的不活性であった。NCY116、NCY139及びNCY144でははっきりした結果が得られなかった。LPSを加える直前に、血液サンプルにこれらの物質を加えた場合、IC5 0値は比較的高いが、しかし、同じグループに属するタンパク質は活性を示した。これらのデータは、さらに、全血のような高く生理学的な環境下において、BP Iのカルボキシ末端、特にアミノ酸残基200-359が、LPS中和活性において役割を有することを示した。それは、NCY109が有効な内毒素中和タンパク質ではないことから（表9及び11参照）、BPIのC-末端領域がNCY103及びNCY119における内毒素中和活性に寄与すると結論づけることができる。この配列（200-359）を含む全物質はNCY139を除いて活性を有している。このNCY139は、他の解析系においても不活性であった。このことは、恐らく置換された陽イオンを有するアミノ酸が本来の分子構造を決定しているためであろう。有効な抗内毒治療剤は、内毒素を中和するだけでなく、循環血中の内毒素を排除する能力を有しているべきである。放射線標識した1251-BPIの循環血に存在するレベルは、マウスにおいて、内毒素存在下及び非存在下において測定した（表 7）。内毒素非存在下では、排除（アルファ）フェイズは、2分以内であった。内毒素存在下では、アルファフェイズは、6.2分に及んだ。125I-LPSのみでは、単一フェイズ分布（ベータ）を示し、半減期が約101分であった。125I-LPS及び非標識BPIを投与した場合、排除（アルファ）フェイズが6.2分であり、このことは排除がBPIにより顕著に影響されることを示している。 BPIの最も短い循環血中の半減期が分子学的な技法により延長されるかどうかを調べるために、BPI、LBP、NCY104及びNCY103の循環血中の半減期を比較した（図12）。標識した試料を用いて行ったところ、BPIのマウスの血中における半減期が非常に短いことが観察された。これは、推定p110.6であるBPIの高い陽イオンの性質に起因することが考えられる。LBPは、通常循環血中に10ug/mlの濃度で存在しており、これは、推定pIが6.8である。予想されるように、NCY103（LBP-B PIキメラは陽イオン残基を欠いている）は、NCY104（BPI-LBPキメラは陽イオン残基を有している）よりもかなり長い半減期であった。図12は、NCY103が、BPI よりも確かに長い半減期を有していることを示している。NCY104はBPIのN末端を有しており、BPIよりもより短い半減期であった。そのため、BPIのN末端領域は、循環において短い半減期とすることに主な役割を果たしていると考えられる。さらなる薬学的な研究は、本発明のタンパク質をCD-1マウスに丸薬として5mg ／ kg量を投与することにより行った。これらの結果を。図18に示す。5mg／kgにおいて、NCY104の半減期は、BPIと同等であった。NCY103及びNCY118は、オーバーラップする排泄カーブを有し、また、BPIあるいはNCY104よりもかなり長く循環血中に維持されたが、血清タンパク質であるLBPほどは長くはなかった。NCY114 、NCY115及びNCY139の排泄カーブの比較は、LBPのN末端が循環血中の半減期を延ばすことに役割を果たしていることを示した。NCY114は、BPIよりもわずかに長く循環血に存在し、テストした組換えタンパク質のいずれにもないLBP配列（アミノ酸残基１-59）を含んでいる。NCY115は、比較的ゆっくりと排泄された。このことは、LBPアミノ酸残基60-134は、より長い循環血中の半減期を可能にすることを示している。逆に、BPIにおけるアミノ酸残基134-199の陽イオン性残基は、半減期を短くする。このことは、NCY139において、上記領域のイオン性残基を LBPにおける対応する残基に置換した際に、半減期がNCY115と同様になったことに由来する。N末端領域のLBP残基をより多く含有することにより、さらに半減期が長くなった。LBPのアミノ酸残基199-357が加わった（NCY117）場合、半減期はより長くなるが、しかし、LBPの半減期と同等にはならない。同様に、NCY135（L BP領域1-199及び274-456を含有）は、比較的長いT1/2を有している。これらの結果は、より”LBPに類似”した分子が、より長く循環血に存在することを示している。さらには、免疫グロブリンのFcフラグメントをNCY103に組み込むことにより、最も長い半減期を獲得する。 BPI、LBP、NCY103、NCY104及びNCY105の致死的な内毒素を投与されたマウスに対する効果を比較した（表8-10）。NCY103、NCY118、NCY114、NCY115、NCY144、 NCY116、NCY117、NCY139、NCY138及びNCY140における致死的な内毒素を投与されたマウスに対する効果も比較した（表11）。これらタンパク質が、致死的な内毒素投与後2分間以内に投与された場合、BPI、NCY103及びNCY105は、ほぼ同程度の効能を示し、一方、LBPおよびNCY104は、弱く、不完全な阻害を示し、BPI程有効でないことが明らかになった。LBPおよびNCY104の部分的な阻害は、ヒト及びマウス間での種の違いに影響されるかもしれない。これらの分子は、in vitroヒト細胞に作用するLPS由来炎症性シグナルをブロックしない（図11）。 LPS投与前あるいは後1時間以上の時点でNCY103を投与した場合、BPIを投与した場合よりもより顕著に効果的であった（図13）。これらの結果は、NCY103におけるより長い循環血中の半減期あるいは恐らくNCY103における全血中の内毒素の阻害活性の上昇が、IN vivo NCY103作用上におけるめざましい効果につながっていることを示している。さらなる実験は、in vivoの本発明のタンパクにおけるLPS中和活性を解析する目的で行った。これらの実験において、致死的LPS投与を0時間目において投与し、次いですぐに組換えタンパク質を丸薬として5mg/kgを投与した。 LPSが関与するサイトカインの生成及び致死率に対するNCY101(BPI)の作用効果は、出血性のショック（a）あるいは内毒素ショック（ｂ）のいずれかを与えたラットをもちいて解析した。出血（消化管から内在性LPSが移行することに伴う出血）、外傷及び敗血症における内毒素の重要な役割はよく知られている。BPI はLPSと結合して、LPSが起因する好中球および単核球への刺激を阻害する。同様に、組換えBPIがLPSに結合して、in vitroでのTNF生成を阻害する。出血性のショック（a）あるいは内毒素ショック(b)のいずれかを与えたラットをもちいたBPIの作用における解析結果は、(a)出血性のショックを与えられたラットにおいて、48時間目の致死率を、5/10（対照群では50％）から2/10（BPI投与群では20％）まで減少させ、（ｂ）内毒素ショックを与えられたラットにおいて、５日目の致死率は、BPI投与により43％であり、対照群における83％と比較して、顕著に減少した（p=0.055）。血漿LPSレベルは、2時間において少なくとも部分的には中和した（5.9±4.1 vs 10.8±4.1ng/ml）。サイトカイン生成は、2時間目の結漿TNFレベルにおいて測定されたように、＋BPI投与群におい減少した（3.9±2.9 VS 10.3±6.3ng/ml）。肝臓のトランスアミラーゼ（GOT及びG PT、これらの上昇は肝不全において観られる）及びビリルビンは、8時間目においても依然として上昇しており、しかしながら、この上昇はBPIにおいてよりも少なかった。これらのデータは、BPIが内毒素に関連した出血性及び内毒素性ショックにおける疾患に対する治療剤として有効に作用することを示している。麻酔処理した雄性CD-1マウスは、BPIあるいはNCY103の1から10ugを50ulに溶かして、鼻の内部に投与した。対照動物には、生理食塩水50ulを投与した。20分後動物は、再び麻酔され、10ngの大腸菌055:B5 LPSを投与した。内毒素投与後1時間目において、マウスは、再麻酔され、1％ヒト血清アルブミンを含む0.7mlの生理食塩水を気管を介して肺に投与した。その後、肺をゆっくりともんだ。0.5ml のBAL（気管支肺胞の洗浄）液はアシピレートされ、細胞を遠心により沈殿させて、その後BAL試料は-70度にて保存した。前記BAL液中のTNFアルファのレベルは、ELISAより検定した（その結果を図20に示した）。図20は、BPI及びNCY103のような内毒素中和タンパクが、肺における内毒素に由来するTNFの産出をも中和可能であることを示している。これらの結果は、これらタンパク質が、肺に直接導入された場合に効果的であることを示している。このことは、肺炎及びARDSのような他の内毒素に起因する肺疾患の治療に利用できることを示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｐ 21/02 9281−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:84） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ

Claims

【特許請求の範囲】１．BPI変異体をコードする組換え核酸分子。２．BPI変異体がBPI(S35-X)構造を有しており、Xがアラニンあるいはセリン以外のアミノ酸残基である請求の範囲１の核酸分子。３．LBP変異体をコードする組換え核酸分子。４．LBP-BPIキメラをコードする組換え核酸分子。５．LBP-BPIキメラがLBPI-197-BPI200-456構造を有している請求の範囲４の核酸分子。６．LBP-BPIキメラがLBPI-197(143-V)-BPI200-456(N206-D)構造を有している請求の範囲４の組換え核酸分子。７．BPI-IgGキメラをコードする組換え核酸分子。８．LBP-IgGキメラをコードする組換え核酸分子。９．LBP-BPI-IgGキメラをコードする組換え核酸分子。１０．核酸分子がDNA分子である請求の範囲１から９のいずれかに記載の組換え核酸分子。１１．請求の範囲１から９のいずれかに記載の組換え核酸分子によりコードされたポリペプチド。１２．請求の範囲１から９のいずれかに記載の組換え核酸分子を含むベクター。１３．BPI変異体の産生に使用する宿主ベクター系であって、適切な宿主内に請求の範囲１２におけるベクターを含有している宿主ベクター系。１４．適切な宿主が細菌あるいは哺乳動物細胞である請求の範囲１３の宿主ベクター系。１５．変異ポリペプチドの産生に使用する方法であって、請求の範囲１３の宿主ベクター系を該変異ポリペプチドの産生が可能な条件下において増殖させ、ここで産生された変異ポリペプチドを回収することからなる方法。１６．薬学的組成物であって、BPI変異体、LBP変異体、LBP-BPIキメラ、BPI-IgG キメラ、LBP-IgGキメラあるいはLBP-BPI-IgGキメラの治療上有効な量と薬学的に許可された賦形剤とを含む薬学的組成物。１７．内毒素に関連した疾病に羅患した対象を治療する方法であって、請求の範囲１６における薬学的組成物の有効量を対象に投与して、LPSに結合させることにより、LPSが起因する好中球及び単核細胞の活性化を阻害して、前記対象を治療することからなる治療方法。１８．対象における内毒素に関連した疾病を予防する方法であって、BPI変異体、LBP変異体、LBP-BPIキメラ、BPI-IgGキメラ、LBP-IgGキメラあるいはLBP-BPI- IgGキメラの予防上の有効量を対象に投与することからなる予防方法。