CN113214168B - 一种固液联合合成含谷氨酸、天冬氨酸的环二肽的方法 - Google Patents

一种固液联合合成含谷氨酸、天冬氨酸的环二肽的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种固液联合合成含谷氨酸、天冬氨酸的环二肽的方法，以Fmoc‑L‑Glu‑OCH3或Fmoc‑L‑Asp‑OCH3为起始原料，以侧链羧基连接固相载体2‑CTC Resin树脂，以Boc‑L‑A(X)‑OH(A代表除半胱氨酸以外的α‑氨基酸，X为侧链保护基团，侧链没有保护基团时X为H原子)为连接的第二个氨基酸，连接好以后用三氟乙酸切割树脂，分别得到各类氨基酸的直链二肽甲酯三氟乙酸盐，在水中用氢氧化钠调pH到7.5～8.5，并在水中形成相应环二肽的钠盐，并经稀盐酸调pH至5～6，并加入适量的氯化钠并使其呈饱和状态，低温放置盐析出相应的环二肽。本发明方法具有规模化操作、合成工艺简单、操作安全，无有机溶液残留，在水中盐析，无需纯化，且纯度高的特点。

Description

一种固液联合合成含谷氨酸、天冬氨酸的环二肽的方法
技术领域
本发明属于多肽合成技术领域，具体涉及一类环二肽的合成方法。
背景技术
环二肽(cyclic dipeptides)，又名2,5-二酮哌(2,5-diketopiperazines)，是一类不以两性离子形式存在的自然界中最小的环肽，由两个氨基酸通过肽键环化形成。环二肽结构简易且构象稳定，同时在体内的稳定性比相应的线性二肽更好。在结构上环二肽具有两个供氢体和氢受体，使其表现出较高的可激活酶或蛋白质特定结合位点的潜力，因而成为药物化学中重要的药效基团。其稳定的六元环结构和刚性空间构象使其具有广泛的生理活性。此外，由于类似药物状和易被修饰的分子结构并可作药物分子设计中的药物分子片段，因此环二肽在寻找蛋白作用受点和药物靶标方面具有重要的意义。目前已经发现了很多环二肽具备一定的生理作用，比如从冬虫夏草培养液中分离的新天然环二肽Cyclo(Gln-Ile)对小鼠成纤维细胞L-929、皮肤黑素瘤细胞A-375，可产生强弱不同的细胞毒活性；Cyclo(Gly-Gln)是一种内源性环二肽，能穿透血脑屏障，对β-内啡肽或吗啡引起的心肺呼吸抑制有抑制作用；Cyclo(Pro-Asn)在抗炎方面具有良好的效果，对创面修复有积极的治疗作用。
L-天冬氨酸作为人体非必需的酸性氨基酸，具有广泛的用途。可作为钾、钙等无机离子补充剂、氨解毒剂。临床上可用于治疗慢性肝炎、心肌功能障碍、低钾症、缺血性贫血等。L-谷氨酸作为哺乳动物脑内含量最高的酸性氨基酸，可调节体内的氨水平，作为兴奋型递质，临床上主要用于神经系统疾病的治疗，还可改善儿童智力发育，是一种公认的健脑物质。当前，有很多含有天冬氨酸、谷氨酸环二肽的合成及其生物活性报道。例如从美洲大蠊中分离得到的Cyclo(Tyr-Asp)，具有显著促进HUVEC细胞血管生成的功效，同时具有创面修复的功效。Cyclo(Asp-Pro)是起源于肠抑素的内源性肽，可以抑制脂肪吸收，起到减肥的作用。南京农业大学报道的Cylco(Leu-Glu)，可促进植物的生长。
含有天冬氨酸、谷氨酸的环二肽的合成方法有固相树脂合成法和液相合成法，液相合成法通常需要每个环二肽的独立合成，且每步反应需要处理、纯化，太过繁琐，无法规模化一次性的大量合成环二肽，对于含有天冬氨酸和谷氨酸的环二肽在活性筛选方面，就非常不利。固相合成含有天冬氨酸和谷氨酸的环二肽，具有快捷、方便的优势，可以规模化一次性的大量合成环二肽。利用谷氨酸或天冬氨酸的侧链COOH与固相载体形成酯键连接，随后先脱除Fmoc，使谷氨酸的α-氨基游离，以便向N端组装肽链。全部缩合完成后，用钯试剂脱除C端Allyl，使谷氨酸的羧基游离；再脱除N端的Fmoc，使肽链N端氨基游离。最后在缩合剂HBTU作用下，N端及C端缩合形成内酰胺键形成环肽，最后用三氟乙酸裂解树脂，得到相应的环二肽。王德心等(环肽的合成研究进展.王德心*韩香龚喜冯鹤鹤，中国医学科学院中国协和医科大学药物研究所)利用谷氨酸或天冬氨酸的侧链COOH与固相载体连接做环二肽的方法，虽然可以解决规模化一次性的大量合成的问题，但是也存在一些弊端，首先氨基酸的丙烯酯相对甲酯相对较难获得，而脱除丙烯酯的钯试剂则非常昂贵，且污染环境，比如脱除丙烯酯的四(三苯基膦)钯价钱昂贵，且不容易保存，另外在实际操作中，有很多情况会导致钯中毒，导致丙烯酯脱除不完全，造成环合反应失败。此外，得到的相应环二肽都是粗品，有很多溶剂残留，因此需要制备纯化才能得到纯品，因此并不是一种绿色、环保、快捷、经济的规模化的一次性的大量合成环二肽的最优方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种固液结合的方式合成含有谷氨酸、天冬氨酸的环二肽的合成方法。
针对上述目的，本发明所采用的技术方案由下述步骤组成：
1、将Fmoc-L-Glu-OCH3或Fmoc-L-Asp-OCH3溶解于二氯甲烷中，加入N,N-二异丙基乙胺(DIEA)，搅拌均匀后，加入到用二氯甲烷溶胀的2-CTC Resin树脂中，在氮气保护下反应1～2小时，使Fmoc-L-Glu-OCH3或Fmoc-L-Asp-OCH3的侧链羧基连接2-CTC Resin，再加入甲醇搅拌10～15分钟封闭树脂，抽滤，依次用异丙醇和N,N-二甲基甲酰胺洗涤树脂，得到Fmoc-L-Glu(2-CTC Resin)-OCH3或Fmoc-L-Asp(2-CTC Resin)-OCH3。
2、用哌啶/N,N-二甲基甲酰胺溶液脱掉Fmoc-L-Glu(2-CTC Resin)-OCH3或Fmoc-L-Asp(2-CTC Resin)-OCH3上的Fmoc保护基团，抽滤，依次用异丙醇和N,N-二甲基甲酰胺洗涤，得到L-Glu(2-CTC Resin)-OCH3或L-Asp(2-CTC Resin)-OCH3。
3、将L-Glu(2-CTC Resin)-OCH3或L-Asp(2-CTC Resin)-OCH3加入N,N-二甲基甲酰胺中，并加入Boc-L-A(X)-OH、1-羟基苯并三唑(HOBT)、N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)，在氮气保护下反应2～3小时，抽滤，依次用异丙醇和N,N-二甲基甲酰胺洗涤树脂，得到Boc-L-A(X)-L-Glu(2-CTC Resin)-OCH3或Boc-L-A(X)-L-Asp(2-CTC Resin)-OCH3；所述Boc-L-A(X)-OH中A代表除半胱氨酸以外的α-氨基酸，X为A的侧链保护基团，当侧链没有保护基团时X为H原子。
4、用三氟乙酸/二异丙基硅烷溶液切割Boc-L-A(X)-L-Glu(2-CTC Resin)-OCH3或Boc-L-A(X)-L-Asp(2-CTC Resin)-OCH3，使环二肽脱落下来，蒸干三氟乙酸，得到油状物。
5、将步骤4得到的油状物溶解于去离子水中，并用乙酯洗涤，除去有机杂质，分出有机层，保留水层，并用氢氧化钠调水层pH为7.5～8.5，室温搅拌10～20小时，使其环合成相应环二肽的钠盐，环合结束后，用稀盐酸调pH至5～6，并加入氯化钠，并其使在水中呈饱和状态，0℃放置8～12小时，逐渐析出相应的含天谷氨酸的环二肽晶体Cyclo(L-A-L-Glu)或含天冬氨酸的环二肽晶体Cyclo(L-A-L-Asp)，两者的结构式分别如下：
Figure BDA0003046585620000031
所述结构式中R为α-氨基酸的侧链。
上述步骤1中，优选2-CTC Resin树脂与Fmoc-L-Glu-OCH3或Fmoc-L-Asp-OCH3、DIEA的摩尔比为1:1:3～5。
上述步骤2中，优选哌啶与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:4～5。
上述步骤3中，优选Boc-L-A(X)-OH、HOBT、DIC与步骤1中2-CTC Resin树脂的摩尔比为2:2.5～3:2.5～3:1。
上述步骤4中，优选三氟乙酸/二异丙基硅烷溶液中三氟乙酸与二异丙基硅烷的体积比为9～19:1。
本发明以固液结合合成方法，代替传统的液相合成以及固相合成的合成方式，以Fmoc-L-Glu-OCH3或Fmoc-L-Asp-OCH3为起始原料，以侧链羧基连接固相载体2-CTC Resin，以Boc-L-A(X)-OH为连接的第二个氨基酸，连接好以后，用三氟乙酸切割树脂，分别得到各类氨基酸的直链二肽甲酯三氟乙酸盐，在水中用氢氧化钠调pH到7.5～8.5，并在水中形成相应环二肽的钠盐，并经稀盐酸调pH至5～6，并加入适量的氯化钠，并使得氯化钠呈接近饱和状态，低温放置最终在水中盐析出相应的环二肽。与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1、采取了固相合成快捷方便和液相合成绿色环保、经济实惠的优点，同时避免了液相合成繁琐的中间处理过程以及固相合成中羧基位置丙烯酯保护需要钯碳脱除，成本巨大，不经济环保的缺点。
2、采用Fmoc-L-Glu-OCH3或Fmoc-L-Asp-OCH3为原料，羧基以甲酯保护相对于固相合成中羧基以丙烯酯保护更方便易得，且避免了钯中毒，无法有效脱除保护，且价格昂贵的缺点。
3、最后一步以液相中的水相环合代替固相树脂上的环合，不仅绿色环保经济，且从水中通过调pH，冷却析出，无有机溶剂残留，无需纯化，且纯度高。
4、本发明简洁，快速，成本低廉，中间体无需纯化处理，从水中通过盐析的方法得到环二肽的晶体，无需制备液相的纯化，是一种高效、快捷、绿色、环保、经济的制备含有天冬氨酸、谷氨酸的环二肽的通用合成方法。
附图说明
图1是Cyclo(L-Leu-L-Glu)的HPLC色谱图。
图2是Cyclo(L-Leu-L-Glu)的ESI-MS图谱。
图3是Cyclo(L-Met-L-Glu)的HPLC色谱图。
图4是Cyclo(L-Met-L-Glu)的ESI-MS图谱。
图5是Cyclo(L-Tyr-L-Asp)的HPLC色谱图。
图6是Cyclo(L-Tyr-L-Asp)的ESI-MS图谱。
图7是Cyclo(L-phe-L-Asp)的HPLC色谱图。
图8是Cyclo(L-phe-L-Asp)的ESI-MS图谱。
图9是Cyclo(L-Thr-L-Asp)的HPLC色谱图。
图10是Cyclo(L-Thr-L-Asp)的ESI-MS图谱。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实例。
实施例1
合成Cyclo(L-Leu-L-Glu)
1、将10g 2-CTC Resin树脂(取代度为1.05mmol/g)用100mL二氯甲烷溶胀10分钟后，抽滤，将溶胀后的2-CTC Resin树脂加入100mL二氯甲烷中，并加入4.02g(10.5mmol)Fmoc-L-Glu-OCH3、7mL(42mmol)N,N-二异丙基乙胺，在氮气保护下室温搅拌反应1小时，使Fmoc-L-Glu-OCH3的侧链羧基连接2-CTC Resin，再加入30mL甲醇，搅拌15分钟封闭树脂，抽滤，依次用异丙醇(200mL×2次)、N,N-二甲基甲酰胺(200mL×2次)洗涤，抽干，得到Fmoc-L-Glu(2-CTC Resin)-OCH3。
2、将步骤1得到的Fmoc-L-Glu(2-CTC Resin)-OCH3中加入50mL哌啶与N,N-二甲基甲酰胺体积比为1:4的混合液中，在氮气保护下室温搅拌反应0.5小时脱Fmoc保护基，抽滤，依次用异丙醇(200mL×1次)、N,N-二甲基甲酰胺(200mL×1次)洗涤并用茚三酮检测树脂，显示树脂为阳性(黑色)，得到L-Glu(2-CTC Resin)-OCH3。
3、将步骤2得到的L-Glu(2-CTC Resin)-OCH3加入100mL N,N-二甲基甲酰胺中，并加入4.85g(21mmol)Boc-L-Leu-OH、4.24g(31.5mmol)1-羟基苯并三唑、5mL(31.5mmol)N,N-二异丙基碳二亚胺，在氮气保护下室温搅拌反应2小时，抽滤，依次用异丙醇(200mL×2次)、N,N-二甲基甲酰胺(200mL×2次)洗涤，抽干，并用茚三酮检测树脂，显示树脂为阴性(白色)，得到Boc-L-Leu-L-Glu(2-CTC Resin)-OCH3。
4、将步骤3得到的Boc-L-Leu-L-Glu(2-CTC Resin)-OCH3加入50mL三氟乙酸与二异丙基硅烷体积比为19:1的混合溶液中，室温反应2小时，过滤，40℃蒸干三氟乙酸，得黄色油状物。
5、将步骤4得到的黄色油状物溶解于50mL去离子水中，并用乙酯洗涤除去有机杂质，分出有机层，保留水层，并用氢氧化钠调水层pH为8，室温搅拌12小时，使其环合成相应环二肽的钠盐，环合结束后，用稀盐酸调pH至5～6，并加入氯化钠使其在水中呈饱和状态，0℃放置10小时析出相应的环二肽晶体，过滤，烘干，得到Cyclo(L-Leu-L-Glu)1.83g，其摩尔产率为72％。所得Cyclo(L-Leu-L-Glu)的HPLC纯度大于90％，色谱图见图1，ESI-MS m/z:243(M+1)，质谱图见图2。
实施例2
合成Cyclo(L-Met-L-Glu)
1、将10g 2-CTC Resin树脂(取代度为1.05mmol/g)用100mL二氯甲烷溶胀10分钟后，抽滤，将溶胀后的2-CTC Resin树脂加入100mL二氯甲烷中，并加入4.02g(10.5mmol)Fmoc-L-Glu-OCH3、7mL(42mmol)N,N-二异丙基乙胺，在氮气保护下室温搅拌反应1小时，使Fmoc-L-Glu-OCH3的侧链羧基连接2-CTC Resin，再加入30mL甲醇，搅拌15分钟封闭树脂，抽滤，依次用异丙醇(200mL×2次)、N,N-二甲基甲酰胺(200mL×2次)洗涤，抽干，得到Fmoc-L-Glu(2-CTC Resin)-OCH3。
2、将步骤1得到的Fmoc-L-Glu(2-CTC Resin)-OCH3中加入50mL哌啶与N,N-二甲基甲酰胺体积比为1:4的混合液中，在氮气保护下室温搅拌反应0.5小时脱Fmoc保护基，抽滤，依次用异丙醇(200mL×1次)、N,N-二甲基甲酰胺(200mL×1次)洗涤并用茚三酮检测树脂，显示树脂为阳性(黑色)，得到L-Glu(2-CTC Resin)-OCH3。
3、将步骤2得到的L-Glu(2-CTC Resin)-OCH3加入100mL N,N-二甲基甲酰胺中，并加入5.26g(21mmol)Boc-L-Met-OH、4.24g(31.5mmol)1-羟基苯并三唑、5mL(31.5mmol)N,N-二异丙基碳二亚胺，在氮气保护下室温搅拌反应2小时，抽滤，依次用异丙醇(200mL×2次)、N,N-二甲基甲酰胺(200mL×2次)洗涤，抽干，并用茚三酮检测树脂，显示树脂为阴性(白色)，得到Boc-L-Met-L-Glu(2-CTC Resin)-OCH3。
4、将步骤3得到的Boc-L-Met-L-Glu(2-CTC Resin)-OCH3加入50mL三氟乙酸与二异丙基硅烷体积比为19:1的混合溶液中，室温反应2小时，过滤，40℃蒸干三氟乙酸，得黄色油状物。
5、将步骤4得到的黄色油状物溶解于50mL去离子水中，并用乙酯洗涤除去有机杂质，分出有机层，保留水层，并用氢氧化钠调水层pH为8，室温搅拌12小时，使其环合成相应环二肽的钠盐，环合结束后，用稀盐酸调pH至5～6，并加入氯化钠使其在水中呈饱和状态，0℃放置10小时，析出相应的环二肽晶体，过滤，烘干，得到Cyclo(L-Met-L-Glu)1.9g，其摩尔产率为70％。所得Cyclo(L-Met-L-Glu)的HPLC纯度大于90％，色谱图见图3，ESI-MS m/z:283(M+Na+)，质谱图见图4。
实施例3
合成Cyclo(L-Tyr-L-Asp)
1、将10g 2-CTC Resin树脂(取代度为1.05mmol/g)用100mL二氯甲烷溶胀10分钟后，抽滤，将溶胀后的2-CTC Resin树脂加入100mL二氯甲烷中，并加入3.88g(10.5mmol)Fmoc-L-Asp-OCH3、7mL(42mmol)N,N-二异丙基乙胺，在氮气保护下室温搅拌反应1小时，使Fmoc-L-Asp-OCH3的侧链羧基连接2-CTC Resin，再加入30mL甲醇，搅拌15分钟封闭树脂，抽滤，依次用异丙醇(200mL×2次)、N,N-二甲基甲酰胺(200mL×2次)洗涤，抽干，得到Fmoc-L-Asp(2-CTC Resin)-OCH3。
2、将步骤1得到的Fmoc-L-Asp(2-CTC Resin)-OCH3中加入50mL哌啶与N,N-二甲基甲酰胺体积比为1:4的混合液中，在氮气保护下室温搅拌反应0.5小时脱Fmoc保护基，抽滤，依次用异丙醇(200mL×1次)、N,N-二甲基甲酰胺(200mL×1次)洗涤并用茚三酮检测树脂，显示树脂为阳性(黑色)，得到L-Asp(2-CTC Resin)-OCH3。
3、将步骤2得到的L-Asp(2-CTC Resin)-OCH3加入100mL N,N-二甲基甲酰胺中，并加入7.08g(21mmol)Boc-L-Tyr(otbu)-OH、4.24g(31.5mmol)1-羟基苯并三唑、5mL(31.5mmol)N,N-二异丙基碳二亚胺，在氮气保护下室温搅拌反应2小时，抽滤，依次用异丙醇(200mL×2次)、N,N-二甲基甲酰胺(200mL×2次)洗涤，抽干，并用茚三酮检测树脂，显示树脂为阴性(白色)，得到Boc-L-Tyr-L-Glu(2-CTC Resin)-OCH3。
4、将步骤3得到的Boc-L-Tyr-L-Glu(2-CTC Resin)-OCH3加入50mL三氟乙酸与二异丙基硅烷体积比为19:1的混合溶液中，室温反应2小时，过滤，40℃蒸干三氟乙酸，得黄色油状物。
5、将步骤4得到的黄色油状物溶解于50mL去离子水中，并用乙酯洗涤除去有机杂质，分出有机层，保留水层，并用氢氧化钠调水层pH为8，室温搅拌12小时，使其环合成相应环二肽的钠盐，环合结束后，用稀盐酸调pH至5～6，并加入氯化钠使其在水中呈饱和状态，0℃放置10小时，析出相应的环二肽晶体，过滤，烘干，得到Cyclo(L-Tyr-L-Asp)2.16g，其摩尔产率为74％。所得Cyclo(L-Tyr-L-Asp)的HPLC纯度大于90％，色谱图见图5，ESI-MS m/z:301((M+Na+))，质谱图见图6。
实施例4
合成Cyclo(L-Phe-L-Asp)
1、将10g 2-CTC Resin树脂(取代度为1.05mmol/g)用100mL二氯甲烷溶胀10分钟后，抽滤，将溶胀后的2-CTC Resin树脂加入100mL二氯甲烷中，并加入3.88g(10.5mmol)Fmoc-L-Asp-OCH3、7mL(42mmol)N,N-二异丙基乙胺，在氮气保护下室温搅拌反应1小时，使Fmoc-L-Asp-OCH3的侧链羧基连接2-CTC Resin，再加入30mL甲醇，搅拌15分钟封闭树脂，抽滤，依次用异丙醇(200mL×2次)、N,N-二甲基甲酰胺(200mL×2次)洗涤，抽干，得到Fmoc-L-Asp(2-CTC Resin)-OCH3。
2、将步骤1得到的Fmoc-L-Asp(2-CTC Resin)-OCH3中加入50mL哌啶与N,N-二甲基甲酰胺体积比为1:4的混合液中，在氮气保护下室温搅拌反应0.5小时脱Fmoc保护基，抽滤，依次用异丙醇(200mL×1次)、N,N-二甲基甲酰胺(200mL×1次)洗涤并用茚三酮检测树脂，显示树脂为阳性(黑色)，得到L-Asp(2-CTC Resin)-OCH3。
3、将步骤2得到的L-Asp(2-CTC Resin)-OCH3加入100mL N,N-二甲基甲酰胺中，并加入5.56g(21mmol)Boc-L-Phe-OH、4.24g(31.5mmol)1-羟基苯并三唑、5mL(31.5mmol)N,N-二异丙基碳二亚胺，在氮气保护下室温搅拌反应2小时，抽滤，依次用异丙醇(200mL×2次)、N,N-二甲基甲酰胺(200mL×2次)洗涤，抽干，并用茚三酮检测树脂，显示树脂为阴性(白色)，得到Boc-L-Phe-L-Asp(2-CTC Resin)-OCH3。
4、将步骤3得到的Boc-L-Phe-L-Asp(2-CTC Resin)-OCH3加入50mL三氟乙酸与二异丙基硅烷体积比为19:1的混合溶液中，室温反应2小时，过滤，40℃蒸干三氟乙酸，得黄色油状物。
5、将步骤4得到的黄色油状物溶解于50mL去离子水中，并用乙酯洗涤除去有机杂质，分出有机层，保留水层，并用氢氧化钠调水层pH为8，室温搅拌12小时，使其环合成相应环二肽的钠盐，环合结束后，用稀盐酸调pH至5～6，并加入氯化钠使其在水中呈饱和状态，0℃放置10小时，析出相应的环二肽晶体，过滤，烘干，得到Cyclo(L-Phe-L-Asp)1.98g，其摩尔产率为％。所得Cyclo(L-Phe-L-Asp)的HPLC纯度大于90％，色谱图见图7，ESI-MS m/z:263((M+1)，质谱图见图8。
实施例5
合成Cyclo(L-Thr-L-Asp)
1、将10g 2-CTC Resin树脂(取代度为1.05mmol/g)用100mL二氯甲烷溶胀10分钟后，抽滤，将溶胀后的2-CTC Resin树脂加入100mL二氯甲烷中，并加入3.88g(10.5mmol)Fmoc-L-Asp-OCH3、7mL(42mmol)N,N-二异丙基乙胺，在氮气保护下室温搅拌反应1小时，使Fmoc-L-Asp-OCH3的侧链羧基连接2-CTC Resin，再加入30mL甲醇，搅拌15分钟封闭树脂，抽滤，依次用异丙醇(200mL×2次)、N,N-二甲基甲酰胺(200mL×2次)洗涤，抽干，得到Fmoc-L-Asp(2-CTC Resin)-OCH3。
2、将步骤1得到的Fmoc-L-Asp(2-CTC Resin)-OCH3中加入50mL哌啶与N,N-二甲基甲酰胺体积比为1:4的混合液中，在氮气保护下室温搅拌反应0.5小时脱Fmoc保护基，抽滤，依次用异丙醇(200mL×1次)、N,N-二甲基甲酰胺(200mL×1次)洗涤并用茚三酮检测树脂，显示树脂为阳性(黑色)，得到L-Asp(2-CTC Resin)-OCH3。
3、将步骤2得到的L-Asp(2-CTC Resin)-OCH3加入200mL N,N-二甲基甲酰胺中，并加入5.78g(21mmol)Boc-L-Thr(tbu)-OH、4.24g(31.5mmol)1-羟基苯并三唑、5mL(31.5mmol)N,N-二异丙基碳二亚胺，在氮气保护下室温搅拌反应2小时，抽滤，依次用异丙醇(200mL×2次)、N,N-二甲基甲酰胺(200mL×2次)洗涤，抽干，并用茚三酮检测树脂，显示树脂为阴性(白色)，得到Boc-L-Thr(tbu)-L-Asp(2-CTC Resin)-OCH3。
4、将步骤3得到的Boc-L-Thr(tbu)-L-Asp(2-CTC Resin)-OCH3加入50mL三氟乙酸与二异丙基硅烷体积比为19:1的混合溶液中，室温反应2小时，过滤，40℃蒸干三氟乙酸，得黄色油状物。
5、将步骤4得到的黄色油状物溶解于50mL去离子水中，并用乙酯洗涤除去有机杂质，分出有机层，保留水层，并用氢氧化钠调水层pH为8，室温搅拌12小时使其环合成相应环二肽的钠盐，环合结束后，用稀盐酸调pH至5～6，并加入氯化钠使其在水中呈饱和状态，0℃放置10小时，析出相应的环二肽晶体，过滤，烘干，得到Cyclo(L-Thr-L-Asp)1.59g，其摩尔产率为70％。所得Cyclo(L-Thr-L-Asp)HPLC纯度大于90％，色谱图见图9，ESI-MS m/z:239(M+Na+)，质谱图见图10。

Claims (5)

1.一种固液联合合成含谷氨酸或天冬氨酸的环二肽的方法，其中含天谷氨酸的环二肽的通式为Cyclo(L-A-L-Glu)，含天冬氨酸的环二肽的通式为Cyclo(L-A-L-Asp)，两者的结构式分别如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
所述通式中A代表除半胱氨酸以外的α-氨基酸，结构式中R为α-氨基酸的侧链，其特征在于所述合成方法由下述步骤组成：
（1）将Fmoc-L-Glu-OCH3或Fmoc-L-Asp-OCH3溶解于二氯甲烷中，加入N,N-二异丙基乙胺，搅拌均匀后，加入到用二氯甲烷溶胀的2-CTC Resin树脂中，在氮气保护下反应1～2小时，使Fmoc-L-Glu-OCH3或Fmoc-L-Asp-OCH3的侧链羧基连接2-CTC Resin，再加入甲醇搅拌10～15分钟，封闭树脂，抽滤，依次用异丙醇和N,N-二甲基甲酰胺洗涤树脂，得到Fmoc-L-Glu(2-CTC Resin)-OCH3或Fmoc-L-Asp(2-CTC Resin)-OCH3；
（2）用哌啶/N,N-二甲基甲酰胺溶液脱掉Fmoc-L-Glu(2-CTC Resin)-OCH3或Fmoc-L-Asp(2-CTC Resin)-OCH3上的Fmoc保护基团，抽滤，依次用异丙醇和N,N-二甲基甲酰胺洗涤，得到L-Glu(2-CTC Resin)-OCH3或L-Asp(2-CTC Resin)-OCH3；
（3）将L-Glu(2-CTC Resin)-OCH3或L-Asp(2-CTC Resin)-OCH3加入N,N-二甲基甲酰胺中，并加入Boc-L-A(X)-OH、1-羟基苯并三唑、N,N-二异丙基碳二亚胺，在氮气保护下反应2～3小时，抽滤，依次用异丙醇和N,N-二甲基甲酰胺洗涤树脂，得到Boc-L-A(X)-L-Glu(2-CTC Resin)-OCH3或Boc-L-A(X)-L-Asp(2-CTC Resin)-OCH3；所述Boc-L-A(X)-OH中的X为A的侧链保护基团，当侧链没有保护基团时X为H原子；
（4）用三氟乙酸/二异丙基硅烷溶液切割Boc-L-A(X)-L-Glu(2-CTC Resin)-OCH3或Boc-L-A(X)-L-Asp(2-CTC Resin)-OCH3，使环二肽脱落下来，蒸干三氟乙酸，得到油状物；
（5）将步骤（4）得到的油状物溶解于去离子水中，并用乙酯洗涤除去有机杂质，分出有机层，保留水层，并用氢氧化钠调水层pH为7.5～8.5，室温搅拌10～20小时，使其环合成相应环二肽的钠盐，环合结束后，用稀盐酸调pH至5～6，并加入氯化钠使其在水中呈饱和状态，0℃放置8～12小时，逐渐析出相应的环二肽晶体Cyclo(L-A-L-Glu)或Cyclo(L-A-L-Asp)。
2.根据权利要求1所述的固液联合合成含谷氨酸或天冬氨酸的环二肽的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述2-CTC Resin树脂与Fmoc-L-Glu-OCH3或Fmoc-L-Asp-OCH3、N,N-二异丙基乙胺的摩尔比为1:1:3～5。
3.根据权利要求1所述的固液联合合成含谷氨酸或天冬氨酸的环二肽的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述哌啶/N,N-二甲基甲酰胺溶液中哌啶与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:4～5。
4.根据权利要求1所述的固液联合合成含谷氨酸或天冬氨酸的环二肽的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述Boc-A(X)-OH、1-羟基苯并三唑、N,N-二异丙基碳二亚胺与步骤（1）中2-CTC Resin树脂的摩尔比为2: 2.5～3:2.5～3:1。
5.根据权利要求1所述的固液联合合成含谷氨酸或天冬氨酸的环二肽的方法，其特征在于：步骤（4）中，所述三氟乙酸/二异丙基硅烷溶液中三氟乙酸与二异丙基硅烷的体积比为9～19:1。
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