CN111793125A - 一种纯固相合成鲑鱼降钙素的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种固相合成鲑鱼降钙素的制备方法，包括(1)制备降钙素去保护的三十二肽树脂、(2)制备还原型鲑鱼降钙素粗品、(3)复性、(4)分离纯化步骤，其特征在于：所述步骤(1)制备降钙素去保护的三十二肽树脂具体为：以氨基树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，以HOBT/HATU为缩合试剂，在多肽合成柱中依次脱掉Fmoc保护基团，逐个偶联相应的氨基酸，获得去保护的三十二肽树脂；其中，氨基酸偶联步骤中，依据各个氨基酸合成难易程度，设计不同的偶联时间。本发明通过分析氨基酸合成难度改变偶联时间可提高合成效率，增加产品纯度，降低生产成本。

Description

一种纯固相合成鲑鱼降钙素的制备方法

技术领域

本发明属于药物固相多肽合成技术领域，具体涉及一种纯固相合成鲑鱼降钙素的制备方法。

背景技术

目前，鲑鱼降钙素的合成方法多是利用Fmoc-策略固相法合成，在Fmoc-RinkAmide MBHA树脂上脱保护与相应氨基酸进行偶联，得到的还原型粗品经弱碱空气氧化法得到鲑鱼降钙素。但由于此肽空间位阻大，合成效率一直很低。在现有的公开中国专利中，比如中国专利(公开号CN104672320A)使用逐一偶联的方式将多种氨基酸片段以及特定保护的氨基酸连接在载体树脂上，并通过碘在树脂上进行氧化，得到纯品鲑鱼降钙素。比如中国专利(公开号CN104177490A)把鲑鱼降钙素分成三段使用片段偶联的方式偶联。比如中国专利(公开号CN105111301A)在易产生杂质的难合成的氨基酸采用片段的方式偶联。

在已有的合成方法中，为了提高合成效率都会采用一些特定保护的氨基酸或是特定的偶联片段，在每个氨基酸偶联的时间都在2小时或4小时左右，这生产过程中务必加大原料的投入以及工艺合成周期长，最终都会增加生产成本。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种鲑鱼降钙素的制备方法，其通过分析氨基酸合成难度改变偶联时间提高合成效率，增加产品纯度，降低生产成本。

本发明通过下述技术方案实现。

一种固相合成鲑鱼降钙素的制备方法，包括(1)制备降钙素去保护的三十二肽树脂、(2)制备还原型鲑鱼降钙素粗品、(3)复性、(4)分离纯化步骤，其特征在于：

所述步骤(1)制备降钙素去保护的三十二肽树脂具体为：以氨基树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，以HOBT/HATU为缩合试剂，在多肽合成柱中依次脱掉Fmoc保护基团，逐个偶联相应的氨基酸，获得去保护的三十二肽树脂；其中，氨基酸偶联步骤中，依据各个氨基酸合成难易程度，设计不同的偶联时间。

作为具体技术方案，所述步骤(3)复性具体为：先将还原型鲑鱼降钙素粗品分离纯化，获得还原型鲑鱼降钙素精肽，然后将还原型鲑鱼降钙素精肽通过空气氧化法进行复性，获得氧化型鲑鱼降钙素粗品。

作为具体技术方案，所述鲑鱼降钙素的制备方法包括如下步骤：

(1)制备降钙素去保护的三十二肽树脂

以氨基树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，以HOBT/HATU为缩合试剂，在多肽合成柱中依次脱掉Fmoc保护基团，逐个偶联相应的氨基酸，获得去保护的三十二肽树脂；其中，氨基酸偶联步骤中，依据各个氨基酸合成难易程度，设计不同的偶联时间；

(2)制备还原型鲑鱼降钙素粗品

于去保护的三十二肽树脂中加入裂解试剂进行切肽，然后加入乙醚沉淀，收集沉淀即获得还原型鲑鱼降钙素粗品；

(3)复性

先将还原型鲑鱼降钙素粗品分离纯化，获得还原型鲑鱼降钙素精肽，然后将还原型鲑鱼降钙素精肽通过空气氧化法进行复性，获得氧化型鲑鱼降钙素粗品；其中，所述空气氧化法具体步骤为：将还原型鲑鱼降钙素精品溶解并调节pH后，加入H2O2水，振荡反应12～20h，之后离心、过滤，收集滤液，获得氧化型鲑鱼降钙素粗品；

(4)分离纯化

将氧化型鲑鱼降钙素粗品进行分离纯化、冻干，获得目标产物氧化型鲑鱼降钙素精肽。

作为具体技术方案，所述步骤(1)制备降钙素去保护的三十二肽树脂中氨基树脂为取代度0.32mmol/g的Rink Amide MBHA树脂。

作为具体技术方案，所述步骤(1)制备降钙素去保护的三十二肽树脂的氨基酸偶联过程中，Ser、Thr、Tyr的保护基为tBu，Glu的保护基为OtBu，Gln的保护基为Trt，Lys的保护基为Boc，His的侧链保护基为Boc，Cys的侧链保护基为Acm，最终N端的保护基为Boc。

作为具体技术方案，所述步骤(1)制备降钙素去保护的三十二肽树脂的氨基酸偶联过程中，氨基酸逐个偶联的顺序为：

Boc-Cys(Acm)-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(Acm)-Val-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Pro-Rink Amide Resin。

作为具体技术方案，所述步骤(1)制备降钙素去保护的三十二肽树脂的氨基酸偶联过程中，依据各个氨基酸合成难易程度，设计不同的偶联时间，具体的：

对于鲑鱼降钙素中的难合成氨基酸片段：Boc-Cys(Acm)-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(Acm)-Val-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu，根据难合成片段中氨基酸的合成难度系数，设计不同的偶联时间，其中1号位Cys、4号位Leu、6号位Thr、7号位Cys、8号位Val、9号位Leu、11号位Lys、12号位Leu的合成难度系数大于1，偶联时间控制为2.5～4h；2号位Ser、3号位Asn、5号位Ser、10号位Gly的难度系数低于1，偶联时间控制为1.5～2h；其中，氨基酸的合成难度系即为通过薛定谔方程计算出的氨基酸和周围氨基酸的相互作用力大小；

对于鲑鱼降钙素中除上述难合成氨基酸片段以外的其它易合成氨基酸片段，其基酸偶联时间均控制为1～1.2h。

作为具体技术方案，所述1号位Cys、4号位Leu、6号位Thr、7号位Cys、8号位Val、9号位Leu、11号位Lys、12号位Leu的偶联时间控制为3h。

作为具体技术方案，所述步骤(3)中空气氧化法具体为：将还原型鲑鱼降钙素精肽溶解后，用氨水调节pH值至8.2，然后加入质量浓度为30％的H₂O2水，于室温条件下40～80rpm振荡反应12～20h，之后离心、过滤，收集滤液。

作为具体技术方案，所述步骤(4)分离纯化采用反相高效液相色谱纯化法，具体条件为：色谱柱为反相C18柱，流动相为0.1％TFA的超纯水和0.1％TFA的乙腈，流速为3ml/min，检测波长为215nm/280nm。

本发明有益效果：

1)本发明通过改进传统的固相合成方法，不需要采用特殊的氨基酸片段，仅仅通过计算得到每个氨基酸的合成难易程度，改变催化剂和反应时间，依次偶联，调整合成难度高的氨基酸的反应时间和投料量，从而极大的提高了多肽的产率并降低的反应时间。

2)本发明在进行氧化的时候创造性的加入过氧化氢，从而减少了杂质产生和缩短了复性时间。

3)本发明方法相对于片段合成法具有合成工艺简便、偶联时间短，能够明显提高降钙素的合成产率，降低工业化生产的成本和缩短时间。

附图说明

图1为采用本发明方法制备的还原型鲑鱼降钙素精肽的RP-HPLC谱图。

图2为采用本发明方法制备的氧化型鲑鱼降钙素精肽的RP-HPLC谱图。

图3为采用MALDI-TOF MS测定还原型鲑鱼降钙素精肽、氧化型鲑鱼降钙素精肽的质谱图。

具体实施方式

本发明实施例公开了本发明公开了一种鲑鱼降钙素的制备方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进相关技术参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

实施例1

本发明所涉及的试剂缩写含义如下表：

本发明使用的氨基酸对应的保护氨基酸对照表及生产厂家如下：

实施例2

一种固相合成鲑鱼降钙素的制备方法，包括如下步骤：

(1)制备降钙素去保护的三十二肽树脂

以氨基树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，以HOBT/HATU为缩合试剂，在多肽合成柱中依次脱掉Fmoc保护基团，逐个偶联相应的氨基酸，获得去保护的三十二肽树脂；其中，氨基酸偶联步骤中，依据各个氨基酸合成难易程度，设计不同的偶联时间；

(2)制备还原型鲑鱼降钙素粗品

于去保护的三十二肽树脂中加入裂解试剂进行切肽，然后加入乙醚沉淀，收集沉淀即获得还原型鲑鱼降钙素粗品；

(3)复性

先将还原型鲑鱼降钙素粗品分离纯化，获得还原型鲑鱼降钙素精品，然后将还原型鲑鱼降钙素精品通过空气氧化法进行复性，获得氧化型鲑鱼降钙素粗品；其中，所述空气氧化法具体步骤为：将还原型鲑鱼降钙素精品溶解并调节pH后，加入H₂O₂水，振荡反应12～20h，之后离心、过滤，收集滤液，获得氧化型鲑鱼降钙素粗品；

(4)分离纯化

将氧化型鲑鱼降钙素粗品进行分离纯化、冻干，获得目标产物氧化型鲑鱼降钙素精肽。

实施例3

以合成0.1mM鲑鱼降钙素为例，本实施例详细阐述了制备去保护的三十二肽树脂的具体步骤，如下：

(1)分别称取0.1mM，0.32mmol/g的Rink Amide Resin和4倍过量的氨基酸以及5倍过量的HOBT/HATU缩合试剂作为之后的琢个偶联氨基酸的反应体系，以及配置20％的哌啶和5％的N-甲基吗啉(均为与DMF的体积比)。

(2)称取取代度为0.32mmol/g的Rink Amide Resin 0.32g用2-3mL的DMF在合成柱中浸泡30min，使其充分膨化，之后用真空泵将DMF抽滤掉。

(3)向膨化后的树脂中加入20％的哌啶2-3mL去保护7min，其间每隔2s在旋转混合仪上摇匀，抽滤掉哌啶，再加适量20％的哌啶进行第二次去保护8min，其间依旧在混合仪上混匀。去保护后真空泵将液体抽干，再用DMF洗涤8次，每次约1.5mL，确保去保护剂洗涤干净。

(4)在进行去保护的同时，活化从C端到N端(Pro-Thr-Gly-Thr-Asn-Thr-Arg-Pro-Tyr-Thr-Gln-Leu-Lys-His-Leu-Glu-Gln-Ser-Leu-Lys-Gly-Leu-Val-Cys-Thr-Ser-Leu-Asn-Ser-Cys)需要依次偶联的氨基酸。

即取0.19g HATU和0.069g HOBT各一份，以及4倍过量的氨基酸(例如Fmoc-Pro-OH称取0.27g)分别加入0.75ml的5％的N-甲基吗啉，溶解后将两者混合加入需要偶联的氨基酸中，放在旋转混合仪上摇匀，活化时间为15-20min。

(5)将活化好的氨基酸加入到已去保护和DMF洗涤干净的树脂中，震荡使树脂和氨基酸溶液充分混匀，在生物摇床上进行偶联，平着放置，180rpm，25℃，偶联相应氨基酸所需要的反应时间；其中，氨基酸偶联步骤中，依据各个氨基酸合成难易程度，设计不同的偶联时间，具体偶联时间的控制同实施例2。

(6)偶联完一个氨基酸，依次往下偶联第二个氨基酸时，应先将第一个氨基酸上的Fmoc保护基团去掉(加入20％的哌啶去保护7min，其间每隔2s在旋转混合仪上摇匀，抽滤掉哌啶，再加适量20％的哌啶进行第二次去保护8min)，DMF洗涤8次之后再与活化了的第二个氨基酸(0.159g的Fmoc-Thr(tBu)-OH)进行反应。一个循环结束之后重复(3)-(5)的操作。偶联到12号位Leu的时候，进入到难偶联片段，提高相应的偶联时间(1号位Cys、4号位Leu、6号位Thr、7号位Cys、8号位Val、9号位Leu、11号位Lys、12号位Leu为合成难度系数大为1的氨基酸，偶联时间改为2.5～4h。2号位Ser、3号位Asn、5号位Ser、10号位Gly低于难度系数1，偶联时间改为1.5～2h。)。

(7)全部偶联之后，去掉最后一个氨基酸的Fmoc保护，之后用DMF洗涤8次，无水甲醇洗涤8次，获得去保护的三十二肽树脂。

实施例4

一种固相合成鲑鱼降钙素的制备方法，包括如下步骤：

1)制备降钙素去保护的三十二肽树脂

a)选择氨基树脂作为起始原料，优选取代度为0.32mmol/g的Rink Amide MBHA；

b)选择HOBT/HATU为缩合试剂；

c)选择以Fmoc保护的氨基酸为单体，依次脱掉Fmoc保护基团，在多肽合成柱中逐个连接相应的氨基酸；偶联顺序为：

Boc-Cys(Acm)-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(Acm)-Val-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Pro-Rink Amide Resin；

Pro-Thr-Gly-Thr-Asn-Thr-Arg-Pro-Tyr-Thr-Gln-Leu-Lys-His-Leu-Glu-Gln-Ser-Leu-Lys-Gly-Leu-Val-Cys-Thr-Ser-Leu-Asn-Ser-Cys；

其中，氨基酸偶联步骤中，依据各个氨基酸合成难易程度，设计不同的偶联时间，具体的：

对于鲑鱼降钙素中的难合成氨基酸片段：Boc-Cys(Acm)-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(Acm)-Val-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu，根据难合成片段中氨基酸的合成难度系数，设计不同的偶联时间，其中1号位Cys、4号位Leu、6号位Thr、7号位Cys、8号位Val、9号位Leu、11号位Lys、12号位Leu为合成难度系数大于1，偶联时间控制为2.5～4h；2号位Ser、3号位Asn、5号位Ser、10号位Gly的难度系数低于1，偶联时间控制为1.5～2h；

对于鲑鱼降钙素中除上述难合成氨基酸片段以外的其它易合成氨基酸片段，其基酸偶联时间均控制为1～1.2h；

d)最后以无水甲醇洗涤8次，获得去保护的三十二肽树脂；

2)制备还原型鲑鱼降钙素粗品

在去保护的三十二肽树脂粗品中加入裂解试剂TFA/苯甲醚/苯甲硫醚/二巯基乙烷进行切肽，然后加入乙醚沉淀，获得还原型鲑鱼降钙素粗品；具体步骤如下：

a)切肽：在三十二肽树脂粗品中，加入裂解液TFA，放入旋转混匀仪中反应2.5h；其中，TFA:苯甲醚:苯甲硫醚:二巯基乙烷＝90:5:2:3；

b)离心:反应完毕后，去掉树脂，用50ml的离心管收集裂解液；

c)沉淀：向裂解液中加冰乙醚至40ml，摇匀，静置2min，在3000r/min转速下离心3min，取出弃上清液；

d)重复离心两次后得到的下层沉淀即为还原型鲑鱼降钙素粗品；

3)复性

将还原型鲑鱼降钙素粗品用的0.1％TFA的超纯水溶解，10000g离心后，0.22μm滤头过滤，收集滤液，之后利用Waters 2535反相高效液相色谱系统，在反相C18柱中进行分离纯化，冻干后获得还原型鲑鱼降钙素精肽。制备的还原型鲑鱼降钙素精肽的RP-HPLC谱图见图1，其中：流动相为0.1％TFA的超纯水和0.1％TFA的乙腈，流速为3ml/min，检测波长为215nm/280nm。理论上0.1mM的合成量应该获得还原型鲑鱼降钙素精肽343.4mg，经计算，实际通过反相色谱分离纯化后实际获得还原型鲑鱼降钙素精肽92.3mg，实际产率为26.8％，且获得的还原型鲑鱼降钙素精肽的纯度为98.6％。

之后将还原型鲑鱼降钙素精肽通过空气氧化法(H₂O₂水氧化法)进行复性，获得氧化型鲑鱼降钙素粗品；空气氧化法具体操作步骤如下：

a)称取还原型鲑鱼降钙素精肽溶解于超纯水中；

b)pH调节:利用稀释氨水调节pH值至8.2；

c)加入质量浓度为30％的H₂O₂水，在生物摇床上室温反应16h，转速60rpm；

d)10000g离心后，0.22μm滤头过滤，收集滤液，得氧化型鲑鱼降钙素粗品；

4)分离纯化

将氧化型鲑鱼降钙素粗品利用Waters 2535反相高效液相色谱系统，在反相C18柱中进行分离纯化、冻干后获得目标产物氧化型鲑鱼降钙素精肽，氧化型鲑鱼降钙素精肽的RP-HPLC谱图见图2。经计算，1mg的还原型鲑鱼降钙素精肽进行复性、分离纯化、冻干后可获得目标产物氧化型鲑鱼降钙素精肽0.405mg，复性产率为40.5％，最终获得的氧化型鲑鱼降钙素精肽的纯度为98.2％。并且，通过MALDI-TOF MS测定相应产物的正确性，结果见图3；经质谱鉴定，复性、分离纯化、冻干后获得的目标产物氧化型鲑鱼降钙素精肽比还原型鲑鱼降钙素精肽明显减少2个分子量，证明复性成功。其中：流动相为0.1％TFA的超纯水和0.1％TFA的乙腈，流速为3ml/min，检测波长为215nm/280nm。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种固相合成鲑鱼降钙素的制备方法，包括(1)制备降钙素去保护的三十二肽树脂、(2)制备还原型鲑鱼降钙素粗品、(3)复性、(4)分离纯化步骤，其特征在于：

所述步骤(1)制备降钙素去保护的三十二肽树脂具体为：以氨基树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，以HOBT/HATU为缩合试剂，在多肽合成柱中依次脱掉Fmoc保护基团，逐个偶联相应的氨基酸，获得去保护的三十二肽树脂；其中，氨基酸偶联步骤中，依据各个氨基酸合成难易程度，设计不同的偶联时间。

2.根据权利要求1所述的一种固相合成鲑鱼降钙素的制备方法，其特征在于所述步骤(3)复性具体为：先将还原型鲑鱼降钙素粗品分离纯化，获得还原型鲑鱼降钙素精肽，然后将还原型鲑鱼降钙素精肽通过空气氧化法进行复性，获得氧化型鲑鱼降钙素粗品。

3.根据权利要求2所述的一种固相合成鲑鱼降钙素的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)制备降钙素去保护的三十二肽树脂

以氨基树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，以HOBT/HATU为缩合试剂，在多肽合成柱中依次脱掉Fmoc保护基团，逐个偶联相应的氨基酸，获得去保护的三十二肽树脂；其中，氨基酸偶联步骤中，依据各个氨基酸合成难易程度，设计不同的偶联时间；

(2)制备还原型鲑鱼降钙素粗品

于去保护的三十二肽树脂中加入裂解试剂进行切肽，然后加入乙醚沉淀，收集沉淀即获得还原型鲑鱼降钙素粗品；

(3)复性

先将还原型鲑鱼降钙素粗品分离纯化，获得还原型鲑鱼降钙素精肽，然后将还原型鲑鱼降钙素精肽通过空气氧化法进行复性，获得氧化型鲑鱼降钙素粗品；其中，所述空气氧化法具体步骤为：将还原型鲑鱼降钙素精品溶解并调节pH后，加入H₂O₂水，振荡反应12～20h，之后离心、过滤，收集滤液，获得氧化型鲑鱼降钙素粗品；

(4)分离纯化

将氧化型鲑鱼降钙素粗品进行分离纯化、冻干，获得目标产物氧化型鲑鱼降钙素精肽。

4.根据权利要求1所述的一种固相合成鲑鱼降钙素的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)制备降钙素去保护的三十二肽树脂中氨基树脂为取代度0.32mmol/g的Rink AmideMBHA树脂。

5.根据权利要求1所述的一种固相合成鲑鱼降钙素的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)制备降钙素去保护的三十二肽树脂的氨基酸偶联过程中，Ser、Thr、Tyr的保护基为tBu，Glu的保护基为OtBu，Gln的保护基为Trt，Lys的保护基为Boc，His的侧链保护基为Boc，Cys的侧链保护基为Acm，最终N端的保护基为Boc。

6.根据权利要求1所述的一种固相合成鲑鱼降钙素的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)制备降钙素去保护的三十二肽树脂的氨基酸偶联过程中，氨基酸逐个偶联的顺序为：

Boc-Cys(Acm)-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(Acm)-Val-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Pro-Rink Amide Resin。

7.根据权利要求1所述的一种固相合成鲑鱼降钙素的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)制备降钙素去保护的三十二肽树脂的氨基酸偶联过程中，依据各个氨基酸合成难易程度，设计不同的偶联时间，具体的：

对于鲑鱼降钙素中的难合成氨基酸片段：Boc-Cys(Acm)-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(Acm)-Val-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu，根据难合成片段中氨基酸的合成难度系数，设计不同的偶联时间，其中1号位Cys、4号位Leu、6号位Thr、7号位Cys、8号位Val、9号位Leu、11号位Lys、12号位Leu的合成难度系数大于1，偶联时间控制为2.5～4h；2号位Ser、3号位Asn、5号位Ser、10号位Gly的合成难度系数低于1，偶联时间控制为1.5～2h；

对于鲑鱼降钙素中除上述难合成氨基酸片段以外的其它易合成氨基酸片段，其基酸偶联时间均控制为1～1.2h。

8.根据权利要求6所述的一种固相合成鲑鱼降钙素的制备方法，其特征在于，所述1号位Cys、4号位Leu、6号位Thr、7号位Cys、8号位Val、9号位Leu、11号位Lys、12号位Leu的偶联时间控制为3h。

9.根据权利要求2或3所述的一种固相合成鲑鱼降钙素的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中空气氧化法具体为：将还原型鲑鱼降钙素精肽溶解后，用氨水调节pH值至8.2，然后加入质量浓度为30％的H₂O₂水，于室温条件下40～80rpm振荡反应12～20h，之后离心、过滤，收集滤液。

10.根据权利要求1～8中任一所述的一种固相合成鲑鱼降钙素的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)分离纯化采用反相高效液相色谱纯化法，具体条件为：色谱柱为反相C18柱，流动相为0.1％TFA的超纯水和0.1％TFA的乙腈，流速为3ml/min，检测波长为215nm/280nm。

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