KR20140104856A - 측쇄 부착을 통한 고상 펩타이드 합성 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 출발 수지로서, 하이드록시 아미노산, 하이드록시 아미노산 아미드, 하이드록시 아미노 알코올 또는 측쇄를 통해 폴리머에 부착된 하이드록시 아미노산을 포함하는 소형 펩타이드를 이용한, 고상 펩타이드 합성에 의해 수득할 수 있는, 고순도의 펩타이드 및 펩타이볼에 관한 것이다.

Description

측쇄 부착을 통한 고상 펩타이드 합성 방법 {SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS VIA SIDE CHAIN ATTACHMENT}
본 발명은 측쇄 부착을 통한 펩타이드의 고상 합성 방법에 관한 것이다.
고상 펩타이드 합성은 전통적으로 적합한 고형 지지체 상에서 α-카르복시 관능기를 통해 C-말단 아미노산을 부착시키고, 점차적으로 자라나는 펩타이드 체인에 아미노산 잔기들을 순차적으로 부가하여 펩타이드의 아미노 말단 쪽으로 펩타이드 체인을 연장시킴으로써 이루어진다. 수십만개의 간행물들과 특허들에 이러한 방법과 펩타이드 의약제 제조에 있어서의 적용이 기술되어 있다.
C-말단 카르복시 기에 부착하는 방식과는 대조적으로, 적정 수지 상에서 아미노산 측쇄를 통해 아미노산과 펩타이드를 부착시키는 방식과 이의 SPPS에서의 이용에 대해서는 특히 30개 미만의 간행물들과 특허들에 매우 간략하게 기술되어 있다. 이들 간행물들 대부분은 Asp 및 Glu의 측쇄 카르복시기를 통해 아미노산을 부착하는 방법을 기술하고 있다. 측쇄 하이드록시기를 통한 아미노산의 측쇄 부착 및 펩타이드 합성에 있어서의 이용에 관한 리포트는 제한적인 것으로 알고 있다: Fmoc-Hya-pNA (식 A1)의 측쇄 부착 [A. Bernhardt, M. Drewello and M. Schutkowski, The solid-phase synthesis of side-chain-phosphorylated peptide-4-nitroanilides J. Peptide Res. 50, 1997. 143-152] 및 짧은 니트로아닐리드 기질 합성에 있어서의 이의 이용, 환형 펩타이드의 제조에 이용하는 경우 마이크로웨이브를 이용한 2-클로로트리틸 수지 상에서의 Fmoc-Hya-O알릴 에스테르 (식 A2 [L. Rizzi, K. Cendic, N. Vaiana, S. Romeo, Alcohols immobilization onto 2-chlorotritylchloride resin under microwave irradiation, Tetrahedron Letters 52 (2011) 2808-2811])의 합성, 및 Tyr-페녹시기의 미츠노부 레독스-알킬화에 의한 벤질-타입의 수지 상에 부착된 Fmoc-Tyr-O-메틸 에스테르 (식 A3 [C. Cabrele, M. Langer and A. G. Beck-Sickinger, Amino Acid Side Chain Attachment Approach and Its Application to the Synthesis of Tyrosine-Containing Cyclic Peptides, J. Org. Chem. 1999, 64, 4353-4361])의 합성 및 이의 짧은 환형 펩타이드의 합성에서의 적용. Hse 및 Hyp의 측쇄 부착에 대해서는 개시된 바 없는 것으로 알고 있다. 아울러, 보호된 펩타이드, 보호된 펩타이드 단편 및 보호된 펩타이드 아미드 및 펩타이볼(peptaibol)을 고상 합성하기 위해 산 민감성 수지 상에 측쇄 부착된 Hya를 이용하는 것도 보고된 바 없다.
Figure pat00001
본 발명에서는, 출발 수지로서, 하이드록시 아미노산, 하이드록시 아미노산 아미드, 하이드록시 아미노 알코올 또는 측쇄를 통해 폴리머에 부착된 하이드록시 아미노산을 포함하는 소형 펩타이드를 이용한, 고상 펩타이드 합성에 의해, 고순도의 펩타이드 및 펩타이볼(peptaibol)을 수득하였다.
정의 및 약어들:
"Hya" 또는 "하이드록시 아미노산(들)"은 하이드록시 (-OH) 기를 포함하는 아미노산을 의미한다.
N-말단 또는 아미노 말단은 펩타이드 체인에서 첫번째 아미노산을 의미한다.
C-말단 또는 카르복시 말단은 아래에 나타낸 바와 같이 펩타이드 체인에서에서 제일 마지막 아미노산을 의미한다.
Figure pat00002
"P" 또는 "고형 지지체" 또는 "수지"는 아미노산 또는 펩타이드와 반응하여 결합하는데 적합한 관능기(들)를 포함하는 불용성 물질을 의미한다.
"알킬"은, 예를 들어, C1-10 알킬 또는 C1-6 알킬은, 분지형 또는 비분지형의 완전히 포화된 비환식 지방족 탄화수소기(즉, 이중 결합 또는 삼중 결합 없이 탄소와 수소로 구성됨)를 의미한다. 일부 구현예들에서, 알킬은 포화 또는 비포화된 형태일 수 있다. 알킬은 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, tert-부틸, 펜틸, 헥실 등을 포함할 수 있지만, 이로 한정되지 않으며, 일부 구현예에서, 이들 각각은 선택적으로 치환될 수 있다. 비제한적인 알킬 치환기로서 C1-3 알콕시, 할로 (F, Cl, Br 또는 I), 니트로, 아미노, -SH 및 -OH를 포함할 수 있다.
"부착"은 불용성 지지체에 아미노산, 펩타이드 또는 펩타이드 유도체가 결합된 것을 의미한다.
"Hse"은 호모세린이며; "Hnv"은 하이드록실노르발린이다.
"SPPS" 또는 "고상 펩타이드 합성"은 본원에 기술된 수지를 이용한 펩타이드 합성을 의미한다.
"pNA"은 4-니트로 아닐리드이다.
"DME"은 디메톡시 에탄을 의미한다.
"산 민감성 수지"는, 산성 처리에 의해 펩타이드로부터 절단시킬 수 있으며, 아미노산 또는 펩타이드와 반응하여 결합하는데 적합한 관능기(들)를 포함하는, 불용성 물질 또는 수지를 의미한다.
"산 민감성 보호기"는 산성 처리에 의해 또는 산성 조건 하에서 아미노산, 펩타이드 또는 펩타이드 유도체로부터 절단할 수 있는 보호기를 의미한다.
"펩타이볼"은 아미노산 또는 아미노산 아미드 대신 아미노 알코올을 C-말단 위치에 포함하는 펩타이드를 의미한다.
"단계적(Step-by-step)"은 펩타이드 체인에 포함되는 임의의 아미노산들이 개별적이고 순차적으로 도입되는 펩타이드 합성법을 의미한다. 이 방법은 중간 정제 단계를 수반하거나 수반하지 않을 수 있다.
"보호된 펩타이드"는 펩타이드에서 모든 관능기들이 보호기로 차단 또는 보호된 것을 의미한다.
"부분 보호된 펩타이드"은 펩타이드에서 하나 이상의 관능기가 보호기에 의해 차단 또는 보호된 것을 의미한다.
고상 펩타이드 합성
일 구현예에서, 펩타이드 산, 펩타이드 아미노 및 목적한 펩타이볼 의약제에 대한 개선된 합성 방법을 제공한다.
Figure pat00003
식 I 식 II
본 발명은, 일 측면에서, 트리틸 또는 벤즈하이드릴-타입의 수지 상에서, 아미노산 측쇄를 통해 하이드록시 아미노산, 또는 서열에 하이드록시 아미노산을 포함하는 소형 펩타이드를 부착하여, 식 I-IV의 아미노산-수지 접합체 또는 펩타이드 수지 접합체를 제조함으로써, 펩타이드를 고수율 및 고순도로 매우 효율적으로 생산하였으며, 여기서, P는 고상 펩타이드 합성에 사용되는 지지체들로부터 선택되는 고상 지지체이고, Pr1은 H, 또는 Fmoc, Boc, Trt, Dde 및 Alloc로부터 선택되는 아미노 보호기이고, Pr2는 Trt, Clt, Mmt, Mtt, Dpm 및 tBu로부터 선택되는 산 민감성 하이드록시 보호기이고, Hya는 D- 또는 L-Ser, Thr, Tyr, Hse, Hyp, Hnv 등으로부터 선택되는 하이드록시 아미노산이고, A는 OH; OTrt, OClt, OMmt, OMtt, ODpm 및 OtBu로부터 선택되는 산 민감성 알콕시기, NH2, NHR1, 또는 NR1R2이되, R1과 R2는 독립적으로 알킬기 또는 서열에 1-10개의 아미노산을 포함하는 보호되거나 또는 세미-보호된 펩타이드이다.
다른 구현예에서, 본 발명자들은, 옥트레오티드(octreotide)와 같은 펩타이볼이 천연적인 하이드록시 아미노산으로부터 유래되는 아미노 알코올류들로부터 선택되는 식 III - VI의 수지-결합된 아미노 알코올을 이용하여 고상 합성함으로써 수득됨을 개시하며, 이때 P, X, V, Z 및 Pr1은 상기에서 정의된 바와 같이 정의되며, R3과 R4는 알킬, 아릴 또는 아랄킬기이고, Pr2는 트리틸, 벤즈하이드릴 또는 벤질 타입의 산 민감성 보호기이다.
Figure pat00004
식 III 식 IV
Figure pat00005
식 V 식 VI
아울러, 본 발명자들은, 식 I-IV의 수지를 이용하여 제조되되, 트리틸 타입의 수지 상에서 하이드록시 아미노산의 측쇄 하이드록시기를 통해 부착되어 있는 펩타이드를, 약 산성 처리에 의해, tBu 및 벤질 타입의 측쇄 보호기들을 그대로 유지시키면서, 수지로부터 절단 할 수 있을 최초로 개시한다. 일 측면에서, 수지로부터의 절단은 TFA, HCl 희석 용액과 같은 1-3%의 산 용액으로, 선택적으로 스케빈저를 첨가하여, 용매 중에서 처리함으로써, 이루어진다. 다른 측면에서, 절단은 DCM 또는 아세톤 등의 용매 중에서 수행될 수 있다. 이러한 부분 보호된 펩타이드는 용액 중에서 또는 고상에서 단편 축합에 의해 보다 긴 펩타이드를 합성하는데 유용한 것으로 입증된 바 있다. 본 방법은 본원에 기술된 수지의 다재다양한 이용성을 확장시키며, 또한 제조되는 약학적 펩타이드의 순도를 현저하게 개선시키며, 동시에 합성 단가를 실질적으로 감소시킨다.
목적한 수종의 약학적 펩타이드들이, 본원에 기술된 새로운 방법의 예시로서, 단계적인 공정, 또는 용액 중 및 고상에서의 단편 축합에 의해; 또는 이의 조합으로 제조된다. 아래에 예들을 나타내지만, 어떠한 방식으로도 다른 펩타이드에 대한 이의 적용을 제한하지 않는다.
란레오티드 (Lanreotide):
일 구현예에서, 란레오티드를 아래 나타낸 바와 같이 수지-결합된 Thr-아미드를 이용한 고상 합성으로 제조하였다:
Figure pat00006
인간 인슐린 B-체인:
선택적으로, 인간 인슐린 B 체인을 SPPS에 의해 합성하였다. 일 측면에서, 합성은 4-메톡시 벤즈하이드릴 수지를 이용하여 실시예에 기술된 바와 같이 수지-결합된 Thr-t-부틸 에스테르에서부터 시작한다. 선택적으로, 합성은 또한 1-8의 부분 보호된 Boc-Phe-Val-Asn(Trt)-Gln(Trt)-His(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Gly-OH 단편을 수지-결합된 9-30 단편과 축합함으로써, 고상에서; 또는 수지로부터 부분 보호된 9-30 단편을 선택적으로 절단한 후, 1-8 단편과 9-30 단편을 용액 중에서 축합으로써, 수행할 수 있다.
Figure pat00007
연어 칼시토닌(Salmon Calcitonin):
선택적으로, 연어 칼시토닌은 수지에 결합된 Fmoc-Thr-Pro-NH2로부터 합성을 시작하여 제조할 수 있다. 그런 후, 펩타이드 체인을 Fmoc-아미노산을 사용하여 연장한다.
Figure pat00008
선택적으로, 수지-결합된 연어 칼시토닌은, 2-4개의 단편을 이용하여 아래에 나타낸 바와 같이 용액 중에서, 또는 예를 들어 전술한 바와 같이 수지 상에서의 단편 축합을 통해 제조한다.
Figure pat00009
옥트레오티드:
다른 구현예에서, 옥트레오티드는, 아래에 나타낸 바와 같이, 트레오니놀의 측쇄를 통해 Fmoc-트레오니놀-OTrt를 4-메톡시벤즈하이드릴 수지에 부착시킨 다음, Fmoc-아미노산을 이용하여 옥트레오티드 체인을 조립하고, 마지막으로 후속적인 또는 동시적인 Cys-산화로 수지로부터 옥트레오티드를 절단함으로써, 효율적으로 합성한다. Fmoc-트레오니놀-OTrt는, 적정 수지 상의 트레오니놀의 하이드록시메틸기를 통해 수지 상에 부착시킬 수 있는 Fmoc-Thr(tBu)-ol 보다 훨씬 더 제조가 용이하다. 그 이유는, Fmoc-Thr(tBu)-ol의 제조에 출발 물질로 사용되는 H-Thr(OtBu)-ol이 수지 상에 측쇄를 통한 트레오니놀 부착에 사용되는 Fmoc-트레오니놀-OTrt 보다 제조하기 훨씬 더 어렵기 때문이다.
Figure pat00010
엑세나티드(Exenatide):
다른 예로서, Fmoc-Ser-NH2를 측쇄를 통해 트리틸 수지에 부착하고, 이를 엑세나티드의 합성에 사용한다. 합성은, 후술되는 바와 같이, 단계적인 방식으로, 또는 약 산성 처리에 의해 수지로부터 부분 보호된 엑세나티드 단편을 절단한 후 용액 중에서, 또는 고상에서 단편을 축합함으로써, 수행할 수 있다. 본 방법에 있어서, Pro 및 Gly 잔기를 다량 포함하는 펩타이드의 합성시에 전형적으로 만들어지는 대부분의 불순물들이 형성되는 것이 완전히 방지되므로, 고순도의 펩타이드가 수득된다. 또한, 본 방법은, 당해 기술 분야에 공지된 기타 방법으로 펩타이드 아미드 링커에서 펩타이드를 절단함으로써 생기는, 펩타이드의 수율과 순도를 현저하게 감소시키는, 불순물이 전혀 발생되지 않게 할 수 있다.
Figure pat00011
일 측면에서, 엑세나티드는 수지에서 부분 보호된 펩타이드 12-39를 자르고, 이를 아래에 나타낸 바와 같이 부분 보호된 1-11 단편과 용액 중에서 축합하여 제조할 수 있다. 다른 예에 있어서, 보호된 엑세나티드를 수득하기 위한 축합은 단편 1-13과 단편 14-39로 수행할 수 있다.
Figure pat00012
프람린티드 (Pramlintide):
본 방법은 또한 아밀린 펩타이드를 제조하는데 매우 효율적이다. 일 측면에서, 측쇄 부착은 아밀린이나, 프라밀린티드 등의 이의 유도체의 C-말단 Ser, Thr 또는 Tyr 중 하나를 이용하여 수행할 수 있다. 합성은 단계적인 공정으로 또는 단편을 용액 중에서 또는 고상에서 축합함으로써 수행할 수 있다. 슈도프롤린 (Ψ, Mutter et al, Peptide Res. (1995 8, 145))을 자라나는 펩타이드 체인에 병합하면, 합성은 가속화되며, 수득되는 펩타이드의 순도는 개선된다.
Figure pat00013
다른 예로, 프람린티드의 합성은 수득되는 프람린티드의 순도와 수율에 대해 동일한 성과를 달성하면서 액상에서 수행할 수 있다. 일 구현예에서, 수지 상에 Fmoc-Tyr-NH2의 측쇄를 통해 결합된 보호된 펩타이드는, 펩타이드 체인의 다양한 위치에서, 약 산성 처리를 이용하여, tBu-타입의 측쇄 보호기를 그대로 유지시키면서, 수지로부터 정량적으로 절단할 수 있다. 일 예에 있어서, 아래에 나타낸 바와 같이, 단계적인 방식으로 2-클로로트리틸 수지 상에서 제조한 부분 보호된 1-10 단편을, 부분적으로 보호된 11-37 단편 아미드와 연속적으로 축합한다.
프람린티드:
Figure pat00014
테트라코스액티드(tetracosactide) (ACTH 1-24):
다른 예에 있어서, ACTH 1-24는, 아래에 나타낸 바와 같이, 수지에 결합된 Fmoc-Tyr-Pro-OtBu로부터 시작하여 단계적인 공정에 의해 또는 1-10의 부분 보호된 단편을 용액 중에서 11-24 단편 또는 수지-결합된 11-24 단편과 축합함으로써, 효율적으로 제조된다.
비발리루딘 (Bivalirudin):
다른 예에 있어서, 비발리루딘은, 아래에 나타낸 바와 같이, 수지-결합된 Fmoc-Tyr-Leu-OtBu에서 시작하여, 단계적인 방식으로 Fmoc-아미노산으로 펩타이드 체인을 연장한 다음, 최종적으로 탈보호화하고 수지로부터 펩타이드를 절단함으로써, 고수율 및 고순도로 제조된다.
다른 예로, 비발리루딘은, 수지 상의 보호된 단편들을 축합하거나, 또는 4-15개의 아미노산 잔기를 포함하는 부분 보호된 펩타이드를 수지로부터 절단하고, 이를 용액 중에서 5-16개의 아미노산을 포함하는 비발리루딘 단편과 축합함으로써, 수득한다. 1-10개의 부분 보호된 비발리루딘 단편과 수지-결합된 11-20의 부분 보호된 비발리루딘 단편을, 수지 상에서의 단편 축합을 통해 비발리루딘을 합성하는 과정은, 아래에 나타낸다.
Figure pat00016
실시예
실시예 1:
Fmoc-Thr(4-메톡시벤즈하이드릴 폴리스티릴)-OtBu의 제조
Figure pat00017
통상적인 방법에 따라 H-Thr-OtBu를 Fmoc-OSu과 반응시켜 H-Thr-OtBu로부터 제조한 Fmoc-Thr-OtBu 30 mmol을, 20 g (30 mmol)의 4-메톡시벤즈하이드릴 폴리스티렌 수지 (CBL-Patras 제품) 및 250 ml THF 중의 60 mmol DIPEA과, RT에서 10시간 동안 반응시켰다. 이 혼합물에, 60 mmol 메탄올을 첨가하여, 다시 4시간 교반하였다. 수지를 여과하여, THF/MeOH/DIPEA (85:10:5)로 3번, DMF로 6번, IPA로 4번, DEE로 3번 세척한 다음, 진공 하에 무게가 일정해질 때까지 건조하였다. 이로써, 0.95 mmol/g(수지)의 수지-결합된 Fmoc-Thr-OtBu 29 g이 수득되었다.
실시예 2:
Fmoc-Thr(4-메톡시벤즈하이드릴 폴리스티릴)-O-Clt
Figure pat00018
통상적인 방법에 따라 H-Thr-OMe를 Trt-Cl/Me3SiCl 및 DIPEA와 반응시켜 제조한 Trt-Thr-OMe 30 mmol을, 20 g (30 mmol)의 4-메톡시 4'-폴리스티릴 벤즈하이드릴 브로마이드 수지 (CBL-Patras 사 제품) 및 250 ml THF 중의 60 mmol DIPEA와 RT에서 10시간 동안 반응시켰다. 이 혼합물에 메탄올 60 mmol을 첨가하여, 다시 4시간 교반하였다. 수지를 여과하고, THF/MeOH/DIPEA (85:10:5)로 3번, DCM으로 3번, DCM 중의 1% TFA로 3번, THF/물/메탄올 (70:15:15) 중의 1N-LiOH로 3번, THF/물 (75:25)로 3번, DMF로 4번 세척한 다음, 60 mmol Fmoc-OSu 및 30 mmol DIPEA와 RT에서 2시간 동안 반응시켰다. 이를 DMF로 3번, DCM로 3번 세척한 다음, 다시 50 mmol Trt-Cl 및 50 mmol DIPEA와 RT에서 3시간 동안 반응시킨 후, DMF로 4번, DEE로 6번 세척하고, 진공 하에 무게가 일정해질 때까지 건조하였다. 이로써, 0.78 mmol/g(수지)의 수지-결합된 Fmoc-Thr-OtBu 32.3 g이 수득되었다.
실시예 3:
Fmoc-Throl(4-메톡시 벤즈하이드릴 폴리스티릴)-O-Clt
A) Fmoc-트레오니놀로부터 개시
Figure pat00019
350 ml DCM 중의 시판 Fmoc-트레오니놀 (CBL-Patras) 50 mmol을 55 mmol의 단량체 Clt-Cl 및 55 mmol DIPEA와 RT에서 4시간 동안 반응시켰다. 수득되는 혼합물을 통상적으로 물로 추출하고, DCM 상을 무수 소듐 설페이트 상에서 건조한 후, 여과하였다. 수득되는 용액에, 30 g의 4-메톡시, 4-폴리스티릴 벤즈하이드릴 브로마이드 (CBL-Patras)를 첨가하고, 이 혼합물과 50 mmol DIPEA를 RT에서 4시간 교반하였다. 수지를 여과한 다음, DMF로 6회, IPA로 4회, DEE로 4회 세척한 후, 무게가 일정해 질때까지 진공 하에 건조하였다. 이로써, 0.82 mmol/g의 수지-결합된 Fmoc-트레오니놀 38.4 g이 수득되었다.
B) Trt-Thr(수지)-OMe에서부터 개시
Figure pat00020
통상적인 방법에 따라 H-Thr-OMe를 Trt-Cl/Me3SiCl 및 DIPEA와 반응시켜 제조한 30 mmol Trt-Thr-OMe를, 20 g (30 mmol)의 4-메톡시 4'-폴리스티릴 벤즈하이드릴 브로마이드 수지 (CBL-Patras 사 제품) 및 250 ml THF 중의 60 mmol DIPEA와 RT에서 10시간 동안 반응시켰다. 이 혼합물에 60 mmol 메탄올을 첨가하여, 혼합물을 다시 4시간 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, THF/MeOH/DIPEA (85:10:5)로 3회, THF로 5회 세척한 후, THF 중에서 30 mmol LiBH4와 반응시켰다. 그런 후, 수지를 여과하고, THF로 6회, DCM으로 4회, DCM 중의 1% TFA로 6회, DMF/DIPEA (97:3)로 3회 세척한 다음, 60 mmol Fmoc-OSu 및 30 mmol DIPEA와 RT에서 2시간 동안 반응시켰다. 그런 후, 이를 DMF로 3회, DCM으로 3회 세척하고, 50 mmol Clt-Cl 및 50 mmol DIPEA와 RT에서 3시간 반응시켰다. 이를 다시 DMF로 4회, IPA로 6회 및 DEE로 6회 세척한 다음, 무게가 일정해 질때까지 진공 하에 건조하였다. 이로써, 0.74 mmol/g의 수지-결합된 Fmoc-Throl-O-Clt 34.7 g이 수득되었다.
실시예 4:
Fmoc-Ser(트리틸 수지)-NH2
당해 기술 분야에 공지된 표준적인 방법으로 제조한 50 mmol의 Fmoc-Ser-NH2를 DCM 0.5 L에 용해하였다. 이 현탁물에, 트리틸 클로라이드 수지 30 g (36 mmol)과 65 mmol DIPEA을 첨가한 다음, 혼합물을 RT에서 6시간 동안 교반하였다. 그런 후, 메탄올 25 ml과 DIPEA 30 mmol을 첨가하여, 혼합물을 다시 2시간 동안 RT에서 교반하였다. 수지를 여과한 다음, DCM/MeOH/DIPEA (90:5:5)로 3회, DMF로 5회, IPA로 4회, DEE로 4회 세척하고, 무게가 일정해 질때까지 진공 하에 건조하였다. 이로써, 0.71 mmol/g의 수지-결합된 Fmoc-Ser-NH2-함유 수지 41.1 g이 수득되었다.
실시예 5:
Fmoc-Tyr(2-클로로트리틸 수지)-NH2
상기 공정에 따라, 50 mmol Fmoc-Tyr-NH2 및 30 g의 2-CTC 클로라이드 수지로, 0.81 g Tyr/g (수지) 하중의 클로라이드 수지 43.7 g을 수득하였다.
실시예 6:
Fmoc-Hyp(4-메틸 벤즈하이드릴 수지)-NH2
상기 공정에 따라, 50 mmol Fmoc-Hyp-NH 및 30 g의 4-메틸 벤즈하이드릴 브로마이드 수지로, 0.49 g Hyp/g (수지) 하중의 수지 39.8 g을 수득하였다.
실시예 7:
Fmoc-Thr(4-메톡시벤즈하이드릴 수지)-Pro-NH2
당해 기술 분야에 공지된 표준적인 방법에 따라 Fmoc-Thr(tBu)-OH를 H-Pro-NH2와 커플링하여 제조한 50 mmol의 Fmoc-Thr-Pro-NH2를 DME 0.5 L에 용해하였다. 수득되는 용액에, 4-메톡시 벤즈하이드릴 브로마이드 수지 30 g (45 mmol)과 65 mmol DIPEA을 첨가한 다음, 혼합물을 RT에서 6시간 동안 교반하였다. 그런 후, 메탄올 25 ml과 DIPEA 50 mmol을 첨가하여, 혼합물을 다시 2시간 동안 RT에서 교반하였다. 수지를 여과한 다음, DCM/MeOH/DIPEA (90:5:5)로 3회, DMF로 5회, IPA로 4회, DEE로 4회 세척하고, 무게가 일정해 질때까지 진공 하에 건조하였다. 이로써, 0.77 mmol/g의 Fmoc-Thr-Pro-NH2 함유 수지 44.5 g이 수득되었다.
실시예 8:
Fmoc-Tyr(2-클로로트리틸 수지)-Pro-OtBu
당해 기술 분야에 공지된 표준적인 방법에 따라 Fmoc-Tyr-Pro-OtBu 50 mmol를 제조하여, 이를 DCM 0.5 L에 용해하였다. 수득되는 용액에, 2-클로로트리틸 클로라이드 수지 30 g (48 mmol)과 65 mmol DIPEA을 첨가한 다음, 혼합물을 RT에서 12시간 동안 교반하였다. 그런 후, 메탄올 25 ml과 DIPEA 50 mmol을 첨가하여, 혼합물을 다시 2시간 동안 RT에서 교반하였다. 수지를 여과한 다음, DCM/MeOH/DIPEA (90:5:5)로 3회, DMF로 5회, IPA로 4회, DEE로 4회 세척하고, 무게가 일정해 질때까지 진공 하에 건조하였다. 이로써, 0.64 mmol/g의 Fmoc-Thr-Pro-OtBu 함유 수지 44.5 g이 수득되었다.
실시예 9:
Fmoc-Tyr(2-클로로트리틸 수지)-Leu-OtBu
당해 기술 분야에 공지된 표준적인 방법에 따라 제조한 Fmoc-Tyr-Leu-OtBu 50 mmol을 THF 0.5 L에 용해하였다. 수득되는 용액에, 2-CTC 클로라이드 수지 30 g (48 mmol)과 65 mmol DIPEA을 첨가한 다음, 혼합물을 60℃에서 12시간 동안 교반하였다. 그런 후, 메탄올 25 ml과 DIPEA 50 mmol을 첨가하여, 혼합물을 다시 2시간 동안 RT에서 교반하였다. 수지를 여과한 다음, DCM/MeOH/DIPEA (90:5:5)로 3회, DMF로 5회, IPA로 4회, DEE로 4회 세척하고, 무게가 일정해 질때까지 진공 하에 건조하였다. 이로써, 0.64 mmol/g의 Fmoc-Tyr-Leu-OtBu-함유 수지 44.5 g이 수득되었다.
실시예 10:
펩타이드 및 보호된 펩타이드 단편의 고상 합성
일반 공정
A1. 2-클로로트리틸 수지에 아미노산 부하(loading), 일반 공정
CBL-Patras 사의 2-클로로트리틸 클로라이드 수지 (CTC-Cl) (100 g; 하중 1.6 mmol/g)를 2 L 펩타이드 합성 반응기에 넣고, 700 mL 디클로로메탄 (DCM):디메틸포름아미드 (DMF) 1:1을 첨가하여 25℃에서 30분간 팽윤시켰다. 수지를 여과하고, 500 mL DCM 중의 100 mmol Fmoc-아미노산 및 300 mmol 디이소프로필에틸아민 (DIEA) 용액을 첨가하였다. 이 혼합물을 질소 하에서 2시간 동안 25℃에서 교반하였다. 그런 후, 메탄올 (MeOH) 10 mL을 첨가하여 1시간 동안 반응시킴으로써, 남아있는 2-CTC 수지의 활성부를 중화시켰다. 이 수지를 여과한 다음, 400 mL DMF로 2회 세척하였다. 수지를 여과하고, 30분간 DMF 중의 25 부피%의 피페리딘 500 mL을 2회 처리하였다. 그 후, 수지를 DMF 500 mL로 4회 세척하였다. 수지를 이소프로판올 (IPA) 500 mL로 3회 탈수(deswelling)시켰다. 수지를 무게가 일정해 질때까지 건조하였다. 수지에는 사용된 아미노산 mmol의 70-95%가 결합되었다.
B. 고상 합성, 일반 프로토콜
고상 합성은, 파트 A 또는 실시예 1에 기술된 바와 같이, 트리틸 또는 벤즈하이드릴 타입의 수지로 에스테르화되거나 또는 그 측쇄를 통해 부착된 아미노산 또는 펩타이드 10 g을 이용하여, 24℃에서 수행한다. 아래 프로토콜을 합성에 사용하였다.
B1. 수지의 팽윤
수지를 15 ml 반응조에 넣고, 7 mL NMP로 2회 처리한 다음, 여과하였다.
B2. 아미노산의 활성화
아미노산 (3.0 당량) 및 1-하이드록시벤조트리아졸 (4.0 당량)을 칭량하여 넣고, 반응조에서 2.5 부피의 NMP에 용해한 다음, 0℃로 냉각하였다. 그런 후, DIC (3.0 당량)을 첨가하고, 혼합물을 15분간 교반하였다.
B3. 커플링
B2에서 제조한 용액을 B1 반응조에 투입하였다. 반응조를 1 부피의 DCM으로 1회 헹군 다음, 투입하여, 25 - 30℃에서 1-3시간 교반하였다. 샘플에 대해 카이저 테스트를 수행하여, 반응 완료를 확인하였다. 커플링 반응이 3시간 후 완료되지 않은 경우에는 (카이저 테스트 양성), 반응 혼합물을 여과하고, 활성화된 아미노산 신선 용액과 다시 커플링하였다. 커플링 반응 완료 후, 반응 혼합물을 여과하고, NMP로 4번 (1회 세척 당 5 부피비) 헹구었다.
B4. Fmoc-기의 제거
B3에서 제조되는 수지를 여과한 다음, 25 부피%의 피페리딘이 포함된 용액 5 mL로 30분간 처리하였다. 그런 후, 수지를 5 mL NMP로 3번 헹구었다.
B5. 펩타이드 체인의 연장
각 아미노산을 조합한 후, 펩타이드 체인이 완성될 때까지 단계 B1 - B5를 반복 수행하였다.
각각의 개개 아미노산 도입시 다음과 같은 Fmoc-아미노산을 사용하였다: Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asn-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-D-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Gln-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Hyp(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-D-Phe-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(Trt)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Ser(Trt)-OH, Fmoc-D-Trp-OH, Fmoc-Trp-OH, Fmoc-D-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(Clt)-OH, Fmoc-Val-OH, Boc-D-Cys(Trt)-OH, Boc-His(Trt)-OH, Boc-Lys(Boc)-OH, Boc-D-2-Nal-OH, Boc-D-Phe-OH, Boc-Ser(tBu)-OH.
C. N-말단에 Fmoc- 또는 Boc-기를 포함하는, 펩타이드 및 보호된 펩타이드 단편을, CTC-수지로부터 산성 절단하는 일반적인 방법.
상기 B1-B5에 기술된 바와 같이 제조한 수지-결합된 펩타이드 또는 펩타이드 단편을 5 mL NMP로 4회, 5 ml IPA로 3회, 마지막으로 7 ml DCM으로 5회 세척하여, 남아있는 NMP 또는 기본적인 성분들을 모두 제거하였다. 그런 후, 수지를 0℃로 냉각시키고, DCM으로부터 여과한 다음, 5℃에서 1-2% TFA/DCM 용액 10 mL을 2회 처리하였다. 그 후, 혼합물을 0℃에서 20분간 교반하고, 여과하였다. 이후, 수지를 10 mL DCM으로 3회 세척하였다. 여과물 (TFA에 대해 1.3 당량)에 피리딘을 첨가하여, TFA를 중화하였다. DCM 중의 절단 용액을 동일 부피의 물과 혼합하였다. 제조되는 혼합물을 감압 하에 증류하여, DCM을 제거하였다 (350 torr, 28 ℃). DCM 제거 후, 펩타이드 또는 펩타이드 단편이 석출되었다. 수득되는 펩타이드를 물로 헹군 다음, 15 Torr 진공 하에 30 - 35℃에서 건조하였다.
실시예 11:
N-말단 보호된 단편과 수지-결합된 C-말단 보호된 단편의 축합에 의한, 수지-결합된 보호된 펩타이드의 합성
일반 공정
DMSO/DCM (95:5) 중의 N-말단 보호된 펩타이드 단편 0.15 mmol/ml 용액에, 0.2 mmol HOBt를 첨가하고, 제조되는 용액을 5℃로 냉각시킨다. 여기에 DIC 0.14 mmol을 첨가한 다음, 혼합물을 15℃에서 20분간 교반한 후, 수지-결합된 C-말단 단편 0.1 mmol에 첨가하여, RT에서 다시 6시간 교반한다. 축합 반응의 완료는 카이저 테스트로 체크한다. 카이저 테스트에서 블루로 유지되는 경우, 축합이 완료되도록 하기 위해 2차 축합을 수행하였다.
실시예 12:
용액 중에서 N-말단 보호된 단편과 C-말단 보호된 단편의 축합에 의한 부분 보호된 펩타이드의 합성.
일반 공정
DCM 중의 0.15 mmol/ml의 N-말단 보호된 단편 용액에 0.2 mmol HOBt를 첨가하고, 제조되는 용액을 5℃로 냉각시킨다. 그런 후, 0.15 mmol EDAC를 첨가하여, 혼합물을 15℃에서 20분간 교반한 후, 다시 C-말단 보호된 단편 0.15 mmol에 투입하여, 다시 2-5시간 동안 RT에서 교반하였다. 축합 반응의 완료는 HPLC로 체크하였다. 불완전 축합이 관찰되는 경우에는, 추가로 0.015 mmol EDAC를 첨가하여, RT에서 다시 한시간 동안 반응이 진행되게 두었다.
실시예 13
펩타이드의 탈보호 및 수지로부터 동시 절단.
일반 공정
전술한 바와 같이 제조한 보호된 수지-결합된 펩타이드 1.00 g에, TFA/DTT/물 (90:5:5) 20 mL을 5℃에서 3시간, 그리고 15℃에서 1시간 처리한다. 그런 후, 수지를 절단 용액으로 3회 세척하고, 조합한 여과물을 진공 농축한 다음, 에테르를 첨가하여 펩타이드 조산물을 석출시킨 후, 에테르로 여러번 헹구고, 무게가 일정해질 때까지 KOH 상에서 진공 건조하였다.
실시예 14:
펩타이드 탈보호
일반 공정
전술한 바와 같이 제조한 보호된 펩타이드 1.00 g에, TFA/DTT/물 (90:5:5) 20 mL을 5℃에서 3시간 동안, 그리고 15℃에서 1시간 동안 처리하였다. 제조되는 용액을 진공 농축하고, 여기에 디이소프로필에테르를 첨가하여 탈보호된 펩타이드를 석출시킨 다음, 디이소프로필에테르 10 mL로 3번 세척하였다. 수득되는 고형물을 무게가 일정해질 때까지 KOH 상에서 진공 건조하였다 (25 ℃, 15 Torr).
실시예 15:
펩타이드 조상물의 정제, 펩타이드의 분리.
일반 공정
전술한 바와 같이 수득한 펩타이드 용액을 진공에서 농축하고, 빙수와 에테르를 첨가하였다. 유기층을 분리한 후, 남아있는 펩타이드 수용액을 에테르로 2회 더 추출한 다음, 수득한 용액에 질소나 헬륨을 통기시킨 후, 여과하여, 반-분취용 컬럼 10 x 25 cm, Lichrospher 100, RP-18, 12 마이크론 (Merck)에 직접 주입하였다; A 상 = 아세토니트릴 중의 1% TFA, B 상 = 1% TFA 수용액; 또는 크로마실(kromasil). 정제된 펩타이드가 포함된 HPLC 분획들을 진공에서 농축하여, 함유된 아세토니트릴을 가능한 많이 제거하고, 표준 동결건조 프로그램으로 동결건조하였다.
아래에 나타낸 실시예 16 내지 23을 전술한 공정으로 수행하여 열거된 화합을 제조하였다.
실시예 16: 란레오티드
실시예 17: 인슐린 B-체인
실시예 18: 연어 칼시토닌
실시예 19: 옥트레오티드
실시예 20: 엑세나티드
실시예 21: 프람린티드
실시예 22: 테트라코스액티드 (ACTH 1-24)
실시예 23: 비발리루딘
SEQUENCE LISTING <110> Barlos, et al. <120> Solid Phase Peptide Synthesis via side chain attachment <160> NUMBER OF SEQ ID NOS: 26 <210> SEQ ID NO 1 <211> LENGTH 8 <212> PRT <213> ORGANISM: Artificial Sequence <220> FEATURE <221> Lanreotide <222> 1; Xaa = D-2-Naphthyl alanine, 2; Xaa = D-Trp <223> OTHER INFORMATION: Disulfide bond between Cys(2) and Cys(6); Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide; Synonyms: <400> SEQUENCE: 1 Xaa Cys Tyr Xaa Lys Val Cys Thr 1 5 <210> SEQ ID NO 2 <211> LENGTH 30 <212> PRT <213> ORGANISM: human <220> FEATURE <221> human insulin B-chain <400> SEQUENCE: 2 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30 <210> SEQ ID NO 3 <211> LENGTH 8 <212> PRT <213> ORGANISM: human <220> FEATURE <221> human insulin B-chain 1-8 <400> SEQUENCE: 3 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly 1 5 <210> SEQ ID NO 4 <211> LENGTH 22 <212> PRT <213> ORGANISM: human <220> FEATURE <221> human insulin B-chain 9-30 <400> SEQUENCE: 4 Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 1 5 10 15 Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 <210> SEQ ID NO 5 <211> LENGTH 32 <212> PRT <213> ORGANISM: salmon <220> FEATURE <221> salmon calcitonin <223> OTHER INFORMATION: Disulfide bond between Cys 1 and Cys 7; Pro(32)-amide; Synonyms: <400> SEQUENCE: 5 Cys Ser Asn Leu Ser Thr Cys Val Leu Gly Lys Leu Ser Gln Glu Leu 1 5 10 15 His Lys Leu Gln Thr Tyr Pro Arg Thr Asn Thr Gly Ser Gly Thr Pro NH2 20 25 30 <210> SEQ ID NO 6 <211> LENGTH 10 <212> PRT <213> ORGANISM: salmon <220> FEATURE <221> salmon calcitonin 1-10 <223> OTHER INFORMATION: Disulfide bond between Cys 1 and Cys 7; <400> SEQUENCE: 6 Cys Ser Asn Leu Ser Thr Cys Val Leu Gly 1 5 10 <210> SEQ ID NO 7 <211> LENGTH 22 <212> PRT <213> ORGANISM: salmon <220> FEATURE <221> salmon calcitonin 11-32 <223> Pro(32)-amide <400> SEQUENCE: 7 Lys Leu Ser Gln Glu Leu His Lys Leu Gln Thr Tyr Pro Arg Thr Asn 1 5 10 15 Thr Gly Ser Gly Thr Pro NH2 <210> SEQ ID NO 8 <211> LENGTH 8 <212> PRT <213> ORGANISM: Artificial sequence <220> FEATURE <221> octreotide <222> 1; Xaa = D-Cys, 3; Xaa = D-Trp, 8; Xaa = L-threoninol <223> OTHER INFORMATION: Disulfide bond between Cys 1 and Cys 7; Synonyms: <400> SEQUENCE: 8 Xaa Phe Xaa Lys Phe Thr Cys Xaa 1 5 <210> SEQ ID NO 9 <211> LENGTH 39 <212> PRT <213> ORGANISM: gila monster <220> FEATURE <221> exenatide <223> OTHER INFORMATION: Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide. 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Claims (42)

  1. 식 I 또는 II의 수지 접합체로서,
    Figure pat00021
    Figure pat00022

    식 I 식 II
    Hya는 하이드록시 아미노산의 잔기이고;
    Pr1은 H, 또는 수지 및 다른 보호기와 직교하는(orthogoanl), 아미노 보호기이고;
    A는 하이드록시기, 또는 tBu, Trt, Clt 및 NR1R2로부터 선택되는 산 민감성 하이드록시 보호기이고;
    R1 및 R2는 H 또는 C1-10 알킬이거나, 또는 0-30개의 아미노산을 포함하는 펩타이드 에스테르, 펩타이드 아미드 또는 펩타이볼(peptaibol)이고;
    X, Y, Z 및 V는 각각 독립적으로 오르소, 메타 또는 파라 위치의 치환기로서, H, Cl, F, C1-10 알킬 및 C1-10 알콕시로부터 선택되며; 및
    P는 펩타이드의 고상 합성에 적합한 불용성 고체 지지체 또는 불용성 링커-수지 접합체인 것을 특징으로 하는 수지 접합체.
  2. 식 III-VI의 수지 접합체:
    Figure pat00023

    식 III 식 IV
    Figure pat00024

    식 V 식 VI
    상기 식에서,
    Pr1은 H, 또는 수지 및 다른 보호기와 직교하는, 아미노 보호기이고;
    Pr2는 H, 또는 수지와 직교하는 하이드록시 보호기이고;
    R3 및 R4는 각각 독립적으로 H 또는 C1-10 알킬이고;
    X, Y, Z 및 V는 각각 독립적으로 오르소, 메타 또는 파라 위치로서, H, Cl, F, C1-10 알킬 및 C1-10 알콕시로부터 선택되며; 및
    P는 펩타이드 고상 합성에 적합한 불용성 고형 지지체 또는 불용성 링커-수지 접합체이다.
  3. 식 I - VI의 수지 접합체의 제조 방법으로서,
    상기 방법은,
    함유된 하이드록시 아미노산 또는 함유된 아미노산 알코올에서 하나 이상의 측쇄가 비보호된, 하이드록시 함유 아미노산, 아미노 알코올 또는 펩타이드 유도체를 제조하는 단계; 또는 선택적으로, 상기 하이드록시 아미노산 또는 상기 하이드록시 아미노 알코올의 측쇄에서, 하이드록시 아미노산, 하이드록시 아미노 알코올 또는 펩타이드 유도체를 탈보호화하는 단계;
    트리틸 타입의 수지 및 링커, 벤즈하이드릴 타입의 수지 또는 벤질-타입의 수지로 이루어진 군으로부터 선택되는, 할라이드 수지와 반응시켜, 적정 수지에 부착하는 단계; 및
    알코올 또는 티오알코올을 첨가하여, 임의의 미반응 할라이드 수지를 차폐(masking)하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 모노알킬화된 Fmoc-아미노 디-알코올의 제조 방법으로서,
    상기 방법은, 삼차 아민 염기와 같은 염기의 존재 하에, 디클로로메탄과 같은 유기 용매 중에서, Fmoc-디-아미노 알코올을 알킬할라이드와 반응시키는 단계를 포함하며;
    상기 알킬이 트리틸, 4-메틸트리틸, 4-메톡시트리틸 및 2-클로로트리틸로부터 선택되는 트리아릴메틸인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 생물학적 활성의 유리형(free) 또는 부분 보호된 펩타이드, 환형 펩타이드 및 펩타이볼의 고상 합성 방법으로서,
    상기 방법은 고상 펩타이드 합성에 관능화된 수지로서 제1항 또는 제2항의 수지 접합체를 이용하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 식 E-D-2-Nal-Cys(A)-Tyr(C)-D-Trp(F)-Lys(E)-Val-Cys(A)-Thr(수지)-NH2의 펩타이드로서,
    D-는 D-아미노산으로서 후행되는 아미노산의 키랄성(chirality)을 표시하며;
    각각의 A는 독립적으로 Trt, Mmt, Acm 및 StBu로부터 선택되는 티올 보호기이고;
    C는 Clt, Trt 및 tBu로부터 선택되는 하이드록시 보호기이고;
    F는 H 또는 Boc이고;
    E는 Mtt, Mmt, Trt 및 Boc로부터 선택되는 아미노 보호기이고;
    수지는 H, 또는 고상 펩타이드 합성에 적합한 산 민감성 수지인 것을 특징으로 하는, 펩타이드.
  7. 제6항에 있어서, 상기 펩타이드는 수지-결합된 란레오티드(resin-bound lanreotide)인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  8. 란레오티드의 제조 방법으로서,
    제7항의 펩타이드 수지 접합체에, 스케빈저(scavenger)를 선택적으로 포함하는, 트리플루오로아세트산 용액으로부터 선택되는 약산을 처리하는 단계; 및
    공기, 과산화수소, DMSO 및 요오드로부터 선택되는 산화제를 이용하여, 상기 펩타이드를 산화하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  9. 제7항의 펩타이드 수지 접합체에 요오드를 포함하는 트리플루오로아세트산 용액과 같은 약산을 처리하는 단계를 포함하는, 란레오티드의 제조 방법.
  10. 식 E-Phe-Val-Asn(A)-Gln(A)-His(A)-Leu-Cys(B)-Gly-Ser(C)-His(A)-Leu-Val-Glu(C)-Ala-Leu-Tyr(C)-Leu-Val-Cys(A)-Gly-Glu(C)-Arg(D)-Gly-Phe-Phe-Tyr(C)-Thr(C)-Pro-Lys(E)-Thr(수지)-O-C의 펩타이드로서,
    A는 H 또는 Trt, Mtt 및 Mmt로부터 선택되는 카르복사미도 또는 이미다졸 보호기이고;
    B는 Mmt, Trt, Acm 및 StBu로부터 선택되는 Cys 보호기이고;
    C는 tBu, Trt 및 Clt로부터 선택되는 하이드록시, 카르복시 또는 페녹시 보호기이고;
    D는 Pbf 및 Pmc로부터 선택되는 구아니딘 보호기이고;
    E는 H, 또는 Fmoc, Boc, Trt, Nps, Mtt, Mmt 및 Clt로부터 선택되는 아미노 보호기이고;
    수지는 H, 또는 고상 펩타이드 합성에 적합한 산 민감성 수지인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  11. 제10항에 있어서, 상기 펩타이드는 인간 인슐린 B-체인인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  12. 인슐린 B-체인의 제조 방법으로서,
    상기 방법은, 제10항의 수지-결합된 펩타이드를, 선택적으로 스케빈저를 포함하는, 디클로로메탄 중의 트리플루오로아세트산 용액과 같은 산 용액과 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  13. 식 E-Ser(C)-His(A)-Leu-Val-Glu(C)-Ala-Leu-Tyr(C)-Leu-Val-Cys(B)-Gly-Glu(C)-Arg(D)-Gly-Phe-Phe-Tyr(C)-Thr(C)-Pro-Lys(E)-Thr(수지)-O-의 펩타이드로서,
    A는 Trt, Mtt 및 Mmt로부터 선택되는 카르복사미도 또는 이미다졸 보호기이고;
    B는 Mmt, Trt, Acm 및 StBu로부터 선택되는 Cys 보호기이고;
    각각의 C는 tBu, Trt 및 Clt로부터 선택되는 하이드록시, 카르복시 또는 페녹시 보호기이고;
    D는 Pbf 및 Pmc로부터 선택되는 구아니딘 보호기이고;
    E는 H, 또는 Fmoc, Boc, Trt, Nps, Mtt, Mmt 및 Clt로부터 선택되는 아미노 보호기이고;
    수지는 H, 또는 고상 펩타이드 합성에 적합한 산 민감성 수지인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  14. 제13항에 있어서, 상기 펩타이드는 인간 인슐린 B-체인의 부분 보호된 9-30 단편에 해당되는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  15. 인슐린 B-체인의 제조 방법으로서,
    상기 방법은, 제13항의 펩타이드를 보호된 1-8 인슐린 단편 Boc-Phe-Val-Asn(A)-Gln(A)-His(A)-Leu-Cys(B)-Gly-OH와 축합하는 단계를 포함하며;
    각각의 A는 독립적으로 Trt, Mtt 및 Mmt로부터 선택되는 카르복사미도 또는 이미다졸 보호기이고;
    B는 Mmt, Trt, Acm 및 StBu로부터 선택되는 Cys 보호기인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  16. 식 E-Cys(B)-Ser(C)-Asn(A)-Leu-Ser(C)-Thr(C)-Cys(B)-Val-Leu-Gly-Lys(E)-Leu-Ser(C)-Gln(A)-Glu(C)-Leu-His(A)-Lys(E)-Leu-Gln(A)-Thr(C)-Tyr(C)-Pro-Arg(D)-Thr(C)-Asn(A)-Thr(C)-Gly-Ser(C)-Gly-Thr(수지)-Pro-NH2의 펩타이드로서,
    각각의 A는 독립적으로 Trt, Mtt 및 Mmt로부터 선택되는 카르복사미도 또는 이미다졸 보호기이고;
    각각의 B는 독립적으로 Mmt, Trt, Acm 및 StBu로부터 선택되는 Cys 보호기이고;
    각각의 C는 독립적으로 tBu, Trt 및 Clt로부터 선택되는 하이드록시, 카르복시 또는 페녹시 보호기이고;
    D는 Pbf 및 Pmc로부터 선택되는 구아니딘 보호기이고;
    각각의 E는 독립적으로 H, 또는 Fmoc, Boc, Trt, Nps, Mtt, Mmt 및 Clt로부터 선택되는 아미노 보호기이고;
    수지는 H, 또는 고상 펩타이드 합성에 적합한 산 민감성 수지인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  17. 제16항에 있어서, 상기 펩타이드는 연어 칼시토닌(salmon calcitonin)인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  18. 연어 칼시토닌의 제조 방법으로서,
    상기 방법은,
    제16항의 펩타이드에, 선택적으로 스케빈저를 포함하는 트리플루오로아세트산 용액과 같은 약산을 처리하는 단계;
    공기, 과산화수소, DMSO 및 요오드로부터 선택되는 적정 산화제를 이용하여, 상기 처리한 펩타이드 용액을 산화하는 단계;
    상기 펩타이드를 탈보호화하는 단계;
    상기 펩타이드를 크로마토그래피로 정제하는 단계; 및
    상기 펩타이드를 동결건조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 연어 칼시토닌의 제조 방법으로서,
    상기 방법은,
    제16항의 펩타이드 수지 접합체에, 트리플루오로아세트산 용액과 같은 약산을 처리하는 단계;
    상기 펩타이드를 요오드로 산화하는 단계;
    스케빈저를 선택적으로 포함하는, 트리플루오로아세트산 또는 하이드로클로르산 용액과 같은 산을 처리하여, 펩타이드를 탈보호화하는 단계;
    상기 연어 칼시토닌 펩타이드를 크로마토그래피로 정제하고, 동결건조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제17항의 펩타이드의 제조 방법으로서,
    상기 방법은, 식 H-Lys(E)-Leu-Ser(C)-Gln(A)-Glu(C)-Leu-His(A)-Lys(E)-Leu-Gln(A)-Thr(C)-Tyr(C)-Pro-Arg(D)-Thr(C)-Asn(A)-Thr(C)-Gly-Ser(C)-Gly-Thr(수지)-Pro-NH2의 연어 칼시토닌의 부분 보호된 11-32 단편을, 식 E-Cys(B)-Ser(C)-Asn(A)-Leu-Ser(C)-Thr(C)-Cys(B)-Val-Leu-Gly-OH의 연어 칼시토닌의 부분 보호된 1-10 단편과 축합하는 단계를 포함하며,
    각각의 A는 독립적으로 Trt, Mtt 및 Mmt로부터 선택되는 카르복사미도 또는 이미다졸 보호기이고;
    각각의 B는 독립적으로 Mmt, Trt, Acm 및 StBu로부터 선택되는 Cys 보호기이고;
    각각의 C는 독립적으로 tBu, Trt 및 Clt로부터 선택되는 하이드록시, 카르복시 또는 페녹시 보호기이고;
    D는 H, 또는 Pbf 및 Pmc로부터 선택되는 구아니딘 보호기이고;
    각각의 E는 독립적으로 H, 또는 Fmoc, Boc, Trt, Nps, Mtt, Mmt 및 Clt로부터 선택되는 아미노 보호기이고; 및
    수지는 H, 또는 고상 펩타이드 합성에 적합한 산 민감성 수지인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 하기 식의 부분 보호된 펩타이드:
    Figure pat00025

    상기 식에서,
    A는 H, 또는 Fmoc, Boc, Trt, Nps, Mtt 및 Mmt로부터 선택되는 아미노 보호기이고;
    D-는 D-아미노산으로 후행되는 아미노산의 키랄성을 표시하며;
    B는 Trt, Mmt, Acm 및 StBu로부터 선택되는 보호기이고;
    C는 H 또는 Boc이고;
    E는 Clt, Trt 및 tBu로부터 선택되는 하이드록시 보호기이고; 및
    수지는 H, 또는 고상 펩타이드 합성에 적합한 산 민감성 수지이다.
  22. 제21항에 있어서, 상기 펩타이드는 수지-결합된 옥트레오티드(octreotide)인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  23. 옥트레오티드의 제조 방법으로서,
    상기 방법은,
    제22항의 펩타이드 수지 접합체에, 스케빈저를 선택적으로 포함하는, 트리플루오르아세트산 용액과 같은 약산을 처리하는 단계; 및
    공기, 과산화수소, DMSO 또는 요오드로부터 선택되는 적정 산화제를 이용하여 상기 수득되는 펩타이드 용액을 산화하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 옥트레오티드의 제조 방법으로서,
    제22항의 펩타이드 수지 접합체에 요오드를 포함하는 트리플루오르아세트산 용액과 같은 약산을 처리하는 단계;
    탈보호, 정제 및 동결건조하여, 순도가 >99%인 옥트레오티드를 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 식 E-His(A)-Gly-Glu(C)-Gly-Thr(C)-Phe-Thr(C)-Ser(C)-Asp(C)-X-Lys(E)-Gln(A)-Met-Glu(C)-Glu(C)-Glu(C)-Ala-Val-Arg(D)-Leu-Phe-Ile-Glu(C)-Trp(F)-Leu-Lys(E)-Asn(A)-Gly-Gly-Pro-Ser(C)-Ser(C)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(수지)-NH2의 부분 보호된 펩타이드로서:
    X는 Leu-Ser(tBu) 또는 Leu-ΨSer이고;
    각각의 A는 독립적으로 H, 또는 Trt, Mtt 및 Mmt로부터 선택되는 카르복사미도 또는 이미다졸 보호기이고;
    각각의 C는 독립적으로 tBu, Trt 또는 Clt로부터 선택되는 하이드록시, 카르복시 또는 페녹시 보호기이고;
    D는 H, 또는 Pbf 및 Pmc로부터 선택되는 구아니딘 보호기이고;
    각각의 E는 독립적으로 H, 또는 Fmoc, Boc, Trt, Nps, Mtt, Mmt 및 Clt로부터 선택되는 아미노 보호기이고;
    F는 H, 또는 Boc이고;
    수지는 고상 펩타이드 합성에 적합한 산 민감성 수지인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  26. 제25항에 있어서, 상기 펩타이드는 엑세나티드(exenatide)인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  27. 엑세나티드 12-39, 13-39, 14-39 단편인, 부분 보호된 펩타이드 Y-Glu(C)-Glu(C)-Ala-Val-Arg(D)-Leu-Phe-Ile-Glu(C)-Trp(F)-Leu-Lys(E)-Asn(A)-Gly-Gly-Pro-Ser(C)-Ser(C)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(수지)-NH2로서,
    Y는 H, E-Glu(C), E-Met-Glu(C), E-Gln(A)-Met-Glu(C) 또는 E-Lys(E')-Gln(A)-Met-Glu(C)이고;
    각각의 A는 독립적으로 H, 또는 Trt, Mtt 및 Mmt로부터 선택되는 카르복사미도 보호기이고;
    E 및 E'은 각각 독립적으로 H, 또는 Fmoc, Boc, Trt, Nps, Mtt, Mmt 및 Clt로부터 선택되는 아미노 보호기이고;
    F는 H, 또는 Boc이고;
    각각의 C는 독립적으로 tBu, Trt 및 Clt로부터 선택되는 하이드록시 또는 카르복시 보호기이고;
    D는 H, 또는 Pbf 및 Pmc로부터 선택되는 구아니딘 보호기이고;
    수지는 H, 또는 고상 펩타이드 합성에 적합한 산 민감성 수지인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  28. 엑세나티드 1-11, 1-13, 1-14 및 1-15 단편에 해당되는, E-His(A)-Gly-Glu(C)-Gly-Thr(C)-Phe-Thr(C)-Ser(C)-Asp(C)-X-Y인, 부분 보호된 펩타이드로서,
    X는 Leu-Ser(tBu) 또는 Leu-ΨSer이고;
    E는 Fmoc, Boc, Trt, Nps, Mtt, Mmt 및 Clt로부터 선택되는 아미노 보호기이고;
    A는 H, Trt, Mtt 및 Mmt로부터 선택되는 카르복사미도 또는 이미다졸 보호기이고;
    각각의 C는 독립적으로 tBu, Trt 및 Clt로부터 선택되는 하이드록시 또는 카르복시 보호기이고;
    Y는 OZ, Lys(E)-Gln(A)-OZ, Lys(E)-Gln(A)-Met-OZ, Lys(E)-Gln(A)-Met-Glu(C)-OZ이고,
    각각의 Z는 독립적으로 H, 또는 Bt, Su, Pfp, Tcp 및 Pnp로부터 선택되는 카르복시기를 친전자적으로 활성화하는 기인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  29. 엑세나티드의 제조 방법으로서,
    제27항에 따른 하나의 단편을 제28항에 따른 하나의 단편과 축합하여, 부분 보호되거나 또는 수지-결합된 보호된 엑세나티드 서열을 제조하는 단계;
    탈보호화 또는 상기 수지로부터 절단하는 단계; 및
    엑세나티드의 탈보호화, 크로마토그래피 정제 및 동결건조 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 식 E-Lys(E)-Cys(B)-Asn(A)-Thr(C)-Y-Cys(B)-Y-Gln(A)-Arg(D)-Leu-Ala-Asn(A)-Phe-Leu-Val-His(A)-X-Asn(A)-Asn(A)-Phe-Gly-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Thr(C)-Asn(A)-Val-Gly-Ser(C)-Asn(A)-Thr(C)-Tyr(수지)-NH2의 부분 보호된 펩타이드로서,
    X는 Ser(tBu)-Ser(tBu) 또는 Ser(tBu)-ΨSer이고;
    Y는 Ala-Thr(tBu) 또는 Ala-ΨThr이고;
    각각의 A는 독립적으로 H, Trt, Mtt 및 Mmt로부터 선택되는 카르복사미도 또는 이미다졸 보호기이고;
    각각의 B는 독립적으로 Mmt, Trt, Acm 및 StBu로부터 선택되는 Cys 보호기이고;
    각각의 C는 독립적으로 tBu, Trt 및 Clt로부터 선택되는 하이드록시, 카르복시 또는 페녹시 보호기이고;
    D는 H, 또는 Pbf 및 Pmc로부터 선택되는 구아니딘 보호기이고;
    E는 H, 또는 Fmoc, Boc, Trt, Nps, Mtt, Mmt 및 Clt로부터 선택되는 아미노 보호기이고;
    수지는 H, 또는 고상 펩타이드 합성에 적합한 산 민감성 수지인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  31. 제30항에 있어서, 보호된 또는 부분 보호된 프람린티드(pramlintide)인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  32. 서열 Z-Asn(A)-Phe-Leu-Val-His(A)-X-Asn(A)-Asn(A)-Phe-Gly-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Thr(C)-Asn(A)-Val-Gly-Ser(C)-Asn(A)-Thr(C)-Tyr(수지)-NH2의 보호된 또는 부분 보호된 펩타이드, 특히 보호되거나 부분 보호된 10-38, 11-38, 12-38 및 14-38의 프람린티드 단편으로서,
    Z는 H, 또는 E-Gln(A)-Arg(D)-Leu-Ala, E-Arg(D)-Leu-Ala, E-Leu-Ala 또는 E-Ala이고;
    X는 Ser(tBu)-Ser(tBu) 또는 Ser(tBu)-ΨSer이고;
    A는 H, 또는 Trt, Mtt 및 Mmt로부터 선택되는 카르복사미도 또는 이미다졸 보호기이고;
    C는 tBu, Trt 및 Clt로부터 선택되는 하이드록시, 카르복시 또는 페녹시 보호기이고;
    D는 H, 또는 Pbf 및 Pmc로부터 선택되는 구아니딘 보호기이고;
    E는 H, 또는 Fmoc, Boc, Trt, Nps, Mtt, Mmt 및 Clt로부터 선택되는 아미노 보호기이고;
    수지는 H, 또는 고상 펩타이드 합성에 적합한 산 민감성 수지인 것을 특징으로 하는 단편.
  33. 부분 보호되며 산화된 프람린티드 단편의 제조 방법으로서,
    Figure pat00026

    보호된 펩타이드들을 2-CTC-수지와 같은 산 민감성 수지 상에서 조립하는 단계;
    상기 수지로부터 상기 보호된 펩타이드를 절단하는 단계;
    상기 수지-결합된 펩타이드을, 디클로로메탄과 같은 유기 용매 중에서, 트리플루오로아세트산 희석물과 같은 약산과 접촉시켜, 수지-결합된 펩타이드를 산화하는 단계를 포함하며,
    상기 용매는 상기 단편에 대해 요오드를 2-200 몰 이상으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 프람린티드의 제조 방법으로서,
    제33항의 단편을, 용액 중에서 또는 고상에서, 제32항 또는 제33항에 따른 하나의 단편 또는 식 E-Lys(E)-Cys(B)-Asn(A)-Thr(C)-Y-Cys(B)-Y-Gln(A)-Arg(D)-Leu-Ala-OZ, E-Lys(E)-Cys(B)-Asn(A)-Thr(C)-Y-Cys(B)-Y-Gln(A)-Arg(D)-OZ, E-Lys(E)-Cys(B)-Asn(A)-Thr(C)-Y-Cys(B)-Y-Gln(A)-OZ, 및 E-Lys(E)-Cys(B)-Asn(A)-Thr(C)-Y-Cys(B)-Y-OZ 중 하나의 단편과 축합하는 단계를 포함하며,
    각각의 Y는 독립적으로 Ala-Thr(tBu) 또는 Ala-ΨThr이고;
    Z는 H, 또는 Bt, Su, Pfp, Tcp 및 Pnp로부터 선택되는 기이고;
    각각의 A는 독립적으로 H, 또는 Trt, Mtt 및 Mmt로부터 선택되는 카르복사미도 또는 이미다졸 보호기이고;
    각각의 C는 독립적으로 tBu, Trt 또는 Clt로부터 선택되는 하이드록시, 카르복시 또는 페녹시 보호기이고;
    각각의 D는 독립적으로 H, 또는 Pbf 및 Pmc로부터 선택되는 구아니딘 보호기이고;
    각각의 E는 독립적으로 H, 또는 Fmoc, Boc, Trt, Nps, Mtt, Mmt 및 Clt로부터 선택되는 아미노 보호기이고;
    각각의 B는 독립적으로 Mmt, Trt, Acm 및 StBu로부터 선택되는 Cys 보호기이고;
    수지는 H, 또는 고상 펩타이드 합성에 적합한 산 민감성 수지인 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 식 E-D-Phe-Pro-Arg(D)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(A)-Gly-Asp(C)-Phe-Glu(C)-Glu(C)-Ile-Pro-Glu(C)-Glu(C)-Tyr(수지)-Leu-O-C의 보호된 또는 부분 보호된 펩타이드로서,
    A는 H, 또는 Trt, Mtt 및 Mmt로부터 선택되는 카르복사미도 또는 이미다졸 보호기이고;
    각각의 C는 독립적으로 tBu, Trt 및 Clt로부터 선택되는 하이드록시 또는 카르복시 보호기이고;
    D는 H, 또는 Pbf 및 Pmc로부터 선택되는 구아니딘 보호기이고;
    E는 H, 또는 Fmoc, Boc, Trt, Nps, Mtt, Mmt 및 Clt로부터 선택되는 아미노 보호기이고;
    수지는 H, 또는 고상 펩타이드 합성에 적합한 산 민감성 수지인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  36. 제35항에 있어서, 상기 보호된 펩타이드는 비발리루딘(bivalirudin)인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  37. 식 E-X-Tyr(수지)-Leu-O-C의 보호된 또는 부분 보호된 단편으로서,
    X는 비발리루딘 펩타이드 서열이고;
    E는 H, 또는 Fmoc, Boc, Trt, Nps, Mtt, Mmt 및 Clt로부터 선택되는 아미노 보호기이고;
    C는 tBu, Trt 및 Clt로부터 선택되는 하이드록시 또는 카르복시 보호기이고;
    수지는 H, 또는 고상 펩타이드 합성에 적합한 산 민감성 수지인 것을 특징으로 하는 단편.
  38. 비발리루딘의 제조 방법으로서,
    제37항에 따른 식 E-X-Tyr(수지)-Leu-O-C의 비발리루딘 단편을, 용액 중에서 또는 고상에서, 식 E-D-Phe-Y-OZ의 비발리루딘 단편과 축합하여, E-D-Phe-Y-X-Tyr(수지)-Leu-O-C를 제조하는 단계;
    탈보호 또는 수지로부터의 절단 및 탈보호화하여 비발리루딘을 수득하는 단계;
    크로마토그래피로 비발리루딘을 정제하는 단계;
    동결건조하여, 순도 >99%의 비발리루딘을 수득하는 단계를 포함하며,
    X 및 Y는 독립적으로 비발리루딘 펩타이드 서열이고;
    D-는 D-아미노산으로서 후행되는 아미노산의 키랄성을 표시하며;
    C는 Clt, Trt 및 tBu로부터 선택되는 하이드록시 보호기이고;
    E는 Fmoc, Mtt, Mmt, Trt, Boc 및 Nps로부터 선택되는 아미노 보호기이고;
    수지는 H, 또는 고상 펩타이드 합성에 적합한 산 민감성 수지인 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 식 E-Ser(C)-Tyr(C)-Ser(C)-Met-Glu(C)-His(A)-Phe-Arg(D)-Trp(F)-Gly-Lys(E)-Pro-Val-Gly-Lys(E)-Lys(E)-Arg(D)-Arg(D)-Pro-Val-Lys(E)-Val-Tyr(수지)-Pro-O-C의 보호된 또는 부분 보호된 펩타이드로서,
    A는 H, 또는 Trt, Mtt 및 Mmt로부터 선택되는 카르복사미도 또는 이미다졸 보호기이고;
    각각의 C는 독립적으로 tBu, Trt 또는 Clt로부터 선택되는 하이드록시, 카르복시 또는 페녹시 보호기이고;
    각각의 D는 독립적으로 H, 또는 Pbf 및 Pmc로부터 선택되는 구아니딘 보호기이고;
    각각의 E는 독립적으로 H, 또는 Fmoc, Boc, Trt, Nps, Mtt, Mmt 및 Clt로부터 선택되는 아미노 보호기이고;
    F는 H, 또는 Boc이고;
    수지는 H, 또는 고상 펩타이드 합성에 적합한 산 민감성 수지인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  40. 제39항에 있어서, ACTH(1-24) 펩타이드인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  41. 식 E-X-Tyr(수지)-Pro-O-C의 보호된 또는 부분 보호된 단편으로서,
    X는 ACTH(1-24) 서열이고;
    E는 H, 또는 Fmoc, Boc, Trt, Nps, Mtt, Mmt 및 Clt로부터 선택되는 아미노 보호기이고;
    C는 tBu, Trt 및 Clt로부터 선택되는 하이드록시, 카르복시 또는 페녹시 보호기이고;
    수지는 H, 또는 고상 펩타이드 합성에 적합한 산 민감성 수지인 것을 특징으로 하는 단편.
  42. ACTH(1-24)의 제조 방법으로서,
    제37항에 따른 식 E-X-Tyr(수지)-Pro-O-C의 ACTH 단편을, 용액 중에서 또는 고상에서, 식 E-Y-OZ의 ACTH 단편과 축합하여, E-Y-X-Tyr(수지)-Pro-O-C를 제조하는 단계;
    탈보호 또는 수지로부터 절단 및 탈보호화하여, ACTH(1-24)를 수득하고, 이를 크로마토그래피로 정제하고 동결건조함으로써, >99% 순도의 ACTH(1-24)를 수득하는 단계를 포함하며,
    X 및 Y는 각각 독립적으로 ACTH 서열이고;
    C는 Clt, Trt 및 tBu로부터 선택되는 하이드록시 보호기이고;
    E는 Fmoc, Mtt, Mmt, Trt, Boc 및 Nps로부터 선택되는 아미노 보호기이고;
    수지는 H, 또는 고상 펩타이드 합성에 적합한 산 민감성 수지인 것을 특징으로 하는 방법.
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