JP2021095336A - ペプチドの製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、ペプチドのエピメリ化が抑制されており、且つＮ末端脱保護アミノ酸またはＮ末端脱保護ペプチド断片の単離を必要としない、液相法によるペプチドの製造方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明に係るペプチドの製造方法は、原料保護アミノ酸または保護ペプチド断片のＮ末端アミノ基を酸で脱保護した後、中間化合物を単離することなくＣ末端カルボキシ基脱保護アミノ酸またはＣ末端カルボキシ基脱保護ペプチド断片と液相法で縮合するに当たり、Ｎ末端アミノ基の脱保護に用いた酸のｍｏｌ当量未満のｍｏｌ当量の塩基を添加した後に縮合反応を行うことを特徴とする。【選択図】なし

Description

本発明は、アミノ酸またはペプチド断片を効率的にカップリングするペプチドの製造方法に関するものである。

ペプチド医薬品の有効成分であるペプチドは、複数のアミノ酸が結合した構造を有する。一般的にペプチドは、以下に示す固相合成法により製造される。具体的には、ペプチドは、固相に担持されたアミノ酸を出発原料とし、アミノ酸を一つずつ伸張していく方法によって合成される。

固相合成法によれば、アミノ酸を１００個以上含むような長鎖ペプチドも合成可能である。しかし固相上で全ての反応を行なうため、各反応の終結に大過剰量の試剤を必要とするなど、必ずしも効率的な方法とはいえない。それに対して、全ての反応を液相で行う液相合成法によれば、反応性は高く試剤量も固相法と比較して大幅に削減できる。その一方で、一定以上の長さのペプチドになると、溶解性の低下に伴い反応性が低下する問題点がある。効率性を上げるため、液相法では複数の短鎖ペプチドを予め調製し、得られた短鎖ペプチドをカップリングする下記のフラグメントカップリングという手法が考えられている。

しかしフラグメントカップリングではエピメリ化が課題となる。詳しくは、Ｎ末端脱保護ペプチド断片とＣ末端脱保護ペプチド断片とをカップリングする際、Ｃ末端脱保護ペプチド断片のＣ末端アミノ酸残基がエピメリ化する傾向がある。特許文献１には、アミノ酸またはペプチドのＣ末端カルボキシ基をアミド化する際におけるペプチド鎖のラセミ化やＣ末端アミノ酸残基のエピメリ化を抑制するための方法が記載されている。しかしかかる方法は、Ｃ末端カルボキシ基をアミド化するためにペプチドカップリング添加剤のアンモニウム塩を用いており、短鎖ペプチド同士のカップリングに適用できるものではない。
また、液相法では、短鎖ペプチドのＮ末端アミノ基を脱保護した後、脱保護工程で除去される保護基や、脱保護に使用される酸や塩基などの試剤を取り除き、続くカップリング工程の副反応を抑制するために、Ｎ末端脱保護ペプチド断片を精製することが一般的である（特許文献２）。しかし、Ｎ末端脱保護操作の後に単離工程を行うことは、製造の効率性の観点からは望ましくない。

国際公開第２００６／００８０５０号パンフレット 国際公開第２０１１／００６６４４号パンフレット

上述したように、ペプチド合成方法としては様々な方法が開発されているが、エピメリ化が伴わない真に効率的なペプチド合成法は確立されていないのが現状である。
そこで本発明は、ペプチドのエピメリ化が抑制されており、且つＮ末端脱保護アミノ酸またはＮ末端脱保護ペプチド断片の単離を必要としない、液相法によるペプチドの製造方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、保護アミノ酸または保護ペプチド断片のＮ末端アミノ基を脱保護し、単離することなくＣ末端カルボキシ基脱保護アミノ酸またはＣ末端カルボキシ基脱保護ペプチド断片と液相法で縮合する場合には、縮合反応を促進するために反応液を完全に中和するか或いは塩基性にするのが一般的であるところ、Ｎ末端アミノ基の脱保護に用いた酸のｍｏｌ当量未満のｍｏｌ当量の塩基を添加した後に縮合反応を行えば、ペプチドのエピメリ化を顕著に抑制できることを見出して、本発明を完成した。
以下、本発明を示す。

［１］ ペプチドを製造するための方法であって、
酸を用いて下記式（Ｉ）で表される化合物のＮ末端アミノ基を脱保護して下記式（ＩＩ）で表される化合物を得る工程Ａ、
Ｐｒｏ¹−（ＡＡ¹）_m−Ｐｒｏ² ・・・ （Ｉ）
Ｈ−（ＡＡ¹）_m−Ｐｒｏ² ・・・ （ＩＩ）
［式中、Ｐｒｏ¹は酸性条件で除去可能なＮ末端アミノ基の保護基を示し、（ＡＡ¹）_mは反応性側鎖官能基が保護されているアミノ酸残基またはペプチド鎖を示し、ｍは１以上の整数を示し、Ｐｒｏ²はＣ末端カルボキシ基の保護基を示す］
上記酸のｍｏｌ当量未満のｍｏｌ当量の塩基を添加する工程Ｂ、および、
下記式（ＩＩＩ）で表される化合物を添加し、上記式（ＩＩ）で表される化合物と縮合することにより、下記式（ＩＶ）で表される化合物を得る工程Ｃを含み、
Ｐｒｏ³−（ＡＡ²）_n−ＯＨ ・・・ （ＩＩＩ）
［式中、Ｐｒｏ³はＮ末端アミノ基の保護基を示し、（ＡＡ²）_nは反応性側鎖官能基が保護されているアミノ酸残基またはペプチド鎖を示し、ｎは１以上の整数を示す］
Ｐｒｏ³−（ＡＡ²）_n−（ＡＡ¹）_m−Ｐｒｏ² ・・・ （ＩＶ）
［式中、Ｐｒｏ³、（ＡＡ²）_n、ｎ、（ＡＡ¹）_m、ｍ、およびＰｒｏ²は、上記と同義を示す］
上記工程Ａ〜Ｃを同一系内で行うことを特徴とする方法。
［２］ 上記酸としてスルホン酸を用いる上記［１］に記載の方法。
［３］ 上記酸として、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、およびｐ−トルエンスルホン酸から必須的になる群より選択される１以上のスルホン酸を用いる上記［１］に記載の方法。
［４］ 上記Ｐｒｏ¹がＢｏｃ基である上記［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］ 上記塩基として、有機アミン化合物を用いる上記［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］ 上記有機アミン化合物として、トリエチルアミン、およびジイソプロピルエチルアミンから必須的になる群より選択される１以上の有機アミン化合物を用いる上記［５］に記載の方法。
［７］ 上記式（Ｉ）で表される化合物に対する上記塩基のｍｏｌ当量が、上記式（Ｉ）で表される化合物に対する上記酸のｍｏｌ当量に対して０．０５ｍｏｌ当量以上少ない上記［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］ 上記式（Ｉ）で表される化合物に対する上記塩基のｍｏｌ当量が、上記式（Ｉ）で表される化合物に対する上記酸のｍｏｌ当量に対して１．０ｍｏｌ当量以下少ない上記［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］ 上記工程Ｃで溶媒を用い、当該溶媒としてアミド系溶媒を用いる上記［１］〜［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］ 上記溶媒として、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、およびジブチルホルムアミドから必須的になる群より選択される１以上のアミド系溶媒を用いる上記［９］に記載の方法。
［１１］ 上記式（ＩＩＩ）で表される化合物と上記式（ＩＩ）で表される化合物とを縮合するために、ＤＣＣ、ＥＤＣ、およびＤＩＣから必須的になる群より選択される１以上の脱水縮合剤を用いる上記［１］〜［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］ 上記式（ＩＩＩ）で表される化合物と上記式（ＩＩ）で表される化合物とを縮合するために、ＨＯＢｔ、ＨＯＯＢｔ、ＨＯＡｔ、Ｏｘｙｍａ、ＮＨＳ、および６−Ｃｌ−ＨＯＢｔから必須的になる群より選択される１以上の活性化添加剤を用いる上記［１］〜［１１］のいずれかに記載の方法。
［１３］ 更に、少なくとも上記式（ＩＶ）で表される化合物の反応性側鎖官能基を脱保護する工程を含む上記［１］〜［１２］のいずれかに記載の方法。

本発明方法によれば、保護アミノ酸または保護ペプチド断片のＮ末端アミノ基の脱保護からＣ末端カルボキシ基脱保護アミノ酸またはＣ末端カルボキシ基脱保護ペプチド断片との縮合に至る一連の反応を、Ｎ末端アミノ基脱保護アミノ酸またはＮ末端アミノ基脱保護ペプチド断片を単離することなく、液相で且つ同一系内で行うことができる。また、かかる反応において、ペプチドのエピメリ化を顕著に抑制することが可能である。よって本発明方法は、高品質のペプチドを極めて効率的に製造できるものとして、産業上非常に有用である。

以下、本発明方法を工程ごとに詳細に述べる。なお、以下では、「式（Ｘ）で表される化合物」を「化合物（Ｘ）」と略記する。

工程Ａ： Ｎ末端アミノ基の脱保護工程
本工程では、酸を用いて化合物（Ｉ）のＮ末端アミノ基を脱保護して化合物（ＩＩ）を得る。
Ｐｒｏ¹−（ＡＡ¹）_m−Ｐｒｏ² ・・・ （Ｉ）
Ｈ−（ＡＡ¹）_m−Ｐｒｏ² ・・・ （ＩＩ）
［式中、Ｐｒｏ¹は酸性条件で除去可能なＮ末端アミノ基の保護基を示し、（ＡＡ¹）_mは反応性側鎖官能基が保護されているアミノ酸残基またはペプチド鎖を示し、ｍは１以上の整数を示し、Ｐｒｏ²はＣ末端カルボキシ基の保護基を示す］

化合物（Ｉ）におけるＰｒｏ¹は酸性条件で除去可能なＮ末端アミノ基の保護基を表す。Ｐｒｏ¹は酸性条件で除去可能なアミノ基の保護基であれば特に限定されず、例えばＴｈｅｏｄｏｒａ Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ， Ｐｅｔｅｒ Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ著 Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第４版、ＷＩＬＥＹ−ＩＮＴＥＲＳＣＩＥＮＣＥ社出版）６９６〜９２６頁に記載の酸性条件で除去可能な保護基が挙げられる。具体的には、Ｐｒｏ¹は、側鎖官能基およびＣ末端カルボキシ基の保護基が除去されない酸性条件で除去される保護基から選択する。例えば、Ｐｒｏ¹としてスルホン酸で除去される保護基を選択することができる。

Ｐｒｏ¹としては、例えば、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、アリルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、フェノキシカルボニル等のカルバメート型保護基；ホルミル、アセチル、トリクロロアセチル、トリフルオロアセチル、ベンゾイル、ｐ−ニトロベンゾイル等のアシル型保護基；メトキシメチル（ＭＯＭ）、ベンジルオキシメチル、ピバロイルオキシなどのアルコキシメチル型保護基；トリフェニルメチル、ジ（ｐ−メトキシフェニル）メチル、（ｐ−メトキシフェニル）ジフェニルメチルなどのフェニルメチル型保護基などを挙げることができ、脱保護のし易さの観点からカルバメート型保護基が好ましく、汎用性の点からＢｏｃが特に好ましい。

（ＡＡ¹）_mは反応性側鎖官能基が保護されているアミノ酸残基またはペプチド鎖を表し、以下の構造単位を有する。

［式中、Ｒはアミノ酸の側鎖を示す］

勿論、（ＡＡ¹）_m中、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅなど、反応性側鎖官能基を有さないアミノ酸残基は保護の必要は無い。ここで「反応性側鎖官能基」とは、アミノ酸側鎖に含まれる反応性の高い官能基をいい、具体的には、水酸基、チオール基、カルボキシ基、アミノ基、グアニジノ基、およびイミダゾール基が挙げられる。また、Ｍｅｔのメチルチオ基や、ＡｓｎおよびＧｌｎのアミド基は、本開示においては反応性側鎖官能基には含めないが、副反応を完全に抑制するために保護してもよい。具体的には、Ｍｅｔの側鎖のチオエーテル基（−Ｓ−）はスルホキシド化してもよく、アミド基の保護基としては、キサンチル、ビス−２，４−ジメトキシベンジル、４，４'−ジメトキシベンズヒドリルなどを挙げることができる。本開示においては、Ｍｅｔの側鎖チオエーテル基と、ＡｓｎおよびＧｌｎの側鎖アミド基を「準反応性側鎖官能基」という場合がある。

反応性側鎖官能基の保護基としては、Ｎ末端アミノ基を脱保護する酸性条件で脱保護されないものが好ましい。以下、特に制限されないが、側鎖水酸基の保護基としては、ベンジル（Ｂｚｌ）、４−メチルベンジル（４−ＭｅＢｚｌ）、４−メトキシベンジル（４−ＭｅＯＢｚｌ）などを挙げることができ、側鎖チオール基の保護基としては、ベンジル（Ｂｚｌ）、４−メチルベンジル（４−ＭｅＢｚｌ）、４−メトキシベンジル（４−ＭｅＯＢｚｌ）、ｔ−ブチル（ｔＢｕ）などを挙げることができ、側鎖カルボキシ基の保護基としては、ベンジルオキシ（ＯＢｚｌ）、シクロヘキシルオキシ（Ｏ−ｃＨｅｘ）などを挙げることができ、側鎖アミノ基の保護基としては、２，４，６−トリメチルベンゼンスルホニル（Ｍｔｓ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、ニトロ（ＮＯ₂）、ｐ−トルエンスルホニル（Ｔｏｓ）、ベンジルオキシメチル（ＢＯＭ）、２，４−ジニトロフェニル（Ｄｎｐ）、ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル（Ｃｌ−Ｚ）などを挙げることができる。
化合物（Ｉ）と化合物（ＩＩ）は、アミノ酸残基であってもよいしペプチド断片であってもよい。ペプチド断片である場合、ｍの上限は特に制限されないが、ペプチド断片が過剰に大きいと反応が進み難くなるおそれがあり得るため、ｍとしては１００以下が好ましく、５０以下がより好ましい。また、化合物（Ｉ）はｍが１である保護アミノ酸であってもよいし、ｍが２以上の保護ペプチドであってもよい。

Ｐｒｏ²はＣ末端カルボキシ基の保護基を表す。Ｃ末端カルボキシ基の保護基としては、Ｔｈｅｏｄｏｒａ Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ， Ｐｅｔｅｒ Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ著 Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第４版、ＷＩＬＥＹ−ＩＮＴＥＲＳＣＩＥＮＣＥ社出版）５３３〜６４６頁に記載の保護基中、Ｎ末端アミノ基を脱保護する酸性条件で脱保護されないものが好ましい。そのような保護基としては、例えば、メチルエステル、エチルエステル、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステルなどのエステル系保護基；アミド、ジメチルアミド、ピロリジニルアミド、ピペリジニルアミド、ｏ−ニトロアニリドなどのアミド系保護基などを挙げることができる。

本工程では、酸を用いて化合物（Ｉ）のＮ末端アミノ基を脱保護する。使用する酸としては、下記に具体例を列挙するがこれらに限定されるものではない。例えば、フッ化水素、塩化水素、臭化水素などのハロゲン化水素；硫酸、硝酸、リン酸などの鉱酸；ギ酸、酢酸、シュウ酸、トリフルオロ酢酸などのカルボン酸；メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ｐ−ニトロスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸などのスルホン酸を用いることができる。好ましくはスルホン酸であり、更に好ましくはメタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸および／またはｐ−トルエンスルホン酸である。これらは混合物として用いてもよい。特にメタンスルホン酸などのスルホン酸は、化合物（ＩＩ）を単離することなく次工程のカップリング反応に供しても、顕著な副生物を発生しないという観点から特に好ましい。

酸の使用量は特に制限されず適宜決定すればよいが、例えば、化合物（Ｉ）に対して０．１ｍｏｌ当量以上、４００ｍｏｌ当量以下とすることができる。当該量としては、０．５ｍｏｌ当量以上、２００ｍｏｌ当量以下が好ましい。

本工程では、酸の種類によっては溶媒を必要としないが、反応液の液性状態を改善したり、反応を加速したり、副反応を抑制する目的で、溶媒を用いてもよい。溶媒は適宜選択すればよく特に制限されないが、例えば、水；メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、エチレングリコール等のアルコール系溶媒；ヘキサン、ヘプタン等の脂肪族炭化水素系溶媒；ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン、クロロホルム、クロロベンゼン等のハロゲン化炭化水素系溶媒；テトラヒドロフラン、２−メチルテトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル等のエーテル系溶媒；酢酸エチル、酢酸イソプロピル、プロピオン酸メチル等のエステル系溶媒；アセトニトリル、プロピオニトリル、ベンゾニトリル等のニトリル系溶媒；アセトン、メチルエチルケトン、アセトフェノン等のケトン系溶媒；ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、ジエチルホルムアミド、ジプロピルホルムアミド、ジブチルホルムアミド等のアミド系溶媒；ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリドン、１，３−ジメチルプロピレンウレア等の非プロトン性極性溶媒が挙げられる。好ましくはハロゲン化炭化水素系溶媒、エーテル系溶媒、アミド系溶媒、非プロトン性極性溶媒であり、より好ましくはハロゲン化炭化水素系溶媒、エーテル系溶媒、アミド系溶媒であり、より更に好ましくはジクロロメタン、クロロベンゼン、テトラヒドロフラン、２−メチルテトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジブチルホルムアミドから必須的になる群より選択される１以上の溶媒である。これらの溶媒は単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。混合する場合、その混合比は特に制限はない。

溶媒の使用量は適宜決定すればよいが、例えば、１ｇの化合物（Ｉ）に対して１ｍＬ以上、２００ｍＬ以下とすることができ、好ましくは５ｍＬ以上、５０ｍＬ以下である。

各試剤の添加順序には特に制限はなく、例えば、化合物（Ｉ）と溶媒の混合物に酸を添加すればよい。反応液全体に対する化合物（Ｉ）の割合は０．２Ｗ／Ｖ％以上、５０Ｗ／Ｖ％以下が好ましく、１Ｗ／Ｖ％以上、２０Ｗ／Ｖ％以下がより好ましい。

本工程の反応温度は特に制限されないが、安全性の観点から使用する溶媒の沸点以下が望ましい。反応温度としては、例えば−４０℃以上、１６０℃以下が好ましく、−２０℃以上、１００℃以下がより好ましく、０℃以上、６０℃以下がより更に好ましい。

反応時間は特に制限されず、予備実験により決定したり、ＨＰＬＣや薄層クロマトグラフィなどで化合物（Ｉ）の消費が確認されるまでとすることもできるが、例えば、１０分以上、２４時間以下とすることができる。

工程Ｂ： 塩基添加工程
一般的に、アミノ酸やペプチド断片の縮合反応は、強い酸性条件下では進行し難いといえる。そこで本工程では、上記工程Ａにより化合物（Ｉ）のＮ末端アミノ基を脱保護した後、その反応液に塩基を添加する。

塩基は、無機塩基や有機塩基など特に制限されないが、反応液に対する溶解性の観点から有機塩基を好適に用いる。塩基としては、例えば、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化セシウム等、アルカリ金属の水酸化物；炭酸リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸セシウム等、アルカリ金属の炭酸塩；炭酸水素リチウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム等、アルカリ金属の炭酸水素塩；リチウムメトキシド、リチウムエトキシド、リチウムイソプロポキシド、リチウムｔｅｒｔ−ブトキシド、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、ナトリウムイソプロポキシド、ナトリウムｔｅｒｔ−ブトキシド、カリウムメトキシド、カリウムエトキシド、カリウムイソプロポキシド、カリウムｔ−ブトキシド等の金属アルコキシド；水素化ナトリウム、水素化カリウム、水素化カルシウム等の金属水素化物；トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ−メチルピロリジン、Ｎ−メチルモルホリン、１，８−ジアザビシクロ［５，４，０］ウンデカ−７−エン、ピリジン、キノリン、イミダゾール等の有機アミン化合物が挙げられる。これらは単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。好ましくは、有機アミン化合物であり、より好ましくはトリエチルアミンまたはジイソプロピルエチルアミンである。

一般的に、アミノ酸やペプチド断片を縮合するに当たり、反応点であるＮ末端アミノ基の塩形成を解除しなければ縮合反応は十分に進行しないと考えられており、その目的で反応系は中性または塩基性に設定される。Ｎ末端アミノ酸の脱保護反応と縮合反応を同一系内で連続して行う場合は、使用した酸に対して同ｍｏｌ当量以上の塩基を使用しなければ、反応液を中性または塩基性にすることはできない。しかし本発明者らは、鋭意検討の結果、驚くべきことに塩基の添加量が使用した酸のｍｏｌ当量未満であっても、縮合反応が十分に進行することが分かった。更に塩基の添加量が使用した酸のｍｏｌ当量未満であれば、エピメリ化などの副反応が顕著に抑制され、高効率的な縮合反応が進行する。よって、エピメリ化などの副反応抑制の観点から、塩基の使用量は、上記Ｎ末端アミノ酸の脱保護工程Ａで使用した酸のｍｏｌ当量よりも少ないことが望ましい。より好ましくは、化合物（Ｉ）に対する塩基のｍｏｌ当量は、化合物（Ｉ）に対する使用した酸のｍｏｌ当量よりも０．０１ｍｏｌ当量以上、１ｍｏｌ当量以下少ないことが好ましい。かかるｍｏｌ当量の差としては、０．０５ｍｏｌ当量以上がより好ましく、０．１ｍｏｌ当量以上がより更に好ましく、また、０．８ｍｏｌ当量以下がより好ましく、０．５ｍｏｌ当量以下がより更に好ましい。なお、本発明において「ｍｏｌ当量」とは、基準になる化合物１ｍｏｌに対する対象化合物のｍｏｌ数をいう。

塩基を添加した後の反応液のｐＨとしては、６未満が好ましく、５．５以下または５．０以下がより好ましく、４．５以下がより更に好ましい。ｐＨが低いほど次の縮合工程でのエピメリ化を抑制できるといえる。一方、上記ｐＨが過剰に低いと次工程での縮合反応が進行し難くなるおそれがあり得るため、上記ｐＨとしては２．０以上が好ましく、３．０以上または３．５以上がより好ましい。

塩基の添加形態は特に制限されず、例えば、Ｎ末端アミノ基の脱保護反応が完了した上記工程Ａの反応液へ塩基を直接添加してもよいし、塩基を溶媒に分散または溶解した上で、分散液または溶液を添加してもよい。この場合の溶媒としては、上記工程Ａの説明で例示した溶媒を用いることができ、上記工程Ａで用いた溶媒と同一の溶媒を用いてもよいし、異なる溶媒を用いてもよい。

塩基を添加する際の温度は特に制限されず適宜決定すればよいが、中和により反応熱が生じることがあるので、反応液を冷却してから塩基を添加することが好ましい。例えば、反応液を−１０℃以上、２０℃以下に冷却してから塩基を添加することが好ましい。また、塩基の添加中および添加後を通じて、反応液を攪拌することが好ましい。

工程Ｃ： 縮合工程
本工程では、上記工程Ｂで反応液に塩基を添加した後、更に化合物（ＩＩＩ）を添加し、化合物（ＩＩ）と縮合することにより、化合物（ＩＶ）を得る。
Ｐｒｏ³−（ＡＡ²）_n−ＯＨ ・・・ （ＩＩＩ）
［式中、Ｐｒｏ³はＮ末端アミノ基の保護基を示し、（ＡＡ²）_nは反応性側鎖官能基が保護されているアミノ酸残基またはペプチド鎖を示し、ｎは１以上の整数を示す］
Ｐｒｏ³−（ＡＡ²）_n−（ＡＡ¹）_m−Ｐｒｏ² ・・・ （ＩＶ）
［式中、Ｐｒｏ³、（ＡＡ²）_n、ｎ、（ＡＡ¹）_m、ｍ、およびＰｒｏ²は、上記と同義を示す］

化合物（ＩＩＩ）および化合物（ＩＶ）のＮ末端アミノ基の保護基であるＰｒｏ³は、酸性条件で除去可能なものといった制限は無く、アミノ酸またはペプチド断片のアミノ基の一般的な保護基であればよい。但し、本工程で得られる化合物（ＩＶ）を上記工程Ａの化合物（Ｉ）として用いてペプチド鎖を連続的に伸長する場合には、Ｐｒｏ³としてＰｒｏ¹と同様に酸性条件で除去可能な保護基を用いる。また、（ＡＡ²）_nは（ＡＡ¹）_mと同一のものである必要はないが、上記工程Ａでの（ＡＡ¹）_mの説明がそのまま適用されるものであり、ｎとしては１００以下が好ましく、５０以下がより好ましく、また、化合物（ＩＩＩ）はｎが１である保護アミノ酸であってもよいし、ｎが２以上の保護ペプチドであってもよい。

本工程で使用する化合物（ＩＩＩ）の量は特に制限されないが、例えば、化合物（ＩＩ）に対して０．４ｍｏｌ当量以上、５ｍｏｌ当量以下とすることができ、０．８ｍｏｌ当量以上、２ｍｏｌ当量以下が好ましく、０．９ｍｏｌ当量以上、１．５ｍｏｌ当量以下がより好ましい。

本工程で化合物（ＩＩ）と化合物（ＩＩＩ）とを縮合させる方法は特に限定されないが、例えば、カルボジイミド化合物を用いることができる。但し、カルボジイミド化合物のみを用いる縮合反応では副反応やエピメリ化が起こるおそれがあり得る。その様な場合には、カルボジイミド化合物に加えてヒドロキシアミン化合物などの活性化添加剤を併用することが好ましい。また、カルボジイミド化合物と活性化添加剤の両方の機能を有するものとして、脱水縮合剤を用いてもよい。脱水縮合剤は、活性化添加剤と併用してもよい。

カルボジイミド化合物としては、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）などが挙げられる。好ましくは、後処理の容易さや入手のし易さの観点から１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）である。

ヒドロキシアミン化合物としては例えば、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、３−ヒドロキシ−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ＨＯＯＢｔ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、２−オキシム−シアノグリオキシル酸エチル（Ｏｘｙｍａ）、１−ヒドロキシ−６−クロロ−ベンゾトリアゾール（６−Ｃｌ−ＨＯＢｔ）、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、Ｎ−ヒドロキシピペリジンなどが挙げられる。好ましくは１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、および３−ヒドロキシ−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ＨＯＯＢｔ）であり、更に好ましくは３−ヒドロキシ−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ＨＯＯＢｔ）である。

脱水縮合剤としては、例えば、１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス−ジメチルアミノホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス−ピロリジノホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム テトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、Ｏ−［（エトキシカルボニル）シアノメチルエナミノ］−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＨＯＴＵ）、（１−シアノ−２−エトキシ−２−オキソエチリデンアミノオキシ）ジメチルアミノ−モルホリノ−カルベニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＣＯＭＵ）、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルフォリニウム クロリド（ＤＭＴ−ＭＭ）などが挙げられる。好ましくはＯ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム テトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、又は（１−シアノ−２−エトキシ−２−オキソエチリデンアミノオキシ）ジメチルアミノ−モルホリノ−カルベニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＣＯＭＵ）であり、更に好ましくはＯ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）である。

カルボジイミド化合物、活性化添加剤、および脱水縮合剤のそれぞれの使用量は適宜調整すればよく特に制限されないが、例えば、化合物（ＩＩＩ）に対して０．１ｍｏｌ当量以上、１０ｍｏｌ当量以下とすることができ、０．５ｍｏｌ当量以上、５ｍｏｌ当量以下が好ましい。

本工程では溶媒を用いてもよく、溶媒としては上記工程Ａの説明で例示したものと同様のものを用いることができる。但し、本工程においては、溶媒中にアミド系溶媒が含まれていることが好ましく、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、およびジブチルホルムアミドから必須的になる群より選択される１以上のアミド系溶媒が含まれていることが好ましい。アミド系溶媒を用いることによって、上記工程Ｂで用いた酸に対する塩基の割合を等ｍｏｌ当量未満にしても、縮合反応がより一層良好に進行すると考えられる。なお、本工程でアミド系溶媒が含まれる溶媒を用いるには、上記工程Ａと工程Ｂで溶媒の少なくとも一部としてアミド系溶媒を用いた場合には継続して本工程を実施すればよいし、上記工程Ａと工程Ｂでアミド系溶媒を用いなかった場合には、本工程でアミド系溶媒を添加すればよい。本工程の溶媒の一部としてアミド系溶媒を用いる場合には、本工程における溶媒全体に占めるアミド系溶媒の割合を２ｖ／ｖ％以上にすることが好ましく、３０ｖ／ｖ％以上がより好ましく、７０ｖ／ｖ％以上がより更に好ましい。

本工程の反応温度や反応時間は特に制限されず、適宜調整すればよいが、例えば反応温度は使用する反応溶媒の沸点以下とすることができ、副反応抑制の観点から、好ましくは５０℃以下であり、常温で反応を行うことも可能である。反応温度の下限は特に制限されないが、反応を良好に進行させる観点から−１０℃以上が好ましい。反応時間は特に制限されず、予備実験により決定したり、ＨＰＬＣや薄層クロマトグラフィなどで化合物（ＩＩ）または化合物（ＩＩＩ）の消費が確認されるまでとすることもできるが、例えば、１分以上、２４時間以下とすることができる。

なお、上記工程Ａ〜Ｃは同一系内、即ちワンポットで実施する。具体的には、上記工程Ａで化合物（Ｉ）のＮ末端アミノ基を脱保護した後、上記工程Ｂで塩基を反応液に添加し、更に少なくとも化合物（ＩＩＩ）を同反応液に添加する。本発明では、Ｎ末端アミノ基を脱保護した化合物（Ｉ）に相当する化合物（ＩＩ）を単離しなくても、化合物（ＩＩＩ）との縮合反応を良好に進行せしめることができる。

本工程での反応終了後は、一般的な後処理を行ってもよい。例えば、水、飽和食塩水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液などで反応液を洗浄後、有機相を無水硫酸ナトリウムや無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮してもよい。更にカラムクロマトグラフィや晶析操作などによって化合物（ＩＩＩ）を精製してもよい。

本工程で得られた化合物（ＩＶ）は、上記工程Ａの化合物（Ｉ）として用いて上記工程Ａ〜Ｃを繰り返し、ペプチド鎖を連続的に伸長してもよい。その場合には、化合物（ＩＩＩ）および化合物（ＩＶ）のＮ末端アミノ基保護基Ｐｒｏ³として、化合物（Ｉ）におけるＰｒｏ¹と同様に酸性条件で除去可能な保護基を用いる。

工程Ｄ： 脱保護工程
本工程では、少なくとも化合物（ＩＶ）の反応性側鎖官能基を脱保護することにより、目的のペプチドを得る。勿論、化合物（ＩＶ）のＡＡ²およびＡＡ¹が反応性側鎖官能基を有さない場合や、準反応性官能基を有するが保護されていない場合には、本工程を行う必要は無い。また、必要に応じて、Ｎ末端アミノ基およびＣ末端カルボキシ基の少なくとも一方を脱保護してもよい。各保護基の脱保護条件としては、公知条件を採用すればよい。
本工程での反応終了後は、一般的な後処理を行ってもよい。例えば、反応液を濃縮後、カラムクロマトグラフィなどで目的のペプチドを精製してもよい。

以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。

比較例１： Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（Ｚ）₂−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ｔｒｐ（ＣＨＯ）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−（４−ＮＯ₂Ｃ₆Ｈ₄ＣＨ₂Ｏ）の合成
Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ｔｒｐ（ＣＨＯ）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−（４−ＮＯ₂Ｃ₆Ｈ₄ＣＨ₂Ｏ）（０．７５ｇ，０．４９ｍｍｏｌ）にジクロロメタン（９．８ｇ）を添加し、更にメタンスルホン酸（０．２４ｇ，２．５ｍｍｏｌ）を添加した。室温で１時間撹拌後、０℃まで冷却し、メタンスルホン酸と等モル量のトリエチルアミン（０．２６ｇ，２．５ｍｍｏｌ）とＤＭＡ（４．９ｇ）を添加した。続けて、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（Ｚ）₂−Ｌｅｕ−ＯＨ（０．４６ｇ，０．４４ｍｍｏｌ）とＨＯＯＢｔ（０．１６ｇ，０．９８ｍｍｏｌ）を添加した。その後、ＥＤＣ塩酸塩（０．１２ｇ，０．６４ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（４．９ｇ）とＤＭＡ（２．５ｇ）に溶解させた溶液を１３時間かけて添加した。反応液をＨＰＬＣにより分析し、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ｔｒｐ（ＣＨＯ）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−（４−ＮＯ₂Ｃ₆Ｈ₄ＣＨ₂Ｏ）を基準とする変換率と目的物に対するエピマー生成割合を求めたところ、変換率は８４％であったが、エピマー生成割合が４４％にも及んだ。

実施例１： Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（Ｚ）₂−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ｔｒｐ（ＣＨＯ）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−（４−ＮＯ₂Ｃ₆Ｈ₄ＣＨ₂Ｏ）の合成
Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ｔｒｐ（ＣＨＯ）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−（４−ＮＯ₂Ｃ₆Ｈ₄ＣＨ₂Ｏ）（０．１８ｇ，０．１２ｍｍｏｌ）にジクロロメタン（２ｍＬ）を添加し、更にメタンスルホン酸（６８ｍｇ，０．７１ｍｍｏｌ）とジクロロメタン（１ｍＬ）を添加した。２０℃で１時間撹拌後、０℃まで冷却し、トリエチルアミン（６６ｍｇ，０．６５ｍｍｏｌ）とＤＭＡ（３ｍＬ）を添加した。続けて、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（Ｚ）₂−Ｌｅｕ−ＯＨ（０．１２ｇ，０．１２ｍｍｏｌ）、ＨＯＯＢｔ（２９ｍｇ，０．１８ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡ（６ｍＬ）を添加した。その後、ＥＤＣ塩酸塩（３５ｍｇ，０．１８ｍｍｏｌ）を添加し、２０℃で４時間撹拌した。反応液を上記比較例１と同様に分析したところ、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ｔｒｐ（ＣＨＯ）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−（４−ＮＯ₂Ｃ₆Ｈ₄ＣＨ₂Ｏ）を基準とする変換率は７３％に達し、且つ目的物に対するエピマー生成割合は１．７％に抑制されていた。なお、反応液のｐＨは４未満であった。

比較例２： Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（ＢＯＭ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−ＮＨ₂の合成
Ｂｏｃ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−ＮＨ₂（６６ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ）にジクロロメタン（４ｍＬ）とメタンスルホン酸（５８ｍｇ，０．６０ｍｍｏｌ）を添加して２５℃で１時間撹拌した。その後、トリエチルアミン（７１ｍｇ，０．７０ｍｍｏｌ）とＤＭＡ（３ｍＬ）を添加した。続けてＢｏｃ−Ｈｉｓ（ＢＯＭ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−Ｌｅｕ−ＯＨ（１７３ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ・Ｈ₂Ｏ（２３ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ塩酸塩（２９ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡ（１ｍＬ）を添加し、２５℃で２２時間撹拌した。反応液を上記比較例１と同様に分析したところ、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ｔｒｐ（ＣＨＯ）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−（４−ＮＯ₂Ｃ₆Ｈ₄ＣＨ₂Ｏ）を基準とする変換率は１００％であったが、目的物に対するエピマーの割合は１１％となった。

実施例２： Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（ＢＯＭ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−ＮＨ₂の合成
Ｂｏｃ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−ＮＨ₂（６６ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ）にジクロロメタン（４ｍＬ）とメタンスルホン酸（５８ｍｇ，０．６０ｍｍｏｌ）を添加し、２５℃で１時間撹拌した。その後トリエチルアミン（５６ｍｇ，０．５５ｍｍｏｌ）とＤＭＡ（３ｍＬ）を添加した。続けてＢｏｃ−Ｈｉｓ（ＢＯＭ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−Ｌｅｕ−ＯＨ（１７３ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ・Ｈ₂Ｏ（２３ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ塩酸塩（２９ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡ（１ｍＬ）を添加し、２５℃で２２時間撹拌した。反応液を上記比較例１と同様に分析したところ、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ｔｒｐ（ＣＨＯ）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−（４−ＮＯ₂Ｃ₆Ｈ₄ＣＨ₂Ｏ）を基準とする変換率は１００％に達し、且つ目的物に対するエピマーの割合は３％に抑制されていた。

Claims (13)

1. ペプチドを製造するための方法であって、
   酸を用いて下記式（Ｉ）で表される化合物のＮ末端アミノ基を脱保護して下記式（ＩＩ）で表される化合物を得る工程Ａ、
   Ｐｒｏ¹−（ＡＡ¹）_m−Ｐｒｏ² ・・・ （Ｉ）
   Ｈ−（ＡＡ¹）_m−Ｐｒｏ² ・・・ （ＩＩ）
   ［式中、Ｐｒｏ¹は酸性条件で除去可能なＮ末端アミノ基の保護基を示し、（ＡＡ¹）_mは反応性側鎖官能基が保護されているアミノ酸残基またはペプチド鎖を示し、ｍは１以上の整数を示し、Ｐｒｏ²はＣ末端カルボキシ基の保護基を示す］
   上記酸のｍｏｌ当量未満のｍｏｌ当量の塩基を添加する工程Ｂ、および、
   下記式（ＩＩＩ）で表される化合物を添加し、上記式（ＩＩ）で表される化合物と縮合することにより、下記式（ＩＶ）で表される化合物を得る工程Ｃを含み、
   Ｐｒｏ³−（ＡＡ²）_n−ＯＨ ・・・ （ＩＩＩ）
   ［式中、Ｐｒｏ³はＮ末端アミノ基の保護基を示し、（ＡＡ²）_nは反応性側鎖官能基が保護されているアミノ酸残基またはペプチド鎖を示し、ｎは１以上の整数を示す］
   Ｐｒｏ³−（ＡＡ²）_n−（ＡＡ¹）_m−Ｐｒｏ² ・・・ （ＩＶ）
   ［式中、Ｐｒｏ³、（ＡＡ²）_n、ｎ、（ＡＡ¹）_m、ｍ、およびＰｒｏ²は、上記と同義を示す］
   上記工程Ａ〜Ｃを同一系内で行うことを特徴とする方法。
2. 上記酸としてスルホン酸を用いる請求項１に記載の方法。
3. 上記酸として、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、およびｐ−トルエンスルホン酸から必須的になる群より選択される１以上のスルホン酸を用いる請求項１に記載の方法。
4. 上記Ｐｒｏ¹がＢｏｃ基である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
5. 上記塩基として、有機アミン化合物を用いる請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
6. 上記有機アミン化合物として、トリエチルアミン、およびジイソプロピルエチルアミンから必須的になる群より選択される１以上の有機アミン化合物を用いる請求項５に記載の方法。
7. 上記式（Ｉ）で表される化合物に対する上記塩基のｍｏｌ当量が、上記式（Ｉ）で表される化合物に対する上記酸のｍｏｌ当量に対して０．０５ｍｏｌ当量以上少ない請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
8. 上記式（Ｉ）で表される化合物に対する上記塩基のｍｏｌ当量が、上記式（Ｉ）で表される化合物に対する上記酸のｍｏｌ当量に対して１．０ｍｏｌ当量以下少ない請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
9. 上記工程Ｃで溶媒を用い、当該溶媒としてアミド系溶媒を用いる請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
10. 上記溶媒として、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、およびジブチルホルムアミドから必須的になる群より選択される１以上のアミド系溶媒を用いる請求項９に記載の方法。
11. 上記式（ＩＩＩ）で表される化合物と上記式（ＩＩ）で表される化合物とを縮合するために、ＤＣＣ、ＥＤＣ、およびＤＩＣから必須的になる群より選択される１以上の脱水縮合剤を用いる請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
12. 上記式（ＩＩＩ）で表される化合物と上記式（ＩＩ）で表される化合物とを縮合するために、ＨＯＢｔ、ＨＯＯＢｔ、ＨＯＡｔ、Ｏｘｙｍａ、ＮＨＳ、および６−Ｃｌ−ＨＯＢｔから必須的になる群より選択される１以上の活性化添加剤を用いる請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
13. 更に、少なくとも上記式（ＩＶ）で表される化合物の反応性側鎖官能基を脱保護する工程を含む請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。