JP3759821B2 - ペプチドの製造法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、視床下部から分泌される性線刺激ホルモン放出ホルモン（ＬＨ−ＲＨ）のアゴニストとしての作用等を有するペプチドまたはその塩の製造法、該ペプチドを製造するための中間体ペプチド、その製造法、その結晶および該結晶の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＬＨ−ＲＨのアゴニストであるペプチドまたはその塩の製造法としては、特開昭５０−５９３７０号公報（米国特許第４,００８,２０９号公報に対応）には、一般式：
(Ｐｙｒ)Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ(またはＰｈｅ)−Ｘ−Ｌｅｕ(またはＩｌｅまたはＮｌｅ)−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＮＨ−Ｒ
〔式中、アミノ酸は特に明記しないものはＬ体を示し、ＸはＤ−Ｌｅｕ，Ｄ−ＮＬｅ，Ｄ−ＮＶａ，Ｄ−Ｓｅｒ，Ｄ−Ａｂｕ，Ｄ−Ｐｈｇ，Ｄ−Ｐｈｅまたはα−Ａｉｂｕを、Ｒは水酸基を有してもよいアルキル基を示す〕で表されるペプチドの製造法として、下記の方法が記載されている。
【０００３】
【化１】
〔式中の記号は前記と同意義を示す〕。
【０００４】
また、特開昭５１−６９２６号公報（米国特許第３,９９７,５１６号公報に対応）には、グアニジノ基を有するペプチドの製造において、グアニジノ基含有原料化合物のグアニジノ基を低級アルコキシベンゼンスルホニル基またはトリ低級アルキルベンゼンスルホニル基で保護することを特徴とするペプチドの製造法が記載されている。
さらに、特開昭５１−１０００３０号（米国特許第３,９９７,５１６号公報に対応）公報には、グアニジノ基を有するペプチドの製造において、グアニジノ基含有原料化合物のグアニジノ基を低級アルコキシ−またはトリ低級アルキルベンゼンスルフォニル基で保護してペプチド縮合した後、該保護基をハロゲノスルホン酸または低級アルキルスルホン酸またはルイス酸で脱離させることを特徴とするペプチドの分離・製造法が記載されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
ペプチドの工業的規模での大量生産においては、(1)原薬の品質、(2)製造コスト、(3)操作性、(4)作業者の安全、(5)環境の汚染防止などの様々な要件を実用上満足できるものとすることが不可欠であるため、実験室レベルのような小規模スケールでの合成方法が必ずしも工業的製法として実用性がある方法とは限らないことが多い。従って、ペプチドの工業的製法の構築には、このような様々の要件を満たすべく、ペプチド鎖の延長方法、フラグメント縮合点の選択、フラグメント縮合時の異性化の抑制方法、α−位及び側鎖官能基の保護基の選択と該保護基の最終的な脱離方法、得られる目的ペプチドの分離・精製方法、各工程間の一連の操作性等、非常に多くの検討課題がある。
また、一般にペプチドの合成過程においては、多種多様なプロセス、種々の反応手段等が考えられるが、多くの場合は、各製造工程の中間体が無晶形であるために、精製が十分に行えなかったり、煩雑な分離・精製操作が必要な場合が多く、品質および収率の点において再現性が得られない等の問題が生じている。即ち、各製造工程の中間体、とりわけ、各工程において鍵となる中間体について、結晶性、安定性、溶解性などの物性の良し悪しが工業的製造法として実用に足るか否かを左右する場合が多い。
【０００６】
上記ペプチド(Ｐｙｒ)Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ(またはＰｈｅ)−Ｘ−Ｌｅｕ(またはＩｌｅまたはＮｌｅ)−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＮＨ−Ｒの製造法において、特開昭５０−５９３７０号公報（米国特許第４,００８,２０９号公報に対応）に記載された方法は、Ａｒｇのグアニジノ基をニトロ基で保護している関係上、α−アミノ基の保護に用いているＺ基を還元的に脱離することが困難となり、その結果、Ｄ基の脱離をＨＢr／ＡcＯＨで行っている。この方法では必然的に強催涙性のベンジルブロマイドが大量に副生する他、目的のペプチドを分離するために大量のエーテル類を使用しなければならない。また、本反応における目的化合物は、通常、臭化水素酸塩として捕捉されるが、フラグメント縮合において、異性化を抑制するためには臭化水素をイオン交換樹脂等で除くことが必要となる。また、該ペプチドの種々のクロマトグラフィーによる精製においては、グラジエント溶出を行っているが、濃度勾配の再現性に乏しいため、有効画分の特定が溶出画分ごとに必要となり、一定した品質の目的化合物を安定して得るための作業の標準化ができない等の問題があり、工業的製法として実用的ではない。
【０００７】
さらに、米国特許第２,９９７,５１６号公報には式
(Ｐｙｒ)Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ(ＭＢＳ)−Ｐｒｏ−ＮＨ−Ｃ2Ｈ5
〔式中、ＭＢＳは、ｐ−メトキシベンゼンスルホニル基を示す〕で表わされるペプチドが製造されるとして、反応が図式されているが、ここには、単にペプチドの構造式が羅列してあるだけであり、実際にどのような反応条件で行なえるかについては、示されていない。
従って、ＬＨ−ＲＨのアゴニストとしての作用等を有するペプチドまたはその塩を、安全かつ簡便な操作で、高収率かつ再現性の良い、工業的に有利な製造法の開発が望まれている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前述の種々の問題を解決すべく、鋭意検討した結果、加水分解時のアミノ酸残基の異性化の抑制などによる鍵となる後述のペプチド(IV)の製造法の確立と結晶化、後述のペプチド(Ｉ')の大量処理可能な脱保護基操作方法の確立、後述のペプチド(Ｉ)の工業的規模の分離・精製法の確立により、安全で高収率かつ再現性良く、ペプチド(Ｉ)を製造できることを見いだし、この知見に基づきさらに鋭意研究の結果、本発明を完成した。
【０００９】
即ち、本発明は、
（１）一般式
５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｒ１−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｒ２−Ｒ３−ＯＨ （ＩＩ）
〔式中、Ｒ１はＨｉｓ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐまたはｐ−ＮＨ２−Ｐｈｅを、Ｒ２はＴｙｒまたはＰｈｅを、Ｒ３はそれぞれ置換基を有していてもよいＧｌｙまたはα−Ｄ−アミノ酸残基をそれぞれ示す。〕で表わされるペプチドまたはその塩と、一般式
Ｈ−Ｒ４−Ｒ５−Ｐｒｏ−Ｒ６ （ＩＩＩ）
〔式中、Ｒ４はＬｅｕ，ＩｌｅまたはＮｌｅを、Ｒ５は保護されたＡｒｇを、Ｒ６は式Ｇｌｙ−ＮＨ−Ｒ７（式中、Ｒ７は水素原子または水酸基を有していてもよいアルキル基を示す）または式ＮＨ−Ｒ８（式中、Ｒ８は水素原子、水酸基を有していてもよいアルキル基またはウレイド基（−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ２）をそれぞれ示す）で表わされる基を示す〕で表わされるペプチドまたはその塩とを反応させ、一般式
５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｒ１−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｐｒｏ−Ｒ６
（Ｉ’）
〔式中の記号は前記と同意義を示す〕で表わされるペプチドまたはその塩を得、ついで、得られたペプチド（Ｉ’）をペプチド（Ｉ’）に対して５〜２５重量倍のＣ １−６ アルキルスルホン酸を用いる脱保護基反応に付し、得られた反応液を−１５℃〜１５℃で塩基で中和することを特徴とする一般式
５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｒ１−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｒ６
（Ｉ）
〔式中の記号は前記と同意義を示す〕で表わされるペプチドまたはその塩の製造法、
【００１０】
（２）Ｒ１がＨｉｓを、Ｒ２がＴｙｒを、Ｒ３がＧｌｙ，Ｄ−Ｌｅｕ，Ｄ−Ｔｒｐ，Ｃ１−４アルキル基で置換されていてもよいＤ−Ｖａｌ，Ｄ−Ｓｅｒ，Ｃ１−４アルコキシ基、ナフチル基もしくは２−メチルインドリルで置換されていてもよいＤ−ＡｌａまたはＣ７−１０アラルキル基で置換されていてもよいＤ−Ｈｉｓを、Ｒ４がＬｅｕを、Ｒ５がＣ１−６アルコキシベンゼンスルホニル基、トリＣ１−６アルキルベンゼンスルホニル基およびニトロ基から選ばれる基で保護されたＡｒｇを、Ｒ６は式ＮＨ−Ｒ８’（式中、Ｒ８’は水素原子または水酸基を有していてもよいＣ１−３アルキル基をそれぞれ示す）で表わされる基をそれぞれ示す上記（１）項記載の製造法、
（３）Ｒ１がＨｉｓを、Ｒ２がＴｙｒを、Ｒ３がＤ−Ｌｅｕを、Ｒ４がＬｅｕを、Ｒ５がＣ１−６アルコキシベンゼンスルホニル基で保護されたＡｒｇを、Ｒ６は式ＮＨ−Ｒ８’’（式中、Ｒ８’’は水酸基を有していてもよいＣ１−３アルキル基を示す）で表わされる基をそれぞれ示す上記（１）項記載の製造法、
（４）ペプチド（ＩＩ）またはその塩とペプチド（ＩＩＩ）またはその塩とを、温度 ０〜４０℃で、 ３０〜６０時間反応させる上記（１）項記載の製造法、
（５）さらに分離した遊離体の油状物を含む反応液をカラムクロマトグラフィーで精製することを特徴とする上記（１）記載の製造法、
【００１１】
（６）一般式
５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｒ １ ’−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｒ ２ ’−Ｒ ３ ’−ＯＲ ９ ’ （ＩＶ’）
〔式中、Ｒ １ ’はＨｉｓ を、Ｒ ２ ’はＴｙｒ を、Ｒ ３ ’はＤ−Ｌｅｕを、Ｒ ９ ’はＣ １−６ アルキル基をそれぞれ示す。〕で表わされるペプチドまたはその塩、
（７）一般式
５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｒ１−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｒ２−Ｒ３−ＯＲ９ （ＩＶ）
〔式中、Ｒ１はＨｉｓ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐまたはｐ−ＮＨ２−Ｐｈｅを、Ｒ２はＴｙｒまたはＰｈｅを、Ｒ３はそれぞれ置換基を有していてもよいＧｌｙまたはα−Ｄ−アミノ酸残基を、Ｒ９は保護基をそれぞれ示す。〕で表わされるペプチドまたはその塩を加水分解反応に付すことを特徴とする一般式
５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｒ１−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｒ２−Ｒ３−ＯＨ （ＩＩ）
〔式中の記号は前記と同意義〕で表わされるペプチドまたはその塩の製造法、
【００１２】
（８）一般式
５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｒ１−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｒ２−Ｒ３−ＯＨ （ＩＩ）
〔式中、Ｒ１はＨｉｓ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐまたはｐ−ＮＨ２−Ｐｈｅを、Ｒ２はＴｙｒまたはＰｈｅを、Ｒ３はそれぞれ置換基を有していてもよいＧｌｙまたはα−Ｄ−アミノ酸残基をそれぞれ示す。〕で表わされるペプチドまたはその塩の結晶、
（９）一般式
５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｒ１−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｒ２−Ｒ３−ＯＨ （ＩＩ）
〔式中、Ｒ１はＨｉｓ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐまたはｐ−ＮＨ２−Ｐｈｅを、Ｒ２はＴｙｒまたはＰｈｅを、Ｒ３はそれぞれ置換基を有していてもよいＧｌｙまたはα−Ｄ−アミノ酸残基をそれぞれ示す。〕で表わされるペプチドまたはその塩の溶液を熟成させることを特徴とするペプチド（ＩＩ）またはその塩の結晶の製造法、および、
（１０）ペプチド（ＩＩ）またはその塩の濃度が ０．０１〜０．０５モル／Ｌである溶液を １０〜７０℃で １０〜７０時間熟成させる上記（９）項記載の結晶の製造法である。
【００１３】
【発明の実施の形態】
上記の式中および図の式中で用いられる記号、略号等について、以下に示す。
Ｒ1はＨｉｓ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐまたはｐ−ＮＨ2−Ｐｈｅを表わすが、なかでもＨｉｓが最も好ましい。
Ｒ2はＴｙｒまたはＰｈｅを示すが、なかでも、Ｔｙｒが好ましい。
Ｒ3で表わされる置換基を有していてもよいＧｌｙまたはα−Ｄ−アミノ酸残基におけるα−Ｄ−アミノ酸としては、例えば、Ｄ−Ｌｅｕ，Ｄ−Ｉｌｅ，Ｄ−Ｎｌｅ，Ｄ−Ｖａｌ，Ｄ−Ｎｖａ，Ｄ−Ｓｅｒ，Ｄ−Ａｂｕ，Ｄ−Ｐｈｅ，Ｄ−Ｐｈｇ，Ｄ−Ｔｈｒ，Ｄ−Ｍｅｔ，Ｄ−Ａｌａ，Ｄ−Ｔｒｐまたはα−Ａｉｂｕが挙げられ、なかでも、Ｄ−Ｌｅｕ，Ｄ−Ｖａｌ，Ｄ−Ｓｅｒ，Ｄ−Ｔｒｐ、Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｂｕまたはα−Ａｉｂｕが好ましく、特に、Ｄ−Ｌｅｕが最も好ましい。
Ｒ3で表わされる置換基を有していてもよいＧｌｙまたはα−Ｄ−アミノ酸残基における置換基としては、例えば、モノＣ1-4アルキル（例、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル等）、ジＣ1-4アルキル（例、ジメチル、ジエチル等）、トリＣ1-4アルキル（例、トリメチル、トリエチル等）、Ｃ1-4アルコキシ（例、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｔ−ブトキシ等）、Ｃ6-10アリール（例、フェニル、ナフチル等）、Ｃ7-10アラルキル基（例、ベンジル、フェネチル等）、インドリル、メチルインドリル、ベンジル−イミダゾリルなどが挙げられる。特に、メチル，ジメチル，トリメチル，ｔ−ブチル，ｔ−ブトキシ，ナフチル（特に、２−ナフチル等），インドリル−３−イル，２−メチルインドリルおよびベンジルイミダゾール−２−イルが好ましく、なかでも、トリメチル，ｔ−ブチル，ｔ−ブトキシ，２−ナフチル，インドール−３−イル，２−メチルインドリルおよびベンジルイミダゾール−２−イルが好ましい。
【００１４】
Ｒ3の好ましいものとしては、例えば、Ｇｌｙ，Ｄ−Ｌｅｕ，Ｄ−Ｔｒｐ，Ｃ1-4アルキル基で置換されていてもよいＤ−Ｖａｌ，Ｄ−Ｓｅｒ，Ｃ1-4アルコキシ基、ナフチル基もしくは２−メチルインドリルで置換されていてもよいＤ−ＡｌａまたはＣ7-10アラルキル基で置換されていてもよいＤ−Ｈｉｓが挙げられる。
Ｒ3としては、さらに、Ｇｌｙ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｄ−Ｔｒｐ、３−メチル−Ｄ−Ｖａｌ、Ｄ−Ｓｅｒ、ｔ−ブトキシ−Ｄ−Ａｌａ、２−ナフチル−Ｄ−Ａｌａ、２−メチルインドリル−Ｄ−Ａｌａ、ベンジルイミダゾール−２−イル−Ｄ−Ａｌａ（＝Ｎim−ベンジル−Ｄ−Ｈｉｓ）が好ましい。
【００１５】
Ｒ4はＬｅｕ、ＩｌｅまたはＮｌｅを表わすが、なかでも、Ｌｅｕが好ましい。
Ｒ5で表わされる保護されたＡｒｇにおける保護基としては、例えば、アルコキシベンゼンスルホニル基、トリアルキルベンゼンスルホニル基等が挙げられる。
該アルコキシベンゼンスルホニル基としては、Ｃ1-6アルコキシで置換されたベンゼンスルホニル基が好ましく、例えば、ｐ−メトキシベンゼンスルホニル基、ｐ−エトキシベンゼンスルホニル基、ｐ−イソプロポキシベンゼンスルホニル基などが挙げられるが、特に好ましくはｐ−メトキシベンゼンスルホニル基である。
該トリアルキルベンゼンスルホニル基におけるアルキルとしては、同一または異なるＣ1-6アルキルが好ましい。該Ｃ1-6アルキルとしては、例えば、メチル、エチル、プロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｔ−ペンチルなどが挙げられる。トリアルキルはベンゼンスルホニル基におけるベンゼン環の置換可能な任意の位置に位置していてよいが、スルホニル基に対して２位、４位および６位に位置していることが特に好ましい。具体的には例えば、２,４,６−トリメチルベンゼンスルホニル基、２,４,６−トリエチルベンゼンスルホニル基、２,４,６−トリプロピルベンゼンスルホニル基、２,４,６−トリイソプロピルベンゼンスルホニル基、２,４,６−トリ−ｔ−ブチルベンゼンスルホニル基などが挙げられる。
【００１６】
Ｒ5で表わされる保護されたＡｒｇにおける保護基の好ましいものとしては、Ｃ1-6アルコキシ−ベンゼンスルホニル基が挙げられ、好ましく、なかでも、ｐ−メトキシベンゼンスルホニル基、ｐ−エトキシベンゼンスルホニル基、ｐ−プロポキシベンゼンスルホニル基、ｐ−イソプロポキシベンゼンスルホニル基等が好ましく、なかでも、ｐ−メトキシベンゼンスルホニル基が最も好ましい。
基Ｒ6中の基Ｒ7およびＲ8で表わされる水酸基を有していてもよいアルキル基におけるアルキル基としては、Ｃ1-4アルキル基が挙げられ、これらは置換可能な任意の位置に水酸基を有していてもよい。該Ｃ1-4アルキル基としては、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチルが挙げられ、最も好ましくはエチルである。
該水酸基を有していてもよいアルキル基の好ましいものとしては、例えば、ヒドロキシメチル、２−ヒドロキシエチル、３−ヒドロキシ−ｎ−プロピル、４−ヒドロキシ−ｎ−ブチル等が挙げられ、なかでも２−ヒドロキシエチルが最も好ましい。
Ｒ9で表わされる保護基としては、例えば、Ｃ1-6アルキル基（例、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル等）、Ｃ7-10アラルキル基（例、ベンジル、フェネチル）等が挙げられる。
Ｒ9で表わされる保護基としては、Ｃ1-3アルキルが好ましく、特に、エチルが好ましい。
【００１７】
本明細書において、アミノ酸およびペプチドは、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Commission on Biological Nomenclature による略記法および当該分野における慣用名により表示し、アミノ酸に関して光学異性体があり得る場合は、特に明記しなければＬ体を示すものとする。また、本明細書中、下記略語を用いる場合もある。Ｇｌｙ：グリシン
Ａｌａ：アラニン
Ｖａｌ：バリン
Ｌｅｕ：ロイシン
Ｉｌｅ：イソロイシン
Ｓｅｒ：セリン
Ｔｈｒ：スレオニン
Ａｒｇ：アルギニン
Ｐｈｅ：フェニールアラニン
Ｔｙｒ：チロシン
Ｈｉｓ：ヒスチジン
Ｔｒｐ：トリプトファン
Ｐｒｏ：プロリン
ＮＬｅ：ノルロイシン
ＮＶａ：ノルバリン
Ａｂｕ：２−アミノ酪酸
Ｐｈｇ：フェニルグリシン
α−Ａｉｂｕ：α−アミノイソ酪酸
ｐ−ＮＨ2−Ｐｈｅ：ｐ−アミノフェニルアラニン
【００１８】
Ｚ：ベンジルオキシカルボニル
Ｐｄ：パラジウム
Ｐｄ−Ｃ：パラジウム−炭素
Ｅt：エチル
ＡcＯＨ：酢酸
ＨＦ：フッ化水素
ＨＢr：臭化水素
ＤＣＨＡ：ジシクロヘキシルアミン
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＤＭＡ：ジメチルアセトアミド
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＭＳＡ：メタンスルフォン酸
ＭＢＳ：ｐ−メトキシベンゼンスルホニル
ＤＣＣ：Ｎ,Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＨＯＮＢ：Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２,３−ジカルボキシイミ
ド
ＨＯＳu：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
ＨＯＢt：１−ヒドロキシベンツトリアゾール
ＥＤＡ：エチル−３−（３−ジメチルアミノ）プロピルカルボジイミド
塩酸塩
ＮＰ：ｐ−ニトロフェニル
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
【００１９】
以下に、本願のペプチド(Ｉ)またはその塩の製造法について説明する。
ペプチド(Ｉ)またはその塩の製造には多くの合成経路が考えられ、また、個々の合成経路においては、アミノ基及びカルボキシル基の保護基、アミド結合の形成方法、該保護基の脱離方法、得られるペプチドの分離・精製方法などに関して、極めて多くの組み合わせが可能である。
その中で、〔図１〕に示す合成経路は、本願発明方法に係る製造法であり、ペプチド(Ｉ)を製造する好ましい方法である。本発明の製造法において特徴とするところは、(1)８位のＡｒｇのグアニジノ基を保護基で保護し、(2)鍵中間体として２つのペプチド（〔図１〕中のペプチド(II)およびペプチド(III)）を合成し、(3)それらの縮合で得られる前駆体ペプチド(Ｉ')を脱保護基反応に付すことにより８位Ａｒｇのグアニジノ基の保護基を脱離し、目的とするペプチド(Ｉ)またはその塩を得ることにある。
本発明のペプチドの塩としては、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、乳酸、グリコール酸、焦性ブドウ酸、蓚酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマール酸、酒石酸、クエン酸、ｐ−トルエンスルフォン酸、トリフルオロ酢酸、メタンスルホン酸などの有機酸や、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などの無機酸などとの塩が挙げられる。
【００２０】
１．ペプチド（ａ）の製造法：
〔図１〕に示される式Ｚ−Ｒ2−Ｒ3−ＯＲ9で表されるペプチド(ａ)は、例えば、「ペプチド合成の基礎と実験」泉屋信夫他（丸善株式会社）、ザ・ペプチド（The Peptides）Vol.１, ７６−１３６頁，Ebehard Schroeder and Klaus Luebke 著に記載された方法、あるいはこれと同様の方法で製造することができる。
【００２１】
２．ペプチド（ａ）→ペプチド（ｂ）の製造法：
〔図１〕に示される式Ｚ−Ｓｅｒ−Ｒ2−Ｒ3−ＯＲ9で表されるペプチド(ｂ)は、ペプチド(ａ)にＺ−Ｓｅｒを導入することにより製造される。
まず、ペプチド（ａ）を脱Ｚ化反応に付す。脱Ｚ化反応は、例えば、Ｐｄ，Ｐｄ−Ｃ等の触媒を用いる接触還元あるいはＨＢｒ／ＡｃＯＨ処理等の方法を用いることにより行うことができる。
該接触還元反応において用いられる溶媒としては、アルコール類（例、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−プロパノール、ｎ−ブタノール、ｔ−ブタノール等）、エーテル類（例、ＴＨＦ、ジオキサン等）、アミド類（例、、ＤＭＦ，ＤＭＡ等）が挙げられる。なかでも、ＤＭＦ，ＤＭＡまたはＴＨＦを用いると、次工程の縮合反応における濃縮等の操作を省略できるので、有利である。反応温度としては、約０〜５０℃、好ましくは約２０〜４０℃である。反応時間は、約３〜１５時間、好ましくは約５〜１０時間である。本反応は、常圧下において行うのが好ましい。
また、還元時に副生するジケトピペラジンを抑制するために、還元反応の前に酸を添加し、ペプチド（ａ）の脱Ｚ化されたペプチドをプロトネーション(protonation)反応に付すのが好ましい。該プロトネーションを行うためには、反応系に酸が添加される。該酸としては、無機酸、有機酸のいずれでもよく、例えば、塩酸、硫酸、ｐ−トルエンスルホン酸などが挙げられるが、とりわけｐ−トルエンスルホン酸が好ましい。酸の添加量としては、ペプチド（ａ）の脱Ｚ化されたペプチドに対して約０.８〜１.５倍（mole／mole）、好ましくは約１.０〜１．１倍（mole／mole）である。
ＨＢｒ／ＡｃＯＨ処理は、通常、無溶媒で、ペプチド（ａ）とＨＢｒとを飽和した酢酸とを混合することにより行われる。反応温度としては、約−１０〜３０℃、好ましくは、約１０〜２０℃である。反応時間は、約１０分〜２時間、好ましくは、約３０分〜１時間である。
反応生成物の分離は、例えば、反応液にエーテル、酢酸エチル等を加えて、生じた沈殿をろ取し、乾燥することにより行われる。
【００２２】
Ｚ−Ｓｅｒの導入方法としては、活性エステル法を適用し（即ち、Ｚ−Ｓｅｒ−ＯＨを活性エステル化し、これを反応に用いる）、反応温度を最適化することにより分子内での脱水反応を抑制することにより有利に行うことができる。
該活性エステルとしては、ペプチド合成において通常用いられるものであればいずれでもよく、例えば、活性エステル化剤（例、ＨＯＮＢ、ＨＯＳｕ、ＨＯＢｔ）とのエステルなどが挙げられるが、とりわけＨＯＮＢとのエステルが好ましい。Ｚ−Ｓｅｒ−ＯＨを活性エステル化するには、Ｚ−Ｓｅｒ−ＯＨと活性エステル化剤とを、溶媒〔例、エーテル類（例、ジエチルエーテル、イソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン等）、アミド類（例、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等）、アセトニトリル、エステル酸（例、蟻酸メチル、酢酸メチル、酢酸エチル等）〕に溶解し、温度約−５〜２０℃、好ましくは約０〜５℃で、約５〜１５時間、好ましくは約７〜１０時間反応させることにより行なわれる。
脱Ｚ化ペプチド（ａ）とＺ−Ｓｅｒ−ＯＨの活性エステルとの反応は、それ自体が反応しない溶媒の中で行われる。該溶媒としては、還元反応において用いられた溶媒を濃縮することなくそのまま用いることができるが、なかでも、アミド類（例、ＤＭＦ、ＤＭＡ等）などが好ましい。反応時の温度としては、低温が好ましく、約−１０〜１０℃、好ましくは約−５〜５℃である。反応時間は約５〜２０時間、好ましくは約７〜１２時間である。
【００２３】
３．ペプチド（ｂ）→ペプチド（ｃ）の製造法：
〔図１〕に示される式Ｚ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｒ2−Ｒ3−ＯＲ9で表されるペプチド(ｃ)は、ペプチド（ｂ）を脱Ｚ化して得られたペプチドとＺ−Ｔｒｐ−ＯＨとを縮合反応に付すことにより行われる。
ペプチド（ｂ）の脱Ｚ化は、Ｐｄ，Ｐｄ−Ｃ等の触媒を用いる接触還元、あるいはＨＢｒ／ＡｃＯＨ処理等の方法を用いることができる。
該Ｐｄ，Ｐｄ−Ｃ等の触媒を用いる接触還元、および、ＨＢｒ／ＡｃＯＨ処理は、上記のペプチド（ａ）→ペプチド（ｂ）の製造法において記載した方法と同様にして行うことができる。
【００２４】
ペプチド（ｂ）を脱Ｚ化して得られたペプチドにＺ−Ｔｒｐを導入するには、Ｚ−Ｔｒｐ−ＯＨを活性エステル化剤（例、ＨＯＮＢ、ＨＯＢｔ，ＨＯＳｕ等）と縮合剤（例、ＤＣＣ、ＥＤＡ等）とで活性エステル化物とし、これとペプチド（ｂ）とを反応させることにより、有利に行うことができる。また、Ｚ−Ｔｒｐ−ＯＨとペプチド（ｂ）とを活性エステル化剤の存在下に縮合剤を用いて縮合させることもできる。
該活性エステル化剤としては、とりわけ、ＨＯＮＢが好ましく、縮合剤としては、とりわけ、ＤＣＣが好ましい。
Ｚ−Ｔｒｐ−ＯＨを活性エステル化するには、上記と同様の方法で行うことができる。
Ｚ−Ｔｒｐ−ＯＨの活性エステル化物とペプチド（ｂ）とを縮合剤の存在下におこなう反応においては、反応温度としては、約０〜２０℃、好ましくは約５〜１０℃である。反応時間は約５〜２０時間、好ましくは約７〜１０時間である。
【００２５】
４．ペプチド（ｃ）およびペプチド（ｄ）→ペプチド（ｅ）の製造法：
式Ｚ−５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｒ1−ＯＨで表されるペプチド（ｄ）は、畑中らの方法〔武田研究所報、第３５巻、第１６頁（１９７６年）；バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Biochemical and Biophysical Research Communications）、第６０巻、第１３４５頁、（１９７４年）〕に記載の方法、あるいはこれらと同様の方法で製造することができる。
ペプチド（ｃ）とペプチド（ｄ）とを反応させて、式Ｚ−５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｒ1−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｒ2−Ｒ3−ＯＲ9で表されるペプチド（ｅ）を製造するには、ペプチド（ｃ）とペプチド（ｄ）とを縮合反応に付すことにより行うことができる。
該縮合反応においては、Ｒ1残基特にＨｉｓ残基の異性化に留意しなけばならないが、その方法としては、ペプチドのフラグメント縮合において、異性化を抑制する方法であればいずれも適用することができる。該異性化を抑制する方法としては、通常、縮合剤や、異性化を抑制する添加物が加えられる。該縮合剤としては、ＤＣＣ、ＥＤＡなどが挙げられる。該添加物としては、ＨＯＮＢ、ＨＯＳｕ、ＨＯＢｔ、ＨＯＳｕなどが挙げられる。該縮合剤と該添加物は、これらを自由に組み合わせて用いてよく、その組み合わせとしては、例えば、ＤＣＣ−ＨＯＮＢ、ＤＣＣ−ＨＯＳｕ、ＤＣＣ−ＨＯＢｔ、ＥＤＡ−ＨＯＳｕなどが挙げられるが、とりわけＤＣＣ−ＨＯＮＢの組み合わせが好ましい。異性化を抑制するための大きな要因の一つとして反応温度があるが、反応温度は約０〜２０℃、好ましくは約５〜１５℃である。反応時間は、約３０〜１００時間、好ましくは約５０〜８０時間である。
用いられる溶媒としては、例えば、アミド類（例、ＤＭＦ、ＤＭＡ），エーテル類（２−メチルピロリドン、ＴＨＦ，ジオキサン等）が挙げられる。
【００２６】
５．ペプチド（ｅ）→ペプチド（IV）の製造法：
式Ｚ−５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｒ1−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｒ2−Ｒ3−ＯＲ9で表されるペプチド（ｅ）を脱Ｚ化することにより、ペプチド（IV）を製造することができる。
ペプチド（ｅ）の脱Ｚ化は、Ｐｄ，Ｐｄ−Ｃ等の触媒を用いる接触還元、あるいはＨＢｒ／ＡｃＯＨ処理等の公知の方法により行なうことができる。
該Ｐｄ，Ｐｄ−Ｃ等の触媒を用いる接触還元においては、溶媒として、アミド類（例、ＤＭＦ、ＤＭＡ），エーテル類（２−メチルピロリドン、ＴＨＦ，ジオキサン等）、ｔ−ブタノールなどがが用いられる。反応温度は、約０〜５０℃、好ましくは、約２５〜４０℃である。反応時間は、約１〜１０時間、好ましくは約３〜６時間である。
ＨＢｒ／ＡｃＯＨ処理は、上記ペプチド（ａ）→ペプチド（ｂ）の製造において記載した方法と同様にして行うことができる。
【００２７】
６．ペプチド（IV）→ペプチド（II）の製造法
ペプチド(IV)を加水分解反応に付し、ついで、所望により、反応液を中和することにより、ペプチド（II）を製造することができる。
該加水分解反応は、アルカリの存在下で、水中において、低温で行うことが好ましい。必要により、水とアルコールとの混液中で行うこともできる。該アルコール類としては、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、ｎ−ブチルアルコール等があげられるが、水−アルコール類の混液中でのアルコール類の混在量は、約１〜３０％（V/V)、好ましくは約１〜１０％（V/V)である。アルコールの量的割合が多くなる程、加水分解の反応速度が遅くなり、一方で、２位Ｒ1および４位Ｓｅｒの異性化が有意に増加する（Ｒ1がＨｉｓの場合）。これらの異性体はカラムクロマトグラフィー等による精製においても効果的に除去することが困難であり、本発明の目的化合物〔ペプチド(Ｉ)〕の品質を低下させる要因となる。
【００２８】
反応溶媒中には、前工程において用いられたＤＭＦ、ＴＨＦ等の溶媒が含まれていてもよいが、これら溶媒の含量は反応速度を著しく低下させない程度、即ち約１〜２０％（V/V）、さらに好ましくは、約５〜１０％（V/V）が好ましい。
該加水分解反応は、アルカリの存在下で行われる。該アルカリとしては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウムなどが挙げられる。加水分解反応速度並びに２位Ｈｉｓおよび４位のＳｅｒの異性化は、用いるアルカリの量および反応液中での濃度によって大きな影響を受ける。そこで、アルカリの量は、ペプチド(IV)の約２.５〜５倍mole/mole、好ましくは、約３〜４倍mole/moleが用いられる。特に、反応液中での初期アルカリ濃度としては、好ましくは約０.０５〜０.３mole/literで、さらに好ましくは約０.１〜０.２mole/literである。
該反応温度は、後処理、即ち、中和が完了するまでは約−１０〜１０℃、好ましくは、約−５℃〜５℃に維持する。均一な反応温度を維持するために、反応液を、攪拌することが好ましい。該反応は、通常約１.５〜３時間で終了する。
好ましくない異性化を最小限に抑制するために、反応終了後直ちに低温下において中和処理を行うことが望ましい。該中和処理の温度は、約−５〜５℃、好ましくは約−２〜２℃である。該中和処理は、反応液に酸（例、塩酸、硫酸など）を加えることにより行われる。
【００２９】
ペプチド(II)は、次に示す方法により結晶化することができる。
すなわち、前述したペプチド(IV)の加水分解液を中和する際に析出するゲル状物を、加熱溶解し、ついで徐冷して、ペプチド(II)を晶出させる。
該加熱溶解は、約６０〜８０℃、このましくは、約６５〜７５℃で撹拌下に行うのが好ましい。
該徐冷の際には種晶を加えることによって晶出が容易になる。該種晶の添加時期は、種晶が溶解せず、加熱溶解液が再びゲル状に変化しない温度範囲であればいつでもよいが、好ましくは加熱溶解液が約３５〜４５℃の時点である。該徐冷は、約１〜３時間を要して、約１５〜３０℃となるようにする。
【００３０】
晶出を完成させるために、さらに、熟成を行うのが好ましい。物性的に優れたペプチド（II）の結晶を収率よく得るためには、熟成時間として、通常約３０〜１５０時間を必要とするが、好ましくは約６０〜１００時間である。
熟成温度は約１０〜３５℃、好ましくは約１０〜３０℃であるが、より好ましくは約１５〜２５℃である。
熟成を開始する時点におけるペプチド(II)の溶液の濃度を、約０.０１〜０.０５mole/liter、好ましくは約０.０２〜０.０４mole/literとすると、晶出に好都合である。
【００３１】
熟成時においては、晶出時間の短縮、収率の確保を図るために、ペプチド(II)含有液を断続的に攪拌することが好ましい。該撹拌としては、例えば熟成の全工程の時間の開始から２／３までは、５時間毎に１分間約３０〜３５ｒｐｍで撹拌し、２／３の工程から最後までは、０.５時間毎に１分間約３０〜３５ｒｐｍで撹拌するのが好ましい。
具体的には例えば、熟成時間が６０時間の場合、晶出開始時より４０時間までは５時間毎に１分間３３ｒｐｍで撹拌し、４０時間後は０.５時間毎に１分間３３ｒｐｍで撹拌するのが好ましい。
上記したペプチド（II）の結晶化法により、ペプチド（c）→ペプチド（e）の縮合反応時及びペプチド(IV)→ペプチド（II）の加水分解反応時に副生するＨｉｓ異性体、ペプチド(IV)→ペプチド（II）の加水分解反応時に副生するＳｅｒ異性体などの最終製品の品質を左右する混在物の繁雑な除去操作、並びにペプチド(IV)の単離操作の省略が可能となる。
このようにして得られたペプチド（II）の結晶は、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｃａ、Ｂａなどのアルカリ金属との塩、トリエチルアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミンなどとの塩として得られる。
【００３２】
７．ペプチド（III）の製造法：
ペプチド（III）またはその塩の製造は、例えば 藤野らの方法〔M.Fujinoら：アーカイブス・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス（Archives of Biochemistry and Biophysics, 154, 488(1973)；ケミカル・アンド・ファーマシューティカル・ブレティン（Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 23, 229 (1975)〕 に記載の方法またはそれと同様の方法によって製造することができる。
ペプチド（III）は塩酸、臭化水素酸、硫酸、ｐ−トルエンスルフォン酸、トリフルオロ酢酸、メタンスルフォン酸などとの塩として、結晶化等の通常の手段により分離・採取して、あるいは溶液状態のまま次工程で用いることもできる。溶液状態のまま次工程で用いる場合には、アミド結合形成反応に先立って、塩基による中和あるいはイオン交換樹脂などによる塩基の除去などが必要になる。
【００３３】
８．ペプチド(II)およびペプチド(III)→(Ｉ')の製造法：
ペプチド（II）とペプチド（III）とから、縮合反応によって、ペプチド(Ｉ')を製造する方法は、反応に悪影響を及ぼさない溶媒中で行われる。該反応に悪影響を及ぼさない溶媒としては、例えば、ＤＭＦ、ＤＭＡ、Ｎ−メチルピロリドン、ジクロルメタン、ジクロロエタン、ＴＨＦ、ジオキサンなどが挙げられ、これらの溶媒は、適宜混合して用いることもできる。該溶媒としては、好ましくはジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミドである。
ペプチド（III）の使用量は、ペプチド（II）に対して約０.５ないし２モル当量、好ましくは約１ないし１.５モル当量である。
反応温度は、通常約０〜４０℃、好ましくは約５〜２５℃である。なお、反応温度がこれからはずれると、Ｒ3の異性化（ラセミ化）が起こりやすくなり、不都合である。反応時間は、通常約３０〜６０時間、好ましくは約４０〜５０時間である。
該縮合反応においては、Ｒ3残基の異性化に留意しなけばならないが、その方法としては、ペプチドのフラグメント縮合において、異性化を抑制する方法であればいずれも適用することができる。該異性化を抑制する方法としては、通常、縮合剤や、異性化を抑制する添加物が加えられる。該縮合剤としては、ＤＣＣ、ＥＤＡなどが挙げられる。該添加物としては、ＨＯＮＢ、ＨＯＳｕ、ＨＯＢｔなどが挙げられる。該縮合剤と該添加物は、これらを自由に組み合わせて用いてよく、その組み合わせとしては、例えば、ＤＣＣ−ＨＯＮＢ、ＤＣＣ−ＨＯＳｕ、ＤＣＣ−ＨＯＢｔ、ＥＤＡ−ＨＯＳｕなどが挙げられるが、とりわけＤＣＣ−ＨＯＮＢの組み合わせが好ましい。
縮合剤は、ペプチド(II)に対して、約１〜３倍（mole/mole）、好ましくは、約１〜２倍（mole/mole）の量が用いられる。添加物は、ペプチド(II)に対し、約１〜４倍（mole/mole）、好ましくは約１.５〜２.５倍（mole/mole）が用いられる。また、ペプチド(II)の反応溶媒中での初期濃度は、約０.０５〜０.２mole/L、好ましくは、約０.０８〜１.５mole/Lである。ペプチド(III)は、ペプチド(II)に対し、約０.８〜２倍（mole/mole）、好ましくは約１〜１.３倍（mole/mole）である。
【００３４】
９．ペプチド(Ｉ')→ペプチド（Ｉ）の製造法：
ペプチド(Ｉ')のＡｒｇ残基の保護基を脱離し、ペプチド(Ｉ)を得る脱保護反応は、例えば,ペプチド(Ｉ')を、反応に悪影響を及ぼさない溶媒中または無溶媒下で、酸で処理することにより行われる。
該反応に悪影響を及ぼさない溶媒としては、例えば、ジクロルメタン、ジクロルエタン、ジオキサン、トリフルオロ酢酸などが挙げられ、これらの溶媒は、適宜混合して用いることもできる。
該脱保護反応において、用いられる酸としては、例えば、Ｃ1-6アルキルスルホン酸（例、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸など）、ハロゲノスルホン酸（例、クロルスルホン酸、フルオロスルホン酸、ブロモスルホン酸）、ルイス酸（例、ボロン・トリス・トリフルオロアセテートなど）などが挙げられ、なかでもＣ1-6アルキルスルホン酸が好ましい。さらに好ましくはＣ1-3アルキルスルホン酸であり、メタンスルホン酸が特に好ましい。
該脱保護反応において、処理に用いられる酸の使用量は、ペプチド(Ｉ')に対し、約５〜２５（W/W）倍、好ましくは約１０〜２０（W/W）倍である。
該脱保護反応における反応温度は、通常約０〜２０℃、好ましくは約５〜１５℃である。反応時間は、通常約２〜８時間、好ましくは約４〜６時間である。
該脱保護反応は、好ましくは、無溶媒下で、メタンスルホン酸を用いて行われる。
また、該脱保護反応の際、ラジカル捕捉剤（ラジカルスカベンジャー）（例、フェノール、アニソールなど）または酸化防止剤（例、チオグリコール酸など）を適宜添加して用いてもよい。これらの使用量は、上記反応生成物に対し、それぞれ約０.８〜２.０（W/W）倍、約０.０５〜２.０（W/W）倍である。
【００３５】
脱保護反応をＣ1-6アルキルスルホン酸を用いて行う場合、反応液から該アルキルスルホン酸を除去する方法としては、例えば反応液をエーテル類で洗浄し、洗浄液に水を溶解し、溶解液をアニオン交換樹脂カラムに付す方法が挙げられる。しかしながら、この方法を工業的に用いる場合、Ｃ1-6アルキルスルホン酸のエーテル類に対する溶解度が低いため、エーテル類の大量使用が避けられず、危険性を伴うため、大量のアルキルスルホン酸を水と混合する際及びイオン交換樹脂カラムに付す際の急激な発熱による危険性、およびその発熱による目的ペプチドの分解などの問題により、工業的方法としては、設備的にも、操作性、安全性の観点からも実用的ではない。
従って、これらの問題がなく工業的に有利な方法としては、例えば、塩基性水溶液を用いる直接的な中和による、反応液から該アルキルスルホン酸を除去する方法が挙げられる。しかし、大量の強酸を中和する本中和反応においては、大量処理が可能である一方、当然激しい中和熱の発生が予想され、大量に発生する中和液の処理という問題に加え、塩基性水溶液中での目的ペプチドにおけるペプチド結合の開裂、アミノ酸残基の異性化など目的化合物の品質に及ぼす悪影響が当初予想され、ペプチド化合物の常識的な取扱いの範囲を越えたものであると考えられた。
【００３６】
しかしながら、本願発明者らは、本中和反応における中和熱の吸収方法、操作方法等を鋭意検討、反応条件の最適化を行った結果、予想外にも、品質的に満足できる目的化合物が高収率で得られることを見出し、本中和反応方法の工業的処理方法を確立するに至った。即ち、本願発明における製造法においては、冷却された無機または有機塩基の水溶液に低温を維持しながら反応液を滴下して、過剰の塩基をアルキルスルホン酸で中和すれば、目的ペプチドにおける構成アミノ酸残基の異性化を抑制しつつ、目的化合物を固体または油状物として分離回収できる。
該無機塩基としては水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウムなどが、また、該有機塩基としてはピリジン、トリエチルアミンなどが用いられるが、炭酸カリウムがとりわけ好ましい。塩基として炭酸塩を用いる場合は、炭酸ガス発生に伴う発泡が著しいが、酢酸エチル、ベンゼン等の有機溶媒を適量混在させてこれを防ぐことができる。無機又は有機塩基の必要量は、アルキルスルホン酸を中和するのに十分な量があれば目的を達成することが出来るが、好ましくはアルキルスルホン酸に対し、約１〜１.３倍当量を用いる。
【００３７】
該中和反応時の液温は、アミノ酸残基の異性化あるいはペプチド鎖の加水分解などを抑制するために、また、無機塩基または有機塩基の水溶液の氷結を防ぐために、約−１５℃〜１５℃、好ましくは、約−５℃〜５℃に維持することが好ましい。
該中和反応後、目的化合物は、通常、中和液から固体もしくは油状物として分離するので、濾過あるいは分液など公知の方法で適宜分離回収することができる。
該中和反応後、分離回収された目的化合物は、所望により自体公知の方法により、分離・精製操作を行うことができる。比較的少量の目的化合物を精製する場合には、クロマトグラィーなどの手段を用いればよく、大量の目的化合物を精製する場合には、その化合物特有のイオン的性質、極性などの溶液物性、芳香族性、分子量などを利用して、例えばカラムクロマトグラフィー（例、液体カラムクロマトグラフィー、好ましくは、高速液体カラムクロマトグラフィー）を数種組み合わせる手段を用いればよい。
分離・回収法としては、上記の反応液において分離した遊離体の油状物をカラムクロマトグラフィーで精製することが好ましい。
【００３８】
工業的観点から好ましい分離・精製手段としては、例えばアンバーライトＸＡＤ−２(Ｒohm ＆ Ｈass CO，USA(ローム・アンド・ハース社；米国))、ダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化学；日本）などのハイポーラス樹脂、カルボキシメチルセルロース(ＣＭＣ、ＣＭ−２３(ワットマン；米国))、アンバーライトＣＧ−５０(Ｒohm ＆ Ｈass CO，USA(ローム・アンド・ハース社；米国))などのイオン交換樹脂、セファデックスＬＨ−２０（ファルマシアファインケミカルズ；スウェーデン）などの分子篩樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーを適宜組み合わせる手段が挙げられる。該手段は、操作的に単純で、安全性に優れ、収率・品質面で再現性が得られ、経済的にも有利である。
カラムクロマトグラフィーの組み合わせとしては、例えば以下に詳述するダイヤイオンＨＰ−２０（前述）（第１回目）→ ＣＭ−２３（前述）→ ダイヤイオンＨＰ−２０（第２回目）→ セファデックスＬＨ−２０（前述）の順の組み合わせが挙げられる。
ペプチド含有水溶液は、一般に、濃縮時に激しい発泡を伴うために、濃縮を必要とする場合には凍結乾燥機などの特殊な装置や消泡剤の添加等が必要となる。上記カラムクロマトグラフィーの組み合わせは、各カラムクロマトグラフィーで得られる有効画分の濃縮、特にＣＭ−２３で得られる大量の有効画分水溶液の濃縮操作の省略を可能にしたものであり、操作性、経済性の観点から有利であるばかりでなく、濃縮に伴うペプチドの分解を抑えて品質の向上にも寄与している。
【００３９】
ダイヤイオンＨＰ−２０（第１回目）カラムクロマトグラフィーは、脱保護反応後の反応液から分離した粗目的化合物を含む固体あるいは油状物中に混在する無機物、保護基脱離時に添加するラジカルスキャベンジャーおよびその反応生成物、必要に応じて用いられる酸化防止剤および少量混在する目的化合物の異性体などを除くのが主目的である。ダイヤイオンＨＰ−２０（第１）カラムクロマトグラフィーにおいて、ダイヤイオンＨＰ−２０の量は目的化合物に対して２０〜４０倍（V／W）、好ましくは２５〜３５倍が用いられる。目的化合物及び夾雑物の溶出は通常、アセトン、メタノール、エタノールの水溶液で行うが、エタノールを用いる場合の具体的な精製法を例示する。先ず最初に、目的化合物を含む水溶液をダイヤイオンＨＰ−２０のカラムに付し、カラムを設定量の、pＨを酢酸で５〜７に調節した酢酸ナトリウム水、酢酸アンモニウム水、１０％エタノール（V/V）で順次洗浄して類縁物質を溶出後、１５％エタノール（V/V）、３５％エタノール（V/V）で目的化合物を順次溶出し、予め設定した所望の画分を集める。
ＣＭ−２３カラムクロマトグラフィーは、目的化合物とイオン的に異なる副生物の除去が主目的であるが、ＣＭ−２３の量は、通常、目的化合物に対して約３５〜６０倍（V/W）、好ましくは約４０〜５５倍（V/W）が用いられる。ダイヤイオンＨＰ−２０（第１回目）カラムクロマトグラフィーで溶出された所望の画分からエタノールを留去した溶液をＣＭ−２３のカラムに付し、水洗後、目的化合物を０.０１５モル酢酸アンモニウム水、０.０３モル酢酸アンモニウム水で順次溶出し、予め設定した所望の画分を集める。
【００４０】
ダイヤイオンＨＰ−２０（第２回目）カラムクロマトグラフィーは、ＣＭ−２３カラムクロマトグラフィーの溶出に用いる酢酸アンモニウムの除去と大量の溶出液の濃縮が主目的である。ダイヤイオンＨＰ−２０（第２）カラムへはＣＭ−２３カラムクロマトグラフィーで得られた所望の画分（濃縮時に発泡を伴う大量の水溶液）を濃縮操作の必要なく付すことができる。ダイヤイオンＨＰ−２０（第２回目）カラムは pＨを酢酸で５〜７に調節した酢酸ナトリウム水、酢酸アンモニウム水、水で順次洗浄する。ついで１５％エタノール（V/V）、３５％エタノール（V/V）で目的化合物を順次溶出し、予め設定した所望の画分を集める。ダイヤイオンＨＰ−２０（第２）カラムの所望画分（ＣＭ−２３カラムの所望画分の約３分の１に濃縮されている）を減圧下に濃縮し、濃縮液をセファデックスＬＨ−２０カラムに付す。
セファデックスＬＨ−２０カラムクロマトグラフィーは、発熱性物質、無機物、その他の微量混在物の除去を目的としている。セファデックスＬＨ−２０は目的化合物の２０〜６０倍（V/W）、好ましくは３０〜５０倍（V/W）が用いられる。ＬＨ−２０カラムは０.００５Ｎ酢酸水で展開し、所望の画分を集める。所望画分は必要に応じて、濃縮、活性炭処理、膜濾過を行ったのち凍結乾燥することにより、目的化合物（酢酸塩）を得ることができる。
【００４１】
このようにして得られたペプチド（Ｉ）は、ＬＨ−ＲＨアゴニスト作用を有し、例えば、特開昭５０−５９３７０号公報（米国特許第４,００８,２０９号公報に対応）等に記載の方法で使用することができる。
【００４２】
【実施例】
つぎに、参考例および実施例を挙げて、本発明をより詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４３】
参考例１．Ｚ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＥｔの製造：
Ｚ−Ｔｙｒ−ＯＨ・ＤＣＨＡ ５８.８ｇを酢酸エチル約３００ml、０〜１０℃で１規定硫酸を用いて脱塩した。有機層を分離し、無水芒硝で乾燥した。無水芒硝をろ去し、ろ液にＤ−Ｌｅｕ−ＯＥｔ ２４.３ｇ、トリエチルアミン１２.６ｇ、ＤＣＣ ２６.８ｇを加え、約５℃で約２時間、約１０℃で５時間攪拌した。反応液に１規定塩酸６０mlを加えてろ過した。ろ液を分液し、有機層を食塩水、重曹水で洗浄した後に酢酸エチルを留去した。残渣にイソプロピルエーテルを加え、析出した結晶をろ取し、酢酸エチル−イソプロピルエーテルから再結晶し、乾燥し、標記ペプチドを得た。
収量：４１.６ｇ（７７％）。
融点：１１６〜１１８℃。
比旋光度〔α〕D 25＝−３.４°（ｃ＝１，ＤＭＦ）。
【００４４】
参考例２．Ｚ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＥｔの製造：
Ｚ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＥｔ ４０.５ｇ、ｐ−トルエンスルホン酸・１水和物１６.９ｇをＤＭＦ約３００mlに溶解して、５％Ｐｄ−Ｃを約５ｇの存在下で２０〜３５℃で水添し、反応終了後触媒をろ去した。
別途、Ｚ−Ｓｅｒ−ＯＨ ２３.３ｇ、ＨＯＮＢ １９.２ｇをＤＭＦ ３００mlに溶かし、ＤＣＣ ２２.１ｇを加えて、０〜５℃で約７時間攪拌し、これに先の還元反応液を加えた。混合液を約０℃に冷却し、トリエチルアミン９ｇを滴下した後、−５〜５℃で約１０時間攪拌、室温で一夜放置した。
析出結晶をろ去し、ろ液を減圧濃縮し、濃縮残渣を酢酸エチルに溶解した。酢酸エチル溶液を１規定塩酸、食塩水、重曹水で洗浄した後、無水芒硝で乾燥した。芒硝をろ去し、ろ液を減圧濃縮し、濃縮残渣にイソプロピルエーテルを加え、析出した結晶をろ取し、粗結晶を酢酸エチルから再結晶し、乾燥し、標記ペプチドを得た。
収量：３７.６ｇ（７７％）。
融点：１３４〜１３６℃。
比旋光度〔α〕D 25＝−４.８°（ｃ＝１，ＤＭＦ）。
【００４５】
参考例３．Ｚ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＥｔ（ＺＴＳＴＬＥ）の製造：
Ｚ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＥｔ ３６.２ｇをＤＭＦ ３００mlに溶解して５％Ｐｄ−Ｃ約５ｇの存在下で２５〜３５℃で水素添加し、反応終了後触媒をろ去した。
別途、Ｚ−Ｔｒｐ−ＯＨ ２１.４ｇ、ＨＯＮＢ １１.９ｇ、をＤＭＦ約３００mlに溶かし、ＤＣＣ １３.７ｇを加え、５〜１０℃で約７時間攪拌し、これに先の還元反応液を加えた。混合液を１０〜１５℃約７時間攪拌し、室温で一夜放置した。
析出結晶をろ去し、ろ液を減圧濃縮し、濃縮残渣を酢酸エチルに溶解した。酢酸エチル溶液を１規定塩酸、食塩水、重曹水で洗浄した後、無水芒硝で乾燥した。芒硝をろ去し、ろ液を減圧濃縮し、濃縮残渣にイソプロピルエーテルを加え、析出した結晶をろ取し、粗結晶を酢酸エチル−イソプロピルエーテルから再結晶し、乾燥し、標記ペプチドを得た。
収量：４１.３ｇ（８５％）。
比旋光度〔α〕D 25＝−１０.０°（ｃ＝１，ＥtＯＨ）。
【００４６】
参考例４．Ｚ−５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＥｔの製造：
Ｚ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＥｔ（ＺＴＳＴＬＥ）５５.７ｇをＤＭＦ約３５０mlに溶解して５％Ｐd−Ｃ（wet）約１２ｇの存在下、約３０℃で水添し、反応終了後触媒をろ去した。
ろ液にＺ−５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−ＯＨ・１.５Ｈ2Ｏ ３２.６ｇとＨＯＮＢ ２７.４ｇを加えて溶解した。溶解液を２〜８℃に冷却してＤＣＣ ２０.５ｇを加え、約８℃で約６０時間攪拌した。
反応液を約４０℃で約２時間攪拌後、不溶物をろ去し、ろ液を減圧濃縮した。濃縮液に酢酸エチル約１Ｌを約６０℃で加えた後、２０〜２５℃で攪拌した。析出した結晶をろ取し、得られた粗結晶をＤＭＦ約２３０mlと酢酸エチル約５３０mlの混液中で懸濁攪拌した後、ろ取した。得られた標記ペプチドの精結晶（ＺＰＧＬＥ）は乾燥することなしに、次工程の還元反応に供した。
【００４７】
参考例５．５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＥｔの製造：
参考例４で得られたＺＰＧＬＥをＤＭＦ約９００mlに溶解し、５％Ｐd−Ｃ（wet）１５ｇの存在下、約３０℃で水添し、反応終了後触媒をろ去した。標記ペプチドを含有するろ液を約１８０mlまで濃縮して，次工程の加水分解反応に供した。
【００４８】
参考例６．Ｚ−Ｌｅｕ−ＯＮＰの製造：
Ｚ−Ｌｅｕ−ＯＨ １２５ｇおよびｐ−ニトロフェノール６５.５ｇを酢酸エチル１.２Ｌに溶解し、０〜５℃でＤＣＣ １０７ｇの酢酸エチル溶液を滴下し、１０〜２５℃で攪拌した。反応終了後、析出結晶をろ去し、ろ液を減圧濃縮した。濃縮残渣をエタノールに溶解し、晶出した結晶をろ取し、真空乾燥し，標記ペプチドを得た。
収量：１４２ｇ（７８％）。
融点：９２〜９４℃。
比旋光度〔α〕D 25＝−４２.５°（ｃ＝１，ＣＨ3ＯＨ）。
【００４９】
参考例７．Ｚ−Ａｒｇ(ＭＢＳ)−Ｐｒｏ−ＮＨＣ2Ｈ5の製造：
Ｚ−Ａｒg(ＭＢＳ)ＯＨ・ＤＣＨＡ ３４.１ｇを酢酸エチル４００mlに懸濁し、０〜１０℃で１規定硫酸５７mlを加え、攪拌、分液し、有機層を芒硝水で洗浄し、減圧濃縮した。一方、Ｚ−Ｐｒｏ−ＮＨＣ2Ｈ5 １５.７ｇをジメチルアセトアミド３０mlに溶解し、５％Ｐd−Ｃ ２.３ｇの存在下で水添し、反応終了後触媒をろ去した。ろ液でＺ−Ａｒｇ(ＭＢＳ)ＯＨを含んだ濃縮残渣、ＨＯＮＢ ９.４ｇを溶解した。これにＤＣＣ １２.８ｇのジメチルアセトアミド溶液を滴下して、１０〜２０℃で攪拌した。反応終了後析出した結晶をろ去し、ろ液を減圧濃縮した。濃縮液を酢酸エチル４５０mlに溶解し、１規定塩酸、食塩水、重曹水で洗浄した後、酢酸エチルを減圧で留去した。濃縮残渣を酢酸エチルとエタノールの混液で処理して粗結晶を得、これをエタノールから再結晶し、真空乾燥し，標記ペプチドを得た。
収量：２２.４ｇ（７２％）。
比旋光度〔α〕D 25＝−３３.０°（ｃ＝１，ＣＨ3ＯＨ）。
【００５０】
参考例８．Ｚ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ(ＭＢＳ)−ＰｒｏＮＨＣ2Ｈ5(ＺＬＡＰ）の製造：
Ｚ−Ａｒｇ(ＭＢＳ)−ＰｒｏＮＨＣ2Ｈ5 ２０.３ｇ及びｐ−トルエンスルホン酸・一水和物６.４ｇをＤＭＦ １６０mlに溶解し、５％Ｐｄ−Ｃ ２.３ｇの存在下で水添し、反応終了後触媒をろ去した。ろ液にトリエチルアミン３.４ｇを冷却下に加え、これにＺ−Ｌｅｕ−ＯＮＰ １３.６ｇを加えて１０〜１５℃で攪拌した。反応終了後減圧濃縮し、濃縮残渣を酢酸エチル１２０mlに溶解し、希塩酸、重曹、水で順次洗浄した。酢酸エチルを留去し、濃縮残渣をシリカゲルカラムに付し、カラムを酢酸エチル−イソプロピルエーテルの混液（１：１）、酢酸エチル−メタノールの混液（３：２）で順次展開し、有効画分を集めて減圧濃縮した。濃縮残渣を酢酸エチルに溶解し、イソプロピルエーテルを加えて、生じた沈殿をろ取し、真空乾燥し、標記ペプチドを得た。
収量：２２.２ｇ（９２％）。
比旋光度〔α〕D 25＝−３９.０°（ｃ＝１，ＣＨ3ＣＨ2ＯＨ）。
【００５１】
実施例１．５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＨ（ＰＧＬＯＨ）の製造：
参考例５で得られた濃縮液に、水酸化ナトリウム８.３ｇを水１Ｌに溶解した液を−３〜０℃で滴下し、約０℃で約２時間攪拌した。反応終了を確認後、１規定塩酸２１０mlを約０℃で滴下して中和し、結晶を析出させた。析出した結晶を加熱溶解し、加熱下に活性炭１.５ｇを加えて攪拌後、活性炭をろ去した。ろ液を徐冷し、１５〜２５℃で３５時間攪拌した。晶出結晶をろ取し、約６０℃で真空乾燥し、標記ペプチドを得た。
収量：３９.９ｇ（５９.２％、参考例３のＺＴＳＴＬＥ基準）。
比旋光度〔α〕D 25＝−２１.５°（ｃ＝０.５，ＤＭＦ）。
なお、本溶媒系での２０℃での反応における１時間後の２位Ｈｉｓおよび４位Ｓｅｒにおける好ましくない異性化は、それぞれ１.３％、４.８％であるのに対し、０℃での反応ではそれぞれ０.２％, ０.４４％であった。
また、本発明方法による結晶化法は、諸々の類縁物質を効果的に除去するが、最も注目すべき類縁物質であるＨｉｓ異性体及びＳｅｒ異性体に焦点を当ててその除去効果の一例を〔表１〕に示す。
【００５２】
【表１】
*) ペプチド（c）→ペプチド（e）の縮合時に副生した〔Ｄ−Ｈｉｓ2 〕 体も含む。
【００５３】
実施例２．５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＨ（ＰＧＬＯＨ）の結晶の製造：
参考例５で得られた濃縮液に、水酸化ナトリウム８.３ｇを水１Ｌに溶解した液を０〜３℃で滴下し、約０℃で約２時間攪拌した。反応終了を確認後、１規定塩酸２１０mlを約０℃で滴下して中和し、結晶を析出させた。析出した結晶を加熱溶解し、加熱下に活性炭１.５ｇを加えて攪拌後、活性炭をろ去した。ろ液を徐冷し、１８〜２２℃で８０時間熟成した。晶出結晶をろ取し、約６０℃で真空乾燥し、標記ペプチドを得た。
収量：４２.９ｇ（６３.６％、参考例３のＺＴＳＴＬＥ基準）。
比旋光度〔α〕D 25＝−２１.８°（ｃ＝０.５，ＤＭＦ）。
【００５４】
実施例３．５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ(ＭＢＳ)−ＰｒｏＮＨＣ2H5 (ＭＢＳＴＡＰと略する) の製造：
ＺＬＡＰ ３５.６ｇをＤＭＦ ３５０mlに溶解し、５％Ｐｄ−Ｃ ７.３ｇの存在下で水添し、反応終了後触媒をろ去した。ろ液にＰＧＬＯＨ ３６.９ｇとＨＯＮＢ １６.２ｇを加えて溶解し、４〜８℃でＤＣＣ １４ｇのＤＭＦ溶液を滴下し、約８℃で１５時間、約２０℃で約３０時間攪拌した。反応終了後析出した結晶をろ去し、ろ液を減圧濃縮した。濃縮残渣をエタノール約２００mlに溶解し、これに酢酸エチル約２.３Ｌを加えて、生じた結晶性固体をろ取した。粗体をエタノール約２２０mlに溶解し、これに酢酸エチル約９００mlを加え、生じた固体をろ取し、ジクロルメタンで洗浄してＭＢＳＴＡＰの湿体を得た。乾燥操作を省略して次工程の脱ＭＢＳ反応に供した。ＨＰＬＣで定量し、ＭＢＳＴＡＰが５１.１ｇ（８２％）得られていることを確認した。
【００５５】
実施例４．５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＰｒｏＮＨＣ2Ｈ5・ＣＨ3 ＣＯＯＨ(ＴＡＰ−１４４と略する) の製造：
(1)脱ＭＢＳ化：
フェノール６０ｇをメタンスルホン酸８００ｇに溶解し、冷却下に、実施例１０で得られたＭＢＳＴＡＰの湿体（ＭＢＳＴＡＰ ５１.１ｇ相当）を加え、約１０℃で５時間攪拌した。
別途、水２Ｌに炭酸カリウム６９０ｇを溶解し、酢酸エチル約４００mlを混ぜて、−２〜０℃に冷却したアルカリ液を調製した。アルカリ液に脱ＭＢＳ反応液を約０℃を保ちながら滴下した。滴下後分液し、上層（油状物と酢酸エチル層）に pＨ４緩衝液（約０.１規定酢酸ナトリウム約３Ｌと酢酸約５８mlの混液）を加えて油状物を溶解、分液し、水層を酢酸エチルで洗浄した。
水層に２０％（w/w）炭酸カリウム溶液を加えて ｐＨを約６とし、析出した油状物を取り除き、ＴＡＰ−１４４を含有する水溶液を得た。
【００５６】
(2)粗ＴＡＰ−１４４の精製：
ＤＡＩＡＩＯＮ・ＨＰ−２０（商品名）のカラム（約１.２Ｌ）に、上記(1)項で得たＴＡＰ−１４４を含有する水溶液を通液した。通液後、０.３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（酢酸で pＨ６.２に調節）約２.５Ｌ、０.０２５Ｍ酢酸アンモニウム水約３Ｌ、１０％エタノール４.３Ｌで順次洗浄した。次に１５％エタノール９.５Ｌ、３５％エタノール９.５Ｌを通液し、有効画分を集め、エタノールを減圧留去した。（Ｓ１−ＴＡＰ）
ここで得られたＳ１−ＴＡＰをＣＭ−２３（商品名）のカラム（約１.７Ｌ）に通液し、水２Ｌで洗浄後、０.０１５Ｍ酢酸アンモニウム水１５Ｌ、次に０.０３Ｍ酢酸アンモニウム水１５Ｌで目的化合物を溶出するカラムクロマトグラフィーを行い、有効画分を集めた（Ｓ２−ＴＡＰ）。
Ｓ２−ＴＡＰをＤＡＩＡＩＯＮ・ＨＰ−２０（商品名）のカラム（約０.７Ｌ）に通液し、０.３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（酢酸で pＨ６.２に調節）約２.１Ｌ、０.０１Ｍ酢酸アンモニウム水３.２Ｌ、水０.７Ｌで順次洗浄した後、１５％エタノール４.３Ｌ、３５％エタノール５.４Ｌで溶出するカラムクロマトグラフィーを行い、有効画分を集めて約２００mlに減圧濃縮した。濃縮液を Sephadex ＬＨ−２０（商品名）カラム（約１０Ｌ）に付し、０.００５Ｎ酢酸水で展開し、有効画分を集めた。有効画分を活性炭処理、限外ろ過、濃縮、凍結乾燥を行ってＴＡＰ−１４４を３１.８ｇ（収率：６７.６％）得た。
含量：９９.８％（ＨＰＬＣ，内標基準）。
旋光度〔α〕D 20＝−３９.０°（ｃ＝１，１％酢酸）。
吸光度：５７（２８１nm）、５５（２８９nm）。
【００５７】
【発明の効果】
本発明の製造法によれば、i）加水分解反応時の２位 His および４位 Ser の異性化を最小限に抑制される、ii）ペプチド（II）が物性的に優れた結晶として得られ、縮合時及び加水分解時に副生する異性体の除去が可能である、iii）アルキルスルホン酸処理によるアルコキシベンゼンスルホニル基の脱離後の目的化合物を工業的規模で分離できる、iv）目的化合物を工業的規模で精製できる、v）ペプチド（b）を副生物の生成を抑制しつつ収率よく得ることができる、vi）ペプチド（e）およびペプチド(Ｉ')の乾燥操作およびペプチド(IV)の単離操作を省略できるなど、多くの利点がある。従って、ＬＨＲＨのアゴニストとしての作用を有するペプチド（Ｉ）を工業的規模で有利に製造できる。
【００５８】
【配列表】
【００５９】
【００６０】
【００６１】
【００６２】
【００６３】
【００６４】
【００６５】
【００６６】
【００６７】
【００６８】
【００６９】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明における好ましい製造法のフローチャートの例を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、視床下部から分泌される性線刺激ホルモン放出ホルモン（ＬＨ−ＲＨ）のアゴニストとしての作用等を有するペプチドまたはその塩の製造法、該ペプチドを製造するための中間体ペプチド、その製造法、その結晶および該結晶の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＬＨ−ＲＨのアゴニストであるペプチドまたはその塩の製造法としては、特開昭５０−５９３７０号公報（米国特許第４,００８,２０９号公報に対応）には、一般式：
(Ｐｙｒ)Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ(またはＰｈｅ)−Ｘ−Ｌｅｕ(またはＩｌｅまたはＮｌｅ)−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＮＨ−Ｒ
〔式中、アミノ酸は特に明記しないものはＬ体を示し、ＸはＤ−Ｌｅｕ，Ｄ−ＮＬｅ，Ｄ−ＮＶａ，Ｄ−Ｓｅｒ，Ｄ−Ａｂｕ，Ｄ−Ｐｈｇ，Ｄ−Ｐｈｅまたはα−Ａｉｂｕを、Ｒは水酸基を有してもよいアルキル基を示す〕で表されるペプチドの製造法として、下記の方法が記載されている。
【０００３】
【化１】
【０００４】
また、特開昭５１−６９２６号公報（米国特許第３,９９７,５１６号公報に対応）には、グアニジノ基を有するペプチドの製造において、グアニジノ基含有原料化合物のグアニジノ基を低級アルコキシベンゼンスルホニル基またはトリ低級アルキルベンゼンスルホニル基で保護することを特徴とするペプチドの製造法が記載されている。
さらに、特開昭５１−１０００３０号（米国特許第３,９９７,５１６号公報に対応）公報には、グアニジノ基を有するペプチドの製造において、グアニジノ基含有原料化合物のグアニジノ基を低級アルコキシ−またはトリ低級アルキルベンゼンスルフォニル基で保護してペプチド縮合した後、該保護基をハロゲノスルホン酸または低級アルキルスルホン酸またはルイス酸で脱離させることを特徴とするペプチドの分離・製造法が記載されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
ペプチドの工業的規模での大量生産においては、(1)原薬の品質、(2)製造コスト、(3)操作性、(4)作業者の安全、(5)環境の汚染防止などの様々な要件を実用上満足できるものとすることが不可欠であるため、実験室レベルのような小規模スケールでの合成方法が必ずしも工業的製法として実用性がある方法とは限らないことが多い。従って、ペプチドの工業的製法の構築には、このような様々の要件を満たすべく、ペプチド鎖の延長方法、フラグメント縮合点の選択、フラグメント縮合時の異性化の抑制方法、α−位及び側鎖官能基の保護基の選択と該保護基の最終的な脱離方法、得られる目的ペプチドの分離・精製方法、各工程間の一連の操作性等、非常に多くの検討課題がある。
また、一般にペプチドの合成過程においては、多種多様なプロセス、種々の反応手段等が考えられるが、多くの場合は、各製造工程の中間体が無晶形であるために、精製が十分に行えなかったり、煩雑な分離・精製操作が必要な場合が多く、品質および収率の点において再現性が得られない等の問題が生じている。即ち、各製造工程の中間体、とりわけ、各工程において鍵となる中間体について、結晶性、安定性、溶解性などの物性の良し悪しが工業的製造法として実用に足るか否かを左右する場合が多い。
【０００６】
上記ペプチド(Ｐｙｒ)Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ(またはＰｈｅ)−Ｘ−Ｌｅｕ(またはＩｌｅまたはＮｌｅ)−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＮＨ−Ｒの製造法において、特開昭５０−５９３７０号公報（米国特許第４,００８,２０９号公報に対応）に記載された方法は、Ａｒｇのグアニジノ基をニトロ基で保護している関係上、α−アミノ基の保護に用いているＺ基を還元的に脱離することが困難となり、その結果、Ｄ基の脱離をＨＢr／ＡcＯＨで行っている。この方法では必然的に強催涙性のベンジルブロマイドが大量に副生する他、目的のペプチドを分離するために大量のエーテル類を使用しなければならない。また、本反応における目的化合物は、通常、臭化水素酸塩として捕捉されるが、フラグメント縮合において、異性化を抑制するためには臭化水素をイオン交換樹脂等で除くことが必要となる。また、該ペプチドの種々のクロマトグラフィーによる精製においては、グラジエント溶出を行っているが、濃度勾配の再現性に乏しいため、有効画分の特定が溶出画分ごとに必要となり、一定した品質の目的化合物を安定して得るための作業の標準化ができない等の問題があり、工業的製法として実用的ではない。
【０００７】
さらに、米国特許第２,９９７,５１６号公報には式
(Ｐｙｒ)Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ(ＭＢＳ)−Ｐｒｏ−ＮＨ−Ｃ2Ｈ5
〔式中、ＭＢＳは、ｐ−メトキシベンゼンスルホニル基を示す〕で表わされるペプチドが製造されるとして、反応が図式されているが、ここには、単にペプチドの構造式が羅列してあるだけであり、実際にどのような反応条件で行なえるかについては、示されていない。
従って、ＬＨ−ＲＨのアゴニストとしての作用等を有するペプチドまたはその塩を、安全かつ簡便な操作で、高収率かつ再現性の良い、工業的に有利な製造法の開発が望まれている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前述の種々の問題を解決すべく、鋭意検討した結果、加水分解時のアミノ酸残基の異性化の抑制などによる鍵となる後述のペプチド(IV)の製造法の確立と結晶化、後述のペプチド(Ｉ')の大量処理可能な脱保護基操作方法の確立、後述のペプチド(Ｉ)の工業的規模の分離・精製法の確立により、安全で高収率かつ再現性良く、ペプチド(Ｉ)を製造できることを見いだし、この知見に基づきさらに鋭意研究の結果、本発明を完成した。
【０００９】
即ち、本発明は、
（１）一般式
５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｒ１−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｒ２−Ｒ３−ＯＨ （ＩＩ）
〔式中、Ｒ１はＨｉｓ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐまたはｐ−ＮＨ２−Ｐｈｅを、Ｒ２はＴｙｒまたはＰｈｅを、Ｒ３はそれぞれ置換基を有していてもよいＧｌｙまたはα−Ｄ−アミノ酸残基をそれぞれ示す。〕で表わされるペプチドまたはその塩と、一般式
Ｈ−Ｒ４−Ｒ５−Ｐｒｏ−Ｒ６ （ＩＩＩ）
〔式中、Ｒ４はＬｅｕ，ＩｌｅまたはＮｌｅを、Ｒ５は保護されたＡｒｇを、Ｒ６は式Ｇｌｙ−ＮＨ−Ｒ７（式中、Ｒ７は水素原子または水酸基を有していてもよいアルキル基を示す）または式ＮＨ−Ｒ８（式中、Ｒ８は水素原子、水酸基を有していてもよいアルキル基またはウレイド基（−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ２）をそれぞれ示す）で表わされる基を示す〕で表わされるペプチドまたはその塩とを反応させ、一般式
５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｒ１−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｐｒｏ−Ｒ６
（Ｉ’）
〔式中の記号は前記と同意義を示す〕で表わされるペプチドまたはその塩を得、ついで、得られたペプチド（Ｉ’）をペプチド（Ｉ’）に対して５〜２５重量倍のＣ １−６ アルキルスルホン酸を用いる脱保護基反応に付し、得られた反応液を−１５℃〜１５℃で塩基で中和することを特徴とする一般式
５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｒ１−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｒ６
（Ｉ）
〔式中の記号は前記と同意義を示す〕で表わされるペプチドまたはその塩の製造法、
【００１０】
（２）Ｒ１がＨｉｓを、Ｒ２がＴｙｒを、Ｒ３がＧｌｙ，Ｄ−Ｌｅｕ，Ｄ−Ｔｒｐ，Ｃ１−４アルキル基で置換されていてもよいＤ−Ｖａｌ，Ｄ−Ｓｅｒ，Ｃ１−４アルコキシ基、ナフチル基もしくは２−メチルインドリルで置換されていてもよいＤ−ＡｌａまたはＣ７−１０アラルキル基で置換されていてもよいＤ−Ｈｉｓを、Ｒ４がＬｅｕを、Ｒ５がＣ１−６アルコキシベンゼンスルホニル基、トリＣ１−６アルキルベンゼンスルホニル基およびニトロ基から選ばれる基で保護されたＡｒｇを、Ｒ６は式ＮＨ−Ｒ８’（式中、Ｒ８’は水素原子または水酸基を有していてもよいＣ１−３アルキル基をそれぞれ示す）で表わされる基をそれぞれ示す上記（１）項記載の製造法、
（３）Ｒ１がＨｉｓを、Ｒ２がＴｙｒを、Ｒ３がＤ−Ｌｅｕを、Ｒ４がＬｅｕを、Ｒ５がＣ１−６アルコキシベンゼンスルホニル基で保護されたＡｒｇを、Ｒ６は式ＮＨ−Ｒ８’’（式中、Ｒ８’’は水酸基を有していてもよいＣ１−３アルキル基を示す）で表わされる基をそれぞれ示す上記（１）項記載の製造法、
（４）ペプチド（ＩＩ）またはその塩とペプチド（ＩＩＩ）またはその塩とを、温度 ０〜４０℃で、 ３０〜６０時間反応させる上記（１）項記載の製造法、
（５）さらに分離した遊離体の油状物を含む反応液をカラムクロマトグラフィーで精製することを特徴とする上記（１）記載の製造法、
【００１１】
（６）一般式
５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｒ １ ’−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｒ ２ ’−Ｒ ３ ’−ＯＲ ９ ’ （ＩＶ’）
〔式中、Ｒ １ ’はＨｉｓ を、Ｒ ２ ’はＴｙｒ を、Ｒ ３ ’はＤ−Ｌｅｕを、Ｒ ９ ’はＣ １−６ アルキル基をそれぞれ示す。〕で表わされるペプチドまたはその塩、
（７）一般式
５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｒ１−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｒ２−Ｒ３−ＯＲ９ （ＩＶ）
〔式中、Ｒ１はＨｉｓ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐまたはｐ−ＮＨ２−Ｐｈｅを、Ｒ２はＴｙｒまたはＰｈｅを、Ｒ３はそれぞれ置換基を有していてもよいＧｌｙまたはα−Ｄ−アミノ酸残基を、Ｒ９は保護基をそれぞれ示す。〕で表わされるペプチドまたはその塩を加水分解反応に付すことを特徴とする一般式
５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｒ１−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｒ２−Ｒ３−ＯＨ （ＩＩ）
〔式中の記号は前記と同意義〕で表わされるペプチドまたはその塩の製造法、
【００１２】
（８）一般式
５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｒ１−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｒ２−Ｒ３−ＯＨ （ＩＩ）
〔式中、Ｒ１はＨｉｓ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐまたはｐ−ＮＨ２−Ｐｈｅを、Ｒ２はＴｙｒまたはＰｈｅを、Ｒ３はそれぞれ置換基を有していてもよいＧｌｙまたはα−Ｄ−アミノ酸残基をそれぞれ示す。〕で表わされるペプチドまたはその塩の結晶、
（９）一般式
５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｒ１−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｒ２−Ｒ３−ＯＨ （ＩＩ）
〔式中、Ｒ１はＨｉｓ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐまたはｐ−ＮＨ２−Ｐｈｅを、Ｒ２はＴｙｒまたはＰｈｅを、Ｒ３はそれぞれ置換基を有していてもよいＧｌｙまたはα−Ｄ−アミノ酸残基をそれぞれ示す。〕で表わされるペプチドまたはその塩の溶液を熟成させることを特徴とするペプチド（ＩＩ）またはその塩の結晶の製造法、および、
（１０）ペプチド（ＩＩ）またはその塩の濃度が ０．０１〜０．０５モル／Ｌである溶液を １０〜７０℃で １０〜７０時間熟成させる上記（９）項記載の結晶の製造法である。
【００１３】
【発明の実施の形態】
上記の式中および図の式中で用いられる記号、略号等について、以下に示す。
Ｒ1はＨｉｓ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐまたはｐ−ＮＨ2−Ｐｈｅを表わすが、なかでもＨｉｓが最も好ましい。
Ｒ2はＴｙｒまたはＰｈｅを示すが、なかでも、Ｔｙｒが好ましい。
Ｒ3で表わされる置換基を有していてもよいＧｌｙまたはα−Ｄ−アミノ酸残基におけるα−Ｄ−アミノ酸としては、例えば、Ｄ−Ｌｅｕ，Ｄ−Ｉｌｅ，Ｄ−Ｎｌｅ，Ｄ−Ｖａｌ，Ｄ−Ｎｖａ，Ｄ−Ｓｅｒ，Ｄ−Ａｂｕ，Ｄ−Ｐｈｅ，Ｄ−Ｐｈｇ，Ｄ−Ｔｈｒ，Ｄ−Ｍｅｔ，Ｄ−Ａｌａ，Ｄ−Ｔｒｐまたはα−Ａｉｂｕが挙げられ、なかでも、Ｄ−Ｌｅｕ，Ｄ−Ｖａｌ，Ｄ−Ｓｅｒ，Ｄ−Ｔｒｐ、Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｂｕまたはα−Ａｉｂｕが好ましく、特に、Ｄ−Ｌｅｕが最も好ましい。
Ｒ3で表わされる置換基を有していてもよいＧｌｙまたはα−Ｄ−アミノ酸残基における置換基としては、例えば、モノＣ1-4アルキル（例、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル等）、ジＣ1-4アルキル（例、ジメチル、ジエチル等）、トリＣ1-4アルキル（例、トリメチル、トリエチル等）、Ｃ1-4アルコキシ（例、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｔ−ブトキシ等）、Ｃ6-10アリール（例、フェニル、ナフチル等）、Ｃ7-10アラルキル基（例、ベンジル、フェネチル等）、インドリル、メチルインドリル、ベンジル−イミダゾリルなどが挙げられる。特に、メチル，ジメチル，トリメチル，ｔ−ブチル，ｔ−ブトキシ，ナフチル（特に、２−ナフチル等），インドリル−３−イル，２−メチルインドリルおよびベンジルイミダゾール−２−イルが好ましく、なかでも、トリメチル，ｔ−ブチル，ｔ−ブトキシ，２−ナフチル，インドール−３−イル，２−メチルインドリルおよびベンジルイミダゾール−２−イルが好ましい。
【００１４】
Ｒ3の好ましいものとしては、例えば、Ｇｌｙ，Ｄ−Ｌｅｕ，Ｄ−Ｔｒｐ，Ｃ1-4アルキル基で置換されていてもよいＤ−Ｖａｌ，Ｄ−Ｓｅｒ，Ｃ1-4アルコキシ基、ナフチル基もしくは２−メチルインドリルで置換されていてもよいＤ−ＡｌａまたはＣ7-10アラルキル基で置換されていてもよいＤ−Ｈｉｓが挙げられる。
Ｒ3としては、さらに、Ｇｌｙ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｄ−Ｔｒｐ、３−メチル−Ｄ−Ｖａｌ、Ｄ−Ｓｅｒ、ｔ−ブトキシ−Ｄ−Ａｌａ、２−ナフチル−Ｄ−Ａｌａ、２−メチルインドリル−Ｄ−Ａｌａ、ベンジルイミダゾール−２−イル−Ｄ−Ａｌａ（＝Ｎim−ベンジル−Ｄ−Ｈｉｓ）が好ましい。
【００１５】
Ｒ4はＬｅｕ、ＩｌｅまたはＮｌｅを表わすが、なかでも、Ｌｅｕが好ましい。
Ｒ5で表わされる保護されたＡｒｇにおける保護基としては、例えば、アルコキシベンゼンスルホニル基、トリアルキルベンゼンスルホニル基等が挙げられる。
該アルコキシベンゼンスルホニル基としては、Ｃ1-6アルコキシで置換されたベンゼンスルホニル基が好ましく、例えば、ｐ−メトキシベンゼンスルホニル基、ｐ−エトキシベンゼンスルホニル基、ｐ−イソプロポキシベンゼンスルホニル基などが挙げられるが、特に好ましくはｐ−メトキシベンゼンスルホニル基である。
該トリアルキルベンゼンスルホニル基におけるアルキルとしては、同一または異なるＣ1-6アルキルが好ましい。該Ｃ1-6アルキルとしては、例えば、メチル、エチル、プロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｔ−ペンチルなどが挙げられる。トリアルキルはベンゼンスルホニル基におけるベンゼン環の置換可能な任意の位置に位置していてよいが、スルホニル基に対して２位、４位および６位に位置していることが特に好ましい。具体的には例えば、２,４,６−トリメチルベンゼンスルホニル基、２,４,６−トリエチルベンゼンスルホニル基、２,４,６−トリプロピルベンゼンスルホニル基、２,４,６−トリイソプロピルベンゼンスルホニル基、２,４,６−トリ−ｔ−ブチルベンゼンスルホニル基などが挙げられる。
【００１６】
Ｒ5で表わされる保護されたＡｒｇにおける保護基の好ましいものとしては、Ｃ1-6アルコキシ−ベンゼンスルホニル基が挙げられ、好ましく、なかでも、ｐ−メトキシベンゼンスルホニル基、ｐ−エトキシベンゼンスルホニル基、ｐ−プロポキシベンゼンスルホニル基、ｐ−イソプロポキシベンゼンスルホニル基等が好ましく、なかでも、ｐ−メトキシベンゼンスルホニル基が最も好ましい。
基Ｒ6中の基Ｒ7およびＲ8で表わされる水酸基を有していてもよいアルキル基におけるアルキル基としては、Ｃ1-4アルキル基が挙げられ、これらは置換可能な任意の位置に水酸基を有していてもよい。該Ｃ1-4アルキル基としては、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチルが挙げられ、最も好ましくはエチルである。
該水酸基を有していてもよいアルキル基の好ましいものとしては、例えば、ヒドロキシメチル、２−ヒドロキシエチル、３−ヒドロキシ−ｎ−プロピル、４−ヒドロキシ−ｎ−ブチル等が挙げられ、なかでも２−ヒドロキシエチルが最も好ましい。
Ｒ9で表わされる保護基としては、例えば、Ｃ1-6アルキル基（例、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル等）、Ｃ7-10アラルキル基（例、ベンジル、フェネチル）等が挙げられる。
Ｒ9で表わされる保護基としては、Ｃ1-3アルキルが好ましく、特に、エチルが好ましい。
【００１７】
本明細書において、アミノ酸およびペプチドは、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Commission on Biological Nomenclature による略記法および当該分野における慣用名により表示し、アミノ酸に関して光学異性体があり得る場合は、特に明記しなければＬ体を示すものとする。また、本明細書中、下記略語を用いる場合もある。Ｇｌｙ：グリシン
Ａｌａ：アラニン
Ｖａｌ：バリン
Ｌｅｕ：ロイシン
Ｉｌｅ：イソロイシン
Ｓｅｒ：セリン
Ｔｈｒ：スレオニン
Ａｒｇ：アルギニン
Ｐｈｅ：フェニールアラニン
Ｔｙｒ：チロシン
Ｈｉｓ：ヒスチジン
Ｔｒｐ：トリプトファン
Ｐｒｏ：プロリン
ＮＬｅ：ノルロイシン
ＮＶａ：ノルバリン
Ａｂｕ：２−アミノ酪酸
Ｐｈｇ：フェニルグリシン
α−Ａｉｂｕ：α−アミノイソ酪酸
ｐ−ＮＨ2−Ｐｈｅ：ｐ−アミノフェニルアラニン
【００１８】
Ｚ：ベンジルオキシカルボニル
Ｐｄ：パラジウム
Ｐｄ−Ｃ：パラジウム−炭素
Ｅt：エチル
ＡcＯＨ：酢酸
ＨＦ：フッ化水素
ＨＢr：臭化水素
ＤＣＨＡ：ジシクロヘキシルアミン
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＤＭＡ：ジメチルアセトアミド
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＭＳＡ：メタンスルフォン酸
ＭＢＳ：ｐ−メトキシベンゼンスルホニル
ＤＣＣ：Ｎ,Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＨＯＮＢ：Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２,３−ジカルボキシイミ
ド
ＨＯＳu：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
ＨＯＢt：１−ヒドロキシベンツトリアゾール
ＥＤＡ：エチル−３−（３−ジメチルアミノ）プロピルカルボジイミド
塩酸塩
ＮＰ：ｐ−ニトロフェニル
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
【００１９】
以下に、本願のペプチド(Ｉ)またはその塩の製造法について説明する。
ペプチド(Ｉ)またはその塩の製造には多くの合成経路が考えられ、また、個々の合成経路においては、アミノ基及びカルボキシル基の保護基、アミド結合の形成方法、該保護基の脱離方法、得られるペプチドの分離・精製方法などに関して、極めて多くの組み合わせが可能である。
その中で、〔図１〕に示す合成経路は、本願発明方法に係る製造法であり、ペプチド(Ｉ)を製造する好ましい方法である。本発明の製造法において特徴とするところは、(1)８位のＡｒｇのグアニジノ基を保護基で保護し、(2)鍵中間体として２つのペプチド（〔図１〕中のペプチド(II)およびペプチド(III)）を合成し、(3)それらの縮合で得られる前駆体ペプチド(Ｉ')を脱保護基反応に付すことにより８位Ａｒｇのグアニジノ基の保護基を脱離し、目的とするペプチド(Ｉ)またはその塩を得ることにある。
本発明のペプチドの塩としては、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、乳酸、グリコール酸、焦性ブドウ酸、蓚酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマール酸、酒石酸、クエン酸、ｐ−トルエンスルフォン酸、トリフルオロ酢酸、メタンスルホン酸などの有機酸や、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などの無機酸などとの塩が挙げられる。
【００２０】
１．ペプチド（ａ）の製造法：
〔図１〕に示される式Ｚ−Ｒ2−Ｒ3−ＯＲ9で表されるペプチド(ａ)は、例えば、「ペプチド合成の基礎と実験」泉屋信夫他（丸善株式会社）、ザ・ペプチド（The Peptides）Vol.１, ７６−１３６頁，Ebehard Schroeder and Klaus Luebke 著に記載された方法、あるいはこれと同様の方法で製造することができる。
【００２１】
２．ペプチド（ａ）→ペプチド（ｂ）の製造法：
〔図１〕に示される式Ｚ−Ｓｅｒ−Ｒ2−Ｒ3−ＯＲ9で表されるペプチド(ｂ)は、ペプチド(ａ)にＺ−Ｓｅｒを導入することにより製造される。
まず、ペプチド（ａ）を脱Ｚ化反応に付す。脱Ｚ化反応は、例えば、Ｐｄ，Ｐｄ−Ｃ等の触媒を用いる接触還元あるいはＨＢｒ／ＡｃＯＨ処理等の方法を用いることにより行うことができる。
該接触還元反応において用いられる溶媒としては、アルコール類（例、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−プロパノール、ｎ−ブタノール、ｔ−ブタノール等）、エーテル類（例、ＴＨＦ、ジオキサン等）、アミド類（例、、ＤＭＦ，ＤＭＡ等）が挙げられる。なかでも、ＤＭＦ，ＤＭＡまたはＴＨＦを用いると、次工程の縮合反応における濃縮等の操作を省略できるので、有利である。反応温度としては、約０〜５０℃、好ましくは約２０〜４０℃である。反応時間は、約３〜１５時間、好ましくは約５〜１０時間である。本反応は、常圧下において行うのが好ましい。
また、還元時に副生するジケトピペラジンを抑制するために、還元反応の前に酸を添加し、ペプチド（ａ）の脱Ｚ化されたペプチドをプロトネーション(protonation)反応に付すのが好ましい。該プロトネーションを行うためには、反応系に酸が添加される。該酸としては、無機酸、有機酸のいずれでもよく、例えば、塩酸、硫酸、ｐ−トルエンスルホン酸などが挙げられるが、とりわけｐ−トルエンスルホン酸が好ましい。酸の添加量としては、ペプチド（ａ）の脱Ｚ化されたペプチドに対して約０.８〜１.５倍（mole／mole）、好ましくは約１.０〜１．１倍（mole／mole）である。
ＨＢｒ／ＡｃＯＨ処理は、通常、無溶媒で、ペプチド（ａ）とＨＢｒとを飽和した酢酸とを混合することにより行われる。反応温度としては、約−１０〜３０℃、好ましくは、約１０〜２０℃である。反応時間は、約１０分〜２時間、好ましくは、約３０分〜１時間である。
反応生成物の分離は、例えば、反応液にエーテル、酢酸エチル等を加えて、生じた沈殿をろ取し、乾燥することにより行われる。
【００２２】
Ｚ−Ｓｅｒの導入方法としては、活性エステル法を適用し（即ち、Ｚ−Ｓｅｒ−ＯＨを活性エステル化し、これを反応に用いる）、反応温度を最適化することにより分子内での脱水反応を抑制することにより有利に行うことができる。
該活性エステルとしては、ペプチド合成において通常用いられるものであればいずれでもよく、例えば、活性エステル化剤（例、ＨＯＮＢ、ＨＯＳｕ、ＨＯＢｔ）とのエステルなどが挙げられるが、とりわけＨＯＮＢとのエステルが好ましい。Ｚ−Ｓｅｒ−ＯＨを活性エステル化するには、Ｚ−Ｓｅｒ−ＯＨと活性エステル化剤とを、溶媒〔例、エーテル類（例、ジエチルエーテル、イソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン等）、アミド類（例、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等）、アセトニトリル、エステル酸（例、蟻酸メチル、酢酸メチル、酢酸エチル等）〕に溶解し、温度約−５〜２０℃、好ましくは約０〜５℃で、約５〜１５時間、好ましくは約７〜１０時間反応させることにより行なわれる。
脱Ｚ化ペプチド（ａ）とＺ−Ｓｅｒ−ＯＨの活性エステルとの反応は、それ自体が反応しない溶媒の中で行われる。該溶媒としては、還元反応において用いられた溶媒を濃縮することなくそのまま用いることができるが、なかでも、アミド類（例、ＤＭＦ、ＤＭＡ等）などが好ましい。反応時の温度としては、低温が好ましく、約−１０〜１０℃、好ましくは約−５〜５℃である。反応時間は約５〜２０時間、好ましくは約７〜１２時間である。
【００２３】
３．ペプチド（ｂ）→ペプチド（ｃ）の製造法：
〔図１〕に示される式Ｚ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｒ2−Ｒ3−ＯＲ9で表されるペプチド(ｃ)は、ペプチド（ｂ）を脱Ｚ化して得られたペプチドとＺ−Ｔｒｐ−ＯＨとを縮合反応に付すことにより行われる。
ペプチド（ｂ）の脱Ｚ化は、Ｐｄ，Ｐｄ−Ｃ等の触媒を用いる接触還元、あるいはＨＢｒ／ＡｃＯＨ処理等の方法を用いることができる。
該Ｐｄ，Ｐｄ−Ｃ等の触媒を用いる接触還元、および、ＨＢｒ／ＡｃＯＨ処理は、上記のペプチド（ａ）→ペプチド（ｂ）の製造法において記載した方法と同様にして行うことができる。
【００２４】
ペプチド（ｂ）を脱Ｚ化して得られたペプチドにＺ−Ｔｒｐを導入するには、Ｚ−Ｔｒｐ−ＯＨを活性エステル化剤（例、ＨＯＮＢ、ＨＯＢｔ，ＨＯＳｕ等）と縮合剤（例、ＤＣＣ、ＥＤＡ等）とで活性エステル化物とし、これとペプチド（ｂ）とを反応させることにより、有利に行うことができる。また、Ｚ−Ｔｒｐ−ＯＨとペプチド（ｂ）とを活性エステル化剤の存在下に縮合剤を用いて縮合させることもできる。
該活性エステル化剤としては、とりわけ、ＨＯＮＢが好ましく、縮合剤としては、とりわけ、ＤＣＣが好ましい。
Ｚ−Ｔｒｐ−ＯＨを活性エステル化するには、上記と同様の方法で行うことができる。
Ｚ−Ｔｒｐ−ＯＨの活性エステル化物とペプチド（ｂ）とを縮合剤の存在下におこなう反応においては、反応温度としては、約０〜２０℃、好ましくは約５〜１０℃である。反応時間は約５〜２０時間、好ましくは約７〜１０時間である。
【００２５】
４．ペプチド（ｃ）およびペプチド（ｄ）→ペプチド（ｅ）の製造法：
式Ｚ−５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｒ1−ＯＨで表されるペプチド（ｄ）は、畑中らの方法〔武田研究所報、第３５巻、第１６頁（１９７６年）；バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Biochemical and Biophysical Research Communications）、第６０巻、第１３４５頁、（１９７４年）〕に記載の方法、あるいはこれらと同様の方法で製造することができる。
ペプチド（ｃ）とペプチド（ｄ）とを反応させて、式Ｚ−５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｒ1−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｒ2−Ｒ3−ＯＲ9で表されるペプチド（ｅ）を製造するには、ペプチド（ｃ）とペプチド（ｄ）とを縮合反応に付すことにより行うことができる。
該縮合反応においては、Ｒ1残基特にＨｉｓ残基の異性化に留意しなけばならないが、その方法としては、ペプチドのフラグメント縮合において、異性化を抑制する方法であればいずれも適用することができる。該異性化を抑制する方法としては、通常、縮合剤や、異性化を抑制する添加物が加えられる。該縮合剤としては、ＤＣＣ、ＥＤＡなどが挙げられる。該添加物としては、ＨＯＮＢ、ＨＯＳｕ、ＨＯＢｔ、ＨＯＳｕなどが挙げられる。該縮合剤と該添加物は、これらを自由に組み合わせて用いてよく、その組み合わせとしては、例えば、ＤＣＣ−ＨＯＮＢ、ＤＣＣ−ＨＯＳｕ、ＤＣＣ−ＨＯＢｔ、ＥＤＡ−ＨＯＳｕなどが挙げられるが、とりわけＤＣＣ−ＨＯＮＢの組み合わせが好ましい。異性化を抑制するための大きな要因の一つとして反応温度があるが、反応温度は約０〜２０℃、好ましくは約５〜１５℃である。反応時間は、約３０〜１００時間、好ましくは約５０〜８０時間である。
用いられる溶媒としては、例えば、アミド類（例、ＤＭＦ、ＤＭＡ），エーテル類（２−メチルピロリドン、ＴＨＦ，ジオキサン等）が挙げられる。
【００２６】
５．ペプチド（ｅ）→ペプチド（IV）の製造法：
式Ｚ−５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｒ1−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｒ2−Ｒ3−ＯＲ9で表されるペプチド（ｅ）を脱Ｚ化することにより、ペプチド（IV）を製造することができる。
ペプチド（ｅ）の脱Ｚ化は、Ｐｄ，Ｐｄ−Ｃ等の触媒を用いる接触還元、あるいはＨＢｒ／ＡｃＯＨ処理等の公知の方法により行なうことができる。
該Ｐｄ，Ｐｄ−Ｃ等の触媒を用いる接触還元においては、溶媒として、アミド類（例、ＤＭＦ、ＤＭＡ），エーテル類（２−メチルピロリドン、ＴＨＦ，ジオキサン等）、ｔ−ブタノールなどがが用いられる。反応温度は、約０〜５０℃、好ましくは、約２５〜４０℃である。反応時間は、約１〜１０時間、好ましくは約３〜６時間である。
ＨＢｒ／ＡｃＯＨ処理は、上記ペプチド（ａ）→ペプチド（ｂ）の製造において記載した方法と同様にして行うことができる。
【００２７】
６．ペプチド（IV）→ペプチド（II）の製造法
ペプチド(IV)を加水分解反応に付し、ついで、所望により、反応液を中和することにより、ペプチド（II）を製造することができる。
該加水分解反応は、アルカリの存在下で、水中において、低温で行うことが好ましい。必要により、水とアルコールとの混液中で行うこともできる。該アルコール類としては、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、ｎ−ブチルアルコール等があげられるが、水−アルコール類の混液中でのアルコール類の混在量は、約１〜３０％（V/V)、好ましくは約１〜１０％（V/V)である。アルコールの量的割合が多くなる程、加水分解の反応速度が遅くなり、一方で、２位Ｒ1および４位Ｓｅｒの異性化が有意に増加する（Ｒ1がＨｉｓの場合）。これらの異性体はカラムクロマトグラフィー等による精製においても効果的に除去することが困難であり、本発明の目的化合物〔ペプチド(Ｉ)〕の品質を低下させる要因となる。
【００２８】
反応溶媒中には、前工程において用いられたＤＭＦ、ＴＨＦ等の溶媒が含まれていてもよいが、これら溶媒の含量は反応速度を著しく低下させない程度、即ち約１〜２０％（V/V）、さらに好ましくは、約５〜１０％（V/V）が好ましい。
該加水分解反応は、アルカリの存在下で行われる。該アルカリとしては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウムなどが挙げられる。加水分解反応速度並びに２位Ｈｉｓおよび４位のＳｅｒの異性化は、用いるアルカリの量および反応液中での濃度によって大きな影響を受ける。そこで、アルカリの量は、ペプチド(IV)の約２.５〜５倍mole/mole、好ましくは、約３〜４倍mole/moleが用いられる。特に、反応液中での初期アルカリ濃度としては、好ましくは約０.０５〜０.３mole/literで、さらに好ましくは約０.１〜０.２mole/literである。
該反応温度は、後処理、即ち、中和が完了するまでは約−１０〜１０℃、好ましくは、約−５℃〜５℃に維持する。均一な反応温度を維持するために、反応液を、攪拌することが好ましい。該反応は、通常約１.５〜３時間で終了する。
好ましくない異性化を最小限に抑制するために、反応終了後直ちに低温下において中和処理を行うことが望ましい。該中和処理の温度は、約−５〜５℃、好ましくは約−２〜２℃である。該中和処理は、反応液に酸（例、塩酸、硫酸など）を加えることにより行われる。
【００２９】
ペプチド(II)は、次に示す方法により結晶化することができる。
すなわち、前述したペプチド(IV)の加水分解液を中和する際に析出するゲル状物を、加熱溶解し、ついで徐冷して、ペプチド(II)を晶出させる。
該加熱溶解は、約６０〜８０℃、このましくは、約６５〜７５℃で撹拌下に行うのが好ましい。
該徐冷の際には種晶を加えることによって晶出が容易になる。該種晶の添加時期は、種晶が溶解せず、加熱溶解液が再びゲル状に変化しない温度範囲であればいつでもよいが、好ましくは加熱溶解液が約３５〜４５℃の時点である。該徐冷は、約１〜３時間を要して、約１５〜３０℃となるようにする。
【００３０】
晶出を完成させるために、さらに、熟成を行うのが好ましい。物性的に優れたペプチド（II）の結晶を収率よく得るためには、熟成時間として、通常約３０〜１５０時間を必要とするが、好ましくは約６０〜１００時間である。
熟成温度は約１０〜３５℃、好ましくは約１０〜３０℃であるが、より好ましくは約１５〜２５℃である。
熟成を開始する時点におけるペプチド(II)の溶液の濃度を、約０.０１〜０.０５mole/liter、好ましくは約０.０２〜０.０４mole/literとすると、晶出に好都合である。
【００３１】
熟成時においては、晶出時間の短縮、収率の確保を図るために、ペプチド(II)含有液を断続的に攪拌することが好ましい。該撹拌としては、例えば熟成の全工程の時間の開始から２／３までは、５時間毎に１分間約３０〜３５ｒｐｍで撹拌し、２／３の工程から最後までは、０.５時間毎に１分間約３０〜３５ｒｐｍで撹拌するのが好ましい。
具体的には例えば、熟成時間が６０時間の場合、晶出開始時より４０時間までは５時間毎に１分間３３ｒｐｍで撹拌し、４０時間後は０.５時間毎に１分間３３ｒｐｍで撹拌するのが好ましい。
上記したペプチド（II）の結晶化法により、ペプチド（c）→ペプチド（e）の縮合反応時及びペプチド(IV)→ペプチド（II）の加水分解反応時に副生するＨｉｓ異性体、ペプチド(IV)→ペプチド（II）の加水分解反応時に副生するＳｅｒ異性体などの最終製品の品質を左右する混在物の繁雑な除去操作、並びにペプチド(IV)の単離操作の省略が可能となる。
このようにして得られたペプチド（II）の結晶は、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｃａ、Ｂａなどのアルカリ金属との塩、トリエチルアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミンなどとの塩として得られる。
【００３２】
７．ペプチド（III）の製造法：
ペプチド（III）またはその塩の製造は、例えば 藤野らの方法〔M.Fujinoら：アーカイブス・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス（Archives of Biochemistry and Biophysics, 154, 488(1973)；ケミカル・アンド・ファーマシューティカル・ブレティン（Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 23, 229 (1975)〕 に記載の方法またはそれと同様の方法によって製造することができる。
ペプチド（III）は塩酸、臭化水素酸、硫酸、ｐ−トルエンスルフォン酸、トリフルオロ酢酸、メタンスルフォン酸などとの塩として、結晶化等の通常の手段により分離・採取して、あるいは溶液状態のまま次工程で用いることもできる。溶液状態のまま次工程で用いる場合には、アミド結合形成反応に先立って、塩基による中和あるいはイオン交換樹脂などによる塩基の除去などが必要になる。
【００３３】
８．ペプチド(II)およびペプチド(III)→(Ｉ')の製造法：
ペプチド（II）とペプチド（III）とから、縮合反応によって、ペプチド(Ｉ')を製造する方法は、反応に悪影響を及ぼさない溶媒中で行われる。該反応に悪影響を及ぼさない溶媒としては、例えば、ＤＭＦ、ＤＭＡ、Ｎ−メチルピロリドン、ジクロルメタン、ジクロロエタン、ＴＨＦ、ジオキサンなどが挙げられ、これらの溶媒は、適宜混合して用いることもできる。該溶媒としては、好ましくはジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミドである。
ペプチド（III）の使用量は、ペプチド（II）に対して約０.５ないし２モル当量、好ましくは約１ないし１.５モル当量である。
反応温度は、通常約０〜４０℃、好ましくは約５〜２５℃である。なお、反応温度がこれからはずれると、Ｒ3の異性化（ラセミ化）が起こりやすくなり、不都合である。反応時間は、通常約３０〜６０時間、好ましくは約４０〜５０時間である。
該縮合反応においては、Ｒ3残基の異性化に留意しなけばならないが、その方法としては、ペプチドのフラグメント縮合において、異性化を抑制する方法であればいずれも適用することができる。該異性化を抑制する方法としては、通常、縮合剤や、異性化を抑制する添加物が加えられる。該縮合剤としては、ＤＣＣ、ＥＤＡなどが挙げられる。該添加物としては、ＨＯＮＢ、ＨＯＳｕ、ＨＯＢｔなどが挙げられる。該縮合剤と該添加物は、これらを自由に組み合わせて用いてよく、その組み合わせとしては、例えば、ＤＣＣ−ＨＯＮＢ、ＤＣＣ−ＨＯＳｕ、ＤＣＣ−ＨＯＢｔ、ＥＤＡ−ＨＯＳｕなどが挙げられるが、とりわけＤＣＣ−ＨＯＮＢの組み合わせが好ましい。
縮合剤は、ペプチド(II)に対して、約１〜３倍（mole/mole）、好ましくは、約１〜２倍（mole/mole）の量が用いられる。添加物は、ペプチド(II)に対し、約１〜４倍（mole/mole）、好ましくは約１.５〜２.５倍（mole/mole）が用いられる。また、ペプチド(II)の反応溶媒中での初期濃度は、約０.０５〜０.２mole/L、好ましくは、約０.０８〜１.５mole/Lである。ペプチド(III)は、ペプチド(II)に対し、約０.８〜２倍（mole/mole）、好ましくは約１〜１.３倍（mole/mole）である。
【００３４】
９．ペプチド(Ｉ')→ペプチド（Ｉ）の製造法：
ペプチド(Ｉ')のＡｒｇ残基の保護基を脱離し、ペプチド(Ｉ)を得る脱保護反応は、例えば,ペプチド(Ｉ')を、反応に悪影響を及ぼさない溶媒中または無溶媒下で、酸で処理することにより行われる。
該反応に悪影響を及ぼさない溶媒としては、例えば、ジクロルメタン、ジクロルエタン、ジオキサン、トリフルオロ酢酸などが挙げられ、これらの溶媒は、適宜混合して用いることもできる。
該脱保護反応において、用いられる酸としては、例えば、Ｃ1-6アルキルスルホン酸（例、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸など）、ハロゲノスルホン酸（例、クロルスルホン酸、フルオロスルホン酸、ブロモスルホン酸）、ルイス酸（例、ボロン・トリス・トリフルオロアセテートなど）などが挙げられ、なかでもＣ1-6アルキルスルホン酸が好ましい。さらに好ましくはＣ1-3アルキルスルホン酸であり、メタンスルホン酸が特に好ましい。
該脱保護反応において、処理に用いられる酸の使用量は、ペプチド(Ｉ')に対し、約５〜２５（W/W）倍、好ましくは約１０〜２０（W/W）倍である。
該脱保護反応における反応温度は、通常約０〜２０℃、好ましくは約５〜１５℃である。反応時間は、通常約２〜８時間、好ましくは約４〜６時間である。
該脱保護反応は、好ましくは、無溶媒下で、メタンスルホン酸を用いて行われる。
また、該脱保護反応の際、ラジカル捕捉剤（ラジカルスカベンジャー）（例、フェノール、アニソールなど）または酸化防止剤（例、チオグリコール酸など）を適宜添加して用いてもよい。これらの使用量は、上記反応生成物に対し、それぞれ約０.８〜２.０（W/W）倍、約０.０５〜２.０（W/W）倍である。
【００３５】
脱保護反応をＣ1-6アルキルスルホン酸を用いて行う場合、反応液から該アルキルスルホン酸を除去する方法としては、例えば反応液をエーテル類で洗浄し、洗浄液に水を溶解し、溶解液をアニオン交換樹脂カラムに付す方法が挙げられる。しかしながら、この方法を工業的に用いる場合、Ｃ1-6アルキルスルホン酸のエーテル類に対する溶解度が低いため、エーテル類の大量使用が避けられず、危険性を伴うため、大量のアルキルスルホン酸を水と混合する際及びイオン交換樹脂カラムに付す際の急激な発熱による危険性、およびその発熱による目的ペプチドの分解などの問題により、工業的方法としては、設備的にも、操作性、安全性の観点からも実用的ではない。
従って、これらの問題がなく工業的に有利な方法としては、例えば、塩基性水溶液を用いる直接的な中和による、反応液から該アルキルスルホン酸を除去する方法が挙げられる。しかし、大量の強酸を中和する本中和反応においては、大量処理が可能である一方、当然激しい中和熱の発生が予想され、大量に発生する中和液の処理という問題に加え、塩基性水溶液中での目的ペプチドにおけるペプチド結合の開裂、アミノ酸残基の異性化など目的化合物の品質に及ぼす悪影響が当初予想され、ペプチド化合物の常識的な取扱いの範囲を越えたものであると考えられた。
【００３６】
しかしながら、本願発明者らは、本中和反応における中和熱の吸収方法、操作方法等を鋭意検討、反応条件の最適化を行った結果、予想外にも、品質的に満足できる目的化合物が高収率で得られることを見出し、本中和反応方法の工業的処理方法を確立するに至った。即ち、本願発明における製造法においては、冷却された無機または有機塩基の水溶液に低温を維持しながら反応液を滴下して、過剰の塩基をアルキルスルホン酸で中和すれば、目的ペプチドにおける構成アミノ酸残基の異性化を抑制しつつ、目的化合物を固体または油状物として分離回収できる。
該無機塩基としては水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウムなどが、また、該有機塩基としてはピリジン、トリエチルアミンなどが用いられるが、炭酸カリウムがとりわけ好ましい。塩基として炭酸塩を用いる場合は、炭酸ガス発生に伴う発泡が著しいが、酢酸エチル、ベンゼン等の有機溶媒を適量混在させてこれを防ぐことができる。無機又は有機塩基の必要量は、アルキルスルホン酸を中和するのに十分な量があれば目的を達成することが出来るが、好ましくはアルキルスルホン酸に対し、約１〜１.３倍当量を用いる。
【００３７】
該中和反応時の液温は、アミノ酸残基の異性化あるいはペプチド鎖の加水分解などを抑制するために、また、無機塩基または有機塩基の水溶液の氷結を防ぐために、約−１５℃〜１５℃、好ましくは、約−５℃〜５℃に維持することが好ましい。
該中和反応後、目的化合物は、通常、中和液から固体もしくは油状物として分離するので、濾過あるいは分液など公知の方法で適宜分離回収することができる。
該中和反応後、分離回収された目的化合物は、所望により自体公知の方法により、分離・精製操作を行うことができる。比較的少量の目的化合物を精製する場合には、クロマトグラィーなどの手段を用いればよく、大量の目的化合物を精製する場合には、その化合物特有のイオン的性質、極性などの溶液物性、芳香族性、分子量などを利用して、例えばカラムクロマトグラフィー（例、液体カラムクロマトグラフィー、好ましくは、高速液体カラムクロマトグラフィー）を数種組み合わせる手段を用いればよい。
分離・回収法としては、上記の反応液において分離した遊離体の油状物をカラムクロマトグラフィーで精製することが好ましい。
【００３８】
工業的観点から好ましい分離・精製手段としては、例えばアンバーライトＸＡＤ−２(Ｒohm ＆ Ｈass CO，USA(ローム・アンド・ハース社；米国))、ダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化学；日本）などのハイポーラス樹脂、カルボキシメチルセルロース(ＣＭＣ、ＣＭ−２３(ワットマン；米国))、アンバーライトＣＧ−５０(Ｒohm ＆ Ｈass CO，USA(ローム・アンド・ハース社；米国))などのイオン交換樹脂、セファデックスＬＨ−２０（ファルマシアファインケミカルズ；スウェーデン）などの分子篩樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーを適宜組み合わせる手段が挙げられる。該手段は、操作的に単純で、安全性に優れ、収率・品質面で再現性が得られ、経済的にも有利である。
カラムクロマトグラフィーの組み合わせとしては、例えば以下に詳述するダイヤイオンＨＰ−２０（前述）（第１回目）→ ＣＭ−２３（前述）→ ダイヤイオンＨＰ−２０（第２回目）→ セファデックスＬＨ−２０（前述）の順の組み合わせが挙げられる。
ペプチド含有水溶液は、一般に、濃縮時に激しい発泡を伴うために、濃縮を必要とする場合には凍結乾燥機などの特殊な装置や消泡剤の添加等が必要となる。上記カラムクロマトグラフィーの組み合わせは、各カラムクロマトグラフィーで得られる有効画分の濃縮、特にＣＭ−２３で得られる大量の有効画分水溶液の濃縮操作の省略を可能にしたものであり、操作性、経済性の観点から有利であるばかりでなく、濃縮に伴うペプチドの分解を抑えて品質の向上にも寄与している。
【００３９】
ダイヤイオンＨＰ−２０（第１回目）カラムクロマトグラフィーは、脱保護反応後の反応液から分離した粗目的化合物を含む固体あるいは油状物中に混在する無機物、保護基脱離時に添加するラジカルスキャベンジャーおよびその反応生成物、必要に応じて用いられる酸化防止剤および少量混在する目的化合物の異性体などを除くのが主目的である。ダイヤイオンＨＰ−２０（第１）カラムクロマトグラフィーにおいて、ダイヤイオンＨＰ−２０の量は目的化合物に対して２０〜４０倍（V／W）、好ましくは２５〜３５倍が用いられる。目的化合物及び夾雑物の溶出は通常、アセトン、メタノール、エタノールの水溶液で行うが、エタノールを用いる場合の具体的な精製法を例示する。先ず最初に、目的化合物を含む水溶液をダイヤイオンＨＰ−２０のカラムに付し、カラムを設定量の、pＨを酢酸で５〜７に調節した酢酸ナトリウム水、酢酸アンモニウム水、１０％エタノール（V/V）で順次洗浄して類縁物質を溶出後、１５％エタノール（V/V）、３５％エタノール（V/V）で目的化合物を順次溶出し、予め設定した所望の画分を集める。
ＣＭ−２３カラムクロマトグラフィーは、目的化合物とイオン的に異なる副生物の除去が主目的であるが、ＣＭ−２３の量は、通常、目的化合物に対して約３５〜６０倍（V/W）、好ましくは約４０〜５５倍（V/W）が用いられる。ダイヤイオンＨＰ−２０（第１回目）カラムクロマトグラフィーで溶出された所望の画分からエタノールを留去した溶液をＣＭ−２３のカラムに付し、水洗後、目的化合物を０.０１５モル酢酸アンモニウム水、０.０３モル酢酸アンモニウム水で順次溶出し、予め設定した所望の画分を集める。
【００４０】
ダイヤイオンＨＰ−２０（第２回目）カラムクロマトグラフィーは、ＣＭ−２３カラムクロマトグラフィーの溶出に用いる酢酸アンモニウムの除去と大量の溶出液の濃縮が主目的である。ダイヤイオンＨＰ−２０（第２）カラムへはＣＭ−２３カラムクロマトグラフィーで得られた所望の画分（濃縮時に発泡を伴う大量の水溶液）を濃縮操作の必要なく付すことができる。ダイヤイオンＨＰ−２０（第２回目）カラムは pＨを酢酸で５〜７に調節した酢酸ナトリウム水、酢酸アンモニウム水、水で順次洗浄する。ついで１５％エタノール（V/V）、３５％エタノール（V/V）で目的化合物を順次溶出し、予め設定した所望の画分を集める。ダイヤイオンＨＰ−２０（第２）カラムの所望画分（ＣＭ−２３カラムの所望画分の約３分の１に濃縮されている）を減圧下に濃縮し、濃縮液をセファデックスＬＨ−２０カラムに付す。
セファデックスＬＨ−２０カラムクロマトグラフィーは、発熱性物質、無機物、その他の微量混在物の除去を目的としている。セファデックスＬＨ−２０は目的化合物の２０〜６０倍（V/W）、好ましくは３０〜５０倍（V/W）が用いられる。ＬＨ−２０カラムは０.００５Ｎ酢酸水で展開し、所望の画分を集める。所望画分は必要に応じて、濃縮、活性炭処理、膜濾過を行ったのち凍結乾燥することにより、目的化合物（酢酸塩）を得ることができる。
【００４１】
このようにして得られたペプチド（Ｉ）は、ＬＨ−ＲＨアゴニスト作用を有し、例えば、特開昭５０−５９３７０号公報（米国特許第４,００８,２０９号公報に対応）等に記載の方法で使用することができる。
【００４２】
【実施例】
つぎに、参考例および実施例を挙げて、本発明をより詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４３】
参考例１．Ｚ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＥｔの製造：
Ｚ−Ｔｙｒ−ＯＨ・ＤＣＨＡ ５８.８ｇを酢酸エチル約３００ml、０〜１０℃で１規定硫酸を用いて脱塩した。有機層を分離し、無水芒硝で乾燥した。無水芒硝をろ去し、ろ液にＤ−Ｌｅｕ−ＯＥｔ ２４.３ｇ、トリエチルアミン１２.６ｇ、ＤＣＣ ２６.８ｇを加え、約５℃で約２時間、約１０℃で５時間攪拌した。反応液に１規定塩酸６０mlを加えてろ過した。ろ液を分液し、有機層を食塩水、重曹水で洗浄した後に酢酸エチルを留去した。残渣にイソプロピルエーテルを加え、析出した結晶をろ取し、酢酸エチル−イソプロピルエーテルから再結晶し、乾燥し、標記ペプチドを得た。
収量：４１.６ｇ（７７％）。
融点：１１６〜１１８℃。
比旋光度〔α〕D 25＝−３.４°（ｃ＝１，ＤＭＦ）。
【００４４】
参考例２．Ｚ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＥｔの製造：
Ｚ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＥｔ ４０.５ｇ、ｐ−トルエンスルホン酸・１水和物１６.９ｇをＤＭＦ約３００mlに溶解して、５％Ｐｄ−Ｃを約５ｇの存在下で２０〜３５℃で水添し、反応終了後触媒をろ去した。
別途、Ｚ−Ｓｅｒ−ＯＨ ２３.３ｇ、ＨＯＮＢ １９.２ｇをＤＭＦ ３００mlに溶かし、ＤＣＣ ２２.１ｇを加えて、０〜５℃で約７時間攪拌し、これに先の還元反応液を加えた。混合液を約０℃に冷却し、トリエチルアミン９ｇを滴下した後、−５〜５℃で約１０時間攪拌、室温で一夜放置した。
析出結晶をろ去し、ろ液を減圧濃縮し、濃縮残渣を酢酸エチルに溶解した。酢酸エチル溶液を１規定塩酸、食塩水、重曹水で洗浄した後、無水芒硝で乾燥した。芒硝をろ去し、ろ液を減圧濃縮し、濃縮残渣にイソプロピルエーテルを加え、析出した結晶をろ取し、粗結晶を酢酸エチルから再結晶し、乾燥し、標記ペプチドを得た。
収量：３７.６ｇ（７７％）。
融点：１３４〜１３６℃。
比旋光度〔α〕D 25＝−４.８°（ｃ＝１，ＤＭＦ）。
【００４５】
参考例３．Ｚ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＥｔ（ＺＴＳＴＬＥ）の製造：
Ｚ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＥｔ ３６.２ｇをＤＭＦ ３００mlに溶解して５％Ｐｄ−Ｃ約５ｇの存在下で２５〜３５℃で水素添加し、反応終了後触媒をろ去した。
別途、Ｚ−Ｔｒｐ−ＯＨ ２１.４ｇ、ＨＯＮＢ １１.９ｇ、をＤＭＦ約３００mlに溶かし、ＤＣＣ １３.７ｇを加え、５〜１０℃で約７時間攪拌し、これに先の還元反応液を加えた。混合液を１０〜１５℃約７時間攪拌し、室温で一夜放置した。
析出結晶をろ去し、ろ液を減圧濃縮し、濃縮残渣を酢酸エチルに溶解した。酢酸エチル溶液を１規定塩酸、食塩水、重曹水で洗浄した後、無水芒硝で乾燥した。芒硝をろ去し、ろ液を減圧濃縮し、濃縮残渣にイソプロピルエーテルを加え、析出した結晶をろ取し、粗結晶を酢酸エチル−イソプロピルエーテルから再結晶し、乾燥し、標記ペプチドを得た。
収量：４１.３ｇ（８５％）。
比旋光度〔α〕D 25＝−１０.０°（ｃ＝１，ＥtＯＨ）。
【００４６】
参考例４．Ｚ−５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＥｔの製造：
Ｚ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＥｔ（ＺＴＳＴＬＥ）５５.７ｇをＤＭＦ約３５０mlに溶解して５％Ｐd−Ｃ（wet）約１２ｇの存在下、約３０℃で水添し、反応終了後触媒をろ去した。
ろ液にＺ−５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−ＯＨ・１.５Ｈ2Ｏ ３２.６ｇとＨＯＮＢ ２７.４ｇを加えて溶解した。溶解液を２〜８℃に冷却してＤＣＣ ２０.５ｇを加え、約８℃で約６０時間攪拌した。
反応液を約４０℃で約２時間攪拌後、不溶物をろ去し、ろ液を減圧濃縮した。濃縮液に酢酸エチル約１Ｌを約６０℃で加えた後、２０〜２５℃で攪拌した。析出した結晶をろ取し、得られた粗結晶をＤＭＦ約２３０mlと酢酸エチル約５３０mlの混液中で懸濁攪拌した後、ろ取した。得られた標記ペプチドの精結晶（ＺＰＧＬＥ）は乾燥することなしに、次工程の還元反応に供した。
【００４７】
参考例５．５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＥｔの製造：
参考例４で得られたＺＰＧＬＥをＤＭＦ約９００mlに溶解し、５％Ｐd−Ｃ（wet）１５ｇの存在下、約３０℃で水添し、反応終了後触媒をろ去した。標記ペプチドを含有するろ液を約１８０mlまで濃縮して，次工程の加水分解反応に供した。
【００４８】
参考例６．Ｚ−Ｌｅｕ−ＯＮＰの製造：
Ｚ−Ｌｅｕ−ＯＨ １２５ｇおよびｐ−ニトロフェノール６５.５ｇを酢酸エチル１.２Ｌに溶解し、０〜５℃でＤＣＣ １０７ｇの酢酸エチル溶液を滴下し、１０〜２５℃で攪拌した。反応終了後、析出結晶をろ去し、ろ液を減圧濃縮した。濃縮残渣をエタノールに溶解し、晶出した結晶をろ取し、真空乾燥し，標記ペプチドを得た。
収量：１４２ｇ（７８％）。
融点：９２〜９４℃。
比旋光度〔α〕D 25＝−４２.５°（ｃ＝１，ＣＨ3ＯＨ）。
【００４９】
参考例７．Ｚ−Ａｒｇ(ＭＢＳ)−Ｐｒｏ−ＮＨＣ2Ｈ5の製造：
Ｚ−Ａｒg(ＭＢＳ)ＯＨ・ＤＣＨＡ ３４.１ｇを酢酸エチル４００mlに懸濁し、０〜１０℃で１規定硫酸５７mlを加え、攪拌、分液し、有機層を芒硝水で洗浄し、減圧濃縮した。一方、Ｚ−Ｐｒｏ−ＮＨＣ2Ｈ5 １５.７ｇをジメチルアセトアミド３０mlに溶解し、５％Ｐd−Ｃ ２.３ｇの存在下で水添し、反応終了後触媒をろ去した。ろ液でＺ−Ａｒｇ(ＭＢＳ)ＯＨを含んだ濃縮残渣、ＨＯＮＢ ９.４ｇを溶解した。これにＤＣＣ １２.８ｇのジメチルアセトアミド溶液を滴下して、１０〜２０℃で攪拌した。反応終了後析出した結晶をろ去し、ろ液を減圧濃縮した。濃縮液を酢酸エチル４５０mlに溶解し、１規定塩酸、食塩水、重曹水で洗浄した後、酢酸エチルを減圧で留去した。濃縮残渣を酢酸エチルとエタノールの混液で処理して粗結晶を得、これをエタノールから再結晶し、真空乾燥し，標記ペプチドを得た。
収量：２２.４ｇ（７２％）。
比旋光度〔α〕D 25＝−３３.０°（ｃ＝１，ＣＨ3ＯＨ）。
【００５０】
参考例８．Ｚ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ(ＭＢＳ)−ＰｒｏＮＨＣ2Ｈ5(ＺＬＡＰ）の製造：
Ｚ−Ａｒｇ(ＭＢＳ)−ＰｒｏＮＨＣ2Ｈ5 ２０.３ｇ及びｐ−トルエンスルホン酸・一水和物６.４ｇをＤＭＦ １６０mlに溶解し、５％Ｐｄ−Ｃ ２.３ｇの存在下で水添し、反応終了後触媒をろ去した。ろ液にトリエチルアミン３.４ｇを冷却下に加え、これにＺ−Ｌｅｕ−ＯＮＰ １３.６ｇを加えて１０〜１５℃で攪拌した。反応終了後減圧濃縮し、濃縮残渣を酢酸エチル１２０mlに溶解し、希塩酸、重曹、水で順次洗浄した。酢酸エチルを留去し、濃縮残渣をシリカゲルカラムに付し、カラムを酢酸エチル−イソプロピルエーテルの混液（１：１）、酢酸エチル−メタノールの混液（３：２）で順次展開し、有効画分を集めて減圧濃縮した。濃縮残渣を酢酸エチルに溶解し、イソプロピルエーテルを加えて、生じた沈殿をろ取し、真空乾燥し、標記ペプチドを得た。
収量：２２.２ｇ（９２％）。
比旋光度〔α〕D 25＝−３９.０°（ｃ＝１，ＣＨ3ＣＨ2ＯＨ）。
【００５１】
実施例１．５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＨ（ＰＧＬＯＨ）の製造：
参考例５で得られた濃縮液に、水酸化ナトリウム８.３ｇを水１Ｌに溶解した液を−３〜０℃で滴下し、約０℃で約２時間攪拌した。反応終了を確認後、１規定塩酸２１０mlを約０℃で滴下して中和し、結晶を析出させた。析出した結晶を加熱溶解し、加熱下に活性炭１.５ｇを加えて攪拌後、活性炭をろ去した。ろ液を徐冷し、１５〜２５℃で３５時間攪拌した。晶出結晶をろ取し、約６０℃で真空乾燥し、標記ペプチドを得た。
収量：３９.９ｇ（５９.２％、参考例３のＺＴＳＴＬＥ基準）。
比旋光度〔α〕D 25＝−２１.５°（ｃ＝０.５，ＤＭＦ）。
なお、本溶媒系での２０℃での反応における１時間後の２位Ｈｉｓおよび４位Ｓｅｒにおける好ましくない異性化は、それぞれ１.３％、４.８％であるのに対し、０℃での反応ではそれぞれ０.２％, ０.４４％であった。
また、本発明方法による結晶化法は、諸々の類縁物質を効果的に除去するが、最も注目すべき類縁物質であるＨｉｓ異性体及びＳｅｒ異性体に焦点を当ててその除去効果の一例を〔表１〕に示す。
【００５２】
【表１】
【００５３】
実施例２．５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＨ（ＰＧＬＯＨ）の結晶の製造：
参考例５で得られた濃縮液に、水酸化ナトリウム８.３ｇを水１Ｌに溶解した液を０〜３℃で滴下し、約０℃で約２時間攪拌した。反応終了を確認後、１規定塩酸２１０mlを約０℃で滴下して中和し、結晶を析出させた。析出した結晶を加熱溶解し、加熱下に活性炭１.５ｇを加えて攪拌後、活性炭をろ去した。ろ液を徐冷し、１８〜２２℃で８０時間熟成した。晶出結晶をろ取し、約６０℃で真空乾燥し、標記ペプチドを得た。
収量：４２.９ｇ（６３.６％、参考例３のＺＴＳＴＬＥ基準）。
比旋光度〔α〕D 25＝−２１.８°（ｃ＝０.５，ＤＭＦ）。
【００５４】
実施例３．５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ(ＭＢＳ)−ＰｒｏＮＨＣ2H5 (ＭＢＳＴＡＰと略する) の製造：
ＺＬＡＰ ３５.６ｇをＤＭＦ ３５０mlに溶解し、５％Ｐｄ−Ｃ ７.３ｇの存在下で水添し、反応終了後触媒をろ去した。ろ液にＰＧＬＯＨ ３６.９ｇとＨＯＮＢ １６.２ｇを加えて溶解し、４〜８℃でＤＣＣ １４ｇのＤＭＦ溶液を滴下し、約８℃で１５時間、約２０℃で約３０時間攪拌した。反応終了後析出した結晶をろ去し、ろ液を減圧濃縮した。濃縮残渣をエタノール約２００mlに溶解し、これに酢酸エチル約２.３Ｌを加えて、生じた結晶性固体をろ取した。粗体をエタノール約２２０mlに溶解し、これに酢酸エチル約９００mlを加え、生じた固体をろ取し、ジクロルメタンで洗浄してＭＢＳＴＡＰの湿体を得た。乾燥操作を省略して次工程の脱ＭＢＳ反応に供した。ＨＰＬＣで定量し、ＭＢＳＴＡＰが５１.１ｇ（８２％）得られていることを確認した。
【００５５】
実施例４．５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＰｒｏＮＨＣ2Ｈ5・ＣＨ3 ＣＯＯＨ(ＴＡＰ−１４４と略する) の製造：
(1)脱ＭＢＳ化：
フェノール６０ｇをメタンスルホン酸８００ｇに溶解し、冷却下に、実施例１０で得られたＭＢＳＴＡＰの湿体（ＭＢＳＴＡＰ ５１.１ｇ相当）を加え、約１０℃で５時間攪拌した。
別途、水２Ｌに炭酸カリウム６９０ｇを溶解し、酢酸エチル約４００mlを混ぜて、−２〜０℃に冷却したアルカリ液を調製した。アルカリ液に脱ＭＢＳ反応液を約０℃を保ちながら滴下した。滴下後分液し、上層（油状物と酢酸エチル層）に pＨ４緩衝液（約０.１規定酢酸ナトリウム約３Ｌと酢酸約５８mlの混液）を加えて油状物を溶解、分液し、水層を酢酸エチルで洗浄した。
水層に２０％（w/w）炭酸カリウム溶液を加えて ｐＨを約６とし、析出した油状物を取り除き、ＴＡＰ−１４４を含有する水溶液を得た。
【００５６】
(2)粗ＴＡＰ−１４４の精製：
ＤＡＩＡＩＯＮ・ＨＰ−２０（商品名）のカラム（約１.２Ｌ）に、上記(1)項で得たＴＡＰ−１４４を含有する水溶液を通液した。通液後、０.３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（酢酸で pＨ６.２に調節）約２.５Ｌ、０.０２５Ｍ酢酸アンモニウム水約３Ｌ、１０％エタノール４.３Ｌで順次洗浄した。次に１５％エタノール９.５Ｌ、３５％エタノール９.５Ｌを通液し、有効画分を集め、エタノールを減圧留去した。（Ｓ１−ＴＡＰ）
ここで得られたＳ１−ＴＡＰをＣＭ−２３（商品名）のカラム（約１.７Ｌ）に通液し、水２Ｌで洗浄後、０.０１５Ｍ酢酸アンモニウム水１５Ｌ、次に０.０３Ｍ酢酸アンモニウム水１５Ｌで目的化合物を溶出するカラムクロマトグラフィーを行い、有効画分を集めた（Ｓ２−ＴＡＰ）。
Ｓ２−ＴＡＰをＤＡＩＡＩＯＮ・ＨＰ−２０（商品名）のカラム（約０.７Ｌ）に通液し、０.３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（酢酸で pＨ６.２に調節）約２.１Ｌ、０.０１Ｍ酢酸アンモニウム水３.２Ｌ、水０.７Ｌで順次洗浄した後、１５％エタノール４.３Ｌ、３５％エタノール５.４Ｌで溶出するカラムクロマトグラフィーを行い、有効画分を集めて約２００mlに減圧濃縮した。濃縮液を Sephadex ＬＨ−２０（商品名）カラム（約１０Ｌ）に付し、０.００５Ｎ酢酸水で展開し、有効画分を集めた。有効画分を活性炭処理、限外ろ過、濃縮、凍結乾燥を行ってＴＡＰ−１４４を３１.８ｇ（収率：６７.６％）得た。
含量：９９.８％（ＨＰＬＣ，内標基準）。
旋光度〔α〕D 20＝−３９.０°（ｃ＝１，１％酢酸）。
吸光度：５７（２８１nm）、５５（２８９nm）。
【００５７】
【発明の効果】
本発明の製造法によれば、i）加水分解反応時の２位 His および４位 Ser の異性化を最小限に抑制される、ii）ペプチド（II）が物性的に優れた結晶として得られ、縮合時及び加水分解時に副生する異性体の除去が可能である、iii）アルキルスルホン酸処理によるアルコキシベンゼンスルホニル基の脱離後の目的化合物を工業的規模で分離できる、iv）目的化合物を工業的規模で精製できる、v）ペプチド（b）を副生物の生成を抑制しつつ収率よく得ることができる、vi）ペプチド（e）およびペプチド(Ｉ')の乾燥操作およびペプチド(IV)の単離操作を省略できるなど、多くの利点がある。従って、ＬＨＲＨのアゴニストとしての作用を有するペプチド（Ｉ）を工業的規模で有利に製造できる。
【００５８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明における好ましい製造法のフローチャートの例を示す。
Claims (9)
- 一般式
５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｒ１−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｒ２−Ｒ３−ＯＨ （ＩＩ）
〔式中、Ｒ１はＨｉｓ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐまたはｐ−ＮＨ２−Ｐｈｅを、Ｒ２はＴｙｒまたはＰｈｅを、Ｒ３はそれぞれ置換基を有していてもよいＧｌｙまたはα−Ｄ−アミノ酸残基をそれぞれ示す。〕で表わされるペプチドまたはその塩と、一般式
Ｈ−Ｒ４−Ｒ５−Ｐｒｏ−Ｒ６ （ＩＩＩ）
〔式中、Ｒ４はＬｅｕ，ＩｌｅまたはＮｌｅを、Ｒ５は保護されたＡｒｇを、Ｒ６は式Ｇｌｙ−ＮＨ−Ｒ７（式中、Ｒ７は水素原子または水酸基を有していてもよいアルキル基を示す）または式ＮＨ−Ｒ８（式中、Ｒ８は水素原子、水酸基を有していてもよいアルキル基またはウレイド基（−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ２）をそれぞれ示す）で表わされる基を示す〕で表わされるペプチドまたはその塩とを反応させ、一般式
５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｒ１−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｐｒｏ−Ｒ６ （Ｉ’）
〔式中の記号は前記と同意義を示す〕で表わされるペプチドまたはその塩を得、ついで、得られたペプチド（Ｉ’）をペプチド（Ｉ’）に対して５〜２５重量倍のＣ１−６アルキルスルホン酸を用いる脱保護基反応に付し、得られた反応液を−１５℃〜１５℃で塩基で中和することを特徴とする一般式
５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｒ１−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｒ６ （Ｉ）
〔式中の記号は前記と同意義を示す〕で表わされるペプチドまたはその塩の製造法。 - Ｒ１がＨｉｓを、Ｒ２がＴｙｒを、Ｒ３がＧｌｙ，Ｄ−Ｌｅｕ，Ｄ−Ｔｒｐ，Ｃ１−４アルキル基で置換されていてもよいＤ−Ｖａｌ，Ｄ−Ｓｅｒ，Ｃ１−４アルコキシ基、ナフチル基もしくは２−メチルインドリルで置換されていてもよいＤ−ＡｌａまたはＣ７−１０アラルキル基で置換されていてもよいＤ−Ｈｉｓを、Ｒ４がＬｅｕを、Ｒ５がＣ１−６アルコキシベンゼンスルホニル基、トリＣ１−６アルキルベンゼンスルホニル基およびニトロ基から選ばれる基で保護されたＡｒｇを、Ｒ６は式ＮＨ−Ｒ８’（式中、Ｒ８’は水素原子または水酸基を有していてもよいＣ１−３アルキル基をそれぞれ示す）で表わされる基をそれぞれ示す請求項１記載の製造法。
- Ｒ１がＨｉｓを、Ｒ２がＴｙｒを、Ｒ３がＤ−Ｌｅｕを、Ｒ４がＬｅｕを、Ｒ５がＣ１−６アルコキシベンゼンスルホニル基で保護されたＡｒｇを、Ｒ６は式ＮＨ−Ｒ８’’（式中、Ｒ８’’は水酸基を有していてもよいＣ１−３アルキル基を示す）で表わされる基をそれぞれ示す請求項１記載の製造法。
- ペプチド（ＩＩ）またはその塩とペプチド（ＩＩＩ）またはその塩とを、温度０〜４０℃で、３０〜６０時間反応させる請求項１記載の製造法。
- さらに分離した遊離体の油状物を含む反応液をカラムクロマトグラフィーで精製することを特徴とする請求項１記載の製造法。
- 一般式
５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｒ１−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｒ２−Ｒ３−ＯＲ９ （ＩＶ）
〔式中、Ｒ１はＨｉｓ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐまたはｐ−ＮＨ２−Ｐｈｅを、Ｒ２はＴｙｒまたはＰｈｅを、Ｒ３はそれぞれ置換基を有していてもよいＧｌｙまたはα−Ｄ−アミノ酸残基を、Ｒ９は保護基をそれぞれ示す。〕で表わされるペプチドまたはその塩を加水分解反応に付すことを特徴とする一般式
５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｒ１−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｒ２−Ｒ３−ＯＨ （ＩＩ）
〔式中の記号は前記と同意義〕で表わされるペプチドまたはその塩の製造法。 - 一般式
５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｒ１−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｒ２−Ｒ３−ＯＨ （ＩＩ）
〔式中、Ｒ１はＨｉｓ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐまたはｐ−ＮＨ２−Ｐｈｅを、Ｒ２はＴｙｒまたはＰｈｅを、Ｒ３はそれぞれ置換基を有していてもよいＧｌｙまたはα−Ｄ−アミノ酸残基をそれぞれ示す。〕で表わされるペプチドまたはその塩の結晶。 - 一般式
５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｒ１−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｒ２−Ｒ３−ＯＨ （ＩＩ）
〔式中、Ｒ１はＨｉｓ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐまたはｐ−ＮＨ２−Ｐｈｅを、Ｒ２はＴｙｒまたはＰｈｅを、Ｒ３はそれぞれ置換基を有していてもよいＧｌｙまたはα−Ｄ−アミノ酸残基を それぞれ示す。〕で表わされるペプチドまたはその塩の溶液を熟成させることを特徴とするペプチド（ＩＩ）またはその塩の結晶の製造法。 - ペプチド（ＩＩ）またはその塩の濃度が０．０１〜０．０５モル／Ｌである溶液を１０〜７０℃で１０〜７０時間熟成させる請求項８記載の結晶の製造法。
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