JPH1067797A - ペプチドの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】ＬＨＲＨアゴニスト作用を有するペプチドの工
業的規模での製造法を提供する。 【解決手段】一般式 5-oxo-Pro-R¹-Trp-Ser-R²-R³-OH (II) 〔式中、Ｒ¹はHis，Tyr，Trpまたはp-NH₂-Pheを、Ｒ²は
TyrまたはPheを、Ｒ³はそれぞれ置換基を有していても
よいGlyまたはα-D-アミノ酸残基をそれぞれ示す。〕で
表わされるペプチドまたはその塩と、一般式 H-R⁴-R⁵-Pro-R⁶ (III) 〔式中、Ｒ⁴はLeu，IleまたはNleを、Ｒ⁵は保護されたA
rgを、Ｒ⁶は式Gly-NH-Ｒ⁷(式中、Ｒ⁷は水素原子または
水酸基を有していてもよいアルキル基を示す)または式N
H-Ｒ⁸（式中、Ｒ⁸は水素原子、水酸基を有していてもよ
いアルキル基またはウレイド基（-NH-CO-NH₂）をそれぞ
れ示す）で表わされる基を示す〕で表わされるペプチド
またはその塩とを反応させ、次いで、得られたペプチド
(I')を脱保護基反応に付すことを特徴とする一般式 5-oxo-Pro-R¹-Trp-Ser-R²-R³-R⁴-Arg-Pro-R⁶ (I) 〔式中の記号は前記と同意義を示す〕で表わされるペプ
チドまたはその塩の製造法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、視床下部から分泌
される性線刺激ホルモン放出ホルモン（ＬＨ−ＲＨ）の
アゴニストとしての作用等を有するペプチドまたはその
塩の製造法、該ペプチドを製造するための中間体ペプチ
ド、その製造法、その結晶および該結晶の製造法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】ＬＨ−ＲＨのアゴニストであるペプチド
またはその塩の製造法としては、特開昭５０−５９３７
０号公報（米国特許第４,００８,２０９号公報に対応）
には、一般式： (Ｐｙｒ)Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ(ま
たはＰｈｅ)−Ｘ−Ｌｅｕ(またはＩｌｅまたはＮｌｅ)
−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＮＨ−Ｒ 〔式中、アミノ酸は特に明記しないものはＬ体を示し、
ＸはＤ−Ｌｅｕ，Ｄ−ＮＬｅ，Ｄ−ＮＶａ，Ｄ−Ｓｅ
ｒ，Ｄ−Ａｂｕ，Ｄ−Ｐｈｇ，Ｄ−Ｐｈｅまたはα−Ａ
ｉｂｕを、Ｒは水酸基を有してもよいアルキル基を示
す〕で表されるペプチドの製造法として、下記の方法が
記載されている。

【０００３】

【化１】 〔式中の記号は前記と同意義を示す〕。

【０００４】また、特開昭５１−６９２６号公報（米国
特許第３,９９７,５１６号公報に対応）には、グアニジ
ノ基を有するペプチドの製造において、グアニジノ基含
有原料化合物のグアニジノ基を低級アルコキシベンゼン
スルホニル基またはトリ低級アルキルベンゼンスルホニ
ル基で保護することを特徴とするペプチドの製造法が記
載されている。さらに、特開昭５１−１０００３０号
（米国特許第３,９９７,５１６号公報に対応）公報に
は、グアニジノ基を有するペプチドの製造において、グ
アニジノ基含有原料化合物のグアニジノ基を低級アルコ
キシ−またはトリ低級アルキルベンゼンスルフォニル基
で保護してペプチド縮合した後、該保護基をハロゲノス
ルホン酸または低級アルキルスルホン酸またはルイス酸
で脱離させることを特徴とするペプチドの分離・製造法
が記載されている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】ペプチドの工業的規模
での大量生産においては、(1)原薬の品質、(2)製造コス
ト、(3)操作性、(4)作業者の安全、(5)環境の汚染防止
などの様々な要件を実用上満足できるものとすることが
不可欠であるため、実験室レベルのような小規模スケー
ルでの合成方法が必ずしも工業的製法として実用性があ
る方法とは限らないことが多い。従って、ペプチドの工
業的製法の構築には、このような様々の要件を満たすべ
く、ペプチド鎖の延長方法、フラグメント縮合点の選
択、フラグメント縮合時の異性化の抑制方法、α−位及
び側鎖官能基の保護基の選択と該保護基の最終的な脱離
方法、得られる目的ペプチドの分離・精製方法、各工程
間の一連の操作性等、非常に多くの検討課題がある。ま
た、一般にペプチドの合成過程においては、多種多様な
プロセス、種々の反応手段等が考えられるが、多くの場
合は、各製造工程の中間体が無晶形であるために、精製
が十分に行えなかったり、煩雑な分離・精製操作が必要
な場合が多く、品質および収率の点において再現性が得
られない等の問題が生じている。即ち、各製造工程の中
間体、とりわけ、各工程において鍵となる中間体につい
て、結晶性、安定性、溶解性などの物性の良し悪しが工
業的製造法として実用に足るか否かを左右する場合が多
い。

【０００６】上記ペプチド(Ｐｙｒ)Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔ
ｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ(またはＰｈｅ)−Ｘ−Ｌｅｕ(ま
たはＩｌｅまたはＮｌｅ)−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＮＨ−Ｒ
の製造法において、特開昭５０−５９３７０号公報（米
国特許第４,００８,２０９号公報に対応）に記載された
方法は、Ａｒｇのグアニジノ基をニトロ基で保護してい
る関係上、α−アミノ基の保護に用いているＺ基を還元
的に脱離することが困難となり、その結果、Ｄ基の脱離
をＨＢr／ＡcＯＨで行っている。この方法では必然的に
強催涙性のベンジルブロマイドが大量に副生する他、目
的のペプチドを分離するために大量のエーテル類を使用
しなければならない。また、本反応における目的化合物
は、通常、臭化水素酸塩として捕捉されるが、フラグメ
ント縮合において、異性化を抑制するためには臭化水素
をイオン交換樹脂等で除くことが必要となる。また、該
ペプチドの種々のクロマトグラフィーによる精製におい
ては、グラジエント溶出を行っているが、濃度勾配の再
現性に乏しいため、有効画分の特定が溶出画分ごとに必
要となり、一定した品質の目的化合物を安定して得るた
めの作業の標準化ができない等の問題があり、工業的製
法として実用的ではない。

【０００７】さらに、米国特許第２,９９７,５１６号公
報には式 (Ｐｙｒ)Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ
−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ(ＭＢＳ)−Ｐｒｏ−ＮＨ−Ｃ
₂Ｈ₅ 〔式中、ＭＢＳは、ｐ−メトキシベンゼンスルホニル基
を示す〕で表わされるペプチドが製造されるとして、反
応が図式されているが、ここには、単にペプチドの構造
式が羅列してあるだけであり、実際にどのような反応条
件で行なえるかについては、示されていない。従って、
ＬＨ−ＲＨのアゴニストとしての作用等を有するペプチ
ドまたはその塩を、安全かつ簡便な操作で、高収率かつ
再現性の良い、工業的に有利な製造法の開発が望まれて
いる。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前述の種
々の問題を解決すべく、鋭意検討した結果、加水分解時
のアミノ酸残基の異性化の抑制などによる鍵となる後述
のペプチド(IV)の製造法の確立と結晶化、後述のペプチ
ド(Ｉ')の大量処理可能な脱保護基操作方法の確立、後
述のペプチド(Ｉ)の工業的規模の分離・精製法の確立に
より、安全で高収率かつ再現性良く、ペプチド(Ｉ)を製
造できることを見いだし、この知見に基づきさらに鋭意
研究の結果、本発明を完成した。

【０００９】即ち、本発明は、（１）一般式 ５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｒ¹−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｒ²−Ｒ³−ＯＨ (II) 〔式中、Ｒ¹はＨｉｓ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐまたはｐ−ＮＨ₂
−Ｐｈｅを、Ｒ²はＴｙｒまたはＰｈｅを、Ｒ³はそれぞ
れ置換基を有していてもよいＧｌｙまたはα−Ｄ−アミ
ノ酸残基をそれぞれ示す。〕で表わされるペプチドまた
はその塩と、一般式 Ｈ−Ｒ⁴−Ｒ⁵−Ｐｒｏ−Ｒ⁶ (III) 〔式中、Ｒ⁴はＬｅｕ，ＩｌｅまたはＮｌｅを、Ｒ⁵は保
護されたＡｒｇを、Ｒ⁶は式Ｇｌｙ−ＮＨ−Ｒ⁷(式中、
Ｒ⁷は水素原子または水酸基を有していてもよいアルキ
ル基を示す)または式ＮＨ−Ｒ⁸（式中、Ｒ⁸は水素原
子、水酸基を有していてもよいアルキル基またはウレイ
ド基（−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ₂）をそれぞれ示す）で表わ
される基を示す〕で表わされるペプチドまたはその塩と
を反応させ、一般式 ５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｒ¹−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｒ²−Ｒ³−Ｒ⁴−Ｒ⁵−Ｐｒｏ−Ｒ⁶ (I') 〔式中の記号は前記と同意義を示す〕で表わされるペプ
チドまたはその塩を得、ついで、得られたペプチド(I')
を脱保護基反応に付すことを特徴とする一般式 ５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｒ¹−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｒ²−Ｒ³−Ｒ⁴−Ａｒｇ−Ｐｒｏ− Ｒ⁶ (I) 〔式中の記号は前記と同意義を示す〕で表わされるペプ
チドまたはその塩の製造法、

【００１０】（２）Ｒ¹がＨｉｓを、Ｒ²がＴｙｒを、Ｒ
³がＧｌｙ，Ｄ−Ｌｅｕ，Ｄ−Ｔｒｐ，Ｃ_1-4アルキル基
で置換されていてもよいＤ−Ｖａｌ，Ｄ−Ｓｅｒ，Ｃ
_1-4アルコキシ基、ナフチル基もしくは２−メチルイン
ドリルで置換されていてもよいＤ−ＡｌａまたはＣ_7-10
アラルキル基で置換されていてもよいＤ−Ｈｉｓを、Ｒ
⁴がＬｅｕを、Ｒ⁵がＣ_1-6アルコキシベンゼンスルホニ
ル基、トリＣ_1-6アルキルベンゼンスルホニル基および
ニトロ基から選ばれる基で保護されたＡｒｇを、Ｒ⁶は
式ＮＨ−Ｒ⁸'（式中、Ｒ⁸'は水素原子または水酸基を有
していてもよいＣ_1-3アルキル基をそれぞれ示す）で表
わされる基をそれぞれ示す上記（１）項記載の製造法、
（３）Ｒ¹がＨｉｓを、Ｒ²がＴｙｒを、Ｒ³がＤ−Ｌｅ
ｕを、Ｒ⁴がＬｅｕを、Ｒ⁵がＣ_1-6アルコキシベンゼン
スルホニル基で保護されたＡｒｇを、Ｒ⁶は式ＮＨ−
Ｒ⁸''（式中、Ｒ⁸''は水酸基を有していてもよいＣ_1-3
アルキル基を示す）で表わされる基をそれぞれ示す上記
（１）項記載の製造法、（４）ペプチド(II)またはその
塩とペプチド(III)またはその塩とを、温度約０〜４０
℃で、約３０〜６０時間反応させる上記（１）項記載の
製造法、（５）脱保護基反応において酸を用いる上記
（１）項記載の製造法、（６）酸がＣ_1-6アルキルスル
ホン酸である上記（５）項記載の製造法、（７）酸をペ
プチド(I')に対して約５〜２５重量倍用いる上記（５）
項記載の製造法、（８）上記（１）記載のペプチド
（I'）の脱保護基反応を酸の存在下に行ない、得られる
ペプチド(Ｉ)を含有する反応液を塩基で中和し、分離し
た遊離体の油状物をカラムクロマトグラフィーで精製す
ることを特徴とするペプチド(Ｉ)の分離・精製法、

【００１１】（９）一般式 ５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｒ¹−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｒ²−Ｒ³−ＯＲ⁹ (IV) 〔式中、Ｒ¹はＨｉｓ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐまたはｐ−ＮＨ₂
−Ｐｈｅを、Ｒ²はＴｙｒまたはＰｈｅを、Ｒ³はそれぞ
れ置換基を有していてもよいＧｌｙまたはα−Ｄ−アミ
ノ酸残基を、Ｒ⁹は保護基をそれぞれ示す。〕で表わさ
れるペプチドまたはその塩、（１０）Ｒ¹がＨｉｓを、
Ｒ²がＴｙｒを、Ｒ³がＧｌｙ，Ｄ−Ｌｅｕ，Ｄ−Ｔｒ
ｐ，Ｃ_1-4アルキル基で置換されていてもよいＤ−Ｖａ
ｌ，Ｄ−Ｓｅｒ，Ｃ_1-4アルコキシ基、ナフチル基もし
くは２−メチルインドリルで置換されていてもよいＤ−
ＡｌａまたはＣ_7-10アラルキル基で置換されていてもよ
いＤ−Ｈｉｓを、Ｒ⁹がＣ_1-6アルキル，Ｃ_6-10アリール
またはＣ_7-12アラルキルをそれぞれ示す上記（９）記載
のペプチドまたはその塩、（１１）Ｒ¹がＨｉｓを、Ｒ²
がＴｙｒを、Ｒ³がＤ−Ｌｅｕを、Ｒ⁹がＣ_1-6アルキル
基をそれぞれ示す上記（９）記載のペプチドまたはその
塩、（１２）一般式 ５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｒ¹−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｒ²−Ｒ³−ＯＲ⁹ (IV) 〔式中、Ｒ¹はＨｉｓ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐまたはｐ−ＮＨ₂
−Ｐｈｅを、Ｒ²はＴｙｒまたはＰｈｅを、Ｒ³はそれぞ
れ置換基を有していてもよいＧｌｙまたはα−Ｄ−アミ
ノ酸残基を、Ｒ⁹は保護基をそれぞれ示す。〕で表わさ
れるペプチドまたはその塩を加水分解反応に付すことを
特徴とする一般式 ５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｒ¹−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｒ²−Ｒ³−ＯＨ (II) 〔式中の記号は前記と同意義〕で表わされるペプチドま
たはその塩の製造法、

【００１２】（１３）一般式 ５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｒ¹−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｒ²−Ｒ³−ＯＨ (II) 〔式中、Ｒ¹はＨｉｓ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐまたはｐ−ＮＨ₂
−Ｐｈｅを、Ｒ²はＴｙｒまたはＰｈｅを、Ｒ³はそれぞ
れ置換基を有していてもよいＧｌｙまたはα−Ｄ−アミ
ノ酸残基をそれぞれ示す。〕で表わされるペプチドまた
はその塩の結晶、（１４）一般式 ５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｒ¹−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｒ²−Ｒ³−ＯＨ (II) 〔式中、Ｒ¹はＨｉｓ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐまたはｐ−ＮＨ₂
−Ｐｈｅを、Ｒ²はＴｙｒまたはＰｈｅを、Ｒ³はそれぞ
れ置換基を有していてもよいＧｌｙまたはα−Ｄ−アミ
ノ酸残基をそれぞれ示す。〕で表わされるペプチドまた
はその塩の溶液を熟成させることを特徴とするペプチド
(II)またはその塩の結晶の製造法、および、（１５）ペ
プチド(II)またはその塩の濃度が約０.０１〜０.０５モ
ル／Lである溶液を約１０〜７０℃で約１０〜７０時間
熟成させる上記（１４）項記載の結晶の製造法である。

【００１３】

【発明の実施の形態】上記の式中および図の式中で用い
られる記号、略号等について、以下に示す。Ｒ¹はＨｉ
ｓ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐまたはｐ−ＮＨ₂−Ｐｈｅを表わす
が、なかでもＨｉｓが最も好ましい。Ｒ²はＴｙｒまた
はＰｈｅを示すが、なかでも、Ｔｙｒが好ましい。Ｒ³
で表わされる置換基を有していてもよいＧｌｙまたはα
−Ｄ−アミノ酸残基におけるα−Ｄ−アミノ酸として
は、例えば、Ｄ−Ｌｅｕ，Ｄ−Ｉｌｅ，Ｄ−Ｎｌｅ，Ｄ
−Ｖａｌ，Ｄ−Ｎｖａ，Ｄ−Ｓｅｒ，Ｄ−Ａｂｕ，Ｄ−
Ｐｈｅ，Ｄ−Ｐｈｇ，Ｄ−Ｔｈｒ，Ｄ−Ｍｅｔ，Ｄ−Ａ
ｌａ，Ｄ−Ｔｒｐまたはα−Ａｉｂｕが挙げられ、なか
でも、Ｄ−Ｌｅｕ，Ｄ−Ｖａｌ，Ｄ−Ｓｅｒ，Ｄ−Ｔｒ
ｐ、Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｂｕまたはα−Ａｉｂｕが好ま
しく、特に、Ｄ−Ｌｅｕが最も好ましい。Ｒ³で表わさ
れる置換基を有していてもよいＧｌｙまたはα−Ｄ−ア
ミノ酸残基における置換基としては、例えば、モノＣ
_1-4アルキル（例、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イ
ソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル等）、ジＣ_1-4ア
ルキル（例、ジメチル、ジエチル等）、トリＣ_1-4アル
キル（例、トリメチル、トリエチル等）、Ｃ_1-4アルコ
キシ（例、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソ
プロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｔ−ブトキシ等）、Ｃ_6-10
アリール（例、フェニル、ナフチル等）、Ｃ_7-10アラル
キル基（例、ベンジル、フェネチル等）、インドリル、
メチルインドリル、ベンジル−イミダゾリルなどが挙げ
られる。特に、メチル，ジメチル，トリメチル，ｔ−ブ
チル，ｔ−ブトキシ，ナフチル（特に、２−ナフチル
等），インドリル−３−イル，２−メチルインドリルお
よびベンジルイミダゾール−２−イルが好ましく、なか
でも、トリメチル，ｔ−ブチル，ｔ−ブトキシ，２−ナ
フチル，インドール−３−イル，２−メチルインドリル
およびベンジルイミダゾール−２−イルが好ましい。

【００１４】Ｒ³の好ましいものとしては、例えば、Ｇ
ｌｙ，Ｄ−Ｌｅｕ，Ｄ−Ｔｒｐ，Ｃ_1-4アルキル基で置
換されていてもよいＤ−Ｖａｌ，Ｄ−Ｓｅｒ，Ｃ_1-4ア
ルコキシ基、ナフチル基もしくは２−メチルインドリル
で置換されていてもよいＤ−ＡｌａまたはＣ_7-10アラル
キル基で置換されていてもよいＤ−Ｈｉｓが挙げられ
る。Ｒ³としては、さらに、Ｇｌｙ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｄ−
Ｔｒｐ、３−メチル−Ｄ−Ｖａｌ、Ｄ−Ｓｅｒ、ｔ−ブ
トキシ−Ｄ−Ａｌａ、２−ナフチル−Ｄ−Ａｌａ、２−
メチルインドリル−Ｄ−Ａｌａ、ベンジルイミダゾール
−２−イル−Ｄ−Ａｌａ（＝Ｎ^im−ベンジル−Ｄ−Ｈｉ
ｓ）が好ましい。

【００１５】Ｒ⁴はＬｅｕ、ＩｌｅまたはＮｌｅを表わ
すが、なかでも、Ｌｅｕが好ましい。Ｒ⁵で表わされる
保護されたＡｒｇにおける保護基としては、例えば、ア
ルコキシベンゼンスルホニル基、トリアルキルベンゼン
スルホニル基等が挙げられる。該アルコキシベンゼンス
ルホニル基としては、Ｃ_1-6アルコキシで置換されたベ
ンゼンスルホニル基が好ましく、例えば、ｐ−メトキシ
ベンゼンスルホニル基、ｐ−エトキシベンゼンスルホニ
ル基、ｐ−イソプロポキシベンゼンスルホニル基などが
挙げられるが、特に好ましくはｐ−メトキシベンゼンス
ルホニル基である。該トリアルキルベンゼンスルホニル
基におけるアルキルとしては、同一または異なるＣ_1-6
アルキルが好ましい。該Ｃ_1-6アルキルとしては、例え
ば、メチル、エチル、プロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチ
ル、ｎ−ペンチル、ｔ−ペンチルなどが挙げられる。ト
リアルキルはベンゼンスルホニル基におけるベンゼン環
の置換可能な任意の位置に位置していてよいが、スルホ
ニル基に対して２位、４位および６位に位置しているこ
とが特に好ましい。具体的には例えば、２,４,６−トリ
メチルベンゼンスルホニル基、２,４,６−トリエチルベ
ンゼンスルホニル基、２,４,６−トリプロピルベンゼン
スルホニル基、２,４,６−トリイソプロピルベンゼンス
ルホニル基、２,４,６−トリ−ｔ−ブチルベンゼンスル
ホニル基などが挙げられる。

【００１６】Ｒ⁵で表わされる保護されたＡｒｇにおけ
る保護基の好ましいものとしては、Ｃ_1-6アルコキシ−
ベンゼンスルホニル基が挙げられ、好ましく、なかで
も、ｐ−メトキシベンゼンスルホニル基、ｐ−エトキシ
ベンゼンスルホニル基、ｐ−プロポキシベンゼンスルホ
ニル基、ｐ−イソプロポキシベンゼンスルホニル基等が
好ましく、なかでも、ｐ−メトキシベンゼンスルホニル
基が最も好ましい。基Ｒ⁶中の基Ｒ⁷およびＲ⁸で表わさ
れる水酸基を有していてもよいアルキル基におけるアル
キル基としては、Ｃ_1-4アルキル基が挙げられ、これら
は置換可能な任意の位置に水酸基を有していてもよい。
該Ｃ_1-4アルキル基としては、例えばメチル、エチル、
ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチ
ル、sec-ブチル、tert-ブチルが挙げられ、最も好まし
くはエチルである。該水酸基を有していてもよいアルキ
ル基の好ましいものとしては、例えば、ヒドロキシメチ
ル、２−ヒドロキシエチル、３−ヒドロキシ−ｎ−プロ
ピル、４−ヒドロキシ−ｎ−ブチル等が挙げられ、なか
でも２−ヒドロキシエチルが最も好ましい。Ｒ⁹で表わ
される保護基としては、例えば、Ｃ_1-6アルキル基
（例、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、
ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、
ｎ−ヘキシル等）、Ｃ_7-10アラルキル基（例、ベンジ
ル、フェネチル）等が挙げられる。Ｒ⁹で表わされる保
護基としては、Ｃ_1-3アルキルが好ましく、特に、エチ
ルが好ましい。

【００１７】本明細書において、アミノ酸およびペプチ
ドは、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Commission on Biological
Nomenclature による略記法および当該分野における慣
用名により表示し、アミノ酸に関して光学異性体があり
得る場合は、特に明記しなければＬ体を示すものとす
る。また、本明細書中、下記略語を用いる場合もある。 Ｇｌｙ：グリシン Ａｌａ：アラニン Ｖａｌ：バリン Ｌｅｕ：ロイシン Ｉｌｅ：イソロイシン Ｓｅｒ：セリン Ｔｈｒ：スレオニン Ａｒｇ：アルギニン Ｐｈｅ：フェニールアラニン Ｔｙｒ：チロシン Ｈｉｓ：ヒスチジン Ｔｒｐ：トリプトファン Ｐｒｏ：プロリン ＮＬｅ：ノルロイシン ＮＶａ：ノルバリン Ａｂｕ：２−アミノ酪酸 Ｐｈｇ：フェニルグリシン α−Ａｉｂｕ：α−アミノイソ酪酸 ｐ−ＮＨ₂−Ｐｈｅ：ｐ−アミノフェニルアラニン

【００１８】Ｚ：ベンジルオキシカルボニル Ｐｄ：パラジウム Ｐｄ−Ｃ：パラジウム−炭素 Ｅt：エチル ＡcＯＨ：酢酸 ＨＦ：フッ化水素 ＨＢr：臭化水素 ＤＣＨＡ：ジシクロヘキシルアミン ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド ＤＭＡ：ジメチルアセトアミド ＴＨＦ：テトラヒドロフラン ＭＳＡ：メタンスルフォン酸 ＭＢＳ：ｐ−メトキシベンゼンスルホニル ＤＣＣ：Ｎ,Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド ＨＯＮＢ：Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２,３
−ジカルボキシイミド ＨＯＳu：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド ＨＯＢt：１−ヒドロキシベンツトリアゾール ＥＤＡ：エチル−３−（３−ジメチルアミノ）プロピル
カルボジイミド塩酸塩 ＮＰ：ｐ−ニトロフェニル ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー

【００１９】以下に、本願のペプチド(Ｉ)またはその塩
の製造法について説明する。ペプチド(Ｉ)またはその塩
の製造には多くの合成経路が考えられ、また、個々の合
成経路においては、アミノ基及びカルボキシル基の保護
基、アミド結合の形成方法、該保護基の脱離方法、得ら
れるペプチドの分離・精製方法などに関して、極めて多
くの組み合わせが可能である。その中で、〔図１〕に示
す合成経路は、本願発明方法に係る製造法であり、ペプ
チド(Ｉ)を製造する好ましい方法である。本発明の製造
法において特徴とするところは、(1)８位のＡｒｇのグ
アニジノ基を保護基で保護し、(2)鍵中間体として２つ
のペプチド（〔図１〕中のペプチド(II)およびペプチド
(III)）を合成し、(3)それらの縮合で得られる前駆体ペ
プチド(Ｉ')を脱保護基反応に付すことにより８位Ａｒ
ｇのグアニジノ基の保護基を脱離し、目的とするペプチ
ド(Ｉ)またはその塩を得ることにある。本発明のペプチ
ドの塩としては、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、乳酸、グ
リコール酸、焦性ブドウ酸、蓚酸、マロン酸、コハク
酸、マレイン酸、フマール酸、酒石酸、クエン酸、ｐ−
トルエンスルフォン酸、トリフルオロ酢酸、メタンスル
ホン酸などの有機酸や、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン
酸などの無機酸などとの塩が挙げられる。

【００２０】１．ペプチド（ａ）の製造法：〔図１〕に
示される式Ｚ−Ｒ²−Ｒ³−ＯＲ⁹で表されるペプチド
(ａ)は、例えば、「ペプチド合成の基礎と実験」泉屋信
夫他（丸善株式会社）、ザ・ペプチド（The Peptides）
Vol.１, ７６−１３６頁，Ebehard Schroeder and Klau
s Luebke 著に記載された方法、あるいはこれと同様の
方法で製造することができる。

【００２１】２．ペプチド（ａ）→ペプチド（ｂ）の製
造法：〔図１〕に示される式Ｚ−Ｓｅｒ−Ｒ²−Ｒ³−Ｏ
Ｒ⁹で表されるペプチド(ｂ）は、ペプチド（ａ)にＺ−
Ｓｅｒを導入することにより製造される。まず、ペプチ
ド（ａ）を脱Ｚ化反応に付す。脱Ｚ化反応は、例えば、
Ｐｄ，Ｐｄ−Ｃ等の触媒を用いる接触還元あるいはＨＢ
ｒ／ＡｃＯＨ処理等の方法を用いることにより行うこと
ができる。該接触還元反応において用いられる溶媒とし
ては、アルコール類（例、メタノール、エタノール、イ
ソプロパノール、ｎ−プロパノール、ｎ−ブタノール、
ｔ−ブタノール等）、エーテル類（例、ＴＨＦ、ジオキ
サン等）、アミド類（例、、ＤＭＦ，ＤＭＡ等）が挙げ
られる。なかでも、ＤＭＦ，ＤＭＡまたはＴＨＦを用い
ると、次工程の縮合反応における濃縮等の操作を省略で
きるので、有利である。反応温度としては、約０〜５０
℃、好ましくは約２０〜４０℃である。反応時間は、約
３〜１５時間、好ましくは約５〜１０時間である。本反
応は、常圧下において行うのが好ましい。また、還元時
に副生するジケトピペラジンを抑制するために、還元反
応の前に酸を添加し、ペプチド（ａ）の脱Ｚ化されたペ
プチドをプロトネーション(protonation)反応に付すの
が好ましい。該プロトネーションを行うためには、反応
系に酸が添加される。該酸としては、無機酸、有機酸の
いずれでもよく、例えば、塩酸、硫酸、ｐ−トルエンス
ルホン酸などが挙げられるが、とりわけｐ−トルエンス
ルホン酸が好ましい。酸の添加量としては、ペプチド
（ａ）の脱Ｚ化されたペプチドに対して約０.８〜１.５
倍（mole／mole）、好ましくは約１.０〜１．１倍（mol
e／mole）である。ＨＢｒ／ＡｃＯＨ処理は、通常、無
溶媒で、ペプチド（ａ）とＨＢｒとを飽和した酢酸とを
混合することにより行われる。反応温度としては、約−
１０〜３０℃、好ましくは、約１０〜２０℃である。反
応時間は、約１０分〜２時間、好ましくは、約３０分〜
１時間である。反応生成物の分離は、例えば、反応液に
エーテル、酢酸エチル等を加えて、生じた沈殿をろ取
し、乾燥することにより行われる。

【００２２】Ｚ−Ｓｅｒの導入方法としては、活性エス
テル法を適用し（即ち、Ｚ−Ｓｅｒ−ＯＨを活性エステ
ル化し、これを反応に用いる）、反応温度を最適化する
ことにより分子内での脱水反応を抑制することにより有
利に行うことができる。該活性エステルとしては、ペプ
チド合成において通常用いられるものであればいずれで
もよく、例えば、活性エステル化剤（例、ＨＯＮＢ、Ｈ
ＯＳｕ、ＨＯＢｔ）とのエステルなどが挙げられるが、
とりわけＨＯＮＢとのエステルが好ましい。Ｚ−Ｓｅｒ
−ＯＨを活性エステル化するには、Ｚ−Ｓｅｒ−ＯＨと
活性エステル化剤とを、溶媒〔例、エーテル類（例、ジ
エチルエーテル、イソプロピルエーテル、テトラヒドロ
フラン、ジオキサン等）、アミド類（例、ジメチルホル
ムアミド、ジメチルアセトアミド等）、アセトニトリ
ル、エステル酸（例、蟻酸メチル、酢酸メチル、酢酸エ
チル等）〕に溶解し、温度約−５〜２０℃、好ましくは
約０〜５℃で、約５〜１５時間、好ましくは約７〜１０
時間反応させることにより行なわれる。脱Ｚ化ペプチド
（ａ）とＺ−Ｓｅｒ−ＯＨの活性エステルとの反応は、
それ自体が反応しない溶媒の中で行われる。該溶媒とし
ては、還元反応において用いられた溶媒を濃縮すること
なくそのまま用いることができるが、なかでも、アミド
類（例、ＤＭＦ、ＤＭＡ等）などが好ましい。反応時の
温度としては、低温が好ましく、約−１０〜１０℃、好
ましくは約−５〜５℃である。反応時間は約５〜２０時
間、好ましくは約７〜１２時間である。

【００２３】３．ペプチド（ｂ）→ペプチド（ｃ）の製
造法：〔図１〕に示される式Ｚ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｒ²
−Ｒ³−ＯＲ⁹で表されるペプチド(ｃ)は、ペプチド
（ｂ）を脱Ｚ化して得られたペプチドとＺ−Ｔｒｐ−Ｏ
Ｈとを縮合反応に付すことにより行われる。ペプチド
（ｂ）の脱Ｚ化は、Ｐｄ，Ｐｄ−Ｃ等の触媒を用いる接
触還元、あるいはＨＢｒ／ＡｃＯＨ処理等の方法を用い
ることができる。該Ｐｄ，Ｐｄ−Ｃ等の触媒を用いる接
触還元、および、ＨＢｒ／ＡｃＯＨ処理は、上記のペプ
チド（ａ）→ペプチド（ｂ）の製造法において記載した
方法と同様にして行うことができる。

【００２４】ペプチド（ｂ）を脱Ｚ化して得られたペプ
チドにＺ−Ｔｒｐを導入するには、Ｚ−Ｔｒｐ−ＯＨを
活性エステル化剤（例、ＨＯＮＢ、ＨＯＢｔ，ＨＯＳｕ
等）と縮合剤（例、ＤＣＣ、ＥＤＡ等）とで活性エステ
ル化物とし、これとペプチド（ｂ）とを反応させること
により、有利に行うことができる。また、Ｚ−Ｔｒｐ−
ＯＨとペプチド（ｂ）とを活性エステル化剤の存在下に
縮合剤を用いて縮合させることもできる。該活性エステ
ル化剤としては、とりわけ、ＨＯＮＢが好ましく、縮合
剤としては、とりわけ、ＤＣＣが好ましい。Ｚ−Ｔｒｐ
−ＯＨを活性エステル化するには、上記と同様の方法で
行うことができる。Ｚ−Ｔｒｐ−ＯＨの活性エステル化
物とペプチド（ｂ）とを縮合剤の存在下におこなう反応
においては、反応温度としては、約０〜２０℃、好まし
くは約５〜１０℃である。反応時間は約５〜２０時間、
好ましくは約７〜１０時間である。

【００２５】４．ペプチド（ｃ）およびペプチド（ｄ）
→ペプチド（ｅ）の製造法：式Ｚ−５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ
−Ｒ¹−ＯＨで表されるペプチド（ｄ）は、畑中らの方
法〔武田研究所報、第３５巻、第１６頁（１９７６
年）；バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リ
サーチ・コミュニケーションズ（Biochemical and Biop
hysical Research Communications）、第６０巻、第１
３４５頁、（１９７４年）〕に記載の方法、あるいはこ
れらと同様の方法で製造することができる。ペプチド
（ｃ）とペプチド（ｄ）とを反応させて、式Ｚ−５−ｏ
ｘｏ−Ｐｒｏ−Ｒ¹−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｒ²−Ｒ³−ＯＲ⁹
で表されるペプチド（ｅ）を製造するには、ペプチド
（ｃ）とペプチド（ｄ）とを縮合反応に付すことにより
行うことができる。該縮合反応においては、Ｒ¹残基特
にＨｉｓ残基の異性化に留意しなけばならないが、その
方法としては、ペプチドのフラグメント縮合において、
異性化を抑制する方法であればいずれも適用することが
できる。該異性化を抑制する方法としては、通常、縮合
剤や、異性化を抑制する添加物が加えられる。該縮合剤
としては、ＤＣＣ、ＥＤＡなどが挙げられる。該添加物
としては、ＨＯＮＢ、ＨＯＳｕ、ＨＯＢｔ、ＨＯＳｕな
どが挙げられる。該縮合剤と該添加物は、これらを自由
に組み合わせて用いてよく、その組み合わせとしては、
例えば、ＤＣＣ−ＨＯＮＢ、ＤＣＣ−ＨＯＳｕ、ＤＣＣ
−ＨＯＢｔ、ＥＤＡ−ＨＯＳｕなどが挙げられるが、と
りわけＤＣＣ−ＨＯＮＢの組み合わせが好ましい。異性
化を抑制するための大きな要因の一つとして反応温度が
あるが、反応温度は約０〜２０℃、好ましくは約５〜１
５℃である。反応時間は、約３０〜１００時間、好まし
くは約５０〜８０時間である。用いられる溶媒として
は、例えば、アミド類（例、ＤＭＦ、ＤＭＡ），エーテ
ル類（２−メチルピロリドン、ＴＨＦ，ジオキサン等）
が挙げられる。

【００２６】５．ペプチド（ｅ）→ペプチド（IV）の製
造法：式Ｚ−５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｒ¹−Ｔｒｐ−Ｓｅ
ｒ−Ｒ²−Ｒ³−ＯＲ⁹で表されるペプチド（ｅ）を脱Ｚ
化することにより、ペプチド（IV）を製造することがで
きる。ペプチド（ｅ）の脱Ｚ化は、Ｐｄ，Ｐｄ−Ｃ等の
触媒を用いる接触還元、あるいはＨＢｒ／ＡｃＯＨ処理
等の公知の方法により行なうことができる。該Ｐｄ，Ｐ
ｄ−Ｃ等の触媒を用いる接触還元においては、溶媒とし
て、アミド類（例、ＤＭＦ、ＤＭＡ），エーテル類（２
−メチルピロリドン、ＴＨＦ，ジオキサン等）、ｔ−ブ
タノールなどがが用いられる。反応温度は、約０〜５０
℃、好ましくは、約２５〜４０℃である。反応時間は、
約１〜１０時間、好ましくは約３〜６時間である。ＨＢ
ｒ／ＡｃＯＨ処理は、上記ペプチド（ａ）→ペプチド
（ｂ）の製造において記載した方法と同様にして行うこ
とができる。

【００２７】６．ペプチド（IV）→ペプチド（II）の製
造法 ペプチド(IV)を加水分解反応に付し、ついで、所望によ
り、反応液を中和することにより、ペプチド（II）を製
造することができる。該加水分解反応は、アルカリの存
在下で、水中において、低温で行うことが好ましい。必
要により、水とアルコールとの混液中で行うこともでき
る。該アルコール類としては、例えば、メタノール、エ
タノール、プロピルアルコール、ｎ−ブチルアルコール
等があげられるが、水−アルコール類の混液中でのアル
コール類の混在量は、約１〜３０％（V/V)、好ましくは
約１〜１０％（V/V)である。アルコールの量的割合が多
くなる程、加水分解の反応速度が遅くなり、一方で、２
位Ｒ¹および４位Ｓｅｒの異性化が有意に増加する（Ｒ¹
がＨｉｓの場合）。これらの異性体はカラムクロマトグ
ラフィー等による精製においても効果的に除去すること
が困難であり、本発明の目的化合物〔ペプチド(Ｉ)〕の
品質を低下させる要因となる。

【００２８】反応溶媒中には、前工程において用いられ
たＤＭＦ、ＴＨＦ等の溶媒が含まれていてもよいが、こ
れら溶媒の含量は反応速度を著しく低下させない程度、
即ち約１〜２０％（V/V）、さらに好ましくは、約５〜
１０％（V/V）が好ましい。該加水分解反応は、アルカ
リの存在下で行われる。該アルカリとしては、例えば、
水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウ
ム、水酸化バリウムなどが挙げられる。加水分解反応速
度並びに２位Ｈｉｓおよび４位のＳｅｒの異性化は、用
いるアルカリの量および反応液中での濃度によって大き
な影響を受ける。そこで、アルカリの量は、ペプチド(I
V)の約２.５〜５倍mole/mole、好ましくは、約３〜４倍
mole/moleが用いられる。特に、反応液中での初期アル
カリ濃度としては、好ましくは約０.０５〜０.３mole/l
iterで、さらに好ましくは約０.１〜０.２mole/literで
ある。該反応温度は、後処理、即ち、中和が完了するま
では約−１０〜１０℃、好ましくは、約−５℃〜５℃に
維持する。均一な反応温度を維持するために、反応液
を、攪拌することが好ましい。該反応は、通常約１.５
〜３時間で終了する。好ましくない異性化を最小限に抑
制するために、反応終了後直ちに低温下において中和処
理を行うことが望ましい。該中和処理の温度は、約−５
〜５℃、好ましくは約−２〜２℃である。該中和処理
は、反応液に酸（例、塩酸、硫酸など）を加えることに
より行われる。

【００２９】ペプチド(II)は、次に示す方法により結晶
化することができる。すなわち、前述したペプチド(IV)
の加水分解液を中和する際に析出するゲル状物を、加熱
溶解し、ついで徐冷して、ペプチド(II)を晶出させる。
該加熱溶解は、約６０〜８０℃、このましくは、約６５
〜７５℃で撹拌下に行うのが好ましい。該徐冷の際には
種晶を加えることによって晶出が容易になる。該種晶の
添加時期は、種晶が溶解せず、加熱溶解液が再びゲル状
に変化しない温度範囲であればいつでもよいが、好まし
くは加熱溶解液が約３５〜４５℃の時点である。該徐冷
は、約１〜３時間を要して、約１５〜３０℃となるよう
にする。

【００３０】晶出を完成させるために、さらに、熟成を
行うのが好ましい。物性的に優れたペプチド（II）の結
晶を収率よく得るためには、熟成時間として、通常約３
０〜１５０時間を必要とするが、好ましくは約６０〜１
００時間である。熟成温度は約１０〜３５℃、好ましく
は約１０〜３０℃であるが、より好ましくは約１５〜２
５℃である。熟成を開始する時点におけるペプチド(II)
の溶液の濃度を、約０.０１〜０.０５mole/liter、好ま
しくは約０.０２〜０.０４mole/literとすると、晶出に
好都合である。

【００３１】熟成時においては、晶出時間の短縮、収率
の確保を図るために、ペプチド(II)含有液を断続的に攪
拌することが好ましい。該撹拌としては、例えば熟成の
全工程の時間の開始から２／３までは、５時間毎に１分
間約３０〜３５ｒｐｍで撹拌し、２／３の工程から最後
までは、０.５時間毎に１分間約３０〜３５ｒｐｍで撹
拌するのが好ましい。具体的には例えば、熟成時間が６
０時間の場合、晶出開始時より４０時間までは５時間毎
に１分間３３ｒｐｍで撹拌し、４０時間後は０.５時間
毎に１分間３３ｒｐｍで撹拌するのが好ましい。上記し
たペプチド（II）の結晶化法により、ペプチド（c）→
ペプチド（e）の縮合反応時及びペプチド(IV)→ペプチ
ド（II）の加水分解反応時に副生するＨｉｓ異性体、ペ
プチド(IV)→ペプチド（II）の加水分解反応時に副生す
るＳｅｒ異性体などの最終製品の品質を左右する混在物
の繁雑な除去操作、並びにペプチド(IV)の単離操作の省
略が可能となる。このようにして得られたペプチド（I
I）の結晶は、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｃａ、Ｂａなどのアル
カリ金属との塩、トリエチルアミン、シクロヘキシルア
ミン、ジシクロヘキシルアミンなどとの塩として得られ
る。

【００３２】７．ペプチド（III）の製造法：ペプチド
（III）またはその塩の製造は、例えば 藤野らの方法
〔M.Fujinoら：アーカイブス・オブ・バイオケミストリ
ー・アンド・バイオフィジックス（Archives of Bioche
mistry and Biophysics, 154, 488(1973)；ケミカル・
アンド・ファーマシューティカル・ブレティン（Chemic
al and Pharmaceutical Bulletin, 23, 229 (1975)〕
に記載の方法またはそれと同様の方法によって製造する
ことができる。ペプチド（III）は塩酸、臭化水素酸、
硫酸、ｐ−トルエンスルフォン酸、トリフルオロ酢酸、
メタンスルフォン酸などとの塩として、結晶化等の通常
の手段により分離・採取して、あるいは溶液状態のまま
次工程で用いることもできる。溶液状態のまま次工程で
用いる場合には、アミド結合形成反応に先立って、塩基
による中和あるいはイオン交換樹脂などによる塩基の除
去などが必要になる。

【００３３】８．ペプチド(II)およびペプチド(III)→
(Ｉ')の製造法：ペプチド（II）とペプチド（III）とか
ら、縮合反応によって、ペプチド(Ｉ')を製造する方法
は、反応に悪影響を及ぼさない溶媒中で行われる。該反
応に悪影響を及ぼさない溶媒としては、例えば、ＤＭ
Ｆ、ＤＭＡ、Ｎ−メチルピロリドン、ジクロルメタン、
ジクロロエタン、ＴＨＦ、ジオキサンなどが挙げられ、
これらの溶媒は、適宜混合して用いることもできる。該
溶媒としては、好ましくはジメチルホルムアミド、ジメ
チルアセトアミドである。ペプチド（III）の使用量
は、ペプチド（II）に対して約０.５ないし２モル当
量、好ましくは約１ないし１.５モル当量である。反応
温度は、通常約０〜４０℃、好ましくは約５〜２５℃で
ある。なお、反応温度がこれからはずれると、Ｒ³の異
性化（ラセミ化）が起こりやすくなり、不都合である。
反応時間は、通常約３０〜６０時間、好ましくは約４０
〜５０時間である。該縮合反応においては、Ｒ³残基の
異性化に留意しなけばならないが、その方法としては、
ペプチドのフラグメント縮合において、異性化を抑制す
る方法であればいずれも適用することができる。該異性
化を抑制する方法としては、通常、縮合剤や、異性化を
抑制する添加物が加えられる。該縮合剤としては、ＤＣ
Ｃ、ＥＤＡなどが挙げられる。該添加物としては、ＨＯ
ＮＢ、ＨＯＳｕ、ＨＯＢｔなどが挙げられる。該縮合剤
と該添加物は、これらを自由に組み合わせて用いてよ
く、その組み合わせとしては、例えば、ＤＣＣ−ＨＯＮ
Ｂ、ＤＣＣ−ＨＯＳｕ、ＤＣＣ−ＨＯＢｔ、ＥＤＡ−Ｈ
ＯＳｕなどが挙げられるが、とりわけＤＣＣ−ＨＯＮＢ
の組み合わせが好ましい。縮合剤は、ペプチド(II)に対
して、約１〜３倍（mole/mole）、好ましくは、約１〜
２倍（mole/mole）の量が用いられる。添加物は、ペプ
チド(II)に対し、約１〜４倍（mole/mole）、好ましく
は約１.５〜２.５倍（mole/mole）が用いられる。ま
た、ペプチド(II)の反応溶媒中での初期濃度は、約０.
０５〜０.２mole/L、好ましくは、約０.０８〜１.５mol
e/Lである。ペプチド(III)は、ペプチド(II)に対し、約
０.８〜２倍（mole/mole）、好ましくは約１〜１.３倍
（mole/mole）である。

【００３４】９．ペプチド(Ｉ')→ペプチド（Ｉ）の製
造法：ペプチド(Ｉ')のＡｒｇ残基の保護基を脱離し、
ペプチド(Ｉ)を得る脱保護反応は、例えば,ペプチド
(Ｉ')を、反応に悪影響を及ぼさない溶媒中または無溶
媒下で、酸で処理することにより行われる。該反応に悪
影響を及ぼさない溶媒としては、例えば、ジクロルメタ
ン、ジクロルエタン、ジオキサン、トリフルオロ酢酸な
どが挙げられ、これらの溶媒は、適宜混合して用いるこ
ともできる。該脱保護反応において、用いられる酸とし
ては、例えば、Ｃ_1-6アルキルスルホン酸（例、メタン
スルホン酸、エタンスルホン酸など）、ハロゲノスルホ
ン酸（例、クロルスルホン酸、フルオロスルホン酸、ブ
ロモスルホン酸）、ルイス酸（例、ボロン・トリス・ト
リフルオロアセテートなど）などが挙げられ、なかでも
Ｃ_1-6アルキルスルホン酸が好ましい。さらに好ましく
はＣ_1-3アルキルスルホン酸であり、メタンスルホン酸
が特に好ましい。該脱保護反応において、処理に用いら
れる酸の使用量は、ペプチド(Ｉ')に対し、約５〜２５
（W/W）倍、好ましくは約１０〜２０（W/W）倍である。
該脱保護反応における反応温度は、通常約０〜２０℃、
好ましくは約５〜１５℃である。反応時間は、通常約２
〜８時間、好ましくは約４〜６時間である。該脱保護反
応は、好ましくは、無溶媒下で、メタンスルホン酸を用
いて行われる。また、該脱保護反応の際、ラジカル捕捉
剤（ラジカルスカベンジャー）（例、フェノール、アニ
ソールなど）または酸化防止剤（例、チオグリコール酸
など）を適宜添加して用いてもよい。これらの使用量
は、上記反応生成物に対し、それぞれ約０.８〜２.０
（W/W）倍、約０.０５〜２.０（W/W）倍である。

【００３５】脱保護反応をＣ_1-6アルキルスルホン酸を
用いて行う場合、反応液から該アルキルスルホン酸を除
去する方法としては、例えば反応液をエーテル類で洗浄
し、洗浄液に水を溶解し、溶解液をアニオン交換樹脂カ
ラムに付す方法が挙げられる。しかしながら、この方法
を工業的に用いる場合、Ｃ_1-6アルキルスルホン酸のエ
ーテル類に対する溶解度が低いため、エーテル類の大量
使用が避けられず、危険性を伴うため、大量のアルキル
スルホン酸を水と混合する際及びイオン交換樹脂カラム
に付す際の急激な発熱による危険性、およびその発熱に
よる目的ペプチドの分解などの問題により、工業的方法
としては、設備的にも、操作性、安全性の観点からも実
用的ではない。従って、これらの問題がなく工業的に有
利な方法としては、例えば、塩基性水溶液を用いる直接
的な中和による、反応液から該アルキルスルホン酸を除
去する方法が挙げられる。しかし、大量の強酸を中和す
る本中和反応においては、大量処理が可能である一方、
当然激しい中和熱の発生が予想され、大量に発生する中
和液の処理という問題に加え、塩基性水溶液中での目的
ペプチドにおけるペプチド結合の開裂、アミノ酸残基の
異性化など目的化合物の品質に及ぼす悪影響が当初予想
され、ペプチド化合物の常識的な取扱いの範囲を越えた
ものであると考えられた。

【００３６】しかしながら、本願発明者らは、本中和反
応における中和熱の吸収方法、操作方法等を鋭意検討、
反応条件の最適化を行った結果、予想外にも、品質的に
満足できる目的化合物が高収率で得られることを見出
し、本中和反応方法の工業的処理方法を確立するに至っ
た。即ち、本願発明における製造法においては、冷却さ
れた無機または有機塩基の水溶液に低温を維持しながら
反応液を滴下して、過剰の塩基をアルキルスルホン酸で
中和すれば、目的ペプチドにおける構成アミノ酸残基の
異性化を抑制しつつ、目的化合物を固体または油状物と
して分離回収できる。該無機塩基としては水酸化ナトリ
ウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、炭酸ナトリ
ウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウムなどが、また、該
有機塩基としてはピリジン、トリエチルアミンなどが用
いられるが、炭酸カリウムがとりわけ好ましい。塩基と
して炭酸塩を用いる場合は、炭酸ガス発生に伴う発泡が
著しいが、酢酸エチル、ベンゼン等の有機溶媒を適量混
在させてこれを防ぐことができる。無機又は有機塩基の
必要量は、アルキルスルホン酸を中和するのに十分な量
があれば目的を達成することが出来るが、好ましくはア
ルキルスルホン酸に対し、約１〜１.３倍当量を用い
る。

【００３７】該中和反応時の液温は、アミノ酸残基の異
性化あるいはペプチド鎖の加水分解などを抑制するため
に、また、無機塩基または有機塩基の水溶液の氷結を防
ぐために、約−１５℃〜１５℃、好ましくは、約−５℃
〜５℃に維持することが好ましい。該中和反応後、目的
化合物は、通常、中和液から固体もしくは油状物として
分離するので、濾過あるいは分液など公知の方法で適宜
分離回収することができる。該中和反応後、分離回収さ
れた目的化合物は、所望により自体公知の方法により、
分離・精製操作を行うことができる。比較的少量の目的
化合物を精製する場合には、クロマトグラィーなどの手
段を用いればよく、大量の目的化合物を精製する場合に
は、その化合物特有のイオン的性質、極性などの溶液物
性、芳香族性、分子量などを利用して、例えばカラムク
ロマトグラフィー（例、液体カラムクロマトグラフィ
ー、好ましくは、高速液体カラムクロマトグラフィー）
を数種組み合わせる手段を用いればよい。分離・回収法
としては、上記の反応液において分離した遊離体の油状
物をカラムクロマトグラフィーで精製することが好まし
い。

【００３８】工業的観点から好ましい分離・精製手段と
しては、例えばアンバーライトＸＡＤ−２(Ｒohm ＆ Ｈ
ass CO，USA(ローム・アンド・ハース社；米国))、ダイ
ヤイオンＨＰ−２０（三菱化学；日本）などのハイポー
ラス樹脂、カルボキシメチルセルロース(ＣＭＣ、ＣＭ
−２３(ワットマン；米国))、アンバーライトＣＧ−５
０(Ｒohm ＆ Ｈass CO，USA(ローム・アンド・ハース
社；米国))などのイオン交換樹脂、セファデックスＬＨ
−２０（ファルマシアファインケミカルズ；スウェーデ
ン）などの分子篩樹脂を用いるカラムクロマトグラフィ
ーを適宜組み合わせる手段が挙げられる。該手段は、操
作的に単純で、安全性に優れ、収率・品質面で再現性が
得られ、経済的にも有利である。カラムクロマトグラフ
ィーの組み合わせとしては、例えば以下に詳述するダイ
ヤイオンＨＰ−２０（前述）（第１回目）→ ＣＭ−２
３（前述）→ ダイヤイオンＨＰ−２０（第２回目）→
セファデックスＬＨ−２０（前述）の順の組み合わせが
挙げられる。ペプチド含有水溶液は、一般に、濃縮時に
激しい発泡を伴うために、濃縮を必要とする場合には凍
結乾燥機などの特殊な装置や消泡剤の添加等が必要とな
る。上記カラムクロマトグラフィーの組み合わせは、各
カラムクロマトグラフィーで得られる有効画分の濃縮、
特にＣＭ−２３で得られる大量の有効画分水溶液の濃縮
操作の省略を可能にしたものであり、操作性、経済性の
観点から有利であるばかりでなく、濃縮に伴うペプチド
の分解を抑えて品質の向上にも寄与している。

【００３９】ダイヤイオンＨＰ−２０（第１回目）カラ
ムクロマトグラフィーは、脱保護反応後の反応液から分
離した粗目的化合物を含む固体あるいは油状物中に混在
する無機物、保護基脱離時に添加するラジカルスキャベ
ンジャーおよびその反応生成物、必要に応じて用いられ
る酸化防止剤および少量混在する目的化合物の異性体な
どを除くのが主目的である。ダイヤイオンＨＰ−２０
（第１）カラムクロマトグラフィーにおいて、ダイヤイ
オンＨＰ−２０の量は目的化合物に対して２０〜４０倍
（V／W）、好ましくは２５〜３５倍が用いられる。目的
化合物及び夾雑物の溶出は通常、アセトン、メタノー
ル、エタノールの水溶液で行うが、エタノールを用いる
場合の具体的な精製法を例示する。先ず最初に、目的化
合物を含む水溶液をダイヤイオンＨＰ−２０のカラムに
付し、カラムを設定量の、pＨを酢酸で５〜７に調節し
た酢酸ナトリウム水、酢酸アンモニウム水、１０％エタ
ノール（V/V）で順次洗浄して類縁物質を溶出後、１５
％エタノール（V/V）、３５％エタノール（V/V）で目的
化合物を順次溶出し、予め設定した所望の画分を集め
る。ＣＭ−２３カラムクロマトグラフィーは、目的化合
物とイオン的に異なる副生物の除去が主目的であるが、
ＣＭ−２３の量は、通常、目的化合物に対して約３５〜
６０倍（V/W）、好ましくは約４０〜５５倍（V/W）が用
いられる。ダイヤイオンＨＰ−２０（第１回目）カラム
クロマトグラフィーで溶出された所望の画分からエタノ
ールを留去した溶液をＣＭ−２３のカラムに付し、水洗
後、目的化合物を０.０１５モル酢酸アンモニウム水、
０.０３モル酢酸アンモニウム水で順次溶出し、予め設
定した所望の画分を集める。

【００４０】ダイヤイオンＨＰ−２０（第２回目）カラ
ムクロマトグラフィーは、ＣＭ−２３カラムクロマトグ
ラフィーの溶出に用いる酢酸アンモニウムの除去と大量
の溶出液の濃縮が主目的である。ダイヤイオンＨＰ−２
０（第２）カラムへはＣＭ−２３カラムクロマトグラフ
ィーで得られた所望の画分（濃縮時に発泡を伴う大量の
水溶液）を濃縮操作の必要なく付すことができる。ダイ
ヤイオンＨＰ−２０（第２回目）カラムは pＨを酢酸で
５〜７に調節した酢酸ナトリウム水、酢酸アンモニウム
水、水で順次洗浄する。ついで１５％エタノール（V/
V）、３５％エタノール（V/V）で目的化合物を順次溶出
し、予め設定した所望の画分を集める。ダイヤイオンＨ
Ｐ−２０（第２）カラムの所望画分（ＣＭ−２３カラム
の所望画分の約３分の１に濃縮されている）を減圧下に
濃縮し、濃縮液をセファデックスＬＨ−２０カラムに付
す。セファデックスＬＨ−２０カラムクロマトグラフィ
ーは、発熱性物質、無機物、その他の微量混在物の除去
を目的としている。セファデックスＬＨ−２０は目的化
合物の２０〜６０倍（V/W）、好ましくは３０〜５０倍
（V/W）が用いられる。ＬＨ−２０カラムは０.００５Ｎ
酢酸水で展開し、所望の画分を集める。所望画分は必要
に応じて、濃縮、活性炭処理、膜濾過を行ったのち凍結
乾燥することにより、目的化合物（酢酸塩）を得ること
ができる。

【００４１】このようにして得られたペプチド（Ｉ）
は、ＬＨ−ＲＨアゴニスト作用を有し、例えば、特開昭
５０−５９３７０号公報（米国特許第４,００８,２０９
号公報に対応）等に記載の方法で使用することができ
る。

【００４２】

【実施例】つぎに、参考例および実施例を挙げて、本発
明をより詳しく説明するが、本発明はこれらに限定され
るものではない。

【００４３】参考例１．Ｚ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＥ
ｔの製造： Ｚ−Ｔｙｒ−ＯＨ・ＤＣＨＡ ５８.８ｇを酢酸エチル約
３００ml、０〜１０℃で１規定硫酸を用いて脱塩した。
有機層を分離し、無水芒硝で乾燥した。無水芒硝をろ去
し、ろ液にＤ−Ｌｅｕ−ＯＥｔ ２４.３ｇ、トリエチル
アミン１２.６ｇ、ＤＣＣ ２６.８ｇを加え、約５℃で
約２時間、約１０℃で５時間攪拌した。反応液に１規定
塩酸６０mlを加えてろ過した。ろ液を分液し、有機層を
食塩水、重曹水で洗浄した後に酢酸エチルを留去した。
残渣にイソプロピルエーテルを加え、析出した結晶をろ
取し、酢酸エチル−イソプロピルエーテルから再結晶
し、乾燥し、標記ペプチドを得た。 収量：４１.６ｇ（７７％）。 融点：１１６〜１１８℃。 比旋光度〔α〕_D ²⁵＝−３.４°（ｃ＝１，ＤＭＦ）。

【００４４】参考例２．Ｚ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｅ
ｕ−ＯＥｔの製造： Ｚ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＥｔ ４０.５ｇ、ｐ−トル
エンスルホン酸・１水和物１６.９ｇをＤＭＦ約３００m
lに溶解して、５％Ｐｄ−Ｃを約５ｇの存在下で２０〜
３５℃で水添し、反応終了後触媒をろ去した。別途、Ｚ
−Ｓｅｒ−ＯＨ ２３.３ｇ、ＨＯＮＢ １９.２ｇをＤＭ
Ｆ ３００mlに溶かし、ＤＣＣ ２２.１ｇを加えて、０
〜５℃で約７時間攪拌し、これに先の還元反応液を加え
た。混合液を約０℃に冷却し、トリエチルアミン９ｇを
滴下した後、−５〜５℃で約１０時間攪拌、室温で一夜
放置した。析出結晶をろ去し、ろ液を減圧濃縮し、濃縮
残渣を酢酸エチルに溶解した。酢酸エチル溶液を１規定
塩酸、食塩水、重曹水で洗浄した後、無水芒硝で乾燥し
た。芒硝をろ去し、ろ液を減圧濃縮し、濃縮残渣にイソ
プロピルエーテルを加え、析出した結晶をろ取し、粗結
晶を酢酸エチルから再結晶し、乾燥し、標記ペプチドを
得た。 収量：３７.６ｇ（７７％）。 融点：１３４〜１３６℃。 比旋光度〔α〕_D ²⁵＝−４.８°（ｃ＝１，ＤＭＦ）。

【００４５】参考例３．Ｚ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−
Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＥｔ（ＺＴＳＴＬＥ）の製造： Ｚ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＥｔ ３６.２ｇを
ＤＭＦ ３００mlに溶解して５％Ｐｄ−Ｃ約５ｇの存在
下で２５〜３５℃で水素添加し、反応終了後触媒をろ去
した。別途、Ｚ−Ｔｒｐ−ＯＨ ２１.４ｇ、ＨＯＮＢ
１１.９ｇ、をＤＭＦ約３００mlに溶かし、ＤＣＣ １
３.７ｇを加え、５〜１０℃で約７時間攪拌し、これに
先の還元反応液を加えた。混合液を１０〜１５℃約７時
間攪拌し、室温で一夜放置した。析出結晶をろ去し、ろ
液を減圧濃縮し、濃縮残渣を酢酸エチルに溶解した。酢
酸エチル溶液を１規定塩酸、食塩水、重曹水で洗浄した
後、無水芒硝で乾燥した。芒硝をろ去し、ろ液を減圧濃
縮し、濃縮残渣にイソプロピルエーテルを加え、析出し
た結晶をろ取し、粗結晶を酢酸エチル−イソプロピルエ
ーテルから再結晶し、乾燥し、標記ペプチドを得た。 収量：４１.３ｇ（８５％）。 比旋光度〔α〕_D ²⁵＝−１０.０°（ｃ＝１，ＥtＯ
Ｈ）。

【００４６】参考例４．Ｚ−５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｈｉ
ｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＥｔの製
造： Ｚ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＥｔ（Ｚ
ＴＳＴＬＥ）５５.７ｇをＤＭＦ約３５０mlに溶解して
５％Ｐd−Ｃ（wet）約１２ｇの存在下、約３０℃で水添
し、反応終了後触媒をろ去した。ろ液にＺ−５−ｏｘｏ
−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−ＯＨ・１.５Ｈ₂Ｏ ３２.６ｇとＨＯ
ＮＢ ２７.４ｇを加えて溶解した。溶解液を２〜８℃に
冷却してＤＣＣ ２０.５ｇを加え、約８℃で約６０時間
攪拌した。反応液を約４０℃で約２時間攪拌後、不溶物
をろ去し、ろ液を減圧濃縮した。濃縮液に酢酸エチル約
１Ｌを約６０℃で加えた後、２０〜２５℃で攪拌した。
析出した結晶をろ取し、得られた粗結晶をＤＭＦ約２３
０mlと酢酸エチル約５３０mlの混液中で懸濁攪拌した
後、ろ取した。得られた標記ペプチドの精結晶（ＺＰＧ
ＬＥ）は乾燥することなしに、次工程の還元反応に供し
た。

【００４７】参考例５．５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−
Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＥｔの製造： 参考例４で得られたＺＰＧＬＥをＤＭＦ約９００mlに溶
解し、５％Ｐd−Ｃ（wet）１５ｇの存在下、約３０℃で
水添し、反応終了後触媒をろ去した。標記ペプチドを含
有するろ液を約１８０mlまで濃縮して，次工程の加水分
解反応に供した。

【００４８】参考例６．Ｚ−Ｌｅｕ−ＯＮＰの製造： Ｚ−Ｌｅｕ−ＯＨ １２５ｇおよびｐ−ニトロフェノー
ル６５.５ｇを酢酸エチル１.２Ｌに溶解し、０〜５℃で
ＤＣＣ １０７ｇの酢酸エチル溶液を滴下し、１０〜２
５℃で攪拌した。反応終了後、析出結晶をろ去し、ろ液
を減圧濃縮した。濃縮残渣をエタノールに溶解し、晶出
した結晶をろ取し、真空乾燥し，標記ペプチドを得た。 収量：１４２ｇ（７８％）。 融点：９２〜９４℃。 比旋光度〔α〕_D ²⁵＝−４２.５°（ｃ＝１，ＣＨ₃Ｏ
Ｈ）。

【００４９】参考例７．Ｚ−Ａｒｇ(ＭＢＳ)−Ｐｒｏ−
ＮＨＣ₂Ｈ₅の製造： Ｚ−Ａｒg(ＭＢＳ)ＯＨ・ＤＣＨＡ ３４.１ｇを酢酸エ
チル４００mlに懸濁し、０〜１０℃で１規定硫酸５７ml
を加え、攪拌、分液し、有機層を芒硝水で洗浄し、減圧
濃縮した。一方、Ｚ−Ｐｒｏ−ＮＨＣ₂Ｈ₅ １５.７ｇを
ジメチルアセトアミド３０mlに溶解し、５％Ｐd−Ｃ
２.３ｇの存在下で水添し、反応終了後触媒をろ去し
た。ろ液でＺ−Ａｒｇ(ＭＢＳ)ＯＨを含んだ濃縮残渣、
ＨＯＮＢ ９.４ｇを溶解した。これにＤＣＣ １２.８ｇ
のジメチルアセトアミド溶液を滴下して、１０〜２０℃
で攪拌した。反応終了後析出した結晶をろ去し、ろ液を
減圧濃縮した。濃縮液を酢酸エチル４５０mlに溶解し、
１規定塩酸、食塩水、重曹水で洗浄した後、酢酸エチル
を減圧で留去した。濃縮残渣を酢酸エチルとエタノール
の混液で処理して粗結晶を得、これをエタノールから再
結晶し、真空乾燥し，標記ペプチドを得た。 収量：２２.４ｇ（７２％）。 比旋光度〔α〕_D ²⁵＝−３３.０°（ｃ＝１，ＣＨ₃Ｏ
Ｈ）。

【００５０】参考例８．Ｚ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ(ＭＢＳ)−
ＰｒｏＮＨＣ₂Ｈ₅(ＺＬＡＰ）の製造： Ｚ−Ａｒｇ(ＭＢＳ)−ＰｒｏＮＨＣ₂Ｈ₅ ２０.３ｇ及び
ｐ−トルエンスルホン酸・一水和物６.４ｇをＤＭＦ １
６０mlに溶解し、５％Ｐｄ−Ｃ ２.３ｇの存在下で水添
し、反応終了後触媒をろ去した。ろ液にトリエチルアミ
ン３.４ｇを冷却下に加え、これにＺ−Ｌｅｕ−ＯＮＰ
１３.６ｇを加えて１０〜１５℃で攪拌した。反応終了
後減圧濃縮し、濃縮残渣を酢酸エチル１２０mlに溶解
し、希塩酸、重曹、水で順次洗浄した。酢酸エチルを留
去し、濃縮残渣をシリカゲルカラムに付し、カラムを酢
酸エチル−イソプロピルエーテルの混液（１：１）、酢
酸エチル−メタノールの混液（３：２）で順次展開し、
有効画分を集めて減圧濃縮した。濃縮残渣を酢酸エチル
に溶解し、イソプロピルエーテルを加えて、生じた沈殿
をろ取し、真空乾燥し、標記ペプチドを得た。 収量：２２.２ｇ（９２％）。 比旋光度〔α〕_D ²⁵＝−３９.０°（ｃ＝１，ＣＨ₃ＣＨ₂
ＯＨ）。

【００５１】実施例１．５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−
Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＨ（ＰＧＬＯ
Ｈ）の製造： 参考例５で得られた濃縮液に、水酸化ナトリウム８.３
ｇを水１Ｌに溶解した液を−３〜０℃で滴下し、約０℃
で約２時間攪拌した。反応終了を確認後、１規定塩酸２
１０mlを約０℃で滴下して中和し、結晶を析出させた。
析出した結晶を加熱溶解し、加熱下に活性炭１.５ｇを
加えて攪拌後、活性炭をろ去した。ろ液を徐冷し、１５
〜２５℃で３５時間攪拌した。晶出結晶をろ取し、約６
０℃で真空乾燥し、標記ペプチドを得た。 収量：３９.９ｇ（５９.２％、参考例３のＺＴＳＴＬＥ
基準）。 比旋光度〔α〕_D ²⁵＝−２１.５°（ｃ＝０.５，ＤＭ
Ｆ）。 なお、本溶媒系での２０℃での反応における１時間後の
２位Ｈｉｓおよび４位Ｓｅｒにおける好ましくない異性
化は、それぞれ１.３％、４.８％であるのに対し、０℃
での反応ではそれぞれ０.２％, ０.４４％であった。ま
た、本発明方法による結晶化法は、諸々の類縁物質を効
果的に除去するが、最も注目すべき類縁物質であるＨｉ
ｓ異性体及びＳｅｒ異性体に焦点を当ててその除去効果
の一例を〔表１〕に示す。

【００５２】

【表１】 *) ペプチド（c）→ペプチド（e）の縮合時に副生した
〔Ｄ−Ｈｉｓ² 〕 体も含む。

【００５３】実施例２．５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−
Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＨ（ＰＧＬＯ
Ｈ）の結晶の製造： 参考例５で得られた濃縮液に、水酸化ナトリウム８.３
ｇを水１Ｌに溶解した液を０〜３℃で滴下し、約０℃で
約２時間攪拌した。反応終了を確認後、１規定塩酸２１
０mlを約０℃で滴下して中和し、結晶を析出させた。析
出した結晶を加熱溶解し、加熱下に活性炭１.５ｇを加
えて攪拌後、活性炭をろ去した。ろ液を徐冷し、１８〜
２２℃で８０時間熟成した。晶出結晶をろ取し、約６０
℃で真空乾燥し、標記ペプチドを得た。 収量：４２.９ｇ（６３.６％、参考例３のＺＴＳＴＬＥ
基準）。 比旋光度〔α〕_D ²⁵＝−２１.８°（ｃ＝０.５，ＤＭ
Ｆ）。

【００５４】実施例３．５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−
Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ
(ＭＢＳ)−ＰｒｏＮＨＣ₂H₅ (ＭＢＳＴＡＰと略する)
の製造： ＺＬＡＰ ３５.６ｇをＤＭＦ ３５０mlに溶解し、５％
Ｐｄ−Ｃ ７.３ｇの存在下で水添し、反応終了後触媒を
ろ去した。ろ液にＰＧＬＯＨ ３６.９ｇとＨＯＮＢ １
６.２ｇを加えて溶解し、４〜８℃でＤＣＣ １４ｇのＤ
ＭＦ溶液を滴下し、約８℃で１５時間、約２０℃で約３
０時間攪拌した。反応終了後析出した結晶をろ去し、ろ
液を減圧濃縮した。濃縮残渣をエタノール約２００mlに
溶解し、これに酢酸エチル約２.３Ｌを加えて、生じた
結晶性固体をろ取した。粗体をエタノール約２２０mlに
溶解し、これに酢酸エチル約９００mlを加え、生じた固
体をろ取し、ジクロルメタンで洗浄してＭＢＳＴＡＰの
湿体を得た。乾燥操作を省略して次工程の脱ＭＢＳ反応
に供した。ＨＰＬＣで定量し、ＭＢＳＴＡＰが５１.１
ｇ（８２％）得られていることを確認した。

【００５５】実施例４．５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−
Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ
−ＰｒｏＮＨＣ₂Ｈ₅・ＣＨ₃ ＣＯＯＨ(ＴＡＰ−１４４
と略する) の製造： (1)脱ＭＢＳ化：フェノール６０ｇをメタンスルホン酸
８００ｇに溶解し、冷却下に、実施例１０で得られたＭ
ＢＳＴＡＰの湿体（ＭＢＳＴＡＰ ５１.１ｇ相当）を加
え、約１０℃で５時間攪拌した。別途、水２Ｌに炭酸カ
リウム６９０ｇを溶解し、酢酸エチル約４００mlを混ぜ
て、−２〜０℃に冷却したアルカリ液を調製した。アル
カリ液に脱ＭＢＳ反応液を約０℃を保ちながら滴下し
た。滴下後分液し、上層（油状物と酢酸エチル層）に p
Ｈ４緩衝液（約０.１規定酢酸ナトリウム約３Ｌと酢酸
約５８mlの混液）を加えて油状物を溶解、分液し、水層
を酢酸エチルで洗浄した。水層に２０％（w/w）炭酸カ
リウム溶液を加えて ｐＨを約６とし、析出した油状物
を取り除き、ＴＡＰ−１４４を含有する水溶液を得た。

【００５６】(2)粗ＴＡＰ−１４４の精製：ＤＡＩＡＩ
ＯＮ・ＨＰ−２０（商品名）のカラム（約１.２Ｌ）
に、上記(1)項で得たＴＡＰ−１４４を含有する水溶液
を通液した。通液後、０.３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（酢
酸で pＨ６.２に調節）約２.５Ｌ、０.０２５Ｍ酢酸ア
ンモニウム水約３Ｌ、１０％エタノール４.３Ｌで順次
洗浄した。次に１５％エタノール９.５Ｌ、３５％エタ
ノール９.５Ｌを通液し、有効画分を集め、エタノール
を減圧留去した。（Ｓ１−ＴＡＰ） ここで得られたＳ１−ＴＡＰをＣＭ−２３（商品名）の
カラム（約１.７Ｌ）に通液し、水２Ｌで洗浄後、０.０
１５Ｍ酢酸アンモニウム水１５Ｌ、次に０.０３Ｍ酢酸
アンモニウム水１５Ｌで目的化合物を溶出するカラムク
ロマトグラフィーを行い、有効画分を集めた（Ｓ２−Ｔ
ＡＰ）。Ｓ２−ＴＡＰをＤＡＩＡＩＯＮ・ＨＰ−２０
（商品名）のカラム（約０.７Ｌ）に通液し、０.３Ｍ酢
酸ナトリウム溶液（酢酸で pＨ６.２に調節）約２.１
Ｌ、０.０１Ｍ酢酸アンモニウム水３.２Ｌ、水０.７Ｌ
で順次洗浄した後、１５％エタノール４.３Ｌ、３５％
エタノール５.４Ｌで溶出するカラムクロマトグラフィ
ーを行い、有効画分を集めて約２００mlに減圧濃縮し
た。濃縮液を SephadexＬＨ−２０（商品名）カラム
（約１０Ｌ）に付し、０.００５Ｎ酢酸水で展開し、有
効画分を集めた。有効画分を活性炭処理、限外ろ過、濃
縮、凍結乾燥を行ってＴＡＰ−１４４を３１.８ｇ（収
率：６７.６％）得た。 含量：９９.８％（ＨＰＬＣ，内標基準）。 旋光度〔α〕_D ²⁰＝−３９.０°（ｃ＝１，１％酢酸）。 吸光度：５７（２８１nm）、５５（２８９nm）。

【００５７】

【発明の効果】本発明の製造法によれば、i）加水分解
反応時の２位 His および４位 Ser の異性化を最小限に
抑制される、ii）ペプチド（II）が物性的に優れた結晶
として得られ、縮合時及び加水分解時に副生する異性体
の除去が可能である、iii）アルキルスルホン酸処理に
よるアルコキシベンゼンスルホニル基の脱離後の目的化
合物を工業的規模で分離できる、iv）目的化合物を工業
的規模で精製できる、v）ペプチド（b）を副生物の生成
を抑制しつつ収率よく得ることができる、vi）ペプチド
（e）およびペプチド(Ｉ')の乾燥操作およびペプチド(I
V)の単離操作を省略できるなど、多くの利点がある。従
って、ＬＨＲＨのアゴニストとしての作用を有するペプ
チド（Ｉ）を工業的規模で有利に製造できる。

【００５８】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴： 存在位置：１ 他の特徴：Xaa = Z-Trp 存在位置：３ 他の特徴：Xaa = Tyr または Phe 存在位置：４ 他の特徴：Xaa = 置換基を有していてもよい Gly-OR (R
= 保護基）または置換基を有していてもよいα-D-アミ
ノ酸残基-OR (R = 保護基）

【００５９】配列番号：２ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴： 存在位置：１ 他の特徴：Xaa = Z-5-oxo-Pro 存在位置：２ 他の特徴：Xaa = His, Tyr, Trp または p-NH₂-Phe 存在位置：５ 他の特徴：Xaa = Tyr または Phe 存在位置：６ 他の特徴：Xaa = 置換基を有していてもよい Gly-OR (R
= 保護基）または置換基を有していてもよいα-D-アミ
ノ酸残基-OR (R = 保護基）

【００６０】配列番号：３ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴： 存在位置：１ 他の特徴：Xaa = 5-oxo-Pro 存在位置：２ 他の特徴：Xaa = His, Tyr, Trp または p-NH₂-Phe 存在位置：５ 他の特徴：Xaa = Tyr または Phe 存在位置：６ 他の特徴：Xaa = 置換基を有していてもよい Gly-OR (R
= 保護基）または置換基を有していてもよいα-D-アミ
ノ酸残基-OR (R = 保護基）

【００６１】配列番号：４ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴： 存在位置：１ 他の特徴：Xaa = 5-oxo-Pro 存在位置：２ 他の特徴：Xaa = His, Tyr, Trp または p-NH₂-Phe 存在位置：５ 他の特徴：Xaa = Tyr または Phe 存在位置：６ 他の特徴：Xaa = 置換基を有していてもよい Gly また
は置換基を有していてもよいα-D-アミノ酸残基

【００６２】配列番号：５ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴： 存在位置：１ 他の特徴：Xaa = 5-oxo-Pro 存在位置：２ 他の特徴：Xaa = His, Tyr, Trp または p-NH₂-Phe 存在位置：５ 他の特徴：Xaa = Tyr または Phe 存在位置：６ 他の特徴：Xaa = 置換基を有していてもよい Gly また
は置換基を有していてもよいα-D-アミノ酸残基 存在位置：７ 他の特徴：Xaa = Leu, Ile または Nle 存在位置：８ 他の特徴：Xaa = 保護された Arg 存在位置：９ 他の特徴：Xaa = Pro-NHR （R = (1) Gly-NH-R'（式
中、R' は水素原子または水酸基を有していてもよいア
ルキル基を示す）または (2) NH-R''（式中、R''は水素
原子、水酸基を有していてもよいアルキル基またはウレ
イド基（-NH-CO-NH₂）を示す））

【００６３】配列番号：６ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴： 存在位置：１ 他の特徴：Xaa = 5-oxo-Pro 存在位置：２ 他の特徴：Xaa = His, Tyr, Trp または p-NH₂-Phe 存在位置：５ 他の特徴：Xaa = Tyr または Phe 存在位置：６ 他の特徴：Xaa = 置換基を有していてもよい Gly また
は置換基を有していてもよいα-D-アミノ酸残基 存在位置：７ 他の特徴：Xaa = Leu, Ile または Ｎｌｅ 存在位置：９ 他の特徴：Ｘａａ ＝ Ｐｒｏ−ＮＨＲ （R = (1) Gl
y-NH-R' (式中、R' は水素原子または水酸基を有してい
てもよいアルキル基を示す）または (2) NH-R''（式
中、R''は水素原子、水酸基を有していてもよいアルキ
ル基またはウレイド基（-NH-CO-NH₂）を示す））

【００６４】配列番号：７ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴： 存在位置：１ 他の特徴：Xaa = Z-Trp 存在位置：４ 他の特徴：Xaa = D-Leu-O-C₂H₅

【００６５】配列番号：８ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴： 存在位置：１ 他の特徴：Xaa = Z-5-oxo−Pro 存在位置：６ 他の特徴：Xaa = D-Leu-O-C₂H₅

【００６６】配列番号：９ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴： 存在位置：１ 他の特徴：Xaa = 5-oxo−Pro 存在位置：６ 他の特徴：Xaa = D-Leu-O-C₂H₅

【００６７】配列番号：１０ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴： 存在位置：１ 他の特徴：Xaa = 5-oxo−Pro

【００６８】配列番号：１１ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴： 存在位置：１ 他の特徴：Xaa = 5-oxo−Pro 存在位置：８ 他の特徴：Xaa = p-メトキシベンゼンスルホニルで保護
された Arg 存在位置：９ 他の特徴：Xaa = Pro-NH-C₂H₅

【００６９】配列番号：１２ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴： 存在位置：１ 他の特徴：Xaa = 5-oxo−Ｐｒｏ 存在位置：９ 他の特徴：Ｘａａ ＝ Ｐｒｏ−ＮＨ−Ｃ_２Ｈ_５

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明における好ましい製造法のフローチャー
トの例を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＥＦ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＥＦ Ｃ０７Ｋ 105:00

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】一般式 ５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｒ¹−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｒ²−Ｒ³−ＯＨ (II) 〔式中、Ｒ¹はＨｉｓ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐまたはｐ−ＮＨ₂
   −Ｐｈｅを、Ｒ²はＴｙｒまたはＰｈｅを、Ｒ³はそれぞ
   れ置換基を有していてもよいＧｌｙまたはα−Ｄ−アミ
   ノ酸残基をそれぞれ示す。〕で表わされるペプチドまた
   はその塩と、一般式 Ｈ−Ｒ⁴−Ｒ⁵−Ｐｒｏ−Ｒ⁶ (III) 〔式中、Ｒ⁴はＬｅｕ，ＩｌｅまたはＮｌｅを、Ｒ⁵は保
   護されたＡｒｇを、Ｒ⁶は式Ｇｌｙ−ＮＨ−Ｒ⁷(式中、
   Ｒ⁷は水素原子または水酸基を有していてもよいアルキ
   ル基を示す)または式ＮＨ−Ｒ⁸（式中、Ｒ⁸は水素原
   子、水酸基を有していてもよいアルキル基またはウレイ
   ド基（−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ₂）をそれぞれ示す）で表わ
   される基を示す〕で表わされるペプチドまたはその塩と
   を反応させ、一般式 ５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｒ¹−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｒ²−Ｒ³−Ｒ⁴−Ｒ⁵−Ｐｒｏ−Ｒ⁶ (I') 〔式中の記号は前記と同意義を示す〕で表わされるペプ
   チドまたはその塩を得、ついで、得られたペプチド(I')
   を脱保護基反応に付すことを特徴とする一般式 ５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｒ¹−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｒ²−Ｒ³−Ｒ⁴−Ａｒｇ−Ｐｒｏ− Ｒ⁶ (I) 〔式中の記号は前記と同意義を示す〕で表わされるペプ
   チドまたはその塩の製造法。
2. 【請求項２】Ｒ¹がＨｉｓを、Ｒ²がＴｙｒを、Ｒ³がＧ
   ｌｙ，Ｄ−Ｌｅｕ，Ｄ−Ｔｒｐ，Ｃ_1-4アルキル基で置
   換されていてもよいＤ−Ｖａｌ，Ｄ−Ｓｅｒ，Ｃ_1-4ア
   ルコキシ基、ナフチル基もしくは２−メチルインドリル
   で置換されていてもよいＤ−ＡｌａまたはＣ_7-10アラル
   キル基で置換されていてもよいＤ−Ｈｉｓを、Ｒ⁴がＬ
   ｅｕを、Ｒ⁵がＣ_1-6アルコキシベンゼンスルホニル基、
   トリＣ_1-6アルキルベンゼンスルホニル基およびニトロ
   基から選ばれる基で保護されたＡｒｇを、Ｒ⁶は式ＮＨ
   −Ｒ⁸'（式中、Ｒ⁸'は水素原子または水酸基を有してい
   てもよいＣ_1-3アルキル基をそれぞれ示す）で表わされ
   る基をそれぞれ示す請求項１記載の製造法。
3. 【請求項３】Ｒ¹がＨｉｓを、Ｒ²がＴｙｒを、Ｒ³がＤ
   −Ｌｅｕを、Ｒ⁴がＬｅｕを、Ｒ⁵がＣ_1-6アルコキシベ
   ンゼンスルホニル基で保護されたＡｒｇを、Ｒ⁶は式Ｎ
   Ｈ−Ｒ⁸''（式中、Ｒ⁸''は水酸基を有していてもよいＣ
   _1-3アルキル基を示す）で表わされる基をそれぞれ示す
   請求項１記載の製造法。
4. 【請求項４】ペプチド(II)またはその塩とペプチド(II
   I)またはその塩とを、温度約０〜４０℃で、約３０〜６
   ０時間反応させる請求項１記載の製造法。
5. 【請求項５】脱保護基反応において酸を用いる請求項１
   記載の製造法。
6. 【請求項６】酸がＣ_1-6アルキルスルホン酸である請求
   項５記載の製造法。
7. 【請求項７】酸をペプチド(I')に対して約５〜２５重量
   倍用いる請求項５記載の製造法。
8. 【請求項８】請求項１記載のペプチド（I'）の脱保護基
   反応を酸の存在下に行ない、得られるペプチド(Ｉ)を含
   有する反応液を塩基で中和し、分離した遊離体の油状物
   をカラムクロマトグラフィーで精製することを特徴とす
   るペプチド(Ｉ)の分離・精製法。
9. 【請求項９】一般式 ５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｒ¹−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｒ²−Ｒ³−ＯＲ⁹ (IV) 〔式中、Ｒ¹はＨｉｓ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐまたはｐ−ＮＨ₂
   −Ｐｈｅを、Ｒ²はＴｙｒまたはＰｈｅを、Ｒ³はそれぞ
   れ置換基を有していてもよいＧｌｙまたはα−Ｄ−アミ
   ノ酸残基を、Ｒ⁹は保護基をそれぞれ示す。〕で表わさ
   れるペプチドまたはその塩。
10. 【請求項１０】Ｒ¹がＨｉｓを、Ｒ²がＴｙｒを、Ｒ³が
    Ｇｌｙ，Ｄ−Ｌｅｕ，Ｄ−Ｔｒｐ，Ｃ_1-4アルキル基で
    置換されていてもよいＤ−Ｖａｌ，Ｄ−Ｓｅｒ，Ｃ_1-4
    アルコキシ基、ナフチル基もしくは２−メチルインドリ
    ルで置換されていてもよいＤ−ＡｌａまたはＣ_7-10アラ
    ルキル基で置換されていてもよいＤ−Ｈｉｓを、Ｒ⁹が
    Ｃ_1-6アルキル，Ｃ_6-10アリールまたはＣ_7-12アラルキ
    ルをそれぞれ示す請求項９記載のペプチドまたはその
    塩。
11. 【請求項１１】Ｒ¹がＨｉｓを、Ｒ²がＴｙｒを、Ｒ³が
    Ｄ−Ｌｅｕを、Ｒ⁹がＣ_1-6アルキル基をそれぞれ示す請
    求項９記載のペプチドまたはその塩。
12. 【請求項１２】一般式 ５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｒ¹−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｒ²−Ｒ³−ＯＲ⁹ (IV) 〔式中、Ｒ¹はＨｉｓ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐまたはｐ−ＮＨ₂
    −Ｐｈｅを、Ｒ²はＴｙｒまたはＰｈｅを、Ｒ³はそれぞ
    れ置換基を有していてもよいＧｌｙまたはα−Ｄ−アミ
    ノ酸残基を、Ｒ⁹は保護基をそれぞれ示す。〕で表わさ
    れるペプチドまたはその塩を加水分解反応に付すことを
    特徴とする一般式 ５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｒ¹−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｒ²−Ｒ³−ＯＨ (II) 〔式中の記号は前記と同意義〕で表わされるペプチドま
    たはその塩の製造法。
13. 【請求項１３】一般式 ５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｒ¹−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｒ²−Ｒ³−ＯＨ (II) 〔式中、Ｒ¹はＨｉｓ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐまたはｐ−ＮＨ₂
    −Ｐｈｅを、Ｒ²はＴｙｒまたはＰｈｅを、Ｒ³はそれぞ
    れ置換基を有していてもよいＧｌｙまたはα−Ｄ−アミ
    ノ酸残基をそれぞれ示す。〕で表わされるペプチドまた
    はその塩の結晶。
14. 【請求項１４】一般式 ５−ｏｘｏ−Ｐｒｏ−Ｒ¹−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｒ²−Ｒ³−ＯＨ (II) 〔式中、Ｒ¹はＨｉｓ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐまたはｐ−ＮＨ₂
    −Ｐｈｅを、Ｒ²はＴｙｒまたはＰｈｅを、Ｒ³はそれぞ
    れ置換基を有していてもよいＧｌｙまたはα−Ｄ−アミ
    ノ酸残基をそれぞれ示す。〕で表わされるペプチドまた
    はその塩の溶液を熟成させることを特徴とするペプチド
    (II)またはその塩の結晶の製造法。
15. 【請求項１５】ペプチド(II)またはその塩の濃度が約
    ０.０１〜０.０５モル／Lである溶液を約１０〜７０℃
    で約１０〜７０時間熟成させる請求項１４記載の結晶の
    製造法。