CN108779150B - 地加瑞克的制备方法及其中间体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了制备肽、优选为十肽，例如地加瑞克(degarelix)的方法，所述方法通过优选地在逐步固相合成期间将对硝基‑苯丙氨酸并入到氨基酸序列中，并将它们转变成所需氨基酸Aph(Hor)和/或D‑Aph(Cbm)，优选地同时附连到固相支持物。本发明还提供了可用于所述制备方法的中间体。

Description

地加瑞克的制备方法及其中间体
技术领域
本发明涉及用于制备肽的合成过程或方法，其中所述肽中的至少一个氨基酸的特征在于是非天然的氨基苯丙氨酸衍生物，具体为Aph(Hor)或Aph(Cbm)。具体来说，本发明涉及十肽，例如地加瑞克，及其受保护的前体和其他有用中间体的合成。本发明还描述了在所述制备过程中有用的中间体。所述合成方法的特征在于使用对硝基-苯丙氨酸，所述对硝基-苯丙氨酸在最终肽序列中Aph(Hor)和/或D-Aph(Cbm)各自的相应位置处被并入到正在生长的肽链中。另一种合成方法是基于使用式II的化合物，所述式II的化合物本身使用对硝基-苯丙氨酸来合成。
背景技术
氨基酸序列中带有至少一个氨基-苯丙氨酸衍生物例如Aph(Hor)、Aph(Cbm)或Aph(Atz)的肽的合成，极具挑战性。所述合成通常产生具有大量杂质(例如缺失产物或副反应产物)的产物。
WO99/26964致力于解决合成azaline B的问题，所述azaline B是在5位和6位带有两个相同的非天然氨基酸Aph(Atz)的十肽。所述文献建议的合成始于中心“5/6”二肽片段的合成。这种方法的核心是同时掺入两个氨基三唑基团(Atz＝5'-(3'-氨基-1H-1',2',4'-三唑基))。首先，产生硝基取代的苯丙氨酸-苯丙氨酸二肽。然后将所述二肽上的硝基还原以获得氨基取代的二肽。然后通过首先将所述还原的二肽与氰亚胺代碳酸二苯酯反应然后再与肼反应，在所述氨基取代的苯丙氨酸基团上同时形成1,2,4-三唑基团。通过与适合的碱反应，然后将其与丢失的片段进行液相反应获得最终的“5/6”二肽片段。显然，这种简练的方法不适合于合成具有不同Aph侧链的十肽，例如地加瑞克。此外，它不能以固态肽合成方式来进行，而只能以液相合成方式进行。WO99/26964认为固态合成不适合于提供改进的地加瑞克的合成(第7页)。
高效地合成在第5位和第6位具有不同Aph衍生物的肽，仍然是具有挑战性的任务。
US5925730公开了具有GnRH拮抗特性并且可用于治疗的十肽的选择。所有这些拮抗剂都在第5-和/或第6-位具有Aph的衍生物。它们可用通用序列X-D-2Nal-(A)D-Phe-D-3Pal-Ser-Xaa5-Xaa6-Leu-Xaa8-Pro-Xaa10来表示，其中Xaa5是4Aph(Q1)或4Amf(Q1)，其中Q1是D-或L-Hor或D-或L-Imz，并且Xaa6是D-4Aph(Q2)或D-4Amf(Q2)，其中Q2是For、Ac、3-氨基-1,2,4-三唑或Q1。或者，当Xaa6含有Q且其中Q是
Figure BDA0001766707220000021
或D-或L-Hor或D-或L-Imz时，Xaa5可以Ac、For或3-氨基-1,2,4-三唑作为Q1。
所述Aph衍生物可以在其侧链中含有氨甲酰基或包括脲的杂环，例如Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(氢乳清酸基)-D-4Aph(乙酰基)-Leu-Lys(异丙基)-Pro-D-Ala-NH2和Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(氢乳清酸基)-D-4Amf(Q2)-Leu-Lys(异丙基)-Pro-D-Ala-NH2，其中Q2是Cbm或MeCbm。这种肽最著名的例子是十肽地加瑞克。地加瑞克是一种被批准的药品。
下文公开了序列中带有Aph衍生物例如Aph(Hor)或Aph(Cbm)的肽的改进的合成方法，所述方法可以产生高得率和高纯度的产物，而无需投资特殊氨基酸例如Aph(Hor)或Aph(Cbm)的生产或采购。下文还公开了地加瑞克的合成方法。
化合物Ac-D-Nal-D-Cpa-D-Pal-Ser-Aph(Hor)-D-Aph(Cbm)-Leu-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH2，也被称为地加瑞克，由式(I)表示，其中的数字指示了对相关氨基酸位置进行计数的方向：
Figure BDA0001766707220000031
地加瑞克(其药物组合物以商品名
Figure BDA0001766707220000032
销售)，也被称为FE200486，是一种合成的直链十肽，并且是一种第三代促性腺激素释放激素(GnRH)受体拮抗剂(GnRH阻断剂)。它于2008年12月24日被美国食品和药品监督管理局(U.S.Food and DrugAdministration)(FDA)批准用于患有晚期前列腺癌的患者的治疗。它通过降低黄体生成素的水平并抑制睾酮和前列腺特异性抗原(PSA)的分泌来发挥作用(G.Jiang等，J.Med.Chem.44,2001,453-467；M.P.Samant等，Bioorg Med.Chem.Lett.15,2005,2894-2897)。它与许多其他GnRH拮抗剂相比具有许多优点，例如对GnRH受体的高亲和性和高效力、足以用于开发注射配方的水溶性以及能够开发持续释放形式的性质(M.Steinberg.Clin.Ther.31,2009,2312-2331)，上述优点快速降低睾酮浓度，并在这一水平维持更长的时间。
由式I表示的地加瑞克在国际公开WO 98/46634中首次被报道。WO 98/46634公开了使用MBHA树脂上的固相肽合成(SPPS)和对氨基酸的Boc-Να保护来合成地加瑞克。在每个偶联步骤后Boc保护基团的去除，通过三氟乙酸在添加有1％间甲酚的二氯甲烷中的50％溶液来实现。D-Aph(Cbm)和L-Aph(Hor)残基以D-Aph(Fmoc)和L-Aph(Fmoc)的形式被引入到所述肽结构中，随后通过施加哌啶在二甲基甲酰胺中的25％溶液，并分别用异氰酸叔丁酯和氢乳清酸处理进行连续的Fmoc去保护。SPPS完成后，用氟化氢切下所述肽，从而获得全长的地加瑞克。可选地，第5位Aph的Fmoc保护基团可以仅在固相合成完成后去除，最终将所述肽用L-二氢乳清酸修饰。
然而，上述合成方法不产生高纯度的地加瑞克。所述方法涉及使用危险试剂例如氟化氢。此外，在非常强酸性条件下进行的多肽最终切除引起肽的部分降解，这会造成显著量的得率损失。此外，由这些合成导致的杂质分布需要纯化步骤，这引起更高的损失。
在随后几年中，适用于地加瑞克工业生产的可替代方法被提出，其中几种方法基于固相肽合成(SPPS)和液相肽合成(LPPS)，以及这些方法的组合。
WO2010/121835公开了全长地加瑞克的基于Fmoc的逐步SPPS合成方法，其使用分别具有氨甲酰基基团和二氢乳清酸基基团的两种可商购的对氨基苯丙氨酸衍生物，即Aph(Cbm)和Aph(Hor)。在只包含顺序偶联和去保护步骤的常规SPPS过程中，上述残基无需任何修饰即可被引入。通过这种方法获得的地加瑞克显示出含有量低于0.3％的地加瑞克的4-([2-(5-海因基)]乙酰基氨基)-苯丙氨酸类似物，其已知在二氢乳清酸基团在碱性条件中异构化后形成。
另一种基于Fmoc-固相肽合成的方法在WO2011/066386中被公开，该方法用三苯甲基保护基团代替叔丁基对丝氨酸进行保护。使用这种在酸性条件下更不稳定的保护基团可以减少最终切割的时间并获得具有较低杂质含量的粗产物。WO2011/066386还公开了通过(9+1)缩合策略和(3+6+1)缩合策略来合成地加瑞克。
类似地，在WO2012/055903中公开了用于地加瑞克制备的液相缩合方法。在溶液中或在固相上合成地加瑞克的各种不同片段，并将其在溶液中偶联。具体来说，公开了[4+6]策略和[3+7]策略。
中国专利申请CN103992392公开了一种通过引入Aph(Hor)来合成地加瑞克的方法，其中使用了对-氨基的碱不稳定的保护基团Dde。使用2％肼的二甲基甲酰胺溶液将它去保护，随后在固相上偶联氢乳清酸，再从树脂上切下，得到最终粗产物。
中国专利申请CN102952174公开了一种在Rink酰胺树脂上合成地加瑞克的方法，其中在基于Fmoc的SPPS期间引入Aph(Trt)。使用10％三氟乙酸去除所述三苯甲基保护。将未保护的氨基与氢乳清酸偶联。
上文提到的所有方法都包括将Aph衍生物插入到地加瑞克结构中，所述Aph衍生物必须预先通过标准的有机化学方法来制备和纯化。这使整个肽的合成复杂化。此外，这些大体积残基优选地在逐步固相合成期间在肽序列中的引入，由于它们的位阻而被复杂化，并因此可能在偶联步骤中造成困难。这些残基(特别是分别在所述十肽的第5和第6位置中的对氨基苯丙氨酸衍生物Aph(Hor)和D-Aph(Cbm))，由于分子间和分子内氢键形成，也可以引起生长的肽链的聚集。所有这些因素可以引起可注意到的副产物形成，例如缺失产物，即形成的缺少目标序列的氨基酸的副产物。
已知用于制备地加瑞克的方法存在下述一个或多个缺点：由于副产物(缺失产物)的形成而导致的低得率，杂质分布不佳导致在粗品肽纯化期间损失增多，以及对使用危险试剂和复杂过程的需求。
因此，亟需开发一种高效、简单、工业上可行的合成方法，以克服现有技术的缺点并提供高得率和杂质分布理想的(粗品)肽、特别是地加瑞克，以便于高得率、高纯度的生产纯化的肽，例如地加瑞克。
发明目的
本发明的目的是克服上面提到的现有技术的缺点。
本发明的另一个目的是提供一种不使用危险试剂即可合成十肽地加瑞克或其可药用盐的改进的方法。
本发明的另一个目的是提供一种用于合成地加瑞克或其可药用盐的改进的方法，所述方法以高得率和理想的杂质分布产生粗品地加瑞克，便于简化的纯化过程和/或具有与现有技术所获得的相比显著更高的得率和纯度。
本发明的另一个目的是提供对地加瑞克或其可药用盐的合成有用的中间体。
发明内容
本发明提供了一种制备肽或其可药用盐的改进的方法，其中所述肽的特征在于在肽序列中具有Aph(Hor)和/或Aph(Cbm)。优选地，所述Aph(Hor)和Aph(Cbm)位于第5和/或第6位。优选地，所述肽是十肽。最优选地，所述肽是十肽地加瑞克，其在第5和第6位分别为Aph(Hor)和Aph(Cbm)。本发明的方法获得了高得率、较高纯度以及改进的杂质分布的粗品肽。
所述用于制备肽的合成方法，特征在于在所述生长的肽链中并入至少一个对硝基苯丙氨酸，所述肽的特征在于在其序列中优选地在第5位置中具有氨基酸Aph(Hor)或优选地在第6位置中具有氨基酸Aph(Cbm)中的至少一者。所述方法优选地包括使用氨基酸对硝基苯丙氨酸或硝基肽，所述硝基肽的特征在于包含一个或两个对硝基苯丙氨酸残基。在优选实施方式中，这些硝基肽是式II、式V和/或式VII的化合物。所述方法的特征还在于随后将所述并入的对硝基苯丙氨酸转化成最终目标肽序列所需的Aph(Hor)或Aph(Cbm)的步骤。另一方面，本发明提供了制备下式I的地加瑞克或其可药用盐的合成方法：
Figure BDA0001766707220000071
其中所述方法包括使用氨基酸对硝基苯丙氨酸或使用包含一个或两个对硝基苯丙氨酸残基的硝基肽。在优选实施方式中，所述硝基肽是下式II、式V和式VII的化合物。
对硝基-苯丙氨酸可以并入地加瑞克多肽序列第5位、第6位中的一个或两个位点，所述并入到地加瑞克内第6位的对硝基苯丙氨酸是D异构体形式，所述并入到地加瑞克内第5位的对硝基苯丙氨酸是L异构体形式。当未具体指明L或D时，是指L形式。
本发明所述方法可以通过用对硝基-苯丙氨酸代替本领域中已知的体积更大的苯丙氨酸衍生物并将其引入到前体肽中来实现，例如通过向Leu-Lys(iPr,BOC)-Pro-D-Ala、式XI的化合物、D-Aph(Cbm-tBu)-Leu-Lys(iPr,BOC)-Pro-D-Ala或式IX的化合物中添加对硝基-苯丙氨酸来实现。所得中间体可用于生产地加瑞克，例如通过连续还原成对氨基-苯丙氨酸并对其进行修饰来实现。
由于侧链基团的不同，两个Aph氨基酸的侧链基团不能像azaline B那样同时构建，而是例如必须首先建立Aph(Cbm)，然后必须将其用适合的保护基团保护，然后通过还原插入的硝基来建立第二个氨基酸侧链基团例如Aph(Hor)。因此，一个挑战是为这些还原反应寻找适合的条件。本发明人发现氯化亚锡(Sn(II)Cl2)在如下所指示的适合的条件下效果最好。由此，他们开发了一种用于地加瑞克的改进的合成。
优选地，本发明所述的合成以固相肽合成法来进行。因此，反应流程图将显示肽结合到“Resin”。因此，优选地，所述“Resin”是固相支持物。原则上，当所述“Resin”为H时，在溶液中进行合成步骤时，可以进行同样的反应流程。
在固相合成中，可以基于所谓的BOC保护策略或Fmoc保护策略进行保护。更优选地，所述合成是基于Fmoc保护策略，其中末端保护基团Pg是碱不稳定的保护基团，优选为Fmoc。最优选地，本发明所述的所有固态合成都使用Fmoc保护策略来进行。
进行这样的合成面临的另一个挑战是规模放大的能力。通常，固相合成对于适用于规模放大并不理想。令人吃惊的是，下文描述的合成方法可以规模放大至最终产量为至少0.5g。
另一方面，本发明提供了一种用于制备式I的地加瑞克或其可药用盐的肽合成方法，其包括将下式II的化合物转变成地加瑞克或其可药用盐
Figure BDA0001766707220000081
其中Pg是末端保护基团，X是侧链保护基团，Y是侧链保护基团或H，并且Resin是固相支持物。
优选地，上述合成，以及根据本发明的其他肽的合成，以固相肽合成法来进行。甚至更优选地，上述合成使用Fmo流程来进行，其中Pg是Fmoc。
另一方面，本发明提供了一种将式II的化合物转变成地加瑞克或其可药用盐的方法，其特征在于包括下述步骤：
a)将式II的化合物用还原剂处理，以形成下式III的化合物：
Figure BDA0001766707220000091
b)将所述式III的化合物与活化的二氢乳清酸反应，以形成下式IV的化合物：
Figure BDA0001766707220000092
c)重复下述步骤(i)-(ii)，直至形成受保护的十肽，优选通过固相肽合成附连到Resin：
(i)将附连到Resin的受保护的肽去保护以去除末端保护基团，
(ii)使用偶联试剂将受保护的氨基酸(按照所需序列)偶联到与所述Resin相连的肽的末端氨基残基，以形成附连到Resin的受保护的肽，
d)将附连到Resin的受保护的十肽去保护以除去所述末端保护基团，
e)在乙酰化试剂存在下将所得十肽的N-末端乙酰化，以及
f)将乙酰化的十肽从所述Resin切下，以形成地加瑞克或其可药用盐，
其中Pg是末端保护基团，X是侧链保护基团，Y是侧链保护基团或H，并且Resin是固相支持物。
另一方面，本发明提供了一种将式II的化合物转变成地加瑞克或其可药用盐的方法，优选为固相多肽合成法，其特征在于该方法包括下述步骤：
a)提供式II的化合物，
b)重复下述步骤(i)-(ii)，直至形成附连到Resin的受保护的十肽：
(i)将所述附连到Resin的受保护的肽去保护以除去所述末端保护基团，
(ii)使用偶联试剂将受保护的氨基酸(按照所需序列)偶联到与所述Resin相连的末端氨基残基，以形成附连到所述Resin的受保护的肽；
c)将附连到Resin的受保护的十肽去保护以去除末端保护基团，
d)在乙酰化试剂存在下将所得十肽的N-末端乙酰化，以产生下式V的化合物：
Figure BDA0001766707220000101
e)将式V的化合物用还原剂处理，以形成式下VI的化合物：
Figure BDA0001766707220000102
f)将所述式VI的化合物与活化的二氢乳清酸反应，以形成附连到所述Resin的受保护的十肽；以及
g)将所述十肽从所述Resin切下，以形成地加瑞克或其可药用盐，
其中X和Z是侧链保护基团，Y是侧链保护基团或H，并且“Resin”是固相支持物。
另一方面，本发明提供了一种用于式II的化合物的固相合成的方法，其包括下述步骤：
a)将下式VII的化合物用还原剂还原，以形成下式VIII的化合物：
Figure BDA0001766707220000111
其中Pg是末端保护基团；X是侧链保护基团，并且Resin是固相支持物，
Figure BDA0001766707220000112
其中Pg是末端保护基团；X是侧链保护基团，并且Resin是固相支持物；
b)将所述式VIII的化合物与异氰酸烷基酯或氰酸碱金属盐反应，以形成下式IX的化合物：
Figure BDA0001766707220000113
其中Pg是末端保护基团，X和Y是侧链保护基团，或者当使用氰酸碱金属盐时Y是H，并且Resin是固相支持物，以及
c)将所述式IX的化合物去保护以除去所述末端保护基团，然后在偶联试剂存在下与式X的受保护的氨基酸偶联，以形成所述式II的化合物，
Figure BDA0001766707220000121
其中Pg是末端保护基团。
另一方面，本发明提供了一种用于式VII的化合物的固相合成方法，所述方法包括下述步骤：将所述式XI的化合物去保护以除去末端保护基团，然后在偶联试剂存在下与式X的受保护的氨基酸(D-异构体)偶联，以形成所述式VII的化合物，
Figure BDA0001766707220000122
其中Pg是末端保护基团，X是侧链保护基团，并且Resin是固相支持物。
本发明另一方面提供了式II、式V和式VII的化合物。
本发明另一方面提供了这些化合物在地加瑞克合成中的应用。
附图说明
图1：这张图示出了乙酸地加瑞克的固相合成的流程，其中使用了适合的肽前体，由此将L-对硝基-Phe和D-对硝基-Phe残基分别掺入在第5位和第6位。
图2：这张图示出了乙酸地加瑞克的固相合成的流程，其中使用了适合的肽前体，由此将L-对硝基-Phe残基掺入在第5位。
图3：这张图示出了实施例3.1中使用连二亚硫酸盐进行还原后五肽的HPLC图谱。
图4：这张图示出了实施例3.2中使用氯化锡进行还原后五肽的HPLC图谱。
具体实施方式
当在本发明中使用时，术语“末端保护基团”是指氨基甲酸酯类型的保护基团。本发明优选的末端保护基团是Fmoc(9-芴基甲氧基羰基)，其可以在酸性条件下去除。在另一个实施方式中，所述末端保护基团是BOC。
当在本发明中使用时，术语“侧链保护基团”是指用于肽侧链中氨基或羟基的保护基团，其在适合的条件下去除，但在末端保护基团或另一种氨基保护基团被去除的条件下不被去除。优选地，侧链保护基团是用于保护侧链中反应活性特别高或不稳定的氨基酸，以避免副反应的发生和/或分子生长过程中产生分支。选择适合的侧链保护基团X、Y和Z的标准是：所述保护基团通常应该在合成的每一步中在被选择用于去除末端氨基保护基团的反应条件下对试剂稳定，并且在所需氨基酸序列合成完成后可以在不改变肽链的反应条件下被去除。优选地，X是胺保护基团，例如叔丁氧基羰基(Boc)；Y是氢或胺保护基团，例如烷基或更优选为叔丁基；Z是羟基保护基团，例如叔丁基。
当在本发明中使用时，术语“盐”包括酸的盐，例如盐酸盐和乙酸盐。
当在本发明中使用时，术语“肽”被理解为是彼此通过肽键偶联的、最小长度为2个氨基酸的氨基酸或氨基酸衍生物的序列。当在本发明中使用时，术语“硝基肽”是包含一个或两个对硝基-苯丙氨酸残基的肽。
术语十肽是通过肽键偶联的10个氨基酸的链。
在本发明使用术语“Resin”的情况下，它被理解为包含适于进行固相肽合成的固相支持物，在(将肽)从所述Resin上切下后可获得C-端酰胺，除非明确说明“Resin”是H(质子)。在“Resin”是H的情况下，在所述指称中包含游离(未结合)形式的肽。用于基于Fmoc合成的优选固相支持物选自Rink酰胺树脂、Rink酰胺AM树脂和Rink酰胺MBHA树脂；更优选地，所述Resin是Rink酰胺MBHA树脂。基于Boc合成的优选固相支持物是二苯甲胺树脂(BHA)或4-甲基二苯甲胺树脂(MBHA)，更优选为甲基二苯甲胺树脂。
当在本发明中使用时，术语“活化的酸”是指能够在与胺反应后形成肽键的酸衍生物。
术语“活化的二氢乳清酸”被理解为是通过一种或多种偶联试剂活化的二氢乳清酸，或者是二氢乳清酸的衍生物例如HOR-CO-Hal，其中Hal是Cl、Br或F。
本发明提供了一种用于制备肽、优选为以在其序列中具有至少一个Aph衍生物、优选为Aph(Hor)或Aph(Cbm)为特征的肽、更优选为十肽或其可药用盐的改进的方法，所述方法包括在最终的肽中是Aph衍生物、优选为Aph(Hor)和/或Aph(Cbm)的那些位置中并入对硝基苯丙氨酸残基。优选地，所述肽是第5位是Aph(Hor)并且第6位是Aph(Cbm)的十肽。最优选地，所述十肽是地加瑞克。这些对硝基苯丙氨酸残基的硝基随后被还原成氨基，并且它们随后被修饰以优选地在所述十肽的第5和6位置中分别获得Aph(Hor)和D-Aph(Cbm)。它们的修饰顺序地(不是同时地)发生。
发明人发现，通过引入对硝基苯丙氨酸代替它们的体积更大的衍生物，然后将它们在并入到肽中时，优选地在SPPS期间在结合到固相(即Resin)时转变成正确的氨基酸衍生物：Aph(Hor)和D-Aph(Cbm)基团，可以制造令人吃惊的药物纯的地加瑞克。发明人还发现，这种策略显著地促进或简化肽链形成。出人意料地，这种以使用相应的对硝基前体为特征的地加瑞克合成，与WO2010/121835中公开的经典方法相比，获得高纯度和杂质分布理想的粗产物，促使HPLC纯化获得更好的分离效果，并因此提高最终得率。
在第一种情况下，本发明提供了用于制备地加瑞克或其可药用盐的肽合成方法。所述地加瑞克或其可药用盐的改进合成方法是基于下述策略，即将对硝基苯丙氨酸残基并入到用于合成地加瑞克的氨基酸序列中的第5位，随后将所述硝基还原成氨基并对它们进行修饰以获得Aph(Hor)，然后继续进行所述合成。在优选实施方式中，所述合成是固相肽合成。优选的合成方法包括将式II的化合物转化成地加瑞克或其可药用盐。
式II所示的新化合物可以通过不同程序转变成地加瑞克或其可药用盐。本发明描述了其中的两种程序。
在本发明的一个实施方式中，涉及式II所示化合物的地加瑞克或其可药用盐的肽合成方法是基于下述策略：随后将并入的硝基还原成氨基并对其进行修饰以获得Aph(Hor)，然后继续进行固相合成。
所述方法包括下述步骤：
a)将所述式II的化合物用还原剂处理以形成式III的化合物，
b)将所述式III的化合物与活化的二氢乳清酸反应，以形成式IV的化合物，所述活化的二氢乳清酸可以是通过偶联剂的存在而被活化的二氢乳清酸，
c)用不同氨基酸重复下述步骤(i)-(ii)，直至形成附连到固相支持物的受保护的十肽：
(i)将附连到Resin的受保护的肽去保护以去除所述末端保护基团，
(ii)使用偶联试剂将受保护的氨基酸(按照所需序列)偶联到与所述Resin相连的末端氨基残基，以形成附连到Resin的受保护的肽，
d)将所述附连到Resin的受保护的十肽去保护以去除所述末端保护基团，
e)在乙酰化试剂存在下将所得十肽的N-末端乙酰化，以及
f)将乙酰化的十肽从所述固相支持物切下，以获得在第5位为Aph(Hor)氨基酸的十肽或其可药用盐。优选地，所述十肽是地加瑞克。
在步骤a)中使用的还原剂选自但不限于连二亚硫酸钠、氯化亚锡(II)或铁粉。优选地，所述还原在氯化亚锡(II)存在下进行。
在步骤b)中，将所述式III的化合物与活化的二氢乳清酸反应以形成所述式IV的化合物。当所述活化通过偶联试剂来促进时，适合的偶联试剂是Ν,Ν'-二异丙基碳二亚胺、二环己基-碳二亚胺、乙基-二甲基氨基丙基碳二亚胺(EDC)。优选地，所述反应在N,N'-二异丙基碳二亚胺存在下进行。
所述反应也可以在偶联剂和添加剂存在下进行。已发现，添加剂的添加减少了酰胺键形成(即肽键形成)期间的消旋。当添加到所述偶联反应中时，添加剂引起形成的肽得率提高和消旋率降低。添加剂与氨基酸形成活化酯。它们抑制副反应例如噁唑酮和N-酰基脲的形成。适合的添加剂优选自1-羟基苯并三唑(HOBt)、2-羟基吡啶N-氧化物、N-羟基琥珀酰亚胺、1-羟基-7-氮杂苯并三唑和内-N-羟基-5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚胺。更优选地，所述反应在Ν,Ν'-二异丙基碳二亚胺和1-羟基苯并三唑存在下进行。
在步骤c)中，通过肽链的延伸来制备与仍然与Resin附连的受保护的十肽，这种概念被称为固相肽合成，其包括首先从附连到Resin的受保护的肽去除末端保护基团，然后以所需顺序与末端受保护的氨基酸逐步偶联，直至形成所需十肽。
在第一步(i)中，如果所述N-末端保护基团是Fmoc的话，其可以通过用碱、优选为有机碱、更优选为胺进行处理来去除。所述碱可以选自哌啶、哌嗪、DBU和二乙胺，优选为哌啶和DBU，并且最优选地使用哌啶。
在第二步(ii)中，在偶联试剂存在下将所述结合到Resin的受保护的肽与下一个受保护的氨基酸偶联，所述偶联试剂选自1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、Ν,Ν'-二环己基碳二亚胺(DCC)、Ν,Ν'-二异丙基碳二亚胺、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基六氟磷酸脲(HBTU)或基于脲盐或鏻盐的任何偶联试剂。优选地，所述反应在2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基六氟磷酸脲存在下进行。
所述偶联反应可以在碱存在下进行，所述碱选自叔胺如二异丙基乙基胺、三乙胺、N-甲基吗啉、N-甲基哌啶，优选地，所述反应在二异丙基乙基胺存在下进行。
所述步骤(i)和(ii)可以重复进行，直至形成所需十肽。
为了在第二步中获得产生地加瑞克所需的氨基酸序列，需要按先后顺序将下述末端受保护的氨基酸逐步偶联：Pg-Ser-OH，Pg-3-Pal-OH，Pg-D-Cpa-OH和Pg-D-Nal-OH。如有需要，所述氨基酸残基可以用侧链保护基团保护。优选地，可在所述合成中使用Pg-Ser(Z)-OH，其中Z是侧链保护基团，优选为叔丁基保护基团。
在步骤d)中，在所需氨基酸序列的合成完成后，通过用碱处理去除末端保护基团，所述碱优选自哌啶、三乙胺、DBU、N-甲基吗啉和N-甲基哌啶，最优选地使用哌啶。
在步骤e)中，在末端氨基被解保护且所需侧链基团仍被保护时，进行乙酰化。优选地，上述反应可以在二异丙基或二环己基碳二亚胺(DIC或DCC)存在下使用乙酸进行，或者通过一些其他适合的酰化反应来进行，例如使用乙酰咪唑。或者，乙酰化通过将所述肽与乙酸酐反应来进行。
在步骤f)中，通过用酸、优选用三氟乙酸处理所述偶联的十肽，将乙酰化的十肽从所述Resin上解偶联，所述酸不仅从Resin上切下所述肽，而且切下所有剩余的侧链保护基团从而得到乙酸地加瑞克。
使用上面描述的基于使用式II的化合物的合成来合成地加瑞克的优选方法描述在图1中。图1还示出了获得式II的化合物的一种方式，其涉及使用式VII的化合物。
描述式II的化合物向地加瑞克或其可药用盐的转变过程的另一种合成方法是基于在所述十肽序列中的第5位并入对硝基苯丙氨酸残基，所述方法的特征在于继续进行固相合成从而添加所述十肽、优选地加瑞克所需的所有氨基酸。只有在所述肽的合成完成后，才将第5位氨基酸残基的硝基还原成氨基并进一步修饰成Aph(Hor)。
所述方法包括下述步骤：
a)提供所述式II的化合物，
b)重复下述步骤(i)-(ii)，直至形成附连到Resin的受保护的十肽：
(i)将附连到Resin的受保护的肽去保护以去除所述末端保护基团，
(ii)使用偶联试剂将在N-末端受保护的另一个氨基酸(按照所需序列)偶联到与所述Resin附连的末端氨基残基，以形成附连到所述Resin的、延长一个氨基酸的受保护的肽；
c)将附连到Resin的受保护的十肽去保护以去除末端保护基团，
d)在乙酰化试剂存在下将所得的十肽的N-末端乙酰化，以形成所述式V的化合物，
e)用还原剂处理所述式V的化合物，以形成所述式VI的化合物，
f)在偶联试剂存在下将所述式VI的化合物与二氢乳清酸反应，以形成附连到所述Resin的受保护的十肽；以及
g)将所述十肽从所述Resin切下，以形成地加瑞克或其可药用盐。
在步骤b)中，通过常用的固相肽合成方法将所述式II的化合物转变成附连到Resin的受保护的十肽，其包括首先去除末端保护基团，然后按所需顺序逐步与末端受保护的氨基酸偶联，直至形成所述十肽。
在第一步(i)中，如果N-末端保护基团是Fmoc的话，可以通过用碱、优选有机碱、更优选胺进行处理来去除。所述碱可以选自哌啶、哌嗪、DBU和二乙胺，优选为哌啶和DBU，并且最优选地使用哌啶。
在第二步(ii)中，在偶联试剂存在下，将所述结合到Resin的受保护的肽与下一个受保护的氨基酸偶联，所述偶联试剂选自1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、Ν,Ν'-二环己基碳二亚胺(DCC)、Ν,Ν'-二异丙基碳二亚胺、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基六氟磷酸脲(HBTU)或基于脲盐或鏻盐的任何偶联试剂。优选地，所述反应在2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基六氟磷酸脲存在下进行。
所述偶联反应可以在碱存在下进行，所述碱选自叔胺如二异丙基乙基胺、三乙胺、N-甲基吗啉、N-甲基哌啶，优选地，所述反应在二异丙基乙基胺存在下进行。
所述第一步(i)和第二步(ii)可以重复，直至形成所需十肽。
为了在第二步中生产作为优选十肽的地加瑞克，必须按照顺序逐步偶联下述末端受保护的氨基酸：Pg-Ser-OH，Pg-3-Pal-OH，Pg-D-Cpa-OH和Pg-D-Nal-OH。如有需要，所述氨基酸残基可以用侧链保护基团进行保护。优选地，在所述肽合成中使用Pg-Ser(Z)-OH，其中Z是侧链保护基团。优选地，Z是羟基保护基团，例如tBu或三苯甲基。
在步骤c)中，在目标氨基酸序列的合成完成后，按照如上所述的条件用适合的碱处理来去除末端保护基团，所述碱优选自哌啶、三乙胺、DBU、N-甲基吗啉和N-甲基哌啶，最优选为哌啶。
在步骤d)中，在末端氨基被解保护且所需侧链基团仍被保护时，优选地进行乙酰化反应。优选地，将与Resin结合的肽在二异丙基或二环己基碳二亚胺(DIC或DCC)存在下用乙酸处理。或者，所述反应可以使用乙酸酐来进行，或通过一些其他适合的酰化反应、例如使用乙酰咪唑来进行。所述乙酰化过程产生所述式V的化合物。
在步骤e)中，将所述式V的化合物还原成式VI的化合物。所使用的还原剂选自但不限于连二亚硫酸钠或氯化亚锡(II)。优选地，所述还原在氯化亚锡(II)存在下进行。
在步骤f)中，将所述式VI的化合物与活化的二氢乳清酸反应以形成附连到Resin的受保护的十肽。如果所述活化是基于偶联试剂的存在，则所述偶联试剂选自Ν,Ν'-二异丙基碳二亚胺、二环己基-碳二亚胺和乙基-二甲基氨基丙基碳二亚胺(EDC)。优选地，所述反应在N,N'-二异丙基碳二亚胺存在下进行。
所述反应也可以在偶联试剂和添加剂存在下进行。已发现，添加剂的添加可以减少酰胺键形成(即肽键形成)期间的消旋。当添加到所述偶联反应中时，添加剂引起所形成的肽的得率提高和消旋率降低。添加剂与氨基酸形成活化酯。它们抑制副反应例如噁唑酮和N-酰基脲的形成。适合的添加剂优选自1-羟基苯并三唑(HOBt)、2-羟基吡啶N-氧化物、N-羟基琥珀酰亚胺、1-羟基-7-氮杂苯并三唑和内-N-羟基-5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚胺。更优选地，所述反应在Ν,Ν'-二异丙基碳二亚胺和1-羟基苯并三唑存在下进行。
在步骤g)中，通过用酸、优选用三氟乙酸处理与所述Resin结合的肽，将所需肽从Resin上解偶联，上述处理不仅可以从Resin上切下所述肽，而且可以将所有剩余的侧链保护基团切下。
使用上述基于使用式II的化合物的合成来合成地加瑞克的优选方法如图2所示。图2还示出了合成式II的化合物的可选方式。
通过本发明的方法制备的地加瑞克的杂质分布有利于通过标准的HPLC纯化方法更有效地纯化。此外，它在无需预先合成Aph衍生物的情况下即可制备地加瑞克，从而使得所述合成方法被显著简化并且更加经济。
在上述方法中使用的式II的化合物可以通过下文描述的新方法来制备。
另一方面，本发明提供了一种式II所示化合物的固相合成方法，所述方法包括下述步骤：
a)用还原剂还原所述式VII的化合物，以形成所述式VIII的化合物，
b)将所述式VIII的化合物与异氰酸烷基酯或氰酸碱金属盐反应，以形成所述式IX的化合物，以及
c)将所述式IX的化合物去保护以去除末端保护基团，然后在偶联试剂存在下与式X的受保护的氨基酸偶联，以形成所述式II的化合物。
在步骤a)中，将所述式VII的化合物还原成式VIII的化合物。所使用的还原剂选自但不限于连二亚硫酸钠或氯化亚锡(II)。优选地，所述还原在氯化亚锡(II)存在下进行。
在步骤b)中，所述式VIII的化合物与氰酸碱金属盐、优选为氰酸钾或氰酸钠反应产生式IX的化合物，其中所述侧链保护基团Y是氢。在另一种可选方式中，所述式VIII的化合物与异氰酸烷基酯例如异氰酸叔丁酯或异氰酸三苯甲基酯反应产生式IX的化合物，其中所述侧链保护基团Y是烷基。所述反应可以在选自极性非质子溶剂例如二甲基甲酰胺或N-甲基吡咯烷酮的溶剂中进行。优选地，所述反应在二甲基甲酰胺中进行。
在步骤c)中，如果所述N-末端保护基团是Fmoc的话，其可以通过用碱、优选为有机碱、更优选为胺进行处理来去除。所述碱可以选自哌啶、哌嗪、DBU和二乙胺，优选为哌啶和DBU，并且最优选地使用哌啶。在去除所述保护基团之后，将所得肽的化合物在偶联试剂存在下与式X的化合物(L异构体)偶联，以形成所述式II的化合物。所述偶联试剂可以选自1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、Ν,Ν'-二环己基碳二亚胺(DCC)、Ν,Ν'-二异丙基碳二亚胺、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基六氟磷酸脲(HBTU)或基于脲盐或鏻盐的任何偶联试剂。优选地，所述反应在2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基六氟磷酸脲存在下进行。
另一方面，本发明提供了式II、V和VII的化合物，上述化合物作为用于合成十肽、优选用于合成地加瑞克的新的中间体。这些中间体肽在本发明中以其游离形式(其中Resin是H)以及以其结合到固相支持物的形式(其中Resin是固相支持物)公开。
所述在制备式II的化合物的方法中使用的式VII的化合物是新的，并且可以采用下文所述方法制备。
另一方面，本发明提供了一种合成式VII所示化合物的方法，其特征在于包括下述步骤：将所述式XI的化合物去保护以去除末端保护基团，然后在偶联试剂存在下与式X的受保护的氨基酸(D-异构体)偶联，以形成所述式VII的化合物。
所述末端保护基团可以通过用碱、优选有机碱、更优选胺进行处理来去除。所述碱可以选自哌啶、哌嗪、DBU和二乙胺，优选为哌啶和DBU，并且最优选使用哌啶。在去除所述保护基团之后，将所得肽与式X的化合物的D-异构体偶联。所述偶联在偶联试剂存在下进行，并导致形成所述式VII的化合物。所述偶联试剂可以选自1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、Ν,Ν'-二环己基碳二亚胺(DCC)、Ν,Ν'-二异丙基碳二亚胺、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基六氟磷酸脲(HBTU)或基于脲盐或鏻盐的任何偶联试剂。优选地，所述反应在2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基六氟磷酸脲存在下进行。
如上所述的固相合成可以在非质子性溶剂中进行，所述非质子溶剂选自二甲基甲酰胺和N-甲基吡咯烷酮。优选地，所述反应在二甲基甲酰胺中进行。
从所述固相支持物释放地加瑞克的优选方法是采用酸进行处理，更优选地用TFA进行处理。
通过使用上述合成方法，可以避免全部残基Aph(Hor)和D-Aph(Cbm)的并入或至少Aph(Hor)的并入。因此，可以消除与插入这种大体积氨基酸残基相伴的复杂情况，并且极大减少相应的des-肽(缺失肽，其缺少一个或多个氨基酸)的形成。因此，在所述肽中Aph(Hor)-或Aph(Hor)-和D-Aph(Cbm)-基团的构建可以引人注目地提高获得的粗品肽的纯度，特别是在作为固态肽合成进行时。可以使用这种新的合成获得的杂质分布有利于使用HPLC的常规后续纯化，因为所述杂质更容易分离。此外，所述方法可以引人注目地便于所述肽的总体合成，因为在这种情况下不需要制备和纯化待插入到肽序列中的中间体Aph衍生物。在这些残基的构建期间所有的副产物和过量的试剂，可以通过过滤和清洗容易地去除。
因此，上述合成方法使用体积较小的中间体，通过使用式II和/或X的化合物，避免了使用危险试剂，并提供了用于合成地加瑞克或其盐的简单方法，其与本领域中已知的方法相比产生具有更高得率和/或更高纯度的产物。
本发明的优选实施方式：
1.一种用于制备肽或其可药用盐的方法，其中所述肽的特征在于在所述肽序列或其可药用盐中具有至少一个Aph衍生物，所述Aph衍生物优选自Aph(Hor)和Aph(Cbm)，其中所述方法包括使用对硝基苯丙氨酸或硝基肽，优选地将至少一个、更优选地将一个硝基苯丙氨酸并入到所述肽序列中；然后将所述肽序列内并入的硝基苯丙氨酸残基修饰成相应的Aph衍生物。优选地，所述肽是十肽。更优选地，Aph(Hor)和/或Aph(Cbm)在第5位和第6位。
2.根据实施方式1的方法，其中所述肽是式I的地加瑞克或其可药用盐。
3.根据实施方式1或2的方法，其中所述硝基肽的特征在于包含一个或两个对硝基苯丙氨酸残基，并且优选地其中所述硝基肽是式II、V或VII的化合物，最优选为式II的化合物。
4.根据上述实施方式任一项的方法，其中所述方法包括将式II的化合物转变成地加瑞克或其可药用盐，其中Pg是末端保护基团，X和Y是侧链保护基团，并且Resin是H或固相支持物。
5.根据上述实施方式任一项的方法，其中所述方法以固相肽合成进行。
6.根据上述实施方式任一项的方法，其特征在于包括下述步骤：
a)用还原剂处理式II的化合物以形成式III的化合物，其中Pg是末端保护基团，X和Y是侧链保护基团，并且Resin是固相支持物；
b)将所述式III的化合物与活化的二氢乳清酸反应，以形成式IV的化合物，其中Pg是末端保护基团，X和Y是侧链保护基团，并且Resin是固相支持物；
c)重复下述附连到Resin的步骤(i)-(ii)，直至形成受保护的十肽：
(i)将受保护的肽去保护以去除所述末端保护基团，
(ii)使用偶联试剂将受保护的氨基酸(按照所需序列)偶联到与所述Resin附连的肽的末端氨基残基，以形成延长一个氨基酸的受保护的肽，
d)将所述受保护的十肽去保护以去除所述末端保护基团，
e)在乙酰化试剂存在下将所得十肽的N-末端乙酰化，以及
f)将乙酰化的十肽从所述Resin切下，以形成地加瑞克或其可药用盐；
由此将式II的化合物转变成地加瑞克或其可药用盐。
7.根据实施方式6的方法，其中在步骤b)中，所述活化的二氢乳清酸由偶联试剂活化，所述偶联试剂选自Ν,Ν'-二异丙基碳二亚胺、二环己基碳二亚胺和乙基-二甲基-氨基丙基碳二亚胺(EDC)，所述偶联试剂优选为N,N'-二异丙基碳二亚胺，更优选为Ν,Ν'-二异丙基碳二亚胺与1-羟基苯并三唑的组合。
8.根据实施方式1至5任一项的方法，其包括下述步骤：
a)提供式II的化合物，
b)重复下述步骤(i)-(ii)，直至形成附连到Resin的受保护的十肽：
(i)将附连到Resin的受保护的肽去保护以去除所述末端保护基团，
(ii)使用偶联试剂将受保护的氨基酸按照所需序列偶联到与所述Resin附连的肽的末端氨基残基，以形成附连到所述Resin的受保护的肽；
c)将受保护的十肽去保护以除去末端保护基团，
d)在乙酰化试剂存在下将所得十肽的N-末端乙酰化，以产生式V的化合物，其中X、Y和Z是侧链保护基团，并且Resin是固相支持物；
e)用还原剂处理所述式V的化合物，以形成式VI的化合物，其中X、Y和Z是侧链保护基团，并且Resin是固相支持物，
f)将所述式VI的化合物与活化的二氢乳清酸反应，以形成附连到所述Resin的受保护的十肽；以及
g)将所述十肽从所述Resin切下，以形成地加瑞克或其可药用盐。
9.根据实施方式8的方法，其中在步骤e)中，所述还原剂选自连二亚硫酸钠或氯化亚锡(II)，优选为氯化亚锡(II)。
10.根据实施方式8的方法，其中在步骤f)中，所述活化的二氢乳清酸通过偶联试剂活化，所述偶联试剂选自Ν,Ν'-二异丙基碳二亚胺、二环己基碳二亚胺和乙基-二甲基-氨基丙基碳二亚胺(EDC)，所述偶联试剂优选为Ν,Ν'-二异丙基碳二亚胺，更优选为Ν,Ν'-二异丙基碳二亚胺与1-羟基苯并三唑的组合。
11.式II的化合物，其中Pg是末端保护基团或H，X和Y是侧链保护基团或H，并且Resin是固相支持物，或者，所述化合物未附连到固相支持物，所述Resin是H。
12.制备式II的化合物的方法，其特征在于包括下述步骤：
a)将式VII的化合物用还原剂还原以形成式VIII的化合物，所述式VII中Pg是末端保护基团，X是侧链保护基团，并且Resin是固相支持物，所述式VIII中Pg是末端保护基团，X是侧链保护基团，并且Resin是固相支持物；
b)将所述式VIII的化合物与异氰酸烷基酯或氰酸碱金属盐反应，以形成式IX的化合物，其中Pg是末端保护基团，X和Y是侧链保护基团，其中当存在氰酸碱金属盐时，Y是H，并且当存在异氰酸烷基酯并且Resin是固相支持物时，Y是tBu或另一种烷基；
c)将所述式IX的化合物去保护以除去所述末端保护基团，然后在偶联试剂存在下与式X所示氨基酸的受保护的D-异构体偶联，其中Pg是末端保护基团，优选为Fmoc，以形成所述式II的化合物。
13.根据实施方式6或12的方法，其中在步骤a)中，所述还原剂是连二亚硫酸钠或氯化亚锡(II)，优选为氯化亚锡(II)。
14.根据实施方式12的方法，其中制备所述式VII的化合物包括下述步骤：通过去除末端保护基团将所述式XI的化合物去保护，其中Pg是末端保护基团，X是侧链保护基团，并且Resin是固相支持物；随后在偶联试剂存在下与式X所示受保护的氨基酸的D-异构体偶联，以形成所述式VII的化合物。
15.根据实施方式12的方法，其中所述偶联试剂选自l-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、Ν,Ν'-二环己基碳二亚胺(DCC)、Ν,Ν'-二异丙基碳二亚胺和2-(1H-苯并三唑-l-基)-1,1,3,3-四甲基六氟磷酸脲(HBTU)，优选为2-(1H-苯并三唑-l-基)-1,1,3,3-四甲基六氟磷酸脲(HBTU)。
16.式V的化合物，其中X、Y和Z是侧链保护基团或H；并且Resin是固相支持物；并且其中所述化合物未被附连到固相支持物时，所述Resin是H。
17.式VII的化合物，其中Pg是末端保护基团或H，X是侧链保护基团或H，并且Resin是固相支持物，和/或其中所述肽未被附连到固相支持物时，所述Resin是H。
18.式X、式II、式V或式VII的化合物用于肽的合成，优选地用于地加瑞克的合成的用途。
19.根据描述上述合成方法的实施方式任一项的方法，其特征在于是基于Fmoc保护策略，其中所述末端保护基团Pg是碱不稳定的保护基团Fmoc。
缩略语
Aph 氨基苯丙氨酸
Amf 氨基甲基苯丙氨酸
For 甲酰基
Imz 4-羰基-2-咪唑烷酮
GnRH 促性腺激素释放激素
SPPS 固相肽合成
LPPS 液相肽合成
MBHAResin 甲基二苯甲基酰胺Resin
Fmoc-Rink酰胺AM-Resin 4-(2',4'-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲 基)-苯氧基乙酰氨基甲基聚苯乙烯 Resin
Fmoc-Rink酰胺-MBHAResin 4-(2',4'-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲 基)-苯氧基乙酰氨基-4-甲基二苯甲胺 聚苯乙烯Resin
Fmoc-D-Ala-RinkResin 9-芴基甲基氧基羰基-D-丙氨酸 -RinkResin
Fmoc-D-Ala-OH 9-芴基甲基氧基羰基-D-丙氨酸
Fmoc-Pro-OH 9-芴基甲基氧基羰基-L-脯氨酸
Fmoc-Lys(iPr,Boc)-OH 9-芴基甲基氧基羰基-N(ε)-异丙基- N(ε)-Boc-赖氨酸
Fmoc-Leu-OH 9-芴基甲基氧基羰基-亮氨酸-OH
Fmoc-D-Phe(NO2)-OH 芴基甲氧基羰基-D-4-硝基苯丙氨酸
Fmoc-Phe(NO2)-OH 芴基甲氧基羰基-4-L-硝基苯丙氨酸
Fmoc-D-Aph(Cbm)-OH 9-芴基甲基氧基羰基-N(4)-氨甲酰基- D-4-氨基苯丙氨酸
Fmoc-Ser(tBu)-OH 9-芴基甲基氧基羰基-O-叔丁基-丝氨 酸
Fmoc-D-3-Pal-OH 9-芴基甲基氧基羰基-D-3-吡啶基丙氨 酸
Fmoc-D-Cpa-OH/ 9-芴基甲基氧基羰基-D-4-氯苯丙氨酸
Fmoc-D-Phe(4-Cl)-OH
Fmoc-D-Nal-OH 9-芴基甲基氧基羰基-D-2-萘基丙氨酸
Fmoc-Aph(L-Hor)-OH 9-芴基甲基氧基羰基-N(4)-(L-氢乳清 酸基)-4-氨基苯丙氨酸
Aph(Hor) N(4)-(L-氢乳清酸基)-4-氨基苯丙氨酸
D-Aph(Cbm) 4-(氨基羰基)氨基-D-苯丙氨酸
Aph(Trt) 4-(三苯甲基)氨基-D-苯丙氨酸
Hor 二氢乳清酸基
Fmoc 9-芴基甲基氧基羰基
Boc 叔丁基氧基羰基
Dde 1,1-二氯-2,2-双(对氯苯基)乙烯
HPLC 高压液相色谱
L-对硝基-Phe L-对硝基苯丙氨酸
D-对硝基-Phe D-对硝基苯丙氨酸
DIPEA 二异丙基乙基胺
tBu-NCO 异氰酸叔丁酯
Ac2O 乙酸酐
SnCl2 氯化亚锡(II)
Hor-OH 二氢乳清酸
HOBt 1-羟基苯并三唑
TFA 三氟乙酸
DCC N,N'-二环己基碳二亚胺
EDC 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚 胺
DIC 二异丙基碳二亚胺
HBTU 2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基 六氟磷酸脲
实施例
适于按照本发明制备地加瑞克的详细实验参数由下述实施例提供，所述实施例旨在说明而不是限制本发明的所有可能的实施方式。
实施例1：通过固相合成制备地加瑞克
步骤1：Fmoc-D-Phe(p-NO2)-Leu-Lys(Boc,iPr)-Pro-D-Ala-Rink树脂的制备
受保护的肽的合成使用Rink酰胺树脂(200mg，载量0.65mmol/g)，通过逐步固相肽合成来进行。将所述树脂在2ml二甲基甲酰胺中溶胀后，由哌啶的二甲基甲酰胺20％溶液(2×2ml，5min和20min)去除Fmoc保护基团，并将所述树脂用二甲基甲酰胺清洗(4×2ml)。将Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Lys(Boc,iPr)-OH、Fmoc-Leu-OH和Fmoc-D-Phe(p-NO2)-OH(相对于所述树脂的载量三倍，并且在Fmoc-Lys(Boc,iPr)-OH的情况下两倍)在二异丙基乙基胺(136μl，0.67mmol)存在下用HBTU(150mg，0.4mmol)活化，并在50min内偶联到所述树脂，得到Fmoc保护的五肽。所述中间体的Fmoc去保护如上所述进行。
步骤2：Fmoc-D-Aph-Leu-Lys(Boc,iPr)-Pro-D-Ala-Rink树脂的制备
将获得的肽树脂用反应溶剂处理15小时，所述反应溶剂是SnCl2(0.6g，3.2mmol)和二异丙基乙基胺(70μl，0.4mmol)的在2.5ml二甲基甲酰胺中的溶液。在反应结束时，过滤掉所述溶剂并将所述树脂用二甲基甲酰胺清洗(3×2ml)。
步骤3：Fmoc-D-Aph(Cbm)-Leu-Lys(Boc,iPr)-Pro-D-Ala-Rink树脂的制备
向所述获得的连接到树脂的肽添加氰酸钾(60mg，0.74mmol)在2.5ml含有10％的85％磷酸(v/v)的二甲基甲酰胺中的溶液。将所述反应静置继续6小时，过滤掉溶剂并添加新鲜制备的氰酸钾溶液。在6小时后，将所述树脂用二甲基甲酰胺清洗(3×2ml)。通过哌啶在二甲基甲酰胺中的20％溶液(2×2ml，5min和20min)去除Fmoc保护基团，并将所述树脂再次用二甲基甲酰胺清洗(4×2ml)。
步骤4：Fmoc-Aph-D-Aph(Cbm)-Leu-Lys(Boc,iPr)-Pro-D-Ala-Rink树脂的制备
在二异丙基乙基胺(136μl，0.67mmol)存在下，用HBTU(150mg，0.4mmol)将Fmoc-Phe(p-NO2)-OH(170mg，0.4mmol)活化，并添加到所述肽树脂。在偶联反应完成后，将所述树脂用二甲基甲酰胺(3×2ml)清洗，并用溶液处理15小时，所述溶液是SnCl2(0.6g，3.2mmol)和二异丙基乙基胺(70μl，0.4mmol)在2.5ml二甲基甲酰胺中的溶液。在反应结束时，将所述树脂用二甲基甲酰胺清洗(3×2ml)。
步骤5：Fmoc-Aph(Hor)-D-Aph(Cbm)-Leu-Lys(Boc,iPr)-Pro-D-Ala-Rink树脂的制备
向树脂添加二氢乳清酸(60mg，0.36mmol)、二异丙基碳二亚胺(60μl，0.39mmol)、羟基苯并三唑(52mg，0.39mmol)和二异丙基乙基胺(114μl，0.65mmol)在2.5ml二甲基甲酰胺中的溶液。在2和4小时后过滤掉溶剂，并添加新鲜制备的二氢乳清酸、N,N-二异丙基碳二亚胺、羟基苯并三唑和二异丙基乙基胺的混合物。然后将所述肽树脂用二甲基甲酰胺清洗(3×2ml)，并通过哌啶在二甲基甲酰胺中的20％溶液(2×2ml，5min和20min)去除Fmoc保护基团，然后用二甲基甲酰胺清洗(4×2ml)。
步骤6：Ac-D-Nal-D-Cpa-D-Pal-Ser(tBu)-Aph(Hor)-D-Aph(Cbm)-Leu-Lys(iPr,Boc)-Pro-D-Ala-Rink树脂的制备
在二异丙基乙基胺(136μl，0.67mmol)存在下，用HBTU(150mg，0.4mmol)将Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-D-Pal-OH、Fmoc-D-Cpa-OH和Fmoc-D-Nal-OH(相当于树脂负载量的三倍)活化，并在50min内偶联到所述树脂，得到Fmoc保护的十肽。用哌啶在二甲基甲酰胺中的20％溶液(2×2ml，5min和20min)对中间体Fmoc去保护，然后用二甲基甲酰胺(4×2ml)清洗。在合成完成后，使用乙酸(23μl，0.4mmol)、二异丙基碳二亚胺(60μl，0.39mmol)、羟基苯并三唑(52mg，0.39mmol)和二异丙基乙基胺(114μl，0.65mmol)的混合物将N-末端氨基乙酰化，将肽树脂用二甲基甲酰胺(2×2ml)、二氯甲烷(2×2ml)清洗并干燥。
步骤7：从树脂切下地加瑞克
将干燥的肽树脂悬浮在4ml的1％水的三氟乙酸混合物中并搅拌1.5小时。然后将所述树脂过滤并用1ml三氟乙酸清洗。收集有机溶液并在真空中干燥。将固体残留物用甲基叔丁基醚洗涤并干燥，得到粗品地加瑞克，其总收率为100mg(50％)，HPLC纯度为70％。
实施例2：通过固相合成制备地加瑞克
步骤1：Ac-D-Nal-D-Cpa-D-Pal-Ser(tBu)-Phe(p-NO2)-D-Aph(Cbm)-Leu-Lys(iPr,Boc)-Pro-D-Ala-Rink树脂的制备
受保护的肽的合成使用Rink酰胺树脂(3g，载量为0.65mmol/g)，通过逐步固相肽合成来进行。将树脂在12ml二甲基甲酰胺中溶胀后，通过哌啶在二甲基甲酰胺中的20％溶液(2×12ml，5min和15min)来除去Fmoc保护基团，并将所述树脂用二甲基甲酰胺(4×12ml)清洗。将Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Lys(iPr,Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Aph(Cbm)-OH、Fmoc-Phe(p-NO2)、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-D-Pal-OH、Fmoc-D-Cpa-OH、Fmoc-D-Nal-OH(相对于树脂负载量的三倍，并且Fmoc-Lys(iPr,Boc)-OH的用量相当于树脂负载量的两倍)在二异丙基乙基胺(1.7ml，9.8mmol)存在下用HBTU(2.2g，5.8mmol)活化，并在60min内偶联到所述树脂。过滤掉所述溶液并将所述树脂用二甲基甲酰胺清洗(3×12ml)。在每次偶联后，使用乙酸酐(0.54ml)和二异丙基乙基胺(0.93ml)在10.5ml二甲基甲酰胺中的溶液将未反应的氨基以及N-末端氨基封端。
步骤2：Ac-D-Nal-D-Cpa-D-Pal-Ser(tBu)-Aph-D-Aph(Cbm)-Leu-Lys(iPr,Boc)-Pro-D-Ala-Rink树脂的制备
将获得的肽树脂用二水氯化亚锡(II)(4.4g，0.019mol)和二异丙基乙基胺(0.4ml，2.3mmol)在12ml二甲基甲酰胺中的溶液处理10小时。在反应结束时，过滤掉溶剂并将所述树脂用二甲基甲酰胺(3×12ml)清洗。
步骤3：Ac-D-Nal-D-Cpa-D-Pal-Ser(fBu)-Aph(Hor)-D-Aph(Cbm)-Leu-Lys(iPr,Boc)-Pro-D-Ala-Rink树脂的制备
将二氢乳清酸(0.62g，3.9mmol)、二异丙基碳二亚胺(0.6ml，3.9mmol)、1-羟基苯并三唑(0.53g，3.9mmol)在18ml二甲基甲酰胺中的溶液搅拌30min，并将所得溶液添加到所述肽树脂。在1.5小时后，过滤所述溶液，并添加新鲜制备的二氢乳清酸、N,N-二异丙基碳二亚胺、羟基苯并三唑和二异丙基乙基胺的混合物。在1.5小时后，将所述肽树脂用二甲基甲酰胺(3×12ml)、二氯甲烷(3×12ml)清洗并真空干燥。
步骤4：从树脂切下所述肽
将干燥的肽树脂(5g)悬浮在30ml的5％水与95％三氟乙酸的混合物中并搅拌1.5小时。然后过滤掉所述树脂并将所得溶液继续搅拌1.5小时。向所述肽的溶液中添加冷却到4℃的甲基叔丁基醚(100ml)并搅拌90min。对第一次切割后剩余的树脂再次重复上述程序。过滤合并的悬液并将所述肽在真空中干燥，得到粗品地加瑞克，其总收率为55％，HPLC纯度为84％。
实施例3：Fmoc-Phe(NO2)-Leu-Lys(iPr)-Pro-Ala-树脂的还原
3.1.使用连二亚硫酸钠(DEG-001-18)
用于还原的储备溶液：Na2S2O41050mg(5mmol)，K2CO3968mg(7mmol)，TBAHS 170mg(0.5mmol)，溶于5ml水中(参考：Tetrahedron Lett.54(2013)2600-2603)。
130mg肽基-树脂(在DCM中溶胀)+0.5ml DCM+0.5mL储备溶液，反应2h，清洗3x 1mlDCM/水(v/v 1：1)、DMF、MeOH和DCM。
用TFA/水99/1的混合物切割。
产物：Fmoc-4-Aph-Leu-Lys(iPr)-Pro-Ala-NH2(M＝810)
分析方法
Figure BDA0001766707220000341
HPLC结果如图3中所示
峰 RT RRT 面积％
1 3,20 0,29 2,13
2 3,37 0,30 12,08
3 8,07 0,72 7,16
4 11,22 1,00 57,52
5 11,42 1,02 0,43
6 11,69 1,04 6,67
7 12,05 1,07 0,92
8 12,22 1,09 1,25
9 13,07 1,16 0,61
10 24,09 2,15 2,53
主峰(产物)：RT＝11.22min，纯度53.24％，[M+H]+＝811.45
主要杂质：RT＝3.15min，[M+H]+＝669.30(-142，未被鉴定)
RT＝3.37，11.10％，[M+H]+＝589.38(-222，-Fmoc)
RT＝8.07，5.30％，无TIC信号
RT＝11.69，6.13％，[M+H]+＝891.40(+90，未被鉴定)
结果：所述还原在2h内完成，但发生部分Fmoc-去保护(相当于产物量的17％)。
3.2使用氯化亚锡(II)(DEG-001-35-2)
将130mg肽基-树脂用脱水氯化亚锡(II)(0.19g，0.82mmol)和二异丙基乙基胺(30μl，0.16mmol)在2ml二甲基甲酰胺中的溶液处理10小时。在反应结束时，过滤掉所述溶剂并将所述树脂用二甲基甲酰胺(2×2ml)和DCM(2×2ml)清洗。
用TFA/水99/1的混合物切割。
产物：Fmoc-4-Aph-Leu-Lys(iPr)-Pro-Ala-NH2(M＝810)。
HPLC结果如图4中所示。
没有观察到Fmoc-去保护的产物*
*在两种情况下都观察到保留时间为8.07的峰。该峰没有表现出TIC信号，可能它不是肽杂质(盐或非肽有机化合物)。当计算HPLC纯度时没有将它考虑在内。
比较表
还原方法 HPLC纯度，％ Fmoc-去保护的产物，％
连二亚硫酸钠 65 17
氯化亚锡(II) 67 无

Claims (16)

1.用于制备十肽或其可药用盐的方法，其中所述十肽的特征在于是在所述十肽的序列中，至少在第5位具有一个Aph衍生物并在第6位具有一个Aph衍生物的肽，其中所述Aph衍生物选自Aph(Hor)和Aph(Cbm)，
其中，所述方法包括使用对硝基苯丙氨酸或下式X的化合物或硝基肽，再将掺入到所述肽序列中的硝基苯丙氨酸残基分别修饰成Aph衍生物Aph(Hor)或Aph(Cbm)，
Figure FDA0003415323860000011
其中Pg是末端保护基团；
其中所述十肽是下式I的地加瑞克或其可药用盐：
Figure FDA0003415323860000012
其中所述硝基肽是包含一个或两个对硝基苯丙氨酸残基的肽，并且是下式II、V或VII的化合物，
Figure FDA0003415323860000013
其中Pg是末端保护基团，X是侧链保护基团，并且Y是侧链保护基团或H，并且Resin是H或固相支持物；
Figure FDA0003415323860000021
其中X和Z是侧链保护基团，并且Y是侧链保护基团或H，Resin是固相支持物；或
Figure FDA0003415323860000022
其中Pg是末端保护基团；X是侧链保护基团，并且Resin是固相支持物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括将下式II的化合物转变成地加瑞克或其可药用盐：
Figure FDA0003415323860000023
其中Pg是末端保护基团，X是侧链保护基团，并且Y是侧链保护基团或H，并且Resin是H或固相支持物。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述方法以固相肽合成进行。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于包括下述步骤：
a)用还原剂处理式II的化合物以形成下式III的化合物：
Figure FDA0003415323860000031
其中Pg是末端保护基团，X是侧链保护基团，并且Y是侧链保护基团或H，并且Resin是固相支持物；
b)将所述式III的化合物与活化的二氢乳清酸反应，以形成下式IV的化合物：
Figure FDA0003415323860000032
其中Pg是末端保护基团，X是侧链保护基团，并且Y是侧链保护基团或H，并且Resin是固相支持物；
c)重复下述附连到Resin的步骤(i)-(ii)，直至形成受保护的十肽：
(i)将受保护的肽去保护以去除所述末端保护基团，
(ii)使用偶联试剂将受保护的氨基酸按照所需序列偶联到附连到所述Resin的肽的末端氨基残基，以形成一个接一个氨基酸延长的受保护的肽，
d)将所述受保护的十肽去保护以去除所述末端保护基团，
e)在乙酰化试剂存在下将所得十肽的N-末端乙酰化，以及
f)将乙酰化的十肽从所述Resin切下，以形成地加瑞克或其可药用盐；
由此将式II的化合物转变成地加瑞克或其可药用盐。
5.根据权利要求2所述的方法，其包括下述步骤：
a)提供式II的化合物，
b)重复下述步骤(i)-(ii)，直至形成附连到Resin的受保护的十肽：
(i)将附连到Resin的受保护的肽去保护以去除所述末端保护基团，
(ii)使用偶联试剂将受保护的氨基酸按照所需序列偶联到附连到所述Resin的末端氨基残基，以形成附连到所述Resin的受保护的肽；
c)将所述受保护的十肽去保护以去除末端保护基团，
d)在乙酰化试剂存在下将所得十肽的N-末端乙酰化，以产生下式V的化合物：
Figure FDA0003415323860000041
其中X和Z是侧链保护基团，并且Y是侧链保护基团或H，Resin是固相支持物；
e)用还原剂处理所述式V的化合物，以形成下式VI的化合物：
Figure FDA0003415323860000042
其中X和Z是侧链保护基团，并且Y是侧链保护基团或H，Resin是固相支持物，
f)将所述式VI的化合物与活化的二氢乳清酸反应，以形成附连到所述Resin的受保护的十肽；以及
g)将所述十肽从所述Resin切下，以形成地加瑞克或其可药用盐。
6.下式II的化合物：
Figure FDA0003415323860000051
其中Pg是末端保护基团或H，X和Y是侧链保护基团或H，并且Resin是固相支持物，并且其中当所述化合物未附连到固相支持物时，所述Resin是H。
7.用于制备下式II的化合物的方法，其特征在于，包括下述步骤：
Figure FDA0003415323860000052
其中Pg是末端保护基团，X是侧链保护基团，并且Y是侧链保护基团或H，并且Resin是H或固相支持物；
a)用还原剂还原式VII的化合物，以形成式VIII的化合物，
Figure FDA0003415323860000053
其中Pg是末端保护基团；X是侧链保护基团，并且Resin是固相支持物，
Figure FDA0003415323860000054
其中Pg是末端保护基团；X是侧链保护基团，并且Resin是固相支持物；
b)将所述式VIII的化合物与异氰酸烷基酯或氰酸碱金属盐反应，以形成式IX的化合物，
Figure FDA0003415323860000061
其中Pg是末端保护基团，X和Y是侧链保护基团，其中当存在氰酸碱金属盐时Y是H，并且当存在异氰酸烷基酯时Y是tBu或另一种烷基，并且Resin是固相支持物；
c)将式IX所示化合物去保护以去除所述末端保护基团，然后在偶联试剂存在下与式X所示氨基酸的受保护的L-异构体偶联，以形成式II所示化合物，
Figure FDA0003415323860000062
其中Pg是末端保护基团。
8.根据权利要求7所述的方法，其中式X中的Pg是Fmoc。
9.根据权利要求7所述的方法，其中制备式VII所示化合物包括通过去除末端保护基团将式XI所示化合物去保护的步骤；随后是在偶联试剂存在下与式X所示受保护的氨基酸的D-异构体偶联的步骤，以形成式VII所示的化合物，
Figure FDA0003415323860000063
其中Pg是末端保护基团，X是侧链保护基团，并且Resin是固相支持物。
10.根据权利要求4、5、7、8和9中任一项所述的方法，其中所述还原剂是连二亚硫酸钠或氯化亚锡(II)。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述还原剂是氯化亚锡(II)。
12.下式V所示的化合物：
Figure FDA0003415323860000071
其中X、Y和Z是侧链保护基团或H；并且Resin是固相支持物；并且其中当所述化合物未附连到固相支持物时，所述Resin是H。
13.下式VII所示的化合物：
Figure FDA0003415323860000072
其中Pg是末端保护基团或H，X是侧链保护基团或H，并且Resin是固相支持物，并且其中当所述肽未附连到固相支持物时，所述Resin是H。
14.下式II、式V或式VII所示化合物在合成地加瑞克中的应用，
Figure FDA0003415323860000081
其中Pg是末端保护基团，X是侧链保护基团，并且Y是侧链保护基团或H，并且Resin是H或固相支持物；
Figure FDA0003415323860000082
其中X和Z是侧链保护基团，并且Y是侧链保护基团或H，Resin是固相支持物；或
Figure FDA0003415323860000083
其中Pg是末端保护基团；X是侧链保护基团，并且Resin是固相支持物。
15.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其特征在于，是基于Fmoc保护策略，其中所述末端保护基团Pg是碱不稳定的保护基团Fmoc。
16.根据权利要求7至9任一项所述的方法，其特征在于，是基于Fmoc保护策略，其中所述末端保护基团Pg是碱不稳定的保护基团Fmoc。
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