CN103936848A - 胸腺肽α1的合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及胸腺肽α1的非线性固相合成方法，方法特征在于偶联Ser-Ser片段时，偶联的位点是Ser的侧链羟基而不是常规的N端氨基。待肽链合成后，在合适的条件下进行，酯键会重组形成酰胺结构，从而得到胸腺肽α1。本发明的方法相对于传统的线性固相合成方法而言，不仅保持了操作简便、后处理容易等优点，还由于降低β-折叠带来的偶联困难以及缓解空间位阻等效应而带来收率高、纯度好的优势，为胸腺肽α1的大规模生产提供了一种全新的思路。

Description

胸腺肽α1的合成方法
技术领域
本发明涉及一种多肽的合成方法，更具体而言，涉及胸腺肽α1的合成方法。 
背景技术
胸腺肽α1（Thymosinα1，后文也简称Tα1）是从牛胸腺制备物TF5（Thymosin fraction5）中分离出的一个酸性多肽，其序列如下： 
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH 
Tα1的生物活性比牛胸腺制备物TF5更高。具体而言，Tα1可促进T淋巴细胞在胸腺内增生及成熟、增加淋巴细胞分泌IL-2、α及r干扰素、增强IL-2受体的表达作用。此外，Tα1可增强NK细胞的数量和活性，通过对辅助T细胞、细胞毒淋巴细胞及NK细胞等免疫细胞的增殖作用，间接地杀死被病毒感染的肝细胞及肿瘤细胞。目前，胸腺肽α1作为免疫增强剂被广泛地用于重度感染、肝炎和肿瘤的免疫治疗。 
目前，合成胸腺肽α1主要采用固相合成法： 
中国专利申请CN102199205A公开了一种制备胸腺肽α1的方法。其中，以羟基官能树脂做载体、顺序偶联氨基酸得到胸腺肽α1肽树脂，TFA裂解得到粗肽，粗肽纯度为52.6%～69.6%。 
中国专利CN101104638B公开了一种制备胸腺肽α1的方法。其中，以氨基官能树脂为载体，将氨基偶联至Asp的侧链羧基上，然后顺序偶联各氨基酸得到胸腺肽α1肽树脂，最后TFA裂解得到胸腺肽α1，粗肽纯度为60%。总收率为20%。 
本领域技术人员已知，胸腺肽α1的两个区段(Ser1-Glu10和Ile11-Asn28)之间易形成β-折叠结构，这造成用现有的固相合成多肽的方法来合成胸腺肽α1非常困难。 
因此，仍需要开发一种新的合成胸腺肽α1的方法，其可降低由于β-折叠而带来的偶联困难。 
发明内容
现有技术合成胸腺肽α1的固相方法中，第一个参与偶联的氨基酸均是Asn或Asp，且均按照胸腺肽α1的肽序进行线性偶联，这个过程中不可避免地存在β-折叠现象。此外，由于大量侧链保护基的存在，线性偶联也必然存在较大的空间位阻。 
本发明在实验过程中意外地发现，采用一种非线性偶联方法，能够有效地降低由于β-折叠带来的偶联困难、缓解空间位阻现象，进而提高产品收率。 
因此，本发明的目的是提供一种合成胸腺肽α1的方法，具体提供一种合成胸腺肽α1的非线性固相合成方法，其包括下述步骤： 
（1）以Rink Amide树脂为载体，与Fmoc-Asp-OtBu合成Fmoc-Asp(树脂)-OtBu，然后按照胸腺肽α1的肽序，采用固相多肽合成方法在Fmoc-Asp(树脂)-OtBu的基础上从C端到N端逐一偶联氨基酸，在此步骤中，偶联的最后一个氨基酸为胸腺肽α1肽序中N端第9位的丝氨酸，得到如下的肽树脂A: 
Boc-Ser-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp(树脂)-OtBu； 
（2）用Fmoc-Ser(tBu)-OH与上述肽树脂A的N端的丝氨酸的游离羟基反应，形成酯键。然后按照胸腺肽α1的肽序，采用固相多肽合成方法顺序偶联余下的氨基酸，且用乙酰基封闭末端丝氨酸，得到如下的肽树脂B 
Boc-Ser((Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ala-Ala-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Ac))-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp(树脂)-OtBu； 
（3）将肽树脂B进行裂解，得到如下的多肽片段b: 
NH2-Ser(O-Ser-Thr-Asp-Thr-Val-Ala-Ala-Asp-Ser-Ac)-Glu-Ile-Thr- Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH； 
（4）将多肽片段b溶于缓冲盐水溶液中，在适合的条件下，多肽片段b中的酯键发生重组，得到胸腺肽α1： 
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH。 
本发明的胸腺肽α1的固相合成方法是一种新的非线性固相合成方法，其相对于传统的线性固相合成方法而言，不仅保持了操作简便、后处理容易等优点，还由于降低β-折叠带来的偶联困难以及缓解空间位阻等效应而带来收率高、纯度好的优势，为胸腺肽α1的大规模生产提供了一种全新的思路。 
具体实施方式
术语解释 
本文通篇的术语“固相多肽合成方法”、“固相合成方法”是指多肽合成领域已知的Fmoc固相合成方法，例如记载于Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis:A Practical Approach,W.C.Chan,Peter D.White著，March2,2000（ISBN-10:0199637245）,英国Oxford University Press。 
本文通篇的术语“线性固相合成”是常规的Fmoc固相合成方法，即按照多肽的肽序依次顺序偶联氨基酸。 
本文通篇的术语“非线性固相合成”是一种非常规Fmoc固相合成方法，具体而言，将多肽分成若干个片段再将该若干个片段偶联，或者，利用氨基酸中除氨基和羧基之外的游离官能团（如羟基）来进行额外的反应，形成侧链，再偶联氨基酸。 
本文通篇的术语“肽树脂”是指多肽的C端连有树脂的多肽树脂。 
本文通篇的术语“多肽片段”是指上文提及的“肽树脂”脱除C端树脂而露出游离羧基的多肽。 
本文在方法步骤（2）中肽树脂B的酯键以丝氨酸后括号的形式表示，且括号中的内容表示酯键连接的侧链部分，具体而言 
Boc-Ser((Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ala-Ala-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Ac))-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp(树脂)-OtBu意指如下的结构： 
在本文通篇中，“Asp(树脂)”的括号中的树脂表示Rink Amide树脂。 
说明书和权利要求书中所使用英文缩写的含义列于下表中： 
本发明提供了一种胸腺肽α1的非线性固相合成方法，包括下述步骤： 
（1）以Rink Amide树脂为载体，与Fmoc-Asp-OtBu合成Fmoc-Asp(树脂)-OtBu，然后按照胸腺肽α1的肽序，采用固相多肽合成方法在Fmoc-Asp(树脂)-OtBu的基础上从C端到N端逐一偶联氨基酸，在此步骤中，偶联的最后一个氨基酸为胸腺肽α1肽序中N端第9位的丝氨酸，得到如下的肽树脂A: 
Boc-Ser-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp(树脂)-OtBu； 
（2）用Fmoc-Ser(tBu)-OH与上述肽树脂A的N端的丝氨酸的游离羟基反应，形成酯键。然后按照胸腺肽α1的肽序，采用固相多肽合成方法顺序偶联余下的氨基酸，且用乙酰基封闭末端丝氨酸，得到如下的肽树脂B 
Boc-Ser((Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ala-Ala-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Ac))-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp(树脂)-OtBu； 
（3）将肽树脂B进行裂解，得到如下的多肽片段b: 
NH2-Ser(O-Ser-Thr-Asp-Thr-Val-Ala-Ala-Asp-Ser-Ac)-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH； 
（4）将多肽片段b溶于缓冲盐水溶液中，在适合的条件下，多肽片段b中的酯键发生重组，得到胸腺肽α1： 
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH。 
其中，步骤（1）中的Rink Amide树脂选自Rink Amide AM树脂， Sieber树脂或Rink Amide MBHA树脂，且得到的Fmoc-Asp(树脂)-OtBu的替代度为0.2-0.5mmol/g。 
步骤（1）和（2）中所述的固相多肽合成方法包括：1）脱除Fmoc，接着用溶剂洗涤树脂，直至用检测方法检测到完全脱除Fmoc为止；2）将合适量的待偶联氨基酸和偶联剂在溶剂中溶解并活化后，一起加入到固相反应柱中，直至用检测方法检测到反应终止为止；3）重复1）和2）。 
其中脱除Fmoc的试剂可为本领域已知的可实现该目的的任何试剂，优选20%的哌啶/DMF溶液（DBLK），即哌啶：DMF（体积比）为1:4的混合溶液。 
步骤（1）中固相多肽合成方法中，除偶联最后一个丝氨酸的偶联过程之外，所用的偶联剂选自DIPCDI/HOBt、PyBOP/HOBt/DIPEA、TBTU/HOBt/DIPEA或HBTU/HOBt/DIPEA，优选HBTU/HOBt/DIPEA体系，即HBTU，HOBt和DIPEA的组合物，该组合物中各成分之间以及与待偶联的氨基酸的比例以摩尔比计为氨基酸:HBTU:HOBt:DIPEA=1:1:1.2:2。在偶联最后一个丝氨酸的情况中，所用的偶联剂为DIPCDI和HOBt的组合物，该组合物中各成分之间以及与待偶联的丝氨酸的比例以摩尔比计为丝氨酸：DIPCDI：HOBt=1:1.2:1.2；且用作最后一个丝氨酸的原料为Boc-Ser-OH。 
步骤（2）中Fmoc-Ser(tBu)-OH与肽树脂A的N端的丝氨酸的羟基偶联过程中所用的偶联体系为HATU/HOAt/TMP/DMAP体系，即HATU，HOAt，TMP和DMAP的组合物，该组合物中各成分之间以及与待偶联的氨基酸的比例以摩尔比计为氨基酸：HATU：HOAt：TMP：DMAP=1:1:1.2:2:0.05。氨基酸的投料5倍于活性基团量（活性基团量=氨基酸树脂替代度*氨基酸树脂重量）。之后，在进行侧链线性偶联余下氨基酸的过程中所用的偶联体系与步骤（1）中相同，即优选选自HBTU，HOBt和DIPEA的组合物，该组合物中各成分之间以及与待偶联的氨基酸的比例以摩尔比计为氨基酸:HBTU:HOBt:DIPEA=1:1:1.2:2。在该步反应过程中，最后一个偶联的氨基酸为Fmoc-Ser(tBu)-OH，偶联后，在封闭液（吡啶/乙酸酐=1:1（摩尔比））的存在下，丝氨酸N端乙酰化为Ac-Ser(tBu)-余下基团，其中Ac为乙酰基。 
上文提及的固相多肽合成方法在固相反应柱中进行。对固相反应柱无特别限制，可为可实现此目的的任意固相反应柱。此外，每种氨基酸进行偶联反应的时间通常为1.5-4小时，优选2-3小时；压力优选为常压，也可在适当提高或降低的压力下进行；温度优选为室温（即20±5℃），也可在适当提高或降低的温度下进行。 
上文提及的固相多肽合成方法优选将树脂在偶联之前进行溶胀，所述洗涤和溶胀的步骤可采用本领域实现该目的的任何试剂进行，优选DMF。所述反应中应用的检测方法是本领域已知的可实现此目的的任意方法，例如色谱法或化学标定法，优选使用可判定反应终点的试剂，优选茚三酮，当使用茚三酮时，若树脂显色则说明多肽中有游离的酰胺，即酰胺氮上无保护基。 
步骤（3）中的裂解过程在裂解液的存在下进行。所述裂解液为以体积比计TFA：EDT：H2O=92:5:3的混合溶液，用量为1g肽树脂对应8-12ml裂解液，裂解时间为1-3小时。在该裂解过程中同时实现Rink Amide树脂的裂解以及精氨酸（Asp）转化为天冬酰胺（Asn）。 
步骤（4）中所述的缓冲盐的水溶液为0.1M（即mol/L）的磷酸氢二钠水溶液或0.2M醋酸铵水溶液。合适的条件为多肽片段b的浓度为2mg/ml水溶液，反应pH值为7.2～7.5，反应温度为0～37℃，反应时间为30分钟至20小时，优选1至16小时。 
本发明优选还包括胸腺肽α1的纯化步骤。所述纯化步骤可采用本领域已知的任意多肽纯化技术进行，优选采用反相高压液相色谱法。进一步地，所述反相高压液相色谱法包括：以反相十八烷基硅烷为固定相，以0.2体积%三氟乙酸的乙腈溶液或体积比为85:15的水和乙腈为流动相，收集目的峰馏分，浓缩冻干。 
实施例 
为了进一步理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，应理解，下述实施例意在说明，不对本发明构成限制。 
在本说明书中使用的Rink Amide树脂购自天津南开和成科技有限公司，各种天然氨基酸以及带保护基的氨基酸购自吉尔生化上海有限公司，偶联试剂购自苏州天马有限公司，其它溶剂和试剂为普通市售品。 
实施例1：替代度为0.2mmol/g的Fmoc-Asp(树脂)-OtBu的合成 
称取替代度为0.6mmol/g的Rink Amide树脂500g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。用DBLK（20%哌啶/DMF）脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。称取51.4g Fmoc-Asp-OtBu（125mmol）、20.3g HOBt（150mmol）溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入23.4mlDIC（150mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入1046.3ml封闭液（吡啶/乙酸酐=1:1，6mol：6mol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Asp(树脂)-OtBu。检测替代度为0.208mmol/g。 
实施例2：替代度为0.3mmol/g的Fmoc-Asp(树脂)-OtBu的合成 
称取替代度为0.6mmol/g的Rink Amide树脂500g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。用DBLK（20%哌啶/DMF）脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。称取77.2g Fmoc-Asp-OtBu（187.5mmol）、30.4g HOBt（225mmol）溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入35.2mlDIC（225mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入1046.3ml封闭液（吡啶/乙酸酐=1:1，6mol：6mol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Asp(树脂)-OtBu。检测替代度为0.311mmol/g。 
实施例3：替代度为0.4mmol/g的Fmoc-Asp(树脂)-OtBu的合成 
称取替代度为0.6mmol/g的Rink Amide树脂500g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。用DBLK（20%哌啶/DMF）脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。称取102.9g Fmoc-Asp-OtBu（250mmol）、40.5g HOBt（300mmol）溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入46.9mlDIC（300mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入1046.3ml封闭液（吡啶/乙酸酐=1:1，6mol： 6mol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Asp(树脂)-OtBu。检测替代度为0.402mmol/g。 
实施例4：制备肽树脂A 
Boc-Ser-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp(树脂)-OtBu 
称取实施例1中替代度为0.208mmol/g的Fmoc-Asp(树脂)-OtBu480.8g（100mmol），加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。用DBLK（20%哌啶/DMF）脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。取128.0g Fmoc-Glu(OtBu)-OH（300mmol），113.8g HBTU（300mmol），48.6g HOBt（360mmol），溶于体积比为10:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入104.3mlDIPEA（600mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照胸腺肽α1主链肽序，从C端到N端依次完成Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH的偶联。用DBLK（20%哌啶/DMF）脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。取98.2g Boc-Ser-OH（300mmol），48.6g HOBt（360mmol），溶于体积比为10:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入56.3mlDIC（360mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时。最终得到肽树脂A： 
Boc-Ser-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp(树脂)-OtBu。 
实施例5：制备肽树脂B 
Boc-Ser((Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ala-Ala-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Ac))-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp(树脂)-OtBu 
用DBLK（20%哌啶/DMF）脱除实施例4中肽树脂A的Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。取191.7g Fmoc-Ser(tBu)-OH（500mmol），190.1g HATU，98.0g HOAt（720mmol），溶于体积比为10:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入131.7mlTMP（1000mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应8小时。用DBLK（20%哌啶/DMF）脱除树脂的Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。称取119.3g Fmoc-Thr(tBu)-OH（300mmol），113.8gHBTU（300mmol），48.6g HOBt（360mmol），溶于体积比为10:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入104.3ml DIPEA（600mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照胸腺肽α1主链肽序，顺序依次偶联Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH，用DBLK（20%哌啶/DMF）脱除树脂的Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。加入1046.3ml封闭液（吡啶/乙酸酐=1:1，6mol：6mol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到肽树脂B： 
Boc-Ser((Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ala-Ala-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Ac))-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(O tBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp(树脂)-OtBu。 
实施例6：制备多肽片段b 
NH2-Ser(O-Ser-Asp-Thr-Val-Ala-Ala-Asp-Ser-Ac)-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH 
将实施例5中的肽树脂B置于裂解反应瓶中，以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂（TFA：EDT：H2O=92：5：3（V/V）），室温搅拌2h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量DCM洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即多肽片段b: 
NH2-Ser(O-Ser-Asp-Thr-Val-Ala-Ala-Asp-Ser-Ac)-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH，共计329.6g，重量收率为106%；ESI，m/z，([M+Na]+):3108.7。 
实施例7：胸腺肽α1粗肽的制备 
在反应瓶中取纯化水20L，加入289.3g磷酸氢二钠，搅拌溶解。取实施例6中40g多肽片段b，溶于上述缓冲液中，并根据实际情况用磷酸或氢氧化钠调节体系pH为7.2。0℃条件下反应15h后，HPLC检测确认所有多肽片段b均转化为胸腺肽α1，水溶液中胸腺肽α1的含量为0.93mg/ml，胸腺肽α1纯度为73.2%；ESI，m/z，([M+Na]+):3108.3。 
实施例8：胸腺肽α1粗肽的制备 
在反应瓶中取纯化水20L，加入289.3g磷酸氢二钠，搅拌溶解。取实施例6中40g多肽片段b，溶于上述缓冲液中，并根据实际情况用磷酸或氢氧化钠调节体系pH为7.5。25℃条件下反应3h后，HPLC检测确认所有多肽片段b均转化为胸腺肽α1，水溶液中胸腺肽α1的含量为0.96mg/ml，胸腺肽α1纯度为76.3%；ESI，m/z，([M+Na]+):3108.6。 
实施例9：胸腺肽α1粗肽的制备 
在反应瓶中取纯化水20L，加入289.3g磷酸氢二钠，搅拌溶解。取实施例6中40g多肽片段b，溶于上述缓冲液中，并根据实际情况用磷酸或氢氧化钠调节体系pH为7.4。37℃条件下反应1h后，HPLC检测确认所有多肽片段b均转化为胸腺肽α1，水溶液中胸腺肽α1的含量为0.91mg/ml，胸腺肽α1纯度为74.1%ESI，m/z，([M+Na]+):3108.2。 
实施例10：胸腺肽α1粗肽的制备 
在反应瓶中取纯化水20L，加入308.3g醋酸铵，搅拌溶解。取实施例6中40g多肽片段b，溶于上述缓冲液中，并根据实际情况用醋酸或氨水调节体系pH为7.3。0℃条件下反应15h后，HPLC检测确认所有多肽片段b均转化为胸腺肽α1，水溶液中胸腺肽α1的含量为0.89mg/ml，胸腺肽α1纯度为70.3%。 
实施例11：胸腺肽α1粗肽的制备 
在反应瓶中取纯化水20L，加入308.3g醋酸铵，搅拌溶解。取实施例6中40g多肽片段b，溶于上述缓冲液中，并根据实际情况用醋酸或氨水调节体系pH为7.4。25℃条件下反应3h后，HPLC检测确认所有多肽片段b均转化为胸腺肽α1，水溶液中胸腺肽α1的含量为1.02mg/ml，胸腺肽α1纯度为78.7%。 
实施例12：胸腺肽α1粗肽的制备 
在反应瓶中取纯化水20L，加入308.3g醋酸铵，搅拌溶解。取实施例6中40g多肽片段b，溶于上述缓冲液中，并用醋酸或氨水调节体系pH为7.5。15℃条件下反应5h后，HPLC检测确认所有多肽片段b均转化为胸腺肽α1，水溶液中胸腺肽α1的含量为0.91mg/ml，胸腺肽α1纯度为72.9%。 
实施例13：胸腺肽α1精肽的制备 
任称取实施例7～12中的胸腺肽α1粗肽，采用Waters2545RP-HPLC系统，波长230nm，色谱柱为50×250mm反相C18柱，常规0.2体积%TFA的乙腈溶液作为流动相来纯化，收集目的峰馏分，得到纯度大于98.5%精肽。然后再次将精肽溶液采用Waters2545RP-HPLC系统，色谱柱为50×250mm反相C18柱，水和乙腈（85:15，V/V）流动相除盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到胸腺肽α1精肽，计算总收率26.9～36.2%，RP-HPLC纯度为99.15～99.42%；ESI，m/z，([M+Na]+):3108.7；[α]20 D=-105.2。 
虽然已参照特定实施方案对本发明进行了说明，但本领域技术人员应认识到的是，在不偏离本发明主旨和范围的情况下，可对所述实施方案进行改变或改进，本发明范围通过所附权利要求书限定。 

Claims (10)

1.一种合成胸腺肽α1的方法，包括下述步骤： 
（1）以Rink Amide树脂为载体，与Fmoc-Asp-OtBu合成Fmoc-Asp(树脂)-OtBu，然后按照胸腺肽α1的肽序，采用固相多肽合成方法在Fmoc-Asp(树脂)-OtBu的基础上从C端到N端逐一偶联氨基酸，在此步骤中，偶联的最后一个氨基酸为胸腺肽α1肽序中N端第9位的丝氨酸，得到如下的肽树脂A: 
Boc-Ser-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp(树脂)-OtBu； 
（2）用Fmoc-Ser(tBu)-OH与上述肽树脂A的N端的丝氨酸的游离羟基反应，形成酯键。然后按照胸腺肽α1的肽序，采用固相多肽合成方法顺序偶联余下的氨基酸，且用乙酰基封闭末端丝氨酸，得到如下的肽树脂B 
Boc-Ser((Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ala-Ala-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Ac))-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Ly s(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp(树脂)-OtBu； 
（3）将肽树脂B进行裂解，得到如下的多肽片段b: 
NH2-Ser(O-Ser-Thr-Asp-Thr-Val-Ala-Ala-Asp-Ser-Ac)-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH； 
（4）将多肽片段b溶于缓冲盐体系中，在适合的条件下，多肽片段b中的酯键发生结构重组，得到胸腺肽α1： 
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH。 
2.权利要求1的方法，其中，步骤（1）中的树脂选自Rink Amide AM树脂、Sieber树脂或Rink Amide MBHA树脂，且得到的Fmoc-Asp(树脂)-OtBu的替代度为0.2-0.5mmol/g。 
3.权利要求1的方法，其中，步骤（1）中的固相多肽合成方法在偶联剂的存在下进行，其中，除偶联最后一个丝氨酸的偶联过程之外，所 用的偶联剂选自DIPCDI/HOBt、PyBOP/HOBt/DIPEA、TBTU/HOBt/DIPEA或HBTU/HOBt/DIPEA，优选HBTU，HOBt和DIPEA的组合物，该组合物中各成分之间以及与待偶联的氨基酸的比例以摩尔比计为氨基酸:HBTU:HOBt:DIPEA=1:1:1.2:2。 
4.权利要求1的方法，其中，在步骤（1）中，在偶联最后一个丝氨酸的情况中，所用的偶联剂为DIPCDI和HOBt的组合物，该组合物中各成分之间以及与待偶联的丝氨酸的比例以摩尔比计为丝氨酸：DIPCDI：HOBt=1:1.2:1.2。 
5.权利要求1的方法，其中，在步骤（2）中，Fmoc-Ser(tBu)-OH与肽树脂A的N端的丝氨酸的游离羟基偶联过程中所用的偶联体系为HATU，HOAt，TMP和DMAP的组合物，该组合物中各成分之间以及与待偶联的Fmoc-Ser(tBu)-OH的比例以摩尔比计为Fmoc-Ser(tBu)-OH：HATU：HOAt：TMP：DMAP=1:1:1.2:2:0.05。 
6.权利要求1的方法，其中，在步骤（2）中，乙酰基封闭末端丝氨酸过程在封闭液的存在下进行，所述封闭液为以摩尔比计为1:1的吡啶和乙酸酐的混合溶液。 
7.权利要求1的方法，其中，步骤（3）中的裂解过程在裂解液的存在下进行，所述裂解液为以体积比计TFA：EDT：H2O=92:5:3的混合溶液，用量为1g肽树脂对应8-12ml裂解液，裂解时间为1-3小时。 
8.权利要求1的方法，其中，步骤（4）中所述的缓冲盐的水溶液为0.1M的磷酸氢二钠水溶液或0.2M醋酸铵水溶液。 
9.权利要求1的方法，其中，步骤（4）中合适的条件为多肽片段b的浓度为2mg/ml水溶液，反应pH值为7.2～7.5，反应温度为0～37℃，反应时间为30分钟至20小时。 
10.权利要求1-9中任一项的方法，还包括胸腺肽α1的纯化步骤，所述纯化步骤采用反相高压液相色谱法，包括以反相十八烷基硅烷为固定相，以0.2体积%三氟乙酸的乙腈溶液或体积比为85:15的水和乙腈为流动相，收集目的峰馏分，浓缩冻干。 
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108314725A (zh) * 2018-04-13 2018-07-24 成都圣诺生物制药有限公司 一种胸腺法新的合成方法
CN110642936A (zh) * 2018-06-26 2020-01-03 深圳翰宇药业股份有限公司 一种制备特立帕肽的方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101104638A (zh) * 2007-06-18 2008-01-16 苏州中科天马肽工程中心有限公司 胸腺素α1的固相合成工艺
CN102199205A (zh) * 2011-03-22 2011-09-28 海南双成药业股份有限公司 一种多肽胸腺法新的合成方法
CN103446944A (zh) * 2013-09-02 2013-12-18 沈阳化工大学 一种非离子Gemini表面活性剂及其制备方法
CN103467595A (zh) * 2013-09-06 2013-12-25 深圳翰宇药业股份有限公司 一种特立帕肽的制备方法
CN103497245A (zh) * 2013-06-25 2014-01-08 深圳翰宇药业股份有限公司 一种合成胸腺法新的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101104638A (zh) * 2007-06-18 2008-01-16 苏州中科天马肽工程中心有限公司 胸腺素α1的固相合成工艺
CN102199205A (zh) * 2011-03-22 2011-09-28 海南双成药业股份有限公司 一种多肽胸腺法新的合成方法
CN103497245A (zh) * 2013-06-25 2014-01-08 深圳翰宇药业股份有限公司 一种合成胸腺法新的方法
CN103446944A (zh) * 2013-09-02 2013-12-18 沈阳化工大学 一种非离子Gemini表面活性剂及其制备方法
CN103467595A (zh) * 2013-09-06 2013-12-25 深圳翰宇药业股份有限公司 一种特立帕肽的制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
卢圣栋主编: "《现代分子生物学实验技术 第二版》", 31 December 1999, 中国协和医科大学出版社 *
张鸿鹏: ""胸腺素α-1的固相片段合成及鉴定分析"", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库电子期刊工程科技I辑》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108314725A (zh) * 2018-04-13 2018-07-24 成都圣诺生物制药有限公司 一种胸腺法新的合成方法
CN110642936A (zh) * 2018-06-26 2020-01-03 深圳翰宇药业股份有限公司 一种制备特立帕肽的方法
CN110642936B (zh) * 2018-06-26 2023-01-17 深圳翰宇药业股份有限公司 一种制备特立帕肽的方法

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