TW201012829A - Process for the synthesis of (Aib8,35)hGLP-1(7-36)-NH2 - Google Patents

Process for the synthesis of (Aib8,35)hGLP-1(7-36)-NH2 Download PDF

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Zheng-Xin Dong
Tom Ciaran Loughman
Fionn Hurley
Steven R Johnson
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Ipsen Mfg Ireland Ltd
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Description

201012829 六、發明說明： 發明所屬之技術領域 本發明涉及一種大規模合成 (Aib8,35)hGLP-l(7-36)-NH2 ( SEQ ID NO:2 )之新方法，即 His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phc-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu -Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Ly s-Aib-Arg-NH2 ( SEQ ID NO:2 )，其中採用固相 Fmoc 化學。 ® 先前技術 升血糖激素樣肽-1 (GLP-1) (7-36)醯胺（SEQ ID ΝΟ:1 ) 是在腸道L-細胞中透過對升血糖激素前驅物-升血糖激素 前原進行組織特異性翻譯後處理而合成，並因進食被釋放 進入血液循環。有人注意到皮下注射一針GLP-1便可以使 非胰島素依賴型糖尿病（NIDDM)患者的餐後血糖完全降至 正常範圍，便提出GLP-1有可能可以用於治療糖尿病 (Gutniak, Μ. K., et al.y 1994, Diabetes Care, 14:1039-44) ° 這種作用被認為是透過增加胰島素釋放以及減少升血糖激 素的分泌以介導。但是，GLP-1代謝不穩定，在體内血聚 半衰期僅1-2分鐘。注射的外源性GLP-1也被快速分解 (Deacon, C. F., et al.t 1995, Diabetes, 44:1126-1131) 〇 (Aib8’35)hGLP-l(7-36)-NH2 ( SEQ ID NO:2)在 PCT 出版物No. WO 00/34331中公開，其内容在本文中將以整 體引述，因為其活性和/或代謝穩定性比天然GLP-1要高。 但在WO 00/34331第18-19頁中，對 201012829 (Aib8’35)hGLP-l(7-36)-NH2 ( SEQ ID NO:2)所作的描述並 不適合此狀的商業規模生產，因為使用的MBH A ( 4-曱基 一苯甲基胺）樹脂要求利用氟氫酸以除去此肽。在大量使 用這種強腐蝕性材料時除要考慮安全問題外，也需要配備 特殊設備方可使用。一般來講，基於氫氟酸的裂解方案要 很大的投資’才能確保其安全且可擴大至工業規模的生 產。照此’需要開發一種高效、大規模生產 (Aib8’35)hGLP-l(7-36)-NH2 ( SEQ ID NO:2)的方法。 發明内容 本發明提供一種合成（Aib8,35)hGLP-l(7-36)-NH2 ( SEQ ID NO:2)的新方法’其中採用階段式固相Fmoc化學。 一方面，本發明提供合成（Aib8,35)hGLP-l(7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)的方法，其包括以下步驟： (a) 利用側鏈保護的精胺酸（Arg)樹脂，從 (Aib8’35)hGLP-l(8-35)-NH2 ( SEQ ID NO:8 )的 C端到 N端連 續耦聯Fmoc胺基酸。在每個連續的耦聯步驟後，Fmoc基團 都從N端被除去，而生成側鏈保護
Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu -Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Ai b-Arg樹脂（SEQ ID NO:4); (b) 將侧鏈保護Boc-His-OH基團與侧鏈保護
Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu -Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Ai 201012829 b-Arg樹脂（SEQIDNO:4)耦聯，以生成側鏈保護 Boc-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr -Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Va 1-Lys-Aib-Arg樹脂（SEQ ID NO:5); (c) 使用裂解混合物（cleavage cocktail)處理侧鏈保護 Boc-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr -Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Va 1-Lys-Aib-Arg樹脂（SEQ ID NO:5)，透過除去側鏈保護基 ❹. 困和N端保護基團，生成粗（Aib8’35)hGLP_l(7-36)-NH2 (SEQ ID NO:2);且 (d) 分離並純化此粗（Aib8’35)hGLP_l(7-36)-NH2 ( SEQ ID NO:2)，以生成純（Aib8’35)hGLP-l(7-36)-NH2 ( SEQ ID NO:2)。 本發明上述方面的一個較佳實施例亦包括以下步驟： (a-Ι) 對能夠生成肽醯胺的Fmoc保護樹脂解除保 參護，以從樹脂上除去Fmoc基團； (a-2) 將侧鍵保護的Fmoc-Arg-OH基團連接到樹脂 上，以生成側鏈保護的Fmoc-Arg樹脂；且 (a-3) 從側鏈保護的Fmoc-Arg樹脂上除去Fmoc基 團’以生成側鏈保護Arg樹脂； 這些步驟在步驟（a)之前執行。 本發明上述方面的一個較佳實施例特徵在於： 步驟（a-2)中所述的側鏈保護的Fmoc-Arg-OH基團是 Fmoc-Arg(Pbf)-〇H基團； 201012829 所述的侧鍵保護的Fmoc-Arg樹脂是Fmoc-Arg(Pbf)樹 脂； 所述的側鏈保護Arg樹脂是侧鏈保護Arg(Pbf)樹脂； 所述的從結構式（Aib8’35)hGLP-l(8-35)-NH2 ( SEQ ID NO:8) C端到N端的Fmoc胺基酸是Fmoc-Aib-OH、 Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH， Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、 Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、 Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、
Fmoc-Ser(tBu)_OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、 Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、 Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH和 Fmoc-Aib-OH ； 所述的侧鏈保護
Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu -Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Ai b-Arg樹脂（SEQIDNO:4)是
Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(0 tBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-G ln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Aib-Arg(Pbf)樹脂（SEQ ID NO:6);
所述的側鏈保護Boc-His-OH基團是Boc-His(Trt)-OH 201012829 基團； 所述的側鏈保護
Boc-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr -Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Va 1-Lys-Aib-Arg樹脂（SEQIDNO:5)是 Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Se r(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu( OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-A ❺ la-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Aib-Arg(Pbf)樹脂（SEQ ID NO:7);且 所述的裂解混合物選自下列群組：TFA/TIPS/水裂解混 合物、TFA/TIPS/二氣甲烷裂解混合物、TFA/苯酚/水/TIPS 裂解混合物、TFA/苯酚/水/甲基苯基硫醚/EDT裂解混合 物、TFA/苯酚/水/甲基苯基硫醚/正十二烷基硫醇裂解混合 物、TFA/DTT/水/TIPS裂解混合物、TFA/苯酚裂解混合物、 〇 TFA/苯酚/甲磺酸裂解混合物、TFA/甲基苯基硫醚/EDT/苯 甲醚裂解混合物、TFA/TES裂解混合物、TFA/水裂解混合 物、TFA/DCM/吲哚裂解混合物和TFA/TIPS裂解混合物。 本發明上述方面的一個較佳實施例特徵在於，所述的 能夠生成肽類的樹脂是選自下列群組：Fmoc-Rink醯胺 -MBHA樹脂、Fmoc-Rink醯胺-AM樹脂、基於PEG的 Fmoc-Rink酿胺樹脂和Sieber酿胺樹脂。 本發明上述方面的一個較佳實施例特徵在於： 所述的裂解混合物是選自下列群組：TFA/TIPS/水裂解 201012829 混合物、TFA/TIPS/二氣曱烷裂解混合物和TFA/水裂解混 合物；且 所述的能夠生成肽醯胺的樹脂是選自下列群組： Fmoc-Rink醯胺-MBHA樹脂、Fmoc-Rink酿胺-AM樹脂和基 於PEG的Fmoc-Rink醯胺樹脂。 本發明上述方面的一個較佳實施例特徵在於，所述的 能夠生成肽醯胺的樹脂是Fmoc-Rink醢胺-MBHA樹脂。 本發明上述方面的一個較佳實施例特徵在於步驟（d) 包含以下步驟： (d-Ι)濾除樹脂，以生成（Aib8,35)hGLP-l(7-36)-NH2 (SEQ ID NO:2 ) /裂解混合物濾出液； (d-2)濃縮（Aib8’35)hGLP-l(7-36)-NH2 ( SEQ ID NO:2) /裂解混合物濾出液。 (d-3)從濃縮的（Aib8’35)hGLP-l(7-36)-NH2 ( SEQ ID NO: 2 ) /裂解混合物濾出液中沉澱粗 (Aib8)35)hGLP-l(7-36)-NH2 ( SEQ ID NO:2)； (d-4) 在乙酸銨緩衝液中漿化此粗沉澱的 (Aib8,35)hGLP-l(7-36)-NH2 ( SEQ ID NO:2)，以逆轉 N-〇 位移； (d-5) 調節此漿料的pH值，以生成 (Aib8’35)hGLP-l(7-36)-NH2 ( SEQ ID NO:2)溶液；且 (d-6)分離並純化（Aib8,35)hGLP-l(7-36)-NH2 ( SEQ ID NO:2)。 本發明上述方面的一個較佳實施例特徵在於，所述的 201012829 N-Ο位移逆轉是透過將此粗沉濺的 (Aib8,35)hGLP-l(7-36)-NH2 ( SEQ ID NO:2)置於微鹼性媒 體中，然後將pH值調至3-3.7左右以完成》 本發明上述方面的一個較佳實施例特徵在於，所述的 去除樹脂上Fmoc基團是採用呱啶DMF溶液進行。 本發明上述方面的一個較佳實施例特徵在於，所述的 呱啶DMF溶液濃度約為25% (v/v)。 本發明上述方面的一個較隹實施例特徵在於， (Aib8’35)hGLP-l(7-36)-NH2 ( SEQ ID NO:2)上的胺基酸殘 基是採用選自下列群組的耦聯試劑組合進行耦聯： TBTU/HOBt、TBTU/HBTU/DIEA、HATU/DIEA、 HCTU/DIEA、TBTU/HOBt/DIEA、DIC/HOBt、DIC/HOAt、 HATU/HOBt/DIEA和 HCTU/HOBt/DIEA » 本發明上述方面的一個較佳實施例特徵在於： (Aib8,35)hGLP-l(7-36)-NH2 ( SEQ ID NO:2) C端的頭 29 個胺基酸殘基使用耦聯試劑組合TBTU/HOBt或 TBTU/HBTU/DIEA進行耦聯；且 N端織胺酸使用選自下列群組的耦聯試劑組合進行耦 聯：HATU/DIEA、HCTU/DIEA、TBTU/HBTU/DIEA、 TBTU/HOBt/DIEA、DIC/HOBt、DIC/HOAt、 HATU/HOBt/DIEA和 HCTU/HOBt/DIEA。 本發明上述方面的一個較佳實施例特徵在於： 所述的用於耦聯（Aib8’35)hGLP-l(7-36)-NH2 ( SEQ ID NO:2 ) C端頭29個胺基酸殘基的耦聯試劑組合是 201012829 c TBTU/HOBt ;且 所述的用於耦聯N端織胺酸的耦聯試劑組合是 HATU/DIEA。 本發明上述方面的一個較佳實施例特徵在於： (Aib8’35)hGLP-l(7_36)-NH2 ( SEQ ID N0:2) C端的頭 29 個胺基酸殘基採用約3.0個當量的各Fmoc-胺基酸、約2.94 個當量的TBTU、約2.94個當量的HOBt和約4.5個當量的 DIEA進行耦聯，這些耦聯試劑均溶於過量約5容積的DMF 中；且 >1端織胺酸採用約3.4個當量的8〇〇11丨8(1^)-〇11、約 4.08個當量的HATU和約9.0個當量的DIEA進行耦聯，這些 耦聯試劑均溶於過量約5容積的DMF中。 另一方面’本發明提供如申請專利範圍第項1的合成 (Aib8,35)hGLP-l(7-36)-NH2 ( SEQ ID NO:2)的方法，其包 括以下步驟： (a) 利用側鏈保護的精胺睃（Arg)樹脂，從 (Aib8,35)hGLP-l(7-35)_NH2 ( SEQ ID NO:9)的 C端到 N端連 續耦聯Fmoc胺基酸❶在每個連續的耦聯步驟後，Fmoc基團 都從N端被除去，而生成側鏈保護
His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu -Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Ly s_Aib-Arg樹脂（SEQ ID NO:3 ); (b) 使用裂解混合物處理侧鏈保護 His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu 201012829 -Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Ly s-Aib-Arg樹脂（SEQ ID NO:3)，透過除去側鏈保護基團， 生成粗（Aib8,35)hGLP-l(7-36)-NH2 ( SEQ ID NO:2);且 (c)分離並純化此粗（Aib8’35)hGLP-l(7-36)-NH2 (SEQ ID NO:2)，以生成純（Aib8,35)hGLP-l(7-36)-NH2 ( SEQ ID NO:2)〇 本發明上述方面的一個較佳實施例還包括以下步驟： (a-Ι) 對能夠生成肽醯胺的Fmoc保護樹脂解除保 護，以從樹脂上除去Fmoc基團； (a-2) 將侧鏈保護的Fmoc-Arg-OH基團連接到樹脂 上，以生成側鏈保護的Fmoc-Arg樹脂；且 (a-3) 從侧鍵保護的Fmoc-Arg樹脂上除去Fmoc基 團，以生成側鏈保護Arg樹脂； 這些步驟在步驟（a)之前執行。 本發明上述方面的一個較佳實施例特徵在於： ϋ 所述步驟（a-2)中的側鏈保護的Fmoc-Arg-OH基困是
Fmoc-Arg(Pbf)-OH基團； 所述的側鏈保護的Fmoc-Arg樹脂是Fmoc-Arg(Pbf)-OH 和 Fmoc-Arg(Pbf)樹脂； 所述的側鏈保護Arg樹脂是侧鏈保護Arg(Pbf)樹脂； 所述的從結構式（Aib8’35)hGLP-l(7-35)-NH2 ( SEQ ID NO:9) C端到N端的Fmoc胺基酸是Fmoc-Aib-OH、 Fmoc-Lys(Boc)-〇H、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Trp(Boc)-〇H、Fmoc，Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、 11 201012829
Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、 Fmoc-Ala-OH ' Fmoc-Ala-OH ' Fmoc-Gln(Trt)-OH ' Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、
Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、 Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、 Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fm〇c-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Aib-OH和 Fmoc-His(Trt)-OH ; 所述的侧鏈保護
His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu -Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Ly s-Aib-Arg樹脂（SEQIDNO:3)是
His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tB u)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtB u)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)_Leu-Val-Lys(Boc)-Aib-Arg(Pbf)樹脂（SEQ ID NO:10);且 所述的裂解混合物選自下列群組：TFA/TIPS/水裂解混 合物、TFA/TIPS/二氣曱烷裂解混合物、TFA/苯酚/水/TIPS 裂解混合物、TFA/苯酚/水/甲基苯基硫醚/EDT裂解混合 物、TFA/苯酚/水/曱基苯基硫醚/正十二烷基硫醇裂解混合 物、TFA/DTT/水/TIPS裂解混合物、TFA/苯酚裂解混合 物、TFA/苯酚/曱磺酸裂解混合物、TFA/甲基苯基硫醚/EDT/ 苯甲醚裂解混合物、TFA/TES裂解混合物、TFA/水裂解混 201012829 合物、TFA/DCM/吲哚裂解混合物和TFA/TIPS裂解混合物。 本發明上述方面的一個較佳實施例特徵在於，所述的 能夠生成肽類的樹脂是選自下列群組：Fmoc-Rink醯胺 -MBHA樹脂、Fmoc-Rink酿胺-AM樹脂、基於PEG的 Fmoc-Rink醯胺樹脂和Sieber酸胺樹脂。 本發明上述方面的一個較佳實施例特徵在於： 所述的裂解混合物是選自下列群組：TFA/TIPS/水裂解 混合物、TFA/TIPS/二氣甲烷裂解混合物和TFA/水裂解混合 ❹ 物；且 所述的能夠生成肽醢胺的樹脂是選自下列群組： Fmoc-Rink醢胺-MBHA樹脂、Fmoc-Rink醯胺-AM樹脂和基 於PEG的Fmoc-Rink酿胺樹腊❶ 本發明上述方面的一個較佳實施例特徵在於，所述的 能夠生成肽醢胺的樹脂是Fmoc-Rink醯胺-MBHA樹脂。 本發明上述方面的一個較佳實施例特徵在於步驟（c)包 Q 含以下步驟： (c-1)濾除樹脂，以生成（Aib8,35)hGLP-l(7-36)-NH2 (SEQ ID NO:2) /裂解混合物濾出液； (c-2)濃縮（Aib8,35)hGLP-l(7-36)-NH2 ( SEQ ID NO:2) /裂解混合物濾出液。 (c-3)從濃縮的（Aib8’35)hGLP-l(7-36)-NH2 ( SEQ ID NO:2) /裂解混合物濾出液中沉澱粗 (Aib8>35)hGLP-l(7-36)-NH2 ( SEQ ID NO:2)； (c-4) 在乙酸銨緩衝液中漿化此粗沉澱的 13 201012829 (Aib8’35)hGLP-l(7-36)-NH2 ( SEQ ID NO:2)，以逆轉 N-O 位 移； (c-5) 調節此漿料的pH值，以生成 (Aib8,35)hGLP-l(7-36)-NH2 ( SEQ ID NO:2)溶液；且 (c-6)分離並純化（Aib8’35)hGLP-l(7-36)-NH2 ( SEQ ID NO:2) » 本發明上述方面的一個較佳實施例特徵在於，步驟 (c-4)中所述的N-O位移逆轉是透過將此粗沉澱的 (Aib8’35)hGLP-l(7-36)-NH2 ( SEQ ID NO:2)置於微鹼性媒 體中，然後將pH值調至3_3.7左右以完成。 本發明上述方面的一個較佳實施例特徵在於，所述的 去除樹脂上Fmoc基團是採用狐唆DMF溶液進行。 本發明上述方面的一個較佳實施例特徵在於，所述的 呱啶DMF溶液濃度約為25% (v/v)。 本發明上述方面的一個較佳實施例特徵在於， (Aib8’35)hGLP-l(7-36)-NH2 ( SEQ ID NO:2)上的胺基酸殘 基是採用選自下列群組的耦聯試劑組合進行耦聯： TBTU/HOBt、TBTU/HBTU/DIEA、HATU/DIEA、 HCTU/DIEA、TBTU/HOBt/DIEA、DIC/HOBt、DIC/HOAt、 HATU/HOBt/DIEA和 HCTU/HOBt/DIEA。 本發明上述方面的一個較佳實施例特徵在於， (Aib8’35)hGLP-l(7-36)-NH2 ( SEQ ID NO:2)上的胺基酸殘 基是採用耦聯試劑組合TBTU/HOBt或TBTU/HBTU/DIEA進 行耦聯。 201012829 本發明上述方面的一個較佳實施例特徵在於， (Aib8,35)hGLP-l(7-36)-NH2 ( SEQ ID NO:2)上的胺基酸殘 基是採用辆聯試劑組合TBTU/HOBt進行耦聯。 本發明上述方面的一個較佳實施例特徵在於， (Aib8’35)hGLP-l(7-36)-NH2 ( SEQ ID NO:2)上的胺基酸殘 基是採用約3.0個當量的各Fmoc-胺基酸、約2.94個當量的 丁6丁11、約2.94個當量的11081和約4.5個當量的0^入進行耦 聯，這些耦聯試劑均溶於過量約5容積的DMF中。 實施方式 本申請使用的縮寫如下： ACN 乙腈 AM 胺甲基
Boc 第三丁氧羰基 DCM 二氣甲烷 DIC 兄二異丙基碳二亞胺 D1EA Ν,Ν-二異丙基乙胺 DMF 二甲基甲醯胺 DTT 二硫蘇糖醇 EDT 乙二硫醇
Fmoc 苐甲氧羰基 HATU 氧-(7-偶氮苯并三氮唑-1-基）-1，1，3,3-四甲基脲六氟 磷酸酯
HBTU 2-(1Η-苯并三氮唑-1-基）-1，1，3,3-四甲基脲六氟磷 15 201012829 HOAt 酸酯 1-羥基-7-疊氮苯并三唑 HOBt 1-經基苯并三唆 HPLC 高壓液相層析 LOD 乾燥減重 MBHA 4-甲基二苯甲基胺 MTBE 曱基第三丁基醚 OtBu 第三丁基酯 Pbf 2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5·磺醯 PEG 聚乙二醇 TBTU 2-(111-苯并三唑-1-基）_1，1，3,3_四甲基脲 tBu 第三丁基醚 TES 三乙基矽烷 TFA 三氟乙酸 TIPS 二異丙基梦烧 Trt 三笨甲基 基於PEG的Fmoc-Rink醢胺樹脂是一種含有 Fmoc-Rink醯胺鏈結劑的樹脂，其中樹脂的組成磁珠含有 PEG成份。一些基於PEG-Rink的醯胺樹脂的非專屬範例 NovaPeg、NovaGel 和 AM SURE。 本文中使用的術語「裂解混合物」是指用於去除或裂 解樹脂中合成肽的試劑混合物。另外，裂解混人物還 於除去所有側鏈保護基團和N端保護基團。 用 本文中使用的術語「關於」肖參數或數量有關是指 16 201012829 參數或數量在聲明參數或數量的土 5%内。以下範例是為解 釋本發明之方法，不應被視為以任何方式限制本發明。 • iAih8,35)hGLP-U7-36、-NH，（ SEO ID NO:2)的合成 (Aib8’35)hGLP-l(7-36)-NH2 ( SEQ ID NO:2)是在一個 35升的玻璃反應器（Quark，Vineland，NJ, USA)内合成，這 種反應器配備有壓縮氣動馬達和聚四氟乙烯（PTFE)攪拌 機。使用的 Fmoc Rink 醯胺 MBHA 樹脂（Merck Biosciences， Darmstadt，Germany)摻入量為 0.63 mmol/g。Fmoc 胺基酸 (Synthetech Inc.，Albany, OR，USA)使用時帶有以下側鏈保 護：Fmoc，Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)，OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、
Boc-His(Trt)-OH ' Fmoc-Lys(Boc)-OH ' Fmoc-Ser(tBu)-〇H ' Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-.Trp(Boc)-OH 和 Fmoc-Tyr(tBu)-OH。以下Fmoc胺基酸不需要側鍵保護： Fmoc-Aib-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、 ❹ Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu，OH、Fmoc-Phe-OH 和 Fmoc-Val-OH。 合成是以0.63莫耳的規模進行（1 kg輸入樹脂）。頭 29個胺基酸（除N端織胺酸外的全部胺基酸）採用3.0個 當量的胺基酸進行耦聯，並使用2.94個當量的TBTU (Fluka， Seelze，Germany)、2.94 個當量的 HOBt (Fluka, Seelze， Germany)和 4 5 個當量的 DIEA (Sigma-Aldrich，Gillingham, UK)進行預活化，這些試劑均溶於4.5升的dMF中。耦聯 時間為60分鐘。Boc-His(Trt)-OH基團使用3.4個當量的胺 17 201012829 基酸、4.08 個當量的 HATU (Applied Biosystems， Framingham，MA，USA)和9個當量的DIEA進行耦聯，這 些試劑均溶於4.5升的DMF中》在開始耦聯之前、每個連 續的耦聯步驟後，使用2 X 10升的25% (v/v)呱啶（BASF， Germany) DMF溶液對樹脂解除保護。 在完成樹脂上的肽裝配後，使用10升的甲醇（Labscan， Dublin，Ireland)沖洗兩次，然後’置於真空烘箱（Mason Technology，Dublin, Ireland)内乾燥至 LOD (乾燥減重）< 1°/〇。樹脂開始是在反應器内被氮氣乾燥，最後置於真空烘 箱内並在< 50 mbar、室溫（22 °C左右）下乾燥》整個乾 燥過程需3天時間。獲取4200克的肽基樹脂。 然後，從樹脂上裂解下此肽，對每個子批取6x 700 克並使用8.4升的TFA/TIPS/水（80/14.3/5.7 % v/v)裂解混合 物處理170分鐘，以除去側鏈保護基團。使用〇.7升tfa 洗脫樹脂，再將濾出液混合。使用減壓濃縮機（Buchi，Flawil, Switzerland)，將此裂解混合物濃縮至其原重量的14-32%， 再在 13.6-17.5 升的挽掉 MTBE (Labscan, Dublin, Ireland) 中對此粗肽進行沉澱。接著，再使用1.5-7.5升的MTBE以 進一步沖洗此粗肽。 將沉澱後的粗肽置於乙酸胺緩衝液（1〇克肽/100毫 升，10% w/v即10克肽/100毫升緩衝液，pfj 8-9)中漿化 處理60分鐘，以逆轉N-0位移。使用14-18升的冰乙酸將 pH值調至3.3-3.7之間’以生成HPLC測試純度為50%左 右的澄清粗肽溶液。純化前’對此肽溶液使用0.45微米濾 18 201012829 膜（Pall Gelman Sciences Inc.，New York, NY，USA)過遽。 然後，使用填料為C18固定相（EKA Chemicals AB， Bohus，Sweden)的反相製備 HPLC 層析柱（Novasep，Pompey， France)純化此肽。接著，置於0.1%的T FA水/乙腈溶液中， 透過梯度洗脫以純化。 使用乙酸銨和乙酸緩衝液，進行鹽置換層析步驟，以 生成乙酸鹽。具體來講，是將肽於HPLC層析柱上純化。 使用乙酸銨缓衝液，在層析柱上沖洗此肽1小時。然後， e 使用乙酸/乙腈梯度以將此肽從層析柱上洗脫下。 根據HPLC分析，純化後此肽的純度為> 99%。具體來 講，將此肽溶液在減壓濃縮機（最高溫度達40°C )上濃縮， 然後，將得到的溶液使用0.45微米濾膜（Pall Gelman Sciences Inc.，New York，NY，USA)過據，再凉_ 乾》 在最後織胺酸耦聯用系統上，與TBTU/HBTU/DIEA、 TBTU/HOBt/DIEA、DIC/HOBt、DIC/HOAt 或 ❹ HATU/HOBt/DIEA系統相比，HATU/DIEA系統能夠將此 29mer 更好地轉化為（Aib8,35)hGLP_l(7-36)-NH2 ( SEQ ID NO:2)，從而提高了產率》 另外’與Fmoc保護織胺酸相比，使用Boc保護織胺 酸也能夠提高產率，而且由於在裂解前無需去除Fmoc的步 驟，使處理時間也略有減少》在織胺酸耦聯和樹脂裂解上 均進行實驗統計學設計，以選擇試劑與反應時間比的最佳 組合’達到提高產率之目的，詳見下表。 正如本領域内眾所周知的，N-O位移即為醯基位移-- 201012829 當暴露在酸性環境中時，含有蘇胺酸或絲胺酸殘基的肽内 便會進行此位移。它們將導致生成異構雜質，而導致產率 降低且不易純化。透過將肽置於在微鹼性媒體（即pH 8-9 ) 中，然後，回調pH值至3左右，可逆轉此N-0位移現象。 上述過程允許其作為漿料逆轉N-O位移，這樣，比基於整 個溶液的逆轉處理更具規模上的優勢。 20 201012829 表1: 小規模實驗設計（且產率/純度結果相同）——
Ο 旨在優化（八比8,35)11〇1^_1(7-36)->^2(8丑(^10 ΝΟ:2)上Ν端織胺酸殘基的耦聯條件 實 驗 編 號 織 胺 酸 當 量 HATU/His 比 DIEA 當量 反應 時間 產率 (%) 純度 (%) D_His 水 準（％) Des-His 水準(0/〇) 1 3 0.6 4.5 0.5 18.52 56.52 0.1 0.27 2 6 0.6 4.5 4 23.51 62.76 0.14 —^----- 0.06 3 3 1.2 4.5 4 26.44 63.43 0.05 ~~~~^. 0.1 4 6 1.2 4.5 0.5 13.17 31.94 0.07 —^ 1.29 5 3 0.6 9 4 25.18 56.47 0.14 0.16 6 6 0.6 9 0.5 21.09 53.89 0.11 ----' 0.14 7 3 1.2 9 0.5 21.65 58.93 0.06 0.2 8 6 1.2 9 4 27.50 62.48 0.03 ------ 0.11 9 4.5 0.9 6.75 2.25 25.73 58.87 0.08 —^ 0.06 10 4.5 0.9 6.75 2.25 26.61 61.1 0.06 --^^ 0.06 註：顯示包含與在粗肽中耦聯（D-和Des-His )相關的雜質 水準的結果。 21 201012829 表2: 反復小規模和大規模合成的結果--利用優 化的織胺酸耦聯條件（3.4個當量的 Boc-His、4.08 個當量的 HATU、9·0 個當 量的DIEA及2.9個小時反應時間） 規模(輸入樹脂） 產率（％) 純度（％) D-His 水準（％) Des-His 水準(％ ) 0.5克 29.2 57.7 2.5 1.7 0.5克 30.4 59.4 2.7 3.3 0.5克 27.8 56.0 3.8 2.7 160克 27.8 56.01 3.19 1.93 160克 29.2 52.22 2.40 0.90 註：顯示包含與在粗肽中耦聯（D-和Des-His)相關的雜質 水準的結果。 22 201012829 表 小規模實驗設計（且產率/純度結果相同）__ 旨在優化從樹腊上裂解 ❹ (Aib )hGLP-1 (7-36)-NH2 ( SEQ ID NO：2) 的條件
註：在上面實驗中TFA佔裂解混合物的8〇〇/〇 23 201012829 表4: 裂解優化實驗：12容積的裂解混合物（超過
樹脂重量），80% TFA，2.8個小時反應時間， 2.5:1 的 TIPS:H20 比 輸入樹脂規模 產率（％) 純度 10克 29.1 ................ 51.9 100克 27.8 51.5 ^ 1〇〇克 27.1 52.7 註：上面結果為N-O位移逆轉後的值。 如上表2和4所示’粗產物（裂解混合物摻入蒸發和 在MTBE中沉澱）經優化，可大規模沉澱而不影響產率。 最後’進行大規模合成（1千克輸入樹脂），其將順序裂解 成子批’總合成產率為27%左右，與先前小規模方法相比 產率増加約8%左右入 在純化方法開發上，我們努力的重點放在從開始便使 用的TFA梯度上’透過對其改進，以極大地減少為獲取純 ❹ 度> 99%材料所需的純化步驟，這將致純化產率為50-60%。 其他實施你丨 透過上面描述，具有該領域技能的人可容易地確定本 發月的特點，而不背離本發明的精神和範圍，能夠對本發 月作適當的變更和修改，使其適用於各種用途和條件。因 此，在申請專利範圍内也包含其他實施例。 24 201012829 <110> 序列表 艾普辛製造愛爾蘭股份有限公司 董，正欣 拉格曼，湯姆·赛倫 荷利，菲翁 強生，史帝芬R <120> (Aib8,35)hGLP-l(7-36)-NH2 之合成方法 <130〉 162P/PCT2 ϋ <140> ^ <141> 2009-09-21 <150〉 <151> US 61/192,939 2008-09-22 <160〉 10 <170> Patentln version 3.5 <210〉 <211> <212〉 Q <213〉 1 30 PRT 智人 <400〉 1
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 15 10 15
Gin Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210〉 2 201012829 <211> 30 <212〉PRT <213>人工序列 <220> <223>升血糖激素樣肽-1 (GLP-1)的合成類似物 <220> <221> MISC.FEATURE <222〉 （2)..(2) <223〉Xaa = α-胺基異丁酸（Aib) <220> <221> MISC_FEATURE <222〉 （29)..(29) <223〉Xaa = α-胺基異丁酸（Aib) <220> <221> MOD_RES <222〉 （30)..(30) <223>醯胺化 <400〉 2
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15
Gin Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg 20 25 30 <210> 3 <211> 30 <212> PRT <213>人工序列 2 201012829 <220> <223〉升血糖激素樣肽-1 (GLP-1)的合成類似物 <220> <221> MISC_FEATURE <222〉 （2)..(2) <223〉Xaa = α -胺基異丁酸（Aib) <220> <221> MISC_FEATURE <222〉 （29)..(29) _ <223> Xaa = α-胺基異丁酸（Aib) <220> <221> M0D_RES <222〉 （30)..(30) <223〉以樹脂修飾 <400〉 3
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 15 10 15 ❹ Gin Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg 20 25 30 <210〉 4 <211> 29 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉升血糖激素樣肽-1 (GLP-1)的合成類似物 201012829 <220> <221> MISC_FEATURE <222〉 （1)..(1) <223> Xaa = a-胺基異丁酸（Aib) <220> <221> MISC.FEATURE <222> (28)..(28) <223〉Xaa = a -胺基異丁酸（Aib) <220〉 <221> MOD_KES <222〉 （29)..(29) <223>以樹脂修飾 <400> 4
Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin 15 10 15
Ala Ala Lys Glu Phe He Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg 20 25 <210> 5 <211> 30 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>升血糖激素樣肽-1 (GLP-1)的合成類似物 <220〉 <221〉 MOD—RES <222> (1)..(1) <223〉在N端以第三丁氧羰基(Boc)保護基團修飾 201012829 <220> <221> <222〉 <223> MISC_FEATURE (2)..(2) Xaa = a-胺基異丁酸（Aib) <220〉 <221> <222〉 <223〉 MISC_FEATURE (29)..(29) Xaa = a-胺基異丁酸（Aib) <220> 〇 <221> <222〉 <223> MDD.RES (30)..(30) 以樹脂修飾 <400〉 5
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 15 10 15
Gin Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg 20 25 30 <210> <211> <212〉 <213〉 6 29 PRT 人工序列 <220〉 <223> 升血糖激素樣肽-1 (GLP-1)的合成類似物 <220〉 <221> MISC一FEATURE <222〉 （1)..(1) 201012829 <223〉Xaa = α-胺基異丁酸（Aib) <220〉 <221> MOD.RES <222〉 （2)..(2) <223〉以第三丁基酯(OtBu)側鏈保護基團修飾 <220> <221> MOD.RES <222> (4)..(4) <223〉以第三丁基醚（tBu)側鏈保護基團修飾 <220〉 <221> MOD.RES <222〉 （6)..(6) <223>以第三丁基醚（tBu)側鏈保護基團修飾 <220> <221〉MOD一RES <222〉 （7)..(7) <223>以第三丁基醚(tBu)側鏈保護基團修飾 <220〉 <221> MOD.RES <222〉 （8)..(8) <223>以第三丁基酯(OtBu)側鏈保護基團修飾 <220〉 <221> MOD.KES <222〉 （10)..(10) <223>以第三丁基醚（tBu)側鏈保護基團修飾 <220〉 <221> M0D_RES <222〉 （11),.(11) <223〉以第三丁基醚(tBu)側鏈保護基團修飾 <220> 201012829 <221> MOD一RES <222〉 <223> (12)..(12) 以第三丁基醚(tBu)側鏈保護基團修飾 <220〉 <221> <222> <223> MOD.RES (14)..(14) 以第三丁基酯(OtBu)側鏈保護基團修飾 <220〉 <221> <222> ❹ <223> MOD一RES (16)..(16) 以三苯甲基(Trt)側鏈保護基團修飾 <220> <221> <222〉 <223> M0D_RES (19)..(19) 以第三丁氧羰基(Boc)側鏈保護基團修飾 <220〉 <221> <222〉 <223> MOD一RES (20)..(20) 以第三丁基酯(OtBu)側鏈保護基團修飾 <220〉 ❿ <221〉 <222> <223〉 MOD— RES (24)..(24) 以第三丁氧羰基(Boc)側鏈保護基團修飾 <220> <221> <222> <223> M0D_RES (27)..(27) 以第三丁氧羰基(Boc)側鏈保護基團修飾 <220〉 <221> <222> <223> MISC一FEATURE (28)..(28) Xaa = α-胺基異丁酸（Aib) 201012829 <220> <221> MOD一RES <222〉 （29)..(29) <223〉2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺醯(Pbf)側鏈保護基團 <220> <221> MOD.RES <222〉 （29)..(29) <223>以樹脂修飾 <400〉 6
Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin 15 10 15
Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg 20 25 <210〉 7 <211> 30 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉升血糖激素樣肽-1 (GLP-1)的合成類似物 <220> <221> M0D_RES <222> (1)..(1) <223>在?^端以第三丁氧羰基(Boc)保護基團修飾 <220〉 <221> M0D_RES <222〉 （1)..(1) 201012829 <223> 以三苯甲基(Trt)側鏈保護基團修飾 <220> <221> <222> <223〉 MISC.FEATURE (2)..(2) Xaa = α-胺基異丁酸（Aib) <220〉 <221> <222〉 <223> MOD一RES (3)..(3) 以第三丁基酯(OtBu)側鏈保護基團修飾 © <22〇> ^ <221> <222> <223> M0D_RES (5)..(5) 以第三丁基醚（tBu)側鏈保護基團修飾 <220> <221> <222〉 <223〉 MOD一RES (7)..(7) 以第三丁基醚(tBu)側鏈保護基團修飾 <220〉 <221> <222> ❹ <223〉 M0D_RES (8)..(8) 以第三丁基醚(tBu)側鏈保護基團修飾 <220> <221> <222> <223> MOD一RES (9)..(9) 以第三丁基酯(OtBu)側鏈保護基團修飾 <220〉 <221〉 <222> <223〉 MOD一RES (11)..(11) 以第三丁基醚(tBu)側鏈保護基團修飾 <220〉 201012829 <221> <222> <223> <220〉 <221> <222〉 <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223〉 <220> <221> <222〉 <223> <220〉 <221〉 <222> <223> <220> <221〉 <222> <223> MOD.RES(12)..(12) 以第三丁基醚（tBu)側鏈保護基團修飾 MOD.RES (13)..(13) 以第三丁基醚（tBu)側鏈保護基團修飾 MOD.RES (15)..(15) 以第三丁基酯(OtBu)側鏈保護基團修飾 M0D—EES (17)..(17) 以三苯甲基(Trt)側鏈保護基團修飾 M0D_RES(20)..(20) 以第三丁氧羰基(Boc)保護基團修飾 MOD.RES(21)..(21) 以第三丁基酯(OtBu)側鏈保護基團修飾 MOD一 RES (25)..(25) 以第三丁氧羰基(Boc)保護基團修飾 M0D.RES (28)..(28) 以第三丁氧羰基(Boc)側鏈保護基團修飾 10 201012829 <220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉 （29)..(29) <223〉Xaa = α-胺基異丁酸（Aib) <220〉 <221〉 MOD—EES <222〉 （30)..(30) <223>以2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺醯(Pbf)側鏈保護基團修飾 <220〉
<221> M0D.RES <222〉 （30)..(30) <223〉以樹脂修飾 <400〉 7
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 15 10 15
Gin Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg 20 25 30
<210〉 8 <211> 28 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉升血糖激素樣肽-1 (GLP-1)的合成類似物 <220> <221> MISC.FEATURE <222〉 （1)..(1) 201012829 <223> Xaa = α-胺基異丁酸（Aib) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa = α-胺基異丁酸（Aib) <220〉 <221> MOD_PES <222> (28)..(28) <223〉醯胺化 <400〉 8
Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin 1 5 10 15
Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Val Lys Xaa 20 25 <210> 9 <211> 29 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220> <223〉升血糖激素樣肽-1 (GLP-1)的合成類似物 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223〉Xaa = α-胺基異丁酸（Aib) <220>
<221> MISC_FEATURE /2 201012829 <222〉 （29)..(29) <223> Xaa = α-胺基異丁酸（Aib) <220〉 <221> MOD.KES <222〉 （29)..(29) <223>醯胺化 <400〉 9
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 15 10 15 o
Gin Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Val Lys Xaa 20 25 <210〉 10 <211> 30 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223〉升血糖激素樣肽-1 (GLP-1)的合成類似物 <220> <221> M0D_RES <222〉 （1)..(1) <223>以三苯甲基(Trt)側鏈保護基團修飾 <220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉 （2)..(2) <223> Xaa = α-胺基異丁酸（Aib) 13 <220〉 201012829 <221> MOD.RES <222> (3)..(3) <223>以第三丁基酯(OtBu)側鏈保護基團修飾 <220> <221> M0D.RES <222〉 （5)..(5) <223>以第三丁基醚（tBu)側鏈保護基團修飾 <220> <221> MDD.RES <222〉 （7)..(7) <223〉以第三丁基醚(tBu)側鏈保護基團修飾 <220> <221〉 MOD一RES <222> (8)..(8) <223>以第三丁基醚（tBu)側鏈保護基團修飾 <220> <221> M0D_RES <222〉 （9)..(9) <223>以第三丁基酯(OtBu)側鏈保護基團修飾 <220> <221> M0D.RES <222〉 （11)..(11) <223〉以第三丁基醚(tBu)側鏈保護基團修飾 <220> <221> M0D_RES <222> (12)..(12) <223>以第三丁基醚(tBu)側鏈保護基團修飾 <220〉 <221> M0D.RES <222〉 （13)..(13) <223>以第三丁基醚(tBu)側鏈保護基團修飾 201012829 <220〉 <221> MOD_RES <222〉 （15)..(15)
<223> 以第三丁基酯(OtBu)側鏈保護基團修飾 <220> <221> <222> <223〉 MOD.KES (17)..(17) 以三苯甲基(Tr t)側鏈保護基團修飾 <220> 參 <221> <222〉 <223> M0D_RES (20)..(20) 以第三丁氧纖Boc)側鏈保護基團修飾 <220〉 <221> <222> <223〉 MOD一;RES (21)..(21) 以第三丁基酯(OtBu)側鏈保護基團修飾 <220> <221> <222> <223> ❹ <220〉 M0D_RES (25)..(25) 以第三丁氧羰基(Boc)側鏈保護基團修飾 <221> <222> <223> M0D.RES (28)..(28) 以第三丁氧羰基(Boc)側鏈保護基團修飾 <220> <221> <222> <223> MISC_FEATURE (29)..(29) Xaa = α-胺基異丁酸（Aib) <220> <221〉 MOD RES 201012829 <222〉 （30)..(30) <223> 2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺醯(Pbf)側鏈保護基團 <220> <221〉 M0D—RES <222〉 （30)..(30) <223〉以樹脂修飾 <400〉 10
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 15 10 15
Gin Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg 20 25 30
Sb

Claims (1)

  1. 201012829 * 七、申請專利範圍： 1. 一種（Aib8,35)hGLP_l(7-36)-NH2 ( SEQ ID NO:2) 的合成方法，其包含階段式固相Fmoc化學。 2- 如申請專利範圍第1項的 (Aib8,35)hGLP_l(7-36)-NH2(SEQIDNO:2)合成方法，其 包括以下步驟： Ο)利用侧鏈保護的精胺酸（Arg)樹脂，從 ❻ （Aib8’35)hGLP-l(8_35)-NH2 ( SEQ ID NO:8 )的 C端到 N端連 續耦聯Fmoc胺基酸，其中在每個連續的耦聯步驟後，Fmoc 基團被從N端除去，而生成側鏈保護的 Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu -Gly-Gln-Ala-Ala-Ly s-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Ai b-Arg樹脂（SEQ ID NO:4); (b) 將侧鏈保護的Boc-His-OH基團與侧鏈保護的 ❹ Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu -Gly-Gln-Ala-Ala-Ly s-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Ai b-Arg樹脂（SEQ ID NO:4)耦聯，以生成側鏈保護的 Boc-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr -Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Va 1-Lys-Aib-Arg樹脂（SEQ ID NO:5); (c) 使用裂解混合物處理該側鏈保護的 Boc-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr- Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr -Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Va 15 201012829 l-Lys-Aib-Arg樹脂（SEQ ID NO:5 )，且從其中除去該側鍵 保護基團和N端保護基團，以生成粗 (Aib8,35)hGLP-l(7-36)-NH2 ( SEQ ID NO:2);及 (d)分離並純化此粗（Aib8,35)hGLP-l(7-36)-NH2 ( SEQ ID NO:2)，以生成純（Aib8’35)hGLP-l(7-36)-NH2 ( SEQ ID NO:2)。 3. 如申請專利範圍第2項的 (Aib8,35)hGLP-l(7-36)-NH2(SEQIDNO:2)合成方法，其 還包括以下步驟： (a-Ι) 對能夠生成肽酿胺的Fmoc保護樹脂解除保 護，以從該樹脂上除去Fmoc基困； (a-2) 將側鏈保護的Fmoc-Arg-OH基團連接到該樹脂 上，以生成一側鏈保護的Fmoc-Arg樹脂；且 (a-3) 從側鍵保護的Fmoc-Arg樹脂上除去Fmoc基 團，以生成側鏈保護Arg樹脂； 這些步驟在步驟（a)之前執行。 4. 如申請專利範圍第3項的 (Aib8,35)hGLP-l(7-36)-NH2(SEQIDNO:2)合成方法，其 中： 所述步稀（a-2)中的側鏈保護的Fmoc-Arg-OH基困是 Fmoc-Arg(Pbf)-OH基團； 所述的側鏈保護的Fmoc-Arg樹脂是Fmoc-Arg(Pbf)樹 201012829 脂； 所述的側鏈保護的Arg樹脂是侧鏈保護的Arg(Pbf)樹 脂； 所述的從結構式（Aib8’35)hGLP_l(8-3 5)-NH2 ( SEQ ID NO:8)的C端到N端的Fmoc胺基酸是Fmoc-Aib-OH、 Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala_OH、Fmoc-Ile-OH、 Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、 Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、 Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、 Fmoc-Ser(tBu)-OH ' Fmoc-Val-OH ' Fmoc-Asp(OtBu)-OH ' Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、 Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH和 Fmoc-Aib-OH ； Q 所述的側鏈保護的 Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu -Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Ai b_Arg樹脂（SEQIDNO:4)是 Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(0 tBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-G ln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Aib-Arg(Pbf)樹脂（SEQ ID NO:6); 所述的側鏈保護的Boc-His-OH基困是Boc-His(Trt)-OH 27 201012829 基困； 所述的側鏈保護的 Boc-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr -Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Va l-Lys_Aib-Arg樹脂（SEQIDNO:5)是 Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Se r(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu( OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-A la-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Aib-Arg(Pbf)樹脂（SEQ ID NO:7);且 所述的裂解混合物是選自下列群組：TFA/TIPS/水裂解 混合物、TFA/TIPS/二氣甲烷裂解混合物、TFA/苯酚/水/TIPS 裂解混合物、TFA/苯酚/水/曱基苯基硫醚/EDT裂解混合 物、TFA/苯酚/水/甲基苯基硫醚/正十二烷基硫醇裂解混合 物、TFA/DTT/水/TIPS裂解混合物、TFA/苯酚裂解混合物、 TFA/苯酚/甲磺酸裂解混合物、TFA/甲基苯基硫醚/EDT/苯 甲醚裂解混合物、TFA/TES裂解混合物、TFA/水裂解混合 物、TFA/DCM/吲哚裂解混合物和TFA/TIPS裂解混合物、 5. 如申請專利範圍第4項的 (Aib8’35)hGLP-l(7-36)-NH2(SEQIDNO:2)合成方法，其 中所述的能夠生成肚的樹脂是選自下列群組：Fmoc-Rink 醯胺-MBHA樹脂、Fmoc-Rink醢胺-AM樹脂、基於PEG的 Fmoc-Rink醯胺樹脂和Sieber酿胺樹脂。 >8 201012829 6. 如申請專利範圍第5項的 (Aib1’35)hGLP-l(7-36)-NH2(SEQIDNO:2)合成方法，其 中： 所述的裂解混合物是選自下列群組：TFA/TIPS/水裂解 混合物、TFA/TIPS/二氣曱烷裂解混合物和TFA/水裂解混合 物；且 所述的能夠生成肽醯胺的樹脂是選自下列群組： Fmoc-Rink醯胺-MBHA樹脂、Fmoc-Rink醯胺-AM樹脂和基 於PEG的Fmoc-Rink醯胺樹脂。 7. 如申請專利範圍第6項的 (Aib1,35)hGLP-l(7-36)-NH2(SEQIDNO:2)合成方法，其 中所述的能夠生成肽醯胺的樹脂是Fmoc-Rink醯胺-MBHA 樹脂。 1 如申請專利範圍第7項的 (Aib1,35)hGLP-l(7_36)_NH2 ( SEQ ID NO:2)合成方法，其 中步驟（d)包括以下步驟： (d-Ι)濾除樹脂，以生成（Aib1,35)hGLP_l(7-36)-NH2 (SEQ ID NO:2) /裂解混合物濾出液； (d-2)濃縮（Aib1’35)hGLP-l(7-36)-NH2 ( SEQ ID NO:2) /裂解混合物濾出液； (d-3)從濃縮的（Aib1,35)hGLP-l(7-36)-NH2 ( SEQ ID 201012829 NO:2) /裂解混合物遽出液中沉殿出粗 (Aib8'35)hGLP-l(7-36)-NH2 ( SEQ ID NO:2)； (d-4)在乙酸銨緩衝液中漿化此粗沉澱的 (Aib8’35)hGLP-l(7-36)-NH2 ( SEQ ID NO:2)，以進行 N-0 位 移逆轉； (d-5) 調節此漿料的pH值，以生成 (Aib8’35)hGLP-l(7-36)-NH2 ( SEQ ID NO:2)溶液；及 (d-6)分離並純化（Aib8,35)hGLP-l(7-36)-NH2 ( SEQ ID NO:2)。 9. 如申請專利範圍第8項的 (Aib8’35)hGLP-l(7-36)-NH2(SEQIDNO:2)合成方法，其 中所述的N-0位移逆轉是透過將粗沉澱的 (Aib8’35)hGLP-l(7-36)-NH2 (SEQIDNO:2)置於微鹼性媒 體中’然後將pH值調至3-3.7左右以完成。 10. 如申請專利範圍第9項的 (Aib8’35)hGLP_l(7-36)-NH2(SEQIDNO:2)合成方法，其 中所述的從樹脂上去除Fmoc基團是採用於DMF中的呱咬 進行° 11.如申請專利範圍第1〇項的 (Aib8’35)hGLP-l(7-36)-NH2(SEQIDNO:2)合成方法，其 中所述的於DMF中的呱啶濃度約為25〇/〇 (v/v)。 4〇 201012829 12. 如前述任申請專利範圍任一項所述的 (Aib8,35)hGLP-l(7-36)_NH2(SEQIDNO:2)合成方法，其 中（Aib8’35)hGLP-l(7-36)-NH2 ( SEQ ID NO:2)上的胺基酸 殘基是採用從以下群組中選出的耦聯試劑組合進行耦聯： TBTU/HOBt、TBTU/HBTU/DIEA、HATU/DIEA、 HCTU/DIEA、TBTU/HOBt/DIEA、DIC/HOBt、DIC/HOAt、 HATU/HOBt/DIEA和 HCTU/HOBt/DIEA。 13. 如申請專利範圍第12項的 (Aib8,35)hGLP-l(7-36)-NH2(SEQIDNO:2)合成方法，其 中： (Aib8,35)hGLP-l(7-36)-NH2 ( SEQ ID NO:2) ·的 C端的頭 29個胺基酸殘基使用耦聯試劑組合TBTU/HOBt或 TBTU/HBTU/DIEA進行耦聯；且 N端織胺酸使用選自下列群組的耦聯試劑組合進行耦 聯：HATU/DIEA、HCTU/DIEA、TBTU/HBTU/DIEA、 TBTU/HOBt/DIEA、DIC/HOBt、DIC/HOAt、 HATU/HOBt/DIEA和 HCTU/HOBt/DIEA » 14.如申請專利範圍第13項的 (Aib 8 3 5)hGLP-l(7_36)-NH2(SEQIDNO:2)合成方法，其 中： 所述的用於耦聯（Aib8,35)hGLP-l(7-36)-NH2 ( SEQ ID 201012829 NO:2)的C端頭29個胺基酸殘基的耦聯試劑組合是 TBTU/HOBt ;且 所述的用於辆聯N端織胺酸的耦聯試劑組合是 HATU/DIEA。 15. 如申請專利範圍第14項的 (Aib8’35)hGLP-l(7-36)-NH2(SEQIDNO:2)合成方法，其 中： (Aib8’35)hGLP-l(7-36)-NH2 ( SEQ ID NO:2)的 C端的頭 29個胺基酸殘基採用於約5容積過量的DMF中的約3.0個當 量的各Fmoc-胺基酸、約2.94個當*的TBTU、約2.94個當量 的HOBt和約4.5個當量的DIEA進行耦聯；且 N端織胺酸採用於約5容積過量的DMF中的約3.4個當 量的Boc-His(Trt)-OH、約4.08個當量的HATU和約9.0個當量 的DIEA進行耦聯，這些耦聯試劑均。 16. 如申請專利範圍第1項的 (Aib8’35)hGLP-l(7-36)-NH2(SEQIDNO:2)合成方法，其 包括以下步驟： (a) 利用側鏈保護的精胺酸（Arg)樹脂，從 (Aib8’35)hGLP-l(7-3 5)_NH2 ( SEQ ID NO:9)的 C端到 N端連 續耦聯Fmoc胺基酸，棋中在每個連續的耦聯步驟後，Fmoc 基團從N端被除去，而生成侧鏈保護的 His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu 201012829 -Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Ly s-Aib-Arg樹脂（SEQ ID NO:3); (b) 使用裂解混合物處理側鍵保護的 His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu -Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Ly s-Aib-Arg樹脂（SEQ ID ΝΟ··3 )，及從其中除去側鏈保護基 團’以生成粗（Aib8’35)hGLP-l(7-36)-NH2(SEQIDNO:2); 且 (c) 分離並純化此粗（Aib8,35)hGLP-l(7-36)-NH2 ( SEQ ID NO:2 )，以生成純（Aib8,35)hGLP-l(7_36)-NH2 ( SEQ ID NO:2)。 17. 如申請專利範圍第16項的 (Aib8,35)hGLP-l(7_36)-NH2(SEQIDN〇:2)合成方法，其 還包括以下步驟： (a-Ι) 對能夠生成肽醢胺的Fmoc保護樹脂解除保 護，以從該樹脂上除去Fmoc基團； (a-2) 將侧鏈保護的Fmoc-Arg-OH基團連接到該樹脂 上，以生成側鏈保護的Fmoc-Arg樹脂；且 (a-3) 從該侧鏈保護的Fmoc-Arg樹脂上除去Fmoc基 團，以生成側鏈保護的Arg樹脂； 這些步驟在步驟（a)之前執行。 18. 如申請專利範圍第17項的 201012829 (Aib8,35)hGLP-l(7-36)-NH2(SEQIDNO:2)合成方法，其 中： 所述步驟（a-2)中的側鏈保護的Fmoc-Arg-OH基團是 Fmoc-Arg(Pbf)-OH基團； 所述的側鏈保護的Fmoc-Arg樹脂是Fmoc-Arg(Pbf)-OH 和 Fmoc-Arg(Pbf)樹脂； 所述的側鏈保護的Arg樹脂是側鏈保護的Arg(Pbf)樹 脂； 所述的從結構式（Aib8’35)hGLP-l(7-35)-NH2 ( SEQ ID NO:9)的C端到N端的Fmoc胺基酸是Fmoc-Aib-OH、 Fmoc-Lys(Boc)-OH ' Fmoc-Val-OH ' Fmoc-Leu-OH ' Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala_OH、Fmoc-Ile-OH、 Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、 Fmoc-Ala-OH ' Fmoc-Ala-OH ' Fmoc-Gln(Trt)-OH ' Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、 Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc_Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)_OH、 Fmoc-Ser(tBu)_OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、 Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-CHu(OtBu)-OH、 Fmoc-Aib-OH 和 Fmoc-His(Trt)-OH ; 所述的侧鏈保護的 His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu -Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Ly s_Aib-Arg樹脂（SEQIDNO:3)是 201012829 His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tB u)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtB u)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Aib-Arg(Pbf)樹脂( SEQ ID NO: 10);且 所述的裂解混合物是選自下列群組：TFA/TIPS/水裂解 混合物、TFA/TIPS/二氣曱烷裂解混合物、TFA/苯酚/水/TIPS 裂解混合物、TFA/苯酚/水/甲基苯基硫醚/EDT裂解混合 ν 物、TFA/苯酚/水/甲基苯基硫醚/正十二烷基硫醇裂解混合 物、TFA/DTT/水/TIPS裂解混合物、TFA/苯酚裂解混合物、 TFA/苯酚/曱磺酸裂解混合物、TFA/甲基苯基硫醚/EDT/苯 甲醚裂解混合物、TFA/TES裂解混合物、TFA/水裂解混合 物、TFA/DCM/吲哚裂解混合物和TFA/TIPS裂解混合物》 19.如申請專利範圍第18項的（Aib8,35)hGLP-l(7-36)-NH2 0 ( SEQ ID NO:2 )合成方法，其中所述的能夠生成肽的樹脂 是選自下列群組：Fmoc-Rink醯胺-MBHA樹脂、Fmoc-Rink 酿胺-AM樹脂、基於PEG的Fmoc-Rink酿胺樹脂和Sieber酿 胺樹脂。 20.如申請專利範圍第19項的 (Aib8,35)hGLP-l(7-36)-NH2(SEQIDNO:2)合成方法，其 中： 所述的裂解混合物是選自下列群組：TFA/TIPS/水裂解 35- 201012829 混合物、TFA/TIPS/二氣甲烷裂解混合物和TFA/水裂解混合 物；且 所述的能夠生成肽醯胺的樹脂是選自下列群組： Fmoc-Rink醢胺-MBHA樹脂、Fmoc-Rink醯胺-AM樹脂和基 於PEG的Fmoc-Rink醯胺樹脂。 21. 如申請專利範圍第20項的 (Aib8,35)hGLP-l(7_36)-NH2(SEQIDNO:2)合成方法，其 中所述的能夠生成肽醯胺的樹脂是Fmoc-Rink醯胺-MBHA 樹脂。 22. 如申請專利範圍第21項的 (Aib8’35)hGLP-l(7_36)-NH2(SEQIDNO:2)合成方法，其 中步驟（c)包括以下步驟： (c-1)濾除樹脂，以生成（Aib8,35)hGLP-l(7-36)-NH2 (SEQ ID NO:2) /裂解混合物濾出液； (c-2)濃縮（Aib8’35)hGLP-l(7-36)-NH2 ( SEQ ID NO:2) /裂解混合物濾出液； (c-3)從濃縮的（Aib8,35)hGLP-l(7-36)-NH2 ( SEQ ID NO:2 ) /裂解混合物濾出液中沉澱出粗 (Aib8>35)hGLP-l(7-36)-NH2 ( SEQ ID NO:2)； (c-4) 在乙酸銨緩衝液中漿化此粗沉澱的 (Aib8’35)hGLP-l(7-36)-NH2 ( SEQ ID NO:2)，以進行 N-O 位 移逆轉； 201012829 ‘ • (c-5) 調節此漿料的pH值，以生成 (Aib8’35)hGLP-l(7-36)-NH2(SEQ lDNO:2)溶液；且 (c-6)分離並純化（Aib8,35)hGLP-l(7_36)-NH2 ( SEQ ID NO:2) 〇 23. 如申請專利範圍第22項的 (Aib8,35)hGLP-l(7-36)-NH2(SEQIDNO:2)合成方法，其 中所述步驟（c-4)中的N-0位移逆轉是透過將粗沉殺的 (Aib8’35)hGLP-l(7-36)-NH2 (SEQIDNO:2)置於微驗性媒 體中’然後將pH值調至3-3.7左右以完成。 24. 如申請專利範圍第23項的 (Aib8’35)hGLP-l(7-36)-NH2 (SEQlDNO:2)合成方法，其 中所述的從樹脂上去除Fmoc基困是採用於DMF中的吸咬 進行。 〇 25.如申請專利範圍第24項的 (Aib8’35)hGLP-l(7-36)-NH2(SEQID NO:2)合成方法其 中所述的於DMF中的呱啶濃度约為25% (v/v) 〇 26.如前述申請專利範圍第16至25項中任一項的 (Aib8’35)hGLP_l(7-36)-NH2(SEQIDN〇:2)合成方法其 中（八1158’35)1^1^-1(7-36)-：^112(5丑(）101^0:2)上的吐*、 ’艰基酸 殘基是採用選自下列群組的耗聯試劑組合進行耦聯. 201012829 TBTU/HOBt、TBTU/HBTU/DIEA、HATU/DIEA、 HCTU/DIEA、TBTU/HOBt/DIEA、DIC/HOBt、DIC/HOAt、 HATU/HOBt/DIEA和 HCTU/HOBt/DIEA。 27. 如申請專利範圍第26項的 (Aib8,35)hGLP-l(7-36)-NH2 ( SEQ ID NO:2)合成方法，其 中（Aib8’35)hGLP-l(7-36)-NH2 ( SEQ ID NO:2)上的胺基酸 殘基是採用耦聯試劑組合TBTU/HOBt或TBTU/HBTU/DIEA 進行耦聯。 28. 如申請專利範圍第27項的 (Aib8,35)hGLP-l(7-36)-NH2(SEQIDNO:2)合成方法，其 中（Aib8,35)hGLP_l(7-36)-NH2 ( SEQ ID NO:2)上的胺基酸 殘基是採用耦聯試劑組合TBTU/HOBt進行耦聯。 29. 如申請專利範圍第28項的 (Aib8,35)hGLP-l(7-36)-NH2(SEQIDNO:2)合成方法，其 中（Aib8,35)hGLP-l(7-36)_NH2 ( SEQ ID NO:2)上的胺基酸 殘基是採用於約5容積過量的約3.0個當量的Fmoc-胺基 酸、約2.94個當量的丁81'1；、約2.94個當量的11081和約4.5 個當量的DIEA進行耦聯。 201012829 <» 四、指定代表圖： (一) 本案指定代表圖為：第（ ）圖。 (二) 本代表圖之元件符號簡單說明： [無] 五、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式：
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