CN104777247B - 确定中药中具有心肌保护和抗炎作用的活性成分的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明实施例公开了一种在治疗缺血性心脏病的中药中具有心肌保护作用和抗炎作用的活性成分的确定方法，包括以下步骤：(1)通过制备液相色谱获得目标中药各分离组分；(2)通过心肌细胞抗氧化模型实验确定具有心肌保护作用的活性成分；(3)通过巨噬细胞抗炎模型实验确定具有抗炎作用的活性成分。根据所确定出的具有心肌保护作用和抗炎作用的中药活性成分，可以容易地确定中药活性成分的含量，进而可以实现对目标中药的质量控制，保证对目标中药的临床疗效。

Description

确定中药中具有心肌保护和抗炎作用的活性成分的方法
技术领域
本发明涉及中药领域，特别涉及确定中药中具有心肌保护和抗炎作用的活性成分的方法。
背景技术
心血管疾病已经成为当今社会中致死率最高的疾病之一，并且发病率逐年增加。心血管疾病的种类很多，其中，发病率较高的一类是缺血性心脏病。这种缺血性心脏病包括粥样硬化病变引致的冠状动脉梗阻或狭窄。心肌缺血引致的左心室室壁瘤，心肌栓塞后心室间隔缺损和乳头肌缺血引起的二尖瓣关闭不全，是中老年常见多发的后天性心脏病。
研究表明，这种缺血性心脏病主要是由于长时间缺血导致心肌细胞缺氧引起心肌组织损伤和坏死，受损的心肌细胞炎性因子过度表达，其中白介素1β(1L-1β)可刺激细胞产生应激性氧分子，使心肌细胞膜通透性增加，产生脂质过氧化物使得三磷酸腺苷合成受阻，从而直接损害心脏的电生理功能和泵血功能，最终使心肌细胞变性，坏死。
中药对上述缺血性心脏病一般有较好的疗效，例如通脉养心丸等。这些治疗缺血性心脏病的中药都具有心肌保护和抗炎作用。但是，由于中药化学成分复杂，现在还不清楚各中药中具体哪些化学成分是具有心肌保护和抗炎作用的活性成分，无法测定这些活性成分的含量，这样不利于对中药进行质量控制，也影响中药的临床疗效。因此，如何能建立中药中具有心肌保护和抗炎作用的活性成分的确定方法，就显得格外重要。
发明内容
为解决上述问题，本发明实施例公开了确定中药中具有心肌保护和抗炎作用的活性成分的方法。
确定中药中具有心肌保护和抗炎作用的活性成分的方法，包括以下步骤：
(1)通过制备液相色谱获得目标中药各分离组分；
(2)通过心肌细胞抗氧化模型实验确定具有心肌保护作用的活性成分，所述心肌细胞抗氧化模型实验包括：
(A)将目标中药各分离组分针对目标心肌细胞分别进行细胞毒评价，确定无显著细胞毒的目标中药各分离组分的浓度；
(B)将目标心肌细胞分别用已确定无显著细胞毒的浓度的目标中药各分离组分进行保护，然后用指定氧化剂分别对已进行保护的目标心肌细胞进行损伤，并确定损伤后的目标心肌细胞的剩余数量，并根据所述剩余数量确定目标中药各分离组分对目标心肌细胞的相对保护率；
(C)将对目标心肌细胞相对保护率达到最低有效率的目标中药分离组分经LC-MS分析，确定出相对保护率达到最低有效率的各分离组分中所包含的化学成分；
用所确定的化学成分分别代替(B)部分的目标中药各分离组分，重复执行的(B)部分的操作，确定各化学成分的相对保护率，并将相对保护率达到最低有效率的化学成分确定为具有心肌保护作用的活性成分；
(3)通过巨噬细胞抗炎模型实验确定具有抗炎作用的活性成分，其中所述巨噬细胞抗炎模型实验包括：
(a)将目标中药各分离组分针对目标巨噬细胞分别进行细胞毒评价，确定无显著细胞毒的目标中药各分离组分的浓度；
(b)将目标巨噬细胞分组培养，每组的培养液中加入一种已确定无显著细胞毒的浓度的目标中药各分离组分及指定炎症诱导剂，培养结束后，确定各培养液上清液中的NO的含量，并根据所述NO的含量确定目标中药各分离组分对目标巨噬细胞的NO相对抑制率；
(c)将对目标巨噬细胞的NO相对抑制率达到抗炎有效率的目标中药分离组分经LC-MS分析，确定出NO相对抑制率达到抗炎有效率的各分离组分中所包含的化学成分；
用所确定的化学成分分别代替(b)部分的目标中药各分离组分，重复执行(b)部分的操作，将NO相对抑制率的半数抑制浓度在指定值以下的化学成分确定为具抗炎作用的活性成分。
其中，步骤(1)包括：获得目标中药的中药提取液，然后使所述中药提取液通过反相色谱柱；再对反相色谱柱进行洗脱，将洗脱液通过制备液相色谱进行分离，收集目标中药各分离组分。
其中，所述获得目标中药的中药提取液，包括：
将目标中药与甲醇水溶液混合后，进行提取、过滤，得到中药提取液；
所述反相色谱柱具体为：十八烷基硅烷键合硅胶为填料的中压反相色谱柱。
其中，所述(A)将目标中药各分离组分针对目标心肌细胞分别进行细胞毒评价，确定无显著细胞毒的目标中药各分离组分的浓度，具体为：
将H9c2心肌细胞在不加任何药物、分别加入第一指定浓度的目标中药各分离组分的情况下，在相同的条件下进行培养；培养结束后，确定不加任何药物及分别加入第一指定浓度的目标中药各分离组分的H9c2心肌细胞的数量；并以不加任何药物的H9c2心肌细胞的数量为标准，分别计算加入第一指定浓度的目标中药各分离组分后H9c2心肌细胞存活率；如果存活率在85％以上，则确定所述第一指定浓度为无显著细胞毒的该目标中药分离组分的浓度。
其中，所述(B)将目标心肌细胞用已确定无显著细胞毒的浓度的目标中药各分离组分分别对目标心肌细胞进行保护，然后用指定氧化剂其进行损伤，并确定损伤后的目标心肌细胞的剩余数量，并根据所述剩余数量确定目标中药各分离组分对目标心肌细胞的相对保护率，具体为：
将H9c2心肌细胞分成对照1组、实验1组及模型1组在相同的条件下进行培养；其中，实验1组加入在(A)部分已确定浓度的目标中药各分离组分进行预保护；对照1组及模型1组不加任何药物；培养结束后，将实验1组及模型1组分别加入指定氧化剂进行H9c2心肌细胞损伤；损伤后，通过酶标仪在第一预设波长下分别测定对照1组吸光度值DO对照1、实验1组吸光度值DO实验1及模型1组吸光度值DO模型1；通过计算分别得到实验1组的相对保护率S实验1，
其中，实验1组的相对保护率S实验的计算公式为：
S实验1％＝(DO实验1-DO模型1)/(DO对照1-DO模型1)×100％。
其中，所述(a)将目标中药各分离组分针对目标巨噬细胞分别进行细胞毒评价，确定无显著细胞毒的目标中药各分离组分的浓度，具体为：
将小鼠巨噬细胞RAW264.7在不加任何药物、分别加入第二指定浓度目标中药各分离组分的情况下，在相同的条件下进行培养；培养结束后，确定不加任何药物、及分别加入第二指定浓度目标中药各分离组分的小鼠巨噬细胞RAW264.7的数量；并以不加任何药物的小鼠巨噬细胞RAW264.7的数量为标准，分别计算加入第二指定浓度目标中药各分离组分后的小鼠巨噬细胞RAW264.7存活率；如果存活率在85％以上，则确定所述第二指定浓度为为无显著细胞毒的该目标中药分离组分的浓度。
其中，所述(b)将目标巨噬细胞分组培养，每组的培养液中加入一种已确定无显著细胞毒的浓度的目标中药各分离组分及指定炎症诱导剂，培养结束后，确定各培养液上清液中的NO的含量，并根据所述NO的含量确定目标中药各分离组分对目标巨噬细胞的NO相对抑制率，具体为：
将相同数量的小鼠巨噬细胞RAW264.7分成对照2组、实验2组及模型2组在相同的条件下进行培养；其中，实验2组加入在(a)部分已确定浓度的目标中药各分离组分及脂多糖；对照2组不加入任何物质，模型2组只加入脂多糖；培养结束后，取对照2组、实验2组及模型2组培养液中的上层清液；采用Griess法，通过酶标仪在第二预设波长下分别测定对照2组吸光度值DO对照2、实验2组吸光度值DO实验2及模型2组吸光度值DO模型2；通过计算分别得到实验2组的相对NO抑制率D实验2，
其中，实验2组的相对NO抑制率D实验2的计算公式为：
D实验2％＝(DO模型2-DO实验2)/(DO模型2-DO对照2)×100％。
其中，所述目标中药为通脉养心丸。
本发明通过将目标中药中的化学组分进行初步分离得到目标中药各分离组分，然后再分别进行确定具有心肌保护作用的活性成分的实验及确定具有抗炎作用的活性成分的实验，从而确定目标中药中所含有的具有心肌保护作用和抗炎作用的中药活性成分。根据所确定出的具有心肌保护作用和抗炎作用的中药活性成分，可以容易的确定中药活性成分的含量，进而可以实现对目标中药的质量控制，保证对目标中药的临床疗效。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为通脉养心丸18种分离组分对H9c2心肌细胞的细胞毒评价结果；
图2为通脉养心丸18种分离组分的相对保护率；
图3为通脉养心丸中TM13、TM14、TM15、TM16、TM17对H9c2心肌细胞保护活性量效关系图；其中，图3a为TM13的保护活性量效关系图，图3b为TM14的保护活性量效关系图，图3c为TM15的保护活性量效关系图，图3d为TM16的保护活性量效关系图，图3e为TM17的保护活性量效关系图；
图4为通脉养心丸中TM13、TM14、TM15、TM16、TM17的LC-MS分析谱图，其中，图4a为TM13的LC-MS图，图4b为TM14的LC-MS图，图4c为TM15的LC-MS图，图4d为TM16的LC-MS图，图4e为TM17的LC-MS图；
图5为通脉养心丸18种分离组分对小鼠巨噬细胞RAW264.7的细胞毒评价结果；
图6为通脉养心丸18种分离组分的相对NO抑制率；
图7为通脉养心丸中TM7、TM11、TM13、TM14、TM18抗炎活性量效关系图，其中，图7a为TM7的抗炎活性量效关系图，图7b为TM11的抗炎活性量效关系图，图7c为TM13的抗炎活性量效关系图，图7d为TM14的抗炎活性量效关系图，图7e为TM18的抗炎活性量效关系图；
图8为通脉养心丸中TM7和TM11的LC-MS分析谱图，其中，图8a为TM7的LC-MS图，图8b为TM11的LC-MS图；
图9为甘草酸、五味子醇甲、戈米辛D、芒柄花素、芹糖异甘草苷、异麦角甾苷、甘草苷的量效关系图，其中，图9a为甘草酸的量效关系图，图9b为五味子醇甲的量效关系图，图9c为芒柄花素的量效关系图，图9d为戈米辛D的量效关系图，图9e为芹糖异甘草苷的量效关系图，图9f为异麦角甾苷的量效关系图，图9g为甘草苷的量效关系图。
具体实施方式
中药对缺血性心脏病一般有较好的疗效，现代医学表明，这些治疗缺血性心脏病的中药都具有心肌保护和抗炎作用。但是，现在还没有任何技术能够确定这些治疗缺血性心脏病的中药中，具有心肌保护作用和抗炎作用的活性成分。这样既不利于对这些中药进行更深入的研究，也不利于对这些中药进行质量控制。
因此，本发明提供了一种确定中药中具有心肌保护和抗炎作用的活性成分的方法，用于确定中药中具体哪些活性成分具有心肌保护作用和抗炎作用，该方法科学有效，结果可靠。
需要说明的是，本发明的技术方案对中药的剂型是没有限制的，例如，丸、散、膏、丹都等剂型都是可以实现本发明的技术方案。
具体的，要实现本发明的技术方案，首先要通过制备液相色谱获得目标中药各分离组分。
本步骤的具体实施方案可以由本领域技术人员根据目标中药的具体制剂形式及中药中各组分的特点，采用现有技术的相关技术方案来实现。本发明在此不作具体限定。在一些实施方式中，该步骤可以包括：获得目标中药的中药提取液，然后使所述中药提取液通过反相色谱柱；再对反相色谱柱进行洗脱，将洗脱液通过制备液相色谱进行分离，收集目标中药各分离组分。在一些实施方式中，获得目标中药的中药提取液，可以包括：将目标中药与甲醇水溶液混合后，进行提取、过滤，得到中药提取液；反相色谱柱具体可以为：十八烷基硅烷键合硅胶为填料的中压反相色谱柱。制备液相色谱的具体色谱条件由本领域技术人员根据实际情况进行确定，本发明在此不作具体限定。
为了能够分别确定目标中药各分离组分中具有心肌保护作用和抗炎作用的活性成分，发明人设计了心肌细胞抗氧化模型实验和巨噬细胞抗炎模型实验，并通过这两个实验来分别确定具有心肌保护作用和抗炎作用的活性成分。
在一个具体的实施方案中，心肌细胞抗氧化模型实验包括：
(A)将目标中药各分离组分针对目标心肌细胞分别进行细胞毒评价，确定无显著细胞毒的目标中药各分离组分的浓度；
(B)将目标心肌细胞分别用已确定无显著细胞毒的浓度的目标中药各分离组分进行保护，然后用指定氧化剂分别对已进行保护的目标心肌细胞进行损伤，并确定损伤后的目标心肌细胞的剩余数量，并根据所述剩余数量确定目标中药各分离组分对目标心肌细胞的相对保护率；
(C)将对目标心肌细胞相对保护率达到最低有效率的目标中药分离组分经LC-MS分析，确定出相对保护率达到最低有效率的各分离组分中所包含的化学成分；
用所确定的化学成分分别代替(B)部分的目标中药各分离组分，重复执行的(B)部分的操作，确定各化学成分的相对保护率，并将相对保护率达到最低有效率的化学成分确定为具有心肌保护作用的活性成分。
这里所说的最低有效率可以由本领域技术人员根据以往的研究经验进行设定，一般设定为50％左右。最低有效率的具体值不应构成对本发明技术方案的限定。
由于该模型实验主要是用于确定对心肌具有保护作用的活性成分，因此采用了心肌细胞进行实验，这样所得到的实验结果会更准确。实验中所用到的目标心肌细胞，可以采用本领域常用的心肌细胞即可，其具体形式本发明不作具体限定，例如，可以采用H9c2心肌细胞。
需要说明的是，在一些实施方式中，可以将一种已确定具有心肌保护作用的化学成分作为阳性药，与目标中药的各的各分离组分同时进行心肌细胞抗氧化模型实验，这样可以将目标中药各分离组分的实验结果直接与阳性药的实验结果进行比较，可以更直接、更容易的确定目标中药各分离组分的心肌保护作用的效果大小。阳性药的具体形式本发明在此不作具体限定，只要是已证实确有心肌保护作用的化学成分即可，例如可以选择槲皮素作为本实验的阳性药。阳性药的心肌细胞抗氧化模型实验参考目标中药各分离组分即可，本发明在此不作赘述。
在一些实施方式中，(A)将目标中药各分离组分针对目标心肌细胞分别进行细胞毒评价，确定无显著细胞毒的目标中药各分离组分的浓度，具体可以为：
将H9c2心肌细胞在不加任何药物、分别加入第一指定浓度的目标中药各分离组分的情况下，在相同的条件下进行培养。培养结束后，确定不加任何药物及分别加入第一指定浓度的目标中药各分离组分的H9c2心肌细胞的数量n分离1；并以不加任何药物的H9c2心肌细胞的数量n对照1为标准，分别计算加入第一指定浓度的目标中药各分离组分后H9c2心肌细胞存活率K分离1；如果存活率K分离1在85％以上，则确定所述第一指定浓度为无显著细胞毒的该目标中药分离组分的浓度。其中，目标中药各分离组分的心肌细胞存活率K分离1的计算公式可以为：
K分离1％＝(n分离1/n对照1)×100％。
在用阳性药进行实验时，通过公式
K阳性1％＝(n阳性1/n对照1)×100％
来确定阳性药心肌细胞存活率K阳性1。
在一些实施方式中，(B)将目标心肌细胞用已确定无显著细胞毒的浓度的目标中药各分离组分分别对目标心肌细胞进行保护，然后用指定氧化剂其进行损伤，并确定损伤后的目标心肌细胞的剩余数量，并根据所述剩余数量确定目标中药各分离组分对目标心肌细胞的相对保护率，具体为：
将H9c2心肌细胞分成对照1组、实验1组及模型1组在相同的条件下进行培养；其中，实验1组加入在(A)部分已确定浓度的目标中药各分离组分进行预保护；对照1组及模型1组不加任何药物；培养结束后，将实验1组及模型1组分别加入指定氧化剂进行H9c2心肌细胞损伤；损伤后，通过酶标仪在第一预设波长下分别测定对照1组吸光度值DO对照1、实验1组吸光度值DO实验1及模型1组吸光度值DO模型1；通过计算分别得到实验1组的相对保护率S实验1，
其中，实验1组的相对保护率S实验的计算公式为：
S实验1％＝(DO实验1-DO模型1)/(DO对照1-DO模型1)×100％。
如前所述，在用阳性药进行实验时，可以增设阳性药1组，并与目标中药各分离组分进行相同的实验，最后得到阳性药1组吸光度值DO阳性1，并通过公式
S阳性1％＝(DO阳性1-DO模型1)/(DO对照1-DO模型1)×100％
阳性药1组的相对保护率S阳性1。
巨噬细胞抗炎模型实验包括：
(a)将目标中药各分离组分针对目标巨噬细胞分别进行细胞毒评价，确定无显著细胞毒的目标中药各分离组分的浓度；
(b)将目标巨噬细胞分组培养，每组的培养液中加入一种已确定无显著细胞毒的浓度的目标中药各分离组分及指定炎症诱导剂，培养结束后，确定各培养液上清液中的NO的含量，并根据所述NO的含量确定目标中药各分离组分对目标巨噬细胞的NO相对抑制率；
(c)将对目标巨噬细胞的NO相对抑制率达到抗炎有效率的目标中药分离组分经LC-MS分析，确定出NO相对抑制率达到抗炎有效率的各分离组分中所包含的化学成分；
用所确定的化学成分分别代替(b)部分的目标中药各分离组分，重复执行(b)部分的操作，将NO相对抑制率的半数抑制浓度在指定值以下的化学成分确定为具抗炎作用的活性成分。
由于该模型实验主要是用于确定具有抗炎作用的活性成分，因此采用了巨噬细胞进行实验，这样所得到的实验结果会更准确一些。实验中所用到的目标巨噬细胞，可以采用本领域常用的巨噬细胞即可，其具体形式本发明不作具体限定，例如，可以采用小鼠巨噬细胞RAW264.7。
这里所说的抗炎有效率可以由本领域技术人员根据以往的研究经验进行设定，一般设定为50％左右的相对NO抑制率，在设置有阳性要对照组的情况下，也可以采用阳性药的相对NO抑制率。抗炎有效率的具体值不应构成对本发明技术方案的限定。
需要说明的是，在一些实施方式中，可以将一种已确定具有抗炎作用的化学成分作为阳性药，同时进行巨噬细胞抗炎模型实验，这样可以将目标中药各分离组分的实验结果直接与阳性药的实验结果进行比较，可以更直接、更容易的确定目标中药各分离组分的抗炎作用的效果大小。阳性药的具体形式本发明在此不作具体限定，只要是已证实确有抗炎作用的化学成分即可，例如可以选择吲哚美辛作为本实验的阳性药。阳性药的巨噬细胞抗炎模型实验参考目标中药各分离组分即可，本发明在此不作赘述。
在一些实施方式中，(a)将目标中药各分离组分针对目标巨噬细胞分别进行细胞毒评价，确定无显著细胞毒的目标中药各分离组分的浓度，具体可以为：
将小鼠巨噬细胞RAW264.7在不加任何药物、分别加入第二指定浓度目标中药各分离组分的情况下，在相同的条件下进行培养；培养结束后，确定不加任何药物、及分别加入第二指定浓度目标中药各分离组分的小鼠巨噬细胞RAW264.7的数量n分离2；并以不加任何药物的小鼠巨噬细胞RAW264.7的数量n对照2为标准，分别计算加入第二指定浓度目标中药各分离组分后的小鼠巨噬细胞RAW264.7存活率K分离2；如果存活率K分离2在85％以上，则确定所述第二指定浓度为为无显著细胞毒的该目标中药分离组分的浓度。
其中，目标中药各分离组分的心肌细胞存活率K分离2的计算公式可以为：
K分离2％＝(n分离2/n对照2)×100％。
在用阳性药进行实验时，通过实验确定一系列不同浓度的阳性药的RAW264.7细胞的数量n阳性2，并通过公式
K阳性2％＝(n阳性2/n对照2)×100％
来确定阳性药RAW264.7细胞存活率K阳性2。
在一些实施方式中，(b)将目标巨噬细胞分组培养，每组的培养液中加入一种已确定无显著细胞毒的浓度的目标中药各分离组分及指定炎症诱导剂，培养结束后，确定各培养液上清液中的NO的含量，并根据所述NO的含量确定目标中药各分离组分对目标巨噬细胞的NO相对抑制率，具体可以为：
将相同数量的小鼠巨噬细胞RAW264.7分成对照2组、实验2组及模型2组在相同的条件下进行培养；其中，实验2组加入在(a)部分已确定浓度的目标中药各分离组分及脂多糖；对照2组不加入任何物质，模型2组只加入脂多糖；培养结束后，取对照2组、实验2组及模型2组培养液中的上层清液；采用Griess法，通过酶标仪在第二预设波长下分别测定对照2组吸光度值DO对照2、实验2组吸光度值DO实验2及模型2组吸光度值DO模型2；通过计算分别得到实验2组的相对NO抑制率D实验2，
其中，实验2组的相对NO抑制率D实验2的计算公式为：
D实验2％＝(DO模型2-DO实验2)/(DO模型2-DO对照2)×100％。
如前所述，在用阳性药进行实验时，可以增设阳性药2组，并与目标中药各分离组分进行相同的实验，最后得到阳性药2组吸光度值DO阳性2，并通过公式
D阳性2％＝(DO阳性2-DO模型2)/(DO对照2-DO模型2)×100％
阳性药2组的相对NO抑制率D阳性2。
下面将以通脉氧心丸为例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
首先，对实施例中所需的仪器与试剂进行说明。
仪器：二氧化碳细胞培养箱(美国Thermo)；超净工作台(美国Thermo)；Anke LXJ-IIB低速大容量多管离心机(上海安亭科学仪器厂)；CKX41倒置相差荧光显微镜(日本OLYMPUS)；细胞自动计数仪(美国invitrogen)；Eppendorf恒温混匀器(Thermo mixer comfort)；Infinite 200多功能酶标仪(瑞士TECAN)；Bio-Tek酶标仪(ELX800)；Agilent 1100型制备液相色谱仪(Agilent公司)；Finnigan LCQ Deca XPplus离子肼质谱仪(Thermo Finnigan公司，美国)；TripleTOFTM 5600+高分辨质谱仪(AB Scienx公司，美国)；Milli-Q超纯水系统(Millipore公司，美国)。
试剂：高糖DMEM基础培养基、胎牛血清(FBS)、胰酶-EDTA、抗生素(青霉素/链霉素)均购自Gibco公司；二甲基亚砜(DMSO)、溴化-3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基四氮唑(MTT)、LPS(细菌脂多糖)均购自Sigma公司；槲皮素、甘草酸、戈米辛D、五味子醇甲、芒柄花素、甘草苷、芹糖异甘草苷、异麦角甾苷购自上海融禾医药科技有限公司；双氧水购自阿法埃莎(天津)化学有限公司；一氧化氮检测试剂盒(碧云天)；甲酸为色谱纯(Roe Scientific Inc.)；乙腈为色谱纯(Merck公司)。
通脉养心丸，天津中新药业乐仁堂制药厂生产，批号：A107626
实施例一确定通脉养心丸中具有心肌保护作用和抗炎作用的中药活性成分
(1)化学组分的初步分离
将目标中药，即通脉养心丸的丸剂置于研钵中研碎，10倍量甲醇超声提取50分钟后倾出提取液，同法超声提取两次。对两次提取液进行抽滤，将滤液通过以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的中压反相色谱柱(ODS中压柱)。先以纯水洗涤，洗涤液弃去；再用甲醇进行洗脱，将洗脱液通过制备液相色谱进行分离，收集目标中药各分离组分；色谱柱型号：SN USA GH01324，流动相为0.1％甲酸-水(A)、乙腈(B)，流速为10mL/分钟，柱温为室温，检测波长为210nm、230nm、250nm、254nm、280nm。洗脱梯度如下：0分钟A:B＝95:5；60分钟A:B＝10:90；72分钟A:B＝5:95；82分钟A:B＝5:95。除去量太少的几个组分之外，共获得18个分离组分，根据流出先后顺序依次编号为TM01-TM18。
需要说明的是，在本步骤中，所描述的具体实验参数，例如甲醇的体积分数，甲醇的用量、制备液相色谱条件等，都是适用于通脉养心丸的，当采用本发明的技术方案来实现其它目标中药的化学组分的初步分离时，具体的实验参数可以由本领域技术人员来进行确定，例如可以采用积分数为0～100％的甲醇水溶液，中压为5～20bar。制备液相色谱条件可以为：流速为8～12mL/分钟，柱温为20～30℃，A相为0.01～1％甲酸-水等。
(2)确定具有心肌保护作用的活性成分
A首先要确定通脉养心丸的18个分离组分对H9c2心肌细胞的细胞毒评价
具体为：以槲皮素(Quercetin，在附图中简称为Q)为阳性药1，分别考察其浓度为60μmol/L、40μmol/L和20μmol/L的细胞毒，以及通脉养心丸各分离组分浓度为50μg/ml的细胞毒。
分别将相同数量的H9c2心肌细胞在不加任何药物、加入指定阳性药1或加入所得到的18个分离组分的情况下，在相同的条件下进行培养；培养结束后，确定不加任何药物的H9c2心肌细胞的数量n对照1、加入指定阳性药1的H9c2心肌细胞的数量n阳性1、加入18个分离组分的H9c2心肌细胞的数量n分离1；并以不加任何药物的H9c2心肌细胞的数量为标准，分别计算加入指定阳性药1、目标中药各分离组分后H9c2心肌细胞存活率；以不加任何药物的对照组(CON)心肌细胞的数量为标准分别计算加入指定阳性药1后H9c2心肌细胞存活率K阳 性1、分别加入18个分离组分后H9c2心肌细胞存活率K分离1；以存活率85％以上认定无显著细胞毒。
其中，K阳性1％＝(n阳性1/n对照1)×100％；
K分离1％＝(n分离1/n对照1)×100％；
结果见图1，表明除了TM15有一定细胞毒外，其余组分在50μg/ml浓度下无显著细胞毒性。因此在后续实验中除了分离组分TM15降为20μg/ml外，其他分离组分仍为50μg/ml。
B筛选通脉养心丸的18个分离组分中具有心肌细胞保护作用的分离组分
细胞：H9c2心肌细胞
实验仪器、试剂：噻唑蓝(MTT)，DMEM高糖培养基，胎牛血清，双抗，DMSO、CO2培养箱，倒置显微镜，超净工作台，平板振荡仪
H9c2心肌细胞计数，分成对照1组、实验1组、阳性药1组及模型1组培养于96孔板平底培养板。培养24小时后，实验1组以通脉养心丸的18个分离组分预保护，阳性药1组以槲皮素预保护，对照1组及模型1组不加任何药物，再将4个组置于CO2细胞培养箱中培养24小时。除对照组外，实验1组、阳性药1组及模型1组分别加620μmol/L双氧水损伤，每孔100μL，损伤3小时。损伤完毕后对照组，实验1组、阳性药1组及模型1组每孔加0.5mg/ml的MTT100μL。孵育4小时后，弃去MTT溶液，每孔加100μL DMSO，于恒温混匀器内混匀10分钟，采用MTT法测定细胞存活率，即酶标仪在550nm下测定对照1组吸光度值DO对照1、实验1组吸光度值DO实验1、阳性药1组吸光度值DO阳性 1及模型1组吸光度值DO模型1。每个样品设3复孔，重复3次实验，趋势一致情况下计算阳性药1和18个分离组分对H9c2心肌细胞的相对保护率，相对保护率可以表示H9c2心肌细胞的抗氧化损伤活性。
其中，实验1组的相对保护率S实验的计算公式为：
S实验1％＝(DO实验1-DO模型1)/(DO对照1-DO模型1)×100％；
阳性药1组的相对保护率S阳性1的计算公式为：
S阳性1％＝(DO阳性1-DO模型1)/(DO对照1-DO模型1)×100％；
根据阳性药活性和以往研究经验，可以设定最低有效率为50％的相对保护率。当然，本领域技术人员也可以根据实际情况设定其它值作为最低有效率。结果见图2，表明在50μg/ml浓度下，TM13(保护率为65.04％)、TM14(保护率为54.48％)、TM16(保护率为74.99％)、TM17(保护率为107.07％)，TM15在浓度为20μg/mL(保护率为68.78％)，与模型组细胞存活率均有显著性差异(P<0.05)，有一定的心肌细胞保护活性。尤其是TM17的分离组分，其保护率超过100％，显示其在抗氧化过程中不仅具有较强的抗氧化活性，还具有一定的促进细胞增殖的活性。
通脉养心丸中具有心肌细胞保护作用的分离组分的量效关系研究
对通脉养心丸组分中相对细胞保护率在50％以上的分离组分(TM13、TM14、TM15、TM16、TM17)进行心肌细胞保护活性量效关系研究，方法与步骤(2)B部分中的实验方案相同，每个样品设3复孔，重复3次实验，趋势一致情况下研究各分离组分对H9c2心肌细胞保护活性量效关系。实验结果见图3，结果表明，TM13、TM14、TM16、TM17在50μmol/L～1.5μmol/L，TM15在20μmol/L～0.625μmol/L呈现较好的量效关系。
C将实验1组中相对保护率达到50％的分离组分(TM13、TM14、TM15、TM16、TM17)经LC-MS分析，确定出相对保护率达到50％的各分离组分中所包含的化学成分；结果分别如图4所示，其中，图4a为TM13的LC-MS图，图4b为TM14的LC-MS图，图4c为TM15的LC-MS图，图4d为TM16的LC-MS图，图4e为TM17的LC-MS图；从各图中可以看出，TM13中的主要成分为甘草酸、五味子醇甲、甘草香豆素，戈米辛D、甘草异黄酮，等；TM14中的主要成分为甘草酸、甘草香豆素、乌拉尔甘草皂苷B、大黄素、当归酰戈米辛H、当归酰戈米辛Q，等；TM15中的主要成分为甘草酸、甘草香豆素、新甘草酚、当归酰戈米辛Q等；TM16中的主要成分为甘草酸、甘草香豆素、当归酰戈米辛P、Glyasperin A(粗毛甘草素A)等；TM17中的主要成分为甘草酸、甘草香豆素、甘草利酮、甘草宁L，等。
将上面所确定的化学成分分别代替步骤(2)中B部分的脉养心丸的18个分离组分，重复执行步骤(2)中的B部分，确定各化学组分的相对保护率，并将相对保护率达到50％的化学成分确定为具有心肌保护作用的活性成分，经验证实验发现的各活性成分在50μM浓度下的心肌细胞保护率如表1所示。
表1具有心肌细胞保护活性的化合物及其保护率
可见，通脉养心丸中所包含的甘草酸、甘草香豆素、甘草异黄酮、乌拉尔甘草皂苷B及当归酰戈米辛H具有较好的心肌保护作用。
(3)确定具有抗炎作用的活性成分
A首先要确定通脉养心丸的18个分离组分对小鼠巨噬细胞RAW264.7(简称RAW264.7细胞)的细胞毒评价
具体为：以吲哚美辛(Indometacin，在附图中简称为Indo)阳性药2，考察浓其度为50μmol/L时的细胞毒，以及通脉养心丸各分离组分浓度为50μg/ml的细胞毒。
分别将相同数量的RAW264.7细胞在不加任何药物、加入指定阳性药2或加入所得到的18个分离组分的情况下，在相同的条件下进行培养；培养结束后，确定不加任何药物的RAW264.7细胞的数量n对照2、加入指定阳性药2的RAW264.7细胞的数量n阳性2、加入18个分离组分的RAW264.7细胞的数量n分 离2；并以不加任何药物的RAW264.7细胞的数量为标准，分别计算加入指定阳性药2、18个分离组分的RAW264.7细胞存活率；以不加任何药物的对照组(Control)RAW264.7细胞的数量为标准分别计算加入指定阳性药2后RAW264.7细胞存活率K阳性2、分别加入18个分离组分后RAW264.7细胞存活率K分离2；以存活率85％以上认定无显著细胞毒。
其中，K阳性2％＝(n阳性2/n对照2)×100％；
K分离2％＝(n分离2/n对照2)×100％；
结果见图5，表明除了TM15有一定细胞毒外，其余组分在50μg/ml浓度下无显著细胞毒性。因此在后续实验中除了组分15降为20μg/ml外，其他组分仍为50μg/ml。
B筛选通脉养心丸的18个分离组分中具有抗炎作用的分离组分
细胞：小鼠巨噬细胞RAW264.7
实验仪器、试剂：脂多糖(LPS)，DMEM高糖培养基，灭活胎牛血清，双抗，DMSO，一氧化氮检测试剂盒，CO2培养箱，倒置显微镜，超净工作台，平板振荡仪，Bio-Tek酶标仪(ELX800)
于96孔板中接种RAW264.7细胞，接种密度3×105细胞/ml，100μLl/孔。细胞接种完成后在CO2细胞培养箱中培养24小时，培养结束后，将培养的RAW264.7细胞分成对照2组、实验2组、阳性药2组及模型2组，并将实验2组、阳性药2组及模型2组加入含200ng/mLl LPS的高糖DMEM培养液(150μLl每孔，加药过程避光)，同时将实验2组分别加入通脉养心丸的18个分离组分，阳性药2组加入吲哚美辛，然后将对照2组、实验2组、阳性药2组及模型2组再孵育24小时。然后取各组细胞上清液，采用Griess法，通过酶标仪在550nm波长下分别测定对照2组吸光度值DO对照2、实验2组吸光度值DO实验2、阳性药2组吸光度值DO阳性2及模型2组吸光度值DO模型2；每个样品设3复孔，重复3次实验，趋势一致情况下通过计算分别得到实验2组的相对NO抑制率D实验2及阳性药2组的相对NO抑制率D阳性2。以表示抗炎活性的大小。
其中，实验2组的相对NO抑制率D实验2的计算公式为：
D实验2％＝(DO模型2-DO实验2)/(DO模型2-DO对照2)×100％；
阳性药2组的相对NO抑制率D阳性2的计算公式为：
D阳性2％＝(DO模型2-DO阳性2)/(DO模型2-DO对照2)×100％；
设定抗炎有效率为阳性药2吲哚美辛的相对NO抑制率；结果见图6(以相对NO抑制率为纵坐标，反应抗炎活性的高低)。结果显示基本上所有组分都显示出一定的抗炎活性。尤其是TM7、TM11、TM13、TM14、TM18，抗炎活性高于阳性药吲哚美辛，表明这几个组分具有较好的抗炎活性。
通脉养心丸中具有抗炎作用的分离组分的量效关系研究
对通脉养心丸组分中相对NO抑制率高于阳性药2吲哚美辛的分离组分(TM7、TM11、TM13、TM14、TM18)进行抗炎活性量效关系研究。方法与步骤(3)B部分中的实验方案相同，每个样品设3复孔，重复3次实验，趋势一致情况下研究各分离组分对RAW264.7细胞保护活性量效关系。实验结果见图7，TM7、TM11、TM13、TM14、TM18在一定浓度范围内呈现较好的量效关系。
C将实验2组中相对NO抑制率高于阳性药2吲哚美辛的分离组分(TM7、TM11、TM13、TM14)经LC-MS分析，确定出相对NO抑制率高于阳性药2吲哚美辛的各分离组分中所包含的化学成分；其中，TM13、TM14的结果可以参考图4a及图4b；其余结果如图8所示，其中，图8a为TM7的LC-MS图，图8b为TM11的LC-MS图。从各图中可以看出，TM7中的主要成分为异麦角甾苷、芹糖异甘草苷、甘草苷、芹糖甘草苷、何首乌苷、芒柄花苷，等；TM11中的主要成分为甘草酸、芒柄花素，麦冬皂苷D，等；TM13中的主要成分为甘草酸、五味子醇甲、甘草香豆素，戈米辛D、甘草异黄酮，等；TM14中的主要成分为甘草酸、甘草香豆素、乌拉尔甘草皂苷B、大黄素、当归酰戈米辛H、当归酰戈米辛Q，等；将上面所确定的化学成分分别代替步骤(3)中B部分的脉养心丸的18个分离组分，重复执行步骤(3)中的B部分，确定各化学成分的相对NO抑制率，并将相对NO抑制率的半数抑制浓度在200μM以下的化学成分确定为具有抗炎作用的活性成分，经验证实验发现的具有抗炎活性的各活性成分的半数抑制剂浓度(IC50)如表3所示。需要说明的是，本领域通常认定半数抑制浓度的指定值设定为200μM左右，即半数抑制浓度在200μM左右或更低时，说明具有抗炎作用。
表2具有抗炎活性的化合物及其IC50
实验结果见图9，结果表明甘草酸、五味子醇甲、戈米辛D、芒柄花素、何首乌苷、芒柄花苷都具有较好的抗炎活性，并且在一定浓度范围内呈现良好的量效关系。
以上，以通脉养心丸为例，对本发明提供的具有心肌保护作用和抗炎作用的中药活性成分的确定方法进行了说明，从上述的描述可以得出，本发明的方法可以有效的得到目标中药中所含有的具有心肌保护作用和抗炎作用的中药活性成分。根据所确定出的具有心肌保护作用和抗炎作用的中药活性成分，可以容易的确定中药活性成分的含量，进而可以实现对目标中药的质量控制，保证对目标中药的临床疗效。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其中心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护。

Claims (7)

1.确定中药中具有心肌保护和抗炎作用的活性成分的方法，其特征在于，所述目标中药为通脉养心丸，该方法包括以下步骤：
(1)通过制备液相色谱获得目标中药各分离组分；
(2)通过心肌细胞抗氧化模型实验确定具有心肌保护作用的活性成分，所述心肌细胞抗氧化模型实验包括：
(A)将目标中药各分离组分针对目标心肌细胞分别进行细胞毒评价，确定无显著细胞毒的目标中药各分离组分的浓度；
(B)将目标心肌细胞分别用已确定无显著细胞毒的浓度的目标中药各分离组分进行保护，然后用指定氧化剂分别对已进行保护的目标心肌细胞进行损伤，并确定损伤后的目标心肌细胞的剩余数量，并根据所述剩余数量确定目标中药各分离组分对目标心肌细胞的相对保护率；
(C)将对目标心肌细胞相对保护率达到最低有效率的目标中药分离组分经LC-MS分析，确定出相对保护率达到最低有效率的各分离组分中所包含的化学成分；
用所确定的化学成分分别代替(B)部分的目标中药各分离组分，重复执行的(B)部分的操作，确定各化学成分的相对保护率，并将相对保护率达到最低有效率的化学成分确定为具有心肌保护作用的活性成分；
(3)通过巨噬细胞抗炎模型实验确定具有抗炎作用的活性成分，其中所述巨噬细胞抗炎模型实验包括：
(a)将目标中药各分离组分针对目标巨噬细胞分别进行细胞毒评价，确定无显著细胞毒的目标中药各分离组分的浓度；
(b)将目标巨噬细胞分组培养，每组的培养液中加入一种已确定无显著细胞毒的浓度的目标中药各分离组分及指定炎症诱导剂，培养结束后，确定各培养液上清液中的NO的含量，并根据所述NO的含量确定目标中药各分离组分对目标巨噬细胞的NO相对抑制率；
(c)将对目标巨噬细胞的NO相对抑制率达到抗炎有效率的目标中药分离组分经LC-MS分析，确定出NO相对抑制率达到抗炎有效率的各分离组分中所包含的化学成分；
用所确定的化学成分分别代替(b)部分的目标中药各分离组分，重复执行(b)部分的操作，将NO相对抑制率的半数抑制浓度在指定值以下的化学成分确定为具抗炎作用的活性成分。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)包括：获得目标中药的中药提取液，然后使所述中药提取液通过反相色谱柱；再对反相色谱柱进行洗脱，将洗脱液通过制备液相色谱进行分离，收集目标中药各分离组分。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述获得目标中药的中药提取液，包括：
将目标中药与甲醇水溶液混合后，进行提取、过滤，得到中药提取液；
所述反相色谱柱具体为：十八烷基硅烷键合硅胶为填料的中压反相色谱柱。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述(A)将目标中药各分离组分针对目标心肌细胞分别进行细胞毒评价，确定无显著细胞毒的目标中药各分离组分的浓度，具体为：
将H9c2心肌细胞在不加任何药物、分别加入第一指定浓度的目标中药各分离组分的情况下，在相同的条件下进行培养；培养结束后，确定不加任何药物及分别加入第一指定浓度的目标中药各分离组分的H9c2心肌细胞的数量；并以不加任何药物的H9c2心肌细胞的数量为标准，分别计算加入第一指定浓度的目标中药各分离组分后H9c2心肌细胞存活率；如果存活率在85％以上，则确定所述第一指定浓度为无显著细胞毒的该目标中药分离组分的浓度。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述(B)将目标心肌细胞用已确定无显著细胞毒的浓度的目标中药各分离组分分别对目标心肌细胞进行保护，然后用指定氧化剂其进行损伤，并确定损伤后的目标心肌细胞的剩余数量，并根据所述剩余数量确定目标中药各分离组分对目标心肌细胞的相对保护率，具体为：
将H9c2心肌细胞分成对照1组、实验1组及模型1组在相同的条件下进行培养；其中，实验1组加入在(A)部分已确定浓度的目标中药各分离组分进行预保护；对照1组及模型1组不加任何药物；培养结束后，将实验1组及模型1组分别加入指定氧化剂进行H9c2心肌细胞损伤；损伤后，通过酶标仪在第一预设波长下分别测定对照1组吸光度值DO对照1、实验1组吸光度值DO实验1及模型1组吸光度值DO模型1；通过计算分别得到实验1组的相对保护率S实验1，
其中，实验1组的相对保护率S实验的计算公式为：
S实验1％＝(DO实验1-DO模型1)/(DO对照1-DO模型1)×100％。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述(a)将目标中药各分离组分针对目标巨噬细胞分别进行细胞毒评价，确定无显著细胞毒的目标中药各分离组分的浓度，具体为：
将小鼠巨噬细胞RAW264.7在不加任何药物、分别加入第二指定浓度目标中药各分离组分的情况下，在相同的条件下进行培养；培养结束后，确定不加任何药物、及分别加入第二指定浓度目标中药各分离组分的小鼠巨噬细胞RAW264.7的数量；并以不加任何药物的小鼠巨噬细胞RAW264.7的数量为标准，分别计算加入第二指定浓度目标中药各分离组分后的小鼠巨噬细胞RAW264.7存活率；如果存活率在85％以上，则确定所述第二指定浓度为为无显著细胞毒的该目标中药分离组分的浓度。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述(b)将目标巨噬细胞分组培养，每组的培养液中加入一种已确定无显著细胞毒的浓度的目标中药各分离组分及指定炎症诱导剂，培养结束后，确定各培养液上清液中的NO的含量，并根据所述NO的含量确定目标中药各分离组分对目标巨噬细胞的NO相对抑制率，具体为：
将相同数量的小鼠巨噬细胞RAW264.7分成对照2组、实验2组及模型2组在相同的条件下进行培养；其中，实验2组加入在(a)部分已确定浓度的目标中药各分离组分及脂多糖；对照2组不加入任何物质，模型2组只加入脂多糖；培养结束后，取对照2组、实验2组及模型2组培养液中的上层清液；采用Griess法，通过酶标仪在第二预设波长下分别测定对照2组吸光度值DO对照2、实验2组吸光度值DO实验2及模型2组吸光度值DO模型2；通过计算分别得到实验2组的相对NO抑制率D实验2，
其中，实验2组的相对NO抑制率D实验2的计算公式为：
D实验2％＝(DO模型2-DO实验2)/(DO模型2-DO对照2)×100％。
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