CN114105931B - 一种基于洗脱-挤出模式的逆流色谱连续进样分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于洗脱‑挤出模式的逆流色谱连续进样分离方法。采用逆流色谱中洗脱‑挤出模式，以逆流色谱两相溶剂中流动相溶解样品，实现样品的连续进样。本方法主要用于两种化合物的分离，可以在洗脱过程中分离得到一个化合物，挤出过程分离得到另一个化合物。本发明的制备方法利用逆流色谱中洗脱‑挤出模式实现了真正意义的连续进样，较传统方法大幅度提高了进样量，可以降低溶剂消耗、提高制备量。
Description
技术领域
本发明属于天然产物分离方法技术领域，涉及一种逆流色谱连续进样分离的方法，尤其涉及一种基于洗脱-挤出模式的逆流色谱连续进样分离方法。
背景技术
逆流色谱（Counter-current Chromatography）是一种基于液-液分配原理的色谱分离技术，它主要利用目标化合物在互不相溶的两相溶剂之间分配系数的差异来实现分离。由于采用液体的固定相和流动相，因此具有无由固体固定相引起的不可逆吸附、进样量大、样品前处理简单等优点，在天然产物分离领域得到了广泛的应用。
洗脱-挤出模式（Elution-ExtrusionMode）是逆流色谱中独特的一种洗脱模式，它充分利用了逆流色谱液体固定相和流动相的特点，在应用洗脱-挤出模式时，保留较小的化合物在洗脱过程中根据分配系数大小被流动相依次洗脱出来；在洗脱过程结束后，保留较强的化合物仍然分布在固定相中，此时转为挤出模式，将流动相换为固定相，将保留在固定相中的化合物推出。洗脱-挤出模式最初主要用来在逆流色谱中分离极性范围跨度比较大的化合物，可以减少分离时间，降低溶剂消耗。但是，现有的洗脱-挤出模式不能同时分离两个目标化合物。
发明内容
本发明针对现有逆流色谱分离方面的需求，提供一种能同时分离两个目标化合物的基于洗脱-挤出模式的逆流色谱连续进样分离方法
为此，本发明采用的技术方案是：一种基于洗脱-挤出模式的逆流色谱连续进样分离方法，主要包括以下步骤：
步骤1：配制用于逆流色谱分离的溶剂系统，以其中一相作为固定相，另一相作为原始流动相；
将原始流动相分为两部分，在其中一部分原始流动相中完全溶解由不同化合物混合组成的样品，制成样品溶液；另一部分原始流动相为流动相；
样品由化合物1和化合物2组成。
步骤2：将固定相泵入逆流色谱仪中，待固定相充满逆流色谱分离柱后启动逆流色谱仪，当逆流色谱仪达到预设转速且稳定后，将流动相泵入逆流色谱分离柱；当逆流色谱分离柱内达到两相平衡后，停止泵入流动相，通过恒流泵泵入样品溶液，当泵入样品溶液的持续时间达到预定时间后，停止泵入样品溶液，再泵入流动相继续洗脱目标化合物，持续洗脱一段时间后；在保持流速不变的前提下，将流动相改为固定相，开始挤出过程；根据检测色谱图，收集分离馏分，减压真空干燥后得到组成样品的各组分。
连续泵入样品溶液的时间T inj 按以下公式计算：
T inj =[(K D2 －K D1 )V S /F]－(0.5W b1 +0.5W b2 )（1）
（1）式中，K D2 和K D1 分别是化合物2和化合物1的分配系数（K D2 >K D1 ），V S 是逆流色谱柱内固定相体积，F是流动相流速，W b1 和W b2 分别为化合物1和化合物2的洗脱色谱峰宽度。为了避免分离时化合物之间交叉，通常实际进样时间根据分离情况要略短于计算得到的T inj 数值。
流动相泵入逆流色谱分离柱的流速、样品溶液泵入逆流色谱分离柱的流速、流动相再次泵入逆流色谱分离柱的流速以及固定相再次泵入逆流色谱柱的流速相同，均为0.5~15mL/min。
本发明连续进样分离方法以逆流色谱两相溶剂中的流动相溶解样品，在分离过程起始阶段持续泵入样品溶液，实现进样和分离同时进行的双重效果；待连续进样时间达到预先计算的时间后，将样品溶液换为流动相，继续进行分离；分离过程结束后，将流动相换为固定相，开始挤出过程。
本发明连续进样分离方法具有如下效果：
1）方法独特：充分利用逆流色谱洗脱-挤出模式的特点，将样品溶解在流动相中，可以在洗脱过程中同时实现洗脱和进样，通过这种方式实现了逆流色谱分离中真正意义的连续进样。
2）分离过程快速，高效：主要适用于两种化合物的分离，在洗脱过程中分离得到一个化合物，挤出过程分离得到另一个化合物。利用逆流色谱中洗脱-挤出模式实现了真正意义的连续进样，较现有技术中的传统方法大幅度提高了进样量，降低溶剂消耗、提高制备量。
附图说明
图1为逆流色谱现有技术洗脱方法单次进样分离木犀草素和黄芩素色谱图。
图2为逆流色谱洗脱-挤出模式连续进样分离木犀草素和黄芩素色谱图。
图3为HPLC检测木犀草素和黄芩素混合物样品和HSCCC分离所得两个化合物的色谱图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明。
本发明实施例中所使用的分离设备逆流色谱仪，根据所需目标分离量的不同，可以选择分析型、半制备型和制备型逆流色谱仪。
为对比例1和实施例1制备两相溶剂系统，并配制样品溶液：
选择木犀草素和黄芩素的混合物作为待分离样品，选用正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水溶剂体系，采用HPLC法测定木犀草素和黄芩素在不同正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水组成比例的两相溶剂系统中的分配系数，最终选定正己烷︰乙酸乙酯︰甲醇︰水的体积比2︰3︰2︰3作为逆流色谱分离的两相溶剂系统，在该系统中黄芩素的分配系数为2.80，木犀草素的分配系数为1.18。
按体积比2︰3︰2︰3，将正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水加入分液漏斗中，剧烈振摇混合，静置分层，得到用于分离的两相溶剂系统，以下相为流动相，上相为固定相。称取75mg木犀草素和75 mg的黄芩素，溶解于150mL流动相中，制得质量体积浓度1.0 mg/mL的样品溶液。
对比例1
单次进样分离，采用现有技术中的常规洗脱模式，将两相溶剂系统的上相作为固定相，将该固定相以30mL/min的流速泵入逆流色谱分离柱中；待逆流色谱分离柱中充满固定相后，将逆流色谱仪的转速设置为1600 rpm，打开逆流色谱仪；当逆流色谱仪实际转速达到1600 rpm且稳定后，将流动相以流速6.0 mL/min泵入逆流色谱分离柱中；等逆流色谱柱内达到流体力学平衡后，通过进样环进样6mL，流动相继续洗脱分离；根据检测色谱图，收集分离馏分，减压真空干燥后得到木犀草素和黄芩素。单次分离中，木犀草素（化合物1）在22～28分钟被洗脱出来，黄芩素（化合物2）在42～49分钟被洗脱出来。
图1为现有技术中逆流色谱洗脱-挤出模式单次进样分离木犀草素和黄芩素的色谱图。分离条件：半制备型逆流色谱仪，柱体积136 mL，进样体积6mL，进样时间1 min，流动相流速6 mL/min，转速1600 rpm，检测波长230 nm。
实施例1
连续进样分离，采用洗脱挤出模式，首先将固定相（上相）以30mL/min的流速泵入逆流色谱分离柱中；待逆流色谱分离柱中充满固定相后，将逆流色谱仪转速设置为1600rpm，打开逆流色谱仪；当逆流色谱仪实际转速达到1600rpm且稳定后，将流动相以6.0mL/min的流速泵入逆流色谱分离柱中；同时，根据公式（1）计算出连续泵入样品溶液的时间T inj 为14.87分钟，为了保证样品溶液中两个化合物洗脱分离不重叠，将持续进样时间设为14分钟。等逆流色谱柱内的固定相和流动相达到流体力学平衡后，将流动相改为制备好的样品溶液，并将样品溶液以 6mL/min 的流速泵入色谱柱，进样时间持续14分钟，总计进样品溶液84 mL，进样结束后，将流体变回原来的流动相继续洗脱目标化合物26分钟，即整个洗脱过程持续了40分钟。将流动相由下相变为上相（原固定相），流速仍然为6 mL/min，开始挤出过程。根据检测色谱图，收集分离馏分，减压真空干燥后得到木犀草素和黄芩素。连续进样分离中，木犀草素（化合物1）在22～39分钟被洗脱出来，黄芩素（化合物2）在41～52分钟被洗脱出来。
图2为采用本发明逆流色谱洗脱-挤出模式连续进样分离方法分离木犀草素和黄芩素的色谱图。分离条件：半制备型逆流色谱仪，柱体积136mL，进样体积84mL，进样时间14min，流动相流速6mL/min，转速1600 rpm，检测波长230 nm。
连续泵入样品溶液的时间T inj 按以下公式计算：
T inj =[(K D2 －K D1 )V S /F]－(0.5W b1 +0.5W b2 )（1）
（1）式中，K D2 和K D1 分别是化合物2和化合物1的分配系数（K D2 >K D1 ），V S 是逆流色谱柱内固定相体积，F是流动相流速，W b1 和W b2 分别为化合物1和化合物2的洗脱色谱峰宽度。为了避免分离时化合物之间交叉，通常实际进样时间根据分离情况要略短于计算得到的T inj 数值。
分别采用洗脱-基础模式中溶质保留的体积模型和速度模型对目标化合物洗脱时间进行推导。
1）按照体积模型对洗脱时间推导如下：
通常逆流色谱洗脱-挤出模式中化合物的洗脱体积按照以下公式计算，在洗出过程洗脱的化合物：
V R =V M +K D V S （2）
（2）式中，V R 是洗出过程洗脱目标化合物的洗脱体积，V M 是逆流色谱柱内流动相体积，V S 是逆流色谱柱内固定相体积，K D 是目标化合物分配系数。
在挤出过程洗脱的化合物：
V EECCC =V CM +V C －(V CM /K D ) （3）
（3）式中，V EECCC 是挤出过程洗脱目标化合物的洗脱体积，V CM 是由流动相变化为固定相时洗脱的流动相体积，V M 是逆流色谱柱体积，K D 是目标化合物分配系数。
将流速F代入公式（2）和（3），得到：
在洗脱过程中分离的化合物1的出峰时间为：
τ1,front =V R1/F=(V M +K D1 V S )－0.5W b1（4）
为避免两个化合物重叠，化合物2的出峰的前沿应晚于化合物1的出峰的后沿，因此：
τ1,TE =[(V M +K D2 V S )/F]－0.5W b1－0.5W b2 （5）
在挤出过程中：
τ2,front =V EECCC /F=[V CM +V C －(V CM /K D2)]/F－0.5W b2（6）
τ2,TE ={[(K D2－K D1)V S +V CM +V C －(V CM /K D2)]/F}－0.5W b1－W b2 （7）
其中τ 1,front 和τ 1,TE 表示化合物1出峰时间的开始和结束，τ 2, front 和τ 2,TE 表示化合物2出峰时间的开始和结束。
2）按照速度模型对洗脱时间推导如下：
在逆流色谱洗脱时，溶质在色谱柱内的移动速度按照以下公式计算：
μ i =F(L/V Ri ) （8）
在洗脱阶段时，化合物以µ i 的线速度移动，当其在i点的时候移动的距离为X i ，F为流动相流速（mL/s）。当化合物被洗脱时，其在色谱柱内移动的距离X i 等于色谱柱长度L，即：
X i =L （9）
因此，洗脱过程中化合物1的出峰的开始时间τ 1,front ：
τ 1,front =(X i /μ i )－0.5W b1 （10）
将公式（2）代入公式（10），得到：
τ1,front =(V R1/F)－0.5W b1=[(V M +K D1 V S )/F]－0.5W b1（11）
为避免重叠，化合物2在出峰时的前沿应晚于化合物1出峰的后沿。因此，在连续进样中，
τ1,TE =τ1,front +T inj + 0.5W b1=[(V M +K D2 V S ) /F]－0.5W b1－0.5W b2 （12）
在挤出过程中，化合物2在色谱柱内移动的距离为：
X 2+ΔX 2=LV CM /K D2 V S（13）
同时，固定相在色谱柱内移动距离µ s 为：
µ s =F(L/V C )（14）
因此，挤出阶段分离的化合物2的出峰时间为：
τ2,front =(V EECCC /F)－0.5W b2 （15）
将公式（3）代入公式（15），得到：
τ2,front ={[V CM +V C －(V CM /K D2)]/F}－0.5W b2 （16）
在挤出过程中，由于化合物2在固定相中保留较强，因此大致认为化合物2的出峰后沿距离前沿大约为持续进样时间，因此：
τ2,TE =τ2,front +T inj ={[(K D2－K D1)V S +V CM +V C －(V CM /K D2)]/F}－0.5W b1－W b2 （17）
其中τ 1,front 和τ 1,TE 表示化合物1出峰时间的开始和结束，τ 2, front 和τ 2,TE 表示化合物2出峰时间的开始和结束。
图3为HPLC检测木犀草素和黄芩素混合物样品和HSCCC分离所得两个化合物的色谱图，图3中（a）：混合样品；图3中（b）：分离得到的木犀草素（化合物1）；图3中（c）：分离得到的黄芩素（化合物2）。流动相为甲醇和水，梯度洗脱：0-30分钟，60%-80%甲醇；流速设置为1mL/min，检测波长230nm；温度25℃，进样量为20μL。HPLC分析前，所有样品均通过0.45μm微孔过滤器过滤。
通过使用模板分子木犀草素和黄芩素进行代表性的分离。如图3所示，通过对连续分离的馏分进行HPLC分析，我们发现在洗脱阶段成功分离了木犀草素，在挤出阶段成功获得了黄芩素。
Claims (1)
1.一种基于洗脱-挤出模式的逆流色谱连续进样分离木犀草素和黄芩素的方法，其特征在于，该连续进样分离方法包含以下的步骤：
1）将用于配制逆流色谱分离的两相溶剂系统的原料加入分液漏斗中，振摇混合，静置分层，得到用于分离的两相溶剂系统，以其中上相作为固定相，下相作为原始流动相；将原始流动相分为两部分；
配制逆流色谱分离的两相溶剂系统的原料为正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水；
正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水的体积比为2︰3︰2︰3；
2）将样品溶解于一部分原始流动相中，配成质量体积浓度1.0 mg/mL的样品溶液，另一部分原始流动相为流动相；
样品由木犀草素和黄芩素组成；
3）将固定相以30mL/min的流速泵入逆流色谱分离柱，当固定相充满逆流色谱分离柱后，启动逆流色谱仪，并设定逆流色谱仪的转速为1600rpm；当逆流色谱仪实际转速达到预设转速且稳定后，将步骤2）中的流动相以6.0mL/min的流速泵入逆流色谱分离柱中；待逆流色谱柱内达到两相平衡后，通过恒流泵以6.0mL/min的流速持续泵入样品溶液，连续进样14分钟后，停止泵入样品溶液，再泵入流动相，继续洗脱目标化合物26分钟，停止泵入流动相，再将固定相泵入逆流色谱柱内，根据检测结果，收集目标化合物馏分；
流动相再次泵入逆流色谱分离柱的流速以及固定相再次泵入逆流色谱柱的流速相同，均为6mL/min；
4）真空干燥目标化合物馏分，得到分离的木犀草素和黄芩素。
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| 逆流色谱Elution-Extrusion模式实现天然产物中目标化合物的连续分离研究;黄新异等;《中国化学会第22届全国色谱学术报告会及仪器展览会论文集（第一卷）》;20190430;第153页全文 * |
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