CN114195910B - 一种富含半乳糖醛酸的枸杞叶多糖及其制备方法和应用 - Google Patents

一种富含半乳糖醛酸的枸杞叶多糖及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种富含半乳糖醛酸的枸杞叶多糖及其制备方法和应用，属于生物医药技术领域。本发明将枸杞叶与丙酮水溶液混合进行褪色处理，得到褪色枸杞叶；采用螯合剂溶液对所述褪色枸杞叶进行提取，得到提取液；采用乙醇对所述提取液进行醇沉，得到醇沉物；将所述醇沉物依次经醇洗、水复溶、透析和干燥，得到枸杞叶多糖。采用本发明提供的方法制备得到的枸杞叶多糖富含半乳糖醛酸，具有调节人肠道菌群的功效。此外，本发明提供的方法操作简单，无需对枸杞叶多糖进一步分离纯化即得到高半乳糖醛酸含量的枸杞叶多糖。

Description

一种富含半乳糖醛酸的枸杞叶多糖及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种富含半乳糖醛酸的枸杞叶多糖及其制备方法和应用。
背景技术
枸杞叶又称枸杞芽茶，有补肾益精、清热明目、延缓衰老等功效，在我国已有两千年以上的药用历史。枸杞叶中含有丰富的多糖、多酚、甜菜碱、维生素及矿物质等成分，然而相对于枸杞，枸杞叶的化学成分研究并未受到重视。有研究显示多糖是枸杞叶中最主要的成分之一，枸杞叶中多糖的结构与枸杞中多糖相似，其含量高达10.23％，甚至高于枸杞中多糖含量。枸杞叶多糖主要由中性糖组成，同时还含有半乳糖醛酸和蛋白质。枸杞叶多糖是枸杞叶中主要的活性物质，具有抗氧化的功效。
目前针对枸杞叶多糖的提取方法多集中于高温水提，该方法对枸杞叶细胞壁破坏程度不足，不足以充分释放枸杞叶细胞壁多糖，导致半乳糖醛酸含量较低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种富含半乳糖醛酸的枸杞叶多糖及其制备方法和应用，采用本发明提供的方法制备得到的枸杞叶多糖富含半乳糖醛酸，具有调节人肠道菌群的功效。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种富含半乳糖醛酸的枸杞叶多糖的制备方法，包括以下步骤：
将枸杞叶与丙酮水溶液混合进行褪色处理，得到褪色枸杞叶；
采用螯合剂溶液对所述褪色枸杞叶进行提取，得到提取液；
采用乙醇对所述提取液进行醇沉，得到醇沉物；
将所述醇沉物依次经醇洗、水复溶、透析和干燥，得到富含半乳糖醛酸的枸杞叶多糖。
优选地，所述丙酮水溶液的体积分数≥60％，所述枸杞叶与丙酮水溶液的用量比为1g：(5～10)mL。
优选地，所述褪色处理的温度为25～35℃，所述褪色处理的次数为3～5次，单次褪色处理的时间为1～2h。
优选地，所述螯合剂溶液中的螯合剂包括1,2-环己二胺四乙酸或乙二胺四乙酸。
优选地，所述螯合剂溶液中螯合剂的浓度为0.04～0.06mol/L，所述褪色枸杞叶与螯合剂溶液的用量比为1g：(20～40)mL。
优选地，所述螯合剂溶液的配制方法包括以下步骤：
将螯合剂与乙酸钠缓冲液混合，调节所得体系的pH值为6.5～7.0，得到螯合剂溶液。
优选地，所述提取的温度为20～30℃，时间为3～5h。
优选地，所述乙醇与提取液的体积比为(2～4)：1。
本发明提供了上述技术方案所述制备方法制备得到的富含半乳糖醛酸的枸杞叶多糖，所述半乳糖醛酸的含量为50～70mol％。
本发明提供了上述技术方案所述富含半乳糖醛酸的枸杞叶多糖在制备调节人肠道菌群制剂中的应用。
本发明提供了一种富含半乳糖醛酸的枸杞叶多糖的制备方法，包括以下步骤：将枸杞叶与丙酮水溶液混合进行褪色处理，得到褪色枸杞叶；采用螯合剂溶液对所述褪色枸杞叶进行提取，得到提取液；采用乙醇对所述提取液进行醇沉，得到醇沉物；将所述醇沉物依次经醇洗、水复溶、透析和干燥，得到富含半乳糖醛酸的枸杞叶多糖。本发明采用螯合剂作为提取剂，通过螯合剂与枸杞叶细胞壁中高价阳离子(主要是钙离子)的螯合作用，打断钙桥与细胞壁的连接，加速与钙桥相连的果胶酸溶出，从而获得高半乳糖醛酸含量的果胶样多糖。采用本发明提供的方法制备得到的枸杞叶多糖富含半乳糖醛酸，具有调节人肠道菌群的功效。此外，本发明提供的方法操作简单，无需对枸杞叶多糖进一步分离纯化即得到高半乳糖醛酸含量的枸杞叶多糖。
具体实施方式
本发明提供了一种富含半乳糖醛酸的枸杞叶多糖的制备方法，包括以下步骤：
将枸杞叶与丙酮水溶液混合进行褪色处理，得到褪色枸杞叶；
采用螯合剂溶液对所述褪色枸杞叶进行提取，得到提取液；
采用乙醇对所述提取液进行醇沉，得到醇沉物；
将所述醇沉物依次经醇洗、水复溶、透析和干燥，得到富含半乳糖醛酸的枸杞叶多糖。
本发明将枸杞叶与丙酮水溶液混合进行褪色处理，得到褪色枸杞叶。在本发明中，所述枸杞叶优选包括宁夏枸杞叶、中华枸杞叶、新疆枸杞叶或黑果枸杞叶。本发明优选将所述枸杞叶依次经干燥、破碎和过筛，将所得枸杞叶粉与丙酮水溶液混合进行褪色处理，得到褪色枸杞叶。在本发明中，所述干燥优选为晒干；本发明对所述破碎没有特殊限定，能够得到满足粒度要求的枸杞叶粉即可；所述过筛所用筛网的目数优选为30～50目，过筛后取筛下物料使用。在本发明中，所述丙酮水溶液的体积分数优选≥60％，更优选为60～80％；所述枸杞叶与丙酮水溶液的用量比优选为1g：(5～10)mL，更优选为1g：(5～8)mL，进一步优选为1g：(5～6)mL。
本发明优选将枸杞叶浸泡于所述丙酮水溶液中进行褪色处理。在本发明中，所述褪色处理的温度优选为25～35℃，具体可以在室温条件下进行所述褪色处理；在本发明的实施例中，所述室温具体为25℃。在本发明中，所述褪色处理的次数优选为3～5次，每次褪色处理后，优选将所得物料进行固液分离，将所得固体物料再次浸泡于所述丙酮水溶液中进行褪色处理；本发明对所述固液分离的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的方式即可，具体可以为过滤，所述过滤采用的滤布目数优选为300～400目。在本发明中，单次褪色处理的时间优选为1～2h。在本发明中，所述褪色处理优选在搅拌条件下进行；本发明对所述搅拌的速率没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的搅拌速率即可。本发明优选在上述条件下进行褪色处理，可以脱去枸杞叶中大部分的色素。
得到褪色枸杞叶后，本发明采用螯合剂溶液对所述褪色枸杞叶进行提取，得到提取液。在本发明中，所述螯合剂溶液中的螯合剂优选包括1,2-环己二胺四乙酸(CDTA)或乙二胺四乙酸(EDTA)，所述螯合剂优选为食品级螯合剂；所述螯合剂溶液中螯合剂的浓度优选为0.04～0.06mol/L，更优选为0.05mol/L。在本发明中，所述螯合剂溶液的配制方法优选包括以下步骤：将螯合剂与乙酸钠缓冲液混合，调节所得体系的pH值为6.5～7.0，得到螯合剂溶液。在本发明中，所述乙酸钠缓冲液的浓度优选为0.05～0.15mol/L，更优选为0.1mol/L；调节pH值采用的试剂优选包括盐酸或氢氧化钠，根据实际需要选择即可。本发明优选将螯合剂溶液的pH值控制在6.5～7.0，能够避免提取液pH值过低导致其中的果胶结构被破坏。在本发明中，所述褪色枸杞叶与螯合剂溶液的用量比优选为1g：(20～40)mL，更优选为1g：(25～30)mL。
本发明优选将褪色枸杞叶浸泡于螯合剂溶液中进行提取。在本发明中，所述提取的温度优选为20～30℃，更优选为25～30℃；时间优选为3～5h，更优选为3～4h。在本发明中，所述提取优选在搅拌条件下进行；本发明对所述搅拌的速率没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的搅拌速率即可。在本发明中，所述提取过程中，螯合剂通过不断和枸杞叶细胞壁中的高价阳离子，主要是钙离子螯合，打断与细胞壁相连的钙桥结构，从而不断地释放与钙离子相连的果胶样多糖，从而获得高半乳糖醛酸含量的果胶样多糖。
所述提取后，本发明优选将所得体系进行固液分离，所得液体物料为提取液。本发明对所述固液分离的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的方式即可，具体可以为过滤，所述过滤采用的滤布目数优选为300～400目。
得到提取液后，本发明采用乙醇对所述提取液进行醇沉，得到醇沉物。在本发明中，所述乙醇与提取液的体积比优选为(2～4)：1，更优选为(2～3)：1。在本发明中，所述乙醇优选为无水乙醇。本发明优选将所述提取液与乙醇混合，在静置条件下进行醇沉。在本发明中，所述醇沉的温度优选为25～35℃，具体可以在室温条件下进行所述醇沉；所述醇沉的时间优选为2～5h，更优选为3～4h。
所述醇沉后，本发明优选将所得体系进行固液分离，所得固体物料为醇沉物。本发明对所述固液分离的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的方式即可，具体可以为过滤，所述过滤采用的滤布目数优选为300～400目。
得到醇沉物后，本发明将所述醇沉物依次经醇洗、水复溶、透析和干燥，得到富含半乳糖醛酸的枸杞叶多糖。在本发明中，所述醇洗采用的醇试剂优选为无水乙醇，所述水复溶采用的水优选为蒸馏水，所述水的用量以使醇洗后所得物料完全复溶为基准。在本发明中，所述透析所用透析袋的截留分子量优选为8000～14000Da，更优选为为10000Da；所述透析采用的透析液优选依次为氯化钠溶液和蒸馏水，所述氯化钠溶液的浓度优选为0.05～0.2mol/L，更优选为0.1～0.15mol/L；具体是以氯化钠溶液为透析液，将水复溶后所得物料进行第一透析；然后以蒸馏水为透析液，将第一透析后所得物料进行第二透析。在本发明中，所述第一透析与第二透析的时间独立地优选为12～24h，更优选为20～24h。本发明优选通过采用氯化钠溶液作为透析液进行透析，去除水复溶后所得物料中的螯合剂，通过采用蒸馏水作为透析液进行透析，是为了去除第一透析过程中引入的钠离子与氯离子。在本发明中，所述干燥优选为冷冻干燥。
本发明提供了上述技术方案所述制备方法制备得到的富含半乳糖醛酸的枸杞叶多糖。本发明提供的枸杞叶多糖中半乳糖醛酸含量较高，为50～70mol％，优选为60～70mol％。本发明所述枸杞叶多糖中优选还包括岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖，所述枸杞叶多糖中岩藻糖的含量优选为0.1～1mol％，鼠李糖的含量优选为5～10mol％，阿拉伯糖的含量优选为10～15mol％，半乳糖的含量优选为5～10mol％，葡萄糖的含量优选为5～10mol％。本发明所述枸杞叶多糖中优选不含有木糖和葡萄糖醛酸。
本发明提供了上述技术方案所述富含半乳糖醛酸的枸杞叶多糖在制备调节人肠道菌群制剂中的应用。本发明所述枸杞叶多糖具有调节人肠道菌群的功效，能够刺激益生菌生长，尤其是具有同时促进双歧杆菌和乳酸杆菌生长的作用。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
(1)用高速粉碎机将晒干后的枸杞叶(具体种类为宁夏枸杞叶)粉碎，过50目筛，筛下物料为枸杞叶粉；将所述枸杞叶粉浸泡于体积分数为80％的丙酮水溶液中，料液比为1g：5mL，在室温(25℃)、搅拌条件下进行褪色处理2h，之后采用300目滤布过滤，将所得滤饼用丙酮水溶液重复进行褪色处理3次，得到褪色枸杞叶粉；
(2)以水为溶剂配制浓度为0.1mol/L的乙酸钠缓冲液，将所述乙酸钠缓冲液与1,2-环己二胺四乙酸(CDTA)混合，使CDTA的浓度为0.05mol/L，之后用1mol/L的盐酸调节所得混合物料的pH值至6.80，得到CDTA溶液；将所述褪色枸杞叶粉浸泡于所述CDTA溶液中，料液比为1g：30mL，在30℃、搅拌条件下提取4h，之后采用300目滤布将所得料液进行过滤，所得滤液为提取液；
(3)将所述提取液与3倍体积量的无水乙醇混合，在室温条件下静置4h，之后采用300目滤布将所得料液进行过滤，所得滤饼为醇沉物；
(4)将所述醇沉物用无水乙醇漂洗，得到醇不溶物；采用蒸馏水将所述醇不溶物完全复溶，得到复溶物料；采用截留分子量为10000Da的透析袋对所述复溶物料进行透析，具体是先以0.1mol/L的氯化钠溶液作为透析液透析24h，然后以蒸馏水作为透析液透析24h，得到多糖溶液；将所述多糖溶液进行冷冻干燥，得到枸杞叶多糖。
对比例1
按照实施例1的方法制备枸杞叶多糖，不同之处仅在于将CDTA溶液替换为碳酸钠溶液，所述碳酸钠溶液的配制方法包括：以水为溶剂配制浓度为25mmol/L的硼氢化钠缓冲液，将所述硼氢化钠缓冲液与碳酸钠混合，得到碳酸钠溶液，所述碳酸钠溶液中碳酸钠的浓度为0.05mol/L。
对比例2
按照实施例1的方法制备枸杞叶多糖，不同之处仅在于将CDTA溶液替换为氢氧化钠溶液，所述氢氧化钠溶液的配制方法包括：以水为溶剂配制浓度为25mmol/L的硼氢化钠缓冲液，将所述硼氢化钠缓冲液与氢氧化钠混合，得到氢氧化钠溶液，所述氢氧化钠溶液中氢氧化钠的浓度为0.1mol/L。
测试例1
采用离子色谱法测定实施例1以及对比例1～2制备的枸杞叶多糖中单糖的组成，具体步骤如下：
取1mL浓度为2mg/mL的枸杞叶多糖水溶液到安瓿瓶中，加入1mL浓度为4mol/L的三氟乙酸水溶液，用酒精喷灯封闭安瓿瓶，在110℃条件下水解8h；之后氮吹除去安瓿瓶中的三氟乙酸，用6mL蒸馏水溶解剩余物，过0.22μm水膜后用离子交换色谱法，以标准曲线定量单糖组成；所述标准曲线的制作方法包括以下步骤：
分别配制10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、60μmol/L以及80μmol/L的含有9种单糖的混标(岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸)，过0.22μm水膜后同样品一起进样，以单糖浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，制作9种单糖的标准曲线，具体如下所示：
岩藻糖：y＝123.27x+4.76，R2＝0.998；鼠李糖：y＝115.72x+0.46，R2＝0.999；阿拉伯糖：y＝167.20-1.921，R2＝0.999；半乳糖：y＝227.49x+3.11，R2＝0.997；葡萄糖：y＝247.96x-1.63，R2＝0.999；甘露糖：y＝161.10x-3.50，R2＝0.993；木糖：y＝242.61x-6.73，R2＝0.999；半乳糖醛酸：y＝95.17x-2.31，R2＝0.997；葡萄糖醛酸：y＝86.89x-3.01，R2＝0.993。
表1为实施例1以及对比例1～2制备的枸杞叶多糖的单糖组成(单位mol％)，由表1可知，本发明采用螯合剂提取的枸杞叶多糖的半乳糖醛酸含量显著高于采用碳酸钠和氢氧化钠提取的枸杞叶多糖的半乳糖醛酸含量。
表1实施例1以及对比例1～2制备的枸杞叶多糖的单糖组成(单位mol％)
Figure BDA0003455774850000071
Figure BDA0003455774850000081
注：“Ns”代表未检出。
测试例2
配制无碳源培养基，组成为10g/L酪蛋白胨、2.5g/L酵母提取物、0.09g/L七水硫酸镁、0.09g/L氯化钙、0.45g/L磷酸二氢钾、0.45g/L磷酸氢二钾、0.9g/L氯化钠、1.5g/L碳酸氢钠、1.0g/L半胱氨酸盐酸盐、0.8mg/L树脂天青、10mg/L氯化血红素、5.0mg/L维生素B2、10.0mg/L维生素B6、2.0mg/L维生素B7、0.1mg/L维生素B12、2.0mg/L叶酸和5.0mg/L对氨基苯甲酸，且所述无碳源培养基的pH值为7.20；将10g人粪便与90mLPBS缓冲液(pH值为7.0)混合匀浆，得到浓度为10％(w/v)的人粪便匀浆；
将实施例1制备的枸杞叶多糖溶解于所述无碳源培养基中，然后加入所述人粪便匀浆，所述人粪便匀浆为无碳源培养基体积的10％，在37℃厌氧条件下发酵24h，之后将所得发酵液离心，收集粪便沉淀，采用qPCR法测定所述粪便沉淀中双歧杆菌、植物乳杆菌、大肠杆菌和拟杆菌的含量，具体步骤如下：
采用液体培养基培养双歧杆菌、植物乳杆菌、大肠杆菌和拟杆菌，采用平板涂布法测定培养后液体培养基中每种细菌的活菌数(CFU/mL)；将所述粪便沉淀与标准菌株一起用DNA提取试剂盒提取DNA，具体是向5μLqPCR预混液(SYBR Green I)中加入0.3μL浓度为10μmol/L的各菌对应的引物水溶液(所述引物的选择参照文献Gil-Sanchez,I.,Cueva,C.,Sanz-Buenhombre,M.,Guadarrama,A.,Moreno-Arribas,M.V.,&Bartolome,B.(2018).Dynamic gastrointestinal digestion of grape pomace extracts:Bioaccessiblephenolic metabolites and impact on human gut microbiota.Journal ofFoodComposition andAnalysis,68,41-52)，然后加入3.4μL去酶水以及1μLDNA模板，上机检测；以Ct值为横坐标，拷贝数的对数值为纵坐标制作标准曲线，以标准曲线定量样品中特定细菌含量；
各细菌以及总细菌的标准曲线具体如下所示：
双歧杆菌：y＝-0.295x+10.593，R2＝0.998；植物乳杆菌：y＝-0.276x+10.718，R2＝0.998；大肠杆菌：y＝-0.250x+9.479，R2＝0.987；拟杆菌：y＝-0.287x+10.622，R2＝0.989；总细菌：y＝-0.214x+10.407，R2＝0.998。
同时设置空白对照组实验以及菊粉组实验，其中，空白对照组实验不添加枸杞叶多糖，其余操作与多糖组相同；菊粉组实验将枸杞叶多糖替换为等质量的菊粉(来源于大丽花，购买自阿拉丁公司)，其余操作与多糖组相同。
表2为实施例1制备的枸杞叶多糖对四种细菌及总细菌含量的影响结果，由表2可知，本发明采用螯合剂提取的枸杞叶多糖相较于空白对照组能显著提高双歧杆菌和乳酸杆菌两种常见益生菌的含量，展现出肠道益生活性。表2实施例1制备的枸杞叶多糖对四种细菌及总细菌含量的影响结果(单位：log10(拷贝数/毫升))
Figure BDA0003455774850000091
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种富含半乳糖醛酸的枸杞叶多糖的制备方法，按以下步骤进行：
将枸杞叶与丙酮水溶液混合进行褪色处理，得到褪色枸杞叶；所述丙酮水溶液的体积分数为60～80％；所述枸杞叶与丙酮水溶液的用量比为1g：(5～6)mL；所述褪色处理的温度为25～35℃，所述褪色处理的次数为3～5次，单次褪色处理的时间为1～2h；
采用螯合剂溶液对所述褪色枸杞叶进行提取，得到提取液；所述螯合剂溶液中的螯合剂为1,2-环己二胺四乙酸；所述螯合剂溶液中螯合剂的浓度为0.04～0.06mol/L，所述褪色枸杞叶与螯合剂溶液的用量比为1g：(20～40)mL；所述提取的温度为20～30℃，时间为3～5h；
采用乙醇对所述提取液进行醇沉，得到醇沉物；所述乙醇与提取液的体积比为(2～3)：1；
将所述醇沉物依次经醇洗、水复溶、透析和干燥，得到富含半乳糖醛酸的枸杞叶多糖；所述透析是先以氯化钠溶液作为透析液透析，然后以蒸馏水作为透析液透析。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述螯合剂溶液的配制方法包括以下步骤：
将螯合剂与乙酸钠缓冲液混合，调节所得体系的pH值为6.5～7.0，得到螯合剂溶液。
3.权利要求1～2任一项所述制备方法制备得到的富含半乳糖醛酸的枸杞叶多糖，所述半乳糖醛酸的含量为60～70mol％。
4.权利要求3所述富含半乳糖醛酸的枸杞叶多糖在制备调节人肠道菌群制剂中的应用。
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