KR101386833B1 - 오만둥이 유래의 혈압조절용 조성물 - Google Patents

오만둥이 유래의 혈압조절용 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR101386833B1
KR101386833B1 KR1020120088932A KR20120088932A KR101386833B1 KR 101386833 B1 KR101386833 B1 KR 101386833B1 KR 1020120088932 A KR1020120088932 A KR 1020120088932A KR 20120088932 A KR20120088932 A KR 20120088932A KR 101386833 B1 KR101386833 B1 KR 101386833B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
blood pressure
angiotensin
peptide
hydrolyzate
convertase
Prior art date
Application number
KR1020120088932A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20140022617A (ko
Inventor
전유진
고석천
Original Assignee
제주대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 제주대학교 산학협력단 filed Critical 제주대학교 산학협력단
Priority to KR1020120088932A priority Critical patent/KR101386833B1/ko
Publication of KR20140022617A publication Critical patent/KR20140022617A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101386833B1 publication Critical patent/KR101386833B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/56—Materials from animals other than mammals
    • A61K35/655—Aquatic animals other than those covered by groups A61K35/57 - A61K35/65
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/01—Hydrolysed proteins; Derivatives thereof
    • A61K38/012—Hydrolysed proteins; Derivatives thereof from animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/55—Protease inhibitors
    • A61K38/556—Angiotensin converting enzyme inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Oceanography (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 발명은 오만둥이(Styela plicata)의 단백질 가수분해물을 포함하는 혈압조절용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 의한 오만둥이의 효소적 가수분해물은 인간을 대상으로 적용하기에 유리하며 부작용이 없는 천연 혈압조절제의 유효성분으로 활용할 수 있는 효과가 크다. 또한, 새로운 혈압조절용 식품소재의 개발, 기존의 혈압치료제라는 의약품 개념에서 기능성 식품으로 안전하게 복용이 가능하다.

Description

오만둥이 유래의 혈압조절용 조성물{Composition for controlling blood pressure from Styela plicata}
본 발명은 오만둥이(Styela plicata)의 단백질 가수분해물을 포함하는 혈압조절용 조성물에 관한 것이다.
종래 화학 합성 방법 등을 통하여 제조되었던 고혈압 제제의 부작용들의 문제가 발생됨에 따라 최근 세계 각국에서는 천연 물질로부터 항고혈압 효과를 갖는 물질을 얻기 위한 노력이 지속 되고 있다. 이에 각국에서는 항고혈압제 뿐만 아니라 항생물질, 항암제와 같이 인체에 유용한 의약품은 물론이고, 효소와 건강 보조제와 같은 식품 소재 등 다양한 용도에 활용될 수 있는 새로운 물질을 탐색하기 위하여 자연 상태의 생물, 특히 대량 배양 및 번식이 용이한 생물에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 특히 해양생물은 육상생물에 없는 특유의 대사과정과 독특한 환경으로 인하여 다양한 신규 생리활성물질의 탐색 기능성을 가지고 있다. 또한, 육상 생물은 이미 많은 연구가 진행되었으나 해양생물은 아직 제한된 연구로 인하여 미지의 천연물질의 개발에 대한 기대가 높이 평가되고 있다.
그 중에서도 오만둥이는 전 세계적으로 우리나라에서만 식용으로 사용하며 유일하게 양식을 하고 있어 대량 생산이 용이할 뿐만 아니라 소재로서의 부가가치가 매우 높기 때문에 생물 소재 산업에 있어서 중요한 위치를 차지하고 있다. 예를 들어 한국식품영양과학회지(제34권, 제7호, 937~941쪽)에서는 주름 미더덕의 가공방법과 용매에 따른 항산화 및 항암효과에 대해 기술하고 있으며, 한국식품영양과학회지(제40권, 제3호, 350~356쪽)에서는 채취시기와 크기에 따른 주름 미더덕의 항산화 및 항고혈압 활성에 대해 기술하고 있으며, 한국식품영양과학회지(제34권, 제7호, 839~845쪽)에서는 주름 미더덕의 항유전 독성 및 대장암 억제 효과에 대해 기술하고 있으며, 한국식품영양과학회지(제36권, 제10호, 1271~1278쪽)에서는 알코올로 인한 흰쥐의 백혈구 및 간 DNA 손상에 미치는 주름 미더덕 분말의 보충섭취 효과에 대해 기술하고 있다.
그렇지만 위의 기술한 주름 미더덕의 생리활성에 대한 연구는 유기용매 및 단순 수용성 추출물을 통하여 확인한 결과로서, 주름 미더덕의 단백질을 이용하여 가수분해를 통한 생리활성에 대한 연구는 없는 실정이다. 또한, 대량 양식이 가능하고 다양한 생리활성 성분을 함유하고 있는 주름 미더덕이 가지고 있는 잠재력을 고려해 볼 때, 주름 미더덕으로부터 약품 또는 기능성 식품과 같이 인체의 건강을 증진시킬 수 있는 조성물을 얻기 위한 연구는 지속적으로 필요한 실정이다.
한국식품영양과학회지 제34권 제7호 한국식품영양과학회지 제36권 제10호 한국식품영양과학회지 제40권 제3호
이에 본 발명자는 해양생물인 오만둥이로부터 유래한 펩타이드가 항고혈압 활성을 갖는 것을 발견하고 본 발명을 하기에 이르렀다.
본 발명은 오만둥이 유래의 조성물의 혈압조절용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 오만둥이(Styela plicata)의 단백질 가수분해물을 포함하는 혈압조절용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 오만둥이(Styela plicata)의 단백질 가수분해물 유래의 펩타이드를 포함하는 혈압조절용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명에 의한 오만둥이의 효소적 가수분해물은 인간을 대상으로 적용하기에 유리하며 부작용이 실질적으로 없는 천연 혈압조절제의 유효성분으로 활용할 수 있는 효과가 크다. 또한, 새로운 혈압조절용 식품소재의 개발, 기존의 혈압치료제라는 의약품 개념에서 기능성 식품으로 안전하게 복용이 가능하다.
도 1은 프로타멕스(Protamex) 가수분해물로부터의 <5kDa 분획의 Sephadex G-25 겔 여과 크로마토그래피이다. 도 1(A)는 각 분획의 안지오텐신 I-전환효소 저해 활성을 나타내고, 도 1(B)는 Sephadex G-25 겔 컬럼에 의해 분리된 분획이 4 개의 분획으로 분리되는 것에 관한 것이다.
도 2는 Sephadex G-25로부터 분리된 분획 F2의 강한 안지오텐신 I-전환효소 저해활성의 RP-HPLC에 관한 것이다. 도 2(A)는 각 분획의 안지오텐신 I-전환효소 저해 활성에 관한 것이고, 도 2(B)는 서브-분획(F2-1에서 F2-3)으로 분리된 1.0 mL/min의 유속에 0 내지 25%의 아세토니트릴의 선형 구배 및 Grom-sil 120 ODS-5 ST 분취용 컬럼(5μm, 10 x 250nm)에서 실행되었다.
도 3은 안지오텐신 I-전환효소 저해 활성을 갖는 정제된 펩타이드 분획에 관한 것이다. 도 3(A)는 각 분획의 안지오텐신 I-전환효소 저해 활성에 관한 것이고, 도 3(B)는 1.0 mL/min의 유속에 0 내지 20%의 아세토니트릴의 선행 구배를 갖는 YMC-Pack ODS-A 분석용 컬럼(5μm, 4.6 x 250nm)에 F2-2 분획의 재크로마토그래피이다.
도 4는 Q-TOF MS 스펙트로미터를 사용하여 정제된 펩타이드의 아미노산 서열 및 분자량의 식별에 관한 것이다.
도 5는 안지오텐신 I-전환효소에 대한 정제된 펩타이드의 저해 모드의 결정을 위한 Lineweaver-Burk plot에 관한 것이다.
본 발명은 해양생물인 오만둥이로부터 혈압조절 효과를 얻기 위하여 오만둥이를 인간에게 적용이 가능한 효소적 가수분해를 통해 혈압조절 효과를 가지는 조성물을 효과적으로 회수하여, 이들로부터 혈압조절 펩타이드를 분리, 정제하는 것이다.
본 발명은 오만둥이(Styela plicata)의 단백질 가수분해물을 포함하는 혈압조절용 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 오만둥이(Styela plicata)의 단백질 가수분해물 유래의 펩타이드를 포함하는 혈압조절용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 혈압조절용 조성물에서, 단백질 가수분해물 유래의 펩타이드는 오만둥이의 단백질 가수분해물을 한외여과과 컬럼 크로마토그래피로 분리하고, 컬럼 크로마토그래피에 의하여 얻어진 분획 성분을 역상 고성능 액체 크로마토그래피로 분리하여 제조된 것일 수 있다.
상기 가수분해물의 단백질 분해효소는 이에 제한되는 것은 아니나, 프로타멕스(Protamex), 코지자임(Kojizyme), 뉴트라제(Neutrase), 플라보자임(Flavourzyme), 알칼라제(Alcalase), 트립신(trypsin), 알파- 카이모트립신(α-chymotrypsin), 펩신(pepsin) 및 파파인(papain)으로 이루어진 그룹으로부터 하나 이상 선택될 수 있으며, 특히, 프로타멕스일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 프로타멕스에 의한 단백질 가수분해물이 가장 높은 안지오텐신 I-전환효소 저해 활성을 나타냄을 알 수 있었다.
본 발명에 의한 혈압조절용 조성물에서, 오만둥이의 단백질 가수분해물 유래의 펩타이드는 혈관 수축을 유도하여 혈압을 상승시키는 안지오텐신 I-전환효소의 활성을 저해할 수 있다.
본 발명의 상기 펩타이드는 Met-Leu-Leu-Cys-Ser의 아미노산 서열을 포함하고 안지오텐신 I-저해효과를 가질 수 있다.
본 발명에 의한 혈압조절용 조성물에서, 단백질 가수분해물 유래의 펩타이드는 안지오텐신 I-전환효소 활성 저해 효과 범위가 0.01~2.5 mg/ml일 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 실시예 1>
1. 재료의 준비
실험에 사용된 오만둥이는 미더덕영업조합(한국, 마산)에서 구입하여 분쇄 후 물로 세 번 세척하여 염분을 제거하였다. 분쇄된 시료는 물에 헹군 뒤 -70℃에 보관하였다. 동결(frozen)된 주름 미더덕을 가수분해 전에 그라인더 내에서 동결건조 및 균질화하였다. 상업적으로 사용된 식품용 단백질 가수분해 효소인 프로타멕스, 코지자임 500 MG, 뉴트라제 0.8L, 플라보자임 500 MG, 알칼라제 2.4L FG는 Novo Co.(Novozyme Nordisk, Bagasvaerd, Denmark)에서 구입하였다.
펩신, 트립신, 알파-카이모트립신, 파파인, 토끼 간 유래의 안지오텐신 I-전환효소, 이의 기질 HHL(N-Hippuryl-His-Leu tetrahydrate)은 Sigma Chemical Co(St. Louis, Mo, USA)에서 구입하였다. 다른 화학약품 및 시약은 분석용 등급을 사용하였다.
2. 건조된 주름 미더덕의 화학적 조성
건조된 주름 미더덕의 화학적 조성은 AOCA법(1990, Official methods of analysis, 16th edn. Associathon of Official Analytical Chemists, Virginia)에 따라 결정하였다. 조 탄수화물(crude carbohydrate)은 페놀-황산법(phenol-sulfuric acid reaction)(480nm의 흡광도에서 글루코즈 표준 계산 법을 이용하여)에 의하여 정하였다. 조 지방(crude lipid)은 속실렛(Soxhlet) 추출법을 시행하였고, 조회분(crude ash)은 건조한 타입의 용광로 550℃에서 제조되었다. 수분량은 105℃의 건조한 오븐에서 24시간 동안 유지하며 측정하였고, 조 단백질은 킬달법(kjeldahl)으로 분석하였다.
3. 오만둥이 효소적 가수분해물의 제조
주름 미더덕으로부터 안지오텐신 I-전환 효소(ACE)의 저해능을 갖는 펩타이드를 얻기 위하여, 효소적 가수분해는 여러 상업적 단백질 가수분해제를 사용하여 수행되었다. 단백질 가수분해제는 프로타멕스, 코지자임, 플라보자임, 알칼라제, 펩신, 트립신, 알파-카이모트립신, 파파인을 사용하여 최적의 상태에서 24시간 수행하였다. 오만둥이 건조 분말 1g을 완충액 100ml으로 균질화하였고, 그 후 효소 10mg(또는 10ul)을 첨가하였다. 균질화된 현탁액의 pH는 가수분해 효소 처리 직전 각각 최적의 pH값으로 조정하였다. 효소반응은 가수분해효소의 최적 활성 수위가 되도록 24시간 동안 수행하였다. 효소반응이 끝난 후, 효소를 불활성화시키기 위해서 가수분해물을 100℃에서 10분간 중탕시켰다. 각각의 효소 가수분해물의 잔사를 제거하기 위하여 4℃ 에서 3500rpm으로 20분 동안 원심 분리하여 제거하였다. 효소 가수분해물의 수율은 건조된 가수분해물의 1g로부터 잔사의 건조된 무게를 제거함으로써 측정하였고 백분율로 나타내었다. 효소 가수분해물의 안지오텐신 I-전환효소 저해활성을 시험하기 위하여 측정된 효소 가수분해물 모두에서, 오만둥이로부터 하나의 효소 가수분해물은 <5 kDa(5 kDa 이하), 5-10 kDa 및 >10 kDa(10 kDa 이상)의 분자량을 갖는 펩타이드를 수득하기 위해서 분자량 분획을 실시하였다. 효소 가수분해물은 4℃에서 Millipore's Labscale TFF 시스템(Millipore Corporation, Bedford, Massachusetts, USA)을 사용하여 한외여과(ultra-filtration membranes; 5 및 10 kDa의 분자량 cut-off)하였다. 분자량(>10, 5-10, 및 <5 kDa)에 따라 수집하여 분획한 결과물을 감압 하에 동결건조하고 사용을 위해서 -20℃에 저장하였다. 모든 가수분해물 및 분자량 분획물은 이후 실험을 위해서 -20℃로 유지하였다.
4. 안지오텐신 I-전환효소 저해활성 펩타이드의 정제
한외여과를 통하여 가장 활성이 뛰어난 분획을 다시 여과하고, 겔여과 크로마토그래피(2.5 X 75 cm, saturated in Sephadex G-25 resin)로 용출하였다. 유속은 1.5ml/min, 용출 피크는 215nm로 모니터링하였다. 분획 5분 간격으로 수집 하였고, 안지오텐신 I-전환효소 저해활성을 보이는 분획을 수집하여 감압 하에 동결 건조하였다.
안지오텐신 I-전환효소 저해활성이 가장 높은 분획을 증류수에 용해시키고 RP- HPLC를 수행하였다(reversed-phase high-performance liquid chromatography, a symmetry Grom-sil 120 ODS-5 ST (C18, 5 μm, 10 X 250 mm, Alltech, Deerfield, USA)). RP- HPLC에 있어서, 이동상은 증류수(v/v) 내의 0.1% TFA(trifluoroacetic acid)를 구성하는 eluant A 및 아세토니트릴 내의 0.1% TFA(trifluoroacetic acid)를 구성하는 eluent B를 사용하였다. 분리는 1 mL/min의 유속에서 0 내지 25% eluent B의 선형으로 수행되었다. 용리액(eluent)의 UV흡광도는 215nm였다.
검출된 모든 피크는 수집되었고, 안지오텐신 I-전환효소 저해활성이 가장 우수한 피크를 수집하여, 감압 하에 동결 건조하였다. 분석용 컬럼으로부터 활성 분획은 1 ml/min의 유속에서 0.1%의 TFA를 포함하는 아세트니트릴의 선형(50분에서 20% v/v)을 갖는 YMC-Pack ODS-A column(C18, 5 μm, 4.6 ⅹ 250 mm, YMC, Kyoto, Japan)로 적용하였다. 최종적으로 정제된 펩타이드의 아미노산 서열을 분석하였다.
5. 분자량 및 아미노산 서열의 결정
오만둥이로부터 정제된 펩타이드의 분자량 및 아미노산 서열을 Q-TOF mass spectrometer (Micromass, Altrincham, UK)electrospray ionization (ESI)을 사용하여 측정하였다. 메탄올 및 물의 혼합 용매(1:1, v/v)에 용해된 정제된 펩타이드는 ESI 소스(source) 내로 주입하였고, 분자량은 질량스펙트럼 내의 이중 차지로 된 (M+2H)2+의 상태로 분석하였다. 다음의 분자량 결정은, 파쇄 및 서열 정보를 위해서 자동적으로 선택된 펩타이드는 tandem MS 분석에 의해 얻어졌다.
6. 안지오텐신 I-전환효소 저해 활성의 결정
안지오텐신 I-전환효소 저해 활성 분석은 약간 수정된 Cushman & Cheung 방법(Cushman DW, Cheung HS(1971), Spectrophotometric assy and properties of the angiotensin-converting enzyme of rabbit lung. Biochem Pharmacol 20:1637-1648)에 따라서 수행하였다. 각 분석은 안지오텐신 I-전환효소 용액(25mU/ml)의 50ul와 가수분해 용액의 50ul 를 37℃에서 30분 동안 전 배양하였고, 그 후, 37℃에서 60분 동안 100ul 의 기질(pH8.3에서 500mM NaCl를 포함하는 50mM의 소듐보레이트버퍼 내의 25mM hippuryl-His-Leu)로 배양하였다. 반응은 250ul의 1N HCl을 추가하여 중단시켰다. Hippuric acid는 500ul 에틸 아세테이트의 500ul로 추출되었다. 추출된 Hippuric acid를 200ul 분취하여 80℃ 건조 오븐에서 증발시켜 제거하였다. 1 ml의 증류수 내에서 잔기는 용해되었고 이의 UV 스펙트라 밀도를 228nm에서 측정하였다. IC50 값은 ACE 저해 활성의 50%를 저해하기 위해서 요구되는 저해 농도를 의미한다.
7. 안지오텐신 I-전환효소의 저해 패턴의 결정
안지오텐신 I-전환효소에 대한 정제된 펩타이드의 저해 메커니즘을 명확히 하기 위해서 정제된 펩타이드의 다양한 농도를 본 실험의 Kim et al 방법(Kim SK, Byun HG, Park PJ, Shahidi F(2001), J Agr Food Chem 49: 2992-2997)에 따라 각 반응물에 첨가하였다. 효소 활성을 기질의 다른 농도로 측정하였다. 저해제에 존재하는 ACE 저해 패턴은 Lineweaver burk plot에 의하여 얻어졌다.
8. 통계 분석
모든 데이터는 3번의 mean ± standard 편차로서 표현되었다. Mean의 값의 통계적 비교는 ANOVA 분석에 의해 실행되었고, SPSS 소프트웨어를 사용하여 Duncan's 다중 레인지 테스트에 의해 뒤따랐다.
< 실시예 2> 결과 분석
1. 화학적 구성성분의 근사값
오만둥이의 화학적 구성성분의 근사값은 표 1과 같다.
Figure 112012065130710-pat00001
오만둥이의 주요 화학적 구성성분은 탄수화물과 단백질, 각각 총 건조된 무게의 42.5% 및 36.17%로 이루어져있다. 오만둥이의 수분, 회분(ash) 및 지질의 함량은 6.30%, 9.72%, 및 5.24%였다.
2. 오만둥이의 가수분해물 및 이의 ACE 저해활성
ACE 저해활성을 나타내는 펩타이드를 얻기 위하여 9가지의 가수분해효소(프로타멕스(Protamex), 코지자임(Kojizyme), 뉴트라제(Neutrase), 플라보자임(Flavourzyme), 알칼라제(Alcalase), 트립신(trypsin), 알파- 카이모트립신(α-chymotrypsin), 펩신(pepsin) 및 파파인(papain))를 이용하여 주름 미더덕을 가수분해 하였다. 가수분해 수율은 뉴트라제, 알파- 카이모트립신, 프로타멕스 및 알칼라제 각각에 있어서, 36.8, 34.3, 29.7 및 29.3%로 관찰되었다(표 2). ACE 저해활성(표 2)에 있어서, 가장 높은 IC50 값은 1.171mg/ml에서 프로타멕스-단백질 분해의 가수분해물이었다.
Figure 112012065130710-pat00002
가수분해 단백질의 분자량은 원하는 기능적 물질을 갖는 단백질 가수분해물을 생성함에 있어 중요한 요소이다. 가수분해물은 <5, 5-10, >10 kDa의 분자량을 갖는 개별적 분획으로 나뉘는 UF 시스템을 갖는 것으로 분획되었다. 안지오텐신 I-전환효소 저해활성(표 3)에 있어서, 가장 높은 IC50 값은 0.828 mg/ml에서 <5kDa 분획에 의해 나타났다.
Figure 112012065130710-pat00003
생리활성(bioactive)을 갖는 펩타이드는 대개 3 내지 20 개의 아미노산 잔기를 포함하고, 낮은 분자량 펩타이드는 생리활성이 더욱 우수하다. 따라서, 안지오텐신 I-전환효소 저해활성의 정제를 위하여 <5kDa 분획을 선택하였다.
3. 안지오텐신 I-전환효소 저해 펩타이드의 정제
<5kDa 분획은 안지오텐신 I-전환효소 활성에 대하여 가장 우수한 저해를 보였다. <5kDa 분획으로부터 안지오텐신 I-전환효소 저해 펩타이드를 분리하기 위하여 Sephadex G-25 컬럼에서 겔여과 크로마토그래피를 수행하였고, F1 내지 F4의 피크(도 1b)를 얻기 위해서 flow-through 분획을 모았다. F2 분획은 0.390mg/ml에서 가장 우수한 안지오텐신 I-전환효소 저해 활성을 나타내었다(도 1a). 이 분획은 ODS 분취용 컬럼을 사용하여 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)로 더 분리하여 3개의 분획을 더 얻었다(도 2b, F2-1~F2-3). 서브 F2-2분획은 가장 우수한 안지오텐신 I-전환효소 저해 활성을 나타내었고, 다음의 피크, F2-2는 ODS 분석용 컬럼을 사용하여 추가적으로 분리되었다. 최종적으로, 오만둥이의 가수분해물(도 3b)로부터의 4 개의 피크(A-D)는 정제되었다. 피크 A는 0.014mg/ml의 IC50의 값을 갖는 가장 높은 안지오텐신 I-전환효소 저해 활성을 갖는다(도 3a). 표 4에 오만둥이로부터 획득한 안지오텐신 I-전환효소 저해활성 펩타이드의 정제 결과를 요약하였다.
Figure 112012065130710-pat00004
ACE 저해제는 3단계의 정제 단계를 거쳐, 오만둥이(1.171mg/ml) 효소적 가수분해물로부터 83.64 fold에서 정제하였다.
4. 정제된 ACE 저해 펩타이드의 아미노산 서열 및 저해 패턴
아미노산 서열은 MS/MS를 사용하여 동정하였고, IC50 값은 24.7uM, 분자량은 566.4Da 및 Met-Leu-Leu-Cys-Ser으로 이루어진 penta 펩타이드로 증명되었다(도 4). ACE 저해 펩타이드의 구성성분과 아미노산 서열은 활성 레벨에 중요한 요소이다. 오만둥이로부터의 안지오텐신 I-전환효소 저해 펩타이드를 함유한 메티오닌, 루신, 세린과 같은 아미노산은 많은 다른 안지오텐신 I-전환효소 저해 펩타이드에서 발견되었다.
다른 안지오텐신 I-전환효소 저해 펩타이드 사이의 구조적 활성 관계는 안지오텐신 I-전환효소 에 대한 바인딩 활성은 기질의 카르복실기 말단 트리펩타이드 서열에 의해 강하게 영향을 받는 것으로 보고되었다. 따라서, 그 부위에서 소수성 아미노산을 포함하는 펩타이드는 강한 안지오텐신 I-전환효소 활성이 있다.
그러므로, 그 위치에 있는 소수성 아미노산인 본 발명의 펩타이드는 강한 저해활성을 나타냄을 알 수 있다. 3 개의 서브-사이트, S1(antepenultimate, 뒤에서 셋째 부위), S’1(penutimate), S’2(ultimate), 기질의 또는 저해제의 바인딩을 위한 공유되지 않은 명백한 특성을 갖는 것은 두 개의 상동의 활성부위에 위치한다. 억제제-효소 바인딩 및 상호작용을 위해서, 다른 아미노산 서열을 갖는 효소의 활성 부위에 있는 세 개의 주요 서브-사이트는 기질과 결합하여야 한다. 효소에 대한 억제제 또는 자연적 기질의 바인딩은 카르복시 말단 트리펩타이드 잔기를 통해서 현저하게 발생한다. 트립토판, 트로신, 프롤린 및 페닐알라닌과 같은 아미노산을 함유하고 있는 저해제의 카르복시 말단 아미노산 잔기는 안지오텐신 I-전환효소 억제를 위해서 가장 바람직하다고 알려졌다. 더욱 자세하게, 방향족 아미노산 및 프롤린은 뒤에서 셋째의 부위(S1)에 좋은 것으로 알려졌다. 또한, Ala, Val, 및 Leu는 동일한 부위를 위해서 바람직하다. Ile는 penultimate 부위(S'1)를 위해서 가장 바람직하다. 기질 서열 내의 Pro 및 Leu는 효소에 친화도를 발휘하는 것에 관해서 최고의 부위(S'2)를 위해서 가장 바람직하다. 분획 A 서열은 효소의 S1 부위에 바인드하기 위해서 아미노산으로서 Leu의 바람직한 부위를 반영하는 것으로 보인다.
정제된 펩타이드의 ACE 저해 패턴은 Lineweaver-Burk plots를 사용하여 측정되었고 안지오텐신 I-전환효소의 (경쟁적) 활성부위 및 (비-경쟁적) 알로스테릭 활성부의에 결합할 수 있는 혼합된-타입의 저해 패턴(도 5)을 나타낸다. 이런 저해 패턴 타입은 hard clam 가수분해물과 유사하다. 이것은 정제된 펩타이드는 이의 유리의 및 HHL-결합된 형태 모두의 안지오텐신 I-전환효소 바인딩활성에 의해 그들의 활성이 가능하도록 나타낸다. 이것은 또한 펩타이드는 HHL 바인딩 사이트와 다르게 다른 사이트에서 안지오텐신 I-전환효소와 결합할 수 있음을 의미하고, 이는 활성의 손실의 결과를 나타내는 활성 부위의 구조에 영향을 줄 수 있다.

Claims (6)

  1. 삭제
  2. 오만둥이(Styela plicata)의 단백질 가수분해물 유래의 펩타이드를 포함하는 고혈압 치료용 약학적 조성물로, 상기 가수분해물의 단백질 분해효소는 프로타멕스(Protamex)이고, 상기 펩타이드는 Met-Leu-Leu-Cys-Ser의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 고혈압 치료용 약학적 조성물.
  3. 삭제
  4. 제2항에 있어서, 상기 펩타이드는 안지오텐신 I-전환효소의 활성을 저해하는 것을 특징으로 하는 고혈압 치료용 약학적 조성물.
  5. 삭제
  6. 제2항에 있어서, 상기 펩타이드는 안지오텐신 I-전환효소 활성 저해 효과 범위가 0.01~2.5 mg/ml인 것을 특징으로 하는 고혈압 치료용 약학적 조성물.
KR1020120088932A 2012-08-14 2012-08-14 오만둥이 유래의 혈압조절용 조성물 KR101386833B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120088932A KR101386833B1 (ko) 2012-08-14 2012-08-14 오만둥이 유래의 혈압조절용 조성물

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120088932A KR101386833B1 (ko) 2012-08-14 2012-08-14 오만둥이 유래의 혈압조절용 조성물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20140022617A KR20140022617A (ko) 2014-02-25
KR101386833B1 true KR101386833B1 (ko) 2014-04-17

Family

ID=50268499

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020120088932A KR101386833B1 (ko) 2012-08-14 2012-08-14 오만둥이 유래의 혈압조절용 조성물

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101386833B1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160096357A (ko) * 2015-02-05 2016-08-16 대구가톨릭대학교산학협력단 오만둥이 다당류 정제물을 유효성분으로 함유하는 골 관련 질환의 예방 또는 개선용 조성물

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114569699B (zh) * 2022-03-18 2022-10-28 山东大学齐鲁医院(青岛) 一种用于血管内皮细胞衰老的药物制剂

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Purification and Characterization of Angiotensin I Converting Enzyme Inhibitory Peptide from Enzymatic Digests of Styela plicata, 제주대학교 대학원 석사학위 논문(2009년2월) *
Purification and Characterization of Angiotensin I Converting Enzyme Inhibitory Peptide from Enzymatic Digests of Styela plicata, 제주대학교 대학원 석사학위 논문(2009년2월)*

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160096357A (ko) * 2015-02-05 2016-08-16 대구가톨릭대학교산학협력단 오만둥이 다당류 정제물을 유효성분으로 함유하는 골 관련 질환의 예방 또는 개선용 조성물
KR101715591B1 (ko) 2015-02-05 2017-03-14 대구가톨릭대학교산학협력단 오만둥이 다당류 정제물을 유효성분으로 함유하는 골 관련 질환의 예방 또는 개선용 조성물

Also Published As

Publication number Publication date
KR20140022617A (ko) 2014-02-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Mirzaei et al. Production of antioxidant and ACE-inhibitory peptides from Kluyveromyces marxianus protein hydrolysates: Purification and molecular docking
Torres-Fuentes et al. Identification and characterization of antioxidant peptides from chickpea protein hydrolysates
Lee et al. Tyr-Pro-Lys, an angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptide derived from broccoli (Brassica oleracea Italica)
Girgih et al. Structural and functional characterization of hemp seed (Cannabis sativa L.) protein-derived antioxidant and antihypertensive peptides
Ko et al. A novel angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitory peptide from a marine Chlorella ellipsoidea and its antihypertensive effect in spontaneously hypertensive rats
Wu et al. A novel angiotensin-І converting enzyme (ACE) inhibitory peptide from gastrointestinal protease hydrolysate of silkworm pupa (Bombyx mori) protein: biochemical characterization and molecular docking study
Asoodeh et al. Biochemical characterization of a novel antioxidant and angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptide from Struthio camelus egg white protein hydrolysis
Sheih et al. Isolation and characterisation of a novel angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitory peptide from the algae protein waste
Miguel et al. Angiotensin I–converting enzyme inhibitory activity of peptides derived from egg white proteins by enzymatic hydrolysis
Pan et al. Studies on purification and the molecular mechanism of a novel ACE inhibitory peptide from whey protein hydrolysate
Rawendra et al. A novel angiotensin converting enzyme inhibitory peptide derived from proteolytic digest of Chinese soft-shelled turtle egg white proteins
Vásquez-Villanueva et al. Revalorization of a peach (Prunus persica (L.) Batsch) byproduct: Extraction and characterization of ACE-inhibitory peptides from peach stones
Shahidi et al. Bioactive peptides
Fan et al. Identification and characterization of gastrointestinal-resistant angiotensin-converting enzyme inhibitory peptides from egg white proteins
Di Pierro et al. Antioxidant activity of bovine casein hydrolysates produced by Ficus carica L.-derived proteinase
Beermann et al. Anti-oxidative capacity of enzymatically released peptides from soybean protein isolate
Toopcham et al. Characterization and identification of angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitory peptides derived from tilapia using Virgibacillus halodenitrificans SK1-3-7 proteinases
Mirzapour et al. Identification of potent ACE inhibitory peptides from wild almond proteins
Wu et al. Purification of angiotensin I-converting enzyme-inhibitory peptides from the enzymatic hydrolysate of defatted canola meal
Ko et al. Purification and characterization of angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptide from enzymatic hydrolysates of Styela clava flesh tissue
Ko et al. Effect of angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitory peptide purified from enzymatic hydrolysates of Styela plicata
Sierra et al. Antioxidant peptides derived from hydrolysates of red tilapia (Oreochromis sp.) scale
Rao et al. Purification and characterization of angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides from enzymatic hydrolysate of hen egg white lysozyme
Ko et al. Purification and molecular docking study of angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitory peptides from hydrolysates of marine sponge Stylotella aurantium
Zhu et al. Production and characterization of angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitory peptides from apricot (Prunus armeniaca L.) kernel protein hydrolysate

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170407

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190327

Year of fee payment: 6