CN112189673A - 粘质沙雷氏菌和桔橙链霉菌cgmcc4.6285的组合在制备生物农药中的应用 - Google Patents

粘质沙雷氏菌和桔橙链霉菌cgmcc4.6285的组合在制备生物农药中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及粘质沙雷氏菌和桔橙链霉菌CGMCC4.6285的组合在制备生物农药中的应用，首次将粘质沙雷氏菌和桔橙链霉菌CGMCC4.6285组合制成生物农药，对多种虫害具有良好的防治效果，具有广泛适用性。该生物农药为固体，运输储存方便，可分散于水中进行喷洒使用，使用方便。

Description

粘质沙雷氏菌和桔橙链霉菌CGMCC4.6285的组合在制备生物 农药中的应用
技术领域
本发明属于生物农药技术领域，涉及粘质沙雷氏菌和桔橙链霉菌CGMCC4.6285的组合在制备生物农药中的应用。
背景技术
植物病害是威胁农作物生产的自然灾害之一，现有技术的杀虫杀菌多为化学农药，其药效低，残毒期长，严重影响作物生长环境和人畜健康。农药一旦进入环境，其毒性、高残留特性便会发生效应，造成严重的大气、水体及土壤的污染，从而给人类健康带来危害。当有毒农药施用在农作物、蔬菜和果树上时，残留在作物表面上的农药，由于脂溶性强，很容易渗入作物表皮的蜡质层，以致很难完全清洗掉。
大量农药挥发到空气中、流入水体中、沉降聚集在土壤中，污染农畜渔果产品，并通过食物链的富集作用转移到人体内，对人体产生危害。高效剧毒的农药，毒性大，且在环境中残留的时间长，当人畜食用了含有残留农药的食物时，就会造成积累性中毒。这类危害往往要经过较长时间的积累才显示出症状，它又是通过食物链的富集作用，最后才进入人体，不易及时发现，危害严重。
随着生活水平的提高和环保意识的增强，人们越来越重视食品安全问题，生物农药因其不污染环境、对人和动植物安全、选择性强、病原菌和害虫难以产生耐药性等诸多优点受到各国的高度重视，是今后农药发展的主要方向。
生物农药是利用微生物或其代谢产物来防治危害农作物的病、虫、草、鼠害及促进作物生长。它包括以菌治虫、以菌治菌、以菌除草等。这类农药具有选择性强，对人、畜、农作物和自然环境安全，不伤害天敌，不易产生抗性等特点。目前市场上常见的生物农药包括细菌、真菌、病毒或其代谢物，例如苏云金杆菌、白僵菌、核多角体病毒、井冈霉素、C型肉毒梭菌外毒素等。
生物农药与化学农药相比，其有效成分来源，工业化生产途径，产品的杀虫防病机理和作用方式等诸多方面，有着许多本质的区别。生物农药更适合于扩大在未来有害生物综合治理策略中的应用比重。但是市场上现有的生物农药通常只对特定害虫或病菌等起作用，不具有广泛适用性。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供粘质沙雷氏菌和桔橙链霉菌CGMCC4.6285的组合在制备生物农药中的应用，对多种虫害具有良好的防治效果，具有广泛适用性。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、粘质沙雷氏菌和桔橙链霉菌(Streptomyces aurantiacus)CGMCC4.6285的组合在制备生物农药中的应用在制备生物农药中的应用，其中，粘质沙雷氏菌为ATCC14041，购自上海北诺生物科技有限公司，桔橙链霉菌CGMCC4.6285是由河北大学于2008年9月3日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。
优选的，所述生物农药用于杀虫，进一步优选为蚧壳虫、棉铃虫、茶黄螨、小地老虎、茄黄斑螟。
2、一种生物农药，其有效成分为粘质沙雷氏菌和桔橙链霉菌(Streptomycesaurantiacus)CGMCC4.6285的组合。
3、上述一种生物农药的制备方法，具体步骤如下：
(1)先将粘质沙雷氏菌培养得到发酵液Ⅰ，后处理，制成菌粉；将桔橙链霉菌CGMCC4.6285培养得到含有厚垣孢子的发酵液Ⅱ，备用；
(2)再将新鲜黄秋葵压榨得到黄秋葵汁，接着边搅拌边将步骤(1)所得菌粉加入黄秋葵汁中，搅拌分散均匀，得到混合物A；
(3)然后边搅拌边将混合物A、麦麸依次加入步骤(1)所得发酵液Ⅱ中，投料完毕后静置30～40分钟，干燥制成混合物B，最后将混合物B与羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、淀粉和可溶性淀粉混合均匀，挤压造粒，即得所述的一种生物农药。
优选的，步骤(1)中，菌粉的制备方法如下：先将粘质沙雷氏菌活化后接种于种子培养基中，28～32℃培养12～18小时，得菌株种子液；然后取菌株种子液接种于发酵培养基中，28～32℃、180～200rpm/min振荡发酵培养，离心，收集上清液，即为发酵液Ⅰ，后处理，制成菌粉。
进一步优选的，利用LB培养基进行活化处理，具体方法是：将粘质沙雷氏菌从保藏菌种的试管斜面中取出转移至LB培养基上，接种量为体积百分数2～3％，28℃恒温箱中倒置培养24～72小时即可；菌株种子液在发酵培养基中的接种量为体积百分数4～6％。
进一步优选的，种子培养基的配方为：胰蛋白胨8～12g，酪蛋白胨8～10g，可溶性淀粉6～9g，6波美麦芽汁400～500mL，海水晶3～5g，醋酸铵2～4g，FeSO4 0.2～0.3g，CaCl23～4g，蒸馏水900～1100mL，pH＝6.8～7.2，121℃灭菌20～30分钟；发酵培养基的配方为：酵母浸膏4～6g，蔗糖0.4～0.5g，MgSO4·7H2O 5～8g，NaNO3 5～8g，KCl 8～12g，蒸馏水900～1100mL，pH＝6.8～7.2，121℃灭菌20～30分钟。
进一步优选的，发酵培养为通气培养，其空气通量为10～12L/min。
进一步优选的，后处理的具体方法为：先利用磷酸氢二钠和氯化钙絮凝发酵液，两者的加入量分别为发酵液Ⅰ重量的1～2％和0.5～0.8％；然后采用板框压滤，接着45～50℃干燥至含水量20～30％，旋风分离后利用粉碎机粉碎，过30目筛，即得所述菌粉。
优选的，步骤(1)中，发酵液Ⅱ的制备方法如下：先将桔橙链霉菌CGMCC4.6285接种于PDA培养基，27～29℃培养6～7天，产生分生孢子，然后用接种环将分生孢子转移到含无菌水的试管中，搅拌使得分生孢子从菌丝上分散下来，用无菌纱布过滤除去菌丝，将孢子浓度调节至106～107cfu/mL，按照1～2％接种量(体积)接种到液体培养基中，27～29℃发酵培养2～3天，即得含有厚垣孢子的发酵液Ⅱ。
进一步优选的，所述PDA培养基的配方为：土豆195～200g，葡萄糖10～12g，琼脂18～20g，Na2HPO4 4～6g，蒸馏水1000g，pH为7.0～7.6；所述液体培养基的配方为：麦麸5～6g，可溶性淀粉20～25g，硫酸铵2～3g，碳酸钙1～1.5g，磷酸氢二钾1～1.5g，蒸馏水1000g。
优选的，步骤(2)中，菌粉与黄秋葵汁的质量比为1：2～3，所述黄秋葵汁的制备方法如下：先将新鲜黄秋葵洗净后进行压榨，然后利用匀质机充分滚压，直至无团粒胶状物即可。
优选的，步骤(3)中，干燥的工艺条件为：35～37℃干燥8～12小时。
优选的，步骤(3)中，混合物A、麦麸、发酵液Ⅱ的质量比为1：6～9：5～8；混合物B与羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、淀粉和可溶性淀粉的质量比为10：0.05～0.07：0.4～0.6：0.6～0.8：0.6～0.8。
本发明的有益效果在于：
本发明首次将粘质沙雷氏菌和桔橙链霉菌(Streptomyces aurantiacus)CGMCC4.6285组合制成生物农药，对多种虫害具有良好的防治效果，具有广泛适用性。
在制备生物农药时，先将粘质沙雷氏菌培养得到发酵液Ⅰ，后处理，制成菌粉；将桔橙链霉菌CGMCC4.6285培养得到含有厚垣孢子的发酵液Ⅱ；再将新鲜黄秋葵压榨得到黄秋葵汁，接着边搅拌边将菌粉加入黄秋葵汁中，搅拌分散均匀，得到混合物A；然后边搅拌边将混合物A、麦麸依次加入发酵液Ⅱ中，投料完毕后静置30～40分钟，干燥制成混合物B，最后将混合物B与羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、淀粉和可溶性淀粉混合均匀，挤压造粒即得。该生物农药为固体，运输储存方便，可分散于水中进行喷洒使用，使用方便。
该生物农药的有效成分粘质沙雷氏菌和桔橙链霉菌CGMCC4.6285协同提高杀虫效果，对蚧壳虫、棉铃虫、茶黄螨、小地老虎、茄黄斑螟等具有良好的杀灭效果。这可能是因为粘质沙雷氏菌的活菌体、代谢产物等，桔橙链霉菌CGMCC4.6285的厚垣孢子、代谢产物等协同提高对各种虫害的杀灭。
另外，在制备生物农药过程中还引入了黄秋葵汁和麦麸，前者中含有丰富的多糖，麦麸具有吸附作用，使得生物农药具有一定黏性，有利于生物农药与作物尽量长时间接触，也有助于捕获杀灭害虫，增强灭虫效果。
具体实施方式
下面将对本发明的优选实施例进行详细的描述。
实施例1：
一种生物农药的制备方法，具体步骤如下：
(1)先将粘质沙雷氏菌ATCC14041培养得到发酵液Ⅰ，后处理，制成菌粉；将桔橙链霉菌CGMCC4.6285培养得到含有厚垣孢子的发酵液Ⅱ，备用；
(2)再将新鲜黄秋葵压榨得到黄秋葵汁，接着边搅拌边将步骤(1)所得菌粉加入黄秋葵汁中，搅拌分散均匀，得到混合物A；
(3)然后边搅拌边将混合物A、麦麸依次加入步骤(1)所得发酵液Ⅱ中，投料完毕后静置30分钟，干燥制成混合物B，最后将混合物B与羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、淀粉和可溶性淀粉混合均匀，挤压造粒，即得所述的一种生物农药。
步骤(1)中，菌粉的制备方法如下：先将粘质沙雷氏菌活化后接种于种子培养基中，28℃培养18小时，得菌株种子液；然后取菌株种子液接种于发酵培养基中，28℃、200rpm/min振荡发酵培养，离心，收集上清液，即为发酵液Ⅰ，后处理，制成菌粉。
利用LB培养基进行活化处理，具体方法是：将粘质沙雷氏菌从保藏菌种的试管斜面中取出转移至LB培养基上，接种量为体积百分数2％，28℃恒温箱中倒置培养72小时即可；菌株种子液在发酵培养基中的接种量为体积百分数4％。
种子培养基的配方为：胰蛋白胨12g，酪蛋白胨8g，可溶性淀粉9g，6波美麦芽汁400mL，海水晶5g，醋酸铵2g，FeSO4 0.3g，CaCl2 3g，蒸馏水1100mL，pH＝6.8，121℃灭菌30分钟；发酵培养基的配方为：酵母浸膏4g，蔗糖0.5g，MgSO4·7H2O 5g，NaNO3 8g，KCl 8g，蒸馏水1100mL，pH＝6.8，121℃灭菌30分钟。
发酵培养为通气培养，其空气通量为10L/min。
后处理的具体方法为：先利用磷酸氢二钠和氯化钙絮凝发酵液，两者的加入量分别为发酵液Ⅰ重量的2％和0.5％；然后采用板框压滤，接着50℃干燥至含水量20％，旋风分离后利用粉碎机粉碎，过30目筛，即得所述菌粉。
步骤(1)中，发酵液Ⅱ的制备方法如下：先将桔橙链霉菌CGMCC4.6285接种于PDA培养基，29℃培养6天，产生分生孢子，然后用接种环将分生孢子转移到含无菌水的试管中，搅拌使得分生孢子从菌丝上分散下来，用无菌纱布过滤除去菌丝，将孢子浓度调节至107cfu/mL，按照1％接种量(体积)接种到液体培养基中，29℃发酵培养2天，即得含有厚垣孢子的发酵液Ⅱ。
所述PDA培养基的配方为：土豆200g，葡萄糖10g，琼脂20g，Na2HPO4 4g，蒸馏水1000g，pH为7.6；所述液体培养基的配方为：麦麸5g，可溶性淀粉25g，硫酸铵2g，碳酸钙1.5g，磷酸氢二钾1g，蒸馏水1000g。
步骤(2)中，菌粉与黄秋葵汁的质量比为1：3，所述黄秋葵汁的制备方法如下：先将新鲜黄秋葵洗净后进行压榨，然后利用匀质机充分滚压，直至无团粒胶状物即可。
步骤(3)中，干燥的工艺条件为：35℃干燥12小时。
步骤(3)中，混合物A、麦麸、发酵液Ⅱ的质量比为1：6：8；混合物B与羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、淀粉和可溶性淀粉的质量比为10：0.05：0.6：0.6：0.8。
实施例2：
一种生物农药的制备方法，具体步骤如下：
(1)先将粘质沙雷氏菌ATCC14041培养得到发酵液Ⅰ，后处理，制成菌粉；将桔橙链霉菌CGMCC4.6285培养得到含有厚垣孢子的发酵液Ⅱ，备用；
(2)再将新鲜黄秋葵压榨得到黄秋葵汁，接着边搅拌边将步骤(1)所得菌粉加入黄秋葵汁中，搅拌分散均匀，得到混合物A；
(3)然后边搅拌边将混合物A、麦麸依次加入步骤(1)所得发酵液Ⅱ中，投料完毕后静置40分钟，干燥制成混合物B，最后将混合物B与羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、淀粉和可溶性淀粉混合均匀，挤压造粒，即得所述的一种生物农药。
步骤(1)中，菌粉的制备方法如下：先将粘质沙雷氏菌活化后接种于种子培养基中，32℃培养12小时，得菌株种子液；然后取菌株种子液接种于发酵培养基中，32℃、180rpm/min振荡发酵培养，离心，收集上清液，即为发酵液Ⅰ，后处理，制成菌粉。
利用LB培养基进行活化处理，具体方法是：将粘质沙雷氏菌从保藏菌种的试管斜面中取出转移至LB培养基上，接种量为体积百分数3％，28℃恒温箱中倒置培养24小时即可；菌株种子液在发酵培养基中的接种量为体积百分数6％。
种子培养基的配方为：胰蛋白胨8g，酪蛋白胨10g，可溶性淀粉6g，6波美麦芽汁500mL，海水晶3g，醋酸铵4g，FeSO4 0.2g，CaCl2 4g，蒸馏水900mL，pH＝7.2，121℃灭菌20分钟；发酵培养基的配方为：酵母浸膏6g，蔗糖0.4g，MgSO4·7H2O 8g，NaNO3 5g，KCl 12g，蒸馏水900mL，pH＝7.2，121℃灭菌20分钟。
发酵培养为通气培养，其空气通量为12L/min。
后处理的具体方法为：先利用磷酸氢二钠和氯化钙絮凝发酵液，两者的加入量分别为发酵液Ⅰ重量的1％和0.8％；然后采用板框压滤，接着45℃干燥至含水量30％，旋风分离后利用粉碎机粉碎，过30目筛，即得所述菌粉。
步骤(1)中，发酵液Ⅱ的制备方法如下：先将桔橙链霉菌CGMCC4.6285接种于PDA培养基，27℃培养7天，产生分生孢子，然后用接种环将分生孢子转移到含无菌水的试管中，搅拌使得分生孢子从菌丝上分散下来，用无菌纱布过滤除去菌丝，将孢子浓度调节至106cfu/mL，按照2％接种量(体积)接种到液体培养基中，27℃发酵培养3天，即得含有厚垣孢子的发酵液Ⅱ。
所述PDA培养基的配方为：土豆195g，葡萄糖12g，琼脂18g，Na2HPO4 6g，蒸馏水1000g，pH为7.0；所述液体培养基的配方为：麦麸6g，可溶性淀粉20g，硫酸铵3g，碳酸钙1g，磷酸氢二钾1.5g，蒸馏水1000g。
步骤(2)中，菌粉与黄秋葵汁的质量比为1：2，所述黄秋葵汁的制备方法如下：先将新鲜黄秋葵洗净后进行压榨，然后利用匀质机充分滚压，直至无团粒胶状物即可。
步骤(3)中，干燥的工艺条件为：37℃干燥8小时。
步骤(3)中，混合物A、麦麸、发酵液Ⅱ的质量比为1：9：5；混合物B与羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、淀粉和可溶性淀粉的质量比为10：0.07：0.4：0.8：0.6。
实施例3：
一种生物农药的制备方法，具体步骤如下：
(1)先将粘质沙雷氏菌ATCC14041培养得到发酵液Ⅰ，后处理，制成菌粉；将桔橙链霉菌CGMCC4.6285培养得到含有厚垣孢子的发酵液Ⅱ，备用；
(2)再将新鲜黄秋葵压榨得到黄秋葵汁，接着边搅拌边将步骤(1)所得菌粉加入黄秋葵汁中，搅拌分散均匀，得到混合物A；
(3)然后边搅拌边将混合物A、麦麸依次加入步骤(1)所得发酵液Ⅱ中，投料完毕后静置35分钟，干燥制成混合物B，最后将混合物B与羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、淀粉和可溶性淀粉混合均匀，挤压造粒，即得所述的一种生物农药。
步骤(1)中，菌粉的制备方法如下：先将粘质沙雷氏菌活化后接种于种子培养基中，30℃培养15小时，得菌株种子液；然后取菌株种子液接种于发酵培养基中，30℃、190rpm/min振荡发酵培养，离心，收集上清液，即为发酵液Ⅰ，后处理，制成菌粉。
利用LB培养基进行活化处理，具体方法是：将粘质沙雷氏菌从保藏菌种的试管斜面中取出转移至LB培养基上，接种量为体积百分数2.5％，28℃恒温箱中倒置培养36小时即可；菌株种子液在发酵培养基中的接种量为体积百分数5％。
种子培养基的配方为：胰蛋白胨10g，酪蛋白胨9g，可溶性淀粉8g，6波美麦芽汁450mL，海水晶4g，醋酸铵3g，FeSO4 0.25g，CaCl2 3.5g，蒸馏水1000mL，pH＝7，121℃灭菌25分钟；发酵培养基的配方为：酵母浸膏5g，蔗糖0.45g，MgSO4·7H2O 7g，NaNO3 6g，KCl 10g，蒸馏水1000mL，pH＝7，121℃灭菌25分钟。
发酵培养为通气培养，其空气通量为11L/min。
后处理的具体方法为：先利用磷酸氢二钠和氯化钙絮凝发酵液，两者的加入量分别为发酵液Ⅰ重量的1.5％和0.7％；然后采用板框压滤，接着48℃干燥至含水量25％，旋风分离后利用粉碎机粉碎，过30目筛，即得所述菌粉。
步骤(1)中，发酵液Ⅱ的制备方法如下：先将桔橙链霉菌CGMCC4.6285接种于PDA培养基，28℃培养6天，产生分生孢子，然后用接种环将分生孢子转移到含无菌水的试管中，搅拌使得分生孢子从菌丝上分散下来，用无菌纱布过滤除去菌丝，将孢子浓度调节至107cfu/mL，按照1.5％接种量(体积)接种到液体培养基中，28℃发酵培养3天，即得含有厚垣孢子的发酵液Ⅱ。
所述PDA培养基的配方为：土豆198g，葡萄糖11g，琼脂19g，Na2HPO4 5g，蒸馏水1000g，pH为7.3；所述液体培养基的配方为：麦麸5.5g，可溶性淀粉22g，硫酸铵2.5g，碳酸钙1.2g，磷酸氢二钾1.2g，蒸馏水1000g。
步骤(2)中，菌粉与黄秋葵汁的质量比为1：2.5，所述黄秋葵汁的制备方法如下：先将新鲜黄秋葵洗净后进行压榨，然后利用匀质机充分滚压，直至无团粒胶状物即可。
步骤(3)中，干燥的工艺条件为：36℃干燥10小时。
步骤(3)中，混合物A、麦麸、发酵液Ⅱ的质量比为1：8：7；混合物B与羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、淀粉和可溶性淀粉的质量比为10：0.06：0.5：0.7：0.7。
对比例1
一种生物农药的制备方法，具体步骤如下：
(1)先将桔橙链霉菌CGMCC4.6285培养得到含有厚垣孢子的发酵液Ⅱ，备用；
(2)再将新鲜黄秋葵压榨得到黄秋葵汁；
(3)然后边搅拌边将黄秋葵汁、麦麸依次加入步骤(1)所得发酵液Ⅱ中，投料完毕后静置30分钟，干燥制成混合物B，最后将混合物B与羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、淀粉和可溶性淀粉混合均匀，挤压造粒，即得所述的一种生物农药。
步骤(1)中，发酵液Ⅱ的制备方法如下：先将桔橙链霉菌CGMCC4.6285接种于PDA培养基，29℃培养6天，产生分生孢子，然后用接种环将分生孢子转移到含无菌水的试管中，搅拌使得分生孢子从菌丝上分散下来，用无菌纱布过滤除去菌丝，将孢子浓度调节至107cfu/mL，按照1％接种量(体积)接种到液体培养基中，29℃发酵培养2天，即得含有厚垣孢子的发酵液Ⅱ。
所述PDA培养基的配方为：土豆200g，葡萄糖10g，琼脂20g，Na2HPO4 4g，蒸馏水1000g，pH为7.6；所述液体培养基的配方为：麦麸5g，可溶性淀粉25g，硫酸铵2g，碳酸钙1.5g，磷酸氢二钾1g，蒸馏水1000g。
步骤(2)中，所述黄秋葵汁的制备方法如下：先将新鲜黄秋葵洗净后进行压榨，然后利用匀质机充分滚压，直至无团粒胶状物即可。
步骤(3)中，干燥的工艺条件为：35℃干燥12小时。
步骤(3)中，黄秋葵汁、麦麸、发酵液Ⅱ的质量比为1：6：8；混合物B与羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、淀粉和可溶性淀粉的质量比为10：0.05：0.6：0.6：0.8。
对比例2
一种生物农药的制备方法，具体步骤如下：
(1)先将粘质沙雷氏菌ATCC14041培养得到发酵液Ⅰ，后处理，制成菌粉，备用；
(2)再将新鲜黄秋葵压榨得到黄秋葵汁，接着边搅拌边将步骤(1)所得菌粉加入黄秋葵汁中，搅拌分散均匀，得到混合物A；
(3)然后边搅拌边将混合物A、麦麸均匀混合，静置30分钟，干燥制成混合物B，最后将混合物B与羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、淀粉和可溶性淀粉混合均匀，挤压造粒，即得所述的一种生物农药。
步骤(1)中，菌粉的制备方法如下：先将粘质沙雷氏菌活化后接种于种子培养基中，28℃培养18小时，得菌株种子液；然后取菌株种子液接种于发酵培养基中，28℃、200rpm/min振荡发酵培养，离心，收集上清液，即为发酵液Ⅰ，后处理，制成菌粉。
利用LB培养基进行活化处理，具体方法是：将粘质沙雷氏菌从保藏菌种的试管斜面中取出转移至LB培养基上，接种量为体积百分数2％，28℃恒温箱中倒置培养72小时即可；菌株种子液在发酵培养基中的接种量为体积百分数4％。
种子培养基的配方为：胰蛋白胨12g，酪蛋白胨8g，可溶性淀粉9g，6波美麦芽汁400mL，海水晶5g，醋酸铵2g，FeSO4 0.3g，CaCl2 3g，蒸馏水1100mL，pH＝6.8，121℃灭菌30分钟；发酵培养基的配方为：酵母浸膏4g，蔗糖0.5g，MgSO4·7H2O 5g，NaNO3 8g，KCl 8g，蒸馏水1100mL，pH＝6.8，121℃灭菌30分钟。
发酵培养为通气培养，其空气通量为10L/min。
后处理的具体方法为：先利用磷酸氢二钠和氯化钙絮凝发酵液，两者的加入量分别为发酵液Ⅰ重量的2％和0.5％；然后采用板框压滤，接着50℃干燥至含水量20％，旋风分离后利用粉碎机粉碎，过30目筛，即得所述菌粉。
步骤(2)中，菌粉与黄秋葵汁的质量比为1：3，所述黄秋葵汁的制备方法如下：先将新鲜黄秋葵洗净后进行压榨，然后利用匀质机充分滚压，直至无团粒胶状物即可。
步骤(3)中，干燥的工艺条件为：35℃干燥12小时。
步骤(3)中，混合物A、麦麸的质量比为1：6；混合物B与羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、淀粉和可溶性淀粉的质量比为10：0.05：0.6：0.6：0.8。
对比例3
一种生物农药的制备方法，具体步骤如下：
(1)先将粘质沙雷氏菌ATCC14041培养得到发酵液Ⅰ，后处理，制成菌粉；将桔橙链霉菌CGMCC4.6285培养得到含有厚垣孢子的发酵液Ⅱ，备用；
(2)然后边搅拌边将菌粉、麦麸依次加入步骤(1)所得发酵液Ⅱ中，投料完毕后静置30分钟，干燥制成混合物B，最后将混合物B与羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、淀粉和可溶性淀粉混合均匀，挤压造粒，即得所述的一种生物农药。
步骤(1)中，菌粉的制备方法如下：先将粘质沙雷氏菌活化后接种于种子培养基中，28℃培养18小时，得菌株种子液；然后取菌株种子液接种于发酵培养基中，28℃、200rpm/min振荡发酵培养，离心，收集上清液，即为发酵液Ⅰ，后处理，制成菌粉。
利用LB培养基进行活化处理，具体方法是：将粘质沙雷氏菌从保藏菌种的试管斜面中取出转移至LB培养基上，接种量为体积百分数2％，28℃恒温箱中倒置培养72小时即可；菌株种子液在发酵培养基中的接种量为体积百分数4％。
种子培养基的配方为：胰蛋白胨12g，酪蛋白胨8g，可溶性淀粉9g，6波美麦芽汁400mL，海水晶5g，醋酸铵2g，FeSO4 0.3g，CaCl2 3g，蒸馏水1100mL，pH＝6.8，121℃灭菌30分钟；发酵培养基的配方为：酵母浸膏4g，蔗糖0.5g，MgSO4·7H2O 5g，NaNO3 8g，KCl 8g，蒸馏水1100mL，pH＝6.8，121℃灭菌30分钟。
发酵培养为通气培养，其空气通量为10L/min。
后处理的具体方法为：先利用磷酸氢二钠和氯化钙絮凝发酵液，两者的加入量分别为发酵液Ⅰ重量的2％和0.5％；然后采用板框压滤，接着50℃干燥至含水量20％，旋风分离后利用粉碎机粉碎，过30目筛，即得所述菌粉。
步骤(1)中，发酵液Ⅱ的制备方法如下：先将桔橙链霉菌CGMCC4.6285接种于PDA培养基，29℃培养6天，产生分生孢子，然后用接种环将分生孢子转移到含无菌水的试管中，搅拌使得分生孢子从菌丝上分散下来，用无菌纱布过滤除去菌丝，将孢子浓度调节至107cfu/mL，按照1％接种量(体积)接种到液体培养基中，29℃发酵培养2天，即得含有厚垣孢子的发酵液Ⅱ。
所述PDA培养基的配方为：土豆200g，葡萄糖10g，琼脂20g，Na2HPO4 4g，蒸馏水1000g，pH为7.6；所述液体培养基的配方为：麦麸5g，可溶性淀粉25g，硫酸铵2g，碳酸钙1.5g，磷酸氢二钾1g，蒸馏水1000g。
步骤(2)中，干燥的工艺条件为：35℃干燥12小时。
步骤(2)中，菌粉、麦麸、发酵液Ⅱ的质量比为1：6：8；混合物B与羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、淀粉和可溶性淀粉的质量比为10：0.05：0.6：0.6：0.8。
试验例
实施例1～3和对比例1～3所得生物农药，各取1g，分别用1kg水稀释，搅拌溶解，得到药液，进行杀虫率比较。
其中，供试害虫包括：蚧壳虫、棉铃虫、茶黄螨、小地老虎、茄黄斑螟，均为田间采集而得；具体实验方法是将药液均匀喷洒于害虫体表，清水作为对照组，每组害虫数量为100个，喷药后6小时考察死亡率，结果见表1。
表1.害虫死亡率比较
Figure BDA0002725646350000101
Figure BDA0002725646350000111
由表1可知，实施例1～3所得生物农药对蚧壳虫、棉铃虫、茶黄螨、小地老虎、茄黄斑螟在喷药后6小时即可百分百杀灭，杀虫率高。
对比例1在步骤(1)中略去粘质沙雷氏菌ATCC14041，对比例2在步骤(1)中略去桔橙链霉菌CGMCC4.6285，对比例3在步骤(2)中略去黄秋葵汁，所得生物农药的杀虫效果均明显变差，说明粘质沙雷氏菌ATCC14041、桔橙链霉菌CGMCC4.6285的组合协同杀虫。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.粘质沙雷氏菌和桔橙链霉菌CGMCC4.6285的组合在制备生物农药中的应用。
2.一种生物农药，其特征在于，其有效成分为粘质沙雷氏菌和桔橙链霉菌CGMCC4.6285的组合。
3.权利要求2所述一种生物农药的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)先将粘质沙雷氏菌培养得到发酵液Ⅰ，后处理，制成菌粉；将桔橙链霉菌CGMCC4.6285培养得到含有厚垣孢子的发酵液Ⅱ，备用；
(2)再将新鲜黄秋葵压榨得到黄秋葵汁，接着边搅拌边将步骤(1)所得菌粉加入黄秋葵汁中，搅拌分散均匀，得到混合物A；
(3)然后边搅拌边将混合物A、麦麸依次加入步骤(1)所得发酵液Ⅱ中，投料完毕后静置30～40分钟，干燥制成混合物B，最后将混合物B与羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、淀粉和可溶性淀粉混合均匀，挤压造粒，即得所述的一种生物农药。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，菌粉的制备方法如下：先将粘质沙雷氏菌活化后接种于种子培养基中，28～32℃培养12～18小时，得菌株种子液；然后取菌株种子液接种于发酵培养基中，28～32℃、180～200rpm/min振荡发酵培养，离心，收集上清液，即为发酵液Ⅰ，后处理，制成菌粉。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，利用LB培养基进行活化处理，具体方法是：将粘质沙雷氏菌从保藏菌种的试管斜面中取出转移至LB培养基上，接种量为体积百分数2～3％，28℃恒温箱中倒置培养24～72小时即可；菌株种子液在发酵培养基中的接种量为体积百分数4～6％。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，种子培养基的配方为：胰蛋白胨8～12g，酪蛋白胨8～10g，可溶性淀粉6～9g，6波美麦芽汁400～500mL，海水晶3～5g，醋酸铵2～4g，FeSO4 0.2～0.3g，CaCl2 3～4g，蒸馏水900～1100mL，pH＝6.8～7.2，121℃灭菌20～30分钟；发酵培养基的配方为：酵母浸膏4～6g，蔗糖0.4～0.5g，MgSO4·7H2O 5～8g，NaNO35～8g，KCl 8～12g，蒸馏水900～1100mL，pH＝6.8～7.2，121℃灭菌20～30分钟。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，发酵液Ⅱ的制备方法如下：先将桔橙链霉菌CGMCC4.6285接种于PDA培养基，27～29℃培养6～7天，产生分生孢子，然后用接种环将分生孢子转移到含无菌水的试管中，搅拌使得分生孢子从菌丝上分散下来，用无菌纱布过滤除去菌丝，将孢子浓度调节至106～107cfu/mL，按照1～2％接种量接种到液体培养基中，27～29℃发酵培养2～3天，即得含有厚垣孢子的发酵液Ⅱ。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，菌粉与黄秋葵汁的质量比为1：2～3，所述黄秋葵汁的制备方法如下：先将新鲜黄秋葵洗净后进行压榨，然后利用匀质机充分滚压，直至无团粒胶状物即可。
9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，干燥的工艺条件为：35～37℃干燥8～12小时。
10.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，混合物A、麦麸、发酵液Ⅱ的质量比为1：6～9：5～8；混合物B与羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、淀粉和可溶性淀粉的质量比为10：0.05～0.07：0.4～0.6：0.6～0.8：0.6～0.8。
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