CN102017946A - 新碳骨架中尼霉素作为农用抗生素的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属生物农药技术领域，具体涉及一种新碳骨架中尼霉素作为农用抗生素的应用。具体为新碳骨架中尼霉素作为农用抗生素的应用。所述新碳骨架中尼霉素作为农用抗生素，其抗生素可加工成用于防治农业病害的乳油、微乳剂及可湿性粉剂。本发明新碳骨架中尼霉素作为农用抗生素对多种农作物的细菌、真菌病害及虫害，防效显著，性能稳定，对环境友好安全。本发明能对开发利用我国丰富的海洋微生物资源提供可借鉴的模式。
Description
技术领域
本发明属生物农药技术领域，具体涉及一种新碳骨架中尼霉素作为农用抗生素的应用。
背景技术
微生物农药是目前农药工业的新产业，代表着植物保护的方向，其最大的优势在于能克服化学农药对生态环境的污染和减少在农副产品中农药残留量，同时在示范推广微生物农药应用的过程中，农副产品的品质和附加值将大幅提升，有利于农村经济增长和农民增收，社会效益显著。
在国际上，20世纪80年代发现最有影响力的新的杀虫抗生素Avermectin，已被美国默克等公司成功开发成良好的杀虫剂，除草剂Phthoxazollin，被作为先导化合物合成出目前最好的除草剂-草甘膦系列；90年代发现的新的杀虫抗生素Spinosad和杀菌抗生素Strobilurin正在开发中，有望成为很好的生物杀虫剂和杀菌剂。
我国农用抗生素的研究早期主要以仿制国外产品为主，相继研究出灭瘟素、春雷霉素、多氧霉素等，为我国农用抗生素的发展应用奠定了基础。20世纪70～80年代，国内逐步开始建立自己的筛选模型，同时相继研究开发成功井冈霉素、多效霉素、公主岭霉素、农抗120、武夷菌素、中生菌素等。我国农用抗生素占生物农药总产量的90％，是生产农用抗生素的大国，但具有自主知识产权实用化的新农抗品种较少。宁南霉素发酵工艺尚需进一步完善；中生菌素对水稻白叶枯等多种细菌性病害防效显著，目前尚只有水剂和可湿性粉剂两种，还不能满足不同作物和不同生态环境应用需要。
国内科研人员已经获得井冈霉素和南昌霉素等农用抗生素的生物合成基因簇，通过代谢工程显著提高农用抗生素的产量，使井冈霉素产生菌的产量超过现有工业生产菌株；通过基因敲除技术获得只产生南昌霉素或只产生梅岭霉素的工程菌。正在利用丰富的抗生素基因资源，通过组合生物合成定向获得新活性新结构的农用抗生素。
近年来，从陆地微生物中发现新结构抗生素的几率越来越低，得到有价值的新菌株或新活性物质的难度越来越大，例如目前通常从两万多株土壤微生物中才能筛选到1株能产生新结构活性化合物的菌株。目前的研究现状是，在90％的有生物活性的链霉菌中，人们很难找到新的化合物，尤其是新骨架化合物。海洋拥有丰富的生物资源，海洋生物约占地球生物种群总数的80％，它们是生理活性物质和新陈代谢产物的庞大资源。从海洋生物尤其是海洋微生物中寻找特殊的先导化合物，筛选具有杀虫、杀菌、除草的农用抗生素，是农药开发的新方向。
发明内容
本发明目的在于提供一种新碳骨架中尼霉素作为农用抗生素的应用。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
新碳骨架中尼霉素作为农用抗生素的应用。
所述新碳骨架中尼霉素作为农用抗生素，其抗生素可加工成用于防治农业病害的乳油、微乳剂及可湿性粉剂。
所述新碳骨架中尼霉素为中尼霉素A或中尼霉素B；
中尼霉素A如结构式1所示；中尼霉素B如结构式2所示；
结构式1
结构式2
所述新碳骨架中尼霉素按下列步骤所得：
1)固体培养基培养：将灰橙链霉菌(Streptomyces griseoaurantiacusM045)接种于M2 +固体培养基，28℃培养3～4天，直至长出白色的孢子；M2 +固体培养基为：麦芽提取物1g，葡萄糖0.4g，酵母提取物0.4g，琼脂粉1.8g，人工海水50ml，去离子水50ml；
2)摇床培养：将步骤1)所得的白色孢子丝接种到M2 +液体培养基中，并在每升液体培养中添加前体物质对氨基苯甲酸50～500mg，同时于28℃摇床培养，转速为110rpm，培养3～4天后，收获发酵液；
3)萃取：发酵液用乙酸乙酯浸提3～4次，浓缩蒸干，得到膏状粗提物；
4)纯化：粗提物用环己烷浸提，溶解部分为提取物I，不溶解部分为提取物II；然后分别进行如下操作：
1)提取物I经硅胶层析柱，用环己烷和乙酸乙酯梯度洗脱，得到含有化合物中尼霉素A的组分，再用环己烷洗2～3次，获得黄色活性化合物中尼霉素A；
2)提取物II经硅胶柱层析，二氯甲烷和甲醇梯度洗脱，得到含有活性化合物的组分，再用环己烷和二氯甲烷洗涤2～3次，得到黄色粉末状不溶物质，经过制备型薄层层析，于Rf＝0.58处得到红色化合物中尼霉素B，并回收Rf＝0.34处黄色化合物中尼霉素A；
所述灰橙链霉菌(Streptomyces griseoaurantiacus M045)于2009年7月3日保藏于“中国生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏登记号为：CGMCC 3161。
所述得到的新碳骨架中尼霉素为中尼霉素A或中尼霉素B，先用丙酮将中尼霉素溶解，再加入乳化剂进行乳化处理，乳化剂的加入量为中尼霉素A或中尼霉素B重量的0.2％进行添加，然后加水稀释成所需浓度。
所述乳化剂可为富华901(黑龙江富华公司)、京9号乳化剂(北京齐民生物有限公司)、农药乳化剂500号、农药乳化剂700号等各种农药乳化剂。
本发明具有如下优点：
1.本发明作为农用抗生素的中尼霉素，其原药和制剂的生产原料易得，通过发酵可大量积累，工艺相对简单，成本低廉，适合作为农药的用途。
2.本发明的农用抗生素具有广谱的抗菌及杀虫活性，对多种农业病原真菌、细菌及虫害都有效。
3.本发明作为农用抗生素的中尼霉素在保证原料稳定的同时，可以通过严格控制发酵过程的各项参数，来控制成品的质量，容易建立完整的质量体系。
4.本发明作为农用抗生素的中尼霉素其对多种农作物病害具有防治作用，优于部分商品化农药。
具体实施方式
下面结合具体实施例详述本发明。
实施例1：
新碳骨架中尼霉素作为农用抗生素的应用。所述新碳骨架中尼霉素为中尼霉素A或中尼霉素B；中尼霉素A如结构式1所示；中尼霉素B如结构式2所示；
结构式1
结构式2
并且所述新碳骨架中尼霉素作为农用抗生素，其抗生素可按照常规方法加工成用于防治农业病害的乳油、微乳剂及可湿性粉剂。
所述新碳骨架中尼霉素中尼霉素A和中尼霉素B的制备方法：
(1)固体培养基培养：将灰橙链霉菌(Streptomyces griseoaurantiacusM045)接种于M2 +固体培养基，28℃培养3～4天，直至长出白色的孢子；所述M2 +固体培养基为：麦芽提取物1g，葡萄糖0.4g，酵母提取物0.4g，琼脂粉1.8g，人工海水50ml，去离子水50ml。所述灰橙链霉菌(Streptomycesgriseoaurantiacus M045)于2009年7月3日保藏于“中国生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏登记号为：CGMCC 3161。
(2)摇床培养：接种所述白色孢子丝到M2+液体培养基25升，培养基中添加前体物质-对氨基苯甲酸，添加量50～500mg/L，28℃摇床培养，转速为110rpm，培养3～4天后，收获发酵液；
所述M2 +液体培养基为：麦芽提取物1g，葡萄糖0.4g，酵母提取物0.4g，人工海水50ml，去离子水50ml。
(3)萃取：发酵液用乙酸乙酯浸提4次，旋转蒸发仪旋转浓缩蒸干，得到膏状粗提物，即为该农用抗生素的原药。
(4)分离纯化：用250ml环已烷浸提粗提物，溶解部分为提取物I，不溶解部分为提取物II；然后分别作如下操作：
1)提取物I经硅胶柱层析，用环己烷和乙酸乙酯梯度(100/0～0/100)洗脱，在环己烷与乙酸乙酯(50/50～0/100)梯度下，得到含有化合物中尼霉素A的组分，用50ml环己烷洗涤两次，获得产物中尼霉素A；
2)提取物II经硅胶柱层析，二氯甲烷与甲醇梯度(100/0～0/100)洗脱，100％二氯甲烷洗脱得到组分a，二氯甲烷与甲醇(99.5/0.5～98/2)梯度下得到组分b，二氯甲烷与甲醇(95/5～90/10)梯度下得到组分c，取所述组分b用含有25％二氯甲烷的环己烷25ml洗涤两次，得到黄色粉末状不溶物质，经过制备型薄层层析(PTLC，层析板为20×20cm，展开剂为95％二氯甲烷与5％甲醇)，于Rf＝0.34处得到产物中尼霉素A，于Rf＝0.58处得到红色化合物中尼霉素B。
所述灰橙链霉菌(Streptomyces griseoaurantiacus M045)，于2009年7月3日保藏于“中国生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏登记号为：CGMCC 3161。该菌株在高氏一号培养基上，生长形成红色的营养菌丝体和白色的气生菌丝体，基内菌丝没有横隔和断裂，气生菌丝有较多分支，没有可溶性色素，孢子链直或弯曲，表面光滑的球形或椭圆形孢子；具有明胶、淀粉酶、过氧化氢酶等水解活性，不产生黑色素和硫化氢；可利用葡萄糖、果糖、鼠李糖等碳源；细胞壁化学组分，糖型C，无特征性糖，含有L，L-DAP(左消旋二氨基庚二酸)；该菌16S rDNA序列的GenBank登录号为AY644669。
实施例2：中尼霉素杀菌活性测定
(1)乳化剂制备：将上述得到的新碳骨架中尼霉素的原药，其由中尼霉素A和中尼霉素B组成，将原药加入乳化剂进行乳化处理，乳化剂的加入量为原药重量百分比的0.2％进行添加，然后加水稀释成所需浓度。在本实施例中加入京9号乳化剂(北京齐民生物有限公司生产)，还可采用富华901(黑龙江富华公司)、农药乳化剂500号或农药乳化剂700号。
(2)室内活性测定：采用生长速率法测定本发明中尼霉素的杀菌毒力，按倍稀释法，设7个浓度梯度，在无菌操作条件下，将1ml上述不同浓度梯度的中尼霉素，分别与49ml PDA培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)均匀混合，倒入4个直径为9cm的无菌培养皿中，凝固后，每皿接种1块直径0.5cm的受试菌饼(纯培养)，在25±1℃恒温条件下培养72小时，量取菌落直径，以加无菌水的作为对照，计算抑菌率(参见表1-8)。
统计方法，以杀菌剂浓度(mg/kg)的对数值为自变量，抑菌率的机率值为因变量，建立毒力回归方程，计算出有效浓度(EC50)和(EC90)。
表1 中尼霉素对黄瓜炭疽病菌室内活性测定结果
表2 中尼霉素对黄瓜枯萎病菌室内活性测定结果
表3 中尼霉素对茶树炭疽病菌室内活性测定结果
表4 中尼霉素对茶树叶枯病菌室内活性测定结果
表5 中尼霉素对芦笋茎枯病菌室内活性测定结果
表6 中尼霉素对桃褐腐病菌室内活性测定结果
表7 中尼霉素对大葱紫斑病菌室内活性测定结果
表8 中尼霉素对杏疮痂病菌室内活性测定结果
(3)采用生长速率法测定本发明中尼霉素与市场售农药的杀菌毒力的差异，以番茄早疫病菌和番茄枯萎病菌为受试菌，对照药为：3％克菌康WP(中生菌素，中国农科院环发所微生物农药研制中心)，10％宝丽安WP(多抗霉素，南通丸宏农用化工有限公司)，1％武夷菌素WP(潍坊万胜生物农药有限公司)，75％百菌清WP(青岛奥迪斯生物科技有限公司)。实验结果如下：
表9 对番茄早疫病菌室内活性测定结果(菌落盲径：cm)
表10 对番茄枯萎病菌室内活性测定结果(菌落直径：cm)
表中浓度均为有效成分浓度，表9中结果表明，在均为1mg/kg浓度下，1％本发明中尼霉素的菌落直径(番茄早疫病菌)最小，为3.1cm，抑菌效果最好，其次是1％武夷菌素水剂，菌落直径为3.7cm。表10同样显示类似结果，因此在相同有效成分浓度下，1％中尼霉素对番茄早疫病菌和番茄枯萎病菌的抑菌效果，优于1％武夷菌素水剂、3％克菌康WP、10％宝丽安WP及化学农药75％百菌清WP。
Claims (5)
1.一种新碳骨架中尼霉素作为农用抗生素的应用。
2.按权利要求1所述的新碳骨架中尼霉素作为农用抗生素的应用，其特征在于：所述新碳骨架中尼霉素作为农用抗生素，其抗生素可加工成用于防治农业病害的乳油、微乳剂及可湿性粉剂。
3.按权利要求1或2所述的新碳骨架中尼霉素作为农用抗生素的应用，其特征在于：所述新碳骨架中尼霉素为中尼霉素A或中尼霉素B；
中尼霉素A如结构式1所示；中尼霉素B如结构式2所示；
结构式1
结构式2
4.按权利要求1或2所述的新碳骨架中尼霉素作为农用抗生素的应用，其特征在于：所述新碳骨架中尼霉素按下列步骤所得：
1)固体培养基培养：将灰橙链霉菌(Streptomyces griseoaurantiacusM045)接种于M2 +固体培养基，28℃培养3～4天，直至长出白色的孢子；
2)摇床培养：将步骤1)所得的白色孢子丝接种到M2 +液体培养基中，并在每升液体培养中添加前体物质对氨基苯甲酸50～500mg，同时于28℃摇床培养，转速为110rpm，培养3～4天后，收获发酵液；
3)萃取：发酵液用乙酸乙酯浸提3～4次，浓缩蒸干，得到膏状粗提物；
4)纯化：粗提物用环己烷浸提，溶解部分为提取物I，不溶解部分为提取物II；然后分别进行如下操作：
1)提取物I经硅胶层析柱，用环己烷和乙酸乙酯梯度洗脱，得到含有化合物中尼霉素A的组分，再用环己烷洗2～3次，获得黄色活性化合物中尼霉素A；
2)提取物II经硅胶柱层析，二氯甲烷和甲醇梯度洗脱，得到含有活性化合物的组分，再用环己烷和二氯甲烷洗涤2～3次，得到黄色粉末状不溶物质，经过制备型薄层层析，于Rf＝0.58处得到红色化合物中尼霉素B，并回收Rf＝0.34处黄色化合物中尼霉素A；
所述灰橙链霉菌(Streptomyces griseoaurantiacus M045)于2009年7月3日保藏于“中国生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏登记号为：CGMCC 3161。
5.按权利要求4所述的新碳骨架中尼霉素作为农用抗生素的应用，其特征在于：所述得到的新碳骨架中尼霉素为中尼霉素A或中尼霉素B，先用丙酮将中尼霉素溶解，再加入乳化剂进行乳化处理，乳化剂的加入量为中尼霉素A或中尼霉素B重量的0.2％进行添加，然后加水稀释成所需浓度。
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