CN114717166A - 一株阿洛杰链霉菌bc1及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及植物病害生物防治技术领域，尤其涉及一株阿洛杰链霉菌BC1及其应用。本发明提供了一株阿洛杰链霉菌BC1，拉丁文名为Streptomycesaraujoniae；保藏编号为CGMCC No：24639。本发明从甘蔗叶片中成功分离获得一株阿洛杰链霉菌菌株BC1，其用于防治甘蔗真菌病害，对甘蔗梢腐病菌、甘蔗赤腐病菌、甘蔗褐条病菌和甘蔗叶枯病菌等甘蔗病原菌有明显的抑制效果，尤其是甘蔗赤腐病菌具有良好的效果，具有较好的开发应用前景。本发明提供的阿洛杰链霉菌菌株BC1发酵培养基制备方法简单，成本低。

Description

一株阿洛杰链霉菌BC1及其应用
技术领域
本发明涉及植物病害生物防治技术领域，尤其涉及一株阿洛杰链霉菌BC1及其应用。
背景技术
甘蔗是世界上最重要的糖料作物，还是轻工、化工和能源的重要原料和战略性资源，广泛种植于热带和亚热带地区。甘蔗赤腐病(sugarcane red rot)是甘蔗上最严重的真菌病害之一，在甘蔗整个生长期都能发生危害，赤腐病菌可浸染蔗叶、蔗茎和蔗芽，主要危害蔗茎(即蔗茎赤腐病)和叶片中脉(即中脉赤腐病)。甘蔗茎受害后，病原菌分泌蔗糖转化酶，使蔗汁纯度降低、蔗糖分减少，导致甘蔗减产29.1％，蔗糖分损失30.8％以上，危害严重蔗区可导致几乎100％的产量损失。
甘蔗褐条病(sugarcane brown stripe)是一种真菌病害，给蔗糖产业带来不同程度经济损失。它通过影响甘蔗叶片光合作用，从而影响糖分积累，发病严重时全株叶片受感染，叶片光合作用严重下降，植株矮小，严重感病发病率高达80％以上，一般减产18％～35％，重的可达40％以上，蔗糖分降低15％～30％。
由于化学防治具有成本低、见效快等特点，目前生产上主要采用化学药剂防治甘蔗赤腐病和甘蔗褐条病，但化学防治容易导致病原菌产生耐药性，还会造成农药残留、破坏生态环境以及威胁人类健康。而采用生物菌剂防治植物病害具有环境友好、病原菌不易产生耐药性等特点，是防治植物病害的新资源，是有效的绿色、环保、可持续防控措施。
发明内容
本发明的目的在于提供一种阿洛杰链霉菌(Streptomyces araujoniae)，并将其应用于防治甘蔗赤腐病和甘蔗褐条病中，效果优异。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一株阿洛杰链霉菌BC1，拉丁文名为Streptomyces araujoniae；保藏编号为CGMCC No：24639。
优选的，所述阿洛杰链霉菌BC1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
优选的，所述植物病原菌为甘蔗梢腐病菌、甘蔗赤腐病菌、甘蔗褐条病菌和甘蔗叶枯病菌的一种或多种。
本发明还提供了一种生物防治菌剂，所述生物防治菌剂为所述阿洛杰链霉菌BC1的发酵液。
优选的，所述发酵液中阿洛杰链霉菌BC1的活菌数为2～6×1010个/mL。
本发明还进一步地提供了一种生物防治菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)将所述阿洛杰链霉菌BC1接种于固体培养中进行活化培养，得到活化菌株；
(2)将步骤(1)得到的活化菌株接种于液体培养基中进行培养，得到液体种子；
(3)将步骤(2)得到的液体种子接种到发酵培养基中发酵，发酵液即为生物防治菌剂。
优选的，步骤(1)所述活化培养的温度为28～32℃，活化培养的时间为6～8d。
优选的，步骤(2)所述培养的温度为28～32℃，培养的时间为24～48h，摇床的转速为150～250r/min。
优选的，步骤(3)所述发酵的温度为28～32℃，发酵的时间为48～72h，摇床的转速为250～350r/min。
优选的，步骤(3)所述发酵过程中溶氧控制体积比10～40％，pH为7.2～7.4。
优选的，步骤(3)所述发酵培养基为可溶性淀粉10g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉4g/L，麦芽浸粉10g/L，葡萄糖4g/L，甘油10g/L，其余为水，pH 7.2～7.4。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
本发明从甘蔗叶片中成功分离获得一株阿洛杰链霉菌菌株BC1，其用于防治甘蔗真菌病害，对甘蔗梢腐病菌、甘蔗赤腐病菌、甘蔗褐条病菌和甘蔗叶枯病菌等甘蔗病原菌有明显的抑制效果，尤其是甘蔗赤腐病菌具有良好的效果，具有较好的开发应用前景。本发明提供的阿洛杰链霉菌菌株BC1发酵培养基制备方法简单，成本低。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为阿洛杰链霉菌菌株BC1菌落形态；
图2为阿洛杰链霉菌菌株BC1对4种甘蔗病原菌室内平板对峙培养抑菌效果；
图3为阿洛杰链霉菌菌株BC1基于16S rRNA序列构建的系统发育树；
图4为阿洛杰链霉菌菌株BC1发酵液对甘蔗褐条病的室内防治效果及对蔗叶的保护作用；
图5为阿洛杰链霉菌菌株BC1对甘蔗赤腐病的防治效果。
生物保藏说明
阿洛杰链霉菌BC1，拉丁文名为Streptomyces araujoniae；
该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2022年04月06日，保藏编号为CGMCC No：24639。
具体实施方式
本发明提供了一株阿洛杰链霉菌BC1，拉丁文名为Streptomyces araujoniae；保藏编号为CGMCC No：24639。
在本发明中，所述阿洛杰链霉菌BC1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在本发明中，所述植物病原菌为甘蔗梢腐病菌、甘蔗赤腐病菌、甘蔗褐条病菌和甘蔗叶枯病菌的一种或多种。
本发明还提供了一种生物防治菌剂，所述生物防治菌剂为所述阿洛杰链霉菌BC1的发酵液。
在本发明中，所述发酵液中阿洛杰链霉菌BC1的活菌数为2～6×1010个/mL；优选为3～5×1010个/mL；进一步优选为4×1010个/mL。
本发明还进一步的提供了一种生物防治菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)将所述阿洛杰链霉菌BC1接种于固体培养中进行活化培养，得到活化菌株；
(2)将步骤(1)得到的活化菌株接种于液体培养基中进行培养，得到液体种子；
(3)将步骤(2)得到的液体种子接种到发酵培养基中发酵，发酵液即为生物防治菌剂。
在本发明中，步骤(1)所述活化培养的温度为28～32℃；优选为29～31℃；进一步优选为30℃。
在本发明中，步骤(1)所述活化培养的时间为6～8d；优选为7d。
在本发明中，步骤(2)所述培养的温度为28～32℃；优选为29～31℃；进一步优选为30℃。
在本发明中，步骤(2)所述培养的时间为24～48h；优选为30～42h；进一步优选为34～38h；更优选为36h。
在本发明中，步骤(2)所述摇床的转速为150～250r/min；优选为170～230r/min；进一步优选为190～210r/min；更优选为200r/min。
在本发明中，步骤(3)所述发酵的温度为28～32℃；优选为29～31℃；进一步优选为30℃。
在本发明中，步骤(3)所述发酵的时间为48～72h；优选为52～68h；进一步优选为58～62h；更优选为60h。
在本发明中，步骤(3)所述摇床的转速为250～350r/min；优选为270～330r/min；进一步优选为290～310r/min；更优选为300r/min。
在本发明中，步骤(3)所述发酵过程中溶氧控制体积比10～40％；优选为20～30％；进一步优选为24～26％；更优选为25％。
在本发明中，步骤(3)所述发酵过程中pH为7.2～7.4；优选pH为7.3。
在本发明中，步骤(3)所述发酵培养基为可溶性淀粉10g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉4g/L，麦芽浸粉10g/L，葡萄糖4g/L，甘油10g/L，其余为水，pH 7.2～7.4；优选pH为7.3。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
以下实施例所用到的阿洛杰链霉菌BC1，拉丁文名为Streptomyces araujoniae；保藏编号为CGMCC No：24639。
实施例1
一种生物防治菌剂的制备方法，步骤如下：
(1)将阿洛杰链霉菌BC1接种于固体培养中28℃活化培养6d，得到活化菌株；
(2)将步骤(1)得到的活化菌株接种于液体培养基中28℃培养24h，摇床的转速为150r/min，得到液体种子；
(3)将步骤(2)得到的液体种子接种到发酵培养基中28℃发酵48h，摇床的转速为250r/min；所述发酵过程中溶氧控制体积比10％，pH控制在7.2，发酵液即为生物防治菌剂，发酵液中阿洛杰链霉菌BC1的活菌数为2×1010个/mL；
所述发酵培养基为可溶性淀粉10g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉4g/L，麦芽浸粉10g/L，葡萄糖4g/L，甘油10g/L，其余为水，pH 7.2。
实施例2
一种生物防治菌剂的制备方法，步骤如下：
(1)将阿洛杰链霉菌BC1接种于固体培养中32℃活化培养8d，得到活化菌株；
(2)将步骤(1)得到的活化菌株接种于液体培养基中32℃培养48h，摇床的转速为250r/min，得到液体种子；
(3)将步骤(2)得到的液体种子接种到发酵培养基中32℃发酵72h，摇床的转速为350r/min；所述发酵过程中溶氧控制体积比40％，pH控制在7.4，发酵液即为生物防治菌剂，发酵液中阿洛杰链霉菌BC1的活菌数为6×1010个/mL；
所述发酵培养基为可溶性淀粉10g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉4g/L，麦芽浸粉10g/L，葡萄糖4g/L，甘油10g/L，其余为水，pH7.4。
实施例3
一种生物防治菌剂的制备方法，步骤如下：
(1)将阿洛杰链霉菌BC1接种于固体培养中30℃活化培养7d，得到活化菌株；
(2)将步骤(1)得到的活化菌株接种于液体培养基中30℃培养36h，摇床的转速为200r/min，得到液体种子；
(3)将步骤(2)得到的液体种子接种到发酵培养基中30℃发酵60h，摇床的转速为300r/min；所述发酵过程中溶氧控制体积比25％，pH控制在7.3，发酵液即为生物防治菌剂，发酵液中阿洛杰链霉菌BC1的活菌数为4×1010个/mL；
所述发酵培养基为可溶性淀粉10g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉4g/L，麦芽浸粉10g/L，葡萄糖4g/L，甘油10g/L，其余为水，pH 7.3。
实施例4
菌株BC1(阿洛杰链霉菌菌株BC1)的分离、纯化及保存
在云南普洱(东经99°85'，北纬23°09')和开远(东经103°27'，北纬23°71')甘蔗种植区，采用组织分离法，从发病甘蔗赤腐病组织在PDA或PSA培养基上进行分离，于28℃恒温培养72h后挑取单菌落进行纯化，恒温培养5～7天后保存，作为待测菌株。
其中，分离与保存的培养基为PDA或PSA培养基。
实施例5
本发明阿洛杰链霉菌(Streptomyces araujoniae)菌株BC1的生物学特征如下：
分子鉴定：采用细菌16S rDNA所用通用引物
27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(如SEQ ID NO:2所示)和
1492R：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′(如SEQ ID NO:3所示)，以菌株BC1基因组DNA为模板进行PCR扩增、克隆、测序。阿洛杰链霉菌(Streptomyces araujoniae)菌株BC1的16S rDNA序列有效长度为1518bp，将该菌株的16S rDNA序列进行Blast比对，发现其与阿洛杰链霉菌(Streptomyces araujoniae)序列同源性达100％，且处于同一个进化分支。该菌株的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID No:1所示(图3为阿洛杰链霉菌菌株BC1基于16SrRNA序列构建的系统发育树)。
形态学鉴定：阿洛杰链霉菌BC1在高氏Ⅰ号平板上28℃培养7d，观察其菌落形态为圆形，微隆起，白色，外围有一圈绒毛，微褶皱(图1为阿洛杰链霉菌菌株BC1菌落形态)。
阿洛杰链霉菌BC1接种于不同固体培养基，28℃培养7d，其生长状况和培养特征如表1所示。
表1阿洛杰链霉菌BC1的培养特征
Figure BDA0003651548370000071
注：‘+++’表示生长旺盛；‘++’表示生长良好；‘+’表示生长一般。
分别测定阿洛杰链霉菌BC1的生理生化反应、碳源和氮源利用情况，结果见表2和表3。结果表明：阿洛杰链霉菌BC1可以水解淀粉、明胶液化、牛奶胨化、不产生硫化氢，不产生黑色素(表2)。
在碳源利用方面，它可以利用葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、阿拉伯糖、D-木糖、D-果糖、结晶乙酸钠和甘露醇；在氮源利用方面，它可以利用甘氨酸、丝氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、蛋白胨和KNO3(表3)。
表2阿洛杰链霉菌BC1生理生化试验结果
试验项目 试验结果 试验项目 试验结果
淀粉水解 + 硫化氢产生 –
明胶液化 + 黑色素产生 –
牛奶胨化 +
注：‘+’为阳性，‘–’为阴性
表3阿洛杰链霉菌BC1碳源、氮源利用试验结果
Figure BDA0003651548370000072
Figure BDA0003651548370000081
注：‘+++’表示生长旺盛；‘++’表示生长良好；‘+’表示生长一般。
综合测序结果与形态学鉴定，本实验保存的从甘蔗组织中分离获得的细菌样本BC1为阿洛杰链霉菌(Streptomyces araujoniae)。
实施例6
菌株BC1的抑菌谱测定
采用对峙培养法测定阿洛杰链霉菌(Streptomyces araujoniae)菌株BC1的抑菌谱：靶标菌有甘蔗梢腐病菌、甘蔗赤腐病菌、甘蔗褐条病菌和甘蔗叶枯病菌。
实验组：将菌株BC1和靶标菌分别打成0.8cm的菌饼，将4个靶标菌甘蔗梢腐病菌、甘蔗赤腐病菌、甘蔗褐条病菌和甘蔗叶枯病菌分别打成0.8cm的菌饼，分别放置9cm PDA培养基平板中央，菌株BC1放置于距离靶标菌菌饼2cm处4个对称点上，置于28℃恒温培养箱中培养7d。
空白对照组：将4个靶标菌甘蔗梢腐病菌、甘蔗赤腐病菌、甘蔗褐条病菌和甘蔗叶枯病菌均打成0.8cm的菌饼，将其分别放置9cm PDA培养基平板中央，置于28℃恒温培养箱中培养7d。
计算公式如下：抑菌率(％)＝(空白对照组菌落直径-各实验组菌落直径)/(空白对照组菌落直径-菌饼直径)×100。
实验结束计算抑菌率，表4实验结果为菌株BC1对4种甘蔗病原菌的抑菌效果(图2为阿洛杰链霉菌菌株BC1对4种甘蔗病原菌室内平板对峙培养抑菌效果)。
表4菌株BC1对4种甘蔗病原菌的抑菌效果
Figure BDA0003651548370000091
从表4可看出，菌株BC1对甘蔗梢腐病菌、甘蔗赤腐病菌、甘蔗褐条病菌和甘蔗叶枯病菌均有一定的抑制率，特别是对甘蔗赤腐病菌和甘蔗褐条病菌抑菌效果较好。由此可知，菌株BC1对大部分甘蔗真菌病害具有防治作用。
实施例7
阿洛杰链霉菌菌株BC1发酵液对甘蔗褐条病的防治效果
发酵液的制备：将菌株BC1在ISP2培养基上培养7天后，将菌丝及孢子接种到ISP2液体培养基中，28～32℃，200r/min摇床振荡培养24～48h，得到液体种子；按体积比10％接种量将液体种子接入到发酵培养基中，28～32℃，转速300～500r/min，溶氧控制体积比10～40％，pH 7.2～7.4，通气培养48～72h，进行发酵，发酵液经4℃、10000r/min下离心30min，得到发酵上清液。
甘蔗褐条病防治实验：甘蔗叶片喷雾接种甘蔗褐条病菌1d后，喷施菌株BC1发酵上清液，空白对照用清水处理。施药14d后，观察发病情况。结果显示，菌株BC1发酵上清液能有效抑制甘蔗褐条病菌对甘蔗叶片的侵染(图4)。
实施例8
阿洛杰链霉菌菌株BC1对甘蔗赤腐病的防治效果
发酵液的制备：将菌株BC1在ISP2培养基上培养7天后，将菌丝及孢子接种到ISP2液体培养基中，28～32℃，200r/min摇床振荡培养24～48h，得到液体种子；按体积比10％接种量将液体种子接入到发酵培养基中，28～32℃，转速300～500r/min，溶氧控制体积比10～40％，pH 7.2～7.4，通气培养48～72h，进行发酵，发酵液经4℃、10000r/min下离心30min，得到发酵上清液。
甘蔗赤腐病防治实验：分别将蔗茎在菌株BC1发酵上清液、对照药剂百菌清800倍液及清水空白对照中浸泡20min，取出放阴凉处晾干后在刀口处接种甘蔗赤腐病强致病力菌株MYN1-1(C.falcatum)。在恒温28℃，75％相对湿度培养7d后，观察蔗茎发病情况，并测量病斑直径。结果如图5所示，阿洛杰链霉菌BC1发酵上清液能有效抑制甘蔗赤腐病菌对蔗茎的浸染，防效达71.4％，显著高于百菌清800倍液的防治效果。
防治效果(％)＝[(空白对照组病斑直径－实验组病斑直径)/空白对照组病斑直径]×100％
表5菌株BC1发酵上清液对甘蔗赤腐病的防治效果
Figure BDA0003651548370000101
实施例1～实施例8的结果表明，本发明从甘蔗组织中分离获得一株阿洛杰链霉菌(Streptomyces araujoniae)菌株BC1，该菌株可用于甘蔗真菌病害防治，防治效果显著，安全、绿色、环保。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 云南省农业科学院甘蔗研究所
<120> 一株阿洛杰链霉菌BC1及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0]
<210> 1
<211> 1518
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agagtttgatcctggctcaggacgaacgctggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgaac 60
gatgaagcctttcggggtggattagtggcgaacgggtgag taacacgtgg gcaatctgcc 120
cttcactctgggacaagccctggaaacggggtctaatacc ggataatact tctgcctgca 180
tgggtgggggttgaaagctccggcggtgaaggatgagccc gcggcctatc agcttgttgg 240
tggggtaatggcctaccaaggcgacgacgggtagccggcc tgagagggcg accggccaca 300
ctgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagc agtggggaat attgcacaat 360
gggcgaaagcctgatgcagcgacgccgcgtgagggatgac ggccttcggg ttgtaaacct 420
ctttcagcagggaagaagcgcaagtgacggtacctgcaga agaagcgccg gctaactacg 480
tgccagcagccgcggtaatacgtagggcgcaagcgttgtc cggaattatt gggcgtaaag 540
agctcgtaggcggcttgtcacgtcggatgtgaaagcccgg ggcttaaccc cgggtctgca 600
ttcgatacgggctagctagagtgtggtaggggagatcgga attcctggtg tagcggtgaa 660
atgcgcagatatcaggaggaacaccggtggcgaaggcgga tctctgggcc attactgacg 720
ctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagatac cctggtagtc cacgccgtaa 780
acgttgggaactaggtgttggcgacattccacgtcgtcgg tgccgcagct aacgcattaa 840
gttccccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaactca aaggaattga cgggggcccg 900
cacaagcagcggagcatgtggcttaattcgacgcaacgcg aagaacctta ccaaggcttg 960
acatataccggaaagcatcagagatggtgccccccttgtg gtcggtatac aggtggtgca 1020
tggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct 1080
tgttctgtgttgccagcatgcctttcggggtgatggggac tcacaggaga ctgccggggt 1140
caactcggaggaaggtggggacgacgtcaagtcatcatgc cccttatgtc ttgggctgca 1200
cacgtgctacaatggccggtacaatgagctgcgatgccgt gaggcggagc gaatctcaaa 1260
aagccggtctcagttcggattggggtctgcaactcgaccc catgaagtcg gagttgctag 1320
taatcgcagatcagcattgctgcggtgaatacgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt 1380
cacgtcacgaaagtcggtaacacccgaagccggtggccca accccttgtg ggagggagct 1440
gtcgaaggtgggactggcgattgggacgaagtcgtaacaa ggtagccgta ccggaaggtg 1500
cggctggatcacctcctt 1518
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agagtttgatcctggctcag 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaggaggtgatccagccgca 20

Claims (10)

1.一株阿洛杰链霉菌BC1，拉丁文名为Streptomyces araujoniae；保藏编号为CGMCCNo：24639。
2.根据权利要求1所述的一株阿洛杰链霉菌BC1，其特征在于，所述阿洛杰链霉菌BC1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.权利要求1所述阿洛杰链霉菌BC1在防治植物病原菌中的应用，其特征在于，所述植物病原菌为甘蔗梢腐病菌、甘蔗赤腐病菌、甘蔗褐条病菌和甘蔗叶枯病菌的一种或多种。
4.一种生物防治菌剂，其特征在于，所述生物防治菌剂为所述阿洛杰链霉菌BC1的发酵液；所述发酵液中阿洛杰链霉菌BC1的活菌数为2～6×1010个/mL。
5.一种生物防治菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将权利要求1所述阿洛杰链霉菌BC1接种于固体培养中进行活化培养，得到活化菌株；
(2)将步骤(1)得到的活化菌株接种于液体培养基中进行培养，得到液体种子；
(3)将步骤(2)得到的液体种子接种到发酵培养基中发酵，发酵液即为生物防治菌剂。
6.根据权利要求5所述的一种生物防治菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述活化培养的温度为28～32℃，活化培养的时间为6～8d。
7.根据权利要求5所述的一种生物防治菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述培养的温度为28～32℃，培养的时间为24～48h，摇床的转速为150～250r/min。
8.根据权利要求5所述的一种生物防治菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述发酵的温度为28～32℃，发酵的时间为48～72h，摇床的转速为250～350r/min。
9.根据权利要求5所述的一种生物防治菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述发酵过程中溶氧控制体积比10～40％，pH为7.2～7.4。
10.根据权利要求5所述的一种生物防治菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述发酵培养基为可溶性淀粉10g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉4g/L，麦芽浸粉10g/L，葡萄糖4g/L，甘油10g/L，其余为水，pH 7.2～7.4。
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何天盈等: "抑菌型表面活性剂抑菌机理及应用", 《日用化学工业》 *

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