CN112063549B - 一种石斛内生巴登鲁希拉菌SP-YTie-7及其应用 - Google Patents

一种石斛内生巴登鲁希拉菌SP-YTie-7及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及石斛真菌病防治技术领域，具体涉及一种石斛内生巴登鲁希拉菌SP‑YTie‑7及其应用。本发明中所提供的巴登鲁希拉菌(Rouxiella badensis)SP‑YTie‑7保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.18776。该菌株及其发酵上清液和菌体的萃取物对石斛病原真菌罗尔阿太菌(Athelia rolfsii)和露湿漆斑菌(Myrotheciuum roridum)均具有优异的抑菌活性，在生物农药、微生物制剂及其他抗菌相关领域具有较好的开发应用前景，为微生物源农药的进一步研制和开发提供了优良的基础菌株。

Description

一种石斛内生巴登鲁希拉菌SP-YTie-7及其应用
技术领域
本发明涉及石斛真菌病防治技术领域，具体涉及一种石斛内生巴登鲁希拉菌SP-YTie-7及其应用。
背景技术
兰科石斛属(Dendrobium)植物含有丰富的多糖、生物碱、酚类等活性成分，具有很好的清热止痛、抗肿瘤、抗氧化、提高免疫力等药用功效，对神经系统和糖脂代谢有一定的调控作用。该属多种植物的新鲜或干燥茎在我国传统医学中被收做药用，具有极高的药用价值，如被《中国药典》所收录的铁皮石斛(Dendrobium offcinale)、霍山石斛(Dendrobiumhuoshanense)、金钗石斛(Dendrobium nobile)和流苏石斛(Dendrobium fimbriatum)等。野生石斛生长缓慢、自身繁殖能力低、数量少，不能满足市场需求。近几年来，石斛种苗繁育和人工栽培技术不断取得突破性进展，但人工栽培石斛易发生细菌性和真菌性病害，对其产量和质量均造成严重影响。因此，加强石斛病害的防治，是人工栽培石斛规模化生产过程中非常重要的环节。目前，多使用化学农药对石斛病害进行防控，但化学农药的长期使用不仅污染环境、破坏生态平衡，而且其残留对人、畜都有危害，并且使病原菌产生抗药性。而生物防治方法则不具有上述缺陷，因此石斛病害的生物防治研究越来越受到重视。
与本发明中的巴登鲁希拉菌SP-YTie-7(Rouxiella badensis DSM 100043T，99.41％)最相似的菌株为DSM 100043T(CIP 111153T，strain 323T)，该菌株是2017年从德国巴登-符腾堡州的泥炭沼泽或沼泽土壤中分离获得的一株新菌株，而鲁希拉菌属(Rouxiella)为2013年从新生儿肠外营养袋中分离得到，目前对其活性研究较少。
发明内容
为了推进石斛病害的生物防治研究，本发明提供了一种石斛内生巴登鲁希拉菌SP-YTie-7及其应用。
本发明首先提供一种巴登鲁希拉菌(Rouxiella badensis)SP-YTie-7，该菌株于2019年11月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为Rouxiella badensis，保藏编号为CGMCC NO.18776。
巴登鲁希拉菌(Rouxiella badensis)SP-YTie-7的16S rDNA的GenBank号为MK389432。巴登鲁希拉菌(Rouxiella badensis)SP-YTie-7的16S rDNA与巴登鲁希拉菌(Rouxiella badensis)DSM 100043T的同源性为99.41％。
巴登鲁希拉菌(Rouxiella badensis)SP-YTie-7为从石斛(Dendrobiumofficinale)鲜茎内部分离得到的石斛内生细菌。该菌株为革兰氏阴性菌，在YIM38固体培养基上生长良好，最适生长温度为28℃，最适生长pH为7.2。
本发明进一步提供一种菌剂，其含有所述的巴登鲁希拉菌(Rouxiella badensis)SP-YTie-7。
所述菌剂可以为液体菌剂或固体菌剂。
所述菌剂可以采用常规技术手段、加入微生物制剂领域允许的辅料制备得到。
本发明还提供所述的巴登鲁希拉菌(Rouxiella badensis)SP-YTie-7或含有该菌株的菌剂在防治植物病原真菌中的应用。
优选地，所述植物病原真菌为石斛病原真菌。
进一步优选地，所述石斛病原真菌为罗尔阿太菌(Athelia rolfsii)和露湿漆斑菌(Myrotheciuum roridum)。
本发明还提供一种石斛病原真菌抑制剂，含有所述的巴登鲁希拉菌(Rouxiellabadensis)SP-YTie-7的发酵物或发酵萃取物。
所述发酵物为将所述巴登鲁希拉菌(Rouxiella badensis)SP-YTie-7经发酵后得到的发酵液上清和/或菌体；
所述发酵萃取物为将所述巴登鲁希拉菌(Rouxiella badensis)SP-YTie-7经发酵后得到的发酵液上清和/或菌体的有机溶剂萃取物。
所述的巴登鲁希拉菌(Rouxiella badensis)SP-YTie-7的发酵可在YIM38液体培养基中，pH为7.0～7.2，28℃条件下振荡培养。
作为优选，采用乙酸乙酯对所述发酵液上清进行萃取，经干燥和复溶后得到所述发酵萃取物。
作为优选，采用丙酮对所述菌体进行萃取，经干燥和复溶后得到所述发酵萃取物。
在一种实施方案中，所述石斛病原真菌抑制剂采用如下方法制备得到：
(1)挑选巴登鲁希拉菌(Rouxiella badensis)SP-YTie-7的单菌接种到pH为7.0～7.2的YIM38培养基中，在150～200rpm、28℃条件下振荡培养48h；
(2)将培养液在低温下离心后分别收集发酵上清液和菌体；发酵上清液用等体积的乙酸乙酯进行萃取，菌体用等体积的丙酮进行萃取，在35～40℃条件下对萃取液进行旋转蒸发浓缩，将浓缩物复溶于甲醇，得到发酵上清乙酸乙酯萃取液和菌体丙酮萃取液。
本发明还提供一种防治石斛病原真菌的方法，利用所述的巴登鲁希拉菌(Rouxiella badensis)SP-YTie-7防治石斛病原真菌。
在一些实施方案中，所述的方法具体为：对石斛施用所述的石斛病原真菌抑制剂。
在一些实施方案中，所述的方法具体为：将所述巴登鲁希拉菌(Rouxiellabadensis)SP-YTie-7接种于石斛。
本发明的有益效果如下：
本发明从石斛鲜茎组织内部分离获得一株石斛内生巴登鲁希拉菌(Rouxiellabadensis)SP-YTie-7，该菌株及其发酵上清液和菌体的萃取物对石斛病原真菌罗尔阿太菌(Athelia rolfsii)和露湿漆斑菌(Myrotheciuum roridum)均具有优异的抑菌活性，在生物农药、微生物制剂及其他抗菌相关领域具有较好的开发应用前景，为微生物源农药的进一步研制和开发提供了优良的基础菌株。同时，也为鲁希拉菌属(Rouxiella)的活性研究提供了新的见解。
附图说明
图1为本发明实施例1中巴登鲁希拉菌(Rouxiella badensis)SP-YTie-7的菌落图。
图2为本发明实施例1中巴登鲁希拉菌(Rouxiella badensis)SP-YTie-7的扫描电镜图。
图3为本发明实施例2中巴登鲁希拉菌(Rouxiella badensis)SP-YTie-7基于16SrRNA基因序列构建的系统进化图。
图4为本发明实施例4中巴登鲁希拉菌(Rouxiella badensis)SP-YTie-7对罗尔阿太菌(Athelia rolfsii)的抑制效果图，图中，清空代表甲醇空白对照1，13代表13号菌株上清和菌体萃取液(上方：上清萃取液；下方：菌体萃取液)，70代表巴登鲁希拉菌(Rouxiellabadensis)SP-YTie-7上清和菌体萃取液(上方：上清萃取液；下方：菌体萃取液)，体空代表甲醇空白对照2。
图5为本发明实施例4中巴登鲁希拉菌(Rouxiella badensis)SP-YTie-7对露湿漆斑菌(Myrotheciuum roridum)的抑制效果图，图中，清空代表甲醇空白对照1，13代表13号菌株上清和菌体萃取液(上方：上清萃取液；下方：菌体萃取液)，70代表巴登鲁希拉菌(Rouxiella badensis)SP-YTie-7上清和菌体萃取液(上方：上清萃取液；下方：菌体萃取液)，体空代表甲醇空白对照2。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
以下实施例中使用的YIM38培养基的配方如下：葡萄糖(Glucose)4g，酵母浸粉(Yeast extract)4g/L，麦芽浸粉(Malt extract)5g/L，维生素B(B-Vitamins)1g/L，氯化钠(Trace salt)1g/L，琼脂粉(Agar)20.0g，pH 7.2。
实施例1巴登鲁希拉菌SP-YTie-7(Rouxiella badensis)的分离与筛选
1、材料采集：铁皮石斛(Dendrobium officinale)鲜茎，采自中国安徽省英山县；
2、表面消毒：石斛鲜茎表面消毒采用超纯水超声处理15min，1％Tween-20浸泡1min，3％次氯酸钠浸泡7min，2.5％硫代硫酸钠浸泡9min，75％乙醇浸泡3min，蒸馏水洗涤3次，取200μL第三次洗涤水涂布于分离培养基检查是否表面消毒干净，最后，用10％碳酸氢钠浸泡10min；
3、内生细菌分离：将消毒后的石斛鲜茎用无菌手术剪剪成0.5-1.0cm小段，置于丙酸钠培养基(SP)分离培养基上，其中包括丙酸钠(Sodium propionate)1.0g、天冬酰胺(L-Asparagine)0.2g、磷酸氢二钾(K2HPO4)0.6g、磷酸二氢钾(KH2PO4)0.9g、7水硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.1g、2水氯化钙(CaCl2·2H2O)0.02g、琼脂粉(Agar)20.0g、超纯水1L、pH值为7.2，为了给石斛内生细菌提供自然的生长条件，在培养基中添加1％的石斛茎汁。28℃、有氧条件下进行培养，直到样品内部出现单个菌落。观察并挑取外观形态特征不同的单菌落在YIM38培养基上划线纯化，经过2-3次点接纯化、转接后，得到单一菌种，对分离出的单菌落进行菌体形态观察、生理生化分析，并对生理生化特征有明显差异的菌株进行16S rRNA序列分析。
4、石斛病原真菌抑菌活性筛查：本实验采用滤纸片扩散法(Kirby-Bauer test)筛选抑菌活性菌株。将10mL在28℃、200rpm条件下培养在马铃薯葡萄糖肉汤(PotatoDextrose Broth)培养基中的石斛白绢病(Southern blight)病原真菌罗尔阿太菌(Athelia rolfsii，CBS 719.83)以及漆斑病(Tar spot disease)病原真菌露湿漆斑菌(Myrotheciuum roridum，CBS357.89)(均由中国福建省三明市农业科学研究院提供，也可通过CBS保藏中心购买获得)。发酵液分别添加到100mL的马铃薯葡萄糖琼脂(PotatoDextrose Agar)培养基中，混合均匀，然后慢慢地倒入培养皿中用作测试板。用20μL的菌株发酵萃取液浸湿无菌滤纸片(直径6mm)，等量的甲醇做为阴性对照，等量的70％代森锰锌(Mancozeb)(750倍稀释)做为阳性对照。将滤纸片晾干后放置在测试平板上，在28℃、有氧条件下培养16h，通过测量抑菌圈的直径(电子数显卡尺，0-150mm)来确定测试菌株抑菌效果。
以上述方法获得的菌株编号为SP-YTie-7的巴登鲁希拉菌(Rouxiella badensis)对两种石斛病原真菌罗尔阿太菌(Athelia rolfsii)以及露湿漆斑菌(Myrotheciuumroridum)均具有较好的抑制活性。
实施例2巴登鲁希拉菌SP-YTie-7(Rouxiella badensis)的鉴定
1、材料采集：
1、形态与生理生化鉴定
将实施例1筛选得到的菌株在YIM38培养基中培养，菌株的平板菌落形态为圆形、饱满，表面光滑、湿润，浅黄色偏白，革兰氏染色阴性，菌落形态见图1，扫描电镜观察如图2，菌体有内生孢子，呈杆状0.7-1.1μm×1.8-3.1μm(宽×长)。
参照R.E.布坎南等《伯杰细菌鉴定手册》和东秀珠等《常见细菌系统鉴定手册》对该菌株的生理生化指标鉴定结果如下表1。
表1.巴登鲁希拉菌SP-YTie-7(Rouxiella badensis)生理生化鉴定结果
Figure BDA0002645089670000071
注：“+”代表阳性反应，“-”代表阴性反应。
结合SP-YTie-7菌株的形态与生理生化特征，鉴定其为鲁希拉菌属(Rouxiella)。
2、分子鉴定
菌株SP-YTie-7总DNA的提取采用Chelex-100法(周双清等，Chelex-100快速提取放线菌DNA作为PCR扩增模板，生物技术通报，2010，2:123-125)。用无菌接种环从固体培养基上挑取适量菌体于1.5mL无菌的Eppendorf管中，加入5％的Chelex100溶液50μL，沸水浴15min，冷却至室温后，12000rpm离心5min，取上清液作为DNA模版，-20℃保存备用。16SrRNA基因PCR扩增中所使用的引物由上海生工生物工程技术有限公司合成，其序列为：27f(SEQ ID NO.1)：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R(SEQ ID NO.2)：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反应体系共50μL，包括2μL DNA模板，25μL的1×EasyTapPCR SuperMix酶，27f和1492r引物各1.5μL，20μL灭菌水。反应程序见表2。PCR产物经1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测后，送由上海生工生物工程技术有限公司进行序列测定。将测得的基因序列登陆EZBioCloud数据库(http://http://www.ezbiocloud.net/)进行16S rRNA序列比对，得到序列相似性比对结果。利用MEGA7.0中的Neighbor-joining法对其进行系统进化树的构建，如图3所示。
表2.PCR反应程序
Figure BDA0002645089670000081
分子鉴定结果表明，巴登鲁希拉菌(Rouxiella badensis)SP-YTie-7的16S rDNA与巴登鲁希拉菌(Rouxiella badensis)DSM 100043T的同源性为99.41％。
巴登鲁希拉菌(Rouxiella badensis)SP-YTie-7于2019年11月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为Rouxiella badensis，保藏编号为CGMCC NO.18776。
实施例3巴登鲁希拉菌SP-YTie-7(Rouxiella badensis)对石斛病原菌抑制剂的制备
挑选该菌株的单菌落接种到150mL的YIM38液体培养基中，在200rpm、28℃条件下振荡培养48h。将培养液在4℃、9500rpm条件下离心20min后分别收集发酵上清液和菌体。发酵上清液用等体积的乙酸乙酯进行萃取，菌体用等体积的丙酮进行萃取，接着用旋转蒸发仪(RE-52AA，YARONG，中国)在38℃条件下对萃取液进行旋转蒸发浓缩，浓缩物复溶于1mL甲醇，分别得到菌株SP-YTie-7发酵上清乙酸乙酯萃取液以及菌体丙酮萃取液，-20℃保存备用。
实施例4巴登鲁希拉菌SP-YTie-7(Rouxiella badensis)石斛病原菌抑制剂对石斛病原真菌的抑制作用
采用滤纸片扩散法(Kirby-Bauer test)对菌株SP-YTie-7进行抑菌活性筛查。将10mL在28℃、200rpm条件下培养在马铃薯葡萄糖肉汤(Potato Dextrose Broth)培养基中的石斛病原真菌罗尔阿太菌(Athelia rolfsii)以及露湿漆斑菌(Myrotheciuum roridum)发酵液分别添加到100mL的马铃薯葡萄糖琼脂(Potato Dextrose Agar)培养基中，混合均匀，然后慢慢地倒入培养皿中用作测试平板。分别用20μL菌株SP-YTie-7的发酵上清乙酸乙酯萃取液以及菌体丙酮萃取液浸湿无菌滤纸片(直径6mm)，用等量的甲醇做为阴性对照，等量的70％代森锰锌(Mancozeb)(750倍稀释)做为阳性对照。将滤纸片晾干后放置在测试平板上，在28℃、有氧条件下培养16h，通过测量抑菌圈的直径(电子数显卡尺，0-150mm)来确定测试菌株抑菌效果。
抑菌活性结果表明，菌株SP-YTie-7对两种石斛病原真菌均具有较好的抑制活性，抑菌圈直径见表3。其中，对石斛罗尔阿太菌(Athelia rolfsii)的抑制效果见图4，对石斛露湿漆斑菌(Myrotheciuum roridum)的抑制效果见图5。在图4～5中，清空代表甲醇空白对照1，13代表13号菌株上清和菌体萃取液(上方：上清萃取液；下方：菌体萃取液)，70代表巴登鲁希拉菌(Rouxiella badensis)SP-YTie-7上清和菌体萃取液(上方：上清萃取液；下方：菌体萃取液)，体空代表甲醇空白对照2。
表3.菌株SP-YTie-7对两种石斛病原真菌抑菌活性结果
Figure BDA0002645089670000091
Figure BDA0002645089670000101
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业科学院农产品加工研究所
<120> 一种石斛内生巴登鲁希拉菌SP-YTie-7及其应用
<130> KHP201113803.9
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tacggctacc ttgttacgac tt 22

Claims (7)

1.巴登鲁希拉菌（Rouxiella badensis）SP-YTie-7，其特征在于，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.18776。
2.一种菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的巴登鲁希拉菌（Rouxiella badensis）SP-YTie-7。
3.权利要求1所述的巴登鲁希拉菌（Rouxiella badensis）SP-YTie-7或权利要求2所述的菌剂在防治植物病原真菌中的应用；
所述植物病原真菌为罗尔阿太菌（Athelia rolfsii）和/或露湿漆斑菌（Myrotheciuumroridum）。
4.一种石斛病原真菌抑制剂，其特征在于，含有权利要求1所述的巴登鲁希拉菌（Rouxiella badensis）SP-YTie-7的发酵物。
5.根据权利要求4所述的石斛病原真菌抑制剂，其特征在于，所述发酵物为将所述巴登鲁希拉菌（Rouxiella badensis）SP-YTie-7经发酵后得到的菌体。
6.一种防治石斛病原真菌的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的巴登鲁希拉菌（Rouxiella badensis）SP-YTie-7防治石斛病原真菌；
所述石斛病原真菌为罗尔阿太菌（Athelia rolfsii）和/或露湿漆斑菌（Myrotheciuumroridum）。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，对石斛施用权利要求4或5所述的石斛病原真菌抑制剂，或者，将所述巴登鲁希拉菌（Rouxiella badensis）SP-YTie-7接种于石斛。
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