CN117363534A - 一种防治猕猴桃溃疡病的淡紫褐链霉菌菌株Wk-1及应用 - Google Patents
一种防治猕猴桃溃疡病的淡紫褐链霉菌菌株Wk-1及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117363534A CN117363534A CN202311359321.6A CN202311359321A CN117363534A CN 117363534 A CN117363534 A CN 117363534A CN 202311359321 A CN202311359321 A CN 202311359321A CN 117363534 A CN117363534 A CN 117363534A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- strain
- canker
- kiwi fruit
- liquid
- kiwi
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 244000298697 Actinidia deliciosa Species 0.000 title claims abstract description 86
- 235000009436 Actinidia deliciosa Nutrition 0.000 title claims abstract description 79
- 235000009434 Actinidia chinensis Nutrition 0.000 title claims abstract description 19
- 230000003405 preventing effect Effects 0.000 title claims abstract description 10
- 241000970957 Streptomyces lilacinus Species 0.000 title claims abstract description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 24
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 17
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 17
- 241000589615 Pseudomonas syringae Species 0.000 claims abstract description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 claims abstract description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 12
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 claims description 10
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 10
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 10
- 230000000443 biocontrol Effects 0.000 claims description 9
- 239000012880 LB liquid culture medium Substances 0.000 claims description 5
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 claims description 4
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 claims description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 abstract description 16
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 15
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 abstract description 11
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 abstract description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract description 7
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 5
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 abstract description 3
- 238000005507 spraying Methods 0.000 abstract description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 abstract 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 7
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 6
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 6
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 4
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 4
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 4
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 239000002420 orchard Substances 0.000 description 3
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 3
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 3
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 3
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 2
- 244000298715 Actinidia chinensis Species 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 241001576300 endophytic bacterium Species 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000011392 neighbor-joining method Methods 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 241000219068 Actinidia Species 0.000 description 1
- 241000219066 Actinidiaceae Species 0.000 description 1
- 244000144730 Amygdalus persica Species 0.000 description 1
- 241000723920 Bacillus subtilis B2 Species 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 240000006509 Gynostemma pentaphyllum Species 0.000 description 1
- 235000002956 Gynostemma pentaphyllum Nutrition 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241001631271 Prunus fasciculata Species 0.000 description 1
- 235000006040 Prunus persica var persica Nutrition 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 description 1
- 241000327293 Streptomyces enissocaesilis Species 0.000 description 1
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000035613 defoliation Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 235000013325 dietary fiber Nutrition 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000015203 fruit juice Nutrition 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N iron(III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]=O JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000012982 microporous membrane Substances 0.000 description 1
- 239000002366 mineral element Substances 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 241001446247 uncultured actinomycete Species 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
- A01G13/00—Protecting plants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
- A01G7/00—Botany in general
- A01G7/06—Treatment of growing trees or plants, e.g. for preventing decay of wood, for tingeing flowers or wood, for prolonging the life of plants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
- A01N63/28—Streptomyces
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01P—BIOCIDAL, PEST REPELLANT, PEST ATTRACTANT OR PLANT GROWTH REGULATORY ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR PREPARATIONS
- A01P1/00—Disinfectants; Antimicrobial compounds or mixtures thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/465—Streptomyces
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Virology (AREA)
- Ecology (AREA)
- Forests & Forestry (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Dentistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Botany (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种防治猕猴桃溃疡病的淡紫褐链霉菌菌株Wk‑1及应用，属淡紫褐链霉菌，保藏编号：CGMCC NO.27261，保藏日期：2023年5月4日，保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。利用菌株Wk‑1防治猕猴桃溃疡病的方法为：将菌株Wk‑1接种至液体LB培养基中进行培养，获得发酵种子液后再扩大培养，最后将发酵培养液配成稀释液，对准猕猴桃植株喷洒。该菌株是从健康猕猴桃植株中分离纯化获得的内生细菌，对猕猴桃细菌性溃疡病病原菌丁香假单胞菌猕猴桃致病变种有很强的拮抗作用，能够明显抑制该病原菌的生长，可以有效防治猕猴桃溃疡病，为猕猴桃溃疡病生物防治提供了新的微生物种质资源。
Description
技术领域
本发明属于植物保护的生物防治技术领域，具体指一种猕猴桃溃疡病生防菌株淡紫褐链霉菌Wk-1及应用该菌株防治猕猴桃溃疡病的方法。
背景技术
猕猴桃（Actinidia Lindl）是隶属猕猴桃科猕猴桃属的多年生藤本植物，别称毛桃、羊桃、奇异果（Kiwifruit）。其果实含有丰富的膳食纤维、维生素、矿质元素、氨基酸以及生物活性物质，尤其Vc含量高（100 g鲜果肉中达90~420 mg），素有“水果之王”的美誉；猕猴桃可以鲜食，也可加工成果酱、果汁等，还有重要的医疗保健价值，具有广阔的市场前景。
近些年来，猕猴桃产业已在全球30多个国家迅猛发展，栽培总面积约20万公顷，产量达240万吨，其中中国猕猴桃栽培面积和产量最大，分别占世界份额的53%和38%，意大利次之，新西兰位列第三。随着猕猴桃种植面积逐年增加和生产规模逐渐扩大，猕猴桃病害问题也日益突显。其中最典型的是猕猴桃细菌性溃疡病，该病由丁香假单胞菌猕猴桃致病变种（Pseudomonas syringae pv. actinidiae）引起，主要危害猕猴桃的主干、枝蔓和叶片等，具有传播迅速、致病性强、防治难度大等特点，极易短期内造成树体大面积死亡。
目前，控制猕猴桃溃疡病的措施除了科学规范的农业管理外，主要包括优良抗性品种选育、化学防治和生物防治，其中生物防治具有环境友好、人畜安全、可持续性、对病原菌特异性强等特征，符合人们对绿色食品的需求而受到众多学者青睐。邵宝林等（2015）从猕猴桃根际土壤获得生防芽孢杆菌B2，盆栽和田间试验均表现出一定的防治溃疡病功效；崔丽红等（2017）从绞股蓝根际土壤获得细菌（JDG6、JDG16、JDG23）能够明显减轻猕猴桃果园溃疡病的发生；Kim等（2019）从猕猴桃根际和叶围分离到3株放线菌，对其溃疡病具有显著防治效果；Wicaksono等（2018）从药用植物Mānuka分离到3株抑制溃疡病菌Psa的内生细菌，能一定程度减轻美味和中华猕猴桃中溃疡病发生等。虽然有关猕猴桃溃疡病的生物防治研究取得了一些成绩，但仍然存在严重不足：目前多数生防菌株来源于土壤、猕猴桃根际和叶围，应用过程中极易受到环境因素（气候、温湿度、土壤性质等）影响，生防效果不稳定和不理想。由于内生微生物对宿主植物的选择具有特异性，且不易收到外界环境因子的干扰。故此，研发猕猴桃土著内生细菌作为其溃疡病生防菌株具有广泛的应用前景。
发明内容
本发明要解决的技术问题就是克服现有技术的不足，提供一种猕猴桃土著内生细菌，该细菌是猕猴桃溃疡病致病菌丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的拮抗菌株，运用该菌株能高效防治猕猴桃溃疡病；同时，本发明还提供了运用该菌株生物防治猕猴桃溃疡病的方法。
本发明人在湖南湘西地区猕猴桃种植园采样点，采集健康的“米良1号”和“红阳”猕猴桃植株枝条和叶片，放入冰盒中带回实验室，从该样品中分离、筛选得到1株抑制猕猴桃溃疡病致病菌生长的内生细菌菌株，即丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的拮抗菌株，经鉴定后命名为淡紫褐链霉菌Wk-1（Streptomyces enissocaesilis Wk-1），并进行了保藏，保藏编号：CGMCC NO. 27261，保藏日期：2023年5月4日，保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
所述菌株Wk-1的分离和筛选步骤包括：
（1）以湖南湘西地区猕猴桃溃疡病频发的果园为采样点，采集健康的“米良1号”和“红阳”猕猴桃植株的枝条和叶片，放入冰盒中带回实验室备用。将枝条和叶片样品进行表面消毒，剪切成合适大小放入灭菌后的研砵中，加入5-10 mL无菌水进行研磨。静置5-10min，吸取上层液体，依次进行10-1倍、10-2倍、10-3倍梯度稀释；分别取0.1 mL稀释液涂布于LB培养基固体平板，每个稀释度重复3次，于28℃倒置培养。
（2）待涂布的平板上长出单菌落，挑取不同形态的菌落，采用四区划线法分别接种于LB固体培养基上培养；重复纯化3代，转接于LB固体培养基斜面试管培养后4℃保存。
（3）将猕猴桃溃疡病病原菌丁香假单胞菌猕猴桃致病变种接种至LB液体培养基培养24 h，吸取菌液涂布于LB固体培养基平板中备用。挑取分离的内生细菌单菌落点种于该平板上，每个平板接种3~4个位点，于28℃恒温培养，观察抑菌情况，产生抑菌圈的即为丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的拮抗菌株。
（4）将初筛的拮抗菌株发酵培养，离心后吸取200 mL发酵液，移入涂布有丁香假单胞菌猕猴桃致病变种平板的牛津杯中，观察牛津杯周围抑菌圈的大小，筛选拮抗效果强的菌株。基于形态学和16S rRNA基因序列分析鉴定菌种。
获得的拮抗丁香假单胞菌猕猴桃致病变种效果优良的内生细菌即为猕猴桃溃疡病的生防菌株，可用于猕猴桃溃疡病的生物防治，其步骤为：
（1）将上述丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的拮抗菌株接种至LB液体培养基中进行培养，获得发酵种子液；
（2）将发酵种子液接种至LB液体培养基进行扩大培养，得到发酵培养液。
（3）将发酵培养液配成一定浓度稀释液（包含菌体，其浓度≥0.8×103 cfu/mL，即每毫升细菌菌落总数大于等于800个），对准猕猴桃植株喷洒，即可实现猕猴桃溃疡病的有效防治。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供了一种新的猕猴桃溃疡病生防菌株Wk-1，是猕猴桃土著内生菌株，即猕猴桃溃疡病致病菌丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的拮抗菌株，经鉴定后命名为淡紫褐链霉菌Wk-1（Streptomyces enissocaesilis Wk-1）。
该菌株是从采集的猕猴桃植株枝条中分离纯化获得的内生细菌，对猕猴桃细菌性溃疡病病原菌丁香假单胞菌猕猴桃致病变种有很强的抑制作用，能够明显抑制猕猴桃细菌性溃疡病病原菌的生长与繁殖，可有效防治猕猴桃溃疡病发生，为猕猴桃溃疡病生物防治提供了新的微生物种质资源。
由于该菌株为猕猴桃内生细菌，可与植物组织互利共生，受外界环境因子干扰小，性能稳定，喷湿方便，防治猕猴桃溃疡效果显著，为猕猴桃溃疡的防治提供了一条环保、简洁、有效的方法，利于环境保护和有机猕猴桃的生产。
具体实施方式
现结合具体实施例对猕猴桃溃疡病生防菌株Wk-1及应用菌株Wk-1防治猕猴桃溃疡病的方法进一步具体说明。
2021年2月，以湖南湘西地区猕猴桃种植园为采样点，经纬度N26°36'29E114°07'35，采集未染病的“米良1号”和“红阳”猕猴桃植株枝条和叶片样品，放入冰盒中带回实验室备用。依次用75%乙醇浸泡1 min、1%次氯酸钠5 min、75%乙醇1 min分别对枝条和叶片样品进行表面消毒，剪切成合适大小放入灭菌后的研砵中，加入5-10 mL无菌水进行研磨。静置5-10 min，吸取上层液体，依次进行10-1倍、10-2倍、10-3倍梯度稀释。分别取0.1 mL 各梯度稀释液涂布于LB培养基平板，每个稀释度重复3次，于28℃恒温培养箱中倒置培养1−2 d，待涂布的平板上长出单菌落；挑取不同形态的菌落，采用四区划线法分别接种于LB固体培养基上培养；反复纯化3代，转接LB固体培养基试管斜面培养后保存于4℃冰箱内。
将猕猴桃溃疡病病原菌丁香假单胞菌猕猴桃致病变种隔夜培养后取50 μL菌液，涂布于LB培养基上备用。挑取分离的内生细菌单菌落点种于该平板上，每个平板接种3~4个位点，于28℃恒温培养，2-3 d后观察抑菌情况，产生抑菌圈的即为丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的拮抗菌株。
将抑菌活性较强菌株接种至5 mL LB液体培养基中，于28℃、180 r/min振荡培养24 h制成种子液，随后取100 μL接入50 mL LB液体培养基中，于28℃、180 r/min培养发酵48 h，将发酵液移入无菌离心管中，4℃、10000 r/min离心10 min，离心后用0.22 μm微孔滤膜过滤器上清备用。同时，将病原菌丁香假单胞菌猕猴桃致病变种隔夜培养，取50 μL菌液涂布于LB培养基上备用。
将牛津杯放置于涂有病原菌的平板上，取上清液200 μL移入牛津杯中，每株菌重复3次，于28℃恒温培养，2-3 d后观察抑菌情况，得到一株抑菌圈直径达与菌落直径比为2.2倍的优良菌株。
该菌株在LB培养基培养96 h后，菌落细小，淡紫色，表面光滑，菌落基底（基丝）嵌入培养基、呈暗褐色，难挑起，培养基中见可溶性微褐色色素。采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取分离细菌总DNA，利用细菌通用引物PA/PB（PA: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA G-3'；PB:5'-TTAAGGTGATCCA GCCGCA-3'）对分离菌株的16S rRNA基因片段进行PCR扩增，反应体系为：Taq PCR Mix (2×) 25 μL；正反引物各1 μL；模板2 μL；无菌水补齐至50 μL。PCR程序为：95℃预变性2.5 min；95℃变性15 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃后延伸10 min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检验后，送生工生物工程（上海）有限公司进行序列测定。将测得的序列提交GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）数据库，采用Blast工具软件搜索同源序列并进行比对，运用Mega7.0软件的邻位加入法（neighbor joining，NJ）构建系统发育树，根据系统发育关系分析，将菌株鉴定和命名为淡紫褐链霉菌Wk-1（Streptomyces enissocaesilis Wk-1），是一种放线菌，并进行了保藏，保藏编号：CGMCCNO. 27261，保藏日期：2023年5月4日，保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
将上述猕猴桃溃疡病生防菌株，用于猕猴桃溃疡病的生物防治，具体实施步骤为：
将菌株Wk-1接种至100 mL LB液体培养基中，于28℃、180 r/min振荡培养24 h，获得发酵种子液；将发酵种子液按5%接种量接种至1 L LB液体培养基中，于28℃、180 r/min振荡培养，当OD 600达到1.0时收获发酵培养液。
将发酵培养液配成一定浓度稀释液（包含菌体，其浓度为850 cfu/mL，即每毫升细菌菌落总数为850个），作为处理组1，72%农用链霉素600倍稀释液作为处理组2，无菌清水为对照组（处理组3）。田间药效试验：选取3个树龄3~5 a生红阳猕猴桃园，在每个果园随机划分3个小区用于3个处理，每个处理50株，3个果园即3个重复，每组调查150株猕猴桃。在秋季采果后至落叶前的关键时期，以每个处理对应的药剂进行猕猴桃全株喷雾，喷施3次，间隔10 d。在春季猕猴桃溃疡高发期（2~3月）统计各处理组中枝干、黄褐色或锈红色溃疡发病株占处理总株数的百分比，并以此为溃疡发病率即病株率，按照下式计算不同处理的田间防病效果。
防病效果=(对照组发病率-处理组发病率)/对照组发病率×100%
经过统计，发现菌株Wk-1组（处理组1）的田间药效试验平均抑制率达90.3%，72%农用链霉素600倍稀释液组（处理组2）的田间药效试验平均抑制率为67.4%。进一步田间防治试验证明：将菌株Wk-1发酵培养液再稀释10倍（0.8×102cfu/mL）仍具有较强的猕猴桃溃疡病防治效果，可达84.5%，优于72%农用链霉素600倍稀释液。由此可见，淡紫褐链霉菌Wk-1对猕猴桃溃疡病的防治效果比较理想，是一株优良的猕猴桃溃疡病生防菌株。
Claims (2)
1.一种防治猕猴桃溃疡病的淡紫褐链霉菌菌株Wk-1，属放线菌，鉴定为淡紫褐链霉菌（Streptomyces enissocaesilis），是猕猴桃溃疡病的生防菌株，也是丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的拮抗菌株，保藏编号：CGMCC NO. 27261，保藏日期：2023年5月4日，保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
2.权利要求1所述淡紫褐链霉菌菌株Wk-1防治猕猴桃溃疡病的方法，其特征在于包括以下几个步骤：
（1）将菌株Wk-1接种至LB液体培养基中进行培养，获得发酵种子液；
（2）将发酵种子液接种至LB液体培养基中扩大培养，得到发酵培养液；
（3）将发酵培养液配成一定浓度稀释液（菌体浓度≥0.8×103cfu/mL），对准猕猴桃植株喷洒。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311359321.6A CN117363534A (zh) | 2023-10-20 | 2023-10-20 | 一种防治猕猴桃溃疡病的淡紫褐链霉菌菌株Wk-1及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311359321.6A CN117363534A (zh) | 2023-10-20 | 2023-10-20 | 一种防治猕猴桃溃疡病的淡紫褐链霉菌菌株Wk-1及应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117363534A true CN117363534A (zh) | 2024-01-09 |
Family
ID=89396094
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311359321.6A Pending CN117363534A (zh) | 2023-10-20 | 2023-10-20 | 一种防治猕猴桃溃疡病的淡紫褐链霉菌菌株Wk-1及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117363534A (zh) |
-
2023
- 2023-10-20 CN CN202311359321.6A patent/CN117363534A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN112175888B (zh) | 贝莱斯芽孢杆菌Hsg1949及其应用 | |
| CN108148794B (zh) | 一种广谱抑菌活性的枯草芽孢杆菌DYr3.3及制备方法和应用 | |
| CN110628687B (zh) | 链霉菌5017及其在拮抗植物病原菌中的应用 | |
| CN113801808B (zh) | 一株阿比科恩链霉菌及其应用 | |
| CN113549578B (zh) | 一株抑制稻瘟病菌和促进种子发芽的暹罗芽孢杆菌BsNlG13及其应用 | |
| CN109112069B (zh) | 一种生防内生真菌及其应用 | |
| CN117165494A (zh) | 一种猕猴桃溃疡病生防菌株Wq-1及其应用 | |
| CN109749953B (zh) | 蜡样芽孢杆菌、菌剂及其制备方法和应用 | |
| CN115960777B (zh) | 一株假真菌样芽孢杆菌及其在蔬菜疫病防治中的应用 | |
| CN108441443B (zh) | 一株防治植物线虫的菌株及其应用 | |
| CN108102992B (zh) | 一株金橙黄微小杆菌及其在防治番茄根结线虫中的应用 | |
| CN114032182B (zh) | 一株兼具拮抗大蒜根腐病病原菌和促生功能的真菌 | |
| CN114085788B (zh) | 一株雅马纳假单胞菌菌株及其应用 | |
| CN114933980B (zh) | 一种防治黄精根腐病的浅紫链霉菌hjb-xtbg45及其应用 | |
| CN112322561B (zh) | 一株克雷伯氏菌及其在果树梨火疫病防治中的应用 | |
| CN116240126A (zh) | 一株多功能贝莱斯芽孢杆菌sb10及其应用 | |
| CN109207398B (zh) | 一株施氏假单胞杆菌及其应用 | |
| CN114467975A (zh) | 一株马胃葡萄球菌在防治果蔬病害上的应用 | |
| CN110607249B (zh) | 链霉菌生防菌株及其应用 | |
| CN117363534A (zh) | 一种防治猕猴桃溃疡病的淡紫褐链霉菌菌株Wk-1及应用 | |
| CN117363537A (zh) | 一种丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的拮抗菌株Wt-1及应用 | |
| CN117106677A (zh) | 一种拮抗猕猴桃溃疡病病原菌的沙福芽孢杆菌Ws-1及应用 | |
| CN111647540A (zh) | 一种防治连作植物根病的生防菌的获取方法 | |
| KR20090105726A (ko) | 고추의 세균성점무늬병과 탄저병을 방제하는 바실러스메가테리움 22-5 균주 | |
| CN116218742B (zh) | 一株拮抗掘氏疫霉菌的地衣芽孢杆菌及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |