CN114426940B - 一株毒三素链霉菌bfs-1及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株毒三素链霉菌BFS‑1及其应用。本发明从灌木鹅掌柴的根际土壤中筛选分离得到一株毒三素链霉菌(Streptomyces toxytricini)BFS‑1菌株，该菌株于2020年9月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心保藏，其保藏编号为GDMCC No：61183。本发明研究表明，毒三素链霉菌BFS‑1菌株对箭叶海芋茎基腐病具有强烈的抑制作用，且来源环保无毒性，对生态环境影响小；另外，毒三素链霉菌BFS‑1菌株的培养条件要求低，对花卉病原菌镰刀菌、疫霉属以及欧文氏菌属病原菌均有较好的抑制作用，抑菌谱广，可用于防治多种农业生产中的植物病害。
Description
技术领域
本发明属于农业微生物技术领域。更具体地，涉及一株毒三素链霉菌BFS-1及其应用。
背景技术
镰刀菌是重要的植物病原真菌，该类真菌可以侵染农作物、蔬菜、果树和花卉等各类植物，引起根茎腐病和枯萎病等，对生产造成严重影响。镰刀菌通常从植物的根茎部侵染，造成植物根茎腐烂，维管束变褐，植株枯萎死亡。比较著名病害的如香蕉枯萎病、黄瓜枯萎病和兰花枯萎病等等。由镰刀菌引起的病害通常发病进程慢，受害植物约15～30天全株枯死。病原菌常以菌丝或厚垣孢子在土壤中越冬，借助土壤、流水和农事操作等传播蔓延，病害一旦发生很难防控。
箭叶海芋(Alocasia longiloba Miq.)属天南星科海芋属植物，又名小仙女、观音莲，天南星科，海芋属多年生上升草本植物。主要分布于我国云南南部、广东和海南等地。该植物在我国南方作物观赏小盆栽被商品化种植。箭叶海芋茎基腐病是近年来生产中出现的一种新病害(Zhang et al.,2021)，该病害主要为害植物的根茎部，造成根和茎基部的腐烂，植株枯萎、死亡。据调查显示，箭叶海芋茎基腐病在我国广东发病严重时，发病率达到10％，对生产造成一定的影响。由于该病害是由镰刀菌(Fusarium elaeidis)引起的土传病害，生产上防控较为困难。因此，如何采取有效地措施已成为当前亟待解决的问题。
目前，针对镰刀菌引起的土传病害的防治方法主要采用化学药剂防治、生物防治和农业防治等。但是，化学药剂防治会产生一定的抗药性和药剂残留等环境问题，农业防治常会有一定的局限性，因此，生物防治已成为该类病害的防治的研究热点。目前，已有部分微生物在该类病害的防治上表现出良好的应用前景，如现有技术报道放线菌肉桂栗色链霉菌(Streptomycescin namocastaneus)HJG-5菌株的粉剂和颗粒剂对黄瓜枯萎病(Fusariumoxysporum f.sp.cucumebrium)的盆栽防效达到60％以上。放线菌米修链霉菌Streptomyces misionensis对禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)和假禾谷镰刀菌(Fusarium pseudograminearum)引起的小麦茎基腐病盆栽实验显示出良好的防治效果。但目前还未见有对箭叶海芋茎基腐病有防效的生防菌的报道，因此，需要寻找新的菌株用于箭叶海芋茎基腐病的防治，为该病害的防治提供更多更有效的选择。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服以上的缺陷和不足，筛选出对箭叶海芋茎基腐病菌有抑制作用的生防菌，为箭叶海芋茎基腐病的防治提供更多更有效的选择。
本发明的目的是提供一株毒三素链霉菌(Streptomyces toxytricini)BFS-1菌株。
本发明的第二个目的是提供所述毒三素链霉菌BFS-1菌株的应用。
本发明的第三个目的是提供一种防治箭叶海芋茎基腐病的生物制剂。
本发明的第四个目的是提供一种防治箭叶海芋茎基腐病的方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供了一株毒三素链霉菌(Streptomyces toxytricini)BFS-1菌株，该菌株已于2020年9月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC No：61183，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。该菌株是从灌木鹅掌柴的根际土壤中筛选分离得到的，其培养条件要求低，在高氏一号培养基上培养48h后观察，其单菌落为圆形，粉红色，表面粉状，不透明，略隆起，边缘呈放射状带白色边沿。该菌株经16S rDNA序列分析，其序列与GenBank中S.toxytricini(登陆号为KY007175.1和KY007169.1)的同源性达100％。
本发明通过研究获得一株新的对箭叶海芋茎基腐病具有很好的抑制效果的微生物菌，即毒三素链霉菌(Streptomyces toxytricini)BFS-1菌株，本发明研究测定毒三素链霉菌BFS-1菌株的活体菌块对箭叶海芋茎基腐病F.elaeidis具有明显抑制作用，产生平均带宽为8.5mm的抑菌带，使靠近拮抗菌一侧的箭叶海芋茎基腐病F.elaeidis菌丝停止生长；且毒三素链霉菌BFS-1菌株对国兰枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、碧玉疫病(Phytophthora sp.)和建兰蘖腐病菌(Erwinia sp.)有较好的抑制作用，抑菌带宽分别为7.5mm、5.8mm、5.0mm，抑菌普较广。表明毒三素链霉菌BFS-1菌株对箭叶海芋茎基腐病具有强烈的抑制作用，同时对多种花卉病原菌具有抑菌作用，且来源环保无毒性，对生态环境影响小。
因此，以下应用均应在本发明的保护范围之内：
本发明提供三素链霉菌BFS-1菌株或其菌块、发酵菌液在制备防治箭叶海芋茎基腐病的生物制剂中的应用。
本发明提供一种防治箭叶海芋茎基腐病的生物制剂，含三素链霉菌BFS-1菌株和/或其菌块、发酵菌液。
本发明提供所述三素链霉菌BFS-1菌株或其菌块、发酵菌液在防治箭叶海芋茎基腐病中的应用。
本发明提供一种防治箭叶海芋茎基腐病的方法，将三素链霉菌BFS-1菌株接种至培养基中进行培养，取培养后的菌块或发酵菌液对箭叶海芋茎基腐病进行处理。
优选地，所述培养基为高氏一号固体培养基。
优选地，所述培养条件为25～35℃培养24～72h。
更优选地，所述培养条件为28℃培养48h。
本发明提供所述三素链霉菌BFS-1菌株或其菌块、发酵菌液在抑制花卉病原菌或防治花卉病害中的应用。
优选地，所述花卉病原菌为镰刀菌(Fusarium elaeidis)、疫霉属(Phytophthorasp.)或欧文氏菌属(Erwinia sp.)病原菌。
优选地，所述花卉病害为国兰枯萎病、碧玉疫病或建兰蘖腐病中的一种或多种。
本发明通过制备毒三素链霉菌BFS-1菌株的发酵菌液，对上述四种病原菌同样表现出较强的抑菌作用，抑菌效果与固体培养物的效果相似。因此，可以通过制备毒三素链霉菌BFS-1菌株发酵菌液应用于花卉病害的田间防治，为田间应用提供生产技术。同时，将菌株BFS-1经高氏一号液体培养基培养后的发酵菌液用于田间防治箭叶海芋茎基腐病、国兰枯萎病、碧玉疫病及建兰蘖腐病，均获得与室内抗菌具有一致性的防效。
本发明具有以下有益效果：
本发明筛选研究得到一株毒三素链霉菌(Streptomyces toxytricini)BFS-1菌株，BFS-1菌株的培养条件要求低，对箭叶海芋茎基腐病菌具有强烈的抑制作用，产生平均带宽为8.5mm的抑菌带，使靠近拮抗菌一侧的箭叶海芋茎基腐病F.elaeidis菌丝停止生长；且毒三素链霉菌BFS-1菌株对其它花卉根茎部病菌国兰枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、碧玉疫病(Phytophthora sp.)和建兰蘖腐病菌(Erwinia sp.)病原菌均有较好的抑制作用，抑菌带宽分别为7.5mm、5.8mm、5.0mm，抑菌谱较广，且来源环保无毒性，对生态环境影响小。
附图说明
图1为菌株BFS-1在高氏一号培养基上的菌落照；
图2为菌株BFS-1对箭叶海芋茎基腐病菌的对峙作用图；
图3为不接种菌株BFS-1的对照平板CK；
图4为菌株BFS-1对国兰枯萎病菌的对峙作用图；
图5为菌株BFS-1对碧玉疫病的对峙作用图；
图6为菌株BFS-1对建兰蘖腐病菌的对峙作用图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
以下实施例中所述培养基配方如下：
高氏一号培养基：可溶性淀粉20g，KNO3 1g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O0.5g，NaCl0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，琼脂20g，水1000mL，pH＝7.4～7.6；121℃灭菌20分钟后，冷却后贮存备用。
高氏一号培养液：可溶性淀粉20g，KNO3 1g，K2 HPO4·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O0.5g，NaCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，水1000mL。调节pH值至7.4～7.6。121℃灭菌20分钟后，冷却后贮存备用。
国兰枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、碧玉疫病(Phytophthora sp.)和建兰蘖腐病菌(Erwinia sp.)病原菌来源均来自于本实验室分离保存。
实施例1菌株的分离与鉴定
1、菌株的分离鉴定
菌株分离自灌木鹅掌柴根际土壤，命名为BFS-1。将菌株在高氏一号培养基上培养48h后观察，其单菌落为圆形，粉红色，表面粉状，不透明，略隆起，边缘白色、呈放射状带，其结果如图1所示。
2、16S rDNA分子生物学鉴定：
提取菌株基因组DNA为模板，采用16S rDNA细菌通用引物(27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1429R:5'-GGTTACCTT GTTACGACTT-3')进行PCR扩增，PCR扩增的程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸90s，30个循环，最后72℃延伸10min；PCR的体系为(25μL)：Taq PCR MasterMix 12.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，DNA模板1μL，ddH2O 9.5μL。扩增产物委托广州市天一辉远基因科技有限公司进行测序。
该菌株经16S rDNA序列分析，其序列与GenBank中S.toxytricini(登陆号为KY007175.1和KY007169.1)的同源性达100％。因此，鉴定该菌株隶属于放线菌纲链霉菌科链霉菌属-毒三素链霉菌(Streptomyces toxytricini)。
基于上述鉴定结果，将该菌株命名为毒三素链霉菌(Streptomyces toxytricini)BFS-1菌株，并于2020年9月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCCNo：61183，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
实施例2菌株BFS-1培养物对箭叶海芋茎基腐病菌的活性
采用平板对峙法测定毒三素链霉菌BFS-1菌株活体菌和菌株培养物的活性，将毒三素链霉菌BFS-1菌株接种于高氏一号培养基中，于28℃培养48h。用内径为6mm的打孔器在高氏一号培养的毒三素链霉菌BFS-1菌株上打孔，取6mm的毒三素链霉菌BFS-1菌块，在距该菌块2cm处接种箭叶海芋茎基腐病菌(F.elaeidis)。每个处理重复3次，培养5天后，测量抑菌带宽度。
经测定BFS-1菌株的活体菌块对F.elaeidis具有明显抑制作用，结果如图2所示，产生平均带宽为8.5mm的抑菌带，使靠近拮抗菌一侧的F.elaeidis菌丝停止生长。图3为不接种菌株BFS-1的对照平板CK。
实施例3菌株BFS-1培养物的抗菌谱
本实施例为了检测毒三素链霉菌BFS-1菌株的抗菌谱，采用以下几种花卉植物病原菌：国兰枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、碧玉疫病(Phytophthora sp.)和建兰蘖腐病菌(Erwinia sp.)为对象，通过抑菌圈法测定BFS-1菌株的抗菌谱。
将毒三素链霉菌BFS-1菌株接种于高氏一号固体平板培养基中，于28℃培养48h。用内径为0.6mm的打孔器在高氏一号固体平板培养物上打孔，取BFS-1的菌块。在培养基上与BFS-1菌块距离3cm处分别接种国兰枯萎病菌和碧玉疫病的菌块；将建兰蘖腐病菌悬液取1mL加入到溶化的PDA培养基中，倒平板，待凝固后，在平板上面接种BFS-1。对照平板不接种放线菌BFS-1。每个处理重复3次，在28℃恒温培养箱内培养，5天后测量抑菌带宽度。
结果如图4～6所示，菌株BFS-1对国兰枯萎病菌、碧玉疫病和建兰蘖腐病菌有较好的抑制作用，抑菌带宽分别为7.5mm、5.8mm、5.0mm。由此可知，毒三素链霉菌BFS-1菌株对这几种病害的病原菌都有较好的抑菌作用，表明该菌株抗菌谱广。
实施例4菌株BFS-1发酵菌液的制备
采用实施例1中分离得到的毒三素链霉菌BFS-1菌株在高氏一号培养基上28℃培养24h后，接种至高氏一号培养液中，于28℃、200r/min振荡培养48h，即可得到发酵菌液。
将上述得到的发酵菌液，分别于与箭叶海芋茎基腐病菌、国兰枯萎病菌、碧玉疫病和建兰蘖腐病菌四种花卉病原真菌进行平板对峙实验，用内径为0.6mm的打孔器在PDA平板上打孔，孔内加入BFS-1发酵菌液80μL，在距该孔3cm处接种箭叶海芋茎基腐病菌、国兰枯萎病菌和碧玉疫霉菌块。建兰蘖腐病菌按照实施例3方法制作含菌平板，待凝固后，打孔接入BFS-1发酵菌液80μL。
结果表明，制备得到的毒三素链霉菌BFS-1菌株发酵菌液对上述四种病原菌同样表现出较强的抑菌作用，抑菌效果与固体培养物的效果一致。因此，可以通过制备毒三素链霉菌BFS-1菌株发酵菌液应用于花卉病害的田间防治，为田间应用提供生产技术。
综上所述，毒三素链霉菌BFS-1除了对箭叶海芋茎基腐病菌有较好的抑菌效果外，对其它花卉病菌国兰枯萎病菌、碧玉疫病和建兰蘖腐病菌也有较好的抑制作用，抑菌谱广。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1. 一株毒三素链霉菌（Streptomyces toxytricini）BFS-1菌株，其特征在于，该菌株于2020年9月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC No：61183。
2. 权利要求1所述毒三素链霉菌BFS-1菌株或其菌块、发酵菌液在制备防治箭叶海芋茎基腐病的生物制剂中的应用，其特征在于，所述箭叶海芋茎基腐病的病原菌为Fusarium elaeidis。
3. 一种防治箭叶海芋茎基腐病的生物制剂，其特征在于，含权利要求1所述毒三素链霉菌BFS-1菌株、其菌块和/或发酵菌液；所述箭叶海芋茎基腐病的病原菌为Fusarium elaeidis。
4. 权利要求1所述毒三素链霉菌BFS-1菌株或其菌块、发酵菌液在防治箭叶海芋茎基腐病中的应用，其特征在于，所述箭叶海芋茎基腐病的病原菌为Fusarium elaeidis。
5. 一种防治箭叶海芋茎基腐病的方法，其特征在于，将权利要求1所述毒三素链霉菌BFS-1菌株接种至培养基中进行培养，取培养后的菌块或发酵菌液对箭叶海芋茎基腐病进行处理；所述箭叶海芋茎基腐病的病原菌为Fusarium elaeidis。
6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述培养基为高氏一号固体培养基。
7. 根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述培养条件为25～35℃培养24～72 h。
8. 权利要求1所述毒三素链霉菌BFS-1菌株或其菌块、发酵菌液在抑制花卉病原菌或防治花卉病害中的应用，其特征在于，所述花卉病原菌为镰刀菌Fusarium elaeidis、国兰枯萎病菌的病原菌Fusarium oxysporum、碧玉疫病的病原菌Phytophthora sp.或建兰蘖腐病的病原菌Erwinia sp.；所述花卉病害为国兰枯萎病、碧玉疫病或建兰蘖腐病中的一种或多种。
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