CN108441453B - 一株具有广谱抗菌活性的萨拉曼卡假单胞菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株具有广谱抗菌活性的假单胞菌SKL108，其分类命名为萨拉曼卡假单胞菌（Pseudomonas helmanticensis），保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.15571，保藏日期为2018年4月9日，本发明还公开了该菌株在大田及经济作物病害防治中的应用；本发明的假单胞菌SKL108，对水稻纹枯病、稻曲病、水稻恶苗病、小麦赤霉病、小麦纹枯病、小麦全蚀病、番茄灰霉病、草莓灰霉病、草莓炭疽病、葡萄溃疡病等病原菌都有强烈的抑制活性，且抗菌效果持久、稳定，具备从中开发出新型、高效、广谱生防杀菌剂的巨大潜力，为微生物应用于生物防治的开发提供了新的途径。

Description

一株具有广谱抗菌活性的萨拉曼卡假单胞菌及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是一种具有广谱抗菌活性的假单胞菌SKL108，以及该菌株在大田及经济作物病害防治中的应用。

背景技术

在田间的自然生态系统中，农作物面临多种病原菌的侵染威胁，其种类和栽培方式的多样化，使得作物病害日趋严重，目前国内传统的防治方法还主要依靠化学农药，但长期的使用产生了抗药性，且农药残留严重的污染了农产品和环境，危及人畜健康，制约了农业生产的可持续发展，已成为当前严重的社会问题之一。为此，利用有益微生物防治作物病虫害，提高作物产量成为研究热点。微生物防治是生物防治的一种，它利用生物物种间的相互关系，如竞争作用、抗生作用、寄生作用、溶菌作用及诱导抗性等，以活菌或其产物抑制病原真菌的生长，其优点在于不污染环境、对人和其他生物安全、产品无残留、节约能源并能保持生态平衡等，鉴于此，广谱高效的生物杀菌剂亟待开发。

近年来，土壤微生物的研究日趋成为热点，其中假单胞菌在作物病害生物防治中发挥重要的作用，它可以通过营养竞争和代谢产物的抗生作用来抑制病原菌的生长。在我国，用于防治作物病原菌的生防假单胞菌主要有荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、丁香假单胞菌、绿针假单胞菌等，目前，可应用拮抗大田和经济作物病原真菌于萨拉曼卡假单胞菌未见报道。

发明内容

针对上述问题，申请人从南京紫金山土壤中分离到一株具有广谱抗菌活性的假单胞菌SKL108，通过16s rRNA克隆和序列分析，发现该假单胞菌株属于萨拉曼卡假单胞菌，具有广谱抗菌活性。

本发明首先提供了一株萨拉曼卡假单胞菌(Pseudomonas helmanticensis)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏编号为CGMCC No.15571，保藏日期为2018年4月9日。

申请人将该萨拉曼卡假单胞菌自命名为SKL108，其形态学特征为：菌体为杆状，革兰氏染色阴性，VP实验阳性，能水解精氨酸双水解酶、柠檬酸，不水解β-半乳糖甘酶，氧化酶和接触酶实验均为阳性。

其次，本发明同时提供了上述保藏编号为CGMCC No.15571的萨拉曼卡假单胞菌在抑制水稻纹枯病、稻曲病、水稻恶苗病、小麦赤霉病、小麦纹枯病、小麦全蚀病、番茄灰霉病、草莓灰霉病、草莓炭疽病、葡萄溃疡病等病原菌中的应用。

具体而言，上述应用是指：在农作物病害零星发生时，将所述萨拉曼卡假单胞菌配置成含菌量约为10¹⁰cfu/ml的菌液或微生物菌剂，稀释500倍后，按15ml/m²的用量均匀喷洒在大田植物叶面上，10天后再按相同用量喷洒一遍，连用3次，用以防治农作物水稻纹枯病、稻曲病、水稻恶苗病、小麦赤霉病、小麦纹枯病、小麦全蚀病、番茄灰霉病、草莓灰霉病、草莓炭疽病、葡萄溃疡病。

与现有技术相比，本申请提供的萨拉曼卡假单胞菌(Pseudomonas

helmanticensis)SKL108菌株能有效抑制水稻纹枯病、稻曲病、水稻恶苗病、小麦赤霉病、小麦纹枯病、小麦全蚀病、番茄灰霉病、草莓灰霉病、草莓炭疽病、葡萄溃疡病等病原菌的生长，弥补了该类菌株在农业生产上的空白，为生物农药防治提供了新的途径。本生防菌株抗菌效果持久、稳定，具备从中开发出新型、高效、广谱生防杀菌剂的巨大潜力，为微生物应用于生物防治的开发提供了新的途径。

附图说明

图1为假单胞菌SKL10816S rRNA基因的系统进化树示意图。

图2为假单胞菌SKL108抑制水稻纹枯病菌对照试验图片，其中图2A为空白对照试验图片，图2B为假单胞菌SKL108抑菌圈图片。

图3为假单胞菌SKL108抑制稻曲病菌对照试验图片，其中图3A为空白对照试验图片，图3B为假单胞菌SKL108抑菌圈图片。

图4为假单胞菌SKL108抑制水稻恶苗病菌对照试验图片，其中图4A为空白对照试验图片，图4B为假单胞菌SKL108抑菌圈图片。

图5为假单胞菌SKL108抑制小麦赤霉病菌对照试验图片，其中图5A为空白对照试验图片，图5B为假单胞菌SKL108抑菌圈图片。

图6为假单胞菌SKL108抑制小麦纹枯病菌对照试验图片，其中图6A为空白对照试验图片，图6B为假单胞菌SKL108抑菌圈图片。

图7为假单胞菌SKL108抑制小麦全蚀病菌对照试验图片，其中图7A为空白对照试验图片，图7B为假单胞菌SKL108抑菌圈图片。

图8为假单胞菌SKL108抑制番茄灰霉病菌对照试验图片，其中图8A为空白对照试验图片，图8B为假单胞菌SKL108抑菌圈图片。

图9为假单胞菌SKL108抑制草莓灰霉病菌对照试验图片，其中图9A为空白对照试验图片，图9B为假单胞菌SKL108抑菌圈图片。

图10为假单胞菌SKL108抑制草莓炭疽病菌对照试验图片，其中图10A为空白对照试验图片，图10B为假单胞菌SKL108抑菌圈图片。

图11为假单胞菌SKL108抑制葡萄溃疡病菌对照试验图片，其中图11A为空白对照试验图片，图11B为假单胞菌SKL108抑菌圈图片。

具体实施方式

下面列举实施例对本发明进一步说明，但不因此限制本发明的内容。

以下实施例涉及的水稻纹枯病、稻曲病、水稻恶苗病的病原菌由江苏省农科院植保所生防室提供；小麦赤霉病、小麦纹枯病、小麦全蚀病、番茄灰霉病的病原菌由江苏省农科院植保所旱作病害研究室提供；草莓灰霉病、草莓炭疽病、葡萄溃疡病的病原菌均由镇江农科所生态农业研究室提供。

PDA培养基：去皮马铃薯200g，葡萄糖10g，琼脂20g，水1L；

实施例中涉及的试剂均为市售产品。

实施例1

1、假单胞菌SKL108菌株的获得

1)菌株的分离、纯化与保存

从江苏省南京市紫金山随机采集的土壤中称取10g，加入盛有90ml灭菌水的三角瓶中，振荡培养30min(150r/min)，制成1:10(土壤：水)的悬浮液，然后取悬浮液1ml于9ml无菌水中，制成10-2稀释悬浮液，依次类推，制成10-5，10-6稀释悬浮液，在其中各吸取200ul，加到LB培养基(胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、琼脂20g、水1L，pH7.0)平板上，用涂布棒涂布均匀，每个处理重复3次，将上述培养皿，置于28℃恒温培养箱中培养2-3d。

根据菌落形态、颜色等特征挑选单菌落，转接到LB液体培养基中培养，然后采用平板对峙法筛选拮抗效果好的菌株。将水稻纹枯病、稻曲病、水稻恶苗病、小麦赤霉病、小麦纹枯病、小麦全蚀病、番茄灰霉病、草莓灰霉病、草莓炭疽病、葡萄溃疡病在专用培养基上培养，待病原菌长满平板后用打孔器在平板边缘打取菌块，放于另一个平板中央，在菌块的四周沿四个方向等距离2.5cm处接种假单胞菌，并置于25℃培养箱中培养，经初筛和复筛后，根据抑菌圈的大小评定菌株的拮抗效果。

2)菌株的鉴定与保藏

经菌株纯化培养后，获得一株拮抗效果较好的菌株，申请人将其自命名为SKL108，送至中国科学院微生物研究所进行检测鉴定，鉴定结果为假单胞菌属萨拉曼卡假单胞菌(Pseudomonas helmanticensis)，并对该菌株进行原始菌株的冻藏。本发明的萨拉曼卡假单胞菌SKL108菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.15571，保藏日期为2018年4月9日。

该菌株理化特性如下：

1)SKL108菌株的细胞形态和理化试验结果见表1

表1细胞形态和理化试验结果

2)本发明SKL108菌株的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示，其16S rRNA基因的系统进化树见图1。

2、假单胞菌SKL108菌株的广谱抗菌活性测定

将水稻纹枯病、稻曲病、水稻恶苗病、小麦赤霉病、小麦纹枯病、小麦全蚀病、番茄灰霉病、草莓灰霉病、草莓炭疽病、葡萄溃疡病的病原菌，用打孔器打成直径为5mm的菌饼放置在PDA培养基平板中间，采用十字交叉法在四周接种5μl假单胞菌SKL108菌液，同时设立空白对照，抑菌效果见附图2-附图11及表2所示：

表2假单胞菌SKL108对大田及经济作物病原菌的抑菌带大小

可见，该菌株对水稻纹枯病、稻曲病、水稻恶苗病、小麦赤霉病、小麦纹枯病、小麦全蚀病、番茄灰霉病、草莓灰霉病、草莓炭疽病、葡萄溃疡病具有较好的拮抗作用。

实施例2萨拉曼卡假单胞菌SKL108菌液对番茄灰霉病的盆栽防治试验。

试验时间：于2017年10月在江苏省农科院温室大棚内进行。

试验品种：巨粉宝。

试验药剂：萨拉曼卡假单胞菌SKL108菌液由实验室摇床(LB培养基，28℃，160r/min)培养2d，培养后含菌量约为10¹⁰cfu/ml。

对照药剂为75％百菌清(日本曹达株式会社)。

盆栽防效试验：将巨粉宝番茄播种于灭菌土壤中，当番茄苗长出6片真叶时，移苗定植。

灰霉病防治试验：将秧苗移栽至装有无菌土的盆钵中，每盆1株。人工喷洒灰霉病的孢子液，2d后，将SKL108的500倍稀释菌液按15ml/m²的用量均匀喷施于番茄苗上。每处理20盆，常规管理。清水和百菌清800倍稀释液(有效用量为0.15g/m²)为对照，生长21d后调差病情，计算防效。

病叶分级标准：0级：无病斑；l级：病斑占叶面积的5％以下；3级：病斑占叶面积的6～15％；5级：病斑占叶面积的16～25％；7级：病斑占叶面积的26～50％；9级：病斑占叶面积的50％以上。

病情指数＝[(各级发病数×各级代表值)/(调查总株数×最高级代表值)]×100

防治效果(％)＝[(对照的病情指数-防治的病情指数)/对照的病情指数]×100％

试验结果见表3：

表3萨拉曼卡假单胞菌SKL108菌液对番茄灰霉病的盆栽试验防效

可见，人工接种后，清水对照番茄灰霉病病情指数是38.25。萨拉曼卡假单胞菌SKL108菌液对番茄灰霉病的防效为69.1％。百菌清对番茄灰霉病的防效为60.7％，明显低于萨拉曼卡假单胞菌SKL108的防治效果。

在具体实践中，可以在农作物各病害零星发生时，将该菌发酵液或制成的微生物菌剂稀释500倍后按15ml/m²的用量均匀施用于作物上，每次喷洒间隔10天，连用3次，用以防治水稻纹枯病、稻曲病、水稻恶苗病、小麦赤霉病、小麦纹枯病、小麦全蚀病、番茄灰霉病、草莓灰霉病、草莓炭疽病、葡萄溃疡病。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用以限制本发明，只要根据权利要求限定的范围，在不脱离本发明原理的前提下，做出的若干改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 江苏省苏科农化有限责任公司

<120> 一株具有广谱抗菌活性的萨拉曼卡假单胞菌及其应用

<141> 2018-05-10

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1348

<212> DNA

<213> 萨拉曼卡假单胞菌(Pseudomonas helmanticensis)

<400> 1

tacttctggt gcaacccact cccatggtgt gacgggcggt gtgtacaagg cccgggaacg 60

tattcaccgc gacattctga ttcgcgatta ctagcgattc cgacttcacg cagtcgagtt 120

gcagactgcg atccggacta cgatcggttt tatgggatta gctccacctc gcggcttggc 180

aaccctttgt accgaccatt gtagcacgtg tgtagcccag gccgtaaggg ccatgatgac 240

ttgacgtcat ccccaccttc ctccggtttg tcaccggcag tctccttaga gtgcccacca 300

taacgtgctg gtaactaagg acaagggttg cgctcgttac gggacttaac ccaacatctc 360

acgacacgag ctgacgacag ccatgcagca cctgtctcaa tgttcccgaa ggcaccaatc 420

catctctgga aagttcattg gatgtcaagg cctggtaagg ttcttcgcgt tgcttcgaat 480

taaaccacat gctccaccgc ttgtgcgggc ccccgtcaat tcatttgagt tttaaccttg 540

cggccgtact ccccaggcgg tcaacttaat gcgttagctg cgccactaag agctcaaggc 600

tcccaacggc tagttgacat cgtttacggc gtggactacc agggtatcta atcctgtttg 660

ctccccacgc tttcgcacct cagtgtcagt atcagtccag gtggtcgcct tcgccactgg 720

tgttccttcc tatatctacg catttcaccg ctacacagga aattccacca ccctctacca 780

tactctagct cgccagtttt ggatgcagtt cccaggttga gcccggggat ttcacatcca 840

acttaacgaa ccacctacgc gcgctttacg cccagtaatt ccgattaacg cttgcaccct 900

ctgtattacc gcggctgctg gcacagagtt agccggtgct tattctgtcg gtaacgtcaa 960

aacagcaaag tattaattta ctgcccttcc tcccaactta aagtgcttta caatccgaag 1020

accttcttca cacacgcggc atggctggat caggctttcg cccattgtcc aatattcccc 1080

actgctgcct cccgtaggag tctggaccgt gtctcagttc cagtgtgact gatcatcctc 1140

tcagaccagt tacggatcgt cgccttggtg agccattacc tcaccaacta gctaatccga 1200

cctaggctca tctgatagcg caaggcccga aggtcccctg ctttctcccg taggacgtat 1260

gcggtattag cgttcctttc gaaacgttgt cccccactac caggcagatt cctaggcatt 1320

actcacccgt ccgccgctga attcagga 1348

Claims (3)

1.一株具有广谱抗菌活性的萨拉曼卡假单胞菌（Pseudomonas helmanticensis），其保藏编号为CGMCC No.15571。

2.如权利要求1所述的萨拉曼卡假单胞菌在防治水稻纹枯病、稻曲病、水稻恶苗病、小麦赤霉病、小麦纹枯病、小麦全蚀病、番茄灰霉病、草莓灰霉病、草莓炭疽病、葡萄溃疡病中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用是指，将萨拉曼卡假单胞菌液喷施于大田植物叶面上，用以防水稻纹枯病、稻曲病、水稻恶苗病、小麦赤霉病、小麦纹枯病、小麦全蚀病、番茄灰霉病、草莓灰霉病、草莓炭疽病、葡萄溃疡病。

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