CN117384806A - 一株产挥发性抑菌物质的绿针假单胞菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株产挥发性抑菌物质的绿针假单胞菌及其应用，分类命名为Pseudomonas chlororaphis J403，于2023年9月28日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.28569。菌株J403在LB固体培养基上可产生对水稻稻曲病原菌具有拮抗作用的挥发性物质，是一种生防效果好、无环境污染、生态安全的、有生物防治潜力的菌株，具有广阔的市场应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物学和植物病害生物防治技术领域，具体涉及一株产挥发性抑菌物质的绿针假单胞菌及其应用。
背景技术
水稻是我国主要的粮食作物之一，然而水稻病害的持续发生严重影响到水稻的生产。稻曲病在世界水稻区广泛分布，并且有逐年上升的趋势，成为水稻的主要病害之一。稻曲病是由稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)侵染水稻颖花造成的。由于稻曲病，每年在水稻产量方面损失巨大。稻曲球携带毒素，危害人畜健康。对于稻曲病的防治，目前还是以化学防治为主，虽然取得了一定效果，但也带来药物残留、环境污染、病原菌产生抗药性等突出问题。因此，如何减少农药用量以及绿色综合防控稻曲病仍然是当前我国水稻生产上面临的重要问题。
挥发性有机物(volatile organic compounds，VOCs)是指能在正常条件下快速地挥发，以蒸气形式存在于空气中的小分子含碳化合物。研究发现，微生物产生的VOCs有良好的穿透性，可以在空气、土壤空隙中高效地进行扩散，从而显著地扩大了作用范围。研究发现，微生物释放的VOCs具有抑制植物病原菌、促进植物生长和诱导系统抗性的能力。微生物产生VOCs的种类和数量根据其培养条件的不同而有所变化，影响其挥发物种类及数量的因素主要有培养基成分及含量、温度、水分和pH等。VOCs可以通过破坏病原菌真菌的原有结构来抑制其生长，例如抑制病原菌细胞壁的形成、阻止细胞分裂、破坏细胞膜结构、抑制线粒体功能、抑制外排泵和抑制DNA、RNA、蛋白质的合成。目前而言，有关微生物产生的挥发性抑菌物质在水稻稻曲病防控中的应用鲜有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一株产挥发性抑菌物质的绿针假单胞菌，能产生抑菌活性的挥发性物质，能抑制稻曲病菌。本发明的另一目的是提供上述绿针假单胞菌的应用，可用于水稻稻曲病的防控。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一株产挥发性抑菌物质的绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)J403，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2023年9月28日，保藏编号为CGMCC NO. 28569。
该菌株是从水稻根际土壤中分离得到，通过多次纯化，菌株J403在LB固体培养基上，30℃培养24h后，生长良好，菌落呈圆形，微隆起，微黄色，边缘光滑，表面较湿润，易挑起。
本发明还提供菌株绿针假单胞菌J403在制备抑制稻曲病菌的菌剂中的应用。
本发明还提供菌株绿针假单胞菌J403在水稻稻曲病防治中的应用。
本发明还提供一种稻曲病菌拮抗菌剂，其活性成分为菌株Pseudomonas chlororaphis J403。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明分离筛选的绿针假单胞菌 J403在LB固体培养基上可产生对稻曲病菌具有拮抗作用的挥发性物质。该菌株可以有效抑制稻曲病菌的生长，防治稻曲病的发生，安全且操作简便。对于开发具有新型绿色环保无污染、高效生防效果特性的微生物菌剂极具潜力，具有较好的市场应用前景。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为菌株J403在二分格培养皿上产生的VOCs对稻曲病菌菌丝生长的抑制作用。其中，图A为只接种了稻曲病菌，图B为接种了稻曲病菌和绿针假单胞菌J403。
图2为菌株J403在LB固体平板上培养24h的菌落照片。
图3为基于菌株J403的16S rDNA构建的系统发育树。
图4为菌株J403在大田试验中对稻曲病的防治效果。
生物材料保藏信息
J403，分类命名为绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2023年9月28日，保藏编号为CGMCC NO. 28569。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均购自常规生化试剂公司。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验。
实施例1 拮抗菌的分离和纯化
本申请发明人从江苏省农科院水稻试验田中采集水稻根际土壤，用无菌自封袋封好后带回实验室，暂保存于4℃，用于分离拮抗菌。称取2g土壤样品加入盛有18mL 无菌水的锥形瓶中，于30℃、160r/min摇床中震荡1h，充分混匀。在超净工作台内吸取1 mL土壤样品悬液加入9mL无菌水中，混匀后稀释液度为10-1，以此为基础逐级稀释成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6这几个浓度梯度。分别吸取10-4、10-5、10-6浓度梯度的土壤悬液100μL涂布于分离培养基上，30℃培养。从培养的第二天起，根据菌落形态等特点挑选细菌单菌落，分别移接到LB培养基上，培养48h后用于后续试验。经纯化的菌株于LB斜面培养基上，4℃保存。
实施例2 产生挥发性物质拮抗稻曲病菌的细菌菌株筛选
采用二分隔平板(直径90mm，中间有隔板)进行菌株筛选。在分隔平板一侧倒入PSA培养基(去皮土豆200g，蔗糖20g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH自然)，待冷凝后接种稻曲病菌菌饼(直径为5mm)；在平板另一侧倒入LB固体培养基，待冷凝后接种分离的菌株。以不接种细菌的平板为对照。用封口膜密封平板边缘，每个处理3皿。倒置于28℃培养7d，用十字交叉法测量稻曲病菌菌落直径大小，按下列公式计算其抑菌率：
结果如图1所示，菌株J403在与真菌病原菌不接触的情况下，对稻曲病菌有明显抑制作用，能有效抑制稻曲病菌菌丝的生长。
实施例3 菌株鉴定
采用菌落形态与分子生物学相结合的方法，对筛选到的拮抗菌株J403进行鉴定。PCR反应体系（50μL体系）：引物各2 μL，2x Mix 25 μL，加ddH2O补充到50 μL。引物为27F一般细菌鉴定选择通用引物，最常用的通用引物为27F/1492R。（27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和（1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）。反应程序：94℃预变性3min，94℃变性55s，50℃退火50s，72℃延伸1min，72℃延伸10min，35个循环后16℃保存。PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳上检测后，送至北京擎科生物科技有限公司进行16S rDNA测序，测序结果如SEQ IDNO.1所示。将所测序列通过Eziocloud数据库进行BLAST比对，利用MEGA软件对分离的细菌进行系统发育分析。
在LB培养基平板上，菌株J403菌落呈圆形，微隆起，微黄色，边缘光滑，表面较湿润，易挑起。
图2为本发明菌株J403的菌落形态。
菌株J403测序结果在Ezbiocloud网站比对，与模式菌株Pseudomonas chlororaphis subsp. Aurantiaca DSM19603（T）相似性最高，达99.44%，鉴定为Pseudomonas chlororaphis 绿针假单胞菌（系统发育树见图3）。将该菌株于2023年9月28日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC NO. 28569。
图3为本发明构建的拮抗菌株J403的16S rDNA基因序列系统发育树。
实施例4菌株J403在防治水稻稻曲病上的应用
供试水稻品种为晶两优，供试菌株为实施例3的稻曲病拮抗菌绿针假单胞菌J403，保藏编号：CGMCC NO. 28569。
绿针假单胞菌菌剂制备：将绿针假单胞菌菌株J403接种于液体LB培养基中，置于恒温摇床30℃，180~200 r/min振荡培养24h，制成发酵液。将发酵液5000rpm/min常温离心5min，弃去上清液，无菌水重悬，用无菌水将培养好的发酵液调节浓度至活菌数为1×108 cfu/ml。
选取常年发病的水稻田进行大田试验，水稻移栽前对田块进行翻耕，平地等农艺措施。选取大小一致的健康水稻苗进行种植，在水稻破口前一周左右，将绿针假单胞菌菌剂浇灌到水稻根际，浓度约为每克土中1×106 cfu的菌。随后再喷施拮抗菌J403。设置无菌水处理为对照组。每组进行三次重复。水稻成熟后，对病情进行调查。
如表1与图4所示，与对照组相比，经过绿针假单胞菌J403处理的水稻病粒数明显降低。结果表明，绿针假单胞菌J403对稻曲病防控有良好的效果。
表1 平均每穗病粒数统计情况
实施例5 菌株J403产生的挥发性物质的成分鉴定
菌株J403用LB固体培养基30℃恒温培养7d后，其VOCs用顶空固相萃取法收集后，用GC/MS分析检测。检测条件如下：
在固相微萃取循环中，萃取温度为50℃；萃取时间30min；解析时间为4min。将Agilent 7890气相色谱与飞行时间质谱联用仪结合，并配有HP-INNOWax毛细管色谱柱(32m×250μm×0.25μm)进行GC-MS分析。采用注入分流进样模式，以氦气为载气，隔垫吹扫流速为3mL min-1，柱流速为1mL min-1。柱箱升温程序为：初始温度保持在50℃持续1min，然后以10℃min-1的速度上升到310℃，并在310℃保持8min。前进样口、传输线、离子源温度分别在280℃、280℃和250℃。电子轰击模式下的电离电压为70eV。在溶剂延迟6.25min后，以50-500的m/z质量范围获取了质谱数据。
使用ChromaTOF软件（V 4.3x，LECO）对质谱数据进行了峰提取、基线矫正、解卷积、峰积分、峰对齐等分析。对物质定性工作中，使用了LECO-Fiehn Rtx5数据库，包括质谱匹配及保留时间指数匹配。测得菌株J403至少产生多种挥发性物质，其中20种物质的含量较高，如表2所示。
表2菌株J403在LB固体平板上培养7天产生的VOCs成分
这些化合物被分为几大类：胺类化合物、脂质、有机酸等，其中含量最高的挥发性有机化合物是1,4-丁二胺(Putrescine)，其次为1,3-丙二胺(1,3-diaminopropane)、胆甾烷-3,5,6-三醇(Cholestane-3,5,6-triol)和2-羟基吡啶(2-hydroxypyridine)。
Claims (4)
1.一株产挥发性抑菌物质的绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)J403，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2023年9月28日，保藏编号为CGMCC NO. 28569。
2.权利要求1所述的绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)J403在制备抑制水稻稻曲病菌的菌剂中的应用。
3.权利要求1所述的绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)J403在水稻稻曲病防治中的应用。
4.一种水稻稻曲病菌拮抗菌剂，其特征在于，其活性成分为权利要求1所述的绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)J403。
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