CN117721022B - 一株促进合成菌群生物膜产量及贝莱斯芽孢杆菌丰度的原生动物变形虫及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一株促进合成菌群生物膜产量及贝莱斯芽孢杆菌丰度的原生动物变形虫及其应用。原生动物变形虫NJAU‑W18已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2023年10月18日，保藏编号为CCTCC NO:C2023316。在合成菌群中添加原生动物变形虫NJAU‑W18可以观察到生物膜的含量显著提高。在温室盆栽中，同时接种原生动物变形虫NJAU‑W18和合成菌群，对番茄有显著的促生作用。原生动物变形虫NJAU‑W18培养条件简单，容易保存，具有开发为生物菌剂的潜力。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株促进合成菌群生物膜产量及贝莱斯芽孢杆菌丰度的原生动物变形虫及其应用。
背景技术
植物根际促生菌 是指在植物根际定殖并且对于植物生长有一定的促进作用，且能一定程度上防控病害的有益菌。在农业生产中植物根际促生菌对作物健康和高产发挥巨大作用，目前许多植物根际促生菌已被制成产品应用于农业生产中。然而，外源菌株进入土壤后会受到土著细菌群落的竞争，从而难以定殖并发挥功能，如何能使外源添加的植物根际促生菌在植物根际高效定殖且发挥功能是破解微生物菌剂在农业生产中应用受限的关键。菌株的生物膜形成能力是影响其在根际定殖的关键因子，成膜能力越强，菌株在根际中的定殖也更容易。
土壤中的原生动物是微生物主要消费者，可以对土壤微生物群落起到自上而下的调控功能。研究发现变形虫的捕食压力可以促进假单胞菌产生对于青枯菌具有较强抑制能力的物质次生代谢产物，比如DAPG，从而防控土传病害。目前国际上也已经开发出了原生动物相关的菌剂产品并投入到了农业生产应用中。
发明内容
本发明提供一株具有提升芽孢杆菌丰度且加强合成菌群生物膜形成能力的原生动物变形虫NJAU-W18及其应用。
鉴于此，本发明的目的在于提供原生动物在促进合成菌群中芽孢杆菌丰度及菌群的生物膜形成能力，利用原生动物高效促进合成菌群形成生物膜，进而促进植物有益芽孢杆菌以及合成菌群在植物根际定殖，本发明还发现原生动物与合成菌群共同接种时还能起到显著促进植物生长的效果。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
一株可以促进芽孢杆菌丰度且加强合成菌群生物膜形成能力的原生动物变形虫（Naegleria sp.）NJAU-W18，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2023年10月18日，保藏编号为CCTCC NO:C2023316。
所述的原生动物变形虫（Naegleria sp.）NJAU-W18在提高合成菌群中贝莱斯芽孢杆菌丰度的应用，所述的合成菌群由贝莱斯芽孢杆菌、绿针假单胞菌、鲍曼不动杆菌、美丽短芽孢杆菌、施氏假单胞菌组成。
作为本发明的一种优选，所述的合成菌群由保藏编号为CGMCC NO.5808的贝莱斯芽孢杆菌SQR9，保藏编号为CGMCC NO. 28569的绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)J403，保藏编号为CGMCC NO.21321的鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）RFAci-1，保藏编号为CGMCC NO.21332的美丽短芽孢杆菌（Brevibacillusformosus）RF-CU-3，保藏编号为CGMCC NO.21329的施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）RFPse-2组成。
所述的原生动物变形虫（Naegleria sp.）NJAU-W18在提高合成菌群成膜能力的应用；所述的合成菌群由贝莱斯芽孢杆菌、绿针假单胞菌、鲍曼不动杆菌、美丽短芽孢杆菌、施氏假单胞菌组成。
作为本发明的一种优选，所述的合成菌群由保藏编号为CGMCC NO.5808的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）SQR9，保藏编号为CGMCC NO. 28569的绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)J403，保藏编号为CGMCC NO.21321的鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）RFAci-1，保藏编号为CGMCC NO.21332的美丽短芽孢杆菌（Brevibacillus formosus）RF-CU-3，保藏编号为CGMCC NO.21329的施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）RFPse-2组成。
所述的原生动物变形虫（Naegleria sp.）NJAU-W18在制备促进番茄生长的产品中的应用。
所述的原生动物变形虫（Naegleria sp.）NJAU-W18和合成菌群相互作用下促进番茄生长的应用；所述的合成菌群由贝莱斯芽孢杆菌、绿针假单胞菌、鲍曼不动杆菌、美丽短芽孢杆菌、施氏假单胞菌组成。
作为本发明的一种优选，所述的合成菌群由保藏编号为CGMCC NO.5808的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）SQR9，保藏编号为CGMCC NO. 28569的绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)J403，保藏编号为CGMCC NO.21321的鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）RFAci-1，保藏编号为CGMCC NO.21332的美丽短芽孢杆菌（Brevibacillus formosus）RF-CU-3，保藏编号为CGMCC NO.21329的施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）RFPse-2组成。
一种组合物，由所述的原生动物变形虫（Naegleria sp.）NJAU-W18以及合成菌群组成；所述的合成菌群由保藏编号为CGMCC NO.5808的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）SQR9，保藏编号为CGMCC NO. 28569的绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)J403，保藏编号为CGMCC NO.21321的鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）RFAci-1，保藏编号为CGMCC NO.21332的美丽短芽孢杆菌（Brevibacillusformosus）RF-CU-3，保藏编号为CGMCC NO.21329的施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）RFPse-2组成。
有益效果
本发明提供一株可以提高合成菌群中植物有益细菌芽孢杆菌的丰度及合成菌群的成膜能力的原生动物变形虫NJAU-W18，并且在盆栽试验中具备促进番茄生长的功能。说明该菌株具备开发成植物促生的生物菌剂的潜在价值。
附图说明
图1为原生动物变形虫NJAU-W18活体及胞囊的形态；
图2为原生动物变形虫NJAU-W18对于合成菌群中芽孢杆菌SQR9绝对数量的影响；
图3为原生动物变形虫NJAU-W18对于合成菌群中芽孢杆菌SQR9相对含量的影响；
图4为原生动物变形虫NJAU-W18对于合成菌群生物膜含量影响的效果图；
图5为原生动物变形虫NJAU-W18对于合成菌群生物膜含量影响的称重结果；
图6为原生动物变形虫NJAU-W18对于合成菌群生物膜含量影响的结晶紫染色效果图；
图7为原生动物变形虫NJAU-W18对于合成菌群生物膜含量影响的结晶紫染色程度定量；
图8为原生动物变形虫NJAU-W18和合成菌群对于番茄生长影响的盆栽效果图；
图9为原生动物变形虫NJAU-W18和合成菌群对于番茄株高的影响；
图10为原生动物变形虫NJAU-W18和合成菌群对于番茄生物量的影响。
生物材料保藏信息
NJAU-W18，分类命名为原生动物变形虫NJAU-W18 Naegleria sp.NJAU-W18，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏日期为2023年10月18日，保藏编号为CCTCC NO:C2023316。
具体实施方式
实施例1 原生动物的分离鉴定
1.供试材料：
供试土壤：南京市江宁区麒麟镇后村(118°57′E, 32°03′N)实验基地番茄大棚，该地连作番茄多年。土壤为黄棕壤，土壤基本理化性质如下：有机质含量32.88 g/kg，总氮含量1.27 g/kg，有效磷含量为145.63 mg/kg，速效钾含量为220.15 mg/kg，土壤pH为6.23。
大肠杆菌：模式大肠杆菌 Escherichia coli DH5α。
LB液体培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物 5 g，氯化钠 10 g，加去离子水，定容至 1000 mL，115 ℃、30 min 灭菌。
PAS（Page’s amoeba saline）缓冲液：首先需配制溶液1 与溶液 2，溶液1 的成分为 0.142 g 磷酸一氢化二钠，0.136 g 磷酸二氰化钾，加水定容至500 mL。溶液 2的成分为 0.12 g 氯化钠，4 mg 七水合硫酸镁，4mg 二水合氯化钙，加水定容至 500 mL。1 L PAS缓冲液的成分为 500 mL 溶液1与 500 mL 溶液2，加水定容至 1 L，121 ℃、20 min 灭菌。
主要试剂和仪器设备：QIAGEN土壤DNA提取试剂盒（DNeasy PowerSoil Kit,QIAGEN）、倒置显微镜、基因扩增仪、立式振荡培养箱、恒温培养箱、紫外可见分光光度计等。
2.菌株分离：
采集南京市江宁区麒麟镇后村(118°57′E, 32°03′N)实验基地番茄大棚的土壤。将5g番茄根际土放入组培瓶中，加入无菌水200mL后将组培瓶放在摇床中，在180rpm/min的条件下充分振荡直至原生动物均匀分散在土悬液体系中，静置片刻直至土壤颗粒沉淀。吸取10uL上清液加到96孔板中，接着在每个孔中加入90ulPAS缓冲液和10uL用无菌水配置的灭活大肠杆菌液作为唯一食物来源。将96孔板放置在培养箱中遮光培养，维持温度在20℃，每隔24h拿出来，用倒置显微镜在400倍下观察每个孔的原生动物生长情况，并且在每个孔中定期补充灭活大肠杆菌液。
在黑暗培养的第7天至第14天，每天利用倒置显微镜对96孔板中的原生动物生长情况进行观察。继续培养一段时间后从原孔中吸出10uL原液加入到新的缓冲液-大肠杆菌培养体系中，重复之前的培养操作，直至在某一孔中只能观察到单一原生动物，将该孔原生动物单独吸出后添加缓冲液和大肠杆菌液进行扩大培养。如果只能观察到1种原生动物，则将玻璃微吸管中的液体转移至新的加有土壤原生动物培养基的96孔微孔板中，培养2到3天后检查孔径中的原生动物是否繁殖以及形态是否单一。如若形态单一，再从形态已经单一的原生动物的培养体系中，吸取10uL于新的96孔微孔板中，加入原生动物培养液，以上操作重复2到3次。此举是为了分离纯化得到的原生动物中一些土壤中的细菌和真菌被大部分去除干净。以免后续提取DNA比对序列鉴定时原生动物不纯。
实施例2 原生动物变形虫NJAU-W18的形态观察
将分离纯化出的原生动物NJAU-W18加入原生动物培养液，放入低温培养箱20℃避光培养24h。取出置于倒置显微镜下，用电子CCD拍下原生动物变形虫NJAU-W18营养体与胞囊的照片（图 1）。如图1所示，图中共计三个原生动物NJAU-W18的活体形态个体，一个胁迫条件下的胞囊形态个体。活体形态下其呈现为不规则的多边形；胞囊形态下呈现半透明圆球状，体积约为活体形的1/3，直径大约在10um左右，个体间形态差异不大。
实施例3 原生动物变形虫NJAU-W18对于合成菌群中芽孢杆菌丰度的影响
施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)RFPse-2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2020年12月7日，保藏编号为 CGMCC NO.21329，公开于CN112662589A中。
绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis) J403 保藏于中中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2023年9月28日，保藏编号为 CGMCC NO.28569，公开于CN117384806A。
美丽短芽孢杆菌（Brevibacillus formosus）RF-CU-3保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 保藏日期为2020年12月7日，保藏编号为CGMCC NO.21332，公开于CN113322209A中。
鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)RFAci-1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2020年12月07日，保藏编号为CGMCC No.21321,公开于CN112899203A中。
贝莱斯芽孢杆菌 (Bacillus velezensis)SQR9；所述的贝莱斯芽孢杆菌SQR9保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏日期为2012年2月27日，保藏编号为CGMCC NO.5808，公开于CN116333937A中。
试验所用的合成菌群由以上5种菌株组成，为本实验室前期构建，用于模拟植物根际细菌群落。将合成菌群的5种菌株划线于 NA 培养基，于 30℃培养 2-3 d，待有明显单菌落出现时，挑取单菌落，接种于液体NA培养基中，于30℃，170 rpm/min 震荡培养 24 h 得到菌株菌悬液。将各菌株菌悬液使用灭菌去离子水调整 OD600为1后，等体积混合。在24孔细胞培养板(Fisher Scientific)中每孔添加2 mL TSB液体培养基，接种 20 μL等体积混合(OD600=1)的5种菌株制成的菌液，原生动物变形虫NJAU-W18每孔接种2000个，将 24 孔细胞培养板在 30℃下静置培养 24 h，取样全部体系，提取DNA，进行qPCR定量实验。
使用细菌 DNA 提取试剂盒(Omega)，按照制造商的说明书提取样品中的细菌基因组 DNA。按照上述的 qPCR 反应体系和反应温度进行定量实验，使用标准曲线公式计算得出样品中的 DNA 拷贝数，即为细胞数量。
定量试验结果如图2和图3所示，可以发现添加原生动物变形虫NJAU-W18后培养相同时间之下，SQR9的绝对数量和占整体细菌数量的百分比相比较于未添加原生动物变形虫NJAU-W18的处理显著增加，绝对数量增加了90.0%，相对含量增加了73.3%。说明了原生动物变形虫NJAU-W18使SQR9在合成菌群中的增殖能力大大加强，成为绝对的优势菌株。
实施例4 原生动物变形虫NJAU-W18对合成菌群生物膜形成能力的影响
生物膜称重定量试验
薄膜生物膜:在24孔细胞培养板(Fisher Scientific)中添加2 mL TSB液体培养基，接种 20 μL等体积混合(OD600=1)的5种菌株制成的菌液，原生动物变形虫NJAU-W18每孔接种2000个，空白对照为不接种原生动物。将 24 孔细胞培养板在 30℃下静置培养 24h。培养结束后使用相机拍照进行记录。
在六孔细胞培养板中插入 100 μm 无菌尼龙细胞过滤器(Biologix Cat#15-1100)， 加入10 mL TSB 液体培养基和 100 μL 等体积混合(OD600=1)的5种细菌，原生动物变形虫NJAU-W18接种10000个，培养薄膜生物膜，5种细菌单独培养作为对照。将六孔细胞培养板在 30℃下静置培养 24 h，使生物膜在尼龙网状细胞过滤器的表面生长，使用相机拍照，后取出细胞过滤器，用纸去除可见的液滴并称重。鲜重是总重量减去尼龙网的重量，每个处理设置六个重复。
如图4所示，在合成菌群中添加原生动物变形虫NJAU-W18可以观察到生物膜的含量显著提高，说明了原生动物变形虫NJAU-W18的存在促进了关键菌株SQR9产生生物膜的能力，在之前的研究中，SQR9产生生物膜的能力越强，其在植物根际的定殖并且发挥功能的能力越强(Weng et al., 2013)。
如图5所示，将生物膜分离后进行称重的结果表明，添加原生动物变形虫NJAU-W18将合成菌群形成生物膜的能力显著提高了18.7%。进一步确定了原生动物变形虫NJAU-W18对于SQR9产生生物膜能力的促进效果。
生物膜结晶紫染色定量试验
过夜培养的细菌用TSB培养基稀释至 OD600=0.15，将160 μL等量混合(OD600=1)的5种细菌菌液和原生动物变形虫NJAU-W18 2000个/孔，接种到 96 孔 Nunc-TSP培养板(Cat# 445497， Thermo Scientific)中，5种细菌单独培养作为对照，放置配套的Nunc-TSP盖子 ，置于30℃恒温培养箱，静置培养24 h。取出 Nunc-TSP 盖子，生物膜附着于其上。用200 μL PBS 溶液洗涤一次，去除游离细胞，转移到含180 μL 结晶紫溶液的96孔板中，染色20 min。转移到含200 μL 96%乙醇的96孔板中，洗脱30 分钟，测OD590。
如图6所示，添加原生动物变形虫NJAU-W18后合成菌群经过染色后颜色更深，说明形成生物膜的能力被显著提高。
如图7所示，测量染色后体系的OD590的值，合成菌群添加原生动物变形虫NJAU-W18后OD590提高了58.3%，说明合成菌群的成膜能力被原生动物变形虫NJAU-W18显著加强了，其中被显著富集的SQR9发挥了主要的作用。
实施例5 原生动物变形虫NJAU-W18和合成菌群共同促进番茄生长的盆栽试验
1.番茄盆栽试验设置4个处理：
空白对照：土壤中添加50 mL PAS缓冲液；
只接种原生动物：土壤中添加50 mL含有1.0×103 个/g干土数量的原生动物变形虫NJAU-W18的PAS缓冲液；
只接种合成菌群：土壤中添加50 mL含有1.0×106 个/g干土数量的合成菌群的PAS缓冲液；
共同接种合成菌群和原生动物：土壤中添加50 mL含有1.0×103 个/g干土数量的原生动物变形虫NJAU-W18和1.0×106 个/g干土数量的合成菌群的PAS缓冲液。
.每个处理10个重复。
2.温室盆栽试验的土壤采集自本课题组在江苏省南通市海安市的长期定位点，该定位点的土壤长期施用化肥处理且具有番茄青枯病病害发病史。采集后的土壤去除其中的石块和植物残体后将土壤再次混匀。将过筛混匀后的土壤与经过高温灭菌的石英砂和蛭石进行混匀，其三者体积比例为土壤：石英砂：蛭石=3：1：2，混匀后的土壤按照每个盆500 g的量装盆待用。
3.原生动物预培养：前期使用大量1L组培瓶，每瓶配700mL的PAS缓冲液，并加入2×1011个的模式大肠杆菌，配成土壤原生动物培养基，再向其中接种原生动物变形虫NJAU-W18。将组培瓶置于20℃低温，黑暗培养5天后，在超净工作台中吸取组培瓶中原生动物变形虫NJAU-W18在显微镜下进行计数，并用PAS缓冲液稀释为接种盆栽试验所需要的浓度备用。
4.原生动物和合成菌群的添加：选取“两叶一心”时期长势一致的番茄苗移栽到装有500g土的花盆中，每盆种植一株番茄。移栽3天后在土壤中施加不同处理，定期浇水，进行盆栽管理。
5.番茄植株株高：使用卷尺测量番茄植株的自然株高，即番茄植株全部的叶片自然伸展时的最高点到植株基部的垂直距离。
6.番茄植株地上部生物量测定：用千分之一天平准确称取番茄地上部新鲜和烘干后的植株重量。
.如图8所示，通过盆栽表型我们观察到原生动物变形虫NJAU-W18和合成菌群共同添加下的番茄生长情况最好。
如图9所示，原生动物变形虫NJAU-W18和合成菌群共同作用下，番茄的株高与CK相比显著提高了45.2%
如图10所示，原生动物变形虫NJAU-W18和合成菌群共同作用下，番茄的鲜重与CK相比显著提高了30.9%。在实际生产中，原生动物变形虫NJAU-W18对于合成菌群的室内实验结论得到了验证。
参考文献
[1]Weng, J., Wang, Y., Li, J., Shen, Q., Zhang, R., 2013. Enhancedroot colonization and biocontrol activity of Bacillus amyloliquefaciens SQR9by abrB gene disruption. Applied Microbiology and Biotechnology 97, 8823–8830. doi:10.1007/s00253-012-4572-4
Claims (3)
1.原生动物变形虫Naegleria sp. NJAU-W18在提高合成菌群中贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）SQR9的丰度的应用，所述的原生动物变形虫Naegleria sp.NJAU-W18，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2023年10月18日，保藏编号为CCTCC NO:C2023316；所述的合成菌群由保藏编号为CGMCCNO.5808的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）SQR9，保藏编号为CGMCC NO. 28569的绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)J403，保藏编号为CGMCC NO.21321的鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）RFAci-1，保藏编号为CGMCC NO.21332的美丽短芽孢杆菌（Brevibacillus formosus）RF-CU-3，保藏编号为CGMCC NO.21329的施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）RFPse-2组成。
2.原生动物变形虫Naegleria sp.NJAU-W18在提高合成菌群成膜能力的应用，所述的原生动物变形虫Naegleria sp.NJAU-W18，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2023年10月18日，保藏编号为CCTCC NO:C2023316；所述的合成菌群由保藏编号为CGMCC NO.5808的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）SQR9，保藏编号为CGMCC NO. 28569的绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)J403，保藏编号为CGMCC NO.21321的鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）RFAci-1，保藏编号为CGMCC NO.21332的美丽短芽孢杆菌（Brevibacillus formosus）RF-CU-3，保藏编号为CGMCCNO.21329的施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）RFPse-2组成。
3.原生动物变形虫Naegleria sp.NJAU-W18和合成菌群相互作用下促进番茄生长的应用，所述的原生动物变形虫Naegleria sp.NJAU-W18，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2023年10月18日，保藏编号为CCTCC NO:C2023316；所述的合成菌群由贝莱斯芽孢杆菌、绿针假单胞菌、鲍曼不动杆菌、美丽短芽孢杆菌、施氏假单胞菌组成；所述的合成菌群由保藏编号为CGMCC NO.5808的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）SQR9，保藏编号为CGMCC NO. 28569的绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)J403，保藏编号为CGMCC NO.21321的鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）RFAci-1，保藏编号为CGMCC NO.21332的美丽短芽孢杆菌（Brevibacillusformosus）RF-CU-3，保藏编号为CGMCC NO.21329的施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）RFPse-2组成。
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Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112662589A (zh) * | 2021-01-19 | 2021-04-16 | 南京农业大学 | 一种植物根际生物膜共定殖型多功能复合菌剂的开发与应用 |
| CN112899203A (zh) * | 2021-03-15 | 2021-06-04 | 南京农业大学 | 一种防控玉米种栖镰刀菌爆发的复合菌群及其应用 |
| CN113322209A (zh) * | 2021-07-01 | 2021-08-31 | 南京农业大学 | 基于菌株间生态关系生产植物促生复合菌剂及其应用 |
| CN115074287A (zh) * | 2022-07-04 | 2022-09-20 | 京博农化科技有限公司 | 贝莱斯芽孢杆菌jbnh 101及其培养基、发酵产物制备方法、制剂与应用 |
| WO2022249194A1 (en) * | 2021-05-27 | 2022-12-01 | Tagra Biotechnologies Ltd. | Encapsulation of live microorganisms |
| CN116333937A (zh) * | 2023-04-03 | 2023-06-27 | 南京农业大学 | 一株具有温室气体氧化亚氮减排功能的植物根际益生菌株及其应用 |
| CN116948829A (zh) * | 2023-05-31 | 2023-10-27 | 南京农业大学 | 一株用于促进番茄生长与防控番茄青枯病的原生生物尾滴虫njau-zg8及其应用 |
| CN117305114A (zh) * | 2023-11-28 | 2023-12-29 | 南京农业大学三亚研究院 | 一株联合芽孢杆菌防控番茄土传青枯病的丝足虫及其应用 |
| CN117384806A (zh) * | 2023-12-13 | 2024-01-12 | 南京农业大学三亚研究院 | 一株产挥发性抑菌物质的绿针假单胞菌及其应用 |
-
2024
- 2024-02-07 CN CN202410172726.7A patent/CN117721022B/zh active Active
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112662589A (zh) * | 2021-01-19 | 2021-04-16 | 南京农业大学 | 一种植物根际生物膜共定殖型多功能复合菌剂的开发与应用 |
| CN112899203A (zh) * | 2021-03-15 | 2021-06-04 | 南京农业大学 | 一种防控玉米种栖镰刀菌爆发的复合菌群及其应用 |
| WO2022249194A1 (en) * | 2021-05-27 | 2022-12-01 | Tagra Biotechnologies Ltd. | Encapsulation of live microorganisms |
| CN113322209A (zh) * | 2021-07-01 | 2021-08-31 | 南京农业大学 | 基于菌株间生态关系生产植物促生复合菌剂及其应用 |
| CN115074287A (zh) * | 2022-07-04 | 2022-09-20 | 京博农化科技有限公司 | 贝莱斯芽孢杆菌jbnh 101及其培养基、发酵产物制备方法、制剂与应用 |
| CN116333937A (zh) * | 2023-04-03 | 2023-06-27 | 南京农业大学 | 一株具有温室气体氧化亚氮减排功能的植物根际益生菌株及其应用 |
| CN116948829A (zh) * | 2023-05-31 | 2023-10-27 | 南京农业大学 | 一株用于促进番茄生长与防控番茄青枯病的原生生物尾滴虫njau-zg8及其应用 |
| CN117305114A (zh) * | 2023-11-28 | 2023-12-29 | 南京农业大学三亚研究院 | 一株联合芽孢杆菌防控番茄土传青枯病的丝足虫及其应用 |
| CN117384806A (zh) * | 2023-12-13 | 2024-01-12 | 南京农业大学三亚研究院 | 一株产挥发性抑菌物质的绿针假单胞菌及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Enhanced root colonization and biocontrol activity of Bacillus amyloliquefaciens SQR9 by abrB gene disruption;Weng, J.等;Applied Microbiology and Biotechnology;20131231;8823-8830 * |
| 番茄根内生细菌的促生及其优势种群的筛选和分析;黎烨;熊娟;张婷;金玲月;桂楚伊;田宝玉;;福建农业科技;20191231(第11期);21-28 * |
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