CN112680380A - 一种生防贝莱斯芽孢杆菌、微胶囊菌剂的制备及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种生防贝莱斯芽孢杆菌、微胶囊菌剂的制备及其应用，涉及生物防治的技术领域，本发明提供了一种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.20317的生防贝莱斯芽孢杆菌，以及该贝莱斯芽孢杆菌在生物防治中的应用，经验证，该贝莱斯芽孢杆菌筛选于病害土壤中，对多种病害的病原菌具有拮抗作用，能够对病害土壤实现综合防治。

Description

一种生防贝莱斯芽孢杆菌、微胶囊菌剂的制备及其应用

技术领域

本发明涉及生物防治技术领域，尤其是涉及一种生防贝莱斯芽孢杆菌、微胶囊菌剂的制备及其应用。

背景技术

生物防治是降低杂草和害虫等有害生物种群密度的一种方法，利用生物物种间的相互作用关系，以一种或一类生物抑制另一种或另一类生物，与农药等非生物防治病虫害方法相比，具有效果持久、安全环保和节约成本等显著优点。生物防治按照防治主体主要分为以虫治虫、以鸟治虫和以菌治虫三大类，其中以菌治虫即以生防菌作为生物防治的主体，其在实现防治害虫的同时，还对杂草及有害病菌实现防治，能够从根本上改善土壤质量和种群结构，为植物生长提供安全和营养保障，具有显著的优势。

但以生防菌为主体的生物防治也存在一些不足，生防菌的应用主要受制于土壤环境等多种生态因素的制约，很难良好的在不同的土壤中完成定植，使得微生物菌剂在实际使用中无法起到真正的作用，同时，通常一种生防菌能够实现防治的病虫害种类有限。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生防贝莱斯芽孢杆菌的筛选方法和所述贝莱斯芽孢杆菌在生物防治中的应用，经验证，该贝莱斯芽孢杆菌筛选于病害土壤中，对多种病害的病原菌具有拮抗作用，能够对病害土壤实现综合防治。

第一方面，本发明提供一种生防贝莱斯芽孢杆菌，所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)于2020年7月8日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.20317，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为贝莱斯芽孢杆菌。

本发明提供上述生防贝莱斯芽孢杆菌是通过筛选得到的，所述筛选方法包括，采用对峙生长法，以拮抗病原菌的能力为筛选指标，从受试菌液中经过分离和纯化筛选得到抗性菌株。所述受试菌液所含菌株筛选于病害田间地表下20cm的病害土壤，由于土壤是上述多种病虫害的病原菌的过冬或传播途径，在病害土壤中富含大量的病原菌，而在富含大量病原菌土壤中仍然能够保持对病原菌具有拮抗作用的微生物，其在正常情况下，拮抗病原菌的能力也会比较强，因此，本发明选择从病害土壤种进行受试菌株的筛选。

本发明采用稀释涂布平板法和单细胞挑取法对病害土壤微生物进行分离。稀释平板计数是根据微生物在固体培养基上所形成的单个菌落，即是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个单细胞。计数时，首先将待测样品制成均匀的系列稀释液，尽量使样品中的微生物细胞分散开，使成单个细胞存在(否则一个菌落就不只是代表一个细胞)，再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内。经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，即可实现病害土壤中微生物的分离。

本发明采用平板划线法对分离得到的病害土壤微生物进行纯化。平板划线分离法是指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种。有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离的目的。

本发明所述对峙生长法包括，将受试菌液点接于病原菌平板内部四周，以将水点接于病原菌平板内部四周作为对照，培养后，选取得到拮抗带宽在5mm以上的为对应病原菌的抗性较强的菌株。

所述点接包括于病原菌平板内部四周铺置灭菌滤纸片，而后于滤纸片上滴加受试菌液。

所述病原菌平板包括，中央放置病原菌菌饼的培养基平板。

第二方面，本发明提供采用前述实施方式所述的菌种保藏号为CGMCC NO.20317的贝莱斯芽孢杆菌制备的生物防治菌剂。

在可选的实施方式中，所述生物防治菌剂包括微胶囊菌剂。

农用微生物制剂仍存在活菌数含量相对偏低、后处理和加工工艺落后等瓶颈问题，因而菌剂中菌株的保存、稳定的释放技术的开发具有重要应用意义。现阶段的微生物菌剂以菌粉为主，其在生产过程中经过高温喷雾干燥不仅造成微生物菌体的损失，同时在施用后土壤定植能力不强，达不到预期结果。本发明提供的微胶囊菌剂与已有菌粉制备技术相比，能够显著降低将微生物菌体制备成菌剂过程中的损耗，提高包埋率以及菌剂的稳定性，通过海藻酸钠-氯化钙-壳聚糖包膜体系制备的微胶囊菌剂更加稳定，膜内的微生物能够最大限度的保存其活性，施入土壤后能够更好的发挥出贝莱斯芽孢杆菌的生防作用。

优选地，所述微胶囊菌剂包括带有壳聚糖覆膜的固定化贝莱斯芽孢杆菌。

优选地，所述固定化贝莱斯芽孢杆菌通过海藻酸钠-氯化钙体系固定得到。

第三方面，本发明提供了前述实施方式所述的生物防治菌剂的制备方法，所述制备方法包括，将含有贝莱斯芽孢杆菌的海藻酸钠溶液加入氯化钙溶液得到固定化贝莱斯芽孢杆菌，再于搅拌条件下，将固定化芽孢杆菌与壳聚糖溶液混合得到壳聚糖覆膜的固定化贝莱斯芽孢杆菌。

在可选的实施方式中，在将固定化贝莱斯芽孢杆菌覆膜前，对固定化贝莱斯芽孢杆菌进行无菌水洗涤。

在可选的实施方式中，所述氯化钙溶液中氯化钙的质量浓度1％～2.5％，进一步优选为1.9％。

在可选的实施方式中，所述壳聚糖溶液中壳聚糖的质量浓度0.5％～1.5％，所述壳聚糖覆膜的时间为35～45min，优选为40min；所述壳聚糖覆膜温度在20℃～35℃之间，优选25℃。

优选地，所述壳聚糖的质量浓度为0.85％。

在可选的实施方式中，所述含有贝莱斯芽孢杆菌的海藻酸钠溶液的制备方法包括，将贝莱斯芽孢杆菌菌悬液与无菌的海藻酸钠溶液混合制得。

优选地，所述海藻酸钠溶液中海藻酸钠的质量浓度1％～2.5％，进一步优选为2.05％。

优选地，所述贝莱斯芽孢杆菌菌悬液的密度为2.5×10⁷cfu/mL～2.5×10⁹cfu/mL，进一步优选为10⁸cfu/mL。

优选地，所述菌悬液与海藻酸钠溶液的体积比为0.16～1：1，优选为0.4:1。

第四方面，本发明提供了前述贝莱斯芽孢杆菌、生物防治菌剂或生物防治菌剂制备方法得到的生物防治菌剂在生物防治中的应用。

在可选的实施方式中，所述生物防治的病害包括番茄青枯病、番茄枯萎病、水稻恶霉病、甜瓜根腐病、黄瓜黑斑病、香蕉灰线病或马铃薯疫病中的一种或两种以上组合。

番茄青枯病由细菌通常由青枯假单胞菌侵染引起，危害番茄、茄子、辣椒、马铃薯、生姜等多种作物。病原细菌主要随病残体在田间或马铃薯块上越冬，无寄主时，病菌可在土中营腐生生活长达14个月，成为该病主要初侵染源，该菌主要通过雨水、灌溉水及农具传播，病薯块及带菌肥料也可带菌。病菌从根部或茎基部伤口侵入，在植株体内的维管束组织中扩展，造成导管堵塞及细胞中毒。

番茄枯萎病通常由番茄尖镰孢菌侵染引起，该病菌存在于病害土壤中，也可通过带菌种子进行远距离传病，病菌多在分苗、定植时从根系伤口、自然裂口、根毛侵入，到达维管束，在维管束内繁殖，堵塞导管，阻碍植株吸水吸肥，导致叶片萎蔫、枯死，通常高温高湿、土温25～30℃、土壤潮湿、偏酸、地下害虫多、土壤板结、土层浅等条件下，发病重。番茄连茬年限愈多，并且，在施用未腐熟粪肥，或追肥不当烧根，或植株生长衰弱，或抗病力降低时，病情加重。

水稻恶霉病通常由串珠镰孢侵染引起，带菌种子和病稻草是该病发生的初侵染源。浸种时带菌种子上的分生孢子污染无病种子而传染，严重的导致苗枯，死苗时产生分生孢子，传播到健苗，进而侵染到花器上，侵入颖片和胚乳内，造成秕谷或畸形，在颖片合缝处产生淡红色粉霉。脱粒时与病种子混收，也会使健种子带菌。

甜瓜根腐病通常由坎诺单孢菌侵染引起，该病菌以子囊壳随病残体在土壤中越冬，据实验在PDA平面培养基上生长8天的菌丝体切碎后拌入灭菌土壤中后，栽植农友香兰甜瓜幼苗，经35天后植株发病死亡，病部又形成子囊壳，进行再侵染。

黄瓜黑斑病通常是由瓜链格孢菌侵染引起的，该病原菌在病残体上火在种子表面过冬，在田间可借气流或雨水传播，高温高湿是发病的重要条件，气温25～32℃、空气相对湿度80％以上时，易发病。坐瓜后遇高温高湿，该病易流行，特别是浇水或风雨过后病情扩展迅速。

香蕉灰线病通常是由斐济假尾孢侵染引起的，该病原菌以菌丝体或分生孢子在寄主病部或落到地面主的病残体上越冬，翌春分生孢子或由菌丝体长出的分生孢子借风雨传播蔓延，在香蕉叶上萌发长出芽管从表皮侵入引起发病，后病部又产生分生孢子进行再侵染。

马铃薯疫病通常是由致病疫霉侵染引起的，该病菌主要以菌丝体在薯块中越冬。播种带菌薯块，导致不发芽或发芽后出土即死去，有的出土后成为中心病株，病部产生孢子囊借气流传播进行再侵染，形成发病中心，致该病由点到面，迅速蔓延扩大。病叶上的孢子囊还可随雨水或灌溉水渗入土中侵染薯块，形成病薯，成为翌年主要侵染源。

本发明提供的保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.20317的贝莱斯芽孢杆菌对多种病原菌具有拮抗作用，能够用于多种病害的生物防治中，仅引入一种微生物，最大程度减少了对土壤微生态的破坏，既保持了土壤微生态平衡又实现了多种病害的防治。

当将本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌制作成微胶囊菌剂进行生物防治应用是时，能够良好的应对外界不良因素，延长产品的货架期，提高了贝莱斯芽孢杆菌的利用率。

海藻酸钠-Ca²⁺是最常用的包埋体系，Ca²⁺与海藻酸钠的比例越高，微胶囊包埋颗粒机械保护强度越强，但仍对酸性条件敏感。此外，在其他高浓度单价离子或螯合剂存在的情况下，Ca²⁺会被替换出来，凝胶稳定性下降，颗粒孔径分布范围较宽，较难保留小分子芯材。本发明通过在其表面覆盖壳聚糖涂层，由于壳聚糖分子量小，能够较快地扩散至海藻酸钠中，并与海藻酸钠具有很好的生物相容性，形成的凝胶颗粒密度和强度更高，可避免因凝胶结构破坏导致的菌体释放问题，并对Ca²⁺螯合剂以及其他抗凝乳剂等严苛的不利因素具有较强的抵抗性能，因此显著提高了胶囊内部贝莱斯芽孢杆菌的稳定性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例2得到的固定化贝莱斯芽孢杆菌；

图2为本发明实施例2得到的贝莱斯芽孢杆菌微胶囊菌剂；

图3为实施例2和对比例8所得微胶囊菌剂稳定性对比图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。

因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。

下面结合附图，对本发明的一些实施方式作详细说明。在不冲突的情况下，下述的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

实施例1

本实施例提供了从病害土壤中分离、纯化并鉴定贝莱斯芽孢杆菌的方法，具体包括以下步骤：

1.1受试菌株的分离和纯化

首先将采集田间地表下20cm左右的北京世纪阿姆斯番茄试验田病害土壤，运至实验室后，取10g土壤，添加至含有90mL无菌水的三角瓶中，随后放置在摇床上，150rpm转动30min，随后取出三角瓶。静置2h，直至液体不在浑浊，取上清液，分别稀释10^-1～10^-6梯度，每个梯度吸取100uL涂布在固体LB培养基(配方为胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，琼脂15g/L)平板上进行涂布。于28℃下培养48h后，使用无菌牙签挑取8株单菌落转移到新的LB固体培养基上进行划线，随后28℃，培养48h后，观察平板表明菌落形态，直至平板中只有一种菌落形态，则表明分离纯化完成，随后将平板放置4℃条件下保存备用，共分离获得8株菌株。

1.2贝莱斯芽孢杆菌的筛选

选用的病原菌分别为番茄青枯病病原菌(Pseudomonas solanacearum)、番茄枯萎病病原菌(Fusarium oxysporum)、水稻恶霉病病原菌(Fusarium moniliforme Sheld)、甜瓜根腐病病原菌(Monosporascus cannonballus Pollack et Ueekez)、黄瓜黑斑病病原菌(Alternaria cucumerina)、香蕉灰线病病原菌(Gloeosporium musarum Cooke et Mass)、马铃薯疫病病原菌(Phytophthora infestans(Mont.)de Bary)。采用对峙生长法筛选抗性菌株，将步骤1.1中筛选出的8株菌株在固体培养基上活化，然后分别转移到相应的液体LB中培养基中(配方为胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L)，于28℃，150rpm的条件下培养，使8株菌株的菌液浓度在分光光度计600nm处的OD值达到1.2，得到8种被试菌液，分别编号为01～08。

然后将上述7种病原菌在平板培养活化后，沿菌落边缘用打孔器打孔，随后将病原菌菌饼置于空白平板中央，得到7种病原菌平板。平板内四周均匀放置4张直径为0.2mm的灭菌滤纸片，且滤纸片外缘距离病原菌菌饼外缘最小距离为2cm，每张滤纸片上滴入50uL被试菌液，每一个病原菌平板中的4张滤纸片滴入相同的被试菌液，共得到56个实验平板，再对7种病原菌分别设置一个滴加清水代替被试菌液的平板作为对照平板，上述每个平板重复设置3个，于28℃恒温培养，待对照平板长满病原菌时统计实验平板的拮抗带宽，结果如下表所示。

表1实验平板拮抗带宽的测定结果

“-”表示无抑制作用；“+”表示有轻微的抑制作用0-1mm；“++”表示有良好的抑制作用1-5mm；“+++”表示有强烈的抑制作用5-10mm；

由上表可以看出，编号为02的筛选菌株对7种病原菌都表现出强烈的抑菌能力，通过16s RNA鉴定后，确定该菌株为Bacillus velezensis，贝莱斯芽孢杆菌，其鉴定步骤如下：

将编号为02的菌株接种于LB固体培养基中，培养过夜后，从平板上取一个新鲜的单菌落置于1.5mL离心管中，加入10uL的S2裂解液，将其震荡混匀，室温静置20min，随后稀释20倍，震荡混匀，12000rpm，离心2min，取上清液作为模板，进行PCR扩增。

扩增条件如下：

正向引物为27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG(SEQ ID No.1)；

反向引物为1492R：TACGGCTACCTTGTTACGACTT(SEQ ID No.2)；

扩增酶为code#AS11

扩增程序为94℃5min；94℃30s；55℃30s；72℃90s；循环数35次，72℃7min，4℃保存。

扩增反应体系如表2所示。

表2 PCR扩增的反应体系

将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化胶块。将纯化后的产物进行sanger测序，获得正反向测序结果，利用DNAMAN软件对所得基因序列进行拼接，并在www.ezbiocloud.net数据库中进行16s RNA的比对，鉴定微生物的种类，所述琼脂糖凝胶电泳的配置体系如表3所示。

表3琼脂糖凝胶电泳的反应体系

拼接后基因序列(SEQ ID No.3)为：

TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCCAATCATCTGTCCCACCTTCGGCGGCTGGCTCCTAAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCCAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCCGCCCTATTTGAACGGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGCGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTTATGTCTGAACCATGCGGTTCAAACAACCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCCATCTGTCCGCTCGACTTGCATGTATTAGGCACGCCGCCAGCGTTCGTCCTGAGCCAGGATCAAACTCT经比对，上述序列的鉴定结果如表4所示。

表4编号为02菌株鉴定结果

因此，可以确定本实施例筛选得到的对7中病原菌均表现出强烈抑制作用的编号为02的菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。

实施例2

本实施例提供了含有实施例1得到的贝莱斯芽孢杆菌微胶囊菌剂的制备方法，具体包括以下步骤：

将实施例1得到的贝莱斯芽孢杆菌于液体培养基中，28℃、150rpm振荡条件下培养24h，然后将培养好的液体培养基于4000rpm条件下离心15min，弃上清，收集菌体，随后添加适量无菌水，制备成菌悬液，菌悬液的浓度控制为10⁸cfu/mL。取一定量的菌悬液与灭菌的质量浓度为2.05％海藻酸钠溶液混合均匀，所述菌悬液与海藻酸钠溶液的体积比为0.4:1，然后在搅拌速度为400rpm的情况下，使用直径0.45nm的无菌注射器将此混合液滴加到质量浓度为1.9％的CaCl₂溶液中，注射速度为每分钟100滴，固化30min，随后使用无菌水洗涤3次，收集固定化贝莱斯芽孢杆菌，如图1所示。将收集的固定化贝莱斯芽孢杆菌在搅拌速度为600rpm的条件下加到质量浓度为0.85％壳聚糖溶液中，覆膜40min，随后使用无菌水洗涤2次，4℃保存，得到贝莱斯芽孢杆菌微胶囊菌剂，如图2所示，得到的贝莱斯芽孢杆菌微胶囊菌剂为直径2mm左右的规则球状颗粒。

对比例1～7

本组对比例与实施例2的区别在于，制备微胶囊菌剂所选用的菌株分别为实施例1中编号为01、03～08的受试菌株。

对比例8

本对比例提供了一种仅用海藻酸钠-氯化钙进行贝莱斯芽孢杆菌固定化的方法，具体包括以下步骤：

将实施例2中制得的菌悬液与灭菌的质量浓度为2.05％的海藻酸钠溶液按照体积比为1:2.5混合，得到混合液，然后，在搅拌速度为400rpm的情况下，用直径0.45nm的无菌注射器将此混合液滴加到质量浓度为1.9％的氯化钙溶液中，注射速度为每分钟100滴，固化30min，形成海藻酸钠-氯化钙微胶囊。随后，使用无菌水洗涤固化颗粒2次，收集备用。

实验例1

将实施例2和对比例1～7制得的微胶囊菌剂应用于番茄盆栽抗枯萎病和青枯病，实验步骤如下：

将番茄苗播种于灭菌基质中，当番茄苗长出6张真叶时，进行移苗。采用直径约15cm的塑料盆，盆底垫20目尼龙网，每盆装土约2kg，将番茄苗移栽至盆中，每盆3株。分别使用20mL番茄青枯病病原菌和番茄枯萎病病原菌孢子液对每株番茄植株进行灌根，24h后实验组分别添加实施例2和对比例1～7制得的微胶囊菌剂30粒，对照组添加等量清水，每个处理组设9盆。待番茄苗生长30天后调查病情，计算发病率及防效，计算公式如下：

发病率＝发病株数/调查总株数×100％

防效＝(对照组发病率-处理组发病率)/对照组发病率×100％

实验结果如表5和6所示。

表5不同微胶囊菌剂发病率测定结果

表6不同微胶囊菌剂防效测定结果

番茄青枯病：对照组发病率为100％，防效为0％，贝莱斯芽孢杆菌微胶囊菌剂实验组的发病率为25％，防效为75％。番茄枯萎病：对照组发病率为100％，防效为0％，贝莱斯芽孢杆菌微胶囊菌剂实验组的发病率为22.22％，防效为77.78％。数据表明将从病害土壤中分离筛选出的生防贝莱斯芽孢杆菌制备成生物微胶囊后，施用在盆栽实验中，其对番茄枯萎病和番茄青枯病具有良好的生防效果。而其他菌株的防效均低于50％。

实验例2

本实验例对实施例2和对比例8所得的贝莱斯芽孢杆菌微胶囊菌剂的包埋率进行检测。

微胶囊的包埋率是微胶囊所包埋的活菌数占总投活菌数的百分比。微胶囊制备后，溶液内、胶囊表面和内部都含有活菌，测定其所有的活菌数即为总菌数；测定溶液内以及微胶囊表面的活菌数即为未包埋的活菌数；总菌数与未包埋的活菌数之差即为微胶囊所包埋的活菌数。包埋率计算公式如下所示：

微胶囊包埋率＝(总菌量-未包埋的菌量)/总菌量×100％。

经检测，实施例2得到的海藻酸钠-氯化钙-壳聚糖微胶囊制备工艺下微胶囊菌剂的包埋率为99.06％，而对比例8得到的海藻酸钠-氯化钙微胶囊制备工艺体系微胶囊菌剂的包埋率为97.57％。结果表明，实施例2提供的微胶囊菌剂的制备方法取得了更好的包埋效果。

实验例3

本实验例对实施例2和对比例8所得的贝莱斯芽孢杆菌微胶囊菌剂的存储稳定性的测定，检测方法如下：

将实施例2得到的微胶囊菌剂与对比例8得到微胶囊菌剂置于4℃保存，每隔一周采用平板稀释法检测一次微胶囊及菌液中的菌体浓度，连续测定5周。结果如图3所示，由图3可以看出，在不添加任何保护剂的条件，制得的微胶囊菌剂下35天后，实施例2得到的微胶囊菌剂菌数的下降率为16.34％，而对比例8得到的微胶囊菌剂的菌数下降率为24.44％，结果表明实施例2得到的微胶囊菌剂对微生物的保存效果更佳。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市芭田生态工程股份有限公司 北京世纪阿姆斯生物工程有限公司

<120> 一种生防贝莱斯芽孢杆菌、微胶囊菌剂的制备及其应用

<130> 2020

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

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<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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<210> 3

<211> 1514

<212> DNA

<213> 贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）

<400> 3

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ttaacccaac atctcacgac acgagctgac gacaaccatg caccacctgt cactctgccc 480

ccgaagggga cgtcctatct ccaggattgt cagaggatgt caagacctgg taaggttctt 540

cgcgttgctt cgaattaaac cacatgctcc accgcttgtg cgggcccccg tcaattcctt 600

tgagtttcag tcttgcgacc gtactcccca ggcggagtgc ttaatgcgtt agctgcagca 660

ctaaggggcg gaaaccccct aacacttagc actcatcgtt tacggcgtgg actaccaggg 720

tatctaatcc tgttcgctcc ccacgctttc gctcctcagc gtcagttaca gaccagagag 780

tcgccttcgc cactggtgtt cctccacatc tctacgcatt tcaccgctac acgtggaatt 840

ccactctcct cttctgcact caagttcccc agtttccaat gaccctcccc ggttgagccg 900

ggggctttca catcagactt aagaaaccgc ctgcgagccc tttacgccca ataattccgg 960

acaacgcttg ccacctacgt attaccgcgg ctgctggcac gtagttagcc gtggctttct 1020

ggttaggtac cgtcaaggtg ccgccctatt tgaacggcac ttgttcttcc ctaacaacag 1080

agctttacga tccgaaaacc ttcatcactc acgcggcgtt gctccgtcag actttcgtcc 1140

attgcggaag attccctact gctgcctccc gtaggagtct gggccgtgtc tcagtcccag 1200

tgtggccgat caccctctca ggtcggctac gcatcgtcgc cttggcgagc cgttacctca 1260

ccaactagct aatgcgccgc gggtccatct gtaagtggta gccgaagcca ccttttatgt 1320

ctgaaccatg cggttcaaac aaccatccgg tattagcccc ggtttcccgg agttatccca 1380

gtcttacagg caggttaccc acgtgttact cacccgtccg ccgctaacat cagggagcaa 1440

gctcccatct gtccgctcga cttgcatgta ttaggcacgc cgccagcgtt cgtcctgagc 1500

caggatcaaa ctct 1514

Claims (10)

1.一种生防贝莱斯芽孢杆菌，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌的菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.20317。

2.采用权利要求1所述菌种保藏号为CGMCC NO.20317的生防贝莱斯芽孢杆菌制备的生物防治菌剂。

3.根据权利要求2所述的生物防治菌剂，其特征在于，所述生物防治菌剂包括微胶囊菌剂；

优选地，所述微胶囊菌剂包括带有壳聚糖覆膜的固定化贝莱斯芽孢杆菌；

优选地，所述固定化贝莱斯芽孢杆菌通过海藻酸钠-氯化钙体系固定得到。

4.权利要求2或3所述的生物防治菌剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括，将含有贝莱斯芽孢杆菌的海藻酸钠溶液加入氯化钙溶液得到固定化贝莱斯芽孢杆菌，再于搅拌条件下，将固定化芽孢杆菌与壳聚糖溶液混合得到壳聚糖覆膜的固定化贝莱斯芽孢杆菌。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在将固定化贝莱斯芽孢杆菌覆膜前，对固定化贝莱斯芽孢杆菌进行无菌水洗涤。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述氯化钙溶液中氯化钙的质量浓度1％～2.5％，进一步优选为1.9％。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖溶液中壳聚糖的质量浓度0.5％～1.5％，所述壳聚糖覆膜的时间为35～45min；优选为40min；所述壳聚糖覆膜温度在20℃～35℃之间，优选25℃；

优选地，所述壳聚糖的质量浓度为0.85％。

8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述含有贝莱斯芽孢杆菌的海藻酸钠溶液的制备方法包括，将贝莱斯芽孢杆菌菌悬液与无菌的海藻酸钠溶液混合制得；

优选地，所述海藻酸钠溶液中海藻酸钠的质量浓度1％～2.5％，进一步优选为2.05％；

优选地，所述贝莱斯芽孢杆菌菌悬液的密度为2.5×10⁷cfu/mL～2.5×10⁹cfu/mL，进一步优选为10⁸cfu/mL；

优选地，所述菌悬液与海藻酸钠溶液的体积比为0.16～1：1，优选为0.4:1。

9.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌、权利要求2或3所述的生物防治菌剂或权利要求4～8任一项所述制备方法得到的生物防治菌剂在生物防治中的应用。

10.根据权利要求9的所述的应用，其特征在于，所述生物防治的病害包括番茄青枯病、番茄枯萎病、水稻恶霉病、甜瓜根腐病、黄瓜黑斑病、香蕉灰线病或马铃薯疫病中的一种或两种以上组合。

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