CN112680379A - 特基拉芽孢杆菌、微胶囊菌剂和制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种特基拉芽孢杆菌、微胶囊菌剂和制备方法，涉及农用微生物菌剂领域。本发明提供的特基拉芽孢杆菌，来源于田间土壤，对植物具有明显的促生作用，能够促进植物种子的萌发以及植物根、茎的生长。本发明提供的微胶囊菌剂，通过海藻酸钠‑氯化钙‑壳聚糖包膜体系对特基拉芽孢杆菌进行包埋，能够显著降低将微生物菌体制备成菌剂过程中的损耗，提高包埋率以及菌剂的稳定性，使得膜内的微生物能够最大限度的保存其活性，施入土壤后能够更好的发挥出特基拉芽孢杆菌的促生作用。

Description

特基拉芽孢杆菌、微胶囊菌剂和制备方法

技术领域

本发明涉及农用微生物菌剂领域，尤其是涉及一种特基拉芽孢杆菌、微胶囊菌剂和制备方法。

背景技术

植物促生菌是一类在一定条件下有利于植物生长的自由生活在土壤、根际、根表、叶际的细菌，目前常用的植物促生菌存在植物促生效果不理想、抗逆性差的技术问题，因此有必要寻找一种植物促生作用更好且抗逆性强的菌株。芽胞杆菌是一类广泛分布的可形成芽孢的革兰氏阳性细菌，可以定殖在植物体表及内部，通过合成抗菌化合物，与有害微生物竞争，激活植物防御反应，提供植物可利用的营养等机制发挥生防功能，促进植物生长，在农作物生产中广泛应用。此外部分芽胞杆菌还可产生纤维素酶、淀粉酶、脂肪酶等多种有用代谢产物，其芽孢具有极强抗逆性、可抵抗高温、干旱、紫外线和有机溶剂等多种不良环境，是微生物制剂中的重要添加菌株之一。

芽胞杆菌生物制剂的制备是其产业化中关键的一环，在芽孢杆菌发酵后，大部分情况是将其制备为菌液或菌粉，然而，菌液在其在运输和保存上都存在增加成本的问题，菌粉在制备过程中大部分采用的是高温喷雾干燥法，该技术会导致菌体及其天然代谢产物在高温条件下受到不可逆的伤害，最终导致生物制剂中的活菌数减少、菌剂活性减低等问题。因此，新型生物菌剂的制备工艺研发具有深远的应用意义和经济价值。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种特基拉芽孢杆菌Bacillus tequilensis，于2020年7月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.20316。

本发明的第二目的在于提供一种菌剂，该菌剂包括上述特基拉芽孢杆菌。

本发明的第三目的在于提供一种上述特基拉芽孢杆菌或菌剂在植物促生中的应用。

本发明的第四目的在于提供一种植物促生产品。

本发明的第五目的在于提供一种微胶囊菌剂，以解决上述问题的至少一种。

本发明的第六目的在于提供一种微胶囊菌剂的制备方法，该方法简单快捷，包埋率高，制备得到的微胶囊菌剂性质稳定。

为了解决上述技术问题，特采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种特基拉芽孢杆菌Bacillus tequilensis，所述特基拉芽孢杆菌Bacillus tequilensis保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.20316。

第二方面，本发明提供了一种菌剂，包括特基拉芽孢杆菌Bacillus tequilensis。

第三方面，本发明提供了一种特基拉芽孢杆菌Bacillus tequilensis或菌剂在植物促生中的应用。

作为进一步技术方案，所述植物包括小白菜和番茄。

第四方面，本发明提供了一种植物促生产品，包括特基拉芽孢杆菌Bacillustequilensis和/或菌剂。

第五方面，本发明提供了一种微胶囊菌剂，包括特基拉芽孢杆菌Bacillustequilensis、海藻酸钠、氯化钙和壳聚糖；

所述微胶囊菌剂的壁材为海藻酸钠与氯化钙形成的海藻酸钙凝胶，海藻酸钙凝胶中分散有壳聚糖；所述微胶囊菌剂的芯材为特基拉芽孢杆菌Bacillus tequilensis。

第六方面，本发明提供了一种微胶囊菌剂的制备方法，包括以下步骤：

将特基拉芽孢杆菌Bacillus tequilensis悬液与海藻酸钠溶液混合，然后滴加至CaCl₂溶液中固化，再添加至壳聚糖溶液中覆膜，制备得到微胶囊菌剂。

作为进一步技术方案，所述特基拉芽孢杆菌Bacillus tequilensis溶液的浓度为2.5×10⁷cfu/mL-2.5×10⁹cfu/mL，优选为10⁸cfu/mL；

优选地，所述海藻酸钠溶液的浓度为1％-2.5％，优选为2.05％；

优选地，所述特基拉芽孢杆菌Bacillus tequilensis溶液与海藻酸钠溶液的体积比为0.16-1，优选为0.4；

优选地，所述CaCl₂溶液的浓度为1％-2.5％，优选为1.9％；

优选地，所述壳聚糖溶液的浓度为0.5％-1.5％，优选为0.85％。

作为进一步技术方案，在搅拌的条件下进行固化和/或覆膜；

优选地，固化过程中，所述CaCl₂溶液的搅拌转速为350-450rpm，优选为400rpm；

优选地，所述固化的时间为25-35min，优选为30min；

优选地，覆膜过程中，所述壳聚糖溶液的搅拌转速为550-650rpm，优选为600rpm；

优选地，所述覆膜的时间为35-45min，优选为40min。

作为进一步技术方案，所述滴加为通过注射器滴加；

优选地，所述注射器针头的直径为0.40-0.50nm，优选为0.45nm；

优选地，固化结束后和覆膜开始前还包括洗涤步骤；

优选地，覆膜结束后还包括洗涤步骤；

优选地，使用无菌水洗涤2-3次。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的特基拉芽孢杆菌，来源于田间土壤，抗逆性强，对植物具有明显的促生作用，能够促进植物种子的萌发以及植物根、茎的生长。

本发明提供的微胶囊菌剂，其组分包括特基拉芽孢杆菌、海藻酸钠、氯化钙和壳聚糖，微胶囊菌剂外层为海藻酸钠与氯化钙形成的海藻酸钙凝胶，海藻酸钙凝胶中分散有壳聚糖，能够提高海藻酸钙凝胶的强度，微胶囊菌剂内部为特基拉芽孢杆菌，得到的微胶囊菌剂的密度和强度高，可避免因凝胶结构破坏导致的菌体释放问题，并对Ca²⁺螯合剂以及其他抗凝乳剂等严苛的不利因素具有较强的抵抗性能，显著提高了胶囊内部特基拉芽孢杆菌的稳定性。

本发明提供的微胶囊菌剂的制备方法，通过海藻酸钠-氯化钙-壳聚糖包膜体系对特基拉芽孢杆菌进行包埋，能够显著降低将微生物菌体制备成菌剂过程中的损耗，提高包埋率以及菌剂的稳定性，使得膜内的微生物能够最大限度的保存其活性，制备得到的微胶囊菌剂性质稳定，菌种分散均匀。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例4提供的固化后得到的微胶囊；

图2为本发明实施例4提供的覆膜后得到的为微胶囊菌剂；

图3为本发明实施例2提供的8种菌株对小白菜种子根长影响；

图4为本发明实施例5提供的放置时间对微胶囊菌剂中菌体浓度影响。

具体实施方式

下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

第一方面，本发明提供了一种特基拉芽孢杆菌，该菌株的分类命名为：特基拉芽孢杆菌，拉丁文学名：Bacillus tequilensis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2020年7月8日，保藏编号：CGMCC No.20316。

本发明的特基拉芽孢杆菌来源于田间土壤，该特基拉芽孢杆菌，属于革兰氏阳性菌，好氧，菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。

本发明提供的特基拉芽孢杆菌，对植物具有明显的促生作用，能够促进植物种子的萌发以及植物根、茎的生长。

第二方面，本发明提供了一种菌剂，包括特基拉芽孢杆菌。

本发明提供的菌剂，包括本发明的特基拉芽孢杆菌，或者特基拉芽孢杆菌与辅料或者其他菌的混合，例如，可以是本发明的特基拉芽孢杆菌与其他的菌混合制备的菌剂，也可以是本发明的特基拉芽孢杆菌与辅料制备得到的菌剂。该菌剂具有本发明特基拉芽孢杆菌的所有有益效果。

第三方面，本发明提供了一种特基拉芽孢杆菌或菌剂在植物促生中的应用。

在一些优选的实施方式中，所述植物包括小白菜和番茄。

经发明人研究发现，本发明提供的特基拉芽孢杆菌对小白菜种子的萌发具有促进作用，对于番茄苗根、茎的生长具有促进作用，因此能够用于植物生长发育的促进。

需要说明的是，上述“促生”是指促进植物生长发育。第四方面，本发明提供了一种植物促生产品，包括特基拉芽孢杆菌和/或菌剂。

需要说明的是，上述“和/或”是指，植物促生产品中可以包括特基拉芽孢杆菌，可以包括菌剂，也可以包括特基拉芽孢杆菌和菌剂。

本发明的特基拉芽孢杆菌或菌剂均具有促进植物生长的作用，因此，以特基拉芽孢杆菌和/或菌剂制备得到的产品也具有促进植物生长的作用。

第五方面，本发明提供了一种微胶囊菌剂，包括特基拉芽孢杆菌、海藻酸钠、氯化钙和壳聚糖；

所述微胶囊菌剂的壁材为海藻酸钠与氯化钙形成的海藻酸钙凝胶，海藻酸钙凝胶中分散有壳聚糖；所述微胶囊菌剂的芯材为特基拉芽孢杆菌。

海藻酸钠-Ca²⁺是最常用的包埋体系，Ca²⁺与海藻酸钠的比例越高，微胶囊包埋颗粒机械保护强度越强，但仍对酸性条件敏感。此外，在其他高浓度单价离子或螯合剂存在的情况下，Ca²⁺会被替换出来，凝胶稳定性下降，颗粒孔径分布范围较宽，较难保留小分子芯材等缺点。本研究通过在其表面覆盖壳聚糖涂层，由于壳聚糖分子量小，能够较快地扩散至海藻酸钠中，并与海藻酸钠具有很好的生物相容性，形成的凝胶颗粒密度和强度更高，可避免因凝胶结构破坏导致的菌体释放问题，并对Ca²⁺螯合剂以及其他抗凝乳剂等严苛的不利因素具有较强的抵抗性能，显著提高了胶囊内部特基拉芽孢杆菌的稳定性。

第六方面，本发明提供了一种微胶囊菌剂的制备方法，包括以下步骤：

将特基拉芽孢杆菌悬液与海藻酸钠溶液混合，然后滴加至CaCl₂溶液中固化，再添加至壳聚糖溶液中覆膜，制备得到微胶囊菌剂。

本发明中将特基拉芽孢杆菌先溶于水得到菌悬液后再与海藻酸钠溶液混合，有助于特基拉芽孢杆菌的分散均匀。

本发明提供的微胶囊菌剂的制备方法，通过海藻酸钠-氯化钙-壳聚糖包膜体系对特基拉芽孢杆菌进行包埋，能够显著降低将微生物菌体制备成菌剂过程中的损耗，提高包埋率以及菌剂的稳定性，使得膜内的微生物能够最大限度的保存其活性，施入土壤后能够更好的发挥出特基拉芽孢杆菌的促生作用。

作为进一步技术方案，所述特基拉芽孢杆菌溶液的浓度为2.5×10⁷cfu/mL～2.5×10⁹cfu/mL，优选为10⁸cfu/mL；

优选地，所述海藻酸钠溶液的浓度为1％-2.5％，例如可以为，但不限于1％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2％、2.2％、2.4％或2.5％，优选为2.05％；

优选地，所述特基拉芽孢杆菌溶液与海藻酸钠溶液的体积比为0.16-1，例如可以为，但不限于0.16、0.2、0.4、0.6、0.8或1，优选为0.4；

优选地，所述CaCl₂溶液的浓度为1％-2.5％，例如可以为，但不限于1％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2％、2.2％、2.4％或2.5％，优选为1.9％；

优选地，所述壳聚糖溶液的浓度为0.5％-1.5％，优选为0.85％。

通过对各个溶液浓度及配比的进一步优化和调整，使得制备得到的微球更加稳定、降低菌剂的损耗。

作为进一步技术方案，在搅拌的条件下进行固化和/或覆膜。在搅拌下进行固化或覆膜有助于微球的分散成球。

优选地，固化过程中，所述CaCl₂溶液的搅拌转速为350-450rpm，例如可以为，但不限于350rpm、360rpm、370rpm、380rpm、390rpm、400rpm、410rpm、420rpm、430rpm、440rpm或450rpm，优选为400rpm；

优选地，所述固化的时间为25-35min，例如可以为，但不限于25min、27min、29min、31min、33min或35min，优选为30min；

优选地，覆膜过程中，所述壳聚糖溶液的搅拌转速为550-650rpm，例如可以为，但不限于550rpm、560rpm、570rpm、580rpm、590rpm、600rpm、610rpm、620rpm、630rpm、640rpm或650rpm，优选为600rpm。

优选地，所述覆膜的时间为35-45min，例如可以为，但不限于35min、37min、39min、41min、43min或45min，优选为40min。

在一些优选的实施方式中，所述滴加为通过注射器滴加。使用注射器更有助于控制溶液的滴加量。

优选地，所述注射器的针头直径为0.40-0.50nm，例如可以为，但不限于0.40nm、0.41nm、0.42nm、0.43nm、0.44nm、0.45nm、0.46nm、0.47nm、0.48nm、0.49nm或0.50nm，优选为0.45nm；

通过对注射器的针头直径的进一步优化和调整，使得制备得到的微胶囊大小均一，为直径约2mm的球形颗粒。

优选地，固化结束后和覆膜开始前还包括洗涤步骤；

优选地，覆膜结束后还包括洗涤步骤。本发明中，固化结束后可以对固化得到的微胶囊进行冲洗，去除微胶囊表面粘连的氯化钙，避免其影响覆膜的效果；覆膜结束后，微胶囊表面粘连有部分壳聚糖，可以对微胶囊表面进行冲洗，去除表面的壳聚糖。

优选地，使用无菌水洗涤2-3次。

下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

实施例1土壤中微生物单菌落的分离与纯化

采用稀释涂布平板法、单细胞挑取法和平板划线法对病害土壤中的微生物进行分离和纯化，首先将收集的病害土壤称取10g加入装有90mL无菌水的无菌锥形瓶中，随后将锥形瓶置于摇床上，150rpm震荡30min，静置2h，直至液体分层，取上清液进行下一步试验，将上清液分别稀释10^-1-10^-6梯度，每个梯度吸取100uL涂布在固体LB培养基(配方为胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂15g/L)上，28℃，培养48h。待平板上长出各种单菌落后，使用无菌牙签小心挑取单菌落，转移到新的LB固体培养基上进行划线，随后28℃，培养48h后，观察平板表明菌落形态，直至平板中只有一种菌落形态，则表明分离纯化完成，共从土壤中分离出8株微生物菌株，随后将纯化后的各菌株平板放置4℃条件下保存备用。

实施例2促生微生物菌株的筛选

将筛选出的菌种进行液体培养，培养24h后，分别将8株菌种的菌液稀释1000倍，进行种子发芽试验，被试种子选用小白菜种子，将小白菜种子放置在一次性平板中，平板内铺有无菌纱布，根据试验设计，在不同平板中，分别加入10mL的菌液稀释液，随后放置在光照培养箱内，25℃，培养48h后，计算种子发芽率及发芽长度。结果表明，本申请的特基拉芽孢杆菌在稀释1000倍后，具有最佳的促生能力，如图3所示，种子发芽试验结果表明，所有菌株相比于对照组均有一定的促生能力，分离出的8株菌种的发芽率均在95％以上，其中07号菌株具有最优的促生能力，其与对照组相比，根长增长了22.32％。

实施例3促生微生物菌株的鉴定

将07号菌株进行16s RNA的鉴定，试验材料包括：扩增引物、LB培养基、扩增酶、细胞裂解液等。

试验方法

16s RNA的鉴定

采用16s RNA测序技术和菌落PCR技术对微生物的种类进行鉴定。将07号菌株接种于LB固体培养基中，培养过夜后，从平板上取一个新鲜的单菌落置于1.5mL离心管中，加入10uL的S2裂解液，将其震荡混匀，室温静置20min，随后稀释20倍，震荡混匀，在12000rpm条件下离心2min，取上清液作为模板，进行PCR扩增。

扩增引物序列为：

正向引物27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG(SEQ ID No.1)；

反向引物1492R：TACGGCTACCTTGTTACGACTT(SEQ ID No.2)；

扩增酶：code#AS11；

扩增程序：94℃5min；94℃30s；55℃30s；72℃90s；循环数35次，72℃7min，4℃保存。

菌落PCR的反应体系如表1所示。

表1菌落PCR的反应体系

琼脂糖凝胶电泳的配置体系如表2所示。

表2琼脂糖凝胶电泳的反应体系

将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化胶块。将纯化后的产物进行sanger测序，获得正反向测序结果，利用DNAMAN软件对所得数据进行拼接，并在www.ezbiocloud.net数据库中进行16s RNA的比对，鉴定微生物的种类。

鉴定结果如表3所示，07号菌株为特基拉芽孢杆菌Bacillus tequilensis。

基因序列为如下(SEQ ID No.3)：

AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGGGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTA

表3 16sRNA菌种测序结果

实施例4微胶囊菌剂的制备

将培养好的特基拉芽孢杆菌液体培养基4000rpm离心15分钟，弃上清，收集菌体，随后添加适量无菌水，制备成菌悬液，菌悬液的浓度控制在为2.5×10⁷cfu/mL-2.5×10⁹cfu/mL之间。取一定量的菌液与灭菌的海藻酸钠溶液混合均匀后，在搅拌速度为400rpm的情况下，使用直径0.45nm的无菌注射器将此混合液滴加到CaCl₂溶液中，固化30min，随后使用无菌水洗涤2-3次，收集微胶囊，洗涤液收集备用，如图1所示。将收集的微胶囊在搅拌速度为600rpm的条件下加到壳聚糖溶液中，覆膜40min，随后使用无菌水洗涤2-3次，4℃保存，洗涤液收集备用，如图2所示。期间涉及到的溶液浓度及比例如下：海藻酸钠浓度2％；氯化钙浓度2％；壳聚糖浓度1％；菌液与海藻酸钠溶液的体积比为0.6:1。生物微胶囊制备后形态为直径2mm左右的规则球状颗粒。

对比例1

一种微胶囊菌剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

取实施例1制得的功能性微生物菌悬液与灭菌的质量浓度为2.05％的海藻酸钠溶液混合均匀，得到溶液A；所述溶液A中功能性微生物菌悬液与海藻酸钠溶液的体积比为1：2.5；

然后，在搅拌速度为400rpm的情况下，用直径0.45nm的无菌注射器将得到溶液A滴加到质量浓度为1.9％的氯化钙溶液中，固化30min，形成海藻酸钠-氯化钙微胶囊。随后，使用无菌水洗涤固化颗粒2次，收集备用。

实施例5微胶囊菌剂包埋率及稳定性的测定

微胶囊包埋率的测定

微胶囊的包埋率是微胶囊所包埋的活菌数占总投活菌数的百分比。微胶囊制备后，溶液内、胶囊表面和内部都含有活菌，测定其所有的活菌数即为总菌数；测定溶液内以及微胶囊表面的活菌数即为未包埋的活菌数；总菌数与未包埋的活菌数之差即为微胶囊所包埋的活菌数。包埋率计算公式如下所示：

微胶囊包埋率＝(总菌量-未包埋的菌量)/总菌量×100％

微胶囊菌剂存储稳定性的测定

将实施例4的海藻酸钠-氯化钙-壳聚糖双层包膜微胶囊菌剂与对比例1的海藻酸钠-氯化钙单层包膜微胶囊菌剂放置于4℃保存，每隔一周采用平板稀释法检测一次二者中的菌体浓度，连续测定5周，结果如图4所示。

结果表明将促生效果最优的特基拉芽孢杆菌制备成微胶囊菌剂，海藻酸钠-氯化钙-壳聚糖微胶囊制备工艺下微胶囊的包埋率为99.06％，而海藻酸钠-氯化钙微胶囊制备工艺体系微胶囊的包埋率为97.57％。结果表明，采用双层微胶囊体系在包埋率上比单层微胶囊体系要效果更好。

经测定本发明微胶囊包埋率可达99％以上。微胶囊菌剂的稳定性试验数据表明，在不添加任何保护剂的条件，本申请实施例4制得的微胶囊菌剂下35天后，双层包膜的微胶囊菌剂菌数的下降率为15.33％，而对比例1单层包膜的微胶囊菌剂的菌数下降率为26％，数据表明双层包膜对微生物的保存效果更佳。说明本发明制备的微胶囊菌剂能够提高菌剂的稳定性和货架期，增强其在土壤中的定植能力。

实施例6微胶囊菌剂的促生能力评价

采用直径约15cm的塑料盆，盆底垫20目尼龙网，每盆装土约2kg，将番茄苗移栽至盆中，每盆3株。添加不同浓度的促生特基拉芽孢杆菌微胶囊菌剂，微胶囊浓度为10⁷CFU/粒，添加浓度分别为：A组：每盆20粒，B组：40粒，C组：60粒，每个处理6盆。培养30天后，将收获的盆栽试验植物，沿着土壤表面剪下，分成地下和地上两部分，用自来水和去离子水冲洗干净。其中地上部分根、茎、叶分开后放置，测定根长、茎高、地上部分和地下部分干重，结果如下表4所示。相比于对照组三组促生特基拉芽孢杆菌微胶囊菌剂的试验组，根长分别增加了0.19、0.28、0.39倍，茎粗分别增加了0.01、0.07、0.13倍，主茎分别增加了0.14、0.28、0.41倍。同时通过测量地上部分和地下部分的干重，如表5所示，施用促生特基拉芽孢杆菌微胶囊菌剂后能够显著提高番茄的地上部分和地下部分的干重，与对照组相比，三组地上部分和地下部分干重的提升率分别为12％、27％、44％和9％、24％、48％，说明本发明制备的微胶囊菌剂对番茄具有显著的促生作用。

表4微胶囊菌剂对番茄根、茎的影响结果

试验30天	主茎长cm	根长cm	茎粗mm
				A组	18.76	13.53	4.53
B组	20.95	15.73	4.78
				C组	22.91	21.5	5.07
对照组	16.36	11.33	4.48

表5微胶囊菌剂对番茄地上部分及地下部分干重的影响结果

试验30天	地上部分干重平均值	地下部分干重平均值
			A组	0.286	0.311
B组	0.325	0.356
			C组	0.368	0.423
对照组	0.255	0.286

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市芭田生态工程股份有限公司 北京世纪阿姆斯生物工程有限公司

<120> 特基拉芽孢杆菌、微胶囊菌剂和制备方法

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tacggctacc ttgttacgac tt 22

<210> 3

<211> 1514

<212> DNA

<213> 特基拉芽孢杆菌

<400> 3

agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc 60

ggacagatgg gggcttgctc cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa 120

cctgcctgta agactgggat aactccggga aaccggggct aataccggat ggttgtttga 180

accgcatggt tcaaacataa aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg 240

cattagctag ttggtgaggt aacggctcac caaggcaacg atgcgtagcc gacctgagag 300

ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg 360

gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt 420

cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga acaagtaccg ttcgaatagg gcggtacctt 480

gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag 540

gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct 600

gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca 660

gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc 720

agtggcgaag gcgactctct ggtctgtaac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg 780

aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg 840

tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc 900

aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa 960

ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc tctgacaatc ctagagatag 1020

gacgtcccct tcgggggcag agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg 1080

agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc agcattcagt 1140

tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc 1200

atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat ggacagaaca aagggcagcg 1260

aaaccgcgag gttaagccaa tcccacaaat ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac 1320

tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt 1380

tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt 1440

gaggtaacct tttaggagcc agccgccgaa ggtgggacag atgattgggg tgaagtcgta 1500

acaaggtagc cgta 1514

Claims (10)

1.一种特基拉芽孢杆菌Bacillus tequilensis，其特征在于，所述特基拉芽孢杆菌Bacillus tequilensis保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.20316。

2.一种菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述的特基拉芽孢杆菌Bacillustequilensis。

3.权利要求1所述的特基拉芽孢杆菌Bacillus tequilensis或权利要求2所述的菌剂在植物促生中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述植物包括小白菜和番茄。

5.一种植物促生产品，其特征在于，包括权利要求1所述的特基拉芽孢杆菌Bacillustequilensis和/或权利要求2所述的菌剂。

6.一种微胶囊菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述的特基拉芽孢杆菌Bacillustequilensis、海藻酸钠、氯化钙和壳聚糖；

所述微胶囊菌剂的壁材为海藻酸钠与氯化钙形成的海藻酸钙凝胶，海藻酸钙凝胶中分散有壳聚糖；所述微胶囊菌剂的芯材为特基拉芽孢杆菌Bacillus tequilensis。

7.权利要求6所述的微胶囊菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将特基拉芽孢杆菌Bacillus tequilensis悬液与海藻酸钠溶液混合，然后滴加至CaCl₂溶液中固化，再添加至壳聚糖溶液中覆膜，制备得到微胶囊菌剂。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述特基拉芽孢杆菌Bacillustequilensis溶液的浓度为2.5×10⁷cfu/mL-2.5×10⁹cfu/mL，优选为10⁸cfu/mL；

优选地，所述海藻酸钠溶液的浓度为1％-2.5％，优选为2.05％；

优选地，所述特基拉芽孢杆菌Bacillus tequilensis溶液与海藻酸钠溶液的体积比为0.16-1，优选为0.4；

优选地，所述CaCl₂溶液的浓度为1％-2.5％，优选为1.9％；

优选地，所述壳聚糖溶液的浓度为0.5％-1.5％，优选为0.85％。

9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，在搅拌的条件下进行固化和/或覆膜；

优选地，固化过程中，所述CaCl₂溶液的搅拌转速为350-450rpm，优选为400rpm；

优选地，所述固化的时间为25-35min，优选为30min；

优选地，覆膜过程中，所述壳聚糖溶液的搅拌转速为550-650rpm，优选为600rpm；

优选地，所述覆膜的时间为35-45min，优选为40min。

10.根据权利要求7-9任一项所述的制备方法，其特征在于，所述滴加为通过注射器滴加；

优选地，所述注射器针头的直径为0.40-0.50nm，优选为0.45nm；

优选地，固化结束后和覆膜开始前还包括洗涤步骤；

优选地，覆膜结束后还包括洗涤步骤；

优选地，使用无菌水洗涤2-3次。

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