CN115873746A - 特基拉芽孢杆菌sy89在促进植物生长中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及农业微生物技术领域，具体涉及一种特基拉芽孢杆菌(Bacillustequilensis)SY89在促进植物生长中的应用，于2022年06月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.24998；所述的特基拉芽孢杆菌SY89在含Trp培养基中分泌的吲哚乙酸IAA量为25.22mg/L；且可分泌铁载体；成功表达绿色荧光，在根部表面及内部均可检测到，平均103CFU/g定殖于当归根部，且持续时间较长。108CFU/mL特基拉芽孢杆菌SY89处理当归根的各项指标比水处理提高23.35％以上，说明特基拉芽孢杆菌SY89对当归有促进生长的效果。

Description

特基拉芽孢杆菌SY89在促进植物生长中的应用
技术领域
本发明涉及农业微生物技术领域，具体涉及特基拉芽孢杆菌SY89在促进植物生长中的应用。
背景技术
当归Angelica sinensis(Oliv.)Diels，为伞形科(Apiaceae)多年生草本植物，主要分布于甘肃省，广泛用于免疫系统、造血系统、心血管系统、中枢神经系统等方面，致使当归的经济价值得到提升，有广阔发展前景。但是目前当归的种植过程中，为了促进当归根部生长，提高当归产量，都是在当归开花前、幼果期、果实膨大期喷施化学试剂，化学试剂的使用，能够加速农作物的生长，但是降低了当归的活性物质含量，降低了当归的保健效果。中药材生产不仅需要注重产量，更加注重品质，因此，中药材专用菌剂的开发需要综合考虑促生、抗病、提质的问题。
植物根际促生菌(plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)指生存在植物根际范围中对植物生长有促进或对病原菌有拮抗作用的有益细菌。能够改善植物根际土壤环境、提高速效养分含量、降解毒害物质，分泌抗病促生物质，诱导菌植互作，对植物整体的生长发育、抗病促生，具有显著的影响。目前常用的植物促生菌存在植物促生效果不理想、抗逆性差、在药用植物中不能应用的技术问题，因此有必要寻找一种植物促生作用更好且抗逆性强的菌株。
发明人意外的从当归种植区土壤中分离得到了一株特基拉芽孢杆菌(Bacillustequilensis)SY89，所述的特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)SY89能够促进植物生长中的应用。
发明内容
针对上述技术问题，本发明的首要目的是提供特基拉芽孢杆菌(Bacillustequilensis)SY89在促进植物生长中的应用，所述的特基拉芽孢杆菌SY89于2022年06月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24998。
本发明的第二目的是提供特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)SY89在促进药用植物生长中的应用，所述的特基拉芽孢杆菌SY89于2022年06月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24998。
优选的，所述的植物或药用植物为当归、党参、黄芪。
优选的，所述的植物为当归。
优选的，所述的特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)SY89菌种的制备方法为：将特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)SY89接种到已灭菌的富集培养基中，摇床震荡培养，使用无菌水稀释到1×108CFU/mL，所述的培养条件为：温度为30-37℃，转速为150-180rpm，培养时间为36-48h。
优选的，所述的富集培养基的配方为葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母膏5g/L，pH为6.5～7.5。
优选的，所述的特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)SY89加入农药学上可接受的辅料制备成可湿性粉剂、水分散粒剂、水悬浮剂或可分散油悬浮剂。
优选的，所述农药学上可接受的辅料选自分散剂、润湿剂、崩解剂、粘结剂、消泡剂、抗冻剂、增稠剂、填料和溶剂中的一种或多种。
本发明的有益效果是：(1)本发明提供了特基拉芽孢杆菌SY89在促进植物生长中的新用途，所述的特基拉芽孢杆菌SY89于2022年06月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24998；(2)所述的特基拉芽孢杆菌SY89在含Trp培养基中分泌的吲哚乙酸IAA量为25.22mg/L；且特基拉芽孢杆菌SY89可分泌铁载体；(3)特基拉芽孢杆菌SY89成功表达绿色荧光，在根部表面及内部均可检测到，平均以103CFU/g定殖于当归根部，且持续时间较长。(4)与水处理相比，108CFU/mL特基拉芽孢杆菌SY89处理当归根的各项指标比水处理分别提高23.35％、56.81％、26.34％和40.86％，说明特基拉芽孢杆菌SY89对当归有促进生长的效果。
附图说明
图1为特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)SY89基于16s rDNA序列的系统发育树。
图2为特基拉芽孢杆菌SY89生成铁载体和吲哚乙酸(IAA)检测图。
图3为特基拉芽孢杆菌SY89成功定殖于当归根部图。
图4为特基拉芽孢杆菌SY89成功定殖于当归根部的持续效果统计。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，但本发明的保护范围并不受以下实施例的限制。
以下实施例中所述的富集培养基的配方为：葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母膏5g/L，pH为6.5～7.5。
以下实施例中所述的LB固体培养基的配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L。
以下实施例中所述的PDA培养基的配方为：马铃薯200g/L,葡萄糖20g/L，琼脂粉15g/L。
实施例1、菌株的分离、纯化和鉴定
2020年10月20日从甘肃省定西市渭源县会川镇当归种植区采集土壤样品，采用稀释涂布法对微生物分离纯化，称取样品1g加入装有9mL无菌水稀释成10﹣1、10﹣2、10﹣3、10﹣4、10﹣5等不同浓度，涂布于LB固体培养基，于30℃培养箱倒置培养，挑取单菌落平板划线纯化，得到纯菌株。筛选拮抗效果好的菌株命名为SY89。菌落呈不规则形态，边缘光滑湿润，不透明，微黄色，菌体杆状，呈革兰氏阳性。通过16s rDNA分子生物学鉴定，确定菌株为特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)，基于16s rDNA序列的系统发育树如图1所示，所述的特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)SY89的16s rDNA序列如SEQ ID No.1所示。
将筛选得到的特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)SY89在中国普通微生物菌种保藏管理中心登记保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.24998，联系电话为：010-64807355。
以下实施例中，将特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)SY89，简写为特基拉芽孢杆菌SY89。
实施例2、特基拉芽孢杆菌SY89对当归促生作用
特基拉芽孢杆菌SY89在含有L-色氨酸和不含有L-色氨酸的LB液体培养基中培养2天，温度30℃，转速180rpm。12000rpm离心5min后，上清液与Salkowski试剂(150mL浓H2SO4，250mL sdH2O，7.5mL 0.5M FeCl3·6H2O)按1:2的比例以短涡流方式混合。在30℃和黑暗中孵育30分钟后，用分光光度计在530nm处测量混合物的光吸光度。
通过O-CAS检测定性地检测了铁载体的产生。细菌在LB琼脂平板上划线，30℃孵育24h。菌落接种在以琼脂糖为胶凝剂的CAS培养基上，30℃孵育48h。在菌落周围出现一个清晰的光晕被认为是产生铁载体的标志。
实验结果如图2所示，特基拉芽孢杆菌SY89在不含L-色氨酸的培养基的比色反应中呈淡红色，相反在含有L-色氨酸的培养基中的比色反应是深红色，特基拉芽孢杆菌SY89在含Trp培养基中分泌的吲哚乙酸IAA量为25.22mg/L；此外通过O-CAS检测可得特基拉芽孢杆菌SY89可分泌铁载体，说明特基拉芽孢杆菌SY89可促进植物生长。
实施例3、特基拉芽孢杆菌SY89在当归根部定殖作用
用GFP标记的载体pGFP4412构建了GFP标记的特基拉芽孢杆菌SY89。特基拉芽孢杆菌SY89-GFP在100mL含100μg/mLAmp的LB液体培养基中培养过夜，30℃孵育。将生长良好的当归根经表面灭菌后移栽至无菌土壤的花盆中，再加入100mL SY89-GFP(108CFU/mL)发酵液，100mL水为空白对照。在接种后3、5、7、10、15d随机采集当归根组织样本，采用平板法检测菌落数，并在488nm的激发波长下使用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM Olympus FV3000)进行观察。
实验结果如图3和4所示，特基拉芽孢杆菌SY89成功表达绿色荧光，在根部表面及内部均可检测到，平均103CFU/g定殖于当归根部，且持续时间较长。
实施例4、特基拉芽孢杆菌SY89对当归幼苗促生效果评价
盆栽实验在兰州交通大学的温室中进行。当归根部用75％酒精进行表面消毒，种植在装有消毒土壤的塑料盆(直径20厘米)中，并在25℃下培养发芽。每盆每5天用50mL特基拉芽孢杆菌SY89悬浮液(1×108CFU/mL)灌溉一次，水作为阴性对照。种植30天后，测量高度、根长、鲜重和干重，每个处理包括30个当归苗。
实验结果如表1所示，与水处理相比，108CFU/mL特基拉芽孢杆菌SY89处理当归根的各项指标比水处理分别提高23.35％、56.81％、26.34％和40.86％，说明特基拉芽孢杆菌SY89对当归有促进生长的效果。
表1特基拉芽孢杆菌SY89对当归幼苗促生效果评价
Figure BDA0003786246330000041
综上所述，本发明提供了特基拉芽孢杆菌SY89在促进植物生长中的新用途，所述的特基拉芽孢杆菌SY89于2022年06月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24998；所述的特基拉芽孢杆菌SY89在含Trp培养基中分泌的吲哚乙酸IAA量为25.22mg/L；且特基拉芽孢杆菌SY89可分泌铁载体；特基拉芽孢杆菌SY89成功表达绿色荧光，在根部表面及内部均可检测到，平均103CFU/g定殖于当归根部，且持续时间较长。同时，与水处理相比，108CFU/mL特基拉芽孢杆菌SY89处理当归根的各项指标比水处理分别提高23.35％、56.81％、26.34％和40.86％，说明特基拉芽孢杆菌SY89对当归有促进生长的效果。

Claims (8)

1.特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)SY89在促进植物生长中的应用，其特征在于，所述的特基拉芽孢杆菌SY89于2022年06月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24998。
2.特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)SY89在促进药用植物生长中的应用，其特征在于，所述的特基拉芽孢杆菌SY89于2022年06月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24998。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的植物或药用植物为当归、党参、黄芪。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的植物为当归。
5.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的特基拉芽孢杆菌(Bacillustequilensis)SY89菌种的制备方法为：将特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)SY89接种到已灭菌的富集培养基中，摇床震荡培养，使用无菌水稀释到1×108CFU/mL，所述的培养条件为：温度为30-37℃，转速为150-180rpm，培养时间为36-48h。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的富集培养基的配方为葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母膏5g/L，pH为6.5～7.5。
7.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的特基拉芽孢杆菌(Bacillustequilensis)SY89加入农药学上可接受的辅料制备成可湿性粉剂、水分散粒剂、水悬浮剂或可分散油悬浮剂。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述农药学上可接受的辅料选自分散剂、润湿剂、崩解剂、粘结剂、消泡剂、抗冻剂、增稠剂、填料和溶剂中的一种或多种。
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