CN115478035A - 苔藓假单胞菌gt31、其应用及所得防治剂 - Google Patents

Abstract

本发明提出一种苔藓假单胞菌Pseudomonas gessardii GT31、其应用及所得防治剂，属于微生物技术领域。该苔藓假单胞菌Pseudomonas gessardii GT31，保藏编号为CGMCC No.25635，于2022年09月02日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。本发明提出的苔藓假单胞菌GT31具有良好的溶解无机磷的活性以及较强的产生长素能力，在将该苔藓假单胞菌GT31用于青枯雷尔氏菌引起的青枯病的防治中时具有良好的抑制效果。

Description

苔藓假单胞菌GT31、其应用及所得防治剂

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种苔藓假单胞菌Pseudomonasgessardii GT31、其应用及所得防治剂。

背景技术

由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的青枯病是最具破坏性的植物土传病害之一。随着生态农业需求的增加，防治土传病害不应完全依赖于化学肥料和农药的使用。目前已有大量研究表明植物根际微生物可以作为生防菌和促生菌用来防治植物病害和促进植物生长。以其为原料制备的微生物制剂具有环境友好、无农药残留的特点，为农业绿色发展带来积极作用，是提升植物产量和防控植物病害的有效途径。

近年来，微生物菌剂已被应用于烟草青枯病的防治中，并且取得了一定的成效。但目前使用的微生物菌剂大多为芽孢杆菌，同质化严重。事实上烟草根际存在着除芽孢杆菌外的许多种具有生防效果的细菌。因此，亟待寻找新的生防菌以丰富微生物菌剂的种类。假单胞菌广泛存在于植物根际中，多种假单胞菌被证实具有促进植物生长、防治植物病害的效果，其促生作用主要表现在具有溶磷活性、产生长素以及铁载体的能力。然而，目前并未有研究报道过苔藓假单胞菌(Pseudomonas mosselii)在防治烟草青枯病上的应用。

发明内容

本发明提供了一种苔藓假单胞菌Pseudomonas gessardii GT31、其应用及所得防治剂，通过对获得的苔藓假单胞菌进行促生防病能力测定，发现其具有良好的溶解无机磷的活性以及较强的产生长素能力，在将苔藓假单胞菌用于烟草青枯病的防治中时，可对青枯雷尔氏菌引起的青枯病进行有效抑制。

为了达到上述目的，本发明提供了一种苔藓假单胞菌Pseudomonas mosseliiGT31，保藏编号为CGMCC No.25635，于2022年09月02日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。

本发明还提供了一种根据上述技术方案所述的苔藓假单胞菌Pseudomonasmosselii GT31在拮抗青枯雷尔氏菌Ralstonia solanacearum引起的青枯病中的应用。

作为优选，OD₆₀₀＝0.3浓度下，接种10μL菌液，GT31产生的抑菌圈直径为1.60±0.05cm。

作为优选，OD₆₀₀＝0.3浓度下，接种20μL菌液至20mL含有0.01％色氨酸的LB培养基中，28℃、180r/min振荡培养4d，GT31产生13.15μg/mL的生长素。

作为优选，所述苔藓假单胞菌Pseudomonas mosselii GT31在每盆接种浓度为4.5×10⁷CFU/g时，对青枯雷尔氏菌引起的青枯病防治效果达到77.08％。

本发明还提供了一种烟草青枯病防治剂，以上述技术方案所述的苔藓假单胞菌Pseudomonas mosselii GT31为主要有效成分。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

本发明提供了一种苔藓假单胞菌Pseudomonas mosselii GT31，通过对获得的苔藓假单胞菌进行促生防病能力测定，发现其具有良好的溶解无机磷的活性以及较强的产生长素能力，并且首次提出了可将该苔藓假单胞菌用于烟草青枯病的防治中，且具有良好的抗病性，在每盆接种浓度为4.5×10⁷CFU/g时，对青枯雷尔氏菌引起的青枯病防治效果达到77.08％。该苔藓假单胞菌的获得能够丰富现有微生物制剂的种类，既解决了长期使用化学药品对环境的污染以及对病原菌产生的抗药性，又克服了目前微生物菌剂同质化比较严重的问题。

附图说明

图1为本发明实施例提供的苔藓假单胞菌GT31与其他模式菌株的系统进化关系示意图；

图2为本发明实施例提供的苔藓假单胞菌GT31在NA培养基上菌落形态示意图；

图3为本发明实施例提供的不同菌株溶解无机磷和产铁载体能力测定示意图；

图4为本发明实施例提供的不同菌株产生长素能力测定示意图；

图5为本发明实施例提供的不同菌株对青枯雷尔氏菌RS10的抑制效果测定示意图；

图6为本发明实施例提供的不同菌株对烟草青枯病的防控效果示意图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1土壤样品采集

2020年7月从贵州遵义烟区发病烟田中采集了健康烟草根际土，将整株烟株带根挖出，抖落非根际土，将根及附着的根际土壤放入无菌自封袋，低温运回实验室进行菌株分离培养。

实施例2苔藓假单胞菌的筛选

2.1试剂：

LB固体培养基(g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母提取物5.0，氯化钠10.0，琼脂粉20.0。

NB培养基(g/L)：蛋白胨10.0，牛肉膏3.0，氯化钠5.0，琼脂粉20.0。

PKO无机磷培养基(g/L)：葡萄糖10.0，(NH₄)₂SO₄ 0.5，MgSO₄·7H₂O 0.1，NaCl 0.2，KCl 0.2，FeSO₄·7H₂O 0.003，MnSO₄·4H₂O 0.03，Ca₃(PO₄)₂ 5.0，酵母粉0.5，琼脂20.0。

蒙金娜有机磷培养基(g/L)：：葡萄糖10.0，MnSO₄·4H₂O 0.03，FeSO₄·7H₂O0.03，CaCO₃ 5.0，(NH₄)₂SO₄ 0.5，NaCl 0.3，KCl 0.3，蛋黄卵磷脂0.2，酵母粉0.4，琼脂20.0。

改良CAS琼脂培养基：购自北京酷来搏科技有限公司。

燕麦培养基(g/L)：燕麦30.0，琼脂20.0。

谷子培养基：谷子100g，煮至2/3开花，滤干水份。

其它生化试剂及普通化学试剂均为进口或国产分析纯。

2.2细菌的分离培养：

在无菌环境中称取采集到的1.0g烟草根际土加入9mL无菌生理盐水中，振荡混匀，吸取100μL上清液加入到900μL生理盐水中，梯度稀释至10^-4。分别吸取10^-2-10^-4浓度的稀释液100μL涂布于LB固体培养基上。在28℃下恒温培养3d，根据菌落颜色、形态、表面光滑度等挑取不同的单菌落，经2-3次划线纯化，接种于LB液体培养基摇培24h至对数生长期，吸取菌液与50％甘油1:1混匀，于-80℃冰箱冷冻保存。

2.3苔藓假单胞菌的筛选及分子鉴定：

采用菌落PCR技术，使用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)对细菌16S rRNA基因序列进行扩增。具体采用的扩增体系为：2×Taq Master Mix 12.5μL、正反向引物(10μM)各1μL、DNA模板2μL、ddH₂O 8.5μL，总体系25μL；扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性1min、55℃退火1min、72℃延伸1.5min，循环30次；最后72℃延伸10min。

将PCR产物送往青岛睿博生物技术有限公司进行测序，所得细菌序列经校对后上传至EzBioCloud数据库(https://www.ezbiocloud.net/)进行比对。比对完成后分别下载同源性最高的模式菌株序列，使用MEGA5.0进行CLUSTALX多重比对，采用邻接法(Neighbor-Joining)构建系统发育树，自举值(Bootstrap)为1000。

经比对，如图1所示，菌株GT31的16S rRNA基因序列与苔藓假单胞菌(Pseudomonasmosselii)相似度最高，为89％；系统发育树显示菌株GT31与苔藓假单胞菌yy061、WAB1873、IR7-11、LJ26以及R3-2聚于一支。因此，初步认定菌株GT31为苔藓假单胞菌，具有SEQ IDNO.1所示核苷酸序列。该苔藓假单胞菌Pseudomonas gessardii GT31的保藏编号为CGMCCNo.25635，于2022年09月02日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。

在上述菌株分离过程中，还同时分离得到假单胞菌Pseudomonas alloputidaGT60和假单胞菌Pseudomonas glycinae FGH5-2-1，两株菌均为现有已知菌，在本文中不进行保护，仅用作同等条件下的对比菌株进行后续测试。

实施例3苔藓假单胞菌GT31的促生指标

3.1苔藓假单胞菌GT31的菌落形态

在营养琼脂培养基上培养48h，菌落直径达到1-2mm；形态为浅黄色、表面光滑并且规则的圆形菌落，如图2所示。

3.2苔藓假单胞菌GT31的促生指标

利用不同的指示培养基测定了苔藓假单胞菌GT31的溶磷活性、ACC脱氨酶活性、产生长素能力以及产铁载体能力。

3.2.1溶磷活性测定：取5μL GT31菌液(OD₆₀₀＝0.3)分别点种到PKO琼脂培养基和蒙金娜有机磷培养基上，28℃培养3d，观察菌落周围具有一个清晰的光环，用增溶指数(SI)评估菌株的增溶作用，计算公式如下：溶解指数(SI)＝(晕+菌落直径)/菌落直径。

3.2.2ACC脱氨酶活性测定：以产物α-丁酮酸作为指标进行检测，以分析菌株的ACC脱氨酶活力。

3.2.3产生长素能力评价：将20μL细菌悬浮液(～10⁸CFU/mL)接种到20mL LB培养基(5mM L-色氨酸)，于28℃、180r/min振荡培养96h，测定生长素产生量。

3.2.4产铁载体能力评价：将GT31菌株在28℃、180r/min下振荡培养到OD₆₀₀＝0.3接种到CAS琼脂培养基，28℃培养7d，观察细菌菌落周围的颜色变化，颜色从蓝色变为橙色或者深黄色，表明菌株可以产生铁载体。

结果发现：菌株GT31不具有溶解有机磷和ACC脱氨酶活性，但具有产铁载体能力(菌株GT31、GT60、FGH5-2-1的晕圈直径分别为2.3、2.2、1.5cm)以及溶解无机磷的活性，GT31、GT60、FGH5-2-1的溶磷指数分别为2.9、1.4、1.2，且GT31对无机磷的溶解性明显强于GT60和FGH5-2-1(如图3所示)；还具有较强的产生长素能力(如图4所示)，其中，各菌株生长素产生量分别为GT31为13.15μg/mL、GT60为11.87μg/mL、FGH5-2-1为4.33μg/mL和CK(空白)为1.06μg/mL。

实施例4苔藓假单胞菌GT31的抑菌能力

将青枯雷尔氏菌Rs10在28℃、180r/min条件下振荡培养至OD₆₀₀为0.3，均匀喷洒至NA固体培养基上，并将活化的待测菌液点种在NA平板上，28℃培养48h，观察是否有抑菌圈出现，并测量抑菌圈直径，计算抑菌率。

结果发现，接种GT31后拮抗青枯雷尔氏菌的抑菌圈直径为1.60±0.05cm。相比接种GT60和FGH5-2-1后拮抗青枯雷尔氏菌的抑菌圈直径分别为0.30±0.00cm和1.40±0.00cm而言，苔藓假单胞菌GT31对于烟草青枯雷尔氏菌具有良好的拮抗效果(如图5所示)。

实施例5苔藓假单胞菌GT31的防病效果

活体烟株实验：

将烟草种子消毒后置于营养基质中育苗，待烟苗长到4-5片叶时，将其移入含有约200g自然土的花盆中(直径约10cm)。烟苗在温室培养约15d(光照条件：16h，28℃；黑暗条件：8h，20℃；相对湿度60％)，每周浇灌灭菌水约50mL/株。待烟苗长到6-7片叶时，用30mL新鲜培养的生防菌悬液(OD₆₀₀＝0.3)均匀浇灌在植株周围。一周后，再用30mL新鲜培养的青枯菌悬液(OD₆₀₀＝0.3)同样均匀浇灌在植株周围。此后每天记录烟株发病情况直到病情稳定。其中，OD600:0.3＝3×10⁸CFU/mL，30mL浇灌至200g土壤，因此，每盆接种浓度计算如下：3×10⁸CFU/mL×30mL÷200g＝4.5×10⁷CFU/g。

使用以下量表对疾病指数进行评分:

0级:无病叶；

1级:不到一半的叶子枯萎；

2级:一半到三分之二的叶子枯萎；

3级:超过三分之二的叶子枯萎；

4级:所有叶子都枯萎甚至死亡。

发病率＝(发病株数/总接种株数)×100％；

病情指数＝[(各病级株数×代表级值)/(总株数×发病最高级的代表级值)]×100；

防治效果＝[(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数]×100％。

表1接种GT31后发病率和病情指数

结果发现，使用GT31菌液后，烟苗病情指数明显减小，发病率显著降低，可有效降低青枯病菌对烟草的侵染(P<0.05)，防治效果达到77.08％，如图6和表1所示。

Claims (6)

1.苔藓假单胞菌Pseudomonas mosselii GT31，其特征在于，保藏编号为CGMCCNo.25635，于2022年09月02日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。

2.如权利要求1所述的苔藓假单胞菌Pseudomonas mosselii GT31在拮抗青枯雷尔氏菌Ralstonia solanacearum引起的青枯病中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，OD₆₀₀＝0.3浓度下，接种10μL菌液，GT31产生的抑菌圈直径为1.60±0.05cm。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，OD₆₀₀＝0.3浓度下，接种20μL菌液至20mL含有0.01％色氨酸的LB培养基中，28℃、180r/min振荡培养4d，GT31产生13.15μg/mL的生长素。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述苔藓假单胞菌Pseudomonas mosseliiGT31在每盆接种浓度为4.5×10⁷CFU/g时，对青枯雷尔氏菌引起的青枯病防治效果达到77.08％。

6.烟草青枯病防治剂，其特征在于，以权利要求1所述的苔藓假单胞菌Pseudomonasmosselii GT31为主要有效成分。

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