TWI740263B - 貝萊斯芽孢桿菌khh13菌株及其增量培養方法與用途 - Google Patents

Abstract

本發明係關於一種貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis )KHH13菌株及其增量培養方法與用途；KHH13菌株之培養方法包含以特定成分之培養基，於一特定培養條件下培養3~8日，以獲得高菌量濃度之貝萊斯芽孢桿菌發酵液；KHH13菌株對蘭花黃葉病菌、香蕉黃葉病菌、蓮霧黑腐病菌、紅龍果果腐病菌、胡瓜萎凋病菌、木瓜炭疽病菌、木瓜疫病菌、水稻稻熱病菌、水稻胡麻葉枯菌、水稻鞘腐病菌、水稻白絹病菌及水稻紋枯病菌具抗生活性，能抑制該些植物病原菌之生長，並可添加於栽培介質中以抑制植物病原菌感染植物；此外，KHH13菌株亦具有良好的溶磷活性，可促進植物生長，以做為微生物肥料。

Description

貝萊斯芽孢桿菌KHH13菌株及其增量培養方法與用途

本發明係關於一種具有抑制多種植物病原生長效果之貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis )KHH13菌株及其增量培養方法與用途。

微生物肥料係指有益於植物生長、包含活性微生物或是微生物孢子的肥料，微生物肥料的功效十分多元，包含增加土壤中的植物營養成分、提高化學肥料的利用率、促進植物根系的生長等等；目前微生物肥料所含有的菌種包含將空氣中的氮素固定為氨的固氮菌、形成菌根以提高植物根部新收面積的菌根真菌、將無效性磷轉化為有效性磷的溶磷菌、將礦物性鉀轉化為水溶性鉀的溶鉀菌、以及分解培養介質中有機物的分解菌株。除此之外，微生物亦可作為生物農藥使用，例如蘇力菌、澱粉芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌等等，能降低的植物病蟲害發生。不論是微生物肥料或是生物農藥，在使用上都可以降低化學肥料或是化學農藥對環境的影響，且提升使用上的安全性。

於使用微生物肥料與生物農藥的使用上，大多需要持續使用才能有較明顯的成效產生，且微生物肥料如溶磷菌或是溶鉀菌，當培養介質中的磷含量、鉀含量或是有機質含量太低時，也無法有效發揮其助益的功效。

目前已有將二種以上菌株合併使用，以達到助益植物生長以及避免病原性感染的雙重功效；例如中華民國專利第TW 201641020(A)號公開案，便為關於澱粉芽孢桿菌RTI301菌株與枯草芽孢桿菌RTI477菌株之組合，此組合同時具有促生長活性及對抗植物病原體之活性，包括增加大豆及玉米之作物的產量，且可對抗多種植物病菌。但是，合併多種微生物共同使用時，需要考量各微生物之間的相容性。

今，發明人有鑑於現有微生物肥料與生物農藥於實際使用時仍有不足之處，於是乃一本孜孜不倦之精神，並藉由其豐富專業知識及多年之實務經驗所輔佐，據此研創出本發明。

本發明係關於一種貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis )KHH13菌株(以下簡稱KHH13菌株)，KHH13菌株的增量培養方法，包含KHH13菌株之培養介質，以及將KHH13菌株應用於抑制植物病原菌以及促進植物生長的用途。KHH13菌株寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 910800；其中KHH13菌株對多種植物病原菌具有抗生活性，能抑制多種植物病原菌之生長，這些病原菌包含蘭花黃葉病菌(Fusarium solani )、香蕉黃葉病菌(Fusarium oxysporum )、蓮霧黑腐病菌(Lasiodiplodia theobromae )、紅龍果果腐病菌(Biporlaris sp. )、胡瓜萎凋病菌(Fusarium oxysporum )、木瓜炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides Penzig)、木瓜疫病菌(Phytophthora palmivora )、水稻稻熱病菌(Magnaporthe grisea )、水稻胡麻葉枯菌(Cochliobolus miyabeanus )、水稻鞘腐病菌(Sarocladium oryzae )、水稻白絹病菌(Sclerotium rolfsii )及水稻紋枯病菌(Ryzoctonia solani )等植物病原菌具抗生活性。

本發明亦提供培養高濃度貝萊斯芽孢桿菌KHH13菌株之方法，包含：將1~5 mL、濃度為 10⁷ ~10¹⁰ cfu/mL之KHH13菌體懸浮液作為接種原，加入一培養基中，於25~35℃、轉速100~300 rpm、溶氧量0.5~10 ppm之條件下，進行液態發酵培養3~8日，其中該培養基係包含0.1~1 wt%大豆蛋白、0.1~1 wt%酵母粉、0.1~1.5 wt%糖蜜、0.05~0.5 wt%磷酸二氫鉀(KH₂ PO₄ )、0.05~0.5 wt%磷酸氫二鉀(K₂ HPO₄ )及剩餘百分比之純水。

本發明進一步提供一種包含貝萊斯芽孢桿菌KHH13菌株的培養介質，培養介質中包含KHH13菌株，且培養介質可抑制植物病原菌感染培養於該培養介質的植物，並促進該植物生長。

本發明亦包含貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis )KHH13菌株於抑制植物病原菌以及促進植物生長的用途，係以一有效劑量之KHH13菌株施予一植物，以抑制植物病原菌感染該植物，且降低該植物病原菌抑制該植物之生長之情形；此外本發明之貝萊斯芽孢桿菌KHH13菌株具有良好的溶磷活性，可促進植物的根部生長、植物的葉片生長、以及提高植物的鮮重。

於本發明之一實施例中，KHH13菌株之培養基包含1 wt%的糖蜜、0.5 wt%的大豆蛋白、0.5 wt%的酵母粉、0.1 wt%的磷酸二氫鉀、0.1 wt%的磷酸氫二鉀與剩餘百分比的純水，且培養溫度為35℃，轉速為150 rpm。

於本發明之一實施例中，KHH13菌株係添加於一培養介質中，且培養介質中包含1 x 10⁴ ~1 x 10⁸ cfu/克-培養介質之KHH13菌株。

於本發明之一實施例中，貝萊斯芽孢桿菌KHH13菌株係存在於一液劑中。

藉此，本發明貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis )KHH13菌株對多種植物病原菌具抗生活性，包含對蘭花黃葉病菌、香蕉黃葉病菌、蓮霧黑腐病菌、紅龍果果腐病菌、胡瓜萎凋病菌、木瓜炭疽病菌、木瓜疫病菌(Phytophthora palmivora )、水稻稻熱病菌、水稻胡麻葉枯菌、水稻鞘腐病菌、水稻紋枯病菌及水稻白絹病菌具有抗生活性，因此可用於製作對水稻秧苗立枯病具抑病效果之育苗介質，且本研發成果已技術移轉予業者，確實能實際應用於產業界。另，因KHH13菌株之溶磷活性高，因此也可應用於製作微生物肥料，並可申請登記成為微生物肥料。

本發明之目的及其結構功能上的優點，將依據以下圖面所示之結構，配合具體實施例予以說明，俾使審查委員能對本發明有更深入且具體之瞭解。

本發明為一種貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis )KHH13菌株(以下簡稱KHH13菌株)，寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 910800；本案說明人欲說明，所檢附的專利生物寄存證明書上原本記載的KHH13菌株為枯草桿菌(Bacillus subtilis )，但後續本案申請人進行更詳細的定序檢測後，確認此菌株為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis )，故申請學名變更與修正(請參見專利生物寄存證明書的資料變更或修正申請書)，因此本案所請之寄存編號為BCRC 910800的KHH13菌株，確實為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis )。

KHH13菌株對多種植物病原菌如蘭花黃葉病菌、香蕉黃葉病菌、蓮霧黑腐病菌、紅龍果果腐病菌、胡瓜萎凋病菌、木瓜炭疽病菌、木瓜疫病菌、水稻稻熱病菌、水稻胡麻葉枯菌、水稻鞘腐病菌、水稻白絹病菌及水稻紋枯病菌等植物病原菌具抗生活性，KHH13菌株可用於製作具抑病效果以及促進植物生找之培養介質，例如製作抑制水稻紋枯病菌及水稻白絹病菌感染水稻秧苗之抑病介質，以防治水稻秧苗立枯病的發生；又KHH13菌株因具有良好的溶磷活性，亦可用於製作微生物肥料。

本發明亦提供大量培養高濃度貝萊斯芽孢桿菌KHH13菌株之方法，包含將菌量濃度為10⁷ ~10¹⁰ cfu/mL之KHH13菌體懸浮液，取1~5 mL做為接種源，加入於一培養基中，並於25~35℃、轉速100~300 rpm、溶氧量0.5~10 ppm之條件培養3~8日，其中該培養基包含0.1~1 wt%大豆蛋白、0.1~1 wt%酵母粉、0.1~1.5 wt%糖蜜、0.05~0.5 wt%磷酸二氫鉀(KH₂ PO₄ )、0.05~0.5 wt%磷酸氫二鉀(K₂ HPO₄ )、0.01~0.1 wt%硫酸鎂(MgSO₄ ·7H₂ O)、0.1~1 wt%氯化鈣(CaCl₂ ·2H₂ O)以及剩餘百分比之純水，純水可為逆滲透水。

以前述KHH13菌株培養方法所得之發酵液，可用以製作植物培養介質，以抑制植物病原菌感染植物，並促進植物生長；例如於培養介質中添加KHH13菌株，且添加濃度為1 x 10⁴ ~1 x 10⁸ cfu/g-介質，所獲得的培養介質能抑制病原菌感染植物，並促進植物的根部與葉片生長、以及提高該植物之鮮重。

又例如將KHH13菌株添加於水稻育苗的培養介質中，亦可有效抑制水稻紋枯病菌及水稻白絹病菌對於水稻秧苗生長的影響。

此外，藉由下述具體實施例，可進一步證明本發明可實際應用之範圍，但不意欲以任何形式限制本發明之範圍。

實驗一、貝萊斯芽孢桿菌KHH13菌株及其培養方法

(一) 貝萊斯芽孢桿菌KHH13之分離與鑑定

自萬丹鄉水稻有機田土取得土壤樣本，經分離篩選後純培養，再以菌落外觀型態初步分類，共得到10株微生物菌株。於馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(potato dextrose agar，以下簡稱PDA)平板上，將芒果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides )與上述分離所得之菌株進行對峙培養，以該些菌株對芒果炭疽病菌之抗生活性作為菌株功效篩選指標，進行篩選後獲得2株對芒果炭疽病菌具有抗生活性的菌株，其中以編號KHH13之菌株對芒果炭疽病菌的菌絲生長具有最佳的抑制效果。請參見第一圖(A)，為KHH13菌株於PDA平板上生長之菌落型態圖，係為邊緣呈現不規則絨狀邊之米色菌落；另請見第一圖(B)，將KHH13菌株於羊血培養平板上培養3天後，並沒有產生溶血反應，表示KHH13菌株具有一定程度的生物安全性。

另，將KHH13菌株委託行政院農業委員會藥物毒物試驗所之優良實驗室操作規範(GLP)實驗室進行KHH13菌株對大鼠肺急毒性與致病性及口服急毒性與致病性試驗，試驗結果顯示KHH13菌株對大鼠不具肺急毒性與致病性及不具口服急毒性與致病性，屬安全菌株。前述資料可供申請登記成為生物農藥使用。

將KHH13菌株進行16s rDNA與全基因體定序，並與NCBI資料庫比對後，確認KHH13菌株為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis )，其16s rDNA之序列請參見序列表之SEQ ID NO: 1；另， SEQ ID NO: 2及SEQ ID NO: 3為KHH13菌株上，帶有的貝萊斯芽孢桿菌特殊專一性片段。

(二) 培養基成分、轉速及培養溫度對於KHH13菌株生長之影響

下列實驗以搖瓶培養系統進行培養，以測試碳素源濃度、氮素源濃度、轉速及培養溫度對於本發明KHH13菌株生長之影響，其中下列所提及之基本培養液為糖蜜培養液，成分包含0.75 wt%糖蜜、0.5 wt%大豆蛋白、0.5 wt%酵母粉、0.1 wt%磷酸二氫鉀(KH₂ PO₄ )、0.1 wt%磷酸氫二鉀 (K₂ HPO₄ )以及剩餘百分比之純水，此處使用的純水為逆滲透水。

本發明之菌量計算方法如下：於無菌操作環境下取1 mL 待測菌液與9 mL 無菌水混合均勻，此即為10倍稀釋菌液，並以此方法繼續進行菌液的10倍序列稀釋；取0.1 mL之稀釋菌液滴至PDA平板，並以消毒過之三角玻璃棒將稀釋液均勻塗佈於PDA平板表面後，置於27℃下培養，待菌落生長至肉眼可見之大小時，計算各稀釋倍率之菌落數；每組實驗皆進行三重複，計算時係將三重複之菌落數加總後除以3以獲得一平均菌落數；平均菌落數再以下列計算公式推算原始菌數：

原始菌數=平均菌落數 × 稀釋倍率之倒數 × 10 (單位：cfu/mL)

菌量計算結果將以顯著性測試進行統計分析，若未達顯著水準則以費雪最小差異測試法(Fisher’s Least Significance Test, LSD)檢定，測定5%之顯著差異，若各組間具有顯著差異則會標記不同的字母，若各組間不具有顯著差異則會標記相同的字母。

(1)碳素源濃度、氮素源濃度、轉速以及培養溫度與KHH13菌株之生長

將菌量濃度為10⁹ cfu/mL之KHH13菌體懸浮液，取1 mL菌體懸浮液作為接種源，加入400 mL之不同培養液中，轉速150 rpm下搖瓶培養5天，並於第5天測量菌量；除了檢測溫度影響之試驗外，其他試驗皆於27℃下進行，實驗結果請參見表一。

以糖蜜作為培養液之碳素源，並以大豆蛋白做為培養液之氮素源，測試不同碳、氮素源濃度比例對KHH13菌株生長之影響，此試驗中使用五種培養液進行培養菌量測試，五種培養液之成分請參見表二；請參見表一，實驗結果顯示以第三培養液培養之組別組的KHH13菌株生長狀況最好，所得之菌量為2.6 x 10⁸ cfu/mL，以第五培養液培養之組別所得的KHH13菌株量次高，菌量為2.2 x 10⁸ cfu/mL；以第一培養液培養之組別所得的菌量最低，所得菌量僅2.0 x 10⁷ cfu/mL。本實驗之糖蜜及大豆蛋白係分別購自於陽田生物科技股份有限公司及新合食品股份有限公司。

請參見表一，以不同培養轉速對KHH13菌株生長的影響試驗中，以轉速150 rpm培養組所得到的菌量最高，為1.9 x 10⁸ cfu/mL，以轉速125rpm培養組所得到的菌量為1.0 x 10⁸ cfu/mL。

又，以不同培養溫度培養KHH13菌株，以35℃培養組所得到的菌量最高為1.9 x 10⁸ cfu/mL，30℃培養組的菌量為1.1 x 10⁸ cfu/mL。

表一

培養條件		菌量(cfu/mL)
碳素源濃度與氮素源濃度	第一培養液	2.0 x 107
第二培養液	6.0 x 107
第三培養液	2.6 x 108
第四培養液	1.7 x 108
第五培養液	2.2 x 108
轉速	125 rpm	1.0 x 108
150 rpm	1.9 x 108
溫度	30℃	1.1 x 108
35℃	1.9 x 108

表二

培養基	成分
第一培養基	1.5 wt%糖蜜、1.5 wt%大豆蛋白、0.5 wt%酵母粉、0.1 wt%磷酸二氫鉀(KH2 PO4 )、0.1 wt%磷酸氫二鉀(K2 HPO4 )與逆滲透水
第二培養基	1 wt%糖蜜、1 wt%大豆蛋白、0.5 wt%酵母粉、0.05 wt%磷酸二氫鉀(KH2 PO4 )、0.05 wt%磷酸氫二鉀(K2 HPO4 )與逆滲透水
第三培養基	1 wt%糖蜜、0.5 wt%大豆蛋白、0.5 wt%酵母粉、0.1 wt%磷酸二氫鉀(KH2 PO4 )、0.1 wt%磷酸氫二鉀(K2 HPO4 )與逆滲透水
第四培養基	0.75 wt%糖蜜、1 wt%大豆蛋白、0.5 wt%酵母粉、0.1 wt%磷酸二氫鉀(KH2 PO4 )、0.1 wt%磷酸氫二鉀(K2 HPO4 )與逆滲透水
第五培養基	0.75 wt%糖蜜、0.5 wt%大豆蛋白、0.5 wt%酵母粉、0.1 wt%磷酸二氫鉀(KH2 PO4 )、0.1 wt%磷酸氫二鉀(K2 HPO4 )與逆滲透水

(三) KHH13菌株液劑之儲存安定性測試

將貝萊斯芽孢桿菌KHH13菌株發酵培養後的菌液加入至育苗介質，即可作為抑病介質，例如做為水稻秧苗抑病介質，此外KHH13菌株的發酵培養液亦可作為微生物肥料使用，以下所稱KHH13菌株液劑係為KHH13菌株發酵培養後的菌液。

將以搖瓶培養5天製作之KHH13菌株液劑(原始菌量為2.0 x 10⁸ cfu/mL)，於常溫下(27℃)儲存一年後，其存活菌量仍可維持在1.4 x 10⁸ cfu/mL，表示及其儲存安定性佳。

(四) 貝萊斯芽孢桿菌KHH13菌株之生理生化測試

此試驗係檢測貝萊斯芽孢桿菌KHH13菌株的蛋白質分解酵素(protease)、澱粉分解酵素(amylase)、磷脂質分解酵素(phospholipase)與纖維素分解酵素(cellulase)之活性；將KHH13培養於特定之篩選培養基上，如SMA培養基(skim milk agar)、YSA培養基(yeast extract-soluble starch agar)、蛋黃培養基與MRA培養基(Mandel-Reese agar)，等菌落長出後進行後續觀察，此技術係為習知技術，容於此不再贅述。請參見第二圖，SMA培養基上KHH13菌株周圍產生透明圓環，表示KHH13菌株具有蛋白質分解酵素活性；YSA培養基上，KHH13菌株周圍具有大透明圓環，表示KHH13菌株亦具有澱粉分解酵素活性；於蛋黃培養基上，KHH13菌株周圍會產生透明圓環，即KHH13菌株具有磷脂質分解酵素活性；而MRA培養基上，KHH13菌株周圍產生橘黃色環，表示KHH13菌株具有纖維素分解酵素活性。

(五) 貝萊斯芽孢桿菌KHH13菌株對農藥之耐受性

本試驗係使用農藥平板法檢測貝萊斯芽孢桿菌KHH13菌株(以下簡稱KHH13)對市售登記核准使用於水稻病蟲害防治之農藥的耐受性。農藥平板法是將菌液塗佈於含有不同農藥之PDA培養基平板，培養後觀測KHH13菌株的生長情形。試驗結果顯示，在對水稻病蟲害防治用藥之耐受性部份，KHH13菌株對包括：殺紋寧、派滅淨、可尼丁、加保扶、貝他賽扶寧、腐絕、依得利、滅普寧、歐殺滅、芬諾尼、三賽唑、嘉賜黴素、賽座滅、福多寧、賓客隆及免賴得等農藥，具有耐受性，可在該等農藥培養基平版上生長，未來於田間應用時可與該等藥劑共同施用，並改進該些藥劑因病原菌產生抗藥性而導致藥劑防治效果不佳之問題。而KHH13菌株對撲克拉、得克利、克枯三賽唑、待克利、喜樂克拉、丙基喜樂松、普可利、鏈四環黴素及撲滅松等農藥則不具耐受性。

實驗二、貝萊斯芽孢桿菌KHH13菌株之抗生活性範圍評估

此實驗之目的係為大範圍評估貝萊斯芽孢桿菌KHH13菌株的抗生活性，係將KHH13菌株於PDA平板之一側劃線培養1日之後，再於KHH13菌株對側接種欲試驗之植物病原真菌，並於27℃進行對峙培養，以觀察該植物病原真菌之生長情形。請參見第三圖，於PDA平板上進行對峙培養的試驗結果中，KHH13菌株能有效抑制蘭花黃葉病菌、香蕉黃葉病菌、蓮霧黑腐病菌、紅龍果果腐病菌、胡瓜萎凋病菌、木瓜炭疽病菌、木瓜疫病菌、水稻稻熱病菌、水稻胡麻葉枯菌、水稻鞘腐病菌的生長；再請參見第四圖，KHH13菌株亦能抑制水稻白絹病菌及水稻紋枯病菌之生長；第四圖中之CK為僅培養水稻白絹病菌或是水稻紋枯病菌之對照組。

實驗三、貝萊斯芽孢桿菌KHH13菌株對水稻秧苗立枯病之防治試驗

此防治測試的試驗結果將進行顯著性測試，若未達顯著水準則進行費雪最小差異測試法(Fisher’s Least Significance Test, LSD)檢定，測定1%及5%之顯著差異(簡稱為1%差異或5%差異)，其中不具顯著差異之組別會標記相同之英文字母，標記不同字母之組別代表該二組別間具有顯著差異。

(一)KHH13菌株對水稻秧苗立枯病之防治效果

將水稻種子以1%次氯酸鈉浸泡消毒30分鐘後，於室溫下以流水浸泡24小時以進行催芽，再將已發芽之水稻種子植播至添加不同濃度KHH13菌株液劑之培養介質，或是將已發芽之水稻種子植播植播至無添加KHH13菌株液劑之無菌栽培介質之中作為對照組；此實驗中，係以每克培養介質中含有2 x 10⁷ 、8 x 10⁵ 、4 x 10⁵ 及2 x 10⁵ cfu之KHH13菌株的培養介質進行水稻種子的培養，並分別將上述各組別分別命名為A、B、 C及D組，並將對照組命名為E組。待水稻苗株高生長約5公分時，再取1叢各組別之水稻苗(大約含有30株之水稻苗)連同栽培介質移植入含有水稻紋枯病菌或是水稻白絹病菌的病土盆缽中進行培養，病土盆缽中分別含有2x10⁴ propagules/g-土壤之水稻紋枯病菌及水稻白絹病菌。

於培養20日後，再以叢(30株)為單位，調查各叢之罹病指數，罹病指數共區分為0~5級，罹病指數0級為未發病；罹病指數1級為病斑面積>莖部1/4；罹病指數2級為病斑面積>莖部1/2；罹病指數3級為病斑面積≧莖部1/2；罹病指數4級為病斑面積率>莖部1/2且葉片輕微感染)；罹病指數5級為病斑面積率>莖部1/2且葉片嚴重感染。

罹病度(%)＝[(Σ罹病指數 x 該指數果實數) /(5 x 總果實數)] x 100%

第五圖(A)為KHH13菌株對水稻紋枯病之防治效果圖，及第五圖(B)為KHH13菌株對水稻白絹病之防治效果圖；根據第五圖呈現的結果，對照組的水稻植株生長高度最低，而以含有KHH13菌株之栽培介質栽種的各組別，水稻植株的生長高度皆較高，且水稻秧苗根部之水稻紋枯病及水稻白絹病發病情形與對照組相比皆有改善之情形。

另請參見表三，為水稻紋枯病及水稻白絹病之罹病度調查，結果顯示本發明之已添加貝萊斯芽孢桿菌KHH13菌株液劑的培養介質栽種的水稻秧苗，確實對於水稻紋枯病菌及水稻白絹病菌具有抗性，罹病度與對照組相比都有顯著下降的情形，表示添加貝萊斯芽孢桿菌KHH13菌株液劑的培養介質具有抑制水稻紋枯病及水稻白絹病的效果。因此，在一般田區的病原菌濃度環境下，將貝萊斯芽孢桿菌KHH13菌株液劑添加入栽培介質中製成含微生物之培抑病介質，能有效防治水稻秧苗立枯病的發生。

表三

病害	處理方式	罹病度(%)	5%差異
水稻紋枯病	A：KHH13  2x107	33	a
B：KHH13  8x105	46	ab
C：KHH13  4x105	54	ab
D：KHH13  2x105	60	b
E：對照組	86	c
水稻白絹病	A：KHH13  2x107	20	a
B：KHH13  8x105	46	b
C：KHH13  4x105	60	bc
D：KHH13  2x105	66	c
E：對照組	86	d

實驗四、貝萊斯芽孢桿菌KHH13菌株之肥效試驗

本部分之實驗結果皆使用費雪最小差異測試法(Fisher’s Least Significance Test, LSD)檢定，標記不同英文字者或標記「*」代表該二組別之間具有 5%顯著差異，標記相同英文字者或無標記代表不具有顯著差異，其中「ND」代表未進行檢測(non-detect)。

另，以下實驗中所使用的KHH13菌株液劑為將KHH13菌株於第三培養基中發酵培養5日所得到的KHH13菌液。

(一) KHH13菌株對種子發芽率之影響

將小白菜、空心菜、番茄、胡瓜與茼蒿的種子分別以0.6%(v/v)的次氯酸鈉溶液消毒5分鐘，再以無菌蒸餾水洗滌3次後備用。將消毒後的種子泡入濃度為4 x 10⁶ cfu/mL的KHH13菌株液劑中10秒，再將各種子放置於水瓊脂(WA)培養平板上，於30℃環境下培養4天後觀察並紀錄其種子發芽率；此外另設一組無處理次氯酸鈉溶液且無浸泡KHH13液劑之組別，作為對照組。種子發芽率的計算公式為：

發芽率(%)＝(發芽種子數 /總種子數) x 100%

請參見表四，為各種子的發芽率試驗結果，表四顯示KHH13液劑可提升空心菜、番茄與茼蒿的種子發芽率。

表四

作物別	對照組	KHH13處理組
小白菜	100.00	100.00
空心菜	46.67	56.67
番茄	86.67	90.00
胡瓜	100.00	100.00
茼蒿	64.00	72.00

(二) KHH13菌株於育苗穴盤中對種子發芽率及植株生長之影響

將小白菜、空心菜、番茄、胡瓜與茼蒿的種子，分別以0.6%次氯酸鈉消毒5分鐘，再以無菌蒸餾水洗滌3次；將消毒後之種子分別泡入濃度為4 x 10⁶ cfu/mL之KHH13菌株液劑中10秒，再將各種子播種於盛有泥炭土之圓形育苗穴盤內，每日定期澆水，於7天後觀察並記錄其種子發芽率；此外另設一組僅處理次氯酸鈉溶液而無浸泡KHH13菌株液劑之組別，作為對照組。此試驗中除了觀察各組別的種子發芽率之外，亦測量培養7日之後，各植物的發根長度，以及植株的鮮重，以作為評估植物生長情形的標準；其中植株鮮重為將植株採集後，馬上測量的植株重量。請參見表五，KHH13菌株不會對發芽率產生抑制效果，且會明顯提高番茄與茼蒿的根的生長長度，此外以KHH13菌株處理的小白菜種子、胡瓜種子與茼蒿種子，與對照組相比，其生長植物的鮮重也有顯著上升的現象。

表五

作物別	處理	發芽率(%)	根長(cm)	鮮重(g)
小白菜	對照組	100	10.50	1.79
KHH13處理組	100	10.50	2.13 *
空心菜	對照組	100	11.97	2.12
KHH13處理組	100	9.17	1.71
番茄	對照組	100	6.13	0.85
KHH13處理組	100	8.43 *	1.04
胡瓜	對照組	100	15.57	7.11
KHH13處理組	100	16.60	11.86 *
茼蒿	對照組	100	6.50	0.27
KHH13處理組	100	8.87 *	0.67 *

(三) KHH13液劑對於盆缽培養植株生長之影響

將小白菜、空心菜、胡瓜與茼蒿的種子於圓形育苗穴盤中育苗，待各植物植株生長至一定高度後分別移植於含有泥炭土之盆缽，並每2週分別定期澆灌500 mL之含有KHH13菌株的液劑，使用的KHH13菌株液劑濃度為5 x 10⁵ cfu/mL，而對照組則澆灌等體積的自來水，之後各組別皆每日定期澆水。小白菜、空心菜及胡瓜於移植到盆缽培養後35天觀察並記錄根長及鮮重；而番茄及茼蒿於移植到盆缽後21天觀察並記錄根長及鮮重，並記錄於表六；表六中「ND」代表未進行檢測(non-detect)。

請參見表六與第六圖，為小白菜的生長紀錄，其中第六圖(A)為小白菜的根長度照片，且第六圖(B)為小白菜的植株外觀照片；以KHH13菌株處理的組別，小白菜的根長度以及植株生長情形，例如植株高度、葉片的發育與葉片面積、以及植株鮮重，皆優於對照組(CK)。

第七圖為空心菜的生長照片，根據第七圖與表六，以KHH13菌株處理的組別，空心菜的根長度以及植株生長情形，例如植株高度、葉片的大小及鮮重，皆優於對照組(CK)。

第八圖為胡瓜植株的生長照片，其中第八圖(A)為胡瓜植株的生長照片，第八圖(B)為胡瓜根部的生長照片；根據第八圖與表六，以KHH13菌株處理的胡瓜，其根部長度明顯優於對照組(CK)，且植株的葉片數量、葉片發育狀況以及植物鮮重也明顯優於對照組(CK)。

第九圖為茼蒿植株的生長照片，其中第九圖(A)為茼蒿根部的生長照片，第九圖(B)為茼蒿植株的生長照片；根據第九圖與表六，以KHH13菌株處理的茼蒿，其根部長度明顯優於對照組(CK)，且植株的葉片數量、葉片發育狀況以及植物鮮重也明顯優於對照組(CK)。

第十圖為番茄植株的根部生長照片，根據第十圖與表六，以KHH13菌株處理的根部長度明顯優於對照組(CK)。

根據以上試驗結果，KHH13菌株確實可提升多種植物的植株的根長度、植株高度及鮮重，顯示KHH13菌株確實可促進植株生長，可以用於製備微生物肥料。

表六

作物別	處理	根長(cm)	株高(cm)	鮮重(g)
小白菜	對照組	38.46	ND	48.47
KHH13處理組	40.50	ND	96.83 *
空心菜	對照組	31.15	32.25	45.25
KHH13處理組	31.40	35.45	51.24 *
番茄	對照組	30.17	46.17	22.41
KHH13處理組	46.83 *	68.08 *	33.33 *
胡瓜	對照組	38.95	ND	ND
KHH13處理組	50.50	ND	ND
茼蒿	對照組	25.58	ND	4.69
KHH13處理組	33.13 *	ND	19.48 *

(四)KHH13菌株液劑於田間(網室)對白菜、油菜、紅萵苣及芹菜生長之影響

將白菜、油菜、紅萵苣及芹菜種子分別於圓形育苗穴盤育苗，待其植株生長至一定高度後分別移植於含有一般土之田間(溫室)種植，於每2週定期澆灌濃度為5 x 10⁵ cfu/mL之KHH13菌株液劑各500 mL，對照組為澆灌等體積之自來水，之後每日定期澆水。白菜及油菜於定植後35天後觀察並記錄根長及鮮重；而紅茼蒿及芹菜於定植後40天後觀察並記錄根長及鮮重。

第十一圖為白菜與油菜的植株生長照片，根據第十一圖與表七，以KHH13菌株處理的白菜，植株鮮重明顯高於對照組，而以KHH13菌株處理的油菜，其根部長度與植株鮮重也明顯高於對照組。

第十二圖為紅萵苣的植株生長照片，根據第十二圖與表七，以KHH13菌株處理的紅萵苣，其根部長度與植株鮮重皆明顯高於對照組。

第十三圖為芹菜的植株生長照片，根據第十三圖與表七，以KHH13菌株處理的芹菜，其植株鮮皆明顯高於對照組。

根據以上結果，顯示在田間或網室種植的植物，澆灌含有KHH13菌株的液劑之後，其生長情形皆明顯優於無澆灌者，顯示KHH13菌株液劑的確可促進植物生長，可用於製備微生物肥料。

表七

作物	處理	根長(cm)	鮮重(g)
白菜	對照組	26.25	416.50
KHH13處理組	27.00	748.67 *
油菜	對照組	26.18	235.67
KHH13處理組	30.50 *	683.00 *
紅萵苣	對照組	15.67	38.67
KHH13處理組	26.33 *	206.67 *
芹菜	對照組	15.08	44.00
KHH13處理組	15.92	125.50 *

(五)、KHH13菌株之溶磷活性試驗

試驗方法為微生物肥料檢測法中的溶磷菌測定方法，簡述如下：將KHH13單一菌落接種於NB培養液中培養48小時，再取1 mL之菌液培養於含磷培養液中，震盪培養4天；另取一組未加入菌液的含磷培養液，以同樣的件培養4天，以作為對照組，本實驗中含磷培養液中係以磷酸三鈣作為磷源；將培養後的培養液離心後取上清液，再將上清液以孔徑為0.45 為徑之濾膜過濾，並測量濾液中水溶性磷濃度；最後，比較對照組與培養KHH13菌株組別所獲得的培養液中，水溶性磷濃度差異，以獲得單位體積肥料中的溶磷菌，在單位時間內將難溶性磷分解為水溶性磷的量，以代表KHH13菌株的溶磷能力。

經過測試，本案之KHH13菌株的溶磷活性為2186.1 μg/mL-day，溶磷能力佳，確實可以作為微生物肥料使用。

由上述之實施說明可知，本發明與現有技術相較之下，本發明具有以下優點：

1. 本發明之貝萊斯芽孢桿菌KHH13菌株對於多種植物病原菌具有抗生活性，除不具溶血特性外，亦對大鼠不具肺急毒性與致病性及口服急毒性與致病性，故其使用安全性極高。

2. 本發明之貝萊斯芽孢桿菌KHH13菌株所製成的液劑，可添加於栽培介質中，以製成抑病介質，並有效抑制水稻紋枯病菌及水稻白絹病菌，並有效防治水稻秧苗立枯病的發生；此外，以KHH13菌株液劑澆灌生長中的植物，亦能有效促進植物的生長，故KHH13菌除了可用於製備抑制植物病原菌的生物農藥之外，亦可作為促進植物生長的微生物肥料使用。

3. 本發明之貝萊斯芽孢桿菌的培養方法，能製備高濃度的KHH13菌株液劑，將菌株液劑添加至栽培介質中後可製成抑病介質；現今多數微生物抑病介質之研究多屬學術研究階段，本研發成果已技術移轉予業者，表示本發明確實能實際應用於產業界量產。

4. 本發明之貝萊斯芽孢桿菌KHH13菌株因具有良好的溶磷活性，且溶磷活性高於市售生物肥料商品，因此可用於製作微生物肥料，並可申請登記成為微生物肥料。

5. 本發明之貝萊斯芽孢桿菌KHH13菌株可應用在水稻秧苗病害預防及作物栽培之肥效增進，具廣大消費市場推廣潛力，並可供產業上被製造使用，且為目前技術可實施，具產業利用性。

綜上所述，本發明貝萊斯芽孢桿菌KHH13菌株及其增量培養方法與用途，的確能藉由上述所揭露之實施例，達到所預期之使用功效，且本發明亦未曾公開於申請前，誠已完全符合專利法之規定與要求。爰依法提出發明專利之申請，懇請惠予審查，並賜准專利，則實感德便。

惟，上述所揭之說明，僅為本發明之較佳實施例，非為限定本發明之保護範圍；其；大凡熟悉該項技藝之人士，其所依本發明之特徵範疇，所作之其它等效變化或修飾，皆應視為不脫離本發明之設計範疇。

無

第一圖：貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis )KHH13菌株於PDA培養基上菌落型態圖。

第二圖：貝萊斯芽孢桿菌KHH13菌株之蛋白質分解酵素、澱粉分解酵素、磷脂質分解酵素及纖維分解酵素活性分析圖。

第三圖：貝萊斯芽孢桿菌KHH13菌株對不同植物病原菌之抗生活性分析圖。

第四圖：貝萊斯芽孢桿菌KHH13菌株對水稻紋枯病菌及水稻白絹病菌之抗生活性分析圖。

第五圖：貝萊斯芽孢桿菌KHH13菌株於水稻紋枯病及水稻白絹病之防治效果照片。

第六圖：貝萊斯芽孢桿菌KHH13菌株影響盆缽培養之小白菜生長照片。

第七圖：貝萊斯芽孢桿菌KHH13菌株影響盆缽培養之空心菜生長照片。

第八圖：貝萊斯芽孢桿菌KHH13菌株影響盆缽培養之胡瓜生長照片。

第九圖：貝萊斯芽孢桿菌KHH13菌株影響盆缽培養之茼蒿生長照片。

第十圖：貝萊斯芽孢桿菌KHH13菌株影響盆缽培養之番茄根部生長照片。

第十一圖：貝萊斯芽孢桿菌KHH13菌株影響於田間培養之白菜及油菜生長照片。

第十二圖：貝萊斯芽孢桿菌KHH13菌株影響田間培養之紅萵苣生長照片。

第十三圖：貝萊斯芽孢桿菌KHH13菌株影響田間培養之芹菜生長狀況照片。

國內寄存資訊

財團法人食品工業發展研究所

民國106年10月26日

寄存編號：BCRC 910800

Claims (10)

1. 一種貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)KHH13菌株，係寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 910800，其中該KHH13菌株係對複數個植物病原菌具抗生活性。
2. 一種培養高濃度貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)KHH13菌株之方法，包含：將貝萊斯芽孢桿菌KHH13菌株加入一培養基中，於25~35℃及轉速100~300rpm之條件震盪培養3~8日，其中該培養基係包含0.1~1.5wt%之糖蜜、0.1~1wt%之大豆蛋白、0.1~1wt%酵母粉、0.05~0.5wt%磷酸二氫鉀(KH2PO4)、0.05~0.5wt%磷酸氫二鉀(K2HPO4)與剩餘百分比之純水。
3. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該培養基係包含1wt%之糖蜜、0.5wt%之大豆蛋白、0.5wt%之酵母粉、0.1wt%之磷酸二氫鉀、0.1wt%之磷酸氫二鉀與剩餘百分比之純水，且該培養溫度為35℃，轉速為150rpm。
4. 一種包含貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)KHH13菌株的培養介質，係包含貝萊斯芽孢桿菌KHH13菌株，其中該培養介質抑制至少一植物病原菌感染培養於該培養介質之一植物，以及促進該植物之生長，且其中該至少一植物病原菌係包含蘭花黃葉病菌、香蕉黃葉病菌、蓮霧黑腐病菌、紅龍果果腐病菌、胡瓜萎凋病菌、木瓜炭疽病菌、木瓜疫病菌、水稻稻熱病菌、水稻胡麻葉枯菌、水稻鞘腐病菌、水稻白絹病菌及水稻紋枯病菌其中至少之一者。
5. 如申請專利範圍第4項所述之培養介質，係包含1 x 10⁴~1 x 10⁸cfu/克-培養介質之該貝萊斯芽孢桿菌KHH13菌株。
6. 一種貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)KHH13菌株於抑制植物病原菌的用途，係將一有效劑量之貝萊斯芽孢桿菌KHH13菌株施予一植物，以抑制至少一植物病原菌感染該植物，且降低該植物病原菌抑制該植物之生長，且其中該至少一植物病原菌係包含蘭花黃葉病菌、香蕉黃葉病菌、蓮霧黑腐病菌、紅龍果果腐病菌、胡瓜萎凋病菌、木瓜炭疽病菌、木瓜疫病菌、水稻稻熱病菌、水稻胡麻葉枯菌、水稻鞘腐病菌、水稻白絹病菌及水稻紋枯病菌其中至少之一者。
7. 如申請專利範圍第6項所述之用途，其中該貝萊斯芽孢桿菌KHH13菌株係添加於一培養介質，且該有效劑量為1 x 10⁴~1 x 10⁸cfu/克-培養介質之該貝萊斯芽孢桿菌KHH13菌株。
8. 一種貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)KHH13菌株用於促進植物生長之用途，係以一有效劑量之貝萊斯芽孢桿菌KHH13菌株施予一植物以促進該植物之根部生長、促進該植物之葉片生長、以及提高該植物之鮮重。
9. 如申請專利範圍第8項所述之用途，其中該貝萊斯芽孢桿菌KHH13菌株係存在於一液劑中。
10. 如申請專利範圍第9項所述之用途，其中該有效劑量係為每毫升(mL)液劑中含有1 x 10⁷~1 x 10¹⁰cfu之該貝萊斯芽孢桿菌KHH13菌株。

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