CN117229966A - 一株产ddp-iv抑制剂、强解磷的甘氨酸假单胞菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
一株产DDP‑IV抑制剂、强解磷的甘氨酸假单胞菌及其应用，涉及一株菌株及其应用。本发明产DDP‑IV抑制剂、强解磷的甘氨酸假单胞菌，其为甘氨酸假单胞菌(Pseudomonas glycinae)DB20，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.28106。本发明上述产DDP‑IV抑制剂、强解磷的甘氨酸假单胞菌在稻蟹综合种养中的用途。甘氨酸假单胞菌(Pseudomonas glycinae)DB20具有产铁载体，解无机磷磷；并且可以产DDP‑IV抑制剂，从而间接起到降血糖，提高中华绒螯蟹饲料消化利用率，还能够促进水稻生长。
Description
技术领域
本发明涉及一株菌株及其应用。
背景技术
稻田是我国最大的人工湿地系统之一，而稻渔综合种养是一种新型高效的生态循环种养模式，具有优化农业结构、促进农业增收等特点，目前在我国各省均有推广。稻田种植和水产养殖结合形成的稻田综合种养能够将水体中的氮、磷元素充分循环利用，水产养殖中的富营养化问题在一定程度上得到改善，对我国水环境的修复有着巨大的意义。中华绒螯蟹(Eriochier sinensis)又称河蟹，属于甲壳纲十足目，是我国重要的养殖蟹品种，因其营养丰富且肉质鲜美而备受消费者的喜爱。因此，稻蟹综合种养因其良好的经济价值和生态价值能够满足人们对绿色食品的要求，因此成为可持续发展的农业模式之一。
水产动物的肠道菌群的变化与宿主营养代谢密切相关，如肥胖、胰岛素抗性及氨基酸代谢等，其中养殖模式会改变养殖对象的肠道菌群进而可能对其肠道免疫和生长发育有较大的影响。众所周知，糖类是水产动物生命代谢的基础物质，也是其重要的能量来源。相较于蛋白质来说，糖类是饲料配制中一种比较廉价的能源物质，因此养殖中常通过提高糖类的含量达到节省蛋白质的目的。
微生物菌剂通过其自身的各种特性在植物保护、绿色可持续农业发展、生态环境修复等领域所展现出的作用，越来越备受关注。所以，需要更多具有更广泛功能性的微生物菌株。
发明内容
本发明提供了一株产DDP-IV抑制剂、强解磷的甘氨酸假单胞菌及其应用。
本发明产DDP-IV抑制剂、强解磷的甘氨酸假单胞菌，其为甘氨酸假单胞菌(Pseudomonas glycinae)DB20，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.28106。
本发明上述产DDP-IV抑制剂、强解磷的甘氨酸假单胞菌在稻蟹综合种养中的用途。
本发明将产DDP-IV抑制剂、强解磷的甘氨酸假单胞菌(Pseudomonas glycinae)DB20菌液加入稻蟹综合种养模式的水稻田中用于促进水稻和稻田养殖中华绒螯蟹(以下简称稻田蟹)的生长。
本发明甘氨酸假单胞菌(Pseudomonas glycinae)DB20在LB固体培养基上的菌落形态为椭圆形或者短棒状，淡黄色，具有一定的荧光性和运动能力，菌落湿润且凸起，边缘不规则，经革兰氏染色为革兰氏阴性菌。
甘氨酸假单胞菌(Pseudomonas glycinae)DB20能产生高铁鳌合能力的铁载体，37℃环境中产铁载体的Su值为54.7％。在缺铁条件下，甘氨酸假单胞菌(Pseudomonasglycinae)DB20可通过产生更高亲和力的铁载体与致病菌竞争铁元素达到抑菌效果，提高稻田蟹免疫防御能力，降低病原菌在稻田蟹肠道菌群中的比例。
在37℃培养环境中甘氨酸假单胞菌(Pseudomonas glycinae)DB20在SKM固体培养基上乳蛋白的水解圈直径D为62.95mm，菌落直径d为44.12mm，D/d为1.42；在37℃环境中DDP-IV抑制剂产率高达28.9％。甘氨酸假单胞菌(Pseudomonas glycinae)DB20可以产DDP-IV抑制剂，可以控制稻田蟹的血糖，能更好的吸收饲料中的糖类物质，尤其是一些非淀粉多糖；进而能够提高饲料消化利用率、增强生长性能的作用。
本发明甘氨酸假单胞菌(Pseudomonas glycinae)DB20是同时兼具降血糖和产铁载体的菌株。将本发明甘氨酸假单胞菌(Pseudomonas glycinae)DB20加入稻蟹综合种养模式的水稻田中，可以提高稻田蟹饲料消化利用率，并产生抑菌效果。甘氨酸假单胞菌(Pseudomonas glycinae)DB20在蒙金娜无机磷培养基上，可形成明显的溶无机磷圈，溶无机磷圈直径D为25.78mm，菌落直径d为12.67mm，D/d为2.03；具有较强的解无机磷功能，够促进水稻的生长。
在37℃条件下本发明甘氨酸假单胞菌(Pseudomonas glycinae)DB20在胆盐浓度为1.5％的环境中存活率仍保持为90％；且甘氨酸假单胞菌(Pseudomonas glycinae)DB20在pH为2.0时菌株孢子存活率可达为76％，对酸度和胆盐均具有极强的耐受性。因此，甘氨酸假单胞菌(Pseudomonas glycinae)DB20可以在稻田蟹肠道内生存、发挥作用。甘氨酸假单胞菌(Pseudomonas glycinae)DB20菌株安全可靠，不造成稻田蟹的死亡，且于对照相比，甘氨酸假单胞菌(Pseudomonas glycinae)DB20组饲料系数明显低于对照组，处理组增重率以及特定生长率显著高于对照组，甘氨酸假单胞菌(Pseudomonas glycinae)DB20可以显著提升饲料的利用率。
甘氨酸假单胞菌(Pseudomonas glycinae)DB20能较大幅度提升水稻幼苗的株高和鲜重，小幅度提升水稻幼苗的根长和茎粗，极为有利于水稻植株的生长。
甘氨酸假单胞菌(Pseudomonas glycinae)DB20为甘氨酸假单胞菌，属于假单胞菌属(Pseudomonas)；保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.28106，保藏日期为2023年08月04日。
附图说明
图1是甘氨酸假单胞菌(Pseudomonas glycinae)DB20在CAS固体检测培养基上的铁载体筛选试验结果图；
图2是甘氨酸假单胞菌(Pseudomonas glycinae)DB20在蒙金娜无机磷细菌培养基上解无机磷的试验结果图；
图3是甘氨酸假单胞菌(Pseudomonas glycinae)DB20在SKM培养基上乳蛋白的水解试验结果图；
图4是由甘氨酸假单胞菌(Pseudomonas glycinae)DB20构建的系统发育树；
图5是实施例2中甘氨酸假单胞菌(Pseudomonas glycinae)DB20菌株对水稻幼苗生长影响盆栽对比效果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
具体实施方式一：本实施方式产DDP-IV抑制剂、强解磷的甘氨酸假单胞菌，其为甘氨酸假单胞菌(Pseudomonas glycinae)DB20，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.28106。
2022年9月选取辽宁省鞍山市海城市西四镇南海村的稻田养殖的中华绒螯蟹群体，随机选择30只健康的稻田养殖中华绒螯蟹，其中雄蟹体重为(75±5)g；雌蟹体重为(60±5)g，将采集的稻田养殖中华绒螯蟹(以下简称稻田蟹)采用冷链运输的方式带回东北农业大学动物科学技术学院，选取其中健康的稻田蟹20只，采用MS-222麻醉剂(250mg/L)麻醉。使用无水乙醇擦拭稻田蟹的表面，在超净工作台中用灭菌后的剪刀和镊子进行解剖，取出稻田蟹的整条肠道，轻轻挤出内含物置于含玻璃珠和50mL无菌水的锥形瓶中，以180r/min的转速室温振荡30min，再进行梯度稀释，将10-3、10-4、10-5梯度取100μL涂布于LB固体培养基平板上，每个梯度重复3次，置于28℃培养24～48h。培养48h后，选取不同形状的菌株进行分离、纯化，其中获得菌株DB20。
然后，将纯化的菌株DB20重新活化转接到LB平板上培养24h，再用灭菌的牙签挑取单菌落接到铬天青S(Chromeazurol S，CAS)固体检测培养基，37℃倒置培养2～3d，观察到菌株DB20的菌落周围形成明显的变色圈(如图1所示)，采用十字交叉法测量菌落直径d和变色圈直径D，菌株DB20的变色圈直径D为27.88mm，菌落直径d为19.90mm，D/d为1.40，说明菌株DB20具有较强产生高铁鳌合能力的铁载体。
对菌株DB20进一步试验：
(1)将活化的菌株DB20菌苔接种于限铁SA液体培养基中，37℃摇床培养48h；
(2)将生长48h的待测菌悬液转移到已灭菌的10mL离心管中，13000rpm离心15min；
(3)将上清液转移到经浓盐酸处理过的试管中，加入一定量现配的CAS检测液使上清液与检测液的体积比为1:1，充分混匀后室温静置1h；
(4)测定630nm波长处的吸光度值(A)，取双蒸水作为对照调零，以同法测定的未接种的SA限铁培养基与检测液混合后630nm波长处的吸光度值作为参比值(Ar)，并以下式表示铁载体活性单位：
Su≈(Ar-As)/Ar×100；
式中：Su为铁载体含量；Ar为所测未接种的SA限铁培养基与检测液上清液的OD值；As为所测培养基上清液的OD值。(铁载体活性单位小于10时，一般认为是阴性的，并且铁载体与检测液的混合物无颜色变化。)
经试验测得，菌株DB20在37℃时产铁载体的Su值为54.7％，说明该菌株具有极强的产铁载体能力。
将菌株DB20纯化后用灭菌牙签接种于蒙金娜无机磷细菌培养基的平板上。每个梯度重复3次，置于28℃培养24～48h。菌株DB20菌落周围形成明显的溶无机磷圈(如图2所示)，采用十字交叉法测量菌落直径d和溶无机磷圈直径D，并计算D/d。菌株DB20的溶无机磷圈直径D为25.78mm，菌落直径d为12.67mm，D/d为2.03。说明菌株DB20具有较强的解无机磷功能。
菌株DB20涂布于SKM(2％脱脂奶粉培养基上)培养基平板上产生透明圈，菌株DB20菌落周围形成明显的水解圈，DB20菌株的水解圈直径D为62.95mm，菌落直径d为44.12mm，D/d为1.42。将培养2代的菌株DB20菌液于8000r/min条件下离心15min去掉上清液留菌泥。用0.1mol/L无菌磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH 6.8)洗涤3次，将菌体重悬于PBS中，并将菌液吸光度值调至1.0。37℃温度下培养24h，在4℃，8000r/min条件下，离心15min，将上清液通过0.22pm水系滤膜滤菌器过滤，得到细胞代谢物(CFS)，于-80℃条件下保存。进一步试验：在96孔板中，准确滴加25μL，1.6mmol/L甘氨酰-脯氨酰-对硝基苯胺和25μL CFS。在37℃下反应15min，再加入50μL，0.01U/mL DDP-IV，在37℃继续反应1h，最后加入100μL、1mol/L醋酸钠缓冲溶液(pH＝4.0)终止反应，使用酶标仪在405nm处检测反应溶液的吸光值。DDP-IV抑制率计算公式：
A待测样品：25μL样品+25μLGly-pro-phy+50μLDDP-IV+100μL醋酸钠；
A样品空白：25μL样品+50μLTris-HCl+25μLGly-pro-phy+100μL醋酸钠；
A阴性对照：25μLTris-HCl+25μLGly-pro-phy+50μLDDP-IV+100μL醋酸钠；
A阴性空白：75μLTris-HCl+25μLGly-pro-phy+100μL醋酸钠。
测得菌株DB20在37℃时DDP-IV抑制剂产率高达28.9％，说明菌株DB20具有一定产DDP-IV抑制剂的能力。
菌株DB20抗逆性检测：
耐酸性能检测：将菌株DB20按2％(v/v)的接种量接种到pH为2.0、2.5、3.0的LB液体培养基中，分别在0、1、2、3h吸取菌液涂板，37℃培养24h后，测定其活菌数。
耐胆盐检测：将活化好的菌株DB20用无菌生理盐水做倍比稀释，选取合适的稀释梯度并吸取1mL稀释液放于灭菌过的平皿内。然后用含0.3％及1.0％牛胆酸钠的LB固体培养基倾注平板，同时用不含牛胆酸钠的MRS固体培养基作为对照组，37℃培养48h，进行菌落计数，并计算菌株的存活率。
检测结果如表1所示，pH的降低对菌株DB20孢子数的影响较大，当pH为2.0时菌株DB20孢子存活率为76％，相较于pH为4.0时的孢子存活率有较大的降低，但是仍优于普通的菌株耐酸性。胆盐的浓度对菌株DB20的孢子数影响较小，当胆盐浓度的提升到1.5％时，菌株DB20孢子存活率仍为87.7％。说明，菌株DB20对酸度具有较高的耐受性，而对胆盐具有极强的耐受性。
表1
菌株DB20生理生化鉴定：将保藏后的菌株DB20在固体LB培养基平板上三区划线，分离出单菌落并对其形态进行描述，根据《常用细菌系统鉴定手册》对菌株进行革兰氏染色以及生理生化鉴定。
菌株DB20菌落形态为椭圆形或者短棒状，淡黄色，具有一定的荧光性和运动能力，菌落湿润且凸起，边缘不规则，经革兰氏染色为革兰氏阴性菌。菌株DB20的部分生理生化指标见表2。根据《伯杰氏细菌鉴定手册》对肠杆菌属生理特征的描述，菌株DB20与甘氨酸假单胞菌(Pseudomonas glycinae)模式种的生理生化具有相同特征，由各项生理生化推断菌株DB20可能为甘氨酸假单胞菌(Pseudomonas glycinae)。
表2
菌株DB20的16S rRNA鉴定：选用北京索莱宝生物科技公司的细菌基因组DNA提取试剂盒，提取分离纯化后的菌株DNA。采用细菌通用引物27F/1492R进行PCR扩增，PCR扩增体系为25μL体系：10×缓冲液2.5μL，Taq酶0.5μL，引物27F 0.5μL，引物1492R 0.5μL，DNA模板1μL，ddH2O 20μL。反应程序设定为95℃预变性5min；94℃变性50s，56℃退火30s，72℃延伸1.5min，循环次数30次，72℃再延伸10min，4℃保存。将PCR扩增产物送往RuiBiotech公司测序。通过NCBI数据库比对菌株16S rRNA的测序结果，并构建系统进化树(如图4所示)。在NCBI中进行BLAST比对发现菌株DB20的16S rRNA基因序列与甘氨酸假单胞菌(Pseudomonasglycinae)相似度为99％。由菌株DB20的系统发育树可以看出菌株DB20与甘氨酸假单胞菌(Pseudomonas glycinae)(NR 179889.1)同处最小的一个分支，进化距离较近，综合生理生化指标将DB20菌株鉴定为甘氨酸假单胞菌(Pseudomonas glycinae)。
实施例1
甘氨酸假单胞菌(Pseudomonas glycinae)DB20对稻田蟹生长性能的影响。
稻田蟹养殖试验在东北农业大学动物科学技术学院的水产养殖基地进行，稻田蟹饲养容器规格730mm×492mm×420mm，每个容器内投放10只稻田蟹，共计60只，水箱内设置遮蔽物以供稻田蟹隐蔽，试验所用的稻田蟹均来源于中国水产科学院黑龙江水产研究所。稻田蟹每日投喂2次(8：00和17：00)，每日投喂量为稻田蟹体质量的4％～6％，投喂1h后将未能吃完的剩余饵料捞出，避免污染水质。根据剩余饵料情况及时调整投喂量，以保证稻田蟹的生长需求，饵料选择江苏省海普瑞饲料有限公司生产的商品幼蟹饵料，饵料基础营养水平为水分≤12.0、粗蛋白质≥40.0、粗脂肪≥5.0、粗灰分≤18.0以及总磷≥1.0。养殖用水为充分曝气自来水，水体盐度2‰。试验期间，每天检测水质指标，溶解氧＞6mg/L，水温为(24±1)℃，pH值为7.0～7.5，亚硝酸盐含量<0.05mg/L，饲养时间60d。
处理组：投喂混有1.5×106CFU/mL的甘氨酸假单胞菌(Pseudomonas glycinae)DB20菌液，饲喂前菌液与饲料充分混合(料液比为1:0.1)，并使菌液全部吸附在饲料上；对照组投喂饲料(与处理组饲料相同，但不混入甘氨酸假单胞菌(Pseudomonas glycinae)DB20菌液)。养殖结束后对每个处理的稻田蟹称重，计算存活率、体重增长率、特定生长率和饲料系数，具体计算公式如下：
存活率＝Nt/N0×100％
体重增长率＝(Mt-M0)/M0×100％
特定生长率＝(lnMt-lnM0)/t×100％
饲料系数＝饲料摄食量/体增重
其中，Nt和N0分别表示初始个数(只)和终末个数(只)；Mt和M0分别表示初始体质量和终末体质量(g)；t为饲养时间(d)。
实验结果如表3所示，由表3可知稻田蟹的存活率在各组间均无显著差异，说明甘氨酸假单胞菌(Pseudomonas glycinae)DB20并不会造成稻田蟹的死亡，菌株安全可靠。处理组饲料系数明显低于对照组，处理组增重率以及特定生长率显著高于对照组，说明甘氨酸假单胞菌(Pseudomonas glycinae)DB20可以显著提升饲料的利用率。
表3
实施例2
将甘氨酸假单胞菌(Pseudomonas glycinae)DB20菌株接入接入50mL LB液体培养基中，28℃、180r/min振荡培养过夜，用无菌水将培养液稀释至菌体浓度为1×105CFU/mL，作为菌悬液，备用。选取150粒饱满一致的龙粳31水稻种子置于55℃温水中浸泡18h，然后分组、分别置于1×105CFU·mL-1甘氨酸假单胞菌(Pseudomonas glycinae)DB20菌悬液或清水中浸泡5h；将浸种后的种子，用蒸馏水冲洗3次后，均匀置于垫有3层滤纸的培养皿中(直径10cm)，而后分别喷撒5mL上述菌悬液(之前采用甘氨酸假单胞菌DB20菌悬液浸种)或清水(之前采用清水浸种)于种子表面。28℃条件下催芽后，播于含15kg水稻田土壤移栽盆中，每盆30粒，28d后取苗，测量其根长、株高、茎粗以及鲜重，3次重复。
实验结果如表4和图5所示，在盆栽条件下甘氨酸假单胞菌(Pseudomonasglycinae)DB20对水稻具有较为明显的促生长作用。从表4中可以看出，经过甘氨酸假单胞菌(Pseudomonas glycinae)DB20浸种处理的水稻植株，其根长、株高、茎粗和鲜重分别增加了4.66％、24.99％、9.02％、和16.07％，进而说明甘氨酸假单胞菌(Pseudomonasglycinae)DB20能较大幅度提升水稻幼苗的株高和鲜重，小幅度提升水稻幼苗的根长和茎粗，极为有利于水稻植株的生长。
表4
本实施例中甘氨酸假单胞菌(Pseudomonas glycinae)DB20菌液培养基中蔗糖的质量浓度为3％、酵母粉的质量浓度为1.5％、氯化钾的质量浓度为0.3％、磷酸氢二钾的质量浓度为0.03％。
以6％的接种量将甘氨酸假单胞菌(Pseudomonas glycinae)DB20种子液接种于甘氨酸假单胞菌(Pseudomonas glycinae)DB20菌液培养基，36℃、200r/min、pH 7.5的条件下培养24h，甘氨酸假单胞菌(Pseudomonas glycinae)DB20菌液中的活菌数达到5.40×108CFU/mL。而未优化前活菌数为3.27×107CFU/mL(未优化培养基为豆芽汁培养基，豆芽汁培养基：豆芽汁100mL，蔗糖10g，(NH4)2SO4 2g，NaCl 0.4g，ZnSO4 0.08g，蒸馏水定容至1000mL，pH 7，115℃高压灭菌30min)。
Claims (2)
1.一株产DDP-IV抑制剂、强解磷的甘氨酸假单胞菌，其为甘氨酸假单胞菌(Pseudomonas glycinae)DB20，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.28106。
2.如权利要求1所述产DDP-IV抑制剂、强解磷的甘氨酸假单胞菌在稻蟹综合种养中的用途。
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| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |