JP2018512177A - 植物寄生性線虫に対して殺線虫活性を有するアスペルギルス・ニガーｆ２２菌株及びこの用途 - Google Patents
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Abstract
本発明は、植物寄生性線虫に対して殺線虫活性を有するアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）Ｆ２２菌株、上記菌株、胞子、培養体またはこの培養液を有効成分として含有する植物寄生性線虫に対する殺線虫用微生物製剤、上記微生物製剤を作物、作物の種子または栽培地に処理する段階を含む植物寄生性線虫を防除する方法、及び上記菌株を培養する段階を含む植物寄生性線虫に対する殺線虫用微生物製剤の製造方法に関する。
Description
本発明は、植物寄生性線虫に対して殺線虫活性を有するアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）Ｆ２２菌株及びこの用途に係り、より詳しくは、植物寄生性線虫に対して殺線虫活性を有するアスペルギルス・ニガーＦ２２菌株、上記菌株、胞子、培養体またはこの培養液を有効成分として含有する植物寄生性線虫に対する殺線虫用微生物製剤、上記微生物製剤を作物、作物の種子または栽培地に処理する段階を含む植物寄生性線虫を防除する方法、及び上記菌株を培養する段階を含む植物寄生性線虫に対する殺線虫用微生物製剤の製造方法に関する。
韓国国内主要園芸作物及び果菜類の施設栽培地で被害を及ぼす代表的線虫としては、根こぶ線虫（root-knot nematode）を含む植物寄生性線虫（plant-parasitic nematode）が知られていて、特に、施設ハウスの土壌内の根こぶ線虫による農作物被害が深刻である。植物寄生性線虫は、加害様相及び寄主によって根こぶ線虫（Meloidogyne spp.）、シスト線虫（Globodera spp.）、ウナギ線虫（Anguina spp.）、茎線虫（Ditylenchus spp.）、葉線虫（Aphalenchoides spp.）、根腐れ線虫（Pratylenchus spp.）、ワ線虫（Tylenchorhychus spp.）、ニセフクロ線虫（Rotylenchulus spp.）などがある。農業において重要な根こぶ線虫は、さつまいも根こぶ線虫（Meloidogyne incognita）、キタ根こぶ線虫（Meloidogyne hapla）、ジャワ根こぶ線虫（Meloidogyne javanica）及びアレナリア根こぶ線虫（Meloidogyne arenaria）などがある。
現在、植物寄生性線虫に対する防除法としては、栽培法防除、物理的防除、そして化学的防除がある。栽培的防除としては、淡水、休耕、乾土、田打ち、置き土、稲輪作栽培、抵抗性品種などがあり、物理的防除としては、熱処理（スチーム、乾熱、温湯浸法）、太陽熱消毒などが使われるし、化学的防除としては、炭素粒剤、ホスチアゼート（ソンチュンタン）などの化学薬剤を散布して線虫を防除している。栽培的防除の場合、地域条件及び栽培作物に応じて適用し難かったり、高費用の要される短所があり、抵抗性品種は特異作物に限られるため実用性が低い。化学薬剤の場合、防除効果は高いものの、大概有機リン酸塩及びカルバメート系であって、土壌に残留すると毒性が高くて環境汚染だけでなく作物の成長に有益な土壌内の有用微生物の無分別殺菌作用によって被害が加重され、徐々に土壌をやせさせる原因となる。よって、農薬の使用による環境汚染問題、生態系破壊、人畜に対する危険性などのような問題と、環境に優しい農産物に対する需要が増加することにつれ、農薬の使用を止揚している。また、土壌薫蒸剤として線虫防除に主に使われていたメチルブロマイド（methyl bromide）のオゾン層破壊問題による農薬の使用を禁じる予定である（Caboni et al．（２０１３）J．Agric．Food Chem．６１、１７９４−１８０３）。したがって、これに代わることができる、より環境に優しい殺線虫剤の開発が求められている。
近年、環境親和的に植物寄生性線虫を防除する方法のうち、微生物を利用する方法がある。微生物は生長しながら多様な２次代謝産物を生産したり、植物病原菌に直接作用して多様な抗菌及び殺虫活性を有するという研究が行われた（Zhao et al.（２０１４）Antagonistic action of Bacillus subtillis strain SG6 on Fusariuｍ graminearuｍ．PLoS one．９（３）、e９２４８６）。したがって、多様な微生物培養液に対して殺線虫活性スクリーニングを通じて活性を持つ菌株を選び、これを用いて植物寄生性線虫病を防除する菌株開発研究が進行中である。
一方、韓国公開特許第２００６−０００２７８９号では「殺線虫剤」が開示されていて、韓国公開特許第２０１０−０１１６５６２号では「バチルス・ベレゼンシスＧ３４１菌株及びこれを利用した植物病の防除方法」が開示されているが、本発明のように植物寄生性線虫に対して殺線虫活性を有するアスペルギルス・ニガーＦ２２菌株及びこの用途については、明かされたことは一切ない。
本発明は、上記のような要求によって想到されたものであって、本発明では６１個のかびの中で、実験室の条件内で植物寄生性線虫の幼虫に対する致死活性を見せ、トマト作物を利用した温室条件でも根こぶ線虫病の発生を顕著に抑制する菌株がアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）Ｆ２２菌株（ＫＣＴＣ １２７７１ＢＰ）であることを確認した。また、液状水和剤（SC）、液状懸濁剤（SM）、吸着式粒剤（吸着式GR）、粉末状粒剤（粉末状GR）及び粉末水和剤（WP）の５つの基礎剤形に調剤して、トマト根こぶ線虫病に対する防除活性を調査した時、粉末水和剤の中で最も優れた防除価を示すことを確認した。したがって、本発明の菌株は、植物寄生性線虫防除に対する生物農薬として化学農薬の代わりにすることができ、環境汚染による問題点を防止することができる画期的な生物的防除剤を提供できる点を確認し、本発明を完成した。
上記課題を解決するため、本発明は植物寄生性線虫に対して殺線虫活性を有するアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）Ｆ２２菌株を提供する。
また、本発明は、上記菌株、胞子、培養体またはこの培養液を有効成分として含む植物寄生性線虫に対する殺線虫用微生物製剤を提供する。
また、本発明は、上記微生物製剤を作物、作物の種子または栽培地に処理する段階を含む植物寄生性線虫を防除する方法を提供する。
また、本発明は、上記菌株を培養する段階を含む植物寄生性線虫に対する殺線虫用微生物製剤の製造方法を提供する。
本発明のアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）Ｆ２２菌株は、試験管内（in vitro）だけでなく、トマト根こぶ線虫病に対する温室内の実験でも濃度依存的に殺線虫活性を示すことから植物寄生性線虫防除剤の開発可能性が非常に高いと判断される。本菌株の場合、粉末水和剤の剤形をして処理した時も優れた防除効果を奏することで、以後最適醗酵工程及び製剤最適化を進める場合、新規な微生物殺線虫剤である生物農薬で化学農薬の代わりになれる。したがって、本発明の菌株は、環境汚染による問題点を防止することができる画期的な生物的防除剤としてとても有用に使われることができる。
上記目的を達成するために、本発明は、植物寄生性線虫に対して殺線虫活性を有するアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）Ｆ２２菌株を提供する。
本発明では、６１個のかびの中で特定菌株の培養濾液が実験室の条件内で植物寄生性線虫幼虫に対する致死活性を示し、トマト作物を利用した温室条件でも根こぶ線虫病の発生を抑制することを確認したが、上記菌株はアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）Ｆ２２菌株と同定された。上記アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）Ｆ２２菌株は、韓国生命工学研究院に２０１５年３月１８日付けで寄託した（寄託番号：ＫＣＴＣ １２７７１ＢＰ）。
本発明の一具現例による菌株において、上記植物寄生性線虫は、マツ材線虫（Bursaphelenchus xylophilus）または根こぶ線虫（Meloidogyne spp.）であってもよく、好ましくは、上記根こぶ線虫（Meloidogyne spp.）はさつまいも根こぶ線虫（Meloidogyne incognita）、キタ根こぶ線虫（Meloidogyne hapla）、ジャワ根こぶ線虫（Meloidogyne javanica）、アレナリア根こぶ線虫（Meloidogyne arenaria）及びトマト根こぶ線虫（Meloidogyne incognita）中で選択された一つ以上であってもよいが、これに制限されない。
本発明の一具現例による菌株において、最も好ましい植物寄生性線虫は、トマト根こぶ線虫と（Meloidogyne incognita）、キタ根こぶ線虫（Meloidogynehapla）またはマツ材線虫（Bursaphelenchus xylophilus）であってもよいが、これに制限されない。
また、本発明は、上記菌株、胞子、培養体またはこれの培養液を有効成分として含有する植物寄生性線虫に対する殺線虫用微生物製剤を提供する。
上記微生物製剤は、植物寄生性線虫に対して殺線虫活性を有するアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）Ｆ２２菌株、胞子、培養体またはこの培養液を有効成分として含むことができる。
好ましくは、上記微生物製剤は、液状水和剤（SC）、液状懸濁剤（SM）、吸着式粒剤（吸着式GR）、粉末状粒剤（粉末状GR）または粉末水和剤（WP）であってもよく、最も好ましくは、粉末水和剤であってもよいが、これに制限されない。
上記微生物製剤は、上記のような菌株を上記のような培養条件で培養して製造された培養液を含むものであって、抗菌微生物農薬、種子コーティング材、微生物栄養剤、土壌改良剤、堆肥腐熟剤、葉面散布剤または灌注散布剤などに利用されることができる。
本発明の微生物製剤において、上記アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）Ｆ２２菌株またはこの培養液を液状及び粉化の形態で当業界で使われる公知の方法によって多様に変形して使用できるが、好ましくはアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）Ｆ２２菌株の培養液または濃縮液を澱粉、粗タンパク質または岩粉のように担体に吸着して乾燥させた方が良い。本発明の菌株の培養液または濃縮液と混合して使える担体は、当業界で使われる如何なる担体でもよい。具体的に、本発明で担体として使えるものとしては、米、小麦、とうもろこし、麦、豆、粟、きび、黍、そばなどの穀類、じゃがいもなどの塊茎類、さつまいも、カッサバなどの塊根類、またはこれらの加工物（例えば、粉末）、これらに来由した澱粉とその誘導体などが含まれる。その他、寒天、ゼラチン、ペクタート（ポリガラクチュロネート）、キトサン、カルボキシメチルセルロース及びその誘導体、ジェラート、天然ワックス、天然ガム、カオリン、ベントナイトなどの粘土鉱物、またはゼオライトなどのような珪藻土物質が使われることができる。このような各種担体は個別的に使われることができ、あるいは２以上の担体を適当な割合で混合して改善された物性の担体を得ることもできる。上記のような担体を使う場合、微生物によって代謝されて栄養源になることができ、これら担体は粘性が非常に高くて植物の表面に対する粘着性が増加されて良い。
本発明は、菌株または菌株培養液を乾燥法で得られた乾燥産物及びこれを含む生物農薬も含むことができる。上記乾燥産物は、水和剤（WP）、固相剤（GM）、顆粒水和剤（WG）、粒剤（GR）、粉剤（DP）及び種子処理水和剤（WS）からなる群から選択された剤形で生物農薬を製造することができる。このような生物農薬製剤は、既存の液状剤形に比べて安定性及び理化学性が優秀であり、植物病の防除処理として使うことができる。
生物農薬における水和剤は、粉状であって水に希釈した時、水和される農薬の剤形を、固相剤は微生物培養液を固相の物質に混合するかまたは吸着した製剤として粉剤、粒剤及び水和剤に該当しない剤形を意味する。また、顆粒水和剤は顆粒状として水に希釈して使われる農薬の剤形を、上記粒剤は顆粒として元の状態で使われる農薬の剤形を、上記粉剤は粉状で元の状態で使われる農薬の剤形を、種子処理水和剤は粉状で種子に処理する前に水和して懸濁液として使われる農薬の剤形を意味する。
本発明の一具現例による水和剤は、有効成分（active ingredient）としてアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）Ｆ２２菌株、吸湿剤としてホワイトカーボン（white carbon）、湿潤剤としてソジウムビス[２−エチルヘキシル]スルホコハク酸塩、分散剤としてリグニンスルホン酸ナトリウム及び増量剤としてカオリンからなることができ、好ましくは、１０重量％のアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）Ｆ２２菌株、１重量％のホワイトカーボン（white carbon）、１重量％のソジウムビス[２−エチルヘキシル]スルホコハク酸塩、１重量％のリグニンスルホン酸ナトリウム及び８７重量％のカオリンからなることができる。
本発明の一具現例による液状水和剤は、植物寄生性線虫を防除するために使われる。本発明の微生物製剤を利用して植物寄生性線虫を防除するためには微生物製剤を水を利用して均一に希釈した後、動力散布器のような適切な散布装置を利用して作物、作物の種子、または栽培地に散布することができる。本発明の液状水和剤を水に希釈する場合、液状水和剤の濃度は、有効成分が生物学的有効範囲になるよう、１０３ないし１０５ｃｆｕ／ｍｌ、好ましくは１０４ｃｆｕ／ｍｌの内外に調節することができるが、これに制限されない。
また、本発明は、上記植物寄生性線虫に対する殺線虫用微生物製剤を作物、作物の種子、または栽培地に処理する段階を含む植物寄生性線虫を防除する方法を提供する。
上記植物寄生性線虫を防除する方法としては、本発明の菌株を培養した培養液、または上記菌株を利用した微生物製剤を作物や作物の種子に浸漬したり、灌注、つまり噴霧して行うことができる。浸漬する方法の場合、培養液及び製剤を植物体周辺の土壌に注いだり、または種子を培養液及び製剤に浸しておくことができる。本発明の方法に適用される植物には別に制限はない。
また、本発明は上記菌株を培養する段階を含む植物寄生性線虫に対する殺線虫用微生物製剤の製造方法を提供する。上記アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）Ｆ２２菌株の培養方法及び微生物製剤の製造方法は、当業界で公知された任意の方法を利用することができ、特定方法に特に制限されることはない。
また、上記菌株の培養はＭＥＢ（Malt extract broth）培地、ＰＤＢ（Potato dextrose broth）培地、ＣＤＢ（Czapek Dox broth）培地、またはＳＤＢ（Sabouraud dextrose broth）培地で行うことができるし、好ましくはＰＤＢ（Potato dextrose broth）培地で行うことができるが、これに制限されない。本発明では上記菌株を培養した後、９６ウェルマイクロプレート生物検定法を利用してトマト根こぶ線虫幼虫の懸濁液に１０％濃度で培養液を処理し、３日後に殺線虫活性を調査したところ、ＰＤＢ培地で９４％の防除活性を示し、最も高い殺線虫活性を示し、よってＰＤＢを最適な培地として選定した。
以下、本発明を実施例をもって詳しく説明する。ただし、下記実施例は本発明を例示するものであって、本発明の内容が下記実施例に限定されることはない。
実施例１：殺線虫活性を有する菌株の選抜及び殺線虫活性分析
優れた殺線虫活性を有する糸状菌を選抜するために、本発明者は６１個の糸状微生物培養濾液を分けてもらって殺線虫活性スクリーニングを行った。具体的に、根こぶ線虫に感染されたトマト植物の根を水道水で洗い出し、異物をとり除いた。その後、きれいに洗った根を１ｃｍ以下の間隔で切った後、ミキサーに入れて根が浸されるほど０．５％の次亜塩素酸ナトリウム（sodium hyphochlorite）溶液を入れた後、１分間磨砕した。そして、これを６５μｍのふるいで根の残物を取り除き、それを通過した卵を２５μｍのふるいで収集した後、滅菌水で何回も洗った。収穫した根こぶ線虫卵の濃度は、実体顕微鏡で測定した。
６１個のかび培養濾液の殺線虫活性スクリーニングは、９６ウェルマイクロプレート生物検定法で調査した。各孔に５０匹の根こぶ線虫幼虫懸濁液を４５μl 入れた後、培養濾液１０％を処理し、試料処理の３日後、以下の式を利用して殺線虫活性を調べた。実験は３回繰り返して行い、無処理対照区で滅菌数の１０％を使用し、対照薬剤としてアバメクチン（Abamectin）を致死濃度の１μg／ｍｌで使用した。
殺線虫活性（％）＝[死んでいる線虫の数／（生きている線虫の数＋死んでいる線虫の水）] ×１００
その結果、図１のように、Ｆ２２菌株は培養濾液を１０％処理した時に１００％の完璧な殺線虫活性を示し、５％処理した時も９６％と強力な殺線虫活性を示した。試料処理時に線虫幼虫はまっすぐ伸びた状態で動きを見せなかったし、一方、無処理区では幼虫が柔軟な曲線形態の動きがあって生きていることが分かった（図２）。一方、対照薬剤として使われたアバメクチン（abamectin）処理区は、１μg／ｍｌの水準で９５％の殺線虫活性を示した。
優れた殺線虫活性を有する糸状菌を選抜するために、本発明者は６１個の糸状微生物培養濾液を分けてもらって殺線虫活性スクリーニングを行った。具体的に、根こぶ線虫に感染されたトマト植物の根を水道水で洗い出し、異物をとり除いた。その後、きれいに洗った根を１ｃｍ以下の間隔で切った後、ミキサーに入れて根が浸されるほど０．５％の次亜塩素酸ナトリウム（sodium hyphochlorite）溶液を入れた後、１分間磨砕した。そして、これを６５μｍのふるいで根の残物を取り除き、それを通過した卵を２５μｍのふるいで収集した後、滅菌水で何回も洗った。収穫した根こぶ線虫卵の濃度は、実体顕微鏡で測定した。
６１個のかび培養濾液の殺線虫活性スクリーニングは、９６ウェルマイクロプレート生物検定法で調査した。各孔に５０匹の根こぶ線虫幼虫懸濁液を４５μl 入れた後、培養濾液１０％を処理し、試料処理の３日後、以下の式を利用して殺線虫活性を調べた。実験は３回繰り返して行い、無処理対照区で滅菌数の１０％を使用し、対照薬剤としてアバメクチン（Abamectin）を致死濃度の１μg／ｍｌで使用した。
殺線虫活性（％）＝[死んでいる線虫の数／（生きている線虫の数＋死んでいる線虫の水）] ×１００
その結果、図１のように、Ｆ２２菌株は培養濾液を１０％処理した時に１００％の完璧な殺線虫活性を示し、５％処理した時も９６％と強力な殺線虫活性を示した。試料処理時に線虫幼虫はまっすぐ伸びた状態で動きを見せなかったし、一方、無処理区では幼虫が柔軟な曲線形態の動きがあって生きていることが分かった（図２）。一方、対照薬剤として使われたアバメクチン（abamectin）処理区は、１μg／ｍｌの水準で９５％の殺線虫活性を示した。
実施例２：菌株の同定
優秀な殺線虫活性を有するＦ２２菌株は、ＰＤＢ培地で２５℃、１５０ｒｐｍの条件で７日間培養した。Ｆ２２菌株を同定するためにＩＴＳ（internal transcribed spacer）領域の塩基配列と、２６Ｓ ｒＲＮＡ領域の塩基配列を決定及び分析した。具体的に、DNeasy Plant mini kit（Qiagen、Valencia、CA、USA）を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、これをＰＣＲ鋳型として使った。Ｆ２２菌株のＩＴＳ領域の塩基配列分析にはＩＴＳ１（５’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG C-3' ：配列番号１）とＩＴＳ４（５'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC−３' ：配列番号２）プライマーセットを利用してＰＣＲを行った。２６Ｓ ｒＲＮＡ領域部分の塩基配列分析にはＮＬ１（５'-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3' ：配列番号３）とＮＬ４（５'-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-３' ：配列番号４）プライマーセットを利用してＰＣＲを行った。
Ｆ２２菌株のＩＴＳ領域と２６Ｓ ｒＲＮＡ領域をＰＣＲで増幅した後、増幅されたＰＣＲ生産物は、QIAquick PCR purification kit（Qiagen、Hilden、Germany）を使って精製した。分析されたかび菌株の塩基配列は、アメリカブロード研究所のデータベース検索を通じて登録された菌株との配列と比べたが、塩基配列を比較した結果、最も高い類似度を示す菌株を基準として菌株を同定した。その結果、図３のように、二つの領域のいずれもアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）とグルーピングされ、ＩＴＳ領域は９９．８％、２６Ｓ ｒＲＮＡ領域は９８％の類似度を示し、Ｆ２２菌株をアスペルギルス・ニガーで同定した。
優秀な殺線虫活性を有するＦ２２菌株は、ＰＤＢ培地で２５℃、１５０ｒｐｍの条件で７日間培養した。Ｆ２２菌株を同定するためにＩＴＳ（internal transcribed spacer）領域の塩基配列と、２６Ｓ ｒＲＮＡ領域の塩基配列を決定及び分析した。具体的に、DNeasy Plant mini kit（Qiagen、Valencia、CA、USA）を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、これをＰＣＲ鋳型として使った。Ｆ２２菌株のＩＴＳ領域の塩基配列分析にはＩＴＳ１（５’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG C-3' ：配列番号１）とＩＴＳ４（５'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC−３' ：配列番号２）プライマーセットを利用してＰＣＲを行った。２６Ｓ ｒＲＮＡ領域部分の塩基配列分析にはＮＬ１（５'-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3' ：配列番号３）とＮＬ４（５'-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-３' ：配列番号４）プライマーセットを利用してＰＣＲを行った。
Ｆ２２菌株のＩＴＳ領域と２６Ｓ ｒＲＮＡ領域をＰＣＲで増幅した後、増幅されたＰＣＲ生産物は、QIAquick PCR purification kit（Qiagen、Hilden、Germany）を使って精製した。分析されたかび菌株の塩基配列は、アメリカブロード研究所のデータベース検索を通じて登録された菌株との配列と比べたが、塩基配列を比較した結果、最も高い類似度を示す菌株を基準として菌株を同定した。その結果、図３のように、二つの領域のいずれもアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）とグルーピングされ、ＩＴＳ領域は９９．８％、２６Ｓ ｒＲＮＡ領域は９８％の類似度を示し、Ｆ２２菌株をアスペルギルス・ニガーで同定した。
実施例３：最適の培地選抜
Ｆ２２菌株の殺線虫活性物質を生産するための最適な培地を選定するために、一般的にかび培養に使われる６種の培地を利用して培養培地別に殺線虫活性を調べた。Ｆ２２菌株の６種の培養培地に菌糸片（直径、６ｍｍ）５つを接種し、２５℃、１５０ｒｐｍの条件で７日間振盪培養し、実験に使用した６種の培地は次のとおりである。ＭＥＢ（Malt extract broth）培地、ＰＤＢ（Potato dextrose broth）培地、ＣＤＢ（Czapek Dox broth）培地、ＳＤＢ（Sabouraud dextrose broth）培地、Ｖ８ジュース培地、ＣＶ８ジュース培地（Clarified V8 juice medium、Campbell Soup Company）。上記のような ６種の培地を利用したＦ２２菌株培養液は、滅菌したガーゼで濾過して培養濾液を得たし、これを前述した９６ウェルマイクロプレート生物検定法を利用して根こぶ線虫幼虫懸濁液に１０％濃度で処理し、３日後に殺線虫活性を調査した。その結果、図４のようにＰＤＢ培地で９４％の防除活性で最も高い殺線虫活性を示し、よって、ＰＤＢを最適の培地として選定した。
Ｆ２２菌株の殺線虫活性物質を生産するための最適な培地を選定するために、一般的にかび培養に使われる６種の培地を利用して培養培地別に殺線虫活性を調べた。Ｆ２２菌株の６種の培養培地に菌糸片（直径、６ｍｍ）５つを接種し、２５℃、１５０ｒｐｍの条件で７日間振盪培養し、実験に使用した６種の培地は次のとおりである。ＭＥＢ（Malt extract broth）培地、ＰＤＢ（Potato dextrose broth）培地、ＣＤＢ（Czapek Dox broth）培地、ＳＤＢ（Sabouraud dextrose broth）培地、Ｖ８ジュース培地、ＣＶ８ジュース培地（Clarified V8 juice medium、Campbell Soup Company）。上記のような ６種の培地を利用したＦ２２菌株培養液は、滅菌したガーゼで濾過して培養濾液を得たし、これを前述した９６ウェルマイクロプレート生物検定法を利用して根こぶ線虫幼虫懸濁液に１０％濃度で処理し、３日後に殺線虫活性を調査した。その結果、図４のようにＰＤＢ培地で９４％の防除活性で最も高い殺線虫活性を示し、よって、ＰＤＢを最適の培地として選定した。
実施例４：菌株培養濾液のトマト根こぶ線虫病の防除活性
アスペルギルス・ニガー（A．niger）Ｆ２２菌株培養濾液を利用してトマト根こぶ線虫病に対するポート実験を行った。直径９．５ｃｍの大きさのプラスチックポートに滅菌した砂４００gを入れた後、真土に播種して温室で３週間生育した「ソグァン」（モンサントコリア）品種のトマトを移植した。前述した方法によって根こぶ線虫に感染したトマト根から卵を収去し、各ポートあたり１０，０００匹の卵を接種した。その後、ＰＤＢ培地で２５℃、１５０ｒｐｍの条件で７日間振盪培養したＦ２２菌株培養液を滅菌されたガーゼで濾過して培養濾液を得たし、これを滅菌水を利用して１０倍と１００倍希釈してトマト根の周辺に週２回土壌灌注処理をした。対照区としてAll Star（a.i. Abamectin １．８％）３，０００倍希釈液を１回処理し、無処理区で滅菌水を処理した。実験は５回繰り返し、線虫卵接種から６週後に植物体の根を水道水できれいに洗った後、Taylor and Sasser（１９７８、Identification and Control of Root−Knot Nematodes（Meloidogyne Species）；Department of Plant Pathology、North Carolina State University：Raleigh、NC、１９７８；Vol．２、p 111）方法によって根こぶ指数を調べた。根こぶ指数は、０−５段階（０は０％、１は１−２０％、２は２１−４０％、３は４１−６０％、４は６１−８０％、５は８１−１００％）を適用して調査した。
その結果、図５のように、Ｆ２２菌株培養濾液の１０倍希釈液で７１％の防除活性を示し、植物の活発な生長が観察された。このように、アスペルギルス・ニガー（A．niger）Ｆ２２菌株は、トマト根こぶ線虫病の防除に効果的に使えると判断した。
アスペルギルス・ニガー（A．niger）Ｆ２２菌株培養濾液を利用してトマト根こぶ線虫病に対するポート実験を行った。直径９．５ｃｍの大きさのプラスチックポートに滅菌した砂４００gを入れた後、真土に播種して温室で３週間生育した「ソグァン」（モンサントコリア）品種のトマトを移植した。前述した方法によって根こぶ線虫に感染したトマト根から卵を収去し、各ポートあたり１０，０００匹の卵を接種した。その後、ＰＤＢ培地で２５℃、１５０ｒｐｍの条件で７日間振盪培養したＦ２２菌株培養液を滅菌されたガーゼで濾過して培養濾液を得たし、これを滅菌水を利用して１０倍と１００倍希釈してトマト根の周辺に週２回土壌灌注処理をした。対照区としてAll Star（a.i. Abamectin １．８％）３，０００倍希釈液を１回処理し、無処理区で滅菌水を処理した。実験は５回繰り返し、線虫卵接種から６週後に植物体の根を水道水できれいに洗った後、Taylor and Sasser（１９７８、Identification and Control of Root−Knot Nematodes（Meloidogyne Species）；Department of Plant Pathology、North Carolina State University：Raleigh、NC、１９７８；Vol．２、p 111）方法によって根こぶ指数を調べた。根こぶ指数は、０−５段階（０は０％、１は１−２０％、２は２１−４０％、３は４１−６０％、４は６１−８０％、５は８１−１００％）を適用して調査した。
その結果、図５のように、Ｆ２２菌株培養濾液の１０倍希釈液で７１％の防除活性を示し、植物の活発な生長が観察された。このように、アスペルギルス・ニガー（A．niger）Ｆ２２菌株は、トマト根こぶ線虫病の防除に効果的に使えると判断した。
実施例５：アスペルギルス・ニガー（A．niger）Ｆ２２菌株を利用した基礎製剤の根こぶ線虫病防除活性の調査
１．アスペルギルス・ニガー（A．niger）Ｆ２２菌株の基礎剤形製造
Ｆ２２菌株の培養液を利用して基礎剤形を開発するために液状剤（Suspecsion Concentrate；SC、Suspension Microbial；SM）２種、粒状剤（吸着式 Granule；GR、組み立て式 Granule；GR）２種、粉末水和剤（Wettable Powder；WP）１種の剤形を調剤した。
１．アスペルギルス・ニガー（A．niger）Ｆ２２菌株の基礎剤形製造
Ｆ２２菌株の培養液を利用して基礎剤形を開発するために液状剤（Suspecsion Concentrate；SC、Suspension Microbial；SM）２種、粒状剤（吸着式 Granule；GR、組み立て式 Granule；GR）２種、粉末水和剤（Wettable Powder；WP）１種の剤形を調剤した。
（１）アスペルギルス・ニガー（A．niger）Ｆ２２液状水和剤（Suspecsion Concentrate、SC）剤形製造
ア）製造処方箋：下記表１のように最終処方して製造した。
イ）製造工程図
１）湿式粉砕部（５０％）
界面活性剤を水に充分に分散し、アスペルギルス・ニガー培養液を粉砕した後でこれを混合した。泡が発生する時、消泡剤を少量ずつ分けて挿入した。
２）増粘部（５０％）
不凍剤に増粘剤を均一に分散した後、防腐剤及び水を添加して均一に撹拌した。
３）製品部混合工程
湿式粉砕部と増粘部を適正割合（お勧め５０:５０）で混合して調剤した。
ア）製造処方箋：下記表１のように最終処方して製造した。
１）湿式粉砕部（５０％）
界面活性剤を水に充分に分散し、アスペルギルス・ニガー培養液を粉砕した後でこれを混合した。泡が発生する時、消泡剤を少量ずつ分けて挿入した。
２）増粘部（５０％）
不凍剤に増粘剤を均一に分散した後、防腐剤及び水を添加して均一に撹拌した。
３）製品部混合工程
湿式粉砕部と増粘部を適正割合（お勧め５０:５０）で混合して調剤した。
（２）アスペルギルス・ニガー（A．niger）Ｆ２２液状懸濁剤（Suspension Microbial、SM）剤形製造
ア）製造処方箋：下記表２のように最終処方して製造した。
イ）製造工程図
１）原剤混合部（５０％）
界面活性剤を水に充分に分散し、アスペルギルス・ニガーＦ２２培養液を噴霧乾燥して得られた粉末と混合した。泡が発生する時、消泡剤を少量ずつ分けて添加した。
２）増粘部（５０％）
不凍剤に増粘剤を均一に分散した後、防腐剤及び水を添加した後、均一に撹拌した。
３）製品部混合工程
原剤混合部と増粘部を適正割合（すなわち５０:５０の推奨比）で混合して調剤した。
ア）製造処方箋：下記表２のように最終処方して製造した。
１）原剤混合部（５０％）
界面活性剤を水に充分に分散し、アスペルギルス・ニガーＦ２２培養液を噴霧乾燥して得られた粉末と混合した。泡が発生する時、消泡剤を少量ずつ分けて添加した。
２）増粘部（５０％）
不凍剤に増粘剤を均一に分散した後、防腐剤及び水を添加した後、均一に撹拌した。
３）製品部混合工程
原剤混合部と増粘部を適正割合（すなわち５０:５０の推奨比）で混合して調剤した。
（３）アスペルギルス・ニガー（A．niger）Ｆ２２吸着式粒剤（ＧＲ）剤形製造
ア）製造処方箋：下記表３のように最終処方して製造した。
イ）製造工程図
アスペルギルス・ニガーＦ２２培養液と粒状珪藻土の混合液を噴霧乾燥して調剤した。
ア）製造処方箋：下記表３のように最終処方して製造した。
アスペルギルス・ニガーＦ２２培養液と粒状珪藻土の混合液を噴霧乾燥して調剤した。
（４）アスペルギルス・ニガー（A．niger）Ｆ２２組み立て式粒剤（ＧＲ）剤形製造
ア）製造処方箋：下記表４のように最終処方して製造した。
イ）製造工程図
原剤、補助剤及び増量剤を均一に混合して液状界面活性剤に適量の水を入れて練った後、組み立て、乾燥、選別して調剤した。
ア）製造処方箋：下記表４のように最終処方して製造した。
原剤、補助剤及び増量剤を均一に混合して液状界面活性剤に適量の水を入れて練った後、組み立て、乾燥、選別して調剤した。
（５）アスペルギルス・ニガー（A．niger）Ｆ２２粉末水和剤（WP）剤形製造
ア）製造処方箋：下記表５のように最終処方して製造した。
イ）製造工程図
原剤、界面活性剤、補助剤、増量剤を混合及び粉砕して調剤した。
ア）製造処方箋：下記表５のように最終処方して製造した。
原剤、界面活性剤、補助剤、増量剤を混合及び粉砕して調剤した。
２．アスペルギルス・ニガー（A．niger）Ｆ２２菌株の基礎剤形を利用したトマト根こぶ線虫病防除活性の調査
上記のように調剤した液状水和剤（SC）、液状懸濁剤（SM）、吸着式粒剤（吸着式GR）、粉末状粒剤（粉末状GR）、粉末水和剤（WP）の総５種の製剤と培養液の生体内（in vivo）トマト根こぶ線虫病に対する防除活性を調べた。具体的に、前述した方法によって、直径９．５ｃｍのプラスチックポートに滅菌した砂４００gを入れて、温室で３週間育ったトマト幼苗を植え替えた。１ポート当たり線虫１０，０００個を接種し、１時間後にアスペルギルス・ニガー（A．niger）Ｆ２２培養液と、上記のように調剤した５種の剤形を粒剤を除いた製剤の場合、滅菌数で１００倍及び５０倍希釈し、１ポート当たり２０ｍｌずつ土壌灌注し、粒剤の場合は土壌混和処理した。試料の処理は、週２回処理し、粒剤の場合、２次処理の時は水に懸濁して処理した。対照区でオールスター（a．i．Abamectin １．８％）３，０００倍希釈液を１回処理し、無処理区で滅菌水処理した。実験は５回繰り返し、線虫卵接種から６週後に植物体の根を水道水できれいに洗った後、Taylor and Sasser （１９７８、Identification and Control of Root−Knot Nematodes（Meloidogyne Species）；Department of Plant Pathology、North Carolina State University：Raleigh、NC、１９７８；Vol。２、p １１１）方法によって根こぶ指数を調査した。根こぶ指数は０−５段階（０は０％、１は１−２０％、２は２１−４０％、３は４１−６０％、４は６１−８０％、５は８１−１００％）を適用して調査した。
その結果、図７のように、Ｆ２２菌株の粉末水和剤（WP）１００倍及び５０倍の処理区でそれぞれ１６％と６４％の濃度で依存的に高い防除価を示した。したがって、製品を開発する際に、粉末水和剤の剤形で調剤した時より優れた防除活性を示すことができると期待される。
上記のように調剤した液状水和剤（SC）、液状懸濁剤（SM）、吸着式粒剤（吸着式GR）、粉末状粒剤（粉末状GR）、粉末水和剤（WP）の総５種の製剤と培養液の生体内（in vivo）トマト根こぶ線虫病に対する防除活性を調べた。具体的に、前述した方法によって、直径９．５ｃｍのプラスチックポートに滅菌した砂４００gを入れて、温室で３週間育ったトマト幼苗を植え替えた。１ポート当たり線虫１０，０００個を接種し、１時間後にアスペルギルス・ニガー（A．niger）Ｆ２２培養液と、上記のように調剤した５種の剤形を粒剤を除いた製剤の場合、滅菌数で１００倍及び５０倍希釈し、１ポート当たり２０ｍｌずつ土壌灌注し、粒剤の場合は土壌混和処理した。試料の処理は、週２回処理し、粒剤の場合、２次処理の時は水に懸濁して処理した。対照区でオールスター（a．i．Abamectin １．８％）３，０００倍希釈液を１回処理し、無処理区で滅菌水処理した。実験は５回繰り返し、線虫卵接種から６週後に植物体の根を水道水できれいに洗った後、Taylor and Sasser （１９７８、Identification and Control of Root−Knot Nematodes（Meloidogyne Species）；Department of Plant Pathology、North Carolina State University：Raleigh、NC、１９７８；Vol。２、p １１１）方法によって根こぶ指数を調査した。根こぶ指数は０−５段階（０は０％、１は１−２０％、２は２１−４０％、３は４１−６０％、４は６１−８０％、５は８１−１００％）を適用して調査した。
その結果、図７のように、Ｆ２２菌株の粉末水和剤（WP）１００倍及び５０倍の処理区でそれぞれ１６％と６４％の濃度で依存的に高い防除価を示した。したがって、製品を開発する際に、粉末水和剤の剤形で調剤した時より優れた防除活性を示すことができると期待される。
実施例６：菌株培養濾液の様々なキタ根こぶ線虫とマツ材線虫に対する防除活性分析
アスペルギルス・ニガー（A．niger）Ｆ２２菌株の多様な植物寄生性線虫病に対する防除活性を調査するために、キタ根こぶ線虫（Meloidogyne hapla）とマツ材線虫（Bursaphelenchus xylophilus）に対する防除活性を調べた。
キタ根こぶ線虫とマツ材線虫は、ソウル大学応用生物学科のキム・ヨンホ教授の研究室で幼虫を分けてもらって実験を行った。キタ根こぶ線虫とマツ材線虫の２令幼虫は１００匹／１００μlの濃度で調剤した後、９６ウェルマイクロプレートに８０μlの線虫幼虫懸濁液を入れて培養濾液を２０μl入れて２０％濃度で処理した。その後、２０％処理区で２０μlを取って８０μlの線虫幼虫懸濁液が入っているウェルに処理し、１／４希釈された５％濃度になるように処理した。このような方法によって２０％、５％、１％濃度で線虫２令幼虫に対する致死活性を調査した。試料処理後、キタ根こぶ線虫とマツ材線虫は２５℃の培養器に保管した後、２４時間後に以下の式を利用して殺線虫活性を調査した。
殺線虫活性（％）= [死んでいる線虫の数／（生きている線虫の数＋死んでいる線虫の水）]×１００
その結果、アスペルギルス・ニガーＦ２２菌株は、培養濾液２０％、５％、１％処理時、キタ根こぶ線虫に対して９９．１％、９８．４％、８０．９％の殺線虫活性を示し、マツ材線虫の場合は７９．７％、１８．３％、７．５％の殺線虫活性を示した。したがって、アスペルギルス・ニガーＦ２２菌株は、トマト根こぶ線虫（M．incognita）だけでなく、キタ根こぶ線虫（M．hapla）とマツ材線虫（B．xylophilus）にも優れた殺線虫活性を有するものと示され、特に、キタ根こぶ線虫に対して強力な殺線虫活性を有することが確認できた（図９）。
アスペルギルス・ニガー（A．niger）Ｆ２２菌株の多様な植物寄生性線虫病に対する防除活性を調査するために、キタ根こぶ線虫（Meloidogyne hapla）とマツ材線虫（Bursaphelenchus xylophilus）に対する防除活性を調べた。
キタ根こぶ線虫とマツ材線虫は、ソウル大学応用生物学科のキム・ヨンホ教授の研究室で幼虫を分けてもらって実験を行った。キタ根こぶ線虫とマツ材線虫の２令幼虫は１００匹／１００μlの濃度で調剤した後、９６ウェルマイクロプレートに８０μlの線虫幼虫懸濁液を入れて培養濾液を２０μl入れて２０％濃度で処理した。その後、２０％処理区で２０μlを取って８０μlの線虫幼虫懸濁液が入っているウェルに処理し、１／４希釈された５％濃度になるように処理した。このような方法によって２０％、５％、１％濃度で線虫２令幼虫に対する致死活性を調査した。試料処理後、キタ根こぶ線虫とマツ材線虫は２５℃の培養器に保管した後、２４時間後に以下の式を利用して殺線虫活性を調査した。
殺線虫活性（％）= [死んでいる線虫の数／（生きている線虫の数＋死んでいる線虫の水）]×１００
その結果、アスペルギルス・ニガーＦ２２菌株は、培養濾液２０％、５％、１％処理時、キタ根こぶ線虫に対して９９．１％、９８．４％、８０．９％の殺線虫活性を示し、マツ材線虫の場合は７９．７％、１８．３％、７．５％の殺線虫活性を示した。したがって、アスペルギルス・ニガーＦ２２菌株は、トマト根こぶ線虫（M．incognita）だけでなく、キタ根こぶ線虫（M．hapla）とマツ材線虫（B．xylophilus）にも優れた殺線虫活性を有するものと示され、特に、キタ根こぶ線虫に対して強力な殺線虫活性を有することが確認できた（図９）。
[受託番号]
寄託機関名：韓国生命工学研究院
受託番号：ＫＣＴＣ１２７７１ＢＰ
受託日付：２０１５年０３月１８日
寄託機関名：韓国生命工学研究院
受託番号：ＫＣＴＣ１２７７１ＢＰ
受託日付：２０１５年０３月１８日
Claims (10)
- 植物寄生性線虫に対して殺線虫活性を有するアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）Ｆ２２菌株。
- 上記アスペルギルス・ニガーＦ２２菌株が寄託番号ＫＣＴＣ １２７７１ＢＰであることを特徴とする、請求項１に記載の菌株。
- 上記植物寄生性線虫がマツ材線虫（Bursaphelenchus xylophilus）または根こぶ線虫（Meloidogyne spp.）であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- 上記根こぶ線虫（Meloidogyne spp.）がさつまいも根こぶ線虫（Meloidogyne incognita）、キタ根こぶ線虫（Meloidogyne hapla）、ジャワ根こぶ線虫（Meloidogyne javanica）、アレナリア根こぶ線虫（Meloidogyne arenaria）及びトマト根こぶ線虫（Meloidogyne incognita）の中で選択された一つ以上を含むことを特徴とする、請求項３に記載の菌株。
- 請求項１ないし請求項４のいずれか一項に記載の菌株、胞子、培養体、またはこの培養液を有効成分として含む、植物寄生性線虫に対する殺線虫用微生物製剤。
- 上記植物寄生性線虫がマツ材線虫（Bursaphelenchus xylophilus）または根こぶ線虫（Meloidogyne spp.）を含むことを特徴とする、請求項５に記載の植物寄生性線虫に対する殺線虫用微生物製剤。
- 上記微生物製剤が粉末水和剤に剤形化されたことを特徴とする、請求項５に記載の植物寄生性線虫に対する殺線虫用微生物製剤。
- 請求項５に記載の植物寄生性線虫に対する殺線虫用微生物製剤を作物、作物の種子または栽培地に処理する段階を含む、植物寄生性線虫を防除する方法。
- 請求項１ないし請求項４のいずれか一項に記載の菌株を培養する段階を含む、植物寄生性線虫に対する殺線虫用微生物製剤の製造方法。
- 上記菌株をＰＤＢ（Potato dextrose broth）培地で培養することを特徴とする、請求項９に記載の植物寄生性線虫に対する殺線虫用微生物製剤の製造方法。
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