JP4102388B2 - 作物の生長を促進させる微生物バチルス属ｋｒ０８３及びこれを含有する微生物製剤 - Google Patents
作物の生長を促進させる微生物バチルス属ｋｒ０８３及びこれを含有する微生物製剤 Download PDFInfo
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Description
本発明は、化学肥料の代わりに、植物の生長を助ける微生物菌株である配列番号１のバチルス属KR083 (KCTC 10811BP)に関する。より詳細には、本発明は、植物根の表面と内部に定着して空中窒素を固定し、植物の生長を促進させ、植物病原菌の生長を抑制する微生物菌株であるバチルス属KR083及びこれを含有する微生物製剤に関する。
農業において、肥料は、作物の収量を決定づける重要な農業資材であるが、過度に多く使用する場合、河川水の富栄養化、地下水の水質汚染、土壌養分の不均衡、作物生育の不良等の原因として作用して、作物の収量減少は勿論、作物の品質低下を招く。しかしながら、産業の発達及び多様化に応じて、農耕地の面積が減少しているから、作物の生産性を高めるための肥料の使用は不可欠であり、よって、既存の化学肥料より親環境的な機能性農業資材の開発に対する関心が高まっている。
一方、土壌微生物を利用した農作物の栽培は、マメ科植物で広範囲に行われており、この時に主に使われる微生物が、マメ科作物と共生関係を有するリゾビウム（Rhizobium；根粒菌）である。土壌微生物のうち、宿主植物(host plant)と完全な共生関係を有することなく植物の生長を促進させる微生物は、1980年Kloepper等により植物生長促進リゾバクテリア［Plant growth-promoting rhizobacteria(PGPR）］と命名され、これには、空中窒素を固定するアゾスピリラム属菌［Azospirillum（Okon, 1985）］、シュードモナス属菌［Pseudomonas（Kloepper et al., 1980）］、バチルス属菌［Bacillus（Backman et al., 1994）］等が代表的な微生物に含まれる。このような植物生長促進微生物は、空中窒素の固定（Boddy and Dobereiner, 1995）、植物生長促進ホルモンの生産、植物の養分吸収促進（Hallmann et al., 1997）、植物の病発生抑制（Pleban et al., 1995）等の色々な機能によって植物の生長を助けると知られている。植物の生長を助ける色々な植物生長促進微生物の作物接種効果は、稲で１９〜６０%（Baldani, 2000）増収されたことを始めとして、トマト（Kloepper and Schroth, 1981）、豆（Polonenko et al., 1987;Dashti et al., 1998）、小麦（Freitas and Germida, 1990）、砂糖大根（Suslow and Schrith, 1982）等でも確認され、これらの植物生長促進微生物の実用化についての研究が続いて進行されてきている。
また、Ward等（1992）は、土壌に棲息する微生物のうち、分類及び同定されたものは、全体種の５%以下であると述べており、Young(1992)は、空中窒素を固定する微生物が１００種以上であると述べており、Torisvik等（1990）は、土壌には人為的に培養されない細菌が多いと述べた。従って、既に発見された有用微生物より機能性に優れた微生物菌株が発見される可能性は非常に高い。
しかしながら、現在までは、植物生長を促進する根圏微生物に分類される土壌微生物のうち、特定微生物の１種(Species）が空中窒素の固定、植物生長促進ホルモンの分泌及び植物の病発生抑制等の機能を同時に有する菌株についてはほとんど知られていない。
これより、本発明者らは、韓国の土壌に棲息する土壌微生物のうち、稲根の表面と内部に定着する特性を有する植物根圏細菌バチルス属KR083が単一種として空中窒素の固定、植物生長促進ホルモンの分泌及び植物の病発生の抑制等の機能を同時に有することを知見し、本発明を完成するに至った。
従って、本発明の目的は、空中窒素の固定、植物生長促進ホルモンの分泌及び植物の病発生の抑制等の機能を有するバチルス属KR083菌株を提供することにある。
また、本発明の目的は、前記バチルス属KR083菌株の２次代謝産物を提供することにある。
また、本発明の更に他の目的は、前記バチルス属KR083菌株を有効成分とする微生物製剤を提供することにある。
また、本発明の更に他の目的は、前記バチルス属KR083菌株を有効成分とする微生物製剤を提供することにある。
本発明は、植物根の表面と内部に定着して空中窒素を固定し、植物の生長を促進させ、かつ植物病原菌の生長を抑制する微生物菌株である配列番号１のバチルス属KR083 (KCTC 10811BP)及びこれを含有する微生物製剤に関する。
本発明のバチルス属KR083は、植物根の表面と内部に定着して空中窒素を固定し、植物の生長を促進させ、かつ植物病原菌の生長を抑制するのに有効なものであることが確認された。従って、バチルス属KR083を通常の方法により微生物製剤として供給した場合、水質及び土壌環境を保存することができると共に、化学肥料を代替して作物の収穫量を増やすことができ、病原菌から作物の安全な生育を助けることができる。
以下、本発明を詳細に説明する。
バチルス属KR083は、丸いロッド形状をしており、サイズは、１．５〜２．０×０．８〜１．０μmであり、鞭毛を有している（図２）。バチルス属KR083菌株をＰＤＢ培地で２４時間培養すれば、ポリ-β-オキシブチレート（Poly-β-oxybutyrate）が集積される。グラム(Gram)陽性細菌であるKR083菌株は、生育環境によっては、胞子を形成し、呼吸代謝をし、カタラーゼ（Catalase）活性を有する。また、KR083菌株は、分子窒素（N2）を固定し、7%塩化ナトリウム（NaCl）溶液で生長が可能であり、リトマスミルク（Litmus milk）反応では無色を示す。KR083菌株は、培地に添加された炭素源がグルコース（Glucose）、アラビノース（Arabinose）、キシロース（Xylose）、ガラクトース（Galactose）、フラクトース（Fructose）、ラクトース（Lactose）、スクロース（Sucrose）、マンニトール（Mannitol）等である時は、生長過程で酸を生産し、炭素源がシトレート（Citrate）、デキストリン（Dextrine）、ラムノース（Ramnose）、ソルビトール（Sorbitol）、澱粉（Starch）等である時は、アルカリを生産する。これに対し、ズルシトール（Dulcitol）及びグリセロール（Glycerol）添加した培地では成長しない。また、KR083菌株は、植物根の表面に棲息しながら根組織の内部に入って定着する特性を有する（図３）。土壌微生物KR083菌株の生理、生化学的特性を下記表１（土壌微生物KR083菌株の生理、生化学的特性）に示した。
バチルス属KR083は、丸いロッド形状をしており、サイズは、１．５〜２．０×０．８〜１．０μmであり、鞭毛を有している（図２）。バチルス属KR083菌株をＰＤＢ培地で２４時間培養すれば、ポリ-β-オキシブチレート（Poly-β-oxybutyrate）が集積される。グラム(Gram)陽性細菌であるKR083菌株は、生育環境によっては、胞子を形成し、呼吸代謝をし、カタラーゼ（Catalase）活性を有する。また、KR083菌株は、分子窒素（N2）を固定し、7%塩化ナトリウム（NaCl）溶液で生長が可能であり、リトマスミルク（Litmus milk）反応では無色を示す。KR083菌株は、培地に添加された炭素源がグルコース（Glucose）、アラビノース（Arabinose）、キシロース（Xylose）、ガラクトース（Galactose）、フラクトース（Fructose）、ラクトース（Lactose）、スクロース（Sucrose）、マンニトール（Mannitol）等である時は、生長過程で酸を生産し、炭素源がシトレート（Citrate）、デキストリン（Dextrine）、ラムノース（Ramnose）、ソルビトール（Sorbitol）、澱粉（Starch）等である時は、アルカリを生産する。これに対し、ズルシトール（Dulcitol）及びグリセロール（Glycerol）添加した培地では成長しない。また、KR083菌株は、植物根の表面に棲息しながら根組織の内部に入って定着する特性を有する（図３）。土壌微生物KR083菌株の生理、生化学的特性を下記表１（土壌微生物KR083菌株の生理、生化学的特性）に示した。
［参考例１］KR083菌株の塩基配列分析
KR083菌株の塩基配列分析は、１６Ｓ ｒＤＮＡ配列分析法を用いて行ったが、まず、１６Ｓ ｒＤＮＡ領域を核酸増幅法（PCR：Polymerase Chain Reaction）で増幅させ、pGEMT-Tベクトル（vector）に挿入した後、自動塩基配列分析機ABI3100（Applied Biosystem, USA）を用いて塩基配列を分析した。これに使われたプライマー(primer)は、配列番号２のｆＤ１（５′−ａｇａｇｔｔｔｇａｔｇｇｃｔｃａｇ−３′）及び配列番号３のｒＰ２（５′−ａｃｇｇｃｔａｃｃｔｔｇｔｔａｃｇａｃｔｔ−３′）であり、プライマーの両末端部位の塩基配列を分析するために、ｐＵＣ／Ｍ１３の正方向プライマ （forward primer：５′−ｇｔｔｔｔｃｃｃａｇｔｃａｃｇａｃ−３′）（配列番号４）及び逆方向プライマー（reverse primer：５′−ｇｃｇｇａｔａａｃａａｔｔｔｃａｃａｃａｇｇ−３′）（配列番号５）を利用した。また、内部の塩基配列分析のために、４つのプライマーを利用した。それぞれの塩基配列は、Escherichia coli １６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列（GenBank No.J01695）の順序によって３１１〜３３０部位の塩基配列である１６ＳＰ−１（５′−ｇｃｃａｃａｃｔｇｇａａｃｔｇａｇａｃａｃ−３′）、６８４〜７０３部位の塩基配列である１６ＳＰ−２（５′−ｔｇｔａｇｃｇｇｔｇａａａｔｇｃｇｔｇ−３′）、９４４〜９６３部位の塩基配列である１６ＳＰ−３（５′−ｇｇａｇｃａｔｇｔｇｔｔａｔｔｃｇ−３′）及び１２２８〜１２４７部位の塩基配列である１６ＳＰ−４（５′−ｃｔａｃａｃａｃｇｔｇｃｔａｃａａｔｇｇ−３′）を利用した。
KR083菌株の塩基配列分析は、１６Ｓ ｒＤＮＡ配列分析法を用いて行ったが、まず、１６Ｓ ｒＤＮＡ領域を核酸増幅法（PCR：Polymerase Chain Reaction）で増幅させ、pGEMT-Tベクトル（vector）に挿入した後、自動塩基配列分析機ABI3100（Applied Biosystem, USA）を用いて塩基配列を分析した。これに使われたプライマー(primer)は、配列番号２のｆＤ１（５′−ａｇａｇｔｔｔｇａｔｇｇｃｔｃａｇ−３′）及び配列番号３のｒＰ２（５′−ａｃｇｇｃｔａｃｃｔｔｇｔｔａｃｇａｃｔｔ−３′）であり、プライマーの両末端部位の塩基配列を分析するために、ｐＵＣ／Ｍ１３の正方向プライマ （forward primer：５′−ｇｔｔｔｔｃｃｃａｇｔｃａｃｇａｃ−３′）（配列番号４）及び逆方向プライマー（reverse primer：５′−ｇｃｇｇａｔａａｃａａｔｔｔｃａｃａｃａｇｇ−３′）（配列番号５）を利用した。また、内部の塩基配列分析のために、４つのプライマーを利用した。それぞれの塩基配列は、Escherichia coli １６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列（GenBank No.J01695）の順序によって３１１〜３３０部位の塩基配列である１６ＳＰ−１（５′−ｇｃｃａｃａｃｔｇｇａａｃｔｇａｇａｃａｃ−３′）、６８４〜７０３部位の塩基配列である１６ＳＰ−２（５′−ｔｇｔａｇｃｇｇｔｇａａａｔｇｃｇｔｇ−３′）、９４４〜９６３部位の塩基配列である１６ＳＰ−３（５′−ｇｇａｇｃａｔｇｔｇｔｔａｔｔｃｇ−３′）及び１２２８〜１２４７部位の塩基配列である１６ＳＰ−４（５′−ｃｔａｃａｃａｃｇｔｇｃｔａｃａａｔｇｇ−３′）を利用した。
KR083菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列分析結果は、配列番号１に記載し、GenBankライブラリーの塩基配列と相同性を調べた結果、Bacillus sp.と９９%以上の高い塩基配列相同性を示すのに対して、その他の種とは９８%以下の比較的低い塩基配列相同性を示したので、暫定的にバチルス属（Bacillus sp.）に分類した。従って、本発明者らは、KR083菌株を“バチルス属KR083”菌株と命名し、2003年6月11日付で韓国農村振興庁農業生命工学研究院に付設の韓国農用微生物保存センター（KACC）に寄託し、受託番号KACC
91050を付与された。
91050を付与された。
また、このバチルス属KR083（Bacillus sp. KR083）菌株については、2005年5月27日付けで国際寄託機関であるＫＲＩＢＢ（Korean Research Institute of Biosceience and Biotechnology）のＫＣＴＣ（Korean Collection for Type Cultures）に再寄託され、寄託番号KCTC 10811BPを付与された。
本発明によるバチルス属KR083菌株の植物生長促進力は、とうもろこし根を菌株培養液の５０倍希釈液に１．５時間沈積する方法で接種した時、根の伸張が２１．３%増加し、空中窒素の固定力は、７２時間室温培養の条件で標準菌株Herbaspirillum seropedicae BR11175及びAcetobacter diazotrophicus BR11281より各々１．０２倍、１４３倍高く、植物病原菌であるリゾクトニア・ソラニー（Rhizoctonia solani）等の２種の糸状菌や、エルウィニア・カロトボーラ（Erwinia carotovora）等の２種の細菌に対して強い生長抑制効果を示した。
本発明による微生物製剤は、通常の方法で植物生長促進用又は病原菌生長抑制用製剤で剤型化することができ、その剤型は特に限定されるものではない。好ましくは、化学肥料を代替するための植物生長促進有機肥料で剤型化することができる。
また、本発明による微生物製剤を植物生長促進用製剤として乾燥粉末形態又は液状肥料形態で製造する場合には、前記バチルス属KR083菌株を乾燥粉末ｇ当たり、又は液状肥料１mL当たり１０5匹以上含有することができる。
また、本発明による微生物製剤を病原菌生長抑制用製剤として乾燥粉末形態又は液状形態で製造する場合には、前記バチルス属KR083菌株を乾燥粉末ｇ当たり、又は液状１mL当たり１０7匹以上含有することができ、前記植物生長促進用製剤で剤型化する時よりも菌株の含量を多く使用することが特徴である。
また、本発明による微生物製剤を病原菌生長抑制用製剤として乾燥粉末形態又は液状形態で製造する場合には、前記バチルス属KR083菌株を乾燥粉末ｇ当たり、又は液状１mL当たり１０7匹以上含有することができ、前記植物生長促進用製剤で剤型化する時よりも菌株の含量を多く使用することが特徴である。
以下、実施例及び実験例により本発明をより詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例及び実験例に限定されるものではない。
［実施例１］土壌微生物KR083の分離
無菌的に発芽させた種籾１粒を０．６%アガロース（Agarose）培地上に移し、稲根から１〜２cm距離に、菌株を分離すべき土壌試料０．５gを接種し、２８℃で４８時間恒温処理した後、根を磨いて懸濁液に作った後、ＬＣ培地に塗抹して、菌株を分離した。分離されたKR083菌株は、図１に示されている。
無菌的に発芽させた種籾１粒を０．６%アガロース（Agarose）培地上に移し、稲根から１〜２cm距離に、菌株を分離すべき土壌試料０．５gを接種し、２８℃で４８時間恒温処理した後、根を磨いて懸濁液に作った後、ＬＣ培地に塗抹して、菌株を分離した。分離されたKR083菌株は、図１に示されている。
［実験例１］土壌微生物KR083の空中窒素固定力検定
KR083菌株を真空採血管内５mLの半固体ＬＧＩ培地に接種した後、恒温培養して、ガスクロマトグラフィ（Gas Chromatography）によりアセチレン還元力（Hardy,1970）を測定して検定した。結果は、下記表２（土壌微生物KR083の空中窒素固定力）に示した。
KR083菌株を真空採血管内５mLの半固体ＬＧＩ培地に接種した後、恒温培養して、ガスクロマトグラフィ（Gas Chromatography）によりアセチレン還元力（Hardy,1970）を測定して検定した。結果は、下記表２（土壌微生物KR083の空中窒素固定力）に示した。
前記表２から明らかなように、本発明のKR083菌株は、対照菌株であるHerbaspirillum seropedicae BR11175、Herbaspirillum rubrisublbican BR11192及びAcetobacter diazotrophicus BR11281より優れた空中窒素固定力を示した。
［実験例２］土壌微生物KR083の植物生長促進効果
KR083菌株の植物生長促進効果を測定するために、藻類であるクロレラブルガリス（Chlorella vulgaris)及びとうもろこし幼苗を対象にして実施した。クロレラブルガリス接種試験は、ハタ(Hata)培地の温度が５０℃である時、液状の培地内にクロレラブルガリスを混合して、シャーレに注ぎ、培地を固めた後、半径４mmのウェル（well）を形成し、菌株培養液１００μLを１０回繰り返して分株した。処理された藻類は、光条件下で５日間培養した後、生長半径を調べた。とうもろこし幼苗接種試験は、とうもろこし根の終端３mm部位を試験菌株の培養物懸濁液に１．５時間浸漬して接種処理し、対照区の幼苗は、滅菌した微生物培養液に浸漬した。次に、とうもろこし幼苗をプラスチックボックス内の湿っぽいろ過紙に載置し、根の伸張開始点にある根終端をろ過紙で覆った後、２８℃で２４時間恒温処理して、新しく伸張した根の長さを１０回繰り返して測定することによって、菌株のとうもろこし生長促進力を検定した。結果を下記表３（土壌微生物KR083菌株の藻類及びとうもろこし生長促進力）に示した。
KR083菌株の植物生長促進効果を測定するために、藻類であるクロレラブルガリス（Chlorella vulgaris)及びとうもろこし幼苗を対象にして実施した。クロレラブルガリス接種試験は、ハタ(Hata)培地の温度が５０℃である時、液状の培地内にクロレラブルガリスを混合して、シャーレに注ぎ、培地を固めた後、半径４mmのウェル（well）を形成し、菌株培養液１００μLを１０回繰り返して分株した。処理された藻類は、光条件下で５日間培養した後、生長半径を調べた。とうもろこし幼苗接種試験は、とうもろこし根の終端３mm部位を試験菌株の培養物懸濁液に１．５時間浸漬して接種処理し、対照区の幼苗は、滅菌した微生物培養液に浸漬した。次に、とうもろこし幼苗をプラスチックボックス内の湿っぽいろ過紙に載置し、根の伸張開始点にある根終端をろ過紙で覆った後、２８℃で２４時間恒温処理して、新しく伸張した根の長さを１０回繰り返して測定することによって、菌株のとうもろこし生長促進力を検定した。結果を下記表３（土壌微生物KR083菌株の藻類及びとうもろこし生長促進力）に示した。
前記表３から明らかなように、KR083菌株は、接種５日目、藻類の生長を直径３mm促進させる効果を示し、とうもろこし根伸長を測定した場合では、培養原液（4.5×109cfu/mL）の２倍希釈接種により、無処理群に比べて２０%の根伸長抑制効果を示したが、培養物の５０倍希釈接種時には、無処理群に比べて２６．３%の伸長促進効果を示した。
［実験例３］土壌微生物KR083菌株の植物病原菌抑制力
KR083菌株の植物病原菌抑制力は、ＰＤＡ（Potato Dextrose Agar）に病原性カビ及び細菌を各々接種した後、シャーレに移して、培地を固めた後、半径４mm大きさのウェル（well）を作り、ここに液体の馬鈴薯培地で２８℃条件で５日間培養したKR083菌株を１００μLずつ接種して、２８℃条件で５日間保管した後、根圏細菌の病原菌生長阻止範囲を測定した。植物病原菌の接種は、カビの場合、１×１０6conidia/mL濃度で５mL、細菌性病原菌の場合、１×１０8cfu/mL濃度で５mLを各々４５℃のＰＤＡ培地２５０mLに混合し、攪拌した後、シャーレ当たり２５mLずつ３回繰り返して分株して接種した。結果を表４｛土壌微生物KR083菌株の植物病原性カビ及び細菌に対する生長抑制力程度（生長阻止範囲、Φmm）｝に示した。
KR083菌株の植物病原菌抑制力は、ＰＤＡ（Potato Dextrose Agar）に病原性カビ及び細菌を各々接種した後、シャーレに移して、培地を固めた後、半径４mm大きさのウェル（well）を作り、ここに液体の馬鈴薯培地で２８℃条件で５日間培養したKR083菌株を１００μLずつ接種して、２８℃条件で５日間保管した後、根圏細菌の病原菌生長阻止範囲を測定した。植物病原菌の接種は、カビの場合、１×１０6conidia/mL濃度で５mL、細菌性病原菌の場合、１×１０8cfu/mL濃度で５mLを各々４５℃のＰＤＡ培地２５０mLに混合し、攪拌した後、シャーレ当たり２５mLずつ３回繰り返して分株して接種した。結果を表４｛土壌微生物KR083菌株の植物病原性カビ及び細菌に対する生長抑制力程度（生長阻止範囲、Φmm）｝に示した。
上記結果から明らかなように、本発明によるKR083菌株は、リゾクトニア・ソラニー（Rhizoctonia solani）とフザリウム・クルモラム（Fusarium culmorum）のような植物病原性カビ、及びエルウィニア・カロトボーラ（Erwinia carotovora）とシュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas syringiae）のような植物病原性細菌等に対して強い生長抑制効果を示すことが確認された。
［実験例４］土壌微生物KR083の農作物接種効果検定
本発明の植物生長促進土壌微生物バチルス属KR083菌株を通常の方法で培養した培養液を、麦、小麦、キャベツ、黍等に接種した。その結果を下記表５（土壌微生物KR083菌株の農作物接種効果）に示した。
本発明の植物生長促進土壌微生物バチルス属KR083菌株を通常の方法で培養した培養液を、麦、小麦、キャベツ、黍等に接種した。その結果を下記表５（土壌微生物KR083菌株の農作物接種効果）に示した。
上記表５から、バチルス属KR083菌株を接種すことによって、麦の収量を３．９%、唐辛子の収量を１３．７%、トマトの幼苗生長を１６５．７%向上させることが分かり、これにより、KR083菌株が実際に農作物の収穫量を増加させることを確認した。
Claims (6)
- 配列番号１で表される塩基配列からなるｒＤＮＡをもち、空中窒素固定、植物生長促進、及び植物病原菌抑制の機能を同時に備えたバチルス属KR083（KCTC 10811BP）菌株。
- 請求項１に記載のバチルス属KR083を有効成分として含有し、空中窒素固定、植物成長促進、及び植物病原菌抑制の機能を同時に発現する微生物製剤。
- 前記微生物製剤は、化学肥料代替用有機肥料であることを特徴とする請求項２に記載の微生物製剤。
- 前記微生物製剤は、バチルス属KR083が生育する間に分泌される物質であるバチルス属KR083の２次代謝産物を有効成分として更に含有することを特徴とする請求項２に記載の微生物製剤。
- 請求項２乃至４のいずれか１項に記載の微生物製剤により土壌を処理する土壌の管理方法。
- 請求項２乃至４のいずれか１項に記載の微生物製剤により植物を処理する植物の栽培方法。
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