PT2324108E - Microorganismo capaz de solubilizar fosfato e ferro e suas aplicações - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"MICROORGANISMO CAPAZ DE SOLUBILIZAR FOSFATO E FERRO E SUAS APLICAÇÕES"

Campo da Invenção A invenção refere-se a uma nova estirpe de P seudomonas putida, capaz de solubilizar fosfato e ferro, e opcionalmente de produzir compostos que promovem o crescimento de plantas, ou um mutante do referido microorganismo que tem essencialmente as mesmas caracteristicas que a estirpe progenitora, bem como as suas aplicações, em particular na solubilização de fosfato insolúvel, na quelação de ferro para prevenir o crescimento do agente patogénico e, opcionalmente, na produção de hormonas vegetais. A nova estirpe de P. putida e sues mutantes são capazes de solubilizar fosfato e ferro, e opcionalmente produzir compostos que promovem o crescimento de plantas, em condições em que a quantidade de água e de 20% ou menos.

Antecedentes da Invenção O uso de fertilizantes tem sido e é um factor determinante para o rendimento das culturas vegetais de interesse agrícola, sendo frequente a utilização de fertilizantes inorgânicos contendo misturas de fósforo, potássio e azoto (conhecido como NPK) . A produção de fosfatos pela indústria química baseia-se na decapagem de fosfato de rocha com um ácido forte, por exemplo ácido sulfúrico, dando origem à formação de resíduos insolúveis do tipo gesso. Um problema adicional de fertilizantes inorgânicos é que o fósforo frequentemente precipita-se (em especial em solos ligeiramente alcalinos) e dá origem à insolubilização do mesmo. Fertilizantes do tipo NPK, também podem ser obtidos por meio da mistura de fosfato de rocha com sulfato de amónio e cloreto de potássio. Em 2 todos estes casos, o resultado é uma forma de fósforo no solo, que não se encontra num estado de pronta biodisponibilidade para as plantas. Além disso, estes fertilizantes não levam em conta outras possíveis deficiências de nutrientes no solo, como é o caso do ferro, que, sendo um elemento quantitativamente abundante na crosta terrestre devido ao seu grau de oxidação, também não se encontra num estado biodisponível para plantas.

Em contraste com as abordagens químicas de solubilização do fósforo no fosfato de rocha, as abordagens biológicos baseiam-se na produção de ácidos fracos por microorganismos. Foram propostas soluções para o referido problema utilizando microorganismos que solubilizam o fósforo in situ e o tornam biodisponível para plantas; no entanto, tais abordagens são parciais e não consideram a dimensão global ou a solubilização de mais de um nutriente que facilita o crescimento das plantas. A microbiologia em geral, e a biotecnologia em particular, apresentam uma alternativa biológica para a solubilização de fósforo, por meio da utilização, por microorganismos adequados, do fosfato presente no fosfato de rocha como fonte de fósforo. Vários estudos incluem a possibilidade de solubilização do fosfato de solos por microorganismos. Entre estes estudos, aqueles que conseguem solubilizar o fósforo devido à excreção de ácidos que facilitam a solubilização do fosfato insolúvel, um fenómeno associado com fungos, por exemplo, Penicillium e Aspergillus, merecem menção especial (Pea, A, Kucey, RMN e Stewart, JWB; Inorganic phosphate solubilization by two Penicillium species in solution culture and soil. Soil Biology and Biochemistry (1981), 20: 459-464; E. Nahal. Factors determining rock phosphate solubilization by microorganisms isolated from soil. World J. Microbiol. 3

Biotechnol. (1996), 12:567-572; e Vassileu N., Baca, M.T.,

Yassileva M., Franco I., e Azcón, R. Rock phosphate solubilization by Aspergilllus niger grown on sugar-beet waste médium. Appl. Microbiol. Biotechnol. (1995), 44: 546- 549). Foram também descritas bactérias que formam simbiose com o sistema radicular de plantas capazes de solubilizar fosfatos, por exemplo, as estirpes do género Rhizobium e Bradyrhizobium (Halder, A.K., Mishra, A.K., Battacharyya, P., e Chakrabarty, P.K. Solubilization of rock phosphate by Rhizobium and Bradyrhizobium. J. Gene. Microbiol. (1990), 36: 81-92), bactérias potencialmente patogénicas, tais como Pseudomonas cepacia (E. Nahal, mencionado acima), bem como bactérias não atribuídas a qualquer género, tais como as identificadas como NBRI2601, NBRI3246 e NBR4003 por Nautilaya et al. (Nautilaya, C.S., B. Bhadauria, P. Kumar, H. Lai, R. Mondei e D. Verma. Stress induced phosphate solubilization in bactéria from alkaline soils. FEMS Microbiol. Lett. (2000), 182:291-296) ou algumas estirpes de Pseudomonas sp. cepas (Illmer, P. e Schinner, F. Solubilization of inorganic calcium phosphates solubilization mechanisms. Soil Biology and Biochemistry (1995), 27:257-263). É também desejável destacar que a maior parte do ferro na crosta da terra é encontrada em formas insolúveis que são difíceis para os microorganismos acederem; na verdade, foi descrito que o ferro pode actuar como um factor limitante para o crescimento de microorganismos em seus habitats específicos. Alguns microorganismos são capazes de produzir moléculas chamadas sideróforos que têm uma elevada afinidade com o ferro, tais como Pseudomonas aeruginosa (Cox, C.D., Adams, P. Siderophore activity of pyoverdin for Pseudomonas aeruginosa. Infection and Immunity. (1985), 48: 130-138) e Pseudomonas fluorescens 4 (Duffy, B.K., Défago, G. Environmental factors modulating antibiotic and siderophore biosynthesis by Pseudomonas flurescens biocontrol strains. Applied and environmental Microbiology. (1999), 65:2429-2438). Estas moléculas são excretadas no meio ambiente e, na presença de ferro, é formado o complexo ferro-sideróforo. Este complexo é incorporado dentro da célula pelo microorganismo, evitando deste modo a biodisponibilidade do ferro para microorganismos concorrentes. Esta propriedade é particularmente importante uma vez gue auxilia na supressão do crescimento do agente patogénico. Na verdade, o ferro é um elemento essencial para gue a virulência de certas estirpes seja manifestada tanto em modelos animais como sistemas vegetais. Entre as obras que estudaram esta questão, um trabalho relacionado com o estudo da regulação da síntese destas moléculas merece uma menção especial (Ventura, V., Weisbeek, P. e Koster, M. Gene regulation of siderophore-mediated iron acquisition in Pseudomonas: not only the Fur repressor. Molecular Microbiology. (1995), 17:603-610), assim como um outro trabalho relacionado com a diversidade de sideróforos (Corneis, P. e Matthijs, S. Diversity of siderophore-mediated iron uptake Systems in fluorescent Pseudomonas: not only pyoverdins. Environ. Microbiol. (2002), 4:787-798).

Rosas S.B. et al. (Rosas S.B. et al. Phosphate-solubilizing Pseudomonas putida can influence the rhizobialegume synbiosis. Soil Biology and Biochemistry (2006), 38:3502-3505) divulga duas estirpes de P. putida capazes de solubilizar fosfato e ferro em condições de humidade não-baixa (isto é, inóculos da referida estirpe foram aplicados ao sistema radicular de algumas mudas nas covas de plantio e as plantas foram aguadas adequadamente e cresceram em condições controladas). 5

Por fim, com a finalidade de aumentar o valor de microorganismos que solubilizam fosfatos de ferro, é vantajoso identificar aqueles que, além disso, produzem compostos que têm um efeito benéfico sobre o crescimento da planta (Bloemberg, G.V., e Lugtenberg, B.J.J. Molecular basls of plant growth promotion and biocontrol by rhizobacteria. Curr. Opin. em Plant Biol. (2001), 4: 434- 450) .

Além disso, o valor dos referidos microorganismos que solubilizam fosfatos e ferro, e, opcionalmente produzem compostos que têm um efeito benéfico sobre o crescimento da planta, aumentaria se os referidos microorganismos fossem tolerantes à dessecação, isto é, se os mesmos fossem capazes de sobreviver em condições de baixa, de preferência extremamente baixa humidade, por exemplo, em solos com apenas 2% de capacidade de campo, uma vez que tais microorganismos seriam capazes de sobreviver durante períodos em que a água é limitada e poderiam ser utilizados em regiões em que a pluviometria é escassa. É, portanto, de interesse ter microorganismos capazes de solubilizar fosfato e ferro em condições extremas de baixa humidade; vantajosamente, os referidos microorganismos poderiam, além disso, produzir compostos com propriedades de estimulação do crescimento de plantas.

Sumário da Invenção

Uma estirpe de Pseudomonas putida (P. putida BIRD-1) foi isolada e caracterizada e depositada em 3 de Junho de 2008, na Colecção Espanhola de Cultivos Tipo (Spanish Type Culture Collectlon - Colección Espanola de Cultivos Tipo (CECT)) com número de acesso CECT 7415. A referida estirpe é capaz de solubilizar fosfato e ferro presentes em fosfato de rocha e de utilizar os referidos compostos como uma fonte de fósforo e ferro, respectivamente, pelo que 6 pode ser utilizada num processo microbiológico para a solubilização de fosfato e ferro. Surpreendentemente, a referida estirpe é capaz de solubilizar fosfato e ferro em condições de humidade extremamente baixa, por exemplo, em solos com apenas 2% de capacidade de campo. Foi ainda observado que a referida estirpe também produz compostos com potencial como hormonas vegetais, uma vez que são capazes de estimular o crescimento das plantas.

Por conseguinte, a invenção também contribui não apenas para a prevenção dos problemas ambientais associados com a utilização de fertilizantes à base de fosfato de rocha por meio da utilização de microorganismos que solubilizam fosfato insolúvel e ferro insolúvel, superando os inconvenientes dos processos do estado da técnica, mas ao contrário, pode também contribuir para evitar o desenvolvimento de organismos patogénicos, em particular agentes patogénicos das plantas, e para estimular o crescimento da planta. Além disso, a invenção também fornece microorganismos que são extremamente tolerantes a condições de humidade extremamente baixa que podem sobreviver em humidade extremamente baixa e podem ser utilizados em regiões em que a pluviometria é escassa.

Desse modo, num aspecto, a invenção refere-se a um microorganismo da espécie Pseudomonas putida depositado na CECT com o número de acesso CECT 7415, com uma capacidade de solubilização e fosfato e ferro em condições em que a quantidade de água é de 20% ou menos, ou um mutante do referido microorganismo que mantém a capacidade de solubilizar fosfato e ferro em condições em que a quantidade de água é de 20% ou menos. Uma cultura biologicamente pura do referido microorganismo é um aspecto adicional da presente invenção. 7

Noutro aspecto, a invenção refere-se a um suporte sólido activo que compreende um suporte sólido e o referido microorganismo.

Noutro aspecto, a invenção refere-se a um fertilizante sólido suplementado que compreende um fertilizante sólido e o referido microorganismo.

Noutro aspecto, a invenção refere-se a uma semente suplementada que compreende uma semente e o referido microorganismo.

Noutro aspecto, a invenção refere-se a um processo para a solubilização microbiológica, em condições aeróbias, de um fosfato num substrato sólido que contém um fosfato insolúvel.

Noutro aspecto, a invenção refere-se a um processo para a solubilização microbiológica, em condições aeróbias, de fosfato insolúvel presente num solo.

Noutro aspecto, a invenção refere-se a um processo para a solubilização microbiológica, em condições aeróbias, de ferro insolúvel presente num solo que contém óxidos de ferro e de outras formas solúveis deste metal.

Noutro aspecto, a invenção refere-se a um processo para a solubilização microbiológica, em condições aeróbias, de um fosfato insolúvel e de um ferro insolúvel num substrato sólido que contém um fosfato insolúvel e ferro insolúvel. Noutro aspecto, a invenção refere-se a um processo para a solubilização microbiológica, em condições aeróbias, de um fosfato insolúvel e de ferro insolúvel presentes num solo que contém um fosfato insolúvel e ferro insolúvel.

Noutro aspecto, a invenção refere-se a um processo para promover o crescimento da planta com base na utilização do microorganismo acima mencionado. 8

Numa forma de realização particular, os processos acima mencionados são realizados em condições em que a quantidade de água é de 20% ou menos.

Noutro aspecto, a invenção refere-se a um processo para isolar um microorganismo que tem capacidade de solubilização de fosfato e ferro em condições de humidade extremamente baixas.

Descrição Detalhada da Invenção A invenção refere-se, de um maneira genérica, a bactérias do género Pseudomonas, com capacidade solubilização de fosfato e ferro em condições de humidade extremamente baixas, e suas aplicações, em particular para a sua utilização na solubilização microbiológica de fosfato e ferro, e, opcionalmente, na produção de compostos com potencial como hormonas vegetais úteis para estimular o crescimento da planta. As referidas bactérias são particularmente capazes de utilizar os fosfatos insolúveis, fonte de fósforo, bem como solubilizar ferro insolúvel por meio de, por exemplo, a produção de sideróforos com propriedades quelantes de ferro, que, após formar complexos com o ferro, são subsequentemente reassimilados pelas bactérias para libertar ferro no interior da referida bactéria. As plantas poderiam, em alternativa, incorporar as formas queladas de ferro. Uma vez que o ferro é um elemento essencial para muitos processos fisiológicos, a sua incorporação facilita o crescimento de bactérias e, além disso, limita a disponibilidade de ferro para organismos patogénicos, o que contribui para reduzir a carga de agentes patogénicos. 1. Microorganismo da invenção

Num aspecto, a invenção refere-se a um microorganismo, daqui por diante microorganismo da invenção, da espécie Pseudomonas putida depositado na Colecção Espanhola de 9

Cultivos Tipo (CECT) com número de acesso CECT 7415, que tem capacidade de solubilização de fosfato e ferro em condições de humidade extremamente baixas, ou um mutante do referido microorganismo que mantém a capacidade de solubilização de fosfato e ferro em condições em que a quantidade de água é de 20% ou menos.

Numa forma de realização particular, o microorganismo da presente invenção produz ainda compostos que estimulam o crescimento das plantas em condições em que a quantidade de água é de 20% ou menos.

Essas capacidades em conjunto [solubilização de fosfato e ferro (e, opcionalmente, a produção de compostos que estimulam o crescimento das plantas] não estão associados à espécie P. putida. A quantidade de fosfato que solubiliza o referido microorganismo P. putida CECT 7415 pode atingir até 10% do total presente em fosfato de rocha em 24 horas. Embora o referido microorganismo P. putida CECT 7415 promova o crescimento das plantas em condições de excesso de fosfato, a natureza da hormona ou precursor é desconhecida.

Como aqui utilizado, a expressão "capacidade de solubilização de fosfato e ferro" significa que o microorganismo da invenção é capaz de (i) solubilizar fosfato insolúvel, tal como o fosfato presente, por exemplo, em solos ou no fosfato de rocha [por exemplo, fosfato de cálcio dibásico (CaHPCú.2H2O) , fosfato de cálcio tribásico (Cas (OH) (P04)3, etc.] e utilizá-lo como uma fonte de fósforo, e também de (ii) solubilizar o ferro insolúvel presente, por exemplo, em solos ou no fosfato de rocha [por exemplo, óxidos de ferro, etc.]; a forma mais frequente que os microorganismos solubilizam o ferro é através da produção de sideróforos com propriedades quelantes de ferro; os referidos sideróforos, na presença 10 de ferro, formam complexos de ferro-sideróforo que são reassimilados pelo microorganismo da presente invenção para libertar o ferro no interior do mesmo. A capacidade de solubilização de fosfato do microorganismo pode ser determinada por meio de qualquer processo convencional, por exemplo, a inoculação de uma cultura do referido microorganismo num meio contendo um ou mais fosfatos insolúveis como a única fonte de fósforo (por exemplo, fosfato de tricálcio, etc.), incubação em condições adequadas e contagem dos microorganismos viáveis, como descrito nos Exemplos 1-3 incluídos na presente descrição; nestas condições, a manutenção ou um aumento da densidade da população bacteriana é indicativa de que os referidos microorganismos solubilizam os referidos fosfato/fosfatos insolúveis e os utiliza como fonte de fósforo (Rodriguez, H., Fraga, R. Phosphate solubilizing bactéria and their role in plant growth promotion. Biotecnology Advances. (1999), 17:319-339). Outro ensaio que permite esclarecer se um microorganismo é capaz de solubilizar fosfatos insolúveis compreende semeá-los em meio sólido especializado para esta finalidade, em que o microorganismo gera um microambiente, devido à produção de ácidos orgânicos, que se traduz num halo visível no médio (Nautiyal, C.S. An efficient microbiological growth médium for screening phosphate solubilizing microorganisms. Microbiology Letters. (1999), 170 (1):265-270). A capacidade de solubilização do ferro de um microorganismo pode ser determinada por meio de qualquer processo convencional, por exemplo, a inoculação de uma cultura do referido microorganismo num meio de cultura adequado sem a adição de ferro, a incubação em condições adequadas e a contagem dos microorganismos viáveis, como descrito nos Exemplos 1 e 4 incluídos na presente 11 descrição; nestas condições, a manutenção ou um aumento da densidade da população bacteriana é indicativa de que os referidos microorganismos utilizam ferro, ou, a formação de uma cor amarelo-esverdeado nos sobrenadantes das culturas é indicativa da excreção de certos sideróforos no meio de cultura.

Os processos de solubilização de fosfatos e ferro, são de natureza genética independente uma vez que podem ser obtidos mutantes que solubilizam fosfato e não solubilizam ferro e vice-versa.

Tal com aqui utilizada, a expressão "condições de humidade extremamente baixas" significa que o microorganismo da invenção é tolerante a condições em que a quantidade de água é de 20% ou menos, tipicamente 10% ou menos, geralmente 5% ou menos, por exemplo, cerca de 2%. A referida expressão, "condições de humidade extremamente baixas", aplicada a solos, significa uma baixa capacidade de campo, tal como solos com 10% de capacidade de campo ou menos, por exemplo, solos com 5% de capacidade de campo ou menos, por exemplo, solos com 2% de capacidade de campo. Como se sabe, "capacidade de campo" é a quantidade de humidade do solo ou teor de água mantido no solo depois que o excesso de água foi drenado e a taxa de movimento descendente diminuiu materialmente, o que em geral ocorre em 2-3 dias depois de uma chuva ou irrigação em solos permeáveis de estrutura e textura uniformes. A capacidade de campo é uma característica constante para cada solo e depende principalmente da textura, quantidade de matéria orgânica e grau de compactação do mesmo. O microorganismo da invenção permanece viável em condições de humidade extremamente baixas permitindo a solubilização do fosfato e ferro em condições de humidade extremamente baixas (Exemplo 6). Como consequência disso, o 12 microorganismo da invenção pode ser utilizado para solubilizar fosfato e/ou ferro, e, opcionalmente, para produzir compostos que estimulam o crescimento da planta, em condições de humidade extremamente baixas, o que constitui uma importante vantagem em relação a microorganismos que são menos tolerantes à dessecação. Naturalmente, o microorganismo da invenção também permanece viável em outras condições de humidade, por exemplo, em condições de humidade elevada, normal ou baixa, por exemplo, em solos com 50% de capacidade de campo ou menos, tal como solos com 20% de capacidade de campo ou menos (Exemplo 6) e mesmo em solos com mais de 50% de capacidade de campo. Desse modo, o microorganismo da invenção, que tem alta tolerância em relação à dessecação, pode ser utilizado para solubilizar fosfato e/ou ferro, e, opcionalmente, para produzir compostos que estimulam o crescimento da planta, não só em condições de humidade extremamente baixa, mas também em condições de humidade alta, normal ou baixa. A tolerância em relação à dessecação é uma qualidade importante neste tipo de microorganismos, uma vez que implica que o microorganismo (como o microorganismo da invenção) tem uma maior capacidade de sobreviver em condições em que a água é escassa ou limitada, por exemplo, em condições de stress hídrico, já que o microorganismo é capaz de permanecer no solo durante uma seca, estações secas (por exemplo verão), em que microorganismos não tolerantes à dessecação não podem sobreviver. Desse modo, a aplicação, o manuseamento e a manipulação do microorganismo da invenção são mais simples e mais económicos; além disso, o microorganismo da invenção pode ser utilizado em regiões em que a pluviometria é escassa. 13

Numa forma de realização particular, o microorganismo da invenção é o P. putida estirpe BIRD-1 (CECT 7415).

Numa outra forma de realização particular, o microorganismo da invenção é um mutante do referido P. putida estirpe BIRD-1 (CECT 7415) que mantém capacidade de solubilização de fosfato e ferro em condições em que a quantidade de água é de 20% ou menos. Tal como aqui utilizado, o termo "mutante" inclui qualquer indivíduo ou organismo resultante de uma mutação ou alteração no DNA de um gene de um organismo resultante num caractere (fenótipo) que não é encontrado no tipo selvagem; numa forma de realização específica, o referido mutante é um mutante de P. putida BIRD-1 (CECT 7415) que mantém essencialmente as mesmas características que as da estirpe progenitora [P. putida BIRD-1 (CECT 7415)], e que tem ainda capacidade de solubilização de fosfato e ferro. O microorganismo da presente invenção pode ser utilizado para solubilizar, por meio de um processo microbiológico, fosfato e ferro, em praticamente qualquer nível de humidade (isto é, incluindo em condições de humidade extremamente baixas); em particular, o referido microorganismo da invenção é capaz de solubilizar fosfato/fosfatos insolúveis, usando os mesmos como fonte de fósforo, e ferro insolúvel, por meio da produção de sideróforos com propriedades quelantes que são subsequentemente reassimilados pelo microorganismo para libertar o ferro no interior do microorganismo; o ferro é utilizado pelo microorganismo como um elemento essencial em muitos processos fisiológicos e para facilitar o crescimento do microorganismo, em que o referido microorganismo limita a disponibilidade de ferro para o crescimento do agente patogénico e como um resultado o crescimento do agente patogénico é evitado ou minimizado. 14

Tanto fosfato insolúvel como ferro insolúvel podem ser encontrados em qualquer substrato sólido que contém um fosfato insolúvel e/ou ferro insolúvel, por exemplo, solo, fosfato de rocha, fertilizantes sólidos, etc.; qualquer um dos referidos substratos pode ser utilizado pelo microorganismo da invenção, como fonte de fósforo e/ou de ferro. Numa forma de realização particular, o substrato contém ferro insolúvel, mas que não contém fosfato insolúvel. Numa outra forma de realização particular, o substrato contém ferro insolúvel, mas não contêm fosfato insolúvel. Numa outra forma de realização particular, o substrato contém tanto o fosfato insolúvel como o ferro insolúvel. 0 microorganismo da presente invenção foi isolado a partir de uma amostra de terra de jardim. Resumidamente, uma amostra do referido solo foi suspensa num meio contendo fosfato insolúvel como a única fonte de fósforo e a suspensão resultante foi incubada a uma temperatura compreendida entre 25 °C e 30 °C, com agitação durante uma semana em condições aeróbias; após este período de tempo, diluições adequadas da referida suspensão foram semeadas em placas de meio sólido selectivo contendo uma fonte de carbono, uma fonte de azoto e nutrientes, que foram incubadas entre 1 e 7 dias. As colónias isoladas foram purificadas e classificada como P. putida (ver abaixo). As referidas bactérias foram subsequentemente inoculadas num meio deficiente em ferro, incubadas com agitação e os sobrenadantes das colónias das culturas que adquiriram uma cor amarelo esverdeado típica da excreção de sideróforos no meio de cultura, tal como indicado no Exemplo 1, foram seleccionados. Uma das colónias isoladas, a mais eficiente, foi a chamada P. putida BIRD-1, que foi depositada no CECT com o número de acesso CECT 7415. 15

Após uma análise de tipo microbiologia, a bactéria mais eficiente foi atribuída ao género Pseudomonas. A bactéria isolada é em forma de bastonete e não apresenta qualquer pigmentação quando cultivada em placas de meio mínimo ou meio LB enriquecido (Maniatis et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1982) . Frutose, glucose, ácido acético, ácido succinico, glicerol ou benzoato de metilo podem ser utilizados como fonte de carbono e compostos de amónio, nitratos e nitritos podem ser utilizados como fonte de azoto em meio mínimo tipo M9.

Foi confirmado que a referida estirpe BIRD-1 pertence à espécie P. putida, por meio de análise da sequência parcial do gene que codifica para rRNA 16S, utilizado como marcador filogenético, por meio da utilização do iniciador directo F8 (SEQ ID NO: 1) e iniciador reverso R798 (SEQ ID NO: 2), descrito por Liu et al. (Liu, Z., Lozupone, C., Hamady, M., Bushman, F.D. e Knight, R. Short pyrosequencing reads suffice for accurate microbial community analysis. Nucleic Acids Research. (2007), 35:el20), que amplificam um fragmento de DNA específico da P. putida de 105 nucleótidos (SEQ ID NO: 3). Para esse fim, resumidamente, o DNA total foi isolado da estirpe (P. putida BIRD—1) por meio de lise alcalina, iniciadores F8 (SEQ ID NO: 1) e R798 (SEQ ID NO: 2) foram adicionados, e na presença de uma Taq polimerase, um fragmento de DNA amplificado foi, subsequentemente, sequenciado. A sequência determinada mostra 100% de identidade com a de diferentes estirpes de P. putida.

Numa análise dos genes da estirpe P. putida BIRD-1 (CECT 7415), os genes rpoD, gyrB, trpE, gltA e edd foram parcial ou totalmente amplificados. As sequências dos genes apresentam grande similaridade em relação a de outras 16 estirpes da espécie, embora haja alterações significativas que indicam que é uma variante natural com diferenças genéticas específicas (Exemplo 5).

Numa forma de realização particular, além disso, o microorganismo da invenção tem capacidade de solubilização de fosfato e ferro, a capacidade de produzir compostos que promovem o crescimento de plantas, tais como, por exemplo, compostos que facilitam o desenvolvimento do sistema radicular, o alongamento do caule, a floração, etc., em particamente qualquer nivel de humidade (mesmo incluindo condições de humidade extremamente baixas). A capacidade do microorganismo da invenção de produzir compostos que estimulam do crescimento das plantas pode ser determinada por meio de qualquer processo convencional, por exemplo, por meio de um ensaio de estimulação de crescimento precoce das plantas. Resumidamente, o referido ensaio, que pode ser realizado numa estufa, compreende a semeadura das sementes (por exemplo, milho, cevada, gramineas, AvexIII (mistura de plantas de pastagem), etc.), numa mistura homogeneizada composta por solo agrícola misturado com areia (sílica) e bactérias P. putida BIRD-1 (CECT 7415), de preferência, aderidas a um suporte sólido, e determinar a percentagem de germinação das sementes e o comprimento da haste uma semana depois da semeadura, como descrito nos Exemplos 8 e 9. A capacidade de P. putida BIRD-1 (CECT 7415) de produzir os compostos que estimulam o crescimento das plantas foi testada por meio de um ensaio de estimulação de germinação de sementes que compreendem, resumidamente, semeando as sementes (por exemplo, cevada, milho, gramineas AvexIII, etc.) em placas de Petri contendo um solo adequado previamente misturado com bactérias P. putida BIRD-1 (CECT 7415), numa densidade de população bacteriana adequada, seguido por incubação em 17 condições que permitem a germinação das sementes (por exemplo, 20 °C, no escuro) , e determinar a percentagem de germinação de sementes, tal como indicado nos Exemplos 5-7. Uma cultura biologicamente pura de um microorganismo da invenção é um aspecto adicional da invenção. 2. Isolamento de microorganismos com capacidade de solubilização de fosfato e ferro em condições de humidade extremamente baixas

Num outro aspecto, a invenção refere-se a um processo para isolar um microorganismo, daqui por diante processo de isolamento da invenção, com uma capacidade de solubilização e fosfato de ferro em condições em que a quantidade de água é de 20% ou menos, compreendendo: a) suspender uma amostra de solo que se suspeita conter o referido microorganismo com capacidade de solubilização de fosfato e ferro num meio de cultura sem uma fonte de fósforo; b) adicionar à suspensão obtida na etapa a) uma fonte de fósforo formada por um ou mais fosfatos insolúveis, uma fonte de carbono e uma fonte de azoto; c) incubar a suspensão resultante da etapa b) , em condições aeróbias, que permitem o crescimento dos referidos microorganismos que solubilizam o fosfato insolúvel; d) semear as diluições da suspensão resultante da etapa c) em placas de meio sólido selectivo contendo até 1% (p/p) de um fosfato insolúvel como a fonte única de fósforo; e) incubar as placas semeadas da etapa d) , durante um período de tempo compreendido entre 1 e 7 dias a uma temperatura compreendida entre 15 °C e 42 °C; f) isolar e purificar as colónias dos microorganismos as quais, obtidas após a incubação da etapa e) , são capazes de utilizar o fosfato insolúvel em condições aeróbias; 18 g) opcionalmente, seleccionar e, se desejado, caracterizar as estirpes das colónias de microorganismos isoladas e purificadas na etapa f); h) semear em placas de colónias de microorganismos que, isoladas e purificadas na etapa f) , ou, opcionalmente, seleccionadas na etapa g) , são capazes de utilizar o fosfato insolúvel em condições aeróbias, num meio de cultura deficiente em ferro, contendo uma fonte de carbono e uma fonte de azoto; i) incubar as placas semeadas da etapa h) a uma temperatura compreendida entre 15 °C e 42 °C durante um periodo de tempo compreendido entre 1 e 7 dias, em condições que permitem o crescimento de microorganismos que solubilizam ferro; j) semear as diluições da suspensão resultante da etapa i) em placas de meio de cultura sólido com deficiência em ferro; k) incubar as placas semeadas da etapa j) durante um periodo de tempo compreendido entre 1 e 7 dias a uma temperatura compreendida entre 15 °C e 42 °C; l) isolar e purificar as colónias de microorganismos que, obtidas após a incubação da etapa k), são capazes de obter ferro a partir das concentrações residuais presentes nos meios de cultura e em condições aeróbias; e m) seleccionar e opcionalmente caracterizar as estirpes das colónias de microorganismos isoladas e purificadas na etapa 1); e n) submeter as estirpes das colónias de microorganismos seleccionadas e opcionalmente caracterizadas na etapa m) a um ensaio para avaliar a tolerância em relação à dessecação e seleccionar as estirpes que têm capacidade de solubilizar fosfato e ferro em condições em que a quantidade de água é de 20% ou menos. 19

Como pode ser visto, o processo de isolamento da invenção compreende, em primeiro lugar, a identificação de microorganismos capazes de solubilizar fosfato, e em segundo lugar a identificação de microorganismos, que, além de solubilizar fosfato insolúvel, sejam capazes de solubilizar ferro insolúvel; no entanto, o especialista na técnica vai compreender que também é possível inverter a ordem, isto é, em primeiro lugar, a identificação de microorganismos capazes de solubilizar ferro insolúvel e, em segundo lugar, a identificação de microorganismos, que, além de solubilizar ferro insolúvel, sejam capazes de solubilizar fosfato insolúvel, fazendo as devidas adaptações para isolar microorganismos capazes de solubilizar fosfato e ferro. A amostra de solo que pode ser utilizada na etapa a) do processo de isolamento da invenção pode ser qualquer amostra de um solo que se suspeite conter microorganismos capacidade de solubilização de fosfato e ferro, por exemplo, um solo agrícola, uma terra de jardim, etc., suspeitos de conter tais microorganismos. A referida amostra de solo é suspensa num meio de cultura sem uma fonte de fósforo, tal como um meio A de modificado (Nautilaya, C.S. um meio de crescimento microbiológico eficaz para o rastreio de microorganismos que solubilizam fosfato. FEMS Microbiol. Lett. (1999), 170:265-270), cuja composição específica por litro é: NH4CI, 267 mg; MgSC>4.7H20, 410 mg; KC1, 300 mg; NaCl, 200 mg e 1 mL de uma solução aquosa de citrato de ferro (6 g/L).

De acordo com a etapa b), (i) uma fonte de fósforo formada por um ou mais fosfatos insolúveis, que não são utilizáveis pelos microorganismos, a menos que estejam solubilizados; (ii) uma fonte de carbono e (iii) uma fonte de azoto são adicionados à suspensão obtida na etapa a). 20

Embora, praticamente, qualquer fosfato insolúvel possa ser utilizado, por exemplo, fosfato de cálcio dibásico (CaHPCú. 2H20) , fosfato de cálcio tribásico (CAs (OH) (P04) 3, etc., e suas misturas; numa forma de realização particular, uma mistura de fosfato de cálcio insolúvel compreendendo fosfato de cálcio dibásico e fosfato de cálcio tribásico é adicionada a uma proporção de 1:1 (p:p) . A quantidade de fosfato ou fosfatos insolúveis que podem ser adicionados à suspensão obtida na etapa a) pode variar dentro de uma vasta gama; no entanto, numa forma de realização particular, a quantidade de fosfato insolúvel que é adicionado à referida suspensão está compreendida entre 0,1 e 90 g por litro, por exemplo, 0,1, 0,5, 1,5, 10, 25, 50, 75 ou 90 g/L. Numa forma de realização específica, entre 0,1 e 90 g por litro de uma mistura de fosfato de cálcio insolúvel compreendendo fosfato de cálcio dibásico e fosfato de cálcio tribásico é adicionada a uma proporção de 1:1 (p:p).

Qualquer fonte de carbono assimilável pelos microorganismos a serem identificados pode ser utilizada como uma fonte de carbono, por exemplo, glicose, benzoato, acetato, etc. A quantidade de fonte de carbono que pode ser adicionada à suspensão obtida na etapa a) pode variar dentro de uma vasta gama; no entanto, numa forma de realização particular, a fonte de carbono é adicionada numa quantidade adequada para atingir uma concentração compreendida entre 10 e 20 mM.

Qualquer fonte de azoto assimilável pelos microorganismos a serem identificados pode ser utilizada como uma fonte de azoto, por exemplo, compostos de amónio, nitrato, ureia, aminoácidos, etc. A quantidade de fonte de azoto que pode ser adicionada à suspensão obtida na etapa a) pode variar dentro de uma vasta gama; no entanto, numa forma de 21 realização particular, a fonte de azoto é adicionada numa quantidade adequada para atingir uma concentração compreendida entre 5 e 10 mM.

Na etapa c), a suspensão resultante da etapa b) é incubada a uma temperatura compreendida entre 15 °C e 42 °C, de preferência entre 25 °C e 30 °C, durante um periodo de tempo compreendido entre 1 e 7 dias, com agitação opcional, em condições aeróbias, permitindo o crescimento de microorganismos que solubilizam o fosfato insolúvel. Subsequentemente [etapa d) ] , diluições da suspensão resultante da etapa c) são propagadas em placas de meio sólido selectivo contendo até 1% (p/p) de um fosfato insolúvel como a única fonte de fósforo. Embora praticamente qualquer fosfato insolúvel possa ser utilizado, por exemplo, fosfato de cálcio dibásico, fosfato de cálcio tribásico, etc., e suas misturas, numa forma de realização particular, a referida fonte de fósforo é composta de fosfato de cálcio tribásico; noutra forma de realização particular, a referida fonte de fósforo compreende fosfato de cálcio dibásico e fosfato de cálcio tribásico. Em seguida, as placas de propagação da etapa d) são incubadas a uma temperatura compreendida entre 15 °C e 42 °C, de preferência entre 25 °C e 30 °C, durante um periodo de tempo compreendido entre 1 e 7 dias [etapa e)], com agitação opcional.

Posteriormente, na etapa f) , as colónias de microorganismos que, obtidas após a incubação da etapa e), são capazes de utilizar o fosfato insolúvel (por exemplo, fosfato de cálcio dibásico, fosfato de cálcio tribásico, etc., e suas misturas) em condições aeróbias são isoladas e purificadas, e em seguida, se desejado, as estirpes, de preferência as estirpes mais eficientes, das colónias de microorganismos isoladas e purificadas na etapa f) são 22 seleccionadas [etapa g) ] e, opcionalmente caracterizadas. Na prática, é aconselhável caracterizar os microorganismos com a finalidade de seleccionar as fontes de carbono e azoto a serem adicionadas ao meio de cultura subsequente. Bactérias dos géneros Pseudomonas, Alcaligenes, Agrobacterium, Mycobacterium, Rhizobium, etc., foram identificadas; no entanto, numa forma de realização particular, a estirpe mais eficiente era uma estirpe Pseudomonas sp.

As colónias de microorganismos que, isoladas e purificadas, na etapa f), ou, opcionalmente, seleccionados na etapa g), são capazes de utilizar o fosfato insolúvel (por exemplo, fosfato de cálcio dibásico, fosfato de cálcio tribásico, etc., e suas misturas), em condições aeróbias, são semeadas [etapa h) ] num meio de cultura deficiente em ferro contendo uma fonte de carbono e uma fonte de azoto, mas ao qual o meio de ferro não é adicionado. Embora praticamente qualquer meio de cultura deficiente em ferro possa ser utilizado, numa forma de realização particular, o meio de King é utilizado, a composição da qual por litro é como se segue: 10 g de peptona de carne, 10 g de peptona de caseína; 1,5 g de KH2PO4; 1,5 g de MgSCN solidificado com ágar (15 g/L).

Qualquer fonte de carbono assimilável pelos microorganismos a serem identificados pode ser utilizada como uma fonte de carbono, por exemplo, benzoato, glicerol, citrato, glicose, etc. Numa forma de realização particular, o microorganismo pertencente ao género Pseudomonas e a fonte de carbono compreende benzoato de sódio, glicerol, citrato de sódio, glicose ou outra fonte de carbono assimilável, de preferência, benzoato de sódio. A quantidade de fonte de carbono que pode estar presente no referido meio com deficiência em ferro pode variar dentro 23 de uma vasta gama; no entanto, numa forma de realização particular, a referida fonte de carbono está presente numa concentração compreendida entre 10 e 20 mM. Numa forma de realização especifica, a fonte de carbono utilizada é seleccionada entre benzoato de sódio 10 mM, glicerol 15 mM, citrato de sódio 10 mM, glicose 16 mM, ou qualquer outra fonte de carbono assimilável na concentração apropriada. Qualquer fonte de azoto assimilável pelos microorganismos a serem identificados pode ser utilizada como uma fonte de azoto, por exemplo, compostos de amónio, nitrito, ureia, aminoácidos, etc. A quantidade de fonte de azoto que pode estar presente no referido meio com deficiência em ferro pode variar dentro de uma vasta gama; no entanto, numa forma de realização particular, a fonte de azoto está presente numa concentração compreendida entre 5 e 10 mM.

As bactérias são propagadas utilizando a técnica de arrasto e é determinado que as culturas sejam puras.

Em seguida, na etapa i), as placas resultantes da etapa h) são incubadas a uma temperatura compreendida entre 15 0 C e 42 °C, de preferência entre 20 O O 0) 00 o o C, durante um período de tempo compreendido entre 1 e 7 dias, com agitação opcional, em condições que permitam o crescimento de microorganismos que solubilizam ferro insolúvel. Quando os referidos microorganismos estão presentes, é observada a formação de colónias individuais e, nas áreas de maior densidade, é observada a formação de uma cor amarela-verde indicativa da produção sideróforos do tipo pioverdina. As pioverdinas são agentes quelantes de ferro que normalmente produzem Pseudomonas do grupo fluorescente (Cox, C.D., Adams, P. Siderophore activity of pyoverdin for Pseudomonas aeruginosa. Infection and Immunity. (1985), 48:130-138) e são formadas por um derivado de cromóforo de 2,3-diamino-6,7-di-hidroxiquinolina, um péptido meio 24 ligado ao cromóforo e uma cadeia lateral ligada ao átomo de azoto da posição C-3 do cromóforo. A composição das cadeias peptídicas é típica das estirpes. As pieoverdinas quelam o ferro numa proporção de 1:1.

Posteriormente, na etapa j), diluições da suspensão resultantes da etapa i) são propagadas em placas de meio sólido de cultura deficiente em ferro, tal como meio A sólido selectivo mínimo que não contém ferro adicionado (King, E.O., Ward, W.K. e Raney, D.E. Media for the demonstration of pyocyanin and fluorescein, J. Lab. Clin. Med. (1954), 44: 301-307) ou em meio de King, e as placas semeadas na etapa j) são incubadas [etapa k) ] , durante um período de tempo compreendido entre 1 e 7 dias a uma temperatura compreendida entre 15 °C e 42 °C, de preferência entre 20 °C e 30 °C, com agitação opcional.

Em seguida, na etapa 1) , as colónias de microorganismos que, obtidas após a incubação da etapa k) , são capazes de obter ferro a partir das concentrações residuais presentes no meio de cultura em condições aeróbias são isoladas e purificadas, e, em seguida, se desejado, as estirpes, de preferência as estirpes mais eficientes, das colónias de microorganismos isoladas e purificadas na etapa 1) são seleccionadas [etapa m) ] e, opcionalmente caracterizadas. Embora tenham sido identificadas bactérias dos géneros Pseudomonas, Alcaligenes, Agrobacterium, Mycobacterium, Rhizobium, etc., capazes de solubilização de fosfato insolúvel e ferro insolúvel, numa forma de realização particular, a estirpe mais eficiente era a estirpe identificada como P. putida BIRD-1, que foi depositada no CECT com o número de acesso CECT 7415. A referida estirpe tem a vantagem de produzir ainda compostos que promovem o crescimento das plantas (compostos com propriedades de hormonas vegetais). 25

Além disso, na etapa n) as estirpes das colónias de microorganismos seleccionadas e opcionalmente caracterizadas na etapa m) são submetidas a um ensaio para avaliar a tolerância em relação à dessecação. Pode ser utilizado qualquer ensaio convencional para avaliar a tolerância em relação à dessecação. Numa forma de realização particular, a tolerância em relação à dessecação das estirpes seleccionadas na etapa m) é determinada na etapa n) pela adição de estirpes ao teste de solos cuja humidade é prefixada em valores diferentes de capacidade de campo (por exemplo, 50, 20, 10 e 2%) e verificação do número de células viáveis da estirpe depois de um periodo de tempo determinado (por exemplo, 15 dias) , tal como é divulgado no Exemplo 6. A etapa n) permite identificar aquelas estirpes que são mais tolerantes em relação à dessecação, bem como os níveis de humidade relativa em que as diferentes estirpes podem sobreviver, o que é importante para garantir a viabilidade da estirpe.

Numa forma de realização particular, o microorganismo que tem capacidade de solubilização de fosfato e ferro obtido de acordo com o processo de isolamento da invenção é o identificado como P. putida BIRD-1 (CECT 7415). Além disso, tal como mostrado no Exemplo 6, P. putida BIRD-1 (CECT 7415). Tolera condições de humidade extremamente baixas.

Numa outra forma de realização particular, o microorganismo que capacidade solubilização de fosfato e ferro obtido de acordo com o processo de isolamento da invenção é um mutante da referida bactéria P. putida BIRD-1 (CECT 7415) que tem essencialmente as mesmas características que as da estirpe progenitora e ainda tem capacidade de solubilização de fosfato de ferro em condições em que a quantidade de água é de 20% ou menos. 26

Numa outra forma de realização particular, o microorganismo isolado de acordo com o processo de isolamento da invenção é capaz de solubilizar tanto fosfato como ferro em condições em que a quantidade de água é de 20% ou menos (isto é, condições de extrema dessecação), permanecendo viável mesmo quando a humidade é de apenas 2%. 3. Aplicações

Os microorganismos com fosfato insolúvel e capacidades de solubilização de ferro insolúveis fornecidas por esta invenção pode ser usada para solubilizar os fosfatos insolúveis e ferro presente em substratos sólidos (por exemplo, solos, pedras, etc.).

Além disso, dado que os microorganismos da invenção têm, para além da capacidade de solubilização de fosfato e ferro, a capacidade de produzir compostos que promovem o crescimento da planta, que pode ser utilizada para estimular a germinação de sementes e/ou o crescimento da planta, em particular o crescimento da planta nas fases iniciais. Uma vez mais, uma vantagem desta invenção é que a produção dos referidos compostos que promovem o crescimento das plantas pelos microorganismos da invenção pode ocorrer particamente a qualquer nível de humidade.

Para facilitar a aplicação e incorporação dos microorganismos da invenção e com o propósito de promover a sua proliferação e interacção com as plantas, é vantajoso fixar ou aderir os referidos microorganismos sobre um suporte sólido adequado.

Portanto, num outro aspecto, a invenção refere-se a um suporte sólido activo, daqui por diante, o suporte sólido activo da invenção, que compreende um suporte sólido e um microorganismo da invenção. 0 referido suporte sólido é um suporte sólido inerte para os microorganismos da invenção 27 e as plantas e deve, vantajosamente, ter uma elevada área de superfície específica, de modo que possa ter uma capacidade de adsorção elevada para adsorver os microorganismos da invenção (Busscher, H.J. e Weerkamp, A.H. Specific and non-specific interactions in bacterial adhesion to solid substrate. FEMS Microbiol. Lett. (1999), 46: 465-173). Praticamente qualquer suporte sólido que satisfaz as referidas condições pode ser usado na presente invenção; exemplos ilustrativos e não limitativos de suportes sólidos que podem ser utilizados incluem argila, por exemplo, bentonita, sepiolita, etc.; um resíduo verde, por exemplo, pó de cortiça, celulose, etc.; talco, etc., e misturas destes, desde que adsorvam pelo menos 105 unidades formadoras de colónias (cfu, do inglês Colony Forming Units) por grama de suporte sólido, tipicamente, pelo menos, 106, vantajosamente, pelo menos, 107, de preferência pelo menos 108, mais preferencialmente pelo menos 109, de modo ainda mais preferido, pelo menos, 1010 cfu/g de suporte sólido. 0 referido suporte sólido activo da invenção pode ser obtido por meio de métodos convencionais, misturando o referido suporte sólido com uma cultura contendo o microorganismo da invenção; a referida mistura é levada a cabo na proporção adequada, dependendo das cfu para ser contido 1 grama de suporte sólido. Numa forma de realização particular, a referida cultura compreende, pelo menos, 103 ufc, tipicamente, pelo menos, 105, vantajosamente, pelo menos, 107, de preferência pelo menos 109, ufc. Em geral, a mistura do suporte sólido com a cultura que contém o microorganismo da invenção pode ser levada a cabo com base numa proporção de peso:volume (p:v) amplamente variável, dependendo, entre outros factores, das cfu presentes na cultura e as cfu por grama de suporte 28 sólido que será obtida no suporte sólido activo da invenção; no entanto, numa forma de realização particular, a referida proporção [suporte sólido]:[cultura contendo o microorganismo da invenção] está compreendida entre 1:0,01 e 1:1 (p:v); numa forma de realização especifica, 1 mL de cultura contendo 107 do microorganismo da invenção é misturado com 1 grama de suporte sólido.

Noutro aspecto, a invenção refere-se a um fertilizante suplementado, daqui por diante fertilizante suplementado da invenção, que compreende um fertilizante e um microorganismo da invenção. Praticamente qualquer fertilizante sólido ou mesmo liquido pode ser utilizado; exemplos ilustrativos não limitativos dos referidos fertilizantes sólidos incluem os fertilizantes do tipo NPK sólidos, etc.; qualquer fertilizante liquido com um pH compreendido entre 2 e 10 também pode ser utilizado; exemplos ilustrativos não limitativos dos referidos fertilizantes líquidos incluem fertilizantes baseados em ácidos fúlvicos, fertilizantes líquidos, com uma composição diferente de NPK, tais como misturas a 16:2:4, 20:5:0, etc., ou outros tipos de fertilizantes em gotas com uma composição de NPK a 8:9:9, 16:4:4, etc. O microorganismo da invenção pode ser adicionado como tal ao fertilizante ou pode ser, alternativamente, e de preferência aderida a um suporte sólido, isto é, na forma de um suporte sólido activo da invenção, como mencionado anteriormente. O referido fertilizante suplementado da invenção pode ser obtido por meio de métodos convencionais, misturando o referido fertilizante com uma cultura contendo o microorganismo da invenção; a referida mistura é levada a cabo na proporção adequada, consoante a cfu que é para ser contida no fertilizante. Numa forma de realização 29 particular, a referida cultura compreende, pelo menos, 103 cfu, tipicamente, pelo menos, 105, vantajosamente, pelo menos, 107, de preferência pelo menos 109 cfu. Em geral, a mistura do fertilizante com a cultura contendo o microorganismo da invenção pode ser levada a cabo com base numa proporção de peso:volume (p:v) amplamente variável, dependendo, entre outros factores, das cfu presentes na cultura e a cfu por unidade de medida (g ou mL) de fertilizante a ser obtido no fertilizante suplementado da a invenção; no entanto, numa forma de realização particular, a referida proporção [fertilizante]:[cultura contendo o microorganismo da invenção] é compreendida entre 1:0,01 e 1:1 (p:v); numa forma de realização especifica, entre 0,01 e 1 mL de cultura contendo 107 do microorganismo da invenção são misturados com 1 g de fertilizante sólido; noutra forma de realização especifica, 1 mL de cultura contendo 107 do microorganismo da invenção é misturado com 1 mL de fertilizante líquido com um pH compreendido entre 2 e 10.

Da mesma forma, se desejado, um adesivo adequado pode ser utilizado para facilitar a adesão dos microorganismos da invenção ao fertilizante. Praticamente qualquer adesivo agricolamente aceitável pode ser utilizado; exemplos ilustrativos não limitativos dos referidos adesivos incluem goma arábica, polímeros à base de alginato (por exemplo, alginato de cálcio, etc.), etc. Neste caso, a quantidade de adesivo que pode ser utilizada pode variar dentro de uma vasta gama; no entanto, numa forma de realização particular, o referido adesivo está presente no fertilizante suplementado da invenção, em particular, num fertilizante sólido suplementado com microorganismos da invenção, proporcionado por esta invenção, numa proporção igual ou inferior a 1% em peso do peso total. A presença 30 do microorganismo da invenção no fertilizante sólido contribuiria não só para reduzir o problema ambiental referente à acumulação de fosfato insolúvel sobre em solos arvenses, uma vez que iria permitir a sua assimilação, mas também contribuir para reduzir o crescimento do agente patogénico na superfície tratada, uma vez que iria remover o ferro da área circundante, um elemento necessário para os agentes patogénicos. Os fertilizantes sólidos assim fornecidos iriam desempenhar um papel duplo no desenvolvimento das plantas, a saber: (i) facilitar os nutrientes e estimulantes de crescimento e (ii) impedir o crescimento do agente patogénico (por exemplo, fungos, bactérias, etc.) para as plantas.

Num outro aspecto, a invenção refere-se a uma semente suplementada, daqui por diante semente suplementada da invenção, que compreende uma semente e um microorganismo da invenção. Praticamente qualquer semente de qualquer planta pode ser utilizada; exemplos ilustrativos não limitativos das referidas sementes incluem sementes de plantas de interesse agrícola, incluindo plantas de interesse na alimentação humana ou animal, plantas de interesse decorativo, plantas de interesse de energia, etc. (aveia, cevada, milho, trigo, gramíneas, sorgo, roseiras, gerânios, margaridas, etc.). O microorganismo da invenção pode revestir completa ou parcialmente a semente. A semente suplementada a invenção pode ser obtida por meio de métodos convencionais, por exemplo, a imersão das sementes numa suspensão (ou cultura) que compreende o microorganismo da invenção, ou, alternativamente, pulverizar a referida suspensão sobre as sementes, etc. 0 microorganismo da invenção pode ser adicionado como tal à semente ou pode ser aderido a um suporte sólido, isto é, na forma de um suporte sólido activo da invenção, como 31 mencionado anteriormente. Como mencionado anteriormente, numa forma de realização particular, a referida suspensão (ou cultura) compreende, pelo menos, 103 ufc, tipicamente, pelo menos 105, vantajosamente, pelo menos 107, de preferência pelo menos 109 ufc. Condições adequadas são geralmente seleccionadas para se obter uma semente suplementada da invenção com a quantidade desejada do microorganismo da invenção. Numa forma de realização particular, a referida proporção de [semente]:[cultura contendo o microorganismo da invenção] é compreendida entre 1:0,01 e 1:1 (p:v); numa forma de realização especifica, 1 mL de cultura contendo 107 do microorganismo da invenção é misturado com 1 grama de sementes.

Da mesma forma, se desejado, um adesivo adequado pode ser utilizado para facilitar a adesão dos microorganismos da invenção às sementes. Praticamente qualquer adesivo agricolamente aceitável pode ser utilizado, como mencionado anteriormente; exemplos ilustrativos não limitativos dos referidos adesivos incluem goma arábica, polímeros à base de alginato (por exemplo, alginato de cálcio, etc.), etc.; o referido adesivo pode ser adicionado na quantidade adequada, por exemplo, goma arábica a 0,1% ou uma suspensão de alginato de cálcio a 0,1%, que pode conter os microorganismos da invenção aprisionados no gel.

Num outro aspecto, a invenção refere-se a um processo para a solubilização microbiológica, em condições aeróbias, de um fosfato insolúvel num substrato sólido que contém um fosfato insolúvel, compreendendo colocar o referido substrato sólido a ser tratado em contacto com um microorganismo da invenção. Numa forma de realização particular, o referido microorganismo da invenção faz parte de um suporte sólido activo da invenção. Desse modo, 32 numa forma de realização particular, o referido processo compreende colocar o referido substrato sólido contendo um fosfato insolúvel a ser tratado em contacto com uma cultura de um microorganismo da invenção; ou, alternativamente, com um suporte sólido activo da invenção Numa forma de realização especifica, o referido processo compreende: a) inocular uma mistura que compreende o referido substrato sólido contendo um fosfato insolúvel a ser tratado e água com uma cultura que compreende um microorganismo da invenção; e, se desejado, b) remover os referidos microorganismos.

Praticamente qualquer tipo de substrato sólido contendo um fosfato insolúvel pode ser tratado de acordo com este processo para reduzir completa ou parcialmente o teor de fosfato insolúvel; no entanto, numa forma de realização particular, o referido substrato sólido contendo um fosfato insolúvel a ser tratado é o fosfato de rocha, como por exemplo o fosfato de rocha utilizado para produzir fertilizantes de fosfato com um teor de fosfato insolúvel variável.

Para realizar este processo, o substrato sólido contendo um fosfato insolúvel a ser tratado é misturado com água e a mistura resultante é posta em contacto com uma cultura de um microorganismo da invenção, ou com um suporte sólido activo da invenção, a uma densidade de população bacteriana que pode variar dentro de uma vasta gama. Numa forma de realização particular, pelo menos, 103 microorganismos da invenção por mL de água são inoculados. Após a inoculação, os microorganismos da invenção são deixados a actuar e após 1 a 24 horas, se desejado, os referidos microorganismos são removidos por meio de métodos convencionais, por exemplo por meio de decantação, 33 precipitação com electrólitos, centrifugação, etc. Se desejado, os microorganismos removidos da invenção podem ser reutilizados num novo processo para a solubilização microbiológica, em condições aeróbias, de um fosfato insolúvel e/ou ferro insolúvel, num substrato sólido, ou em solo contendo um fosfato insolúvel e/ou ferro insolúvel Este processo pode ser realizado num reactor, tanque ou semelhante, em que o substrato sólido contendo um fosfato insolúvel a ser tratado é introduzido, devidamente equipado com meios de alimentação e drenagem de água, substrato sólido, inoculação de microorganismos da invenção e recuperação dos mesmos. Se necessário, a mistura (substrato sólido, a água e microorganismos da invenção, opcionalmente, fazendo parte de um suporte sólido activo da invenção) é completada com uma fonte de carbono e/ou com uma fonte de azoto e/ou nutrientes essenciais, com a finalidade de facilitar a sobrevivência dos microorganismos da invenção. A titulo de ilustração, quantidades adequadas de solução de micronutrientes, juntamente com quantidades adequadas de magnésio, cobalto e molibdénio, tipicamente na ordem micromolar, podem ser adicionadas para optimizar o processo; no entanto, em qualquer caso, a escolha e a quantidade de nutrientes e micronutrientes a serem adicionados dependerá da composição do substrato sólido contendo um fosfato insolúvel (por exemplo, fosfato de rocha) a ser tratado e da demanda microbiológica.

Este processo pode ser utilizado para solubilizar todo ou parte do fosfato insolúvel presente no substrato sólido contendo um fosfato insolúvel, por exemplo, fosfato de rocha utilizado para a produção de fertilizantes de fosfato, com o objectivo de reduzir o teor de fosfato 34 insolúvel presente nos referidos fertilizantes de fosfato obtido a partir do referido fosfato de rocha.

Noutro aspecto, a invenção refere-se a um processo para a solubilização microbiológica, em condições aeróbias, de fosfato insolúvel presente num solo contendo um fosfato insolúvel, em que o referido solo tem qualquer nivel de humidade, o processo compreendendo pôr o referido solo a ser tratado contendo o fosfato insolúvel e tendo qualquer nivel de humidade em contacto com um microorganismo da invenção. Numa forma de realização particular, o referido processo compreende: injectar, uma ou mais vezes, no referido solo a ser tratado, uma cultura de um microorganismo da invenção contendo um fosfato insolúvel e tendo qualquer nivel de humidade; ou alternativamente adicionar ao referido solo contendo um fosfato insolúvel e tendo qualquer nivel de humidade, um suporte sólido activo da invenção; ou alternativamente semear o referido solo contendo um fosfato insolúvel e tendo qualquer nivel de humidade, com uma semente suplementada da invenção, ou alternativamente adicionar ao referido solo contendo um fosfato insolúvel e tendo qualquer nivel de humidade um fertilizante suplementado da invenção, ou alternativamente semear o referido solo contendo um fosfato insolúvel e tendo qualquer nivel de humidade com uma semente suplementada da invenção.

Numa forma de realização especifica, o referido processo para a solubilização microbiológica, em condições aeróbias, de fosfato insolúvel presente num solo contendo um fosfato insolúvel e tendo qualquer nivel de humidade é realizado por meio de injecção dos microorganismos da invenção no 35 solo a ser tratado, por exemplo por meio de um processo que compreende: a) a primeira injecção no referido solo de uma cultura contendo um microorganismo da invenção; e b) injecções sucessivas de culturas que contêm os microorganismos da invenção até a completa ou parcial solubilização do fosfato insolúvel presente no solo a ser tratado.

Praticamente qualquer tipo de solo que contém um fosfato insolúvel (por exemplo, fosfato de cálcio dibásico, fosfato de cálcio tribásico, etc., e suas misturas) pode ser tratado de acordo com este processo para a redução completa ou parcialmente do teor de fosfato insolúvel presente no referido solo a ser tratado; no entanto, numa forma de realização particular, o referido solo é uma camada superficial de solo agrícola, uma camada superficial de solo tratado com fertilizantes, etc. Se necessário, o solo a ser tratado é suplementado com uma fonte de carbono e/ou com uma fonte de azoto e/ou com nutrientes essenciais para facilitar a sobrevivência dos microorganismos da invenção. 0 nível de humidade do solo pode variar dentro de um ampla gama (condições de humidade alta, normal, baixa ou extremamente baixa); esse modo, os solos com 50% de capacidade de campo ou menos, tais como solos com 20% de capacidade de campo ou menos, por exemplo, solos com 10% de capacidade de campo ou menos, mesmo solos com 2% de capacidade de campo podem ser utilizados para realizar o processo acima definido, bem como solos com mais de 50% de capacidade de campo. Isto é devido às características do microorganismo da invenção que é extremamente tolerante em relação à dessecação e permanece viável e funcional em condições de humidade extremamente baixas, tal como em 36 solos com apenas 2% de capacidade de campo. As referidas características constituem uma vantagem importante do microorganismo da invenção em relação a outros microorganismos que são menos tolerantes em relação à dessecação.

Os microorganismos da invenção são injectados com o objectivo de atingir uma alta densidade de células no solo a ser tratado , por exemplo , igual ou superior a 103 microorganismos da invenção por grama de solo a ser tratado, tipicamente igual a ou superior a O \—1 microorganismos da invenção por grama de solo a ser tratado, de preferência, igual ou superior a 105 microorganismos da invenção por grama de solo a ser tratado, com a finalidade de facilitar a solubilização de fosfato insolúvel.

Numa forma de realização especifica, o referido processo para a solubilização microbiológica, em condições aeróbias, de fosfato insolúvel presente num solo contendo um fosfato insolúvel e tendo qualquer nivel de humidade, é levado a cabo por meio de adição ao referido solo a ser tratado de um suporte sólido activo da invenção, que compreende um microorganismo da invenção. As caracteristicas do referido suporte sólido activo da invenção foram descritas anteriormente. A quantidade de suporte sólido activo da invenção que é adicionada ao solo a ser tratado (o solo que contém um fosfato insolúvel com qualquer nivel de humidade) pode variar dentro de uma vasta gama; no entanto, numa forma de realização particular, a quantidade do referido suporte sólido activo da invenção, que é adicionada ao solo a ser tratado é igual ou superior a 0,01 kg de suporte sólido activo da invenção por hectare (Ha) de solo a ser tratado, tipicamente igual ou superior a 0,1 kg/Ha, de preferência igual ou superior a 0,5 kg/Ha 37 de solo a ser tratado, ainda mais preferencialmente igual ou superior a 1 kg/Ha de solo a ser tratado, com a finalidade de facilitar a solubilização do fosfato insolúvel.

Numa outra forma de realização especifica, o referido processo para a solubilização microbiológica, em condições aeróbias, de fosfato insolúvel presente num solo contendo um fosfato insolúvel e com qualquer nivel de humidade, é levada a cabo por meio da adição ao referido solo a ser tratado de um fertilizante suplementado da invenção, que compreende um microorganismo da invenção. As caracteristicas do referido fertilizante suplementado da invenção foram descritas anteriormente. A quantidade de fertilizante suplementado da invenção, que é adicionada ao solo a ser tratado (o solo que contém um fosfato insolúvel e com qualquer nivel de humidade) pode variar dentro de uma vasta gama, dependendo, entre outros factores, da quantidade de fosfato insolúvel presente no solo a ser tratado e da quantidade de microorganismos da invenção presentes no fertilizante suplementado da invenção.

Numa outra forma de realização especifica, o referido processo para a solubilização microbiológica, em condições aeróbias, de fosfato insolúvel presente num solo contendo fosfato insolúvel e com qualquer nivel de humidade é realizado por meio de semeadura do referido solo a ser tratado com uma semente da invenção que compreende um microorganismo da invenção. As caracteristicas da referida semente da invenção foram descritas anteriormente. A quantidade de sementes suplementadas da invenção que são semeadas no solo a ser tratado (solo contendo de fosfato insolúvel e com qualquer nivel de humidade) pode variar dentro de uma vasta gama, dependendo da densidade requerida pelo agricultor. 38

Os processos anteriormente descritos para a solubilização microbiológica de fosfatos insolúveis fornecem inúmeras vantagens, incluindo o seguinte: elevada especificidade na solubilização dos fosfatos insolúveis; funcionam numa ampla gama de concentrações de fosfato, tipicamente entre 0,01% e 95% (p/p) de fosfato; e são altamente versáteis uma vez que podem ser utilizados in situ para solubilizar os referidos compostos em solos (que têm qualquer nivel de humidade, mesmo condições de humidade extremamente baixas) ou em reactores de solubilização de fosfato, que podem ser utilizados como fertilizante per se ou em mistura com outros compostos.

Num outro aspecto, a invenção refere-se a um processo para a solubilização microbiológica, em condições aeróbias, de ferro insolúvel num substrato sólido contendo ferro insolúvel, compreendendo o pôr o referido substrato sólido em contacto com um microorganismo da invenção. Numa forma de realização particular, o referido microorganismo da invenção faz parte de um suporte sólido activo da invenção. Portanto, numa forma de realização particular, o referido processo compreende pôr o referido substrato sólido contendo ferro insolúvel a ser tratado em contacto com uma cultura de um microorganismo da invenção; ou, alternativamente, com um suporte sólido activo da invenção. Numa forma de realização especifica, o referido processo compreende: a) inocular uma mistura que compreende o referido substrato sólido contendo um fosfato insolúvel a ser tratado e água com uma cultura que compreende um microorganismo da invenção; e, se desejado, b) remover os referidos microorganismos. 39

Praticamente qualquer tipo de substrato sólido contendo ferro insolúvel (por exemplo, ferro insolúvel do tipo óxido de ferro ou qualquer outro tipo de ferro) pode ser tratado de acordo com este processo para reduzir completa ou parcialmente o teor de ferro insolúvel presente no referido substrato sólido a ser tratado; no entanto, numa forma de realização particular, 0 referido substrato sólido contendo ferro insolúvel a ser tratado é um solo, tal como uma camada superficial de solo agrícola, uma camada superficial de solo tratado com fertilizantes, etc. Para realizar este processo, o substrato sólido contendo ferro insolúvel a ser tratado é misturado com água e a mistura resultante é posta em contacto com uma cultura de um microorganismo da invenção, ou com um suporte sólido activo da invenção, a uma densidade de população bacteriana que pode variar dentro de uma vasta gama. Numa forma de realização particular, pelo menos, 103 microorganismos da invenção por mL de água são inoculados.

Após a inoculação, os microorganismos da invenção são deixados a actuar e após 1 a 24 horas, se desejado, os referidos microorganismos são removidos por meio de métodos convencionais, por exemplo, por meio de decantação, precipitação com electrólitos, centrifugação, etc. Se desejado, os microorganismos removidos da invenção podem ser reutilizados num novo processo para a solubilização microbiológica, em condições aeróbias, de fosfato insolúvel e/ou de ferro insolúvel num substrato sólido ou num solo que contém fosfato insolúvel e/ou de ferro insolúvel.

Este processo pode ser realizado num reactor, tanque ou semelhante, em que o substrato sólido contendo ferro insolúvel a ser tratado é introduzido, devidamente equipado com meios de alimentação e drenagem de água, 40 substrato sólido, inoculação de microorganismos da invenção e recuperação dos mesmos. Se necessário, a mistura (substrato sólido, água e microorganismos da invenção, opcionalmente, fazendo parte de um suporte sólido activo da invenção) é suplementada com uma fonte de carbono e/ou com uma fonte de azoto e/ou nutrientes essenciais, com a finalidade de facilitar a sobrevivência dos microorganismos da invenção. A titulo de ilustração, quantidades adequadas de solução de micronutrientes, juntamente com quantidades adequadas de magnésio, cobalto e molibdénio, tipicamente na ordem micromolar, podem ser adicionadas para optimizar o processo; no entanto, em qualquer caso, a escolha e a quantidade de nutrientes e micronutrientes a serem adicionados vai depender da composição do substrato sólido contendo ferro insolúvel a ser tratado e da demanda microbiológica.

Este processo pode ser utilizado para solubilizar todo ou parte do ferro insolúvel presente no substrato sólido contendo ferro insolúvel, com o objectivo de reduzir o teor de ferro insolúvel presente no referido substrato sólido.

Noutro aspecto, a invenção refere-se a um processo para a solubilização microbiológica, em condições aeróbias, de ferro insolúvel presente num solo contendo ferro insolúvel, em que o referido solo tem qualquer nível de humidade, o processo compreendendo pôr o referido solo contendo ferro insolúvel a ser tratado em contacto com um microorganismo da invenção. Numa forma de realização particular, o referido processo compreende: injectar, uma ou mais vezes, no referido solo a ser tratado, uma cultura de um microorganismo da invenção contendo ferro insolúvel e tendo qualquer nível de humidade; ou alternativamente 41 adicionar ao referido solo contendo ferro insolúvel e tendo qualquer nivel de humidade, um suporte sólido activo da invenção; ou alternativamente adicionar ao referido solo contendo ferro insolúvel e tendo qualquer nivel de humidade um fertilizante suplementado da invenção, ou alternativamente semear o referido solo contendo ferro insolúvel e tendo qualquer nivel de humidade com uma semente suplementada da invenção.

Numa forma de realização especifica, o referido processo para a solubilização microbiológica, em condições aeróbias, de ferro insolúvel presente num solo contendo ferro insolúvel é levado a cabo por meio de injecção de microorganismos da invenção no solo a ser tratado, por exemplo, por meio de um processo que compreende: a) a primeira injecção no referido solo de uma cultura contendo um microorganismo da invenção; e b) injecções sucessivas de culturas que contêm os microorganismos da invenção até a completa ou parcial solubilização do ferro insolúvel presente no solo a ser tratado.

Praticamente qualquer tipo de solo contendo ferro insolúvel (por exemplo, ferro insolúvel do tipo óxido de ferro ou qualquer outro tipo de ferro) pode ser tratado de acordo com este processo para remover todo ou parte do ferro insolúvel para reduzir total ou parcialmente o conteúdo de ferro insolúvel presente no solo a ser tratado; no entanto, numa forma de realização particular, o referido solo contendo ferro insolúvel a ser tratado é um solo, tal como uma camada superficial de solo agrícola, uma camada superficial de solo tratado com fertilizantes, etc. Se necessário, o solo a ser tratado é suplementado com uma fonte de carbono e/ou com uma fonte de azoto e/ou 42 com nutrientes essenciais para facilitar a sobrevivência dos microorganismos da invenção.

Tal como foi mencionado anteriormente, devido às caracteristicas do microorganismo da invenção que é extremamente tolerante em relação à dessecação e permanece viável e funcional em condições de humidade extremamente baixas, como em solos com apenas 2% de capacidade de campo, o nivel de humidade do solo pode variar dentro de um ampla gama (condições de humidade alta, normal, baixa ou extremamente baixa); esse modo, os solos com 50% de capacidade de campo ou menos, tais como solos com 20% de capacidade de campo ou menos, por exemplo, solos com 10% de capacidade de campo ou menos, mesmo solos com 2% de capacidade de campo podem ser utilizados para realizar o processo acima definido, bem como solos com mais de 50% de capacidade de campo.

Os microorganismos da invenção são injectados com o propósito de alcançar alta densidade de células no solo a ser tratado, por exemplo, igual ou superior a 103 microorganismos da invenção por grama de solo a ser tratado, tipicamente igual a ou superior a O i—1 microorganismos da invenção por grama de solo a ser tratado, de preferência, igual ou superior a LO O i—1 microorganismos da invenção por grama de solo a ser tratado, com a finalidade de facilitar a solubilização do ferro insolúvel.

Numa forma de realização especifica, o referido processo para a solubilização microbiológica, em condições aeróbias, de ferro insolúvel presente num solo contendo ferro insolúvel é levado a cabo por meio da adição ao referido solo a ser tratado de um suporte sólido activo da invenção que compreende um microorganismo da invenção. As caracteristicas do referido suporte sólido activo da 43 invenção foram descritas anteriormente. A quantidade de suporte sólido activo da invenção, que é adicionada ao solo a ser tratado (o solo que contém ferro insolúvel e com qualquer nível de humidade) pode variar dentro de uma vasta gama; no entanto, numa forma de realização particular, a quantidade do referido suporte sólido activo da invenção, que é adicionado ao solo a ser tratado é igual ou superior a 0,01 kg de suporte sólido da invenção activo por hectare (Ha) de solo a ser tratado, tipicamente igual ou superior a 0,1 kg/Ha, de preferência igual ou superior a 0,5 kg/Ha de solo a ser tratado, ainda mais preferencialmente igual ou superior a 1 kg/Ha de solo a ser tratado, com a finalidade de facilitar a solubilização do ferro insolúvel.

Noutra forma de realização específica, o referido processo para a solubilização microbiológica, em condições aeróbias, de ferro insolúvel presente num solo contendo ferro insolúvel é levado a cabo por meio da adição ao referido solo a ser tratado de um fertilizante suplementado da invenção, que compreende um microorganismo da invenção. As características do referido fertilizante suplementado da invenção foram descritas anteriormente. A quantidade de fertilizante suplementado da invenção, que é adicionada ao solo a ser tratado (o solo que contém ferro insolúvel e com qualquer nivel de humidade) pode variar dentro de uma vasta gama, dependendo, entre outros factores, da quantidade de ferro insolúvel presente no solo a ser tratado e da quantidade de microorganismos da invenção presente no fertilizante suplementado da invenção.

Noutra forma de realização especifica, o referido processo para a solubilização microbiológica, em condições aeróbias, de ferro insolúvel presente num solo contendo ferro insolúvel é levado a cabo por meio de semeadura do 44 referido solo a ser tratado com uma semente da invenção compreendendo um microorganismo da invenção. As caracteristicas da referida semente da invenção foram descritas anteriormente. A quantidade de sementes suplementadas da invenção que são semeadas no solo a ser tratado (o solo que contém ferro insolúvel e com qualquer nível de humidade) pode variar dentro de uma vasta gama, dependendo da densidade requerida pelo agricultor. A solubilização de ferro, por exemplo, por meio de quelação de sideróforos, impede que o ferro esteja disponível para os microorganismos patogénicos, em particular agente patogénicos de plantas, desse modo exercendo biocontrolo em populações microbianas agricolamente indesejadas. Esta vantagem pode ser obtida através da utilização do microorganismo da invenção.

Num outro aspecto, a invenção refere-se a um processo para a solubilização microbiológica, em condições aeróbias, de um fosfato e ferro insolúveis num substrato sólido contendo fosfato insolúvel e ferro insolúvel, compreendendo pôr o referido substrato sólido a ser tratado em contacto com um microorganismo da invenção. Numa forma de realização particular, o referido microorganismo da invenção faz parte de um suporte sólido activo da invenção. Desse modo, numa forma de realização particular, o referido processo compreende pôr o referido substrato sólido contendo fosfato insolúvel e ferro insolúvel a ser tratado em contacto com uma cultura de um microorganismo da invenção; ou, alternativamente, com um suporte sólido activo da invenção.

Numa forma de realização específica, o referido processo compreende: a) inocular uma mistura que compreende o referido substrato sólido contendo fosfato insolúvel e ferro 45 insolúvel a ser tratado e água com uma cultura que compreende um microorganismo da invenção; e, se desejado, b) remover o referido microorganismo.

Praticamente qualquer tipo de substrato sólido contendo fosfato insolúvel e ferro insolúvel pode ser tratado de acordo com este processo para a redução completa ou parcialmente do teor de fosfato insolúvel e ferro insolúvel; no entanto, numa forma de realização particular, o referido substrato sólido contendo fosfato insolúvel e ferro insolúvel a ser tratado é o fosfato de rocha, tal como fosfato de rocha utilizado para a produção de fertilizantes de fosfato, com um fosfato insolúvel variável e, por vezes, teor de ferro insolúvel.

Para realizar este processo, o substrato sólido contendo fosfato insolúvel e ferro insolúvel a ser tratado é misturado com água, e a mistura resultante é posta em contacto com uma cultura de um microorganismo da invenção, ou com um suporte sólido activo da invenção, numa densidade de população bacteriana que pode variar dentro de uma vasta gama; no entanto, numa forma de realização particular, pelo menos, 103 microorganismos da invenção por mL de água são inoculados. Após a inoculação, os microorganismos da invenção são deixados a actuar e após 1 a 24 horas, se desejado, os referidos microorganismos são removidos por meio de métodos convencionais, por exemplo por meio de decantação, precipitação com electrólitos, centrifugação, etc. Se desejado, os microorganismos removidos da invenção podem ser reutilizados num novo processo para a solubilização microbiológica, em condições aeróbias, de um fosfato insolúvel e/ou de ferro insolúvel num substrato sólido contendo fosfato insolúvel e/ou ferro insolúvel. 46

Este processo pode ser realizado num reactor, tanque ou semelhante, em que o substrato sólido contendo fosfato insolúvel e ferro insolúvel a ser tratado é introduzido, devidamente equipado com meios de alimentação e drenagem de água, substrato sólido, inoculação de microorganismos da invenção e recuperação dos mesmos. Se necessário, a mistura (substrato sólido, água e microorganismos da invenção, opcionalmente, fazendo parte de um suporte sólido activo da invenção) é suplementada com uma fonte de carbono e/ou com uma fonte de azoto e/ou nutrientes essenciais, com a finalidade de facilitar a sobrevivência dos microorganismos da invenção. A titulo de ilustração, quantidades adequadas de solução de micronutrientes, juntamente com quantidades adequadas de magnésio, cobalto e molibdénio, tipicamente na ordem micromolar, podem ser adicionadas para optimizar o processo; no entanto, em qualquer caso, a escolha e a quantidade de nutrientes e micronutrientes a serem adicionados vai depender da composição do substrato sólido a ser tratado e da demanda microbiológica.

Este processo pode ser utilizado para solubilizar todo ou parte do fosfato insolúvel e do ferro insolúvel presentes no substrato sólido a ser tratado com a finalidade de reduzir o teor de fosfato insolúvel e de ferro insolúvel presentes no referido substrato sólido a ser tratado.

Num outro aspecto, a invenção refere-se a um processo para a solubilização microbiológica, em condições aeróbias, de fosfato insolúvel e ferro insolúvel presentes num solo contendo fosfato insolúvel e ferro insolúvel, em que o referido solo tem qualquer nivel de humidade, o processo compreendendo pôr o referido solo contendo fosfato insolúvel e ferro insolúvel a ser tratado em contacto com 47 um microorganismo da invenção. Resumidamente, numa forma de realização particular, o referido processo compreende: injectar, uma ou mais vezes, no referido solo a ser tratado, uma cultura de um microorganismo da invenção contendo fosfato insolúvel e ferro insolúvel tendo qualquer nivel de humidade; ou alternativamente adicionar ao referido solo contendo fosfato insolúvel e ferro insolúvel e tendo qualquer nivel de humidade, um suporte sólido activo da invenção; ou alternativamente adicionar ao referido solo contendo fosfato insolúvel e ferro insolúvel e tendo qualquer nivel de humidade um fertilizante suplementado da invenção, ou alternativamente semear o referido solo contendo fosfato insolúvel e ferro insolúvel e tendo qualquer nível de humidade com uma semente suplementada da invenção.

Numa forma de realização específica, o referido processo para a solubilização microbiológica, em condições aeróbias, de fosfato insolúvel e ferro insolúvel presentes num solo contendo fosfato insolúvel e ferro insolúvel e tendo qualquer nível de humidade é levado a cabo por meio de injecção de microorganismos da invenção no solo a ser tratado, por exemplo, por meio de um processo que compreende: a) a primeira injecção no referido solo de uma cultura contendo um microorganismo da invenção; e b) injecções sucessivas de culturas que contêm microorganismos da invenção até a solubilização completa ou parcial do fosfato insolúvel e do ferro insolúvel presentes no solo a ser tratado.

Praticamente qualquer tipo de solo contendo um fosfato insolúvel (por exemplo, fosfato de cálcio dibásico, fosfato de cálcio tribásico, etc., e suas misturas) e ferro insolúvel (por exemplo, ferro insolúvel do tipo 48 óxido de ferro ou qualquer outra forma de ferro) pode ser tratado de acordo com este processo para reduzir total ou parcialmente o teor de fosfato insolúvel e ferro insolúvel presentes no referido solo a ser tratado; no entanto, numa forma de realização particular, o referido solo é uma camada superficial de solo agrícola, uma camada superficial de solo tratado com fertilizantes, etc. Se necessário, o solo a ser tratado é suplementado com uma fonte de carbono e/ou com uma fonte de azoto e/ou nutrientes essenciais para facilitar a sobrevivência dos microorganismos da invenção.

Tal como foi mencionado anteriormente, devido às características do microorganismo da invenção que é extremamente tolerante em relação à dessecação e permanece viável e funcional em condições de humidade extremamente baixas, como em solos com apenas 2% de capacidade de campo, o nível de humidade do solo pode variar dentro de um ampla gama (condições de humidade alta, normal, baixa ou extremamente baixa); esse modo, os solos com 50% de capacidade de campo ou menos, tais como solos com 20% de capacidade de campo ou menos, por exemplo, solos com 10% de capacidade de campo ou menos, mesmo solos com 2% de capacidade de campo podem ser utilizados para realizar o processo acima definido, bem como solos com mais de 50% de capacidade de campo.

Os microorganismos da invenção são injectados com o propósito de alcançar alta densidade de células no solo a ser tratado, por exemplo, igual ou superior a 103 microorganismos da invenção por grama de solo a ser tratado, tipicamente igual a ou superior a 104 microorganismos da invenção por grama de solo a ser tratado, de preferência, igual ou superior a 105 microorganismos da invenção por grama de solo a ser 49 tratado, com a finalidade de facilitar a solubilização do fosfato insolúvel e do ferro insolúvel.

Numa forma de realização especifica, o referido processo para a solubilização microbiológica, em condições aeróbias, de fosfato insolúvel e ferro insolúvel presentes num solo contendo um fosfato insolúvel e ferro insolúvel e tendo qualquer nível de humidade é levado a cabo por meio da adição ao referido solo a ser tratado de um suporte sólido activo da invenção que compreende um microorganismo da invenção. As características do referido suporte sólido activo da invenção foram descritas anteriormente. A quantidade de suporte sólido activo da invenção, que é adicionada ao solo a ser tratado pode variar dentro de uma vasta gama; no entanto, numa forma de realização particular, a quantidade do referido suporte sólido activo da invenção, que é adicionado ao solo a ser tratado é igual ou superior a 0,01 kg de suporte sólido da invenção activo por hectare (Ha) de solo a ser tratado, tipicamente igual ou superior a 0,1 kg/Ha, de preferência igual ou superior a 0,5 kg/Ha de solo a ser tratado, ainda mais preferencialmente igual ou superior a 1 kg/Ha de solo a ser tratado, com a finalidade de facilitar a solubilização do ferro insolúvel.

Numa outra forma de realização específica, o referido processo para a solubilização microbiológica, em condições aeróbias, de fosfato insolúvel e ferro insolúvel presentes num solo contendo um fosfato insolúvel e ferro insolúvel é levado a cabo por meio da adição ao referido solo a ser tratado de um fertilizante suplementado da invenção compreendendo um microorganismo da invenção. As características do referido fertilizante suplementado da invenção foram descritas anteriormente. A quantidade de fertilizante suplementado da invenção que é adicionada ao 50 solo a ser tratado pode variar dentro de uma vasta gama, dependendo, entre outros factores, da quantidade de fosfato insolúvel presente no solo a ser tratado e da quantidade de microorganismos da invenção presentes no fertilizante suplementado da invenção.

Numa outra forma de realização específica, o referido processo para a solubilização microbiológica, em condições aeróbias, de fosfato insolúvel e ferro insolúvel presentes em solo contendo um fosfato insolúvel e ferro insolúvel é levado a cabo por meio de semeadura no referido solo a ser tratado com uma semente da invenção, compreendendo um microorganismo da invenção. As características da referida semente da invenção foram descritas anteriormente. A quantidade de sementes suplementadas da invenção que são semeadas no solo a ser tratado pode variar dentro de uma vasta gama, dependendo da densidade requerida pelo agricultor.

Os processos anteriormente descritos para a solubilização de fosfato insolúvel microbiológica de fosfato insolúvel e ferro insolúvel proporcionam, entre outras, a vantagem previamente mencionada de elevada especificidade, que funciona numa larga gama de concentrações de fosfato, tipicamente entre 0,01% e 95% de fosfato (p/p), e alta versatilidade; do mesmo modo, a solubilização de ferro, por exemplo, por meio de quelação de sideróforos, impede que o ferro esteja disponível para os microorganismos patogénicos, em particular agentes patogénicos das plantas, exercendo, desse modo, um biocontrolo em populações microbianas agricolamente indesejadas.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a um processo para estimular o crescimento das plantas, compreendendo a aplicação de uma quantidade eficaz de um microorganismo da invenção ao solo que circunda a referida planta. 51

Praticamente qualquer planta pode ser tratada de acordo com este processo para estimular o seu crescimento, particularmente o seu crescimento em estágios iniciais; a titulo de exemplo ilustrativo não limitativo, a referida planta pode ser uma planta de interesse agrícola, incluindo plantas de interesse na alimentação humana ou animal, plantas de interesse decorativo, plantas de interesse de energia, etc. (aveia, cevada, milho, trigo, grama, sorgo, roseiras, gerânios, margaridas, etc.). 0 microorganismo da presente invenção pode ser aplicado de diferentes maneiras. Numa forma de realização particular, o referido microorganismo da invenção é aplicado directamente ao solo, enquanto que em outra forma de realização particular, o microorganismo da presente invenção é aplicado aderido a um suporte sólido na forma de um suporte sólido activo da invenção. Do mesmo modo, em outra forma de realização particular, o microorganismo da presente invenção é aplicado por revestimento de toda ou parte das sementes das plantas cujo crescimento é para ser estimulado, na forma de uma semente suplementada da invenção. Alternativamente, numa outra forma de realização particular, o microorganismo da presente invenção é aplicado juntamente com um fertilizante no solo que circunda as plantas cujo crescimento é para ser estimulado, na forma de um fertilizante suplementado da invenção.

As características do referido suporte sólido activo, sementes suplementadas e fertilizante suplementado fornecidos pela presente invenção foram descritas anteriormente. A quantidade eficaz do microorganismo da invenção a ser aplicada ao solo que circunda a planta cujo crescimento é para ser estimulado pode variar dentro de uma vasta gama; no entanto, numa forma de realização particular, a 52 quantidade de microorganismos da invenção a ser aplicada ao solo que circunda a planta cujo crescimento é para ser estimulado é compreendida entre 103 e 108 microorganismos por grama de solo adjacente ao sistema radicular. A presença de microorganismos promove a germinação de sementes em simultâneo, dá uma aparência homogénea ao crescimento das plantas e coordena o florescimento, as frutas e o período de maturação.

Os exemplos seguintes ilustram a invenção e não devem ser interpretados de forma a limitar o âmbito da invenção. EXEMPLO 1

Isolamento das bactérias da invenção

Uma amostra de 10 g de um solo de um jardim em Pinos Genil (Granada) foi suspenso num meio A modificado, a uma proporção de 1:10 (p/v). O referido meio A modificado é um meio mínimo sem uma fonte de fósforo cuja composição específica por litro é: NH4CI, 267 mg; MgS04.7H20, 410 mg; KC1, 300 mg; NaCl, 200 mg; e 1 mL de uma solução aquosa de citrato de ferro (6 g/L) . Fosfato de cálcio tribásico foi adicionado subsequentemente ao referido meio numa quantidade suficiente para atingir uma concentração de 10% (p/v) . A suspensão resultante foi incubada a uma temperatura compreendida entre 25 °C e 30 °C, com agitação, durante uma semana em condições aeróbias. Diluições adequadas da referida suspensão foram subsequentemente propagadas em placas de meio sólido selectivo formado por meio A modificado, 1,5% (p/v) de ágar e 1% (p/v) de benzoato.

Após incubação entre 1 e 7 dias, as colónias isoladas foram purificadas e o seu fenótipo foi verificado por meio da sua cultura no meio acima mencionado. Várias colónias de bactérias que foram classificados como Pseudomonas putida que tinham capacidade de solubilização de fosfato 53 insolúvel (fosfato de cálcio tribásico) foram identificadas após a análise do tipo de microbiologia (coloração de Gram, teste de catalase, teste de oxidase, teste de utilização de nutrientes, etc.).

Em seguida, foi analisada a capacidade da referida bactéria de utilizar ferro em pequenas quantidades (como uma fonte de ferro para as referidas bactérias), em condições aeróbias. Para o efeito, as bactérias anteriormente isoladas classificadas como P. putida foram inoculadas individualmente num meio tipo M9 (Abril, M.A., Michán, C., Timmis, K.N. e Ramos, J.L. Regulator and enzyme specificities of TOL plasmid-encoded upper pathway for degradation of aromatic hydrocarbons. J. Bacteriol. (1989), 171: 6782-6790), sem a adição de qualquer ferro.

As culturas foram incubadas com agitação (entre 50 e 200 rpm) numa incubadora orbital tipo Kuhner. Os microorganismos viáveis foram contados depois de 24 horas (em primeiro lugar) e, posteriormente, a cada 24 horas, durante o tempo do ensaio, observando-se que a densidade da população duplicou aproximadamente a cada 6 horas até densidades celulares na ordem de 108 unidades formadoras de colónias por mililitro (cfu/mL) serem obtidas, altura em que a taxa de crescimento diminuiu, embora as culturas atingissem até 109 cfu/mL após 24 horas de incubação. Os sobrenadantes das culturas adquiriu uma cor amarela-esverdeada tipica da excreção de sideróforos para o meio de cultura.

Uma cultura de bactérias da colónia identificada como P. putida BIRD-1 foi depositada em 3 de Junho de 2008, na Colecção Espanhola de Cultivos Tipo (CECT), Burjasot (Valência, Espanha), com número de acesso CECT 7415. EXEMPLO 2 54

Utilização de fosfato de cálcio tribásico como fonte de fósforo para as bactérias da invenção em condições aeróbias

Uma cultura de P. putida BIRD-1 (CECT 7415) [Exemplo 1]

com 103 microorganismos foram inoculada num meio A modificado [composição especifica por litro: NH4CI, 267 mg; MgSC>4.7H20, 410 mg; KC1, 300 mg; NaCl, 200 mg; e 1 mL de uma solução aquosa de citrato de ferro (6 g/L)] com 1% (p/p) de fosfato de cálcio tribásico e foi incubada com agitação (entre 50 e 200 rpm) numa incubadora orbital tipo Kiihner. Os microorganismos viáveis foram contados ao longo do tempo (a cada 24 horas), observando-se que a densidade da população bacteriana duplicou aproximadamente a cada 2 horas até densidades celulares na ordem de 108 cfu/mL serem obtidas, altura em que a taxa de crescimento diminuiu, embora as culturas atingissem até 109 cfu/mL após 24 horas de incubação. EXEMPLO 3

Utilização de fosfatos insolúveis como fonte de fósforo para as bactérias da invenção em condições aeróbias O processo descrito no Exemplo 2 foi repetido, mas usando fosfato de rocha moído contendo de 15 a 30% de P2O5 e cuja dimensão do grão era inferior a 3 mm; 0,1 a 5% (p/v) de fosfato foram adicionados, observando-se que a taxa de duplicação da população de bactérias era mais lenta e na ordem de 4 horas; no entanto, as culturas de células atingiram entre 1010 e 1011 cfu/mL. EXEMPLO 4

Utilização de ferro em quantidades vestigiais em fosfato de rocha como fonte de ferro para as bactérias da invenção em condições aeróbias

Uma cultura de P. putida BIRD-1 (CECT 7415) [Exemplo 1] com 103 microorganismos foram inoculados num meio tipo M9 55 (Abril, M.A., Michán, C., Timmis, K.N. e Ramos, J.L. Regulator and enzyme specificities of TOL plasmid-encoded upper pathway for degradation of aromatic hydrocarbons. J. Bacteriol. (1989), 171:6782-6790), sem a adição de qualquer ferro a que 1% (p/p) de fosfato de rocha, contendo de 15 a 30% de P2O5 foi adicionado e cuja dimensão do grão era inferior a 3 mm, e foi incubada com agitação (entre 50 e 200 rpm) numa incubadora orbital tipo Kuhner. Os microorganismos viáveis foram contados ao longo do tempo a cada 24 horas, observando-se que a densidade de população duplicou aproximadamente a cada 6 horas, até

densidades celulares na ordem de 108 unidades formadoras de colónias por mililitro (cfu/mL) serem atingidas, altura em que a taxa de crescimento diminuiu, embora as culturas atingissem até 109 cfu/mL após 24 horas de incubação. O sobrenadante da cultura adquiriu uma cor amarelo-esverdeado tipica da excreção de sideróforos para o meio de cultura. EXEMPLO 5

Pseudomonas putida BIRD-1 exibe características únicas

Os genes rpoD, gyrB, trpE, gltA e edd foram parcialmente amplificados e comparados com sequências depositadas em bases de dados. As sequências dos genes correspondentes exibiram alta similaridade com os genes das bactérias do género Pseudomonas, mas com diferenças significativas, indicando a existência de variabilidade genética. Os resultados são apresentados nas Tabelas 1 e 2. 56

Tabela 1

Gene Tamanho do gene (bp) Fragmento amplificado (bp) bp não identificável no fragmento amplificado com o organismo mais próximo % de identidade com BIRD—1 gltA (Citrato Sintase) 1290 1190 7 Pseudomonas putida (KT2440 (99%) Pseudomonas putida F1 (98%) Pseudomonas putida W619 (94%) trpE (Antranilato Sintase, componente I) 1482 1382 8 Pseudomonas putida F1 (99%) Pseudomonas putida KT2440 (98%) Pseudomonas putida GB-1 (92%) Pseudomonas putida W619 (82%)

Tabela 2

Gene % de identidade em relação à sequência mais próxima e sua fonte RpoD 99% P. putida KT2440 99% P. putida F1 97% P. putida Edd 98% P. putida KT2440 gltA 99% P. putida KT2440 trpE 97% P. putida KT2440 gyrB 98% P. putida KT2440 EXEMPLO 6

Pseudomonas putida BIRD-1 tolera condições de humidade extremamente baixas 57 A fim de avaliar a tolerância em relação à dessecação, 107 cfu de BIRD-1 foram adicionados aos solos cuja humidade tinha sido pré-fixada em 50, 20, 10 e 2% (capacidade de campo). O número de células viáveis da estirpe foi mantido durante 15 dias a 107 a 108 cfu/g de solo, independentemente da taxa de humidade. Controlos em paralelo com as estirpes tais com P. putida Kt2440 (Abril et al., supra citado), a viabilidade só ocorreu em níveis de humidade relativa acima dos 10%. EXEMPLO 7

Estimulação da germinação de sementes de cevada 250 sementes de cevada foram semeadas em placas de Petri com 40 g de solo do tipo agrícola de pH 7,5 que tinha sido previamente misturado com bactérias P. putida BIRD-1 (CECT 7415) [Exemplo 1] para alcançar 106 cfu/g de solo. 250 sementes de cevada foram semeadas em placas de Petri com 40 g do mesmo solo agrícola de pH 7,5, sem bactérias P putida BIRD-1 (CECT 7415) [Exemplo 1] como controlo. A germinação das sementes terminou após 4 dias de incubação a 20 °C no escuro. Observou-se que a percentagem de germinação das sementes de cevada no solo agrícola sem bactérias foi de 66,6%, ao passo que atingiu pelo menos 98,6% no solo tratado com as referidas bactérias P. putida BIRD-1 (CECT 7415) [Exemplo 1]. EXEMPLO 8

Estimulação da germinação de semente de gramíneas O ensaio descrito no Exemplo 7 foi repetido, mas utilizando sementes de gramíneas em vez de sementes de cevada, observando-se que a percentagem de germinação das sementes de gramíneas no solo sem bactérias foi de 92%, ao passo que atinge 100% em solo tratado com as referidas bactérias P. putida BIRD-1 (CECT 7415) [Exemplo 1]. Foi adicionalmente observado que o sistema radicular de todas 58 as plantas é da ordem de 1,3 a 2 vezes mais denso do que o das sementes que não foram inoculadas. EXEMPLO 9

Estimulação da germinação de semente de milho 0 ensaio descrito no Exemplo 7 foi repetido, mas utilizando sementes de milho em vez de sementes de cevada, observando-se que a percentaqem de qerminação de sementes de milho no solo sem bactérias foi de 93%, ao passo que atingiu 100% no solo tratado com as referidas bactérias P. putida BIRD-1 (CECT 7415) [Exemplo 1]. EXEMPLO 10

Estimulação do crescimento precoce de plantas de milho

Para determinar o potencial de estimular o crescimento de plantas das bactérias P. putida BIRD-1 (CECT 7415) [Exemplo 1] num suporte sólido (sepiolite) foram realizados diversos ensaios em estufa nos quais foi utilizado um solo agrícola que foi misturado com areia de sílica e com a sepiolite no qual as referidas bactérias foram aderidas para alcançar uma densidade final de, pelo menos, 105 microorganismos por grama de mistura, em 2:1:1; 2:1:0,1 e 2:1:0,01 [misturas de solo agrícola:areia de sílica:sepiolita contendo P. putida BIRD-1 (CECT 7415)]. As sementes de milho foram plantadas nas referidas misturas bem homogeneizadas, e a percentagem de germinação e o comprimento do caule ao longo do tempo foram determinados uma semana após a semeadura.

Como controle, sementes de milho foram semeadas em solo agricola misturado com areia de sílica e com suportes sólidos (sepiolita) sem bactérias em 2:1:1; 2:1:0,1 e 2:1:0,01 [misturas de solo agrícola:areia de sílica:suporte sólido]. As sementes de milho foram plantadas nas referidas misturas bem homogeneizadas, e a percentagem de germinação e o comprimento do caule ao 59 longo do tempo foram determinados uma semana após a semeadura.

Observou-se que os caules das plantas de milho nas culturas com bactérias eram entre 7% e 10% mais longos do que os caules das plantas de milho semeadas em solos sem bactérias, embora, após 20 dias de crescimento, o comprimento do caule das plantas de milho eram idênticos. EXEMPLO 11

Estimulação do crescimento precoce de azevém 0 ensaio do Exemplo 10 foi repetido, mas foi semeado azevém em vez de milho, observando-se que as hastes eram do mesmo comprimento, tanto na presença como na ausência de bactérias; no entanto, na presença das bactérias P. putida BIRD-1 (CECT 7415), o comprimento da raiz chegou a 3 cm, enquanto que na ausência da bactéria que era de apenas 2,3 cm de comprimento. EXEMPLO 12

Solubilização de fósforo de fosfato de rocha 10 g de fosfato com 27% de P2O5 foram introduzidos num recipiente contendo 100 mL de água e foi suplementado com a solução de micronutrientes descrita por Abril et al. (Abril, M.A., Michán, C., Timmis, K.N. e Ramos, J.L. Regulator and enzyme specificities of TOL plasmid-encoded upper pathway for degradation of aromatic hydrocarbons. J. Bacteriol. (1989), 171:6782-6790) e, pelo menos, 103 bactérias P. putida BIRD-1 (CECT 7415) [Exemplo 1] e 1% (p/v) de sacarose. O sistema foi arejado por meio de bombeamento de ar. O fósforo utilizado foi determinado a cada 24 horas e, quando 1 a 5% do fósforo total tinha sido solubilizado ao fim de 24 horas, aumentando em até 20% num período adicional de 24 a 96 horas, a suspensão foi removida e os processos foram repetidos. EXEMPLO 13 60

Solubilização de fosfato de rocha fosfórica a baixa humidade (2%) A fim de estabelecer a solubilização do fosfato em rocha fosfórica, 10 g de rocha fosfórica peso em seco foram misturados com 27% de P2O5 com 10 g de solo seco ao forno a 270 °C. a mistura foi suplementada com 107 cfu/g de mistura suspensa em 0,5 mL de água. Depois de misturar bem e obter homogeneização, o frasco foi vedado com uma tampa de Teflon e cultivado à temperatura ambiente (18 a 22 °C) durante 10 dias. Um ensaio de controlo foi preparado em paralelo mas sem microorganismos. Fosfato solúvel foi determinado utilizando uma fracção da amostra, revelando que quase 1% do fosfato total era solúvel, ao passo que os niveis na amostra de controlo eram inferiores a 0,1%. EXEMPLO 14

Solubilização de fosfato em solos com níveis médios de humidade

Tal como no Exemplo 13, excepto por o teor de água ser de 10%. O nível de fosfato solubilizado atingiu 3% do total em 10 dias. EXEMPLO 15

Complemento de fertilizante sólido

Formulações de fertilizantes do tipo NPK (0:12:12 e 4:8:12) e soluções líquidas à base de ácido fúlvico com 106 a 108 cfu/mL de bactérias P. putida BIRD-1 (CECT 7415) imobilizadas em sepiolite, na proporção de 1:100 foram misturadas umas às outras. O fertilizante suplementado com as referidas bactérias foi utilizado para estimular o crescimento da planta de milho. EXEMPLO 12

Complemento de fertilizante sólido por aderência 61

Foi utilizado o mesmo processo tal como no Exemplo 11, mas utilizando goma arábica a 0,1% para facilitar a aderência das bactérias P. putida BIRD-1 (CECT 7415) aos fertilizantes sólidos.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIA <110> Biο-ILIBERIS Research and Development S.L. <120> Microorganismo capaz de solubilizar fosfato e ferro e suas aplicações <130> P3795PC00 <150> EP 08380251.2 <151> 2008-08-14 <160> 3D <17 0> Patentln versão 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial

<220>D

<223> Iniciador F8 <4 0 0> 1D agagtttgat cctggctcag 20 <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> <22 0> Artificial <223> Iniciador R798 <4 0 0> 2 ggggtatcta atccc 15

<210> 3D <211> 105D

<212> DNAD <213> Estirpe Pseudomonas putida BIRD-1 (CECT 4715) <400> 3 ettgaiisaf ^esgfaegg· ftgaffe&atf c«$tfctoga*a

Claims (15)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Microorganismo da espécie Pseudomonas putida depositado na Colecção Espanhola de Cultivos Tipo (CECT) com o número de acesso CECT 7415, com capacidade de solubilização do fosfato e do ferro em condições em que a quantidade de água é de 20% ou menos, ou um mutante do referido organismo que mantém a capacidade de solubilização do fosfato e ferro em condições em que a quantidade de água é de 20% ou menos.

2. Microorganismo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por também produzir um composto que estimula o crescimento das plantas em condições em que a quantidade de água é de 20% ou menos, em que o referido composto que estimula o crescimento das plantas é uma hormona vegetal.

3. Cultura biologicamente pura de um microorganismo de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2.

4. Suporte activo sólido caracterizado por compreender um fertilizante e um microorganismo de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2.

5. Fertilizante suplementado caracterizado por compreender um fertilizante e um microorganismo de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2.

6. Semente suplementada caracterizada por compreender uma semente e um microorganismo de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2, opcionalmente aderido a um suporte sólido.

7. Processo para a solubilização microbiológica, em condições aeróbias, de um fosfato insolúvel num substrato sólido, contendo um fosfato insolúvel, que compreende pôr o referido substrato sólido em contacto com um microorganismo de acordo com qualquer das 2 reivindicações 1 ou 2, ou com um suporte sólido de acordo com a reivindicação 4.

8. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o referido substrato sólido ser fosfato de rocha.

9. Processo para a solubilização microbiológica, em condições aeróbias, de fosfato insolúvel presente num solo que contém um fosfato insolúvel, em que o referido solo tem qualquer nível de humidade, o processo caracterizado por compreender injectar, uma ou mais vezes, no referido solo, uma cultura de um microorganismo de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2; ou alternativamente adicionar ao referido solo um suporte sólido activo de acordo com a reivindicação 4; ou alternativamente adicionar ao referido solo um fertilizante suplementado de acordo com a reivindicação 5; ou alternativamente semear o referido solo com uma semente suplementada de acordo com a reivindicação 6.

10. Processo para a solubilização microbiológica, em condições aeróbias, de ferro insolúvel presente num substrato sólido contendo ferro insolúvel, que compreende pôr o referido substrato sólido em contacto com um microorganismo de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2, ou com um suporte sólido de acordo com a reivindicação 4.

11. Processo para a solubilização microbiológica, em condições aeróbias, de ferro insolúvel presente num solo contendo ferro insolúvel, em que o referido solo tem qualquer nível de humidade, caracterizado por o referido processo compreender injectar, uma ou mais vezes, no referido solo, uma cultura de um microorganismo de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2; ou alternativamente 3 adicionar ao referido solo um suporte sólido activo de acordo com a reivindicação 4; ou alternativamente adicionar ao referido solo um fertilizante suplementado de acordo com a reivindicação 5; ou alternativamente semear o referido solo com uma semente suplementada de acordo com a reivindicação 6.

12. Processo para a solubilização microbiológica, em condições aeróbias, de um fosfato insolúvel e ferro insolúvel num substrato sólido contendo um fosfato insolúvel e ferro insolúvel, que compreende pôr o referido substrato sólido em contacto com um microorganismo de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2, ou com um suporte sólido activo de acordo com a reivindicação 4.

13. Processo para a solubilização microbiológica, em condições aeróbias, de um fosfato insolúvel e ferro insolúvel presentes num solo que contém um fosfato insolúvel e ferro insolúvel, em que o referido solo tem qualquer nivel de humidade, caracterizado por o processo compreender injectar, uma ou mais vezes, no referido solo, uma cultura de um microorganismo de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2; ou alternativamente adicionar ao referido solo um suporte sólido activo de acordo com a reivindicação 4; ou alternativamente adicionar ao referido solo um fertilizante suplementado de acordo com a reivindicação 5; ou alternativamente semear o referido solo com uma semente suplementada de acordo com a reivindicação 6.

14. Processo para promover o crescimento das plantas, caracterizado por compreender uma quantidade eficaz de um microorganismo de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2, ou de um suporte sólido activo 4 de acordo com a reivindicação 4, ou de um fertilizante suplementado de acordo com a reivindicação 5, ao solo que circunda a referida planta, ou alternativamente semear uma semente da referida planta suplementada com um microorganismo de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2, ou com um suporte sólido activo de acordo com a reivindicação 4.

15. Processo para isolar um microorganismo que capacidade de solubilizar fosfato e ferro em condições em que a quantidade de água é de 20% ou menos, caracterizado por compreender: a) suspender uma amostra de um solo que se suspeita conter o referido microorganismo com capacidade de solubilização de fosfato e ferro num meio de cultura sem uma fonte de fósforo; b) adicionar à suspensão obtida na etapa a) uma fonte de fósforo formada por um ou mais fosfatos insolúveis, uma fonte de carbono e uma fonte de azoto; c) incubar a suspensão resultante da etapa b) , em condições que permitam o crescimento dos referidos microorganismos que solubilizam o fosfato insolúvel; d) semear as diluições da suspensão resultante da etapa c) em placas de meio sólido selectivo contendo até 1% (p/p) de um fosfato insolúvel como a fonte única de fósforo; e) incubar as placas semeadas da etapa d) , durante um período de tempo compreendido entre 1 e 7 dias a uma temperatura compreendida entre 15 °C e 42 °C; f) isolar e purificar as colónias dos microorganismos as quais, obtidas após a incubação da etapa e) , são capazes de utilizar o fosfato insolúvel em condições aeróbias; 5 g) opcionalmente, seleccionar e, se desejado, caracterizar as estirpes das colónias de microorganismos isoladas e purificadas na etapa f); h) semear em placas colónias de microorganismos que, isoladas e purificadas na etapa f), ou, opcionalmente, seleccionadas na etapa g) , são capazes de utilizar o fosfato insolúvel em condições aeróbias, num meio de cultura deficiente em ferro, contendo uma fonte de carbono e uma fonte de azoto; i) incubar as placas semeadas da etapa h) a uma temperatura compreendida entre 15 °C e 42 °C durante um período de tempo compreendido entre 1 e 7 dias, em condições que permitem o crescimento de microorganismos que solubilizam ferro; j) semear as diluições da suspensão resultante da etapa i) em placas de meio de cultura sólido com deficiência em ferro; k) incubar as placas semeadas da etapa j) durante um período de tempo compreendido entre 1 e 7 dias a uma temperatura compreendida entre 15 °C e 42 °C; l) isolar e purificar as colónias de microorganismos que, obtidas após a incubação da etapa k) , são capazes de obter ferro a partir das concentrações residuais presentes nos meios de cultura e em condições aeróbias; e m) seleccionar e opcionalmente caracterizar as estirpes das colónias de microorganismos isoladas e purificadas na etapa 1); e n) submeter as estirpes das colónias de microorganismos seleccionadas e opcionalmente caracterizadas na etapa m) a um ensaio para avaliar a tolerância em relação à dessecação e seleccionar as estirpes que têm capacidade 6 6 que a de solubilizar fosfato e ferro em condições em quantidade de água é de 20% ou menos. Lisboa,