ES2307391B1 - Microorganismos recombinantes que contienen un gen de resistencia a estres salino y sus aplicaciones. - Google Patents
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Abstract
Microorganismos recombinantes que contienen un
gen de resistencia a estrés salino y sus aplicaciones. La
invención describe microorganismos recombinantes que contienen un
gen de resistencia a estrés salino procedente de una planta y sus
aplicaciones. Dichos microorganismos recombinantes permiten que,
cuando están presentes en el suelo, las plantas que de forma
natural no crecerían bajo condiciones de estrés salino, puedan
hacerlo. La invención también describe una planta o una semilla
recubierta total o parcialmente por dicho microorganismo
recombinante y un procedimiento para crecer una planta bajo
condiciones de estés salino.
Description
Microorganismos recombinantes que contienen un
gen de resistencia a estrés salino y sus aplicaciones.
La invención se relaciona, en general, con
microorganismos recombinantes que contienen un gen de resistencia a
estrés salino y sus aplicaciones. Dichos microorganismos
recombinantes permiten el crecimiento de plantas en suelos
salinos.
El medio natural del suelo es un ecosistema
habitado por plantas y microorganismos en equilibrio, donde la
existencia de estos últimos determina la presencia de los primeros.
Cuando dicho equilibrio, desarrollado en el curso de la evolución,
es alterado por las actividades humanas en su estructura y función,
pueden ocurrir cambios no deseables. La sobreexplotación de los
acuíferos, por ejemplo, tiene como consecuencia la aparición de
grandes extensiones de suelos salinizados que impiden o inhiben el
crecimiento de las plantas y de los microorganismos que
originalmente estaban allí establecidos.
El incremento de la salinización de los suelos
es un problema que afecta tanto a ambientes o ecosistemas naturales
como a las áreas de cultivo, lo que tiene graves repercusiones
económicas. Aproximadamente el 20% de la superficie terrestre
mundial utilizada para cultivo se encuentra afectada por niveles de
salinidad que superan la tolerancia de las especies de los cultivos
tradicionales. Este porcentaje va en aumento a una tasa del 0,5%
anual debido, fundamentalmente, a las bajas precipitaciones,
irrigación con aguas salinas y a las prácticas habituales de cultivo
que favorecen el incremento de la concentración de sales en el
suelo. Este incremento en la concentración de sales en el suelo
afecta directamente al rendimiento de los cultivos, inhibe su
crecimiento y desarrollo óptimos, y, en algunos casos, puede
conducir a la muerte de los mismos. Una de las sales que causa
mayor perjuicio es el cloruro de sodio
(NaCl).
(NaCl).
Los primeros avances en la generación de
variedades cultivables o plantas con una relativa tolerancia a la
salinidad vinieron desde la genética clásica asociada a técnicas de
biología molecular que permitieron identificar loci específicos de
tolerancia a las sales en tomate y arroz. Sin embargo, los
programas de mejora genética de las especies cultivables sólo han
podido lograr variedades moderadamente sensibles al estrés salino
en todos los estadios de desarrollo de la planta.
El desarrollo de poblaciones de microorganismos
necesarias para el crecimiento o cultivo óptimo de una planta bajo
nuevas condiciones ambientales, necesita de un largo periodo de
tiempo. Sin embargo, es posible modificar las características del
suelo para permitir el crecimiento de las plantas, incorporando a
dicho suelo poblaciones de microorganismos que permitan el
establecimiento, crecimiento y desarrollo de las plantas,
recuperando de este modo el ecosistema.
Se han descrito microorganismos que toleran y
crecen en un amplio espectro de concentraciones de sales. Sin
embargo, cuando estos microorganismos se introducen en suelos
desnudos salinizados o no, su viabilidad se ve disminuida y son poco
eficientes en la colonización de dicho suelo. Para conseguir el
crecimiento de plantas en suelos salinos, se ha optado por
transferir a las plantas los genes que confieren resistencia a
concentraciones elevadas de sales a bacterias y levaduras y
facilitar de ese modo el crecimiento de las plantas en suelos
salinos tanto superficiales como profundos.
Una estrategia alternativa consiste en explotar
las relaciones planta-microorganismos para favorecer
el crecimiento de la planta mediante la introducción de
microorganismos adheridos a las semillas de las plantas. De esta
manera se consiguen altas densidades celulares bacterianas en raíz.
Un ejemplo de esta estrategia se lleva a cabo en la patente china
CN 1366060, que describe un método para mejorar el crecimiento de
las plantas en condiciones de sequía y resistencia a enfermedades
del césped mediante el empleo de cepas de Pseudomonas
fluorescens recombinantes que expresan el gen iiaM
(triptófano monooxigenasa) bajo el control del promotor bacteriano
RDR y el gen iiaM bajo el control del promotor fúngico
GPD.
La invención se basa en que los inventores han
observado que la introducción de un gen de resistencia a estrés
salino procedente de una planta en un microorganismo, en
particular, del género Pseudomonas sp., permite el
crecimiento de plantas que de forma natural no crecerían bajo
condiciones de estrés salino. Dicho microorganismo recombinante
puede emplearse, por tanto, en la recuperación de suelos que de otro
modo estarían desprovistos de vegetación debido a su alta
concentración de sales.
Por tanto, en un aspecto, la invención se
relaciona con un microorganismo del género Pseudomonas sp.,
recombinante, que contiene un gen de resistencia a estrés salino
procedente de una planta. En una realización particular, dicho
microorganismo del género Pseudomonas sp., recombinante, es
P. putida o P. fluorescens.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
una composición agrícola que comprende dicho microorganismo
recombinante junto con un vehículo agrícolamente aceptable. En una
realización particular, dicha composición agrícola comprende,
además, compuestos que estimulan y/o regulan el crecimiento de las
plantas.
Las aplicaciones de dicho microorganismo
recombinante y de dicha composición agrícola constituyen aspectos
adicionales de esta invención. Dichas aplicaciones incluyen, entre
otras, estimular el crecimiento de una planta bajo estrés salino,
restaurar ecosistemas dañados por el avance de la desertización,
restaurar ecosistemas dañados por la salinización del suelo y/o
impedir el avance de la salinización de los suelos.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
una semilla o con una planta recubierta total o parcialmente por
dicho microorganismo recombinante o por dicha composición
agrícola.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un procedimiento para crecer una planta en condiciones de estrés
salino que comprende poner en contacto dicha planta, o una plántula
de dicha planta, sus raíces, o su semilla con dichos microorganismo
recombinante o composición agrícola.
Las Figuras 1, 2 y 3 muestran, respectivamente,
una representación esquemática del mapa físico de los plásmidos
recombinantes pJMR1 (comprende el gen XvPer1), pJMR2
(comprende el gen XVSAP1) y pJMR3 (comprende el gen
ALDRXV4).
La Figura 4 muestra los resultados de una PCR
para comprobar la inserción de los genes XvPer1,
XVSAP1 y ALDRXV4 en el genoma de P. putida
KT2440. Se emplearon distintos clones de P. putida que
crecieron en medio mínimo M9.
La Figura 5 es una gráfica que muestra el efecto
del cloruro de sodio (NaCl) en el crecimiento de P.
putida
KT2440.
KT2440.
La Figura 6 muestra el efecto del NaCl en P.
putida KT2440 y en una cepa recombinante que porta el gen
XVSAP1. En las imágenes se puede apreciar cómo la cepa
recombinante tolera mejor la alta salinidad (NaCl 0,6 M) que la cepa
silvestre. (A), crecimiento de P. putida en condiciones de
estrés salino; (B), crecidas previamente en IPTG
(isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido).
La Figura 7 es un diagrama de barras que
representa el crecimiento de P. putida KT2440 y alguna de
las cepas recombinantes de los genes XVSAP1, ALDRXV4 y
XvPer1 en medio LB y medio LB con NaCl en placa con y sin
IPTG. Nótese que las cepas recombinantes crecen bien incluso en
presencia de NaCl 0,6 M independientemente de si fueron inducidas
previamente con IPTG.
La Figura 8 es una gráfica que representa la
supervivencia de P. putida KT2440 y sus derivados
recombinantes bajo condiciones de desecación ambiental. A) sin
inducción con IPTG; B) inducción con IPTG.
La Figura 9 muestra el efecto de la desecación
en condiciones ambientales sobre P. putida KT2440 y en cepas
recombinantes que portan los genes XVSAP1, ALDRXV4 y
XvPer1. Las cepas recombinantes se recuperan mejor que la
cepa silvestre después de un estado de desecación ambiental.
La Figura 10 muestra la germinación del maíz en
presencia de distintas concentraciones de NaCl, 5 días después de
la siembra.
La Figura 11 muestra la apariencia de las
plantas inoculadas con las cepas de P. putida modificadas,
la de las plantas inoculadas con la cepa silvestre (P. putida
KT2440) y la de las plantas no inoculadas tanto en presencia como
en ausencia de NaCl. En I, II, III y IV se compara el crecimiento
de las plantas no estresadas a los 15 dpi (días
post-infección). (a) Plantas no inoculadas; (b)
Plantas inoculadas con la cepa silvestre P. putida KT2440;
(c) Plantas inoculadas con la cepa P. putida
KT2440::XvPer1; (d) Plantas inoculadas con la cepa P.
putida KT2440::XVSAP1, (e) Plantas inoculadas con la
cepa P. putida KT2440::ALDRXV4. En V, VI, VII y VIII
se compara el crecimiento de las plantas estresadas por NaCl (56
mM) a los 15 dpi. (f) Plantas no inoculadas-NaCl;
(g) Plantas inoculadas con la cepa silvestre P. putida
KT2440-NaCl; (h) Plantas inoculadas con la cepa
P. putida KT2440::XvPer1-NaCl; (i) plantas inoculadas
con la cepa P. putida KT2440::XVSAP1-NaCl; y (j)
plantas inoculadas con la cepa P. putida
KT2440::ALDRXV4.
La Figura 12 es una gráfica que representa el
número de bacterias que colonizan la rizosfera de maíz a los 15
dpi, tanto en condiciones óptimas (barras gris oscuro) como en
condiciones de estrés salino (barras gris claro). (1 y 6) P.
putida KT2440; (2 y 7) P. Putida::MiniTn5XvPer1
6a; (3 y 8) P. putida::MiniTn5 XVSAP1 5; y (4 y 9)
P. putida::MiniTn5ALDRXv4 11a. Los datos representan
la media de 15 determinaciones de plantas independientes. Letras
iguales dentro del gráfico significa que los valores no difieren
significativamente, de acuerdo con el análisis estadístico
(t-student a p< 0,05). V = vermiculita.
\newpage
La Figura 13 es una gráfica que muestra el peso
seco de la región aérea de plantas de maíz a los 15 dpi. Las
plantas crecieron tanto en condiciones óptimas (barras gris oscuro)
como en condiciones de estrés salino (barras gris claro). (1 y 7)
plantas no inoculadas; (2 y 8) plantas inoculadas con P.
putida KT2440; (3 y 9) plantas inoculadas con P.
putida::MiniTn5XvPer1 6a; (4 y 10) plantas inoculadas con
P. putida::MiniTn5XVSAP1 5; y (5 y 11) plantas
inoculadas con P. putida::MiniTn5ALDRXV4 11a. Los
datos representan la media de 15 plantas. Letras iguales dentro del
gráfico significa que los valores no difieren significativamente,
de acuerdo con el análisis estadístico (t-student a p<
0,05).
La Figura 14 es una gráfica que muestra el peso
seco de raíz de plantas de maíz a los 15 dpi. Las plantas crecieron
tanto en condiciones óptimas (barras gris oscuro) como en
condiciones de estrés salino (barras gris claro). (1 y 7) plantas no
inoculadas; (2 y 8) plantas inoculadas con P. putida KT2440;
(3 y 9) plantas inoculadas con P.
putida::MiniTn5XvPer1 6a; (4 y 10) plantas inoculadas con
P. putida::MiniTn5XVSAP1 5; y (5 y 11) plantas
inoculadas con P. putida::MiniTn5ALDRXV4 11a. Los
datos representan la media de 15 plantas. Letras iguales dentro del
gráfico significa que los valores no difieren significativamente,
de acuerdo con el análisis estadístico (t-student a p<
0,05).
Las altas concentraciones de sales inhiben el
crecimiento de numerosos organismos, tanto procariotas como
eucariotas. En particular, el crecimiento de las plantas en suelos
con alta concentración de sales está disminuido como consecuencia de
un menor rendimiento fotosintético y un aprovechamiento menos
eficiente de los compuestos nitrogenados.
Sorprendentemente, los investigadores han
descubierto que en suelos con alta concentración salina, la
presencia de bacterias recombinantes, especialmente del género
Pseudomonas sp., que portan genes de resistencia a estrés
salino procedentes de plantas (que generalmente viven en ambientes
secos o salinos) favorece el crecimiento de otras plantas que, de
forma natural, no crecerían en suelos con alta concentración de
sales. Las plantas crecidas en suelos con alta concentración de
sales en presencia de dichas bacterias recombinantes presentan un
mayor contenido en proteína, una mayor concentración de clorofila
en las hojas y un mayor crecimiento vegetativo, tanto en altura
como en peso seco, que las plantas crecidas en las mismas
condiciones pero en ausencia de dichas bacterias recombinantes.
Por consiguiente, en un aspecto, la invención se
relaciona con un microorganismo, en adelante microorganismo
recombinante de la invención, del género Pseudomonas sp,
recombinante, que contiene un gen de resistencia a estrés salino
procedente de una planta. Dicho microorganismo recombinante de la
invención permite que, en su presencia, las plantas que de forma
natural no crecen bajo condiciones de estrés salino puedan hacerlo,
consiguiendo con ello la recuperación de suelos que de otro modo
estarían desprovistos de vegetación debido a su salinidad.
Tal como se entiende en esta descripción, la
expresión "estrés salino" hace referencia a la
concentración de sales, e.g., cloruro sódico (NaCl), cloruro
magnésico (MgCl_{2}) o cloruro cálcico (CaCl_{2}), a partir de
la cual el crecimiento de un organismo se ve seriamente afectado o
inhibido. El estrés salino es un estrés producido por una
concentración de iones tan elevada que produce estrés iónico y
estrés osmótico.
Adicionalmente, tal como aquí se utiliza, la
expresión "alta concentración salina", "alta
concentración de sales" o "salinidad", se refiere
a la concentración de sales, tales como las citadas anteriormente
(NaCl, MgCl_{2} o CaCl_{2}), que provocan estrés salino en un
ser vivo, en particular, en una planta.
Desde el punto de vista agrícola se considera un
suelo como salino si su conductividad eléctrica es igual o superior
a 4 dS/m (unidades de conductividad). Desde el punto de vista
ecológico, se habla de suelo salino si la concentración de NaCl es
superior a 70 mM.
La expresión "gen de resistencia a estrés
salino", tal como se utiliza en esta descripción, se refiere
a un gen que permite a un ser vivo, e.g., un microorganismo o una
planta, sobrevivir y desarrollarse bajo condiciones de estrés
salino, o sobrevivir y desarrollarse en un suelo salino.
Tal como se ha mencionado previamente, el gen de
resistencia a estrés salino utilizado en la producción del
microorganismo recombinante de la invención procede de una planta.
Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de genes de resistencia a
estrés salino procedentes de plantas, incluyen aquellos genes cuyo
producto génico actúa de forma directa o indirecta en respuesta a
los efectos de las sales:
- -
- En la acción directa pueden considerarse los productos génicos que conforman las proteínas transportadoras de Na^{+}/H^{+} de la membrana plasmática o de la membrana vacuolar, que movilizan al Na^{+} fuera de la célula o bien lo acumulan en el interior de la vacuola; dentro de este grupo, deben considerarse el conjunto de productos génicos involucrados en la activación de dichas proteínas intercambiadoras de sodio; también en la acción directa, se encuentran los genes que codifican para los enzimas responsables de la síntesis de los llamados osmoprotectores, de gran importancia para la supervivencia de la planta bajo estas condiciones de estrés abiótico; otro importante grupo de genes son los encargados de la homeostasis dentro de la planta, entre ellos destacan los genes para las acuaporinas y los que codifican para las proteínas encargadas de regular el cierre estomático.
- -
- En la acción indirecta han sido identificados un importante número de genes cuyos productos génicos están relacionados con la eliminación de radicales libres y que actúan después de la formación de elementos reactivos de oxígeno (ROS).
En una realización particular, como genes de
resistencia a estrés salino procedentes de plantas pueden emplearse
los denominados "genes de resurrección", tales como los genes
empleados en los Ejemplos de la presente invención procedentes de
plantas halófitas o xerófitas. Como es conocido, un "gen de
resurrección" es un gen cuya expresión, en condiciones
normales, se induce en plantas expuestas a humedad tras un largo
periodo de sequía. Sin embargo, cuando dicho gen de resurrección
procedente de una planta es introducido en un sistema de expresión,
tal como una bacteria (e.g., Pseudomonas sp.), dicho gen de
resurrección puede desempeñar otras funciones y comportarse como un
gen de resistencia a estrés salino; su expresión puede ser
inducible, o, si se desea, constitutiva, dependiendo del promotor
presente en la bacteria recombinante.
El gen de resistencia a estrés salino procedente
de una planta, contenido en el microorganismo recombinante de la
invención, procede, en una realización particular, de una planta
capaz de sobrevivir en suelos con alta concentración de sales o en
ambientes muy secos. Prácticamente, cualquier gen de resistencia a
estrés salino procedente de una planta puede ser empleado en la
obtención del microorganismo recombinante de la invención. En una
realización particular, dicho gen de resistencia a estrés salino es
un gen de resurrección que procede de una planta halófita o
xerófita.
xerófita.
Tal como se entiende en esta descripción, una
"planta halófita" es una planta (o vegetal) capaz de
vivir y desarrollarse en ambientes o suelos salinos. Ejemplos
ilustrativos, no limitativos, de plantas halófitas incluyen las
plantas Trifolium fragislerum, Rhizophora mangle,
Rhizophora racimun, Avicennia germinans, Mora
megistosperma, Suaeda spp Atriplex, etc.
Asimismo, una "planta xerófita" se
refiere a una planta (o vegetal) capaz de vivir en ambientes muy
secos y soportar grandes sequías. Ejemplos ilustrativos, no
limitativos, de plantas xerófitas incluyen las plantas
Xerophyta sp., Hydrolea spinosa, Euphorbia
splendens, Fagara rhoifolia, Cerba speciosa Aloe spp.,
Agave sp., etc. En una realización particular, dicha planta
xerófita pertenece al género Xerophvta sp., preferentemente,
X. viscosa.
Aunque prácticamente cualquier gen de
resistencia a estrés salino procedente de una planta puede ser
empleado en la obtención del microorganismo recombinante de la
invención, en una realización particular, dicho gen de resistencia a
estrés salino procede de X. viscosa y se selecciona entre
los genes ALDRXV4, XvPer1 y XVSAP1 de X.
viscosa. En otra realización particular, el gen de resistencia a
estrés salino procedente de una planta, es un gen procedente de una
planta con una homología de, al menos, un 70% en su secuencia de
nucleótidos respecto a la de los genes ALDRXV4, XvPer1
y XVSAP1 de X. viscosa.
Como es conocido, los microorganismos del género
Pseudomonas sp. habitan de forma general en el suelo y, más
concretamente, en ocasiones se encuentran asociados a la rizosfera,
por lo que se establece una relación interespecífica entre dicho
microorganismo y las plantas presentes en el medio.
La parte del suelo que está en contacto con la
raíz de la planta recibe el nombre de rizosfera. Tal como aquí se
utiliza, "rizosfera" se refiere a la región del suelo
inmediatamente adyacente a la planta, en particular, aquella zona de
mayor intercambio de nutrientes en la relación
planta-suelo. El crecimiento microbiano más
importante tiene lugar en la superficie de las partículas del suelo
asociadas a la rizosfera, y las especies del género
Pseudomonas sp. son colonizadores habituales de ella.
En una realización particular, el microorganismo
recombinante de la invención procede de P. putida o P.
fluorescens.
El gen de resistencia a estrés salino procedente
de una planta contenido en el microorganismo recombinante de la
invención puede introducirse en dicho microorganismo por cualquier
método convencional conocido por los expertos en la materia. En una
realización particular, dicho gen de resistencia al estrés salino
puede encontrarse inserto en el genoma del microorganismo
recombinante, mientras que, en otra realización particular, se
encuentra en un plásmido o en un vector episomal que se replica
dentro del microorganismo. La introducción de genes dentro de un
microorganismo es un procedimiento de rutina para el experto en la
materia, que puede llevarse a cabo mediante cualquiera de los
métodos recogidos en el estado de la técnica, por ejemplo, en
Sambrook et al., "Molecular cloning, a Laboratory
Manual", 2^{nd} ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,
N.Y., 1989, Vol.
1-3.
1-3.
El gen de resistencia a estrés salino procedente
de una planta puede incorporar, operativamente unido, un promotor o
secuencia reguladora que dirija la expresión de dicho gen dentro
del microorganismo recombinante de la invención. Dependiendo del
promotor o secuencia reguladora operativamente unida al gen, la
expresión puede ser constitutiva o inducible. El empleo de un
promotor o secuencia reguladora inducible permite expresar el gen
únicamente bajo unas condiciones concretas, por ejemplo, en
respuesta a estrés salino o en respuesta a sal en el medio y, con
ello, ahorrar energía en la expresión de dichos genes cuando dichas
condiciones no están presenten.
\newpage
Por tanto, en una realización particular, la
invención se relaciona con un microorganismo del género
Pseudomonas sp., recombinante, que contiene un gen de
resistencia a estrés salino procedente de una planta cuya expresión,
ya sea inserto en el genoma, en un plásmido o en un vector, es
constitutiva o inducible.
Adicionalmente, el microorganismo recombinante
de la invención puede comprender un gen marcador o "reporter"
unido operativamente al gen de resistencia a estrés salino
procedente de una planta, que permita, no sólo la identificación de
dicho microorganismo recombinante, sino también conocer si dicho
gen de resistencia a estrés salino se está expresando. Ejemplos
ilustrativos, no limitativos, de dichos genes marcadores o
"reporter" que pueden ser utilizados en la presente invención
incluyen el gen lacZ que codifica la
\beta-galactosidasa, el gen xylE que
codifica la catecol 2,3-dioxigenasa, etc.,
ventajosamente situados en posición 3' respecto al gen de
resistencia a estrés salino procedente de una planta.
El gen de resistencia a estrés salino procedente
de una planta contenido en el microorganismo recombinante de la
invención permite a dicho microorganismo no sólo estimular el
crecimiento de las plantas bajo condiciones de estrés salino, sino
que además, permite al propio microorganismo sobrevivir bajo
condiciones de desecación ambiental e incluso, bajo condiciones
severas de desecación, como aquéllas que se producen en el proceso
de liofilización. De hecho, en una realización particular, el
microorganismo recombinante de la invención se encuentra en
forma
liofilizada.
liofilizada.
Tal como se utiliza en esta descripción, la
expresión "desecación ambiental" hace referencia a
aquella condición ambiental en donde la humedad del suelo está por
debajo del 30% de la capacidad de campo.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un cultivo de un microorganismo recombinante de la invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
una composición agrícola, en adelante composición agrícola de la
invención, que comprende un microorganismo recombinante de la
invención junto con un vehículo agrícolamente aceptable. Dicha
composición agrícola de la invención puede contener una población de
microorganismos donde, al menos, uno de ellos es un microorganismo
recombinante de la invención. La composición agrícola de la
invención puede ser utilizada para los mismos fines que el
microorganismo recombinante de la invención. La concentración de
microorganismo recombinante de la invención en la composición
agrícola de la invención puede variar dentro de un amplio
intervalo; no obstante, en una realización particular, la
composición agrícola de la invención comprende entre 10^{4} y
10^{8} unidades formadoras de colonias por ml (UFC/ml) del
microorganismo recombinante de la
invención.
invención.
El término "vehículo agrícolamente
aceptable", tal y como aquí se emplea, incluye cualquier
material líquido o sólido agrícolamente aceptable que pueda añadirse
y/o mezclarse con el microorganismo recombinante de la invención,
para ponerlo en una forma de aplicación más sencilla o mejorada, o
bien con una intensidad de activación aplicable o deseable. Debido
a la naturaleza del ingrediente activo de la composición (el
microorganismo recombinante de la invención), dicho vehículo
agrícolamente aceptable tiene que permitir o no perjudicar ni
comprometer la viabilidad dicho microorganismo.
La composición agrícola de la invención puede
emplearse bien en forma sólida o bien en forma líquida, por
ejemplo, en forma de un polvo humectable o de un concentrado
emulsionable que incorpora los diluyentes convencionales. Dichas
composiciones pueden obtenerse de manera tradicional, por ejemplo,
mezclando el microorganismo recombinante de la invención con un
diluyente y opcionalmente con otros ingredientes de formulación,
como los conocidos por el experto en la materia.
La composición agrícola de la invención puede
formularse de manera que resulte apta para su administración por
aspersión, riego, fumigación o cualquier otro procedimiento de
administración agrícola conocida en el estado de la técnica.
Adicionalmente, en una realización particular,
la composición agrícola de la invención comprende compuestos que
estimulan y/o regulan el crecimiento de las plantas. Ejemplos
ilustrativos, no limitativos, de compuestos que estimulan y/o
regulan el crecimiento de las plantas incluyen, entre otros, las
hormonas vegetales, entre las que se incluyen, pero no se limitan
a, auxinas [ácido indol acético (IAA), ácido naftilacético (ANA),
ácido indolbutírico (AIB), 2,4-D,
2,4,5-T, etc.], citoquinas, giberelinas (ácido
giberélico, entre los más comunes, GA1, GA3, GA4, GA7 y GA9), ácido
abscísico (ABA), etileno, etc.
La composición agrícola de la invención puede
contener, además, otros ingredientes o constituyentes que son
empleados habitualmente en las composiciones agrícolas y que son
conocidas por el experto en la materia, tales como, pero no
limitadas a, solventes, agentes activos o reguladores de pH,
fertilizantes, etc., siempre y cuando todos ellos permitan o no
perjudiquen ni comprometan la viabilidad del microorganismo
recombinante proporcionado por la presente invención.
El experto en la materia conoce las distintas
formas de administración de productos agrícolas, los vehículos a
utilizar y sus procedimientos de fabricación, información que puede
encontrarse en libros específicos del campo.
\newpage
Las distintas aplicaciones del microorganismo
recombinante de la invención o la composición agrícola de la
invención constituyen aspectos adicionales de la presente
invención.
Así, en otro aspecto, la invención se relaciona
con método para estimular el crecimiento de una planta bajo
condiciones destrés salino que comprende aplicar una cantidad eficaz
de un microorganismo de la invención o de una composición agrícola
de la invención al suelo que rodea a dicha planta y/o la raíz de
dicha planta. La aplicación de dicho microorganismo o composición
agrícola se lleva a cabo por métodos convencionales conocidos por
los expertos en la materia.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un método para estimular el crecimiento de una planta bajo estrés
salino que comprende:
- (i)
- sembrar una semilla de dicha planta recubierta total o parcialmente con un microorganismo de la invención o con una composición agrícola de la invención, o
- (ii)
- aplicar un microorganismo de la invención o una composición agrícola de la invención a una semilla de dicha planta.
En una realización particular, la semilla de la
planta está recubierta total o parcialmente con un microorganismo
de la invención o con una composición agrícola de la invención. En
otra realización particular, un microorganismo de la invención o una
composición agrícola de la invención se aplica a una semilla de
dicha planta; la aplicación de dicho microorganismo o composición
agrícola puede hacerse simultáneamente con la siembra de la semilla
o después de haber sembrado la semilla de la planta. Estas etapas
se llevan a cabo por métodos convencionales conocidos por los
expertos en la materia.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un método para restaurar un ecosistema dañado por el avance de la
desertización, o para restaurar un ecosistema dañado por la
salinización del suelo o para impedir el avance de la salinización
de los suelos, que comprende aplicar una cantidad eficaz de un
microorganismo de la invención o de una composición agrícola de la
invención al suelo del ecosistema, a una planta o plántula de dicho
ecosistema, a una planta o plántula colonizadora de dicho
ecosistema, al suelo que rodea a dicha planta, a la raíz de dicha
planta, y/o a las semillas de dicha planta.
Tal como aquí se utiliza, el término
"plántula" se refiere a aquella semilla que acaba de
germinar o a aquella planta que se encuentra en un estado de
desarrollo temprano, por ejemplo, en los tres o cuatro primeros
días posteriores a la germinación. Cuando ya han pasado más días,
se considera una planta.
Los métodos descritos en la presente invención
pueden aplicarse a plantas de todo tipo, tales como plantas
hortícolas, plantas de cereales, plantas frutales, plantas
arvenses, plantas forrajeras, plantas ruderales, plantas
ornamentales, etc.
En una realización particular, en cualquiera de
los métodos descritos previamente, la planta se selecciona entre
una planta hortícola o una planta de cereal o una planta
frutal.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
una semilla o una planta recubierta total o parcialmente por un
microorganismo de la invención o por una composición agrícola de la
invención.
Análogamente, tal como se ha indicado para los
métodos descritos en la presente invención, dicha semilla o planta
recubierta total o parcialmente por un microorganismo de la
invención o por una composición agrícola de la invención, es de una
planta hortícola, planta de cereal, planta frutal, plantas
arvenses, plantas forrajeras, plantas ruderales, etc. En una
realización particular, la semilla o la planta es una planta
hortícola, una planta de cereal, una planta frutal, etc. Ejemplos
ilustrativos, no limitativos, de dichas plantas incluyen maíz,
tomate, pimiento, berenjena, melón, sandía, naranja, etc. En una
realización todavía más particular, la planta de cereal pertenece
al género Zea sp., preferentemente, Z. mays.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un procedimiento para crecer una planta en condiciones de estrés
salino que comprende poner en contacto dicha planta, una plántula
de dicha planta, sus raíces, o su semilla con un microorganismo de
la invención o con una composición agrícola de la invención. La
aplicación de dicho microorganismo o composición agrícola se lleva
a cabo por métodos convencionales conocidos por los expertos en
la
materia.
materia.
A continuación se describen algunos ejemplos
ilustrativos que ponen de manifiesto las características y ventajas
de la invención, no obstante, no se deben interpretar como
limitativos del objeto de la invención tal como están definidas en
las reivindicaciones.
\newpage
Ejemplo
1
Los genes de resurrección (ALDRXV4,
XvPer1 y XVSAP1) proceden de la planta Xerophyta
viscosa [Garwe, D., et al., 2003. Molecular
characterization of XVSAP1, a stress-responsive
gene from the resurrection plant Xerophyta viscosa Baker. J.
Exp. Botany, 54:191-201; Mowla, S. B., et al,
2002. A novel stress-inducible antioxidant enzyme
identified from resurrection plant Xerophyta viscosa Baker.
Planta, 215:716-726; Mundree, S.G., et al.,
2000. An aldose reductase homolog from the resurrection plant
Xerophyta viscosa Baker. Planta, 211:693-700]
y están disponibles en plásmidos derivados de los vectores de
clonación pGEMT-easy (Promega) y pSK (Stratagene).
Por conveniencia, para llevar a cabo la clonación de los genes en el
sitio NotI del vector binario pCNB5 [De Lorenzo, V., et
al., 1993. Analysis of Pseudomonas gene products using
lacIq/Ptrp-lac plasmids and transposons that confer
conditional phenotypes. Gene, 123:17-24], los genes
ALDRXV4 y XVSAP1 se subclonaron en el vector pGEMT1
easy (Promega). Para ello se amplificaron usando los siguientes
pares de cebadores:
\vskip1.000000\baselineskip
(SEQ ID NO:
1)Cebador 1: 5'-ATG GCG CAT GCA CCG
TGT
TTT-3'
(SEQ ID NO:
2)Cebador 2: 5'-TTA GAC TTC ACC GTC
CCA
GAG-3'
que amplifican un producto de 960
pb (pares de bases) correspondiente al gen completo que codifica
una aldosa reductasa (Mowla, et al, 2002, citado et
supra).
\vskip1.000000\baselineskip
(SEQ ID NO:
3)Cebador 1: 5'-ATG AGG AAC GAG GGT
TTT
CTG-3'
(SEQ ID NO:
4)Cebador 2: 5'-TTA AAA TTC AGC TTC
ATA
GAT-3'
que amplifican un producto de 798
pb correspondiente al gen completo que codifica para una proteína
de función desconocida y que se induce en condiciones de estrés
(Garwe, et al.,2003, citado et
supra).
Para experimentos posteriores, el gen
XvPer1 fue amplificado con los cebadores:
(SEQ ID NO:
5)Cebador 1: 5'-ATG CCG GGG CTC ACC
ATT
GGC-3'
(SEQ ID NO:
6)Cebador 2: 5'-TCA GAC GTT CGT AAA
ACG
AAG-3'
que amplifican un producto de 660
pb correspondiente al gen completo que codifica para
1-Cys Peroxiredoxina (Mundree et al., 2000,
citado et
supra).
Cada uno de los plásmidos que portan los genes
de resurrección (GR) se digirió con NotI, y, después de su
electroforesis en un gel de agarosa, los insertos se purificaron y
clonaron en el sitio NotI del vector pCNB5, un plásmido de la
serie pUT que porta un transposón
mini-Tn5lacI_{q}/P_{trc}; cada
construcción fue posteriormente transformada en Escherichia
coli CC118 \lambdapir. Los transformantes obtenidos se
seleccionaron en medio LB [Sambrook et al. (1989) Molecular
Cloning: A laboratory Manual 2ª edición, Cold Spring Harbor
Laboratory Press], con kanamicina (Km) y ampicilina (Ap). Los
plásmidos recombinantes se purificaron de 5 clones positivos
representantes de cada gen y se digirieron con KpnI y
NaeI o NheI para determinar la orientación en la que
se insertaron (Tabla 1). Un clon de cada construcción en la
orientación correcta se mantuvo para ulteriores ensayos. Las
construcciones fueron designadas como pJMR1, pJMR2 y pJMR3 (Figuras
1, 2 y 3) que portan los genes XvPer1, XVSAP1 y
ALDRXV4,
respectivamente.
respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Los plásmidos que portan los genes de
resurrección con la orientación correcta (pJMR1, pJMR2 y pJMR3)
fueron transferidos a células de P. putida KT2440 [Lorenzo
et al., 1990, Mini-Tn5 transposon derivatives
for insertion mutagenesis, promoter probing, and chromosomal DNA in
gram-negative eubacteria. J. Bacteriol.
172:6568-6572] mediante conjugación triparental
(E. coli pJMR1 o pJMR2 o pJMR3, E. coli con el
plásmido auxiliar RK600, P. putida KT2440) [de Lorenzo et
al., citado supra], en la que se seleccionaron los
eventos de transposición de los genes de resurrección al genoma de
P. putida KT2440. Como medio de selección se utilizó medio
mínimo M9 [Abril et al., 1989, Regulador and enzyme
specificities of the TOL plasmad encoged upper pathway for
degradation of aromatic hydrocarbons and expression of the substrate
range of the pathway, J. Bacteriol. 171:6782-6790]
con citrato como fuente de carbono y cloramfenicol (Cm) y
kanamicina (Km). Los clones que crecieron en el medio de selección
[P. putida KT2440::MiniTn5Km:GR (Gen de Resurrección)] se
comprobaron por PCR de colonia (usando los cebadores citados en el
Ejemplo 1) (Figura 4) y por hibridación de ADN total de distintos
clones de P. putida KT2440::MiniTn5Km:GR gen de resurrección
cortado con KpnI. Las sondas de hibridación que se usaron
fueron cada uno de los genes de resurrección amplificados por
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando dUTP como molécula
de marcaje. Los clones analizados contienen los genes de
resurrección insertados en distintos sitios del genoma.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
P. putida KT2440 crece en medio LB con un
tiempo de generación de 35 minutos y alcanza una densidad celular
alta (9x10^{9} unidades formadoras de colonia (UFC)/ml, densidad
óptica (OD_{660}) 5 aproximadamente). Cuando el medio LB se
suplementó con NaCl 0,4 M, la tasa de crecimiento de esta cepa
disminuyó y el tiempo de duplicación fue de alrededor de 90
minutos; sin embargo, los cultivos celulares alcanzaron una
densidad óptica alta en fase avanzada de crecimiento (OD_{660}: 4
aproximadamente), con un alto número de células (8x10^{8} UFC/ml),
aunque ligeramente inferior al obtenido sin estrés salino. Cuando
el medio de cultivo se suplementó con NaCl 0,6 M el crecimiento se
vio notablemente retardado, aunque tras 24 horas de incubación la
OD_{600} fue de 3,75 y el número de células capaz de sobrevivir
bajo estas condiciones fue de 6x10^{8} UFC/ml. Tomando como base
que la concentración de NaCl 0,6 M afecta el crecimiento de P.
putida KT2440 (Figura 5), 15 clones recombinantes de P.
putida conteniendo los genes de resurrección (XvPer1,
XVSAP1 o ALDRXV4) y la cepa silvestre se cultivaron
en medio LB líquido hasta densidad óptica de 0,8. A partir de estos
cultivos se realizaron diluciones seriadas y se sembraron en medios
LB gelificados en presencia o ausencia de NaCl 0,6 M. El número de
bacterias capaz de crecer en medios sólidos con cloruro de sodio
fue muy reducido en la cepa silvestre (4x10^{4} UFC/ml) comparado
con su control que crece en LB sin estrés salino (1x10^{8}
UFC/ml). En cambio, las cepas recombinantes fueron capaces de crecer
en números altos en presencia de NaCl 0,6 M (6x10^{6} a
1x10^{8} UFC/ml), incluso en números similares a los observados
en medio LB sin NaCl (1x10^{8} UFC/ml). Se muestran algunos
resultados en las Figuras 6 y 7. Esta ventaja de las cepas
recombinantes fue independiente de donde se insertasen los genes de
resurrección y es un efecto constitutivo en las cepas recombinantes
de P. putida KT2440.
Algunas de las cepas recombinantes de P.
putida que contenían los genes de resurrección capaces de
tolerar una dosis de NaCl 0,6 M en placa, fueron elegidas al azar y
cultivadas en medio LB líquido en presencia o ausencia de NaCl para
determinar sus curvas de crecimiento. Se observó que las cepas
recombinantes de P. putida que contenían el gen
XvPer1 eran capaces de crecer en medio LB líquido en
presencia de NaCl con un tiempo de generación similar al observado
en ausencia de NaCl. Sin embargo, las cepas de P. putida que
contenían los genes XVSAP1 y ALDRXV4 mostraron un
tiempo de generación menor en medio LB líquido en presencia de NaCl
que en ausencia de éste (a pesar de que en el cultivo de placa eran
capaces de crecer en presencia de alta concentración de NaCl).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
En un trabajo anterior los inventores habían
demostrado que P. putida KT2440 es particularmente sensible
al proceso de desecación como aquel que se produce por
liofilización [Muñoz-Rojas et al., 2006,
Appl. Environ. Microbiol. 72:472-477]. Se sabe que
las células en fase exponencial son menos tolerantes a la
liofilización que las células en la fase estacionaria y que la
trehalosa es mejor crioprotector que el mio- inositol. Las cepas
recombinantes que portan los genes de resurrección, así como la
cepa silvestre se sometieron al proceso de liofilización bajo
condiciones poco favorables para su supervivencia (fase exponencial
y usando mio-inositol como crioprotector). La cepa
silvestre bajo estas condiciones presentó una tasa de supervivencia
menor que las cepas recombinantes bajo condiciones de inducción con
IPTG. Los resultados obtenidos y las cepas utilizadas se muestran
en la Tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La Tabla 2 recoge la tasa de supervivencia
bacteriana de las diferentes cepas de P. putida KT2440 a
condiciones de liofilización usando mio-inositol
como crioprotector. Antes de la liofilización las cepas fueron
crecidas bajo dos tratamientos diferentes (LB o LB+IPTG). El número
de células de las suspensiones antes de liofilizarlas están en el
intervalo de 3x10^{8} a 5x10^{8} UFC/ml. Letras iguales dentro
del gráfico significan que los valores no difieren
significativamente a p= 0,05.
La cepa recombinante que porta el gen
XvPer1 es más resistente al proceso de liofilización aun
cuando no hay inducción con IPTG. Esto implica que los genes de la
planta confieren tolerancia a desecación impuesta por las
condiciones artificiales como aquellas aplicadas a los cultivos
bajo condiciones de liofilización. Debido a ello se llevaron a cabo
ensayos de desecación bajo condiciones ambientales para la cepa
silvestre y las cepas modificadas. Para ello, alícuotas de 1 ml de
cada una de las cepas cultivadas hasta fase estacionaria se
centrifugaron, lavaron y su contenido celular se desecó bajo
condiciones ambientales. Con el tiempo, tres muestras de cada cepa
fueron rehidratadas y en cada caso se determinó el número de
células (Figura 8). Se encontró que la tasa de supervivencia de la
cepa silvestre y la de las cepas recombinantes disminuyó con el
tiempo. Sin embargo, la disminución de la supervivencia fue mayor en
la cepa silvestre que en las bacterias recombinantes. Debe notarse
que, después de 50 días bajo condiciones de desecación a aire
ambiental, solo sobrevivieron alrededor de 10^{3} UFC/ml de la
cepa silvestre, mientras que el número de células que se rescataron
de las cepas recombinantes fue mayor en dos órdenes de magnitud
(Figura 9). Los resultados se apreciaron mejor bajo condiciones de
inducción con IPTG e indicaron que los genes de resurrección
conferían una tolerancia aumentada a condiciones de estrés por
desecación en P. putida
KT2440.
KT2440.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Para conocer la tolerancia natural del maíz a
salinidad, las semillas se germinaron en medio MS [Murashigue and
Skoog (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with
tobacco tissue cultures. Physiol Plant
15(3):473-497] conteniendo distintas
concentraciones de NaCl (Figura 10). Una concentración 50 mM es
suficiente para inhibir completamente la germinación. Sin embargo,
dicha concentración no inhibió del todo el crecimiento de las
plantas de maíz cuando estas habían sido previamente germinada en
MS sin NaCl. La variedad de maíz usada para los experimentos fue
Girona (Especie: Maíz Híbrido Simple).
La inoculación se realizó sumergiendo las
semillas de maíz germinadas en una suspensión bacteriana
(conteniendo la respectiva cepa modificada con el gen xvPer o
la cepa silvestre P. putida KT2440 sin modificar
genéticamente) durante una hora. La suspensión bacteriana en cada
caso contenía 1x10^{9} UFC/ml y se obtuvo de cultivos en fase
estacionaria. Después de la inoculación las semillas germinadas se
plantaron en tubos Falcon conteniendo vermiculita fina (40 ml),
adicionándose a estos tubos 25 ml de solución MSJ (MS sin sacarosa,
ni fitagel), ó 25 ml de MSJ-NaCl 50 mM. Los tubos
se colocaron bajo condiciones controladas en cámaras de cultivo a
24°C con periodos de luz/oscuridad 16/8 horas. Al día siguiente (1
dpi = día posterior a la inoculación) las tapas de los tubos Falcon
se retiraron. El número de bacterias que fue capaz de adherirse a
las raíces y semillas de maíz se determinó a las 0 y 24 horas dpi, y
se encontró que fue del orden de 1 x 10^{7} UFC/semilla tanto
para la cepa silvestre como para las cepas recombinantes.
Las plantas se regaron a los 4 dpi con 20 ml de
una solución de MS o MS-NaCl (56 mM), de acuerdo al
tratamiento correspondiente. En lo sucesivo, éstas se regaron
solamente con agua estéril miliQ, periódicamente. A los 15 dpi, las
plantas se fotografiaron y se determinó el número de unidades
formadoras de colonia (UFC) de cada cepa asociada a la rizosfera
así como el peso seco de las plantas.
En general, la apariencia de las plantas (Figura
11) inoculadas con las cepas modificadas fue similar a la de las
plantas inoculadas con la cepa silvestre o las plantas no
inoculadas, cuando estas no fueron sometidas a estrés salino. Las
plantas no inoculadas fueron las más afectadas por el estrés
salino, las inoculadas con la cepa silvestre también estaban
afectadas, pero su crecimiento fue ligeramente mejor que el de las
plantas no inoculadas. Interesantemente, las plantas inoculadas con
las cepas modificadas tienen un crecimiento mayor que el de las
plantas inoculadas con la cepa silvestre y mucho mayor al de las
plantas no inoculadas, lo que sugiere que las bacterias
recombinantes aportan una mejor tolerancia al NaCl para la
planta.
El número de UFC de las cepas recombinantes por
gramos de raíz de las plantas inoculadas con estas cepas fue
similar al número de bacterias de la cepa silvestre por gramos de
raíz de maíz, cuando las plantas no se sometieron a estrés salino.
Sin embargo, el número de UFC de la cepa silvestre colonizando la
rizosfera de las plantas estresadas por cloruro de sodio (56 mM)
fue menor que el de las cepas recombinantes. De hecho, la cepa
silvestre fue la única que se vio afectada en la situación de estrés
(Figura 12).
Cuando no hubo situación de estrés salino, el
peso seco aéreo de las plantas sin inocular con bacterias fue muy
similar al de las plantas inoculadas con la cepa silvestre y al de
aquellas inoculadas con las cepas recombinantes. Bajo condiciones de
estrés salino (56 mM), el peso seco de estas plantas fue menor que
el de las plantas no estresadas. No obstante, en estas condiciones
de estrés salino, el peso seco de las plantas inoculadas con las
cepas recombinantes fue mayor que el de las plantas inoculadas con
la cepa silvestre; y a su vez éste fue mayor que el peso seco de las
plantas no inoculadas (Figura 13).
El peso seco de la raíz de las plantas sin
inocular con bacterias fue muy similar al de las plantas inoculadas
con la cepa silvestre y al de aquellas inoculadas con las cepas
recombinantes, en condiciones de ausencia de estrés salino. Bajo
condiciones de estrés salino (56 mM), el peso seco de la raíz de
estas plantas fue menor que el de las plantas no estresadas. No
obstante, bajo estas condiciones, el peso seco de la raíz de las
plantas inoculadas con las cepas recombinantes fue mayor que el de
las plantas no inoculadas (Figura 14) y solo ligeramente mayor que
el de las plantas inoculadas con la cepa silvestre, pero no
estadísticamente significativo por t-student. Las plantas
inoculadas con la cepa silvestre tienen un peso seco de raíz mayor
al de las no inoculadas bajo condiciones de
estrés.
estrés.
En conclusión, el crecimiento de las plantas
inoculadas con las cepas recombinantes se vio favorecido bajo
condiciones de estrés salino. No obstante, la cepa silvestre
también ofreció a las plantas un mejor crecimiento bajo condiciones
de estrés salino con respecto a las plantas no inoculadas, aunque
este crecimiento fue menor que el que permiten las cepas
recombinantes. El hecho de que la presencia de bacterias en el
medio favorezca el crecimiento de las plantas bajo condiciones de
estrés salino, es posible que se deba a que las bacterias producen
solutos compatibles que ayudan a la planta a soportar el estrés
provocado por la alta concentración de sales. Por lo tanto, si las
cepas recombinantes son capaces de tolerar mayor concentración de
sal que las cepas silvestres, podrán llevar a cabo este proceso de
manera más eficiente y favorecer el crecimiento de las plantas.
Por otro lado, el número de cepas recombinantes
asociadas a las plantas en presencia de estrés salino es muy
similar al número de cepas recombinantes asociadas a plantas en
ausencia de dicho estrés, situación que no ocurre en el caso de
cepas silvestres, donde el número de cepas silvestres asociadas a
las plantas en condiciones de estrés es menor que en condiciones
normales. Esta diferencia en el número de cepas asociadas a las
plantas no explicaría del todo por qué la cepa silvestre no protege
a las plantas bajo condiciones de estrés salino al mismo nivel que
las cepas recombinantes. Se cree que los mecanismos involucrados en
la antioxidación derivada de los genes de resistencia a estrés
salino que portan las cepas modificadas también benefician a las
plantas, pues es posible que la expresión de dichos genes de
resistencia implica un mejor funcionamiento metabólico que permite
una acumulación temprana y efectiva de los solutos compatibles. Así,
las plantas se benefician de forma más efectiva cuando están en
interacción con las cepas recombinantes que con la silvestre.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Se realizaron ensayos similares a los descritos
en el Ejemplo 5 con plantas de pimiento salvo que la concentración
de NaCl fue de 3 mM, que es la que tolera esta planta. Los
resultados fueron similares (datos no mostrados).
<110> Consejo Superior de Investigaciones
Científicas, CSIC
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<120> Microorganismos recombinantes que
contienen un gen de resistencia a estrés salino y sus
aplicaciones
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<160> 6
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<210> 1
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador 1 diseñado para amplificar
el gen ALDRXV4
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatggcgcatg caccgtgttt t
\hfill21
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
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<223> Cebador 2 diseñado para amplificar
el gen ALDRXV4
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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\hskip-.1em\dddseqskipttagacttca ccgtcccaga g
\hfill21
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<210> 3
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220> ADN sintético
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<223> Cebador 1 diseñado para amplificar
el gen XVSAP1
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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\hskip-.1em\dddseqskipatgaggaacg agggttttct g
\hfill21
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<210> 4
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220> ADN sintético
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<223> Cebador 2 diseñado para amplificar
el gen XVSAP1
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<400> 4
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\hskip-.1em\dddseqskipttaaaattca gcttcataga t
\hfill21
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<210> 5
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220> ADN sintético
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<223> Cebador 1 diseñado para amplificar
el gen XvPer1
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<400> 5
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<210> 6
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador 2 diseñado para amplificar
el gen XvPer1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcagacgttc gtaaaacgaa g
\hfill21
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Claims (26)
1. Un microorganismo del género
Pseudomonas sp., recombinante, que contiene un gen de
resistencia a estrés salino procedente de una planta.
2. Microorganismo según la reivindicación 1,
donde el microorganismo es P. putida.
3. Microorganismo según la reivindicación 1,
donde el microorganismo es P. fluorescens.
4. Microorganismo según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde el gen de resistencia a estrés
salino se encuentra inserto en el genoma del microorganismo o en un
plásmido del mismo o en un vector que se replica dentro del
microorganismo.
5. Microorganismo según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde el gen de resistencia a estrés
salino se expresa de forma constitutiva.
6. Microorganismo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, donde el gen de resistencia a estrés salino
se expresa de forma inducible.
7. Microorganismo según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde el gen de resistencia a estrés
salino es un gen de resurrección que procede de una planta halófita
o xerófita.
8. Microorganismo según la reivindicación 7,
donde la planta xerófita pertenece al género Xerophyta
sp.
9. Microorganismo según la reivindicación 8,
donde la planta del género Xerophyta sp. es X.
viscosa.
10. Microorganismo según la reivindicación 9,
donde el gen procedente de X. viscosa se selecciona entre
los genes ALDRXV4, XvPer1 y XVSAP1.
11. Microorganismo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, donde el gen de resistencia a estrés salino
tiene una secuencia de nucleótidos que presenta una homología de,
al menos, un 70% con los genes ALDRXV4, XvPer1 o
XVSAP1 procedentes de X viscosa.
12. Microorganismo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, en forma liofilizada.
13. Un cultivo de un microorganismo recombinante
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
14. Una composición agrícola que comprende un
microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12,
junto con un vehículo agrícolamente aceptable.
15. Composición agrícola según la reivindicación
14, que comprende, además, un compuesto que estimula y/o regula el
crecimiento de las plantas.
16. Un método para estimular el crecimiento de
una planta bajo estrés salino que comprende aplicar una cantidad
eficaz de un microorganismo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12 o de una composición agrícola según
cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 15, al suelo que rodea a
dicha planta y/o a la raíz de dicha planta.
17. Un método para estimular el crecimiento de
una planta bajo estrés salino que comprende:
- (i)
- sembrar una semilla recubierta total o parcialmente con un microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o con una composición agrícola según cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 15; o
- (ii)
- aplicar a una semilla de dicha planta un microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o una composición agrícola según cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 15.
18. Un método para restaurar un ecosistema
dañado por el avance de la desertización, o para restaurar un
ecosistema dañado por la salinización del suelo o para impedir el
avance de la salinización de los suelos, que comprende aplicar una
cantidad eficaz de un microorganismo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, o de una composición agrícola según
cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 15, al suelo del
ecosistema, a una planta o plántula de dicho ecosistema, a una
planta o plántula colonizadora de dicho ecosistema, al suelo que
rodea a dicha planta, a la raíz de dicha planta, y/o a las semillas
de dicha planta.
19. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 18, en donde la planta se selecciona entre
una planta hortícola, una planta de cereal y una planta frutal.
\newpage
20. Una semilla recubierta total o parcialmente
con un microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a
12, o con una composición agrícola según cualquiera de las
reivindicaciones 14 ó 15.
21. Semilla según la reivindicación 20, donde
dicha semilla es una semilla de una planta seleccionada entre una
planta hortícola, una planta de cereal y una planta frutal.
22. Semilla según la reivindicación 21, donde
dicha semilla es una semilla de Zea sp., preferentemente, de
Z. mays.
23. Una planta recubierta total o parcialmente
con un microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a
12, o con una composición agrícola según cualquiera de las
reivindicaciones 14 ó 15.
24. Planta según la reivindicación 23, donde
dicha planta se selecciona entre una planta hortícola, una planta
de cereal y una planta frutal.
25. Planta según la reivindicación 24, donde
dicha planta de cereal pertenece al género Zea sp.,
preferentemente, Z. mays.
26. Un procedimiento para crecer una planta en
condiciones de estrés salino que comprende poner en contacto dicha
planta, una plántula de dicha planta, sus raíces, o su semilla, con
un microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, o
con una composición agrícola según cualquiera de las
reivindicaciones 14 ó 15.
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|---|---|---|---|
| ES200602012A ES2307391B1 (es) | 2006-07-26 | 2006-07-26 | Microorganismos recombinantes que contienen un gen de resistencia a estres salino y sus aplicaciones. |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| ES200602012A ES2307391B1 (es) | 2006-07-26 | 2006-07-26 | Microorganismos recombinantes que contienen un gen de resistencia a estres salino y sus aplicaciones. |
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|---|---|
| ES2307391A1 ES2307391A1 (es) | 2008-11-16 |
| ES2307391B1 true ES2307391B1 (es) | 2009-09-28 |
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ID=39926834
Family Applications (1)
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| ES200602012A Expired - Fee Related ES2307391B1 (es) | 2006-07-26 | 2006-07-26 | Microorganismos recombinantes que contienen un gen de resistencia a estres salino y sus aplicaciones. |
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|---|---|
| ES (1) | ES2307391B1 (es) |
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|---|---|---|---|---|
| US6156953A (en) * | 1997-06-03 | 2000-12-05 | University Of Chicago | Plant artificial chromosome compositions and methods |
| HU230555B1 (hu) * | 2001-08-13 | 2016-12-28 | Biofil Kft. | Környezetbarát mikroorganizmus-készítmény és annak előállítása |
-
2006
- 2006-07-26 ES ES200602012A patent/ES2307391B1/es not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| GLICK B.R. et al. Early development of canola seedlings in the presence of the plant growth-promoting rhizobacterium Pseudomonas putida GR12-2. Soil Biology and Biochemistry 1997, Vol. 29, N$^{o}$ 8, resumen. * |
| MOWLA S.B. et al. A novel stress-inducible antioxidant enzyme identified from the resurrection plant Xerophyta viscosa Baker. Planta 2002, Vol. 215, resumen. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2307391A1 (es) | 2008-11-16 |
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