ES2992243B2 - Nueva cepa de Pseudomonas y sus usos como agente de biocontrol y como bioestimulante en plantas - Google Patents

Description

DESCRIPCIÓN

Nueva cepa dePseudomonasy sus usos como agente de biocontrol y como bioestimulante en plantas

La presente invención pertenece al campo técnico de la microbiología, particularmente a la microbiología agrícola. La presente invención se refiere a una nueva cepa dePseudomonas,con número de depósito CECT 30310, y su uso como agente de biocontrol de patógenos, preferiblemente frente aOlpidium virulentussp., vector de los virus causantes de la enfermedad de la vena ancha de la lechuga y/o como bioestimulante del crecimiento de una planta y como agente inductor de resistencia a estrés en una planta.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La agricultura intensiva implica la aplicación de importantes cantidades de fitosanitarios y fertilizantes químicos, que a menudo conduce a la acumulación de metales pesados, a la disminución de la diversidad microbiana y de nutrientes disponibles para el cultivo. Además, el uso continuado de fertilizantes supone una amenaza para el medio ambiente por la lixiviación de nitratos, lavado superficial del fósforo y nitrógeno y eutrofización de los ecosistemas acuáticos, con el aumento de la concentración de nitrógeno en el agua que puede ser consumida(Vivian Z., Larsona J. A., Yinb, X., Savoyc H. J., McCIureb A. M., Essingtonc M. E. and Boyera Ch. N. (2018). Profitability of enhanced efficiency urea fertilizers in no-tillage corn production. Agron. J. Abs. - Crop Econ. Prod. Manag.

110(4):1439-1446).El uso de microorganismos como agentes de bioestimulación o de biocontrol, se está investigando para mantener la productividad agrícola y preservar el medio ambiente. Así, el manejo integrado de la fertilización usando microorganismos puede mejorar la absorción de nutrientes y la eficiencia de los fertilizantes, reducir las cantidades de estos químicos y la aportación de fósforo o nitrógeno(Satyaprakash M., Nikitha T. and Reddi E. U. B. (2017). Phosphorous and phosphate solubilising bacteria and their role in plant nutrition. Int. J. Curr. Microbiol. App. Sci, 6 (4): 2133-2144).

Los biofertilizantes son fertilizantes orgánicos naturales que contribuyen a poner a disposición de las plantas los nutrientes necesarios y mejoran la calidad del suelo al crear un entorno microbiológico natural, que reduce la población de microorganismos fitopatógenos. Se conocen gran número de bacterias que destacan por su potencial como biofertilizante(Prabakaran Elavarasi, Muthuraman Yuvaraj and Pandurangan Gayathri. (2020). Application of Bacteria as a Prominent Source of Biofertilizers. doi: 10.5772/intechopen.89825),entre ellas el géneroPseudomonas.Los efectos positivos que ejercen estas bacterias en las plantas radican en la producción y segregación de reguladores del crecimiento como auxinas, giberelinas y citoquininas, que mejoran la germinación de semillas, la nutrición mineral, el desarrollo de raíces, la absorción de agua, entre otros.

Los bioestimulantes actúan sobre la fisiología de la planta, mejoran el vigor del cultivo, el rendimiento y la calidad de la cosecha, la disponibilidad y absorción de nutrientes, e incrementan la tolerancia a estreses abióticos. Los bioestimulantes y biofertilizantes pueden tener efectos positivos en la mitigación de enfermedades causadas por microorganismos fitopatógenos. Debido a que contribuyen a modificar el metabolismo de las plantas haciéndolas más tolerantes a los síntomas de la enfermedad, a promover su crecimiento enmascarando los síntomas de ésta y/o a ocupar nichos ecológicos que podrían ser ocupados por los microorganismos patógenos(Bhattacharyya P.&Jha D. (2012). Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR): emergence in agriculture. World J. Microbiol. Biotechnol., 28(4), 1327-1350).

El control de enfermedades de plantas transmitidas por el suelo es difícil debido, entre otras razones, a la limitación de las materias activas disponibles para el control de agentes patógenos del suelo. Este es el caso de la enfermedad de la vena ancha de la lechuga(Lettuce Big Vein Diseaseo LBVD), responsable de importantes pérdidas de calidad y rendimiento en cultivos de lechuga de todo el mundo. Las plantas afectadas muestran un aclaramiento de las nervaduras, con un aspecto característico de venas engrosadas, fruncimiento de las hojas, reducción del tamaño del cogollo y descenso significativo de la calidad del producto comestible(Maccarone L. D., et al 2013. Relationships between the pathogen Olpidium virulentus and viruses associated with lettuce big-vein disease. Plant Dis. 97, 700-707).LBVD puede causar pérdidas de producción de hasta el 70% en ciertas regiones, y en algunas áreas geográficas son frecuentes incidencias cercanas al 100% durante el invierno y principios de la primavera.

El virus de Mirafiori de la vena ancha de la lechuga(Mirafiori lettuce big-vein virus,MiLBVV; géneroOphiovirusspp.) junto con el virus asociado a la vena ancha de la lechuga (Lettuce big-vein associated virus,LBVaV; géneroVaricosavirusspp.) causan la enfermedad(Sasaya, T., Fujii, H , Ishikawa, K. and Koganezawa, H. (2008). Further evidence of Mirafiori lettuce big-vein virus but not of Lettuce big-vein associated virus with big-vein disease in lettuce. Phytopathology 98, 464-468).Ambos virus son transmitidos por zoosporas del hongo quitridiomiceto,Olpidium virulentus,parásito obligado de la raíz(Hartwright, L. M., Hunter, P. J. and Walsh, J. A. (2010). A comparison of Olpidium isolates from a range of host plants using internal transcribed spacer sequence analysis and host range studies. Fungal Biol. 114, 26-33; Maccarone, L. D., Barbetti M. J., Sivasithamparam K. and Jones R. A. C. (2010). Molecular genetic characterization of Olpidium virulentus isolates associated with big-vein diseased lettuce plants. Plant Dis. 94, 563-569).Las esporas de resistencia pueden permanecer latentes en el suelo durante mucho tiempo, y tanto MiLBVV como LBVaV pueden sobrevivir hasta 20 años en su interior. Por ello, el inóculo de ambos virus puede durar años, lo que hace del control de LBVD un desafío una vez que el hongo se establece en el campo. No existen estrategias de control efectivas deO. virulentusya que infecta una amplia gama de especies de malas hierbas que actúan como reservorios(Navarro J. A., Botella F., Marhuenda A., Sastre P., Sánchez-Pina M. A., and Pallas V. (2005). Identification and partial characterisation of Lettuce big-vein associated virus and Mirafiori lettuce big-vein virus in common weeds found amongst Spanish lettuce crops and their role in lettuce big-vein disease transmission. Eur. J. Plant Pathol. 113, 25-34).

Actualmente en el mercado hay pocos bioestimulantes o biofertilizantes elaborados a partir de microorganismos, y ninguno está descrito de forma específica como biofertilizante o bioestimulante para el cultivo de lechuga y mucho menos como producto de control de LBVD.

Por todo lo anteriormente descrito, y dada la gran problemática económica que supone esta enfermedad, es necesaria la búsqueda de alternativas ecológicas que prevengan o disminuyan su incidencia en el cultivo, basados en el uso de microorganismos que sean aplicables tanto en semillero como en campo y capaces de sobrevivir en el sustrato en el que se inoculan.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a una nueva cepa dePseudomonas seleniipraecipitans,la cepa ABP-B9 con número de depósito CECT 30310, con una alta capacidad bioestimulante sobre las plantas, particularmente de lechuga, espinaca, tomate, apio y melón, que genera un incremento del desarrollo del sistema radicular, al producir mayor número de raicillas secundarias, lo que puede mejorar la absorción de nutrientes (Figura 3, 5, 9, 10 y 13), tanto en semillero como en campo, y da lugar a un incremento en el desarrollo de las plantas.

Esta cepa es, además, capaz de minimizar los síntomas de la enfermedad de la vena ancha de la lechuga (LBVD) y de reducir el número de esporas producidasin vitropor el hongoOlpidium virulentus,vector de LBVD, por lo que tiene un efecto de biocontrol de los microorganismos responsables de la enfermedad (Figura 4, 12 y 13), proporcionando una solución ecológicamente sostenible frente a LBVD, así dicha cepa o una composición que la comprenda, podrían ser aplicadas tanto en cultivo convencional como en cultivo ecológico.

Así, un primer aspecto de la invención es una cepa dePseudomonas seleniipraecipitansdepositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con número de depósito CECT 30310, de aquí en adelante la "cepa de la invención”.

La cepa de la invención fue aislada a partir del sistema radicular de plantas de lechuga. La cepa fue depositada el 31 de marzo de 2021 bajo el Tratado de Budapest en la Colección Española de Cultivos Tipo como Autoridad Internacional de Depósito (con sede en el Edificio 3 CUE, Parc Científic Universitat de Valencia, C/ Catedrático Agustín Escardino, 9, 46980 Paterna (Valencia) ESPAÑA). El número de depósito asignado fue el CECT 30310. El depositante de la cepa fue ABIOPEP S.L.

La cepa de la invención es una bacteria que pertenece al géneroPseudomonasspp., particularmente a la especiePseudomonas seleniipraecipitanssp., bacterias Gram negativas de pigmentación amarilla que reducen el selenito a selenio rojo elemental, capaz de promover o estimular el crecimiento vegetal, así como de minimizar los síntomas de la LBVD y de reducir el número de esporas producidasin vitropor el hongoOlpidium virulentus(Figura 1).

En la presente invención, también están contemplados aquellos microorganismos o bacterias que derivan de la cepa de la invención y que conservan la capacidad de incrementar o promover el crecimiento de las plantas y de minimizar los síntomas de enfermedades causadas por patógenos, particularmente la enfermedad de etiología viral LBVD. Ejemplos de cepas o microorganismos derivados de la cepa de invención pueden ser mutantes que presentan variaciones en su genoma respecto al genoma de la cepa de la invención.

Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención también se refiere a una cepa derivada de la cepa de la invención. En el presente documento, los términos "mutante" o “derivado”, utilizados indistintamente, se refieren a cualquier microorganismo resultante de una mutación o modificación en el ADN de un organismo que da como resultado un carácter (fenotipo) que no se encuentra en la cepa silvestre ("wild type" en inglés o "wt") y que mantiene las características de la cepa silvestre referidas a la capacidad de bioestimular el crecimiento vegetal y de biocontrol frente a patógenos.

La cepa derivada de la cepa de la invención puede producirse de forma natural, o bien de forma intencionada por métodos de mutagénesis conocidos en el estado de la técnica como, por ejemplo, agentes mutagénicos o causantes de estrés, o mediante ingeniería genética dirigida a la modificación de genes específicos. Así, dentro de la presente invención también se contemplan mutantes genéticamente modificados derivados de la cepa de la invención.

En otra realización particular, la cepa de la invención puede estar en forma de células viables. El término “células viables” usado en la presente invención, se refiere a células vivas o viables que cuando, son suplementadas o incubadas en un medio adecuado, son capaces de dividirse y de reproducirse.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un cultivo biológicamente puro de la cepa de la invención, de aquí en adelante el “cultivo biológicamente puro de la invención” . En el presente documento se entiende por "cultivo biológicamente puro" a aquel cultivo en el que el microorganismo o la cepa de la invención se encuentra en una proporción igual o superior al 99% respecto al resto de posibles microorganismos presentes en el cultivo, y que puede contener metabolitos derivados de la cepa de la invención.

Como entiende un experto en la materia, la cepa de la invención puede estar comprendida dentro de una composición bioestimulante y/o de una composición de biocontrol frente a patógenos. Así, otro aspecto de la presente invención se refiere a una composición que comprende la cepa de la invención y/o un medio de cultivo bacteriano, de aquí en adelante la “composición de la invención”.

En otra realización particular de la presente invención, la composición de la invención comprende la cepa de la invención en forma de disolución y más preferiblemente a una concentración de entre 1103 y 11013 Unidades Formadoras de Colonias (UFC) por unidad de volumen, particularmente UFC/mL de disolución. En otra realización más particular de la invención, la concentración de la cepa de la invención es de entre 106 a 1011 UFC/mL, preferiblemente es de entre 107 a 1010 UFC/mL, ambos extremos incluidos. Preferiblemente, la concentración de la cepa de la invención es 106, 107, 108, 109 o 1010 UFC/mL.

Como entiende el experto en la materia, la cepa de la invención puede estar comprendida en cualquier disolución del estado de la técnica que conserve y mantenga viable el cultivo celular y que permita el desarrollo de la cepa de la invención. Ejemplos de disoluciones de la cepa de la invención, incluyen sin limitar a, agua, sales como KCl o NaCl y/o nutrientes (fuentes de carbono y/o nitrógeno).

Como entiende un experto en la materia, la composición de la invención además comprende al menos un excipiente o coformulante, que facilite y ayude al incremento del desarrollo y del crecimiento vegetal y/o del biocontrol frente a patógenos.

Por tanto, en otra realización particular de la invención, la composición de la invención además comprende al menos un excipiente o coformulante. En el presente documento el término “excipiente” o “coformulante” se refiere a una composición, disolución, mezcla, elemento o producto, que no es la cepa de la invención, y que es utilizado en agricultura o jardinería para facilitar, promover y ayudar el crecimiento de las plantas, mejorar la calidad o fertilidad del suelo, aumentar la viabilidad y estabilidad de la cepa de la invención, mejorar la calidad de la composición de la invención y sus usos como bioestimulante y/o agente de biocontrol frente a patógenos.

Como entiende un experto en la materia, la composición de la invención además puede comprender al menos un adyuvante. En el presente documento el término “adyuvante” se refiere a una sustancia, compuesto o producto que se incorpora a la composición de la invención para mejorar su comportamiento y funcionalidad, así como, compatibilizar y estabilizar la mezcla de productos. Así, en otra realización particular de la presente invención, la composición de la invención además comprende un adyuvante, preferiblemente donde este adyuvante se selecciona sin limitarse a, de la lista que consiste en: agentes dispersantes, correctores de pH, espesantes, agentes de re suspensión, preservantes, minerales, sales, ácidos, bases, estabilizadores, y cualquier combinación de los mismos.

En una realización particular de la presente invención, la cepa o la composición de la invención está en estado sólido (por ejemplo, liofilizada), líquido, gelificada o coloidal, o gaseoso; preferiblemente en estado líquido o sólido.

Como se ha descrito anteriormente, la cepa de la invención potencia e incrementa el desarrollo y crecimiento de las plantas y minimiza los síntomas de LBVD, reduciendo el número de esporas producidas por el hongoO. virulentus.Así, otro aspecto de la invención es el uso de la cepa o la composición de la invención como bioestimulante del crecimiento de una planta, como agente inductor de resistencia a estrés en una planta y/o como agente de biocontrol frente a un patógeno de plantas, para incrementar, estimular y potenciar el crecimiento vegetal y/o minimizar los síntomas de LBVD, de aquí en adelante el "uso de la invención” .

El término “bioestimulante”, usado en la presente invención, se refiere a un producto agrícolamente aceptable que comprende microorganismos vivos, en concreto la cepa de la presente invención, que cuando se aplica a plantas, material vegetal aislado, rizosfera o semillas, de cultivos; promueve, mejora, e incrementa el desarrollo o crecimiento vegetal, es decir, promueve el crecimiento o desarrollo del sistema radicular de las plantas, la elongación de los tallos, la floración y/o el desarrollo de frutos y semillas, ayudando a la mejora del rendimiento y la calidad de cosechas agrícolas, mejora la captación de nutrientes, eficiencia nutricional y tolerancia a estrés y que además protege frente a patógenos.

Como entiende el experto en la materia, cualquier especie de planta puede ser usada para estimular su crecimiento. Ejemplos de plantas incluyen, sin limitar a, plantas de interés agronómico o de cultivo (por ejemplo, plantas de interés en alimentación humana o animal o plantas de interés forestal) y plantas de interés ornamental. Ejemplos de plantas de interés agronómico incluyen, sin limitar a, avena, cebada, maíz, trigo, olivo, vid, almendro, soja, remolacha, patata, zanahoria, ajo, arroz, cebolla, tomate, girasol, pimiento, melón, lechuga, espinaca, apio, rúcula, brócoli, fresa, judía, naranja, manzana, melocotón, limón y pera, preferiblemente lechuga(Lactucaspp.), espinaca(Spinaceaspp.), tomate(Solanumspp.), apio(Apiumspp.), o melón(Cucumisspp.).

En otra realización particular del uso de la invención, la planta pertenece al géneroLactucaspp,Cucumisspp,Spinaceaspp.,Solanumspp., oApiumspp.

En otra realización más particular del uso de la invención, la planta pertenece a la especieLactuca sativa sp., Cucumis melo sp., Spinacea olerácea sp., Solanum lycopersicum sp., o Apium graveolens sp.

En el presente documento el término "agente inductor de resistencia a estrés en una planta” se refiere a una sustancia, un agente, medio natural, ser vivo o microrganismo, de origen natural, que controla, elimina, reduce, estabiliza las condiciones de estrés bióticos, abióticos o ambientales y fitotécnicos, en las que, la planta no realiza sus funciones fisiológicas de manera normal lo que detiene su crecimiento y desarrollo, limitando así la productividad de los cultivos.

En el presente documento el término "agente de biocontrol o control biológico frente a patógenos” se refiere a una sustancia, un agente, medio natural, ser vivo o microrganismo, de origen natural, que controla, elimina, reduce, estabiliza las plagas o enfermedades causadas por patógenos en las plantas, cosechas o cultivos agrícolas, así como la población de fitopatógenos. Ejemplos de fitopatógenos, incluyen, sin limitar a, nematodos, bacterias, virus, hongos, protozoarios, moluscos, e insectos.

En otra realización particular de la invención, la cepa o la composición de la invención se usa como agente de biocontrol frente a un patógeno, donde el patógeno es un hongo o un virus.

Particularmente, la cepa o composición de la invención minimiza los síntomas de LBVD, reduciendo el número de esporas producidas por el hongoOlpidium virulentus.El virus Mirafiori de la vena ancha de la lechuga (Mirafiori lettuce big-vein virus, MiLBVV; géneroOphiovirusspp.) y el virus asociado a la vena ancha de la lechuga (Lettuce big-vein associated virus, LBVaV; géneroVaricosavirusspp.) causan LBVD. Ambos virus son transmitidos por zoosporas del hongo quitridiomiceto,O. virulentus,que es un parásito obligado de la raíz.

Así, en otra realización más particular de la invención, la cepa o la composición de la invención se usa como agente de biocontrol frente a un hongo, donde el hongo pertenece al géneroOlpidiumspp, preferiblemente pertenece a la especieOlpidium virulentussp.

En otra realización más particular de la invención, la cepa o la composición de la invención se usa como agente de biocontrol frente al menos un virus, donde el virus pertenece al géneroOphiovirusspp. y/oVaricosavirusspp.

En otra realización aún más particular de la invención, la cepa o la composición de la invención se usa como agente de biocontrol frente a un virus, donde el virus que pertenece al géneroOphiovirusspp. es MiLBVV y/o el virus que pertenece al géneroVaricosavirusspp. es el virus LBVaV.

Como entiende un experto en la materia, el uso de la cepa o composición de la invención puede presentar efectos bioestimulantes, como los descritos anteriormente, o de biocontrol frente a patógenos, de forma separada o combinada (actividad dual bioestimulante/agente biocontrol).

Tal como se ha descrito anteriormente, la cepa de la invención puede usarse en un método para incrementar el desarrollo y crecimiento de las plantas y/o minimizar los síntomas de la enfermedad producidas por patógenos.

Por tanto, otro aspecto de la presente invención es un método para incrementar o promover el crecimiento de una planta, para incrementar la resistencia a estrés de una planta y/o para el biocontrol de patógenos en una planta, de aquí en adelante el "método de la invención”, que comprende:

(i) poner en contacto una planta o material vegetal aislado de dicha planta con la cepa dePseudomonas seleniipraecipitansCECT 30310 o con la composición de la invención.

La cepa de la invención y la composición de la invención, ya se han descrito en párrafos anteriores del presente documento y aplican de igual modo a este aspecto inventivo, así como todas sus realizaciones particulares. Así mismo, las expresiones “incrementar el crecimiento de una planta”, “agente inductor de resistencia a estrés en una planta” o “biocontrol de patógenos” han sido descritas anteriormente en el presente documento y se aplica de igual modo a este aspecto inventivo.

En otra realización particular de la etapa (i) del método de la invención, la planta pertenece a los génerosLactucaspp,Cucumisspp,Spinaceaspp.,Solanumspp.,Apiumspp., preferiblemente la planta pertenece a la especieLactuca sativa sp., Cucumis melo sp., Spinacea olerácea sp., Solanum lycopersicum sp., o Apium graveolens sp.

Tal como se ha descrito anteriormente, la cepa o la composición de la invención se usa en el método de la invención para el biocontrol frente a un patógeno. Así, en otra realización particular del método de la invención, el patógeno es un hongo o un virus.

En otra realización más particular del método de la invención, el hongo pertenece al géneroOlpidiumspp., preferiblemente a la especieOlpidium virulentussp.

En otra realización más particular del método de la invención, el virus pertenece al géneroOphiovirusspp. y/oVaricosavirusspp.

En otra realización aún más particular del método de la invención el virus que pertenece al géneroOphiovirusspp. es MiLBVV y/o el virus que pertenece al géneroVaricosavirusspp. es LBVaV.

La cepa o la composición de la invención pueden ser inoculadas o aplicadas a plantas, incluyendo todos los estadíos de desarrollo, o a un material vegetal aislado de dicha planta. El término “material vegetal aislado de plantas”, tal y como se usa en la presente invención, se refiere a células vegetales aisladas, o partes de una plata aisladas, como tejidos y órganos de una planta, que pueden dar lugar al desarrollo de una planta. Ejemplos de material vegetal aislado de planta incluyen, sin limitar a, semillas, hojas, tallos, hipocótilos, cotiledones, granos de polen, raíces, puntas de raíces, anteras, óvulos, flores, plántulas, embriones y cápsulas, preferiblemente el material vegetal aislado de planta es una semilla.

En otra realización particular del método de la invención, la etapa (i) se lleva a cabo mediante la aplicación de la cepa o de la composición en forma líquida, sólida (por ejemplo, liofilizada) o de forma hidropónica, preferiblemente en forma líquida.

En otra realización particular del método de la invención, la cepa o la composición de la invención se administra al menos una vez, preferiblemente entre una y cinco veces, más preferiblemente entre una y tres veces.

En la etapa (i), el método de la invención comprende poner en contacto una planta o material vegetal aislado de dicha planta con la cepa o la composición de la invención por cualquier técnica conocida, como por ejemplo, pero sin limitarse a, a través de hidroponía, a través de una solución aplicada al suelo, por medio de la aplicación de la cepa o composición por pulverización, infiltración, rociado, revestimiento, fumigación o impregnación de cualquier parte de la planta, semillas o del material vegetal aislado de dicha planta o en el agua de riego.

Posteriormente al contacto entre una planta o el material vegetal aislado de una planta y la cepa o la composición de la invención, se desarrolla dicha planta o material vegetal por prácticas conocidas en el estado de la técnica. El término “desarrollar la plata” se refiere a cultivar una planta o material vegetal aislado de una planta en un ambiente y condiciones particulares (medio de cultivo, temperatura, tiempo, condiciones de luz y/u oscuridad) que permitan el incremento del desarrollo y crecimiento vegetativo de dicha planta y/o el biocontrol frente a patógenos.

Por ejemplo, el desarrollo de la planta se puede llevar a cabo en un soporte agrícola o soporte agrícolamente aceptable, referidos a un elemento, compuesto, producto o disolución, natural o sintético, mineral u orgánico, que en forma pura o en mezcla, permite el anclaje del sistema radicular de la planta tanto en suelo como en cultivo hidropónico, desempeñando, por tanto, un papel de soporte y sujeción para la planta o semillas, así como también facilitar la interacción en las plantas o cultivos agrícolas con la cepa o composición de la invención.

Así, en otra realización particular de la invención, el soporte agrícola del método de la invención se selecciona de la lista que consiste en: sustrato orgánico, sustrato inorgánico, agua, solución salina o cualquier combinación de los mismos.

Como entiende un experto en la materia cualquier suelo, sustrato orgánico o inorgánico agrícolamente aceptable es válido para ser utilizado en la presente invención. Ejemplos de sustratos orgánicos agrícolamente aceptables incluyen, sin limitar a, arcilla, residuo vegetal, polvo de corcho, celulosa, turba, fibra de coco o compost.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Imágenes de microscopía óptica del crecimiento de la bacteria ABP-B9 y esporas deOlpidium virulentusen placas de agar-agua (resolución 100X). (A) Crecimiento de ABP-B9. (B) Cultivo dual de ABP-B9 yO. Virulentus.(C) Crecimiento deO. virulentus.Esporas de resistencia deO. virulentusse señalan con flechas.

Figura 2.Desarrollo en placas de agar-agua de las plántulas de lechuga (variedad Fernandola). (A) Plantas inoculadas con agua (control), (B) con la bacteria ABP-B9 y (C) esquema de la disposición de la placa.

Figura 3.Desarrollo de la parte aérea y del sistema radicular de las plántulas de lechuga cultivadasin vitro(placas agar-agua) a los 20 días post-germinación con tratamiento control (agua) y ABP-B9. (A) peso de la aérea, (B) número de hojas, (C) peso de la raíz y (D) número de raicillas secundarias.

Figura 4.Efecto en el desarrollo vegetativo de plantas de lechuga (var. Fernandola) cultivadas en invernadero (tratamiento control y con ABP-B9) del (A) peso medio (g) de la parte aérea y (B) número de moléculas deO. virulentuspresentes en su sistema radicular (cuantificación relativa mediante RT-qPCR). El asterisco indica la existencia de diferencias significativas entre los tratamientos, test One-Way Anova (p < 0.05).

Figura 5.Media del peso fresco (g) de plantas de lechuga (variedad Amenas) cultivadas en invernadero con tratamientos: control (agua); medio de cultivo Luria-Bertani (LB); ABP-B9 con medio LB (ABP-B9) y ABP-B9 sin medio LB (ABP-B9 sin LB). El asterisco indica la existencia de diferencias significativas entre los tratamientos, test One-Way Anova (p < 0.05).

Figura 6.Media de (A) contenido relativo en agua (Relative Water Contení;RWC, por sus siglas en inglés) y (B) de la masa foliar por unidad de superficie(Leaf Mass per Area;LMA) en plantas de lechuga (variedad Amenas) cultivadas en invernadero con tratamientos: control (agua); medio de cultivo Luria-Bertani (LB); ABP-B9 con medio LB (ABP-B9) y ABP-B9 sin medio LB (ABP-B9 sin LB). Los asteriscos indican la existencia de diferencias significativas entre los tratamientos, test One-Way Anova (p < 0.05).

Figura 7.Media de(A) índice de balance de nitrógeno(Nitrogen Balance Index;NBI, por sus siglas en inglés), (B) clorofilas y (C) polifenoles (flavonoides), de plantas de lechuga (variedad Amenas) cultivadas en invernadero con tratamiento control (agua), medio LB y ABP-B9. Los asteriscos indican diferencias significativas entre los tratamientos, test One-Way Anova (p < 0.05).

Figura 8.Escala para la evaluación de síntomas de la enfermedad de la vena ancha de lechuga (LBVD) utilizada para evaluar las plantas sometidas a los diferentes tratamientos.

Figura 9.Desarrollo de las plantas de lechuga (var LI645) transcurridos 5 días tras su inoculación en el semillero. Tratamientos (A) control (agua), (B) ABP-B9.

Figura 10.Media de (A) peso de la planta (g), (B) peso cogollo (g), (C) diámetro radial (cm) y (D) diámetro polar (cm), de plantas de lechuga (var. LI645) cultivadas en campo, cultivo comercial con tratamiento control (agua) y ABP-B9. Los asteriscos indican diferencias significativas, test de One-Way Anova (p<0.05).

Figura 11.Porcentaje de aparición de síntomas de LBVD en plantas de lechuga (var. LI645) cultivadas en campo, cultivo comercial, tratadas con control (agua) y ABP-B9, a los 51 (A), 59 (B) y 72 (C) días post trasplante, en (a) total o en función de la gravedad de síntomas (b) leve, (c) moderado y (d) grave. (D) Número de moléculas deO. virulentuspresentes en su sistema radicular (cuantificación relativa mediante RT-qPCR). Los asteriscos indican diferencias significativas, test de One-Way Anova (p<0.05).

Figura 12.Media de los parámetros de fluorescencia de plantas de lechuga cultivadas en campo, cultivo comercial: (A) var. Zasmira (Zas) y (B) var Amenas (Am): rendimiento cuántico del PSII [Y(PSII)], disipación fotoquímica de la fluorescencia (qP), procesos no fotoquímicos (qNP), y tasa de transporte electrónico (ETR), con tratamiento control (ctr) (agua) y ABP-B9 (inoc)). Los asteriscos indican diferencias significativas, test One-Way Anova (p<0.05).

Figura 13.Media de (A) número de flores, (B) longitud del tallo (cm), (C) peso fresco (g) y (D) peso seco (g) de plantas de melón (variedad Charentais) cultivados en invernadero con tratamientos: control (agua); medio de cultivo Luria-Bertani (LB) y ABP-B9 con medio LB (ABP-B9). Los asteriscos indican diferencias significativas, test One-Way Anova (p < 0.05).

Figura 14.Media de (A) índice de balance de nitrógeno(Nitrogen Balance Index;NBI) (B) clorofilas y (C) polifenoles (antocianos), de plantas de melón (variedad Charentais) cultivadas en invernadero, tratamiento control (agua) y ABP-B9. Los asteriscos indican diferencias significativas, test One-Way Anova (p < 0.05).

Figura 15.Media de (A) la longitud de la planta (m), (B) peso seco de la raíz (%) y (C) moléculas de ABP-B9 en el sistema radicular (cuantificación relativa mediante RT-qPCR, con sonda Taq-Man), de plantas de melón (variedad Loire) cultivadas en campo, cultivo comercial, tratamiento control (agua) y ABP-B9. El asterisco indica diferencias significativas, test One-Way Anova (p<0.05).

Figura 16.Media de (A) número, (B) Peso (g), (C) diámetro (cm) y (D) espesor de la pulpa (cm) de frutos de plantas de melón (variedad Loire) cultivadas en campo, cultivo comercial, tratamiento control (agua) y ABP-B9. El asterisco indica diferencias significativas, test One-Way Anova (p<0.05).

Figura 17.Media (A) del peso de 10 tomates maduros (g) recolectados a los 53 (a), 60 (b) y 70 (d) días tras el trasplante; (B) del peso de 30 tomates maduros recolectados al final del ensayo; (C) número medio de tomates producidos por planta; (D) estimación del número de tomates que producirían 100 plantas y (E) número medio de flores producidas por planta, tratamiento control (agua), ABP-B9 y ABP-B9 (1/10). Los asteriscos indican diferencias significativas, test One-Way Anova (p<0.05).

Figura 18.Media (A) de la conductancia estomática (p,mol m12 s-1) de 5 plantas de tomate, (B) acidez (equivalentes de ácido cítrico) y (C) contenido en azúcar (° Brix) de 20 plantas de tomate y (D) media del número de moléculas de ABP-B9 en el sistema radicular (cuantificación relativa mediante RT-qPCR con sondas TaqMan), tratamiento control (agua), ABP-B9 y ABP-B9 (1/10). El asterisco indica diferencias significativas, test One-Way Anova (p<0.05).

Figura 19. Media de (A) longitud (cm) y (B) peso (g) de la parte aérea, (C) peso medio (g) de 100 plantas y (D) estimación de producción (Kg) de 100 m2 de espinacas, cultivo comercial en campo, tratamiento control (agua) y ABP-B9. El asterisco indica diferencias significativas, test de One-Way Anova (p<0.05).

Figura 20. Media de (A) peso seco de la raíz (g); (B) del número de moléculas de ABP-B9 (cuantificación relativa mediante RT-qPCR, con sondas Taq-Man) en el sistema radicular de plantas de espinaca y (C) imágenes del sistema radicular de 3 plantas de espinaca cultivo comercial en campo, tratamiento control (agua) y ABP-B9. El asterisco indica las diferencias significativas, test de One-Way Anova (p<0.05).

Figura 21.Imágenes del desarrollo de las plántulas de apio transcurridos 5 días desde la aplicación de los diferentes tratamientos en semillero, (A) bandeja y (B) detalle de plántulas, tratamientos control (agua) y ABP-B9.

Figura 22.Media (A) de la longitud (cm), (B) peso de la parte aérea (g) y (C) peso seco de la raíz (g) de 100 plantas de apio cultivadas en campo, cultivo comercial, tratamiento control (agua) y ABP-B9. El asterisco indica diferencias significativas, test de One-Way Anova (p<0.05).

EJEMPLOS

A continuación, se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la efectividad del producto de la invención.

1. AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE ABP-B9

Se aislaron microorganismos presentes en el sistema radicular de plantas de lechuga de tipo iceberg cultivadas en parcelas de cultivo en el municipio de Águilas en la Región de Murcia. Para ello, se esterilizó el sistema radicular con hipoclorito sódico al 10% durante 10 min, a continuación, se preparó un homogenado con agua destilada estéril, y se realizaron diluciones seriadas de las que se sembraron 100 pL en placas con medio de cultivo LB Miller (Condalab). Las placas se incubaron a 28°C en oscuridad y se aislaron los distintos microorganismos presentes.

La capacidad biocontrol frente aO. virulentus,vector de los virus responsables de LBVD, y capacidad bioestimulante se evaluó utilizando plántulas de lechuga mediante cultivo dual en placa, enfrentando cada microorganismo a una suspensión de esporasO. virulentus.Tras varias semanas de incubación, se realizó el recuento del número de esporas del hongo con un microscopio óptico. La bacteria que dio lugar a la formación del menor número de esporas fue la denominada como ABP-B9 (Figura 1).

Se realizó el análisis filogenético de ABP-B9 basado en los geneshousekeepingpropuestos para el géneroPseudomonas,16S rRNA, gyrB, rpoB and rpoD. Los árboles filogenéticos, utilizando las alineaciones individuales o concatenadas, se construyeron con el software MEGA 7(The Molecular Evolutionary Genetics Analysis Versión 7.0) (Kumar, S., Stecher, G. & Tamura K. (2016). MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets. Molecular biology and evolution, 33(7), 1870 1874),mostrando que ABP-B9 presentaba una alta relación filogenética conPseudomonas seleniipraecipitans(Tabla 1).

Tabla 1. Relación filogenética conPseudomonas seleniipraecipitans.

2. EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD DE BIOCONTROL Y BIOESTIMULANTE EN LECHUGA

Estos análisis se realizaron en laboratorio(in vitro),utilizando placas de agar-agua, y en invernadero utilizando plantas de lechuga cultivadas en maceta(in vivo).

2.1. Ensayoin vitro

Se colocaron 4 plántulas de lechuga, pregerminadas en condiciones de esterilidad, en placas de agar-agua previamente inoculadas con agua (tratamiento control) o con la bacteria ABP-B9 que induce la formación de raicillas secundarias (Figura 2). Se incubaron 5 placas/tratamiento, a 25°C con un fotoperiodo 16h:8h (luz:oscuridad) y 60% de humedad. Tras 2 semanas, se determinó el peso de la parte aérea, del sistema radicular, recuento de hojas y raíces. Las plántulas tratadas con la bacteria ABP-B9 mostraron un mayor desarrollo, tanto de la parte aérea (Fig. 3A), como del sistema radicular (Fig. 3C), un mayor número de hojas (Fig. 3B) y de raicillas secundarias (Fig. 3D), a los 20 días post-germinación frente al tratamiento control (agua).

2.2. Ensayosin vivo

Para corroborar los datos de los ensayosin vitro,estudiar el comportamiento de la bacteria ABP-B9 y su efecto sobre plantas de lechuga, se realizaron ensayosin vivoen invernadero.

2.2.1. Evaluación del efecto de ABP-B9 en el desarrollo de las plantas de lechuga y de su capacidad de biocontrol frente a O. virulentus.

• Evaluación del efecto biocontrol y bioestimulante de ABP-B9 sobre plantas de lechuga

Se germinaron semillas de lechuga (variedad Fernandola) en sustrato (compost pro-line, fibra de coco y vermiculita, 2:1:0,1). A los 30 días, se trasplantaron a macetas que se inocularon con 5 mL de ABP-B9 (108 UFC/mL), 5 réplicas/tratamiento, en presencia o en ausencia deO. virulentus,inoculado incorporando a cada maceta 20 g de turba infectada. Se realizaron 2 tratamientos: control (inoculado con agua) e inoculado con ABP-B9. La incorporación deO. virulentusprodujo una disminución generalizada del desarrollo de las plantas, en comparación con las plantas desarrolladas en su ausencia. A los 30 días post trasplante (dpt) se determinó el peso de la parte aérea de las plantas y la población deO. virulentusen su sistema radicular.

Los resultaron mostraron que la inoculación de ABP-B9 produjo un incremento del desarrollo de la parte aérea en comparación con el control (Figura 4A). Además, las plantas inoculadas con ABP-B9 presentaban una menor población deO. virulentusque las plantas control (Figura 4B).

Por lo tanto, la aplicación de ABP-B9 da lugar a un incremento del desarrollo de las plantas y tiene efecto biocontrol frente aO. virulentus.

<•>Evaluación del efecto de ABP-B9 sobre el estado fisiológico de las plantas de lechuga

La evaluación del desarrollo y el estado fisiológico de las plantas de lechuga tratadas con ABP-B9, se realizó con la variedad Amenas cultivada en invernadero en maceta en ausencia de abonado. Se realizaron 4 tratamientos (6 plantas/tratamiento): control (agua), LB (medio LB), ABP-B9 (109 UFC/mL) con (ABP-B9) y sin LB (ABP-B9 sin LB), aplicando 5 mL de inóculo en todos los casos.

El análisis del desarrollo de la planta y su estado fisiológico se realizó a los 30 dpt. Se determinó (i) peso de la parte aérea (peso fresco), (ii) contenido relativo en agua de la hoja (RWC), (iii) masa foliar por unidad de superficie (LMA), (iv) clorofilas, (v) polifenoles (Flavonoides) e (vi) índice de balance de nitrógeno (NBI), utilizando el medidor óptico Dualex Scientifc+TM (FORCE A; Francia).

El análisis de los resultados mostró que la aplicación de ABP-B9 produjo un incremento del peso fresco de las plantas (Figura 5), debido a la acción del microorganismo y no a los nutrientes aportados por el medio de cultivo (LB). Además, el microorganismo no afecta negativamente al desarrollo de las plantas (Figura 6) e incrementa de manera significativa su estado nitrogenado (Fig. 7A), niveles de clorofilas (Fig. 7B) y de flavonoides (Fig. 7C), lo que incrementa su capacidad fotosintética.

2.2.2. Evaluación de la efectividad de ABP-B9 en cultivo de lechuga en condiciones de producción comercial

El cultivo en campo es un entorno más complejo para el desarrollo de la planta y la supervivencia de los microorganismos inoculados. Por lo que se realizó un ensayo de campo para evaluar el efecto de ABP-B9 sobre las plantas en las condiciones de cultivo comercial y en la época de mayor incidencia de la enfermedad (LBVD).

El ensayo se realizó en Águilas (Murcia, España) y constó de dos tratamientos (control, (inoculadas con agua) y ABP-B9), 6 réplicas/tratamiento distribuidos en bloques aleatorizados de 25/bloque, 150 plantas (variedad LI 645)/tratamiento. Los tratamientos se separaron colocando 20 plantas sin tratar, para evitar posibles contaminaciones. Las semillas se germinaron en semillero para su trasplante a campo a los 30 días. 5 días antes de este trasplante se inocularon 5 mL de ABP-B9/ plántula (109 UFC/mL).

Se hizo un seguimiento visual del desarrollo del cultivo y de la afección por LBVD, al finalizar se muestrearon las 150 plantas de cada tratamiento y de su separación. A los 72 dpt se determinó: peso de la parte aérea, del cogollo, diámetros radial y polar, la cantidad deO. virulentusen el sistema radicular (30 plantas/tratamiento). Para la evaluación de los síntomas se siguió una escala elaborada previamente (Figura 8).

A los 5 días tras la inoculación ya se observó un mayor desarrollo de las plantas inoculadas con ABP-B9 respecto al control (Figura 9), incremento que se seguía manteniendo a los 20 días del trasplante a campo. Las plantas inoculadas con ABP-B9 mostraron un incremento significativo en el desarrollo, con un mayor peso fresco de la parte aérea y del cogollo (Figura 10A y 10B). Estas plantas mostraron un menor diámetro radial y polar del cogollo que las que fueron tratadas con agua (control), indicando que ABP-B9 induce mayor compactación del cogollo (Figura 10C y 10D).

Los primeros síntomas de LBVD se observaron a los 40 dpt. Desde el inicio, las plantas inoculadas con ABP-B9 mostraron muy poca incidencia de la enfermedad y las que mostraron síntomas, fueron mayoritariamente de carácter leve (Figura 11A, 11B y 11C). Situación que se mantuvo hasta el final del ensayo (72 días). El análisis de la población deO. virulentusen el sistema radicular mostró que la inoculación con ABP-B9 disminuye de forma significativa la población del patógeno (Figura 11D).

Efecto de ABP-B9 en la eficacia fotosintética

Para conocer si las plantas sufrían algún tipo de estrés, se evaluó su estado fisiológico determinando el rendimiento fotosintético del fotosistema II (PSII) (10 plantas/ tratamiento), usando un fluorímetro de fluorescencia modulada. Este análisis se realizó a dos variedades comerciales de lechuga iceberg, Amenas y Zasmira, tratadas con el microorganismo ABP-B9. El tratamiento mostró un aumento en el proceso fotoquímico o quenching fotoquímico, medido como Y(PSII) y qP, más pronunciado en la variedad Zasmira (Figura 12A y 12B). Lo que indica una mayor eficiencia fotosintética en las plantas tratadas con ABP-B9 que en las no tratadas. Las diferencias observadas en la tasa de transporte electrónico (ETR) entre el tratamiento y el control, no fueron significativas probablemente debido al bajo número de muestras analizadas (Figura 12A y B). El quenching no fotoquímico (relacionado con la disipación del exceso de energía en forma de calor y con la respuesta a estrés), medido como NPQ o qNP, aumentó significativamente respecto al control en las 2 variedades (P<0.05) (Figura 12A y 12B), lo que indica que el tratamiento con ABP-B9 incrementa la capacidad de las plantas de lechuga para responder frente a situaciones de estrés, tanto biótico como abiótico.

3. EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD DE BIOCONTROL Y BIOESTIMULANTE EN MELÓN

3.1. Evaluación del efecto de ABP-B9 sobre el desarrollo y estadofisiológico de plantas de melón Charentais

La evaluación del efecto de ABP-B9 en melón se realizó con la variedad Charentais en invernadero, 6 réplicas/tratamiento, en ausencia de abonado. Las semillas se desinfectaron, pregerminaron y trasplantaron a macetas con sustrato. Cuando las plantas desarrollaron la primera hoja verdadera se inocularon con 5 mL de agua (control), de LB o de ABP-B9 (109 UFC/mL). A los 30 dpt concluyó el ensayo, se determinó: (i) peso de la parte aérea (fresco y seco), longitud de tallo y número de hojas y flores de cada planta, (ii) contenido relativo en agua de la hoja (RWC), (iii) masa foliar por unidad de superficie (LMA), (iv) pérdida de electrolitos (LE) y (v) determinación de clorofilas, polifenoles (flavonoles y antocianos) y del índice de balance de nitrógeno (ratio clorofila flavonoles), empleando el medidor óptico Dualex Scientifc+TM (FORCE A; Francia).

Los resultados obtenidos junto con el análisis visual del desarrollo del sistema radicular permitieron concluir que la aplicación de ABP-B9 a plantas de melón no tuvo efectos negativos sobre el desarrollo del cultivo, dio lugar a un incremento del peso fresco y del número de inflorescencias de las plantas tratadas (Fig. 13). Además, esta aplicación no supone un estrés para la planta ya que los parámetros RWC, LMA y pérdida de electrolitos se mantuvieron al mismo nivel que los registrados para las plantas control.

El análisis del NBI, clorofilas y polifenoles mostró un incremento del estado nitrogenado de las plantas tratadas con ABP-B9 (Fig. 14A), en particular el incremento significativo en clorofilas (Fig. 14B) y antocianos (Fig. 14C) puede resultar en una mayor capacidad fotosintética.

3.2. Evaluación del efecto de ABP-B9 sobre el desarrollo y estado fisiológico de plantas de melón Loire

Para evaluar el efecto bioestimulante de ABP-B9 en cultivo comercial de melón, se realizó un ensayo utilizando la variedad Loire (tipo cantaloup), en una parcela situada en San Pedro del Pinatar (Murcia). Se realizaron 2 tratamientos control (inoculados con 5 mL de agua) y ABP-B9 (5 mL a 2,1x 108 UFC/mL), 18 plantas/tratamiento. Las semillas se germinaron y plantaron en semillero, 5 días antes del trasplante a la parcela de cultivo se aplicaron los 5 mL de cada inóculo. Se realizaron 3 réplicas/tratamiento (6 plantas/replica) que se distribuyeron en bloques aleatorizados, separados entre si con plantas no tratadas para evitar contaminaciones. Se realizó un seguimiento visual del desarrollo del cultivo, y se evaluó la incidencia de enfermedades. Una vez concluido el ensayo (61 dpt) se determinó peso de la parte aérea, longitud de las plantas y peso seco del sistema radicular.

Los análisis mostraron que la aplicación de ABP-B9 no produjo un efecto negativo en el desarrollo de las plantas tratadas y sí un incremento en la longitud de las plantas y en el peso seco del sistema radicular (Fig. 15). Además, se analizó la producción de cada una de las plantas, lo que permitió verificar que, aunque la aplicación de ABP-B9 no indujo un incremento en el número de melones producidos, sí se observó un incremento en el peso de éstos, su diámetro y en espesor de la pulpa (Fig. 16). La cuantificación de la población de ABP-B9 en el sistema radicular de las plantas al final del ciclo de cultivo, mostró que la población quedaba estabilizada en niveles habituales detectados de este microorganismo en el sistema radicular de las plantas no tratadas (Fig. 15C).

4. EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD BIOESTIMULANTE EN TOMATE CHERRI

Para evaluar el efecto de ABP-B9 sobre el desarrollo del cultivo de tomate se realizó un ensayo en macetas (1L) en invernadero con sustrato“Floragard Grow Mix” ,utilizando una variedad de tomate cherri cereza (semillero BayPlant). Se ensayaron 3 tratamientos: Control (agua), ABP-B9 (108 UFC/mL) y ABP-B9(1/10) (107 UFC/mL), 36 plantas/tratamiento, distribuidas en bloques al azar (de 4 o 5 plantas/bloque). Se realizaron 3 aplicaciones de los tratamientos, una al inicio del ensayo, a los 15 y a los 30 días. Durante el cultivo, el seguimiento visual del desarrollo de las plantas fue exhaustivo, se realizaron 3 recolecciones de tomates, a los 53, 60 y 70 días, la última coincidió con el levantamiento del ensayo, momento en el que se muestrearon todas las plantas.

Se determinó el número de ramilletes, las flores y tomates producidos; el peso de cada planta y el diámetro del tallo. Se tomaron muestras de hojas completas del tercio superior de plantas de cada tratamiento y se analizó la conductancia estomática (C.e. pmol m2s-1) con un porómetro de difusión CS-1 (Meter Group). La acidez y grado brix de los tomates de las 3 primeras recogidas se determinó por refractometría y electroconductividad (ATAGO Brix-Acidity Meters). Se cuantificó la población de ABP-B9 en el sistema radicular de 6 plantas por PCR cuantitativa a tiempo real utilizando SYBR Green.

El análisis del número de tomates producidos en las diferentes recolecciones mostró que la aplicación de ABP-B9 daba lugar a un incremento del peso medio de los tomates, y del número total de éstos (maduros y no maduros) siendo este incremento ligeramente superior con el tratamiento ABP-B9 (1/10) (Fig. 17A) que con ABP-B9 (Tabla 2 y Fig 17A). La extrapolación de los datos a la producción de 100 plantas mantuvo la tendencia siendo mayor el incremento con ABP-B9 (1/10) seguido de ABP-B9 (Fig. 17D).

Tabla 2. Datos obtenidos tras la recolección de tomates de las plantas de los diferentes tratamientos.

El análisis de la conductancia estomática (5 plantas/tratamiento) no mostró diferencias significativas entre el tratamiento control y los tratamientos inoculados con ABP-B9 (Fig. 18A), indicando que ABP-B9 no produjo estrés biótico a las plantas. Este hecho podría indicar que las plantas tratadas con ABP-B9 son más eficientes fotosintéticamente que las control, ya que a igual conductancia estomática son más productivas tanto en número, como en peso de tomates (Fig. 17B y C). La determinación de los parámetros de acidez y contenido en azúcar mostró que la aplicación de ABP-B9 parece disminuir la acidez y el contenido en azúcar (Fig. 18B y C). Esta aplicación no produjo variación significativa en el número de ramilletes, de flores o en el peso de planta, pero sí que se observó un incremento significativo en la producción de flores en el tratamiento ABP-B9 (1/10) con respecto a los otros tratamientos (Fig. 17E). La cuantificación de la población de ABP-B9 presente en el sistema radicular de las plantas confirmó su presencia en los tratamientos ABP-B9 y ABP-B9(1/10), siendo mayor en el tratamiento ABP-B9 (Fig. 18D).

5. EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD BIOESTIMULANTE EN ESPINACA

El efecto bioestimulante de ABP-B9 en espinaca se analizó usando la variedad Elgiga, se realizaron 2 tratamientos, control y ABP-B9, 2.100 plantas/tratamiento con 3 réplicas de 700 plantas, en bloques de 75 x 140 cm, separados con plantas sin tratar para evitar contaminación cruzada. Las semillas de espinaca se sembraron directamente a una densidad de 7,5 millones de plantas/ha, a los 20 días de la siembra, cuando las plantas habían desarrollado la primera hoja verdadera, se aplicaron los tratamientos con ayuda de una mochila de pulverización de 10L de capacidad, 10,5 L (3,5 L/ réplica), la presión de salida es constante, cada línea de espinaca se regó por aspersión 4 veces. El tratamiento ABP-B9 se aplicó a una concentración de 5 x 108 UFC/mL. Se llevó a cabo un seguimiento visual exhaustivo del desarrollo del cultivo y la incidencia de enfermedades.

Trascurridos 35 días de la aplicación de los tratamientos se levantó el ensayo, se muestrearon todas las plantas. 120 plantas/ tratamiento (40 plantas/réplica) se tomaron enteras y se determinó la longitud de la parte aérea, su peso y el del sistema radicular; el peso seco de sus raíces se determinó tras un lavado seguido de secado a 70°C durante 5 días. El análisis del efecto en el rendimiento de cultivo se completó determinando el número y peso de las hojas de las plantas restantes.

Los resultados mostraron que la aplicación de ABP-B9 produjo un incremento significativo de la longitud y peso de la parte aérea (Fig. 19 A y B) en comparación con las plantas control, así como un incremento significativo del peso seco de la raíz (Fig. 20A) y del peso medio de las plantas (4% respecto al control), (Fig. 19C). Cuando se estimó el rendimiento en 100 m2 del cultivo para cada tratamiento, se observó que el incremento producido por el tratamiento ABP-B9 fue del 7% con respecto control (Fig. 19D). La cuantificación de la población de ABP-B9 en el sistema radicular a los 35 días de la inoculación, mostro una población 2 órdenes de magnitud superior en el tratamiento con la bacteria que en el control (Fig. 20B) y las plantas tratadas con ABP-B9 presentaban una mayor longitud radicular (Fig. 20C).

6. EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD BIOESTIMULANTE EN APIO

La evaluación del efecto bioestimulante y biocontrol de ABP-B9 en el cultivo de apio se realizó utilizando la variedad PH 535, destinada a productos de IV gama por lo que se valora la ausencia de daños en hojas, la longitud y peso de los tallos, se realizaron 2 tratamientos (control y ABP-B9), 100 plantas/tratamiento, (3 réplicas de 33 plantas), se distribuyeron por bloques aleatorizados, separados con plantas sin tratar para evitar contaminación cruzada. El ensayo se realizó en una finca de cultivo comercial situada en Águilas (Murcia) con una densidad de plantación de 94.444 plantas/ha. Las semillas se plantaron en semillero y las plántulas 5 días antes de su trasplante a campo fueron inoculadas con 5 mL/planta de agua (control) o de ABP-B9 (108 UFC/mL).

Se llevó a cabo un seguimiento visual exhaustivo del desarrollo del cultivo y la incidencia de enfermedades. 5 días tras la aplicación de los tratamientos ya se observó mayor desarrollo de las plantas tratadas con ABP-B9 que las plantas del control (Fig. 21). Durante el cultivo no se observó incidencia de enfermedades, y las plantas se desarrollaron con normalidad. Transcurridos unos 3 meses y 20 días (112 días) del trasplante se levantó el ensayo y se determinó longitud de las plantas, peso de la parte aérea y peso seco de las raíces. Los resultados de estos análisis mostraron que las plantas tratadas con ABP-B9 mostraron un mayor desarrollo que el control, con una mayor longitud (Fig. 22A), mayor peso de la parte aérea (Fig. 22B), así como un incremento en el peso seco del sistema radicular (Fig. 22C).

Claims (20)

REIVINDICACIONES

1. Una cepa dePseudomonas seleniipraecipitanscon número de depósito CECT 30310.

2. Una composición que comprende la cepa según la reivindicación 1.

3. La composición según la reivindicación 2 que además comprende al menos un excipiente y/o un medio de cultivo bacteriano.

4. Uso de la cepa según la reivindicación 1 o de la composición según la reivindicación 2 o 3 como bioestimulante del crecimiento de una planta, como agente inductor de resistencia a estrés en una planta y/o como agente de biocontrol frente a un patógeno de plantas.

5. Uso según la reivindicación 4 donde la planta pertenece al géneroLactucaspp,Cucumisspp,Spinaceaspp.,Solanumspp., oApiumspp.

6. Uso según la reivindicación 4 o 5 donde la planta pertenece a la especieLactuca sativasp.,Cucumis melosp.,Spinacea oleráceasp.,Solanum lycopersicumsp., oApium graveolenssp.

7. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 donde el patógeno es un hongo o un virus.

8. Uso según la reivindicación 7 donde el hongo pertenece al géneroOlpidiumspp.

9. Uso según la reivindicación 8 donde el hongo pertenece a la especieOlpidium virulentussp.

10. Uso según la reivindicación 7 donde el virus pertenece al géneroOphiovirusspp. oVaricosavirusspp.

11. Uso según la reivindicación 10 donde el virus que pertenece al géneroOphiovirusspp. es el virus mirafiori de la vena ancha de la lechuga (MiLBVV) y/o el virus que pertenece al géneroVaricosavirusspp. es el virus asociado a la vena ancha de la lechuga (LBVaV).

12. Método para incrementar o promover el crecimiento de una planta, para incrementar la resistencia a estrés de una planta y/o para el biocontrol de patógenos en una planta, que comprende:

(i) administrar a una planta o material vegetal aislado de dicha planta la cepa dePseudomonas seleniipraecipitanssegún la reivindicación 1 o la composición según las reivindicaciones 2 o 3.

13. El método según la reivindicación 12, donde el contacto en el paso (i) se lleva a cabo mediante la aplicación de la cepa o de la composición en forma líquida, sólida o de forma hidropónica, preferiblemente en forma líquida.

14. El método según la reivindicación 12 o 13 donde la cepa o la composición de la invención se administra al menos una vez, preferiblemente entre una y cinco veces, más preferiblemente entre una y tres.

15. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14 donde la planta pertenece al géneroLactucaspp.,Cucumisspp.,Spinaceaspp.,Solanumspp., oApiumspp.

16. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15 donde la planta pertenece a la especieLactuca sativasp.,Cucumis melosp.,Spinacea oleráceasp.,Solanum lycopersicumsp., oApium graveolenssp.

17. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16 donde el patógeno es un hongo o un virus.

18. El método según la reivindicación 17 donde el hongo pertenece al géneroOlpidiumspp., preferiblemente a la especieOlpidium virulentussp.

19. El método según la reivindicación 17 donde el virus pertenece al géneroOphiovirusspp. oVaricosavirusspp.

20. El método según la reivindicación 19 donde el virus que pertenece al género Ophiovirus spp. es el virus mirafiori de las venas anchas de lechuga (MiLBVV) y/o el virus que pertenece al géneroVarícosavirusspp. es el virus asociado a las venas anchas de lechuga (LBVaV).