JP4472945B2 - 植物ウィルスを防除する微生物及び当該微生物からなる植物ウィルス防除剤並びに当該微生物を用いた植物ウィルスの防除方法 - Google Patents
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【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物ウィルスの不活化能を有する新規微生物及び当該微生物により植物ウイルスを不活化する方法に関する。また、本発明は、当該微生物と、タンパク質分解酵素プロテアーゼ、有機質基質、多孔質基質、木質炭化物及び／又はアルギン酸ビーズとからなる植物ウィルス防除剤に関する。また更には、本発明は、当該微生物、又は当該微生物とプロテアーゼとの組み合わせで種子、葉、根及び／又は土壌に処理してなる植物ウィルスの防除方法に関する。本発明は農業及び園芸の分野において、植物ウイルス病の防除を目的として広く利用することができる。
【０００２】
【従来の技術】
農業生産において栽培されるタバコ、ピーマン、メロン、スイカ、キュウリ、トマトなどの各種作物は、タバコモザイクウイルス（TMV）、トウガラシマイルドモットルウイルス（TMV-P）、トマトモザイクウイルス（TMV-T）、キュウリ緑斑モザイクウイルス（CGMMV）、メロンえそ斑点ウイルス（MNSV）、レタスビックベインウイルス（LBVV）、ビートえそ性葉脈黄化ウイルス（BNYVV）などによって引き起こされる土壌伝染性のウイルスに罹病し、著しい被害を受けることが多い。これらの病原ウイルスは土壌、残渣・残根、雑草、種子に存在し、定植や作業時の管理作業によって伝播する。
【０００３】
このような土壌伝染性のウイルス病害対策として、従来は臭化メチル剤の土壌くん蒸消毒により防除されてきた。しかし、本薬剤は国際規約によって2005年に全廃され、現在のところ植物ウイルス病防除における臭化メチル代替剤がない。これらのことから、本病害の土壌伝染を阻止するための技術開発が急務であり、必要不可欠なものである。また、近年の環境問題への意識の高まりから減農薬への動きも大きくなってきている。そういった状況の中で、今後生物的な防除による環境保全型のウイルス病害防除が必要不可欠である。
その他、植物ウイルスの防除剤としては、アルギン酸ナトリウム剤や、シイタケ菌糸体培養抽出物（特公昭54-33994号）があるが、いずれも土壌消毒を目的として使用するものではなく、植物体の全面に漏れなく一様に散布する必要があり、また畑での効果はあまり高くない。
【０００４】
【発明が解決しようとする問題点】
本発明は、臭化メチル代替の土壌消毒材および土壌改良材として、土壌伝染性の植物ウイルス病害汚染圃場の伝染を阻止する、あるいは予防対策を目的に、有効な生物素材を提供することを課題とする。また、本生物素材を用い、減農薬による環境保全型農業が可能となるような、植物ウイルス病害の生物的防除方法を提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究した結果、根圏土壌、有機質肥料および堆肥に存在する微生物群からウイルス分解・不活化菌の検索を行い、土壌伝染性のウイルス病害を引き起こすＴＭＶに対して高い不活化能を有する微生物を見出した。特にＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属の菌株Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． Ｃ−０１７６ＡＶ（寄託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１９２５２）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属の菌株Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＢＳ−００１７ＡＶ（寄託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１９２７８）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属の菌株Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ｍ−００２１ＡＶ（寄託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１９２５３）の３種の微生物が植物ウィルスの防除に有効であることを見出した。
【０００６】
すなわち、本発明は、植物ウィルスの不活化能を有する新規微生物及び当該微生物により植物ウイルスを不活化する方法に関する。また、本発明は、当該微生物と、タンパク質分解酵素プロテアーゼ、有機質基質、多孔質基質、木質炭化物及び／又はアルギン酸ビーズとからなる植物ウィルス防除剤に関する。また更には、本発明は、当該微生物、又は当該微生物とプロテアーゼの組み合わせで種子、葉、根及び／又は土壌に処理してなる植物ウィルスの防除方法に関する。
【０００８】
本発明の微生物としては、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． Ｃ−０１７６ ＡＶ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＢＳ−００１７ＡＶ、 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ｍ−００２１ＡＶ（それぞれ、以下 Ｃ−１７６、ＢＳ−１７、Ｍ−２１とする）から少なくとも一種選ばれる植物ウィルスの不活化能を有することを特徴とする微生物であれば特に制限されず、これら菌株は活性が高く、有効に用いることができる。
Ｃ−１７６の菌学的特性は表１のとおりである。
【表１】
【０００９】
本菌株は、上記菌学的特徴において桿状のグラム染色陰性で、運動性があり好気的・嫌気的条件で生育でき、グルコースから酸の生成を行うことからシュードモナス属（Pseudomonas sp.）に分類される。本菌の類縁種としてはシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）あるいはシュードモナス・ピケッティー（Pseudomonas pickettii）があげられるが、L-ロイシンを分解しないことからシュードモナス・ピケッティーにより近い種である。また、アラビノースを分解しない点やL-ヒスチジンを分解する点からシュードモナス・ピケッティーと異なり、本菌株はシュードモナス属の新菌種であると認定した〔バージーズ・マニュアル オブ システマティク バクテリオロジー第1巻(JOHN G HOLT et al.,BERGEY'S MANUAL OF Systematic Bacteriology)〕。
【００１０】
本菌株Pseudomonas sp. C-0176AVは寄託番号：FERM P-19252として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
本菌株は、YPMG寒天培地で培養して増殖することができる。用いられるYPMG培地は、寒天培地であっても、液体培地であっても使用することができる。YPMG培地を用いた培養は30℃で３日間行うことが好ましい。
BS-17の菌学的特性は表２のとおりである。
【表２】
【００１１】
本菌株は、上記菌学的特徴において桿状で胞子を形成し、主として好気的条件で増殖する菌であることからバチルス属に分類される。本菌の類縁種としては、バチルス・ポピリエ（Bacillus popilliae）があげられるが、D-キシロース、L−アラビノースを分解する点からバチルス・ポピリエと異なり、本菌株はバチルス属の新菌種であると認定した。
本菌株Bacillus sp. BS-0017AVは寄託番号：FERM P-19278として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
本菌株は、YPMG寒天培地で培養して増殖することができる。用いられるYPMG培地は、寒天培地であっても、液体培地であっても使用することができる。YPMG培地を用いた培養は30℃で３日間行うことが好ましい。
M-21の菌学的特性は表３のとおりである。
【表３】
【００１２】
本菌株は、上記菌学的特徴において楕円形、円筒形で分裂増殖し、球形、卵形の胞子を形成する菌であることからシゾサッカロマイセス属に分類される。本菌の類縁種としてはシゾサッカロマイセス・ジャポニクス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）あるいはシゾサッカロマイセス・ポムベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）があげられるが、Ｄ−グルコースを分解しないことから、本菌株はシゾサッカロマイセス属の新菌種であると認定した。
本菌株Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ． Ｍ−００２１ＡＶは寄託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１９２５３として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託され、その後Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ｍ−００２１ＡＶに表示が変更されている。
本菌株は、ＹＰＭＧ寒天培地で培養して増殖することができる。用いられるＹＰＭＧ培地は、寒天培地であっても、液体培地であっても使用することができる。ＹＰＭＧ培地を用いた培養は３０℃で３日間行うことが好ましい。
【００１３】
本発明の微生物は、寒天培地又は液体培地を用いて、培養・増殖される。増殖された微生物は、白金耳等により採取、遠心分離等の操作により集菌して採取、あるいは培養液の状態として、植物ウィルスの防除又は植物ウィルス防除剤に用いることができる。
こうして培養・増殖して得られた本発明の微生物は、いずれか単独で用いることも２種以上を組み合わせて用いることもできる。本発明の微生物は、ウィルス不活化能を有し、本発明の微生物を種子、葉、根、土壌等に処理して植物ウィルスの防除効果が発揮される。たとえば、土壌中の残渣・残根に定着して土壌伝染を引き起こす植物ウイルスがある場合、これを分解し不活化することもできる。この処理方法としては、土壌への施用、育苗培土への添加、作物種子にバクテリゼーション処理、葉面散布、養液栽培における養液への添加、土耕栽培における株元への添加・潅注等をあげることができる。本発明の微生物処理により、栽培植物の植物ウィルス防除を行うことはもとより、植物ウイルス病害汚染圃場の伝染を阻止、あるいは予防対策として使用することができる。
【００１４】
本発明の植物ウィルスの防除方法としては、上記のように微生物単独で処理することもできるが、タンパク質分解酵素プロテアーゼと組み合わせて処理すると、より植物ウィルスの防除効果は高まる。プロテアーゼとしては、酸性プロテアーゼ、中性プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ等があげられるが、酸性プロテアーゼを用いることが好ましい。プロテアーゼの処理の時期としては、本発明の微生物の処理と同時又は前処理として行うことができ、処理の方法としては種子、葉、根、土壌等に上記微生物の処理方法と同様にして行うことができる。
【００１５】
また、本発明の微生物は、有機質基質、多孔質基質、木質炭化物等と組み合わせ、植物ウィルス防除剤とすることができる。有機質基質としては菜種粕、大豆粕、魚粕、コメヌカ、フスマ等があげられる。多孔質基質としてはゼオライト、イソライト、バーミキュライト等があげられる。こうして、本発明の植物ウィルス防除剤は、有機質基質、多孔質基質等と組み合わせることで効果が高まる。木質炭化物としては、バーク炭等があり微生物の住処となりやすい。
これら有機質基質、多孔質基質、木質炭化物の混合量は、植物ウィルス防除剤全量に対し、0.1%〜50%が望ましい。
【００１６】
さらに、本発明の植物ウィルス防除剤には、プロテアーゼを組み合わせることができる。これにより、上述したように、より植物ウィルスの防除効果は高まる。また、有機質基質、多孔質基質、木質炭化物等と組み合わせることにより相乗効果も期待することができる。
またさらに、本発明の植物ウィルス防除剤には、アルギン酸ビーズを組み合わせることができる。アルギン酸は、海藻などに含まれる天然の多糖類であり、アルギン酸を組み合わせることにより、本発明の微生物はこのアルギン酸ビーズに固定化され、微生物が作物根圏および土壌へ優先的に定着して安定した効果が期待できる。また、アルギン酸ビーズは、生分解性であることから、環境汚染を引き起こすこともない。
【００１７】
本発明の植物ウィルス防除剤に、本発明の微生物と組み合わされるプロテアーゼ、有機質基質、多孔質基質、木質炭化物及びアルギン酸ビーズは、目的に応じ１種を選択し、組み合わせることもできるが、２種以上選択して組み合わせることもできる。
本発明の微生物及び当該微生物からなる植物ウィルス防除剤は、単独で使用することもできるが、適当な個体担体、液体担体、乳化分散剤などを用いて、粒剤、粉剤、錠剤、乳剤、水和剤等の任意の形状で使用できる。また、本発明の微生物及び当該微生物からなる植物ウィルス防除剤を無機質肥料、有機質肥料、除草剤、土壌等と共に使用し、肥料、土壌改良資材、育苗用培土等とすることができる。
【００１８】
本発明の微生物及び植物ウィルス防除剤の防除するウィルスとしては、タバコモザイクウイルス（TMV）、トウガラシマイルドモットルウイルス（TMV-P）、トマトモザイクウイルス（TMV-T）、キュウリ緑斑モザイクウイルス（CGMMV）、メロンえそ斑点ウイルス（MNSV）、レタスビックベインウイルス（LBVV）、ビートえそ性葉脈黄化ウイルス（BNYVV）等によって引き起こされる土壌伝染性のウイルスの他に、昆虫媒介によるキュウリモザイクウイルス（CMV）、トマト黄化えそウイルス(TSWV)等があげられる。
【００１９】
【発明の実施の形態】
以下に本発明の実施態様を示すが、本発明は、これら実施例に限定されるものではない。
実施例１〜３ 微生物を用いたウイルス不活化検定
（実施例１）C-176
YPMG寒天（酵母エキス3.0ｇ、ペプトン5.0ｇ、肉エキス1.0ｇ、グルコース10ｇ、寒天16g、蒸留水1.0リットル、pH7.0）斜面培地に分離した菌株C-176をTMV-P汚染ピーマン根に接種して、各温度区（30℃、10℃）の暗条件下で1ヶ月間静置培養した。各温度区において菌株を接種しない以外は同様に培養した区を無処理区として設定した。培養後、リン酸緩衝液(pH7.0)を添加して磨砕した。検定にはウイルスを接種することによって局部病斑を生ずるタバコ品種（キサンチ・エヌシー）を用いた。検定用のタバコ品種は直径１２ｃｍの鉢で2ヶ月育成し、1区につき2鉢、３葉（第５〜第７葉）ずつ計６葉を用いた。それらの葉にカーボランダムを振掛けて、それぞれ磨砕した液を展開した葉の表の主脈を境とした半葉の半分（1/4葉）に各被検液（30℃、10℃）をそれぞれ塗抹接種し、もう半分に無処理液（30℃、10℃）をそれぞれ塗抹接種した。接種5日後、接種葉に現れた斑点の数を数え、次式によって病斑出現率を算出した。結果を表４に示した。
【数１】
【表４】
【００２０】
（実施例２）BS-17
菌株C-176のかわりに菌株BS-17を用いる以外は、実施例１と同様の方法を行いウイルス不活化検定を行った。結果を表５に示した。
【表５】
【００２１】
（実施例３）M-21
菌株C-176のかわりに菌株M-21を用いる以外は、実施例１と同様の方法を行いウイルス不活化検定を行った。結果を表６に示した。
【表６】
【００２２】
（結果の概要）
30℃、10℃のいずれの温度区においてもC-176、BS-17、M-21とも無処理区に比較し、低い病斑出現率が確認された。すなわち、ウイルス汚染根（TMV-P汚染根）とこれら微生物とを培養した後、培養後の磨砕液をウイルス検定植物であるタバコ品種に接種した結果、C-176、BS-17、M-21に高いウイルス不活化能を有することが判明した。特にC-176によるウイルス不活化能が非常に高いことが判明した。
【００２３】
実施例４ プロテアーゼとの組合せによる不活化能
さらに、各ウイルス不活化微生物（C-176、BS-17、M-21）と酵素処理の組み合わせによるウイルス不活化能をみた。各微生物をTMV-P汚染ピーマン根に接種して、培養温度は30℃の暗条件下で、培養期間は酵素単独は２週間、酵素と微生物の組み合わせは各１週間培養で先に酵素で処理した。処理した酵素は１％濃度になるように蒸留水で希釈して添加した。菌株・酵素を接種及び添加しない以外は同様に培養した区を無処理区として設定した。培養後、リン酸緩衝液(pH7.0)を添加して磨砕した。その磨砕した無処理区、酵素単独区、酵素＋微生物区の3つの被検液を、実施例１と同様の方法で1枚のタバコ葉に1/4葉ずつ塗抹接種し、第５〜第７葉の2株（計6葉）用いた。接種5日後、接種葉に現れた斑点の数を数え、病斑出現率を算出した。
結果を表７に示した。本発明によって、ウイルス不活化微生物と酸性プロテアーゼなどの酵素処理との組み合わせにより、ウイルス不活化能がより一層高まりほぼ完全に防除できた。
【表７】
【００２４】
実施例５ アルギン酸ビーズによる微生物の固定化
C-176をYPMG液体培地に懸濁し30℃で３日間培養した。培養後、YPMG液体培地を用いて菌密度を108CFU／gに調整した。調整液と等量のアルギン酸ナトリウムを調製液に混合し、十分撹拌した。混合液に一定圧力を加え、２％塩化カルシウム溶液に滴下した。得られたビーズは滅菌水で洗浄し、真空乾燥した。
【００２５】
実施例６ アルギン酸ビーズを用いたウイルス防除適用試験（ノイバウエルポット試験）
TMV-P汚染土（500ｇ）に各微生物を固定化したアルギン酸ビーズを5.0%(w/w)添加してよく混合し、ノイバウエルポットに充填した。充填後の土壌に潅水して、30℃の一定条件に設定した人工気象器中に1ヶ月間静置した。その後、播種10日目のピーマン苗（ニュー土佐ひかり）を定植して、1ヶ月間栽培したピーマン苗の最上葉を摘み取り、発病株を調べるためにELISA検定を行った。試験区は、TMV-P汚染していない土（非汚染土）、TMV-P汚染土に当該微生物を添加していない区（汚染土）、TMV-P汚染土に当該微生物を添加したアルギン酸ビーズの区で、1試験区あたり10株用いた。その結果、各微生物区ともにウイルス病の発病する株の割合が低下する傾向が認められた（表８）。特に、C-176区では発病の軽減効果が大きかった。
【表８】
【００２６】
実施例７ 有機質基質の評価
各有機質基質（菜種粕、大豆粕、魚粕、コメヌカ、フスマ）100gをポリポットに入れ、水を25mL加えて121℃で30分間オートクレーブ滅菌した。滅菌後、あらかじめYPMG液体培地で培養しておいた各種微生物(C-176、BS-17、M-21)の培養液を4mL(108CFU/g)ずつ添加して30℃で培養を行い、培養21日目の菌数を調査した。結果を表９に示した。培養21日目で各微生物に共通して増殖量の大きかった資材は大豆粕、コメヌカ、フスマで、108オーダーであった。その他の資材では微生物の種類やアンモニアガスの発生などの影響で107オーダー以下になるものもあった。有機質基質としては大豆粕＞コメヌカ＞フスマの順に好ましい結果となった。
【表９】
【００２７】
実施例８ 多孔質基質及び木質炭化物の評価
大豆粕40gと多孔質基質及び木質炭化物（ゼオライト、イソライト、バーク炭、バーミキュライト）の各供試資材360gをシナノパック（（株）シナノポリ製）へ入れ、水を100mL加え混合し、封をして121℃で30分間オートクレーブ滅菌した。滅菌後、あらかじめYPMG液体培地で培養しておいた各種微生物(C-176、BS-17、M-21)の培養液を4mL(108CFU/ml)ずつ添加して30℃で培養を行い、培養21日後の菌数を測定した。結果を表１０に示した。バーク炭以外のいずれも107オーダー以上増殖し、ゼオライト＞バーミキュライト＞イソライト＞バーク炭の順に菌数が多かった。
【表１０】
【００２８】
実施例９ 各種基質を用いた資材製造
実施例７、８で菌数の多かった有機質基質の大豆粕と多孔質基質のゼオライトを重量比で２：８に混合したもの１ｋｇに、水を300mL添加して混合し、シナノパック（（株）シナノポリ製）に入れ封をして121℃で30分間オートクレーブ滅菌した。滅菌後、あらかじめYPMG液体培地で培養しておいた各種微生物(C-176、BS-17、M-21)の培養液を10mL(108CFU/ml)ずつ添加して、30℃で1ヶ月間培養を行い、植物ウイルス防除資材を製造した（以下、防除資材と略す）。
【００２９】
実施例１０ 防除資材を用いたウイルス防除適用試験（ノイバウエルポット試験）
TMV-P汚染土500ｇに各微生物の基質資材を10%(w/w)添加してよく混合し、ノイバウエルポットに充填した。充填後の土壌に潅水して、30℃の一定条件に設定した人工気象器中に1ヶ月間静置した。その後、実施例６と同様の方法で播種10日目のピーマン苗（ニュー土佐ひかり）を定植して、1ヶ月間栽培したピーマン苗の最上葉を摘み取り、発病株を調べるためにELISA検定を行った。試験区は、TMV-P汚染していない土（非汚染土）、TMV-P汚染土に各微生物の防除資材を添加していない区（汚染土）、TMV-P汚染土に各微生物を添加した防除資材の区で、1試験区あたり10株用いた。その結果、各微生物区ともにウイルス病の発病する株の割合が低下する傾向が認められた（表11）。しかし、防除資材の場合はC-176区ではアルギン酸ビーズほどの発病の軽減効果はなかった。
【表１１】
【００３０】
【発明の効果】
実施例による根圏土壌、有機質肥料および堆肥に存在する微生物群から選抜された植物ウイルス不活化能を有する微生物は、高いウイルス防除効果を示した。さらには、プロテアーゼと当該微生物との組合せ処理によって、相乗的に非常に高いウイルス防除効果を示した。これらのことにより、本発明の微生物及び当該微生物からなる植物ウィルス防除剤は、難防除植物ウイルス汚染圃場などのウイルス病害の防除対策及び予防対策に有効に使用できることがわかった。本発明により従来にない、新しい土壌消毒法が確立し、ウイルス病害に対する臭化メチル代替剤としての利用が可能となる。また、減農薬による環境保全型農業が可能となる。
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物ウィルスの不活化能を有する新規微生物及び当該微生物により植物ウイルスを不活化する方法に関する。また、本発明は、当該微生物と、タンパク質分解酵素プロテアーゼ、有機質基質、多孔質基質、木質炭化物及び／又はアルギン酸ビーズとからなる植物ウィルス防除剤に関する。また更には、本発明は、当該微生物、又は当該微生物とプロテアーゼとの組み合わせで種子、葉、根及び／又は土壌に処理してなる植物ウィルスの防除方法に関する。本発明は農業及び園芸の分野において、植物ウイルス病の防除を目的として広く利用することができる。
【０００２】
【従来の技術】
農業生産において栽培されるタバコ、ピーマン、メロン、スイカ、キュウリ、トマトなどの各種作物は、タバコモザイクウイルス（TMV）、トウガラシマイルドモットルウイルス（TMV-P）、トマトモザイクウイルス（TMV-T）、キュウリ緑斑モザイクウイルス（CGMMV）、メロンえそ斑点ウイルス（MNSV）、レタスビックベインウイルス（LBVV）、ビートえそ性葉脈黄化ウイルス（BNYVV）などによって引き起こされる土壌伝染性のウイルスに罹病し、著しい被害を受けることが多い。これらの病原ウイルスは土壌、残渣・残根、雑草、種子に存在し、定植や作業時の管理作業によって伝播する。
【０００３】
このような土壌伝染性のウイルス病害対策として、従来は臭化メチル剤の土壌くん蒸消毒により防除されてきた。しかし、本薬剤は国際規約によって2005年に全廃され、現在のところ植物ウイルス病防除における臭化メチル代替剤がない。これらのことから、本病害の土壌伝染を阻止するための技術開発が急務であり、必要不可欠なものである。また、近年の環境問題への意識の高まりから減農薬への動きも大きくなってきている。そういった状況の中で、今後生物的な防除による環境保全型のウイルス病害防除が必要不可欠である。
その他、植物ウイルスの防除剤としては、アルギン酸ナトリウム剤や、シイタケ菌糸体培養抽出物（特公昭54-33994号）があるが、いずれも土壌消毒を目的として使用するものではなく、植物体の全面に漏れなく一様に散布する必要があり、また畑での効果はあまり高くない。
【０００４】
【発明が解決しようとする問題点】
本発明は、臭化メチル代替の土壌消毒材および土壌改良材として、土壌伝染性の植物ウイルス病害汚染圃場の伝染を阻止する、あるいは予防対策を目的に、有効な生物素材を提供することを課題とする。また、本生物素材を用い、減農薬による環境保全型農業が可能となるような、植物ウイルス病害の生物的防除方法を提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究した結果、根圏土壌、有機質肥料および堆肥に存在する微生物群からウイルス分解・不活化菌の検索を行い、土壌伝染性のウイルス病害を引き起こすＴＭＶに対して高い不活化能を有する微生物を見出した。特にＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属の菌株Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． Ｃ−０１７６ＡＶ（寄託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１９２５２）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属の菌株Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＢＳ−００１７ＡＶ（寄託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１９２７８）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属の菌株Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ｍ−００２１ＡＶ（寄託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１９２５３）の３種の微生物が植物ウィルスの防除に有効であることを見出した。
【０００６】
すなわち、本発明は、植物ウィルスの不活化能を有する新規微生物及び当該微生物により植物ウイルスを不活化する方法に関する。また、本発明は、当該微生物と、タンパク質分解酵素プロテアーゼ、有機質基質、多孔質基質、木質炭化物及び／又はアルギン酸ビーズとからなる植物ウィルス防除剤に関する。また更には、本発明は、当該微生物、又は当該微生物とプロテアーゼの組み合わせで種子、葉、根及び／又は土壌に処理してなる植物ウィルスの防除方法に関する。
【０００８】
本発明の微生物としては、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． Ｃ−０１７６ ＡＶ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＢＳ−００１７ＡＶ、 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ｍ−００２１ＡＶ（それぞれ、以下 Ｃ−１７６、ＢＳ−１７、Ｍ−２１とする）から少なくとも一種選ばれる植物ウィルスの不活化能を有することを特徴とする微生物であれば特に制限されず、これら菌株は活性が高く、有効に用いることができる。
Ｃ−１７６の菌学的特性は表１のとおりである。
【表１】
本菌株は、上記菌学的特徴において桿状のグラム染色陰性で、運動性があり好気的・嫌気的条件で生育でき、グルコースから酸の生成を行うことからシュードモナス属（Pseudomonas sp.）に分類される。本菌の類縁種としてはシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）あるいはシュードモナス・ピケッティー（Pseudomonas pickettii）があげられるが、L-ロイシンを分解しないことからシュードモナス・ピケッティーにより近い種である。また、アラビノースを分解しない点やL-ヒスチジンを分解する点からシュードモナス・ピケッティーと異なり、本菌株はシュードモナス属の新菌種であると認定した〔バージーズ・マニュアル オブ システマティク バクテリオロジー第1巻(JOHN G HOLT et al.,BERGEY'S MANUAL OF Systematic Bacteriology)〕。
【００１０】
本菌株Pseudomonas sp. C-0176AVは寄託番号：FERM P-19252として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
本菌株は、YPMG寒天培地で培養して増殖することができる。用いられるYPMG培地は、寒天培地であっても、液体培地であっても使用することができる。YPMG培地を用いた培養は30℃で３日間行うことが好ましい。
BS-17の菌学的特性は表２のとおりである。
【表２】
本菌株は、上記菌学的特徴において桿状で胞子を形成し、主として好気的条件で増殖する菌であることからバチルス属に分類される。本菌の類縁種としては、バチルス・ポピリエ（Bacillus popilliae）があげられるが、D-キシロース、L−アラビノースを分解する点からバチルス・ポピリエと異なり、本菌株はバチルス属の新菌種であると認定した。
本菌株Bacillus sp. BS-0017AVは寄託番号：FERM P-19278として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
本菌株は、YPMG寒天培地で培養して増殖することができる。用いられるYPMG培地は、寒天培地であっても、液体培地であっても使用することができる。YPMG培地を用いた培養は30℃で３日間行うことが好ましい。
M-21の菌学的特性は表３のとおりである。
【表３】
本菌株は、上記菌学的特徴において楕円形、円筒形で分裂増殖し、球形、卵形の胞子を形成する菌であることからシゾサッカロマイセス属に分類される。本菌の類縁種としてはシゾサッカロマイセス・ジャポニクス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）あるいはシゾサッカロマイセス・ポムベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）があげられるが、Ｄ−グルコースを分解しないことから、本菌株はシゾサッカロマイセス属の新菌種であると認定した。
本菌株Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ． Ｍ−００２１ＡＶは寄託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１９２５３として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託され、その後Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ｍ−００２１ＡＶに表示が変更されている。
本菌株は、ＹＰＭＧ寒天培地で培養して増殖することができる。用いられるＹＰＭＧ培地は、寒天培地であっても、液体培地であっても使用することができる。ＹＰＭＧ培地を用いた培養は３０℃で３日間行うことが好ましい。
【００１３】
本発明の微生物は、寒天培地又は液体培地を用いて、培養・増殖される。増殖された微生物は、白金耳等により採取、遠心分離等の操作により集菌して採取、あるいは培養液の状態として、植物ウィルスの防除又は植物ウィルス防除剤に用いることができる。
こうして培養・増殖して得られた本発明の微生物は、いずれか単独で用いることも２種以上を組み合わせて用いることもできる。本発明の微生物は、ウィルス不活化能を有し、本発明の微生物を種子、葉、根、土壌等に処理して植物ウィルスの防除効果が発揮される。たとえば、土壌中の残渣・残根に定着して土壌伝染を引き起こす植物ウイルスがある場合、これを分解し不活化することもできる。この処理方法としては、土壌への施用、育苗培土への添加、作物種子にバクテリゼーション処理、葉面散布、養液栽培における養液への添加、土耕栽培における株元への添加・潅注等をあげることができる。本発明の微生物処理により、栽培植物の植物ウィルス防除を行うことはもとより、植物ウイルス病害汚染圃場の伝染を阻止、あるいは予防対策として使用することができる。
【００１４】
本発明の植物ウィルスの防除方法としては、上記のように微生物単独で処理することもできるが、タンパク質分解酵素プロテアーゼと組み合わせて処理すると、より植物ウィルスの防除効果は高まる。プロテアーゼとしては、酸性プロテアーゼ、中性プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ等があげられるが、酸性プロテアーゼを用いることが好ましい。プロテアーゼの処理の時期としては、本発明の微生物の処理と同時又は前処理として行うことができ、処理の方法としては種子、葉、根、土壌等に上記微生物の処理方法と同様にして行うことができる。
【００１５】
また、本発明の微生物は、有機質基質、多孔質基質、木質炭化物等と組み合わせ、植物ウィルス防除剤とすることができる。有機質基質としては菜種粕、大豆粕、魚粕、コメヌカ、フスマ等があげられる。多孔質基質としてはゼオライト、イソライト、バーミキュライト等があげられる。こうして、本発明の植物ウィルス防除剤は、有機質基質、多孔質基質等と組み合わせることで効果が高まる。木質炭化物としては、バーク炭等があり微生物の住処となりやすい。
これら有機質基質、多孔質基質、木質炭化物の混合量は、植物ウィルス防除剤全量に対し、0.1%〜50%が望ましい。
【００１６】
さらに、本発明の植物ウィルス防除剤には、プロテアーゼを組み合わせることができる。これにより、上述したように、より植物ウィルスの防除効果は高まる。また、有機質基質、多孔質基質、木質炭化物等と組み合わせることにより相乗効果も期待することができる。
またさらに、本発明の植物ウィルス防除剤には、アルギン酸ビーズを組み合わせることができる。アルギン酸は、海藻などに含まれる天然の多糖類であり、アルギン酸を組み合わせることにより、本発明の微生物はこのアルギン酸ビーズに固定化され、微生物が作物根圏および土壌へ優先的に定着して安定した効果が期待できる。また、アルギン酸ビーズは、生分解性であることから、環境汚染を引き起こすこともない。
【００１７】
本発明の植物ウィルス防除剤に、本発明の微生物と組み合わされるプロテアーゼ、有機質基質、多孔質基質、木質炭化物及びアルギン酸ビーズは、目的に応じ１種を選択し、組み合わせることもできるが、２種以上選択して組み合わせることもできる。
本発明の微生物及び当該微生物からなる植物ウィルス防除剤は、単独で使用することもできるが、適当な個体担体、液体担体、乳化分散剤などを用いて、粒剤、粉剤、錠剤、乳剤、水和剤等の任意の形状で使用できる。また、本発明の微生物及び当該微生物からなる植物ウィルス防除剤を無機質肥料、有機質肥料、除草剤、土壌等と共に使用し、肥料、土壌改良資材、育苗用培土等とすることができる。
【００１８】
本発明の微生物及び植物ウィルス防除剤の防除するウィルスとしては、タバコモザイクウイルス（TMV）、トウガラシマイルドモットルウイルス（TMV-P）、トマトモザイクウイルス（TMV-T）、キュウリ緑斑モザイクウイルス（CGMMV）、メロンえそ斑点ウイルス（MNSV）、レタスビックベインウイルス（LBVV）、ビートえそ性葉脈黄化ウイルス（BNYVV）等によって引き起こされる土壌伝染性のウイルスの他に、昆虫媒介によるキュウリモザイクウイルス（CMV）、トマト黄化えそウイルス(TSWV)等があげられる。
【００１９】
【発明の実施の形態】
以下に本発明の実施態様を示すが、本発明は、これら実施例に限定されるものではない。
実施例１〜３ 微生物を用いたウイルス不活化検定
（実施例１）C-176
YPMG寒天（酵母エキス3.0ｇ、ペプトン5.0ｇ、肉エキス1.0ｇ、グルコース10ｇ、寒天16g、蒸留水1.0リットル、pH7.0）斜面培地に分離した菌株C-176をTMV-P汚染ピーマン根に接種して、各温度区（30℃、10℃）の暗条件下で1ヶ月間静置培養した。各温度区において菌株を接種しない以外は同様に培養した区を無処理区として設定した。培養後、リン酸緩衝液(pH7.0)を添加して磨砕した。検定にはウイルスを接種することによって局部病斑を生ずるタバコ品種（キサンチ・エヌシー）を用いた。検定用のタバコ品種は直径１２ｃｍの鉢で2ヶ月育成し、1区につき2鉢、３葉（第５〜第７葉）ずつ計６葉を用いた。それらの葉にカーボランダムを振掛けて、それぞれ磨砕した液を展開した葉の表の主脈を境とした半葉の半分（1/4葉）に各被検液（30℃、10℃）をそれぞれ塗抹接種し、もう半分に無処理液（30℃、10℃）をそれぞれ塗抹接種した。接種5日後、接種葉に現れた斑点の数を数え、次式によって病斑出現率を算出した。結果を表４に示した。
【数１】
（実施例２）BS-17
菌株C-176のかわりに菌株BS-17を用いる以外は、実施例１と同様の方法を行いウイルス不活化検定を行った。結果を表５に示した。
【表５】
（実施例３）M-21
菌株C-176のかわりに菌株M-21を用いる以外は、実施例１と同様の方法を行いウイルス不活化検定を行った。結果を表６に示した。
【表６】
（結果の概要）
30℃、10℃のいずれの温度区においてもC-176、BS-17、M-21とも無処理区に比較し、低い病斑出現率が確認された。すなわち、ウイルス汚染根（TMV-P汚染根）とこれら微生物とを培養した後、培養後の磨砕液をウイルス検定植物であるタバコ品種に接種した結果、C-176、BS-17、M-21に高いウイルス不活化能を有することが判明した。特にC-176によるウイルス不活化能が非常に高いことが判明した。
【００２３】
実施例４ プロテアーゼとの組合せによる不活化能
さらに、各ウイルス不活化微生物（C-176、BS-17、M-21）と酵素処理の組み合わせによるウイルス不活化能をみた。各微生物をTMV-P汚染ピーマン根に接種して、培養温度は30℃の暗条件下で、培養期間は酵素単独は２週間、酵素と微生物の組み合わせは各１週間培養で先に酵素で処理した。処理した酵素は１％濃度になるように蒸留水で希釈して添加した。菌株・酵素を接種及び添加しない以外は同様に培養した区を無処理区として設定した。培養後、リン酸緩衝液(pH7.0)を添加して磨砕した。その磨砕した無処理区、酵素単独区、酵素＋微生物区の3つの被検液を、実施例１と同様の方法で1枚のタバコ葉に1/4葉ずつ塗抹接種し、第５〜第７葉の2株（計6葉）用いた。接種5日後、接種葉に現れた斑点の数を数え、病斑出現率を算出した。
結果を表７に示した。本発明によって、ウイルス不活化微生物と酸性プロテアーゼなどの酵素処理との組み合わせにより、ウイルス不活化能がより一層高まりほぼ完全に防除できた。
【表７】
実施例５ アルギン酸ビーズによる微生物の固定化
C-176をYPMG液体培地に懸濁し30℃で３日間培養した。培養後、YPMG液体培地を用いて菌密度を108CFU／gに調整した。調整液と等量のアルギン酸ナトリウムを調製液に混合し、十分撹拌した。混合液に一定圧力を加え、２％塩化カルシウム溶液に滴下した。得られたビーズは滅菌水で洗浄し、真空乾燥した。
【００２５】
実施例６ アルギン酸ビーズを用いたウイルス防除適用試験（ノイバウエルポット試験）
TMV-P汚染土（500ｇ）に各微生物を固定化したアルギン酸ビーズを5.0%(w/w)添加してよく混合し、ノイバウエルポットに充填した。充填後の土壌に潅水して、30℃の一定条件に設定した人工気象器中に1ヶ月間静置した。その後、播種10日目のピーマン苗（ニュー土佐ひかり）を定植して、1ヶ月間栽培したピーマン苗の最上葉を摘み取り、発病株を調べるためにELISA検定を行った。試験区は、TMV-P汚染していない土（非汚染土）、TMV-P汚染土に当該微生物を添加していない区（汚染土）、TMV-P汚染土に当該微生物を添加したアルギン酸ビーズの区で、1試験区あたり10株用いた。その結果、各微生物区ともにウイルス病の発病する株の割合が低下する傾向が認められた（表８）。特に、C-176区では発病の軽減効果が大きかった。
【表８】
実施例７ 有機質基質の評価
各有機質基質（菜種粕、大豆粕、魚粕、コメヌカ、フスマ）100gをポリポットに入れ、水を25mL加えて121℃で30分間オートクレーブ滅菌した。滅菌後、あらかじめYPMG液体培地で培養しておいた各種微生物(C-176、BS-17、M-21)の培養液を4mL(108CFU/g)ずつ添加して30℃で培養を行い、培養21日目の菌数を調査した。結果を表９に示した。培養21日目で各微生物に共通して増殖量の大きかった資材は大豆粕、コメヌカ、フスマで、108オーダーであった。その他の資材では微生物の種類やアンモニアガスの発生などの影響で107オーダー以下になるものもあった。有機質基質としては大豆粕＞コメヌカ＞フスマの順に好ましい結果となった。
【表９】
実施例８ 多孔質基質及び木質炭化物の評価
大豆粕40gと多孔質基質及び木質炭化物（ゼオライト、イソライト、バーク炭、バーミキュライト）の各供試資材360gをシナノパック（（株）シナノポリ製）へ入れ、水を100mL加え混合し、封をして121℃で30分間オートクレーブ滅菌した。滅菌後、あらかじめYPMG液体培地で培養しておいた各種微生物(C-176、BS-17、M-21)の培養液を4mL(108CFU/ml)ずつ添加して30℃で培養を行い、培養21日後の菌数を測定した。結果を表１０に示した。バーク炭以外のいずれも107オーダー以上増殖し、ゼオライト＞バーミキュライト＞イソライト＞バーク炭の順に菌数が多かった。
【表１０】
実施例９ 各種基質を用いた資材製造
実施例７、８で菌数の多かった有機質基質の大豆粕と多孔質基質のゼオライトを重量比で２：８に混合したもの１ｋｇに、水を300mL添加して混合し、シナノパック（（株）シナノポリ製）に入れ封をして121℃で30分間オートクレーブ滅菌した。滅菌後、あらかじめYPMG液体培地で培養しておいた各種微生物(C-176、BS-17、M-21)の培養液を10mL(108CFU/ml)ずつ添加して、30℃で1ヶ月間培養を行い、植物ウイルス防除資材を製造した（以下、防除資材と略す）。
【００２９】
実施例１０ 防除資材を用いたウイルス防除適用試験（ノイバウエルポット試験）
TMV-P汚染土500ｇに各微生物の基質資材を10%(w/w)添加してよく混合し、ノイバウエルポットに充填した。充填後の土壌に潅水して、30℃の一定条件に設定した人工気象器中に1ヶ月間静置した。その後、実施例６と同様の方法で播種10日目のピーマン苗（ニュー土佐ひかり）を定植して、1ヶ月間栽培したピーマン苗の最上葉を摘み取り、発病株を調べるためにELISA検定を行った。試験区は、TMV-P汚染していない土（非汚染土）、TMV-P汚染土に各微生物の防除資材を添加していない区（汚染土）、TMV-P汚染土に各微生物を添加した防除資材の区で、1試験区あたり10株用いた。その結果、各微生物区ともにウイルス病の発病する株の割合が低下する傾向が認められた（表11）。しかし、防除資材の場合はC-176区ではアルギン酸ビーズほどの発病の軽減効果はなかった。
【表１１】
【発明の効果】
実施例による根圏土壌、有機質肥料および堆肥に存在する微生物群から選抜された植物ウイルス不活化能を有する微生物は、高いウイルス防除効果を示した。さらには、プロテアーゼと当該微生物との組合せ処理によって、相乗的に非常に高いウイルス防除効果を示した。これらのことにより、本発明の微生物及び当該微生物からなる植物ウィルス防除剤は、難防除植物ウイルス汚染圃場などのウイルス病害の防除対策及び予防対策に有効に使用できることがわかった。本発明により従来にない、新しい土壌消毒法が確立し、ウイルス病害に対する臭化メチル代替剤としての利用が可能となる。また、減農薬による環境保全型農業が可能となる。
Claims (5)
- Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． Ｃ−０１７６ＡＶ（ＦＥＲＭ Ｐ−１９２５２）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＢＳ−００１７ＡＶ（ＦＥＲＭ Ｐ−１９２７８）及びＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ｍ−００２１ＡＶ（ＦＥＲＭ Ｐ−１９２５３）から少なくとも一種選ばれるトウガラシマイルドモットルウィルス（ＴＭＶ−Ｐ）の不活化能を有することを特徴とする微生物。
- 請求項１記載の微生物と、プロテアーゼ、有機質基質、多孔質基質、木質炭化物及び／又はアルギン酸ビーズからなることを特徴とするトウガラシマイルドモットルウィルス（ＴＭＶ−Ｐ）防除剤。
- Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． Ｃ−０１７６ＡＶ（ＦＥＲＭ Ｐ−１９２５２）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＢＳ−００１７ＡＶ（ＦＥＲＭ Ｐ−１９２７８）及びＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ｍ−００２１ＡＶ（ＦＥＲＭ Ｐ−１９２５３）から少なくとも一種選ばれる微生物によりトウガラシマイルドモットルウィルス（ＴＭＶ−Ｐ）を不活化する方法。
- Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． Ｃ−０１７６ＡＶ（ＦＥＲＭ Ｐ−１９２５２）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＢＳ−００１７ＡＶ（ＦＥＲＭ Ｐ−１９２７８）及びＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ｍ−００２１ＡＶ（ＦＥＲＭ Ｐ−１９２５３）から少なくとも一種選ばれる微生物を、種子、葉、根及び／又は土壌に処理してなることを特徴とするトウガラシマイルドモットルウィルス（ＴＭＶ−Ｐ）の防除方法。
- プロテアーゼと、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． Ｃ−０１７６ＡＶ（ＦＥＲＭ Ｐ−１９２５２）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＢＳ−００１７ＡＶ（ＦＥＲＭ Ｐ−１９２７８）及びＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ｍ−００２１ＡＶ（ＦＥＲＭ Ｐ−１９２５３）から少なくとも一種選ばれる微生物を、栽培植物の種子、葉、根及び／又は土壌に処理してなることを特徴とするトウガラシマイルドモットルウィルス（ＴＭＶ−Ｐ）の防除方法。
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