MXPA05008322A - Bacterias que incrementan la produccion agricola y procedimientos para aislar y producir con ellas un biofertilizante y para aplicarlo sobre cultivos y suelos similares a su origen. - Google Patents

Abstract

Se describe un proceso de fabricacion de inoculante o fertilizante biologico bacteriano para ser empleado de preferencia en cultivos y suelos agricolas de donde se aisla y selecciona la bacteria que constituye el principio activo. El proceso inicia con la seleccion del sitio de muestreo de la region de interes, el aislamiento de cepas de bacterias empleando raices de los cultivos objetivo y suelos agricolas, la seleccion de cepas en base a criterios especificos, la produccion de biomasa bacteriana en fermentadores, la formulacion del inoculante en materiales solidos y la evaluacion de su efectividad biologica in vivo. El inoculante asi preparado tiene la capacidad de incrementar el rendimiento del cultivo donde se aplica debido a que la mejor capacidad de adaptacion de las cepas bacterias a la rizosfera. La invencion es el procedimiento para el aislamiento de bacterias nativas y la seleccion de cepas destacadas, que a traves de mecanismos como la fijacion de nitrogeno atmosferico y la produccion de hormonas vegetales, mejoran el desarrollo de cultivos de interes economico, siendo el producto final un formulado solido que incrementa la sobrevivencia de la bacteria para ser aplicada directamente sobre la semilla del cultivo.

Description

BACTERIAS QUE INCREMENTAN LA PRODUCCIÓN AGRÍCOLA Y PROCEDIMIENTOS PARA AISLAR Y PRODUCIR CON ELLAS UN BIOFERTILIZANTE Y PARA APLICARLO SOBRE CULTIVOS Y SUELOS SIMILARES A SU ORIGEN.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere bacterias de las especie Azospirillum brasilense cepa CBG- 497, depositado en la Agricultural Research Service Patent Culture Collection con número de acceso NRRL B-30822, que incrementa la producción agrícola de gramíneas. De igual manera son también objeto de invención, el procedimiento para aislarlas las bacterias, el procedimiento para preparar un fertilizante biológico bacteriano o biofertilizante conteniendo estas bacterias y el sistema para la aplicación del biofertilizante.

OBJETO DE LA INVENCIÓN El inoculante o fertilizante biológico tiene como principio activo bacterias del género Azospirillum. Esta bacteria tiene como característica no desarrollar estructuras diferenciadas en las que ellas se alberguen, sino que se localizan en la superficie de la raíz y en el suelo que la envuelve, es decir en la rizosfera de la planta hospedera. Al no existir especificidad propiamente dicha, la aplicación de este producto se extiende a un amplio rango de cultivos aunque sea mayormente recomendada para la familia Gramineae o Poaceae comúnmente conocidas como gramíneas. Este producto contiene bacterias del género mencionado, destacando el hecho que su aislamiento es realizado de cultivos y suelos sobre los que serán reaplicados, provocando mediante la inoculación un desbalance en la microflora del cultivo de manera que se favorezca la asociación bacteria selecta-hospedero en beneficio del desarrollo de los cultivos objetivo. El procedimiento comprende las siguientes etapas: A) Selección del sitio de muestreo de la región de interés; B) Aislamiento de cepas de bacterias del género a partir de raíces de los cultivos objetivo y suelos agrícolas, empleando medios de cultivo específicos; C) Selección de cepas en base su resistencia a antibióticos, a su producción sobresaliente de la fitohormona, ácido indol acético y de moléculas quelantes del hierro secretadas por las bacterias denominadas sideróforos en condiciones estándar in vitro; D) Producción de biomasa bacteriana en fermentadores en número superior a 1010; E) Formulación del inoculante mezclando la bacteria en materiales sólidos finos inertes de origen orgánico y porosos previamente esterilizados por métodos físicos o químicos, teniendo un concentración mínima de 109 bacterias por gramo de mezcla húmeda, sin que la humedad supere el 30%; y F) Evaluación de su desempeño sobre el cultivo de interés en condiciones de invernadero y campo donde se demuestre su efectividad biológica in vivo.

ANTECEDENTES El género Azospirillum pertenece al grupo de las denominadas bacterias promotoras del crecimiento vegetal o en inglés Plant-Growth Promoting Bacteria mencionadas en lo sucesivo como PGPB, motivo por el cual es empleada como inoculante o biofertilizante (Bashan and Holguín, 1997). Estas bacterias viven en la rizósfera de las plantas, en la zona de elongación de la raíz (Bashan et al., 1993). Este género destaca por la producción de auxinas, como ácido indol acético y ácido indo butírico (Martínez-Morales L. J. et al., 2003). La síntesis de estas fitohormonas indica ser la causa de la promoción del crecimiento en plantas, ya que en plantas donde se han inoculado cepas de Azospirillum con limitada producción de ácido índol acético se ha observado un efecto muy reducido en la promoción del crecimiento. Las especies del género Azospirillum dada su producción de auxinas, estimulan la densidad y longitud de los pelos radiculares, la tasa de aparición de raíces laterales y la superficie de la raíz. Los resultados indican que la intensidad del efecto sobre la morfología de la raíz depende de la especie de la planta y del cultivar pero sobre todo de la concentración del inoculo de Azospirillum, cuyo oscila entre 105 - 107 bacteria por semilla (Glick 1995; Bashan y Holguín 1994 y Bashan, 1998). Algunas cepas de Azospirillum tienen el potencial para producir bacteriocinas, las cuales inhiben a algunos elementos de la microflora. Algunas cepas de Azospirillum penetran las raíces de su hospedero y enseguida se establecen en gran número en los espacios intercelulares entre la epidermis y el cortex o en las capas corticales (Okon et al., 1997) y aun en el sistema vascular (Patriquin et al.; 1983). También producen sideróforos los cuales son muy eficientes para la adquisición de Fe"" en la rizósfera, por este medio toman este elemento no disponible para otros microorganismos sin capacidad siderófora (Kloepper et al., 1980). Azospirillum ha sido un organismo modelo para el estudio de las interacciones planta-bacteria y es probablemente la bacteria de la rizósfera no-simbiótica más estudiada. También ha sido aislada de una amplia variedad de plantas incluyendo muchos pastos y cereales en todo el mundo, en climas tropicales, templados y fríos, de plantas desérticas, de cultivos de maíz inundados y suelos afectados por sales (Haahtela et al., 1981; Lamm and Neyra, 1981).

La asociación puede ser descrita como una colonización de rizósfera, rizoplano y el interior de la raíz. Esta colonización es el resultado de un enriquecimiento selectivo del microorganismo mejor adaptado al nicho ecológico formado por la raíz (Bashan and Holguín, 1997). El fenómeno de promoción de crecimiento de la planta debido a la asociación de la bacteria Azospirillum con las raíces de las plantas es de considerable interés económico y científico.

Hasta ahora beneficios de Azospirillum en la familia Poaceae o Gramineae tales como maíz, sorgo y trigo han sido bien establecidos y los resultados de muchos experimentos al respecto han sido publicados. La mayoría de los estudios en campo han sido realizados en zonas templadas, en suelos con alto de materia orgánica y en suelos ácidos, habitat donde Azospirillum más ha sido reportado en la naturaleza (Bashan 1998 y Glick, 1995). Además, los resultados más destacados se han obtenido con cepas aisladas del mismo hospedero y experimentos no comparativos se han realizado usando diferentes cepas bajo diferentes condiciones ambientales (Bashan and Holguín, 1997). Una estrategia que puede contribuir a bajar los costos de producción de los cultivos es sustituyendo parcial o totalmente los fertilizantes aplicados al cultivo a favor del uso de las bacterias que se asocian naturalmente a los cultivos. El aporte de ácido indol acético por microorganismos asociados podría contribuir al establecimiento, crecimiento y desarrollo del vegetal. En maíz se ha reportado un aumento en la producción así como en el contenido de nitrógeno en el grano. Diversos estudios realizados en México y a nivel internacional han mostrado claramente que la inoculación del maíz y del trigo con bacterias promotoras del crecimiento vegetal del género Azospirillum puede ser altamente benéfica (Caballero-Mellado et al.. 1992; Okon y Labandera, 1995). En estudios previos, usando como estrategia la selección de cepas de A. brasilense, aisladas de la rizosfera y rizoplano de cultivos del maíz y trigo tropicales y semitropicales se logró incrementar entre el 30 y 80% el rendimiento del maíz en regiones tropicales y semitropicales de México donde el uso de los fertilizantes es nulo. Además, se obtuvieron niveles comerciales de producción de maíz y trigo, tanto bajo condiciones experimentales como de cultivo intensivo en los estados de Veracruz, Puebla y Tlaxcala, reduciendo en un 50% la dosis regulares de fertilizantes aplicados a estos cultivos inoculados con cepas de A. brasilense (Caballero-Mellado et al. 1992). Además, Hann y New reportan en 1998 una gran variación en cepas aisladas de Azospirillum en su actividad de nitrogenasa y en su capacidad para colonizar las raíces. Así mismo, mencionan que el éxito en las inoculaciones de gramíneas depende en gran medida del tipo de cepa aislada, por lo que se sugiere el aislamiento de cepas propias de la región y sus ensayos previos bajo condiciones controladas tales como invernadero y parcelas experimentales. Esta variabilidad en la colonización de las raíces tiene al parecer relación con aislamientos de cepas defectivas en la producción de exopolisacáridos extracelulares y de fitohormonas, lo que se ve reflejado en la producción del grano, indicando que no se garantizan los resultados si se utilizan cepas provenientes de otras regiones, sobre todo de donde las condiciones son diferentes. En resumen el mayor impedimento a la aplicación a extensiva de inoculantes basados en Azospirillum, es que los efectos benéficos dependen de múltiples factores, muchos de los cuales son difíciles de ser controlados bajo condiciones de campo, por ejemplo, la temperatura, la precipitación pluvial, la difusión de O2 y N2 y las características fisicoquímicas y microbiológicas del suelo, lo que complica su estudio sistemático. Esta carencia de información relevante, puede explicar la carencia de resultados estadísticamente significativos relacionados con la promoción de crecimiento y en el incremento en el rendimiento del cultivo objetivo, planteando además, la necesidad de evaluar cepas específicas para cada cereal y aun más para cada microregión (Okon y Labandera, 1994 y Caballero et al., 1992), de aquí que propongamos un enfoque de aislamiento y selección de cepas de sus zonas de desarrollo para ser aplicados solo en ambiente similares. En el aspecto tecnológico o industrial, existen patentes donde se describe el empleo Azospirillum como inoculante, sin embargo, en ninguna de estas patentes se describe algún procedimiento similar al método y a las cepas aisladas sujetas a escrutinio: En las patentes WO84/01686 (1984) y EP01217642 (1984), se detalla la utilidad como biofertilizante a la cepa de A. brasilense ATCC 39199, destacando su actividad pectinolítica. También en la patente EP0570079 (1993), las cepas Azospirillum NCIMB 40487 y NCIMB 40488, mezclados con diatomitas y su uso para incrementar el crecimiento de maíz, es reivindicado. En la patente WO96/34840 (1996), se refiere el empleo de Azotobacter vinelandü y Azospirillum brasilense como fertilizante bacteriano destacando su tolerancia a medios muy alcalinos, una mayor fijación de nitrógeno y mayor capacidad de asimilación de exudados de la raíz. En las patentes WO94/19924 (1994) y US5697186 (1997), un procedimiento de floculación es descrito con la finalidad de aumentar la sobrevivencia durante el almacenamiento, método empleado con bacterias de los géneros Azospirillum y Rhizobium como modelos aunque abriendo esta metodología a las amplia variedad de microorganismos agriculturalmente benéficos. La cepa Azospirillum brasilense SAP MKB con número NRRL B-30082 en las patentes WO00/34440 (2000) y US5951978 (1999) es empleada en la formulación de un inoculante microbiano. Un procedimiento para cultivar juntos al menos dos microorganismos en medios de cultivo sin nitrógeno donde una de las bacterias es la cepa de Azospirillum brasilense CCM 4644 es descrito en la patente WO98/37038 (1998), en este método ésta bacteria es cultivada junto con otras especies de bacterias como Azotobacter croococcum, Bacillus megaterium, Pseudomonas putida. Un producto biológico que incluye la cepa Azospirillum sp. M32 como bacteria fijadora de nitrógeno y Bacillus polymixa M7 como bacteria que productora de un péptido antimicrobiano contra bacterias Gram negativas, estrategia que le confiere ventaja sobre la microflora nativa al producto, es descrito en la patente US 5147441 (1992). El procedimiento para un producto multiespecie que incluye, además de cepas de Azospirillum brasilense, cepas de varias especies de Azotobacter, Pseudomonas y Bacillus es detallado en la patente WO03/016241 (2003). Como la anterior la patente coreana KB9602865 (1996) hacer describe un fertilizante bacteriano que incluye dos Azospirillum, tres de Azotobacter, dos de Pseudomonas y una de Bacillus, Rhi?obium y Arthrobacter. En las patentes españolas ES2041219 (1993) y ES2041219 (1995), procedimientos para la biosíntesis de aminoácidos, proteínas, alginatos y obtención de Biofertilizantes, aplicable a bacterias de los géneros Azotobacter y Azospirillum es puntualizado. En la patente ROÍ 15453 (2000), el residuo sólido de la extracción del café soluble es empleado como vehículo y medio sólido de fermentación, de además del género Azospirillum, de un vasto número de géneros de bacterias, actinomicetos y hongos con aplicación en el cultivo de plantas. Hasta el residuo Inclusive un método para la detección específica de las especies y/o géneros de PGPB, empleando oligonucleótidos como sonda específico que hibridizan específicamente a el gen 16S del rRNA bacteriano 16S es descrito en la patente EP1130115 (2001), los géneros de Azospirillium, Skermanella, Rhodocista y Herbaspirillium, así como las especies de Azotobacter puede ser detectados con estas sondas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura. 1. representa la Producción in vitro de ácido indol acético de los aislados o cepas destacadas.

La Figura. 2. representa la evaluación de aislados de Azospirillum en ensayos de efectividad biológica. Efecto de las bacterias sobre la materia verde en plantas de sorgo a los 14 días de inoculadas. El porcentaje es el aumento observado en relación al testigo. La multicepa fue formulada por el total de las cepas evaluadas.

La Figura. 3 representa la evaluación de las cepas de Azospirillum en sorgo en una parcela demostrativa de una hectárea por tratamiento. Para fines comparativos se incluyó un biofertilizante comercial formulado con el hongo endomicorrízico arbuscular Glomus intraradix. El porcentaje es el aumento sobre el rendimiento en toneladas de granos por hectárea observado en comparación con el testigo.

Tabla 1. Prueba de medias por prueba de Tukey para la evaluación en parcela demostrativa.

Tratamiento Kg. grano Ha ^"r % Incremento.* BV- 181 4313 a 12.7 BV- 180 4367 a 13.3 Micorriza 4264 a 11.8 CBG-497 4240 b 10.4 Micorriza +CBG-497 4133 c 7.4 BV- 191 3813 d -0.2 Multicepa 4080 d 6.7 Testigo 3800 d - BV- 112 3727 e -2.2 * Incremento en el rendimiento de grano con respecto al testigo. Valores con las mismas letras son estadísticamente iguales (Tukey, a=0.05) La Figura. 4. representa la evaluación del biofertilizante formulado con la cepa CBG-497 y aplicada sobre sorgo y maíz por los productores en municipios del norte de Tamaulipas. El porcentaje es el aumento observado en relación a los testigos individuales y el promedio es sobre el promedio de los testigos.

Tabla 2. Prueba de medias por prueba de Tukey para la evaluación de inoculante formulado con la cepa CBG-497, en municipios del norte de Tamaulipas.

Tratamiento Kg. grano Ha -i % Incremento.* Río Bravo 4687 a 4.6 Matamoros 4687 a 11.6 Valle Hermoso 4581 b 7.2 Reynosa 4240 c 15.0 Promedio 4296 c 12.5 Testigo (promedio) 3773 d -San Fernando 3284** e 23.5 *Jncremento en el rendimiento de grano con respecto al testigo. ** En San Fernando en rendimiento en el testigo fue de 2235 Kg./Ha Valores con las mismas letras son estadísticamente iguales (Tukey, a=0.05) DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención aquí detallada, es un fertilizante biológico cuyo principio activo lo constituyen aislados o cepas de bacterias del género Azospirillum, principalmente de la especie brasilense, aisladas y seleccionadas bajo criterios como: Regionalidad entendiéndose como esto, que son aisladas en la zona donde serán empleadas, la producción in vitro de ácido indol acético, la resistencia a antibióticos y la producción de sideróforos, y que después de incrementar el número bacterial por métodos de bioingeniería, son mezcladas con sustancias inertes en formulaciones líquidas y sólidas que aumentan la sobrevivencia de las bacterias, para ser aplicadas directamente en las semillas. Este fertilizante biológico, debe ser aplicado preferentemente cultivos y los suelos similares a los que se realizó el aislamiento de las estirpes o cepas selectas. De las cepas de A. brasilense, destacan las cepas CBG-497, BV- 180 y BV181 que en si mismas y junto con la técnica de aislamiento, preparación y aplicación de biofertilizante constituyen el objeto de la presente invención, que comprende las siguientes etapas: A) Selección del sitio de muestreo. B) Aislamiento de Azospirilla. C) Selección de cepas bajo criterios específicos. D) Producción de biomasa bacteriana. E) Formulación del inoculante en materiales sólidos, y F) Evaluación en invernadero y campo.

A) Selección del sitio de muestreo: Los suelos y los cultivos constituyen el primer criterio de selección en el aislamiento de las bacterias, ya que el principio de la presente invención está fundamentado en: Aislar bacterias del género Azospirillum de la microflora nativa.

Seleccionar cepas destacadas bajo criterios que demuestran su supremacía para el objetivo pretendido. Incrementar el número bacterial con métodos eficientes en medios de cultivo adecuados. Y finalmente mezclar las bacterias puras con sustratos sólidos o líquidos que prolonguen su sobrevivencia. Un vez preparado el inoculante, las bacterias serán reintroducirlas a los suelos y preferente - pero no necesariamente - al mismo cultivo de los que fueron aisladas, para propiciar un desequilibrio en el microambiente de la rizósfera en favor de estas bacterias con actividad benéfica para el desarrollo y desempeño productivo del cultivo.

Por lo anterior, si el inoculante será formulado para emplearse en suelos alcalinos y maíz, este procedimiento será aplicado en regiones como las que mencionamos en el ejemplo 1. Para suelos neutros o ácidos; en sorgo, trigo o cualquier otro cultivo, en sus distintas variedades, la efectividad biológica del inoculante, establecida por cualquier procedimiento estándar, que demuestre significancia estadística determinará si el inoculante puede o no ser empleado. De esta manera, el procedimiento aquí descrito y de acuerdo a los resultados mostrados en los ejemplos, otorgan un valor especial al inoculante, cuando este es empleado sobre el cultivo y suelo de donde fue obtenido el principio activo, pero sin descartar su extrapolación a otras condiciones como serías suelos y cultivares, bajo previa validación.

B) Aislamiento de Azospirilla: Para la toma de muestras se emplea el criterio arriba mencionado y técnicas comunes la práctica agronómica. Para el aislamiento de los Azospirilla se emplean tres tipos muestras; a) Suelo agrícola, b) Rizosfera comprendida por la raíz y suelo adyacente o adherido a la misma y c) Tejido del tallo de los cultivos seleccionados de acuerdo a lo descrito anteriormente. Se prepara una suspensión con una cantidad fija de cada tipo de muestra y 10 ml solución estéril de NaCl2 al 0.85%. Del suelo agrícola se emplea lg, de rizósfera 10 g y de tejido de plantas se utilizan 10 g de tejido machacado en condiciones asépticas. De la fase líquida de las suspensiones, se preparan sucesivas diluciones decimales para cada tipo de muestras. Cien µl de la de las diluciones 10"3 y 10"4 de cada muestra be aplica en un medio sólido en cajas de petri, las que son incubadas a 30°C por 48 a 72 horas. El sembrado en placa se realiza por triplicado. El medio de cultivo utilizado es Rojo Congo con un pH modificado de 7.5 (Rodríguez Cáceres, 1982).

Se hacen dos diferentes pruebas para verificar las colonias típicas de Azospirilla. Primero, después de 72 horas, las pequeñas colonias rojas presentes en las cajas de Petri con medio Rojo Congo indican la presencia de Azospirillum spp. de acuerdo a Rodríguez Cáceres, (1982) y segundo las colonias del primer aislamiento se inoculan en condiciones de microaerofílicas, en el medio Nitrogen Fixation Biological o NFB. Finalmente, para tener abundante biomasa bacteriana en medio sólido, estas colonias se siembran por estría con asa en cajas de Petri con medio sólido de cualquiera de los siguientes medios; Papa Dextrosa Agar o PDA, Peptona Extracto de Levadura Agar o PYA o Triptona Extracto de Levadura Glucosa Agar o TYGA, se incuban a 30°C por 7 días.

Para la conservación de los aislados o cepas se pueden emplear cualquier de estos dos procedimientos: A) Inocular los aislados en cualquier medio de los anteriores pero sin Agar, más un antibiótico adecuado, se crecen en agitador orbital a 250 rpm y 30°C, después de crecer por 24 horas, la suspensión de bacterias se mezcla con un parte de glicerol al 40%, se agita y en condiciones de esterilidad se vacía en contenedores adecuados como tubos Eppendorf o viales y se congela a — 70°C. B) Inocular los aislados o cepas en medio Luria Bertani o LB complementado con 10 g/l de ácido succínico ajustado con hidróxido de sodio a pH 7.0, más un antibiótico adecuado, se crecen en agitador orbital a 250 rpm y 30°C, después de crecer por 24 horas, un volumen de suspensión de bacterias se mezcla con un 5 volúmenes de glicerol al 30%, se agita y en condiciones de esterilidad se vacía en contenedores adecuados como tubos Eppendorf y se congela a— 20°C. La identificación fenotípica de las cepas obtenidas se realiza sobre la base de los criterios aceptados para el género Azospirillum, tal como se describe en Tarrand et al. (1978) y puede ser confirmado diversas técnicas moleculares como polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción o en inglés Restriction Fragment Length Polymorphism o secuenciación de gen 16S de DNA ribosomal y comparados con los datos de tamaño de fragmentos y secuencias reportadas en bancos de información como el NCBI.

C) Selección de cepas bajo criterios específicos. El criterio de selección de las cepas productivas es en base a su resistencia a antibióticos, su producción de sideróforos y su capacidad de producción de ácido indol acético in vitro.

Resistencia a antibióticos. Para distinguir las cepas de Azospirillum inoculadas de la población nativa se realizan pruebas de resistencia a antibióticos por triplicado. Los antibióticos recomendables son: eritromicina de 5 a 30 µg/ml de preferencia 15 µg/ml , polimixina B de 100 a 500 µg ml de preferencia 300 µg ml), cloramfenicol de 10 a 50 µg/ml de preferencia 30 µg ml, gentamicina de 5 a 15 µg/ml de preferencia 10 µg/ml, ofloxacina de 1 a 10 µg/ml de preferencia 5 µg/ml, cefotaximina de 10 a 50 µg/ml de preferencia 30 µg/ml, imipenem 5 a 15 µg/ml de preferencia 10 µg/ml, ácido nalidíxico de a 30 µg/ml de preferencia 20 µg ml, penicilina de 5 a 15 µg/ml de preferencia 10 µg/ml, trimetoprina 0.25 a 2 µg/ml de preferencia 1.25 µg/ml y ampicilina de 50 a 150 µg/ml de preferencia 100 µg/ml.

Producción de sideróforos. Para la determinar la producción de sideróforos in vitro de las cepas de Azospirillum es necesario preparar primero cuatro soluciones que integran el medio sólido. La solución MM9 contiene la siguiente cantidad por litro de agua desmineralizada; 1.0 g de cloruro de amonio, 0.5 g de cloruro de sodio, 0.3 g de fosfato monobásico de potasio, 0.25 g de sulfato de magnesio y 0.011 g de cloruro de calcio. La solución I se prepara con 20 g de fructuosa, 5 g de ácido glutámico, 5 g de ácido succínico, 50 ml de solución MM9, 3 g de casaminoácidos y agua desmineralizada para ajustar a 100 ml de solución. Las soluciones MM9 e I se someten a un método de extracción de hierro que consiste en mezclar cada solución por separado con 1 g de 8-hidroxiquinoleina disuelta previamente en cloroformo, agitando por 48 horas en refrigeración, lavando de tres a cuatro veces con cloroformo, separando la fase acuosa de la fase orgánica, evaporando el residuo de cloroformo de la fase acuosa con agitación, para finalmente esterilizar las soluciones por filtración. La solución II se prepara con 50 ml de cromo azurol con 1.21 mg/ml, 40 ml de HDTMA con 1.82 mg/ml y 10 ml de solución de hierro, mezclando la solución de hierro con el cromo azurol y agregando el HDTMA manteniendo en agitación y esterilizando a 15 Libras/in2 por 20 min. La solución III se prepara con 30.24 g de pipes ácido y 50 ml de solución MM9 preferentemente sin hierro, aforando a 800 ml con agua desmineralizada y L ajustando el pH a 6.8 con hidróxido de sodio. El medio de cultivo se prepara con la solución I que se vierte en la solución III, después se agrega la solución II más 1.5 % de Agar y se esteriliza a 15 Libras/in2 por 20 min. Finalmente, se vacía el medio en cajas Petri y una vez solidificado se inocula, por punción con un cultivo fresco de los diferentes aislados o cepas de Azospirillum brasilense. Posteriormente se incuban a 30° C por 72 horas. La producción de sideróforos es positiva si en el punto de inoculación de la bacteria cambia del color azul grisáceo hacia amarillo, destacando que el diámetro del halo es proporcional a la producción de sideróforos.

Producción de ácido indol acético. Para la evaluación de la producción de ALA in vitro, todos los aislamientos de Azospirilla se inoculan en matraces de 125 ml conteniendo 50 ml de caldo succinato-fructuosa de sales adicionado con 100 mg de triptofano, se crecen por 48 horas a 30 °C (Jain y Patriquin, 1985), para favorecer la producción de ácido indol acético. Al cumplir este tiempo se separan las bacterias del caldo por cualquier medio; centrifugación a 3000 rpm o filtración. Se cuantifica el contenido de ALA de la fase líquida por cromatografía líquida de alta resolución acuerdo al método descrito por Mascarúa-Esparza, et al., en 1988 y Fuentes-Ramírez et al., en 1993.

D) Producción de biomasa bacteriana. Ya que el número bacterial es un aspecto importante en la efectividad biológica de los fertilizantes bacterianos, es necesario producir una considerable cantidad de bacterias del aislado o cepa seleccionada. Cuando se pretende abarcar una limitada superficie de cultivo, esto se puede lograr con procedimientos sencillos como lo es en matraces de 500 ml con 250 ml del medio adecuado, incubado normalmente a 30°C por 48 horas en una incubadora con movimiento orbital. Sin embargo, para producir grandes volúmenes de caldo de fermentación con bacterias se emplean fermentadores agitados operando en diferentes regímenes; lote o lote alimentado y diferentes volúmenes.

Dado que se trabaja con aislamientos nuevos, se requiere establecer los parámetros de bioingeniería con el fin de obtener altas concentraciones de bacterias, aunque las condiciones de operación preferentemente son: pH inicial de 6 a 8, sin control de pH en régimen de lote y con control de pH en régimen de lote alimentado, donde se alimenta una solución de ácido succínico / succinato de amonio a un pH de 1.5 a 3.0, a una temperatura de 25 a 35°C por un tiempo no menor a 20 horas y no mayor a 48 horas, a una concentración de oxígeno disuelto superior al 20 % de saturación, para lo que es necesario manipular la agitación o el flujo de aire, al fermentador. Los medios de cultivo para lograr una concentración de bacterias elevado, son diversos, el mas adecuado contiene medio LB (Luria-Bertani) complementado con una fuente de carbono como; fructosa, ácido málico, ácido glucónico o ácido succínico, más hidróxido de amonio para un pH neutro o ácido. Una vez terminada la fermentación, la concentración celular se mide por métodos turbidimétricos típicos los cuales relacionan la densidad óptica de la suspensión microbiana con la concentración en bacterias o bacteria por mililitro. La biomasa bacteriana se centrífuga para separar el medio agotado de la biomasa. El paquete celular se resuspende empleando una solución estéril de NaCl2 al 0.85% o en un medio similar al empleado para la producción de la biomasa. El volumen de solución se estima de acuerdo a la densidad celular deseada en el producto final por lo cual generalmente está en el orden de lxl 010 bacterias por mililitro.

E) Formulación del inoculante en materiales sólidos. Para la preparación del fertilizante bacteriano, la presentación puede ser sólida o líquida. Las bacterias se mezclan con soportes sólidos o coadyuvantes adecuados para la presentación líquida, de tal manera con ellos se prolongue la sobrevivencia de las bacterias. Para la presentación sólida, la turba fina es el soporte más recurrido, sin embargo, en el mercado se encuentran mezclas de turba con otros sustratos que mejoran las características del soporte. Una vez elegido el soporte, se verifica su pH, el cual de ser necesario es ajustado a un valor de 6.5 a 7.5 con CaC?3. La suspensión bacteriana se mezcla con el sustrato en cantidades adecuadas para el uso a que vaya a destinar. Los coadyuvantes de la presentación líquida son compuestos inorgánicos y polímeros orgánicos. La mezcla líquida o sólida se prepara empleando contenedores asépticos y de preferencia en condiciones de esterilidad. La formulación sólida debe tener una población inicial de Azospirillum de 5x10 a 1x10 bacterias por gramo de sustrato, con una humedad no mayor al 30% base húmeda y la formulación líquida, una concentración mínima de lxl O9 bacterias por mililitro.

F) Evaluación en invernadero y campo. La evaluación de la efectividad biológica se determina en condiciones artificiales en un invernadero y en campo en parcelas con suelos agrícolas similares a los suelos donde finalmente se empleará el fertilizante biológico. Para ello las semillas del cultivo tipo, ya sea híbrido o variedad, libres de fungicidas, son tratadas con el producto sólido que previamente fue mezclado con un polímero adherente, que puede ser goma arábiga o goma acacia y que facilita la adhesión del fertilizante biológico a la semilla. La proporción de inoculante/semilla se establece de manera tal que la cantidad de bacteria no sea inferior a 1x10 ni superior a 1x10 bacterias/semilla, siendo una concentración bacterial adecuada lxl O6 bacterias/semilla. En el caso de los ensayos de efectividad biológica en invernadero se realizan por empleando las repeticiones necesarias para validar estadísticamente la evaluación, y se puede inocular la bacteria directamente como solución líquida. Las parcelas demostrativas se establecen acuerdo a las prácticas agronómicas comunes para medir el desempeño del cultivo, incluyendo la producción de grano por superficie.

BIBLIOGRAFÍA. 1. Bashan Y et al. (1993) Methods in Plant Mol. Boil. and Biotech. CRC. P. 331-345. 2. Bashan Y and Holguin G (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60:2120-2131. 3. Bashan Y and Holguin G (1997) Can. J. Microbiol. 43:103-121. 4. Bashan Y (1998) Biotechnol. Adv. 16:729-770. 5. Caballero-Mellado et al (1992) Simbiosis. 13:243-253 6. Lamm RB and Neyra CA (1981) Can. J. Microbiol. 27: 1320-1325 7. Fuentes-Ramírez et al (1993) Plant and Soil. 154: 145- 150 8. Glick R. (1995) Can. J. Microbiol. 41:109-117 9. Kloepper JW et al (1980) Nature. 286:885-886 10. Martínez-Morales LJ et al. (2003) FEMS Microbiology Letters. 228:167-173 11. Mascarua-Esparza MA, et al (1988) Plant and Soil. 106, 91 -95 12. Neyra CA et al (1980) Can. J. Microbiol. 26(3):338-42. 13. Okon Y et al (1977) Appl. Environ. Microbiol. 33:85-88 14. Okon Y and Labandera-Gonzáles CA (1994) Soil. Biol. Biochem. 26:1591-1601 15. Haahtela K et al (1981) Appl. Environ. Microbiol. 41:203-206 16. Hann SO and New PB (1988) Microbiol. Ecol. 36: 193-210 17. Patriquin DG et al (1983) Can. J. Microbiol. 29:900-915 18. Rodríguez Cáceres EA (1982) Appl. Environ. Microbiol. 44, 990-991 19. Tarrand JJ et al (1978). Can. J. Microbiol. 24: 967-980.

EJEMPLO 1. Aislamiento de cepas destacadas de Azospirillum de suelos alcalinos y de las gramíneas las cuales entre otras pueden ser sorgo y maíz, su preparación con material inerte para ser empleado como inoculante o fertilizante bacteriano y su uso en similares condiciones a las del aislamiento. a) Selección del sitio de muestreo: Las muestras de suelos, raíces y tejido se obtuvieron de municipios del norte de Tamaulipas, de parcelas de temporal y riego. En esta zona el suelo varía de franco limoso a arenoso, con 0.6 a 2.3 ppm de materia orgánica, de 400 a 600 ppm de Potasio, de 10 a 50 ppm de NO3, de 9 a 13 ppm de P2O5 con un conductividad de 0.3 a 3.9 mS/cm. y con pH alcalino en promedio de 7.8, donde en los últimos ciclos agrícolas se han sembrado híbridos de maíz y de sorgo. b) Aislamiento de los Azospirilla: Los aislamientos de Azospirillum de suelo, se obtuvieron haciendo diluciones decimales en una solución estéril de NaCl2 al 0.85% donde las diluciones de 10"3 y 10"4 fueron plaqueadas por triplicado en medio Rojo Congo. Para los aislamientos de rizósfera se tomó un gramo de raíz; el suelo intacto adherido a la raíz fue resuspendido en 1 ml de solución estéril de NaCl2 0.85%. El aislamiento de Azospirillum de tejido de plantas fue hecho de 5 g de tejido molido con 5 ml de NaCl2 al 0.85% estéril y plaqueado en cantidades iguales en Rojo Congo. Se hicieron nueve repeticiones por planta en todos los estudios. Estos cultivos fueron incubados a 30°C por 72 horas. Se verificó de acuerdo al procedimiento descrito que fueran pequeñas colonias rojas típicas de Azospirilla. Posteriormente las colonias del primer aislamiento fueron inoculadas en condiciones de microaerof?licas, en el medio NFB, incubando a 30 °C por 72 horas. Los aislamientos que cumplían ambos criterios; morfología colonial y actividad nitrogenasa, fueron estriadas en placas de PDA, incubadas a 32°C por 7 días y sometidas a los posteriores ensayos: Perfil de resistencia a antibióticos, producción de sideróforos y de AIA. c) Selección de cepas bajo criterios específicos: Perfil de resistencia a antibióticos. Los Azospirilla seleccionados fueron aquellos que presentaron resistencia a 100 µg/ml ampicilina, por esta razón, en lo sucesivo este antibiótico se emplea en los medios sólidos y líquidos de conservación para las cepas aisladas.

Producción de sideróforos. Cada aislamiento de Azospirillum se sometió al método de producción sideróforos y se seleccionaron solo aquellas cepas que mostraron un adecuado halo de actividad de sideróforos.

Producción de ácido indol acético. Los aislados seleccionados de la prueba de sideróforos se sometieron al método de producción de ALA, donde las cepas sin o muy baja producción de ALA fueron desechadas y las cepas con un adecuado nivel de producción de ALA fueron finalmente elegidas para los ensayos de efectividad biológica. En la figura 1, se muestra la producción in vitro de ácido indol acético de los cepas destacadas. c) Producción de biomasa bacteriana. Para la realización de los ensayos de efectividad biológica y pruebas de evaluación en campo, las cepas selectas y especialmente la cepa designada como CBG-497, fueron multiplicadas en matraces o fermentadores, selección del equipo realizada de acuerdo la cantidad del inoculante requerida, empleando el medio líquido LB+S, que contiene 25 g de medio LB, 10 g de ácido succínico y 7.12 g de hidróxido de sodio a 1000 ml de agua desionizada, ajustado a un pH a 7.50. El inoculo bacteriano se preparó en matraces de 250 ml con 50 ml del medio LB+S, los cuales fueron inoculados con una asada de bacteria activada previamente en medio sólido TGYA o PDA. Los matraces se colocaron en un agitador orbital a 250 rpm y 30 °C por 10 a 12 horas cuando la bacteria estaba en crecimiento logarítmico de preferencia a una densidad óptica a 660 nm de 2.0.

Matraces Erlenmeyer de 250 ml con 100 ml de medio y fermentadores de 3 L y 20 L ml de volumen nominal, con 1.5 L y l4 L de volumen de medio LB+S fueron inoculados con 2% v/v de inoculo. Los matraces se colocaron en un agitador orbital a 250 rpm y 30 °C por 36 horas, cosechando la bacteria en el estado estacionario, cuando la fuente de carbono se agotó, y el caldo de fermentación contenía de 4.0 a 5.0 de OD66onm que equivale de 3.2xl010 a 4xl010 bacterias/ml ya que cada unidad de OD660nm equivale a 8xl09 bacterias/ml. En los fermentadores, el oxígeno disuelto se mantuvo a un mínimo de 15%, manipulando la agitación y la aireación de acuerdo a lo requerido. El pH al inicio de la fermentación se ajustó a 7.50 y se controló con hidróxido de amonio o sodio. La temperatura se controló a 29 °C. La fermentación se realizó por 24 horas y se terminó, cuando el crecimiento bacterial se encontraba en la fase estacionaria con una densidad óptica a 660 nm de 7.5 a 9.0 o 6xl010 a 7.2xl010 bacterias/ml. Para la cepa CBG-497 se tuvo un coeficiente de respiración de 2.4 gO2 1"1 Hr"1.

Se preparó una suspensión bacteriana o SB con una concertación de lxlO10 bacterias/ml con el caldo de fermentación cosechado, el cual se centrifugó a 3000 rpm en condiciones asépticas, decantando el líquido y resuspendiendo el paquete celular con solución isotónica de cloruro de sodio al 0.85%, empleando el volumen necesario para tener la concentración celular definida. e) Formulación del inoculante en materiales sólidos. La formulación sólida del Biofertilizante bacteriano se preparó con una mezcla comercial a base de turba como soporte, previamente esterilizado y posteriormente mezclado con la solución bacteriana con lxlO10 bacterias/ml, preparada con la solución isotónica. La mezcla se preparó con 30 ml de la SB, 90 ml solución isotónica de cloruro de sodio al 0.85% estéril y 300 g de turba estéril. De esta manera se tuvieron al momento de la preparación 3x1011 bacterias por cada unidad de 420 g de turba húmeda, que contiene bacteria suficiente para inocular la semilla requerida por una hectárea de sorgo o de maíz, de manera que al momento de la preparación con la semilla se tenía 1x10 bacterias/semilla de sorgo y 6x10 bacterias/semilla de maíz.

F) Evaluación en invernadero y campo. La evaluación en invernadero y campo se realizó para evaluar la efectividad biológica de las cepas selectas. Ensayos en invernadero. El sustrato se esterilizó en autoclave a 1 Kg/cm2. El sustrato se vertió en condiciones asépticas en charolas de germinación con 32 contenedores de 290 cm3. La semilla de sorgo se desinfectó con etanol al 70% por 30 segundos y se lavó con agua estéril. Se sembraron 3 semillas de sorgo. El sustrato de humectó con agua estéril y la charola se cubrió con su domo de germinación, el cual se cubrió con plástico negro hasta la emergencia de las plántulas. Una vez germinadas las semillas solo se dejó una planta. Se agregaron 100 µl de SB con lxlO10 bacterias/ml sobre la base de la planta. Se inoculó una charola con cada estirpe selecta de Azospirillum. El desarrollo de la planta se realizó por dos semanas. A completar los 14 días, se midió la altura, se pesó la materia verde y la raíz de cada charola. En la figura 2 muestra la evaluación de aislados de Azospirillum en bioensayos. Efecto de las bacterias sobre la materia verde en plantas de sorgo a los 14 días de inoculadas. El porcentaje es el aumento observado en relación al testigo. La multicepa fue formulada por el total de las cepas evaluadas.

La cepas de Azospirillum que mostraron alto potencial in vitro y en ensayos de efectividad biológica en invernadero, se evaluaron en campo bajo condiciones más controladas. La evaluación se realizó en una parcela ubicada en el municipio de Matamoros a los 97°48.945' latitud norte, 25°54.735' longitud oeste y altitud promedio 11 metros sobre el nivel del mar, con suelo franco limoso conteniendo 66% arena, 22% limo y 12% arcilla, con menos de 1 ppm de materia orgánica y pH de 7.8. Se empleo la semilla sorgo DK-52.

Para fines comparativos se incluyó un Biofertilizante comercial formulado con el hongo endomicorrízico arbuscular Glo us intraradix. Cada tratamiento se aplicó en una superficie de una hectárea y los tratamientos fueron: TI, cepa BV-112; T2, cepa BV-191; T3, multicepa (BV-112, BV-193, BV-181, BV-180); T4, cepa BV-181; T5, cepa BV-180; T6, cepa CBG-497; T7, cepa CBG-497 más Micorriza; T8, Micorriza de la especie Glomus intraradix y T9, Testigo. Al final del ciclo agrícola, cada tratamiento fue cosechado y pesado en su totalidad empleando un carro báscula. La producción de grano por hectárea en los tratamientos con las cepas CBG-497, BV-180 y BV 181 fue estadísticamente similar al tratamiento con la micorriza de la especie Glomus intraradix considerado testigo positivo. Por lo contrario, se obtuvo diferencia estadística en relación al testigo con las cepas CBG-497, BV-180 y BV181 y similitud con las cepas BV112 y BV-191, para este tipo de suelo y cultivar de sorgo resultados ilustrados en la Figura 3 y la Tabla 1.

Finalmente la cepa CBG-497, se evaluó en varias localidades de los municipios de la zona norte de Tamaulipas, que comparten similitud de suelo agrícola. Esta evaluación fue realizada directamente por productores quienes aplicaron la bacteria en forma de Biofertilizante formulado como se describe en e) y mezclado directamente sobre la semilla de manera tal que se tuvo como mínimo lxlO6 bacterias/semilla. Se dejó como testigo, una superficie igual a la aplicada con el inoculante. Con excepción de Abasólo donde se evaluó únicamente maíz, en el resto de los municipios, la evaluación se realizó con diferentes híbridos de sorgo grano.

Los resultados se estimaron en base a una metodología agronómica típica para la determinación del rendimiento. Los resultados son el promedio de las parcelas donde se realizó el seguimiento como se muestra en la Figura 4. El análisis estadístico por la prueba de medias de Tukey que se representa en la Tabla 2, indica que el incremento observado en el rendimiento de grano fue estadísticamente significativo en los diferentes municipios donde se realizó la evaluación. Subrayando que en ninguna parcela se obtuvieron resultados negativos. El porcentaje mostrado en la Figura 4, es el incremento observado en relación a los testigos individuales y el promedio mostrado se refiere al promedio de los testigos.

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES Habiendo descrito de manera suficiente y clara nuestra invención, consideramos como una novedad y por lo tanto reclamamos como de nuestra exclusiva propiedad, lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Un cultivo puro de la bacteria perteneciente de la especie Azospirillum brasilense designada como cepa CBG-497, depositado en la Agricultural Research Service
2. Patent Culture Collection con número de acceso NRRL B-30822. 2. Fertilizante biológico bacteriano o biofertilizante eficaz para incrementar la producción agrícola de las especies incluidas en la familia Poaceae, caracterizado por que contiene bacterias de la cepa CBG-497 de Azospirillum brasilense.
3. 3. Procedimiento para el aislamiento del cultivo puro de la bacteria según la reivindicación 1, caracterizado por que comprende las siguientes etapas: a. Colectar de muestras de suelo circundante a la raíz y tejido de raíz del cultivo objetivo, preferentemente de la misma zona geográfica donde se empleará el biofertilizante, suspendiendo las muestras colectadas en solución de NaCl al 0.85 %, preparando diluciones decimales. b. Inocular las suspensiones en cajas de Petri conteniendo medio Rojo Congo con un pH 7.5, incubando por 30 °C por 72 horas, para aislar solo las colonias típicas de Azospirilla c. Sembrar las colonias aisladas del paso anterior en condiciones microaerofílicas en el medio NFB, incubando a 30°C por 72 horas, d. Cultivar las colonias aisladas que crecieron en los anteriores medios en medio PDA, incubando a 32°C por 7 días. e. Seleccionar de las colonias aisladas solo las cepas que muestren resistencia a antibióticos como eritromicina, polimixina B, cloramfenicol, gentamicina, ofloxacina, cefotaximina, imipenem, ácido nalidíxico, penicilina, trimetoprina y ampicilina, así como adecuada producción de sideróforos y ácido indol acético in vitro.
4. 4. Procedimiento para obtener biomasa bacteriana a partir del cultivo puro de la bacteria según la reivindicación 1, requerida para elaborar un biofertilizante según la reivindicación 2, caracterizado por que comprende las siguientes etapas: a) Cultivar la cepa CBG-497, activada previamente en medio sólido PDA, en matraces de 250 ml con 50 ml del medio de cultivo LB+S que contiene 25 g de medio Luria Bertani, 10 g de ácido succínico y 7.12 g de hidróxido de sodio en 1000 ml de agua desionizada, un pH de 6 a 8, en un agitador orbital a 250 rpm, a una temperatura entre 25 a 35 °C por 10 a 24 horas o una densidad óptica a 600 nm de 1.5 a 3.0 b) Inocular 2% en volumen de la suspensión bacteriana obtenida mediante el paso anterior, a matraces de 300 ml con 100 ml de medio LB+S, agitando a 250 rpm, a una temperatura de 25 a 35 °C por 10 a 24 horas o una densidad óptica a 600 nm de 1.5 a 3.0. c) Inocular de 1 a 3% en volumen de la suspensión bacteriana obtenida mediante el paso anterior a un fermentador conteniendo medio LB+S a un pH inicial de 6 a 8, sin control de pH; en régimen de lote y con control de pH; en régimen de lote alimentado, donde se alimenta una solución de ácido succínico / succinato de amonio a un pH de 1.5 a 3.0, a una temperatura de 25 a 35°C por un tiempo no menor a 20 horas y no mayor a 48 horas, con una concentración de oxígeno disuelto superior al 20 % de saturación, para lo que es necesario manipular la agitación, el flujo de aire o la presión manométrica del fermentador, condiciones adecuadas para obtener concentraciones bacterianas mayores a lxlO10 bacterias/mL. d) Separar la biomasa bacteriana por centrifugación de 3000 a 9000 rpm o filtración con filtro de 0.45 µm, resuspendiendo el paquete celular con una solución estéril de NaCl2 al 0.85% o con un medio similar al empleado para la producción de la biomasa, empleando un volumen necesario para tener una concentración celular de 1 x 109 bacterias/ml.
5. 5. Biofertilizante según la reivindicación 2, caracterizado por que la bacteria está mezclada, atrapada, envuelta, embebida, suspendida o en el interior de una cápsula de un material sólido inerte que contenga total o parcialmente turba, vermiculita, acrilato, grenetina, alginato de sodio o calcio, con cualquier contenido de humedad dentro del rango de 1 a 99 %.
6. 6. Biofertilizante según la reivindicación 2, caracterizado por que la bacteria está mezclada con una solución acuosa preparada con un porcentaje dentro del rango de 1 a 99% de las concentraciones base de cada componente de medio descrito como LB+S.
7. 7. Biofertilizante según la reivindicación 2, caracterizado por que la bacteria está liofilizada.
8. 8. Sistema para incrementar la producción agrícola, caracterizado por que utiliza un Biofertilizante según la reivindicación 2, el cual a sido formulado de acuerdo a una o mas de una de las reivindicaciones 5, 6 y 7.
9. 9. Sistema para incrementar la producción agrícola según la reivindicación 9, caracterizado por que el biofertilizante se aplica como una delgada cubierta sobre la semilla o cualquier parte de la planta, en cualquiera de sus etapas fisiológicas, o directamente sobre el suelo.
10. 10. Sistema para incrementar la producción agrícola según la reivindicación 9, caracterizado por que el biofertilizante se aplica solo o en combinación con fertilizantes comerciales inorgánicos, orgánicos o biológicos
11. 11. Sistema para incrementar la producción agrícola según la reivindicación 9, caracterizado por que el biofertilizante se aplica solo o en combinación con sustancias químicas orgánicas denominadas genéricamente como fitohormonas y que funcionalmente actúan como reguladores, promotores o moduladores del potencial de crecimiento de plantas como auxinas, citocininas o citoquininas, giberelinas y oligosacáridos.
12. 12. Sistema para incrementar la producción agrícola según la reivindicación 9, caracterizado por que el biofertilizante se aplica solo o en combinación con sustancias químicas inorgánicas, orgánicas o biológicas, denominadas genéricamente como micro nutrientes y aminoácidos.
13. 13. Sistema para incrementar la producción agrícola según la reivindicación 9, caracterízado por que el biofertilizante se aplica solo o mezclado con insumos agrícolas comerciales, inorgánicos, orgánicos o biológicos, tales; insecticidas, herbicidas, fungicidas o compostas.