CN104245948B - 乳酸的制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种即使连续地生产也能够维持乳酸的高生产率的、利用丝状菌的乳酸的制造方法。本发明的乳酸的制造方法包括：在磷酸根离子浓度被控制在低于0.007质量％、且包含碳源的液体培养基中，使用选自丝状菌球和固定化丝状菌中的1种以上的菌体，通过发酵而得到乳酸的第一发酵工序。
Description
技术领域
本发明涉及乳酸的制造方法。
背景技术
真菌类中包含的米根霉(Rhizopus oryzae)等丝状菌容易变成菌丝块(球)。已知若将这样的球状的丝状菌用于乳酸的制造，则容易从发酵后的培养基分离生成物，且可以进行连续的制造(专利文献1)。例如，有报告称使用米根霉(Rhizopus oryzae)的菌球并利用半间歇式反应法，连续生产了乳酸25天(25个周期)(非专利文献1)。
另外，还有报告称通过利用将磷酸根离子、钾离子、钠离子、镁离子和钙离子的浓度分别控制在5～60mM、5～60mM、2～50mM、0.5～9mM、0.5～12mM的培养基来培养丝状菌，从而使丝状菌的过度的浆化和过度的球化得到抑制，使浆与球的混合状态得到维持，其结果，不饱和脂肪酸的收率大幅提高(专利文献2)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平6-253871号公报
专利文献2：国际公开第98/29558号
非专利文献
非专利文献1：Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，38卷(2011)565-571
发明内容
本发明提供一种乳酸的制造方法，其包括：在磷酸根离子浓度被控制在低于0.007质量％、且包含碳源的液体培养基中，使用选自丝状菌球和固定化丝状菌中的1种以上的菌体，通过发酵而得到乳酸的第一发酵工序。
具体实施方式
本发明人等发现，在包含碳源的液体培养基中，使用丝状菌球或固定化丝状菌，通过发酵连续地制造乳酸，其结果，醇的生成经时地增加，而乳酸的生产率降低。
本发明在于提供一种即使连续地生产也能够维持乳酸的高生产率的、利用丝状菌的乳酸的制造方法。
本发明人等为了查明上述乳酸的生产率降低的主要原因而进行了各种讨论，结果发现，通过将包含碳源的液体培养基中的特定成分的浓度控制为低于规定值，从而可使丝状菌球或固定化丝状菌的菌丝形态得到维持，即使连续地生产，也能够维持乳酸的高生产率。
根据本发明，可以提供下述的利用丝状菌的乳酸的制造方法，对于该制造方法而言，在维持丝状菌球或固定化丝状菌的菌丝形态的同时，即使连续地生产乳酸，也能够维持高生产率。
本发明的乳酸的制造方法包括：在磷酸根离子浓度被控制在低于0.007质量％、且包含碳源的液体培养基中，使用选自丝状菌球和固定化丝状菌中的1种以上的菌体(以下，也简单称为“菌体”)，通过发酵而得到乳酸的第一发酵工序。
作为用于本发明的丝状菌，可以举出属于根霉(Rhizopus)属、曲霉(Aspergillus)属、毛霉(Mucor)属的微生物，其中，优选根霉(Rhizopus)属。具体来说，优选米根霉(Rhizopus oryzae)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)、土曲霉(Aspergillus terreus)、东北毛霉(Mucor mandshuricus)，更优选米根霉(Rhizopusoryzae)。
本发明中，可以将丝状菌以丝状菌球或固定化丝状菌的形态单独使用，也可以作为丝状菌球和固定化丝状菌的混合物加以使用。此处，本说明书中“球”是指，通过液体培养菌丝自发地形成的数百μm～数mm大小的菌丝块。另外，“固定化丝状菌”是指，被载体保持或包埋的丝状菌。
丝状菌球和固定化丝状菌可以使用商业上购得的物质，也可以使用通过以下工序制备的物质。
(丝状菌球的制备工序)
丝状菌球可以通过培养进行制备。
作为培养基，若为可以生长丝状菌的液体培养基，则可以是合成培养基、天然培养基和添加了天然成分的半合成培养基中的任一种。培养基中通常含有碳源、氮源、无机盐等，但可以适当选择各成分组成。另外，培养基中的磷酸根离子浓度可以适当采用通常用于培养丝状菌的培养基的磷酸根离子浓度，并不要求低于0.007质量％。
作为培养条件，培养温度优选为20～40℃，更优选为25～30℃。另外，培养基的初始pH(25℃)优选为3～7，更优选为4～6。
培养方法可以采用公知的方法。例如，将丝状菌的孢子植菌到液体培养基后，使孢子发芽而成为菌丝，由该菌丝形成菌体而使其菌球化。该培养通常在需氧条件下进行。通气条件优选为0.25～4vvm，更优选为0.5～2vvm。将丝状菌的孢子植菌到液体培养基后，培养期限优选30分钟～7天，更优选0.5～6天，进一步优选1～5天。另外，用于培养的培养槽可以适当采用以往公知的培养槽。具体来说，可以举出通气搅拌型培养槽、气泡塔型培养槽、流动床培养槽等。
培养后，丝状菌球可以与培养液一起从培养槽中抽出，通过过滤、离心分离等简便的操作来分离回收并用于下一工序，也可以在培养槽中留下丝状菌球，在同一培养槽中进行下一工序。
另外，本工序也可以进一步分成2个以上的工序进行。
(固定化丝状菌的制备工序)
固定化丝状菌可以通过培养来制备。
培养方法可以采用公知的方法。例如，将丝状菌的孢子植菌到存在丝状菌固定化用载体的液体培养基后，使孢子发芽而成为菌丝，由向载体内捕捉到的菌丝来制备固定化丝状菌。作为丝状菌固定化用载体的材质，可以举出氨基甲酸酯系聚合物、烯烃系聚合物、二烯系聚合物、缩合系聚合物、硅酮系聚合物、氟系聚合物等。作为丝状菌固定化用载体的形状，可以是平板状、多层板状、波形板状、四面体状、球状、绳状、网状、圆柱状、方格状、圆筒状等中的任一种。作为丝状菌固定化载体的形态，优选发泡体、薄片体、片体、中空体、树脂成型体等，更优选发泡体。另外，作为丝状菌固定化用载体的尺寸，优选为0.1mm～10mm，更优选为0.5～5mm，进一步优选为0.7～2mm。
需要说明的是，作为用于丝状菌的固定化的培养基和培养槽，可以使用与上述丝状菌球同样的培养基和培养槽，另外，对于培养条件，也可以采用与上述丝状菌球同样的条件。进而，在培养后，固定化丝状菌可以通过与丝状菌球同样的操作来分离回收并用于下一工序，但也可以在培养槽中留下固定化丝状菌，在同一培养槽中进行下一工序。
另外，本工序也可以进一步分成2个以上的工序进行。
<第一发酵工序>
本工序是使用菌体使碳源发酵来生产乳酸的工序。乳酸可以是L体、R体和外消旋体中的任一种。
本工序中使用的培养基若为包含碳源、且磷酸根离子浓度被控制在低于规定值的液体培养基，则没有特别限定，可以包含氮源、磷酸盐以外的无机盐、维生素等。另外，在所使用的碳源中包含适合培养的浓度的上述营养源的情况下，也可以仅使用碳源。
本工序中使用的培养基中的磷酸根离子浓度低于0.007质量％，但从维持丝状菌球的菌丝形态、并维持乳酸的高生产率的观点出发，优选为0.006质量％以下，更优选为0.005质量％以下，进一步优选为0.004质量％以下，更进一步优选为0.003质量％以下。另一方面，培养基中的磷酸根离子浓度的下限值没有特别限定，可以为0质量％，即，可以不含有磷酸根离子。需要说明的是，“磷酸根离子浓度为0质量％”是还包括利用酶比色法测定培养基中的磷酸根离子浓度时为检测限度以下的情况的概念。另外，作为磷酸根离子浓度的范围，为0～低于0.007质量％，优选为0～0.006质量％，更优选为0～0.005质量％，进一步优选为0～0.004质量％，更进一步优选为0～0.003质量％。优选这样的范围的理由未必明确，但本发明人等推测原因在于丝状菌的过剩增殖被抑制而使菌丝形态得到维持。需要说明的是，在本工序中使用的培养基中含有磷酸根离子的情况下，可以以磷酸盐的形态含有磷酸根离子。作为磷酸盐的具体例，可以举出与后述第二发酵工序中例示出的磷酸盐同样的物质。
另外，在本工序中使用的培养基中包含碳源，作为碳源，可以举出糖类。具体来说，可以举出葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖等。这些可以使用1种或组合使用2种以上。其中，从维持乳酸的高生产率的观点出发，优选葡萄糖、果糖。
在本工序中，作为碳源，还可以使用含有这样的糖类的糖液。具体来说，可以举出由淀粉得到的糖液、糖蜜(废糖蜜)、由木质纤维素系生物物质得到的糖液。它们可以使用1种或组合使用2种以上。此处，本说明书中“木质纤维素系生物物质”是指以纤维素、半纤维素和木质素为主要成分的生物物质。作为木质纤维素系生物物质，具体例中，可以举出稻秸、谷壳、麦秸、蔗渣、椰子壳、玉米穗轴、杂草、木材以及由它们制造的纸浆和纸等。另外，作为淀粉，可以举出例如玉米等谷类、大豆等豆类的提取物，作为糖蜜，可以举出例如源自于甘蔗、甜菜等的糖蜜。
从维持乳酸的高生产率的观点出发，培养基中的初始碳浓度优选为1质量％以上，更优选为3质量％以上，进一步优选为5质量％以上，并且优选为40质量％以下，更优选为30质量％以下，进一步优选为20质量％以下。另外，作为培养基中的初始碳浓度的范围，优选为1～40质量％，更优选为3～30质量％，进一步优选为5～20质量％。
本工序中使用的培养基中可以含有氮源。作为氮源，具体来说，可以举出尿素、硝酸铵、硝酸钾、硝酸钠等含氮化合物。从维持乳酸的高生产率的观点出发，培养基中的初始氮浓度优选为0.01～1质量％，更优选为0.02～0.8质量％，进一步优选为0.04～0.6质量％。
本工序中使用的培养基中可以含有硫酸盐。作为硫酸盐，具体来说可以举出硫酸镁、硫酸锌、硫酸钾、硫酸钠等。从维持乳酸的高生产率的观点出发，培养基中的初始硫酸离子浓度优选为0.001～0.1质量％，更优选为0.005～0.08质量％，进一步优选为0.01～0.04质量％。
本工序中使用的培养基中可以含有镁盐。作为镁盐，具体来说可以举出硫酸镁、硝酸镁、氯化镁等。从维持乳酸的高生产率的观点出发，培养基中的初始镁离子浓度优选为0～0.5质量％，更优选为0.001～0.2质量％，进一步优选为0.002～0.1质量％。
本工序中使用的培养基中可以含有锌盐。作为锌盐，具体来说可以举出硫酸锌、硝酸锌、氯化锌等。从维持乳酸的高生产率的观点出发，培养基中的初始锌离子浓度优选为0～0.1质量％，更优选为0.00001～0.01质量％，进一步优选为0.00005～0.005质量％。
作为培养条件，培养温度优选为20～40℃，更优选为30～37℃。另外，从菌体的生长、乳酸的生产率的观点出发，培养基的pH(25℃)优选为2～7，更优选为4～6。pH控制可以使用氢氧化钙、氢氧化钠、碳酸钙、氨等碱，硫酸、盐酸等酸来进行。
培养方法可以适当选择厌氧条件和需氧条件中的任一种。需氧条件下的通气条件优选为0.25～4vvm，更优选为0.5～2vvm。另外，用于培养的培养槽可以适当采用以往公知的培养槽，但从乳酸的生产速度的提高的观点出发，可以优选使用通气搅拌型培养槽、气泡塔型培养槽和流动床培养槽。
本工序可以例如将菌体播种于上述条件的培养基来进行。另外，还可以将制备工序后的菌体留在培养槽，向其中加入上述条件的培养基来进行。
本工序可以采用间歇式、半间歇式和连续式中的任一种进行，但从生产率提高的观点出发，优选连续式。
例如，采用半间歇式进行时，可以将菌体与发酵液分离，向分离回收的菌体中加入培养基来进一步进行发酵。另外，采用连续式进行时，可以采用将一定量的培养基以一定速度向发酵槽内供给，同时抽出等量的发酵液的方法。这种情况下，为了使发酵槽内的液面高度保持恒定，可以通过液面传感器等来控制液面高度。另外，也可以在发酵时仅供给碳源，碳源的供给可以利用流速控制，也可以利用葡萄糖浓度控制。
<第二发酵工序>
在本发明中，从菌丝的活性化、维持乳酸的高生产率的观点出发，可以在第一发酵工序后，进行第二发酵工序。即，第二发酵工序是：当第一发酵工序中的乳酸的生产速度维持率成为50～95％时，结束第一发酵工序，使用第一发酵工序中使用的菌体，在磷酸根离子浓度为0.007质量％以上且1质量％以下、且包含碳源的液体培养基中进行发酵的工序。
通过进行本工序，能够恢复由于长期发酵生产而降低的乳酸的生产率。基于本工序的乳酸生产率恢复的机制未必明确，但可认为其原因在于通过适度的磷酸供给使由于磷的缺乏而活性降低的菌丝发生了再活化。
从菌丝的活化、维持乳酸的高生产率的观点出发，优选在第一发酵工序中的乳酸的生产速度维持率优选为50％以上、更优选为60％以上、进一步优选为70％以上、且优选为95％以下、更优选为90％以下、进一步优选为85％以下时进行本工序。作为乳酸的生产速度维持率的范围，通常为50～95％，但优选为50～90％，进一步优选为60～90％，更进一步优选为70～90％，再进一步优选为70～85％。
此处，“乳酸的生产速度维持率”是指通过下述式(i)求得的值。
T[％]＝Vt[g/L/h]/Vi[g/L/h]×100 (i)
〔式(i)中，T表示乳酸的生产速度维持率[％]，Vt表示试样的乳酸生产速度[g/L/h]，Vi表示乳酸生产速度的管理值[g/L/h]。〕
需要说明的是，在式(i)中，乳酸生产速度[g/L/h]是指试样中的乳酸浓度(g/L)除以发酵时间(h)而得的值。另外，乳酸生产速度的管理值(Vi)是指根据第一发酵工序的发酵液中的乳酸浓度与发酵时间的关系而规定的值。乳酸生产速度的管理值可以根据在实际操作之前预先求出的发酵液中的乳酸浓度与发酵时间的关系决定，也可以根据实际操作中取得的发酵液中的乳酸浓度与发酵时间的关系决定。这种情况下，可以参考由液体培养基中的碳源所产生的乳酸浓度的理论值(g/L)。
乳酸生产速度的管理值(Vi)根据制造规模等而不同，但例如优选为0.1g/L/h以上，更优选为0.3g/L/h以上，进一步优选为0.5g/L/h以上，而且优选为40g/L/h以下，更优选为30g/L/h以下，进一步优选为20g/L/h以下。作为乳酸生产速度的管理值(Vi)的范围，优选为0.1～40g/L/h，更优选为0.3～30g/L/h，进一步优选为0.5～20g/L/h。
本工序可以在第一发酵工序结束后，将菌体与发酵液分离，将回收的菌体播种于新制备的本工序的液体培养基来进行，也可以在第一发酵工序结束后，向第一工序中使用的液体培养基中添加磷酸根离子并调整到规定的磷酸根离子浓度来进行。
本工序中使用的培养基除了磷酸根离子浓度为0.007质量％以上且0.1质量％以下这点，与第一发酵工序中使用的液体培养基相同，若包含碳源，则可以包含氮源、磷酸盐以外的无机盐、维生素等。另外，所使用的碳源中含有适合培养的浓度的上述营养源时，也可以仅使用碳源。
从菌丝的活性化、维持乳酸的高生产率的观点出发，本工序中使用的培养基中的磷酸根离子浓度优选为0.007质量％以上，更优选为0.01质量％以上，进一步优选为0.03质量％以上。另外，从维持菌体的形态的观点出发，本工序中使用的培养基中的磷酸根离子浓度优选为0.1质量％以下，更优选为0.09质量％以下，进一步优选为0.08质量％以下。作为培养基中的磷酸根离子浓度的范围，优选为0.007～0.1质量％，更优选为0.01～0.09质量％，进一步优选为0.03～0.08质量％。
本工序中使用的培养基中包含的磷酸根离子可以在培养基中以磷酸盐的形态含有。作为磷酸盐，具体来说可以举出磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等。
作为本工序的培养条件，培养温度优选为20～40℃，更优选为30～37℃。另外，从菌体的生长、乳酸的生产率的观点出发，培养基的pH(25℃)优选为2～7，更优选为4～6。pH控制可以使用氢氧化钙、氢氧化钠、碳酸钙、氨等碱，硫酸、盐酸等酸来进行。
培养方法可以适当选择厌氧条件和需氧条件中的任一种培养方法。需氧条件下的通气条件优选为0.25～4vvm，更优选为0.5～2vvm。
在本工序中，将满足培养基的温度为20℃以上且40℃以下、并且pH(25℃)为2以上且7以下的条件的时刻作为本工序的开始时间。需要说明的是，在需氧条件下进行时，将在满足上述条件的基础上进一步满足通气条件为0.25vvm以上且4vvm以下的条件的时刻作为本工序的开始时间。
本工序从菌丝的活性化、维持乳酸的高生产率的观点出发，在本工序开始后，优选继续1小时以上，更优选继续12小时以上，进一步优选继续24小时以上。另外，本工序从固定化丝状菌的形态维持的观点出发，在本工序开始后，优选在240小时以内、更优选在120小时以内、进一步优选在60小时以内、更进一步优选在48小时以内结束。作为本工序的发酵时间，优选为1～240小时，更优选为12～120小时，进一步优选为24～60小时，更进一步优选为24～48小时。
<第三发酵工序>
本发明中，在进行第二发酵工序的情况下，从维持乳酸的更高生产率的观点出发，优选在第二发酵工序后进行第三发酵工序。即，第三发酵工序是使用第二发酵工序中使用的菌体，在磷酸根离子浓度被控制在低于0.007质量％、且包含碳源的液体培养基中进行发酵的工序。
第二发酵工序中使用的菌体可以在第二发酵工序结束后，将菌体与发酵液分离并回收，另外，回收的菌体播种于新制备的本工序的液体培养基中即可。
本工序中使用的液体培养基与第一发酵工序中使用的液体培养基相同，具体构成如上述第一发酵工序中的说明所述。
第三发酵工序中，在乳酸的生产率降低的情况下，可以通过再次实施第二发酵工序，使乳酸的生产率再活化。
<菌体和发酵液的分离工序>
发酵工序后的菌体与发酵液的分离可以在发酵槽内利用过滤器进行固液分离，也可以一次抽出到槽外，并供于液体旋流分离、过滤等固液分离，然后仅将菌体返回发酵槽内。
<从分离工序后的发酵液中回收乳酸的工序>
可以在将通过分离工序得到的发酵液浓缩后，利用晶析法、离子交换法、溶剂提取法、使乳酸以碱土金属盐的形式析出后使析出物发生酸分解的方法、或者以乳酸酯的形式蒸馏精制后进行水解的方法等，从发酵液中分离并回收乳酸。
关于上述的实施方式，本发明进一步公开以下的乳酸的制造方法。
<1>
一种乳酸的制造方法，其包括：在磷酸根离子浓度被控制在低于0.007质量％、且包含碳源的液体培养基中，使用选自丝状菌球和固定化丝状菌中的1种以上的菌体，通过发酵而得到乳酸的第一发酵工序。
<2>
上述<1>所述的乳酸的制造方法，其具有：在上述第一发酵工序中，当乳酸的生产速度维持率优选成为50～95％时，使用第一发酵工序中使用的上述菌体，在磷酸根离子浓度为0.007质量％以上且1质量％以下、且包含碳源的液体培养基中进行发酵的第二发酵工序。
<3>
上述<2>所述的乳酸的制造方法，其中，上述乳酸的生产速度维持率优选为50％以上，更优选为60％以上，进一步优选为70％以上，且优选为90％以下，进一步优选为85％以下。
<4>
上述<2>或<3>所述的乳酸的制造方法，其中，上述乳酸的生产速度维持率优选为50～90％，更优选为60～90％，进一步优选为70～90％，更进一步优选为70～85％。
<5>
上述<2>～<4>中任一项所述的乳酸的制造方法，其中，上述乳酸的生产速度维持率优选为通过下述式(i)求得的值。
T[％]＝Vt[g/L/h]/Vi[g/L/h]×100 (i)
〔式(i)中，T表示乳酸的生产速度维持率[％]，Vt表示试样的乳酸生产速度[g/L/h]，Vi表示乳酸生产速度的管理值[g/L/h]。〕
<6>
上述<5>所述的乳酸的制造方法，其中，上述乳酸生产速度的管理值优选为0.1g/L/h以上，更优选为0.3g/L/h以上，进一步优选为0.5g/L/h以上，且优选为40g/L/h以下，更优选为30g/L/h以下，进一步优选为20g/L/h以下。
<7>
上述<5>或<6>所述的乳酸的制造方法，其中，上述乳酸生产速度的管理值优选为0.1～40g/L/h，更优选为0.3～30g/L/h，进一步优选为0.5～20g/L/h。
<8>
上述<2>～<7>中任一项所述的乳酸的制造方法，其中，上述第二发酵工序优选继续1小时以上，更优选继续12小时以上，进一步优选继续24小时以上，优选在240小时以内结束，更优选在120小时以内结束，进一步优选在60小时以内结束，更进一步优选在48小时以内结束。
<9>
上述<2>～<8>中任一项所述的乳酸的制造方法，其中，将上述第二发酵工序进行优选1～240小时，更优选12～120小时，进一步优选24～60小时，更进一步优选24～48小时。
<10>
上述<2>～<9>中任一项所述的乳酸的制造方法，其在上述第二发酵工序后具有：使用优选第二发酵工序中使用的上述菌体，在磷酸根离子浓度被控制在低于0.007质量％、且包含碳源的液体培养基中进行发酵的第三发酵工序。
<11>
上述<1>～<10>中任一项所述的乳酸的制造方法，其在上述第一发酵工序前优选具有：制备选自丝状菌的菌球和固定化丝状菌中的1种以上的菌体的制备工序。
<12>
上述<1>～<11>中任一项所述的乳酸的制造方法，其中，上述丝状菌优选为根霉(Rhizopus)属。
<13>
上述<1>～<12>中任一项所述的乳酸的制造方法，其中，上述丝状菌优选为米根霉(Rhizopus·oryzae)。
<14>
上述<1>～<13>中任一项所述的乳酸的制造方法，其中，上述碳源优选为糖类。
<15>
上述<14>所述的乳酸的制造方法，其中，上述糖类优选为选自由淀粉得到的糖液、糖蜜、以及由木质纤维素系生物物质得到的糖液中的1种以上。
<16>
上述<1>～<15>中任一项所述的乳酸的制造方法，其中，上述第一发酵工序中使用的液体培养基中的磷酸根离子浓度优选为0.006质量％以下，更优选为0.005质量％以下，进一步优选为0.004质量％以下，更进一步优选为0.003质量％以下，再进一步优选为0质量％。
<17>
上述<1>～<15>中任一项所述的乳酸的制造方法，其中，上述第一发酵工序中使用的液体培养基中的磷酸根离子浓度优选为0～低于0.007质量％，更优选为0～0.006质量％，进一步优选为0～0.005质量％，更进一步优选为0～0.004质量％，再进一步优选为0～0.003质量％。
<18>
上述<1>～<15>中任一项所述的乳酸的制造方法，其中，上述第一发酵工序中使用的液体培养基中不包含磷酸根离子(磷酸根离子浓度为0质量％)，或者在液体培养基中包含磷酸根离子的情况下，优选为0.006质量％以下，更优选为0.005质量％以下，进一步优选为0.004质量％以下，更进一步优选为0.003质量％以下。
<19>
上述<2>～<18>中任一项所述的乳酸的制造方法，其中，上述第二发酵工序中使用的液体培养基中的磷酸根离子浓度优选为0.1质量％以下，更优选为0.09质量％以下，进一步优选为0.08质量％以下，且优选为0.007质量％以上，更优选为0.01质量％以上，进一步优选为0.03质量％以上。
<20>
上述<2>～<19>中任一项所述的乳酸的制造方法，其中，上述第二发酵工序中使用的液体培养基中的磷酸根离子浓度优选为0.007～0.1质量％，更优选为0.01～0.09质量％，进一步优选为0.03～0.08质量％。
<21>
上述<10>～<20>中任一项所述的乳酸的制造方法，其中，上述第三发酵工序中使用的液体培养基中的磷酸根离子浓度优选为0.006质量％以下，更优选为0.005质量％以下，进一步优选为0.004质量％以下，更进一步优选为0.003质量％以下，再进一步优选为0质量％。
<22>
上述<10>～<20>中任一项所述的乳酸的制造方法，其中，上述第三发酵工序中使用的液体培养基中的磷酸根离子浓度优选为0～低于0.007质量％，更优选为0～0.006质量％，进一步优选为0～0.005质量％，更进一步优选为0～0.004质量％，再进一步优选为0～0.003质量％。
<23>
上述<10>～<20>中任一项所述的乳酸的制造方法，其中，上述第三发酵工序中使用的液体培养基中不包含磷酸根离子(磷酸根离子浓度为0质量％)，或者在液体培养基中包含磷酸根离子的情况下，优选为0.006质量％以下，更优选为0.005质量％以下，进一步优选为0.004质量％以下，更进一步优选为0.003质量％以下。
<24>
上述<1>～<23>中任一项所述的乳酸的制造方法，其中，以液体培养基中的初始碳浓度优选为1质量％以上、更优选为3质量％以上、进一步优选为5质量％以上、且优选为40质量％以下、更优选为30质量％以下、进一步优选为20质量％以下，进行上述第一发酵工序、第二发酵工序和第三发酵工序中的1个以上的工序。
<25>
上述<1>～<24>中任一项所述的乳酸的制造方法，其中，以液体培养基中的初始碳浓度优选为1～40质量％、更优选为3～30质量％、进一步优选为5～20质量％，进行上述第一发酵工序、第二发酵工序和第三发酵工序中的1个以上的工序。
<26>
上述<1>～<25>中任一项所述的乳酸的制造方法，其中，以液体培养基中的初始氮浓度优选为0.01～1质量％、更优选为0.02～0.8质量％、进一步优选为0.04～0.6质量％，进行上述第一发酵工序、第二发酵工序和第三发酵工序中的1个以上的工序。
<27>
上述<1>～<26>中任一项所述的乳酸的制造方法，其中，以液体培养基中的初始硫酸离子浓度优选为0.001～0.1质量％、更优选为0.005～0.08质量％、进一步优选为0.01～0.04质量％，进行上述第一发酵工序、第二发酵工序和第三发酵工序中的1个以上的工序。
<28>
上述<1>～<27>中任一项所述的乳酸的制造方法，其中，以液体培养基中的初始镁离子浓度优选为0～0.5质量％、更优选为0.001～0.2质量％、进一步优选为0.002～0.1质量％，进行上述第一发酵工序、第二发酵工序和第三发酵工序中的1个以上的工序。
<29>
上述<1>～<28>中任一项所述的乳酸的制造方法，其中，以液体培养基中的初始锌离子浓度优选为0～0.1质量％、更优选为0.00001～0.01质量％、进一步优选为0.00005～0.005质量％，进行上述第一发酵工序、第二发酵工序和第三发酵工序中的1个以上的工序。
<30>
上述<1>～<29>中任一项所述的乳酸的制造方法，其中，优选采用向发酵槽内以一定速度供给一定量的液体培养基，同时将等量的发酵液抽出到发酵槽外的连续式，进行上述第一发酵工序、第二发酵工序和第三发酵工序中的1个以上的工序。
<31>
用于乳酸产生的菌体的再活化方法，其包括：在磷酸根离子浓度被控制在低于0.007质量％、且包含碳源的液体培养基中，使用选自丝状菌球和固定化丝状菌中的1种以上的菌体，通过发酵而得到乳酸的第一发酵工序中，当乳酸的生产速度维持率优选成为50～95％时，使用上述第一发酵工序中使用的上述菌体，在磷酸根离子浓度为0.007质量％以上且1质量％以下、且包含碳源的液体培养基中进行发酵的第二发酵工序。
实施例
<分析方法>
[利用高效液相色谱法(HPLC)的各种成分的测定]
用0.0085当量浓度的硫酸水溶液适当稀释发酵液，使用孔径为0.22μm的纤维素乙酸酯制膜滤器(ADVANTEC公司制)进行过滤，作为HPLC分析用样品。HPLC的分析条件如下。
·色谱柱：ICSep ICE-ION-300
·洗脱液：0.0085当量浓度硫酸、0.4mL/min
·检测法：RI(HITACHI、L-2490)
·柱温度：40℃
·注入液量：20μL
·保持时间：40min
该分析系统中的各成分的保持时间如下。
·葡萄糖：16min
·乳酸：23min
·乙醇：34min
〔培养例1〕
<丝状菌球的制备>
〔孢子悬浊液的制备〕
菌株使用由独立行政法人制品评价技术基础机构(National Institute ofTechnology and Evaluation(NITE))得到的丝状菌R.oryzae NBRC5384。对于丝状菌，在试管内形成的斜面状琼脂培养基(Difco Potato Dextrose Agar、Becton，Dickinson andCompany)上划线/涂布菌体，在25℃下静置培养，定期进行继代培养。在使用菌体时向菌体增殖后的试管添加10mL的灭菌蒸馏水，然后用触摸式搅拌机(touch mixer)搅拌4分钟，从而回收孢子，进一步添加无菌的蒸馏水进行稀释，从而将调整到1×106spores/mL的液体作为孢子悬浊液。
〔丝状菌的菌球化〕
丝状菌球的制备通过以下2个阶段的培养进行。
第一阶段的培养，对投入有60mL的PDB培养基(Difco Potato Dextrose Broth、Becton，Dickinson and Company)的容积200mL的带折流板锥形瓶(baffled Erlermeyerflask)进行灭菌，进行植菌以使得利用上述方法所制备的孢子悬浊液成为1×104个孢子/mL，在27℃、100r/m(PRECI公司、PRXYg-98R)的培养条件下进行3天。
第二阶段的培养，对投入有形成菌球的培养基(葡萄糖(和光纯药工业公司制)10质量％、硫酸镁七水合物0.025质量％、硫酸锌七水合物0.009质量％、硫酸铵0.1质量％、磷酸二氢钾0.06质量％)2L的容积2L的气升型发酵槽进行灭菌，将第一阶段的培养液120mL植菌，并在27℃、以通气速度1vvm供给空气的条件下进行1.5天。pH通过适当添加3N氢氧化钠溶液来维持在pH(25℃)6.0。
〔菌球的回收〕
利用纱布过滤上述各阶段中得到的丝状菌球培养液1分钟直至滤液的滴下停止为止，得到湿润状态的丝状菌球。第二阶段中得到的菌球立即供于发酵性的评价。
〔培养例2〕
〔丝状菌的载体固定化〕
固定化丝状菌的制备通过以下2个阶段的培养进行。
第一阶段的培养，对投入有30mL的固定化培养基(葡萄糖(和光纯药工业公司制)5质量％、硫酸镁七水合物0.025质量％、硫酸锌七水合物0.009质量％、尿素0.2质量％、磷酸二氢钾0.06质量％)、以及5个0.8mm见方聚氨酯发泡体(日清纺公司制、APG)的100mL锥形瓶进行灭菌，进行植菌以使得利用与上述丝状菌球同样的方法所制备的孢子悬浊液成为2×104个孢子/mL，在35℃、200r/m(PRECI公司、PRXYg-98R)的培养条件下进行1天。
第二阶段的培养，对投入有菌体增殖培养基(葡萄糖(和光纯药工业公司制)10质量％、硫酸镁七水合物0.025质量％、硫酸锌七水合物0.009质量％、尿素0.1质量％、磷酸二氢钾0.06质量％、碳酸钙5质量％)100mL的容积500mL的锥形瓶进行灭菌，将第一阶段中固定于载体的丝状菌进行植菌，在35℃、200r/m(PRECI公司、PRXYg-98R)的培养条件下进行2天。
〔固定化丝状菌的回收〕
通过纱布过滤上述各阶段中得到的固定化丝状菌培养液1分钟直至滤液的滴下停止为止，得到湿润状态的固定化丝状菌。第二阶段中得到的固定化丝状菌立即供于发酵性的评价。
〔发酵例1〕
<发酵性的评价>
〔培养方法1〕
向灭菌过的容积2L的气升型发酵槽中添加乳酸发酵培养液2L，接着添加培养例1中制备的丝状菌球总量(湿润状态)。随后立即进行培养第0小时的取样，然后在35℃、以通气速度1vvm供给空气的条件下进行培养。然后边经时进行取样，边进行14天培养。pH通过适当添加3N氢氧化钠溶液而维持在pH(25℃)6.0。发酵时在发酵槽内以2L/天的速度连续地供给乳酸发酵培养液，同时将等量的发酵液抽出到发酵槽外。需要说明的是，边通过利用液面传感器来控制回收液用的泵而使发酵液面保持恒定，边进行培养液的供给。培养后，在利用设置于发酵液内的烧结过滤器使丝状菌球留在槽内的状态下，仅回收了发酵液。
〔发酵例2〕
<发酵性的评价>
〔培养方法2〕
向灭菌过的容积500mL的锥形瓶中添加乳酸发酵培养液100mL，接着添加培养例2中制备的固定化丝状菌总量(湿润状态)。随后立即进行培养第0小时的取样，然后在35℃、200r/m(PRECI公司、PRXYg-98R)的培养条件下进行2天。发酵结束时进行了取样。然后，进行固定化丝状菌的回收，向添加了再次灭菌后的乳酸发酵培养液100mL的容积500mL的锥形瓶中，添加回收的固定化丝状菌，在35℃、200r/m(PRECI公司、PRXYg-98R)的培养条件下进行2天，回收了固定化丝状菌。然后，重复进行使用回收的固定化丝状菌且基于同样操作的分批培养。
〔评价方法〕
利用发酵液的分析值，将(1)由糖向乳酸的转化率(P[％])、(2)由糖向乙醇的转化率(Q[％])、(3)向在上述乙醇转化中产生的二氧化碳的转化率(R[％])这3项作为评价轴。各项的计算式示于表1和式(1)～(3)。需要说明的是，式中，将供给糖液的葡萄糖浓度定义为G0。另外，如式(4)所示，将利用中和剂的发酵液的稀释率定义为S[-]。在使用烧瓶的发酵中，利用在培养基中预先添加的碳酸钙进行中和，因此将稀释率S设为1。
[表1]
由糖向乳酸的转化率
P[％]＝L/(G0×S-G)×100 (1)
由糖向乙醇的转化率
Q[％]＝E/(G0×S-G)×100 (2)
向在上述乙醇转化中产生的二氧化碳的转化率
R[％]＝Q×(CO2分子量/EtOH分子量)×100 (3)
利用中和剂的发酵液的稀释率
S[-]＝1/(1+(L/90/3)) (4)
乳酸的生产速度维持率
T[％]＝试样的乳酸生产速度[g/L/h]/乳酸生产速度的管理值Lg/L/h]×100
乳酸制造时的磷酸浓度降低的效果
〔实施例1〕
<丝状菌球的制备>
通过上述培养例1，使用丝状菌R.oryzae NBRC5384制备了丝状菌球。
<发酵性的评价>
使用以表2所示浓度溶解了葡萄糖、尿素、硫酸镁七水合物和硫酸锌七水合物的乳酸发酵培养液，进行发酵例1所述的发酵性的评价。需要说明的是，作为葡萄糖源，使用了葡萄糖(和光纯药工业公司制)。评价结果示于表4。
〔实施例2〕
除了在第一阶段的培养中向PDB培养基中添加0.5质量％的山梨糖醇酐单月桂酸酯(商品名Rheodol SP-L10、花王制)以外，在与实施例1同样的条件下进行丝状菌球的制备。使用表2所示乳酸发酵培养液，除此之外，在与实施例1同样的条件下进行发酵性的评价，其中，所述乳酸发酵培养液是添加磷酸二氢钾而使乳酸发酵培养液的磷酸根离子浓度为0.0014质量％(0.15mM)的乳酸发酵培养液。评价结果示于表4。
〔实施例3〕
使用表2所示乳酸发酵培养液，除此之外，在与实施例2同样的条件下进行丝状菌球的制备和发酵性的评价，其中，所述乳酸发酵培养液是添加磷酸二氢钾而使乳酸发酵培养液的磷酸根离子浓度为0.0035质量％(0.37mM)的乳酸发酵培养液。评价结果示于表4。
〔比较例1〕
使用表3所示乳酸发酵培养液，除此之外，在与实施例1同样的条件下进行丝状菌球的制备和发酵性的评价，其中，所述乳酸发酵培养液是添加磷酸二氢钾而使乳酸发酵培养液的磷酸根离子浓度为0.0070质量％(0.73mM)的乳酸发酵培养液。评价结果示于表5。
〔比较例2〕
使用表3所示乳酸发酵培养液，除此之外，在与实施例1同样的条件下进行丝状菌球的制备和发酵性的评价，其中，所述乳酸发酵培养液是添加磷酸二氢钾而使乳酸发酵培养液的磷酸根离子浓度为0.0042质量％(4.4mM)的乳酸发酵培养液。评价结果示于表5。
[表2]
[表3]
[表4]
[表5]
由表4和5可知，若培养基的磷酸根离子浓度在本发明的范围内，则未确认到乙醇的生成，与此相对，若磷酸根离子浓度在本发明的范围外，则生成乙醇，相对于所消耗的葡萄糖的乳酸转化率大幅降低。
〔实施例4〕
<固定化丝状菌的制备>
通过上述培养例2，使用丝状菌R.oryzae NBRC5384制备了固定化丝状菌。
<发酵性的评价>
使用以实施例1(表2)所示浓度溶解了葡萄糖、尿素、硫酸镁七水合物和硫酸锌七水合物的乳酸发酵培养液，进行50天(25个周期)的发酵例2所述的发酵性的评价。需要说明的是，作为葡萄糖源，使用了葡萄糖(和光纯药工业公司制)。评价结果示于表6。
〔实施例5〕
<固定化丝状菌的制备>
通过上述培养例2，使用丝状菌R.oryzae NBRC5384制备了固定化丝状菌。
<发酵性的评价>
使用以实施例1(表2)所示浓度溶解了葡萄糖、尿素、硫酸镁七水合物和硫酸锌七水合物的乳酸发酵培养液，进行36天(18个周期)的发酵例2所述的发酵性的评价，回收固定化丝状菌。需要说明的是，乳酸生产速度的管理值设定为1.6〔g/L/h〕，36天后的乳酸生产速度为1.3〔g/L/h〕。然后，使用回收的固定化丝状菌，将培养液替换成比较例2(表3)所示乳酸发酵培养液而培养2天，回收固定化丝状菌。接着，使用回收的固定化丝状菌，再次将培养液替换成实施例1(表2)所示乳酸发酵培养液进行12天(6个周期)的发酵性的评价。需要说明的是，作为葡萄糖源，使用了葡萄糖(和光纯药工业公司制)。评价结果示于表6。
[表6]
由表6确认出，即使在使用固定化丝状菌的情况下，也能在与丝状菌球同样地以高水平维持乳酸转化率的状态下生产乳酸。另外，可知若在第一发酵工序的乳酸生产速度降低到50～95％时，用磷酸根离子浓度高的培养基暂时进行发酵，则菌体被活化，使用该活化的菌体供给至与第一发酵工序同样的第三发酵工序，由此，可以在更进一步的长期中持续以高水平维持乳酸转化率和乳酸生产速度的状态下生产乳酸。
Claims (36)
1.一种乳酸的制造方法，其包括：在磷酸根离子浓度被控制在低于0.007质量％、初始氮浓度被控制在0.01～1质量％、且包含碳源的液体培养基中，使用选自丝状菌球和固定化丝状菌中的1种以上的菌体，通过半间歇式或连续式发酵而得到乳酸的第一发酵工序。
2.如权利要求1所述的乳酸的制造方法，其中，所述第一发酵工序中使用的液体培养基中的磷酸根离子浓度为0～0.006质量％。
3.如权利要求1或2所述的乳酸的制造方法，其中，所述第一发酵工序中使用的液体培养基中的磷酸根离子浓度为0～0.005质量％。
4.如权利要求1或2所述的乳酸的制造方法，其中，所述第一发酵工序中使用的液体培养基中的磷酸根离子浓度为0～0.003质量％。
5.如权利要求1或2所述的乳酸的制造方法，其具有：当第一发酵工序中的乳酸的生产速度维持率成为50～95％时，使用第一发酵工序中使用的所述菌体，在磷酸根离子浓度为0.007质量％以上且1质量％以下、且包含碳源的液体培养基中进行发酵的第二发酵工序。
6.如权利要求5所述的乳酸的制造方法，其中，所述乳酸的生产速度维持率为60～90％。
7.如权利要求5所述的乳酸的制造方法，其中，所述乳酸的生产速度维持率为70～85％。
8.如权利要求5所述的乳酸的制造方法，其中，所述乳酸的生产速度维持率为通过下述式(i)求得的值，
T[％]＝Vt[g/L/h]/Vi[g/L/h]×100 (i)
式(i)中，T表示乳酸的生产速度维持率[％]，Vt表示试样的乳酸生产速度[g/L/h]，Vi表示乳酸生产速度的管理值[g/L/h]。
9.如权利要求8所述的乳酸的制造方法，其中，所述乳酸的生产速度的管理值为0.3～30g/L/h。
10.如权利要求8或9所述的乳酸的制造方法，其中，所述乳酸的生产速度的管理值为0.5～20g/L/h。
11.如权利要求5所述的乳酸的制造方法，其中，所述第二发酵工序中使用的液体培养基中的磷酸根离子浓度为0.01～0.09质量％。
12.如权利要求5所述的乳酸的制造方法，其中，所述第二发酵工序中使用的液体培养基中的磷酸根离子浓度为0.03～0.08质量％。
13.如权利要求5所述的乳酸的制造方法，其中，将第二发酵工序进行12～120小时。
14.如权利要求5所述的乳酸的制造方法，其中，将第二发酵工序进行24～60小时。
15.如权利要求5所述的乳酸的制造方法，其在第二发酵工序后具有：使用第二发酵工序中使用的所述菌体，在磷酸根离子浓度被控制在低于0.007质量％、且包含碳源的液体培养基中进行发酵的第三发酵工序。
16.如权利要求15所述的乳酸的制造方法，其中，所述第三发酵工序中使用的液体培养基中的磷酸根离子浓度为0～0.005质量％。
17.如权利要求15或16所述的乳酸的制造方法，其中，所述第三发酵工序中使用的液体培养基中的磷酸根离子浓度为0～0.003质量％。
18.如权利要求1或2所述的乳酸的制造方法，其在第一发酵工序前具有：制备选自丝状菌球和固定化丝状菌中的1种以上的菌体的制备工序。
19.如权利要求1或2所述的乳酸的制造方法，其中，丝状菌为根霉属(Rhizopus)。
20.如权利要求1或2所述的乳酸的制造方法，其中，丝状菌为选自由米根霉(Rhizopusoryzae)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)、土曲霉(Aspergillus terreus)、东北毛霉(Mucor mandshuricus)构成的组中的1种以上。
21.如权利要求1或2所述的乳酸的制造方法，其中，丝状菌为米根霉(Rhizopusoryzae)。
22.如权利要求1或2所述的乳酸的制造方法，其中，碳源为糖类。
23.如权利要求22所述的乳酸的制造方法，其中，糖类是选自由葡萄糖、果糖、木糖和蔗糖构成的组中的1种以上。
24.如权利要求22所述的乳酸的制造方法，其中，糖类是选自由葡萄糖和果糖构成的组中的1种以上。
25.如权利要求22所述的乳酸的制造方法，其中，糖类为从由淀粉得到的糖液、糖蜜、以及由木质纤维素系生物物质得到的糖液中选择的1种以上。
26.如权利要求15或16所述的乳酸的制造方法，其中，在所述第一发酵工序、第二发酵工序和第三发酵工序中的1个以上的工序中使用的液体培养基中的初始碳浓度为1～40质量％。
27.如权利要求15或16所述的乳酸的制造方法，其中，在所述第一发酵工序、第二发酵工序和第三发酵工序中的1个以上的工序中使用的液体培养基中的初始碳浓度为5～20质量％。
28.如权利要求15或16所述的乳酸的制造方法，其中，在所述第一发酵工序、第二发酵工序和第三发酵工序中的1个以上的工序中使用的液体培养基中的初始氮浓度为0.01～1质量％。
29.如权利要求15或16所述的乳酸的制造方法，其中，在所述第一发酵工序、第二发酵工序和第三发酵工序中的1个以上的工序中使用的液体培养基中的初始氮浓度为0.04～0.6质量％。
30.如权利要求15或16所述的乳酸的制造方法，其中，在所述第一发酵工序、第二发酵工序和第三发酵工序中的1个以上的工序中使用的液体培养基中的初始硫酸根离子浓度为0.001～0.1质量％。
31.如权利要求15或16所述的乳酸的制造方法，其中，在所述第一发酵工序、第二发酵工序和第三发酵工序中的1个以上的工序中使用的液体培养基中的初始硫酸根离子浓度为0.01～0.04质量％。
32.如权利要求15或16所述的乳酸的制造方法，其中，在所述第一发酵工序、第二发酵工序和第三发酵工序中的1个以上的工序中使用的液体培养基中的初始镁离子浓度为0～0.5质量％。
33.如权利要求15或16所述的乳酸的制造方法，其中，在所述第一发酵工序、第二发酵工序和第三发酵工序中的1个以上的工序中使用的液体培养基中的初始镁离子浓度为0.002～0.1质量％。
34.如权利要求15或16所述的乳酸的制造方法，其中，在所述第一发酵工序、第二发酵工序和第三发酵工序中的1个以上的工序中使用的液体培养基中的初始锌离子浓度为0～0.1质量％。
35.如权利要求15或16所述的乳酸的制造方法，其中，在所述第一发酵工序、第二发酵工序和第三发酵工序中的1个以上的工序中使用的液体培养基中的初始锌离子浓度为0.00005～0.005质量％。
36.如权利要求15或16所述的乳酸的制造方法，其中，采用向发酵槽内以一定速度供给一定量的液体培养基，同时将等量的发酵液抽出到发酵槽外的连续方式，进行上述第一发酵工序、第二发酵工序和第三发酵工序中的1个以上的工序。
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