WO2013161674A1 - 乳酸の製造方法 - Google Patents

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WO2013161674A1
WO2013161674A1 PCT/JP2013/061519 JP2013061519W WO2013161674A1 WO 2013161674 A1 WO2013161674 A1 WO 2013161674A1 JP 2013061519 W JP2013061519 W JP 2013061519W WO 2013161674 A1 WO2013161674 A1 WO 2013161674A1
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lactic acid
mass
fermentation
filamentous fungus
culture
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PCT/JP2013/061519
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French (fr)
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裕 入江
伸吾 小山
将宏 野場
大樹 浦川
聡志 中原
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花王株式会社
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/56—Lactic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P2203/00—Fermentation products obtained from optionally pretreated or hydrolyzed cellulosic or lignocellulosic material as the carbon source

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing lactic acid.
  • Filamentous fungi such as Rhizopus oryzae contained in fungi tend to become mycelium (pellets).
  • pellet-like filamentous fungus When such a pellet-like filamentous fungus is used for the production of lactic acid, it is known that the product can be easily separated from the medium after fermentation and continuous production is possible (Patent Document 1). .
  • Patent Document 1 there is a report that lactic acid was continuously produced for 25 days (25 cycles) by a semi-batch reaction method using pellets of Rhizopus oryzae.
  • the filamentous fungus is adjusted to a phosphate ion, potassium ion, sodium ion, magnesium ion and calcium ion concentration of 5 to 60 mM, 5 to 60 mM, 2 to 50 mM, 0.5 to 9 mM and 0.5 to 12 mM, respectively.
  • a phosphate ion, potassium ion, sodium ion, magnesium ion and calcium ion concentration of 5 to 60 mM, 5 to 60 mM, 2 to 50 mM, 0.5 to 9 mM and 0.5 to 12 mM, respectively.
  • fermentation is performed using one or more bacterial cells selected from filamentous fungal pellets and immobilized filamentous fungi in a liquid medium containing a carbon source and having a phosphate ion concentration controlled to less than 0.007% by mass.
  • the present invention provides a method for producing lactic acid, which includes a first fermentation step for obtaining lactic acid by the above method.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing lactic acid by filamentous fungi, which can maintain high productivity of lactic acid even when continuously produced.
  • the present inventors have controlled the concentration of a specific component in a liquid medium containing a carbon source to be less than a predetermined value, thereby causing filamentous fungus pellets or It has been found that the mycelium form of the immobilized filamentous fungus is maintained and that high productivity of lactic acid can be maintained even when continuously produced.
  • a method for producing lactic acid by filamentous fungi which can maintain high productivity even if lactic acid is continuously produced while maintaining the mycelial morphology of filamentous fungal pellets or immobilized filamentous fungi.
  • the phosphate ion concentration is controlled to be less than 0.007% by mass, and one or more bacteria selected from filamentous fungus pellets and immobilized filamentous fungi in a liquid medium containing a carbon source.
  • filamentous fungus used in the present invention examples include microorganisms belonging to the genus Rhizopus, the genus Aspergillus and the genus Mucor, and among them, the genus Rhizopus is preferable. Specifically, Rhizopus oryzae, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus termulus, and Aspergillus terum -Orizae (Rhizopus oryzae) is more preferable.
  • the filamentous fungus may be used alone in the form of a filamentous fungus pellet or an immobilized filamentous fungus, or may be used as a mixture of the filamentous fungus pellet and the immobilized filamentous fungus.
  • pellet refers to a mycelial mass having a size of several hundred ⁇ m to several mm formed spontaneously by liquid culture.
  • immobilized filamentous fungus refers to a filamentous fungus that is held or embedded in a carrier.
  • the filamentous fungus pellet and the immobilized filamentous fungus those obtained commercially may be used, or those prepared by the following steps may be used.
  • Filamentous fungal pellets can be prepared by culture.
  • the medium may be any of a synthetic medium, a natural medium, and a semi-synthetic medium to which natural components are added as long as it is a liquid medium capable of growing filamentous fungi.
  • the medium generally contains a carbon source, a nitrogen source, an inorganic salt, and the like, but the composition of each component can be selected as appropriate.
  • the phosphate ion concentration in the medium can be appropriately selected from the phosphate ion concentration of the medium usually used for culturing filamentous fungi, and does not need to be less than 0.007% by mass.
  • the culture temperature is preferably 20 to 40 ° C., more preferably 25 to 30 ° C.
  • the initial pH (25 ° C.) of the medium is preferably 3 to 7, more preferably 4 to 6.
  • a well-known method can be employ
  • the aeration condition is preferably 0.25 to 4 vvm, more preferably 0.5 to 2 vvm.
  • the culture period is preferably 30 minutes to 7 days, more preferably 0.5 to 6 days, and further preferably 1 to 5 days after inoculating filamentous fungal spores in a liquid medium.
  • a conventionally well-known thing can be employ
  • Specific examples include an aeration and stirring type culture tank, a bubble column type culture tank, and a fluidized bed culture tank.
  • the filamentous fungal pellet is extracted from the culture tank together with the culture solution, and can be separated and recovered by simple operations such as filtration and centrifugation, and used in the next step, but the filamentous fungal pellet remains in the culture tank, It is also possible to perform the next step in the same culture tank. In addition, this step can be further divided into two or more steps.
  • Immobilized filamentous fungi can be prepared by culture.
  • a well-known method can be employ
  • the material for the filamentous fungus immobilization carrier include urethane polymers, olefin polymers, diene polymers, condensation polymers, silicone polymers, and fluorine polymers.
  • the shape of the carrier for immobilizing filamentous fungi may be any of a flat plate shape, a multilayer plate shape, a corrugated plate shape, a tetrahedron shape, a spherical shape, a string shape, a net shape, a columnar shape, a lattice shape, a cylindrical shape, and the like.
  • the form of the filamentous fungus-immobilized carrier is preferably a foam, a thin piece, a sheet, a hollow body, a resin molded body or the like, and more preferably a foam.
  • the size of the filamentous fungus immobilization carrier is preferably 0.1 mm to 10 mm, more preferably 0.5 to 5 mm, and still more preferably 0.7 to 2 mm.
  • the medium and culture tank used for immobilization of filamentous fungi can be the same as the filamentous fungus pellet described above, and the same culture conditions as those of the filamentous fungus pellet described above are adopted. can do. Furthermore, after culturing, the immobilized filamentous fungus can be separated and recovered by the same operation as the filamentous fungus pellet and used in the next step, but the immobilized filamentous fungus is left in the culture tank and the next process is performed in the same culture tank. It is also possible. In addition, this step can be further divided into two or more steps.
  • This step is a step of producing lactic acid by fermenting a carbon source using bacterial cells.
  • Lactic acid may be any of L-form, R-form and racemate.
  • the medium used in this step is not particularly limited as long as it is a liquid medium that contains a carbon source and the phosphate ion concentration is controlled below a predetermined value, such as a nitrogen source, inorganic salts other than phosphate, vitamins, and the like. It may be included.
  • a predetermined value such as a nitrogen source, inorganic salts other than phosphate, vitamins, and the like. It may be included.
  • the carbon source to be used contains the above nutrient source at a concentration suitable for culture, it is possible to use only the carbon source.
  • the phosphate ion concentration in the medium used in this step is less than 0.007% by mass, but preferably 0.006 from the viewpoint of maintaining high productivity of lactic acid while maintaining the mycelial morphology of the filamentous fungal pellet. It is at most mass%, more preferably at most 0.005 mass%, further preferably at most 0.004 mass%, further preferably at most 0.003% by mass.
  • the lower limit of the phosphate ion concentration in the medium is not particularly limited, and may be 0% by mass, that is, phosphate ions may not be included.
  • the phosphate ion concentration is 0% by mass is a concept including a case where the phosphate ion concentration in the medium is measured by the enzyme colorimetric method and is below the detection limit.
  • the range of the phosphate ion concentration is 0 to less than 0.007% by mass, preferably 0 to 0.006% by mass, more preferably 0 to 0.005% by mass, and still more preferably 0 to 0.004% by mass. %, More preferably 0 to 0.003 mass%. The reason why such a range is preferable is not necessarily clear, but the present inventors speculate that excessive growth of filamentous fungi is suppressed and the mycelial morphology is maintained.
  • a phosphate ion when the phosphate ion is contained in the culture medium used at this process, a phosphate ion can be contained with the form of a phosphate.
  • Specific examples of the phosphate include the same as those exemplified in the second fermentation step described later.
  • the carbon source is contained in the culture medium used at this process
  • saccharides are mentioned as a carbon source.
  • Specific examples include glucose, fructose, xylose, sucrose, and the like. These can be used alone or in combination of two or more. Among these, glucose and fructose are preferable from the viewpoint of maintaining high productivity of lactic acid.
  • a sugar solution containing such a saccharide can also be used as a carbon source.
  • sugar liquid obtained from starch, molasses (waste molasses), sugar liquid obtained from lignocellulosic biomass can be mentioned. These can be used alone or in combination of two or more.
  • lignocellulose-based biomass in the present specification means biomass mainly composed of cellulose, hemicellulose, and lignin.
  • lignocellulosic biomass include inawara, rice husk, straw, bagasse, coconut shell, corn cob, weed, wood, and pulp and paper produced therefrom.
  • starch examples include extracts of millet such as corn and beans such as soybean, and examples of molasses include those derived from sugar cane and sugar beet.
  • the initial carbon concentration in the medium is preferably 1% by mass or more, more preferably 3% by mass or more, still more preferably 5% by mass or more, and preferably 40% from the viewpoint of maintaining high productivity of lactic acid. It is not more than mass%, more preferably not more than 30 mass%, still more preferably not more than 20 mass%.
  • the range of the initial carbon concentration in the medium is preferably 1 to 40% by mass, more preferably 3 to 30% by mass, and still more preferably 5 to 20% by mass.
  • the medium used in this step can contain a nitrogen source.
  • the nitrogen source include nitrogen-containing compounds such as urea, ammonium nitrate, potassium nitrate, and sodium nitrate.
  • the initial nitrogen concentration in the medium is preferably 0.01 to 1% by mass, more preferably 0.02 to 0.8% by mass, and still more preferably 0.04 to 0% from the viewpoint of maintaining high productivity of lactic acid. .6% by mass.
  • the medium used in this step can contain sulfate.
  • Specific examples of the sulfate include magnesium sulfate, zinc sulfate, potassium sulfate, and sodium sulfate.
  • the initial sulfate ion concentration in the medium is preferably 0.001 to 0.1% by mass, more preferably 0.005 to 0.08% by mass, and still more preferably 0.001% from the viewpoint of maintaining high productivity of lactic acid. 01 to 0.04% by mass.
  • the medium used in this step can contain a magnesium salt. Specific examples of the magnesium salt include magnesium sulfate, magnesium nitrate, and magnesium chloride.
  • the initial magnesium ion concentration in the medium is preferably 0 to 0.5% by mass, more preferably 0.001 to 0.2% by mass, and still more preferably 0.002 to 0.5% from the viewpoint of maintaining high productivity of lactic acid. 0.1% by mass.
  • the medium used in this step can contain a zinc salt.
  • the zinc salt include zinc sulfate, zinc nitrate, and zinc chloride.
  • the initial zinc ion concentration in the medium is preferably 0 to 0.1% by mass, more preferably 0.00001 to 0.01% by mass, and still more preferably 0.00005 to 0.01% by mass from the viewpoint of maintaining high productivity of lactic acid. 0.005% by mass.
  • the culture temperature is preferably 20 to 40 ° C, more preferably 30 to 37 ° C.
  • the pH of the medium (25 ° C.) is preferably 2 to 7, more preferably 4 to 6, from the viewpoint of bacterial cell growth and lactic acid productivity.
  • the pH can be controlled using a base such as calcium hydroxide, sodium hydroxide, calcium carbonate or ammonia, or an acid such as sulfuric acid or hydrochloric acid.
  • anaerobic conditions or aerobic conditions can be selected as appropriate.
  • the aeration condition in the aerobic condition is preferably 0.25 to 4 vvm, more preferably 0.5 to 2 vvm.
  • the culture tank used for the culture conventionally known ones can be appropriately employed. From the viewpoint of improving the production rate of lactic acid, an aeration and stirring type culture tank, a bubble column type culture tank, and a fluidized bed culture tank are used. Preferably used.
  • This step can be performed, for example, by seeding the cells in a medium having the above conditions. Moreover, it can also carry out by leaving the microbial cell after a preparation process in a culture tank, and adding the culture medium of said conditions to this.
  • This step may be carried out by any of batch, semi-batch and continuous methods, but a continuous method is preferred from the viewpoint of improving productivity. For example, when it is carried out in a semi-batch manner, the microbial cells and the fermentation broth can be separated, and a medium can be added to the separated and recovered microbial cells for further fermentation.
  • the method of extracting the same quantity of fermented liquor can be employ
  • the liquid level may be controlled by a liquid level sensor or the like so that the liquid level in the fermenter is kept constant.
  • the second fermentation step can be performed after the first fermentation step from the viewpoint of activation of mycelia and maintenance of high productivity of lactic acid. That is, the second fermentation process ends the first fermentation process when the production rate maintenance rate of lactic acid in the first fermentation process reaches 50 to 95%, and the cells used in the first fermentation process. Is a step of performing fermentation in a liquid medium having a phosphate ion concentration of 0.007% by mass to 1% by mass and containing a carbon source.
  • the production rate maintenance rate of lactic acid in the first fermentation step is preferably 50% or more, more preferably 60% or more, still more preferably 70% or more, preferably 95% or less, more preferably It is preferable to carry out when it becomes 90% or less, more preferably 85% or less, from the viewpoint of activation of hyphae and maintenance of high productivity of lactic acid.
  • the range of the production rate maintenance rate of lactic acid is usually 50 to 95%, preferably 50 to 90%, more preferably 60 to 90%, further preferably 70 to 90%, more preferably 70 to 85%. It is.
  • production rate maintenance rate of lactic acid refers to a value obtained by the following formula (i).
  • T [%] Vt [g / L / h] / Vi [g / L / h] ⁇ 100 (i)
  • T represents the production rate maintenance rate [%] of lactic acid
  • Vt represents the lactic acid production rate [g / L / h] of the sample
  • Vi represents the control value [g / L of lactic acid production rate] / H].
  • the lactic acid production rate [g / L / h] is a value obtained by dividing the lactic acid concentration (g / L) in the sample by the fermentation time (h).
  • the control value (Vi) of the lactic acid production rate is a value determined based on the relationship between the lactic acid concentration in the fermentation liquid and the fermentation time according to the first fermentation step.
  • the control value of the lactic acid production rate may be determined based on the relationship between the lactic acid concentration in the fermentation broth previously determined prior to actual operation and the fermentation time, or in the fermented liquor obtained during actual operation. You may determine based on the relationship between lactic acid concentration and fermentation time. In this case, the theoretical value (g / L) of the lactic acid concentration produced from the carbon source in the liquid medium can be taken into consideration.
  • the control value (Vi) of the lactic acid production rate is not uniform depending on the production scale and the like, but is preferably 0.1 g / L / h or more, more preferably 0.3 g / L / h or more, and 0.5 g / L / h or more is more preferable, and 40 g / L / h or less is preferable, 30 g / L / h or less is more preferable, and 20 g / L / h or less is more preferable.
  • the range of the lactic acid production rate control value (Vi) is preferably 0.1 to 40 g / L / h, more preferably 0.3 to 30 g / L / h, still more preferably 0.5 to 20 g / L / h. h.
  • the bacterial cells and the fermentation broth may be separated, and the recovered bacterial cells may be seeded in a newly prepared liquid medium according to the present step.
  • phosphate ions may be added to the liquid medium used in the first step to adjust to a predetermined phosphate ion concentration.
  • the medium used in this step is the same as the liquid medium used in the first fermentation step except that the phosphate ion concentration is 0.007% by mass or more and 0.1% by mass or less.
  • a nitrogen source, inorganic salts other than phosphate, vitamins and the like may be included.
  • the carbon source to be used contains the above nutrient source at a concentration suitable for culture, it is possible to use only the carbon source.
  • the phosphate ion concentration in the medium used in this step is preferably 0.007% by mass or more, more preferably 0.01% by mass or more, and still more preferably, from the viewpoint of activation of hyphae and maintaining high productivity of lactic acid. Is 0.03% by mass or more.
  • the phosphate ion concentration in the medium used in this step is preferably 0.1% by mass or less, more preferably 0.09% by mass or less, and still more preferably 0.0% by mass, from the viewpoint of maintaining the cell morphology. It is 08 mass% or less.
  • the range of the phosphate ion concentration in the medium is preferably 0.007 to 0.1% by mass, more preferably 0.01 to 0.09% by mass, and still more preferably 0.03 to 0.08% by mass. is there.
  • Phosphate ions contained in the medium used in this step can be contained in the form of phosphate in the medium. Specific examples of the phosphate include dipotassium monohydrogen phosphate, monopotassium dihydrogen phosphate, disodium monohydrogen phosphate, monosodium dihydrogen phosphate, and the like.
  • the culture temperature is preferably 20 to 40 ° C., more preferably 30 to 37 ° C.
  • the pH of the medium (25 ° C.) is preferably 2 to 7, more preferably 4 to 6, from the viewpoint of bacterial cell growth and lactic acid productivity.
  • the pH can be controlled using a base such as calcium hydroxide, sodium hydroxide, calcium carbonate or ammonia, or an acid such as sulfuric acid or hydrochloric acid.
  • any one of anaerobic conditions and aerobic conditions can be appropriately selected.
  • the aeration condition in the aerobic condition is preferably 0.25 to 4 vvm, more preferably 0.5 to 2 vvm.
  • the time when the temperature of the medium satisfies the conditions of 20 ° C. or more and 40 ° C. or less and the pH (25 ° C.) of 2 or more and 7 or less is set as the start time of this step.
  • the aeration conditions satisfy the conditions of 0.25 vvm or more and 4 vvm or less, it is set as the start time of this process.
  • This step is preferably continued for 1 hour or longer, more preferably 12 hours or longer, and even more preferably 24 hours or longer after the start of this step, from the viewpoint of activating hyphae and maintaining high productivity of lactic acid.
  • this step is preferably completed within 240 hours, more preferably within 120 hours, still more preferably within 60 hours, and even more preferably within 48 hours after the start of this step.
  • the fermentation time in this step is preferably 1 to 240 hours, more preferably 12 to 120 hours, still more preferably 24 to 60 hours, still more preferably 24 to 48 hours.
  • ⁇ Third fermentation process> when a 2nd fermentation process is performed, it is preferable to perform a 3rd fermentation process after a 2nd fermentation process from a viewpoint of higher productivity maintenance of lactic acid. That is, in the third fermentation step, fermentation is performed in a liquid medium containing a carbon source with the phosphate ion concentration controlled to less than 0.007% by mass using the cells used in the second fermentation step. It is a process.
  • the cells used in the second fermentation step can be separated and recovered after the completion of the second fermentation step, and the collected cells are newly prepared books. What is necessary is just to seed
  • the liquid medium used in this step is the same as the liquid medium used in the first fermentation step, and the specific configuration is as described in the first fermentation step.
  • the productivity of lactic acid when the productivity of lactic acid has decreased, the productivity of lactic acid can be reactivated by performing the second fermentation step again.
  • Separation of the bacterial cells and fermentation broth after the fermentation process may be performed by solid-liquid separation with a filter in the fermenter, or only after the cells are taken out of the tank and subjected to solid-liquid separation such as liquid cyclone or filtration. May be returned to the fermenter.
  • Step of recovering lactic acid from the fermentation broth after the separation step After concentrating the fermentation broth obtained in the separation step, crystallization method, ion exchange method, solvent extraction method, method of depositing lactic acid as alkaline earth metal salt and then acid-decomposing the precipitate, or distillation as lactic acid ester Lactic acid can be separated and recovered from the fermentation broth by a method such as hydrolysis after purification.
  • the present invention further discloses the following method for producing lactic acid.
  • Lactic acid is obtained by fermentation using one or more bacterial cells selected from filamentous fungus pellets and immobilized filamentous fungi in a liquid medium containing a carbon source with a phosphate ion concentration controlled to less than 0.007% by mass.
  • the production rate maintenance rate of lactic acid is preferably 50 to 95%
  • the phosphate ion concentration is 0.007 using the cells used in the first fermentation step.
  • the production rate maintenance rate of the lactic acid is preferably 50% or more, more preferably 60% or more, further preferably 70% or more, preferably 90% or less, more preferably 85% or less, ⁇ 2 > Method for producing lactic acid as described above.
  • lactic acid production rate maintenance rate is preferably 50 to 90%, more preferably 60 to 90%, still more preferably 70 to 90%, and still more preferably 70 to 85%.
  • ⁇ 5> The method for producing lactic acid according to any one of ⁇ 2> to ⁇ 4>, wherein the production rate maintenance rate of the lactic acid is preferably a value obtained by the following formula (i).
  • T [%] Vt [g / L / h] / Vi [g / L / h] ⁇ 100 (i)
  • T represents the production rate maintenance rate [%] of lactic acid
  • Vt represents the lactic acid production rate [g / L / h] of the sample
  • Vi represents the control value [g / L of lactic acid production rate] / H].
  • the control value of the lactic acid production rate is preferably 0.1 g / L / h or more, more preferably 0.3 g / L / h or more, still more preferably 0.5 g / L / h or more, preferably 40 g. / L / h or less, More preferably, it is 30 g / L / h or less, More preferably, it is 20 g / L / h or less, The manufacturing method of the lactic acid of said ⁇ 5> description.
  • the control value of the lactic acid production rate is preferably 0.1 to 40 g / L / h, more preferably 0.3 to 30 g / L / h, still more preferably 0.5 to 20 g / L / h,
  • the second fermentation step is preferably continued for 1 hour or longer, more preferably 12 hours or longer, more preferably 24 hours or longer, preferably within 240 hours, more preferably within 120 hours, still more preferably within 60 hours, More preferably, the method for producing lactic acid according to any one of ⁇ 2> to ⁇ 7>, which is completed within 48 hours.
  • ⁇ 12> The method for producing lactic acid according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 11>, wherein the filamentous fungus is preferably genus Rhizopus.
  • ⁇ 14> The method for producing lactic acid according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 13>, wherein the carbon source is preferably a saccharide.
  • the saccharide is preferably one or more selected from the group consisting of a sugar solution obtained from starch, molasses, and a sugar solution obtained from lignocellulosic biomass.
  • the phosphate ion concentration in the liquid medium used in the first fermentation step is preferably 0.006% by mass or less, more preferably 0.005% by mass or less, still more preferably 0.004% by mass or less, and still more preferably.
  • the phosphate ion concentration in the liquid medium used in the first fermentation step is preferably 0 to less than 0.007% by mass, more preferably 0 to 0.006% by mass, and still more preferably 0 to 0.005% by mass.
  • the process for producing lactic acid according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 15> above.
  • the phosphate medium is not contained in the liquid medium used in the first fermentation step (phosphate ion concentration is 0% by mass) or the phosphate medium is contained in the liquid medium, it is preferably 0.006.
  • ⁇ 1> to ⁇ 15> wherein the content is not more than mass%, more preferably not more than 0.005 mass%, still more preferably not more than 0.004 mass%, still more preferably not more than 0.003 mass%.
  • the content is not more than mass%, more preferably not more than 0.005 mass%, still more preferably not more than 0.004 mass%, still more preferably not more than 0.003 mass%.
  • the phosphate ion concentration in the liquid medium used in the second fermentation step is preferably 0.1% by mass or less, more preferably 0.09% by mass or less, and further preferably 0.08% by mass or less.
  • the phosphate ion concentration in the liquid medium used in the second fermentation step is preferably 0.007 to 0.1% by mass, more preferably 0.01 to 0.09% by mass, and still more preferably 0.03.
  • the phosphate ion concentration in the liquid medium used in the third fermentation step is preferably 0.006% by mass or less, more preferably 0.005% by mass or less, still more preferably 0.004% by mass or less, still more preferably.
  • the phosphate ion concentration in the liquid medium used in the third fermentation step is preferably 0 to less than 0.007% by mass, more preferably 0 to 0.006% by mass, and still more preferably 0 to 0.005% by mass.
  • the liquid medium used in the third fermentation step does not contain phosphate ions (phosphate ion concentration is 0% by mass), or contains phosphate ions in the liquid medium, it is preferably 0.006.
  • phosphate ion concentration is 0% by mass
  • the content is not more than mass%, more preferably not more than 0.005 mass%, still more preferably not more than 0.004 mass%, still more preferably not more than 0.003 mass%.
  • the initial carbon concentration in the liquid medium is preferably 1% by mass or more, more preferably 3% by mass or more, and further preferably 5%.
  • the initial carbon concentration in the liquid medium is preferably 1 to 40% by mass, more preferably 3 to 30% by mass, and still more preferably The method for producing lactic acid according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 24>, wherein the step is carried out at 5 to 20% by mass.
  • the initial nitrogen concentration in the liquid medium is preferably 0.01 to 1% by mass, more preferably 0.02 to 0. 0%. The method for producing lactic acid according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 25>, which is performed at 8% by mass, more preferably 0.04 to 0.6% by mass.
  • the initial sulfate ion concentration in the liquid medium is preferably 0.001 to 0.1% by mass, more preferably 0.005.
  • the initial magnesium ion concentration in the liquid medium is preferably 0 to 0.5% by mass, more preferably 0.001 to 0.
  • the initial zinc ion concentration in the liquid medium is preferably 0 to 0.1% by mass, more preferably 0.00001 to 0.
  • At least one of the first, second, and third fermentation steps is preferably performed, and a fixed amount of liquid medium is supplied into the fermentor at a constant rate, and the same amount of fermentation broth is removed from the fermenter.
  • the method for producing lactic acid according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 29> which is performed in a continuous manner.
  • Lactic acid is obtained by fermentation using one or more bacterial cells selected from filamentous fungus pellets and immobilized filamentous fungi in a liquid medium containing a carbon source with a phosphate ion concentration controlled to less than 0.007% by mass.
  • the phosphate cell concentration is 0.007 using the cells used in the first fermentation step.
  • a method for reactivating cells used for lactic acid production comprising a second fermentation step in which fermentation is performed in a liquid medium containing at least 1% by mass and not more than 1% by mass.
  • filamentous fungus pellet> Preparation of spore suspension
  • filamentous fungus R. oryzae NBRC5384 obtained from National Institute of Technology and Evaluation (NITE) was used.
  • Filamentous fungi are streaked / coated on slanted agar medium (Difco Potato Dextrose Agar, Becton, Dickinson and Company) formed in a test tube, statically cultured at 25 ° C, and periodically passaged. Teenager.
  • the filamentous fungus pellet was prepared by the following two-stage culture.
  • a 200 mL baffled Erlenmeyer flask charged with 60 mL of PDB medium (Difco Potato Dextrose Broth, Becton, Dickinson and Company) was sterilized, and the spore suspension prepared by the above-mentioned method was sterilized at 1 ⁇ 10 4.
  • the cells were inoculated so that the number of cells was 1 spore / mL, and cultured for 3 days under a culture condition of 27 ° C. and 100 r / m (PRECI, PRXYg-98R).
  • pellet formation medium glucose (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 10% by mass, magnesium sulfate heptahydrate 0.025% by mass, zinc sulfate heptahydrate 0.009% by mass, ammonium sulfate 0 Sterilize 2L airlift fermenter charged with 2L, inoculate 120mL of the first stage culture solution at 27 ° C, aeration rate 1vvm
  • pH 3N sodium hydroxide solution was appropriately added to maintain pH (25 ° C.) of 6.0.
  • the filamentous fungus pellet culture obtained at each stage was filtered with gauze for 1 minute until the filtrate drip settled to obtain wet filamentous fungus pellets.
  • the pellets obtained in the second stage were immediately subjected to fermentability evaluation.
  • the immobilized filamentous fungus was prepared by the following two-stage culture.
  • the first stage culture is 30 mL immobilized medium (glucose (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 5% by mass, magnesium sulfate heptahydrate 0.025% by mass, zinc sulfate heptahydrate 0.009% by mass, Sterilize a 100 mL Erlenmeyer flask containing 5 masses of urea 0.2 mass%, monopotassium dihydrogen phosphate 0.06 mass%), and 0.8 mm square polyurethane foam (Nisshinbo Co., Ltd., APG).
  • a spore suspension prepared in the same manner as the fungal pellet was inoculated to 2 ⁇ 10 4 spore / mL and cultured at 35 ° C. and 200 r / m (PRECI, PRXYg-98R). I went for one day.
  • the culture in the second stage is a cell growth medium (glucose (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 10% by mass, magnesium sulfate heptahydrate 0.025% by mass, zinc sulfate heptahydrate 0.009% by mass, urea Sterilize a 500 mL Erlenmeyer flask containing 100 mL of 0.1 mass%, monopotassium dihydrogen phosphate 0.06 mass%, calcium carbonate 5 mass%) and inoculate the filamentous fungus immobilized on the carrier in the first stage Then, the cultivation was performed at 35 ° C. and 200 r / m (PRECI, PRXYg-98R) for 2 days.
  • a cell growth medium glucose (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 10% by mass, magnesium sulfate heptahydrate 0.025% by mass, zinc sulfate heptahydrate 0.009% by mass, urea Steril
  • the lactic acid fermentation broth was continuously supplied into the fermenter at a rate of 2 L / day, and the same amount of the fermented broth was extracted outside the fermenter.
  • the culture solution was supplied while keeping the fermentation solution level constant by controlling the pump for the collected solution with a solution level sensor. After the culture, only the fermentation broth was collected while the filamentous fungus pellets were left in the tank by a sintered filter installed in the fermentation broth.
  • the immobilized filamentous fungus was recovered, and the recovered immobilized filamentous fungus was added to a 500 mL Erlenmeyer flask to which 100 mL of sterilized lactic acid fermentation broth was added again, and 35 ° C., 200 r / m (PRECI, PRXYg-98R). ) For 2 days, and the immobilized filamentous fungi were recovered. Then, batch culture by the same operation was repeatedly performed using the recovered immobilized filamentous fungi.
  • Production rate maintenance rate of lactic acid T [%] Lactic acid production rate of sample [g / L / h] / Control value of lactic acid production rate [g / L / h] ⁇ 100
  • Example 1 Effect of reducing phosphoric acid concentration during lactic acid production
  • a filamentous fungus pellet was prepared using the filamentous fungus R. oryzae NBRC5384.
  • ⁇ Evaluation of fermentability> Using the lactic acid fermentation broth in which glucose, urea, magnesium sulfate heptahydrate and zinc sulfate heptahydrate were dissolved at the concentrations shown in Table 2, the fermentability described in Fermentation Example 1 was evaluated. In addition, glucose (made by Wako Pure Chemical Industries) was used as a glucose source. The evaluation results are shown in Table 4.
  • Example 2 A filamentous fungus pellet was prepared under the same conditions as in Example 1 except that 0.5% by mass of sorbitan monolaurate (trade name Leidol SP-L10, manufactured by Kao Corporation) was added to the PDB medium in the first stage culture. It was.
  • Example 1 with the exception of using the lactic acid fermentation broth shown in Table 2 in which monopotassium dihydrogen phosphate was added and the phosphate ion concentration of the lactic acid fermentation broth was 0.0014% by mass (0.15 mM). Fermentability was evaluated under the same conditions. The evaluation results are shown in Table 4.
  • Example 3 Example 2 with the exception of using the lactic acid fermentation broth shown in Table 2 in which monopotassium dihydrogen phosphate was added and the phosphate ion concentration of the lactic acid fermentation broth was 0.0035% by mass (0.37 mM). Preparation of filamentous fungal pellets and evaluation of fermentability were performed under the same conditions. The evaluation results are shown in Table 4.
  • Example 1 Example 1 except that the lactic acid fermentation broth shown in Table 3 was used except that monopotassium dihydrogen phosphate was added and the phosphate ion concentration of the lactic acid fermentation broth was 0.0070 mass% (0.73 mM). Preparation of filamentous fungal pellets and evaluation of fermentability were performed under the same conditions. The evaluation results are shown in Table 5.
  • Example 2 Example 1 except that the lactic acid fermentation broth shown in Table 3 was used except that monopotassium dihydrogen phosphate was added and the phosphate ion concentration of the lactic acid fermentation broth was 0.042% by mass (4.4 mM). Preparation of filamentous fungal pellets and evaluation of fermentability were performed under the same conditions. The evaluation results are shown in Table 5.
  • Example 4 Preparation of immobilized filamentous fungi>
  • an immobilized filamentous fungus was prepared using the filamentous fungus R. oryzae NBRC5384.
  • ⁇ Evaluation of fermentability> Using the lactic acid fermentation broth in which glucose, urea, magnesium sulfate heptahydrate and zinc sulfate heptahydrate were dissolved at the concentrations shown in Example 1 (Table 2), the fermentability evaluation described in Fermentation Example 2 was performed. 50 days (25 cycles) were performed. In addition, glucose (made by Wako Pure Chemical Industries) was used as a glucose source. The evaluation results are shown in Table 6.
  • Example 5 Preparation of immobilized filamentous fungi>
  • an immobilized filamentous fungus was prepared using the filamentous fungus R. oryzae NBRC5384.
  • ⁇ Evaluation of fermentability> Using the lactic acid fermentation broth in which glucose, urea, magnesium sulfate heptahydrate and zinc sulfate heptahydrate were dissolved at the concentrations shown in Example 1 (Table 2), the fermentability evaluation described in Fermentation Example 2 was performed. After 36 days (18 cycles), the immobilized filamentous fungi were collected.
  • the control value of the lactic acid production rate was set to 1.6 [g / L / h], and the lactic acid production rate after 36 days was 1.3 [g / L / h]. Then, using the recovered immobilized filamentous fungi, the culture solution was changed to the lactic acid fermentation broth shown in Comparative Example 2 (Table 3), and cultured for 2 days to recover the immobilized filamentous fungus. Subsequently, using the recovered immobilized filamentous fungi, the culture solution was changed to the lactic acid fermentation broth shown in Example 1 (Table 2) again, and the fermentability was evaluated for 12 days (6 cycles). In addition, glucose (made by Wako Pure Chemical Industries) was used as a glucose source. The evaluation results are shown in Table 6.

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Abstract

　連続的に生産しても乳酸の高い生産性を維持できる、糸状菌による乳酸の製造方法を提供する。　本発明の乳酸の製造方法は、リン酸イオン濃度が０．００７質量％未満に制御され、かつ炭素源を含む液体培地にて、糸状菌ペレット及び固定化糸状菌から選ばれる１種以上の菌体を用いて発酵により乳酸を得る第１の発酵工程を含むものである。

Description

乳酸の製造方法
　本発明は、乳酸の製造方法に関する。
　真菌類に含まれるリゾプス　オリザエ(Rhizopus oryzae)等の糸状菌は、菌糸塊（ペレット）となりやすい。このようなペレット状の糸状菌を乳酸の製造に用いると、発酵後の培地から生成物の分離が容易であり、かつ連続的な製造が可能となることが知られている（特許文献１）。例えば、リゾプス　オリザエ(Rhizopus oryzae)のペレットを用いて半回分式反応法により、乳酸を２５日間（２５サイクル）連続生産したとの報告がある（非特許文献１）。
　また、糸状菌を、リン酸イオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン、マグネシウムイオン及びカルシウムイオンの濃度を、それぞれ５～６０ｍＭ、５～６０ｍＭ、２～５０ｍＭ、０．５～９ｍＭ、０．５～１２ｍＭに制御した培地で培養することで、糸状菌の過度のパルプ化及び過度のペレット化が抑制され、パルプとペレットとの混合状態が維持され、その結果不飽和脂肪酸の収率が大幅に増大するとの報告もある（特許文献２）。
特開平６－２５３８７１号公報 国際公開第９８／２９５５８号
Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 38巻 (2011) 565-571
　本発明は、リン酸イオン濃度が０．００７質量％未満に制御され、かつ炭素源を含む液体培地にて、糸状菌ペレット及び固定化糸状菌から選ばれる１種以上の菌体を用いて発酵により乳酸を得る第１の発酵工程を含む、乳酸の製造方法を提供するものである。
発明の詳細な説明
　本発明者らは、炭素源を含む液体培地にて、糸状菌ペレット又は固定化糸状菌を用いて発酵により乳酸を連続的に製造したところ、経時的にアルコールの生成が増加し乳酸の生産性が低下することが判明した。
　本発明は、連続的に生産しても乳酸の高い生産性を維持できる、糸状菌による乳酸の製造方法を提供することにある。
　本発明者らは、前述の乳酸の生産性低下の要因を究明すべく種々検討した結果、炭素源を含む液体培地中の特定成分の濃度を所定値未満に制御することで、糸状菌ペレット又は固定化糸状菌の菌糸形態が維持され、連続的に生産しても乳酸の高い生産性を維持できることを見出した。
　本発明によれば、糸状菌ペレット又は固定化糸状菌の菌糸形態を維持しつつ、乳酸を連続的に生産しても高い生産性を維持できる、糸状菌による乳酸の製造方法が提供される。
　本発明の乳酸の製造方法は、リン酸イオン濃度が０．００７質量％未満に制御され、かつ炭素源を含む液体培地にて、糸状菌ペレット及び固定化糸状菌から選ばれる１種以上の菌体（以下、単に「菌体」とも称する）を用いて発酵により乳酸を得る第１の発酵工程を含むものである。
　本発明に用いられる糸状菌としては、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属に属する微生物が挙げられ、中でも、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属が好ましい。具体的には、リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）、ムコール・マンドシュリクス（Ｍｕｃｏｒ ｍａｎｄｓｈｕｒｉｃｕｓ）が好ましく、リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）がより好ましい。
　本発明においては、糸状菌を糸状菌ペレット又は固定化糸状菌の形態で単独で用いても、糸状菌ペレット及び固定化糸状菌の混合物として用いてもよい。ここで、本明細書において「ペレット」とは、液体培養により菌糸が自発的に形成した数百μｍ～数ｍｍの大きさの菌糸塊をいう。また、「固定化糸状菌」とは、担体に保持又は包埋された糸状菌をいう。
　糸状菌ペレット及び固定化糸状菌は、商業的に入手したものを使用しても、次の工程により調製したものを使用してもよい。
（糸状菌ペレットの調製工程）
　糸状菌ペレットは、培養により調製することができる。
　培地としては、糸状菌を生育可能な液体培地であれば、合成培地、天然培地及び天然成分を添加した半合成培地のいずれでもよい。培地には、炭素源、窒素源、無機塩等が含まれるのが一般的であるが、各成分組成は適宜選択可能である。また、培地中のリン酸イオン濃度は、糸状菌の培養に通常使用される培地のリン酸イオン濃度を適宜採用することが可能であり、０．００７質量％未満であることを要しない。
　培養条件としては、培養温度が、好ましくは２０～４０℃、より好ましくは２５～３０℃である。また、培地の初発ｐＨ（２５℃）は、好ましくは３～７、より好ましくは４～６である。
　培養方法は、公知の方法を採用することができる。例えば、糸状菌の胞子を液体培地に植菌後、胞子を発芽させて菌糸とし、その菌糸から菌体を形成させペレット化させる。この培養は、通常、好気的条件で行われる。通気条件は、好ましくは０．２５～４ｖｖｍ、より好ましくは０．５～２ｖｖｍである。培養期間は、糸状菌の胞子を液体培地に植菌後、好ましくは３０分～７日間、より好ましくは０．５～６日間、更に好ましくは１～５日間である。また、培養に用いる培養槽は、従来公知のものを適宜採用することができる。具体的には、通気撹拌型培養槽、気泡塔型培養槽、流動床培養槽等が挙げられる。
　培養後、糸状菌ペレットは、培養液と共に培養槽から抜き出して、ろ別、遠心分離等の簡便な操作により分離回収し次工程に使用することができるが、培養槽に糸状菌ペレットを残し、同一培養槽で次工程を行うことも可能である。
　また、本工程は２以上の工程に更に分けて行うこともできる。
（固定化糸状菌の調製工程）
　固定化糸状菌は、培養により調製することができる。
　培養方法は、公知の方法を採用することができる。例えば、糸状菌の胞子を糸状菌固定化用担体の存在する液体培地に植菌後、胞子を発芽させて菌糸とし、担体内へ捕捉された菌糸から固定化糸状菌を調製する。糸状菌固定化用担体の材質としては、ウレタン系重合体、オレフィン系重合体、ジエン系重合体、縮合系重合体、シリコーン系重合体、フッ素系重合体等が挙げられる。糸状菌固定化用担体の形状としては、平板状、多層板状、波板状、四面体状、球状、紐状、網状、円柱状、格子状、円筒状等のいずれでもよい。糸状菌固定化担体の形態としては、発泡体、薄片体、シート体、中空体、樹脂成型体等が好ましく、発泡体がより好ましい。また、糸状菌固定化用担体のサイズとしては、０．１ｍｍ～１０ｍｍが好ましく、０．５～５ｍｍがより好ましく、０．７～２ｍｍが更に好ましい。
　なお、糸状菌の固定化に使用する培地及び培養槽としては前述の糸状菌ペレットと同様のものを使用することが可能であり、また培養条件についても前述の糸状菌ペレットと同様の条件を採用することができる。更に、培養後、固定化糸状菌は、糸状菌ペレットと同様の操作により分離回収し次工程に使用することができるが、培養槽に固定化糸状菌を残し、同一培養槽で次工程を行うことも可能である。
　また、本工程は２以上の工程に更に分けて行うこともできる。
＜第１の発酵工程＞
　本工程は、菌体を用いて炭素源を発酵させて乳酸を生産する工程である。乳酸は、Ｌ体、Ｒ体及びラセミ体のいずれでもよい。
　本工程で使用する培地は、炭素源を含み、リン酸イオン濃度が所定値未満に制御されている液体培地であれば特に限定されず、窒素源、リン酸塩以外の無機塩、ビタミン等が含まれていてもよい。また、使用する炭素源に培養に適切な濃度の上記栄養源が含まれている場合には、炭素源のみを用いることも可能である。
　本工程で使用する培地中のリン酸イオン濃度は、０．００７質量％未満であるが、糸状菌ペレットの菌糸形態を維持しつつ、乳酸の高い生産性維持の観点から、好ましくは０．００６質量％以下、より好ましくは０．００５質量％以下、更に好ましくは０．００４質量％以下、更に好ましくは０．００３質量％以下である。他方、培地中のリン酸イオン濃度の下限値は特に限定されず、０質量％、すなわちリン酸イオンを含まなくてもよい。なお、「リン酸イオン濃度が０質量％」とは、酵素比色法により培地中のリン酸イオン濃度を測定したときに検出限界以下である場合も包含する概念である。また、リン酸イオン濃度の範囲としては、０～０．００７質量％未満、好ましくは０～０．００６質量％、より好ましくは０～０．００５質量％、更に好ましくは０～０．００４質量％、更に好ましくは０～０．００３質量％である。このような範囲が好ましい理由は必ずしも明らかではないが、本発明者らは、糸状菌の過剰な増殖が抑制されて菌糸形態が維持されるものと推測する。なお、本工程で使用する培地中にリン酸イオンが含まれる場合には、リン酸イオンをリン酸塩の形態で含有することができる。リン酸塩の具体例としては、後述の第２の発酵工程において例示したものと同様のものを挙げることができる。
　また、本工程で使用する培地には、炭素源が含まれるが、炭素源としては、糖類が挙げられる。具体的には、グルコース、フルクトース、キシロース、スクロース等を挙げることができる。これらは１種又は２種以上組み合わせて使用することができる。中でも、乳酸の高い生産性の維持の観点から、グルコース、フルクトースが好ましい。
　本工程においては、炭素源として、このような糖類を含有する糖液を使用することもできる。具体的には、でんぷんから得られる糖液、糖蜜（廃糖蜜）、リグノセルロース系バイオマスから得られる糖液が挙げられる。これらは１種又は２種以上組み合わせて使用することができる。ここで、本明細書において「リグノセルロース系バイオマス」とは、セルロース、ヘミセルロース、及びリグニンを主成分とするバイオマスを意味する。リグノセルロース系バイオマスとしては、具体例には、イナワラ、籾殻、麦わら、バガス、ヤシ殻、コーンコブ、雑草、木材、並びにそれらから製造されたパルプ及び紙等が挙げられる。また、でんぷんとしては、例えば、トウモロコシ等の雑穀類、大豆等の豆類の抽出物が挙げられ、糖蜜としては、例えば、サトウキビ、テンサイ等に由来するものが挙げられる。
　培地中の初発の炭素濃度は、乳酸の高い生産性維持の観点から、好ましくは１質量％以上、より好ましくは３質量％以上、更に好ましくは５質量％以上であって、そして、好ましくは４０質量％以下、より好ましくは３０質量％以下、更に好ましくは２０質量％以下である。また、培地中の初発の炭素濃度の範囲としては、好ましくは１～４０質量％、より好ましくは３～３０質量％、更に好ましくは５～２０質量％である。
　本工程で使用する培地には、窒素源を含有することができる。窒素源としては、具体的には、尿素、硝酸アンモニウム、硝酸カリウム、硝酸ナトリウム等の含窒素化合物が挙げられる。培地中の初発の窒素濃度は、乳酸の高い生産性維持の観点から、好ましくは０．０１～１質量％、より好ましくは０．０２～０．８質量％、更に好ましくは０．０４～０．６質量％である。
　本工程で使用する培地には、硫酸塩を含有することができる。硫酸塩としては、具体的には、硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛、硫酸カリウム、硫酸ナトリウム等が挙げられる。培地中の初発の硫酸イオン濃度は、乳酸の高い生産性維持の観点から、好ましくは０．００１～０．１質量％、より好ましくは０．００５～０．０８質量％、更に好ましくは０．０１～０．０４質量％である。
　本工程で使用する培地には、マグネシウム塩を含有することができる。マグネシウム塩としては、具体的には、硫酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、塩化マグネシウム等が挙げられる。培地中の初発のマグネシウムイオン濃度は、乳酸の高い生産性維持の観点から、好ましくは０～０．５質量％、より好ましくは０．００１～０．２質量％、更に好ましくは０．００２～０．１質量％である。
　本工程で使用する培地には、亜鉛塩を含有することができる。亜鉛塩としては、具体的には、硫酸亜鉛、硝酸亜鉛、塩化亜鉛等が挙げられる。培地中の初発の亜鉛イオン濃度は、乳酸の高い生産性維持の観点から、好ましくは０～０．１質量％、より好ましくは０．００００１～０．０１質量％、更に好ましくは０．００００５～０．００５質量％である。
　培養条件としては、培養温度が、好ましくは２０～４０℃、より好ましくは３０～３７℃である。また、培地のｐＨ（２５℃）は、菌体の生育や、乳酸の生産性の観点から、好ましくは２～７、より好ましくは４～６である。ｐＨ制御は、水酸化カルシウム、水酸化ナトリウム、炭酸カルシウム、アンモニア等の塩基、硫酸、塩酸等の酸を用いて行うことができる。
　培養方法は、嫌気的条件及び好気的条件のいずれかを適宜選択することができる。好気的条件における通気条件は、好ましくは０．２５～４ｖｖｍ、より好ましくは０．５～２ｖｖｍである。また、培養に用いる培養槽は、従来公知のものを適宜採用することができるが、乳酸の生産速度の向上の観点から、通気撹拌型培養槽、気泡塔型培養槽、及び流動床培養槽が好ましく使用される。
　本工程は、例えば、菌体を上記の条件の培地に播種して行うことができる。また、調製工程後の菌体を培養槽に残し、これに上記の条件の培地を加えて行うこともできる。
　本工程は、回分式、半回分式及び連続式のいずれで行ってもよいが、生産性向上の観点から、連続式が好ましい。
　例えば、半回分式で行う場合、菌体と発酵液とを分離し、分離回収した菌体に培地を加えて更に発酵を行うことができる。また、連続式で行う場合、一定量の培地を発酵槽内に一定速度で供給するとともに、同量の発酵液を抜き取るという方法を採用することができる。その場合、発酵槽内の液面高さを一定に保つように、液面高さを液面センサー等により制御してもよい。また、発酵時に炭素源のみを供給することも可能であり、炭素源の供給は、流速で制御しても、グルコース濃度で制御してもよい。
＜第２の発酵工程＞
　本発明においては、菌糸の活性化、乳酸の高い生産性維持の観点から、第１の発酵工程後、第２の発酵工程を行うことができる。すなわち、第２の発酵工程は、第１の発酵工程における乳酸の生産速度維持率が５０～９５％となったときに第１の発酵工程を終了し、第１の発酵工程で使用した菌体を用いて、リン酸イオン濃度が０．００７質量％以上１質量％以下であり、かつ炭素源を含む液体培地にて発酵を行う工程である。
　本工程を行うことで、長期発酵生産によって低下した乳酸の生産性を回復することが可能である。本工程による乳酸生産性回復の機構は必ずしも明らかではないが、リンの欠乏によって活性の低下した菌糸を適度なリン酸の供給によって再活性しているものと考えられる。
　本工程は、第１の発酵工程における乳酸の生産速度維持率が、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、更に好ましくは７０％以上であって、好ましくは９５％以下、より好ましくは９０％以下、更に好ましくは８５％以下となったときに行うことが、菌糸の活性化、乳酸の高い生産性維持の観点から好ましい。乳酸の生産速度維持率の範囲としては、通常５０～９５％であるが、好ましくは５０～９０％、更に好ましくは６０～９０％、更に好ましくは７０～９０％、更に好ましくは７０～８５％である。
　ここで、「乳酸の生産速度維持率」とは、下記式（ｉ）により求められる値をいう。
　Ｔ［％］＝Ｖｔ［ｇ／Ｌ／ｈ］／Ｖｉ［ｇ／Ｌ／ｈ］×１００　　（ｉ）
〔式（ｉ）中、Ｔは乳酸の生産速度維持率［％］を示し、Ｖｔは試料の乳酸生産速度［ｇ／Ｌ／ｈ］を示し、Ｖｉは乳酸生産速度の管理値［ｇ／Ｌ／ｈ］を示す。〕
　なお、式（ｉ）において、乳酸生産速度［ｇ／Ｌ／ｈ］とは、試料中の乳酸濃度（ｇ／Ｌ）を発酵時間（ｈ）で除した値である。また、乳酸生産速度の管理値（Ｖｉ）とは、第１の発酵工程に係る発酵液中の乳酸濃度と発酵時間との関係に基づいて定めた値である。乳酸生産速度の管理値は、実稼動に先立って予め求めておいた発酵液中の乳酸濃度と発酵時間との関係に基づいて決定してもよいし、実稼動中に取得した発酵液中の乳酸濃度と発酵時間との関係に基づいて決定してよい。この場合、液体培地中の炭素源から産生される乳酸濃度の理論値（ｇ／Ｌ）を参酌することができる。
　乳酸生産速度の管理値（Ｖｉ）は、製造スケール等により一様ではないが、例えば、０．１ｇ／Ｌ／ｈ以上が好ましく、０．３ｇ／Ｌ／ｈ以上がより好ましく、０．５ｇ／Ｌ／ｈ以上が更に好ましく、そして４０ｇ／Ｌ／ｈ以下が好ましく、３０ｇ／Ｌ／ｈ以下がより好ましく、２０ｇ／Ｌ／ｈ以下が更に好ましい。乳酸生産速度の管理値（Ｖｉ）の範囲としては、好ましくは０．１～４０ｇ／Ｌ／ｈ、より好ましくは０．３～３０ｇ／Ｌ／ｈ、更に好ましくは０．５～２０ｇ／Ｌ／ｈである。
　本工程は、第１の発酵工程終了後、菌体と発酵液とを分離し、回収した菌体を、新たに調製した本工程に係る液体培地に播種して行ってもよいし、第１の発酵工程終了後、第１の工程で使用した液体培地にリン酸イオンを添加し所定のリン酸イオン濃度に調整して行ってもよい。
　本工程で使用する培地は、リン酸イオン濃度が０．００７質量％以上０．１質量％以下である点を除いては、第１の発酵工程で使用する液体培地と同様であり、炭素源を含めば、窒素源、リン酸塩以外の無機塩、ビタミン等が含まれていてもよい。また、使用する炭素源に培養に適切な濃度の上記栄養源が含まれている場合には、炭素源のみを用いることも可能である。
　本工程で使用する培地中のリン酸イオン濃度は、菌糸の活性化、乳酸の高い生産性維持の観点から、好ましくは０．００７質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上、更に好ましくは０．０３質量％以上である。また、本工程で使用する培地中のリン酸イオン濃度は、菌体の形態の維持の観点から、好ましくは０．１質量％以下、より好ましくは０．０９質量％以下、更に好ましくは０．０８質量％以下である。培地中のリン酸イオン濃度の範囲としては、好ましくは０．００７～０．１質量％、より好ましくは０．０１～０．０９質量％、更に好ましくは０．０３～０．０８質量％である。
　本工程で使用する培地に含まれるリン酸イオンは、培地中にリン酸塩の形態で含有することができる。リン酸塩としては、具体的には、リン酸一水素二カリウム、リン酸二水素一カリウム、リン酸一水素二ナトリウム、リン酸二水素一ナトリウム等が挙げられる。
　本工程の培養条件としては、培養温度が、好ましくは２０～４０℃、より好ましくは３０～３７℃である。また、培地のｐＨ（２５℃）は、菌体の生育や、乳酸の生産性の観点から、好ましくは２～７、より好ましくは４～６である。ｐＨ制御は、水酸化カルシウム、水酸化ナトリウム、炭酸カルシウム、アンモニア等の塩基、硫酸、塩酸等の酸を用いて行うことができる。
　培養方法は、嫌気的条件及び好気的条件のいずれかの培養方法を適宜選択することができる。好気的条件における通気条件は、好ましくは０．２５～４ｖｖｍ、より好ましくは０．５～２ｖｖｍである。
　本工程では、培地の温度が２０℃以上４０℃以下、かつｐＨ（２５℃）が２以上７以下の条件を満たした時を本工程の開始時間とする。なお、好気的条件で行う場合には、前述の条件に加え、更に通気条件が０．２５ｖｖｍ以上４ｖｖｍ以下の条件を満たした時を本工程の開始時間とする。
　本工程は、菌糸の活性化、乳酸の高い生産性維持の観点から、本工程開始後、好ましくは１時間以上、より好ましくは１２時間以上、更に好ましくは２４時間以上継続する。また、本工程は、固定化糸状菌の形態維持の観点から、本工程開始後、好ましくは２４０時間以内、より好ましくは１２０時間以内、更に好ましくは６０時間以内、更に好ましくは４８時間以内に終了する。本工程の発酵時間としては、好ましくは１～２４０時間、より好ましくは１２～１２０時間、更に好ましくは２４～６０時間、更に好ましくは２４～４８時間である。
＜第３の発酵工程＞
　本発明においては、第２の発酵工程を行った場合には、乳酸のより高い生産性維持の観点から、第２の発酵工程後、第３の発酵工程を行うことが好ましい。すなわち、第３の発酵工程は、第２の発酵工程で使用した菌体を用いて、リン酸イオン濃度が０．００７質量％未満に制御され、かつ炭素源を含む液体培地にて発酵を行う工程である。
　第２の発酵工程で使用した菌体は、第２の発酵工程終了後、菌体と発酵液とを分離して回収することが可能であり、また回収した菌体は、新たに調製した本工程に係る液体培地に播種すればよい。
　本工程で使用する液体培地は、第１の発酵工程で使用する液体培地と同様であり、具体的な構成は前述の第１の発酵工程において説明したとおりである。
　第３の発酵工程においては、乳酸の生産性が低下してきた場合に、再び第２の発酵工程を実施することで、乳酸の生産性を再活性化することが可能である。
＜菌体と発酵液の分離工程＞
　発酵工程後の菌体と発酵液の分離は、発酵槽内でフィルタにより固液分離してもよいし、一度槽外に抜き出して液体サイクロンやろ過等の固液分離に供した後に菌体のみを発酵槽内に戻してもよい。
＜分離工程後の発酵液から乳酸を回収する工程＞
　分離工程により得られた発酵液を濃縮した後、晶析法、イオン交換法、溶剤抽出法、乳酸をアルカリ土類金属塩として析出させた後析出物を酸分解する方法、あるいは乳酸エステルとして蒸留精製後加水分解する方法等により、発酵液から乳酸を分離し回収することができる。
　上述した実施形態に関し、本発明は更に以下の乳酸の製造方法を開示する。
＜１＞
　リン酸イオン濃度が０．００７質量％未満に制御され、かつ炭素源を含む液体培地にて、糸状菌ペレット及び固定化糸状菌から選ばれる１種以上の菌体を用いて発酵により乳酸を得る第１の発酵工程を含む、乳酸の製造方法。
＜２＞
　前記第１の発酵工程において、乳酸の生産速度維持率が好ましくは５０～９５％となったときに、第１の発酵工程で使用した前記菌体を用いて、リン酸イオン濃度が０．００７質量％以上１質量％以下であり、かつ炭素源を含む液体培地にて発酵を行う第２の発酵工程を有する、前記＜１＞記載の乳酸の製造方法。
＜３＞
　前記乳酸の生産速度維持率が、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、更に好ましくは７０％以上であって、好ましくは９０％以下、更に好ましくは８５％以下である、前記＜２＞記載の乳酸の製造方法。
＜４＞
　前記乳酸の生産速度維持率が、好ましくは５０～９０％、更に好ましくは６０～９０％、更に好ましくは７０～９０％、更に好ましくは７０～８５％である、前記＜２＞又は＜３＞記載の乳酸の製造方法。
＜５＞
　前記乳酸の生産速度維持率が、好ましくは下記式（ｉ）により求められる値である、前記＜２＞～＜４＞のいずれか一に記載の乳酸の製造方法。
　Ｔ［％］＝Ｖｔ［ｇ／Ｌ／ｈ］／Ｖｉ［ｇ／Ｌ／ｈ］×１００　　（ｉ）
〔式（ｉ）中、Ｔは乳酸の生産速度維持率［％］を示し、Ｖｔは試料の乳酸生産速度［ｇ／Ｌ／ｈ］を示し、Ｖｉは乳酸生産速度の管理値［ｇ／Ｌ／ｈ］を示す。〕
＜６＞
　前記乳酸生産速度の管理値が、好ましくは０．１ｇ／Ｌ／ｈ以上、より好ましくは０．３ｇ／Ｌ／ｈ以上、更に好ましくは０．５ｇ／Ｌ／ｈ以上であって、好ましくは４０ｇ／Ｌ／ｈ以下、より好ましくは３０ｇ／Ｌ／ｈ以下、更に好ましくは２０ｇ／Ｌ／ｈ以下である、前記＜５＞記載の乳酸の製造方法。
＜７＞
　前記乳酸生産速度の管理値が、好ましくは０．１～４０ｇ／Ｌ／ｈ、より好ましくは０．３～３０ｇ／Ｌ／ｈ、更に好ましくは０．５～２０ｇ／Ｌ／ｈである、前記＜５＞又は＜６＞記載の乳酸の製造方法。
＜８＞
　前記第２の発酵工程を、好ましくは１時間以上、より好ましくは１２時間以上、更に好ましくは２４時間以上継続し、好ましくは２４０時間以内、より好ましくは１２０時間以内、更に好ましくは６０時間以内、更に好ましくは４８時間以内に終了する、前記＜２＞～＜７＞のいずれか一に記載の乳酸の製造方法。
＜９＞
　前記第２の発酵工程を、好ましくは１～２４０時間、より好ましくは１２～１２０時間、更に好ましくは２４～６０時間、更に好ましくは２４～４８時間行う、前記＜２＞～＜８＞のいずれか一に記載の乳酸の製造方法。
＜１０＞
　前記第２の発酵工程後、好ましくは第２の発酵工程で使用した前記菌体を用いて、リン酸イオン濃度が０．００７質量％未満に制御され、かつ炭素源を含む液体培地にて発酵を行う第３の発酵工程を有する、前記＜２＞～＜９＞のいずれか一に記載の乳酸の製造方法。
＜１１＞
　前記第１の発酵工程前に、好ましくは糸状菌のペレット及び固定化糸状菌から選ばれる１種以上の菌体を調製する調製工程を有する、前記＜１＞～＜１０＞のいずれか一に記載の乳酸の製造方法。
＜１２＞
　前記糸状菌が好ましくはリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属である、前記＜１＞～＜１１＞のいずれか一に記載の乳酸の製造方法。
＜１３＞
　前記糸状菌が好ましくはリゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ・ｏｒｙｚａｅ）である、前記＜１＞～＜１２＞のいずれか一に記載の乳酸の製造方法。
＜１４＞
　前記炭素源が好ましくは糖類である、前記＜１＞～＜１３＞のいずれか一に記載の乳酸の製造方法。
＜１５＞
　前記糖類が好ましくはデンプンから得られる糖液、糖蜜、及びリグノセルロース系バイオマスから得られる糖液よりなる群から選ばれる１種以上である、前記＜１４＞に記載の乳酸の製造方法。
＜１６＞
　前記第１の発酵工程で使用する液体培地中のリン酸イオン濃度が、好ましくは０．００６質量％以下、より好ましくは０．００５質量％以下、更に好ましくは０．００４質量％以下、更に好ましくは０．００３質量％以下、更に好ましくは０質量％である、前記＜１＞～＜１５＞のいずれか一に記載の乳酸の製造方法。
＜１７＞
　前記第１の発酵工程で使用する液体培地中のリン酸イオン濃度が、好ましくは０～０．００７質量％未満、より好ましくは０～０．００６質量％、更に好ましくは０～０．００５質量％、更に好ましくは０～０．００４質量％、更に好ましくは０～０．００３質量％である、前記＜１＞～＜１５＞のいずれか一に記載の乳酸の製造方法。
＜１８＞
　前記第１の発酵工程で使用する液体培地中にリン酸イオンを含まないか（リン酸イオン濃度が０質量％）、あるいは液体培地中にリン酸イオンを含む場合には、好ましくは０．００６質量％以下、より好ましくは０．００５質量％以下、更に好ましくは０．００４質量％以下、更に好ましくは０．００３質量％以下である、前記＜１＞～＜１５＞のいずれか一に記載の乳酸の製造方法。
＜１９＞
　前記第２の発酵工程で使用する液体培地中のリン酸イオン濃度が、好ましくは０．１質量％以下、より好ましくは０．０９質量％以下、更に好ましくは０．０８質量％以下であって、好ましくは０．００７質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上、更に好ましくは０．０３質量％以上である、前記＜２＞～＜１８＞のいずれか一に記載の乳酸の製造方法。
＜２０＞
　前記第２の発酵工程で使用する液体培地中のリン酸イオン濃度が、好ましくは０．００７～０．１質量％、より好ましくは０．０１～０．０９質量％、更に好ましくは０．０３～０．０８質量％である、前記＜２＞～＜１９＞のいずれか一に記載の乳酸の製造方法。
＜２１＞
　前記第３の発酵工程で使用する液体培地中のリン酸イオン濃度が、好ましくは０．００６質量％以下、より好ましくは０．００５質量％以下、更に好ましくは０．００４質量％以下、更に好ましくは０．００３質量％以下、更に好ましくは０質量％である、前記＜１０＞～＜２０＞のいずれか一に記載の乳酸の製造方法。
＜２２＞
　前記第３の発酵工程で使用する液体培地中のリン酸イオン濃度が、好ましくは０～０．００７質量％未満、より好ましくは０～０．００６質量％、更に好ましくは０～０．００５質量％、更に好ましくは０～０．００４質量％、更に好ましくは０～０．００３質量％である、前記＜１０＞～＜２０＞のいずれか一に記載の乳酸の製造方法。
＜２３＞
　前記第３の発酵工程で使用する液体培地中にリン酸イオンを含まないか（リン酸イオン濃度が０質量％）、あるいは液体培地中にリン酸イオンを含む場合には、好ましくは０．００６質量％以下、より好ましくは０．００５質量％以下、更に好ましくは０．００４質量％以下、更に好ましくは０．００３質量％以下である、前記＜１０＞～＜２０＞のいずれか一に記載の乳酸の製造方法。
＜２４＞
　前記第１、第２及び第３の発酵工程のうちの１以上の工程を、液体培地中の初発の炭素濃度が、好ましくは１質量％以上、より好ましくは３質量％以上、更に好ましくは５質量％以上であって、好ましくは４０質量％以下、より好ましくは３０質量％以下、更に好ましくは２０質量％以下で行う、前記＜１＞～＜２３＞のいずれか一に記載の乳酸の製造方法。
＜２５＞
　前記第１、第２及び第３の発酵工程のうちの１以上の工程を、液体培地中の初発の炭素濃度が、好ましくは１～４０質量％、より好ましくは３～３０質量％、更に好ましくは５～２０質量％で行う、前記＜１＞～＜２４＞のいずれか一に記載の乳酸の製造方法。
＜２６＞
　前記第１、第２及び第３の発酵工程のうちの１以上の工程を、液体培地中の初発の窒素濃度が、好ましくは０．０１～１質量％、より好ましくは０．０２～０．８質量％、更に好ましくは０．０４～０．６質量％で行う、前記＜１＞～＜２５＞のいずれか一に記載の乳酸の製造方法。
＜２７＞
　前記第１、第２及び第３の発酵工程のうちの１以上の工程を、液体培地中の初発の硫酸イオン濃度が、好ましくは０．００１～０．１質量％、より好ましくは０．００５～０．０８質量％、更に好ましくは０．０１～０．０４質量％で行う、前記＜１＞～＜２６＞のいずれか一に記載の乳酸の製造方法。
＜２８＞
　前記第１、第２及び第３の発酵工程のうちの１以上の工程を、液体培地中の初発のマグネシウムイオン濃度が、好ましくは０～０．５質量％、より好ましくは０．００１～０．２質量％、更に好ましくは０．００２～０．１質量％で行う、前記＜１＞～＜２７＞のいずれか一に記載の乳酸の製造方法。
＜２９＞
　前記第１、第２及び第３の発酵工程のうちの１以上の工程を、液体培地中の初発の亜鉛イオン濃度が、好ましくは０～０．１質量％、より好ましくは０．００００１～０．０１質量％、更に好ましくは０．００００５～０．００５質量％で行う、前記＜１＞～＜２８＞のいずれか一に記載の乳酸の製造方法。
＜３０＞
　前記第１、第２及び第３の発酵工程のうちの１以上の工程を、好ましくは一定量の液体培地を発酵槽内に一定速度で供給するとともに、同量の発酵液を発酵槽外に抜き取る連続式にて行う、前記＜１＞～＜２９＞のいずれか一に記載の乳酸の製造方法。
＜３１＞
　リン酸イオン濃度が０．００７質量％未満に制御され、かつ炭素源を含む液体培地にて、糸状菌ペレット及び固定化糸状菌から選ばれる１種以上の菌体を用いて発酵により乳酸を得る第１の発酵工程において、乳酸の生産速度維持率が好ましくは５０～９５％となったときに、前記第１の発酵工程で使用した前記菌体を用いて、リン酸イオン濃度が０．００７質量％以上１質量％以下であり、かつ炭素源を含む液体培地にて発酵を行う第２の発酵工程を含む、乳酸産生に使用する菌体の再活性化方法。
＜分析方法＞
［高速液体クロマトグラフ（HPLC）による各種成分の測定］
　発酵液を０．００８５規定硫酸水溶液で適宜希釈し、孔径が０．２２μｍのセルロースアセテート製メンブレンフィルタ（ADVANTEC社製）を用いて濾過を行い、HPLC分析用サンプルとした。HPLCの分析条件は、次の通りである。
・カラム　　：ICSep ICE-ION-300
・溶離液　　：０．００８５規定 硫酸、０．４ｍＬ／ｍｉｎ
・検出法　　：RI（HITACHI、L-2490）
・カラム温度：４０℃
・注入液量　：２０μＬ
・保持時間　：４０ｍｉｎ
　この分析系における各成分の保持時間は、次の通りである。
・グルコース：１６ｍｉｎ
・乳酸　　　：２３ｍｉｎ
・エタノール：３４ｍｉｎ
〔培養例１〕
＜糸状菌ペレットの調製＞
〔胞子懸濁液の調製〕
　菌株は独立行政法人　製品評価技術基盤機構（NITE）より入手した糸状菌R.oryzae NBRC5384を使用した。糸状菌は、試験管内に形成させた斜面状寒天培地（Difco Potato Dextrose Agar、Becton, Dickinson and Company）上に菌体を画線／塗布し、２５℃にて静置培養し、定期的に継代を行った。菌体使用時には菌体増殖した試験管に１０ｍＬの滅菌蒸留水を添加後、タッチミキサにて４分間撹拌することで胞子を回収し、更に無菌の蒸留水を添加して希釈することで１×１０6 ｓｐｏｒｅｓ／ｍＬに調整したものを胞子懸濁液とした。
〔糸状菌のペレット化〕
　糸状菌ペレットの調製は以下の２段階の培養にて行った。
　１段目の培養は、６０ｍＬのＰＤＢ培地（Difco Potato Dextrose Broth、Becton,Dickinsonand Company）を仕込んだ２００ｍＬ容バッフル付き三角フラスコを滅菌し、前述の方法で調製した胞子懸濁液を１×１０4個－胞子／ｍＬとなるように植菌して２７℃，１００ｒ／ｍ（PRECI社、PRXYg-98R）の培養条件にて３日間行った。
　２段目の培養は、ペレット形成培地（グルコース（和光純薬工業社製）１０質量％、硫酸マグネシウム七水和物 ０．０２５質量％、硫酸亜鉛七水和物 ０．００９質量％、硫酸アンモニウム ０．１質量％、リン酸二水素一カリウム ０．０６質量％）２Ｌを仕込んだ２Ｌ容エアリフト型発酵槽を滅菌し、１段目の培養液１２０ｍＬを植菌して２７℃、通気速度１ｖｖｍで空気を供給した条件にて１．５日間行った。ｐＨは３Ｎ水酸化ナトリウム溶液を適宜添加して、ｐＨ（２５℃）６．０を維持した。
〔ペレットの回収〕
　上記の各段で得られた糸状菌ペレット培養液を、ガーゼにてろ液のドリップが落ち着くまで１分ろ過し、ウエット状態の糸状菌ペレットを得た。２段目で得られたペレットは速やかに発酵性の評価に供した。
〔培養例２〕
〔糸状菌の担体固定化〕
　固定化糸状菌の調製は以下の２段階の培養にて行った。
　１段目の培養は、３０ｍＬの固定化培地（グルコース（和光純薬工業社製）５質量％、硫酸マグネシウム七水和物 ０．０２５質量％、硫酸亜鉛七水和物 ０．００９質量％、尿素 ０．２質量％、リン酸二水素一カリウム ０．０６質量％）、及び０．８ｍｍ角ポリウレタン発泡体(日清紡社製、APG)を５個仕込んだ１００ｍＬ三角フラスコを滅菌し、前述の糸状菌ペレットと同様の方法で調製した胞子懸濁液を２×１０4個－胞子／ｍＬとなるように植菌して３５℃，２００ｒ／ｍ（PRECI社、PRXYg-98R）の培養条件にて１日間行った。
　２段目の培養は、菌体増殖培地（グルコース（和光純薬工業社製）１０質量％、硫酸マグネシウム七水和物 ０．０２５質量％、硫酸亜鉛七水和物 ０．００９質量％、尿素 ０．１質量％、リン酸二水素一カリウム ０．０６質量％、炭酸カルシウム５質量％）１００ｍＬを仕込んだ５００ｍＬ容三角フラスコを滅菌し、１段目で担体に固定化した糸状菌を植菌して３５℃，２００ｒ／ｍ（PRECI社、PRXYg-98R）の培養条件にて２日間行った。
〔固定化糸状菌の回収〕
　上記の各段で得られた固定化糸状菌培養液を、ガーゼにてろ液のドリップが落ち着くまで１分ろ過し、ウエット状態の固定化糸状菌を得た。２段目で得られた固定化糸状菌は速やかに発酵性の評価に供した。
〔発酵例１〕
＜発酵性の評価＞
〔培養方法１〕
　乳酸発酵培養液２Ｌを滅菌済の２Ｌ容エアリフト型発酵槽に添加し、続いて培養例１で調製した糸状菌ペレット全量（ウエット状態）を添加した。その直後に培養０時間目のサンプリングを行った後、３５℃、通気速度１ｖｖｍで空気を供給した条件にて培養を行った。その後経時的にサンプリングを行いながら、１４日間培養を行った。ｐＨは３Ｎ水酸化ナトリウム溶液を適宜添加して、ｐＨ（２５℃）６．０を維持した。発酵時には発酵槽内に２Ｌ／日の速度で乳酸発酵培養液を連続的に供給するとともに、同量の発酵液を発酵槽外に抜き取った。なお、培養液の供給は、液面センサーにより回収液用のポンプを制御することで発酵液面を一定に保ちながら行った。培養後、発酵液内に設置した焼結フィルタにより糸状菌ペレットを槽内に残したまま、発酵液のみを回収した。
〔発酵例２〕
＜発酵性の評価＞
〔培養方法２〕
　乳酸発酵培養液１００ｍＬを滅菌済の５００ｍＬ容三角フラスコに添加し、続いて培養例２で調製した固定化糸状菌全量（ウエット状態）を添加した。その直後に培養０時間目のサンプリングを行った後、３５℃、２００ｒ／ｍ（PRECI社、PRXYg-98R）の培養条件にて２日間行った。発酵終了時にサンプリングを行った。その後、固定化糸状菌の回収を行い、再度滅菌した乳酸発酵培養液１００ｍＬを添加した５００ｍＬ容三角フラスコに回収した固定化糸状菌を添加し、３５℃、２００ｒ／ｍ（PRECI社、PRXYg-98R）の培養条件にて２日間行い、固定化糸状菌を回収した。その後、回収した固定化糸状菌を用いて同様の操作によるバッチ培養を繰り返し行った。
〔評価方法〕
　発酵液の分析値から、（１）糖から乳酸への変換率（Ｐ［％］、（２）糖からエタノールへの変換率（Ｑ［％］）、（３）前記エタノール変換で発生する二酸化炭素への変換率（Ｒ［％］）の３項目を評価軸とした。各項目の算出式を表１及び式（１）～（３）に示す。なお、式中、供給糖液のグルコース濃度をＧ0と定義した。また、式（４）に示すように中和剤による発酵液の希釈率をＳ[－]と定義した。フラスコを用いた発酵では培地中に予め添加した炭酸カルシウムで中和するため、希釈率Ｓを１とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　糖から乳酸への変換率
　　Ｐ［％］＝Ｌ／（Ｇ0×Ｓ－Ｇ）×１００　　　　　　　　　　（１）
　糖からエタノールへの変換率
　　Ｑ［％］＝Ｅ／（Ｇ0×Ｓ－Ｇ）×１００　　　　　　　　　　（２）
　前記エタノール変換で発生する二酸化炭素への変換率
　　Ｒ［％］＝Ｑ×（ＣＯ2分子量／ＥｔＯＨ分子量）×１００　　（３）
　中和剤による発酵液の希釈率
　　Ｓ［－］＝１／（１＋（Ｌ／９０／３））　　　　　　　　　 （４）
　乳酸の生産速度維持率
　　Ｔ［％］＝試料の乳酸生産速度［ｇ／Ｌ／ｈ］／乳酸生産速度の管理値［ｇ／Ｌ／ｈ］×１００
乳酸製造時のリン酸濃度低減の効果
〔実施例１〕
＜糸状菌ペレットの調製＞
　上記培養例１により、糸状菌R.oryzae NBRC5384を用いて糸状菌ペレットを調製した。
＜発酵性の評価＞
　グルコース、尿素、硫酸マグネシウム七水和物及び硫酸亜鉛七水和物を表２に示す濃度で溶解した乳酸発酵培養液を用いて、発酵例１に記載の発酵性の評価を行った。なお、グルコース源として、グルコース（和光純薬工業社製）を用いた。評価結果を表４に示す。
〔実施例２〕
　１段目の培養でＰＤＢ培地に０．５質量％のソルビタンモノラウレート（商品名レオドールＳＰ－Ｌ１０、花王製）を添加した以外は実施例１と同一の条件で糸状菌ペレットの調製を行った。リン酸二水素一カリウムを添加し、乳酸発酵培養液のリン酸イオン濃度を０．００１４質量％（０．１５ｍＭ）にした、表２に示す乳酸発酵培養液を用いた以外は実施例１と同一の条件で発酵性の評価を行った。評価結果を表４に示す。
〔実施例３〕
　リン酸二水素一カリウムを添加し、乳酸発酵培養液のリン酸イオン濃度を０．００３５質量％（０．３７ｍＭ）にした、表２に示す乳酸発酵培養液を用いた以外は実施例２と同一の条件で糸状菌ペレットの調製及び発酵性の評価を行った。評価結果を表４に示す。
〔比較例１〕
　リン酸二水素一カリウムを添加し、乳酸発酵培養液のリン酸イオン濃度を０．００７０質量％（０．７３ｍＭ）にした、表３に示す乳酸発酵培養液を用いた以外は実施例１と同一の条件で糸状菌ペレットの調製及び発酵性の評価を行った。評価結果を表５に示す。
〔比較例２〕
　リン酸二水素一カリウムを添加し、乳酸発酵培養液のリン酸イオン濃度を０．０４２質量％（４．４ｍＭ）にした、表３に示す乳酸発酵培養液を用いた以外は実施例１と同一の条件で糸状菌ペレットの調製及び発酵性の評価を行った。評価結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表４及び５から、培地のリン酸イオン濃度が本発明の範囲内であるとエタノールの生成が確認されなかったのに対し、リン酸イオン濃度が本発明の範囲外であるとエタノールが生成し、消費されたグルコースに対する乳酸変換率が大きく低下することが分かった。
〔実施例４〕
＜固定化糸状菌の調製＞
　上記培養例２により、糸状菌R.oryzae NBRC5384を用いて固定化糸状菌を調製した。
＜発酵性の評価＞
　グルコース、尿素、硫酸マグネシウム七水和物及び硫酸亜鉛七水和物を実施例１（表２）に示す濃度で溶解した乳酸発酵培養液を用いて、発酵例２に記載の発酵性の評価を５０日間（２５サイクル）行った。なお、グルコース源として、グルコース（和光純薬工業社製）を用いた。評価結果を表６に示す。
〔実施例５〕
＜固定化糸状菌の調製＞
　上記培養例２により、糸状菌R.oryzae NBRC5384を用いて固定化糸状菌を調製した。
＜発酵性の評価＞
　グルコース、尿素、硫酸マグネシウム七水和物及び硫酸亜鉛七水和物を実施例１（表２）に示す濃度で溶解した乳酸発酵培養液を用いて、発酵例２に記載の発酵性の評価を３６日間（１８サイクル）行い、固定化糸状菌を回収した。なお、乳酸生産速度の管理値は、１．６〔ｇ／Ｌ／ｈ〕に設定し、３６日後の乳酸生産速度は、１．３〔ｇ／Ｌ／ｈ〕であった。その後、回収した固定化糸状菌を用い、培養液を比較例２（表３）に示す乳酸発酵培養液に替えて２日間培養を行い、固定化糸状菌を回収した。次いで、回収した固定化糸状菌を用い、培養液を再び実施例１（表２）に示す乳酸発酵培養液に替えて発酵性の評価を１２日間（６サイクル）行った。なお、グルコース源として、グルコース（和光純薬工業社製）を用いた。評価結果を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表６から、固定化糸状菌を使用した場合においても、糸状菌ペレットと同様に乳酸変換率を高水準で維持したまま乳酸を生産できることが確認された。また、第１の発酵工程に係る乳酸生産速度が５０～９５％に低下したときにリン酸イオン濃度の高い培地で一時的に発酵を行うと、菌体が活性化され、この活性化された菌体を用いて第１の発酵工程と同様の第３の発酵工程に供することで、より一層長期に亘って乳酸変換率と乳酸生産速度を高水準で維持したまま、乳酸を生産できることが分かった。

Claims (7)

  1. 　リン酸イオン濃度が０．００７質量％未満に制御され、かつ炭素源を含む液体培地にて、糸状菌ペレット及び固定化糸状菌から選ばれる１種以上の菌体を用いて発酵により乳酸を得る第１の発酵工程を含む、乳酸の製造方法。
  2. 　第１の発酵工程における乳酸の生産速度維持率が５０～９５％となったときに、第１の発酵工程で使用した前記菌体を用いて、リン酸イオン濃度が０．００７質量％以上１質量％以下であり、かつ炭素源を含む液体培地にて発酵を行う第２の発酵工程を有する、請求項１記載の乳酸の製造方法。
  3. 　第２の発酵工程後、第２の発酵工程で使用した前記菌体を用いて、リン酸イオン濃度が０．００７質量％未満に制御され、かつ炭素源を含む液体培地にて発酵を行う第３の発酵工程を有する、請求項２記載の乳酸の製造方法。
  4. 　第１の発酵工程前に、糸状菌ペレット及び固定化糸状菌から選ばれる１種以上の菌体を調製する調製工程を有する、請求項１～３の何れか１項に記載の乳酸の製造方法。
  5. 　糸状菌がリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属である、請求項１～４の何れか１項に記載の乳酸の製造方法。
  6. 　炭素源が糖類である、請求項１～５の何れか１項に記載の乳酸の製造方法。
  7. 　糖類がデンプンから得られる糖液、糖蜜、及びリグノセルロース系バイオマスから得られる糖液よりなる群から選ばれる１種以上である、請求項６に記載の乳酸の製造方法。
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