SU1221241A1 - Способ получени лимонной кислоты глубинным методом - Google Patents

Description

Изобретение относитс  к пищевой промышленности, а именно к технологи получени  пищевых органических кислот , в частности лимонной,кислоты, способом глубинной ферментации углеводе одержащего сырь , например мелассы , погруженной культурой микроорганизма - продуцента лимонной кислоты.

Цель изобретени  - повьшение вы- хода лимонной кислоты и создание .оптимальных условий дл  ферментации при использовании меласс с содержанием кальци  свьше 0,8%.

Способ осуществл ют следующим образом.

Посевной мицелий в течение 24- 36 ч выращивают на среде из мелассы, содержащей 4,5-6% сахара, в одну стадию: дл  ферментации подготавливают ме лас сную среду с начальной концентрацией сахара 13-14%, В качестве ингибитора образовани  побочных кислот примен ют сернокислый цинк в дозе, соответствующей 10-17 мг на литр среды. Объем заполнени  ферментатора 70-75%. Увеличение концентрации свьше 6% приводит к непроизводительному расходу сахара, дополнительным затратам сырь . Уменьшение концентрации ниже 4,5% настолько увеличивает период адаптации гриба- продуцента в результате резкого перепада концентрации питательных веществ при переводе подрощенного мицеЛи  в ферментированные растворы, что процесс становитс  нерентабельным

Использование мелассной среды с высокой концентрацией сахара и одновременное заполнение объема ферментатора на 70-75% позвол ет использовать в одном цикле (без дополнительных подливов) до 7,5 т мелассы и, следовательно, получить высокий валовый выход лимонной кислоты с ферментатора. При использова- ., кальци  возрастает содержание азота.

НИИ концентрированных мелассных сред, когда весь запас питательных веществ даетс  сразу, процесс адаптации и роста гриба происходит с первых суток, а затем идет активный биосинтез лимонной кислоты, увеличение титруемой кислотности без снижени  до конца процесса.

Дл  обеспечени  нормальной аэрации в ферментаторе эрлифтного типа и более полной утилизации субстрата, в процессе ферментации на 2-е и 3-й сутки производ т долив стерильной

50

что способствует накоплению побочных кислот, в частности щавелевой.

Дозировка ZnSO. зависит от исполь зуемых образцов мелассы, от доз фер- роцианида кальци  и щавелевокислого аммони , примен емых дл  обработки

мелассы. Вещества, используемые дл  осаждени  т желых металлов и солей кальци , не имеют избирательного 55 действи  и в процессе соосаждени  вьюод т из раствора р д необходимых микроэлементов, в том числе и Zn. Экспериментально / установлено, что

0

2212412

вода в количестве 4-5% от объема ферментатора. Продолжительность ферментации 4,5-5,5 сут.

Необходимость доливов стерильной 5 воды вызвана тем, что в результате испарени  среды увеличиваетс  в зкость растворов, возрастает концент-, раци  продуктов метаболизма гриба, ухудшаютс  услови  питани  и газо- 0 обмена. Доливы воды в количе(;тве 4-5% от объема среды снимают зти негативные  влени  и улучшают услови  кислотообразовани . Выбранное врем  долива (2-е и 3-й сутки 5 ферментации) наиболее благопри тно, так как именно в этот период в результате нарастани  мицелиальной массы и высокой степени аэрации происходит значительное испарение среды и накопление продуктов жизнеде тельности гриба. При более позднем сроке начала доливов происходит снижение технологических показателей процесса. Прозводить долив воды на первые сутки, нецелесообразно, так как гриб только начинает накапливать биомассу и любые операции, св занные с доливом, увеличивают веро тность инфицировани  среды.

В качестве гриба-продуцента используют осмофильный штамм AspergiL- lus niger Л-4 (штамм депонирован в Центральном музее промьшшенных микроорганизмов института ВНИИгенетика под номером Г-171).

Высока  исходна  степень заполнени  ферментаторов достигаетс  в результате частичного (1/2) осаждени  солей кальци  щавелевокислым аммонием. Вследствие этого происходит сравнительно небольшое вспенивание среды, что позвол ет сохранить необходимый уровень заполнени  ферментатора на 70-75%. При полном осаждении солей

S

30

5

40

50

что способствует накоплению побочных кислот, в частности щавелевой.

Дозировка ZnSO. зависит от используемых образцов мелассы, от доз фер- роцианида кальци  и щавелевокислого аммони , примен емых дл  обработки

мелассы. Вещества, используемые дл  осаждени  т желых металлов и солей кальци , не имеют избирательного 55 действи  и в процессе соосаждени  вьюод т из раствора р д необходимых микроэлементов, в том числе и Zn. Экспериментально / установлено, что

3

ZnSO, примен емый в дозе 10-17 мг на литр мелассной среды, дает возможность направить биосинтез в сторону максимального продуцировани  лимонной кислоты за счет угнетани  биосинтеза глюконовой кислоты при ферментации мелассных сред.

Изобретение иллюстрируетс  следующими примерами.

Пример 1. Выращивание кислотообразующего мицели  и синтез лимонной кислоты осуществл ли в лабораторных услови х на качалке типа АВУ-50р с числом качаний 160 в минуту в колбах емкостью 700 см при 32 С. В качестве продуцента использовали Aspergillus niger штамм Л-4.

Дл  подращивани  мицели  приготавливали мелассную среду, содержащую 5% сахара по следующему рецепту, г/л:

Меласса106,4

Щавелевокислый

аммоний2,11

Ферроцианид кали  0,35

Однозамещенный

фосфат кали 0,16

Углекислый натрий

безводный0,146

Сульфат цинка водный 0,005

Сульфат магни  водньй 0,25

Готовую стерильную среду разливал в качалочные колбы по 50 мл и засевали суспензией конидий. Дл  приготовлени  суспензии 15 мг конидий замачивали в 10 мл мелассной среды, приготовленной дл  подращивани , и интенсивно стр хивали в течение 5 мин. Подращивание мицели  проводил 24 ч.

Дл  ферментации приготавливали мелассную среду, содержащую 13% сахара следующего состава, г/л:

Меласса276,0

Ферроцианид кали  0,9

Углекислый натрий

безводный0,38

Однозамещенный фосфат

кали 0,16

Сульфат цинка водный 0,005

А

Пример 2. Процесс подращивани  посевного мицели  осуществл ли как в примере 1. Процесс ферментации отличаетс  от примера 1 тем, что приготавливаемый мелассный раствор обрабатывали щавелевокислым аммонием в количестве, необходимом дл  осаждени  половины солей кальци  (из

2124 14

расчета содержани  Са в мелассе в пересчете на СаО). Одновременно увеличивали в 2,0 раза количество вносимого сернокислого цинка по отноше- с нию к оптимальной дозе, установленной дл  разбавлени  сред, используемых в известном способе.

Рецепт мелассной среды дл  ферментации , г/л:

0 Меласса276,0

Ферроцианид кали  0,9 Углекислый натрий безводный0,38 .

Щавелевокисльм

5 аммоний2,73

Однозамещенньш

фосфат кали 0,16

Сульфат цинка

водный -0,010

0 Результаты испытаний даны в табл. 1

Данные табл. 1 показывают, что при ведении процесса по предлагаемой технологии количество лимонной кис- 5 лоты, полученное с колбы, возрастает на 18,7%, а выход от сахара на 5,7% по сравнению с прототипом.

Пример 3. Процесс подращивани  посевного мицели  осуществл ли Q так же, как в примере 2. Процесс ферментации отличаетс  от примера 2 тем, что приготовленньш мелассный раствор обрабатывали щавелевокислым .аммонием в количестве, необходимом дл  полного осаждени  солей кальци  5 (из расчета содержани  Са в мелассе в пересчете на СаО). Одновременно увеличивали в 2,0 раза количество вносимого сернокислого цинка по отношению к оптимальной дозе, уста- 0 новленной дл  разбавлени  сред, используемых в известном способе.

Рецепт мелассной среды дл  ферментации , г/л:« Меласса 276,0 5 Ферроцианид кали  0,9 Углекисльй натрий безводный 0,38 Щавелевокислый натрий, безводньш 5,46 0 Однозамещенный фосфат

кали 0,16

Сульфат цинка водный 0,01 Сравнива  данные, полученные при ведении процесса по предлагаемой 5 технологии, количество лимонной кислоты , полученное с,колбы, снижаетс  на 10,8%, выход от сахара на 12,4%. В растворе накапливаетс  25,8% щаве-г

левой кислоты, тогда как по прототипу ее содержание составл ет 11,9, а про предлагаемой технологии щавелева  кислота не синтезируетс  вообще (табл. 1).

Готовую среду разливали в качалоч ные колбы по 50 мл и засевали 10 мл подрощенного мицели . Процесс ферментации длилс  5 сут. С колбы получено 5180 мг общей кислоты, в составе синтезируемых кислот лимонна  кислота составила 96,3%, глюконова  3,7%, щавелева  кислота отсутствовала, выход лимонной кислоты от сахара 71,25%.

Контролем служил процесс, осуществл емый по технологии прототипа, при котором мицелий производственного штамма Aspergillus niger Л-4 подращивают на мелассной среде, содержащей 3% сахара в течение 2А ч. Подросшим мицелием в количестве 10 мл засевали ферментационную ме- лассную среду, содержащзто 3% сахара. Через 24 ч после засева бродильнь1х растворов подрощенным мицелием начинали долины мелассного раствора. 25%-ного по сахару. Долины проводили

в два приема по 9,5 мл через 5 ч. Мелассца  среда дл  подращивани  мицели , г/л:

Меласса63,8

Ферроцианид кали  0,21 Углекисльй натрий безводный0,09

Щавелевокисльй аммоний 1,26 Однозамещенный фосфат кали 0,16

Сульфат цинка водньй 0,005 Сульфат магни  водный 0,25 Дл  ферментации среда приготавливаетс  по тому же рецепту,г что и дл  подращивани , но не ввод т сульфат магни .

Мелассна  среда дл  долива, г/л: Меласса532,0

Ферроцианид кали  17,7 Процесс ферментации длилс  5 сут За процесс с колбы получено 5440 кг общей кислоты, в составе кислот лимощ}а  составл ет 79,8%, щавелева  11,9%, глюконова  8,3%, выход лимонной кислоты от сахара 67,2%.

Данные табл. 1 показывают, что при ведении процесса по предлага- емой технологии ферментации концентрированных сред количество лимонной кислоты, полученное с колбы, возросл

o

5

0

5

0

5

255,0 0,8

0,35 2,5

0,16 0,010

2212416

на J3,5%, а выход от сахара на 4,0%, при этом в составе синтезируемых -кислот отсутствует щавелева  кислота,

Пример 4. Процесс подра- 5 щивани  посевного осуществл ли,

как в примере 1. Процесс ферментации отличаетс  от примера 2 тем, что дл  ферментации приготавливали мелассный раствор 12%-ный по сахару.

Рецепт мелассной среды дл ферментации , г/л:

Меласса

Ферроцианид кали 

Углекислый натрий

безводньй

Щавелевокислый

аммоний

Однозамещенньй фосфат

кали 

Сульфат цинка водньй

Из табл. 1 видно, что при ведении процесса по предлагаемой технологии количество лимонной кислоты, полученное с колбы, возрастает по сравнению с прототипом на 5,4%, а выход от сахара на 2,5%.

Пример 5. Процесс подращивани  посевного мицели  осуществл ли, как в примере 1. Процесс ферментации отличаетс  от примера 2 тем, что дл  ферментации приготавливали мелас- сньй раствор с содержанием сахара 14%.

Рецепт мелассной среды дл  ферментации , г/л:

Меласса

Ферроцианид кали 

Углекисльй натрий

безводньй

Щавелевокисльй аммоний

Однозамещенньй фосфат

кали 

Сульфат цинка водньй

Данные табл. 1 показывают, что при ведении процесса по предлагаемой технологии количество лимонной кислоты , полученное с колбы, возрастает по сравнению с прототипом на 18,2%.

298,0 1,0

0,41

0,16 0,10

. Пример 6. Процесс подращивани  посевного мицели  осуществл ли, как в примере 2. Процесс ферментации отТтичаетс  от примера 2 тем, что количество вносимого сернокислого цинка в мелассньй раствор равнр оптимальной дозе, установленной дл  разбавленных сред (5 мг/л). Данные табл. 1 показывают, что при такой подготовке сред.усиливаетс  синтез глюконовой кислоты и снижаетс  биосинтетическа  активность гриба, в результате количество лимонной кислоты , полученной с колбы, возрастает лишь на 2,7%, а выход от сахара снижаетс  на 4,5% по сравнению с прототипом.

Пример 7. Процесс подращивани  посевного мицели  и ферментаци осуществл ют, как в примере 2 (табл. 1). Отличие состоит в том,- что количество сернокислого цинка, вносимого в мелассную ферментационную среду, увеличиваетс  по сравнени с оптимальной дозой, установленной дл  разбавленньк сред, в 3,4 раза и составл ет 17 мг/л. При такой подготовке сред гриб активно синтезирует органические кислоты, причем в основном лимонную кислоту (88,8%), в результате количество лимонной кислоты по сравнению с прототипом возрастает на 15,5%, а выход от сахара на 3,7% (табл. 1).

Пример 8. Процесс подращивани  посевного мицели  и ферментаи 1 осуществл ют, как в 2. Отличие состоит в том, что количество сернокислого цинка, вносимого в ме- лассную среду дл  ферментации, превышает норму, установленную дл  разбав ленных сред, и составл ет 15 мг/л . При такой подготовке сред активность гриба повышаетс , увеличиваетс  содержание лимонной кислоты в составе синтезируемых кислот, в результате количество лимонной кислоты по сравнению с прототипом повышаетс  на 16,2%, а выход от сахара на 4,5% (табл. 1).

Следовательно, при обработке ме- лассных сред повьппенной концентрации ПЦСА (в дозе, необходимой дл  выведени  половины солей кальци , содержащихс  в мелассе) доза вносимого сернокислого цинка должна быть увели- чена по сравнению с дозой, установленной дл  разбавленных сред, и составл ет 10-17 мг/л.

Пример 9. Культивирование осуществл ли в производственньк услови х . В качестве продуцента использовали осмофильный штамм Aspergillus niger Л-4. Дл  подращивани  мицели  приготавливали 3 м- мелассной среды, содержащей 5% сахара.

Состав среды дл  подращивани  мицели , г/л:

j

0 5 0

5 о

,

5

0

5

Меласса 46%-на 

по сахару108,7

Щавелевокислый

, аммоний3,66

Ферроцианид кали  О ,,46 Сульфат магни  0,23 Фосфорнокислый калий 0,116 Сульфат цинка,

гидрат0,01

Фурациллин0,017

, Мелассу разбавл ли в 2 м гор чей воды в варочном котле и кип тили 10 мин. Затем добавл ли щавелевокислый аммоний, кип тили 5 мин, вносили ферроцианид кали  и кип тили еще 5 мин. После внесени  сернокислого магни  раствор через стерили- зационную систему подавали в посевной ферментатор емкостью 5 м. В мелас- сный раствор, охлажденный до 38 С, вносили стерильные растворы питательных солей фосфорнокислого кали  и сернокислого цинка и антисептик фура- циллин. Засев среды производили кониди ми гриба в количестве 3 г предварительно (за 6 ч до посева), замоченных в мелассной среде того же состава.

Ферментацию проводили в 50 м ферментаторе на среде, содержащей 13% сахара.

Состав среды дл  ферментации, г/л:

Меласса 46%-на  по сахару,282,0 ,

Щавелевокислый

аммоний3,33

Ферроцианид кали  1,03 Фосфорнокисльй калий 0,106 Сульфат цинка, гидрат 0,02 Раствор, приготовленный в 50 м ферментаторе, засевали мицелием гриба Aspergillus niger штамма Л-4, выросшим в посевном ферментаторе за 24 ч.

В процессе ферментации мелассный раствор не подливали. В св зи с тем, что в процессе ферментации происходит испарение, производ т долив стерильной воды два ды по 2-2,5 м, обеспечива  лучшее эрлифтное перемешивание и более полное усвоение субстрата.

В процессе ферментации соблюдали следующий режим аэрации: первые 3 ч на ферментатор подают 200-300 м в час воздуха, через 3-6 ч 300-600 м в час, через 12 ч 600-800 м в час.

- 9

через 20 с 800-1000 м в час и через сутки 1100-1200 м в час. На этом уровне аэрацию сохран ли до конца цикла.

Процесс ферментации заканчивают при содержании сахара в ферментируемой среде 0,2%. Длительность ферментации 4,9 сут.

Контролем служил процесс, осу- ществл емьй по известному способу, прин тому за прототип, на разбавленных средах, при котором в качестве продуцента примен ли производственный штамм Aspergillus niger Л-1.

Результаты представлены в табл.

При ведении процесса по предлагаемой технологии за цикл с ферментатора получено 3014 кг лимонной кислоты. В составе синтезируемых кислот содержалось 88,3% лимонной кислоты и 11,6% глюконовой кислоты щавелева  кислота не синтезировалас

Съем лимонной кислоты составил 11,2 кг с 1 м в сут, выход лимонной кислоты от сахара мелассы 73,6%. Дл  получени . 1 т лимонной кислоты затрачено 2952 кг 46%-ной по сахару мелассы.

При ведении процесса по прототипу за 5,0 сут с ферментатора получено 2748 кг лимонной кислоты. В составе синтезируемых кислот содержалось 85,9% лимонной кислоты, 10,0% щавелевой кислоты и 4,1% глюконовой кислоты. Съем лимонной кислоты с 1 м в сут 10,0 кг, выход лимонной кислоты от сахара мелассы 77,4%. На получение 1 т лимонной кислоты затрачено 2808 кг 46%-ной по сахару мелассы.

Пример 10. Процесс осу-, ществл ют, как в примере 9. Отличие состоит в том, что долив стерильной воды начинают с третьих суток. По результатам, представленным в табл. 2, видно, что при таком веде2124110

НИИ процесса по сравнению с прототи- пом сокращаетс  длительность цикла,

увеличиваетс  съем лимонной кислоты, однако значительно снижаетс  выход 5 от сахара.

Пример 11. Процесс осуществл ют , как в примере 9. Отличие состоит в том, что долив стерильной воды начинают с четвертых суток. По

10 результатам, представленным в . табл. 2, видно, что при таком ведении процесса резко ухудшаютс  все показатели процесса как по сравнению с прототипом, так и в случа х когда

15 долив стерильной воды начинают на 2-3 сут (см. табл. 2, пример 9 и 10).

Таким образом, предложенный способ позвол ет ферментировать мелас- сные среды повышенной концентрации,

0 при этом съем лимонной кислоты с 1 м в сутки возрастал На 11,2%.

Отсутствие щавелевой кислоты при ведении процесса по предлагаемой технологии исключает образование

5 оксалата кальци  при переработке сброженных растворов, вывоз оксалата кальци  и св занные с этим транспортные расходы. Ведение процесса без

. доливов мелассных растворов з ень0 шает трудозатраты на стерилизацию подливных емкостей, приготовление подливньк растворов мелассы и ведение дробных доливов за врем  ферментации . При этом уменьшаетс  расход

5 воды и пара. Исключение операции по доливу сред уменьшает возможность попадани  посторонней микрофлоры, в результате чего улучшаютс  технико-экономические показатели.

0

Применение предлагаемой технологии на проектируемых заводах уменьшает капитальные затраты на оборудование бродильных цехов подливными 5 ёмкост ми и высвобождает производ- : ственные площади.

п) cf s t;

Ю nJ H

oo

(У1 CM

r

in

fsl

a

CO

ts r

-

1Л

(Ti vO

r

vO

CSJ v)

О

r

o

CM CM

Ы

о о

ЧГ Ю

о о -

VO

2 Ш

д)

п) а R и

51 &

0-)

4D

оо

Прототип

11редла:гаемый по примеру

10,0

77,4

5,5

3200

2748

Продолжение та бл.2

7716

2808

Claims (2)

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ ГЛУБИННЫМ МЕТОДОМ, включающий посев спор гриба-продуцента Aspergillus niger в условиях аэрации и перемешивания в посевной ферментатор, подращивание на мелассном растворе кислотообразующего мицелия, ферментацию на мелассной среде в основном ферментаторе и выделение лимонной кислоты, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода лимонной кислоты, для подращивания мицелия используют мелассный рас-твор с концентрацией сахара 4,5-6,0%, при этом подращивание ведут в течение 24-36 ч для ферментации используют мелассную среду с концентрацией сахара 13-14%, ферментацию проводят в течение 4,55,5 сут., а на вторые и третьи сутки ферментации проводят долив стерильной воды в количестве 4-5% от объема среды, причем в качестве гриба-продуцента используют Aspergillus niger Л-4.

2. Способ по п. ^отличающийся тем, что, с целью создания оптимальных условий для ферментации при использовании меласс с содержанием кальция свыше 0,8%,в: мелассную среду вводят щавелевокислый аммоний в количестве, необходимом для осаждения 1/2 солей кальция, содержащихся в мелассе, и сернокислый цинк в количестве 10-17 мг на 1 л мелассной среды, при этом общее количество мелассной среды берут исходя из заполнения объема основного ферментатора на 70-75%.