CN102286551A - 一种产富马酸根霉菌的发酵过程调控方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程领域，涉及一种产富马酸根霉菌的发酵过程调控方法。本发明通过对根霉菌高产菌株和原始菌株代谢组的测量和比较解析，从而全面获得根霉菌高产富马酸胞内代谢特征信息，为发酵过程控制优化提供重要指导。与其它发酵调控策略相比，该方法能对细胞内所有代谢物进行无偏分析，深入理解根霉菌高产富马酸的机制，对发酵调控更具有针对性，效率更高，可以为发酵过程控制优化提供一种高效、系统的方法。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及一种产富马酸根霉菌的发酵过程调控方法，具体涉及一种基于代谢组学技术调控根霉菌生物合成富马酸的方法。
背景技术：
富马酸是一种含有双键的二元羧酸，可以通过氨化、水合、加氢及异构等工艺生产L-天冬氨酸、苹果酸、琥珀酸、1,4-丁二醇、马来酸等化合物，同时，作为重要的有机化工原料和精细化工产品也被广泛应用于材料（树脂、涂料及增塑剂等）、医药、化工、食品及饲料添加剂等领域（李学坤，张昆，高振等.富马酸的合成及应用[J]. 现代化工, 2005, 25(suppl1): 81-84.）。目前，富马酸主要通过石油衍生物马来酸酐转化而来，然而，随着石油资源的枯竭和价格的不断上升，研究者越来越重视用发酵技术代替石油化工转化技术从可再生资源中生物炼制富马酸。
诸如米根霉（Rhizopus oryzae）等根霉属丝状真菌，其发酵产物可提取富马酸，是目前生物法合成富马酸的主要菌种。但由于根霉菌的重组基因不易表达，特异性重组频率低，利用基因工程手段来提高根霉菌生产富马酸的转化率和生产能力仍很困难。传统的诱变方法是提高根霉菌发酵富马酸生产能力的重要工具。但是，由于传统的诱变方法对细胞是全局性的改变，很难通过定点分析的方法全面深入理解高产富马酸根霉菌菌株的代谢特征以及根霉菌高产富马酸的机理，不能有效的指导进一步菌种改造和工业发酵过程的优化。
根霉菌胞液中的TCA还原途径是积累富马酸的主要途径，在富马酸有氧条件下的积累过程中，TCA 循环和TCA 还原途径是同时起作用的。TCA循环为细胞提供生长及基础代谢所需的中间代谢产物与能量ATP，还为TCA 还原途径提供必需的还原力NADH。（Kenealy W, Zaady E, Dupreez JC, et al, Biochemical aspects of fumaric acid accumulation by Rhizopus arrhizus . Appl Environ Microbiol, 1986, 52: 128-133.）上述两条富马酸代谢途径间通过能量及还原力相互偶联。相对以上较多的研究根霉菌生物合成富马酸的生理过程，却少有报道根霉菌生物合成富马酸的分子机理。代谢组是细胞内各种各样生理变化产生的终端代谢物的集合，被认为是对基因或环境变化响应的一种放大。随着越来越多的丝状真菌被测序，科学家需要将这些数据与转录信息和代谢轮廓分析信息结合起来以全面系统理解根霉菌胞内代谢组特征（Meijer, S.; Panagiotou, G.; Olsson，L.; Nielsen, J., Physiological characterization of xylose metabolism inAspergillus niger under oxygen-limited conditions. Biotechnology and Bioengineering 2007, 98 (2), 462-475.），这些信息有利于理解因菌种改造和环境因素变化导致的代谢网络以及胞内代谢物的响应特性。对根霉菌来说，目前还没有报道基于代谢组学技术分析基础上的调控其生物合成富马酸发酵过程的报道。
发明内容
本发明技术目的是：提供一种产富马酸根霉菌的发酵过程调控方法，该方法能利用代谢组学技术原理，系统、定量测定根霉菌高产富马酸菌株胞内代谢物，并通过多元统计数据分析方法确定生物标记物和显著变化的胞内代谢物，并结合根霉菌代谢网络比较分析获得根霉菌高产富马酸的代谢特征，将获得的信息指导根霉菌生物合成富马酸发酵过程的调控。
为了实现本发明的技术目的，本发明的技术方案如下。
一种产富马酸根霉菌的发酵过程调控方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）同步培养
将根霉菌的原始菌株和其高产突变株用同样的培养条件分别同步培养发酵富马酸，并每12～16 h对发酵液进行取样。
以米根霉为例，在本发明中，具体培养条件为在400 rpm、温度35℃的NBS发酵罐中，以10%的接种量接入装液量为5 L的7 L发酵罐中，发酵周期为72 h，每12～16h对发酵液进行取样分析。
（2）根霉菌胞内代谢物的提取
将取样得到的发酵液中的根霉菌细胞用冷甲醇溶液灭活，并将淬灭后的根霉菌细胞在液氮中捣碎；将甲醇、氯仿、水的预冷溶液加入到细胞粉末中，同时，加入核糖醇作为内标物，振荡混均。
（3）GC-TOF-MS测定和胞内代谢物分析
将步骤（2）得到的样品分别加入甲氧基铵盐酸盐的吡啶溶液和三甲基硅烷基三氟乙酰（MSTFA）后，用气相色谱-飞行时间质谱（GC-TOF-MS）分析，定性定量检测出根霉菌细胞内所有代谢物。
以米根霉为例，在本发明中，具体的分析方法为：1 μL的样品的以分流比1:1比例注入气相色谱里；质谱的扫描范围为m/z50-800，分析软件为Masslynx（version4.1，Waters）；GC-MS 的分析峰利用NIST MS 数据库及Golm Metabolome 数据库进行分析确定。
（4）多元统计分析
利用主成分分析法（PCA）对步骤（3）确定的胞内代谢物进行分析，确定生物标记物和显著变化因素。
（5）高产富马酸根霉菌突变株的机理分析
将步骤（4）分析得到的生物标记物和显著变化因素结合根霉菌的代谢功能区进行比对，分析高产富马酸突变株细胞内的代谢特征，从代谢水平理解突变株高产富马酸的机理。
其中所述的比对并不局限于糖代谢、氮代谢、嘌呤嘧啶代谢以及脂肪酸代谢等中心碳代谢网络，也包括质谱检测出来的其它任何相关代谢功能区。
（6）根霉菌生物合成富马酸的发酵调控
结合根霉菌高产突变菌株的胞内代谢特征，通过有针对性的改变发酵过程参数，以实现调控根霉菌生物合成富马酸的发酵过程。
其中，所述的发酵过程参数主要包括：溶氧、pH、转速等；培养基成分，如碳源、氮源，无机盐等；培养方式，如分步发酵、连续发酵、补料发酵等；以及外源添加辅助因子等发酵技术以实现强化高产菌株的胞内代谢特征。
本发明所述的根霉菌包括米根霉或者少根根霉。
本发明的有益效果在于：本发明将代谢组学技术应用于指导调控根霉菌生物合成富马酸的发酵过程。通过对高产富马酸菌株的代谢组分析，全面获得根霉菌高产富马酸胞内代谢特征信息，从而为发酵过程控制优化提供重要指导。与其它发酵调控策略相比，该方法能对细胞所有代谢物进行无偏分析，对发酵调控更具有针对性，效率更高，可以为发酵过程控制优化提供一种高效、系统的方法。
附图说明
图1是本发明所述的调控方法示意图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
本实施例说明产富马酸米根霉（Rhizopus oryzae）的发酵过程调控方法。
菌株：（1）原始菌株米根霉(ATCC 20344)。
（2）高产富马酸突变菌株：采用波长为800 nm、重复频率为76 MHz的飞秒激光，在照射功率为5～40 mW、照射时间为5～30 s的条件下对上述原始菌株进行处理，获得了一株米根霉高产富马酸菌株；其中所用的优化飞秒激光诱变方法，来自专利公开号 CN102061294A、名称为“飞秒激光诱变米根霉选育富马酸高产菌株的方法”的专利申请文献。
1、将上述原始菌株和飞秒激光诱变的高产突变株同步培养在400 rpm、温度35℃，10%的接种量，装液量为5 L的7 L NBS发酵罐中（发酵培养基组成及质量含量为：葡萄糖80 g、尿素0.2 g、KH2PO4 0.6 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、ZnSO4·7H2O 0.015 g、FeSO4·7H2O 0.001 g、CaCO3 55 g，溶解在1 L蒸馏水中，初始pH为6），发酵周期为72 h，分别在0 h、12 h、24 h、48 h、60 h对发酵液进行取样分析。米根霉细胞用含有-40℃、80%的甲醇/水溶液，灭活5 min，并将淬灭后的米根霉细胞在液氮中捣碎。将1 mL、-40℃的甲醇、氯仿、水预冷溶液（2.5:1:1，v/v/v）加入到30 mg的细胞粉末中，同时加入50 μL核糖醇（0.2 mg/mL）作为内标物，振荡混均。10000转离心10 min后转入新离心管中。细胞碎片加入500 μL、-40℃甲醇和氯仿混合溶剂（1:1，v/v）再提取，将两次萃取液混合。在分析前，加入250 μL超纯水220转离心20 min分层，取150 μL冻干。衍生化处理通过加入50 μL（20 mg/mL）甲氧基铵盐酸盐的吡啶溶液，30℃反应90 min和加入80 μL三甲基硅烷基三氟乙酰（MSTFA），37℃反应30 min，转移到进样瓶中室温静置2 h，用于GC-MS分析。
2、胞内代谢物通过气相色谱-飞行时间质谱（GC-TOF-MS）分析，这个系统包括安捷伦7683自动进样器、安捷伦6890气相色谱分析仪（Agilent Technologies，Palo Alto，CA）和 一个飞行时间质谱仪(Waters)。GC色谱柱为DB-5柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm，Agilent Technologies）。胞内代谢物通过气相色谱-飞行时间质谱（GC-TOF-MS）分析， 1 μL的衍生化样品的以分流比1:1比例注入气相色谱里。其中进样口温度为280℃、GC的界面温度270℃、源温度250℃。在恒定压力91KPa下以氦气为载气。质谱的扫描范围为m/z50-800，分析软件为Masslynx（version4.1，Waters）。GC-MS 的分析峰利用NIST MS 数据库及Golm Metabolome 数据库进行分析确定。一共确定了81种化合物，这些物质涵盖了米根霉细胞内的糖代谢、氮代谢、嘌呤嘧啶代谢以及脂肪酸代谢，是全局性的胞内代谢物分析。
3、利用Matlab2008b软件包中主成分分析（PCA）对81种确定的胞内代谢物进行分析，确定生物标记物和显著变化因素。飞秒激光诱变的高产富马酸菌株和原始菌株相比共有46种胞内代谢物在至少两个连续的时间点上产生了显著的变化。说明两株菌在代谢上存在明显差异。特别地，飞秒激光诱变的高产富马酸菌株氧化TCA循环在24 h以后，异柠檬酸（0.22～0.65倍）、酮戊二酸（0.37～1.2倍）、柠檬酸（0.25～0.67倍）、乌头酸（0.45～0.93倍）含量与原始菌株相比，都出现了明显的降低（括号中是同步培养24 h后高产菌株含量与原始菌株细胞含量相比）。
4、结合米根霉代谢网络分析米根霉高产富马酸的机理，发现飞秒激光诱变改变了原始菌株胞内既有的物质代谢和能量代谢的平衡，高产富马酸的米根霉突变株TCA途径中间代谢物含量减少了0.22～1.2倍，这说明米根霉高产富马酸菌株的TCA循环效率要低于原始菌株。
5、基于以上的代谢组学分析所获得的信息，改变发酵过程中的控制策略，以强化高产菌株胞内代谢特征。通过在24 h以后将米根霉生物合成富马酸发酵过程中溶氧浓度降到20%，以降低TCA循环效率的发酵调控方法，使米根霉发酵富马酸的产量从36.2 g/L提高到43.5 g/L，在代谢组学分析基础上有效的调控了米根霉生物合成富马酸的发酵过程。
实施例2
本实施例说明产富马酸少根根霉（Rhizopus arrhizus）的发酵过程调控方法。
菌株：（1）原始菌株少根根霉（NRRL 2582）。
（2）高产富马酸突变菌株：采用功率为15 W紫外灯、在照射距离为30 cm、照射时间为50 s的条件下对上述原始菌株进行处理，获得了一株少根根霉高产富马酸菌株。
1、将少根根霉的高产突变株和原始菌株同步培养在400 rpm、温度35℃，10%的接种量，装液量为5 L的7 LNBS发酵罐中（发酵培养基组成及质量含量为：葡萄糖80 g，(NH4)2SO2 2 g，酵母膏(总氮含量9.8% )0.4 g，KH2PO4 0.4 g，MgSO4·7H2O 0.4 g，ZnSO4·7H2O 0.05 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，甲醇15 mL；CaCO3 55 g，溶解在1 L蒸馏水中，初始pH为5.5），发酵周期为72 h，分别在0 h、12 h、24 h、48 h、60 h对发酵液进行取样分析。少根根霉细胞用含有-40℃、80%的甲醇/水溶液，灭活5min，并将淬灭后的少根根霉细胞在液氮中捣碎。将1 mL、-40℃的甲醇、氯仿、水预冷溶液（2.5:1:1，v/v/v）加入到30 mg的细胞粉末中，同时，加入50 μL核糖醇（0.2 mg/mL）作为内标物，振荡混均。10000转离心10min后转入新离心管中。细胞碎片加入500 μL、-40℃甲醇和氯仿混合溶剂（1:1，v/v）再提取，将两次萃取液混合。在分析前，加入250 μL超纯水220转离心20 min分层，取150 μL冻干。衍生化处理通过加入50 μL（20 mg/mL）甲氧基铵盐酸盐的吡啶溶液，30℃反应90 min和加入80 μL三甲基硅烷基三氟乙酰（MSTFA），37℃反应30 min，转移到进样瓶中室温静置2 h，用于GC-MS分析。
2、胞内代谢物通过气相色谱-飞行时间质谱（GC-TOF-MS）分析，这个系统包括安捷伦7683自动进样器、安捷伦6890气相色谱分析仪（Agilent Technologies，Palo Alto，CA）和 一个飞行时间质谱仪(Waters)。GC色谱柱为DB-5柱（30 m × 0.25 mm，0.25 μm，Agilent Technologies）。胞内代谢物通过气相色谱-飞行时间质谱（GC-TOF-MS）分析， 1μL的衍生化样品的以分流比1:1比例注入气相色谱里。其中进样口温度为280℃、GC的界面温度270℃、源温度250℃。在恒定压力91 KPa下以氦气为载气。质谱的扫描范围为m/z50-800，分析软件为Masslynx（version4.1，Waters）。GC-MS 的分析峰利用NIST MS 数据库及Golm Metabolome 数据库进行分析确定。一共确定了102种化合物，这些物质涵盖了少根根霉细胞内的糖代谢、氮代谢、嘌呤嘧啶代谢以及脂肪酸代谢，是全局性的胞内代谢物分析。
3、利用Matlab2008b软件包中主成分分析（PCA）对102种确定的胞内代谢物进行分析，确定生物标记物和显著变化因素。高产富马酸菌株和原始菌株相比共有63种胞内代谢物在至少两个连续的时间点上产生了显著的变化。说明两株菌在代谢上存在明显差异。特别地，在 18 种检测的氨基酸中，天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸均在12 h以后与对照组相比分别降到了0.26～0.54、0.31～0.51、0.19～0.78倍（括号中是同步培养12 h以后高产菌株含量与原始菌株细胞含量相比）。
4、结合米根霉代谢网络分析少根根霉高产富马酸的机理，发现高产菌株和原始菌株胞内的物质代谢和能量代谢存在较大差异，主要氨基酸代谢物的含量受到了0.26～0.78倍的抑制等信息，这说明少根根霉高产富马酸菌株的氮代谢效率要低于原始菌株。
5、基于以上的代谢组学分析所获得的信息，改变发酵过程中的控制策略，以强化高产菌株胞内代谢特征。通过在少根根霉生物合成富马酸发酵过程中流加2 mg/L/h的尿素，初始阶段不加氮源的调控策略，以降低氮代谢效率的发酵调控方法，使少根根霉发酵富马酸的产量从32.4 g/L提高到39.7 g/L。在代谢组学分析基础上有效的调控了少根根霉生物合成富马酸的发酵过程。
Claims (7)
1.一种产富马酸根霉菌的发酵过程调控方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）同步培养
将根霉菌的原始菌株和其高产突变株在同样的培养条件下进行同步培养发酵富马酸，并每12～16 h对发酵液进行取样；
（2）根霉菌胞内代谢物的提取
将取样得到的发酵液中的根霉菌细胞用冷甲醇溶液灭活，并将淬灭后的根霉菌细胞在液氮中捣碎；将甲醇、氯仿、水的预冷溶液加入到细胞粉末中，同时，加入核糖醇作为内标物，振荡混均；
（3）GC-TOF-MS测定和胞内代谢物分析
将步骤（2）得到的样品分别加入甲氧基铵盐酸盐的吡啶溶液和三甲基硅烷基三氟乙酰后，用GC-TOF-MS分析，定性定量检测出根霉菌细胞内所有代谢物；
（4）多元统计分析
利用主成分分析法对步骤（3）确定的胞内代谢物进行分析，确定生物标记物和显著变化因素；
（5）高产富马酸根霉菌突变株的机理分析
将步骤（4）分析得到的生物标记物和显著变化因素结合根霉菌的代谢功能区进行比对，分析高产富马酸突变株细胞内的代谢特征，从代谢水平理解突变株高产富马酸的机理；
（6）根霉菌生物合成富马酸的发酵调控
结合根霉菌高产突变菌株的胞内代谢特征，改变发酵过程参数，以实现调控根霉菌生物合成富马酸的发酵过程。
2. 根据权利要求1所述的产富马酸根霉菌的发酵过程调控方法，其特征在于所述的根霉菌包括米根霉或者少根根霉。
3. 根据权利要求1所述的产富马酸根霉菌的发酵过程调控方法，其特征在于步骤（5）所述的包括中心碳代谢功能区比对。
4. 根据权利要求3所述的产富马酸根霉菌的发酵过程调控方法，其特征在于所述的中心碳代谢功能区比对包括糖代谢、氮代谢、嘌呤嘧啶代谢以及脂肪酸代谢等代谢功能区比对。
5. 根据权利要求1所述的产富马酸根霉菌的发酵过程调控方法，其特征在于步骤（6）所述的发酵过程参数包括：溶氧、pH、转速、培养基成分、培养方式或者外源添加辅助因子。
6. 根据权利要求5所述的产富马酸根霉菌的发酵过程调控方法，其特征在于所述的培养基成分包括碳源、氮源或者无机盐。
7. 根据权利要求5所述的产富马酸根霉菌的发酵过程调控方法，其特征在于所述的培养方式包括分步发酵、连续发酵或者补料发酵。
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